Papel del estrés oxidativo y la peroxidación lipídica en la patofisiología de la esteatosis hepática metabólica

1 TRABAJO DE FIN DE GRADO DE MEDICINA “PAPEL DEL ESTRÉS OXIDATIVO Y LA PEROXIDACIÓN LIPÍDICA EN LA PATOFISIOLOGÍA DE LA ESTEATOSIS HEPÁTICA METABÓLICA” CARMEN DEL OLMO PUEBLA TUTORAS: ROCÍO ALLER DE LA FUENTE, MARTA MARTÍN-FERNÁNDEZ Universidad de Valladolid Curso 2022-2023 2 ÍNDICE I. RESUMEN ---------------------------------------------------------------------------------- 4 II. INTRODUCCIÓN ------------------------------------------------------------------------ 5 1. Características generales de la enfermedad ------------------------------ 5 2. Métodos diagnósticos en la NAFLD ----------------------------------------- 5 3. Mecanismos patogénicos ------------------------------------------------------ 6 III. HIPÓTESIS ------------------------------------------------------------------------------- 10 IV. OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------ 10 V. MATERIALES Y MÉTODOS --------------------------------------------------------- 10 1. Diseño del estudio -------------------------------------------------------------- 10 2. Criterios de inclusión y exclusión ------------------------------------------- 10 3. Aspectos éticos ------------------------------------------------------------------ 11 4. Biopsia hepática ----------------------------------------------------------------- 11 5. Elastografía de transición -----------------------------------------------------12 6. Parámetros bioquímicos -------------------------------------------------------12 7. Métodos no invasivos de esteatosis ---------------------------------------- 12 8. Métodos no invasivos de fibrosis -------------------------------------------- 12 9. Características antropométricas --------------------------------------------- 12 10. Determinaciones de moléculas de estrés oxidativo -------------------- 12 11. Análisis estadístico ------------------------------------------------------------- 13 VI. RESULTADOS ---------------------------------------------------------------------------- 13 1. Características clínicas -------------------------------------------------------- 13 2. Niveles de las moléculas de estrés oxidativo en NAFLD --------------16 3. Evaluación del riesgo de NASH score en función de los niveles de LPO -----------------------------------------------------------------------------18 VII. DISCUSIÓN -------------------------------------------------------------------------------- 19 VIII. CONCLUSIONES ------------------------------------------------------------------------ 21 IX. BIBLIOGRAFÍA --------------------------------------------------------------------------- 22 X. ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------ 24 3 ABREVIATURAS/SIGLAS 8-OHdG: 8-hidroxi-2-guanosina AGL: ácidos grasos libres APRI score: AST to Platelet Ratio Index (índice de los niveles de plaquetas y aspartato aminotransferasa) ABTS: ácido 2,2'-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) ChREBP: proteína de unión al elemento de respuesta a carbohidratos FADH2: flavín adenín dinucleótido FDA: Food and Drug Administration FLI score: Fatty liver index (índice de hígado graso) FIB4 score: Fibrosis-4 (índice de hígado fibrótico) FRAP: poder antioxidante reductor férrico GOT: transaminasa glutámico-oxalacética GGT: gamma-glutamil transpeptidasa GPT: glutamato-piruvato transaminasa HFS score: Hepamet Fibrosis Score HNE: 4-hidroxialqueno HOMA: índice de resistencia a la insulina HSI score: Hepatitis Steatosis Índex (índice de esteatosis hepática) IL-8: interleucina-8 IMC: índice de masa muscular LPO: lipoperoxidación LXR: receptor X hepático MDA: malondialdehído MAFLD/NAFLD: Metabolic (dysfunction) associated fatty liver disease (Enfermedad de hígado graso asociada a disfunción metabólica) NADH: nicotinamida adenina dinucleótido NAFLD score: Non Alcoholic Fatty Liver Disease Score NASH: Non-alcoholic steatohepatitis (Esteatohepatitis no alcohólica) NF-kB: factor nuclear potenciador de cadenas ligeras kappa de las células B activadas OOP: optimal operating point (punto óptimo de operación) PUFAs: poliinsaturated fatty acids (ácidos grasos poliinsaturados) RE: retículo endoplasmático ROS: reactive oxygen species (especies reactivas del oxígeno) SOD: superóxido dismutasa SREBP-1c: proteína de unión al elemento regulador del esterol TNF-α: factor de necrosis tumoral α 4 I. RESUMEN La enfermedad por hígado graso no alcohólico (NAFLD) se caracteriza por un exceso de grasa en el hígado (>5%), que puede progresar a esteatohepatitis, fibrosis, cirrosis y hepatocarcinoma. La alteración del metabolismo lipídico es un factor crucial, existiendo un desequilibrio entre la producción de lípidos y su degradación en el hígado. Debido a la falta de métodos no invasivos lo suficientemente fiables para el diagnóstico de esteatohepatitis (NASH), es fundamental encontrar marcadores analíticos capaces de discriminar aquellos pacientes con NASH. Se han obtenido muestras sanguíneas de 152 individuos caucásicos con NAFLD diagnosticada mediante biopsia hepática, en las que hemos estudiado diferentes metabolitos representativos del estrés oxidativo. Los resultados indican que los pacientes con NAFLD con un NASH score ≥4 (diagnóstico de NASH) tienen niveles mayores de lipoperoxidación (LPO). De hecho, un valor de peroxidación lipídica por encima del punto de corte de 315,39 μM, es un factor de riesgo independiente de una puntuación en el NASH score ≥4 (OR: 4,71, CI 95% 1,68-13,19, p=0,003). El área bajo la curva (AUC = 0,81; IC 95% = 0,73-0,89; p < 0,001) muestra la buena capacidad de discriminación del modelo (Figura 2). Por lo tanto, la interpretación de los mecanismos moleculares ligados a la inflamación basal presente en los pacientes con NASH se postularía como una fuente tanto de biomarcadores como de dianas terapéuticas en esta patología. ABSTRACT Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is characterized by an excess of fat in the liver, which can lead to steatohepatitis, fibrosis, cirrhosis and hepatocarcinoma. The disturbance of lipid metabolism is a crucial feature, there being an disparity between the production of hepatic lipids and its degradation. Due to the lack of dependable methods for the non-invasive diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis (NASH), we sought to identify serum markers that could be used to identify NASH patients. For that, we have analyzed the molecular activity underlying the basal inflammation that causes the disease. Blood samples have been obtained from 152 Caucasian individuals with NAFLD diagnosed by liver biopsy, in which we studied representative metabolites of oxidative stress. The results indicate that NAFLD patients with a NASH score ≥4 (NAH diagnosis) have higher levels of lipid peroxidation. In fact, a lipid peroxidation value above the cutoff point of 315.39 μM is an independent risk factor for a NASH score ≥4 (OR: 4.71; 95% CI 1.68-13.19; p=0.003). The area under the curve (AUC = 0.81; IC 95% = 0.73-0.89; p < 0.001) shows the good discrimination capacity of the model (Figure 2). For this reason, interpreting the molecular mechanisms underlying inflammation in 5 NASH patients could be considered as a source of biomarkers and therapeutic targets in this pathology. II. INTRODUCCIÓN 1. Características generales de la enfermedad La esteatosis hepática metabólica, también denominada enfermedad del hígado graso no alcohólica (NAFLD, -de sus siglas en inglés-), es una enfermedad del hígado de carácter crónico e inflamatorio, caracterizada por la presencia de un porcentaje de grasa en los adipocitos mayor del 5% (1–3), habiendo descartado para su diagnóstico otras causas como la ingesta de alcohol, la toma de fármacos esteatogénicos y otras causas de hepatopatía crónica. Forma parte de un espectro más amplio de enfermedades que pueden ir desde una simple esteatosis, hasta el estado final de cirrosis y hepatocarcinoma, habiendo pasado por la esteatohepatitis y la fibrosis (4). La progresión de una etapa a otra de la enfermedad se ve favorecida por la inflamación, y el daño celular y mitocondrial, que es causado por distintos mediadores inflamatorios y en el que juegan un papel importante los radicales libres y el estrés oxidativo. Su prevalencia global es de alrededor de un 25% (3), con una incidencia en aumento, simultánea al cambio en el estilo de vida y al incremento de la obesidad, Diabetes Mellitus (DM) tipo 2 y del síndrome metabólico en la población general. La presencia concomitante de DM tipo 2 incrementa el riesgo de progresión del daño hepático, constituyendo además un riesgo significante para enfermedades cardiovasculares (4). La obesidad central es un factor de riesgo conocido para NAFLD, sin embargo, también podemos encontrar esta enfermedad en pacientes con un índice de masa muscular (IMC) dentro de los límites de la normalidad. La prevalencia difiere también en cuanto al sexo y etnia de los pacientes, lo que sugiere que otros factores genéticos, epigenéticos y ambientales puedan estar también implicados en la patogenia (1). Diversas alteraciones intrahepáticas se pueden observar en la NAFLD como son el daño inflamatorio, muerte de células parenquimatosas, angiogénesis, fibrosis, o depósitos de lípidos en el citoplasma de los hepatocitos. 2. Métodos diagnósticos en la NAFLD Para realizar el diagnóstico de estos pacientes, la biopsia sigue siendo actualmente el “gold standard”, ya que permite identificar tanto inflamación como fibrosis en cualquiera de sus cuatro estadíos (F0 a F4) (4), siendo el principal factor que impacta en el pronóstico de estos pacientes. Sin embargo, el riesgo de complicaciones (dolor y 6 sangrado principalmente) y su invasividad limitan su uso. Otros métodos que intentan sustituirla en la práctica clínica son la ultrasonografía con elastografía, la metabolómica, las técnicas basadas en la resonancia magnética nuclear y la aplicación de índices clínico-analíticos no invasivos. No obstante, estas técnicas permiten identificar fibrosis o cirrosis, pero no esteatohepatitis, lo cual impide hacer un diagnóstico temprano de la NAFLD. La elastografía de transición tiene buena precisión para discriminar entre fibrosis moderada y severa, pero no es capaz de detectar niveles de esteatohepatitis (5). En cuanto a los índices no invasivos, son fórmulas generadas mediante la integración de parámetros clínicos y analíticos, siendo económicos y eficientes para evaluar la extensión de la fibrosis hepática y la esteatosis en la NAFLD. Un estudio reciente demostró que en relación con la biopsia, los índices de esteatosis son más sensibles y los de fibrosis más específicos (6). Lo más utilizados y a los que haremos referencia en este estudio son: el FLI score, HSI score, NAFLD score, FIB-4 score, HFS score y APRI score. La exactitud diagnóstica de estos todavía no está bien definida (6), aunque se cree que pueden ser de gran utilidad por su alto valor predictivo negativo a la hora de estudiar pacientes con fibrosis y el riesgo de progresión (7). Por todo ello, se están investigando nuevos marcadores que permitan identificar la enfermedad en todos sus estadíos ya que la detección y tratamiento en fases precoces condiciona el pronóstico de la enfermedad, puesto que es un problema de salud pública de primera magnitud (8). 3. Mecanismos patogénicos En cuanto al sustrato patogénico de la enfermedad, la resistencia a la insulina es el factor implicado mejor conocido. Se considera que juega un papel imprescindible en el origen de la enfermedad al favorecer que se produzca un acúmulo de lípidos fuera del tejido adiposo, principalmente en músculo e hígado, consecuencia de la liberación de ácidos grasos libres (AGL) desde el tejido adiposo al torrente sanguíneo (9). Actualmente, la hipótesis del doble impacto ha sido dejada atrás por la hipótesis de múltiple impacto “multiple parallel-hit” (1,2), la cual postula, que debido principalmente a la presencia de una cantidad significativa de grasa acumulada en los hepatocitos y a la resistencia hepática a la insulina, se producen diversas alteraciones que dan lugar a un desequilibrio entre los sistemas de protección frente a la lipotoxicidad y la producción de radicales libres en el tejido adiposo. Esto deriva en estrés oxidativo, estrés del retículo endoplasmático y apoptosis de los hepatocitos. La alteración del metabolismo lipídico es decisiva en la NAFLD. La esteatosis resulta de un desequilibrio entre la producción de lípidos y su degradación por parte del hígado. La 7 gran mayoría de los AGL que participan en la acumulación de lípidos proceden de ácidos grasos no esterificados y de reacciones de lipólisis periféricas (10). La lipólisis de los triglicéridos fuera del hígado está regulada además por la presencia de insulina en el tejido adiposo. Por ello, la resistencia a la insulina es un factor importante en la patogénesis. Esta disminución de la sensibilidad a la insulina es la causante de una lipólisis desmesurada, produciéndose una gran cantidad de ácidos grasos no esterificados que van al hígado, contribuyendo también la síntesis de novo y los lípidos de la dieta. Los hepatocitos sintetizan ácidos grasos a partir del exceso de glucosa y fructosa de la dieta. La resistencia a la insulina en el músculo esquelético genera hiperglucemia e hiperinsulinemia que van a inducir la activación tanto de la proteína de unión al elemento regulador del esterol (SREBP-1c), como de la proteína de unión al elemento de respuesta a carbohidratos (ChREBP) y el receptor X hepático (LXR) (10). Estas proteínas tienen un papel esencial en la regulación de la homeostasis glucídica y lipídica, así como en la presencia de inflamación. Al ser activadas, incrementan la expresión de múltiples enzimas lipogénicas con la consiguiente síntesis hepática de novo de ácidos grasos a partir de glucosa. Gran parte de estos ácidos grasos libres en el citoplasma de los hepatocitos son convertidos en Acyl-CoA que entra en la mitocondria, donde se lleva a cabo la β-oxidación, convirtiéndose en Acetil-CoA (10). El gran incremento de AGL hace que el hígado se sature y que la beta-oxidación (β-oxidación) que se produce en el hepatocito sea insuficiente. Como consecuencia, estos se acumulan y pueden ser utilizados como sustratos para generar especies lipotóxicas que inducirán estrés metabólico con posterior inflamación y muerte celular. Se ha demostrado una relación entre el grado de severidad de la esteatosis y el riesgo de aparición y progresión de la NAFLD, asociada también a los niveles de lipoperoxidación (9). Un hallazgo importante en la patogenia de la NAFLD es la disfunción mitocondrial. Las mitocondrias son las principales encargadas de mantener la homeostasis de las grasas, al llevar a cabo la β-oxidación lipídica en su interior, así como la transferencia de electrones y la producción de ATP y de especies reactivas del oxígeno (ROS). Los ROS son indispensables para la señalización celular y juegan un papel importante en diversos procesos fisiológicos como la proliferación y diferenciación celular, expresión de genes, modificación oxidativa post-traduccional de proteínas, defensa frente a patógenos o adaptación frente a la hipoxia y, por lo tanto, un cierto nivel de estas especies es necesario para mantener la homeostasis. A pesar de ello, pueden también afectar a la función normal de la célula, ocasionando una disfunción metabólica y generando vías de señalización inflamatorias. Esto ocurre cuando se produce un desequilibrio entre 8 estas moléculas prooxidantes y los sistemas antioxidantes. Este sistema protector está formado tanto por compuestos no enzimáticos (vitaminas y sus análogos: vitamina A y E (α-tocoferol), ascorbato, coenzima Q10, minerales: selenio, zinc, …), como por enzimas: superóxido dismutasa, catalasa, y glutation peroxidasa son las principales (11). La enzima superóxido dismutasa cataliza la reacción del radical superóxido (O2 -) a agua y peróxido de hidrógeno (H2O2). Este último, participa en la reacción de Fenton (11): en presencia de Fe2+, el H2O2 se reduce parcialmente a radical hidroxilo, un compuesto excesivamente tóxico, de modo que, antes de que esto ocurra, la catalasa promueve la conversión de H2O2 en agua y oxígeno molecular. En situación de estrés oxidativo continuo, la glutation oxidasa es esencial para neutralizar el H2O2 en agua y alcohol (12). Estudios han demostrado que el aumento en la expresión de estas tres enzimas está en relación directa con los niveles de ROS (11). El exceso de ROS por encima de su nivel basal produce modificaciones patológicas en lípidos, ADN y proteínas, esto es lo que conocemos como estrés oxidativo. El daño al ADN produce, además de mutaciones en los genes e inestabilidad de microsatélites, productos como 8-hidroxiguanina (8-OHdG) y 8-hidroxiadenina, al modificar las bases nitrogenadas. Los fosfolípidos de las membranas celulares son especialmente sensibles a este daño oxidativo debido a su gran cantidad de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), originándose la peroxidación lipídica. Es un proceso en el cual los radicales libres retienen electrones de los ácidos grasos y, por consiguiente, generan reactivos lipídicos intermediarios que continúan estas cadenas de reacciones dañinas. Los productos finales de la lipoperoxidación son el malondialdehído (MDA) y el 4hidroxialqueno (HNE) (12). De esta manera, se activan vías de señalización de muerte celular. Alteraciones en las mitocondrias, como el desequilibrio en favor de las moléculas prooxidantes, originan un aumento de ácidos grasos no metabolizados en el citosol, resultado del bloqueo de la β-oxidación y, en consecuencia, un aumento de producción de ROS. Este acúmulo de AGL confiere un aumento de la permeabilidad de la membrana interna mitocondrial, disipando así el potencial de membrana y disminuyendo la capacidad de síntesis de ATP. Esto promueve que se generen radicales libres, como el radical superóxido o el peróxido de hidrógeno. Así mismo, la β-oxidación genera nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavín adenín dinucleótido (FADH2) que transfieren sus electrones a la cadena transporte de electrones (9). El aumento de la oxidación de los ácidos grasos produce un incremento en el flujo de electrones en la cadena de transporte, proporcionando un mayor contacto entre estos y el oxígeno y aumentando una vez más la producción de especies reactivas. Todo ello contribuye a un ambiente de estrés oxidativo en los hepatocitos, generándose un círculo vicioso. 9 El retículo endoplasmático (RE), tiene un rol bien establecido en la patogenia de enfermedades metabólicas y cardiacas, en la que tiene especial participación el citocromo P450 (9,13), en especial CYP2E1, habiéndose demostrado una sobre expresión de este complejo en la NAFLD (14). Cambios en el balance del estrés oxidativo del RE tienen influencia sobre la función de las mitocondrias. En general, tres estrategias son frecuentemente utilizadas para determinar los niveles de estrés oxidativo: la detección directa de los niveles de ROS, la medición de moléculas que participan en este daño oxidativo, y la evaluación del estado antioxidante de las células (10). La detección directa de ROS es difícil debido a su corta vida media y su rápida reactividad con otros componentes. Por ello, la medición del estrés oxidativo evaluando el daño que estas especies causan en lípidos, ácidos nucleicos y proteínas es una buena alternativa. Los productos más frecuentemente medidos en este caso son el MDA y el HNE. La peroxidación lipídica genera como producto esos dos componentes que son aldehídos reactivos (formados por la interacción del oxígeno y H2O2 junto con los dobles enlaces de los ácidos grasos poliinsaturados). Tienen una vida media mayor, lo que aumenta el daño oxidativo que producen. Además de esto, la oxidación de ácidos nucleicos puede dar lugar a la rotura de hebras simples o dobles y la alteración de las bases. El 8-OHdG es un marcador del daño oxidativo en el ADN. Por último, se puede evaluar el estado antioxidante mediante la determinación de la actividad de enzimas antioxidantes (como la enzima superóxido dismutasa, la catalasa, y la glutation peroxidasa) o la capacidad antioxidante total. Por otro lado, se encuentran los mecanismos que dan lugar a la inflamación y fibrosis, provocando la progresión de la enfermedad. Los peróxidos lipídicos, MDA y HNE y las especies reactivas derivadas del CYP2E1 activan a las células estrelladas hepáticas, principales encargadas de la producción de colágeno y generación de fibrosis (14). Además, el estrés oxidativo se ha relacionado con la expresión de citoquinas proinflamatorias como la interleucina 8 (IL-8). Hasta un 40% de los pacientes con NASH, tiene niveles de hierro ligeramente elevados, que promueven la formación de ROS, la activación de las células de Kupffer (macrófagos hepáticos), así como la expresión del factor de necrosis tumoral α (TNF-α) y el Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NFkB), produciendo apoptosis de las células (14). Todo lo anterior favorece un estado de inflamación crónica con el consiguiente desarrollo de fibrosis y posterior cirrosis. 16 Plaquetas (células/mL) 254 000 (95 000) 242 000 (122 250) 0,346 CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS (n, %) Esteatosis leve (<33%) 60 (73,2) 9 (12,9) <0,001 Esteatosis moderada/severa (≥33%) 22 (26,8) 61 (87,1) <0,001 NASH (Inflamación + Balonización) 17 (20,7) 62 (88,6) <0,001 Fibrosis severa (≥F3) 8 (9,8) 18 (25,7) 0,009 Cirrosis 3 (3,7) 8 (11,4) 0,06 Fibroscan® (kPa) 8,1 (6,4) 10,35 (7,55) 0,033 ÍNDICES NO INVASIVOS (mediana, RQ) FLI score 85,26 (84,03) 81,36 (73,23) 0,68 HSI score 42,07 (33,22) 45,8 (28,73) 0,033 NFS score (NAFLD score) -3,59 (3,46) -2,05 (2,92) 0,005 FIB4 score 0,85 (0,64) 1,06 (1,15) 0,074 HFS score 0,019 (0,06) 0,12 (0,36) <0,001 APRI score -3,48 (6,72) 0,33 (10,55) <0,001 2. Niveles de las moléculas de estrés oxidativo en NAFLD De las moléculas de estrés oxidativo evaluadas, solo las referentes a la peroxidación lipídica: MDA y HNE han mostrados valores significativamente más elevados en el grupo de NASH score ≥4 (Tabla 2 y Figura 1). No se han encontrado diferencias destacables ni para la capacidad antioxidante total, medida mediante las técnicas FRAP y ABTS, ni para los niveles de la actividad de enzimas antioxidantes, superóxido dismutasa y catalasa. Tampoco en relación con los tioles ni con el 8-OHdG (Tabla 2 y Figura 1). Tabla 2. Niveles de moléculas de estrés oxidativo en pacientes segregados por un NASH score de 4. Los datos están representados como mediana y rango intercuartílico (RQ). FRAP: poder antioxidante reductor férrico, ABTS: ácido 2,2'-azinobis, SOD: superóxido dismutasa, 8-OHdG: 8-hidroxi-2-guanosina, MDA: malondialdehído, HNE: 4-hidroxialqueno. NASH Score <4. N=82 NASH Score ≥4. N=70 p-valor FRAP (μM) 409,64 (110,65) 392,71 (130,14) 0,826 ABTS (μM) 548,43 (477,99) 540,09 (556,05) 0,496 17 SOD (U/μM) 0,12 (0,06) 0,13 (0,06) 0,518 Catalasa (U/μL) 42,4 (45,84) 34,02 (39,65) 0,384 Tioles (μmol/L) 0,15 (0,18) 0,17 (0,17) 0,734 8-OHdG (pg/mL) 17 710 (24974) 19 935 (33 234) 0,370 MDA + HNE (μM) 120,48 (280,6) 230,14 (355,89) 0,024 Figura 1. Diagrama de cajas mostrando las moléculas de estrés oxidativo en los diferentes grupos de pacientes. 18 3. Evaluación del riesgo de NASH score en función de los niveles de LPO Posteriormente, se determinó cuál es el valor para el cual los niveles de peroxidación lipídica se asocian a la presencia de esteatohepatitis, definida por un NASH score ≥4. Se calculó el punto de corte, que resultó ser de 315. 39 μM. El análisis de regresión multivariable identificó los niveles de LPO por encima del OOP (LPO >315.39 μM) como un factor de riesgo independiente de una puntuación en el NASH score ≥4 (OR:4,71; CI 95% 1,68-13,19; p=0,003) en pacientes con NAFLD (Tabla 3). En la figura 2 se muestra la curva ROC de probabilidad predicha para el modelo de regresión logística multivariante realizado. El área bajo la curva (AUC = 0,81; IC 95% = 0,73-0,89; p < 0,001) muestra la buena capacidad de discriminación del modelo. Tabla 3. Análisis de regresión logística multivariable para evaluar la asociación de los niveles de LPO y el riesgo asociado a NASH ≥4. HSI score: Hepatitis Steatosis Índex, FIB4: Fibrosis-4, APRI: AST to Platelet Ratio Index, LPO: lipoperoxidación. OR IC 95% p-valor HSI 1,05 1,02-1,09 <0,001 FIB4 1,68 1,05-2,68 0,030 APRI 1,08 1,02-1,13 0,005 LPO > 315.39 μM) 4,71 1,68-13,19 0,003 Figura 2. Curva ROC para la probabilidad de predicción del método NASH score ≥4. 19 V. DISCUSIÓN Este estudio ha evaluado diferentes marcadores de estrés oxidativo en pacientes con NAFLD. Los hallazgos derivados de este trabajo revelaron que los pacientes con NAFLD con una puntuación NASH score ≥4 (esteatohepatitis) mostraban niveles significativamente más altos de peroxidación lipídica. De hecho, los niveles de LPO superiores a 315,39 μM son un factor de riesgo independiente para presentar una puntuación de NASH score ≥4. El estrés oxidativo es considerado uno de los principales factores en la fisiopatología de numerosas enfermedades inflamatorias crónicas del hígado, entre ellas la NAFLD. El deterioro crónico del metabolismo de los lípidos está estrechamente relacionado con alteraciones del equilibrio oxidante/antioxidante, que afecta a los orgánulos relacionados con el metabolismo, ocasionando lipotoxicidad celular, peroxidación lipídica, estrés del RE y disfunción mitocondrial (15). El aumento del almacenamiento de lípidos en los hepatocitos induce la producción de altos niveles de ROS, que se unen a los PUFAs formando peróxidos lipídicos, generándose así una reacción biológica en cadena de radicales libres. Los peróxidos lipídicos inestables se descomponen fácilmente en 4-HNE y MDA activos, lo que provoca daño celular (16). Este aumento de ROS desencadena las vías de estrés de los hepatocitos, favoreciendo la inflamación y la fibrogénesis, que contribuyen en la progresión a NASH (17). La disfunción mitocondrial que tiene lugar en los hepatocitos en pacientes con NAFLD, afecta al equilibrio lipídico en el hígado. El poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) desempeña un papel importante en la homeostasis mitocondrial. La apertura excesiva del mPTP conduce al estrés mitocondrial, incluyendo el deterioro de la función de la cadena de transporte de electrones, la inflamación mitocondrial y la generación de ROS (16). Los fosfolípidos de la membrana mitocondrial se oxidan, lo que reduce la fluidez y dificulta la entrada de glutatión en la mitocondria, provocando un desequilibrio entre antioxidantes y ROS. Todo esto induce estrés oxidativo, que conduce a una reducción de la síntesis de ATP mitocondrial. En consecuencia, los pacientes con NAFLD tienen menos reservas de ATP (18), lo que hace que las células sean más susceptibles a la necrosis y desencadena una respuesta inflamatoria cuando el hígado se lesiona por isquemia e hipoxia (19). Asimismo, la producción de ROS, la lipoperoxidación y la liberación de citoquinas, conducirá en última instancia a la muerte celular (20). 20 Numerosos estudios han demostrado un estado redox alterado en la mayoría de los pacientes con NAFLD, detectando niveles elevados de marcadores de estrés oxidativo y productos de peroxidación lipídica en plasma (21). En la patogénesis, los ROS también oxidan las proteínas, sobre todo las enzimas antioxidantes, viéndose la capacidad antioxidante muy afectada tras la oxidación. Aunque la mayoría de los estudios exponen niveles disminuidos de enzimas antioxidantes hepáticas en los pacientes con NAFLD, algunos han mostrado resultados discordantes en modelos animales, encontrando tanto niveles aumentados como disminuidos de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa, la glutation peroxidasa o incluso el glutation reducido (22). Aunque estas observaciones son contradictorias, podrían explicarse por la fisiopatología de la NAFLD en la que inicialmente una respuesta antioxidante adaptativa a la excesiva producción de ROS es seguida por el agotamiento del sistema antioxidante, lo que resulta en menores niveles de enzimas antioxidantes. En los estudios de Ampuero et al., una proporción relativamente alta de pacientes no mostró hallazgos relacionados con NASH bien definida (en particular, la mitad de los pacientes cirróticos y un tercio de los que presentaban fibrosis avanzada no pudieron ser diagnosticados de NASH) (23). Además, un reciente estudio italiano (24) demostró que hasta el 33% de los pacientes con una fibrosis significativa relacionada con NAFLD no presentaban NASH (hasta el 10% no tenían inflamación). Por lo tanto, los resultados de nuestro trabajo demuestran que, mediante la determinación de marcadores de LPO, podríamos identificar a dichos pacientes evitando los riesgos y la variabilidad de la biopsia con una alta precisión diagnóstica, lo que también podría ser útil como herramienta terapéutica. Estudios muy recientes han revelado una posible implicación del RNA no codificante (ncRNAs) en esta patología, así como la posibilidad de que sea utilizado como un biomarcador no invasivo (25). Los ncRNA regulan la fisiología y las funciones celulares a través del silenciamiento epigenético de genes mediante la regulación postranscripcional, y su expresión anormal se ha asociado con NAFLD. Otros marcadores circulantes relacionados con la inflamación, incluidas las citocinas, las quimiocinas o los receptores de células inmunitarias, y los exosomas circulantes relacionados con la inflamación se han propuesto como herramientas de puntuación de NAFLD, pero carecen de estudios de validación (25). 21 Como vieron en su estudio Puri et al. (26) comparando controles normales con un grupo de pacientes con NAFLD y un tercer grupo con NASH, estos dos últimos tenían niveles mayores de GOT y GPT, menor cantidad de HDL y niveles mayores de LDL y triglicéridos. Como era de esperar, una proporción significativa de sujetos con NAFLD y NASH tenían características de síndrome metabólico. El estudio de la metabolómica de los lípidos circulantes puede dar información sobre el estado metabólico del hígado, pero no proporciona información directa sobre los cambios fisiopatológicos e histológicos que se están produciendo. Por ello, es necesario encontrar marcadores que definan mejor los cambios que están teniendo lugar, basándonos entre otros, en los datos de peroxidación lipídica (27). En la actualidad, se han creado más de cien índices para valorar el daño hepático o pronosticar eventos como infartos, cáncer u otros relacionados con la progresión de la cirrosis, el hepatocarcinoma o la descompensación de la cirrosis. Estos son típicamente combinaciones de parámetros antropométricos y bioquímicos semejantes, aunque se ha avanzado más en los marcadores de fibrosis que en los de NASH. La implementación de técnicas descubiertas a través de la investigación en transcriptómica, genómica, metabolómica o proteómica no parece mejorar significativamente el rendimiento (28). Como procedimientos de respaldo, se han sugerido OWLiver® (perfil metabolómico) (29) y ELF® (European Liver Fibrosis) (30). Sin embargo, faltan índices no invasivos basados en los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad, como los derivados del estrés oxidativo y la LPO, que permitan un mejor enfoque diagnóstico tanto en la vida real como en el contexto de los ensayos clínicos. Este trabajo presenta varias limitaciones que deben tenerse en cuenta. Primeramente, la comparación de los marcadores de estrés oxidativo se realizó en un único punto temporal. Asimismo, el estudio se llevó a cabo en un solo centro sanitario y sería necesario evaluarlo en un diseño de tipo multicéntrico para poder valorar adecuadamente el posible papel de la lipoperoxidación en el diagnóstico de NASH. VI. CONCLUSIONES Los altos niveles de lipoperoxidación presentan una asociación independiente significativa con la presencia de esteatohepatitis valorada por un NASH score ≥4. Asimismo, podemos decir que los niveles de peroxidación lipídica podrían ser una prometedora herramienta diagnóstica no invasiva a tener en cuenta a la hora de detectar NASH en pacientes con NAFLD. 22 Este estudio podría ayudar a sentar las bases de nuevos estudios clínicos para comprender la correlación entre la peroxidación lipídica y la inflamación basal en esta población, lo que guiará el desarrollo de nuevas terapias y el descubrimiento de nuevos biomarcadores. VII. BIBLIOGRAFÍA 1. Masarone M, Rosato V, Dallio M, Gravina AG, Aglitti A, Loguercio C, et al. Role of Oxidative Stress in Pathophysiology of Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Oxid Med Cell Longev. June 2018; 2018: 1-14. 2. Gonzalez A, Huerta-Salgado C, Orozco-Aguilar J, Aguirre F, Tacchi F, Simon F, et al. Role of Oxidative Stress in Hepatic and Extrahepatic Dysfunctions during Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD). Cipak Gasparovic A, editor. Oxid Med Cell Longev. October 2020; 2020:1-16. 3. Maurice J, Manousou P. 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Índices no invasivos para el diagnóstico de la NAFLD Debido a la invasividad y alto coste de la biopsia hepática, se han creado fórmulas que combinan datos clínicos y analíticos para evaluar de forma rápida, sencilla y económica el grado de esteatosis y fibrosis hepática en la NAFLD. La precisión diagnóstica de estos índices varía según la población a la que se aplique, con una exactitud diagnóstica (su área bajo la curva es aproximadamente 0.8) que oscila entre el 80-85%. La principal limitación de estos índices es que dejan una zona gris del 25% salvo para el HFS (Hepamet Fibrosis Score) que se reduce a un 9%. Las tablas inferiores recogen las fórmulas a partir de las cuales se obtienen los índices y la interpretación de los valores que se pueden obtener. La elastografía de transición hepática se realiza mediante el Fibroscan®. Se trata de una técnica no invasiva, sencilla y rápida cuyo principal factor limitante es el IMC de los pacientes. Se mide en kPa, y tiene un amplio rango de acción, entre 2.5 y 75 kPa, que se correlaciona con el grado de fibrosis hepática. 25 Tabla 1. Índices de esteatosis no invasivos Tabla 2. Índices no invasivos de fibrosis hepática. ÍNDICES DE ESTEATOSIS NO INVASIVOS TEST FÓRMULAS INTERPRETACIÓN FLI ("!".$%&'()(+,)!.!"./&$'012!.!".3/4'()(,,+)!.!"."%&'526!7!/%.38%) #$%$"".$%&'()(+,)!.!"./&$'012!.!".3/4'()(,,+)!.!"."%&'526!7!/%.38%) x100 < 30 No esteatosis ³ 30 - 60 Indeterminado ³ 60 Esteatosis HSI HSI = 8 x (ALT/AST) + BMI (Añadir: + 2 si mujer y + 2 si DM2) < 30 No esteatosis ³ 30 - < 36 Indeterminado ³ 36 Esteatosis ÍNDICES DE FIBROSIS NO INVASIVOS TEST FÓRMULAS INTERPRETACIÓN NFS NFS = [-1,675 + 0,037 × edad (años) + 0,094 × IMC (kg/m) + 1,13 × IFG/diabetes (sí = 1, no = 0) + 0,99 × cociente AST/ALT -0,013 × plaquetas (×109/l) – 0,66 × albúmina (g/dl)] < -1,455 Fibrosis leve ³ - 1,455 - 0,675 Indeterminado ³ 0.676 Fibrosis avanzada FIB-4 [edad (años) × AST (U/I)/(plaquetas (×109/l) × (ALT (U/I)1/2] < 1.3 Fibrosis leve ³ 1,3 – 2,67 Indeterminado ³ 2,67 Fibrosis avanzada HFS 1 / [ 1 + e (5.713 - 0.996 x Edad [45-64 años] – 1.745 x Edad [>65 años] + 0.907 x Sexo masculino – 0.771 x Diabetes Mellitus – 0.746 x AST [35-69 UI/mL] – 1.992 x AST [>70 UI/mL] – 0.044 x Albúmina [4-4,49 mg/dL] – 0.944 x Albúmina [<4 mg/dL] – 1.028 x HOMA [2-3,99] – 2.087 x HOMA [>4] – 0.876 x plaquetas [155.000-219.999] – 2.241 x plaquetas [<155.000]) ] < 0.12 Fibrosis leve ³ 0.12 – 0.24 Indeterminado ³ 0.24 Fibrosis Avanzada APRI [(nivel AST / valor superior de la normalidad de la AST) / recuento de plaquetas (109/L)] × 100 < 0’5 Ausencia o fibrosis leve 0,5 - < 1,5 Indeterminada ³ 1,5 Fibrosis avanzada