Estudio estructural de la N-acetilcisteína

Facultad de Ciencias Trabajo Fin de Grado Grado en Química Estudio estructural de la N-acetilcisteína Autor: Elena Rábano Pérez Tutor/es: Iker León ÍNDICE 1. RESUMEN/ABSTRACT ..................................................................................................................... 5 2. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 6 2.1 Estrés oxidativo ...................................................................................................................... 6 2.2 N-acetilcisteína (NAC) ............................................................................................................. 7 NAC como antioxidante directo ...................................................................................... 8 NAC como antioxidante indirecto ................................................................................... 9 NAC y la ruptura puentes disulfuro............................................................................... 10 2.3 Ventajas de NAC frente a cisteína ........................................................................................ 12 2.4 Papel de NAC frente al COVID .............................................................................................. 13 3. JUSTIFICACIÓN.............................................................................................................................. 15 4. OBJETIVOS .................................................................................................................................... 15 5. METODOLOGÍA ............................................................................................................................. 17 5.1 Metodología computacional................................................................................................. 17 Mecánica molecular ..................................................................................................... 17 Métodos mecanocuánticos .......................................................................................... 23 5.2 Espectroscopía de rotación .................................................................................................. 32 Fundamentos ................................................................................................................ 32 Expansión supersónica y ablación láser ........................................................................ 34 Rotación interna ........................................................................................................... 35 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................................... 37 6.1 Búsqueda conformacional .................................................................................................... 37 6.2 Análisis de las interacciones predominantes ........................................................................ 39 6.3 Predicción del espectro ........................................................................................................ 41 6.4 Tratamiento de la muestra y realización del espectro .......................................................... 42 6.5 Asignación del espectro ........................................................................................................ 44 6.6 Comparativa de campos de fuerzas, niveles de teoría y bases de cálculo. ........................... 47 6.7 Estabilidad estructural de la NAC frente a la cisteína ........................................................... 49 7. CONCLUSIONES ............................................................................................................................ 51 8. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................... 52 9. ÍNDICE DE FIGURAS, TABLAS Y ECUACIONES ................................................................................ 56 10. ANEXOS ........................................................................................................................................ 58 10.1 Resultados búsqueda conformacional .................................................................................. 58 10.2 Comparativa niveles de cálculo ............................................................................................ 64 5 Resumen/Abstract 1. RESUMEN/ABSTRACT En este trabajo de fin de grado se estudia el panorama conformacional de la N-acetilcisteína, un fármaco antioxidante comúnmente utilizado como mucolítico. Mediante la utilización de métodos computacionales se buscan las estructuras más relevantes. Para comenzar, se identifican los posibles confórmeros con mecánica molecular. A continuación, las estructuras se optimizan con métodos del Teorema del Funcional de la Densidad. Esto nos permite obtener las estructuras más estables y realizar la predicción de sus espectros de rotación, con los que poder comparar el espectro experimental, para proceder a su asignación. Experimentalmente, se obtiene el espectro rotacional de la N-acetilcisteína y se encuentra una especie predominante, que se corresponde con el confórmero predicho como más estable para la molécula. Finalmente, su estructura se compara con la de la cisteína para ver la diferencia entre ambos antioxidantes y así poder discutir si existe alguna correlación con el papel biológico tan dispar que ejerce cada una de estas moléculas. Palabras clave: (Antioxidante, Química Computacional, Espectroscopia de Rotación, Confórmeros) ABSTRACT In this project the conformational landscape of N-acetylcysteine, an antioxidant drug commonly used as a mucolytic, is studied. Using computational methods, we search for the most relevant structures. To begin with, possible conformers are identified with molecular mechanics. The structures are then optimised using Density Functional Theorem methods. This allows us to obtain the most stable structures, and make a prediction of the rotational spectra, with which we can compare the experimental spectrum, in order to proceed to their assignment. On the experimental side, the rotational spectrum of N-acetylcysteine is obtained, and a single species is found, which turns out to be the predicted most stable conformer. Finally, its structure will be compared with that of cysteine to evaluate potential differences between the two antioxidants, so to discuss any correlation with their drastic different biological role. Keywords: (Antioxidant, Computational Chemistry, Rotational Spectroscopy, Conformers) 6 Introducción 2. INTRODUCCIÓN 2.1 Estrés oxidativo Los radicales libres son átomos o moléculas altamente reactivos con uno o más electrones desapareados en su capa externa y pueden formarse cuando el oxígeno interactúa con ciertas moléculas. Estos radicales se pueden producir en las células al perder o aceptar un solo electrón, por lo que se comportan como oxidantes o reductores.1 El estrés oxidativo se define como un desequilibrio que favorece los sistemas oxidativos frente a los antioxidantes, lo que da lugar, sobre todo, a derivados tóxicos como especies reactivas de oxígeno (ROS) y especies reactivas de nitrógeno (RNS). Ambas son subproductos de varios procesos celulares, incluido el metabolismo aeróbico. Las ROS en concreto, son especies químicas oxigenadas como el anión superóxido (O2•-), oxígeno singlete, peróxido de hidrógeno (H2O2) y radicales hidroxilos (OH•-). Éstos aparecen como subproductos del metabolismo normal del oxígeno y, por tanto, desempeñan un papel importante en la comunicación entre las células. El desequilibrio que favorece a los radicales libres frente a los antioxidantes es perjudicial para la salud humana. El estrés oxidativo provoca una generación excesiva de ROS, que se unen a varios componentes celulares, como el ADN (ácido desoxirribonucleico), el ARN (ácido ribonucleico), los lípidos y las proteínas, alterando el sistema de defensa antioxidante, la homeostasis redox, e interfiriendo con la señalización celular. En caso de estrés oxidativo, las células utilizan muchas moléculas antioxidantes agrupadas en sistemas enzimáticos y no enzimáticos a fin de regular el desequilibrio: • Enzimáticos: existen tres grandes tipos de enzimas antioxidantes, como las superóxido dismutasas (SOD) las glutatión peroxidasas (GPxs), y las catalasas (CAT). • No enzimáticos: el glutatión (γ-L-glutamil-L-cisteinilglicina, GSH) es el más importante de los sistemas endógenos no enzimáticos. La función tiol de GSH le confiere un papel de agente reductor hacia ciertas ROS.2 7 Introducción 2.2 N-acetilcisteína (NAC) La N-acetilcisteína (NAC), es un precursor del glutatión reducido (GSH) derivado de la Lcisteína (Figura 1), conocido desde hace mucho tiempo por sus propiedades antioxidantes. La NAC se compone de cisteína y un grupo acetilo unido al grupo amino. Es un polvo cristalino blanco con un olor ligeramente ácido y un sabor amargo. Es estable con luz ordinaria y temperaturas de hasta 120°C. Además, se conoce que ejerce sus efectos antioxidantes de múltiples formas.3 Uno de sus usos más habituales es su empleo en la prevención y el tratamiento adyuvante en afecciones con producción de moco espeso y tenaz, como neumonía, fibrosis quística, bronquitis crónica y complicaciones pulmonares posoperatorias, pues la NAC es un potente mucolítico. No solo es responsable de controlar el estado redox mediante la reposición de las reservas de tiol, sino que también es un precursor de cisteína, lo que lo convierte en un antioxidante duradero.3 A la amplia aplicación de la NAC se suma que, como molécula tiol, es bastante estable y está disponible comercialmente a bajo precio. Esta molécula tiene además una variedad de beneficios clínicos, utilizándose para el tratamiento de la tos, la sequedad ocular y la influenza. También se usa comúnmente como un antídoto para la sobredosis de acetaminofén y como un medio para reducir la tolerancia a los nitratos. Este medicamento ha sido recomendado por la Organización Mundial de la Salud como antídoto en intoxicaciones desde la década de 1960. La NAC también es un ingrediente común que se encuentra en ciertos cosméticos y suplementos vitamínicos. La actividad antioxidante in vivo de la NAC y su diversidad como fármaco está relacionada con al menos tres mecanismos diferentes. En particular, de interés para este trabajo son: • Efecto antioxidante directo sobre determinadas especies oxidantes. Figura 1. Desacetilación de la NAC para dar cisteína. Fuente: A review on the possible molecular mechanism of action of Nacetylcysteine against insulin resistance and type-2 diabetes development. 8 Introducción • Un efecto antioxidante indirecto como resultado de la capacidad de la NAC para actuar como un precursor de Cys, que es un componente básico y el paso limitante de la velocidad en la síntesis de glutatión, siendo GSH un antioxidante directo bien conocido y un sustrato de varias enzimas antioxidantes. • Un efecto de ruptura de los disulfuros y la capacidad de restaurar los depósitos de tiol, que a su vez regulan el estado redox.4 NAC como antioxidante directo Los grupos tiol, típicamente se refieren a la forma R-SH de los restos químicos y están sujetos a deprotonación (pérdida de H+) para formar tiolatos cargados (RS- ); aunque ambas formas tienen pares solitarios de electrones y son nucleofílicos, un tiolato es mucho más reactivo que un tiol neutro, por ello posee distintas propiedades y reactividades en comparación con los tioles. La relación de equilibrio entre las formas tiol y tiolato varía con el pH y es característica de grupos tiol específicos ubicados dentro de un entorno proteico distinto.5 La actividad antioxidante se lleva a cabo por reacción del tiolato con las especies reactivas. Las constantes de velocidad de reacción de la NAC y de los compuestos endógenos que contienen tiol, como antioxidantes siguen el orden general: Cys> GSH> NAC. 6 Por tanto, asumiendo las mismas concentraciones, la NAC es el antioxidante más débil, pues como habíamos mencionado la actividad antioxidante del SH se debe al anión tiolato, cuya concentración relativa está regulada por la acidez del tiol. En otras palabras, la acidez (Ka) del grupo tiol regula el equilibrio y, por tanto, la cantidad relativa de S - con respecto a SH. En consecuencia, el pKa de los tioles mencionados anteriormente sigue el mismo orden: cisteína (8,30)> GSH (8,83)> NAC (9,52). 4 Debido a ello, la NAC solo pueda actuar cuando su concentración relativa es más alta que la de GSH y la del aminoácido Cys libre. Esta situación puede darse en algunas situaciones y condiciones patológicas, como en los fluidos pulmonares expuestos a un proceso inflamatorio / oxidativo. Esto se explica por la baja acidez del tiol de la NAC como consecuencia de la acetilación del grupo amino, lo que hace que el equilibrio entre la forma antioxidante (tiolato) y el tiol, se desplace en gran medida hacia este último, que es el inactivo.6 Si, por un lado, la NAC es el antioxidante más débil entre los compuestos de tiol endógenos, por otro lado, es más estable en solución acuosa.4 9 Introducción NAC como antioxidante indirecto El glutatión es un tripéptido sintetizado y mantenido a altas concentraciones (mM) en las células. La NAC aumenta el GSH porque es un precursor de Cys, que es el factor limitante de la velocidad en la biosíntesis de glutatión celular (Figura 2).4 El GSH es esencial para mantener el equilibrio redox intracelular y el estado de tiol esencial de las proteínas, pues es el tiol no proteico dominante en células de mamíferos. Las células mantienen un entorno reductor mediante la presencia de biomoléculas como el glutatión, que reducen las ROS a moléculas menos dañinas como el agua y el oxígeno molecular. La síntesis de GSH se produce en el citosol y está estrechamente regulada. Como se muestra en la Figura 3, el glutatión existe en dos estados: oxidado (GSSG) y reducido (GSH). Existe predominantemente como GSH, con concentraciones de 5 a 10 mM en las células hepáticas; la cantidad de GSSG, sin embargo, es menos del 1% de la de GSH. [8] El GSH sufre intercambio de tiol-disulfuro en una reacción catalizada por tiol-transferasa de la siguiente manera: Proteína-SSG +GSH→ Proteína-SH + GSSG Dado que esta reacción es reversible, el equilibrio está determinado por el estado redox de la célula, que depende de las concentraciones de GSH.7 Figura 2. Obtención de glutatión a partir de NAC. Fuente: Existing and potential therapeutic uses for N-acetylcysteine: The need for conversion to intracellular glutathione for antioxidant benefits Figura 3. Estructura química de las distintas formas de glutatión. a) Glutatión reducido (GSH), su grupo activo es el grupo SH. b) Glutatión oxidado, formado por dos moléculas de GSH unidas por un enlace disulfuro. (GSSG) 16 Objetivos Corroborar las predicciones hechas por métodos computacionales mediante su comparación con los resultados experimentales. Realizar una comparación de los resultados proporcionados por distintos campos de fuerzas. Permitiendo dilucidar cuales de los campos de fuerzas utilizados son los más adecuados para el estudio de moléculas con grupos funcionales similares a los de la N-acetilcisteína. Comparar la N-acetilcisteína con otro antioxidante, en concreto la cisteína, para ver las diferencias estructurales y discutir su posible implicación en sus diferentes roles biológicos. 17 Metodología 5. METODOLOGÍA Tal y como se mostrará en la parte de resultados, la NAC es una molécula que presenta varios confórmeros. Por ello, será necesaria una búsqueda conformacional previa. Además, el análisis de las energías y los parámetros espectroscópicos más relevantes serán de gran ayuda para la identificación conformacional del trabajo experimental. Los resultados experimentales, por comparación con los teóricos, nos permitirán determinar cuáles son los confórmeros que presenta la molécula realmente. Por ello, en esta sección se resumen los aspectos más importantes de las metodologías empleadas. 5.1 Metodología computacional La búsqueda de los distintos confórmeros estructurales de una molécula se podría realizar basándose en la intuición química. No obstante, esto conllevaría un enorme gasto de tiempo para una molécula compleja, además de que probablemente no se considerarían todos los confórmeros o podría dar lugar a errores. Afortunadamente, el desarrollo de los métodos computacionales facilita enormemente esta labor. La química computacional emplea los distintos conceptos para caracterizar moléculas. Los métodos basados en la química cuántica son los más precisos, pero hoy en día solo permiten el estudio de moléculas sencillas. Esto se debe a que este tipo de cálculos conllevan mucho tiempo de procesamiento de datos y requieren de ordenadores muy potentes. Para poder estudiar moléculas de mayor tamaño necesitamos entonces una simplificación o un modelo menos riguroso. La mecánica molecular es un segundo método que permite el estudio de moléculas de gran tamaño, incluyendo macromoléculas como las proteínas.16 Mecánica molecular La mecánica molecular (MM), a diferencia de los métodos cuánticos, se establece en un modelo mecano clásico simple de la estructura molecular. En este modelo, las moléculas son consideradas como un conjunto de átomos en el espacio, unidos entre sí mediante enlaces y dirigidos por un conjunto de funciones de potencial mecano-clásicas. 17 La mecánica molecular permite estudiar las moléculas a través de un modelo de bolas (átomos) y muelles (enlaces), que verifican la ley de elasticidad de Hooke. 18 Metodología Gracias a esta aproximación la energía de una molécula en su estado fundamental puede estudiarse como una función de las coordenadas de los núcleos atómicos. Esta función es conocida como Campo de Fuerzas o Force Field (FF). Además, los cambios que se producen en la energía potencial de un sistema pueden representarse como una superficie, denominada superficie de energía potencial (SEP o PES, como es comúnmente empleado en inglés). 18 5.1.1.1. SUPERFICIES DE ENERGÍA POTENCIAL Las disposiciones que puede adoptar una molécula en el espacio son infinitas. Basta con que la molécula realice pequeños cambios en las medidas de sus parámetros geométricos para obtener nuevas disposiciones, cada una de ellas de una determinada energía. Para especificar esta variación de la energía debida a los cambios en la estructura definimos las PES, una relación matemática que une la estructura molecular y la energía resultante. Consideremos el caso más sencillo. En una molécula diatómica solo tenemos un grado de libertad (la longitud de enlace) por lo que la superficie de energía potencial podemos representarla mediante un gráfico bidimensional (energía frente a longitud de enlace). Sin embargo, para moléculas poliatómicas, la superficie tiene tantas dimensiones como grados de libertad haya dentro de la molécula. Esto daría lugar a una hipersuperficie de energía potencial, como se muestra en la Figura 10. Los mínimos de energía de esta superficie se corresponderían con las estructuras estables, los confórmeros o isómeros estructurales de la molécula bajo investigación. Entre cada confórmero hay diferentes caminos de interconversión, pasando por un estado de transición, que sería un máximo en energía.19 Figura 10. Superficie de energía potencial (SEP). Fuente: Computational Chemistry and Molecular Modeling 19 Metodología Una estructura de equilibrio está en un punto de una superficie de energía potencial en el que son cero todas las primeras derivadas de la energía con respecto a las coordenadas geométricas individuales y cuya representación diagonal de la matriz de derivadas segundas de la energía, tiene todos los elementos positivos. En términos simples, una estructura de equilibrio corresponde al fondo de un pozo en la superficie de energía potencial global. La optimización de la geometría consiste en calcular, para la geometría inicial, la energía y sus primeras derivadas con respecto a todas las coordenadas geométricas, y utilizar esta información para proyectar una nueva geometría. Este proceso se repite hasta alcanzar la energía más baja o la geometría optimizada. El proceso de identificar los confórmeros de más baja energía llega a ser difícil conforme el número de grados de libertad conformacional se incrementa, a causa del gran número de disposiciones que es preciso examinar. Para ello serán necesarias técnicas de muestreo para reemplazar los procedimientos sistemáticos en las moléculas complejas. Los más comunes son los llamados métodos de Monte Carlo (que generan al azar las diferentes conformaciones de la muestra) y las técnicas de la dinámica molecular (que siguen el movimiento entre los diferentes confórmeros con el tiempo).20 La primera suele ir acompañada de varias estrategias como lo son el realizar torsiones, frecuencias de bajo modo, …. CAMPOS DE FUERZAS En la mecánica molecular las interacciones entre las masas se describen mediante funciones de potencial derivadas de la mecánica clásica. La expresión de la energía potencial de una determinada geometría es la suma de: la tensión de enlaces, la torsión alrededor de los enlaces simples y ángulos de flexión, y las fuerzas intermoleculares tales como los enlaces de hidrógeno o de van der Waals. Como ya habíamos dicho anteriormente, la mecánica molecular realiza una simplificación al no considerar los electrones. Es de esperar que entonces el método no proporcione valores de la energía precisos. A pesar de esto es perfectamente válido para realizar estudios de macromoléculas tales como las proteínas o, en el caso de moléculas pequeñas tales como ligandos, para una primera búsqueda conformacional. Esto permite evaluar la energía de los puntos de la superficie de energía potencial en un tiempo reducido y con un coste computacional muchísimo menor que otros métodos. Para hacerse una idea, para moléculas 20 Metodología con muchas torsiones, esta metodología permite buscar más de 10000 estructuras en pocas horas. Lo primero que necesitamos para realizar una búsqueda conformacional es la estructura de la molécula, es decir, las posiciones relativas en el espacio de los átomos que la componen, además de una serie de datos como las constantes de fuerza (k) de los distintos enlaces, los posibles ángulos de giro y torsiones, disolvente (si es el caso), etc… Para obtener las constantes de fuerza de los enlaces recurrimos (o el software en este caso) a la base de datos del programa utilizado, las cuales han sido halladas de forma experimental o mediante cálculos ab initio. La base de datos de compuestos empleada durante la parametrización es esencial para una correcta búsqueda conformacional, además de para modelar distintas propiedades. El conjunto de parámetros obtenidos empíricamente para describir las interacciones entre átomos y las funciones de potencial empleadas forman el campo de fuerzas (FF, force field) en el que se fundamentan esta clase de métodos. La energía del campo de fuerzas se escribe como una suma de términos, cada uno de los cuales describe la energía necesaria para distorsionar una molécula de una manera específica, como variar la distancia de enlace, variar el ángulo, o realizar una torsión entorno a un enlace. Algunos de estos términos están descritos en la Figura 11. A la hora de escoger utilizar un campo de fuerzas u otro debemos conocer sus características más transcendentales, puesto que existen muchos campos de fuerza dependiendo del uso. Se diferencian en tres aspectos principales: Figura 11. Términos fundamentales de un campo de fuerzas.Fuente: Dinámica molecular, Juan A. Bueren-Calabuig 21 Metodología 1. ¿Cuál es la forma funcional de cada término energético? Como hemos visto la energía del campo de fuerza es la suma de varias contribuciones. Dependiendo del tipo de campo de fuerza elegido la función que describe cada término energético varia. 2. ¿Cuántos términos cruzados se incluyen? Los términos cruzados aparecen al considerar que los enlaces, ángulos de enlace y diedros en una molécula no están aislados, sino que pueden estar influenciados por los átomos y grupos químicos vecinos. Están representados por funciones que dependen de dos o más coordenadas de movimiento, por lo que los funcionales que los describen son combinaciones de los funcionales para los términos por separado. Por lo tanto, sus expresiones son más complejas. Incluir más términos cruzados conlleva por tanto un mayor gasto computacional.17 3. ¿Qué tipo de información se utiliza para ajustar los parámetros? Hay dos tendencias generales. Si el campo de fuerza está diseñado principalmente para tratar grandes sistemas, como las proteínas o el ADN, las formas funcionales se mantienen tan simples como sea posible. Esto significa que sólo se utilizan funciones armónicas para Eenlace y Etorsión (o se omiten estos términos, obligando a que todas las longitudes y ángulos de enlace sean constantes), no se incluyen términos cruzados y el potencial de Lennard-Jones se utiliza para Evdw. Estos campos de fuerza se denominan a menudo "armónicos", "diagonales" o "Clase I". La otra rama se concentra en reproducir moléculas de tamaño pequeño y mediano con un alto grado de precisión. Estos campos de fuerza incluirán una serie de términos cruzados, utilizarán al menos expansiones cúbicas o cuádricas de Eenlace y Etorsión, y posiblemente un potencial de tipo exponencial para Evdw. Estos campos de fuerzas se denominan a menudo campos de fuerza de "Clase II". Se han introducido mejoras al permitir que los parámetros dependan de los tipos de átomos vecinos, por ejemplo, para modelar la hiperconjugación, e incluir efectos de polarización electrónica. Estos último son los campos de fuerza de "Clase III". Como hemos visto podemos escoger entre varios campos de fuerzas de distintas características. Dentro de los campos de fuerzas más comunes nos encontramos: 22 Metodología • La familia MM, se utilizan para cálculos computacionales de moléculas pequeñas, existiendo distintas variaciones dentro de este tipo que se designan con números (por ejemplo, MM2, MM3…). • Los AMBER (Assisted Model Building and Energy Refinement), se utilizan en el estudio de algunos sistemas orgánicos, además de proteínas y ácidos nucleicos. Son de clase I. • Los CHARMM (Chemistry at Harvard Macromolecular Mechanics), son campos de fuerzas parametrizados con datos experimentales y utilizados tanto para moléculas pequeñas como complejos solvatados de macromoléculas biológicas. Son de clase I. • El MMFF (Merck Molecular Force Field), es uno de los campos de fuerza más extendidos por su gran reproducibilidad en sistemas con varios grupos funcionales. Es de clase II. • Los OPLS (Optimized Potentials for Liquid Simulations) simula las propiedades del estado líquido, se utiliza para el agua y líquidos orgánicos. Otorgan especial importancia en la derivación de las interacciones no enlazadas por comparación con la termodinámica del estado líquido.21 Son de clase I. En este trabajo se han utilizado los campos de fuerza AMBER, MMFFs y OPLS. COMPARACIÓN CAMPOS DE FUERZA Para un mayor detalle de las ecuaciones empleadas por los distintos campos de fuerza y los términos que contribuyen a la energía, véase el Material adicional. A continuación, se muestra un resumen de la comparativa de los términos del funcional, como podemos ver en la Figura 12. Figura 12. Comparativa de los campos de fuerzas empleados en este trabajo. Pn es el polinomio de grado n utilizado. 23 Metodología • Como vemos, AMBER y OPLS utilizan términos en sus funcionales muy semejantes, además de no tener en cuenta la energía debida a términos cruzados (CROSS), ni la del doblado fuera del plano (OOP, Out of plane) pues esta última da lugar a un ángulo de torsión inadecuado (imp.: improper torsional angle). Las moléculas a las que se aplican estos dos campos son también las mismas: proteínas, ácidos nucleicos y carbohidratos. • El campo de fuerza MMFFs es muy distinto a estos otros dos. Presenta polinomios de mayor grado para describir los términos de las energías además de tener en cuenta la energía debida a términos cruzados, (sb: stretch–bend, es decir términos cruzados de enlace y torsión) y la energía de doblado fuera del plano. Además, este campo tiene una aplicación general, dando buenos resultados para un mayor tipo de moléculas. Métodos mecanocuánticos Los métodos de la mecánica cuántica se fundamentan en la resolución de la ecuación de Schrödinger, la cual sólo puede resolverse de manera exacta para átomos o moléculas que contienen un electrón. Esto se debe a que en sistemas polielectrónicos las partículas no se mueven de forma independiente, sino que existe correlación electrónica, por lo que deben considerarse varias aproximaciones para resolver la ecuación de Schrödinger. Las aproximaciones consisten en: • Aproximación de Born-Oppenheimer La función de onda molecular total Ψ(R,r) depende de las posiciones de los núcleos y de las posiciones de los electrones. Dado que los electrones son mucho más ligeros que los núcleos, y por lo tanto se mueven mucho más rápidamente, pueden responder de forma instantánea a cualquier cambio en las posiciones relativas de los núcleos. Esto permite separar las variables nucleares de las variables electrónicas. De esta forma podemos dividir la función de onda total, en una función de onda electrónica 𝜓(r) y en una función de onda nuclear Φ(R). Esto significa que las posiciones de los núcleos pueden fijarse (se suprimen los términos nucleares considerándolos constantes al calcular las derivadas, y se parametriza el término de atracción electrónica entre núcleos y electrones), de manera que sólo sea necesario resolver la parte electrónica. 24 Metodología • Aproximación de Hartree-Fock La función de onda electrónica 𝜓(r) depende de las coordenadas de todos los electrones en la molécula. Hartree propuso la idea de que se puede separar en un producto de funciones que dependen sólo de un electrón. De esta forma aplicaba la aproximación de la partícula independiente para los electrones, así el término de un electrón se considera independiente del resto, permitiendo dividir el operador Hamiltoniano en operadores individuales para cada electrón. 20 Esta función de onda resolvería la ecuación de Schrödinger de forma exacta si no fuera por el término de repulsión electrón-electrón del hamiltoniano. Hartree rescribió este término como una expresión que describe la repulsión que un electrón siente desde la posición media de los otros electrones. En otras palabras, el término de la repulsión electrón-electrón se sustituye por un campo de energía potencial producido por las posiciones medias de los electrones restantes. Es una modificación en la que se describe la función de onda de varios electrones como un producto antisimetrizado (determinante de Slater) de funciones de onda de un electrón. 22 • Aproximación de los electrones independientes Otra aproximación consiste en considerar los electrones independientes asumiendo que el comportamiento de los orbitales moleculares resulta de la combinación lineal de los orbitales atómicos que lo forman. De esta forma cada electrón estará en un orbital distinto. Así, la función de onda del sistema se puede escribir como el producto de las funciones de onda de cada partícula. • Aproximación de la separación de orbitales  Para poder caracterizar la contribución  de un enlace, se puede considerar la separación de las contribuciones  y . MÉTODOS BASADOS EN LA FUNCIÓN DE ONDA Tras plantear la ecuación de Schrödinger y aplicar la aproximación de Born-Oppenheimer, se divide el Hamiltoniano electrónico en distintos términos, de los cuales, el correspondiente a la repulsión interelectrónica no tiene solución exacta. 25 Metodología El método HF ignora la repulsión interelectrónica, también conocida como correlación de electrones. La energía de correlación de electrones se define como la diferencia entre la energía exacta y la energía en el límite de HF.22 Método de Hartree-Fock Se emplea entonces el modelo de Hartree-Fock. El concepto en el que se fundamenta la teoría Hartree-Fock (HF) reside en que cada electrón percibe al resto como un campo promedio, lo que permite un enorme progreso en la realización de los cálculos de orbitales moleculares. El principal defecto del método HF es que no trata correctamente la correlación de electrones: se considera que cada electrón se mueve en un campo electrostático representado por las posiciones medias de los otros electrones, considerando que de hecho los electrones se evitan unos a otros mejor de lo que predice este modelo, ya que cualquier electrón A realmente ve cualquier otro electrón B como una partícula en movimiento y los dos se ajustan mutuamente (correlacionan) sus movimientos para minimizar su energía de interacción. Por esta razón, la energía calculada resulta siempre mayor que la verdadera energía que posee el sistema, debiendo procurar minimizar el resultado para cometer el menor error posible. Para ello se plantea el determinante secular cuya resolución puede realizarse por distintos métodos.23,20 En el método de Hartree-Fock, la función de onda molecular total se aproxima como un determinante de Slater compuesto de orbitales de espín ocupados (cada orbital de espín es un producto de un orbital espacial convencional y una función de espín). Para poder utilizarlos en cálculos prácticos, los orbitales espaciales se aproximan como una combinación lineal (una suma ponderada) de funciones de base. Estos se identifican generalmente con orbitales atómicos, pero pueden ser realmente cualquier función matemática que da una función de onda razonable.23 Métodos Post Hartree-Fock Los métodos post-HF realizan el cálculo de la energía de correlación. De nuevo, se encuentran distintas metodologías como variacionales, perturbativos y de agregados acoplados. Para este trabajo se ha empleado el método MP2 que detallaremos a continuación. 32 Metodología electrones de valencia se deslocalicen. Una solución es ampliar el tamaño del conjunto de bases, creando bases de valencia desdoblada (múltiple zeta) en las que se representa por una parte el núcleo con una función base que es contracción de distintas funciones gaussianas, y por otra los orbitales de valencia con varias funciones.32,33 En este trabajo se han utilizado bases de Pople y bases de Ahlrichs. Para un mayor detalle, consultar el Material adicional. 5.2 Espectroscopía de rotación Para poder comprender la parte experimental debemos conocer qué datos extraer del estudio computacional. Para ello debemos definir la espectroscopía de rotación, así como de qué depende la obtención del espectro de la molécula o qué información nos proporciona. Además, puesto que este trabajo se desarrolla mediante expansión supersónica y ablación láser, comentaremos sus aspectos más relevantes. Fundamentos En un espectro rotacional las señales observadas son debidas a la absorción o emisión de energía por parte de las moléculas al cambiar su nivel de energía de rotación. Estos niveles vienen dados por la ecuación de Schrödinger independiente del tiempo. Esta ecuación predice qué funciones de onda pueden formar estados estacionarios. Matemáticamente la ecuación se escribe de la siguiente forma: Ĥ ∗ 𝛹 =𝐸∗ 𝛹 (10) Siendo Ψ la función de onda de un determinado nivel energético, denominada normalmente función propia o eigenfunción del estado estacionario; E: es la energía del estado estacionario. Se denomina valor propio o eigenvalor; Ĥ es el operador hamiltoniano, el cual corresponde al observable “energía”, es decir, la suma de las energías cinética y potencial del sistema bajo estudio. En el estudio de sistemas en rotación, el parámetro más importante para la energía es el momento de inercia (I) dado por la expresión: 𝐼𝐴,𝐵,𝐶 =Σ𝑚𝑖𝑟𝑖2 (11) donde 𝑚𝑖 es la masa de cada átomo y 𝑟 la distancia desde el átomo considerado al eje correspondiente. 33 Metodología El problema de rotación se trata matemáticamente en términos de un sistema de eje fijo de molécula con su origen en el centro de masa de la molécula y sus ejes orientados a lo largo de los ejes inerciales principales. Estos ejes son designados por a, b, y c. Las constantes rotacionales A, B y C, podemos definirlas según la ecuación (12), siendo inversamente proporcionales a los momentos de inercia Ia, Ib e Ic, respectivamente. 𝐵 = ℎ 8𝜋2𝐼𝐵 (12) siendo ℎ es la constante de Plank e 𝐼 es el momento de inercia en el eje B. La fórmula es análoga para las constantes rotacionales A y C. Estos parámetros son específicos de cada estructura, ya que dependen de la distribución espacial de las masas, por lo que permiten realizar una predicción de las transiciones rotacionales, que por comparación con la obtención experimental nos permitirá identificar los confórmeros analizados. Debemos analizar a su vez la intensidad de las transiciones, la cual está relacionada con la proyección del momento dipolar de la molécula a lo largo de los ejes, µa, µb y µc, debido a que la intensidad de la transición es proporcional a la integral momento de transición ⟨ψ1│µa,b,c│ψ2⟩, donde ψ1 y ψ2 es la función de onda de los estados inicial y final respectivamente. 34 Además, las intensidades dependen de la población del estado inferior de una transición. Para obtener la población NJ del nivel J relativa a N0 se aplica la ley de distribución de Boltzmann: 𝑁𝑗 𝑁0=(2J+1)exp (−𝐸𝑟 𝑘𝑇) (13) donde (2J+1) es la degeneración del nivel J. Como se menciona en el siguiente apartado, en este trabajo las transiciones que tendrán lugar vendrán dadas desde estados iniciales bajos, pues serán los únicos con la suficiente población para dar una intensidad de línea adecuada. Esto es debido a que se ha utilizado expansión supersónica, en la que se producen colisiones entre la muestra y el gas portador de forma que se enfrían las moléculas para adquirir la velocidad del gas portador. A causa de este 34 Metodología enfriamiento, los niveles rotacionales y vibracionales de la muestra pasan al nivel fundamental. 35 Para que una molécula proporcione un espectro de rotación debe tener un momento dipolar permanente, siendo este el requisito principal. Además, debemos tener en cuenta que no todas las transiciones están permitidas, hay unas reglas de selección que deben cumplir. Para describir las reglas de selección hay que tener en cuenta la variación en los números cuánticos del momento angular, J, y la proyección del momento angular sobre el eje z de la molécula, K.36 ΔJ= -1,0,1: Proporciona las ramas P, Q y R. o Las transiciones de tipo a poseen las siguientes reglas de selección: ΔKa=0; ΔKc = ±1. o Las de tipo b: ΔKa = ±1; ΔKc = ±1. o Y las de tipo c: ΔKa = ±1; ΔKc = 0. De esta forma, las transiciones de cada tipo dependen de la proyección del momento dipolar a lo largo del eje que les corresponde. En conclusión, tanto la intensidad de las transiciones como si estas son de tipo a, b o c, proporcionan información sobre las componentes del momento dipolar de la estructura molecular, permitiendo un apoyo extra en la identificación de los confórmeros, además de las constantes de rotación.35 Expansión supersónica y ablación láser Para realizar el estudio conformacional de nuestra molécula mediante técnicas espectroscópicas debemos tener dos precauciones, que la molécula no se descomponga a la hora de volatilizar la muestra, y que la molécula no presente interacciones con el entorno, es decir condiciones de aislamiento. Estas dos condiciones se desarrollan a continuación. Se denomina ablación láser a la eyección de material desde una superficie sólida como resultado de la irradiación producida por medio de un rayo láser. La ablación con láser puede proceder fototérmicamente, utilizando energía fotónica para calentar la superficie, o fotoquímicamente, utilizando energía fotónica sin calentamiento para romper los enlaces químicos dentro de la superficie. Esta segunda opción es de especial importancia a la hora de 35 Metodología estudiar compuestos biológicos, pues se descomponen con el calor. Así la ablación láser permite volatilizar parte de las moléculas neutras mediante pulsos de radiación, que de otra forma no podrían llevarse a fase gas, sin deteriorarlas.37 Para poder realizar el estudio conformacional de una molécula no deben darse interacciones de la molécula con el entorno, pues influiría en las conformaciones. Necesitamos entonces condiciones de aislamiento. Para ello se dispone de aparatos que permiten introducir la muestra a través de un jet supersónico. Esto consiste en la expansión adiabática de un gas portador, el cual contiene una pequeña proporción de la muestra a elevada presión en un recinto de alto vacío al pasar por un pequeño orificio llamado Nozzle, originando su expansión supersónica.34 Las moléculas de la muestra soportan un fuerte enfriamiento de los grados de libertad rotacionales, vibracionales y traslacionales. Este hecho proporciona una serie de ventajas, como una mayor población del nivel fundamental que aumenta la intensidad de las transiciones fundamentales, haciendo además que el espectro se simplifique. Además, se produce un gran incremento de la velocidad (alcanza velocidades supersónicas) y la direccionalidad de esta. Una vez lograda la expansión supersónica se crea una zona libre de colisiones en la que el entorno en el que se encuentran las moléculas es el propicio para este tipo de espectroscopía. 38 Rotación interna La rotación interna consiste en una vibración en la que varias disposiciones (n) son equivalentes entre sí, conectándose mediante el movimiento realizado por la molécula, siendo el ángulo de rotación interna (α) la coordenada que describe dicho movimiento. La función del potencial es simétrica y periódica con el ángulo α, siendo el máximo de potencial la barrera que impide el movimiento. En algunos casos esta barrera es baja, por lo que el sistema puede pasar de un mínimo a otro por medio del efecto túnel. Este suceso causa que los niveles cercanos a la barrera se dividan en n componentes. En el caso de la NAC puede observarse rotación interna debido a la rotación del grupo metilo (Figura 14). Cada hidrógeno puede adoptar una posición equivalente a la de los otros, de forma que habría tres mínimos equivalentes. Esto da lugar a una función de energía potencial en tres partes, con tres mínimos equivalentes y tres máximos equivalentes. 36 Metodología Como la barrera de potencial es suficientemente pequeña, la rotación da lugar a desdoblamientos hiperfinos en el espectro de rotación. Los niveles rotacionales se dividen en un nivel no degenerado de componente A y un nivel doblemente degenerado de componente E, como se observa en la Figura 15.39 En el espectro cada transición rotacional aparece desdoblada en dos componentes, haciendo más compleja su resolución.40,41 Figura 15. Función del potencial proporcionado por la rotación interna de un grupo metilo al cambiar el ángulo  Figura 14.N-acetilcisteína. Destacado el grupo metilo que ocasiona la rotación interna. 37 Resultados 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Búsqueda conformacional Aunque la labor experimental se desarrolló a la par que la computacional, primero se introducirá la parte computacional para facilitar la lectura. En este trabajo se ha estudiado la molécula N-acetilcisteína de fórmula molecular: C5H9NO3S, con un total de 18 átomos en su estructura. Como puede verse en la Figura 16, se trata de una estructura con bastantes enlaces simples por lo que cabe esperar que pueda dar lugar a múltiples confórmeros debido a sus posibles torsiones. Debido al elevado número de torsiones, en primer lugar, se llevaron a cabo cálculos de mecánica molecular, para dilucidar las posibles estructuras que posee la molécula, para después proceder a optimizarlas. El primer paso fue la construcción de la molécula con el programa Maestro de Schrödinger. Posteriormente se procede a lanzar un cálculo de mecánica molecular empleando distintos campos de fuerza. Debido a que la molécula posee distintos grupos funcionales, será muy útil para evaluar la eficacia de cada campo de fuerza. Se emplearon los siguientes: -El campo de fuerzas de MMFFs. -El campo de fuerzas de AMBER -Los campos de fuerzas: OPLS, OPLS 2005 y OPLS3. En todos los casos se estableció un umbral de energía de 30 KJ/mol por encima del cual no se consideran dichas estructuras. Se realizará un análisis más detallado sobre las diferencias observadas con cada campo de fuerza en la sección 6.6, una vez se haya realizado la asignación experimental, a fin de contrastar los resultados. Figura 16. Posibles torsiones N-acetilcisteína 38 Resultados Para una mayor facilidad de lectura y organización se usará el AMBER como referencia, al ser una metodología que, se adelanta, ha encontrado la estructura más estable, además de ser la que más confórmeros ha proporcionado. En total se obtuvieron 70 estructuras las cuales se re-optimizaron mediante DFT, con el funcional B3LYP y la base cálculo de Ahlrichs, concretamente, el Def2tzvp. A pesar de comenzar con 70 estructuras iniciales, varias convergieron a la misma, obteniendo 50 estructuras distintas. En la Figura 17 se muestran las ocho estructuras más estables y las dos más inestables. La Tabla 1 recoge sus parámetros espectroscópicos más relevantes. El resto de las estructuras se muestran en el Anexo 10.1. Confórmero 8 Confórmero 1 Confórmero 7 Confórmero 23 Confórmero 11 Confórmero 50 Confórmero 65 Confórmero 37 Confórmero 63 Confórmero 44 Figura 17.Confórmeros más estables de la N-acetilcisteína (8 primeros) y los dos más inestables (2 últimos). 39 Resultados Confórmero 8 1 7 11 23 50 65 37 63 44 A(MHz) 1500.5 1436.2 1424.1 1188.0 1517.9 1870.3 1494.2 1413.8 1224.1 1036.5 B(MHz) 844.0 783.4 785.3 938.2 839.5 669.0 769.4 819.2 1131.2 1002.9 C(MHz) 604.5 636.4 637.9 563.7 606.7 556.8 537.4 630.4 752.7 603.5 µA(D) -1.1 0.8 2.0 1.5 -1.2 -3.0 -0.8 2.2 0.0 0.1 µB(D) 4.4 -1.4 -1.4 5.0 5.6 4.6 1.2 0.9 0.7 -3.2 µC(D) -1.1 1.0 0.8 -0.1 -1.8 1.8 0.7 0.0 -3.2 -2.9 ∆E(cm-1) 0.0 775.1 963.2 867.2 1006.2 1031.9 1156.7 1242.8 3338.5 3423.0 ∆EZPE(cm-1) 0.0 552.5 709.7 762.7 940.8 959.0 1010.3 1018.5 3110.0 3176.7 ∆G(cm-1) 0.0 140.6 203.9 567.4 824.5 858.3 769.3 410.5 2866.2 2576.9 Tabla 1. Parámetros espectroscópicos calculados y energías relativas calculadas con optimización a nivel B3LYP-GD3/ Def2tzvp. Se muestran los 8 confórmeros más estables de la NAC. Los dos más inestables aparecen a la derecha. 6.2 Análisis de las interacciones predominantes Como puede verse en la Figura 17, el confórmero más estable, la estructura 8, presenta una serie de interacciones mediante varios enlaces de hidrógeno intramoleculares que estabilizan mucho a la molécula. El H carboxílico queda estabilizado por el oxígeno de la amida, el H unido al nitrógeno de la amida queda estabilizado por el azufre, y el H del grupo sulfhidrilo interacciona con el oxígeno del carboxilo. Además, la estructura se dispone de manera que sus H más ácidos quedan protegidos en una especie de ciclo de interacciones electrostáticas que refuerzan la interacción, también conocido como red cooperativa de enlaces de hidrógeno. Además, la proximidad de los grupos hace posible que la distancia de enlace sea mucho menor, dando un mejor solapamiento de los orbitales que forman el enlace. El siguiente confórmero más estable es la estructura 1. Podemos ver que, al igual que en el confórmero anterior, la estructura presenta tres enlaces de hidrógeno intramoleculares que estabilizan los hidrógenos más ácidos. La diferencia con la estructura 8 son los grupos entre los que se producen las interacciones. El H carboxílico queda estabilizado por el azufre, el H de la amida interacciona con el oxígeno del carboxilo, y el H del grupo sulfhidrilo interacciona con el nitrógeno. No obstante, la disposición de la estructura 8 permite una mayor flexibilidad de la molécula en las interacciones de hidrógeno lo cual permite que sean más direccionales 40 Resultados y disminuir las distancias de enlace, estabilizando la molécula enormemente. De hecho, entre el mínimo global y la siguiente estructura más energética hay más de 500 cm-1 de diferencia. A partir de la tercera estructura, el número de enlaces de hidrógeno intramoleculares comienza a disminuir. Como puede verse en la Figura 17, la molécula adopta muchísimas posibilidades con distintas combinaciones de enlaces de hidrógeno. Por ejemplo, la tercera estructura más estable, la estructura 7, se estabiliza mediante dos enlaces de hidrógeno, obteniendo una situación de mayor energía. Por tanto, estos confórmeros sería raro encontrarlos en el espectro experimental. Los confórmeros más inestables encontrados son las estructuras 63 y el 44. En ambos podemos ver que solo se estabilizan por un enlace de hidrógeno cuya interacción es además débil. Asimismo, adopta orientaciones en las que existen impedimentos estéricos justificando así su enorme desestabilidad. Este estudio conformacional muestra una fuerte correlación entre el número de enlaces intramolecular y la estabilización de los confórmeros. Además, las estructuras obtenidas nos permiten realizar una serie de observaciones generales: -El grupo NH y el grupo CO forman el grupo amida, prefieren disponerse en trans que en cis. -El H ácido del grupo carboxilo, el más ácido de la molécula, se estabiliza mayormente al interaccionar con el oxígeno del grupo amida por dos razones: - En primer lugar, porque se consigue una mayor estabilización cuando el átomo que interacciona con el H es más electronegativo. En la NAC el átomo más electronegativo es el oxígeno, por lo que los confórmeros más estables tendrán una interacción del H del ácido carboxílico con el grupo ceto de la amida. - En segundo lugar, la geometría de la molécula es la adecuada para que pueda disponerse de tal modo que la distancia del enlace de hidrogeno sea corta y por tanto fuerte. Una excepción a este hecho es el segundo confórmero, donde el H del ácido carboxílico interacciona con el azufre, aunque esta interacción no sea preferida se ve compensada por la 41 Resultados estabilización que se forma mediante un ciclo de interacciones que refuerza los enlaces de hidrógeno. -En ninguno de los confórmeros proporcionados se ha observado la interacción del H del ácido carboxílico con el nitrógeno. Esto es debido a que H del ácido carboxílico, al ser el más ácido de la molécula, se ve muy poco estabilizado al interaccionar con el N, más electropositivo que el O y el S. Los confórmeros con esta interacción han quedado fuera del umbral que ha considerado el programa de 30 kJ/mol. -El H ácido del tiol también se estabiliza más al interaccionar con oxígenos, más electronegativos que el nitrógeno, concretamente con los del ácido carboxílico pues se encuentran más cerca que el oxígeno del grupo amida. Una excepción es el segundo confórmero más estable, donde el H acido interacciona con el nitrógeno, viéndose esta interacción solo en los confórmeros de mayor energía. 6.3 Predicción del espectro Para saber el rango de medida y poder realizar la asignación del espectro de manera más sencilla, será conveniente realizar una predicción previa. Como el estudio se llevó a cabo mediante expansión supersónica, la distribución conformacional deberá reflejar las poblaciones relativas si las barreras de interconversión entre confórmeros son lo suficientemente altas. Asimismo, los confórmeros más abundantes y poblados serán los más estables. Debido a ello la predicción se realiza comenzando por el confórmero de menor energía, es decir, el confórmero 8. Para realizar la predicción, se necesitan los datos de las constantes rotacionales del confórmero a analizar, las cuales se calculan durante la optimización geométrica. Los valores de las constantes rotacionales, junto con los momentos dipolares, son claves para interpretar los espectros experimentales. Para calcular las frecuencias a las que aparecerán las distintas transiciones rotacionales y su intensidad se ha empleado en este trabajo el programa JB95. Fijándonos en las componentes del momento dipolar eléctrico (Tabla 1), podemos observar que el momento dipolar de tipo b es considerablemente mayor que a y c, por lo que en nuestro espectro predominarán las transiciones de tipo b. La Figura 18 muestra dicha predicción, 48 Resultados • El nivel de cálculo DFT descrito durante este trabajo, el funcional B3LYP con una base cálculo de Ahlrichs, concretamente: Def2tzvp, añadiendo las dispersiones de Grimme y Becke Johnson. Los resultados se muestran en el Anexo 10.2, mientras que la Tabla 5 muestra una comparativa para el confórmero más estable observado experimentalmente. Experimental B3LYP-GD3/Def2tzv MP2/6-311++G (d, p) B3LYP/6-311++G(d, p) A(MHz) 1508.75897 1500 1507 1494 B(MHz) 843.62143 844 843 839 C(MHz) 606.35637 604 606 602 A(D) No observado -1.1 -0.9 -1.1 B(D) Observado 4.4 -4.3 -4.4 C(D) No observado -1.1 1.0 1.2 Tabla 5. comparativa mediante el empleo de distintas metodologías para el confórmero más estable de la NAC. Podemos ver que todos los niveles de cálculo y las distintas bases aportan resultados similares en cuanto a las constantes rotacionales y momentos dipolares, con B3LYP/6-311++G (d, p) alejándose un poco más. Por otro lado, la metodología MP2 proporciona los resultados más precisos estructuralmente, pero, sin embargo, no energéticamente. El nivel de cálculo MP2/6311++G da como confórmero más estable la estructura 1 (ver anexo 10.2), estructura que no ha sido encontrada experimentalmente, mientras que la estructura 8 aparece predicha a 345 cm-1, es decir, con una población baja. Esto deja de manifiesto que no existe actualmente una metodología que proporcione todas las “respuestas”, en este caso, estructura y energía. Curiosamente, el nivel de cálculo B3LYP/6-311++G (d, p), establece la estructura 1 por encima de la estructura 8 a 314 cm-1, es decir, lo opuesto a MP2. Por lo tanto, el nivel de cálculo B3LYPGD3/Def2tzv es el que obtuvo mejores resultados, pues el confórmero 8 se ha observado experimentalmente con unas constantes rotacionales muy próximas a las obtenidas experimentalmente, mientras que la estructura 1 no ha sido hallada a pesar de los esfuerzos, tal y como predice esta metodología. Finalmente, mencionar que todas las metodologías empleadas predicen una estabilización entrópica (ver la energía libre de Gibbs en el Anexo 10.2) de la estructura 1 frente a la estructura 8. 49 Resultados 6.7 Estabilidad estructural de la NAC frente a la cisteína Habiendo obtenido la estructura del confórmero más estable de la NAC, se comparará su estructura con la de la cisteína. Las estructuras experimentales de la cisteína han sido ya caracterizadas42. En cualquier caso, los cálculos de la cisteína se han repetido utilizando la misma metodología que para la NAC (B3LYP-GD3/Def2tzvp). La Figura 24 recoge el confórmero obtenido en este estudio junto con las dos estructuras más estables detectadas de la cisteína. Como se puede observar, la estructura más estable y observada de la NAC y la estructura 22 de la cisteína son muy similares. Podemos observar que introducir el grupo acetato a la cisteína para formar la NAC, proporciona mayor estabilidad a todos los enlaces de hidrógeno de la molécula, pues en la estructura 22 al eliminar la interacción entre el H ácido del ácido carboxílico y el nitrógeno la molécula cambia de disposición de tal forma que el resto de las interacciones, que sí se mantienen respecto a la cisteína, se ven reforzadas al disminuir la distancia del enlace de hidrógeno. Además, ahora el H del ácido carboxílico, que es el H de mayor acidez de la molécula, interacciona con un oxígeno en vez de con un nitrógeno. Como el oxígeno es más electronegativo el enlace de hidrógeno es más fuerte, provocando una mayor estabilización. Para corroborar la existencia de estas interacciones se realiza un NCI Plot (Non-Covalent Interactions) a los dos confórmeros más estables de la cisteína y al confómero de la NAC. La comparación se muestra en la Figura 25. El H del tiol en ambos casos queda estabilizado por un oxígeno, dando lugar a una interacción débil representada en verde. El programa utilizado Confórmero 8 NAC. AMBER Confórmero 22, el más estable de la cisteína. Confórmero 18, el segundo más estable de la cisteina. Figura 24.Comparación del confórmero más estable de NAC junto con los dos confórmeros más estables de la cisteína. 50 Resultados representa las interacciones más fuertes en azul, por lo que podemos confirmar que en la NAC el tiol está más estabilizado. Aunque especulativo, podemos acabar el trabajo con una posible relación entre estas diferencias observadas en las estructuras de las dos biomoléculas y el papel que desempeñan biológicamente. Como ya hemos mencionado, el confórmero más estable de NAC tiene sus tres H ácidos protegidos. Esta estabilidad en concreto del H del grupo tiol sería la responsable de que la NAC no dimerice creando puentes disulfuro en disolución tal y como hace la cisteína cuyo grupo tiol tiene una interacción muy débil, enlace intramolecular más fácil de “romper”. El hecho de que la NAC no se dimerice12 es importante, pues si esto ocurriera la actividad antioxidante de la NAC quedaría inactiva. Por otro lado, se sabe que la cisteína dimeriza en el entorno extracelular, a través del grupo tiol. Una hipótesis para explicar este hecho es considerar la mayor distancia del enlace de hidrógeno, que provoca que el enlace sea más débil, y por tanto más susceptible a deprotonación, que es de 2.749 Å para el confórmero 22 frente a 2.440 Å para la NAC. Cisteína confórmero 18. Cisteína confórmero 22. NAC. Confórmero 8. Figura 25.Comparación del análisis de interacciones no covalentes (NCI Plot) de los confórmeros más estables de cisteína y NAC. Las superficies en azul corresponden a fuerzas atractivas, las repulsiones se muestran en rojo y en tonos verdes se representan las interacciones débiles. 51 Conclusiones 7. CONCLUSIONES El estudio del panorama conformacional de la N-acetilcisteína dio como resultado 50 confórmeros estables por debajo de 30 KJ/mol para el campo de fuerzas AMBER. Entre los confórmeros obtenidos, se pueden diferenciar tres grupos. El primer grupo engloba a aquellos confórmeros que presentan tres enlaces de hidrógeno, estabilizando por tanto todos sus hidrógenos ácidos, estas son las estructuras más estables. Después, el segundo grupo está formado por aquellos confórmeros que solo estabilizan dos de sus tres hidrógenos ácidos. Finalmente, el tercer grupo contiene aquellos confórmeros que solo poseen un enlace de hidrógeno en su estructura, los más inestables. Esta búsqueda conformacional determinó el confórmero más estable de la NAC. Se ha obtenido el espectro rotacional de la NAC y se ha encontrado un confórmero. La asignación del espectro experimental confirmó el confórmero obtenido como el más estable. Los campos de fuerzas AMBER, OPLS, OPLS2005 y OPLS3 fueron capaces de encontrar la estructura observada experimentalmente, mientras que MMFFs no. La metodología MP2 predice la estructura observada considerablemente alta en energía, mientras que la teoría DFT da resultados correctos. Los cálculos computacionales indican que la NAC presenta rotación interna, pudiendo explicar el elevado número de líneas no asignadas. La comparación del confórmero más estable de la NAC, con el de cisteína al mismo nivel de cálculo, permitió plantear hipótesis sobre la mayor estabilidad de la NAC ante la oxidación y la dimerización, pudiendo ser debida a la mayor fuerza de enlace intramolecular del H del grupo tiol de la NAC. 52 Bibliografía 8. BIBLIOGRAFÍA (1) Liguori, I.; Russo, G.; Curcio, F.; Bulli, G.; Aran, L.; Della-Morte, D.; Gargiulo, G.; Testa, G.; Cacciatore, F.; Bonaduce, D.; Abete, P. Oxidative Stress, Aging, and Diseases. Clin. Interv. Aging 2018, Volume 13 (29), 757–772. https://doi.org/10.2147/CIA.S158513. (2) Bakadia, B. M.; Boni, B. O. O.; Ahmed, A. A. Q.; Yang, G. The Impact of Oxidative Stress Damage Induced by the Environmental Stressors on COVID-19. Life Sci. 2021, 264 (September 2020), 118653. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.118653. (3) Dominari, A.; Hathaway III, D.; Kapasi, A.; Paul, T.; Singh Makkar, S.; Castaneda, V.; Gara, S.; Mohan Singh, B.; Agadi, K.; Butt, M.; Retnakumar, V.; Chittajallu, S.; Taugir, R.; Khawar Sana, M.; Razzack, S.; Moallem, N.; Alvarez, A.; Talalaev, M. Bottom-up Analysis of Emergent Properties of N-Acetylcysteine as an Adjuvant Therapy for COVID-19. https://doi.org/10.5501/wjv.v10.i2.34. (4) Aldini, G.; Altomare, A.; Baron, G.; Vistoli, G.; Carini, M.; Borsani, L.; Sergio, F. NAcetylcysteine as an Antioxidant and Disulphide Breaking Agent: The Reasons Why. Free Radic. Res. 2018, 52 (7), 751–762. https://doi.org/10.1080/10715762.2018.1468564. (5) Poole, L. B. The Basics of Thiols and Cysteines in Redox Biology and Chemistry. Free Radical Biology and Medicine. Elsevier Inc. 2015, pp 148–157. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2014.11.013. (6) Altomare, A.; Baron, G.; Brioschi, M.; Longoni, M.; Butti, R.; Valvassori, E.; Tremoli, E.; Carini, M.; Agostoni, P.; Vistoli, G.; Banfi, C.; Aldini, G. N-Acetyl-Cysteine Regenerates Albumin Cys34 by a Thiol-Disulfide Breaking Mechanism: An Explanation of Its Extracellular Antioxidant Activity. Antioxidants 2020, 9 (5), 367. https://doi.org/10.3390/antiox9050367. (7) Lu, S. C. Regulation of Glutathione Synthesis. Molecular Aspects of Medicine. Pergamon February 1, 2009, pp 42–59. https://doi.org/10.1016/j.mam.2008.05.005. (8) Balsamo, R.; Lanata, L.; Egan, C. G. Mucoactive Drugs. European Respiratory Review. European Respiratory Society June 1, 2010, pp 127–133. https://doi.org/10.1183/09059180.00003510. (9) Yuan, S.; Hollinger, M.; Lachowicz-Scroggins, M. E.; Kerr, S. C.; Dunican, E. M.; Daniel, B. M.; Ghosh, S.; Erzurum, S. C.; Willard, B.; Hazen, S. L.; Huang, X.; Carrington, S. D.; Oscarson, S.; Fahy, J. V. Oxidation Increases Mucin Polymer Cross-Links to Stiffen Airway Mucus Gels. Sci. Transl. Med. 2015, 7 (276), 276ra27-276ra27. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3010525. (10) Putzu, M.; Gräter, F.; Elstner, M.; Kubař, T. On the Mechanism of Spontaneous ThiolDisulfide Exchange in Proteins. Phys. Chem. Chem. Phys. 2018, 20 (23), 16222–16230. https://doi.org/10.1039/c8cp01325j. (11) de Andrade, K. Q.; Moura, F. A.; dos Santos, J. M.; de Araújo, O. R. P.; Santos, J. C. de F.; Goulart, M. O. F. Oxidative Stress and Inflammation in Hepatic Diseases: Therapeutic Possibilities of N-Acetylcysteine. International Journal of Molecular 53 Bibliografía Sciences. MDPI AG December 18, 2015, pp 30269–30308. https://doi.org/10.3390/ijms161226225. (12) Samuni, Y.; Goldstein, S.; Dean, O. M.; Berk, M. The Chemistry and Biological Activities of N-Acetylcysteine. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 2013, pp 4117– 4129. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.04.016. (13) Suhail, S.; Zajac, J.; Fossum, C.; Lowater, H.; McCracken, C.; Severson, N.; Laatsch, B.; Narkiewicz-Jodko, A.; Johnson, B.; Liebau, J.; Bhattacharyya, S.; Hati, S. Role of Oxidative Stress on SARS-CoV (SARS) and SARS-CoV-2 (COVID-19) Infection: A Review. Protein Journal. Springer December 1, 2020, pp 644–656. https://doi.org/10.1007/s10930-020-09935-8. (14) Montaño, L. M.; Flores-Soto, E. COVID-19 y Su Asociación Con Los Inhibidores de La Enzima Convertidora de Angiotensina y Los Antagonistas de Los Receptores Para Angiotensina II. Rev. la Fac. Med. 2020, 63 (4), 30–34. https://doi.org/10.22201/fm.24484865e.2020.63.4.05. (15) Debnath, U.; Mitra, A.; Dewaker, V.; Prabhakar, Y. S.; Tadala, R.; Krishnan, K.; Wagh, P.; Velusamy, U.; Subramani, C.; Agarwal, S.; Vrati, S.; Baliyan, A.; Kurpad, A. V; Bhattacharyya, P.; Mandal, A. N-Acetyl Cysteine: A Tool to Perturb SARS-CoV-2 Spike Protein Conformation. 2021. https://doi.org/10.26434/CHEMRXIV.12687923.V2. (16) Beatriz de Pascual-Teresa. Nobel de Química 2013: Combinación de Métodos de Mecánica Molecular y Mecánica Cuántica Para Entender y Predecir Procesos Químicos Comple. An. Real Acedamia Farm. 2014, 80, 408–432. (17) Andrés Bort, J. M. (ed. .; Alvariño Herrero, J. M.; Andrés Bort, J. M.; Borondo Rodríguez, F.; Caballol Lorenzo, R.; Frau Munar, J. Química Teórica y Computacional, 1st ed.; Castelló de la Plana, U. J. I. S. de C. i P., Ed.; 2001. (18) Cramer, C. J. Essentials of Computational Chemistry; John Wiley & Sons Ltd, 2004. https://doi.org/10.1016/0025-5408(96)80018-3. (19) Ramachandran, K. I.; Deepa, G.; Namboori, K. Computational Chemistry and Molecular Modeling; Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2008. (20) Engel, T.; Reid, P.; Hehre, W. Química Física; Pearson, 2006. (21) Ponder, J. W.; Case, D. A. Force Fields for Protein Simulations. Adv. Protein Chem. 2003, 66, 27–85. (22) Bachrach, S. M. Computational Organic Chemistry, Second.; Wiley, 2014. (23) Lewars, E. G. Computational Chemistry: Introduction to the Theory and Applications of Molecular and Quantum Mechanics. Computational Chemistry: Introduction to the Theory and Applications of Molecular and Quantum Mechanics. 2011, pp 1–664. https://doi.org/10.1007/978-90-481-3862-3. (24) Orio, M.; Pantazis, D. A.; Neese, F. Density Functional Theory. Photosynthesis Research. 2009, pp 443–453. https://doi.org/10.1007/s11120-009-9404-8. (25) Bockstedte, M.; Kley, A.; Neugebauer, J.; Scheffler, M. Density-Functional Theory 54 Bibliografía Calculations for Poly-Atomic Systems: Electronic Structure, Static and Elastic Properties and Ab Initio Molecular Dynamics. Comput. Phys. Commun. 1997, 107 (1– 3), 187–222. https://doi.org/10.1016/s0010-4655(97)00117-3. (26) Singh, David J., Nordstrom, L. Density Functional Theory and Methods. In Planewaves, Pseudopotentials and the LAPW Method; Springer US, 1994; pp 5–21. https://doi.org/10.1007/978-0-387-29684-5_2. (27) Density Functional (DFT) Methods. (28) Grimme, S. Density Functional Theory with London Dispersion Corrections. Ltd. WIREs Comput Mol Sci 2011, 1, 211–228. https://doi.org/10.1002/wcms.30. (29) Grimme, S.; Antony, J.; Ehrlich, S.; Krieg, H. A Consistent and Accurate Ab Initio Parametrization of Density Functional Dispersion Correction (DFT-D) for the 94 Elements H-Pu. J. Chem. Phys. 2010, 132 (15), 1–20. https://doi.org/10.1063/1.3382344. (30) Becke, A. D.; Johnson, E. R. A Density-Functional Model of the Dispersion Interaction. J. Chem. Phys. 2005, 123 (15), 154101. https://doi.org/10.1063/1.2065267. (31) Grimme, S.; Ehlich, S.; Goerikg, L. Effect of the Damping Function in Dispersion Corrected Density Functional Theory. J. Comput. Chem. 2011, 32 (7), 1456–1465. https://doi.org/10.1002/jcc. (32) James B. Foresman; AEleen Frisch. Exploring Chemistry With Electronic Structure Methods: A Guide to Using Gaussian: Foresman, James B., Frisch, AEleen: 9780963676931: Amazon.Com: Books. (33) Engel, T. Quantum Chemistry. Pearson 2013, p 533. (34) Alonso, J. L.; López, J. C. Microwave Spectroscopy of Biomolecular Building Blocks. In Encyclopedia of Signaling Molecules; 2015; pp 2–4. https://doi.org/10.1007/128_2014_601. (35) Hollas, J. M. Modern Spectroscopy. Spectrochimica Acta Part A: Molecular Spectroscopy. Wiley and sons 1988, p 449. https://doi.org/10.1016/05848539(88)80069-2. (36) Atkins, P.; de Paula, J. Química Física, 8th ed.; Editorial Médica Panamericana, 2008. (37) Teresa Flores Reyes; Luis Ponce. Solución Láser Para Un Problema Espinoso, La Ablación Láser Como Método Para Remover Las Espinas Del Fruto de Tuna. GmbH & Co. 2011, p 126. (38) Stefano Rampino. Schematic diagram of a supersonic expansion from a nozzle. The change... | Download Scientific Diagram. (39) Pinacho Morante, P. Microsolvation of Biomolecular Models by Microwave Spectroscopy: Structure and Cooperative Effects. Tésis Dr. 2016. (40) Lin, C. C.; Swalen, J. D. Internal Rotation and Microwave Spectroscopy. Rev. Mod. Phys. 1959, 31 (4), 841–892. 55 Bibliografía (41) Lister, V. D. G.; Macdonald, J. N.; Owen., N. L. Internal Rotation and Inversion. An Introduction to Large Amplitude Motions in Molecules. Academic Press, London 1978. Angew. Chemie 1979, 91 (5), 450–451. https://doi.org/10.1002/ange.19790910533. (42) Goldsztejn, G.; Mundlapati, V. R.; Brenner, V.; Gloaguen, E.; Mons, M.; Cabezas, C.; León, I.; Alonso, J. L. Intrinsic Folding of the Cysteine Residue: Competition between Folded and Extended Forms Mediated by the-SH Group. Phys. Chem. Chem. Phys. 2020, 22 (36), 20284–20294. https://doi.org/10.1039/d0cp03136d. 56 Índice de esquemas, figuras, tablas y ecuaciones 9. ÍNDICE DE FIGURAS, TABLAS Y ECUACIONES Figura 1. Desacetilación de la NAC para dar cisteína. Fuente: A review on the possible molecular mechanism of action of N-acetylcysteine against insulin resistance and type-2 diabetes development. ............................................................................................................................................................... 7 Figura 2. Obtención de glutatión a partir de NAC. Fuente: Existing and potential therapeutic uses for N-acetylcysteine: The need for conversion to intracellular glutathione for antioxidant benefits .......... 9 Figura 3. Estructura química de las distintas formas de glutatión. a) Glutatión reducido (GSH), su grupo activo es el grupo SH. b) Glutatión oxidado, formado por dos moléculas de GSH unidas por un enlace disulfuro. (GSSG) ......................................................................................................................... 9 Figura 4. El estrés oxidativo causa una excesiva formación de enlaces disulfuro en la mucosa. Fuente: Oxidation increases mucin polymer cross-links to stiffen .................................................................... 11 Figura 5.Intercambio tiol disulfuro. ...................................................................................................... 11 Figura 6. La NAC rompe los puentes disulfuro. Fuente: N-Acetylcysteine as an antioxidant and disulphidebreaking agent: the reasons why ......................................................................................... 12 Figura 7. NAC, cisteína y GHS, oxidantes a través de un grupo tiol. Fuente: Oxidative Stress and Inflammation in Hepatic Diseases: Therapeutic Possibilities of N-Acetylcysteine ................................ 12 Figura 8. La proteína de espiga se une al ACE2 para entrar en las células. Fuente: COVID-19 y su asociación con los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y los antagonistas de los receptores para angiotensina II ............................................................................................................ 14 Figura 9. Diferencia en la interacción proteína-proteína entre el receptor ACE2(verde) y la proteína de espiga (azul) antes y después de la conjugación con NAC a través del mecanismo de intercambio de tiol. La línea roja muestra la distancia entre el terminal C y el terminal N de la proteína de espiga (rosa), antes (9 Å) y después (130,2Å) de la conjugación NAC. Fuente: N-acetyl cysteine: A tool to perturb SARS-CoV-2 spike protein conformation. ................................................................................ 14 Figura 10. Superficie de energía potencial (SEP). Fuente: Computational Chemistry and Molecular Modeling .............................................................................................................................................. 18 Figura 11. Términos fundamentales de un campo de fuerzas.Fuente: Dinámica molecular, Juan A. Bueren-Calabuig ................................................................................................................................... 20 Figura 12. Comparativa de los campos de fuerzas empleados en este trabajo. Pn es el polinomio de grado n utilizado................................................................................................................................... 22 Figura 13. En rojo podemos ver la STO, en azul la GTO. Fuente: Quantum Chemistry & Spectroscopy de Thomas Engel .................................................................................................................................. 31 Figura 14.N-acetilcisteína. Destacado el grupo metilo que ocasiona la rotación interna. .................... 36 Figura 15. Función del potencial proporcionado por la rotación interna de un grupo metilo al cambiar el ángulo  ......................................................................................................................................... 36 Figura 16. Posibles torsiones N-acetilcisteína ..................................................................................... 37 Figura 17.Confórmeros más estables de la N-acetilcisteína (8 primeros) y los dos más inestables (2 últimos). ............................................................................................................................................... 38 Figura 18. Transiciones de tipo b en la predicción del espectro de la N-acetilcisteína. ........................ 42 Figura 19. Barra de muestra compactada de la NAC. ........................................................................... 43 Figura 20. Espectro experimental de la NAC. ....................................................................................... 43 Figura 21. Algunas de las transiciones asignadas en el espectro experimental junto con su predicción. ............................................................................................................................................................. 44 Figura 22.Libre giro del carbono metílico. ............................................................................................ 46 Figura 23. Superficie de energía potencial relajada de la torsión del grupo metilo que dar lugar a rotación interna. .................................................................................................................................. 46 57 Índice de esquemas, figuras, tablas y ecuaciones Figura 24.Comparación del confórmero más estable de NAC junto con los dos confórmeros más estables de la cisteína. ......................................................................................................................... 49 Figura 25.Comparación del análisis de interacciones no covalentes (NCI Plot) de los confórmeros más estables de cisteína y NAC. Las superficies en azul corresponden a fuerzas atractivas, las repulsiones se muestran en rojo y en tonos verdes se representan las interacciones débiles. ............................... 50 Tabla 1.Parámetros espectroscópicos calculados y energías relativas calculadas con optimización a nivel B3LYP-GD3/ Def2tzvp. Se muestran los 8 confórmeros más estables de la NAC. Los dos más inestables aparecen a la derecha. ........................................................................................................ 39 Tabla 2. Transiciones asignadas. .......................................................................................................... 45 Tabla 3. Comparación de los parámetros espectroscópicos proporcionados para las dos estructuras más estables con los resultados experimentales. ................................................................................ 45 Tabla 4. Número de confórmeros aportado por cada campo de fuerzas. ............................................ 47 Tabla 5. comparativa para el confórmero más estable. ....................................................................... 48 Ecuación 1. Operador Hamiltoniano. ................................................................................................... 26 Ecuación 2. Energía en forma de expresión de Taylor en función del parámetro de perturbación. .... 26 Ecuación 3.Función de onda modificada en forma de expresión de Taylor en función del parámetro de perturbación.................................................................................................................................... 26 Ecuación 4. Expresión de Kohn-Sham. ................................................................................................. 28 Ecuación 5.Energía dispersiones Becke-Johnson (BJ). .......................................................................... 30 Ecuación 6. Expresión función de onda como combinación lineal de orbitales atómicos (LCAO). ....... 30 Ecuación 7.Expresión orbitales atómicos. ............................................................................................ 30 Ecuación 8. Parte radial funciones gaussianas (GTO). .......................................................................... 30 Ecuación 9. Contracción de funciones combinando distintas funciones gaussianas. ........................... 31 Ecuación 10. Ecuación de Schrödinger independiente del tiempo....................................................... 32 Ecuación 11. Energía es el momento de inercia (I)............................................................................... 32 Ecuación 12. Expresión constante rotacional B. ................................................................................... 33 Ecuación 13. Ley de distribución de Boltzmann ................................................................................... 33 64 10.2 Comparativa niveles de cálculo Datos proporcionados por el nivel de cálculo MP2/6-311++G (d, p). Confórmero 1 5 8 61 56 6 2 4 31 9 36 A(MHz) 1467 1453 1507 1476 1417 1526 1225 1055 1272 1526 1246 B(MHz) 775 781 843 829 789 787 884 966 950 712 971 C(MHz) 641 647 606 647 643 630 601 592 636 565 634 A(D) -0.5 -2.0 -0.9 -2.1 0.7 0.6 -2.4 -1.3 1.4 -0.6 -0.3 B(D) -1.2 -1.1 -4.3 -0.7 1.3 -1.2 -0.9 -1.6 -2.0 1.9 0.3 C(D) -1.2 -1.0 1.0 0.1 3.3 -2.2 -1.2 -2.5 -3.5 -0.8 -2.3 aa1 2 2 2 2 2 2 1 2 -3 2 -3 bb1 -3 -4 0 0 -4 -2 -1 -3 1 -1 1 cc1 1 2 -2 -2 2 -1 0 1 1 -1 2 E(cm-1) 0 282 111 363 688 638 909 912 936 976 1030 EZPE(cm-1) 0 216 345 392 645 662 900 903 923 959 1066 G(cm-1) 0 88 719 279 463 526 861 721 1027 362 1161 Confórmero 13 49 11 39 33 43 65 66 15 23 3 A(MHz) 1429 1872 1175 1242 1400 1843 1478 1534 1168 1532 1273 B(MHz) 774 671 948 976 804 735 781 708 1008 836 848 C(MHz) 540 564 573 639 618 615 542 569 641 609 621 A(D) -0.3 2.7 1.5 0.6 -2.5 3.0 1.1 1.2 -5.1 -1.2 -1.2 B(D) 3.4 -4.5 -4.8 1.0 -2.6 -0.4 1.3 2.0 -1.6 -5.6 -0.7 C(D) 1.2 1.9 -0.1 -3.7 -1.7 -3.5 -0.7 3.4 -2.2 1.7 -3.7 aa1 2 2 1 -2 2 2 2 2 -2 2 0 bb1 1 -3 0 2 -2 -4 1 -2 1 0 -2 cc1 -3 0 -1 0 0 2 -3 -1 1 -2 2 E(cm-1) 1179 962 996 1232 1122 1237 1165 1302 1099 1167 1338 EZPE(cm-1) 1109 1109 1138 1212 1224 1238 1260 1265 1301 1310 1313 G(cm-1) 822 1352 1285 1273 1189 1411 1298 1055 1453 1534 1248 65 Confórmero 24 10 53 25 20 67 52 68 32 45 57 A(MHz) 1171 1140 1219 1495 1217 1826 1262 1856 1443 1231 1076 B(MHz) 1006 906 990 721 896 738 886 671 756 1153 931 C(MHz) 639 591 639 564 599 613 601 572 637 761 602 A(D) -4.8 1.4 1.6 0.9 -2.7 1.1 1.6 2.8 -2.2 -1.9 -3.3 B(D) -0.4 0.0 -0.4 3.2 -0.1 -0.4 0.8 -5.5 -0.5 0.2 1.6 C(D) -2.7 -4.6 -2.3 4.0 -2.5 -1.9 4.2 1.0 3.9 4.0 2.1 aa1 -2 0 -3 2 1 2 0 2 2 1 1 bb1 1 -2 2 -1 -1 -4 0 -3 -4 -3 -3 cc1 1 2 0 -1 0 2 0 1 2 2 1 E(cm-1) 1167 1447 1514 1529 1612 1550 1667 1633 1719 1810 1769 EZPE(cm-1) 1355 1430 1465 1470 1568 1580 1654 1718 1751 1765 1824 G(cm-1) 1522 1005 1443 1153 1413 1705 1584 1855 1926 1955 1887 Confórmero 34 62 26 48 40 51 46 47 55 70 69 A(MHz) 1716 1854 1267 1346 1540 1045 1434 1733 1396 1447 1502 B(MHz) 736 733 901 840 786 942 752 659 772 778 697 C(MHz) 628 618 598 631 625 613 633 583 639 641 576 A(D) 4.3 2.7 3.4 -4.0 1.3 -2.5 -3.4 1.7 -0.9 1.0 2.1 B(D) -3.6 -1.4 -0.6 -1.7 2.5 1.1 -1.4 0.6 -0.7 0.6 -0.9 C(D) -2.8 -4.5 -2.8 -1.8 2.1 -0.1 4.2 1.7 1.8 0.5 2.8 aa1 2 2 0 2 2 0 2 2 2 2 3 bb1 -4 -4 -2 -4 -1 -2 -4 -4 -4 -3 -2 cc1 2 2 2 1 -1 2 2 2 2 1 0 E(cm-1) 1676 1975 1875 1915 1917 2006 2139 2084 2120 2352 2258 EZPE(cm-1) 1826 1897 1950 1978 2007 2037 2096 2139 2179 2246 2291 G(cm-1) 1994 1897 2018 1898 2093 1950 2019 2163 2185 2201 2278 Confórmero 63 64 44 58 A(MHz) 1259 1337 1045 1389 B(MHz) 1117 860 989 913 C(MHz) 758 652 614 731 A(D) 0.3 -2.6 0.6 5.4 B(D) 0.0 1.3 3.3 1.4 C(D) 3.1 2.1 3.0 4.9 aa1 1 2 -4 2 bb1 -3 -3 2 -4 cc1 2 1 2 1 E(cm-1) 2280 2560 2734 2858 EZPE(cm-1) 2304 2560 2759 2988 G(cm-1) 2542 2502 2556 3105 66 Datos proporcionados por con el nivel de cálculo B3LYP/6-311++G(d, p). Confórmero 8 1 7 37 11 42 50 56 65 23 2 A(MHz) 1494 1427 1415 1427 1179 1451 1864 1386 1486 1502 1232 B(MHz) 839 782 783 795 933 777 665 793 767 836 875 C(MHz) 602 635 636 621 562 606 555 637 536 603 595 A(D) -1.1 -0.7 -2.0 -2.3 1.6 -0.3 -3.0 0.9 0.9 -1.1 -2.4 B(D) -4.4 -1.4 -1.4 -0.8 -5.0 -0.7 -4.7 1.7 1.3 -5.8 -0.8 C(D) 1.2 -1.1 -0.9 0.2 0.1 2.4 -1.9 3.4 -0.7 1.9 -1.3 aa1 2 2 2 2 1 2 2 2 3 2 1 bb1 0 -3 -4 -1 1 -3 -2 -4 1 0 -1 cc1 -2 1 2 -2 -2 0 0 2 -3 -2 0 E(cm-1) 0 519 763 1000 924 1036 1010 1217 1142 1145 1373 EZPE(cm-1) 0 314 516 777 817 827 938 971 1013 1061 1130 G(cm-1) 76 0 106 203 692 298 915 538 874 1001 761 Confórmero 15 24 4 13 9 33 28 36 43 39 3 A(MHz) 1136 1135 1051 1425 1515 1379 1218 1194 1783 1219 1234 B(MHz) 1010 1010 955 767 705 801 962 979 730 961 862 C(MHz) 632 629 585 534 554 609 625 624 602 625 606 A(D) -5.0 -4.8 -1.5 -0.3 -0.6 -2.4 1.1 0.0 3.1 0.3 -1.2 B(D) -2.3 -1.0 -1.3 3.5 2.0 -2.8 -2.2 0.3 -0.6 1.2 -1.5 C(D) -2.2 -2.8 -2.6 1.3 -0.7 -1.8 -3.7 -2.4 -3.7 -4.0 -3.8 aa1 -2 -2 2 3 2 2 -3 -3 2 -3 1 bb1 1 1 -4 1 -1 -2 2 1 -4 2 -2 cc1 1 1 1 -3 -1 0 1 2 2 0 2 E(cm-1) 1221 1229 1498 1472 1514 1429 1651 1781 1836 1885 1921 EZPE(cm-1) 1169 1178 1256 1261 1278 1305 1416 1581 1623 1629 1653 G(cm-1) 1016 1024 721 888 763 960 1118 1272 1411 1288 1139 67 Confórmero 68 34 66 14 25 20 53 67 48 16 32 A(MHz) 1818 1687 1529 1072 1435 1190 1197 1764 1328 1178 1407 B(MHz) 667 729 694 956 755 896 973 732 815 907 762 C(MHz) 562 614 560 576 540 592 627 603 610 587 632 A(D) 3.0 4.4 1.3 -1.8 1.8 -2.7 1.4 1.0 -3.6 -1.6 -2.4 B(D) -5.8 -3.9 2.0 -0.6 4.5 0.1 -0.4 -0.6 -3.4 0.9 -0.4 C(D) 1.2 -2.7 3.6 4.6 2.9 -2.6 -2.5 -2.1 -1.8 -4.4 4.2 aa1 2 2 2 0 3 1 -3 2 2 0 3 bb1 -3 -4 -2 -3 0 -1 2 -4 -3 0 -5 cc1 1 2 -1 2 -3 0 1 2 0 0 2 E(cm-1) 1792 1806 1999 2001 2078 2126 2163 2179 2246 2379 2313 EZPE(cm-1) 1656 1714 1734 1736 1812 1835 1903 1981 2049 2080 2089 G(cm-1) 1521 1529 1208 1107 1306 1311 1520 1755 1582 1408 1858 Confórmero 27 26 40 45 47 51 62 70 46 55 64 A(MHz) 1115 1226 1499 1220 1685 1089 1766 1413 1387 1367 1315 B(MHz) 900 908 786 1135 658 903 727 784 759 775 850 C(MHz) 596 590 605 750 570 607 603 634 627 634 641 A(D) -3.4 3.4 1.1 -2.0 1.5 -2.5 2.9 0.9 -3.6 -0.9 -2.3 B(D) 2.1 -0.8 2.9 0.1 0.8 1.3 -1.7 0.4 -1.4 -0.8 1.9 C(D) 2.2 -3.0 2.5 4.3 1.8 -0.2 -4.7 0.6 4.5 1.9 2.4 aa1 1 0 2 1 3 0 2 2 3 3 2 bb1 -2 -2 -1 -3 -5 -2 -4 -3 -5 -5 -4 cc1 1 2 -1 2 2 2 2 1 2 2 2 E(cm-1) 2274 2353 2349 2500 2477 2521 2695 2707 2730 2679 2752 EZPE(cm-1) 2094 2184 2201 2278 2313 2326 2404 2408 2456 2472 2534 G(cm-1) 1835 1904 1962 2191 2043 1905 2034 2078 2056 2146 2207 Confórmero 69 60 58 63 44 A(MHz) 1495 1376 1376 1221 1038 B(MHz) 684 760 906 1125 996 C(MHz) 568 544 723 750 600 A(D) 2.1 4.1 5.8 0.1 0.4 B(D) -1.0 -0.1 1.3 0.6 3.3 C(D) 3.0 1.5 4.9 3.3 3.0 aa1 3 3 2 1 -4 bb1 -3 0 -4 -3 2 cc1 0 -3 1 2 2 E(cm-1) 2825 2888 2749 3039 3223 EZPE(cm-1) 2606 2655 2659 2820 2982 G(cm-1) 2111 2321 2513 2678 2469