Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos

TRABAJO DE FINAL DE GRADO Grado en Ingeniería Química DESARROLLO DE NUEVOS DISPOSITIVOS COMPUESTOS DE HIDROGEL Y MICROFIBRAS COMO SISTEMA DE ENTREGA DE MEDICAMENTOS Memoria y Anexos Autor/a: Anna Mariano Rodríguez Director/a: Núria Borràs Cristòfol Co-Director/a: Samuele Colombi Convocatoria: Junio 2024 Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos i Resumen Cuando el suministro de oxígeno destinado al músculo cardíaco es insuficiente, se produce la pérdida irreversible de cardiomiocitos, también denominado ataque cardíaco. Esto lleva a la necesidad de encontrar una solución a esta emergencia médica desarrollando una bioplataforma que tenga la capacidad de reparar el tejido cardíaco. La comunidad científica actual propone que para la formación y replicación de cardiomiocitos es de gran ayuda el uso de compuestos exógenos. Recientemente se ha estudiado que la suplementación de L-lactato a una etapa temprana promueve la proliferación de este y la regeneración del tejido cardíaco. El objetivo principal de este proyecto es desarrollar nuevos dispositivos como sistema de entrega de medicamentos, específicamente del L-lactato. Partiendo de la base de hidrogeles de alginato y microfibras de ácido poliláctico, se desea sintetizar nuevos hidrogeles de gelatina metacrilada, para después estudiar su viabilidad durante el transcurso de los días. También es determinada la liberación de L-lactato de una serie de hidrogeles preparados con L-lactato, ácido poliláctico y diferentes concentraciones de la enzima proteinasa K. Se ha agregado PEDOT a cada muestra para poder desarrollar unos hidrogeles conductores con el fin de electroestimularlos para poder estudiar cómo afecta este fenómeno a la liberación de L-lactato a lo largo del tiempo. Se han realizado diversas técnicas de caracterización para determinar las propiedades de los hidrogeles desarrollados a lo largo de este trabajo, como el FTIR, SEM o Raman entre otros. Memoria ii Resum Quan el subministrament d’oxigen destinat al múscul cardíac es insuficient, es produeix la pèrdua irreversible de cardiomiocits, també denominat com atac cardíac. Això porta a la necessitat de trobar una solució a aquesta emergència mèdica desenvolupant una bioplataforma que tingui la capacitat de reparar el teixit cardíac. La comunitat científica actual proposa que per la formació i replicació de cardiomiocits es de gran ajuda l’ús de compostos exògens. Recentment s’ha estudiat que la suplementació de lactat a una etapa primerenca promou la proliferació d’aquest i la regeneració del teixit cardíac. El objectiu principal d’aquest projecte es desenvolupar nous dispositius com a sistema de entrega de medicaments, específicament del L-lactat. Partint de la base de hidrogels de alginat i microfibres de àcid polilàctic, es desitja sintetitzar nous hidrogels de gelatina metacrilada, per després estudiar la seva viabilitat durant el transcurs dels següents dies. També es determinada la alliberació de L-lactat de una sèrie de hidrogels preparats amb L-lactat, àcid polilàctic i diverses concentracions de l’enzim proteïnasa K. S’ha afegit PEDOT a cada mostra per tal de poder desenvolupar uns hidrogels conductors amb la finalitat de electroestimular-los per poder estudiar com afecta aquest fenomen a la alliberació del L-lactat al llarg del temps. S’han realitzat diverses tècniques de caracterització per determinar les propietats dels hidrogels desenvolupats al llarg d’aquest treball, com el FTIR, SEM o Raman entre altres. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos iii Abstract When the oxygen supply to the heart muscle is insufficient, it occurs the irreversible loss of cardiomyocytes, also known as a heart attack. This leads to the need of finding a solution to this medical emergency by developing a bioplatform that has the capacity to repair cardiac tissue. The current scientific community proposes that the formation and replication of cardiomyocytes is greatly aided using exogenous compounds. Recently, it has been studied that early lactate supplementation promotes lactate proliferation and cardiac tissue regeneration. The main objective of this project is to develop new devices as a drug delivery system, specifically for L-lactate. Starting from the basis of alginate hydrogels and polylactic acid microfibers, it is desired to synthesize new hydrogels of gelatine methacryloyl, and then study their viability over the course of days. There is also determined the L-lactate release from a series of hydrogels prepared with L-lactate, polylactic acid and different concentrations of enzyme proteinase K. PEDOT has been added to each sample to develop conductive hydrogels with the aim of electrostimulate them to study how this phenomenon affects the release of L-lactate over time. Several characterisation techniques have been carried out to determine the properties of hydrogels that have been developed along this project, as FTIR, SEM or Raman among others. Memoria iv Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos v Agradecimientos Primero de todo agradecer la confianza depositada por parte de mi tutora, Núria Borràs por permitirme formar parte durante estos meses del grupo de investigación IMEM y poder conocer de primera mano la investigación llevaba a cabo en la universidad. Dar las gracias a todo el personal del grupo IMEM por su simpatía y compañerismo des de que llegué. Y, sobre todo, agradecer a mi cotutor Samuele Colombi por el seguimiento, los consejos y la ayuda recibida a lo largo de este proyecto, incluso aun estando en otro país. Sus indicaciones en el laboratorio, ánimos y bromas han sido fundamentales para la realización de este trabajo. Agradecer especialmente a mis padres, Diego y Elena, y a mi hermano Marc por su gran apoyo y preocupación durante estos años de carrera, por haberme sujetado cuando ha sido necesario y porque, aunque no ha sido fácil, ha sido un camino muy satisfactorio llegar adonde he llegado. Por supuesto mencionar también a mi pareja, Marc, por su apoyo incondicional y amor en todo momento. Y agradecer también a mis compañeros de grado todo el tiempo compartido, en especial a Vanesa, a la que me llevo como amiga durante y después de la universidad. Memoria vi Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos vii Glosario Alg Alginato AFM Atomic Force Microscopy - Microscopia de Fuerza Atómica CA Cronoamperometry – Cronoamperometría FTIR Espectrofotometría de transformada de Fourier GelMA Gelatina metacrilada HG Hidrogel Lact L-Lactato MAA Methacrylic anhydride – Metacrílico anhídrido PBS Phosphate buffer saline - Tampón fosfato salino PEDOT Poli(3,4-etilendioxitiofeno) PK Serine Proteinase – Proteína serina PLA Polylactic acid - Ácido poliláctico SEM Scanning Electron Microscope - Microscopio electrónico de barrido TRIS Tris(hidroximetil)aminometano UV-Vis Ultraviolet Visble Radiation - Radiación Ultravioleta visible WCA Water Contact Angle - Ángulo de contacto Pág. 2 Memoria 2 Figura 17. Potenciostato Galvanostato AUTOLAB PGSTAT101. Fuente Metrohm [40] _________ 25 Figura 18. Procedimiento para la creación de microfibras de PLA. Fuente propia hecho con BioRender®. _________________________________________________________________________ 28 Figura 19. Procedimiento para la creación de microfibras de PLA + PK33. Fuente propia hecho con BioRender®. ______________________________________________________________ 29 Figura 20. Procedimiento para la creación de microfibras de PLA + PK42. Fuente propia hecho con BioRender®. ______________________________________________________________ 29 Figura 21. Protocolo de síntesis de los hidrogeles de alginato y L-lactato. Fuente propia hecho con BioRender®. ______________________________________________________________ 31 Figura 22. Protocolo de extracción de alícuotas. Fuente propia hecho con BioRender®. _______ 32 Figura 23. Protocolo de síntesis de hidrogeles de alginato. Fuente propia hecho con BioRender®. 33 Figura 24. Protocolo de síntesis de los hidrogeles de alginato, PEDOT y L-lactato. Fuente propia hecho con BioRender®. ___________________________________________________________ 34 Figura 25. Protocolo de síntesis de hidrogeles de alginato y PEDOT. Fuente propia hecho con BioRender®. ______________________________________________________________ 35 Figura 26. Molde para la síntesis de hidrogeles. Fuente propia. __________________________ 36 Figura 27. Proceso de síntesis de HG electroestimulados. Fuente propia hecho con BioRender®. 37 Figura 28. Protocolo de electroestimulación de HG. Fuente propia hecho con BioRender®. ____ 38 Figura 29. Proceso de síntesis de GelMA. Fuente propia hecho con BioRender®. _____________ 39 Figura 30. Procedimiento para la formación de HG de GelMA. Fuente propia hecho con BioRender®. _________________________________________________________________________ 40 Figura 31. Procedimiento para la formación de HG de GelMA +microfibras. Fuente propia hecho con BioRender®. ______________________________________________________________ 41 Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 3 Figura 32. Gráfica FTIR HG Alg. Fuente propia. ________________________________________ 43 Figura 33. Gráfica FTIR HG Alg|PEDOT. Fuente propia. __________________________________ 44 Figura 34. Gráfica FTIR HG GelMA. Fuente propia. _____________________________________ 45 Figura 35. Gráfica Raman HG Alg. Fuente propia. ______________________________________ 46 Figura 36. Gráfica Raman HG Alg|PEDOT. Fuente propia. _______________________________ 47 Figura 37. Gráfica Raman HG GelMA. Fuente propia. ___________________________________ 48 Figura 38. Gráfica del módulo de almacenamiento HG GelMA. Fuente propia. ______________ 50 Figura 39. Gráfica del módulo de perdida HG GelMA. Fuente propia. ______________________ 51 Figura 40. Módulo HG GelMA caracterización reológica. Fuente propia. ____________________ 51 Figura 41. Módulo HG GelMA|PK42 caracterización reológica. Fuente propia._______________ 52 Figura 42. Microfibras de PLA|PK42 sin y con plasma. Fuente propia. ______________________ 55 Figura 43. HG de Alg|PK42 y Alg|PK42|PEDOT. Fuente propia. ___________________________ 56 Figura 44. Imágenes de SEM de HG GelMA. Fuente propia. ______________________________ 57 Figura 45. Imágenes de SEM de HG GelMA | PK42. Fuente propia. ________________________ 58 Figura 46. Gráfica de la curva de calibrado del UV-Vis. Fuente propia. _____________________ 59 Figura 47. Gráfica de barras de liberación de lactato diaria. Fuente propia. _________________ 60 Figura 48. Gráfica de dispersión de HGs durante 24 h. Fuente propia. _____________________ 60 Figura 49. Gráfica de dispersión de liberación de HG durante 15 días. Fuente propia. _________ 61 Figura 50. Gráfico de barras de HGs electroestimulados durante 12 días. Fuente propia. ______ 62 Pág. 4 Memoria 4 Figura 51. Gráfico de dispersión de HGs electroestimulados durante 24 horas. Fuente propia. _ 63 Figura 52. Gráfico de dispersión de HGs electroestimulados durante 12 días. Fuente propia. ___ 64 Figura 53. Gráfico de barras de HGs electroestimulados y no electroestimualdos durante 12 días. Fuente propia. _____________________________________________________________ 65 Figura 54. Gráfico de dispersión de HGs electroestimulados y no electroestimualdos durante horas. Fuente propia. _____________________________________________________________ 65 Figura 55. Gráfico de barras de HGs GelMA. Fuente propia. _____________________________ 66 Figura 56. Gráfico de dispersión de HGs GelMA durante 11 días. Fuente propia. _____________ 67 Figura 57. Gráfica circular sobre los impactos totales de los costes al proyecto. Fuente propia. _ 75 Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 5 Índice de tablas Tabla 1. Tabla de muestras de fibras. Fuente propia. ___________________________________ 30 Tabla 2. Tabla de muestras de HG de Alg|Lact. Fuente propia. ___________________________ 31 Tabla 3. Tabla de muestras de HG de Alg|Lact|PEDOT. Fuente propia. _____________________ 34 Tabla 4. Tabla de muestras de electroestimulación. Fuente propia. _______________________ 37 Tabla 5. Tabla de muestras de GelMA. Fuente propia. __________________________________ 39 Tabla 6. Tabla de resultados de WCA. Fuente propia. ___________________________________ 42 Tabla 7. Tabla de resultados AFM. Fuente propia. _____________________________________ 49 Tabla 8. Tabla de propiedades reológicas HG GelMA. Fuente propia. ______________________ 50 Tabla 9. Tabla de módulo de Young de HG de GelMA. Fuente propia. ______________________ 53 Tabla 10. Tabla de reactivos y sus correspondientes pictogramas. Fuente propia. ____________ 68 Tabla 11. Tabla de costes de equipos amortizables. Fuente propia. _______________________ 71 Tabla 12. Tabla de costes de equipos del Centro Multiescala. Fuente propia. ________________ 72 Tabla 13. Tabla de costes de material amortizable. Fuente propia. ________________________ 72 Tabla 14. Tabla de costes de material no amortizable. Fuente propia. _____________________ 73 Tabla 15. Tabla de costes de reactivos. Fuente propia. __________________________________ 74 Tabla 16. Tabla de costes de personal. Fuente propia. __________________________________ 74 Tabla 17. Tabla de resumen de todos los castes asociados. Fuente propia. __________________ 75 Memoria 6 Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 7 1. Introducción El objetivo de este trabajo es desarrollar una serie de compuestos de hidrogeles y microfibras como sistema de entrega de medicamentos a partir de hidrogeles hechos de alginato y ácido poliláctico (PLA). Para ello se han seguido los siguientes protocolos: 1. Crear unos hidrogeles a base de alginato, PLA y PEDOT y determinar su liberación de lactato. 2. Determinar la liberación de lactato llevando a cabo una electroestimulación con diferentes rangos de voltajes de una serie de hidrogeles de PLA y PEDOT. 3. Desarrollar hidrogeles a partir de gelatina metacrilada y determinar su viabilidad durante el transcurso de los días. 1.1. Objetivos del trabajo Los objetivos por abordar a lo largo de este proyecto son:  Determinar la cantidad de lactato liberado en una solución de tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) por los hidrogeles formados.  Determinar la cantidad de lactato liberado por diferentes tipologías de hidrogeles con microfibras de PLA y PEDOT cada cierto intervalo de tiempo durante una serie de electroestimulaciones a diferentes voltajes.  Caracterizar y estudiar la viabilidad de hidrogeles sintetizados con gelatina metacrilada Memoria 8 2. Estado del arte 2.1. Historia de los geles Un gel es una estructura conformada por un esqueleto sólido que a su vez comprime un líquido, en dimensiones coloidales [1]. Este suele estar compuesto por diversos compuestos como largas cadenas de polímeros, moléculas y grandes cantidades de solvente [2]. Este esqueleto es formado gracias al llamado “cross-linking” o reticulación, que consiste en el proceso de enlace de una cadena polimérica a otra. En los geles, la red que conforma el polímero puede ser formada mediante reticulación física o química. Los geles físicos son enlazan mediante enlaces débiles como enlaces de Van der Waals, de hidrógeno o mediante reticulación de cadenas poliméricas. Mientras que los químicos presentan uniones más fuertes por los enlaces covalentes y por ende una mayor estabilidad y durabilidad de este a lo largo del tiempo [3]. La utilidad de los geles es muy amplia y prácticamente se pueden encontrar en nuestro día a día. Su importancia es vital dada todas sus grandes aplicaciones, desde su utilidad en productos higiénicos o sanitarios, pasando por su uso en centros de estética hasta llegar a aplicaciones biomédicas. Figura 1. Gel desinfectante. Fuente Sanytol [4] Actualmente hay una gran tipología de geles, aunque los más destacables son los aerogeles, los xerogeles y los hidrogeles, en los cuales se basa el objeto de nuestro estudio. Cabe destacar que mientras los aerogeles y los xerogeles tienen su mismo origen en soluciones de alcóxidos, los hidrogeles pueden estar formados por diferentes compuestos químicos, aunque mayoritariamente están conformados por polímeros. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 9 Los aerogeles son una clase de sólidos particularmente ligeros con una alta porosidad y son conocidos por presentar grandes propiedades aislantes. Están constituidos mayoritariamente por aire, ocasionando su bajo peso y su apariencia casi transparente. Destacan en el campo de la ingeniería por sus muchas aplicaciones como en la creación de materiales aeroespaciales, en ámbitos como la óptica y la electricidad por gran aislamiento térmico y acústico. Debido a estas propiedades aislantes y sus bajos pesos moleculares son unos de los materiales más estudiados en el campo de la ingeniería aeroespacial [5]. Figura 2. Aerogel mostrando sus propiedades aislantes. Fuente Engineer News Network [6] Por su origen, se puede decir que son unos geles que han sido sometidos a un tratamiento de secado con un gas en condiciones críticas, ocasionando que se evapore todo el líquido y que el gas se introduzca en la matriz del gel [8]. Figura 3. Esquema formación de aerogeles y xerogeles. Fuente propia hecho con BioRender®. Memoria 10 Mientras que los xerogeles corresponden a un tipo de geles que su tratamiento de secado se realiza con unas condiciones más suaves, a temperatura ambiente y con presiones bajas, al contrario que los aerogeles. Dada su procedencia de soluciones con alcóxidos y con metal alcóxidos, tienen una capacidad para ser modificados y ser dopados con otros compuesto químicos, generando un gran interés en la electrónica. Tienen una gran aplicabilidad en el mundo de la biomedicina y electrónica por su funcionalidad como sensores y biosensores [9]. Los hidrogeles o geles hidrofílicos son materiales flexibles y viscosos compuestos por agrupaciones de polímeros que forman una estructura tridimensional y son capaces de absorber y retener agua [5]. Son materiales “cross-linked” o reticulados [2] y tal y como dice su nombre, interaccionan con el agua. Figura 4. Ejemplo de hidrogel. Fuente Bekia salud. [7] Son unos materiales que presentan una gran absorción, tienen una alta capacidad de poder incorporar en su estructura interna una sustancia. Esto genera que el hidrogel se hinche y pueda retener la sustancia dentro suyo. El mayor ejemplo sería como el agua es capaz de penetrar dentro del hidrogel dotándolo de mayores dimensiones. Tienen una gran biocompatibilidad por su origen natural y porque están conformados por una estructura que presenta una gran similitud a una matriz extracelular [10], dotando a estos de una gran aplicabilidad en tejidos humanos. Esto proporciona una multitud de ventajas ya que su baja toxicidad y semejanza a tejidos biológicos lo hacen un material con grandes aplicaciones biomédicas. Su estructura flexible y viscosa le confiere que pueda tener multitud de formas según la aplicación que se desee. Los hidrogeles están conformados por poros, que son pequeños huecos que conforman el material y a su vez son los responsables de la capacidad de retener sustancias. Actualmente hay una multitud de aplicaciones con materiales porosos ya que pueden ser usados en ámbitos de separación. Son materiales muy versátiles ya que tienen una gran capacidad de manipulación. Estos pueden ser modificados agregando diferentes compuestos como polímeros o nanopartículas para obtener materiales con mejores propiedades y funcionalidades. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 11 Una de sus propiedades esenciales es la gran capacidad de adsorción [2]. Esta se caracteriza por la capacidad de un material para poder retener las moléculas de un compuesto químico de manera superficial. A continuación, la Figura 5 muestra un esquema del proceso de adsorción, donde también se muestra el proceso opuesto, llamado des adsorción. Figura 5. Esquema del proceso de adsorción. Fuente propia. Su propiedad más interesante y que los hace objeto de estudios de muchos sectores es la capacidad que tienen para liberar fármacos de manera controlada. Esta propiedad está relacionada a todas las características que presentan como son la porosidad intrínseca o la capacidad de absorción. Su primera aplicación fue en la biomedicina por Wichterle and Lim (1960) [2] ya que presentan una gran biocompatibilidad y biodegradabilidad que los hacen muy interesantes en este ámbito. En la siguiente Figura 6 se muestran las diversas tipologías según su origen, composición, carga iónica, estructura y “cross-linking” según Thakur (2018) [2]: Memoria 18 Figura 11. Estructura PEDOT:PSS. Fuente Yayie et al. [25]. Puede usarse como agente de liberación de compuestos químicos y de organismos biológicos usando la electroestimulación [13], uno de los objetivos de este proyecto. 3.5. Gelatina Metacrilada La gelatina es una proteína que se puede encontrar en el cuerpo humano como producto de la hidrolisis del colágeno [23]. Aunque cuenta con muchas propiedades, su comportamiento dependiente a la temperatura lo hace un material muy sensible y es lo que lleva a investigar diferentes maneras de convertir-lo en un material mucho más resistente a los cambios externos, sobre todo térmicos. Gracias a la gelatina, se puede obtener la conocida gelatina metacrilada (GelMA), que es un derivado de la gelatina que contiene anhídrido metacrilado (MA). Este material cuenta con unas propiedades muy interesantes des del punto de vista biomédico ya que tal y como su nombre indica, al ser una gelatina manipulada, una de sus propiedades es su gran biocompatibilidad y presenta una resistencia a la temperatura mayor su precursor. La primera síntesis de GelMA fue llevada a cabo por Van Den Bulcke et al [26] y posteriormente ha sido ampliamente estudiada y se han conocido diversas maneras de obtenerla con algunas modificaciones. A partir de una solución tamponada de fosfato (PBS) en un pH neutro, se disuelve la gelatina y mientras está en constante agitación, se añade el anhídrido metacrilado. Se deja agitar toda la solución durante 1 hora y cuando está bien homogeneizada, se hace una posterior diálisis durante 1 día en agua destilada. Una vez ha finalizado el tiempo de diálisis, se deja liofilizar y es obtenido un material muy ligero y blanco con una apariencia parecida al poliestireno expandido. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 19 Figura 12. Frasco de GelMA. Fuente ZetaMatrix [27] Memoria 20 4. Tipologías de hidrogeles a estudiar Hay una gran variedad de hidrogeles formados por polímeros y también por proteínas. A continuación, se detallan los hidrogeles que serán el objeto de nuestro estudio. 4.1. Hidrogeles de Alginato Los hidrogeles de alginato (Alg) son muy populares por sus propiedades que los hacen muy importantes en el sector alimentario, cosmético y sobre todo en el ámbito biomédico [28]. El alginato es un material muy flexible, lo que hace que pueda ser manipulado para crear hidrogeles con unas propiedades características según la finalidad de uso de este. Los hidrogeles de alginato tienen una gran aplicabilidad como pomadas para la curación de tejidos y son muy usados como sistemas de encapsulamiento de células [10]. Se combina el hidrogel de alginato con un material sintético para así obtener un sistema con las propiedades más interesantes del alginato como su biocompatibilidad y las propiedades del material sintético que confieren más rigidez a la plataforma. Aunque presenta grandes aplicaciones, el alginato presenta algunas desventajas ya que carece de ciertas propiedades mecánicas y estas son las resultantes de la fragilidad que presenta. Estas propiedades pueden ser mejoradas si se combinan estos hidrogeles con ciertas sustancias, como por ejemplo materiales sintéticos. 4.2. Hidrogeles de Alginato|PEDOT Tal y como se ha mencionado anteriormente, el alginato confiere una estructura biodegradable y biocompatibilidad, mientras que el PEDOT dota de conductividad y estabilidad. Este material resultante es una plataforma muy importante en el estudio de liberación de fármacos. Un ejemplo de aplicación de los hidrogeles de alginato y PEDOT es la conformación de una matriz de alginato y un polímero, juntamente con la adición de nanopartículas de PEDOT, con el objetivo de crear una plataforma que pueda ser introducida en el cuerpo humano y controlar la segregación del componente químico que se desee [29]. Como se ha mencionado anteriormente, los hidrogeles pueden ser sintetizados de diversas maneras, conllevando que el mismo sistema mencionado anteriormente, pueda ser reproducido, pero teniendo el alginato, el polímero y el PEDOT: PSSS conformando los tres el hidrogel. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 21 4.3. Hidrogeles de GelMA Los hidrogeles de gelatina cuentan con una gran biocompatibilidad, ya que su matriz proviene de una proteína hallada en sistemas biológicos. Esto confiere una similitud con los tejidos celulares que dota de gran interés y permite la posibilidad de hacer experimentación en ingeniería de tejidos. Los hidrogeles de GelMA han adquirido una gran notoriedad por sus múltiples aplicaciones en la ingeniería de tejidos, medicina regenerativa y en sistemas de entrega de medicamentos [30]. Al ser un derivado, presenta su biocompatibilidad con una mejor estabilidad que los hidrogeles conformados únicamente por gelatina. Una peculiaridad de estos hidrogeles es la necesidad de aplicar una radiación UV a la solución para el proceso de reticulación. Esta solución debe contener previamente el foto indicador, que ayuda a la síntesis del hidrogel mediante la radiación UV [31]. Memoria 22 5. Técnicas de caracterización A continuación, se detallan las técnicas que se han usado para caracterizar las diferentes tipologías de hidrogeles desarrollados. 5.1. Ángulo de contacto (WCA) La medida del ángulo de contacto se usa para caracterizar una superficie y para estudiar los fenómenos de humectación y des humectación [32]. Es un proceso muy simple ya que consiste en depositar una gota de agua en la superficie que se desea estudiar y calcular el ángulo en que la gota se deposita en la superficie sólida. Dado su simplicidad, es un método muy usado, aunque interpretar los datos no suele ser sencillo. La humedad de una superficie sólida por un líquido se describe a partir del perfil de una gota a partir del ángulo tangente a la interfaz líquido-sólido-aire. Lo que hace que el ángulo de contacto se defina como el ángulo de Young o ángulo de contacto estático, expresado como un equilibrio de las tres tensiones superficiales. En la siguiente Figura 13 se pueden ver representados estos los vectores donde se muestran la tensión superficial líquida (𝛾𝐿𝑉), la tensión superficial sólida (𝛾𝑆𝑉) y finalmente tensión interfacial líquido-sólida (𝛾𝑆𝐿) [32]. Figura 13. Representación de los vectores de los parámetros en sessile drop. Fuente Law et al. [32] Este sistema se puede expresar de forma matemática como la ecuación de Young: 𝛾𝑆𝑉 = 𝛾𝐿𝑉 · cos 𝜃 + 𝛾𝑆𝐿 (Eq. 1) En el caso que se va a estudiar, el ángulo de contacto ayuda a saber el comportamiento hidrofílico o hidrofóbico de las microfibras. Mayor ángulo de contacto significa que la fibra es más hidrofóbica ya que no se deja absorber rápidamente por la superficie. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 23 5.2. Microscopio electrónico de barrido (SEM) La microscopia es una técnica de caracterización que crea imágenes con gran exactitud gracias al bombardeo de electrones que proporcionan información a escala microscópica de diversas propiedades de la muestra estudiada. La peculiaridad que tiene esta técnica es la creación de un haz de electrones energéticos a partir de la emisión de una fuente de electrones, obteniendo unas imágenes tridimensionales y con una gran resolución [33]. Esta técnica implica la captura de electrones secundarios y retro dispersados ocasionados por el haz de electrones primarios, a diferencia de las técnicas basadas en rayos X [34]. Esta técnica tiene la capacidad de poder caracterizar la forma, apariencia y otras propiedades físicas y químicas [33]. Tal y como se puede apreciar en la siguiente Figura 14, su alta resolución y precisión la hace una técnica imprescindible en el campo de los materiales. Figura 14. SEM de un hidrogel. Fuente Hou et al., 2018 [35] 5.3. Espectroscopia Raman La espectroscopia Raman es una técnica analítica que ayuda a identificar los enlaces químicos que conforman las moléculas en un material. Es una técnica no destructiva [36] que consiste en hacer incidir la luz sobre la materia, dando lugar a que el campo magnético ocasione un cambio de distribución de cargas, provocando una modificación en la materia [37]. Memoria 24 5.4. Espectrofotometría infrarroja de Transformada de Fourier (FTIR) La espectrofotometría infrarroja de transformada de Fourier (FTIR) es una técnica de caracterización que permite reconocer los grupos funcionales mediante la radiación infrarroja. Esta técnica se pueden reconocer los grupos funcionales característicos de los compuestos que se estudian ofreciendo como resultado un espectro donde las abscisas y las ordenadas corresponden al porcentaje de transmitancia y la longitud de onda. En la Figura 16 se puede observar un ejemplo de espectro donde se aprecian las coordenadas donde los picos son reconocibles, relacionándolo con los grupos funcionales ya que cada uno tiene asociada una longitud de onda característica. Figura 15. Espectrómetro Jasco FTIR-4700. Fuente propia. Para poder reconocer los grupos funcionales, la molécula absorbe la radiación infrarroja siempre que esta tenga un momento dipolar, ya que este es el causante de la excitación cuando hay radiación y eso se ve reflejado en el espectro como los conocidos picos [37]. Figura 16. Espectro FTIR de HAEO, SACD y el complejo de inclusion. Fuente Amine Ez-Zoubi et al [38] Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 25 5.5. Cronoamperometría (CA) La cronoamperometría es una técnica usada en soluciones electroquímicas para estudiar la cinética y los mecanismos. En el momento que se aplica un escalón de potencial mayor, este genera una reacción electroquímica en el electrodo, causando un cambio de intensidad a lo largo del tiempo [39]. Se ha usado un Potenciostato Galvanostato AUTOLAB PGSTAT101 para electroestimular los hidrogeles con la finalidad de determinar la liberación de lactato de estos en un rango de -1V. Figura 17. Potenciostato Galvanostato AUTOLAB PGSTAT101. Fuente Metrohm [40] 5.6. Caracterización mediante técnicas reólogicas La reología estudia el comportamiento dinámico de los materiales fluidos. Se estudia el comportamiento de los materiales una vez se ha aplicado una deformación sobre estos [41]. Con esta técnica se estudia la tensión aplicada a un material, también conocida como 𝜏, y la deformación a la que se somete este, llamada como 𝜀. Y mediante estas dos se calcula el módulo de Young (𝐸), calculado mediante la siguiente ecuación (Eq. 2.). 𝐸 = 𝜏 𝜀 (Eq. 2) El estudio consiste en aplicar una determinada fuerza en el hidrogel para así puede estudiar el comportamiento de un hidrogel para así determinar las propiedades viscoelásticas del material a evaluar. Memoria 26 5.7. Espectroscopia UV-Visible (UV-VIS) La espectrometría UV-visible es una técnica analítica para cuantificar soluciones químicas. Esta técnica proporciona información sobre el estado excitado electrónico al que llegan las moléculas cuando se someten a una radiación en el rango UV-visible [42]. El espectro resultante es expresado mediante las coordenadas x correspondientes a la longitud de onda y las coordenadas y correspondientes a la transmitancia. Es una técnica muy usada en los laboratorios por su rapidez y ayuda a determinar la concentración de compuestos que residen en la solución a analizar. 5.8. Microscopia de Fuerza Atómica (AFM) La microscopia de fuerza atómica es una técnica analítica de caracterización de superficies a escala nanométrica e incluso más pequeña [43]. En nuestro caso concreto, se usa está técnica como técnica de nano deflexión, para la realización de esta técnica es necesario un nanosensor que entra en contacto con la muestra a analizar. El equipo hace que el nanosensor se vaya aproximando a la muestra hasta que entre en contacto y deflacte para poder determinar características reológicas que en este caso es el módulo de Young. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 27 6. Metodología Para la realización de este proyecto, se han desarrollado 3 diferentes tipologías de hidrogeles a partir de diferentes tipos de síntesis. La primera tipología corresponde a unos hidrogeles de alginato y PEDOT recubriendo microfibras de PLA hechos en unas placas de vidrio. La siguiente tipología corresponde a los mismos hidrogeles, pero a su vez electroestimulados y con la característica que la síntesis de estos es llevada a cabo en un molde de teflón. Y finalmente, la última tipología corresponde a unos hidrogeles de gelatina metacrilada. Cabe destacar que todas las tipologías estudiadas son depositadas en un recipiente con una cantidad concreta de solución 0,075 M de tris(hidroximetil)aminoetano, también conocido como TRIS, a un pH de 7,75. El medio escogido para estudiar esta liberación es TRIS por su naturaleza como solución tamponada y proporcionar un pH adecuado para estudiar bioplataformas. Para llevar a cabo estos, primero es necesario sintetizar las microfibras de PLA que constituirán la mayor parte del esqueleto de los hidrogeles. A continuación, se muestran los pasos a seguir: 1. Preparación de microfibras 2. Desarrollo de HG de PK33 y PK44 con y sin PEDOT 3. Desarrollo de HG para electroestimulación 4. Desarrollo de HG de GelMa 6.1. Preparación de microfibras Nuestro objetivo es desarrollar hidrogeles y cuantificar la liberación de lactato de estos a lo largo del tiempo, por esa razón primero se deben desarrollar las microfibras de PLA a partir de la técnica del electro spinning. Partiendo de una disolución de PLA 2002D con la respectiva concentración de 16,6 g PLA por 100 mL de solución. Se preparan unas 3 soluciones compuestas por PLA, cloroformo y acetona. La primera compuesta por solo estos compuestos (llamada solución de PLA) y otras dos añadiendo unos 33 mg de PK por g de PLA (solución PLA + PK33) y unos 42 mg de PK por g de PLA (solución PLA + PK42). Se decide el volumen de la solución, en este caso de unos 6 mL y se realizan los cálculos para determinar los gramos de PLA para posteriormente pesarlos en la balanza. Dado que la relación de cloroformo y acetona es 2:1, la solución resultante está formada por unos 4 mL de cloroformo y unos 2 mL de acetona. Esta solución formada por cloroformo, acetona y los gramos de PLA se deja en agitación y a una temperatura de 40°C durante una hora hasta que presenten una textura gelatinosa y viscosa. Memoria 34 Figura 24. Protocolo de síntesis de los hidrogeles de alginato, PEDOT y L-lactato. Fuente propia hecho con BioRender®. Y posteriormente tal y como se ha detallado en la Figura 22, se extrae una alícuota a diario. En total se han formado los siguientes HGs tal y como se muestran en la siguiente Tabla 3. Como en el apartado anterior, para una caracterización de los hidrogeles, se han formado HG de Alg|PEDOT|Lact, siguiendo el mismo procedimiento, pero sin la incorporación de microfibras. Tabla 3. Tabla de muestras de HG de Alg|Lact|PEDOT. Fuente propia. HG de Alg|PEDOT|Lact HG de Alg|PEDOT|Lact|PK33 HG de Alg|PEDOT|Lact|PK42 HG de Alg|PEDOT|Lact HG de Alg|PEDOT|Lact|PK33 HG de Alg|PEDOT|Lact|PK42 Hidrogeles de Alginato y PEDOT (HG Alg|PEDOT) Como en el caso de HG de Alg|Lact, con los que contienen PEDOT también es necesario desarrollar hidrogeles que contengan solamente alginato y PEDOT para las pruebas de Raman y FTIR. Por eso se ha seguido el mismo procedimiento, solo que sin añadir la cantidad de L-lactato. La Figura 25 muestra el proceso de síntesis de los hidrogeles de alginato y PEDOT. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 35 Figura 25. Protocolo de síntesis de hidrogeles de alginato y PEDOT. Fuente propia hecho con BioRender®. 6.3. Hidrogeles de Alg|PEDOT|Lact|Microfibras para electroestimulación Uno de los objetivos de este trabajo es electroestimular una serie de hidrogeles para estudiar la liberación de estos. Dado que la electroestimulación es llevada a cabo con ayuda del Potenciostato Galvanostato AUTOLAB PGSTAT101, un equipo que tiene una gran aplicabilidad en la electroquímica,es necesario que los compuestos que forman el hidrogel sean conductores, por eso en este apartado solo se emplean los hidrogeles que contienen PEDOT:PSS 1 . Para preparar estos hidrogeles, se ha seguido un procedimiento distinto al anterior, pero con los mismos reactivos ya que la única diferencia es la plataforma donde se efectúa y las medidas de los hidrogeles resultantes. En este caso concreto, en vez de usar portaobjetos y depositar las microfibras en ellos, se usa un molde de plástico con diversas ranuras (Figura 26) donde se formarán nuestros hidrogeles. 1 Los hidrogeles están conformados por PEDOT:PSS pero para abreviar solo se menciona como PEDOT. Memoria 36 Figura 26. Molde para la síntesis de hidrogeles. Fuente propia. Las ranuras que se pueden apreciar en la imagen son donde primeramente se colocará una lámina de ITO para después añadir las microfibras y las soluciones para formar los hidrogeles. El ITO es el llamado oxido de indio y estaño. Se recorta una lámina de ITO y se deposita el lado no conductivo en contacto con el molde y el lado conductivo adherido al hidrogel. Una vez el molde tenga en cada ranura la disolución, de depositará en un vaso de precipitados que contiene una solución de cloruro de calcio. La siguiente Figura 27 muestra el siguiente proceso para la formación de hidrogeles para ser electroestimulados. 1. Se recortan las microfibras y se someten al tratamiento de plasma. 2. Cortar y depositar una lámina de ITO en cada ranura de la plataforma de muestras y añadir las microfibras. 3. Siguientemente añadir unos 300 μL de la solución Alg|PEDOT|Lact para formar el HG deseado. 4. Una vez las ranuras están completas de la solución de HG, se recubre con una solución al 3% de CaCl2 y se deposita en la nevera. 5. Al día siguiente se retiran los HG del molde. 6. Se añade a una solución de unos 6 mL de TRIS. 7. Se conecta la lámina con el HG con ayuda de unos cocodrilos y un electrodo de referencia al AUTOLAB y comienza la electroestimulación con los parámetros establecidos. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 37 Figura 27. Proceso de síntesis de HG electroestimulados. Fuente propia hecho con BioRender®. Durante el transcurso de este proyecto, se ha realizado el siguiente protocolo de electroestimulación. El primero con los HG mostrados la siguiente y el rango de voltaje aplicado en cada uno de los casos, con la característica que la electroestimulación seria solamente de valor negativo con “step” y con una duración larga. Para esta casuística solo se realizó con HG que contenían microfibras. Tabla 4. Tabla de muestras de electroestimulación. Fuente propia. HG de Alg|PEDOT|Lact|PK33 De 0 a -1 V HG de Alg|PEDOT|Lact|PK42 De 0 a -1 V HG de Alg|PEDOT|Lact|PK33 De 0 a -1 V HG de Alg|PEDOT|Lact|PK42 De 0 a -1 V Estos HG mostrados en la Tabla 4 fueron sometidos a una electroestimulación negativa y siguieron el protocolo que se muestra detallado en la Figura 28: Memoria 38 Figura 28. Protocolo de electroestimulación de HG. Fuente propia hecho con BioRender®. 6.4. Hidrogeles de GelMA Para poder realizar los siguientes hidrogeles, se sigue el protocolo procedente del siguiente artículo con las cantidades de cada reactivo [31]. Primero de todo, se prepara una solución tamponada de PBS 0,25 M, con 0,5 L de agua MiliQ. Para ello se añaden 3,975 g Na2CO3 y 7,325 g de NaHCO3 a los 0,5 L de agua MiliQ. La Figura 29 ilustra el procedimiento que se ha seguido para sintetizar GelMA con un grado de sustituación del 80 % en el laboratorio. 1. Se depositan unos 100 mL de la solución de PBS en un vaso de precipitados 2. Con ayuda de un pH-metro se añade HCl 2 M hasta que la solución llegue a un intervalo de pH entre 9 y 10. 3. Una vez la solución llegue al pH deseado, se añaden los 10 g de gelatina porcina y 1 mL de MAA se vuelve a corregir el pH hasta 9 ya que, una vez añadida la gelatina, este aumenta al intervalo entre 10 y 11. Se deja agitar durante 2 horas. 4. Transcurridas las 2 horas, se disminuye el pH hasta 7 con NaOH 2 M. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 39 5. Una vez la solución ha llegado a pH neutro, es el momento de hacer la diálisis. Se humedecen las membranas con un tamaño de poros de 32 mm y se separan, para después introducir dentro de ellas la solución. Posteriormente se colocan estas membranas en un vaso de precipitados de 2 L lleno con agua destilada y se dejan en constante agitación durante los siguientes 3 días, cambiando 2 veces al día el agua del vaso. 6. Una vez transcurridos los 3 días, se deposita la solución en frascos Falcon. 7. Y se introducen los Falcon en el liofilizador durante 4 días más. 8. Sacar las muestras del liofilizador y ya se ha sintetizado el GelMA. Figura 29. Proceso de síntesis de GelMA. Fuente propia hecho con BioRender®. Se han sintetizado diversas muestras distintas de hidrogeles según su deseada caracterización posterior. Para estimar la liberación de lactato de GelMA y microfibras, se han sintetizado 2 muestras por cada tipología de microfibras. Mientras que 2 hidrogeles exclusivamente hechos por GelMA se han usado para caracterizar mediante reología y diferentes técnicas analíticas como Raman y FTIR. Tabla 5. Tabla de muestras de GelMA. Fuente propia. HG de GelMA HG de Gelma|Lact|PK33 HG de Gelma|Lact|PK42 HG de GelMA HG de Gelma|Lact|PK33 HG de Gelma|Lact|PK42 Memoria 40 Aunque haya 3 tipologías diferentes, el procedimiento de formar los hidrogeles es el mismo, solamente difiere que en los 2 posteriores casos se añaden las microfibras previamente sintetizadas del apartado 1. En la siguiente Figura 30 se muestra el procedimiento detallado a continuación: 1. Se añade a un frasco unos 10 mL de PBS y se le añaden unos 0,792 g de GelMA en agitación constante y a una temperatura de 50 grados. 2. Una vez se obtiene la solución completamente agitada y el GelMA se haya disuelto, se añaden los correspondientes 23,66 mg de L-lactato (en el caso de GelMA con microfibras) y 1% en peso de Irgacure 2959, el fotoindicador (FI) usado respecto de GelMA. 3. Con ayuda de un portaobjetos, se depositan unos 2 mL de la solución de GelMA y rápidamente se cubre con otro portaobjetos. 4. Se aplica una radiación ultravioleta a la solución para realizar la reticulación durante 1 min por cada cara del portaobjetos hasta que el gel no tenga ya una textura acuosa. 5. Se extrae el HG del portaobjetos y se somete al HG de GelMA a un tratamiento de unos 20 minutos a una disolución de HF al 4% en peso para mejorar su estabilidad. 6. Una vez pasados los minutos, el hidrogel de GelMA ya está formado y se puede depositar en un recipiente con unos 2 mL de TRIS. Figura 30. Procedimiento para la formación de HG de GelMA. Fuente propia hecho con BioRender®. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 41 Tal y como se ha mencionado anteriormente, para formar los HG que contienen microfibras se han seguido los mismos pasos, solamente añadiendo las microfibras en el apartado 6.3 tal y como se muestra en la siguiente Figura 31: Figura 31. Procedimiento para la formación de HG de GelMA +microfibras. Fuente propia hecho con BioRender®. Memoria 42 7. Resultados 7.1. Ángulo de contacto - WCA Tal y como se explica en el apartado sobre el ángulo de contacto en la página 22, esta prueba se ha realizado depositando una gota de agua sobre la superficie de estas láminas de microfibras, para poder estudiar su tendencia hidrófila o hidrofóbica. En este apartado se comparan los 3 tipos diferentes de microfibras creadas sin y con el tratamiento de plasma mostradas en la Tabla 6. El PLA es un polímero muy hidrofóbico, y con estas pruebas se puede comprobar cómo afecta este comportamiento a las microfibras. Tabla 6. Tabla de resultados de WCA. Fuente propia. PLA 144.64 ± 3.89 ° PLA (PLASMA) 32.62 ± 11.27 ° PLA|PK33 133.38 ± 3.73 ° PLA|PK33 (PLASMA) 21.83 ± 4.06 ° PLA|PK42 129.15 ± 1.96 ° PLA|PK42(PLASMA) 18.94 ± 0.53 ° En la Tabla 6 se aprecian dos comportamientos muy notorios. El primer factor es como la adición de la enzima resulta en un ángulo de contacto menor. Eso es debido a que la enzima es la encargada de romper los enlaces de PLA ocasionando que cuanta más rotura haya, más facilidad tenga el agua para penetrar en la superficie de las microfibras. Y esto se ve reflejado en la muestra exclusiva de PLA|PK42, que tiene el menor ángulo de contacto en las muestras no tratadas y una diferencia apreciable comparándolo con la muestra PLA. El segundo factor es el tratamiento de plasma a las microfibras. Este es el encargado de conferir que las microfibras presenten un comportamiento hidrofílico, y en la tabla de resultados se detalla como las muestras presentan un ángulo de contacto muy inferior a su homólogo no tratado. Por lo tanto, para el objetivo de liberar fármacos, son más idóneas aquellas muestras que hayan sido tratadas y presenten una mayor cantidad de enzima. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 43 7.2. Espectrofotometría Infrarroja de Transformada de Fourier (FTIR) 7.2.1. Hidrogeles conformados por alginato Dado el número de diferentes tipologías, para la realización de los gráficos se han agrupado primeramente los hidrogeles conformados por alginato y seguidamente los conformados por alginato y PEDOT. El primer gráfico presentado es la Figura 32 donde se aprecia como los tres hidrogeles presentan prácticamente casi la misma tendencia, concluyendo que, en esta técnica, la presencia de microfibras con la enzima incorporada es prácticamente imperceptible. Figura 32. Gráfica FTIR HG Alg. Fuente propia. Se muestra el primer gráfico (Figura 32) donde se aprecia un primer pico sobre unos 3400 cm-1 que hace referencia al enlace (O-H). Y sobre los 1750 cm-1 se encuentra un pico casi imperceptible que solamente se encuentra en la muestra de HG Alg|Lact|PK42 que hace referencia al enlace (C=O). También se aprecian en todos los HG diversos picos sobre los 1600 cm-1 y 1420 cm-1 que hace referencia a los enlaces (C=O) y finalmente cerca de los 1000 cm-1 un enlace (C-O-C). 40 50 60 70 80 90 100 110 5001000150020002500300035004000 Tramsmitancia (%) Longitud de onda (1/cm) Comparación HG Alg HG Alg HG Alg|Lact HG Alg|Lact|PK42 Memoria 50 7.5. Técnicas reológicas Para los hidrogeles de GelMA se ha usado un reómetro rotacional HR-2 de TA equipado con placas paralelas dentadas para caracterizar las muestras. Se deposita el hidrogel en la placa inferior de diámetro de 20 mm, a una distancia de 15 μm de la placa superior. A continuación, se muestra una tabla con los módulos de almacenamiento y de perdida de los hidrogeles de GelMA y de GelMA|Lact|PK42. Estos módulos son los encargados de ayudar a determinar el comportamiento viscoelástico inherente del hidrogel. Se han realizado unas mediciones de tres muestras de cada tipología y se han obtenido los resultados de la Tabla 8. Tabla 8. Tabla de propiedades reológicas HG GelMA. Fuente propia. Tipología HG Módulo de almacenamiento (KPa) Desviación estándar Módulo de pérdida (KPa) Desviación estándar GelMA 1,087 0,022 0,202 0,007 GelMA|Lact|PK42 0,218 0,022 0,099 0,002 En la siguiente gráfica, Figura 38, se muestra el módulo de almacenamiento, que hace referencia a las propiedades elásticas. Tal y como se puede apreciar, la presencia de microfibras hace disminuir las propiedades elásticas del hidrogel, en comparación al hidrogel de GelMA solamente. Figura 38. Gráfica del módulo de almacenamiento HG GelMA. Fuente propia. 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 GelMA GelMA|Lact|PK42 Módulo de almacenamiento (kPa) Gráfica módulo de almacenamiento Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 51 Figura 39. Gráfica del módulo de perdida HG GelMA. Fuente propia. La Figura 39 muestra el módulo de pérdida de los hidrogeles, referido al módulo viscoso. Tal y como se muestra, prácticamente las dos tipologías de hidrogeles presentan el mismo valor de módulo de pérdida, significando que las propiedades viscosas del hidrogel no son tan rígidas. A continuación, se muestran las figuras correspondientes a la evolución de los módulos de cada hidrogel según el tiempo que han sido caracterizados en el reómetro donde la G´ hace referencia al módulo de almacenamiento y la G’’ es el módulo de perdida. Figura 40. Módulo HG GelMA caracterización reológica. Fuente propia. 0.004 0.009 0.014 0.019 0.024 0.029 0.034 GelMA GelMA|Lact|PK42 Módulo de pérdida (kPa) Gráfica módulo de pérdida 1.E-02 1.E-01 1.E+00 1.E+01 050 100 150 200 250 300 G',G'' (kPa) Tiempo (s) GelMA Módulo de almacenamiento Módulo de pérdida Memoria 52 Figura 41. Módulo HG GelMA|PK42 caracterización reológica. Fuente propia. Tal y como se puede apreciar en las dos figuras anteriores, el módulo de almacenamiento es superior al módulo de pérdida. La diferencia más notoria entre las dos gráficas es que la Figura 41 correspondiente al HG GelMA|Lact|PK42 presenta un módulo de almacenamiento menor. Tal y como se había podido comprobar en la Figura 38, esto es debido a la presencia de microfibras, que hacen que el hidrogel no sea tan resistente a la deformación como el HG GelMA. Aunque no es tan resistente a la deformación, esta característica es muy beneficiosa ya que como se ha ido comentando durante todo el proyecto, el objetivo es la liberación de L-lactato, y por ende, se relaciona la capacidad de liberar L-lactato con una estructura no tan rígida del hidrogel. Luego de haber determinado el comportamiento elástico y viscoso de los hidrogeles de GelMA, con ayuda de la (Eq. 3) y sustituyendo el área en la (Eq. 4), se obtiene el módulo de Young de los hidrogeles. Se usa esta fórmula porque a diferencia de la usada en el AFM, aquí el HG a tratar tiene forma circular. 𝐸 = 𝜎 𝜀= 𝐹 𝐴 ∆𝐿 𝐿0 = 𝐹 𝜋 · 𝑟2 ∆𝐿 𝐿0 (Eq. 4) A continuación, se muestra el módulo de Young obtenido con esta técnica y su respectiva desviación estándar. 1.E-02 1.E-01 1.E+00 1.E+01 050 100 150 200 250 300 G',G'' (kPa) Tiempo (s) GelMA|Lact|PK42 Módulo de almacenamiento Módulo de pérdida Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 53 Tabla 9. Tabla de módulo de Young de HG de GelMA. Fuente propia. Tipología HG Módulo de Young (KPa) Desviación estándar GelMA 106,17 17,56 GelMA|Lact|PK42 9,56 2,02 Se aprecia una diferencia muy notoria entre los 2 hidrogeles, donde el HG de GelMA tiene un módulo de Young prácticamente 10 veces más que el HG de GelMA|Lact|PK42. Como se ha mencionado anteriormente, eso significa que el HG de GelMA presenta una mayor rigidez o resistencia a deformarse que el de GelMA|Lact|PK42. Memoria 54 7.6. Microscopio electrónico de barrido (SEM) Se muestran todas las fotografías realizadas por el microscopio electrónico de barrido para la caracterización de los materiales con los cuales se ha trabajo a lo largo de estos meses. 7.6.1. Microfibras de PLA Primeramente, se muestran fotografías de las microfibras sintetizadas a partir de PLA y enzima PK42. En la Figura 42, se muestran las diferentes dimensiones en las cuales se han tomado las imágenes. Se aprecia una gran diferencia en las microfibras que han sido tratadas y las que no. Las tratadas con plasma muestran una superficie más dañada por el plasma, ocasionando que las microfibras presenten el comportamiento hidrofílico ya que, al presentar más porosidad, hay más capacidad de absorber el agua. PLA|PK42 (sin plasma) PLA|PK42 (con plasma) Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 55 PLA|PK42 (sin plasma) PLA|PK42 (con plasma) Figura 42. Microfibras de PLA|PK42 sin y con plasma. Fuente propia. 7.6.2. Hidrogeles de alginato y PEDOT Como en el apartado anterior, se muestra la dimensión de cada imagen en la Figura 43. Con estas imágenes, se aprecia una mayor área transversal cuando hay PEDOT que cuando no, ya que confiere de mayor rigidez y estabilidad al HG. En las dos tipologías se pueden ver las microfibras contenidas dentro del HG, aunque la que contiene PEDOT muestra más poros, confiriendo mayor absorción a su vez. Memoria 56 HG Alg|PK42 HG Alg|PK42|PEDOT Figura 43. HG de Alg|PK42 y Alg|PK42|PEDOT. Fuente propia. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 57 7.6.3. Hidrogeles de GelMA Tal y como se puede apreciar en las imágenes de la Figura 44, el GelMA compone una capa superficial con ciertas grietas y formando una gran porosidad dentro del hidrogel. Esto es una ventaja ya que es un material que puede revestir con gran idoneidad el fármaco que se desee liberar. HG GelMA Figura 44. Imágenes de SEM de HG GelMA. Fuente propia. Memoria 58 En las posteriores imágenes de la Figura 45, se aprecia como el GelMA encapsula las microfibras, situándose estas mismas en medio del HG. A su vez, tal y como se aprecia en la Figura 44, comparten que el material forma una gran cantidad de poros dotándolo de grandes aplicaciones en la liberación de L-lactato, lo que es idóneo ya que es uno de los objetivos del proyecto. HG GelMA|Lact|PK42 Figura 45. Imágenes de SEM de HG GelMA | PK42. Fuente propia. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 59 7.7. Espectroscopia UV-VIS Tal y como se ha mencionado en los métodos, se extraen unas alícuotas diarias de los siguientes HGs para poder determinar la liberación de L-lactato mediante la espectroscopia UV-VIS con ayuda del microplate reader con una absorbancia de unos 340 nm aproximadamente. Las siguientes gráficas provienen de la realización de la extracción de las alícuotas, donde con ayuda del peso de las microfibras posteriormente se ha determinado la concentración de L-lactato liberado. Antes de poder evaluar las muestras, es necesario realizar una recta de calibración en la cual se mide la molaridad del L-lactato y la absorbancia que presenta este en el medio acuoso que en este caso concreto es el TRIS. A continuación, en la Figura 46, se muestra la recta de calibración utilizada para los resultados que se comentarán posteriormente. Figura 46. Gráfica de la curva de calibrado del UV-Vis. Fuente propia. 7.7.1. Hidrogeles de alginato, PEDOT y L-lactato La siguiente Figura 47 muestra el diagrama de barras de la liberación de las 4 tipologías de hidrogeles al cabo de 14 días. Se aprecia una notable diferencia en la cantidad de liberación de L-lactato de los HGs que no contienen PEDOT a los que sí. Aunque anteriormente se ha explicado en la teoría que el PEDOT ayuda a las propiedades físicas del hidrogel, en este caso no ayuda a una mayor liberación de L-lactato. y = 0.2344x - 0.0025 R² = 0.9971 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 Abs [Lact] (mM) Curva de calibración Memoria 66 7.7.3. Hidrogeles de GelMA En la siguiente Figura 55 se expone el diagrama de barras de la liberación de los 2 tipos de hidrogeles de GelMA durante 11 días. Se aprecia una gran diferencia en la cantidad de liberación del que contiene PK42 que el que tienen PK33, prácticamente más de la mitad del primero. Concluyendo que, a mayor cantidad de enzima, mayor cantidad de L-lactato liberado durante los días transcurridos. Figura 55. Gráfico de barras de HGs GelMA. Fuente propia. En la Figura 56 se muestra el gráfico de dispersión del porcentaje de L-lactato liberado, donde tal y como se ha mencionado en el anterior gráfico, la cantidad liberada por el HG de GelMA|Lact|PK42 es más de la mitad que la liberada por el HG de GelMA|Lact|PK33, concluyendo que la mejor opción sería un HG de GelMA|Lact|PK42. 0 10 20 30 40 50 60 70 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 Liberación de L-lactato/día (%) Días Comparación HGs GelMA HG GelMA|Lact|PK33 HG GelMA|Lact|PK42 Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 67 Figura 56. Gráfico de dispersión de HGs GelMA durante 11 días. Fuente propia. 0 10 20 30 40 50 60 70 0246810 12 Liberación de L-lactato (%) Días Liberación de lactato de HGs GelMA durante 11 días HG GelMA|Lact|PK33 HG GelMA|Lact|PK42 Memoria 68 8. Análisis del impacto ambiental Para este apartado, se ha realizado una evaluación detallada sobre el impacto que desencadenan los reactivos usados en el medio ambiente. Siguiendo el Reglamento (CE) nº 1272/2008 (CLP), este establece una clasificación de la sustancia o mezcla en caso de que esta sea peligrosa y qué advertencias debe contener su ficha de seguridad. A continuación, se detallan en la siguiente Tabla 10, los reactivos que son considerados como peligrosos y su correspondiente pictograma. Tabla 10. Tabla de reactivos y sus correspondientes pictogramas. Fuente propia. Reactivos Pictogramas Acetona Ácido fluorhídrico Bicarbonato de sodio Carbonato de sodio Cloroformo Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 69 Reactivos Pictogramas Cloruro de calcio Irgacure Metacrilado anhídrido PEDOT: PSS Proteinasa K En el caso del alginato, la gelatina, el TRIS, L-lactato y PLA, estos no reúnen los criterios para ser clasificadas como un riesgo ya que por su origen natural no son considerados una amenaza ambiental. Cabe mencionar también que cualquier manipulación de los reactivos considerados como peligrosos ha sido efectuada en todo momento en las campanas extractoras y con sumo cuidado de estos. En la mayoría de los casos las soluciones hechas se han guardado en la nevera durante los siguientes meses para próximos usos. Los papeles contaminados y los guantes de nitrilo han sido depositados en el barril de sólidos contaminados y en los casos de tener que verter líquidos, se han arrojado en su correspondiente barril, según los componentes que forman la solución a gestionar. Memoria 70 9. Conclusiones Durante el proyecto se han conseguido sintetizar hidrogeles de Alg|Lact e hidrogeles de Alg|Lact|PEDOT y cuantificar su liberación de L-lactato. Se ha relacionado la cantidad incorporada de la proteinasa K en el hidrogel como un agente acelerador de la degradación del hidrogel para la liberación del L-lactato que contiene en su interior y, por ende, a mayor adición de proteína, mayor liberación de L-lactato. Aunque la incorporación de PEDOT: PSS ayuda a estabilizar la matriz del hidrogel, en este caso este reduce su capacidad de liberación, concluyendo que la mejor elección para una liberación de L-lactato es un hidrogel conformado por Alg|Lact|PK42. Se han comparado los hidrogeles de PEDOT sometidos a un proceso de electroestimulación con los que no y se ha concluido que este proceso ayuda a mejorar la liberación de L-lactato, logrando una mejora notable sobre todo en el caso de HG ES Alg|PEDOT|Lact|PK42. Por lo cual se determina que, en el caso de electroestimulación, se aprecia una mejoría respecto el hidrogel electroestimulado cuando la cantidad de enzima añadida a las microfibras es mayor. Concluyendo que la elección del hidrogel de alginato y enzimas más idóneo para la liberación es el HG ES Alg|PEDOT|Lact|PK42. En cuanto al tercer objetivo, aparte de sintetizar hidrogeles conformados por GelMA y microfibras y conseguir una viabilidad a lo largo de 11 días, se ha comparado con los hidrogeles conformados anteriormente. La liberación de lactato por parte de los HG de GelMA es inferior a la obtenida respectivamente en el caso de hidrogeles conformados por alginato y enzimas, sin embargo, al tener una mayor biocompatibilidad, es una opción más favorable para estudiar en tejidos humanos que el alginato. Mediante caracterizaciones reológicas se ha comprobado como el módulo de Young disminuye por la influencia de microfibras con enzima, y dando como resultado que los hidrogeles conformados por GelMA|Lact|PK42 son más elásticos que rígidos, dotando al hidrogel de las características idóneas para la liberación de L-lactato deseada. Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 71 10. Análisis Económico 10.1. Equipos Los equipos que se han usado forman parte del grupo de investigación Innovation in Materials and Molecular Engineering (IMEM) del departamento de Ingeniería Química (EQ) de la EEBE. Dado que se han usado equipos que pertenecen al laboratorio y unos que pertenecen al Centro Multiescala del edifico I, se han separado los costes en dos tablas diferentes. Para poder calcular el coste asociado a los equipos del laboratorio se ha usado la siguiente ecuación de para calcular el coste amortización: 𝐴𝑚𝑜𝑟𝑡𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐶𝑜𝑠𝑡𝑒 𝑒𝑞𝑢𝑖𝑝𝑜 𝑉𝑖𝑑𝑎 ú𝑡𝑖𝑙 · 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑢𝑠𝑜 (Eq. 5) Para estimar la vida útil del equipo se ha estimado unos 8 años para cada equipo de laboratorio. Tabla 11. Tabla de costes de equipos amortizables. Fuente propia. Equipo Precio (€)1 Vida útil (años) Tiempo de uso (años) Coste total (€) AUTOLAB PGSTAT101 8.756,15 8 0,03125 34,20 Balanza analítica METTLER TOLEDO 676,00 8 0,03125 2,64 Balanza de precisión 1270,00 8 0,03125 4,96 Cámara incubadora / Homogeneizador 2658,00 8 0,03125 10,38 Cary UV-VIS 8.285,40 8 0,03125 32,36 Diener electronics PlasmaSurface-Technology 55.302,00 8 0,03125 216,02 E-FIBER EF100 SKE Research Equipment 46.085,00 8 0,03125 180,02 FTIR 19.127,12 8 0,03125 74,72 Krüss Drop Shape Analyzer 19044,00 8 0,03125 74,39 Lámpara UV 545,00 8 0,03125 2,13 1 El precio mostrado incluye el IVA. Memoria 72 Equipo Precio (€) Vida útil (años) Tiempo de uso (años) Coste total (€) Liofilizador 14415,00 8 0,03125 56,31 pH meter GLP 21 CRISON 1992,80 8 0,03125 7,78 Placa agitadora y calefactora 607,00 8 0,03125 2,37 Reómetro HR-2 TA Instruments 18.434,00 8 0,03125 72,01 COSTE TOTAL DE EQUIPO AMORTIZABLE 770,30 Tabla 12. Tabla de costes de equipos del Centro Multiescala. Fuente propia. Equipo Tiempo de uso (h) Precio (€) Coste total (€) Atomic Force Microscope Veeco 4 39,21 156,84 Recubridror de carbono Emitech K950X 0,17 536,20 89,37 RENISHAW inVia Raman microscope 3 57,76 173,28 Microscòpia SEM 2,5 46,23 115,58 COSTE TOTAL EQUIPO CENTRO MULTIESCALA 535,06 El total de la suma de los equipos asciende a un total de 1305,36 €. 10.2. Material Tabla 13. Tabla de costes de material amortizable. Fuente propia. Material Unidades (u) Precio pack (u/€) Coste total (€) Bandejas de plástico 4 4 63,20 63,20 Bata laboratori 1 19,50 19,50 Cables 4 10 5,41 2,16 Cristal de reloj 1 12 112,00 9,33 Cubeta de cuarzo 1 187,00 Electrodo de Ag/AgCl 1 126,00 Espátula 3 12 109,00 27,25 Frasco plástico de 1 L 2 14,54 Frascos de plástico 15 4 13,75 51,56 Frascos de vidrio 25 48 79,85 41,59 Frascos Falcon 8 500 210,00 3,36 Imán 5 10 61,70 30,85 Láminas de cúter 3 10 16,00 4,80 Micropipeta de 100 μL 1 382,00 Molde impreso en 3D 1 15,00 15,00 Pinzas 3 27,00 81,00 Pipeta de 1 mL 1 265,00 Pipeta de 5 mL 1 265,00 Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 73 Material Unidades (u) Precio pack (u/€) Coste total (€) Placas de Petri de plástico 4 500 196,00 1,57 Probeta graduada de vidrio 10 mL 1 9,17 Soporte 1 103,00 103,00 Soporte de muestras 1 4 107,00 26,75 Pinzas soporte 2 70,30 70,30 Termométro 1 2463,47 2463,47 Vaso de precipitados de vidrio 50 mL 1 8,43 Vaso de precipitados de vidrio 250 mL 1 9,70 Vaso de precipitados de vidrio 2 L 1 24,27 COSTE TOTAL MATERIAL AMORTIZABLE 4305,81 Se pueden diferenciar los materiales que son amortizables como la balanza y el liofilizador, entre otros, de los que solamente se pueden usar una vez y posteriormente depositar en el respectivo bidón de residuos. Es por eso por lo que se muestra la siguiente tabla haciendo referencia aquellos materiales no amortizables. Tabla 14. Tabla de costes de material no amortizable. Fuente propia. Material Unidades (u) Precio pack (u/€) Coste total (€) Guantes de nitrilo 60 100 12,9 7,74 Jeringa de 5 mL 3 100 66,4 1,99 Lámina ITO 1 52,80 Papel de pesaje 20 500 37,8 1,51 Parafilm 1 52,80 Punta micropipeta 100 μL 800 4800 160,65 26,78 Punta pipeta 1 mL 80 5000 167 2,67 Punta pipeta 5 mL 50 2500 428 8,56 Tubos Eppendorf 0,5 mL 646 500 55,3 71,45 COSTE TOTAL MATERIAL NO AMORTIZABLE 213,50 En total la suma de los materiales resulta en unos 4519,30 €. 10.3. Reactivos A continuación, se presenta la Tabla 15 donde se muestran los reactivos usados para la realización de este proyecto. Dada la cantidad de soluciones que se han realizado, se detallan solamente el precio por unidades que venían en cada recipiente de reactivo. Memoria 74 Tabla 15. Tabla de costes de reactivos. Fuente propia. Reactivo Unidades Precio (€) Coste total (€) Acetona 1 L 54,20 54,20 Agua MiliQ 10 L 2,90 29,00 Ácido fluorhídrico 500 mL 49,60 49,60 Alginic acid sodium salt low viscosity SigmaAldrich 100 g 57,90 57,90 Calcio Cloruro 2-hidrato polvo 500 g 49,40 49,40 Cloroformo 1 L 90,50 90,50 Gelatine porcine skin 100 g 55,70 55,70 Indicador 2-Hidroxi-4’-(2-hidroxietoxi)-2metilpropiophenona 10 g 65,70 65,70 Kit de analisis de lactato 1 kit 421,00 421,00 Methacrylic anhydride 100 mL 64,60 64,60 Na2Co3 500 g 53,80 53,80 NaHCo3 500 g 47,80 47,80 PEDOT: PSS 250 g 288,00 288,00 Reactivo Unidades Precio (€) Coste total (€) PLA 2002D 100 g 312,00 312,00 Proteinase K Sigma-Aldrich 100 mg 197,00 197,00 Sodium L-lactate Sigma-Aldrich 10 g 89,50 89,50 Spectra/Por Dialysis Membrane MWCO: 3,500 1 560,05 560,05 TRIS 100 g 39,50 39,50 COSTE TOTAL REACTIVOS 2525,25 10.4. Personal En la siguiente tabla (Tabla 16) aparecen las horas dedicadas por cada personal que ha contribuido a la realización de este trabajo, juntamente con las horas dedicadas y el coste anual de este según la normativa de la UPC. También se ha tenido en cuenta en el coste anual la aportación a la Seguridad Social que suele ser entre un 30% y un 30,3%, pero para simplificar cálculos se ha estimado el primer valor. Tabla 16. Tabla de costes de personal. Fuente propia. Personal Horas dedicadas (h) Coste anual (€/año) Coste total (€) Proyectista 600 20.770,15 5991,39 Doctorando 300 35.068,96 5058,02 Tutora 30 55.288,61 797,43 COSTE TOTAL DE PERSONAL 11846,84 Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 75 10.5. Resumen costes En la Tabla 17 de detallan todos los costes asociados mencionados anteriormente y una posterior figura donde se expresan de manera gráfica el impacto que tienen estos en el desarrollo del proyecto. Se ha incorporado también un 10% añadido a la suma de costes en caso de contingencia. Se ve como el mayor impacto es debido a gastos de personal, seguidamente por costes asociados al material. Resultando la realización del proyecto en un total de 22159,24 €. Tabla 17. Tabla de resumen de todos los castes asociados. Fuente propia. Tipo de coste Coste (€) Impacto (%) Equipos 1305,36 5,88 Material 4519,30 20,34 Reactivos 2525,25 11,37 Personal 11846,84 53,32 Suma Costos 20196,76 90,91 +10% contingencia 2019,68 9,09 COSTE TOTAL 22216,44 100,00 Figura 57. Gráfica circular sobre los impactos totales de los costes al proyecto. Fuente propia. Costes Totales Equipos Material Reactivos Personal 10% contingencia) Memoria 82 Desarrollo de nuevos dispositivos compuestos de hidrogel y microfibras como sistema de entrega de medicamentos 83 Anexos A1. Fichas de seguridad de los reactivos Reactivo Referencia Acetona Ficha de Datos de Seguridad: Acetona (carlroth.com) Ácido fluorhídrico Ficha de Datos de Seguridad: Ácido fluorhídrico (carlroth.com) Cloruro de calcio Ficha de Datos de Seguridad: Cloruro de calcio (carlroth.com) Cloroformo Ficha de Datos de Seguridad: Triclorometano / Cloroformo D1 (carlroth.com) Irgacure 2959 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2methylpropiophenone 98% | 106797-53-9 (sigmaaldrich.com) Methacrylic anhydride 276685 (sigmaaldrich.com) Carbonato de sodio - Na2CO3 Ficha de Datos de Seguridad: Carbonato de sodio (carlroth.com) Bicarbonato de sodio - NaHCO3 HDS-Bicarbonato de Sodio..pdf (isquisa.com) PEDOT:PSS 655201 (sigmaaldrich.com) Proteinase K Sigma-Aldrich Ficha de Datos de Seguridad: Proteinasa K (carlroth.com) Annexos 84