Compuestos fenólicos y flavonoides como marcadores bioquímicos de la respuesta a estrés abiótico en plantas tolerantes

UNIVERSIDAD POLITECNICA DE VALENCIA ESCUELA POLITECNICA SUPERIOR DE GANDIA Licenciatura en Ciencias Ambientales “Compuestos fenólicos y flavonoides como marcadores bioquímicos de la respuesta a estrés abiótico en plantas tolerantes” TRABAJO FINAL DE CARRERA Autor: Pau Calatayud Vaello Directores Dra. Mónica Boscaiu Neagu Dr. Óscar Vicente Meana GANDIA 2010 - 2 - "Aceptaría la posibilidad de crecimiento infinito de la economía, el día que uno de mis colegas economista pudiera demostrar que la Tierra misma podría crecer a un ritmo acorde." Herman Daly, economista. - 3 - Índice . - 4 - 1INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………...7 1.1 Estrés ambiental y estrés abiótico...….………...…………….………......8 1.2 Plantas adaptadas al estrés……...…….……………………………..…….9 - Plantas halófilas….……………………………………………..….9 - Plantas gipsófilas………………..…………………………….....10 - Plantas xerófilas…………………..……………………………...11 1.3 Zonas de estudio……………………………..………………..……...…….12 - Zona salina…………………………..………….…………..……..12 - Zona yesífera…………………………..………………..………...18 - Zona semiárida…….………………….…………….…..……...…24 1.4 Compuestos fenólicos………………………………………...…..……….28 1.5 Flavonoides……...…………………………………...…………..…..……...29 - Estructura química…………..…………………………..……….29 - Biosíntesis…………..…………………………………..…...…….30 2 OBJETIVOS………...…………………………………...…………..………….33 2.1 Objetivo general del trabajo…………………….....……………..……….34 2.2 Objetivos particulares del trabajo………………………………..………35 3 MATERIAL Y MÉTODOS……………………………….……………..………36 3.1Material vegetal………………………..……………………………………..37 - Especies propias de suelo salino……………………..………37 - Especies propias de suelo yesífero……………..……………41 - Especies propias de suelo semiárido……………...…………43 - 5 - - Especies que crecen en más de un tipo de suelo….…...….44 3.2 Trabajo de campo…………………………………..…………………..…..46 3.3 Trabajo de laboratorio………………..…………………………..………..47 - Preparación de muestras en el laboratorio……...…………..47 - Preparación del extracto…………………………………..……47 - Medida de compuestos fenólicos………………………..……48 - Medida de flavonoides………………………………………..…52 3.4 Análisis estadístico………………………………………………………....55 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………….56 4.1 Compuestos fenólicos……………….…………………..…………………57 - Zona Saler…….……………………………….…………………..57 - Zona de Yesos.……………………………….…………………..61 - Zona de Bétera……………………………….…………………...66 4.2 Flavonoides….……………………………………………..……………..….67 - Zona Saler.…………………………………….…………………..67 - Zona de Yesos.……………………………….…………………..71 - Zona de Bétera.…………………………………………………...75 5 CONCLUSIONES………………………………………………………...…………77 5.1 Proporción de Flavonoides en el total de………………………..…….78 Compuestos Fenólicos 5.2 Variación de la proporción de Flavonoides……………………..……..78 en Fenoles totales según muestreos - 6 - 5.3 Variación de la proporción Flavonoides/Fenoles……………………..79 totales según la zona 5.4 Cantidad total de Fenoles…………………..……………………………..79 5.5 Cantidad de Flavonoides…………………………………..………………80 6 BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………..…………………82 ANEXOS……………………………………………………………………..………...86 - 7 - 1 INTRODUCCIÓN - 8 - 1.1 Estrés ambiental y estrés abiótico El estrés abiótico se define como cualquier condición externa a los organismos vivos que reduce el crecimiento, supervivencia y fecundidad de una planta. Puede ser una sequía, una elevada salinidad del suelo, temperaturas extremas, escasez de luz o exceso de radiación, inundaciones, suelos ácidos, alcalinos, pobres en nutrientes, etc. Los recursos del suelo requeridos para el crecimiento de las plantas se distribuyen de forma heterogénea con una gran variabilidad temporal y espacial (Jackson & Caldwell, 1993). Esta característica propia de los ecosistemas naturales puede tener consecuencias ecológicas, afectando al crecimiento de las plantas y al reparto de la biomasa entre raíces y parte aérea (Wijesinghe et al., 2005). En ambientes naturales, factores del microhábitat como luz, agua y nutrientes afectan al desarrollo de la planta y por tanto, examinar los nutrientes y las características de los microhábitat afectados por estrés abiótico puede ayudar a comprender la distribución espacial de las especies de estas zonas, ya que mediante la selección natural las plantas han adquirido una serie de mecanismos que les han permitido sobrevivir en situaciones adversas (Ortolà, 2003) y de esta forma adaptarse a estos ecosistemas. El Servicio de Gestión del Territorio y Nutrición Vegetal de la FAO, estima que aproximadamente el 6% de los suelos de la tierra están afectados por la salinidad o la sodicidad. De los suelos cultivados actualmente 230 millones de Ha de las tierras de regadío, el 19.5% están afectadas por la sal y de las 1500 millones de Ha bajo agricultura de secano el 2.1% están afectadas por la sal en distintos grados. Estos son algunos de los motivos por los cuales es prioritario el estudio de la respuesta al estrés abiótico por ser una de las principales causas de reducción de las cosechas a nivel mundial. Hasta el momento se han realizado estudios en condiciones artificiales en laboratorios con especies no tolerantes al estrés como Arabidopsis thaliana, con estos ensayos se han definido algunos mecanismos bioquímicos básicos de respuesta al estrés: homeostasis iónica, síntesis de metabolitos y proteínas, regulación de balance osmótico. No obstante los niveles de tolerancia al estrés abiótico, que tienen estas especies no son comparables a los de las plantas silvestres adaptadas a un tipo estrés como son los casos de las halólifitas, gipsófita, xerófitas. Por esta razón es especialmente interesante el estudio de los mecanismos de respuesta al estrés de las especies silvestres tolerantes en condiciones naturales, para poder estudiar las - 9 - variaciones en función de los cambios especiales y temporales, teniendo en cuenta las características de sus hábitats, las condiciones climatológicas. El estudio de estos mecanismos es complementario al realizado en el laboratorio con plantas no tolerantes, ayudara a avanzar en este campo. 1.2 Plantas adaptadas al estrés La domesticación inicial y el posterior desarrollo de las plantas cultivadas a lo largo de la historia, al ser seleccionadas por caracteres como rapidez de crecimiento, acumulación de biomasa, o producción de frutos y semillas, no ha potenciado la tolerancia a estrés; al contrario, ha supuesto su disminución con respecto a sus predecesores silvestres, ya que la inhibición del crecimiento vegetativo y del desarrollo reproductivo es precisamente la respuesta al estrés más general e inmediata de las plantas, que desvían todos sus recursos (energía, precursores metabólicos, etc.) para sobrevivir a las condiciones adversas (Serrano & Gaxiola 1994; Zhu, 2001). No obstante también existen plantas adaptadas de forma natural a condiciones de estrés. Esta vegetación especializada es capaz de sobrevivir y completar su ciclo biológico a pesar de estar sometida a estas condiciones adversas en sus hábitats respectivos. - Plantas halófilas Son plantas que viven en ambientes hipersalinos: zonas áridas, costas, diferentes profundidades de agua de mar, etc. Son las únicas plantas que pueden crecer y completar su ciclo biológico en estas condiciones son las denominadas halófilas, las cuales han desarrollado adaptaciones fisiológicas para subsistir con éxito en estos ambientes. En la flora predominante de los suelos litorales encontramos pocas especies, pertenecientes a géneros cosmopolitas como Sarcocornia, Spartina, Juncus, Plantago y Limonium, estas han desarrollado adaptaciones fisiológicas para subsistir en estos ambientes, evitando así la competencia con las plantas glicófilas (plantas “dulces” o no halófilas) (Flowers et al., 1986). - 16 - La vegetación está fuertemente condicionada por las características físicas de este tipo de suelos, ya que la textura arenosa carece de capacidad de retención de agua y pose una gran facilidad de infiltración, sometiendo a la vegetación que habita sobre este sustrato a estrés hídrico b. Suelos solonchaks gleicos El material original constituido por cualquier material no consolidado, son suelos característicos de depresiones litorales o interiores. En la Comunidad Valenciana lo encontramos en el ámbito territorial costero, presentando una capa freática superficial salina, que provocan una fuerte concentración de sales solubles acumulándose en la parte superior del estrato, provocando una escasa implantación de especies vegetales, tan sólo especies halófilas c. Suelos gleysoles calcáreos El material original lo constituye un amplio rango de materiales no consolidados, principalmente sedimentos de origen fluvial, marino o lacustre, del Pleistoceno u Holoceno. Localizados en zonas deprimidas mal drenado o zonas de marjales que no reciben aporte regular de sedimentos, la capa superficial puede tener un comportamiento similar al de suelos anaeróbicos. Son suelos con exceso de humedad y suelen estar cubiertos con una vegetación natural pantanosa que puede usarse para pastizal extensivo. Una vez drenados pueden utilizarse para cultivos, agricultura de subsistencia o huertas. En los trópicos y subtrópicos se utilizan ampliamente para el cultivo del arroz.  Hidrología La cuenca hidrográfica de la Albufera se sitúa entre las de los ríos Turia, al Norte, y Júcar, al Sur. El lago funciona como un embalse natural de regulación de la cuenca, ocupando una superficie de 917 km². - 17 - La máxima elevación es de 1.042 m en el sector occidental y la altitud media de la cuenca es de alrededor de 150m. En ésta se puede diferenciar una zona alta, por encima de los 400 m y su uso fundamental forestal, una zona media entre los 20 m y los 400 m de uso agrícola ( viñas y algarrobos) y una zona baja en la que predominan los cultivos de arroz, hortícolas y cítricos. El drenaje de la cuenca al lago, se realiza fundamentalmente a través de seis barrancos, que son los siguientes ordenados de mayor a menor importancia: el barranco de Torrent o Chiva (417km²), Picassent (con una cuenca de 100 km²), de Montes (92km²), del Agua (42km²), Hondo (24km²), Berenguera (18km²), y, sobretodo.  Biogeografía y bioclimatología A nivel biogeográfico, atendiendo a la clasificación de Rivas-Martínez (2007), la unidad corológica que afecta a la comarca de La Plana es la que aparece en negrita: Reino Holártic Región Mediterránea Subregión Mediterránea Occidental Provincia Catalana-Provenzal-Balear Subprovincia Valenciana Sector Valenciano-Tarraconense Distrito Huertano-Valenciano En lo referente a la climatología, el clima de la zona es mediterráneo, se caracteriza por tener veranos largos y secos, otoños muy lluviosos, primaveras a veces lluviosas. La temperatura media anual es de unos 17°C, la oscilación térmica es muy reducida debido a la cercanía al mar. Enero es el mes más frío con valores entorno a los 11°C, como vemos al observar en la Fig.1.3.3. El mes más cálido es Agosto con temperaturas medias cercanas a los 25°C. Las precipitaciones medias anuales se sitúan cercanas a los 500 mm. Se puede hablar de un período lluvioso de 4 meses que corresponde al otoño y comienzos del invierno, donde suele concentrarse el 40-45 % de la precipitación total y - 18 - en muchas ocasiones estas se dan de forma torrencial debido a los fenómenos de gota fría. Figura 1.3.3. Diagrama climático de la estación más cercana a la zona salina (Fuente: www.globalbioclimatics.org). - Zona yesífera La zona escogida está situada en el municipio de Tuéjar, Fig. 1.3.4. Las parcelas seleccionadas para el estudio se sitúan en una ladera, han elegidas en esta zona por la variación de condiciones según la posición en la ladera. Se caracteriza por:  Marco Territorial El municipio de Tuejar se encuentra en la comarca de Los Serranos, situada en el interior de la provincia de Valencia. También conocida esta comarca con los nombres de La Serranía y de Alto Turia. Comprende el curso alto del río Turia y territorios adyacentes. - 19 - La Serranía limita al este con la comarca del Campo de Turia, al oeste con la provincia de Cuenca, al norte con la comarcas del Alto Palancia, la Hoya de Buñol y la Gúdar-Javalambre, ya en la provincia de Teruel. Al sur con las comarcas de Plana de Utiel-Requena. Figura 1.3.4 Localización de la zona de estudio en el término municipal de Tuéjar.  Geomorfología Los montes de Tuéjar forman parte de las estribaciones secundarias de la cordillera Ibérica, que penetra en la provincia de Valencia a través de las de Cuenca y Teruel con orientación NO-SE, dando lugar a una muy accidentada topografía. La parte comprendida en la margen izquierda del río Turia, está constituida por las estribaciones del macizo de Javalambre que penetra en la provincia de Valencia a través de las sierras de Tortajada y del Sabinar. La parte occidental, comprendida en la margen derecha del río Turia, está constituida por estribaciones de la Serranía de Cuenca. Tuéjar se encuentra en la zona central, que forma un pliegue anticlinal de dirección NO-SE. El río Turia y su afluente, el río Tuéjar, quedan encajonados en la zona del interior. - 20 -  Edafología En la zona de Tuejar se dan suelos con horizonte argólico; con elevada concentración de arcillas, sobre calizas en escasa pendiente y en clima subhúmedoseco. En topografías de mayores desniveles toman mayor importancia los aportes de ladera y la incorporación de materia orgánica, desapareciendo los horizontes argilicos. En las zonas de clima semiárido, con características topográficas y litológicas desfavorables aparecen intensos procesos erosivos, predominando los suelos esqueléticos) y los de tipo rególico Los suelos predominantes en la zona de estudio son: a. Calcisoles Son suelos en los cuales hay una acumulación secundaria sustancial de material calcáreo. Creados por la acumulación sedimentos aluviales, coluviales y eólicos de material meteorizado rico en bases. Los Calcisoles están muy extendidos en zonas planas de ambientes áridos y semiáridos, con frecuencia asociados con materiales parentales altamente calcáreos. La vegetación es escasa, dominada por arbustos y árboles xerófitos, también puede estar acompañada pastos efímeros. Tiene limitaciones para la utilización como suelo agrícola como, la pedregosidad de algunas zonas, y la presencia de horizontes petrocálcicos someros. Las zonas colimadas se usan preferentemente para pastizal con baja carga de ovejas y cabras. b. Cambisoles Los cambisoles son suelos que presentan un grado de desarrollo mínimo, se manifiesta en la presencia de un horizonte superficial grueso, oscuro y rico en bases desarrollado sobre un subsuelo alterado procedente de depósitos de carácter eólico, aluvial o coluvial. Están presentes en todo tipo de morfologías, climas y tipos de vegetación. - 21 - La débil o moderada alteración del material original, por la ausencia de cantidades apreciables de arcilla, materia orgánica y compuestos de hierro y aluminio, de origen aluvial, son sus principales características Este tipo de suelo permite un gran número de usos agrícolas. Las limitaciones de esto son debido a la topografía, bajo espesor, pedregosidad. En zonas de elevada pendiente su uso queda reducido al forestal o pascícola. c. Kastanozems Suelos pardo oscuro ricos en materia orgánica, constituido por gran tipo de materiales no consolidados Presentan carbonatos o arcillas en el horizonte B y acumulaciones de carbonatos o de yeso en el horizonte C. Asociados a regiones de clima seco y cálido, en zonas de llano con una vegetación típica herbácea anual de poco porte. En la agricultura se emplean para el cultivo de cereales de invierno. Las inundaciones y la erosión eólica o hídrica son sus principales limitaciones. d. Luvisoles Los Luvisoles son suelos que tienen mayor contenido de arcilla en el subsuelo que en la parte superficial del suelo como resultado de procesos pedogenéticos (especialmente migración de arcilla) que da como resultado un horizonte subsuperficial árgico. Los Luvisoles tienen arcillas de alta actividad en todo el horizonte árgico y alta saturación con bases a ciertas profundidades. Se produce un lavado de arcilla de los horizontes superiores para acumularse en una zona más profunda. Se desarrollan sobre una gran variedad de materiales no consolidados como depósitos glaciares, eólicos, aluviales y coluviales. Predominan en zonas llanas o con suaves pendientes de climas templados fríos o cálidos pero con una estación seca y otra húmeda, como en el clima mediterráneo de esta zona. Cuando el drenaje interno es adecuado, presentan una gran potencialidad para un gran número de cultivos a causa de su moderado estado de alteración y su, generalmente, alto grado de saturación. - 22 - e. Regosoles Los Regosoles se desarrollan sobre materiales no consolidados, alterados y de textura fina. Presentes en las zonas climáticas sin permafrost y todas las alturas. Los Regosoles son comunes en áreas áridas y en regiones montañosas. La evolución del perfil es mínima como consecuencia de su juventud, o de un lento proceso de formación por una prolongada sequedad. Su uso y manejo varían muy ampliamente. Bajo regadío soportan una amplia variedad de usos, si bien los pastos extensivos de baja carga son su principal utilización. En zonas montañosas es preferible mantenerlos bajo bosque.  Hidrología La Serranía presenta una adaptación a la cuenca del Turia, el curso medio de este río recorre de la comarca de este a oeste, a él llegan diversos cursos confluentes, pero debido a la naturaleza angosta de su trazado, desempeña un papel menor del que se le podría atribuir a primera vista. Esta comarca vinculada al Turia, donde este río presenta un papel secundario incluso respecto a alguno de sus afluentes, como sucede especialmente con Chelva/Tuéjar, denominaciones propias de su principal afluente. El río Turia cruza Los Serranos en dirección NO-SE. Circula en algunos tramos entre calizas y margas, materiales que propician la infiltración y circulación de caudales subterráneos, lo que favorece la surgencia de numerosas fuentes y manantiales. Las aguas del río Turia se recogen aquí en los embalses de Benagéber y en el de Loriguilla.  Biogeografía y bioclimatología La comarca de Los Serranos está englobada en la unidad corológica por la provincia Mediterránea Ibérica Central en su franja septentrional, y por la provincia - 23 - Catalana-Provenzal-Balear en el resto (Rivas-Martínez, 2007), afectando ésta a la mayor parte del territorio, en la que podríamos incluir nuestra zona de estudio: Reino Holártico Región Mediterránea Subregión Mediterránea Occidental Provincia Catalana-Provenzal-Balear Subprovincia Valenciana Sector Valenciano-Tarraconense Distrito Suriano Provincia Mediterránea Ibérica Central Subprovincia Oroibérica Sector Ibérico Maestracense Distrito Javalambrense El clima de la zona es mediterráneo xérico oceánico, caracterizado por presentar aridez estival. En lo relativo a los datos climáticos se ha considerado la estación la estación climatológica más próxima a las parcelas que la del municipio de Chelva. La zona de estudio la situamos en el piso bioclimático mesomediterraneo , representando hasta altitudes de entre 900 m y 1000 m, ya que esta se encuentra a una altura de 700m respecto el nivel del mar. El ombrotipo de Chelva se caracteriza por ser seco, aunque en estaciones vecinas es subhúmedo, así que se puede decir que el ombrotipo de la zona estudiada varía entre subhúmedo y seco. La temperatura media anual tomada en la estación más cercana es de unos 15,5ºC y la precipitación media de 483 mm, como podemos ver en la Fig.1.3.5.. Las temperaturas máximas se dan en el periodo estival coincidiendo con la temporada de sequía y hay un aumento de las precipitaciones en otoño y en primavera. Todas estas condiciones son típicas del clima mediterráneo. - 24 - Figura 1. 3. 5. Diagrama climático de la estación más cercana a la zona yesífera(Fuente: www.globalbioclimatics.org). - Zona semiárida La parcela está situada en el término municipal de Serra, en la zona conocida como Portaceli o Porta Celi, en la Serra Calderona (Fig.1.3.6.), que forma parte de la comarca del Camp de Tria, en la provincia de Valencia. Se encuentra incluida en la partida “Pla de Colom”, área natural que consta de una extensión superior a 140 Ha, de las cuales aproximadamente 22 Ha aparecen como zona verde en el Plan General de Ordenación Urbana (PGOU), estando incluida la parcela en este último sector. Se encuentra en un terreno sin gradientes de altura ni en las características del suelo, por ese motivo sólo se ha delimitado una parcela, al no estimarse diferencias significativas con las zonas próximas.  Marco territorial Parte de la Serra Calderona se incluyó en la Red Natura 2000, dentro de la Directiva Hábitats, como LIC en el año 1998, en el 2000 su protección legislativa se amplió al incluirse como zona ZEPA y es Parque Natural desde el año 2002. En la - 25 - sierra se encuentran también zonas BIC que protegen zonas de interés cultural, microrreserva de flora, bajo protección, y cuevas incluidas en el Catálogo de Cuevas de la Comunidad Valenciana. Figura 1.3.6. Localización de la zona de estudio en el término municipal de Bétera, Portaceli.  Geomorfología Esta sierra ocupa una vasta superficie que se desarrolla principalmente por debajo de los 1000 metros de altitud, con excepción del Montemayor, en el extremo noroccidental, donde se alcanza una cota de 1.015 metros sobre el nivel del mar. Otras alturas importantes son el Gorgo (907 metros), Rebalsadors (802 metros), Oronet (742 metros) y el Garbí (600 metros).  Edafología Los suelos están clasificados como calcisoles, y dentro de éstos, la zona de estudio pertenece a una asociación denominada calcisol pétrico y calcisol háplico. a. Calcisoles Como ya se ha comentado anteriormente se trata de suelos con una l acumulación de caliza secundaria, el material original esta constituido por depósitos aluviales, coluviales o eólicos de materiales alterados ricos en bases. Asociado con un clima árido o semiárido. El relieve es llano a colinado. La vegetación natural es de matorral o arbustiva de carácter xerofítico junto a árboles y herbáceas anuales. - 32 - La vía del ácido shikímico es dependiente de la luz. La acción de la fenilalanina amonioliasa, que inicia la vía biosintética de los flavonoides, es fundamental para la vida de las plantas y por ello está estrictamente regulada. Entre otros factores, la fenilalanina amonioliasa es activada por la luz, y depende además de la concentración de diferentes hormonas vegetales. La actividad de la fenilalanina amonioliasa suele aumentar cuando a los vegetales se les somete a situaciones de estrés, como puede ser la falta de agua, infecciones fúngicas o bacterianas, radiaciones UV y el frío La ciencia aplicada aprovechó el conocimiento de la biosíntesis y su regulación en muchos trabajos de ingeniería metabólica, en los que se buscó por ejemplo, aumentar la concentración de flavonoides beneficiosos en las plantas de consumo humano o de uso farmacéutico, modificar su concentración en flores ornamentales para cambiarles el color, e inhibir su producción en el polen para lograr la esterilidad de los híbridos de interés comercial. En lo que respecta a su producción, se ha desarrollado con éxito un cultivo de bacterias que sintetiza flavonoides de interés humano. A pesar de estos avances aún queda mucho por investigar de los flavonoides, de su valor medicinal, y de su impacto en la nutrición y la salud humana y de los animales. También es necesario continuar la investigación de su estructura, su metabolismo y su biodisponibilidad, por lo que se esperan importantes progresos en este campo. - 33 - 2 OBJETIVOS - 34 - Este trabajo de final de carrera, es una pequeña parte de un proyecto mucho más amplio en cuanto extensión temporal, y a ensayos sobre indicadores bioquímicos. El objetivo de este, es el estudio de la respuesta al estrés abiótico de plantas silvestres tolerantes al estrés en su hábitat natural, en este gran proyecto se correlación distintos marcadores bioquímicos característicos de las distintas rutas de respuesta con las propiedades edafoclimaticas de estos hábitats (Proyecto CGL200800438/BOS del Ministerio de Ciencia e Innovación). Algunos de los marcadores químicos y bioquímicos considerados en este proyecto son: la acumulación de iones mono y divalentes y de osmolitos, la síntesis de alguna proteínas frente al estrés como forma de defensa, activación de sistemas antioxidantes, tanto químicos como enzimáticas. 2.1 Objetivo general del trabajo Se pretende estudiar el mecanismo de respuesta al estrés Proponemos que los mecanismos de respuesta de las plantas adaptadas a condiciones de estrés en la naturaleza son más eficientes que los que operan en plantas no tolerantes (aunque compartan las mismas bases moleculares), y que estas diferencias cuantitativas están condicionadas o moduladas por las propiedades edafoclimáticas del hábitat donde se desarrollan las plantas, y por las variaciones espaciales y temporales de dichas propiedades. De acuerdo con esta idea, el proyecto pretende abordar el estudio de los mecanismos de tolerancia a estrés abiótico en un número representativo de especies de tres tipos de hábitats naturales sometidos a diferentes condiciones de estrés ambiental (elevada salinidad, suelos yesíferos y una zona árida). Para ello, se determinan los niveles de varios marcadores bioquímicos y enzimáticos característicos de distintas rutas de respuesta a estrés en plantas. En este Trabajo Final de Carrera se determinaran algunos de los compuestos antioxidantes como son los compuestos fenólicos y los flavonoides. - 35 - 2.2 Objetivos particulares del trabajo  Determinación de los niveles de compuestos fenólicos totales en material vegetal de distintas especies silvestres, recolectado en las zonas experimentales seleccionadas en El Saler (suelo salino), Tuéjar (zona de yesos) y Porta Celi (zona árida) en el muestreo de verano, 2009. Se utilizará un método de ensayo previamente establecido en el laboratorio, usando el compuesto fenólico gálico como patrón.  Determinación de los niveles de flavonoides totales, en el material descrito anteriormente, utilizando asimismo el ensayo establecido en el laboratorio, con el flavonoides catequeina como patrón.  Colaboración en la recogida y preparación de muestras vegetales, en las parcelas experimentales mencionadas anteriormente (muestreo otoño,2009).  Determinación de los niveles de compuestos fenólicos totales y flavonoides totales como se ha descrito en los puntos anteriores del muestreo de otoño.  Análisis estadísticos de los resultados y estudio comparativo por zonas, muestreos y taxones.  Obtención de conclusiones a partir de los resultados obtenidos - 36 - 3 MATERIAL Y MÉTODOS . - 37 - 3.1 Material vegetal Los hábitats prioritarios según la Directiva Hábitat (Directiva 92/43/CEE). - Estepas salinas mediterráneas (Limoinietalia) Código Natura 2000: *1510 Código Corine-Biotopos: 15.18 Hábitat presente en el interior de la Península, con irradiaciones hacia las costas e islas mediterráneas Formaciones ricas en plantas perennes que suelen presentarse sobre suelos temporalmente húmedos por agua salina, expuestos a una desecación estival extrema. Suelen aparecer asociadas a complejos salinos de cuencas endorreicas, donde ocupan las partes más secas. Estas comunidades también pueden aparecer en la banda más seca de marismas y saladares costeros. Las formaciones de Limonietalia están dominadas por especies del género Limonium, algunas sonendémicas de la Comunidad Valenciana, como Limonium dufourii, L. santapolense. Algunas de estas especies están protegidas bien por la legislación nacional o autonómica, como por ejemplo el Limonium dufourii. Hábitat muy amenazado por la construcción en las zonas cercanas a la costa, y por la desecación de las zonas húmedas que provocan un cambio en las condiciones abióticas y con él un cambio en la flora del hábitat Las especies que hemos utilizado para nuestro estudio de este hábitat son( imágenes extraídas del Herbari Virtual del Mediterrani Occidental ): - 38 - Familia: Chenopodiaceae Sarcocornia fruticosa (L.) A. J. Scott Familia: CHENOPODIACEAE Nombre común: Sosa alacranera, cirialera Distribución: Mediterránea Hábitat: Saladares abundantes en agua. Costa rocosa Categoría IUCN: Poco preocupante Ubicación: Zonas salina, parcelas 2 y 3 Familia: Compositae Helichrysum stoechas (L.) Moench Nombre común: Manzanilla bastarda, siempreviva Distribución: Mediterránea Hábitat: Tomillares abiertos y soleados, frecuentemente cercanos al mar. También en cunetas Categoría IUCN: Poco preocupante Ubicación: Zona salina, parcela 1 Inula crithmoides L. Nombre común: Salsona Distribución: Plurirregional Hábitat: Zonas litorales de suelos salinos Categoría IUCN: Poco preocupante Ubicación: Zonas salina, parcela 3 Familia: Cyperaceae - 39 - Schoenus nigricans L. Nombre común: Junquillo negral Distribución: Plurirregional Hábitat: Suelos húmedos Categoría IUCN: Poco preocupante Ubicación: Zonas salina, parcela 1 Familia: Juncaceae Juncus acutus L. Nombre común: Junco, junco espinoso Distribución: Plurirregional Hábitat: Zonas húmedas y pantanosas Categoría IUCN: Poco preocupante Ubicación: Zonas salina, parcelas 1 y 2 Juncus maritimus Lam. Nombre común: Junco marítimo Distribución: Plurirregional Hábitat: Zonas húmedas, pantanosas y marismas Categoría IUCN: Poco preocupante Ubicación: Zonas salina, parcela 2 y 3 - 40 - Familia: Labiatae Teucrium capitatum L. Nombre común: Polio, tomillo macho, zamarrilla Distribución: Plurirregional Hábitat: Matorrales y pinares secos, frecuentes cerca del mar Categoría IUCN: Poco preocupante Ubicación: Zonas salina, parcela 1 Familia:Leguminosae Ononis natrix L. subsp. ramosissima Nombre común: Adonis, beluda, hierba culebra, melera, melosa, pegamoscas, Distribución: Mediterránea-occidental Hábitat: Lugares secos y soleados, márgenes de caminos, etc. Categoría IUCN: Poco preocupante Ubicación: Zonas salina, parcela 1 Familia: Plantaginaceae Plantago crassifolia Forssk. Nombre común: Plantago Distribución: Mediterránea Hábitat: Zonas húmedas costeras con suelos salinos Categoría IUCN: Poco preocupante Ubicación: Zonas salina, parcela 1 y 2 - 41 - Familia: Plumbaginaceae Limonium virgatum (Willd.) Fourr. Nombre común: Limonio, siempreviva Distribución: Mediterránea Hábitat: Suelos salobres del litoral Categoría IUCN: Poco preocupante Ubicación: Zonas salina, parcela 2 y 3 - Estepas sobre yeso (Gypsophiletalia) Código Natura 2000: *1520 Código Corine-Biotopo: 15.19 • Comunidades herbáceas o arbustivas sobre yesos, dominadas, en cada caso, por una o unas cuantas especies pertenecientes a los géneros Limonium, Gypsophila, Ononis, Frankenia, Lygeumo Teucrium. • Estos sustratos se desarrollan a menudo en margas triásicas de la facies Keuper. En algunos tipos de margas del Mioceno con elevada conductividad, también se desarrolla un tipo de vegetación semejante. • Es un hábitat de aspecto desértico e improductivo, por lo que ha determinado una escasa estima entre la población. También es muy erosionado por la implantación de Canteras y el sobre pastoreo excesivo. Las transformaciones agrarias a gran escala, que han convertido en cultivos de regadío miles de hectáreas de diferentes tipos de estepas. Y Debido al carácter impermeable de algunas capas del suelo, muchas estepas han sido transformadas en vertederos. Las distintas especies que podemos encontrar en este hábitat son : - 48 - De este Eppendorf se extrae la cantidad necesaria para realizar los análisis tanto de compuestos fenólicos como de flavonoides y el resto se conserva en el congelador a -20ºC. - Medida de compuestos fenólicos Para la medida de compuestos fenólicos se han utilizado los protocolos de Marinova et. al (2005), sometiéndolos a algunos ajustes y modificaciones de acuerdo al material disponible y a las necesidades particulares de detección de los aparatos de análisis del laboratorio, hallando al final as cantidades de compuestos fenólicos totales, expresadas como miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de peso seco.  Reactivos y Preparación de los reactivos Los reactivos se preparan en grandes volúmenes de forma que queden almacenados y no se tengan preparar para cada análisis, de esta forma se elimina parte del error derivado de la utilización de diluciones. Estos son reactivos y su correspondiente preparación: . a. Metanol al 80%: Se prepara una disolución de metanol al 80%. Se hace añadiendo 80 ml de metanol a 20 ml de agua milli-Q. Para conseguir más cantidad de disolución se cogen mayores cantidades, manteniendo las proporciones. b. Ácido gálico: Se prepara una disolución de ácido gálico a una proporción de 1/25. Para ello se cogen 40 µl de ácido gálico al 0,5% y se enrasa a 1000 µl añadiendo 960 µl de agua milli-Q. Esta disolución se conserva en nevera. c. Reactivo Folin: Se utiliza el reactivo comercial, no necesita ninguna preparación. d. Carbonato de sodio (Na2CO3 ) al 15%: Se prepara una disolución de Na2CO3 al 15%. Para ello se añaden 15 g de Na2CO3 a 100 ml de agua - 49 - milli-Q. Para conseguir más cantidad de disolución se cogen mayores cantidades, manteniendo las proporciones.  Procedimiento El procedimiento que se lleva a cabo es el siguiente: 1º Se prepara un patrón de ácido gálico diluido de forma que podemos observar en la Tabla 3.3.1: Tabla 3.3.1. Preparación de patrón PREPARADO DEL PATRÓN Añadir Blanco Pto1 Pto 2 Pto 3 Pto 4 Pto 5 Pto 6 Ácido gálico (1/25) (µl) 0 20 30 40 60 80 100 Agua milli-Q (µl) 100 80 70 60 40 20 0 2º Se preparan los extractos para medirse de la forma que muestra la Tabla 3.3.2. . Se hacen 2 muestras por extracto con diferente concentración. Tabla 3.3.2. Preparación de la muestras PREPARACION DE LAS MUESTRAS Añadir Blanco Muestras 5 Muestras 50 Extracto concentrado (µl) 0 5 50 Metanol (80%) (µl) 100 95 50 3º l patrón y a las muestras preparadas se les añaden los reactivo de siguiendo el orden mostrado en la Tabla 3.3.3. Tabla 3.3.3. Incorporación de los reactivos INCORPORACIÓN DE LOS REACTIVOS Agua milli-Q (ml) 1,4 y agitar Folin (µl) 100, agitar y en reposo durante 5 minutos a temperatura ambiente Na2CO3 (15%) (µl) 350, agitar y en reposo durante 1,5-2 horas a temperatura ambiente - 50 - El volumen final obtenido para cada muestra de patrón y de extractos será de 1950 µl. 4º Cuando estén listas las muestras se pasan a cubetas para medir en el espectrofotómetro. Se hace con la ayuda de una pipeta. 5º Se mide la absorbencia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 765 nm. 6º En ocasiones las concentraciones son demasiado altas y los resultados de absorbancia se salen del rango óptimo [0,1-1], por lo que hay que diluir las muestras 5 veces. Para ello se cogen 200 µl de muestra y se añaden 800 µl de agua milli-Q. Se mezcla bien y se vuelve a medir la absorbancia. Es suficiente con que haya un valor, de la muestra de 20 o de la muestra de 50, dentro del rango óptimo. El proceso entero se realiza par cada ensayo, incluyendo el patrón, para minimizar errores.  Cálculos Una vez obtenidos los datos de absorbancia con el espectrofotómetro, los datos obtenidos, se insertan en una tabla del programa informático Microsoft Excel(Fig. 3.3.1). Con los datos del patrón realizaremos una recta de calibrado, de la que obtendremos una ecuación de la recta y el error - 51 - Figura 3.3.1 Ejemplo de gráfico con ecuación de la recta de calibrado. A partir de la ecuación de la recta calculamos las concentraciones de las muestras, hasta llegar al resultado en mg/g peso seco tenemos que realizar diversos cálculos que son : 1º Ec. recta  Abs=aC1+b  C1=(Abs-b)/a (µg)  a y b son variables de la ecuación de la recta de calibrado  C es la concentración 2º La muestra puede ser de 5µl o 50 µl de extracto concentrado: Cf= [C1 x (1/ 5 )x 3000]/g pesados de cada muestra (µg/g peso seco) Si la muestra tenía 50 µl de extracto concentrado: Cf= [C2 x (1/ 50)x 3000]/g pesados de cada muestra (µg/g peso seco) 3º Como los valores en µg/g peso seco son muy altos se dan en mg/g peso seco. Para ello se divide entre 1000. 4º Si tenemos para una planta los dos valores se halla la media. y = 0,0478x + 0,0214 R² = 0,9983 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 5 10 15 20 25 Absorbancia Compuestos fenolicos (ug) Recta de calibrado - 52 - - Medida de flavonoides Los compuestos fenólicos se han medido en base a los protocolos de Zhishen et al. (1998), Kähkönen et al. (1999), Marinova et al. (2005) y Piccolella et al. (2008), aunque se han modificado y ajustado de acuerdo al material disponible y a las necesidades particulares de detección de los aparatos de análisis del laboratorio. Al final se determinan las cantidades de flavonoides totales, expresadas como “miligramos equivalentes de catequina por gramo de peso seco”.  Reactivos y Preparación de los reactivos a. Metanol al 80%: La disolución de metanol al 80% es la misma que para el ensayo de compuestos fenólicos totales. Se hace añadiendo añadiendo 80 ml de metanol a 20 ml de agua milli-Q. b. Catequina: Se prepara una disolución de catequina con una concentración de 100 mg/ml de etanol. Para ello se pesa la cantidad correspondiente de catequina y se diluye en etanol. De esta disolución se cogen 100 µl y se les añaden 9,9 ml de agua milli-Q, de forma que se obtiene una nueva disolución de catequina de concentración 100 µl/ml, que es con la que se trabaja. Esta disolución se conserva en nevera. c. Nitrito de sodio (NaNO2) al 5%: Se prepara una disolución de NaNO2 al 5%. Para ello se añaden 5g de NaNO2 a 100 ml de agua milli-Q. d. Tricloruro de aluminio (AlCl3 ) al 10%: Para obtener la disolución de AlCl3 al 10% se diluyen 10g en 100 ml de agua milli-Q. f. Hidróxido de sodio (NaOH) 1M: Para conseguir la disolución de NaOH 1M se ponen 4g en 100 ml de agua milli-Q. Para conseguir más cantidad de disolución se cogen mayores cantidades, manteniendo las proporciones  Procedimiento 1º Se utilizan los mismos extractos que para el análisis de compuestos fenólicos totales. - 53 - 2º Se prepara un patrón en tubo Eppendorf de 1,5ml y se añadirá la de catequina (100µg/ml) de la forma mostrada en la tabla 3.3.4 Tabla 3.3.4. Preparación del patrón PREPARADO DEL PATRÓN Añadir Blanco Pto1 Pto 2 Pto 3 Pto 4 Pto 5 Pto 6 Catequina (100 µg/ml) (µl) 0 20 50 100 150 200 300 Agua milli-Q (µl) 300 280 250 200 150 100 0 3º Al patrón y a las muestras preparadas se les añaden los reactivos en orden indicado en la tabla 3.3.5. tabla 3.3.5. Preparación de los reactivos INCORPORACIÓN DE LOS REACTIVOS Agua milly-Q (µl) 440 NaNO2 (5%) (µl) 30, agitar y en reposo 5 minutos a temperatura ambiente AlCl3 (10%) (µl) 30 y mezclar NaOH (1M) (µl) 200, añadiendo cada 30 segundos y mezclar El volumen final obtenido para cada muestra de patrón y de extractos será de 1ml. 4º Cuando estén listas las muestras se pasan a cubetas de 1 ml , con ayuda de una pipeta para medir en el espectrofotómetro. 5º Se mide la absorbencia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 510. 6º En ocasiones las concentraciones son demasiado bajas y los resultados de absorbencia se salen del rango óptimo [0,1-1], por lo que hay que concentrar las muestras 3 veces. Para ello se añaden 150 µl de extracto diluido en lugar de 50 µl y se - 54 - lleva a 300 µl con agua milli-Q. El resto del proceso se sigue normalmente. Es suficiente con que haya un valor dentro del rango óptimo. El proceso entero se repite cada día que se haga el análisis, incluido el patrón, para minimizar errores.  Cálculos Se pasan los datos de las absorbancias a tablas de Excel (Fig.3.3.2), una hoja por día de análisis. Con los datos del patrón se hace un gráfico, sobre él se dibuja la recta de calibrado y se calcula la ecuación de dicha recta. Figura 3.3.2 Ejemplo de gráfico con ecuación de la recta de calibrado. Con la ecuación de la recta podemos calcular las concentraciones de las muestras, teniendo en cuenta los ajustes que hay que hacer para normalizar los resultados y obtener concentraciones en mg/g peso seco. Los pasos para los cálculos serían: 1º Ec. recta  Abs=aC1+b  C=(Abs-b)/a (µg)  a y b son variables de la ecuación de la recta de calibrado  C es la concentración 2º Las muestras pueden tener 10 o 50 µl de extracto concentrado: y = 0,0326x + 0,0141 R² = 0,9852 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 5 10 15 20 25 30 35 Absorbancia Flavonoides (ug) Recta de calibrado - 55 - Cf= [C x (1/ 10)x 3000]/g pesados de cada muestra (µg/g peso seco) Si la muestra tenía 50 µl de extracto concentrado: Cf= [C x (1/ 50)x 3000]/g pesados de cada muestra (µg/g peso seco) 3º Como los valores en µg/g peso seco son muy altos se dan en mg/g peso seco. Para ello se divide entre 1000. 4º Si tenemos para una planta los dos valores se halla la media. 3.4 Análisis estadístico El contenido de compuestos fenólicos y de flavonoides expresado como valor medio de entre tres o cinco valores por especie, según su presencia en la zona y del muestreo al que nos refiramos. Se han determinado los datos estadísticos con el análisis de varianza ANOVA, mediante el cual se detectan diferencias significativas entre los muestreos o las zonas, con un nivel de confianza del 95%. Si el valor es menor que 0.05 existe una diferencia significativa. - 56 - 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN - 57 - 4.1 Compuestos fenólicos Zona Saler La Zona Salina corresponde con la Mallada Llarga de la Dehesa del Saler, está dividida en tres parcelas de muestreo como ya se ha señalo en el capitulo de material y métodos. Con respecto a las condiciones ambientales, existen claras diferencias en la humedad y la salinidad del suelo como lo indican los datos pluviométricos y los análisis de la conductividad, realizados por el equipo de edafología participantes en el proyecto. Es necesario precisar que las especies que podemos encontrar en la parcela 1 no son halófilas verdaderas, ya que esta parcela se ubica en el borde de la Mallada. Las tres únicas especies halófilas que penetran en esta zona son: Juncus acutus (Ja), Schoenus nigricans(Sn) y Plantago crasifolia (Pc). En los datos obtenidos mostrados en Tabla 4.1.1. podemos observar que de las especies: Ononis natrix, Teucrium capitatum, Helianthemum syriacum, Helichriysum stoechas, solo tenemos datos del muestreo de otoño al encontrarse en la estación de verano todos los ejemplares de estas especies en un estado de sequedad. Podemos advertir que la variabilidad de contenido de compuestos fenólicos en los distintos ejemplares puede variar hasta 15 veces, teniendo la concentración mas baja Schoenus nigricans y la más alta Helianthemum syriacum . Tabla 4.1.1. Compuestos fenólicos Zona Saler parcela 1 (Las medidas en las marcadas con * consisten en tres repeticiones del mismo extracto) Especie (Código) Verano Otoño Media (mg/g peso seco) SD Media (mg/g peso seco) SD Ononis natrix (On)* n.d n.d 23,83* 0,032 Teucrium capitatum (Tc) n.d n.d 34,66 6,95 Helianthemum syriacum (Hsyr) n.d n.d 74,72 9,62 Helichriysum stoechas (Hsto) n.d n.d 48,75 7,38 Rosmarinus officinalis (Ro) 11,37 1,14 51,25 2,11 Plantago crassifolia (Pc) 21,66 3,93 21,66 2,11 Schoenus nigricans (Sn) 28,24 3,20 5,89 0,79 Juncus acutus (Ja) 19,98 3,91 11,83 1,93 - 64 - Como se puede observar (Fig. 4.1.5) se produce un descenso en la cantidad de compuestos fenólicos en el caso de Ononis tridentata pero de una forma muy leve, de forma que el nivel de este es casi igual en los dos muestreos. En cambio el descenso en compuestos fenólicos en el caso de Rosmarinus officinalis del primer muestreo al segundo es más acusado. No obstante el análisis estadístico no revela que ninguna de la variaciones sea significativa al ser p>0,05. Figura 4.1.5.Compuestos fenólicos muestreo Zona Yesos parcela 2 En la parcela 3 encontramos un mayor numero de especies, que en la parcela dos, está es la parcela con mayor cantidad de yesos, en algunas especies encontramos valor bastante altos de compuestos fenólicos como podemos comprobar en la Tabla 4.1.6, siendo Cistus clusii la especie con mayor cantidad de fenoles totales en el muestreo de verano y Ononis tridentata la especie que menos tiene en el muestreo de otoño. En esta parcela se confirma la tendencia general de la zona de descenso de compuestos fenólicos en el muestreo de otoño con respecto al de verano. 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 Ot Ro Compuestos fenólicos (mg/g peso seco) Especies Parcela 2 Zona de Yesos Muestreo verano Muestreo otoño - 65 - Tabla 4.1.6. Compuestos fenólicos Zona Yesos parcela 3 Especie (Código) Verano Otoño Media (mg/g peso seco) SD Media (mg/g peso seco) SD Thymus vulgaris (Tv) n.d n.d 66,22 2,67 Cistus clusii (Cc) 88,76 12,94 75,38 2,79 Ononis tridentata (Ot) 10,95 1,56 7,69 2,49 Rosmarinus officinalis (Ro) 74,85 16,11 58,75 8,73 Gipsophyla struthium sp. Hispanica (Gs) 21,62 4,57 15,22 4,18 Helianthemum syriacum (Hsyr) n.d n.d 69,31 3,56 Ahora observamos de una manera gráfica (Fig. 4.1.6.) lo que antes comentados como la cantidad de los fenoles disminuye en el muestreo de otoño, siendo en Ononis tridentata el que menos desciende y en el caso de Rosmarinus officinalis el que más desciendo. No obstante aunque la tendencia sea el descenso, en la única especie en que la diferencia es significativa es en el caso de Cistus clusii, p=0,047. Figura 4.1.6.Compuestos fenólicos muestreo Zona Yesos parcela 3 Entre las especies que encontramos en las distintas parcelas de la Zona de Tuejar, está Ononis tridentata que tiene un comportamiento muy similar ya que siempre desciende la cantidad de fenoles pero en una pequeña cantidad siendo, en la parcela 3 en la que mas desciende la concentración y en la 1 en la que menos. 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 Cc Ot Ro Gs mg/g peso seco Especies Parcela 3 Zona de Yesos Muestreo verano Muestreo otoño - 66 - Rosmarinus officinalis también presente en las tres zonas tiene un comportamiento muy variable, con distintas concentraciones dependiendo de la zona, llegando a ser casi el triple en la parcela 1 que en la 2. Zona Bétera En la zona de Bétera sólo encontraremos una sola parcela que la consideraremos al no encontrar gradientes diferenciadores que invitaran a delimitar la zona en distintas parcelas , esta zona se considera semiárida en ella encontraremos distintas plantas características de estas zonas como; Stipa tenacissima (St) y Stipa capensis (Sc), con otras plantas más comunes. Observando la tabla, podemos ver que Helianthemum syriacum es la especie con más cantidad de compuestos fenólicos, pese a que es en el muestreo de otoño, y que Stipa capensis es la especie con menos cantidad de compuestos fenólicos en el muestreo de otoño Tabla 4.1.7. Compuestos fenólicos Zona Bétera Especie (Código) Verano Otoño Media (mg/g peso seco) SD Media (mg/g peso seco) SD Rosmarinus officinalis (Ro) 68,40 6,23 40,25 6,78 Helianthemum syriacum (Hsyr)* n.d n.d 71,59* 0,61 Stipa tenacissima (St) 16,51 1,86 5,66 0,82 Dorycnium pentaphyllum (Dp)* 57,24* 0,61 79,98* 0,81 Stipa capensis (Sc) 15,53 0,59 6,55 0,84 Al observar al gráfico vemos que como excepción del descenso de la concentración de compuestos fenólicos en los ejemplares de Dorycnium pentaphyllum, en el resto de taxones se ve un descensos de la concentración de estas sustancia. Cabe reseñar que en romero es en la especie que más disminuye la cantidad de compuestos fenólicos el verano a otoño. - 67 - Figura 4.1.7.Compuestos fenólicos muestreo Zona Bétera 4.2 Flavonoides Zona Saler Como cabe recordar en la primera parcela de el Saler no se recogieron, algunas especies debido a su estado de sequedad durante el mes de julio cuando se realizo la recolección de plantas para su posterior análisis, en este caso el * también significa que el extracto se prepara a partir de varios individuos. Al observar la tabla 4.2.1. concluimos que existen datos muy variable con una diferencia de casi 40 mg/g de peso seco entre el valor más alto y el más bajo. Los valores por debajo de 1mg/g de peso seco registrados en Plantago crassifolia y Juncus acutus no concuerdan con los valores obtenidos en la parcela 2 . 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 Ro St Dp Sc Compuestos fenólicos (mg/g de peso seco ) Especies Zona Betera Muestreo verano Muestreo otoño - 68 - Tabla 4.2.1. Flavonoides Zona Salina parcela 1 Especie (Código) Verano Otoño Media (mg/g peso seco) SD Media (mg/g peso seco) SD Ononis natrix (On)* n.d n.d 9,58 0,04 Teucrium capitatum (Tc) n.d n.d 13,99 0,89 Helianthemum syriacum (Hsyr) n.d n.d 39,30 4,82 Helichriysum stoechas (Hsto) n.d n.d 37,53 2,38 Rosmarinus officinalis (Ro) 12,50 0,67 37,97 2,91 Plantago crassifolia (Pc) 0,64 0,38 26,90 17,24 Schoenus nigricans (Sn) 15,92 1,49 11,17 1,56 Juncus acutus (Ja) 5,49 0,59 0,88 0,55 En el caso de Schoenus nigricans y Juncus acutus, la cantidad de flavonoides desciende en ambos casos en un valor próximo a los 5 mg/g de peso seco con respecto al muestreo de verano, como podemos corroborar en la Fig.4.2.1. Siendo la diferencia significativa entre muestreos en ambos casos según el análisis estadístico. Figura 4.2.1. Flavonoides Zona Salina parcela 1 Por lo que se refiere a la segunda parcela del Saler encontramos datos de todas la especies en las dos muestras a excepción de Limonium virgatum. Esta da el valor más alto en el muestreo de otoño. - 69 - 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 Jm Sf Flavonoides (mg/g peso seco ) Especies Parcela 2 Zona Salina Muestreo verano Muestreo otoño Las muestras del resto de especies tienen valores similares, como tendencia general desciende la cantidad de flavonoides del muestreo de verano al de otoño, en distinta medida dependiendo el taxón al que nos refiramos. Tabla 4.2.2. Flavonoides Zona Salina parcela 2 En el caso de Juncus maritimus y Sarcocornia fruticosa podemos observar que se produce un descenso de la concentración de flavonoides en los dos, produciéndose un descenso en el contenido de flavonoides mayor en el caso de Sarcocornia fruticosa como comprobamos en la imagen (Fig. 4.2.2.). No obstante la diferencia entre los muestreos no es significativa al ser la probabilidad mucho mayor de 0,05. Figura 4.2.2. Flavonoides Zona Salina parcela 2 Especie (Código) Verano Otoño Media (mg/g peso seco) SD Media (mg/g peso seco) SD Plantago crassifolia (Pc) 7,61 2,50 3,71 1,53 Juncus acutus ( Ja) 3,06 0,58 3,42 0,06 Juncus maritimus (Jm) 5,29 2,06 4,79 0,38 Limonium virgatum (Lv)* n.d n.d 15,07 0,03 Sarcocornia fruticosa (Sf) 4,30 0,83 3,27 0,94 - 70 - En la parcela 3 de la Zona Salina, como podemos observar en la tabla 4.2.3. la concentración de flavonoides en los distintos taxones aumenta en otoño , de una forma muy leve en el caso de Juncus maritimus, y de una forma más pronunciada en el caso de Inula crithmoides y Sarcocornia fruticosa, cuando lo lógico sería que descendiera la concentración de está sustancia. En está parcela también debido al mal estado en la época estival del Limonium virgatum no se pudo recolectar. Tabla 4.2.3. Flavonoides Zona Salina parcela 3 Especie (Código) Verano Otoño Media (mg/g peso seco) SD Media (mg/g peso seco) SD Sarcocornia fruticosa (Sf) 3,10 0,94 4,79 0,38 Juncus maritimus (Jm) 4,44 2,16 4,82 0,76 Limonium virgatum (Lv)* n.d n.d 15,18* 0,07 Inula crithmoides (Ic) 4,49 2,12 6,21 1,35 Podemos observar en la Fig. 4.2.3. como la concentración de flavonoides aumenta respecto a verano en distintos taxones, en este caso en Sarcocornia fruticosa y Juncus maritimus, siendo el aumento de Sarcocornia bastante más pronunciada que la de Juncus. Figura 4.2.3. Flavonoides Zona Salina parcela 3 - 71 - Zona Yesos En la primera parcela encontramos un gran número de especies, algunas de ellas no pudieron ser muestreadas en la época estival debido a su sequedad. Dentro de estos taxones encontramos una gran variabilidad en lo que respecta al contenido de flavonoides, siendo Rosmarinus officinalis la especie con mayor concentración y Ononis tridentata la de menor concentración en el muestreo de verano. Como podemos observar en la Tabla 4.2.4 en esta primera parcela del Saler, encontramos distintas especies como: Helianthemum syriacum, Cistus clusii u Ononis tridentata, en las que el valor del contenido de flavonoides del muestreo de otoño es superior al verano. Tabla 4.2.4. Flavonoides Zona Yesos parcela 1 Especie (Código) Verano Otoño Media (mg/g peso seco) SD Media (mg/g peso seco) SD Helianthemum syriacum (Hsyr )* 13,13* 0,94 21,43* 0,13 Plantago albicans (Pa)* n.d n.d 36,57* 0,41 Thymus vulgaris (Tv) n.d n.d 70,45 9,16 Cistus clusii (Cc) * 12,61* 0,07 57,91* 0,20 Ononis tridentata (Ot) 3,86 0,7 5,60 1,02 Anthyllis cytissoides (Ac) n.d n.d 29,58 6,35 Rosmarinus officinalis (Ro) 44,27 14,81 15,27 3,04 Rosmarinus officinalis como se puede comprobar en la Fig.4.2.4 es la única especie de la parcela 1 que disminuye la cantidad de flavonoides, en este taxón se reduce de una manera muy considerable, siendo en otoño la concentración una tercera parte respecto a la de verano, siendo esta diferencia significativo. En el caso de Helianthemum syriacum y Ononis tridentata, aunque a observando el gráfico parece que no exista prácticamente variación entre los muestreos el ANOVA no revela que p<0,05. - 72 - Figura 4.2.4. Flavonoides Zona Yesos parcela 1 En la parcela 2 encontramos un menor número de especies que en la uno. En el caso de Ononis tridentata que es una especie gipsófila, se obtiene el mismo patrón que en la parcela 1, ya que el valor que de la concentración de flavonoides en otoño es superior que en el de verano como vemos en la Tabla 4.2.5. En Helianthemum syriacum y Anthyllis cytissoides, no tenemos datos del primer muestreo así que no podemos realizar ningún análisis comparativo. Tabla 4.2.5. Flavonoides Zona Yesos parcela 2 Especie (Código) Verano Otoño Media (mg/g peso seco) SD Media (mg/g peso seco) SD Helianthemum syriacum (Hsyr) n.d n.d 28,56 0,78 Ononis tridentata (Ot) 3,26 0,59 5,58 0,64 Anthyllis cytissoides (Ac) n.d n.d 26,96 2,44 Rosmarinus officinalis (Ro) 43,93 12,77 14,07 9,97 En el caso de Rosmarinus officinalis se produce una reducción de la concentración de los flavonoides como se puede apreciar en la Fig.4.2.5. Siendo en otoño casi una tercera parte de la concentración de verano, en lo que se refiere a Ononis tridentata la concentración de otoño es ligeramente superior a la de verano. Al realizar el ANOVA obtenemos p= 0,014 y 0,003 respectivas por lo que la diferencia entre las muestras es significativa. 0 10 20 30 40 50 60 70 Hsyr Ot Ro Flavonoides (mg/g peso seco) Especies Parcela 1 Zona de Yesos Muestreo verano Muestreo otoño - 73 - Figura 4.2.5. Flavonoides Zona Yesos parcela 2 Por lo que se refiere a la parcela 3 de la Zona de Yesos podemos encontrar a plantas gipsófilas como es el caso dl Ononis tridentata y Gipsophyla struthium sp. hispanica, así como otras más cosmopolitas como el Rosmarinus officinalis. En esta parcela la única especie de que no se pudo muestrear en verano es Thymus vulgaris del resto tenemos datos de ambos muestreos como observamos en la Tabla 4.2.6. Tabla 4.2.6. Flavonoides Zona Yesos parcela 3 Especie (Código) Verano Otoño Media (mg/g peso seco) SD Media (mg/g peso seco) SD Thymus vulgaris (Tv) n.d n.d 40,84 0,48 Cistus clusii (Cc) 18,91 2,65 17,90 2,82 Ononis tridentata (Ot) 4,48 0,29 7,75 9,74 Rosmarinus officinalis (Ro) 36,19 12,51 33,16 6,13 Gipsophyla struthium sp. Hispanica (Gs) 10,60 1,53 2,72 1,16 Helianthemum syriacum (Hsyr) n.d n.d 69,31 3,56 La concentración más alta la encontramos en Thymus vulgaris en el muestreo de otoño y menor Gipsophyla struthium sp. hispanica en el muestreo de otoño. Por lo que respecta a la variación de la concentración entre los dos muestreos, no podemos hallar un patrón claro; por un lado Cistus clusii, Rosmarinus officinalis y Gipsophyla struthium sp. hispanica, se produce un descenso en la concentración, 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 Ot Ro Flavonoides (mg/g peso seco ) Especie Parcela 2 Zona de Yesos Muestreo verano Muestreo otoño - 80 - En la zona de El Saler no podemos afirmar que exista alguna tendencia ya que en algunos casos aumenta y en otros desciende la concentración del primer muestreo al segundo. En la Zona de Yesos sí que se puede afirmar que existe una tendencia general a la disminución del muestreo de verano al de otoño. En la Zona de Bétera también se puede afirmar lo anterior con la excepción del Dorycnium pentaphyllum que aumenta la concentración de compuestos fenólicos en otoño con respecto a verano. 5.5 Cantidad de Flavonoides  La concentración de flavonoides oscila entre 81 y 0,02mg/eq g peso seco.  Se ha detectado variabilidad entre los muestreos, de forma que hay diferencias estadísticamente significativas. En la zona de Salina al igual que ocurre con los compuestos fenólicos no podemos hablar de tendencia, ya que existen datos muy dispares en unas especies aumenta mientras que en otras desciende. En la Zona de Yesos la tendencia general es que aumenta la cantidad de flavonoides entre el muestreo de verano y el de otoño, a excepto en el caso de Rosmarinus officinalis. Por lo que respecta a la Zona Bétera las concentraciones se mantiene muy similar sufriendo un ligero ascenso en algunos casos en el muestreo de otoño - 81 - Como conclusión final podemos destacar que tanto la cantidad de compuestos fenólicos como de flavonoides es muy variable, no solamente de una especie a otra sino también dentro del mismo taxón. Sin embargo, en algunas especies se ha detectado una correlación entre los niveles de compuestos fenolicos y la salinidad. En las parcelas de mayor salinidad (Juncus maritimus y Sarcocornia fruticosa),presentan mayores niveles de compuestos fenólicos. La misma correlación se ha establecido en algunos casos (Schoenus nigricans, Juncus acutus o Sarcocornia fruticosa) comparando los dos muestreos: mayores niveles de compuestos fenólicos en verano, cuando la salinidad del suelo es considerablemente más elevada. Estos datos concuerdan con nuestra hipótesis de partida. Con respecto a los valores de los flavonoides la variación detectada es enorme, y no podemos definir ningún patrón de variación que se repita en los táxones presentes en más de una parcela. . - 82 - 6 BIBLIOGRAFÍA - 83 - FLOWERS, T.J., HAJIBAGHERI, M.A., CLIPSON, N.J.W. (1986). Halophytes. The Quarterly Review of Biology 61: 313–337. GANKIN,R., MAJOR, J.(1964). Arctostaphylos myrtifolia, its biology and relationship to the problem of endemism. Ecology 45: 792–808. HERRERO GONZÁLEZ, F.J. (2000). Recuperación ecológica y paisajística de las malladas de la Devesa de la Albufera de Valencia. Trabajo fin de carrera. EUITA, Valencia. JACKSON, R.B., CALDWELL, M.M. (1993). Geostatistical patterns of soil heterogeneity around individual perennial plants. Journal of Ecology 81: 683-692. KÄHKÖNEN,M.P. et al. (1999). Antioxidant activity of plants extracts containing phenolics compounds. J. Agric. Food Chem, 47: 3954-3962. MARINOVA, D. et al. (2005). 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Leyenda de los códigos de las especies Código Especie Código Especie On Ononis natrix Ic Inula crithmoides Tc Teucrium capitatum St Stipa tenacissima Ro Rosmarinus officinalis Cc Cistus clusii Hsyr Helianthemum syriacum Pa Plantago albicans Hsto Helichriysum stoechas Ot Ononis tridentata Pc Plantago crassifolia Ac Anthyllis cytissoides Sn Schoenus nigricans Gs Gipsophyla struthium sp. hispanica Sf Sarcocornia fruticosa Tv Thymus vulgaris Jm Juncus maritimus Dp Dorycnium pentaphyllum Ja Juncus acutus Sc Stipa capensis Lv Limonium virgatum Tabla Anexo 2 Compuestos fenólicos Zona Saler Compuestos fenólicos (mg/g peso seco ) Código Zona Verano Otoño On* 1 n.d 23,82* On* 1 n.d 23,81* On* 1 n.d 23,87* Tc1 1 n.d 37,05 Tc2 1 n.d 32,79 Tc3 1 n.d 26,15 Tc4 1 n.d 42,63 Tc5 1 n.d n.d Hsyr1 1 n.d 85,42 Hsyr2 1 n.d 66,77 Hsyr3 1 n.d 71,98 Hsto1 1 n.d 6,93 Hsto2 1 n.d 7,62 Hsto3 1 n.d n.d Ro1 1 10,06 59,57 Ro2 1 12,09 50,42 Ro3 1 11,97 40,32 Ro4 1 n.d 51,90 Ro5 1 n.d 54,04 Pc1 1 27,17 66,31 - 88 - Compuestos fenólicos (mg/g peso seco ) Código Zona Verano Otoño Pc2 1 25,49 14,96 Pc3 1 21,21 22,15 Pc5 1 28,82 18,31 Sn1 1 32,00 5,60 Sn2 1 31,18 5,23 Sn3 1 27,38 7,07 Sn4 1 25,82 6,30 Sn5 1 24,83 5,27 Ja 1 1 21,11 12,58 Ja2 1 24,85 14,24 Ja3 1 15,79 9,25 Ja4 1 18,16 10,63 Ja5 1 n.d 12,46 Sf1 2 12,90 8,76 Sf2 2 12,88 8,11 Sf3 2 12,90 8,72 Sf4 2 18,61 8,31 Sf5 2 12,41 7,57 Pc1 2 0,81 4,40 Pc2 2 0,70 8,17 Pc3 2 0,50 4,76 Pc4 2 0,64 3,10 Pc5 2 0,75 6,17 Jm1 2 3,37 8,08 Jm2 2 8,23 7,50 Jm3 2 8,15 8,18 Jm4 2 8,49 8,09 Jm5 2 4,36 7,89 Ja1 2 0,73 8,67 Ja2 2 0,65 8,03 Ja3 2 0,62 8,64 Ja4 2 0,62 8,15 Ja5 2 n.d 7,88 Lv* 2 n.d 6,03* Lv* 2 n.d 5,98* Lv* 2 n.d 6,11* Lv* 3 n.d 6,65* Lv* 3 n.d 6,62* Lv* 3 n.d 6,71* Jm1 3 10,28 8,30 Jm2 3 10,81 8,35 Jm3 3 13,68 9,80 - 89 - Compuestos fenólicos (mg/g peso seco ) Código Zona Verano Otoño Jm4 3 12,34 7,82 Jm5 3 16,88 8,94 Ic1 3 7,99 8,21 Ic2 3 5,27 6,86 Ic3 3 5,11 5,39 Ic4 3 7,55 7,72 Ic5 3 n.d 9,44 Sf1 3 17,95 5,38 Sf2 3 17,97 5,83 Sf3 3 19,34 4,76 Sf4 3 17,23 4,00 Sf5 3 15,25 5,36 Tabla Anexo 3 Compuestos fenólicos Zona Yesos Compuestos fenólicos (mg/g peso seco ) Código Zona Verano Otoño Hsyr* 1 11,01* 8,68* Hsyr* 1 10,91* 8,76* Hsyr* 1 10,95* 8,57* Pa* 1 n.d 56,5* Pa* 1 n.d 56,34* Pa* 1 n.d 56,85* Tv 1 n.d 30,67 Tv 1+2+5 1 n.d 58,26 Tv3+4 1 n.d 51,72 Cc* 1 10,97* 56,17* Cc* 1 10,9* 56,24* Cc* 1 11,05* 55,83* Ot1 1 11,69 10,16 Ot2 1 12,01 11,06 Ot3 1 10,90 9,07 Ot4 1 12,93 10,69 Ot5 1 8,18 10,16 Ac1 1 n.d 50,14 Ac2 1 n.d 47,90 Ac3 1 n.d 55,33 Ro1 1 104,83 17,78 Ro2 1 115,24 21,99 Ro3 1 103,91 15,31 - 96 - Flavonoides (mg/g peso seco ) Código Zona Verano Otoño Ro3 1 59,25 15,85 Ro4 1 27,57 10,16 Ro5 1 53,06 14,61 Ot1 2 4,13 4,64 Ot2 2 3,45 5,72 Ot3 2 3,14 6,36 Ot4 2 3,02 5,36 Ot5 2 2,54 5,79 Ac1+3 2 n.d 24,47 Ac2+5 2 n.d 29,35 Ac4 2 n.d 27,07 Ro1 2 31,52 15,20 Ro2 2 31,03 11,50 Ro3 2 51,63 10,93 Ro4 2 60,40 16,58 Ro5 2 45,08 16,12 Hsyr1 2 n.d 28,68 Hsyr2 2 n.d 26,70 Hsyr3+4 2 n.d 30,30 Hsyr5 2 n.d 27,51 Ot1 3 4,80 4,70 Ot2 3 4,48 4,31 Ot3 3 4,54 4,73 Ot4 3 4,09 2,00 Ot5 3 n.d 3,26 Hsyr1+2 3 n.d 24,17 Hsyr3 3 n.d 27,27 Cc1 3 19,57 20,24 Cc2 3 14,79 20,44 Cc3 3 21,63 18,91 Cc4 3 20,51 14,10 Cc5 3 18,07 15,81 Ro1 3 21,32 26,79 Ro2 3 30,37 30,29 Ro3 3 46,95 29,35 Ro4 3 46,12 40,57 Ro5 3 n.d 38,80 Gs1 3 11,30 n.d Gs2 3 12,97 3,64 Gs3 3 9,73 1,91 Gs4 3 9,63 3,79 Gs5 3 9,35 1,55 - 97 - Flavonoides (mg/g peso seco ) Código Zona Verano Otoño Tv 1+2 3 n.d 40,56 Tv 3+4 3 n.d 41,40 Tv5 3 n.d 40,57 Tabla Anexo 6 Flavonoides Zona Bétera Flavonoides (mg/g peso seco ) Código Verano Otoño Ro1 68,31 43,55 Ro2 55,71 19,87 Ro3 63,39 30,01 Ro4 44,50 49,87 Ro5 39,45 37,94 Hsyr* n.d 26,33 Hsyr* n.d 27,25 Hsyr* n.d 26,88 St1 3,15 3,59 St2 2,39 3,50 St3 2,50 3,50 St4 n.d 2,98 St5 n.d 3,68 Dp* 13,86 14,14 Dp* 14,91 15,13 Dp* 13,59 14,87 Sc1 4,53 4,20 Sc2 3,95 3,79 Sc3 3,20 n.d