Viabilidad del uso de las escorias de acería en el crecimiento de microalgas marinas

Efectos de la escoria negra de acería en el crecimiento de fitoplancton marino Autora: Júlia Mestre Torras Director: Dr. Diego Aponte Tutora externa: Dra. Elisa Berdalet Titulació: Ciències i Tecnologies del Mar Convocatòria: Primavera, 2024. TREBALL FINAL DE GRAU ESTUDIO DEL EFECTO DE LA ESCORIA DE ACERÍA EN EL CRECIMIENTO DE FITOPLANCTON MARINO Autora JÚLIA MESTRE TORRAS Tutor Dr. DIEGO APONTE Tutora externa Dra. ELISA BERDALET Universidad Politécnica de Cataluña Ingeniería Civil y Ambiental Barcelona, junio 2024 i AGRADECIMIENTOS Quisiera expresar mi más sincero agradecimiento a mis tutores, Diego Aponte Hernández y Elisa Berdalet Andrés, por brindarme la oportunidad de llevar a cabo este trabajo junto a ellos. Su constante apoyo, motivación y orientación fueron fundamentales para que acudiera al laboratorio siempre con entusiasmo y dedicación. Agradezco enormemente su valiosa formación y guía durante todo el proceso de elaboración de esta tesis y, sobre todo, la confianza que han depositado en mí. Extiendo mi gratitud al Cap d'estudis del grado Ciencias y Tecnologías del Mar, César Möso Aranda, por facilitar mi contacto con mi tutor y por su disposición constante para ofrecer ayuda cuando fue necesario. Su intervención fue crucial para el inicio y el desarrollo de este proyecto. Quisiera agradecer también a mis compañeras de carrera de la Universitat Politècnica de Catalunya (UPC), y en especial a Clara del Bar Kmins, por su apoyo desde el comienzo de esta tesis y a lo largo de mi trayectoria universitaria. También a los técnicos de laboratorio, Sergi Rodríguez Luna y David Torrens Martin por valiosa contribución a mi formación. Agradezco al Institut de Ciències del Mar (ICM) por colaborar en este proyecto, proporcionando los recursos y el apoyo necesarios para el desarrollo de la investigación. En especial, a mis compañeros Sofia Ibáñez Homedes y Raimon Bundó Ruiz, sin cuya colaboración este trabajo no habría sido el mismo. También a los técnicos de laboratorio de la Zona de Acuarios Experimentales (ZAE), Pedro Siles Liebana y Pere Sabio I Sáenz, por su gran apoyo y dedicación durante el desarrollo de la investigación. Mi reconocimiento también a mi familia y amigos, especialmente a mis padres, cuyo apoyo incondicional fue crucial para la realización de este trabajo. ii RESUMEN La liberación considerable de dióxido de carbono (CO₂) debido a actividades humanas, principalmente el uso de combustibles fósiles, está vinculada al aumento de las temperaturas y al cambio climático. Este CO₂ en la atmósfera es absorbido por los sistemas acuáticos, lo que incrementa la acidez del agua y reduce su pH, impactando negativamente a los ecosistemas acuáticos. Los organismos fotosintéticos desempeñan un papel crucial en la dinámica del CO₂, puesto que a través de la fotosíntesis, fijan el CO₂ atmosférico en forma de materia orgánica y producen oxígeno. Estos organismos son esenciales para las redes tróficas y la regulación del clima global. En los ecosistemas acuáticos, el fitoplancton marino, que constituye el 0,2% de la biomasa fotosintética del planeta, produce aproximadamente el 50% del oxígeno atmosférico. Siendo así, el calentamiento global afecta al fitoplancton de múltiples maneras, comprometiendo su productividad, distribución y la salud general de los ecosistemas acuáticos. En este contexto, la escoria de acería valorizada, un subproducto de la producción de acero, está generando interés para el cultivo de algas y microalgas. La escoria negra de acería, generada en hornos de arco eléctrico, se utiliza principalmente en la producción de cemento y la mejora del suelo, aunque su utilización sigue siendo insuficiente en muchos países a pesar de su abundante producción. Estudios previos han sugerido la utilización de este material en el ámbito marino, investigando también su carbonatación para reducir el impacto ambiental y mejorar la respuesta de las algas y microalgas. Este proyecto analiza la escoria, tanto carbonatada como sin carbonatar, desde dos perspectivas: fisicoquímica y biológica. El primer enfoque se centra en ensayos de lixiviación para evaluar los elementos liberados por la escoria de acería en el agua de mar y sus posibles impactos. En el ámbito biológico, se estudia el comportamiento de dos cepas de fitoplancton marino (Nannochloropsis salina y Thalassiosira pseudonana) en cultivos tratados con la escoria de acería. Se observó un mayor crecimiento en los cultivos tratados con escoria de acería, probablemente por proporcionar este material, una mayor concentración de nutrientes a las células. Palabras clave: Cambio climático, dióxido de carbono (CO₂), ecosistemas acuáticos, fitoplancton, producción de oxígeno, escoria de acería valorizada, carbonatación, cultivo de microalgas, ensayos de lixiviación. iii RESUM El considerable alliberament de diòxid de carboni (CO₂) degut a activitats humanes, principalment l'ús de combustibles fòssils, està vinculat a l’augment de les temperatures i al canvi climàtic. Aquest CO₂ atmosfèric és absorbit pels sistemes aquàtics, cosa que incrementa l’acidesa de l’aigua i redueix el seu pH, causant un impacte negatiu en els ecosistemes aquàtics. Els organismes fotosintètics juguen un paper crucial en la dinàmica del CO₂, ja que a través de la fotosíntesi, fixen el CO₂ atmosfèric en forma de matèria orgànica i produeixen oxigen. Aquests organismes són essencials per a les xarxes tròfiques i la regulació del clima global. Als ecosistemes aquàtics, el fitoplàncton marí, que constitueix el 0,2% de la biomassa fotosintètica del planeta, produeix aproximadament el 50% de l' oxigen atmosfèric. Sent així, l’escalfament global afecta el fitoplàncton de múltiples maneres, comprometent la seva productivitat, distribució i la salut general dels ecosistemes aquàtics. En aquest context, l’escòria d’acer valoritzada, un subproducte de la producció de l’acer, està generant interès per al cultiu d’algues i microalgues. L'escòria negra d’acer, generada en forns d'arc elèctric, s'utilitza principalment en la producció de ciment i la millora del sòl, encara que la seva utilització segueix sent insuficient en molts països malgrat la seva abundant producció. Estudis previs han suggerit la utilització d'aquest material en l’àmbit marí, investigant també la seva carbonatació per reduir l’impacte ambiental i millorar la resposta de les algues i microalgues. Aquest projecte analitza l’escòria, tant carbonatada com sense carbonatar, des de dues perspectives: fisicoquímica i biològica. El primer enfocament se centra en assajos de lixiviació per avaluar els elements alliberats per l’escòria d’acer a l’aigua de mar i els seus possibles impactes. En l’àmbit biològic, s’estudia el comportament de dues soques de fitoplàncton marí (Nannochloropsis salina i Thalassiosira pseudonana) en cultius tractats amb l’escòria d’acer. Es va observar que els cultius tractats amb escòria d’acer, potser per proporcionar una major concentració de nutrients, van presentar un major creixement de la població de fitoplàncton. Paraules clau: Canvi climàtic, diòxid de carboni (CO₂), ecosistemes aquàtics, fitoplàncton, producció d’oxigen, escòria d’acer valoritzada, carbonatació, cultiu de microalgues, assajos de lixiviació. iv ABSTRACT The considerable release of carbon dioxide (CO₂) due to human activities, mainly the use of fossil fuels, is linked to rising temperatures and climate change. This atmospheric CO₂ is absorbed by aquatic systems, increasing the acidity of the water and lowering its pH, negatively impacting aquatic ecosystems. Photosynthetic organisms play a crucial role in the dynamics of CO₂, as through photosynthesis, they fix atmospheric CO₂ into organic matter and produce oxygen. These organisms are essential for trophic networks and the regulation of the global climate. In aquatic ecosystems, marine phytoplankton, which constitutes 0.2% of the planet's photosynthetic biomass, produces approximately 50% of atmospheric oxygen. Thus, global warming affects phytoplankton in multiple ways, compromising their productivity, distribution, and the overall health of aquatic ecosystems. In this context, valorised steel slag, a byproduct of steel production, is generating interest for the cultivation of algae and microalgae. Black steel slag, generated in electric arc furnaces, is mainly used in cement production and soil improvement, although its utilization remains insufficient in many countries despite its abundant production. Previous studies have suggested the use of this material in the marine environment, also investigating its carbonation to reduce environmental impact and improve the response of algae and microalgae. This project analyses the slag, both carbonated and non-carbonated, from two perspectives: physicochemical and biological. The first approach focuses on leaching tests to evaluate the elements released by the steel slag in seawater and their possible impacts. In the biological field, the behaviour of two strains of marine phytoplankton (Nannochloropsis salina and Thalassiosira pseudonana) is studied in cultures treated with steel slag. It was observed that cultures treated with steel slag, likely due to higher concentration of nutrients from this material, exhibited a greater growth of the phytoplankton populations. Keywords: Climate change, carbon dioxide (CO₂), aquatic ecosystems, phytoplankton, oxygen production, valorised steel slag, carbonation, microalgae cultivation, leaching tests. v ÍNDICE DE CONTENIDO 1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................. 1 2 OBJETIVOS ............................................................................................................................................. 2 2.1 Objetivo principal ........................................................................................................................... 2 2.2 Objetivos específicos ...................................................................................................................... 2 3 ESTADO DEL CONOCIMIENTO ................................................................................................... 3 3.1 Escoria negra de acería ................................................................................................................... 3 3.1.1 Definición .................................................................................................................................. 3 3.1.2 Valorización de la escoria de acería ....................................................................................... 3 3.1.3 Proceso de producción de la escoria negra de acería .......................................................... 3 3.1.4 Caracterización básica de la escoria negra de acería ............................................................ 4 3.1.4.1 Caracterización física y mecánica ................................................................................. 4 3.1.4.2 Caracterización química y mineralógica ...................................................................... 5 3.1.5 Aplicaciones............................................................................................................................... 6 3.1.5.1 Aplicaciones en ingeniería civil ..................................................................................... 6 3.1.5.2 Aplicaciones en el crecimiento de algas y microalgas marinas ................................ 6 3.1.6 Consideraciones medioambientales ....................................................................................... 7 3.2 Nannochloropsis salina ........................................................................................................................ 9 3.2.1 Clasificación taxonómica ......................................................................................................... 9 3.2.2 Descripción morfológica ......................................................................................................... 9 3.2.3 Distribución y ecología .......................................................................................................... 10 3.3 Thalassiosira pseudonana ................................................................................................................... 11 3.3.1 Clasificación taxonómica ....................................................................................................... 11 3.3.2 Descripción morfológica ....................................................................................................... 11 3.3.3 Distribución y ecología .......................................................................................................... 12 4 MATERIALES Y METODOLOGÍA ............................................................................................... 13 4.1 Materiales ........................................................................................................................................ 13 4.1.1 Caracterización física, química y mineralógica de las escorias ......................................... 13 4.1.2 Ensayos de caracterización biológica .................................................................................. 15 4.2 Metodología ................................................................................................................................... 16 4.2.1 Caracterización de la escoria negra de acería ..................................................................... 16 4.2.1.1 Granulometría ............................................................................................................... 16 4.2.1.1.1 Principio del método ............................................................................................... 16 4.2.1.1.2 Preparación de la muestra de ensayo .................................................................... 16 4.2.1.1.3 Tamizado y pesada .................................................................................................. 16 4.2.1.2 Densidad ........................................................................................................................ 17 vi 4.2.1.2.1 Principio del método ............................................................................................... 17 4.2.1.2.2 Obtención de los diferentes pesos de estudio .................................................... 17 4.2.1.2.3 Cálculo de las diferentes densidades ..................................................................... 17 4.2.2 Ensayos de lixiviación ............................................................................................................ 17 4.2.2.1 Principio del método .................................................................................................... 18 4.2.2.2 Obtención de las muestras .......................................................................................... 18 4.2.2.2.1 Preparación del agua de mar .................................................................................. 18 4.2.2.2.2 Preparación de las condiciones específicas del tamaño de partícula ............... 19 4.2.2.2.3 Carbonatación de la escoria negra de acería ........................................................ 20 4.2.2.2.4 Relaciones líquido-sólido ........................................................................................ 21 4.2.2.3 Descripción del procedimiento de lixiviación .......................................................... 21 4.2.2.4 Preparación posterior del eluato para el análisis ...................................................... 22 4.2.2.5 Medidas de pH y conductividad ................................................................................. 22 4.2.3 Ensayos caracterización biológica ........................................................................................ 23 4.2.3.1 Preparación del medio de cultivo ............................................................................... 23 4.2.3.1.1 Nannochloropsis salina................................................................................................. 23 4.2.3.1.2 Thalassiosira pseudonana ............................................................................................. 24 4.2.3.2 Preparación de los experimentos ............................................................................... 25 4.2.3.2.1 Tratamiento tipo A .................................................................................................. 25 4.2.3.2.2 Tratamiento tipo B .................................................................................................. 25 4.2.3.3 Cultivo de fitoplancton ................................................................................................ 26 4.2.3.3.1 Inoculación ............................................................................................................... 26 4.2.3.3.2 Condiciones de cultivo ........................................................................................... 27 4.2.3.3.3 Muestreo ................................................................................................................... 27 4.2.3.4 Recuento celular............................................................................................................ 28 4.2.3.4.1 Nannochloropsis salina................................................................................................. 28 4.2.3.4.2 Thalassiosira pseudonana ............................................................................................. 29 4.2.3.5 Cuantificación de la clorofila-a por fluorescencia ................................................... 30 4.2.3.5.1 Principio del método ............................................................................................... 30 4.2.3.5.2 Extracción de los filtros de fibra de vidrio .......................................................... 30 4.2.3.5.3 Lectura de la fluorescencia ..................................................................................... 31 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................................ 33 5.1 Ensayos caracterización fisicoquímica ....................................................................................... 33 5.1.1 Densidad .................................................................................................................................. 33 5.1.2 Granulometría ......................................................................................................................... 33 5.1.3 Composición química y mineralógica.................................................................................. 34 5.1.4 Ensayos de lixiviación ............................................................................................................ 35 5.1.4.1 Agua desionizada como agente lixiviante ................................................................. 35 vii 5.1.4.2 Agua de mar como agente lixiviante.......................................................................... 37 5.1.4.3 Medidas de pH y conductividad ................................................................................. 39 5.1.4.3.1 Agua desionizada (Milli-Q) como lixiviante ........................................................ 39 5.2 Ensayos caracterización biológica .............................................................................................. 41 5.2.1 Cálculo del volumen de inóculo ........................................................................................... 41 5.2.2 Resultados en base a los recuentos celulares ...................................................................... 41 5.2.2.1 Nannochloropsis salina...................................................................................................... 41 5.2.2.1.1 Tratamientos tipo A ................................................................................................ 41 5.2.2.1.2 Tratamientos tipo B ................................................................................................ 42 5.2.2.2 Thalassiosira pseudonana .................................................................................................. 45 5.2.2.2.1 Tratamientos tipo A ................................................................................................ 45 5.2.2.2.2 Tratamientos tipo B ................................................................................................ 46 5.2.3 Resultados en base a la estimación de la concentración de clorofila-a .......................... 48 5.2.3.1 Nannochloropsis salina...................................................................................................... 48 5.2.3.1.1 Tratamientos tipo A ................................................................................................ 49 5.2.3.1.2 Tratamientos tipo B ................................................................................................ 50 5.2.3.2 Thalassiosira pseudonana .................................................................................................. 52 5.2.3.2.1 Tratamientos tipo A ................................................................................................ 52 5.2.3.2.2 Tratamientos tipo B ................................................................................................ 53 6 CONCLUSIONES ................................................................................................................................ 56 7 TRABAJO FUTURO ............................................................................................................................ 58 8 ANÁLISIS DE SOSTENIBILIDAD Y IMPLICACIONES ÉTICAS ....................................... 59 8.1 Evaluación Ambiental .................................................................................................................. 59 8.1.1 Desarrollo del trabajo ............................................................................................................ 59 8.1.2 Ejecución del proyecto .......................................................................................................... 59 8.1.3 Riesgos y limitaciones ............................................................................................................ 60 8.2 Evaluación económica .................................................................................................................. 60 8.2.1 Desarrollo del trabajo ............................................................................................................ 60 8.2.2 Ejecución del proyecto .......................................................................................................... 60 8.2.3 Riesgos y limitaciones ............................................................................................................ 61 8.3 Evaluación social ........................................................................................................................... 61 8.3.1 Desarrollo del trabajo ............................................................................................................ 61 8.3.2 Ejecución del trabajo ............................................................................................................. 62 8.3.3 Riesgos y limitaciones ............................................................................................................ 62 9 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................... 63 10 ANEXOS ............................................................................................................................................ 65 3 3 ESTADO DEL CONOCIMIENTO 3.1 Escoria negra de acería 3.1.1 Definición Las escorias negras y blancas de horno eléctrico de arco, o también llamadas escorias oxidantes y escorias reductoras, respectivamente, son subproductos de la fabricación del acero cuya materia prima principal es la chatarra. Este trabajo solo se centra en las primeras, escorias negras de acería. 3.1.2 Valorización de la escoria de acería Las escorias acería valorizadas son escorias residuales generadas durante el proceso de fabricación del acero, que han sido tratadas o procesadas de manera que se les ha dado un valor adicional o se han convertido en materiales útiles para diversas aplicaciones. El término "valorización" en este contexto implica aprovechar estas escorias de manera que no solo se las considera como residuos, sino que se las convierte en recursos que pueden ser utilizados económicamente o de manera beneficiosa para el medio ambiente. El uso de escorias en lugar de recursos naturales no solo ahorra recursos no renovables y reduce la energía necesaria para extraer estos minerales, sino que también evita el impacto negativo del vertido indiscriminado de residuos. Esto contribuye a la protección de la biodiversidad y la preservación del paisaje. En resumen, la valorización de las escorias negras de acería busca transformar estos subproductos industriales en recursos útiles y económicamente viables, contribuyendo así a la sostenibilidad ambiental y económica de las operaciones metalúrgicas. 3.1.3 Proceso de producción de la escoria negra de acería En este apartado se describe el proceso de producción del acero y la generación de escoria siderúrgica en este proceso. Hay tres productores principales: Siemens-Martin, Convertidor al oxígeno y Horno de Arco Eléctrico, siendo los dos últimos los más utilizados a nivel mundial. En Cataluña, CELSA es el único productor de acero, utilizando exclusivamente hornos de arco eléctrico. El horno de arco eléctrico se utiliza para fundir chatarra junto con otros materiales como mineral de hierro, ferroaleaciones, cal, espato flúor, coque y oxígeno. El proceso implica la fusión de chatarra mediante corriente eléctrica, seguida por la oxidación, defosforación y formación de escoria durante la fusión. A continuación, se realiza el afino del baño fundido, que incluye desoxidación, desulfuración y descarburación del acero. Durante la fusión, se inyecta oxígeno puro para oxidar impurezas, formando escoria que cubre el líquido fundido. La adición de carbón en polvo reduce el óxido de hierro en la escoria. La presencia de cal ayuda a eliminar fósforo, y la escoria resultante se conoce como escoria negra u oxidante. En la fase de afino, se alimenta el horno de afino con líquido fundido cubierto por escoria reductora, compuesta principalmente por cal, espato-flúor y coque o grafito. La desoxidación se logra mediante contacto con la escoria. Se añaden ferroaleaciones de silicio y manganeso para lograr la desoxidación definitiva. Se lleva a cabo la desulfuración en presencia de óxido de calcio y carbón. 4 Antes de colar el líquido fundido, se desescoria, eliminando la escoria blanca. En la fabricación de aceros aleados, se ajustan otros parámetros según las especificaciones del acero. Se estima que por cada tonelada de acero se generan aproximadamente de 110 a 150 kg de escoria negra y de 20 a 30 kg de escoria blanca. 3.1.4 Caracterización básica de la escoria negra de acería 3.1.4.1 Caracterización física y mecánica Las escorias siderúrgicas son un conjunto de óxidos que flotan sobre la chatarra líquida en el proceso de creación del acero, debido a su bajo punto de fusión y baja densidad, siempre inferior a la del caldo que protegen. Cada proceso de fabricación siderúrgica genera un tipo específico de escoria, cada una con características distintivas que la diferencian de las demás. En cuanto a sus propiedades físicas, la escoria negra de acería tiene una densidad que varía generalmente entre 2.8 y 3.6 g/cm³, lo que la hace más densa que muchos agregados naturales. Esta alta densidad se debe a la presencia de minerales pesados como óxidos de hierro y magnesia. La granulometría de la escoria puede abarcar desde polvo fino hasta agregados de varios milímetros, pudiendo ajustarse mediante procesos de trituración y cribado para cumplir con requisitos específicos de distintas aplicaciones. Las partículas de escoria suelen tener una textura rugosa y una forma angular, lo que mejora su adhesión en mezclas de concreto y asfaltos, proporcionando mayor resistencia mecánica. Su color típicamente oscuro se debe al alto contenido de óxidos de hierro y otros minerales. Además, la porosidad de la escoria negra varía, pero generalmente es baja, lo que contribuye a su alta resistencia y durabilidad (Tabla 1). En términos de propiedades mecánicas, la escoria negra de acería muestra una alta resistencia a la compresión, comparable e incluso superior a la de muchos agregados naturales, lo que la hace adecuada para aplicaciones que requieren materiales de alta resistencia, como bases de carreteras y estructuras de concreto. Su excelente resistencia al desgaste y a la abrasión, debido a su dureza y composición mineral, la hace ideal para su uso en superficies expuestas a tráfico pesado y en mezclas asfálticas. La escoria negra de acería posee un alto módulo de elasticidad, indicando su capacidad para deformarse elásticamente bajo cargas y recuperar su forma original una vez que la carga es removida. Además, tiene una buena resistencia a la fractura gracias a su composición densa y estructura cristalina, lo que contribuye a su durabilidad y capacidad para soportar condiciones de carga intensiva sin fracturarse. Finalmente, su alta capacidad de soporte de carga la hace útil en aplicaciones estructurales y de infraestructura, donde se requiere un material con alta estabilidad y resistencia. 5 Tabla 1. Propiedades físico-mecánicas de las escorias negras de acería (Centro de Estudios y Experimentación de Obras Públicas (CEDEX), Ministerio de Transporte, Movilidad y Agenda Urbana, 2013) 3.1.4.2 Caracterización química y mineralógica La composición de las escorias está fuertemente influenciada por el tipo de chatarra utilizada y el control de las variables de operación. Las escorias negras se caracterizan principalmente por contener hierro, calcio y silicio. Encontramos variabilidad en los porcentajes relativos de las escorias de acería de diversos autores (Tabla 2). Las escorias negras de acería contienen aproximadamente entre un 20% y un 42,5% de hierro, confiriéndoles alta densidad y cierta resistencia al desgaste y la abrasión. Los contenidos de CaO y MgO libres pueden llevar a fenómenos de expansión a corto y a largo plazo, respectivamente. En la composición mineralógica de las escorias negras, destacan los óxidos y silicatos, como el silicato bicálcico, silicato tricálcico, cal libre, wüstita, ferrita bicálcica y las fases magnéticas (Fe3O4 y Fe2O3). La presencia significativa de silicato bicálcico (30-60%) en la escoria negra se debe a su formación a altas temperaturas o a la descomposición parcial del silicato tricálcico durante el enfriamiento, dando lugar también a CaO libre. Este último, al distribuirse uniformemente en la matriz compacta de la escoria, no presenta riesgo de expansión, a diferencia de la cal no completamente disuelta. La wüstita, segundo componente más abundante en las escorias de acería, muestra una leve reactividad en la hidratación del MgO en fase cristalina. El color negro característico de la escoria negra se atribuye mayormente a la presencia de óxidos de hierro, siendo la fase magnética resultado del enfriamiento del Fe3O4 a 1600 °C y su asociación con el Fe2O3 durante el descenso de la temperatura, formando así una fase sólida única con compuestos químicos. Tabla 2. Caracterización química de las escorias negras de acería (Centro de Estudios y Experimentación de Obras Públicas (CEDEX), Ministerio de Transporte, Movilidad y Agenda Urbana, 2013) Propiedad Escoria negra de acería Densidad aparente (g/cm3 ) 3,5 Resistencia a compresión (MPa) > 130 Resistencia al impacto (% en peso) 18 Coeficiente de Pulido Acelerado 54 – 57 Desgaste de los Ángeles (%) 12 – 25 Absorción de agua (% en peso) 0,3 – 6 Resistencia al hielo-deshielo (% en peso) < 0,3 Incremento de volumen (% vol) 1 – 5 Material CaO(%) SiO2(%) Fe(%) MgO(%) Al2O3(%) MnO(%) P2O5(%) Cr2O3(%) CaO(%) Escoria negra de acería 25-40 10-17 18-30 2-15 3-10 5-7 0-1,5 0-3 < 3 6 3.1.5 Aplicaciones 3.1.5.1 Aplicaciones en ingeniería civil Las escorias de acería negras desempeñan múltiples roles, siendo utilizadas como áridos en firmes de carretera, adicionadas en la fabricación de cemento, empleadas en la elaboración de morteros y hormigones siderúrgicos, así como en aplicaciones como la consolidación de suelos, capas de rodadura y vías férreas. Un uso tradicional y directo de estas escorias es su empleo como áridos en capas granulares para la construcción de carreteras, incluyendo coronación de explanadas, bases y sub-bases. Además, se utilizan en mezclas bituminosas debido a su resistencia a la abrasión y excelente coeficiente de pulimento acelerado, siendo especialmente adecuadas para capas de rodadura. Sin embargo, debido a su porosidad, angulosidad y falta de finos, pueden resultar difíciles de extender y compactar, por lo que se combinan con áridos naturales, generalmente de origen calizo, para mejorar su manipulación y garantizar una dosificación adecuada. Su riesgo inherente de expansión y hinchamiento exige una evaluación cuidadosa de su potencial expansivo y la garantía de su estabilidad volumétrica. Estas escorias se emplean también como aporte de hierro, silicio y cal en la fabricación del clinker, un componente esencial para la elaboración del cemento. Los cementos con escorias ofrecen una mayor trabajabilidad debido a la menor cantidad de agua requerida, así como una mayor resistencia a la abrasión y mayores resistencias con el tiempo. Aunque la resistencia inicial es menor y el tiempo de fraguado mayor, no existen limitaciones técnicas o medioambientales, ya que la legislación española no impone restricciones sobre cromo y manganeso, elementos que aumentan considerablemente en estos cementos. Otra aplicación común de las escorias negras es como árido, tanto grueso como fino, para la fabricación de morteros y hormigones. Antes de su uso, se someten a un pretratamiento que incluye trituración, tamizado, separación de metales, y estabilización para evitar la expansión. Dada su baja presencia de finos, se requiere la adición de áridos finos, generalmente caliza, al utilizarlas en la fabricación de hormigones. Además, se han utilizado puntualmente como material fino de relleno en escolleras o como relleno en obras fluviales, aunque su heterogeneidad demanda un control riguroso de su comportamiento dimensional en estas aplicaciones más específicas. 3.1.5.2 Aplicaciones en el crecimiento de algas y microalgas marinas Las escorias de acería pueden tener varias aplicaciones ambientales y agrícolas debido a su composición química rica en metales y minerales. Este material puede relacionarse con el crecimiento de microalgas marinas al actuar como una fuente de nutrientes esenciales, mejorando el medio ambiente marino y proporcionando un sustrato para el crecimiento de las microalgas. En el estudio de (Sugimoto, et al., 2014), se desarrolló un sustrato para el crecimiento de algas utilizando escoria de acería con un tamaño de partícula más fino que el de la roca natural, el cual se mantuvo como sustrato para el lecho de algas durante un año. Después de este período, las especies de algas y la cantidad presentes en el lecho construido con escoria de acería fueron similares a las encontradas en un lecho natural construido con roca natural. La escoria contiene una variedad de minerales y metales como hierro, calcio, magnesio y silicio, que son cruciales para el crecimiento de las microalgas. Cuando se trata adecuadamente, la escoria puede liberar estos nutrientes al agua, funcionando como un fertilizante. Además, tiene propiedades que pueden adsorber contaminantes del agua, mejorando así las condiciones del hábitat para las 7 microalgas. También puede influir en el pH y la alcalinidad del agua, creando condiciones más favorables para ciertas especies de microalgas. Las partículas de escoria pueden servir como un sustrato físico al que las microalgas pueden adherirse y crecer. Su estructura física proporciona estabilidad en ambientes acuáticos, facilitando la colonización por microalgas. En el caso de (Miyata, et al., 2004), se examinó la aplicabilidad de la escoria de acería para mejorar los sedimentos del fondo en varias áreas marinas (Figura 1). Los resultados experimentales mostraron que la escoria de acería en grandes cantidades controlaba la aparición de sulfuros, y que los materiales estaban disponibles como material de dique sumergido, que puede ser utilizado como base para algas y organismos bentónicos. También se encontró que los gránulos de la escoria de acería pueden ser una base efectiva y pueden suministrar nutrientes para las algas adheridas. Figura 1. Algas observadas en escorias de acería (Miyata, et al., 2004) Sin embargo, es crucial evaluar la escoria para asegurarse de que no contenga niveles tóxicos de metales pesados que podrían dañar las microalgas o el ecosistema marino. La escoria de acería podría necesitar ser tratada o procesada antes de ser utilizada para garantizar que los nutrientes sean liberados de manera controlada y segura. 3.1.6 Consideraciones medioambientales En España, la Ley 22/2011 de residuos y suelos contaminados (Jefatura del Estado, 2011, 29 of july), en su artículo 6, establece que la clasificación de residuos como peligrosos o no peligrosos se realiza de acuerdo con la Lista Europea de Residuos (LER) (Ministerio de medioambiente, 2022, 8 of february). Las escorias de acería de horno de arco eléctrico están contempladas en la Lista Europea de Residuos, específicamente en el Capítulo 10 relacionado con "Residuos de procesos térmicos", con los códigos: - 10 02 01: Residuos de tratamiento de escorias. - 10 02 02: Escorias no tratadas. El tratamiento adecuado de estas escorias ofrece beneficios globales tanto para los generadores como para la sociedad en general, incluyendo: - Reducción de costos de vertido y ahorro de materias primas mediante la reutilización de subproductos de acería. 8 - Menor impacto ambiental y beneficios espaciales al evitar la ocupación de vertederos y no depositar residuos en ellos. - Mejora de la calidad de vida en las áreas circundantes a estas industrias. Desde la perspectiva ambiental, las escorias negras de acería de horno de arco eléctrico pueden emplearse en capas granulares, como bases, subbases y coronación de explanadas, siempre y cuando los resultados de los ensayos de lixiviación se mantengan dentro de los límites establecidos. Los lixiviados de estas escorias, especialmente aquellas no envejecidas, pueden presentar problemas debido a los altos valores de pH y la presencia de cantidades significativas de metales pesados. Los lixiviados, en particular, pueden corroer las tuberías de aluminio y acero que entren en contacto con ellos. Se recomienda especialmente controlar la lixiviación de elementos como molibdeno, vanadio, selenio y fluoruros. Solo tres Comunidades Autónomas en España (País Vasco, Cataluña y Cantabria) establecen umbrales máximos de lixiviación para este flujo residual (Tabla 3). Tabla 3. Concentraciones máximas permitidas en Cataluña para los lixiviados de escoria negra obtenidos según ensayo de lixiviación UNE-EN 12457-4:2003 (Ministerio para la Transición Ecológica y el Reto Demográfico , 2021) Parámetros Unidad Valor límite Arsénico [mg/Kg] 0,5 Bario [mg/Kg] 20 Cadmio [mg/Kg] 0,04 Cromo total [mg/Kg] 0,5 Cobre [mg/Kg] 2 Mercurio [mg/Kg] 0,01 Molibdeno [mg/Kg] 0,5 Níquel [mg/Kg] 0,4 Plomo [mg/Kg] 0,5 Antimonio [mg/Kg] 0,06 Selenio [mg/Kg] 0,1 Cinc [mg/Kg] 4 Cloruros [mg/Kg] 800 Fluoruros [mg/Kg] 18 Sulfatos [mg/Kg] 1000 9 3.2 Nannochloropsis salina 3.2.1 Clasificación taxonómica Nannochloropsis es un género de microalgas que comprende seis especies conocidas. En la Tabla 4 se observa la clasificación taxonómica actual del género Nannochloropsis, nombrado por primera vez por D. J. Hibberd en 1981 (Hibberd, 1981). Tabla 4. Clasificación taxonómica de Nannochloropsis salina (Hibberd, 1981) 3.2.2 Descripción morfológica Las microalgas pertenecientes al género Nannochloropsis se destacan de otras cepas afines al poseer clorofila a y carecer por completo de clorofila-b y clorofila-c. Todas las especies son inmóviles, sin exhibir características morfológicas distintivas que puedan distinguirse mediante microscopía óptica o electrónica. La caracterización se lleva a cabo principalmente mediante análisis de la secuencia del gen rbcL y del ARNr 18S. En general, las células son cilíndricas, rectas o ligeramente reniformes, de 3-4 μm x 1.5-1.7 μm, con extremos redondeados, generalmente con un gránulo refractivo en cada extremo; carece de vaina gelatinosa (Figura 2). Nivel taxonómico Nombre del taxón Reino Chromista Subreino Harosa Infrareino Heterokonta Filo Ochrophyta Clase Eustigmatophyceae Orden Eustigmatales Familia Monodopsidaceae Género Nannochloropsis Especie Nannochloropsis salina 10 Figura 2. Nannochloropsis salina en microscopio ótico Leica DMi1 a 20x aumentos 3.2.3 Distribución y ecología La especie Nannochloropsis salina, se encuentra comúnmente en ambientes acuáticos salinos, como estanques de salinidad elevada, lagunas costeras y otros cuerpos de agua marina. Se caracteriza por su gran adaptabilidad a condiciones salinas y su capacidad para crecer en ambientes marinos la hacen de interés en la investigación y la industria relacionada con la acuicultura y la producción de bioproductos, donde se puede cultivar esta microalga de manera controlada. La microalga Nannochloropsis salina desempeña un papel crucial en la productividad primaria de los ecosistemas acuáticos. Como productor primario, realiza fotosíntesis y convierte la energía solar en materia orgánica, formando la base de la cadena alimentaria acuática. Esto es particularmente importante en zonas donde esta microalga es abundante, contribuyendo significativamente a la biomasa fitoplanctónica total. Esta microalga es una fuente vital de nutrientes para una variedad de organismos acuáticos. Su alto contenido en proteínas, lípidos y ácidos grasos esenciales como el ácido eicosapentaenoico (EPA) la convierte en un alimento preferido por zooplancton, larvas de peces y otros pequeños organismos marinos. Este flujo de nutrientes desde Nannochloropsis salina hacia niveles tróficos superiores es fundamental para la salud y productividad de los ecosistemas acuáticos. Esta microalga contribuye al ciclo del carbono mediante la fotosíntesis, fijando dióxido de carbono atmosférico y convirtiéndolo en biomasa. Este proceso no solo ayuda a mitigar el aumento de CO2 en la atmósfera, sino que también juega un papel en la regulación del carbono en los ecosistemas marinos. La biomasa de Nannochloropsis salina puede ser consumida por otros organismos o sedimentarse, contribuyendo al almacenamiento de carbono en los sedimentos marinos. Las condiciones ambientales, como la temperatura, la luz y la disponibilidad de nutrientes, influyen significativamente en el crecimiento y la distribución de Nannochloropsis salina. Esta microalga es particularmente sensible a los cambios en la temperatura y puede experimentar variaciones en su tasa de crecimiento y composición bioquímica en respuesta a las fluctuaciones térmicas. La disponibilidad de luz también es un factor crítico, ya que afecta su capacidad fotosintética y, por ende, su productividad primaria. 11 El cambio climático y la acidificación de los océanos pueden tener efectos significativos en la ecología de Nannochloropsis salina. A medida que las temperaturas globales aumentan y los océanos se vuelven más ácidos, las condiciones óptimas para el crecimiento de esta microalga pueden cambiar, afectando su distribución y productividad. 3.3 Thalassiosira pseudonana 3.3.1 Clasificación taxonómica El género Thalassiosira comprende un gran número de especies de diatomeas, la mayoría planctónicas, con amplia distribución en los diversos ambientes acuáticos y todas las latitudes. En la Tabla 5 se observa la clasificación taxonómica actual del género Thalassiosira, nombrado por primera vez por Hasle y Heimdal en 1970 ( Hasle & Heimdal, 1970). Tabla 5. Clasificación taxonómica de Thalassiosira pseudonana ( Hasle & Heimdal, 1970) 3.3.2 Descripción morfológica Thalassiosira pseudonana se caracteriza por tener un tamaño de diámetro de célula que oscila entre las 4 y 9 μ, y por estar débilmente silicificados. Esta diatomea es conocida por su forma cilíndrica y su frústulo silíceo compuesto de dos valvas (Figura 3). La pared celular está ornamentada con poros y costillas que facilitan el intercambio de nutrientes y gases. Nivel taxonómico Nombre del taxón Reino Chromista Filo Bacillariophyta Subfilo Bacillariophytina Clase Bacillariophyceae Subclase Coscinodiscophycidae Superorden Thalassiosiranae Orden Thalassiosirales Familia Thalassiosiraceae Género Thalassiosira Especie Thalassiosira pseudonana 12 Figura 3. Thalassiosira pseudonana en microscopio ótico Leica DMi1 a 20x aumentos 3.3.3 Distribución y ecología Thalassiosira pseudonana es una diatomea marina cosmopolita que se encuentra en una amplia variedad de hábitats marinos, desde aguas costeras hasta océanos abiertos. Es especialmente común en zonas templadas y tropicales, aunque también puede habitar en aguas más frías y menos salinas. Su distribución global se debe a su capacidad para adaptarse a diferentes condiciones de luz, temperatura y salinidad. Thalassiosira pseudonana es una fuente importante de alimento para zooplancton, larvas de peces y filtradores como moluscos y crustáceos, debido a su alto contenido en lípidos, proteínas y ácidos grasos esenciales. Estas interacciones tróficas son fundamentales para la transferencia de energía en las cadenas alimentarias marinas y para mantener la biodiversidad en los ecosistemas marinos. Una característica distintiva de T. pseudonana es su dependencia del silicio para construir sus frústulos silíceos, estructuras externas que proporcionan protección y estructura celular. El ciclo del silicio influye en su éxito competitivo y en la formación de floraciones en ambientes ricos en nutrientes. La capacidad de esta diatomea para adaptarse y responder a cambios en las condiciones ambientales, como temperatura, salinidad y disponibilidad de nutrientes, es crucial para su distribución geográfica y dinámica poblacional. Aunque Thalassiosira pseudonana desempeña un papel fundamental en los ecosistemas marinos como productor primario y fuente de alimento, las floraciones algales pueden tener impactos negativos. El exceso de nutrientes y las condiciones ambientales favorables pueden provocar floraciones que agotan los recursos disponibles y afectan la biodiversidad y la salud del ecosistema marino. La investigación futura se centra en comprender mejor la ecología de Thalassiosira pseudonana en un contexto de cambio climático global y de impactos ambientales antropogénicos. La integración de datos genómicos, ambientales y ecológicos seguirá proporcionando información crucial para gestionar y conservar esta especie clave en los ecosistemas marinos, así como para explorar sus aplicaciones potenciales en biotecnología y en la producción sostenible de recursos marinos. 19 Para que el agua de mar recogida sea apta para los siguientes ensayos, debe ser filtrada y esterilizada. En primer lugar, se realiza una filtración para eliminar todas las partículas, tanto orgánicas como inorgánicas, que puedan entorpecer el transcurso de los estudios y contaminar las muestras, como podrían ser arena, microplásticos o restos orgánicos, entre otros. Este proceso se lleva a cabo mediante una bomba de vacío, un embudo Büchner de porcelana, un Kitasato de 1 L y papel de filtro para análisis cuantitativo de 110 mm de diámetro y poro de 1-3 μm, que se cambia cada 6 L filtrados, aproximadamente. (Figura 8) Figura 8. Representación del proceso de filtrado del agua de mar Posterior al filtrado, se realiza una esterilización del agua marina mediante un autoclave, aparato que esteriliza objetos o sustancias en su interior. El proceso de esterilización se realiza durante unos 30 minutos en los cuales la muestra se encuentra a 121ºC y 1 atm. De esta forma, se pretende evitar una contaminación por bacterias presentes en el agua marina. 4.2.2.2.2 Preparación de las condiciones específicas del tamaño de partícula Según la Norma Europea EN 12457-4 de septiembre de 2002 ( Comité Europeo de Normalización, 2022), para residuos granulares, el tamaño del material a lixiviar no debe superar un tamaño de partícula de 4 mm, además la masa de material a moler debe ser 2 Kg, aproximadamente (Figura 9). Inicialmente la escoria negra de acería tiene un tamaño de 10 a 20 mm, por lo tanto, es necesaria la acción de una trituradora y así convertir la dimensión de las partículas del árido a un volumen que pase por el tamiz de 4mm. En este caso, se necesitan 2 muestras de la escoria negra de acería molida, con masas cercanas a los 2 Kg, puesto que una se destina a la cámara climática para su carbonatación. 20 Figura 9. Muestra de escoria negra de acería molida con un tamaño de partícula menor a 4 mm 4.2.2.2.3 Carbonatación de la escoria negra de acería En este caso, la escoria negra de acería se trabaja en dos estados, el árido carbonatado y sin carbonatar. Esto es debido a que se han hecho estudios que refuerzan la idea de que las escorias de acería carbonatadas resultan en una mayor captación de CO2, tienen un nivel de fijación de elementos pesados mayor y por, lo tanto, lixivian menos, además de ayudar a carbonatar diferentes componentes del árido y así afectar menos al pH del agua de mar, en este caso. (Ogawa, et al., 2020) El proceso de la carbonatación se lleva a cabo a través de una cámara climática con control de CO2. Para este ensayo, el árido estuvo sujeto a las siguientes condiciones ambientales: una temperatura de 20ºC, un nivel de humedad del 60% y una exposición de niveles del 20% de CO2 en aire, con una duración de 4 semanas. La carbonatación es una reacción química en la que los óxidos de calcio (CaO) y magnesio (MgO) presentes en la escoria reaccionan con el dióxido de carbono (CO2) del aire para formar carbonatos (CaCO3 y MgCO3). Esta reacción puede ser representada como: CaO+CO2→CaCO3 MgO+CO2→MgCO3 Los óxidos de calcio y magnesio son altamente básicos y, cuando se disuelven en agua, pueden elevar significativamente el pH del agua, haciéndola más alcalina. Los carbonatos de calcio y magnesio, por otro lado, son menos solubles en agua y menos básicos que sus respectivos óxidos. Esto significa que, una vez que los óxidos se han convertido en carbonatos, la capacidad de la escoria para aumentar el pH se reduce significativamente. 21 4.2.2.2.4 Relaciones líquido-sólido Como se ha mencionado anteriormente, en esta tesis se trabaja bajo distintas condiciones de relación líquido[mL]/sólido[g], además de tener siempre un blanco (B) como referente. También se debe mencionar que todas las muestras tienen su réplica correspondiente, para un mayor grado de fiabilidad. Se realizan 3 muestras, con sus réplicas, con las siguientes relaciones mL/g, además de un blanco: - L/S = 10; 1000mLde lixiviante / 100 g de material. - L/S = 50; 1000mLde lixiviante / 20 g de material. - L/S = 100; 1000mLde lixiviante / 10 g de material. - B = 1000 mLde lixiviante. Por tanto, se realizan las diferentes combinaciones, respecto a la naturaleza del lixiviante y la del material y las diferentes relaciones L/S, con sus respectivas replicas (Figura 10): - Agua ultrapura | Escoria negra de acería sin carbonatar. - Agua ultrapura | Escoria negra de acería carbonatada. - Agua de mar | Escoria negra de acería sin carbonatar. - Agua de mar | Escoria negra de acería carbonatada. Figura 10. Preparación de las muestras para el ensayo de lixiviación 4.2.2.3 Descripción del procedimiento de lixiviación Preparamos las muestras con sus respectivas relaciones L/S, el material se pesa en una balanza granataria hasta conseguir la masa deseada. Aparte, en el recipiente plástico se pesan 1000 g de agua y se le añaden los gramos de árido correspondientes, se repite el procedimiento con las 3 relaciones L/S de estudio, y se deja una botella solo con el agua, el blanco (B). Entonces se cierran las botellas y se colocan en el gira-botellas, y finalmente se dejan girando durante 24 horas (¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.). Una vez pasadas las 24 h, se deja reposar hasta que los sólidos suspendidos se asienten (15 ± 5 min.) y se filtran mediante la bomba de vacío. El filtrado se guarda en dos botes de 100 mL uno será para medir el pH y la conductividad y para el análisis con el HPLC y el otro para el análisis de ICP-MS (acidificado con 1 mL de HNO3, concentración de 1%). Todos se conservan a 4º C. Este proceso de ensayo se realiza tanto para agua ultrapura como agua de mar y con el material sin carbonatar y carbonatado. Además, cada muestra se realiza por duplicado. 22 4.2.2.4 Preparación posterior del eluato para el análisis Se detiene el gira-botellas pasadas las 24 horas de trabajo y se procede a filtrar las muestras mediante una bomba de vacío, un embudo Büchner de porcelana, un Kitasato de 1 L y papel de filtro para análisis cuantitativo de 110 mm de diámetro y poro de 1-3 μm. Se utiliza material que ha sido limpiado mediante agua mili-Q y secado al aire para cada muestra, de esta manera se pretende evitar su contaminación en el proceso de filtración. Las fracciones de lixiviado se guardan en dos botes de 100 mL cada uno y bien etiquetados, uno será para el análisis de ICP-MS (acidificado con 1 mL de HNO3, para obtener una concentración del ≈1%) y el otro para medir el pH y la Conductividad y hacer el análisis con el HPLC (Figura 11). Los dos se conservan en la nevera hasta el momento de su correspondiente análisis. Figura 11. Frascos de 100 mL para los eluatos resultantes del proceso de lixiviación 4.2.2.5 Medidas de pH y conductividad Al ser el pH y la conductividad unos de los parámetros más influyentes en la lixiviación, estos ensayos son fundamentales para la comprensión del comportamiento químico del contaminante. Además, saber los valores de pH resultantes, del agua de mar expuesta a la escoria negra de acería, nos ayudaran a comprender mejor los posibles comportamientos del fitoplancton en los futuros ensayos, puesto que tienen una cierta sensibilidad a las variaciones en el pH del agua. Las mediciones de pH y conductividad se realizan después de recolectar las distintas fracciones resultantes de la lixiviación, es decir, a las 24 horas, una vez terminado en trabajo del gira-botellas. Las mediciones se realizan mediante un pHmetro y un conductímetro (Figura 12) 23 Figura 12. pHmetro CRISON Basic 20+ y conductímetro CRISON GLP 31, respectivamente 4.2.3 Ensayos caracterización biológica 4.2.3.1 Preparación del medio de cultivo Para realizar los cultivos madre o cultivos stock, se utiliza el medio de cultivo f/2 que es uno de los medios minerales de cultivo más utilizados para el crecimiento de microalgas en laboratorio. Fue desarrollado inicialmente por Guillard y Ryther en 1962 (Anderson, 2005) y se ha convertido en un estándar en la investigación de microalgas debido a su eficacia y simplicidad. El medio f/2 está formulado para proporcionar todos los nutrientes esenciales necesarios para el crecimiento óptimo de microalgas marinas. Estos nutrientes incluyen macronutrientes (nitratos, fosfatos, silicatos), micronutrientes (hierro, zinc, manganeso, cobre, molibdeno, etc.), y vitaminas (tiamina, biotina y cobalamina). 4.2.3.1.1 Nannochloropsis salina N. salina se obtuvo de un comercio de acuicultura, y se desconocía la composición precisa de los macronutrientes (fósforo y nitrógeno) que contenía el cultivo stock que se transferirían a los cultivos experimentales. Por ello, se realizó un estudio previo a la preparación del cultivo madre. Se iniciaron cultivos en agua de mar en dos condiciones: a una de ellas, se le añadió fosfato y nitrato en las concentraciones de f/2, mientras que a la segunda no se le añadieron nutrientes. Las muestras se colocaron en una cámara climática durante 7 días. Pasada la semana, se llevó a cabo un ensayo de clorofila-a en cada muestra y se compararon los resultados. Ambos cultivos mostraron una densidad celular muy similar, por lo que se decidió no añadir fósforo ni nitrógeno extra en los experimentos siguientes (Figura 13). Una vez que se confirmó que la cantidad de nutrientes del cultivo inicial era adecuada, se procedió a la preparación del medio de cultivo para el cultivo madre de los experimentos. Como se mencionó anteriormente, esto se realiza utilizando el medio de cultivo f/2. El cultivo madre de N. salina se prepara con 200 mL del medio de cultivo f/2 y 200 mL del cultivo inicial de la microalga. De esta manera se esperaba obtener unos 400 mL de cultivo que permitiera inocular todos los frascos experimentales a partir de un mismo cultivo madre. 24 Figura 13. Preparación del cultivo madre de Nannochloropsis salina 4.2.3.1.2 Thalassiosira pseudonana Thalassiosira pseudonana se encuentra en la colección de cultivos del ICM-CSIC y fue proporcionada amablemente por el Grupo de Zooplancton (A. Calbet, E. Saiz). Al ser una microalga de la familia de las diatomeas, necesita silicato para la formación de la pared celular. Por tanto, al medio de cultivo con f/2, con fosfatos y nitratos, se le añaden también silicatos. El cultivo madre de la T. pseudonana, por tanto, se realizó con la inoculación 40 mL de un cultivo stock de la microalga en el ICM en 300 mL de f/2 + silicato (Figura 14). Figura 14. Cultivo madre de Thalassiosira pseudonana 25 4.2.3.2 Preparación de los experimentos Los ensayos de carácter biológico consistieron en dos tipos principales de tratamientos (tipo A y B) y a su vez, diferentes tratamientos, con dos réplicas todos ellos, lo cual representa un total de 18 frascos experimentales por cada especie de fitoplancton marino estudiada. 4.2.3.2.1 Tratamiento tipo A El primer tratamiento consistió en la exposición del fitoplancton a agua de mar filtrada y esterilizada de L'Estartit junto con escoria negra de acería valorizada, con una relación líquido/sólido de 4:1. Por un lado, tenemos el tratamiento con la escoria de acería carbonatada (CS) y, por otro, el árido sin carbonatar (NCS), cada uno con sus respectivas réplicas. Además, se incluyen dos tratamientos solo con agua de mar, que funcionan como controles del crecimiento de las microalgas sin estar en contacto con el árido, permitiendo así la comparación de los resultados (Figura 15). Todos los recipientes experimentales consistieron en botellas de 2 litros de HHPE/PP con tapón, previamente esterilizados mediante autoclavado. Los experimentos se iniciaron en cada condición, inoculando el correspondiente volumen de cultivo madre de la especie en estudio. Figura 15. Ilustración del tratamiento tipo A 4.2.3.2.2 Tratamiento tipo B En el segundo tipo de tratamiento, el agua de mar preparada de L'Estartit se puso en contacto con escoria negra de acería valorizada durante 24 horas, 48 horas o 7 días. Por un lado, tenemos agua de cada uno de dichos tratamientos con escoria de acería carbonatada (CS) y, por otro, con el árido sin carbonatar (NCS), cada una con sus respectivas réplicas (Figura 16), distribuidas en 12 botellas. A estas muestras preparadas se les añadirá el inóculo de fitoplancton marino al inicio del ensayo. Las diferentes aguas se distribuyeron en botellas de 2 litros con tapón, que han sido previamente esterilizados mediante autoclavado. 26 Figura 16. Ilustración del tratamiento tipo B 4.2.3.3 Cultivo de fitoplancton Los experimentos se realizaron por duplicado, utilizando las dos cepas de fitoplancton marino diferentes, una clorófita y una diatomea. De esta forma se espera entender mejor el comportamiento resultante del fitoplancton marino. 4.2.3.3.1 Inoculación La inoculación de fitoplancton marino en el laboratorio es un procedimiento en el cual se introduce una cantidad conocida de microalgas en un medio de cultivo controlado, con el propósito de cultivarlo y estudiarlo (Figura 17). En este caso, en contacto con la escoria negra de acería valorizada, tanto carbonatada como sin carbonatar. Figura 17. Ilustración del proceso de inoculación del fitoplancton El proceso de inoculación del fitoplancton se debe realizar en condiciones estériles, es decir, bajo la campana de flujo laminar con el mechero Bunsen encendido. El inóculo de cada especie de microalga es el mismo en sus 18 potes de cultivo, puesto que todos tienen el mismo volumen de agua de mar. 27 Este proceso es el mismo para las dos cepas de fitoplancton marino de estudio, pero el valor de los inóculos varia debido a las concentraciones iniciales del cultivo madre de cada microalga. 4.2.3.3.2 Condiciones de cultivo El cultivo del fitoplancton marino tiene lugar en una cámara climática de cultivo (Figura 18). Se someten a las mismas condiciones de luz y temperatura a los dos tipos de microalgas. La temperatura de la cámara climática es de 20 ± 2ºC y periodos de luz / oscuridad 14h/10h. Figura 18. Cámara climática de cultivo 4.2.3.3.3 Muestreo Se realiza un muestreo cada 2-3 días para monitorear la evolución del fitoplancton a lo largo del tiempo e identificar las fases de crecimiento logarítmico, estacionario y de declive. El proceso de muestreo se debe realizar bajo condiciones asépticas, se trabaja en una cámara de flujo laminar, con el mechero Bunsen encendido (Figura 19). Se recogen 7-10 mL de muestra de cada uno de los 18 frascos experimentales para su estudio: 5 mL serán destinados a la determinación de la concentración de clorofila-a y unos 1 mL – 5 mL para el recuento celular. 28 Figura 19. Ilustración del proceso de muestreo del fitoplancton 4.2.3.4 Recuento celular 4.2.3.4.1 Nannochloropsis salina 4.2.3.4.1.1 Principio del método Para el recuento celular de Nannochloropsis salina, cuyo tamaño de célula es muy pequeño (1-3 μm), se utiliza un citómetro de flujo, en este caso el modelo CytoFLEX S (Figura 20). Este instrumento emplea tecnología de láser y detección óptica para contar y analizar las características físicas y químicas de las células en una suspensión líquida. Figura 20. Citómetro de flujo CytoFLEX S 4.2.3.4.1.2 Fijación y análisis de las muestras de ensayo Al recoger las muestras de los cultivos, se destinan 1800 μL para el recuento celular mediante citometría de flujo, depositándolas en crioviales junto con 200 μL de una solución de paraformaldehído y glutaraldehído (P + G) para su fijación. Las muestras se almacenan en un congelador a -80ºC durante 24 horas (Figura 21). Pasado este tiempo, las muestras se descongelan y se transfieren 400 μL de cada una a tubos de plástico nuevos para su análisis. Además, se añaden 2μL de beads, que son microesferas fluorescentes utilizadas para proporcionar una referencia sobre los volúmenes de las diferentes partículas de la muestra fijada. 35 En la Tabla 9 se recogen las diferentes fases encontradas en la escoria negra de acería valorizada. Gehlenita (Ca2Al2SiO7) es un mineral silicato rico en calcio y aluminio, siendo estable a altas temperaturas. Wuestita (FeO) es un óxido de hierro conocido por su color negro y estructura cristalina. Larnita (Ca2SiO4) es un silicato de calcio importante en la industria del cemento, contribuyendo a la resistencia y durabilidad del cemento Portland. Magnetita (Fe3O4) es un mineral de óxido de hierro con propiedades magnéticas. Tabla 9. Fases presentes en la escoria negra de acería valorizada En la Figura 26 se recogen los compuestos mineralógicos de la escoria negra de acería valorizada. Figura 26. Composición mineralógica de la escoria negra de acería valorizada 5.1.4 Ensayos de lixiviación 5.1.4.1 Agua desionizada como agente lixiviante La Figura 27 muestra la cantidad liberada de contaminantes resultante de la lixiviación de la escoria negra de acería sin carbonatar, en función de la relación líquido/sólido (L/S) en agua desionizada (Mili-Q). Estas cantidades de material [mg/Kg] se comparan con los límites establecidos para Fases presentes Gehlenita (Ca2Al2SiO7) Wuestita (FeO) Larnita (Ca2SiO4) Magnetita (Fe3O4) 36 materiales inertes según el Decreto 2003/33/EC. Este estilo de gráfica es útil para identificar cuáles contaminantes necesitan mayor control y tratamiento para cumplir con las normativas ambientales y minimizar el impacto ecológico. En el caso de la escoria no carbonatada, los elementos contaminantes que sobrepasan el límite de material inerte que les corresponde son el Ni en la relación L/S=100, el V en los casos L/S=50 y L/S=100, el Hg también en las muestras L/S=50 y L/S=100 y, por último, el Ba donde las tres relaciones L/S se encuentran demasiado elevadas. Por lo tanto, los contaminantes Ni, V, Hg y Ba superan los límites establecidos para materiales inertes en varias condiciones de L/S, lo que indica una preocupación ambiental en cuanto a la liberación de estos elementos. Otros elementos, como As, Cr, Cd y Sb, se liberan en cantidades muy por debajo de los límites, lo que sugiere menor riesgo en términos de estos contaminantes específicos. Figura 27. Resultados del proceso de lixiviación de la escoria negra de acería no carbonatada en agua desionizada La Figura 28 muestra la cantidad liberada de contaminantes resultante de la lixiviación de la escoria negra de acería carbonatada, en función de la relación líquido/sólido (L/S) en agua Mili-Q. Estas cantidades de material [mg/Kg] se comparan con los límites establecidos para materiales inertes según el Decreto 2003/33/EC. En el caso de la escoria de acería carbonatada, se observa una notable disminución en la cantidad de lixiviados en comparación con la escoria sin carbonatar. Sin embargo, algunos elementos contaminantes aún superan los límites establecidos para materiales inertes. En particular, el V sobrepasa el límite en la muestra con relación L/S = 100 y el Hg excede los límites en todas las relaciones L/S evaluadas. Además, el Ni en la muestra con L/S = 100 y el Ba en las tres relaciones L/S analizadas están cercanos al límite permitido. En contraste, el Cd está completamente ausente, y el Pb solo se detecta en la muestra con L/S = 100. 37 Figura 28. Resultados del proceso de lixiviación de la escoria negra de acería carbonatada en agua desionizada Comparando los resultados de los lixiviados de la escoria negra de acería carbonatada y sin carbonatar en agua desionizada, Mili-Q, se puede afirmar que, en el caso de la escoria carbonatada, las cantidades de contaminantes son menores en todos los casos. Sin embargo, en ambos tipos de escoria se encuentran elevadas cantidades de Ni, V, Hg y Ba, lo que indica una preocupación ambiental significativa en cuanto a la liberación de estos elementos. La menor cantidad de elementos contaminantes en la escoria carbonatada respecto la sin carbonatar, se debe a que la carbonatación puede inmovilizar ciertos metales pesados presentes en la escoria, reduciendo su solubilidad y toxicidad, lo que resulta en un ambiente menos tóxico. (Ogawa, et al., 2020) En cuanto a las diferentes relaciones L/S, se observa que, en general, a mayor relación L/S, es decir, menor cantidad de material respecto al eluato, mayor es la cantidad de contaminantes liberados. Esto podría deberse a la saturación del eluato cuando está en contacto con una cantidad elevada de árido; llega un punto en el cual el agua no puede disolver más elementos de la escoria. Por tanto, cuando hay más líquido en la muestra, el sistema no se satura y puede liberar una mayor cantidad de elementos contaminantes, lo que resulta en concentraciones más altas en relaciones L/S mayores. En conclusión, según la Norma Europea EN 12457-4 de septiembre de 2002 ( Comité Europeo de Normalización, 2022) para materiales granulares, se observa que en todos los casos estudiados, la relación L/S = 10 no supera el límite establecido. Por lo tanto, el material se considera inerte. 5.1.4.2 Agua de mar como agente lixiviante La Figura 29 muestra la cantidad de contaminantes liberados como resultado de la lixiviación de la escoria negra de acería sin carbonatar, en función de la relación líquido/sólido (L/S) en agua de mar de la playa del L’Estartit. En este caso, el agua de mar ya contiene estos elementos contaminantes. Por tanto, se estudiarán las cantidades de lixiviados liberados por la escoria utilizando el agua de mar como control, con HMar L/S = 10. 38 Figura 29. Resultados del proceso de lixiviación de la escoria negra de acería no carbonatada en agua de mar La Figura 30 muestra la cantidad de contaminantes liberados como resultado de la lixiviación de la escoria negra de acería carbonatada, en función de la relación líquido/sólido (L/S) en agua de mar de la playa del L’Estartit. En este caso, el agua de mar ya contiene estos elementos contaminantes. Por tanto, se estudiarán las cantidades de lixiviados liberados por la escoria utilizando el agua de mar como control, con HMar L/S = 10. Figura 30. Resultados del proceso de lixiviación de la escoria negra de acería carbonatada en agua de mar 39 En la Figura 27 y Figura 28, que utilizan agua desionizada en sus ensayos, los elementos contaminantes que sobrepasaban sus límites establecidos para materiales inertes según el Decreto 2003/33/EC son Ni, V, Hg y Ba. Por tanto, en este apartado, utilizando agua de mar como lixiviante, nos centraremos en los resultados de estos elementos. Al comparar los resultados de los lixiviados de la escoria negra de acería carbonatada y sin carbonatar en agua de mar, se observan las siguientes tendencias para los elementos Ni, V, Hg y Ba: en el caso del Ni, no se observan diferencias significativas en las muestras con el árido carbonatado y sin carbonatar, por otro lado, con relación al V se observan valores menores en las relaciones L/S=50 y L/S=100 por parte de la escoria carbonatada. Finalmente, en el caso del Hg y el Ba la escoria negra de acería carbonatada presenta valores de cantidad significativamente menores a los del árido sin carbonatar. Estos resultados indican que la carbonatación de la escoria negra de acería reduce la liberación de Hg y Ba, así como del V en ciertas condiciones, aunque no afecta significativamente la liberación de Ni. Esto se debe a que la carbonatación puede inmovilizar ciertos metales pesados presentes en la escoria, reduciendo su solubilidad y toxicidad, lo que resulta en un ambiente menos tóxico. (Ogawa, et al., 2020) 5.1.4.3 Medidas de pH y conductividad Las siguientes gráficas recogen los valores de pH y conductividad de los lixiviados de la escoria negra de acería carbonatada y sin carbonatar, durante los ensayos de lixiviación. 5.1.4.3.1 Agua desionizada (Milli-Q) como lixiviante En la Figura 31 y Figura 32 se recogen los valores de pH y conductividad de los lixiviados en agua desionizada y en agua de mar, respectivamente. Figura 31. pH y conductividad del agua desionizada en contacto con la escoria negra de acería valorizada 40 Desde el punto de vista del valor de pH, en los dos casos, se observa como los valores de pH que provienen de las lixiviaciones de la escoria negra sin carbonatar (NCS) son mayores, respecto al control, que la escoria negra carbonatada (CS). Esto se debe a que el proceso de carbonatación al que se ha sometido la CS, como ya se ha comentado, transforma los óxidos básicos de calcio y magnesio en carbonatos más estables y menos solubles, reduciendo así su capacidad de aumentar la alcalinidad del agua. En el caso de la conductividad, es mayor en las muestras de NCS que de CS en el caso del agua desionizada como lixiviante, y todo lo contrario en el caso del agua de mar, donde las CS tienen una conductividad más elevada que las NCS. Esto es debido a la solubilidad de los carbonatos en el agua de mar. Los carbonatos de calcio y magnesio presentes en la escoria carbonatada se disuelven en el agua de mar, liberando iones Ca²⁺, Mg²⁺ y HCO₃⁻, lo que aumenta la concentración iónica y, por tanto, la conductividad eléctrica. En contraste, la escoria sin carbonatar, que contiene principalmente óxidos, libera menos iones al agua de mar, resultando en una menor conductividad. Por otro lado, se observa que, en el caso del agua de mar, la adición de escoria negra de acería no resulta en cambios significativos en la conductividad del agua de mar (Control). En contraste, en el caso del agua desionizada como lixiviante en contacto con la escoria negra de acería aumenta su conductividad debido a la liberación de iones de la escoria en el agua ultrapura, lo que eleva significativamente la concentración de elementos conductores. Figura 32. Medidas de pH y conductividad de agua de mar en contacto con la escoria negra de acería valorizada 41 5.2 Ensayos caracterización biológica 5.2.1 Cálculo del volumen de inóculo En el caso de Nannochloropsis salina, a partir de un cultivo madre en fase exponencial con una concentración de 229,5 μg/L de clorofila-a, se realizaron inóculos de 20 mL en cada frasco experimental de 400 mL, de manera que la concentración inicial es de 10 μg/L de clorofila-a. En el segundo caso de estudio, con Thalassiosira pseudonana, a partir de un cultivo madre en fase exponencial con una concentración de 739 μg/L de clorofila-a, se realizaron inóculos de 6 mL en cada frasco experimental de 400 mL, de manera que la concentración inicial es de 10 μg/L de clorofila-a. 5.2.2 Resultados en base a los recuentos celulares En estas gráficas se puede observar la evolución temporal de los cultivos en los distintos tratamientos, según las estimaciones del número de células. 5.2.2.1 Nannochloropsis salina 5.2.2.1.1 Tratamientos tipo A Los siguientes gráficos muestran la evolución del número de células de Nannochloropsis salina a lo largo del tiempo. Los valores en los gráficos son los promedios de dos cultivos de cada tipo de muestra. En la Figura 33, se muestra la evolución del cultivo, expresado en número de células en los tratamientos tipo A, es decir, los cultivos en agua de mar en contacto directo con la escoria negra de acería carbonatada (CS) y sin carbonatar (NCS), con una relación líquido/sólido 4:1, junto con un grupo Control (Ctr). En el caso de N. salina, como ya se ha mencionado, se realizan los recuentos celulares mediante de citómetro de flujo. Los recuentos en los tratamientos del tipo A presentaron valores con mucha variabilidad en comparación con las muestras de los tratamientos tipo B, así como en los valores de clorofila-a. Se cree que fue debido probablemente a una elevada presencia de partículas inorgánicas en suspensión con elevado contenido en metales en las muestras procedentes de los recipientes con escoria. Las partículas inorgánicas pueden obstruir los capilares o los canales del citómetro de flujo, causando interrupciones y alteraciones en el análisis. Además, aumentan el ruido de fondo en las mediciones, lo que reduce la sensibilidad y la precisión del citómetro de flujo para detectar y contar células específicas. Por tanto, la inclusión de partículas inorgánicas en los datos del citómetro de 42 distinción entre células y partículas no celulares, afectando así la calidad y la interpretación de los datos obtenidos (véase Tabla A. 1-2-3, Anexo A). Por esta razón, en el caso de la Nannochloropsis salina, se presentan y discuten los resultados obtenidos en los tratamientos de tipo B a partir de las estimaciones de la concentración de clorofila-a para obtener conclusiones. Figura 33. Evolución del número de células de la Nannochloropsis salina en los tratamientos tipo A 5.2.2.1.2 Tratamientos tipo B En la Figura 34, se muestra la evolución del número de células de Nannochloropsis salina presentes en las muestras tipo B, es decir, los cultivos en agua de mar que ha estado en contacto con la escoria negra de acería sin carbonatar (NCS), durante 24h, 48h o 7 días. En este caso, se observa que los tres cultivos con aguas tratadas siguen una curva de crecimiento muy similar entre ellos, donde los coeficientes de variación (CV%) entre los dos cultivos de cada muestra de ensayo, durante los primeros siete días, no superan el 5% de CV%, y posteriormente van aumentando (véase Tabla A. 4-5-6, Anexo A). Este aumento con el paso del tiempo de cultivo puede deberse a que, a medida que el cultivo consume los nutrientes disponibles en el medio, la variación en la concentración de nutrientes puede causar diferencias en el crecimiento de las células de fitoplancton. De todos modos, no se pudo analizar la concentración de los nutrientes a lo largo de los experimentos. Este aspecto debería estudiarse con más detalle en futuros experimentos. En la fase exponencial, la velocidad de crecimiento inicial de las aguas tratadas es notablemente similar, alcanzándose el punto de máxima densidad celular el día 7. Posteriormente, se entra en una breve fase estacionaria hasta el día 11, después de lo cual comienza a decrecer el número de células de fitoplancton marino en los tres distintos tratamientos. En cuanto al punto de máxima densidad celular, no se observan diferencias significativas entre los cultivos con NCS/48h y NCS/7d, siendo el pico de NCS/48h apenas un 5% mayor que el del tratamiento de 7 días. Por otro lado, NCS/24h presenta un 15% menos de células de N. salina en 43 comparación con el cultivo con agua de mar tratada durante 48h, que es el tratamiento con un a biomasa total (expresada en número de células) resultante mayor. Figura 34. Evolución del número de células de la Nannochloropsis salina en los tratamientos tipo B con NCS En la Figura 35, se muestra la evolución del número de células de Nannochloropsis salina presentes en las muestras tipo B, es decir, los cultivos en agua de mar que ha estado en contacto con la escoria negra de acería carbonatada (CS), durante 24h, 48h o 7 días. En el caso de la escoria negra de acería carbonatada, las curvas de crecimiento son similares a las de la Figura 34, que representa la escoria negra de acería sin carbonatar. Los coeficientes de variación entre los dos cultivos de cada muestra de ensayo durante los primeros siete días no superan el 4% de variación, pero posteriormente van aumentando, a excepción de la muestra con agua tratada durante 24h. En el caso de la muestra CS/24h, el coeficiente de variación ronda el 10% desde el inicio del ensayo. Esta variación inicial podría deberse a que, en la inoculación del fitoplancton marino, una de las dos muestras recibió un mayor número de células. Estos valores han ido evolucionando con el tiempo, pero al partir de un inicio tan dispar, el CV% en 11% hasta el último día de cultivo, donde aumenta notablemente (véase Tabla A. 7-8-9, Anexo A). El aumento del coeficiente de variación de los cultivos a lo largo del tiempo, como ya se ha comentado en el caso de la NCS, es muy probablemente debido a la disponibilidad de nutrientes en los últimos días, aunque debería comprobarse. En cuanto al punto de máxima densidad celular, no se observan diferencias significativas entre los cultivos con NCS/48h y NCS/7d, siendo el pico de NCS/48h apenas un 3% mayor que el del tratamiento de 7 días. Por otro lado, NCS/24h presenta un 25% menos de células de N. salina en 44 comparación con el cultivo con agua de mar tratada durante 48h, que es el tratamiento con una biomasa total resultante mayor. Figura 35. Evolución del número de células de la Nannochloropsis salina en los tratamientos tipo B con CS Con referencia a la Figura 34 y Figura 35, no se presentan diferencias significativas entre ellas. La estructura de las curvas de crecimiento sigue el mismo patrón y los valores máximos de densidad celular representan cantidades relativamente similares. En todos los casos, el valor total de biomasa mayor lo ocupan los cultivos con agua de mar tratada durante 48 horas, sin ser apenas distantes de los valores de las muestras con aguas tratadas durante siete días. 51 En la Figura 41, se muestra la evolución de la cantidad de clorofila-a de Nannochloropsis salina presentes en las muestras tipo B, es decir, los cultivos en agua de mar que ha estado en contacto con la escoria negra de acería carbonatada (CS), durante 24h, 48h o 7 días. En el caso de la escoria negra de acería carbonatada, las curvas de crecimiento son similares a las de la Figura 40, que representa la respuesta de la microalga a la exposición a la escoria negra de acería sin carbonatar. En cuanto al pico máximo de clorofila-a, el tratamiento CS/48h presenta el valor más alto, siendo solo un 10% mayor que el tratamiento CS/7d y la muestra A, pero un 25% mayor que el cultivo con agua de mar tratada durante 24h. En referencia al coeficiente de variación de los cultivos con escoria de acería carbonatada, se muestra como en el tratamiento de tipo CS/24h se inicia el ensayo con un CV del 70% y va disminuyendo exponencialmente hasta llegar a un valor del 6%. Por otro lado, en el caso de las muestras con agua de mar tratada durante 48 horas se mantiene un CV% alrededor del 15% durante todo el tiempo de cultivo. Por último, en el tratamiento CS/7d se muestra un CV inicial del 39% y disminuye exponencialmente con el paso del tiempo a un porcentaje del 2% (véase Tabla B. 7-8-9, Anexo B). Figura 41. Evolución del contenido de clorofila-a en Nannochloropsis salina en los tratamientos tipo B con CS Con referencia a la Figura 40 y Figura 41, no se presentan diferencias marcadas entre ellas. La estructura de las curvas de crecimiento sigue el mismo patrón y los valores máximos de clorofila-a representan cantidades relativamente similares. En todos los casos, la cantidad de clorofila-a es mayor con respecto al grupo control, tanto en los tratamientos tipo A como en los de tipo B. Esto sugiere 52 que Nannochloropsis salina podría disponer de más nutrientes en el agua de mar en los cultivos con escoria negra de acería, principalmente debido a los lixiviados del árido. 5.2.3.2 Thalassiosira pseudonana 5.2.3.2.1 Tratamientos tipo A Los siguientes gráficos muestran la evolución del contenido de clorofila-a de Thalassiosira pseudonana a lo largo del tiempo. Los valores en los gráficos son los promedios de dos cultivos de cada tipo de muestra. En la Figura 42, se muestra la evolución de la cantidad de clorofila-a en los tratamientos tipo A, es decir, los cultivos en agua de mar en contacto directo con la escoria negra de acería carbonatada (CS) y sin carbonatar (NCS), con una relación líquido/sólido 4:1, junto con un grupo Control (Ctr). En todos los tratamientos los cultivos inician rápidamente la fase exponencial, reflejado en un aumento inicial de la cantidad de clorofila-a. En esta fase, los tres tratamientos presentan pendientes similares, indicando que las velocidades de crecimiento de los distintos cultivos prácticamente no se pueden distinguir entre ellas. En todos los cultivos, se alcanza el punto máximo de clorofila-a el día 5 del ensayo, después del cual los valores de clorofila-a de la curva de crecimiento empiezan a decrecer. En los cultivos con escoria negra de acería carbonatada (CS), la pendiente de decrecimiento de los valores de clorofila-a es menos pronunciado que en las muestras con escoria negra de acería sin carbonatar (NCS). En el caso del grupo control, los valores del CV fluctúan entre valores del 15% al 20%, hasta el último día de cultivo donde disminuye hasta un 3%. Por otro lado, en los cultivos con escoria negra de acería sin carbonatar, se mantienen valores de CV de entre 10% y 15%, hasta el último día de ensayo que disminuye a un valor del 1%. Finalmente, los cultivos con escoria negra de acería carbonatada inician el ensayo con un valor de coeficiente de variación del 10% y va disminuyendo de forma más o menos exponencial hasta un 5% (véase Tabla B. 10-11-12, Anexo B). En cuanto al pico máximo de clorofila-a, se observan diferencias significativas entre los tres casos de estudio. El valor más alto se encuentra en los cultivos con CS, siendo más de un 50% mayor que el del Control y un 25% mayor que el de los cultivos con NCS. Los resultados muestran que tanto los cultivos con NCS como los con CS favorecen el crecimiento positivo de Thalassiosira pseudonana, especialmente en los cultivos con escoria carbonatada. Estos valores indican que esta cepa de fitoplancton encuentra más nutrientes en el agua de mar de los cultivos con escoria negra de acería, principalmente debido a los lixiviados del árido. Comparando los cultivos con escoria negra de acería carbonatada y sin carbonatar, se observa una mayor cantidad de biomasa total en los cultivos con CS. Esto podría deberse a que la escoria carbonatada estabiliza el pH, proporciona una liberación controlada de nutrientes esenciales como calcio y magnesio, y reduce la toxicidad de metales pesados, creando un entorno más favorable para el crecimiento del fitoplancton marino. En contraste, la escoria sin carbonatar puede aumentar significativamente el pH 53 y liberar nutrientes de manera abrupta y menos aprovechable. Además, la escoria carbonatada mejora la disponibilidad de dióxido de carbono disuelto, esencial para la fotosíntesis del fitoplancton. Figura 42. Evolución del contenido de clorofila-a en Thalassiosira pseudonana en los tratamientos tipo A 5.2.3.2.2 Tratamientos tipo B En la Figura 43, se muestra la evolución de la cantidad de clorofila-a de Thalassiosira pseudonana presentes en las muestras tipo B, es decir, los cultivos en agua de mar que ha estado en contacto con la escoria negra de acería sin carbonatar (NCS), durante 24h, 48h o 7 días. En este caso, se observa cómo los 3 cultivos con aguas tratadas siguen una curva de crecimiento muy similar a la de la muestra tipo A con escoria negra de acería sin carbonatar. En el caso de las muestras de agua de mar tratada durante 24 horas con escoria negra de acería sin carbonatar, los coeficientes de variación inicialmente de un 12% disminuyen de manera más o menos exponencial hasta alcanzar un 2% al final del periodo de tratamiento. Por otro lado, en las muestras NCS/48h, los días 2 y 5 de cultivo muestran CV del 19% y 18%, respectivamente. En los días restantes del ensayo, los CV no superan el 10%, finalizando con un valor del 1%. Finalmente, en las 54 muestras NCS/7d, los CV% se mantienen entre el 20% y el 30%, excepto en los días 2 y 5, donde son del 2% y 5%, respectivamente (véase Tabla B. 13-14-15, Anexo B). En cuanto al pico máximo de clorofila-a, el valor más elevado pertenece a la muestra tipo A (NCS), siendo un 13% mayor al valor de pico del tratamiento NCS/24h, un 23% mayor en el tratamiento NCS/48h y un 30% más grande que el valor del tratamiento NCS/7d. Figura 43. Evolución del contenido de clorofila-a en Thalassiosira pseudonana en los tratamientos tipo B con NCS En la Figura 44, se muestra la evolución de la cantidad de clorofila-a de Thalassiosira pseudonana presente en las muestras tipo B, es decir, los cultivos en agua de mar que han estado en contacto con la escoria negra de acería carbonatada (CS), durante 24h, 48h o 7 días. En este caso, se encuentran diferencias entre las curvas de crecimiento de los diferentes cultivos. En el caso de las aguas tratadas con CS, el pico máximo de clorofila-a se encuentra en el día 5 de cultivo, aproximadamente, a excepción del agua tractada con CS durante 7 días, su pico máximo de clorofilaa corresponde al día de ensayo 2-3. Además, el valor máximo de clorofila-a pertenece a los cultivos del tipo A, siendo un 37% mayor que el del cultivo CS/24h, un 44% mayor a las muestras de CS/48h y un 63% mayor que el de los cultivos CS/7d (véase Tabla B. 16-17-18, Anexo B). En el caso de las muestras de agua de mar tratada durante 24 horas con escoria negra de acería carbonatada, los coeficientes de variación se mantienen entre el 10% y el 20% sin seguir un patrón claro, hasta el último día de cultivo dónde presenta un valor del 51%. Por otro lado, en el caso de las muestras CS/48h, los días 7 y 13 de cultivo presentan valores de 14% y 20%, respectivamente. En los demás días de ensayo, los CV% se mantienen cercanos al 5%. Finalmente, en el caso de los cultivos del tipo CS/7d, los CV% se mantienen entre el 10% y el 30% sin seguir ningún patrón aparente. 55 Figura 44. Evolución del contenido de clorofila-a en Thalassiosira pseudonana en los tratamientos tipo B con CS En referencia a la Figura 43 y Figura 44, siendo tan similares las curvas de crecimiento de todos los cultivos a excepción de las muestras con agua tratada durante 7 días, se podría deber a una menor presencia de nutrientes en el agua de mar, quizás por una menor lixiviación del árido en este caso. 56 6 CONCLUSIONES Después de una campaña experimental con diferentes tipos de fitoplancton, se ha observado que la escoria de acería, especialmente la carbonatada, podría ser una opción viable para el crecimiento de microalgas marinas. La densidad de la escoria estudiada es de 3,5 g/cm³, ligeramente superior a lo documentado en la literatura. En cuanto a la granulometría, la muestra analizada contiene una gran proporción de partículas en el rango de 8 a 16 mm, con prácticamente todas las partículas menores de 32 mm. El ensayo de caracterización química de la escoria negra de acería valorizada revela diferencias significativas respecto a los valores estándar de cada elemento presente en la escoria de acería. Las principales diferencias incluyen una mayor cantidad de Al₂O₃, Fe y CaO en la escoria valorizada. Destaca especialmente el contenido de hierro, que en la escoria estudiada alcanza el 38.55%, comparado con el rango estándar de 18% a 30%. La caracterización mineralógica muestra las siguientes fases: Gehlenita (Ca2Al2SiO7), Wuestita (FeO), Larnita (Ca2SiO4) y Magnetita (Fe3O4). Los elementos contaminantes en agua desionizada y en agua de mar fueron menores en la escoria negra de acería carbonatada (CS) en comparación con la escoria negra de acería sin carbonatar (NCS) en todos los casos. Según la norma y los resultados de L/S = 10, se cumplen los límites y el material se puede catalogar como inerte. El pH de los tratamientos con escoria negra de acería sin carbonatar (NCS) resultó ser mayor, es decir, más ácido, en comparación con los tratamientos con escoria de acería carbonatada (CS), que mantuvieron un pH más estable tanto en agua desionizada como en agua de mar. En cuanto a la conductividad, fue mayor en NCS que en CS en agua desionizada, mientras que en agua de mar ocurrió lo contrario, debido a la solubilidad de los carbonatos en el agua de mar. El seguimiento de los cultivos se realizó en base a dos indicadores de biomasa: el número de células y la concentración de clorofila-a. Estos parámetros aportan diferente información sobre la respuesta de los cultivos. El número de células no es directamente comparable entre especies diferentes debido a las variaciones en tamaño y características de cada especie en cultivo. Mientras que el seguimiento de Nannochloropsis salina se realizó mediante citometría de flujo, el de Thalassiosira pseudonana se hizo mediante microscopía óptica. Por tanto, los valores absolutos de las abundancias celulares no son directamente comparables. Además, la presencia de metales y/o partículas inorgánicas podría haber interferido en las mediciones mediante citometría de flujo, como se menciona en la sección 5.2.2.1.1. Por esta razón, la estimación de la concentración de clorofila-a, común a ambas especies, permite comparar sus respuestas a los distintos tratamientos. En general, el orden de magnitud de la clorofilaa es muy similar y permite observar tendencias de crecimiento según el cultivo. Los cultivos con mayor biomasa total fueron aquellos en presencia de escoria negra de acería. Además, los tratamientos con escoria de acería carbonatada (CS) mostraron mejores resultados que los realizados con escoria negra de acería sin carbonatar (NCS), creando un entorno más favorable para el crecimiento del fitoplancton marino. En los tratamientos tipo A, con la escoria de acería directamente en los cultivos, los resultados sugieren un mayor nivel de nutrientes en presencia de escoria de acería. 57 En los tratamientos tipo B, con aguas que han estado en contacto con la escoria de acería durante 24 horas, 48 horas o 7 días, el crecimiento del fitoplancton fue mayor en comparación con los cultivos sin escoria, sin diferencias marcadas entre los tres tipos de tratamiento B. Con respecto a la escoria negra de acería, el material carbonatado presenta una mejor respuesta en el crecimiento del fitoplancton marino debido a su menor lixiviación de elementos contaminantes y a su capacidad para mantener el pH del agua más estable. 58 7 TRABAJO FUTURO En un futuro escenario de trabajo, se plantean diversas modificaciones en los ensayos, además de posibles ampliaciones en el ámbito de las especies de estudio. Un volumen mayor en las muestras de los tratamientos de ensayo haría posible analizar más parámetros y por tanto un aumento en la fiabilidad de los resultados. Igualmente, un número mayor de las réplicas de cada tratamiento de cultivo, y con diferentes concentraciones de microalgas. Medir con más detalle las concentraciones de macronutrientes y de micronutrientes para asegurar que se empieza con cantidades similares, y ver como se consumen a medida que crecen las algas. Realizar un seguimiento de los valores de pH a lo largo del tiempo en las diversas muestras, permitirá analizar la evolución y las posibles implicaciones en el comportamiento de las algas. Realizar estudios con un mayor número de especies de fitoplancton, incluyendo diatomeas y dinoflagelados planctónicos tóxicos (Pseudo-nitzschia spp., Alexandrium spp.) y bentónicos (Ostreopsis spp.), productores de proliferaciones nocivas y tóxicas (Berdalet, et al., 2022). Estas proliferaciones nocivas de algas tienen impactos directos en la salud humana y efectos negativos en el bienestar general (Berdalet, et al., 2016), lo que aumenta el interés en estudiar su comportamiento en contacto con la escoria de acería. En el caso de las bentónicas, también se debería de estudiar su nivel de adherencia antes de proponer la utilización de la escoria de acería en sustratos artificiales. Realizar estudios con diversas especies de medusas en su fase de pólipo, donde se adhieren al sustrato, para determinar si la escoria de acería podría favorecer la proliferación de los pólipos en las costas. Realizar estudios con diversas especies de macroalgas, tanto constructoras de hábitat como invasoras (por ejemplo, Cystoseira spp. o Rugulopterix ukamurae, respectivamente), y briozoos como Amathia verticillata, entre otros. Esto adquiere especial relevancia en un contexto de cambio climático y expansión de especies, derivado de la tropicalización y la destrucción de hábitats naturales (M. Zarzyczny, et al., 2024). 59 8 ANÁLISIS DE SOSTENIBILIDAD Y IMPLICACIONES ÉTICAS 8.1 Evaluación Ambiental 8.1.1 Desarrollo del trabajo Este estudio tiene una gran carga experimental llevada a cabo en los laboratorios de la UPC y del ICM. Gran parte de los ensayos se realizan en condiciones asépticas, especialmente los de carácter biológico. Esto requiere el uso de numerosos utensilios de laboratorio desechables, como puntas de pipeta, guantes, tubos de ensayo y crioviales, la mayoría de ellos de plástico. Aunque los laboratorios siguen un estricto plan de reciclaje, reciclándose y reutilizándose todos los utensilios posibles (Figura 45). Además, los residuos resultantes de la utilización de la escoria negra de acería en los ensayos de lixiviación se han desechado de forma controlada, siguiendo la normativa del laboratorio. Otro aspecto relevante es la limpieza de los utensilios de laboratorio. El uso de agua del grifo y agua desionizada, junto con papel de laboratorio, ha sido considerable. Figura 45. Reciclaje de plásticos desechables en el laboratorio 8.1.2 Ejecución del proyecto El uso de escoria negra en el cultivo de microalgas presenta múltiples beneficios ambientales. Este proceso ayuda a mitigar el impacto ambiental del residuo industrial al evitar su acumulación en vertederos, donde puede lixiviar metales pesados y contaminar suelos y aguas subterráneas (Liu, et al., 2021). Además, al emplear escoria negra en lugar de otros materiales, se disminuye la necesidad de extraer y procesar materias primas vírgenes. Esto contribuye a reducir la huella ambiental del proyecto, alineándose con los objetivos de sostenibilidad y conservación de recursos. Las microalgas son capaces de absorber dióxido de carbono durante su crecimiento, contribuyendo a la reducción de gases de efecto invernadero. La combinación de la escoria con el cultivo de 60 microalgas puede potenciar este efecto, dado que las microalgas también pueden ayudar a capturar y fijar carbono de manera eficiente (Wang, et al., 2024). Además, el proceso puede integrar la utilización de aguas residuales urbanas, ayudando en la depuración de estas aguas y reduciendo la carga de contaminantes como nitratos y fosfatos antes de que se descarguen en cuerpos de agua naturales (Yu, et al., 2021). 8.1.3 Riesgos y limitaciones La escoria negra puede contener metales pesados y otros contaminantes que, si no se tratan adecuadamente, pueden lixiviar y contaminar el medio ambiente. Esto representa un riesgo para la calidad del agua y del suelo (Liu, et al., 2021). El uso de escoria en entornos naturales o semicerrados puede tener un impacto significativo en las especies locales si los contaminantes presentes en la escoria no se gestionan de manera adecuada. La presencia de metales pesados y otros elementos tóxicos en las escorias de acería puede causar daños a la flora y fauna, alterando los ecosistemas y poniendo en riesgo la biodiversidad. Por ello, es crucial implementar estrategias de tratamiento y valorización de las escorias para adaptarlas a ambientes específicos, en este caso el marino. Sin embargo, el proceso de tratamiento y uso de escoria también puede generar residuos adicionales. Estos residuos, si no se gestionan adecuadamente, pueden provocar nuevos problemas ambientales, como la contaminación del suelo y del agua. Por lo tanto, es esencial desarrollar y aplicar prácticas de gestión de residuos que aseguren la recolección, tratamiento y disposición segura de los desechos generados durante el proceso de valorización de la escoria. La gestión adecuada de estos residuos adicionales es fundamental para evitar impactos ambientales negativos y garantizar que el uso de escorias en ambientes naturales o semicerrados sea sostenible y beneficioso. Esto incluye la implementación de tecnologías avanzadas de tratamiento de residuos, así como la vigilancia continua y el monitoreo de los efectos ambientales a largo plazo. 8.2 Evaluación económica 8.2.1 Desarrollo del trabajo El material de laboratorio utilizado en este trabajo incluye escoria negra de acería y cultivos de fitoplancton marino, que han sido los principales recursos empleados. Estos materiales fueron financiados por la Universidad Politécnica de Cataluña (UPC) y el Instituto de Ciencias del Mar (ICM). En cuanto a las horas dedicadas en laboratorio a este trabajo, se han invertido 300 horas en la UPC y 350 horas en el ICM. Durante estas sesiones, también han participado mis tutores y varios técnicos de laboratorio, quienes han brindado apoyo y asistencia técnica. 8.2.2 Ejecución del proyecto El uso de escoria negra de acería para el crecimiento de microalgas tiene potencial para reducir costos significativamente. Este material de desecho industrial es generalmente barato o incluso gratuito, ya que es un subproducto de la producción de acero. Aprovecharlo para la producción de microalgas puede convertir un residuo en un recurso valioso, disminuyendo los costos de eliminación y tratamiento de residuos (Liu, et al., 2021). 67 Tabla A. 8. Coeficientes de variación (CV%) de los recuentos celulares de las muestras CS/48 h / tratamiento B, con Nannochloropsis salina Tabla A. 9. Coeficientes de variación (CV%) de los recuentos celulares de las muestras CS/7 d / tratamiento B, con Nannochloropsis salina Tabla A. 10. Coeficientes de variación (CV%) de los recuentos celulares de las muestras Control /tratamiento A, con Thalassiosira pseudonana Tabla A. 11. Coeficientes de variación (CV%) de los recuentos celulares de las muestras NCS /tratamiento A, con Thalassiosira pseudonana Día de cultivo Media CS/48h CV% 0 297,25 1% 4 1035,695 1% 7 2636,335 1% 11 1731,65 10% 13 1630,72 6% 19 925,225 37% Día de cultivo Media CS/7d CV% 0 288,33 2% 4 962,63 3% 7 2569,935 0% 11 2174,925 30% 13 1415,75 13% 19 1211 30% Día de cultivo Media control CV% 0 1,79 9% 4 9,22 7% 7 16,44 4% 11 17,69 2% 13 14,06 12% 19 14,38 0% Día de cultivo Media NCS CV% 0 1,58 2% 4 7,59 18% 7 25,57 12% 11 24,34 19% 13 27,16 3% 19 16,24 10% 68 Tabla A. 12. Coeficientes de variación (CV%) de los recuentos celulares de las muestras CS /tratamiento A, con Thalassiosira pseudonana Tabla A. 13. Coeficientes de variación (CV%) de los recuentos celulares de las muestras NCS/24 h / tratamiento B, con Thalassiosira pseudonana Tabla A. 14. Coeficientes de variación (CV%) de los recuentos celulares de las muestras NCS/48 h / tratamiento B, con Thalassiosira pseudonana Tabla A. 15. Coeficientes de variación (CV%) de los recuentos celulares de las muestras NCS/7 d / tratamiento B, con Thalassiosira pseudonana Día de cultivo Media CS CV% 0 1,64 4% 4 7,66 24% 7 32,45 3% 11 40,51 14% 13 36,88 3% 19 37,78 11% Día de cultivo Media NCS/24h CV% 0 1,66 12% 4 11,00 4% 7 27,13 6% 11 23,26 2% 13 26,41 3% 19 16,15 12% Día de cultivo Media NCS/48h CV% 0 1,59 3% 4 12,18 4% 7 26,81 2% 11 29,66 7% 13 23,76 16% 19 18,92 12% Día de cultivo Media NCS/7 días CV% 0 1,70 14% 4 11,95 45% 7 21,33 3% 11 25,88 4% 13 24,01 14% 19 14,54 1% 69 Tabla A. 16. Coeficientes de variación (CV%) de los recuentos celulares de las muestras CS/24 h / tratamiento B, con Thalassiosira pseudonana Tabla A. 17. Coeficientes de variación (CV%) de los recuentos celulares de las muestras CS/48 h / tratamiento B, con Thalassiosira pseudonana Tabla A. 18. Coeficientes de variación (CV%) de los recuentos celulares de las muestras NCS/7 d / tratamiento B, con Thalassiosira pseudonana Día de cultivo Media CS/24h CV% 0 1,73 29% 4 15,39 0% 7 32,68 1% 11 33,15 2% 13 30,77 18% 19 24,46 11% Día de cultivo Media CS/48h CV% 0 2,40 26% 4 12,70 32% 7 25,28 10% 11 26,98 49% 13 36,48 5% 19 26,72 5% Día de cultivo Media CS/7 días CV% 0 1,67 7% 4 8,37 12% 7 15,85 13% 11 15,34 3% 13 11,23 17% 19 14,86 2% 70 Anexo B. Tablas de los coeficientes de variación de los valores de clorofila-a de las muestras de Nannochloropsis salina y Thalassiosira pseudonana. En las siguientes tablas se muestran los coeficientes de variación (CV%) del promedio entre las dos réplicas de cada tipo de tratamiento. Tabla B. 1. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras Control /tratamiento A, con Nannochloropsis salina Tabla B. 2. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras NCS /tratamiento A, con Nannochloropsis salina Tabla B. 3. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras CS /tratamiento A, con Nannochloropsis salina Día de cultivo Media Control CV% 0 17,90 38% 4 46,56 3% 7 82,62 23% 11 78,62 17% 13 96,42 5% 19 38,99 31% Día de cultivo Media NCS CV% 0 24,74 16% 4 33,45 48% 7 67,92 81% 11 106,16 63% 13 119,82 10% 19 83,21 1% Día de cultivo Media CS CV% 0 25,55 8% 4 29,97 44% 7 51,00 84% 11 93,77 58% 13 122,52 40% 19 73,91 2% 71 Tabla B. 4. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras NCS/24 h / tratamiento B, con Nannochloropsis salina Tabla B. 5. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras NCS/48 h / tratamiento B, con Nannochloropsis salina Tabla B. 6. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras NCS/7 d / tratamiento B, con Nannochloropsis salina Tabla B. 7. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras CS/24 h / tratamiento B, con Nannochloropsis salina Día de cultivo Media NCS/24 h CV% 0 22,79 12% 4 56,13 3% 7 104,82 24% 11 96,32 12% 13 80,22 17% 19 57,89 8% Día de cultivo Media NCS/48 h CV% 0 21,08 0% 4 45,72 0% 7 133,62 3% 11 104,12 15% 13 86,52 20% 19 60,11 1% Día de cultivo Media NCS/7 días CV% 0 25,67 11% 4 48,87 11% 7 130,02 7% 11 106,82 16% 13 75,12 5% 19 67,31 11% Día de cultivo Media CS/24 h CV% 0 17,09 71% 4 42,48 2% 7 78,84 58% 11 100,82 4% 13 67,62 13% 19 53,54 6% 72 Tabla B. 8. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras CS/48 h / tratamiento B, con Nannochloropsis salina Tabla B. 9. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras CS/7 d / tratamiento B, con Nannochloropsis salina Tabla B. 10. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras Control /tratamiento A, con Thalassiosira pseudonana Tabla B. 11. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras NCSl /tratamiento A, con Thalassiosira pseudonana Día de cultivo Media CS/48 h CV% 0 29,81 24% 4 42,87 2% 7 135,42 10% 11 96,02 10% 13 72,72 5% 19 58,97 17% Día de cultivo Media CS/7 días CV% 0 19,61 39% 4 39,24 9% 7 122,22 4% 11 93,32 8% 13 60,96 6% 19 50,93 2% Día de cultivo Media Control CV% 0 11,81 26% 4 29,90 33% 7 39,49 14% 11 34,25 27% 13 31,81 28% 19 22,42 3% Día de cultivo Media NCS CV% 0 13,82 8% 4 39,11 17% 7 60,85 16% 11 50,33 13% 13 40,21 24% 19 23,80 1% 73 Tabla B. 12. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras CS /tratamiento A, con Thalassiosira pseudonana Tabla B. 13. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras NCS/24 h / tratamiento B, con Thalassiosira pseudonana Tabla B. 14. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras NCS/48 h / tratamiento B, con Thalassiosira pseudonana Tabla B. 15. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras NCS/7 d / tratamiento B, con Thalassiosira pseudonana Día de cultivo Media CS CV% 0 11,84 10% 4 41,84 16% 7 80,80 14% 11 79,82 5% 13 65,14 1% 19 47,23 5% Día de cultivo Media NCS/24h CV% 0 9,08 12% 4 35,06 10% 7 52,99 9% 11 39,77 15% 13 30,76 3% 19 15,31 2% Día de cultivo Media NCS/48h CV% 0 14,54 5% 4 42,83 19% 7 47,92 18% 11 39,44 9% 13 28,24 4% 19 18,64 1% Día de cultivo Media NCS/7d CV% 0 14,33 2% 4 32,54 39% 7 42,07 29% 11 30,74 5% 13 25,60 15% 19 14,65 23% 74 Tabla B. 16. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras CS/24 h / tratamiento B, con Thalassiosira pseudonana Tabla B. 17. Tabla B. 16. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras CS/48 h / tratamiento B, con Thalassiosira pseudonana Tabla B. 18. Tabla B. 16. Coeficientes de variación (CV%) de los valores de clorofila-a de las muestras CS/7 d / tratamiento B, con Thalassiosira pseudonana Día de cultivo Media CS/24h CV% 0 13,07 25% 4 40,52 9% 7 51,28 8% 11 41,42 25% 13 34,99 15% 19 16,21 51% Día de cultivo Media CS/48h CV% 0 13,76 5% 4 36,50 7% 7 45,25 2% 11 30,77 14% 13 28,45 4% 19 16,81 20% Día de cultivo Media CS/7d CV% 0 8,39 20% 4 30,35 39% 7 25,75 13% 11 20,12 8% 13 22,21 27% 19 15,55 17% 75 Anexo C. Gráficas de los resultados del recuento celular de Nannochloropsis salina Tratamientos del tipo A, con el citómetro de flujo CytoFLEX S. Figura A. 3 Resultados Control 1, citómetro de flujo 14/03/2024 Figura A. 2 Resultados Control 1, citómetro de flujo 25/03/2024 Figura A. 4 Resultados Control 1, citómetro de flujo 21/03/2024 Figura A. 1. Resultados Control 1, citómetro de flujo 18/03/2024 76 Figura A. 5. Resultados Control 1, citómetro de flujo 03/04/2024 Figura A. 6. Resultados Control 1, citómetro de flujo 27/03/2024 Figura A. 7. Resultados Control 2, citómetro de flujo 18/03/2024 Figura A. 8. Resultados Control 2, citómetro de flujo 14/03/2024 83 Figura A. 33. Resultados CS 2, citómetro de flujo 25/03/2024 Figura A. 34. Resultados CS 2, citómetro de flujo 21/03/2024 Figura A. 35. Resultados CS 2, citómetro de flujo 27/03/2024 Figura A. 36. Resultados CS 2, citómetro de flujo 03/04/2024 84 Anexo D. Recopilatorio de imágenes de muestras de cultivo de Thalassiosira pseudonana realizadas con microscopio Leica DMI 1. Figura D. 1. Muestra 1 tratamiento tipo A con escoria de acería carbonatada (CS), a 20x aumentos Figura D. 2. Muestra 2 tratamiento tipo A con escoria de acería carbonatada (CS), a 40x aumentos 85 Figura D. 3. Muestra 1 tratamiento tipo con A escoria de acería sin carbonatada (NCS), a 20x aumentos Figura D. 4. Muestra 2 tratamiento tipo A con escoria de acería sin carbonatada (NCS), a 40x aumentos