Modificación de la membrana de los espermatozoides de verraco para mejorar su supervivencia a la crioconservación

MODIFICACIÓN DE LA MEMBRANA DE LOS ESPERMATOZOIDES DE VERRACO PARA MEJORAR SU SUPERVIVENCIA A LA CRIOCONSERVACIÓN Eva Blanch Torres DIRECTORA: Eva Mocé Cervera Valencia, diciembre de 2007 RESUMEN Los espermatozoides de verraco presentan uno de los más bajos ratio colesterol/fosfolípidos de membrana. Esta característica es importante ya que el colesterol juega un papel fundamental en el mantenimiento de la estructura y funcionalidad de la membrana espermática tras la congelación, y, por lo tanto, en la supervivencia del espermatozoide tras el proceso de criopreservación. El objetivo de este trabajo es desarrollar un protocolo de adición de ciclodextrinas saturadas de colesterol (CLC) a los espermatozoides de verraco con el fin de aumentar la cantidad de colesterol en la membrana espermática, mejorando así su supervivencia a la congelación. Para ello se trataron los espermatozoides con diferentes tipos de ciclodextrinas, a diferentes concentraciones y en diferentes fases del protocolo de congelación. Los espermatozoides tratados con metil- -ciclodextrina saturada de colesterol, a una concentración de 1 mg/120 x 106 espermatozoides, añadida 15 minutos antes de comenzar la fase de enfriamiento lento hasta 16ºC, presentaron mejor calidad tras la descongelación que los espermatozoides no tratados. Sin embargo, este incremento no alcanza el obtenido al tratar con CLC los espermatozoides de otras especies con bajo ratio colesterol/fosfolípidos. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1 2. MATERIAL Y MÉTODOS 5 2.1. Medios y productos químicos 5 2.2. Recuperación de semen y procesamiento general 5 2.2.1. Animales 5 2.2.2. Recuperación de semen 5 2.2.3. Protocolo de congelación y descongelación 6 2.2.4. Análisis de motilidad 7 2.2.5. Análisis de viabilidad 7 2.3. Desarrollo de un protocolo de adición de CLC a los espermatozoides de verraco previamente a la congelación (diseño experimental) 8 Experimento 1: Determinación de la fase de adición de la ciclodextrina (I) 8 Experimento 2: Determinación de la fase de adición de la ciclodextrina (II) 9 Experimento 3: Determinación del tipo de ciclodextrina más adecuado ( , o - ciclodextrinas) 12 Experimento 4: Determinación de la concentración óptima de ciclodextrina (I) 13 Experimento 5: Determinación de la concentración óptima de ciclodextrina (II) 14 3. RESULTADOS 16 3.1. Determinación de la fase de adición de la ciclodextrina (I) 16 3.1.1. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides inmediatamente tras la descongelación 16 3.1.2. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides tras la incubación a 39ºC 17 3.2. Determinación de la fase de adición de la ciclodextrina (II) 18 3.2.1. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides 18 inmediatamente tras la descongelación 3.2.2. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides tras la incubación a 39ºC 19 3.3. Determinación del tipo de ciclodextrina más adecuado ( , ó - ciclodextrinas) 20 3.3.1. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides inmediatamente tras la descongelación 20 3.3.2. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación e incubación a 39ºC 20 3.4. Determinación de la concentración óptima de ciclodextrina (I) 22 3.4.1. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides tras la fase de incubación a 16ºC 22 3.4.2. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides inmediatamente tras la descongelación 22 3.4.3. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación e incubación a 39ºC 23 3.5. Determinación de la concentración óptima de ciclodextrina (II) 24 3.5.1. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides tras la fase de incubación a 16ºC 24 3.5.2. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides inmediatamente tras la descongelación 24 3.5.3. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación e incubación a 39ºC 25 4. DISCUSIÓN 26 5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 33 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación, cuando los espermatozoides son tratados con CLC (ciclodextrinas saturadas de colesterol) al inicio de la incubación a 16ºC (clcInicio), al final de la fase de incubación (clcFinal) o no son tratados (control) 16 Tabla 2. Porcentajes de espermatozoides (spz) móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación cuando los espermatozoides son diluidos hasta diferentes concentraciones de congelación: alta (109 spz/mL) o baja (150 x 106 spz/mL) 16 Tabla 3. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación e incubación en baño de agua a 39ºC cuando las muestras son observadas a las 0, 1 y 3 horas durante la incubación 39ºC (experimento 1) 17 Tabla 4. Porcentajes de espermatozoides (spz) móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación y la incubación en baño de agua a 39ºC cuando los espermatozoides son diluidos hasta diferentes concentraciones de congelación (alta 109 spz/mL o baja 150 x 106 spz/mL) y las muestras son observadas a las 0, 1 y 3 horas durante la incubación a 39ºC 17 Tabla 5. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación, cuando los espermatozoides son tratados con CLC (ciclodextrinas saturadas de colesterol) antes de la centrifugación (clc A), después de la centrifugación (clc D) o no son tratados (control) 18 Tabla 6. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación cuando los espermatozoides sufren diferentes tipos de incubación a 16 ºC (con plasma, con medio lactosa-yema de huevo (LEY) o no sufren incubación a 16ºC) 19 Tabla 7. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación e incubación en baño de agua a 39ºC cuando las muestras son observadas a las 0, 1 y 3 horas durante la incubación 39ºC (experimento 2) 19 Tabla 8. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la congelación cuando los espermatozoides son tratados con diferentes tipos de ciclodextrinas saturadas de colesterol ó CLC (α-ciclodextrina (clc alfa), βciclodextrina (clc beta), γ-ciclodextrina (clc gamma), hydroxypropyl-αciclodextrina (clc hpalfa), 2HBCDcol (clc hpbeta) y 2-hydroxipropyl-γciclodextrina (clc hpgamma), con ciclodextrinas no saturadas de colesterol ( control negativo) o no son tratados (control) 20 Tabla 9. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación e incubación en baño de agua a 39ºC cuando las muestras son observadas a las 0, 1 y 3 horas durante la incubación 39ºC (experimento 3) 21 Tabla 10. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la incubación a 16ºC cuando los espermatozoides son tratados con diferentes concentraciones de ciclodextrina saturada de colesterol (clc 1 mg, clc 2 mg, clc 3 mg, clc 6 mg ó clc 12 mg), con diferentes concentraciones de ciclodextrina no saturada de colesterol (negativo 2 mg, negativo 3 mg ó negativo 6 mg) o no son tratados (control) 22 Tabla 11. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la congelación cuando los espermatozoides son tratados con diferentes concentraciones de ciclodextrina saturada de colesterol (clc 1 mg, clc 2 mg, clc 3 mg, clc 6 mg ó clc 12 mg), con diferentes concentraciones de ciclodextrina no saturada de colesterol (negativo 2 mg, negativo 3 mg ó negativo 6 mg) o no son tratados (control) 23 Tabla 12. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación e incubación en baño de agua a 39ºC cuando las muestras son observadas a las 0, 1 y 3 horas durante la incubación 39ºC (experimento 4) 23 Tabla 13. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la incubación a 16ºC cuando los espermatozoides son tratados con diferentes concentraciones de ciclodextrina saturada de colesterol (clc 0,5 mg, clc 1 mg, clc 1,5 mg y clc 2 mg), con 1mg de ciclodextrina no saturada de colesterol (negativo) o no son tratados (control) 24 Tabla 14. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la congelación cuando los espermatozoides son tratados con diferentes concentraciones de ciclodextrina saturada de colesterol (clc 0,5 mg, clc 1 mg, clc 1,5 mg y clc 2 mg), con 1mg de ciclodextrina no saturada de colesterol 25 (negativo) o no son tratados (control) Tabla 15. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación e incubación en baño de agua a 39ºC cuando las muestras son observadas a las 0, 1 y 3 horas durante la incubación 39ºC (experimento 5) 25 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1Esquema del protocolo de congelación utilizado para los espermatozoides de verraco 6 Figura 2. Esquema del experimento 2: incubación de las muestras a 16ºC con plasma seminal 10 Figura 3. Esquema del experimento 2: incubación de las muestras a 16ºC en medio LEY 10 Figura 4. Esquema del experimento 2: las muestras no sufren la incubación a 16ºC 11 Figura 5. Esquema del protocolo de congelación utilizado para la adición de las ciclodextrinas en el experimento 3 12 Figura 6: Diferentes tratamientos con CLC utilizados en: espermatozoides incubados a 16ºC con plasma seminal, en espermatozoides incubados a 16ºC con medio lactosa-yema de huevo (medio LEY) o en espermatozoides que no son sometidos a la incubación a 16ºC. 29 1. INTRODUCCIÓN 1 1. INTRODUCCIÓN La explotación del ganado porcino es una de las producciones más importantes (detrás de la producción avícola) en España, siendo ésta uno de los principales productores de Europa, tanto por el número de animales como por la tecnología desarrollada y utilizada (García Casado, 2007). El uso de la inseminación artificial presenta muchas ventajas, tales como: una amplia difusión del material genético del verraco seleccionado, mejoras sanitarias en la explotación al evitar el contacto macho-hembra, la evaluación continua del potencial reproductivo de los machos, el mejor control de los resultados reproductivos de una explotación y la reducción del número de verracos. La aplicación de la inseminación artificial en la industria porcina en muchos de los países europeos, incluida España, es muy elevada, superando el 80 % de las reproductoras (Gadea, 2006). En la práctica totalidad de las inseminaciones artificiales que se realizan en porcino se utiliza semen refrigerado a 15-20ºC (Johnson et al, 2000), ya que la fertilidad del semen congelado tradicionalmente ha sido sensiblemente menor que la obtenida con semen refrigerado, estimándose una reducción media del 20% en la tasa de partos (Gadea, 2006). Sin embargo, en los últimos años varios autores han obtenido resultados de fertilidad elevados tras el uso de semen congelado en inseminación cervical (Eriksson et al., 2002; Sellés et al., 2003) o tras la inseminación intrauterina profunda (Roca et al., 2003). Desde que en los años ‘50 se consiguiera utilizar con éxito el glicerol como agente crioprotector en espermatozoides (Polge et al, 1949) se han desarrollado espectacularmente los sistemas de congelación de todo tipo de células y, sin embargo, sólo se ha implantado el uso de semen congelado en las especie humana y en la especie bovina, siendo la base para las grandes mejoras productivas obtenidas en las razas bovinas lecheras (Zeng y Terada, 2001b). La congelación de los espermatozoides de porcino no resultó tan exitosa y es en el año 1975 cuando se desarrollan dos métodos de congelación que pueden ser aplicados a nivel comercial (Pursel y Johnson, 1975; Westendorf et al, 1975) basados en la utilización de yema de huevo, glicerol, azúcares y un agente detergente (Orvus Es Paste). Estos protocolos, sobre todo el desarrollado por Westendorf, son los que se utilizan actualmente, con algunas modificaciones con respecto al envasado, a las curvas de enfriamiento, a la fase de adición del crioprotector, etc. En la última década se han realizado numerosos estudios con el objetivo de mejorar la fertilidad de los espermatozoides congelados siguiendo diferentes estrategias: - optimización de los sistemas de congelación y descongelación (nuevos diluyentes, nuevos envases, aditivos, curvas de congelación automatizadas…). - adecuación de las condiciones de la inseminación artificial (protocolos de sincronización de celo, diagnósticos de ovulación por ecografía, inseminaciones intrauterinas profundas…). - selección de reproductores por su capacidad de congelación y no sólo por sus rendimientos reproductivos. 2. MATERIAL Y MÉTODOS 8 Se realizaron cinco experimentos para determinar el tipo de ciclodextrina, la concentración de ciclodextrina y la fase de adición de la ciclodextrina más adecuados. Paralelamente también se compararon: - diferentes concentraciones de congelación del semen (la concentración normalmente utilizada (109 espermatozoides/mL) frente a 150 x 106 espermatozoides/mL) con el objetivo de poder realizar un mayor número de tratamientos por eyaculado. - diferentes tipos de incubación a 16ºC con el fin de agilizar el protocolo de congelación, ya que era posible que la adición de CLC permitiera una velocidad más alta de enfriamiento del semen. Experimento 1: Determinación de la fase de adición de la ciclodextrina (I) En este experimento se utilizaron 10 eyaculados procedentes de 5 verracos con el objetivo de evaluar dos concentraciones de congelación (109 vs 150 x 106 espermatozoides/mL) y dos fases diferentes de adición de las ciclodextrinas a lo largo del protocolo de crioconservación (al inicio y al final de la fase de incubación a 16ºC). Para ello se alicuotó el semen en 3 tipos de muestras con 800x106 espermatozoides cada una: una muestra no tratada que se utilizó como control (C), una muestra tratada con 2-hidroxipropil- - ciclodextrina saturada de colesterol (2HBCDcol) 15 minutos antes de iniciar la fase de incubación a 16ºC (clc Inicio) y una tercera muestra tratada con 2HBCDcol 15 minutos antes de finalizar la fase de incubación a 16ºC (clc Final). Las muestras clc Inicio y clc Final fueron tratadas con 2 mg de 2HBCDcol/120x106 espermatozoides, eligiendo esta ciclodextrina porque en algunas especies se ha observado que ofrece mejores resultados que otros tipos de ciclodextrina y esta concentración por ser una de las más utilizadas en los protocolos de adición de CLC en otras especies. Cada uno de los tipos de muestra (C, clc Inicio, clc Final) fueron congelados siguiendo el protocolo anteriormente descrito (Figura 1), pero utilizando dos concentraciones de congelación diferentes: 109 espermatozoides/mL (alta) y 150x106 espermatozoides/mL (baja). Se evaluó la motilidad de los espermatozoides descongelados a las 0, 1 y 3 horas de la incubación en baño de agua a 39ºC y la viabilidad de los espermatozoides inmediatamente tras la descongelación, según los protocolos descritos anteriormente. Análisis estadístico Para realizar los análisis, las variables móviles totales y móviles progresivos fueron transformadas siguiendo la transformación de Freeman y Tukey, aunque los datos se muestran en las tablas en la escala original. Se realizaron dos tipos de análisis: 2.3. DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE ADICIÓN DE CLC A LOS ESPERMATOZOIDES DE VERRACO PREVIAMENTE A LA CONGELACIÓN (DISEÑO EXPERIMENTAL) 2. MATERIAL Y MÉTODOS 9 1Se utilizaron los datos a las 0 horas (muestras descongeladas) para analizar los efectos de los diferentes tratamientos con CLC y de las diferentes concentraciones de congelación sobre la supervivencia de los espermatozoides inmediatamente después de la congelación. Para ello se realizó un análisis de varianza para las variables vivos, móviles totales y móviles progresivos utilizando un modelo con los efectos fijos de CLC (control, clc Inicio y clc Final), concentración (alta y baja), su interacción y el efecto aleatorio de eyaculado (1-10) (Procedimiento Mixed; SAS Institute Inc., versión 9.0 2002). 2Se utilizaron los datos a las 0, 1 y 3 horas de la incubación a 39ºC para analizar los efectos de los diferentes tratamientos con CLC y de las diferentes concentraciones de congelación sobre la supervivencia de los espermatozoides a lo largo de las tres horas de incubación a 39ºC. Para ello se realizó un análisis de varianza para las variables móviles totales y móviles progresivos utilizando un modelo con los efectos fijos de CLC (control, clc Inicio y clc Final), concentración (alta y baja), horas (0, 1 y 3h), sus interacciones dobles y el efecto aleatorio de eyaculado (1-10) (Procedimiento Mixed; SAS Institute Inc., versión 9.0 2002). Experimento 2: Determinación de la fase de adición de la ciclodextrina (II) El objetivo de este experimento fue perfilar la fase del protocolo de congelación más adecuada para añadir las CLC (antes o después de la centrifugación). Además se compararon diferentes tipos de incubación a 16ºC (incubación con plasma seminal, con medio LEY o sin fase de incubación a 16ºC). En este experimento se utilizaron 9 eyaculados procedentes de 6 verracos. Cada eyaculado fue dividido en tres muestras de 800x106 espermatozoides cada una: una muestra no tratada se utilizó como control (C), otra muestra fue tratada con 2HBCDcol antes de la centrifugación (clcA) y la otra muestra fue tratada con 2HBCDcol después de la centrifugación (clcD). Las muestras clcA y clcD fueron tratadas con 2mg 2HBCDcol/120x106 espermatozoides. Cada uno de los tipos de muestra fue sometido a tres modelos de incubación a 16ºC: a) Incubación a 16ºC con plasma seminal. Se incubó la muestra clcA durante 15 minutos con CLC y después las tres muestras (C, clcA y clcD) se incubaron con el plasma seminal durante la fase de descenso de temperatura a 16ºC. Posteriormente se centrifugaron, se eliminó el plasma seminal, la muestra clcD se trató con CLC y las muestras fueron resuspendidas en medio LEY (Figura 2). En este caso, el protocolo de congelación es el que se utiliza habitualmente para el ganado porcino (descenso de temperatura a 16ºC en presencia de plasma seminal). El resto de la congelación se realizó como se ha descrito previamente (Figura 1). 2. MATERIAL Y MÉTODOS 10 Figura 2. Esquema del experimento 2: incubación de las muestras a 16ºC con plasma seminal b) Incubación a 16ºC con medio LEY. Se incubó la muestra clcA durante 15 minutos con CLC, después las tres muestras se centrifugaron, se eliminó el plasma seminal y la muestra clcD se trató con CLC. A continuación las muestras fueron resuspendidas en medio LEY y los espermatozoides fueron incubados a 16ºC durante 2 horas (la fase de descenso de temperatura a 16ºC se realizó en medio LEY) (Figura 3). Al centrifugar antes de la incubación se conseguía que el descenso de la temperatura a 16ºC se produjese junto a las CLC y que la adición de las CLC ocurriera después de la centrifugación y sin presencia de yema de huevo. El resto de la congelación se realizó de la forma habitual (Figura 1). Figura 3. Esquema del experimento 2: incubación de las muestras a 16ºC en medio LEY c) Sin incubación a 16ºC. Se incubó la muestra clcA durante 15 minutos con CLC y después las tres muestras fueron centrifugadas y liberadas del plasma seminal, la muestra clcD fue tratada con CLC, las muestras fueron resuspendidas en medio LEY y a continuación se realizó el descenso lento de temperatura a 5ºC, sin que los espermatozoides fuesen sometidos a la fase de descenso lento de temperatura a 16ºC (Figura 4). El resto de la congelación se realizó de la forma habitual (Figura 1). Con este experimento se pretendía estudiar si es posible acortar el protocolo de congelación del ganado porcino haciéndolo similar al de otras especies ganaderas. Muestra C: semen 22ºC → incubación con plasma 16ºC → centrifugado → resuspensión en LEY adición CLC  Muestra clcA: semen 22ºC → incubación con plasma 16ºC → centrifugado → resuspensión en LEY adición CLC  Muestra clcD: semen 22ºC → incubación con plasma 16ºC → centrifugado → resuspensión en LEY Muestra C: semen 22ºC → centrifugado → resuspensión en LEY → incubación con LEY 16ºC adición CLC  Muestra clcA: semen 22ºC → centrifugado → resuspensión en LEY → incubación con LEY 16ºC adición CLC  Muestra clcD: semen 22ºC → centrifugado → resuspensión en LEY → incubación con LEY 16ºC 2. MATERIAL Y MÉTODOS 11 Figura 4. Esquema del experimento 2: las muestras no sufren la incubación a 16ºC Se evaluó la motilidad de los espermatozoides descongelados a las 0, 1 y 3 horas de la incubación en baño de agua a 39ºC y la viabilidad de los espermatozoides inmediatamente tras la descongelación, según los protocolos descritos anteriormente. Análisis estadístico Se realizaron dos tipos de análisis: 1Se utilizaron los datos a las 0 horas (muestras descongeladas) para analizar los efectos de los diferentes tratamientos con CLC y de los diferentes tipos de incubación a 16ºC sobre la supervivencia de los espermatozoides inmediatamente después de la congelación. Para ello se realizó un análisis de varianza para las variables vivos, móviles totales y móviles progresivos utilizando un modelo con los efectos fijos de CLC (control, clcA y clcD), incubación (plasma, con medio LEY o sin incubación), su interacción y el efecto aleatorio de eyaculado (1-9) (Procedimiento Mixed; SAS Institute Inc., versión 9.0 2002). 2Se utilizaron los datos a las 0, 1 y 3 horas de la incubación a 39ºC para analizar los efectos de los diferentes tratamientos con CLC y de los diferentes tipos de incubación a 16ºC sobre la supervivencia de los espermatozoides a lo largo de las tres horas de incubación a 39ºC. Para ello se realizó un análisis de varianza para las variables móviles totales y móviles progresivos utilizando un modelo con los efectos fijos de CLC (control, clcA y clcD), incubación (plasma, con medio LEY o sin incubación), horas (0, 1 y 3h), sus interacciones dobles y el efecto aleatorio de eyaculado (1-9) (Procedimiento Mixed; SAS Institute Inc., versión 9.0 2002). Para realizar los análisis las variables móviles totales y móviles progresivos fueron transformadas siguiendo la transformación de Freeman y Tukey, aunque los datos se muestran en las tablas en la escala original. Muestra C: semen 22ºC → centrifugado → resuspensión en LEY → incubación a 5ºC adición CLC  Muestra clcA: semen 22ºC → centrifugado → resuspensión en LEY → incubación a 5ºC adición CLC  Muestra clcD: semen 22ºC → centrifugado → resuspensión en LEY → incubación a 5ºC 2. MATERIAL Y MÉTODOS 12 Experimento 3: Determinación del tipo de ciclodextrina más adecuado ( , o - ciclodextrinas En este experimento se utilizaron 10 eyaculados procedentes de 6 verracos con el fin de determinar el tipo de ciclodextrina más adecuado ( , o -ciclodextrina). Para ello cada eyaculado fue dividido en 8 alícuotas de 800x106 espermatozoides cada una: una de las alícuotas no fue tratada utilizándola como control (C) y otra fue tratada con metil-β-ciclodextrina (MBCD) no saturada de colesterol y se utilizó como control negativo (N), esta ciclodextrina fue elegida por su facilidad de preparación. Las demás alícuotas fueron tratadas con α-ciclodextrina (clc alfa), β-ciclodextrina (clc beta), γciclodextrina (clc gamma), hidroxipropil-α-ciclodextrina (clc hpalfa), 2hidroxipropil- -ciclodextrina (clc hpbeta) y 2-hidroxipropil-γ-ciclodextrina (clc hpgamma) todas ellas saturadas de colesterol. Las muestras fueron tratadas con 2mg de CLC o CD/120x106 espermatozoides durante 15 minutos a 22ºC antes del inicio de la fase de incubación con plasma seminal a 16ºC, siguiendo el protocolo descrito en la Figura 5 y posteriormente las muestras fueron congeladas siguiendo el protocolo habitual (Figura 1). Figura 5. Esquema del protocolo de congelación utilizado para la adición de las ciclodextrinas Se evaluó la motilidad y viabilidad de los espermatozoides descongelados a las 0, 1 y 3 horas de la incubación en baño de agua a 39ºC, según los protocolos descritos anteriormente. Análisis estadístico Para realizar los análisis las variables vivos, móviles totales y móviles progresivos fueron transformadas siguiendo la transformación de Freeman y Tukey, aunque los datos se muestran en las tablas en la escala original. Se realizaron dos tipos de análisis: 1Se utilizaron los datos a las 0 horas (muestras descongeladas) para analizar los efectos de los diferentes tratamientos con CLC sobre la supervivencia de los espermatozoides inmediatamente después de la congelación. Para ello se realizó un análisis de varianza para las variables vivos, móviles totales y móviles progresivos utilizando un modelo con el efecto fijo de CLC (control, negativo, clc alfa, clc beta, clc gamma, clc hpalfa, clc hpbeta y clc hpgamma) y el efecto aleatorio de Muestra C: semen 22ºC → incubación con plasma 16ºC → centrifugado → resuspensión en LEY adición CD  Muestras N: semen 22ºC → incubación con plasma 16ºC → centrifugado → resuspensión en LEY adición CLC  Muestras clc: semen 22ºC → incubación con plasma 16ºC → centrifugado → resuspensión en LEY 2. MATERIAL Y MÉTODOS 13 eyaculado (1-10) (Procedimiento Mixed; SAS Institute Inc., versión 9.0 2002). 2Se utilizaron los datos a las 0, 1 y 3 horas de la incubación a 39ºC para analizar los efectos de los diferentes tratamientos con CLC sobre la supervivencia de los espermatozoides a lo largo de las tres horas de incubación a 39ºC. Para ello se realizó un análisis de varianza para las variables vivos, móviles totales y móviles progresivos utilizando un modelo con los efectos fijos de CLC (control, negativo, clc alfa, clc beta, clc gamma, clc hpalfa, clc hpbeta y clc hpgamma), horas (0, 1 y 3h), su interacción doble y el efecto aleatorio de eyaculado (1-10) (Procedimiento Mixed; SAS Institute Inc., versión 9.0 2002). Experimento 4: Determinación de la concentración óptima de ciclodextrina (I) El experimento constó de 10 repeticiones para las que se utilizaron 5 verracos con el objetivo de delimitar el rango de concentraciones óptimo de ciclodextrina. Se utilizaron 9 alícuotas de cada eyaculado, una de ellas no fue tratada y se utilizó como control (C), tres de ellas se utilizaron como controles negativos siendo tratadas con MBCD a 2 mg (negativo 2mg), 3 mg (negativo 3mg) ó 6 mg (negativo 6mg) de ciclodextrina/120x106 espermatozoides y las 5 restantes fueron tratadas con metil-β-ciclodextrina saturada de colesterol (MBCDcol) a las concentraciones de 1 mg (clc1mg), 2 mg (clc2mg), 3 mg (clc3mg), 6 mg (clc6mg) ó 12 mg (clc12mg) de MBCDcol/120x106 espermatozoides. Se eligió la MBCDcol debido a que es una de las ciclodextrinas más utilizadas en otras especies, también debido a que es una de las más económicas y a su facilidad de preparación, ya que en el experimento 3 no se observaron diferencias entre los tipos de ciclodextrinas analizados. Las muestras fueron tratadas con las CLC o CD durante 15 minutos a 22ºC antes del inicio de la fase de incubación con plasma seminal a 16ºC siguiendo el protocolo descrito en la Figura 5 y posteriormente las muestras fueron congeladas siguiendo el protocolo habitual (Figura 1). Se evaluó la motilidad de los espermatozoides tras la incubación a 16ºC, y de las muestras descongeladas tras 0, 1 y 3 horas de la incubación en baño de agua a 39ºC. La viabilidad de las muestras descongeladas fue evaluada tras 0 y 1 horas de incubación en baño de agua a 39ºC, según los protocolos descritos anteriormente. Análisis estadístico Para realizar los análisis las variables vivos, móviles totales y móviles progresivos fueron transformadas siguiendo la transformación de Freeman y Tukey , aunque los datos se muestran en las tablas en la escala original. Se realizaron dos tipos de análisis: 1Las observaciones tras la incubación a 16ºC se utilizaron para descartar las muestras que presentaran bajos porcentajes de motilidad debido a una posible toxicidad como consecuencia del tratamiento con altas 2. MATERIAL Y MÉTODOS 14 concentraciones de CD o CLC. Para ello se realizó un análisis de varianza para las variables móviles totales y móviles progresivos utilizando un modelo con el efecto fijo de CLC (control, negativo 2mg, negativo 3mg, negativo 6 mg, clc 1 mg, clc 2mg, clc 3 mg, clc 6 mg y clc 12 mg) y el efecto aleatorio de eyaculado (1-10) (Procedimiento Mixed; SAS Institute Inc., versión 9.0 2002). En este caso no fue necesario transformar la variable móviles totales. 2Se utilizaron los datos a las 0 horas (muestras descongeladas) para analizar los efectos de los diferentes tratamientos con CLC sobre la supervivencia de los espermatozoides inmediatamente después de la congelación. Para ello se realizó un análisis de varianza para las variables vivos, móviles totales y móviles progresivos utilizando un modelo con el efecto fijo de CLC (control, negativo 2mg, negativo 3mg, negativo 6 mg, clc 1 mg, clc 2mg, clc 3 mg, clc 6 mg y clc 12 mg) y el efecto aleatorio de eyaculado (1-10) (Procedimiento Mixed; SAS Institute Inc., versión 9.0 2002). 3Se utilizaron los datos a las 0, 1 y 3 horas de la incubación a 39ºC para analizar los efectos de los diferentes tratamientos con CLC sobre la supervivencia de los espermatozoides a lo largo de las tres horas de incubación a 39ºC. Para ello se realizó un análisis de varianza para las variables vivos, móviles totales y móviles progresivos utilizando un modelo con los efectos fijos de CLC (control, negativo 2mg, negativo 3mg, negativo 6 mg, clc 1 mg, clc 2mg, clc 3 mg, clc 6 mg y clc 12 mg), horas (0, 1 y 3h), su interacción doble y el efecto aleatorio de eyaculado (1-10) (Procedimiento Mixed; SAS Institute Inc., versión 9.0 2002). Experimento 5: Determinación de la concentración óptima de ciclodextrina (II) Siguiendo con el objetivo del ensayo anterior, el fin de este experimento fue precisar la concentración óptima de CLC dentro del rango de concentraciones obtenido en el experimento anterior. Se utilizaron 15 eyaculados procedentes de 9 verracos y cada uno de ellos fue dividido en 6 alícuotas: una de ellas no sufrió ningún tratamiento siendo la muestra control (C), otra alícuota fue tratada con MBCD a 2 mg/120x106 espermatozoides (según los resultados del experimento 4) siendo la muestra control negativo (negativo 2mg) y 4 alícuotas se trataron con 0,5 mg (clc0,5mg), 1 mg (clc1mg), 1,5 mg (clc1,5) ó 2 mg (clc2mg) de MBCDcol/120x106 espermatozoides. Las muestras fueron tratadas con las CLC o CD durante 15 minutos a 22ºC antes del inicio de la fase de incubación con plasma seminal a 16ºC siguiendo el protocolo descrito en la Figura 5 y posteriormente las muestras fueron congeladas siguiendo el protocolo habitual (Figura 1). Se evaluó la motilidad de los espermatozoides tras la incubación a 16ºC, y de las muestras descongeladas tras 0 y 1 horas de la incubación en baño de agua a 39ºC. La viabilidad de las muestras descongeladas fue evaluada tras 0 y 1 horas de incubación en baño de agua a 39ºC, según los protocolos descritos anteriormente. 2. MATERIAL Y MÉTODOS 15 Análisis estadístico Para realizar los análisis las variables vivos, móviles totales y móviles progresivos fueron transformadas siguiendo la transformación de Freeman y Tukey , aunque los datos se muestran en las tablas en la escala original. Se realizaron dos tipos de análisis: 1Las observaciones tras la incubación a 16ºC se utilizaron para descartar las muestras que presentaran bajos porcentajes de motilidad debido a una posible toxicidad como consecuencia del tratamiento con altas concentraciones de CLC. Para ello se realizó un análisis de varianza para las variables móviles totales y móviles progresivos utilizando un modelo con el efecto fijo de CLC (control, negativo, clc 0,5 mg, clc 1 mg, clc 1,5 mg y clc 2 mg) y el efecto aleatorio de eyaculado (1-15) (Procedimiento Mixed; SAS Institute Inc., versión 9.0 2002). En este caso no fue necesario transformar la variable móviles totales. 2Se utilizaron los datos a las 0 horas (muestras descongeladas) para analizar los efectos de los diferentes tratamientos con CLC sobre la supervivencia de los espermatozoides inmediatamente después de la congelación. Para ello se realizó un análisis de varianza para las variables vivos, móviles totales y móviles progresivos utilizando un modelo con el efecto fijo de CLC (control, negativo, clc 0,5 mg, clc 1 mg, clc 1,5 mg y clc 2 mg)y el efecto aleatorio de eyaculado (1-15) (Procedimiento Mixed; SAS Institute Inc., versión 9.0 2002). 3Se utilizaron los datos a las 0, 1 y 3 horas de la incubación a 39ºC para analizar los efectos de los diferentes tratamientos con CLC sobre la supervivencia de los espermatozoides a lo largo de las tres horas de incubación a 39ºC. Para ello se realizó un análisis de varianza para las variables vivos, móviles totales y móviles progresivos utilizando un modelo con los efectos fijos de CLC (control, negativo, clc 0,5 mg, clc 1 mg, clc 1,5 mg y clc 2 mg), horas (0 y 1h), su interacción doble y el efecto aleatorio de eyaculado (1-15) (Procedimiento Mixed; SAS Institute Inc., versión 9.0 2002). En este caso no fue necesario transformar la variable vivos. 3. RESULTADOS 16 3. RESULTADOS 3.1.1. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides inmediatamente tras la descongelación El tratamiento de los espermatozoides con CLC al inicio (clc Inicio) o al final (clc Final) de la fase de incubación a 16ºC no mejoró el porcentaje de espermatozoides que sobreviven al proceso de crioconservación (porcentaje de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos). Cuando las muestras fueron tratadas con CLC al final de la fase de incubación a 16ºC se observó un descenso significativo en el porcentaje de espermatozoides vivos con respecto a las muestras control (40 vs 31%; P<0,05) (Tabla 1). Los porcentajes de espermatozoides vivos, móviles totales y móviles progresivos fueron significativamente mayores cuando las muestras fueron congeladas a bajas concentraciones (150 x 106 espermatozoides/mL) (P<0,05) (Tabla 2). La supervivencia de los espermatozoides al proceso de crioconservación siempre fue mayor cuando se utilizaron las concentraciones bajas de congelación independientemente de que fueran tratadas o no con CLC (Datos no mostrados, P>0,05). Tabla 1. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación, cuando los espermatozoides son tratados con CLC (ciclodextrinas saturadas de colesterol) al inicio de la incubación a 16ºC (clcInicio), al final de la fase de incubación (clcFinal) o no son tratados (control) CLC MÓVILES (%) PROGRESIVOS (%) VIVOS (%) control 20 ± 4,6 17 ± 4,2 40 A ± 3,4 clc Inicio 20 ± 4,6 17 ± 4,2 38 A ± 3,4 clc Final 19 ± 4,6 17 ± 4,2 31 B ± 3,4 A, B Valores en la misma columna con distintos superíndices son diferentes P<0,05. Tabla 2. Porcentajes de espermatozoides (spz) móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación cuando los espermatozoides son diluidos hasta diferentes concentraciones de congelación: alta (109 spz/mL) o baja (150 x 106 spz/mL) CONCENTRACIÓN MÓVILES (%) PROGRESIVOS (%) VIVOS (%) alta 12 B ± 4,5 10 B ± 4,1 28 B ± 3,2 baja 27 A ± 4,5 23 A ± 4,1 45 A ± 3,2 A, B Valores en la misma columna con distintos superíndices, son diferentes (P < 0,05). 3.1. DETERMINACIÓN DE LA FASE DE ADICIÓN DE LA CICLODEXTRINA (I) 3. RESULTADOS 17 3.1.2. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides tras la incubación a 39ºC Se observó una disminución significativa de los porcentajes de espermatozoides móviles totales y móviles progresivos durante la incubación a 39ºC (P<0,05) (Tabla 3), independientemente del tratamiento con CLC empleado (Datos no mostrados, P>0,05). No obstante las muestras congeladas a 109 espermatozoides/mL mantuvieron sus valores de motilidad total debido a los bajos porcentajes que presentaron desde el inicio de la incubación (P<0,05) (Tabla 4). Teniendo en cuenta los resultados de este experimento, en el resto de experimentos se utilizó la concentración baja de congelación pudiendo realizar así un mayor número de tratamientos por eyaculado. Dado que no se observaron mejoras en la supervivencia a la crioconservación con las fases de adición evaluadas, el momento óptimo de adición de las CLC se siguió estudiando en el segundo experimento. Tabla 4. Porcentajes de espermatozoides (spz) móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación y la incubación en baño de agua a 39ºC cuando los espermatozoides son diluidos hasta diferentes concentraciones de congelación (alta 109 spz/mL o baja 150 x 106 spz/mL) y las muestras son observadas a las 0, 1 y 3 horas durante la incubación a 39ºC CONCENTRACIÓN HORAS MÓVILES (%) PROGRESIVOS (%) Baja 0 27 A ± 3,2 23 A ± 2,8 1 19 B ± 3,2 14 B ± 2,8 3 8 D ± 3,2 3 E ± 2,8 Alta 0 12 C ± 3,2 10 C ± 2,8 1 9 CD ± 3,2 6 D ± 2,8 3 3 E ± 3,2 1 E ± 2,8 A, B, C, D, E Valores en la misma columna con distintos superíndices, son diferentes (P < 0,05) Tabla 3. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación e incubación en baño de agua a 39ºC cuando las muestras son observadas a las 0, 1 y 3 horas durante la incubación 39ºC HORAS MÓVILES (%) PROGRESIVOS (%) 0 20 A ± 3,0 17 A ± 2,6 1 14 B ± 3,0 10 B ± 2,6 3 6 C ± 3,0 2 C ± 2,6 A, B, C Valores en la misma columna con distintos superíndices, son diferentes (P < 0,05). 3. RESULTADOS 24 3.5.1. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides tras la fase de incubación a 16ºC No se descartó ninguna de las muestras tras la observación de la motilidad total y progresiva después del descenso de temperatura a 16 ºC. Las muestras tratadas con 1,5 ó 2 mg de CLC presentaron un porcentaje de espermatozoides móviles totales significativamente menores que las tratadas con 0,5 mg de CLC (P<0,05), sin embargo fueron las muestras no tratadas y las tratadas con ciclodextrina no saturada de colesterol las que presentaron los menores porcentajes de espermatozoides móviles progresivos (P<0,05) (Tabla 13). 3.5.2. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides inmediatamente tras la descongelación Los espermatozoides tratados con 1 mg de CLC mostraron los mayores porcentajes de espermatozoides vivos (±5% con respecto al control) aunque no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos para ninguno de los parámetros analizados (Tabla 14). Tabla 13. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la incubación a 16ºC cuando los espermatozoides son tratados con diferentes concentraciones de ciclodextrina saturada de colesterol (clc 0,5 mg, clc 1 mg, clc 1,5 mg y clc 2 mg), con 1mg de ciclodextrina no saturada de colesterol (negativo) o no son tratados (control) CLC MÓVILES (%) PROGRESIVOS (%) control 72 AB ± 4,5 39 C ± 5,4 negativo 72 AB ± 4,5 42 BC ± 5,4 clc 0,5 mg 75 A ± 4,5 49 A ± 5,4 clc 1 mg 69 ABC ± 4,5 49 A ± 5,4 clc 1,5 mg 68 BC ± 4,5 48 AB ± 5,4 clc 2 mg 63 C ± 4,5 49 A ± 5,4 A, B, C Valores en la misma columna con distintos superíndices, son diferentes (P < 0,05) 3.5. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ÓPTIMA DE CICLODEXTRINA (II) 3. RESULTADOS 25 3.5.3. Efecto sobre la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación e incubación a 39ºC La supervivencia de los espermatozoides disminuyó significativamente durante la incubación a 39ºC (P<0,05) (Tabla 15), independientemente del tratamiento recibido (Datos no mostrados, P>0,05). Tabla 14. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la congelación cuando los espermatozoides son tratados con diferentes concentraciones de ciclodextrina saturada de colesterol (clc 0,5 mg, clc 1 mg, clc 1,5 mg y clc 2 mg), con 1mg de ciclodextrina no saturada de colesterol (negativo) o no son tratados (control) CLC MOVILES (%) PROGRESIVOS (%) VIVOS control 24 ± 3,2 21 ± 2,9 52 ± 2,6 negativo 26 ± 3,2 23 ± 2,9 50 ± 2,6 clc 0,5 mg 26 ± 3,2 21 ± 2,9 53 ± 2,6 clc 1 mg 23 ± 3,2 19 ± 2,9 57 ± 2,6 clc 1,5 mg 22 ± 3,2 18 ± 2,9 53 ± 2,6 clc 2 mg 21 ± 3,2 17 ± 2,9 49 ± 2,6 A, B Valores en la misma columna con distintos superíndices, son diferentes (P < 0,05) Tabla 15. Porcentajes de espermatozoides móviles totales, móviles progresivos y vivos después de la descongelación e incubación en baño de agua a 39ºC cuando las muestras son observadas a las 0, 1 y 3 horas durante la incubación 39ºC HORAS MOVILES (%) PROGRESIVOS (%) VIVOS (%) 0 24 A ± 2,6 20 A ± 2,4 53 A ± 1,9 1 17 B ± 2,6 12 B ± 2,4 34 B ± 1,9 A, B, C Valores en la misma columna con distintos superíndices, son diferentes (P < 0,05) 4. DISCUSIÓN 26 4. DISCUSIÓN Alrededor de un 50% de la población de espermatozoides resulta irreversiblemente dañada cuando es sometida a los procesos de crioconservación actuales (Watson, 2000). Además, un gran porcentaje de los espermatozoides que sobreviven a la congelación presentan daños subletales que limitan o impiden el proceso de fecundación o de desarrollo embrionario. Los espermatozoides crioconservados presentan una reducida longevidad en el tracto reproductor femenino y/o un transporte espermático alterado. Como consecuencia de estos fenómenos, el número de espermatozoides crioconservados incluidos en las dosis debe ser incrementado, o la inseminación tiene que ser realizada profundamente en el tracto reproductor femenino y/o cercana al momento de la ovulación. Así, cuando se utiliza el método de inseminación clásico (inseminación cervical), es necesario utilizar altas concentraciones de espermatozoides en las dosis de congelación para conseguir una inseminación artificial exitosa (Holt, 2000). Otros autores han conseguido buenos porcentajes de fertilidad tras el uso de espermatozoides congelados utilizando la inseminación transcervical uterina profunda y realizando un control exhaustivo del momento de la ovulación (Roca et al., 2003). Los protocolos habituales de congelación en porcino utilizan una concentración de congelación de 109 espermatozoides/mL. Woelders et al (2004) observaron un aumento en los porcentajes de supervivencia de espermatozoides de cerdo congelados con medio BTS-yema de huevo a una concentración de 150 x 106 espermatozoides/mL (con respecto a espermatozoides congelados a 1500 x 106) y unos porcentajes de supervivencia similares entre estas concentraciones si el medio utilizado era lactosa-yema de huevo. En el presente trabajo se observó que la congelación del semen de verraco a 150 x 106 espermatozoides/mL no solo no era perjudicial, sino que presentó unos porcentajes de espermatozoides vivos, móviles totales y móviles progresivos mayores que la concentración de congelación habitual. La célula espermática sufre diversos cambios de volumen a lo largo del proceso de crioconservación. En el momento de la congelación estos cambios son debidos al estrés osmótico producido por la congelación del agua intra y extracelular, de manera que la membrana requiere de un grado de desplazamiento para poder acomodarse a estas variaciones de volumen (Watson, 2000). Hernández et al. (2007) observaron mediante criomicroscopía electrónica en una pajuela durante el proceso de congelación, que los lagos formados por el hielo extracelular, que ocupaban un 80 % de la superficie, comprimían las bandas de diluyente concentrado en las que se encontraban los espermatozoides. Así, la utilización de altas concentraciones de congelación podría suponer que dentro de cada una de estas bandas se encuentre un gran número de espermatozoides, de manera que el reducido espacio que queda entre las células no permita la acomodación de la membrana espermática a los cambios de volumen anteriormente citados. En el resto de experimentos se utilizó la concentración baja de congelación ya que permitiría realizar un mayor número de tratamientos por eyaculado, aunque serían necesarios más trabajos para confirmar esta mejora. 4. DISCUSIÓN 27 Una de las estructuras más afectada por el descenso de temperatura y los cambios osmóticos que se producen durante el proceso de congelación es la membrana plasmática. Los cambios de organización lipídica que sufre la membrana son dependientes de la temperatura y se producen por la transición de fase líquida a gel de los fosfolípidos que la componen. El colesterol juega un papel muy importante en la regulación de estos fenómenos debido a que interactúa con los fosfolípidos alterando su comportamiento de cambio de fase (Watson, 1981). Los espermatozoides de la especie porcina presentan un bajo ratio colesterol/fosfolípidos en su membrana y, por ello, son muy susceptibles al descenso de temperatura (Holt, 2000). Una manera sencilla de incrementar el contenido en colesterol de la membrana de los espermatozoides es el tratamiento con CLC. A priori, y tal y como se observa en otras especies con bajo ratio colesterol/fosfolípidos (caballos, toros, moruecos, burros y caprinos), el uso de CLC debería mejorar la supervivencia a la crioconservación de los espermatozoides de verraco. Existen pocos trabajos realizados para el estudio de la congelación de semen porcino con ciclodextrinas y sus resultados resultan contradictorios. Zeng y Terada (2000; 2001a; 2001b) observaron que el tratamiento de los espermatozoides de un solo verraco con ciclodextrinas no saturadas de colesterol (metil- -ciclodextrina o 2-hidroxipropil- -ciclodextrina) mejoraba los resultados tras la congelación, mientras que el suplemento de colesterol al medio resultaba en un empeoramiento. Sin embargo, Galantino-Homer et al. (2006) realizaron un estudio utilizando 2-hidroxipropil- -ciclodextrina y colesterol para el tratamiento de los espermatozoides y observaron un incremento de la viabilidad post-cold shock con respecto a los espermatozoides no tratados o tratados únicamente con la ciclodextrina. En el trabajo de Zeng y Terada emplearon un solo macho sin tener en cuenta la alta variabilidad para la congelación que existe entre individuos y, además, el tratamiento de los espermatozoides con las ciclodextrinas se realizó en presencia de yema de huevo, hecho que afecta a la transferencia de colesterol desde las ciclodextrinas hacia los espermatozoides, ya que se produce intercambio de colesterol entre las ciclodextrinas y el medio (Purdy y Graham, 2004). Además, los autores no determinaron la cantidad de colesterol que contenía la membrana de los espermatozoides antes y después del tratamiento con ciclodextrina, con lo que se desconoce si en realidad se produjo adición o eliminación de colesterol. Por otro lado, se ha demostrado en varios estudios en otras especies que el tratamiento de los espermatozoides con CLC previamente a la congelación mejora el porcentaje de espermatozoides que sobreviven al proceso. Así, esta mejora se ha observado en caballos (Combes et al., 2000; Moore et al., 2005; Zahn et al., 2002), en burros (Alvarez et al., 2006), en toros (Purdy y Graham, 2004; Mocé y Graham, 2005), en moruecos (Morrier et al., 2004; Mocé et al., 2006, datos no publicados) y en caprino (Barrera-Compean et al., 2005). Algunos autores observaron que los espermatozoides de porcino son muy susceptibles al cold-shock inmediatamente tras la eyaculación, pero que su resistencia aumenta (en un 50-80% de los espermatozoides) si los espermatozoides son incubados durante unas horas junto al plasma seminal (Watson, 1982). Si la incubación con CLC dotara de mayor resistencia a la membrana de los espermatozoides de porcino, el paso de incubación con plasma seminal 4. DISCUSIÓN 28 podría ser eliminado del protocolo de congelación, asemejándolo al del resto de especies. Los espermatozoides incubados a 16ºC junto a medio lactosa-yema de huevo y los espermatozoides llevados directamente a 5ºC sin pasar por la fase de enfriamiento lento a 16ºC presentaron porcentajes de viabilidad o motilidad similares a los espermatozoides congelados con el protocolo habitual (incubados con plasma seminal a 16ºC) independientemente de que fueran tratados o no con CLC. Dado que el protocolo de congelación de la especie porcina es muy diferente al del resto de especies (que no necesitan la fase de enfriamiento lento hasta 16ºC), fue necesario adaptar el protocolo de adición de las ciclodextrinas generalmente utilizado en los estudios nombrados anteriormente, comenzando por determinar cuál era el momento más adecuado para la incubación de los espermatozoides con las ciclodextrinas. Purdy y Graham (2004) observaron que los espermatozoides de toro experimentaban el efecto beneficioso de la incubación con CLC tanto si la adición se producía a 37ºC como a 22ºC y que alargar la incubación de los espermatozoides con las CLC más allá de los 15 minutos tampoco mejoraba los resultados obtenidos. Sin embargo, Álvarez et al. (2006) observaron que la temperatura idónea de adición de las CLC a los espermatozoides de burro era 20ºC (en comparación con la adición a 37ºC). La incubación de los espermatozoides de porcino con CLC al inicio o al final de la fase de incubación a 16ºC no resultó en un incremento de la supervivencia a la crioconservación de los espermatozoides. Tampoco mejoraron los porcentajes de viabilidad, motilidad total o motilidad progresiva al tratar los espermatozoides con CLC antes o después de la centrifugación. Estos resultados contradictorios con respecto a los observados en otras especies pueden ser consecuencia de la mala elección del tipo de ciclodextrina, de una concentración de ciclodextrina inadecuada o puede que sean necesarios un periodo de incubación más largo o una temperatura de incubación más alta. La ciclodextrina elegida en nuestros experimentos fue la 2-hidroxipropil- -ciclodextrina, ya que ésta es la que mejores resultados produce en algunas especies (moruecos). Además, esta es la ciclodextrina utilizada en la mayoría de los trabajos en porcino, ya que se ha observado que la exposición prolongada de los espermatozoides de porcino a la metil- - ciclodextrina (que es la más utilizada en otras especies) puede afectar a su viabilidad e integridad de membrana a concentraciones que son toleradas por células somáticas (Van Gestel et al., 2005). La concentración elegida fue la empleada en el resto de especies (2 mg CLC/120 x 106 espermatozoides). Mocé et al. (2006, datos no publicados) observaron que en los espermatozoides de caballos la adición de CLC antes de la centrifugación ofrecía porcentajes de espermatozoides móviles y vivos ligeramente más elevados que cuando la adición se producía después de la centrifugación. Sin embargo, en nuestro trabajo se observaron peores porcentajes de espermatozoides que sobreviven a la congelación cuando las muestras fueron tratadas justo antes de la centrifugación (tratamiento con “clc final” en incubación a 16ºC con plasma seminal, tratamiento con “clc A” en incubación a 16ºC con medio LEY y tratamiento con “clc A” cuando no hay incubación a 16ºC; datos no mostrados; Figura 6). Estos resultados pueden indicar que es perjudicial para el espermatozoide de porcino centrifugar inmediatamente después de los 15 minutos de incubación con las CLC y que es necesario más tiempo de equilibrado con el colesterol antes de someterlos al proceso de 4. DISCUSIÓN 29 centrifugación. La eficiencia en la transferencia de colesterol de las ciclodextrinas depende, entre otros factores, de la duración de la exposición de la célula al complejo ciclodextrina-colesterol (Zidovetzi y Levitan, 2007). Levitan et al. (2000) observaron que el contenido en colesterol de la célula del endotelio aórtico bovino expuesta durante 30 minutos a la ciclodextrina saturada de colesterol, aumentaba significativamente, y que, exposiciones más largas no presentaban mayores diferencias. Asimismo, Purdy y Graham (2004) observaron que un tiempo de incubación de 15 minutos con las CLC era suficiente para los espermatozoides de toro, sin embargo, durante el proceso de congelación habitual de esta especie, los espermatozoides no son sometidos a centrifugación. Con el protocolo habitual de congelación de semen de porcino (incubación a 16ºC con plasma seminal) el tratamiento con CLC de elección es la adición al inicio de la fase de incubación a 16ºC ya que así los espermatozoides ya han sido reforzados cuando se produce el descenso de temperatura de 22ºC a 16ºC, periodo en el que se producen los cambios de fase en los fosfolípidos de la membrana espermática y, como consecuencia, su desestructuración y pérdida de funcionalidad. INCUBACIÓN 16ºC PLASMA 22ºC 16ºC CENTRIFUGACIÓN 16ºC MEDIO LEY 16ºC 5ºC INCUBACIÓN 16ºC MEDIO LEY 22ºC CENTRIFUGACIÓN 22ºC MEDIO LEY 22ºC 16ºC 5ºC SIN INCUBACIÓN 16ºC 22ºC CENTRIFUGACIÓN 22ºC MEDIO LEY 22ºC 5ºC Figura 6: Diferentes tratamientos con CLC utilizados en: espermatozoides incubados a 16ºC con plasma seminal, en espermatozoides incubados a 16ºC con medio lactosa-yema de huevo (medio LEY) o en espermatozoides que no son sometidos a la incubación a 16ºC Puesto que la adición de 2-hidroxipropil- -ciclodextrina saturada de colesterol a los espermatozoide de verraco no mejoró su supervivencia tras la Adición clc Inicio Adición clc Final Adición clc D Adición clc A Adición clc D Adición clc A Adición clc D Adición clc A 4. DISCUSIÓN 30 descongelación, se procedió a determinar cuál era el tipo de ciclodextrina más adecuado para modificar la cantidad de colesterol en la membrana de los espermatozoides de esta especie. En este trabajo no se observaron diferencias entre las , ó ciclodextrinas o los hidratos de , o ciclodextrina. Los espermatozoides de porcino tratados con -ciclodextrinas saturada de colesterol presentaron los porcentajes más bajos para todos los parámetros estudiados. Estos resultados corroboran los obtenidos por Pitha et al. (1988) en los que observaron que las ciclodextrinas no modificadas, como la - o - ciclodextrina, presentan una solubilidad limitada en soluciones acuosas, lo que puede afectar a la eficiencia en la transferencia de colesterol. Esta capacidad para transferir colesterol a la membrana de los espermatozoides puede mejorar al incluir residuos metilo o hidroxipropilo en los grupos hidroxilo de las ciclodextrinas, ya que aumenta su solubilidad en agua y su capacidad para disolver compuestos hidrofóbicos (Yancey et al., 1996). Cuando los espermatozoides de porcino fueron tratados con hidroxipropil- -, 2hidroxipropil- - ó 2-hidroxipropil- -ciclodextrina saturadas de colesterol presentaron un menor descenso de motilidad tras una hora de incubación a 39ºC (Datos no mostrados). Mocé et al. (2006, datos no publicados) observaron que cuando los espermatozoides de morueco son tratados con ciclodextrina no saturada de colesterol, disminuyen sus porcentajes de motilidad total (-12%) y progresiva (-9%) con respecto a los espermatozoides no tratados. Sorprendentemente, en nuestro estudio, el tratamiento con la ciclodextrina no saturada de colesterol, que, a priori, eliminaría colesterol de la membrana del espermatozoide y aumentaría su susceptibilidad al cold shock, no resultó en una menor supervivencia a la congelación que los espermatozoides no tratados o los tratados con CLC. Zeng y Terada (2000; 2001a; 2001b) también observaron que el tratamiento con metil- -ciclodextrina o 2-hidroxipropil- -ciclodextrina no saturadas de colesterol mejoraba los resultados post-congelación en semen de verraco. No obstante, en estos trabajos la incubación de los espermatozoides con las ciclodextrinas se realizó en presencia de yema de huevo, produciéndose posiblemente transferencia de colesterol de la yema hacia el espermatozoide a través de la ciclodextrina, como se ha indicado previamente. En posteriores estudios realizados por Galantino-Homer et al. (2006), en los que se utilizaba la misma metodología para el tratamiento con las ciclodextrinas pero con un medio de congelación sin yema de huevo, no se observó esta mejora, ya que los espermatozoides de verraco sometidos a un tratamiento con ciclodextrina no saturada de colesterol presentaban unos porcentajes de viabilidad tras el cold-shock menores (-19%) que los espermatozoides control. Además, en un estudio realizado por Jiude Mao et al. (2005) observaron que los espermatozoides porcinos tratados con metil- -ciclodextrina no saturada de colesterol presentaban un porcentaje de acrosomas reaccionados significativamente mayor que los no tratados. Ante la falta de respuesta tras el tratamiento con distintas CLC a una concentración de 2 mg/120 x 106 espermatozoides, en el resto de experimentos se intentó determinar cuál es la concentración de CLC óptima. Para ello se utilizó la metil-β-ciclodextrina saturada de colesterol, ya que ésta es la ciclodextrina más utilizada en el resto de especies, además de presentar una mayor solubilidad en BTS (por lo tanto una buena transferencia de colesterol a las membranas) y de ser más económica. 4. DISCUSIÓN 31 En estos experimentos se observó que el tratamiento de los espermatozoides de verraco con más de 3 mg de CLC/120x106 espermatozoides provocaba una disminución en la supervivencia postdescongelación de los espermatozoides. Purdy y Graham (2004) observaron, en espermatozoides de toros, que cuando el contenido en colesterol aumenta de cuatro a cinco veces por encima del nivel normal éste se convierte en perjudicial para la supervivencia celular, ya que afecta a la fluidez de membrana y a su funcionalidad. El tratamiento de los espermatozoides de porcino con 1 mg ó 2 mg de metil- -ciclodextrina saturada de colesterol/ 120 x 106 espermatozoides mejoró la viabilidad (+8 % y +5 %) y el tratamiento con 1 mg la motilidad total y progresiva (+4 % y +4%) tras la descongelación. Al determinar con más exactitud la concentración óptima, de nuevo fue el tratamiento con 1 mg de metil- -ciclodextrina saturada de colesterol /120 x 106 espermatozoides el que presentó mejores resultados (vivos: +5%). Esta cantidad de metil- -ciclodextrina saturada de colesterol es similar a la utilizada por Purdy y Graham (2004) en toros (1,5-3 mg /120 x 106 espermatozoides), Moore et al. (2005) en caballos (1,5 mg /120 x 106 espermatozoides) y BarreraCompean et al. (2005) en caprino (0,75-1,5 mg /120 x 106 espermatozoides), todas ellas especies con un bajo ratio colesterol/fosfolípidos de membrana en sus espermatozoides y por lo tanto con mayor susceptibilidad al cold-shock. Galantino-Homer et al. (2006) obtuvieron un aumento significativo (+31%) en la supervivencia tras cold-shock de los espermatozoides de verraco utilizando 3,144 mg de 2-hidroxipropil- -ciclodextrina y colesterol/120 x 106 espermatozoides. No obstante, no es apropiado comparar directamente los resultados de este estudio con el presente trabajo ya que Galantino-Homer et al. (2006) utilizaron metodologías diferentes, tanto para la saturación de colesterol de las ciclodextrinas y su adición a los espermatozoides, como para el protocolo de inducción de cold shock (medio de congelación no capacitante sin yema de huevo Tardif et al. (2003), cold-shock inducido mediante incubación en baño de agua a 10ºC durante 10 minutos sin completar el protocolo de congelación y descongelación). Por otro lado, los incrementos observados en los porcentajes de espermatozoides vivos y móviles totales no alcanzan los obtenidos en estudios realizados en otras especies en los que se utilizan los mismos procedimientos de saturación de colesterol y de adición de las CLC: en toros, +15-18 % espermatozoides móviles totales y 9-14% espermatozoides vivos (Purdy y Graham, 2004);en caballos, +10-19% espermatozoides móviles totales y +9-21% espermatozoides vivos (Combes et al., 2000; Moore et al., 2005); en burros, +11-15% espermatozoides móviles totales y +7-9% espermatozoides vivos (Álvarez et al., 2006); en moruecos, +15-17% espermatozoides móviles totales y +15-23% espermatozoides vivos (Mocé et al.,2006, datos no publicados). Quizá, la mejora obtenida en porcino pueda aumentar hasta dichos niveles una vez determinado el protocolo completo de adición de CLC, ya que en futuros experimentos se volverá a determinar el tipo de CLC adecuada utilizando la concentración de 1 mg/120 x 106 espermatozoides, se determinará el contenido de colesterol en la membrana antes y después de la adición de CLC y también se compararán otros crioprotectores más permeables y otros diluyentes de congelación. 5. BIBLIOGRAFÍA 32 5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Álvarez AL, Serres C, Torres P, Crespo F, Mateos E, Gómez-Cuétara C. Effect of cholesterol-loaded cyclodextrin on the cryopreservation of donkey spermatozoa. Anim Reprod Sci, 2006;94:89-91. Amann RP. Cryopreservation of sperm. En: Encyclopedia of Reproduction, Volume 1. Academic Press, 1999:773-783. Bailey JL, Bilodeau JF, Cormier N. Semen cryopreservation in domestic animals: a gamaging and capacitating phenomenon. J Androl, 2000;21;1-7. Barrera-Compean MH, Purdy PH, Dzakuma JM, Newton GR, Nuti LC. Cholesterol-loaded cyclodextrin improves post-thaw goat sperm motility. J Anim Sci Suppl 2005;83;suppl 1;153. Bracken CJ. Effect of time of ovulation and sperm concentration on fertilization rate in gilts. Theriogenology, 2003;60:669-676. Combes GB, Varner DD, Schroeder F, Burghardt RC, Blanchard TL. Effect of cholesterol on the motility and plasma membrane integrity of frozen equine spermatozoa after thawing. J Reprod Fertil Suppl, 2000;56:127132. Carvajal G, Cuello C, Ruiz M, Vázquez JM, Martínez EA, Roca J. Effects of centrifugation before freezing on boar sperm cryosurvival. J Androl, 2004;25:389-396. Christian AE, Haynes MP, Phillips MC, Rothblat GH. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J Lipid Research, 1997;38:2264-2272. Cremades T, Roca J, Rodríguez-Martínez H, Abaigar T, Vázquez JM, Martínez EA. Kinematic changes during cryopreservation of boar spermatozoa. J Androl, 2005;26:610-618. Curry MR. Cryopreservation of semen from domestic livestock. Reviews of Reproduction, 2000;5:46-52. Darin Bennett A, White IG. Influence of the cholesterol content of mammalian spermatozoa on susceptibility to cold-shock. Cryobiology, 1977;14:466470. Eriksson BM, Petersson H, Rodríguez-Martínez H. Fierld fertility with exported boar semen frozen in the new flatpack container. Theriogenology, 2002;58:1065-79. 5. BIBLIOGRAFÍA 33 Gadea J. El uso de semen porcino congelado. Mundo ganadero, 2004;169:6062. Gadea J, Gumbao D, Matas C, Romar R. Supplementation of the thawing media with reduced glutathione improves function and the in vitro fertilizing ability of boar spermatozoa after cryopreservation. J Androl, 2005;26:749-756. García-Casado P, 2007. Estado actual de la congelación de semen de verraco. XXX Curso internacional de reproducción animal-INIA, Madrid, vol 1:107113. Galantino-Homer HL, Zeng WX, Megee SO, Dallmeyer M, Voelkl D, Dobrinski. Effects of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin and cholesterol on porcine sperm viability and capacitation status following cold shock or incubation. Mol Reprod Dev, 2006;73:638-650. Graham JK, Purdy PH, Moore A, Mocé E. Mechanisms of cryopreservation: the effect of membrane cholesterol. Proceedings of the 21st Technical Conference on Artificial Insemination and Reproduction, 2006. Gillmore Ja, Liu J, Peter AT, Critser JK. Determination of plasma membrane characteristics of boar spermatozoa and their relevance of cryopreservation. Biol Reprod, 1998;58:28-36. Hammerstedt RH, Graham JK, Nolan JP. Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. J Androl, 1990;11:73-86. He L, Bailey JL, Buhr MM. Incorporating lipids into boar sperm decreases chilling sensitivity but noy capacitation potential. Biol Reprod, 2001;64:69-79. Hernández M. Cryo-scanning electron microscopy (Cryo-SEM) of semen frozen in medium-straws from good and sub-standard freezers AI-boars. Cryobiology, 2007;54:63-70. Holt WV. Fundamental aspects of sperm cryobiology: The importance of species and individual differences. Theriogenology, 2000;53:47-58. Holt WV. Basic aspects of frozen storage of semen. Anim Reprod Sci, 2000;62:3-22. Holt WV, Medrano A, Thurston LM, Watson PF. The significance of cooling rates and animal variability for boar sperm cryopreservation: insights from the cryomicroscope. Theriogenology, 2005;63:370-382. Horvath G, Seidel Jr. GE. Vitrification of bovine oocytes after treatment with cholesterol-loaded methylβ-cyclodextrin. Theriogenology, 2006;66:1026-1033.