Estudio de sistemas de extracción en fase sólida para su aplicación en la determinación del plaguicida dimetoato

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR DE GANDÍA INGENIERÍA TÉCNICA FORESTAL ESTUDIO DE SISTEMAS DE EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA PARA SU APLICACIÓN EN LA DETERMINACIÓN DEL PLAGUICIDA DIMETOATO TRABAJO FINAL DE CARRERA Autora: Andrea Peña Badenas Directores: Mónica Catalá Icardo José Luis López Paz GANDÍA, 2011 Índice 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………….……1 1.1 Plaguicidas en el medio forestal .................................................................... 3 1.2 Dimetoato en el medio forestal ...................................................................... 4 1.2.1 Características generales ......................................................................... 4 1.2.2 Toxicidad en el ser humano ...................................................................... 4 1.2.3 Métodos de análisis del plaguicida dimetoato. ........................................ 5 1.3 Análisis por inyección en flujo ....................................................................... 7 1.3.1 Elementos del sistema FIA ....................................................................... 7 1.3.2 Características de los métodos FIA ......................................................... 8 1.4 Quimioluminiscencia ...................................................................................... 9 1.5 Combinación FIA - quimioluminiscencia ................................................... 10 1.6 Pretratamiento de la muestra: Sistemas de extracción en fase sólida ..... 11 1.6.1 Interacción analito-adsorbente .............................................................. 12 1.6.2 Características de los sistemas SPE ....................................................... 13 1.6.3 Procedimiento de extracción .................................................................. 14 1.6.4 Empleo de SPE en la determinación de plaguicidas .............................. 15 2. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO .................................................................. 17 2.1. Objetivos ........................................................................................................ 19 2.2. Plan de trabajo .............................................................................................. 19 3. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................... 21 3.1 Reactivos ........................................................................................................ 23 3.2 Cartuchos de SPE ......................................................................................... 24 3.3 Aparatos ........................................................................................................ 24 3.3.1 Instrumental del trabajo experimental ................................................... 24 3.3.2 Elementos del sistema FIA-CL ............................................................... 24 3.4 Determinación del dimetoato: sistema FIA-CL ......................................... 25 4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Y RESULTADOS ................................. 29 4.1 Efecto de los disolventes orgánicos en el sistema FIA-CL. ....................... 31 4.2 Selección del sistema del adsorbente para la SPE ..................................... 34 4.3 Optimización de variables del SPE ............................................................. 37 4.4 Estudio de interferentes ............................................................................... 38 4.5 Resumen del Sistema optimizado de extracción en fase sólida ................ 40 5. MUESTRAS REALES ........................................................................................... 43 6. CONCLUSIONES .................................................................................................. 49 7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 53 1. INTRODUCCIÓN 3 1.1 Plaguicidas en el medio forestal El uso de plaguicidas está muy extendido, tanto en el medio forestal como en el medio agrícola, debido a la necesidad de combatir plagas animales y vegetales. Sin embargo, la sobreutilización de los mismos conlleva graves problemas medioambientales, como la aparición de resistencias en las plagas. Además, los plaguicidas son compuestos muy tóxicos y no siempre selectivos, afectando a otras especies a las que inicialmente no estaban destinados y desequilibrando los sistemas biológicos. El uso reiterado de plaguicidas y en concentraciones más elevadas de lo establecido, puede producir que la planta no absorba el compuesto, y termine acumulándose en el suelo y en los vegetales, siendo arrastrado por la lluvia y contaminando tanto aguas superficiales como subterráneas, así como los organismos que viven en ella. El análisis de plaguicidas en muestras medioambientales es un requisito imperativo para asegurar la calidad de los recursos naturales. Sin embargo, dada la complejidad de este tipo de muestras y las bajas concentraciones a las que se encuentran los plaguicidas en las mismas, es necesario el desarrollo de métodos cada vez más selectivos y sensibles para su análisis. Habitualmente el análisis de los plaguicidas en muestras medioambientales se lleva a cabo empleando métodos de cromatografía líquida o gaseosa acoplada a diferentes sistemas de detección, especialmente la espectrometría de masas (MS). Sin embargo, estos equipos no están disponibles en cualquier laboratorio, dado el elevado coste de los mismos. Es por ello que resulta de gran interés el desarrollo de métodos alternativos más sencillos y económicos. En este sentido, la combinación análisis por inyección en flujo-quimioluminiscencia (FIA-CL), empleada como sistema de detección en el presente Proyecto Final de Carrera, aporta una elevada sensibilidad y selectividad con unos límites de detección muy bajos y amplios intervalos de aplicación. Anteriormente, este tándem ha sido aplicado con éxito en el análisis de alimentos1, fármacos2-4 o plaguicidas5-8 4 1.2 Dimetoato en el medio forestal 1.2.1 Características generales El dimetoato es un plaguicida organofosforado sistémico, esto es, un compuesto que es absorbido y transportado por el interior de la planta, siendo frecuentemente transformado en su interior en productos menos tóxicos o productos metabólicos con propiedades insecticidas y acaricidas. El nombre asignado por la IUPAC para el dimetoato es O,O-dimetil S-metilcarbamoilmetil fosforoditioato y su estructura química se presenta en la figura 1. Figura 1: Estructura química del dimetoato. Este plaguicida se usa contra insectos: áfidos, trips, saltamontes y moscas blancas en plantas ornamentales, aunque también se ha utilizado para la lucha contra la mosca del olivo9, además de en otros cultivos como cítricos. El dimetoato es estable a la hidrólisis en medio ácido o neutro, con una vida media de 156 y 678 días a pH 5 y 7 respectivamente. Sin embargo, a pH 9, la vida media es de 4,4 días10. La degradación del dimetoato da lugar a O-desmetil-dimetoato y ácido O,Odimetil hidrogeno fosforotioato11. Por regla general, la velocidad de hidrólisis de los pesticidas organofosforados es mayor en condiciones alcalinas, lo que sugiere que la reacción es más efectiva catalizada por radicales OHque por H2O o H3O+ 12. 1.2.2 Toxicidad en el ser humano La toxicidad en el ser humano10 puede ser: a) Aguda: La exposición durante breves periodos de tiempo causa los siguientes síntomas: entumecimiento, descoordinación, dolor de cabeza, H3C N H O S P(CH3O) 2 S 5 vértigo, dolores abdominales, visión borrosa, dificultad respiratoria, bradicardia. En dosis muy altas: inconsciencia, incontinencia, convulsiones y muerte. b) Crónica: En exposiciones largas, se produce: daño en la memoria, problemas de concentración, desorientación, depresión severa, irritabilidad, dolor de cabeza, dificultad al hablar, adormecimiento, náuseas, debilidad, pérdida del apetito y malestar. 1.2.3 Métodos de análisis del plaguicida dimetoato El método más habitualmente empleado para llevar a cabo la determinación del dimetoato es la cromatografía gaseosa (GC) acoplada con detector de nitrógenofósforo13,14, espectrómetro de masas (MS) de impacto electrónico15,16 o con un detector de fotometría de llama17,18. Sin embargo, la cromatografía líquida (LC) acoplada a la MS resulta más ventajosa cuando se trata de analizar compuestos polares, no volátiles o inestables térmicamente. Así, la combinación de la LC con la MS con ionización por electrospray19-23 ha sido ampliamente utilizada por diversos autores en la determinación de dimetoato. Por otra parte, la combinación del análisis por inyección en flujo (FIA) con este sistema de detección, llevada a cabo por H. John y col.19 permitió incrementar la velocidad de inserción del método. Además, el elevado grado de dilución que el método desarrollado requirió, permitió que los potenciales interferentes presentes en la matriz de la muestra también se vieran diluidos, de modo que la selectividad del sistema FIA desarrollado fue comparable a la del método cromatográfico. Aunque con menor frecuencia, la electroforesis capilar (EC) con detección por MS acoplada a una fuente de ionización de plasma (ICP) o con detección UV también ha sido empleada para la determinación de dimetoato24-25. Y. Chen y col.26 han desarrollado un método de EC con detección por electroquimioluminiscencia. El sistema se basa en un electrodo eléctricamente calentado de tris(2,2’-bipiridina)rutenio(II)/nanotubo de pasta de carbón de pared múltiple. El empleo de un electrodo calentado, proporcionó algunas ventajas frente al convencional electrodo a temperatura ambiente, tales como un incremento de sensibilidad, menor desviación estándar relativa y menor anchura de 12 inmovilizado en una membrana de microfibras. Los discos son de 0,5 mm de espesor y permiten flujos más elevados que los empleados con los cartuchos47. Figura 2: Tipos de presentaciones de los adsorbentes. La selección del adsorbente es un factor muy importante, que dependerá del analito y de sus grupos funcionales, del tipo de muestra y de cómo interacciona esta con el adsorbente. En general, cuanto mayor sea el área superficial específica, mayor será el contacto con las especie a retener y por tanto mayor grado de retención48. 1.6.1 Interacción analito-adsorbente Se puede introducir selectividad en el proceso de extracción en fase sólida utilizando distintos absorbente y variando la naturaleza del eluyente49. Las interacciones entre el sólido adsorbente y los analitos de una muestra pueden ser de tres tipos: apolares, polares e iónicas50. a) Interacciones apolares Este tipo de interacción se produce entre las cadenas hidrocarbonadas del sólido adsorbente y los analitos de la muestra. Dado que la mayoría de los compuestos orgánicos posee una estructura apolar, estos pueden ser fácilmente adsorbidos mediante fuerzas de Van der Waals. La excepción la constituyen aquellos compuestos que poseen un gran número de grupos polares o iónicos, que pueden enmascarar el carácter apolar del esqueleto carbonado. Adsorbentes típicos con un pronunciado carácter apolar son las sílices modificadas C18 y C8. Estas resinas muestran, no obstante, una baja selectividad, debido a que sus 13 grupos funcionales, los sustituyentes alquilo, pueden interaccionar con casi todos los analitos apolares. En general, los compuestos apolares presentes en una disolución polar son fácilmente adsorbidos en adsorbentes apolares y eluidos con disolventes apolares. La C18 es, en la actualidad, la fase más ampliamente utilizada. b) Interacciones polares Las interacciones polares incluyen la formación de puentes de hidrógeno, interacciones dipolo - dipolo e interacciones π - π que pueden ocurrir entre el sólido adsorbente y los grupos funcionales de los analitos. Algunas de esas interacciones son posibles entre grupos amino, hidroxilo y carbonilo, al igual que anillos aromáticos, dobles enlaces y grupos con heteroátomos como el nitrógeno, el azufre, el fósforo y el oxígeno. Adsorbentes típicos de este tipo son la sílice no modificada, o las sílices modificadas con grupos -CN, -NH2 y -OH. En general, los compuestos polares presentes en una disolución apolar son fácilmente adsorbidos en adsorbentes polares y eluidos con disolventes polares. c) Interacciones iónicas Las interacciones iónicas se producen entre un analito con carga positiva o negativa, y un sólido adsorbente con grupos funcionales de carga opuesta. La retención se ve favorecida si los analitos se encuentran presentes en una matriz de poca fuerza iónica, mientras que, para la elución de los analitos, lo más adecuado es utilizar un disolvente de elevada fuerza iónica. Algunos adsorbentes típicos para interacciones iónicas son las resinas Chelex-100 y Metpac CC-1. 1.6.2 Características de los sistemas SPE Los métodos SPE presentan un gran número de ventajas frente a otras técnicas de extracción. Se trata de una técnica que utiliza una instrumentación económica, sencilla y con un consumo de disolventes relativamente bajo comparado con los habituales en los métodos LLE. Por otra parte, el SPE es rápido y proporciona elevados factores de recuperación. 14 Se puede automatizar el proceso e incluso acoplarlo a sistemas cromatográficos. Además, se puede usar en combinación con otros sistemas de extracción. La selectividad dependerá de la correcta selección del adsorbente y del eluyente empleados. Cabe resaltar que la extracción del analito, además de eliminar potenciales interferentes, permite preconcentrar la muestra: el volumen de muestra que se trata suele ser superior al volumen empleado en la etapa de elución. El principal inconveniente estriba en la posibilidad de que otros componentes de la matriz afecten a la interacción del analito y el adsorbente. En otras ocasiones, compuestos oleosos y/o sólidos pueden obstruir el cartucho impidiendo la retención del analito. Ambas situaciones se traduce en una baja recuperación del analito de interés. Otro inconveniente de la técnica reside en las variaciones que se pueden dar entre lotes del mismo adsorbente, lo que se traduciría en una falta de reproducibilidad. Finalmente, indicar que esta técnica únicamente se puede aplicar a compuestos semivolátiles y no volátiles con temperaturas de ebullición muy por encima de la temperatura de trabajo, para evitar pérdidas de los analitos51,52. 1.6.3 Procedimiento de extracción La metodología para llevar a cabo la extracción consta de cuatro etapas53, que se esquematizan en la figura 2 y que se resumen a continuación: Primera etapa: Acondicionamiento del cartucho. Se emplea un disolvente adecuado para equilibrar, solvatar y limpiar el lecho. Segunda etapa: Adición de la muestra. Se hace pasar la muestra líquida a través del cartucho donde se retienen tanto los analitos como algunas sustancias interferentes. La muestra se introduce por gravedad, presión positiva o vacío, a una velocidad de flujo controlada, que permita la completa retención de los analitos. Tercera etapa: Etapa de lavado. Se eluyen las sustancias interferentes mediante un disolvente selectivo, mientras que los analitos permanecen en el lecho adsorbente. Cuarta etapa: Elución de los analitos mediante un disolvente selectivo. La elución de los analitos, una vez purificados y concentrados, puede llevarse a cabo por gravedad o con ayuda de una fuente de vacío, mediante presión o por centrifugación. La velocidad del 15 flujo debe ser adecuada para permitir que se alcance el equilibrio y la extracción sea próxima al 100%. A veces el extracto se evapora para concentrar el analito o para redisolverlo en un disolvente compatible con la técnica analítica que se vaya a emplear a continuación. Figura 2: Proceso de SPE La efectividad de la separación mediante SPE dependerá principalmente de la elección del sólido adsorbente y de los disolventes empleados para la elución54,55. Tras considerar la naturaleza química y la polaridad de los componentes de la muestra, y del disolvente en el que se encuentran, se elige un adsorbente sólido, de actividad y tamaño de partícula adecuado, y se empaqueta la columna fabricada con un material inerte. El lecho debe ser homogéneo y estar libre de huecos y canales, para asegurar la eficiencia del contacto con la muestra. 1.6.4 Empleo de SPE en la determinación de plaguicidas Como se ha comentado, las concentraciones de plaguicidas en las muestras medioambientales son, habitualmente, muy bajas. Esto, unido a la complejidad de este tipo de muestras, hace que, incluso cuando se emplean técnicas separativas como la cromatografía, y de elevada sensibilidad, sea necesario llevar a cabo algún pretratamiento previo de la muestra que suele implicar la extracción del plaguicida o plaguicidas de interés del resto de la matriz. 16 La aplicación de la SPE para llevar a cabo el proceso implica el paso de la muestra a través de un cartucho o una columna empaquetada con un adsorbente que sea capaz de retener los plaguicidas, seguido por la elución con un disolvente orgánico (generalmente los plaguicidas presentan baja polaridad), para obtener un extracto orgánico concentrado (que suele ser bastante limpio) y puede ser analizado por cromatografía de gases o cromatografía líquida, u otras técnicas analíticas suficientemente sensibles. Los adsorbentes más usados en la extracción de plaguicidas son las alquilsílicas (C8 y C18) y, más recientemente fases poliméricas como Oasis HLB, formada por un copolímero de vinil benceno y de vinil pirrolidona56. También son muy empleadas las tierras de diatomeas o columnas de intercambio catiónico para los compuestos iónicos. En la sección dedicada al análisis de dimetoato, se comentaron algunos de los sistemas SPE descritos en la bibliografía para su extracción. 2. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 19 2.1 Objetivos El presente Trabajo Final de Carrera tiene como objetivo principal poner a punto una estrategia basada en la extracción en fase sólida (SPE) del plaguicida dimetoato presente en muestras medioambientales de naturaleza acuosa. Dicha extracción deberá permitir la eliminación de interferentes y la preconcentración del dimetoato presente en las muestras, proporcionando la selectividad y sensibilidad necesaria para poder llevar a cabo la determinación del plaguicida. Esta se realizará mediante un sistema de análisis por inyección en flujo (FIA) con detección quimioluminiscente previamente desarrollado. Así pues, los objetivos desglosados del proyecto son los siguientes:  Puesta a punto del sistema de SPE para la extracción del plaguicida dimetoato presente en muestras acuosas.  Estudio de la eficacia del método de SPE desarrollado en la eliminación de interferentes.  Aplicación del sistema de SPE a muestras de agua de diferente procedencia y determinación del dimetoato mediante un sistema de análisis por inyección en flujo (FIA) con detección por quimioluminiscencia (CL) previamente desarrollado. 2.2 Plan de trabajo A continuación se detalla el plan de trabajo que se ha seguido en la realización del Trabajo Final de Carrera: 1. Revisión bibliográfica, con la finalidad de obtener información sobre los sistemas de SPE previamente empleados con el plaguicida dimetoato. 2. Estudio del efecto de diferentes disolventes orgánicos en el sistema FIA-CL. Los disolventes orgánicos, habitualmente empleados como eluyente en los sistemas SPE, a menudo afectan a la respuesta quimioluminiscente, especialmente cuando esta se basa en el empleo oxidantes fuertes. Para determinar si este es el caso del sistema FIA-CL seleccionado para llevar a cabo la determinación del dimetoato, se 20 estudiará el efecto de los disolventes orgánicos más habituales, tales como metanol, acetonitrilo, etanol o acetona. En caso de que los disolventes orgánicos no fueran compatibles con el sistema de detección, sería necesario llevar a cabo tediosos procesos de eliminación del mismo y redisolución del plaguicida en un medio adecuado. 3. Estudio comparativo de diversos sistemas de SPE. Para seleccionar el adsorbente más adecuado para llevar a cabo la extracción del dimetoato, se ensayarán diversos cartuchos de adsorbentes comerciales y se determinará el factor de recuperación proporcionado por cada uno de ellos. 4. Puesta a punto del sistema de SPE. Una vez seleccionado el adsorbente más adecuado, en función de los resultados del punto anterior, se estudiarán las variables más importantes que pueden afectar a la recuperación del dimetoato, tales como volumen de elución y caudal al que se pasa la muestra en la etapa de carga o al que se realiza la elución. En caso de que fuera necesario eliminar el disolvente empleado en la elución, se estudiarían las condiciones más adecuadas para ello. 5. Estudio de interferentes en el sistema SPE-FIA-CL. Se estudiará la capacidad de la estrategia de SPE desarrollada para eliminar las especies que interfieren en la determinación del dimetoato mediante el sistema FIACL. 6. Aplicación del sistema de SPE-FIA-CL a la determinación de dimetoato en muestras de agua. El método desarrollado se aplicará a la determinación del plaguicida dimetoato en diversas muestras de agua natural de diferente procedencia, con el fin de comprobar la aplicabilidad de la estrategia desarrollada. 3. MATERIAL Y MÉTODOS 28 4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Y RESULTADOS 31 4.1 Efecto de los disolventes orgánicos en el sistema FIA-CL El sistema FIA-CL seleccionado para la llevar a cabo la determinación del dimetoato, y que ha sido descrito en la sección 3.4, se basó en la reacción de un oxidante fuerte, cerio (IV) en medio ácido clorhídrico, con el producto de la hidrólisis alcalina del dimetoato, actuando el cloruro de hexadecil piridinio como sensibilizador de la reacción quimioluminiscente. Con frecuencia los disolventes orgánicos afectan a la señal quimioluminiscente en este tipo de sistemas, pudiendo provocar una inhibición o una exaltación de la misma, y por tanto una interferencia en la determinación. Así pues, en caso de emplearse un disolvente orgánico para la elución del plaguicida en el proceso de SPE, serían necesarios tediosos procesos para la eliminación del mismo por evaporación y la posterior redisolución del residuo sólido obtenido en un medio compatible con el sistema FIA-CL. Con el fin de determinar el efecto de algunos de los disolventes orgánicos habitualmente empleados en los procesos de SPE sobre el sistema FIA-CL, se prepararon calibrados del plaguicida en presencia de: metanol, etanol, acetonitrilo y acetona. Se consideraron dos porcentajes distintos de cada disolvente orgánico, 10 y 20%, y además se preparó un calibrado de dimetoato en agua para emplearlo como referencia. Los resultados obtenidos se presentan a continuación en la tabla 4 y los gráficos 1, 2 y 3, siendo las concentraciones de dimetoato utilizadas: 0, 1, 5, 15, 35 y 70 g/l. En el caso de la acetona, las señales de blanco obtenidas fueron tan elevadas que su uso fue descartado, por lo que no se ha reflejado en las tablas y gráficos. [Dimetoato], g/l Referencia ACN 10% ACN 20% Etanol 10% Etanol 20% Metanol 10% Metanol 20% 0 1610 2090 3150 3040 3890 6900 6300 1 2110 2470 3160 3120 3700 7900 6600 5 3650 4060 5090 4500 4970 8800 7300 15 7480 8080 9220 7690 8070 10100 8400 35 15700 16800 18400 14800 13200 12840 11500 70 30500 33100 34400 25400 21360 18500 14540 Tabla 4: Señales (Hz) obtenidas para diferentes concentraciones de dimetoato en diferentes medios. 32 0 5 10 15 20 25 30 35 0 20406080 Señal (kHz) [Dimetoato] (ppb) Referencia ACN 10% ACN 20% Gráfico 1: Efecto del acetonitrilo en el sistema FIA-CL. I es la intensidad de la señal corregida restando el blanco. 0 5 10 15 20 25 30 35 0 20406080 Señal (kHz) [Dimetoato] (ppb) Referencia Etanol 10% Etanol 20% Gráfico 2: Efecto del etanol en el sistema FIA-CL. I es la intensidad de la señal corregida restando el blanco. 0 5 10 15 20 25 30 35 0 20406080 Señal (kHz) [Dimetoato] (ppb) Referencia Metanol 10% Metanol 20% Gráfico 3: Efecto del metanol en el sistema FIA-CL. I es la intensidad de la señal corregida restando el blanco. 33 Como se observa en los resultados mostrados en los gráficos anteriores, la presencia de metanol (gráfico 3) y etanol (gráficos 2) supuso un descenso importante en las señales obtenidas, una vez corregidas por el blanco. Las señales obtenidas para las concentraciones más bajas de dimetoato ensayadas fueron difícilmente detectables y la pendiente de la recta de calibrado sufrio un importante descenso, especialmente acentuado en el caso del metanol. En la tabla 5 se muestran las ecuaciones de las rectas de calibrado obtenidas, así como la variación experimentada por la pendiente de la recta tomando como referencia el calibrado preparado en agua. Sin embargo, en el caso del acetonitrilo el efecto diferió considerablemente de los anteriores disolventes. Como se observa en el gráfico 1 y la tabla 5, la pendiente de la recta incluso se incrementó ligeramente respecto de la obtenida en agua, en concreto un 8,0 y un 9,7% para acetonitrilo al 10 y 20% respectivamente. Aunque el incremento de la pendiente fue algo superior al aumentar el porcentaje de acetonitrilo, se descartó ensayar concentraciones más altas por diversos motivos. Por una parte se observó un aumento de la señal de blanco, lo que habitualmente se traduce en un incrementio en el límite de detección. Por otra parte, se deseaba minimizar en la medida de los posible el empleo de disolventes orgánicos, para desarrollar un método lo más límpio posible. Medio Ecuación de la recta de calibrado Δ pendiente, % Agua (referencia) I = 0.412·C – 0.108; r2 = 0.9997 - Acetonitrilo 10% I = 0.445·C – 0.394; r2 = 0.9992 +8.0% Acetonitrilo 20% I = 0.452·C – 0.497; r2 = 0.9999 +9.7% Etanol 10%: I = 0.324·C – 0.111; r2 = 0.9989 -21,4% Etanol 20%: I = 0.254·C + 0.039; r2 = 0.9969 -38.3% Metanol 10% I= 0.151·C + 0.928; r2 = 0.9981 -63.3% Metanol 20%: I = 0.116·C + 0.445; r2 = 0.98 -71.8% Tabla 5: Donde I representa la señal corregida por el blanco, medida en kHz, y C la concentración, en g/l. Por tanto, teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se deduce que la presencia de pequeños porcentajes de acetonitrilo (en torno al 10%) no suponen una alteración significativa en la respueta del sistema FIA-CL, de manera que el empleo de este disolvente como eluyente en el proceso de SPE sería perfectamente compatible con el mismo. 34 4.2 Selección del sistema del adsorbente para la SPE Como resultado de la búsqueda bibliográfica realizada, se encontró que existe una gran variedad de sistemas de SPE que han sido empleados para extraer dimetoato de muestras acuosas, que incluyen tanto cartuchos con rellenos apolares tipo C18 y C8 y de diferentes polímeros. En el presente estudio se incluyeron tres cartuchos comerciales diferentes, que fueron:  Cartuchos BOND ELUT-ENV con 200 mg de relleno, comercializados por la casa Varian para la extracción de plaguicidas. La composición del adsorbente no es facilitada por la casa.  Cartuchos CHROMABOND con 500 mg de una resina adsorbente de poliestireno-divinilbenceno, comercializado por la casa Macherey-Nagel.  Cartuchos BOND ELUT-ENV de C18 con 200 mg de relleno, comercializados por la casa Varian. En todos los casos, el procedimiento seguido para llevar a cabo la SPE fue el mismo y se resume a continuación: Primera etapa: Acondicionamiento del cartucho. Se pasaron a través del cartucho 3 ml de metanol, 3 ml de acetonitrilo y de nuevo 3 ml de metanol. Finalmente se pasaron 9 ml de agua para eliminar los restos de disolvente orgánico. Segunda etapa: Adición de la muestra. Se pasó a través de los cartuchos acondicionados 50 ml de 6 disoluciones patrón de dimetoato en agua, de concentraciones comprendidas entre 0,1 y 12 g/l, además de una disolución blanco (0 g/l de dimetoato). El caudal al que pasó cada disolución a través del cartucho se mantuvo entre 2-3 ml/min. Tercera etapa: Etapa de lavado. A continuación se procedió al lavado del cartucho empleando 9 ml de agua y finalmente se secó el cartucho dejando pasar aire a su través durante 20 minutos con ayuda de la bomba de vacío. 35 Cuarta etapa: Elución. Finalmente se empleó 1 ml de acetonitrilo para eluir el dimetoato retenido en el cartucho. La elución se realizó por gravedad y cuando ya no se observó líquido se aplicó vacío para recoger el máximo disolvente. Finalmente se pasaron a través del cartucho 2 ml de agua, para arrastrar cualquier resto de acetonitrilo que pudiera haber quedado retenido en el sistema y se completó hasta un volumen de 10 ml con agua en un matraz aforado. Teniendo en cuenta que el volumen final tras la elución fue de 10 ml y el volumen tratado de cada patrón fue de 50 ml, las concentraciones obtenidas despues del proceso de SPE deberían ser 5 veces superiores a las de partida, situándose entre 0,5 y 60 g/l, dentro por tanto del intervalo de linealidad del método FIA-CL. Además, cada una de las disoluciones de dimetoato obtenidas contenía un 10% de acetonitrilo. Para comprobar la efectividad de cada cartucho en las condiciones ensayadas, las disoluciones obtenidas se insertaron en el sistema FIA-CL, junto con un calibrado de dimetoato preparado en acetonitrilo al 10%. En las tablas 6, 7 y 8 se muestran la concentración de dimetoato encontrada tras aplicar la estrategia SPE-FIA-CL con cada uno de los cartuchos ensayados, así como los porcentajes de recuperación obtenidos en cada caso. [Dimetoato]preparada, g/l [Dimetoato]encontrada,  g/l Recuperación, % 0,5 1,925 385 1,5 4,625 308 5 16,196 324 15 36,884 246 30 66,338 221 60 113,324 189 Tabla 6: Resultados obtenidos al aplicar la estrategia SPE-FIA-CL con los cartuchos BOND ELUT-ENV. Como se observa en la tabla 6 las concentraciones encontradas para el cartucho de BOND ELUT-ENV fueron significativamente superiores a las reales, con factores de recuperación situados entre 189 y 385%. Esto probablemente pueda deberse al desprendimiento de algún compuesto del relleno del cartucho por efecto del acetonitrilo, ya que la señal del blanco obtenida también fue unas 2.5 veces mayor a la 36 proporcionada por un blanco con el mismo porcentaje de acetonitrilo pero que no pasó a través del catucho. [Dimetoato]preparada, g/l [Dimetoato]encontrada,  g/l Recuperación, % 0,5 - - 1,5 - - 5 - - 15 0,783 5,2 30 5,750 19,2 60 17,596 29,3 Tabla 7: Resultados obtenidos al aplicar la estrategia SPE-FIA-CL con los cartuchos CHROMABOND. Como se muestra en la tabla 7, el empleo de los cartuchos de Chromabond, rellenos de una resina adsorbente de poliestireno-divinilbenceno, proporcionó factores de recuperación muy bajos. De hecho, las concentraciones de dimetoato más bajas fueron indistinguibles de la señal de blanco. Los motivos pueden ser varios, ya que es posible que el plaguicida no sea retenido en el cartucho o bien que este no sea completamente eluido con 1 ml de acetonitrilo. [Dimetoato]preparada, g/l [Dimetoato]encontrada,  g/l Recuperación, % 0,5 0,507 101,4 1,5 1,648 109,9 5 4,311 86,2 15 15,014 100,1 30 29,815 99,4 60 68,593 114,3 Tabla 8: Resultados obtenidos al aplicar la estrategia SPE-FIA-CL con los cartuchos C18. Según los datos obtenidos, mostrados en la tabla 8, podemos observar que los resultados con el relleno de C18 fueron satisfactorios en todo el intervalo de concentraciones ensayado, siendo la recuperación promedio obtenida del (10210)%. Teniendo encuenta los resultados anteriores, se decidió seleccionar los cartuchos de C18 para llevar a cabo la etapa de SPE. Se mantuvo en todas las experiencias el volumen de muestra en 50 ml, de modo que el factor de preconcentración fue de 5. Tratando 37 volúmenes mayores sería posible incrementar aun más la sensibilidad del método, aunque a costa de incrementar el tiempo de análisis. 4.3 Optimización de variables del SPE Una vez seleccionado el adsorbente y eluyente a emplear, una de las variables más importantes que pueden afectar al proceso de SPE es el caudal al que la muestra atraviesa el cartucho, ya que este debe ser tal que permita la interacción efectiva del analito con el adsorbente. Otras variables igualmente importantes son el volumen de eluyente y el caudal al que este atraviesa el cartucho, que debe permitir la desorción completa del analito. El volumen empleado de eluyente en las experiencias anteriores fue de 1 ml, valor de por sí lo suficientemente bajo, teniendo en cuenta el volumen del cartucho, como para evitar el estudio de valores inferiores. Por otra parte, se descartó el empleo de volúmenes mayores para no incrementar el consumo de acetonitrilo, disolvente de elevada toxicidad. La elución se llevó a cabo por gravedad para asegurar que el tiempo de contacto fuera suficiente, y dado el pequeño volumen de disolvente empleado, se consideró innecesario estudiar el empleo de caudales mayores que no habrían repercutido en una mejora significativa en la velocidad del proceso. Así pues, la única variable que fue necesario estudiar fue el efecto del caudal o velocidad a la que la muestra atraviesa el cartucho. Para ello se repitió la experiencia anterior pero modificando la etapa 2, para emplear un caudal mayor que permitiera reducir el tiempo necesario para procesar las muestras. En este caso el caudal se mantuvo entre 5-6 ml/min, mostrándose en la tabla 9 los resultados obtenidos. [Dimetoato]preparada, g/l [Dimetoato]encontrada,  g/l Recuperación, % 0,5 0,303 60,6 1,5 1,246 83,1 5 3,871 77,4 15 16,029 106,9 30 19,954 66,5 60 51,560 85,9 Tabla 9: Resultados obtenidos con los cartuchos C18 usando 5-6 ml/min como caudal de la muestra. 45 Para comprobar la eficacia de la estrategia SPE-FIA-CL propuesta, se procedió a aplicarla a muestras de agua naturales de diferencia procedencia. En la tabla 12 se muestra la procedencia de cada una de ellas. Las muestras se recogieron en una botella de plástico y se mantuvieron a 4ºC para ser analizadas en menos de 48 horas. Con el fin de eliminar arena y otros sólidos en suspensión, a su llegada al laboratorio fueron filtradas empleando un filtro de membrana de 0,45 m. Tipo de agua Localidad Mar Playa de Gandía Fuente Balconchán, Zaragoza Pozo Huesca Grifo Grau de Gandía Mineral Bezoya Ortigosa del Monte (Segovia) Tabla 12: Procedencia de las muestras de agua estudiadas. Se tomaron alícuotas de 50 ml de cada muestra y se doparon con el volumen necesario de una disolución patrón de 100 mg/l de dimetoato para obtener concentraciones de plaguicida de 0,2, 0,5 y 1,0 g/l. Se prepararon tres réplicas de cada concentración. Se trataron a continuación tal y como se ha descrito en el apartado anterior para llevar a cabo la SPE, de modo que las concentraciones de dimetoato obtenidas tras la elución fueran: 1,0, 2,5 y 5,0 g/l. Finalmente se determinó la concentración de dimetoato mediante el sistema FIA-CL. Los resultados obtenidos se muestran a continuación en las tablas de la 13 a la 17. 46 [Dimetoato] adicionada, g/l [Dimetoato] encontrada, g/l Recuperación, % Error relativo, % 1,0 0,391 39,1 (6030) 0,866 86,6 - - 2,5 2,634 108,5 (1072) 2,713 105,3 - - 5,0 4,269 85,4 (11030) 6,486 129,7 - - Tabla 13: Determinación de dimetoato (SPE-FIA-CL) en una muestra de agua de mar La recuperación promedio en la determinación de dimetoato en la muestra de agua de mar fue del (9030)%. En los tres casos una de las réplicas se perdió por errores aleatorios. [Dimetoato] adicionada, g/l [Dimetoato] encontrada, g/l Recuperación, % Error relativo, % 1,0 0,921 92,1 (9314)% 1,072 107,2 0,791 79,1 2,5 2,434 97,4 (977)% 2,586 103,4 2,233 89,3 5,0 5,517 110,3 (1082)% 5,423 108,5 5,298 106.0 Tabla 14: Determinación de dimetoato (SPE-FIA-CL) en una muestra de agua de fuente La recuperación promedio en la determinación de dimetoato en la muestra de agua procedente de fuente fue del (9911)%. 47 [Dimetoato] adicionada, g/l [Dimetoato] encontrada, g/l Recuperación, % Error relativo, % 1,0 0,990 99.0 (965)% 0,990 99.0 0,909 90,9 2,5 2,449 98.0 (11011)% 2,930 117,2 2,877 115,1 5,0 5,696 113,9 (1133)% 5,797 115,9 5,520 110,4 Tabla 15: Determinación de dimetoato (SPE-FIA-CL) en una muestra de agua de pozo La recuperación promedio en la determinación de dimetoato en la muestra de agua de pozo fue del (10710)%. [Dimetoato] adicionada, g/l [Dimetoato] encontrada, g/l Recuperación, % Error relativo, % 1,0 1,014 101,4 (1039)% 1,120 112.0 0,946 94,6 2,5 2,569 102,8 (939)% 2,126 85,0 2,253 90,1 5,0 4,798 96.0 (906)% 4,225 84,5 4,509 90,2 Tabla 16: Determinación de dimetoato (SPE-FIA-CL) en una muestra de agua de grifo La recuperación promedio en la determinación de dimetoato en la muestra de agua de grifo fue del (959 )% 48 [Dimetoato] adicionada, g/l [Dimetoato] encontrada, g/l Recuperación, % Error relativo, % 1 1,000 100,0 (1008)% 0,924 92,4 1,076 107,6 2.5 2,368 94,7 (965)% 2,520 100,8 2,292 91,7 5 5,067 101,3 (983)% 4,801 96,0 4,839 96,8 Tabla 17: Determinación de dimetoato (SPE-FIA-CL) en una muestra de agua mineral La recuperación promedio en la determinación de dimetoato en la muestra de agua mineral comercial fue del (985)%. En resumen, los resultados obtenidos muestran recuperaciones promedio entre el 90 y 107% empleando concentraciones entre 0,2 y 1,0 g/l de dimetoato y cinco matrices acuosas de diferente procedencia. 6. CONCLUSIONES 51 El sistema de extracción en fase sólida (SPE) desarrollado ha permitido una eficaz limpieza y preconcentración del dimetoato presente en muestras de agua de diferente naturaleza. Las concentraciones en las que se encuentran los plaguicidas en las muestras de aguas naturales son muy bajas, lo que hace necesario el desarrollo de métodos analíticos con una elevada sensibilidad. Aunque la estrategia FIA-CL previamente desarrollada fue altamente sensible, permitiendo la determinación de dimetoato en concentraciones del orden de partes por billón, la Unión Europea ha establecido un valor máximo en muestras de consumo humano de 0,1 g/l para plaguicidas individuales y de 0,5 g/l para plaguicidas totales58. Es por ello que la preconcentración mediante técnicas de extracción es necesaria. La estrategia de SPE desarrollada a permitido la determinación eficaz de concentraciones de dimetoato entre 0,2 y 1,0 g/l, tratando 50 ml de muestra de agua. Incrementando el volumen de muestra, fácilmente se podría llegar a determinar las concentraciones máximas fijadas por la legislación para muestras de agua de consumo humano. Por otra parte, un problema habitual en la mayoría de los métodos analíticos es la falta de selectividad, ya que las muestras medioambientales presentan una elevada complejidad. La estrategia de SPE desarrollada ha demostrado su eficacia al eliminar aquellos iones, además de la urea y el clorpirifos (plaguicida formulado junto con el dimetoato), que fueron cauda de interferencia en el método FIA-CL. Así pues, los objetivos planteados en el Trabajo Final de Carrera han sido alcanzados con éxito, habiéndose desarrollado una estrategia SPE-FIA-QL que podría resultar de interés en el control de los niveles de dimetoato en muestras de agua de diferente procedencia. 7. BIBLIOGRAFÍA [34] F. Hernández, J. V. Sancho, O. Pozo, A. Lara and E. Pitarch “Rapid direct determination of pesticides and metabolites in environmental water samples at sub-μg/l level by on-line solid-phase extraction-liquid chromatography– electrospray tandem mass spectrometry” J. Chromatogr. A, 2001, 939(1-2), 1-11. [35] A. Garrido Frenich, J.L. Martinez Vidal, M.C. Pablos Espada, M.D. Gil Garcia, F.J. Arrebola. “Comparison of gas chromatography with NPD, MS, and tandem MS in the multiresidue analysis of pesticides in environmental waters” Chromatographia, 2000, 52 (9-10), 614-620. [36] V.K. Karamfilova, T.W. Filemanb, K.M. Evansb, R.F.C. 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