Regeneración, transformación y variación somaclonal en fresa (Fragaria x ananassa Duch.)

Universidad de Málaga. Facultad de Ciencias Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera CONSEJERIA DE AGRICULTURA, PESCA Y DESARROLLO RURAL Regeneración, transformación y variación somaclonal en fresa ( Fragaria x ananassa Duch.) TESIS DOCTORAL Marta Barceló Muñoz 2016 AUTOR: Marta Barceló Muñoz http://orcid.org/0000-0002-5676-0856 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es Memoria presentada por Marta Barceló Muñoz Para optar al grado de Doctora por la Universidad de Málaga Regeneración, transformación y variación somaclonal en fresa ( Fragaria x ananassa Duch.) Directores: Dr. Fernando Pliego Alfaro Dr. José Ángel Mercado Carmona Departamento de Biología Vegetal Área de Mejora y Biotecnología de Cultivos Fisiología Vegetal IFAPA-Centro de Málaga Universidad de Málaga Málaga, 2016 AGRADECIMIENTOS En primer lugar, manifestar mi más profundo agradecimiento a Fernando Pliego y a Jose Ángel Mercado, por su valiosa y constante ayuda que han hecho posible la elaboración de este trabajo. He sido muy afortunada al tener la oportunidad de trabajar con ellos. A Fernando, mi director de tesis, quisiera agradecerle muy especialmente su aporte continuo de conocimiento, así como su paciencia y amabilidad en todo momento. He tenido la suerte de poder trabajar a su lado durante muchos años; y espero que siga siendo así por mucho tiempo más. Durante todo este periodo, siempre ha estado ahí, dispuesto a ayudar y a colaborar en la elaboración de este trabajo, su generosidad a la hora de compartir conocimientos y experiencia, así como su ejemplo constante, han sido un modelo incuestionable a seguir, ojalá hubieran más personas así. También quiero mencionar mi agradecimiento a José Ángel, mi codirector de tesis, por el tiempo dedicado a ayudarme y orientarme muy especialmente en la etapa final de este trabajo, aunque siempre estuvo ahí. Su sentido práctico, disposición y buen hacer, así como su humildad, han hecho mucho más agradable el logro de este trabajo, lo cual agradezco profundamente. Quisiera agradecer muy especialmente a todos mis compañeros del IFAPA su amistad, así como, su ánimo y colaboración en todo momento. Todos ellos son para mí una gran familia. Desde Conchi cuidándome con sus desayunos o Pepa regalándome sus buenos días y su alegría nada más llegar al Centro; a Dani, Antonio, Baltasar, Pepillo y algunos más que ya no están, por su amabilidad y simpatía, dispuestos siempre a ayudarme en lo que hiciera falta. Y como no Araceli, muchas gracias por haber confiado siempre en mí. Tu categoría humana y científica, tu ejemplo e innumerables ofertas de ayuda, así como tu apoyo incondicional en todo momento, son en gran medida responsables de que este trabajo se haya podido realizar. A mis compañeros más cercanos del laboratorio, Isa, Ely, Clara, Amalia, Adela, Borja, Josefa y J.Luis, por aguantarme y ayudarme todos los días; y a los que ya se fueron, Yanet, Isa, Laura, Sonia, Inma…; a Mayte, a Carmen Soria y a Carmen Villalobos, por ser como son, siempre dispuestas a colaborar y a escuchar; y por supuesto, a mi compañera y amiga incondicional Pepa, siempre sonriendo y cuidándome las fresas en el invernadero, o lo que hiciera falta. A Pepe Sevilla, por su amabilidad y aclaraciones cuando lo necesité, a Elsa por su ayuda en los últimos momentos. Al resto de compañeros de Entomología, Patología, Mejora y Bioquímica. Y por supuesto, a todo el personal de Administración, a todos ellos muchas gracias. A Juliet, a la que considero amiga, por todo lo que me has enseñado y transmitido, por tu confianza y ánimo y por saber que estás ahí. No quisiera olvidar mi gratitud hacia los directores del Centro IFAPA, porque han sido varios, muy especialmente a José Manuel López Aranda, antiguo compañero de la fresa, cuya valía profesional y humana es indiscutible. Por estar siempre dispuesto a ayudarme cuando lo he necesitado, por contarme tantas historias y anécdotas, y por lo mucho que hemos trabajado y disfrutado. Gracias Mane. A todo el departamento de Biología Vegetal, Área de Fisiología Vegetal, por su generosidad y simpatía, abriéndome las puertas desde el primer día y acogiéndome como una más. A Sergio y a Antonio por su amabilidad en todo momento, a Candela por el tiempo compartido en las calurosas jornadas en el invernadero del IFAPA. A Nieves, mi compañera de alegrías, penas, estrategias de trabajo y escritura en estos últimos meses. Su apoyo incondicional en cualquier momento, han convertido los días difíciles en posibles y los fáciles en divertidos. Sin tí, todo habría resultado mucho más duro, por tú generosidad y amistad, siempre te estaré agradecida. También quisiera recordar a las Dras. Anita Wallin y Mary Nyman, de la Universidad de Uppsala, Suecia. Siempre recordaré su valía personal y científica, así como su amistad. Al Dr. Carlos López Encina, también un amigo, por su ayuda y su apoyo siempre que lo he necesitado. A todas mis amigas, Marta, Marga, Bea, Sole, Rocio L., Rocio H. y Ana, algunas de ellas desde que teníamos seis años. Por estar siempre a mi lado, tanto en los momentos buenos como en los malos, y por vuestro ánimo y aliento contínuo. A mis hermanos y familia política, cuyo interés me animaron a continuar. Por último quiero dar las gracias a los que más cerca han estado siempre de mí, a Jose cuyo apoyo constante e incondicional desde el primer hasta el último día me ha animado a seguir, porque sin tú ayuda tanto en el plano personal como en el familiar, no hubiera podido concluir este trabajo. Gracias por ocuparte de todo y de todos, muy especialmente en estos últimos meses. A Carlos, Marta y Nacho, a los tres agradeceros enormemente vuestra confianza, presencia y paciencia por el III.2.1.3 Toma de datos 31 III.2.2 Aclimatación y evaluación agronómica de las plantas del cv. Carisma obtenidas vía organogénesis adventicia 31 III.2.3 Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens del cv. Carisma 33 III.2.4 Aclimatación y evaluación morfológica de las líneas transgénicas del cv. Carisma 37 III.3 Resultados 38 III.3.1 Regeneración adventicia 38 III.3.1.1 Cultivar Chandler 38 III.3.1.2 Cultivar Carisma 42 III.3.2 Aclimatación y evaluación agronómica de las plantas del cv. Carisma obtenidas vía organogénesis adventicia 44 III.3.3 Transformación del cv. Carisma mediada por Agrobacterium tumefaciens 56 III.3.4 Aclimatación y evaluación morfológica de las líneas transgénicas de Carisma 59 III.4 Discusión 72 III.4.1 Regeneración adventicia 72 III.4.2 Valoración agronómica de los regenerantes de Carisma 74 III.4.3 Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens del cv. Carisma 81 III.4.4 Evaluación morfológica de las líneas transgénicas de Carisma 85 III.V Conclusiones 88 CAPÍTULO IV: Caracterización del papel del gen Fxacad1 , que codifica una cinamil alcohol deshidrogenasa, en el proceso de II maduración del fruto de fresa IV.1 Introducción 93 IV.2 Materiales y métodos 96 IV.2.1 Material vegetal y transformación genética 96 IV.2.2 Evaluación agronómica de las plantas transgénicas 97 IV.2.3 Extracción de ARN 98 IV.2.4 Análisis de expresión de Fxacad1 mediante PCR cuantitativa a tiempo real (QRT-PCR) 98 IV.2.5 Análisis estadístico 99 IV.3 Resultados 99 IV.3.1 Obtención de plantas transgénicas 99 IV.3.2 Primera evaluación fenotípica de las líneas transgénicas 100 IV.3.3 Análisis molecular de las líneas Cad 104 IV.3.4 Evaluación fenotípica de las líneas Cad seleccionadas 105 IV.4 Discusión 111 IV.5 Conclusiones 118 CAPÍTULO V: Aislamiento y cultivo de protoplastos en el cultivar de fresa Chandler. Evaluación morfológica de los protoclones obtenidos V.1 Introducción 121 V.2 Materiales y Métodos 125 V.2.1 Fuente de material vegetal 127 V.2.2 Aislamiento y purificación de los protoplastos 128 V.2.2.1 Influencia de la concentración de sacarosa y el percoll en la recuperación de protoplastos viables 129 V.2.3 Cultivo y regeneración de plantas 129 V.2.3.1 Influencia de la duración del cultivo en agarosa antes de la adición de medio líquido. 130 III V.2.3.2 Efecto de diferentes densidades de cultivo en medio con BA ó TDZ 130 V.2.3.3 Efecto del medio de cultivo en la regeneración de plantas 130 V.2.4 Aclimatación 131 V.2.5 Comportamiento de los protoclones en vivero 133 V.2.6 Comportamiento de los protoclones en campo de fructificación 135 V.2.7 Estabilidad genética de los protoclones 138 V.3 Resultados 139 V.3.1 Fuente de material 139 V.3.1.1 Efecto de la duración del último subcultivo en el medio para inducir hiperhidricidad 140 V.3.2 Aislamiento y purificación de los protoplastos 141 V.3.2.1 Influencia de la concentración de sacarosa y el percoll en la recuperación de protoplastos viables 141 V.3.3 Cultivo y regeneración de plantas 143 V.3.3.1 Influencia de la duración del cultivo en agarosa antes de la adición de medio líquido 143 V.3.3.2 Efecto de diferentes densidades de cultivo en medio con BA y TDZ 144 V.3.3.3 Efecto del medio de cultivo en la regeneración de plantas 145 V.3.4 Aclimatación 149 V.3.5 Comportamiento de los protoclones en vivero (F0) 149 V.3.6 Comportamiento de los protoclones en el campo de fructificación (F1) 152 V.3.6.1 Caracteres morfológicos de las plantas 152 V.3.6.2 Fructificación 155 V.3.6.3 Morfología de los frutos 157 IV V.3.6.4 Dureza media de los frutos maduros 160 V.3.7 Estabilidad genética de los protoclones 161 V.4 Discusión 162 V.4.1 Pretratamiento de la fuente de material 163 V.4.2 Aislamiento y purificación de los protoplastos 164 V.4.3 Cultivo y regeneración de plantas 166 V.4.3.1 Densidad de cultivo 167 V.4.3.2 Formación de microcallos 168 V.4.4 Evaluación de los protoclones y estabilidad genética 169 V.5 Conclusiones 173 CAPÍTULO VI: Discusión general VI.1 Regeneración vía organogénesis adventicia en los cultivares de fresa Chandler y Carisma. Puesta a punto de un sistema eficiente de transformación genética en Carisma vía Agrobacterium tumefaciens y evaluación del material obtenido 177 VI.1.1 Regeneración de los cvs. Chandler y Carisma mediante organogénesis adventicia 177 VI.1.2 Evaluación morfológica y agronómica de los regenerantes de Carisma 178 VI.1.3 Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens del cv. Carisma 180 VI.1.4 Evaluación morfológica de las líneas transgénicas de Carisma 182 VI.2 Caracterización del papel del gen Fxacad1 , que codifica una cinamil alcohol deshidrogenasa, en el proceso de maduración del fruto de fresa 184 VI.3 Aislamiento y cultivo de protoplastos en el cultivar de fresa Chandler. Evaluación morfológica y agronómica de los protoclones obtenidos y estabilidad genética 188 VI.3.1 Aislamiento y cultivo de protoplastos 188 V VI.3.2 Evaluación morfológica y agronómica de los protoclones obtenidos y estabilidad genética 190 CAPÍTULO VII: Conclusiones VII. Conclusiones 195 CAPÍTULO VIII: Bibliografía VIII. Bibliografía 201 Anexos: Publicaciones Anexo I Anexo II VI Abreviaturas Abreviaturas ADN: ácido desoxirribonucléico AIA: ácido indol-3 acético AIB: ácido 3-indol-butírico ANA: ácido naftalenacético ANOVA: análisis de la varianza ARN: ácido ribonucléico BA: 6-benciladenina Cad: líneas de plantas de fresa transformadas conteniendo la secuencia codificante del gen Fxacad1 CAD: cinamil alcohol deshidrogenasa CaMV35S: virus del mosaico de la coliflor CCR: cinamil alcohol reductasa ChFaM: marcadores microsatélites para el cultivar Chandler ( Fragaria x ananassa Duch.) CIELAB: CIE=modelo cromático usado para describir los colores que pueden ser percibidos por el ojo humano. LAB= espacio de color tridimensional donde L* es luminosidad de negro a blanco, a* va de rojo a verde y b* es la gradiente del azul. CPW: medio de Banks y Evans, 1976 Abreviaturas Cv: cultivar DNase I: endonucleasa dNTPs: deoxinucleósido trifosfato DPAC: programa análisis protoplastos EDTA: ácido etilendiamino tetraacético EST-SSR: microsatélites desarrollados a partir de fragmentos de secuencias expresadas F0: generación madre F1: primera generación hija F2: segunda generación hija GUS: β-glucuronidasa HBO: lámpara de mercurio utilizada en microscopía e inspección visual IFAPA: Instituto Andaluz de Investigación y Formación Agraria, Pesquera, Alimentaria y de la Producción Ecológica K3: medio de Menzel y col. (1981) KG1: vidrios incoloros con alta transmisión en la absorción visible y eficaces en los filtros de protección del calor. LSD: mínima diferencia significativa Abreviaturas milliQ: agua ultrapura N30K-BA: medio de organogenesis para fresa (Barceló 1998) nptII: neomicina fosfotransferasa PCR: reacción en cadena de la polimerasa PVP: polivinilpirrolidona QRT-PCR: PCR en tiempo real RNAi: ARN interferente RNase: ribonucleasa TDZ: tidiazurón W5: medio de Menzel y col. (1981) 2,4-D: ácido 2,4-diclorofenoxiacético 8p-m: medio de cultivo 8p modificado por Glimelius y col. (1986) Introducción 3 I.1 Descripción de la especie: aspectos históricos. Características genéticas y botánicas La fresa pertenece a la familia de las Rosáceas ( Rosaceae), subFamilia Potentilloideae, teniendo a Duschenea y Potentilla como parientes cercanos. Linneo eligió la palabra latina “fraga” (fresa) como un derivado para el nombre del género. Los poetas romanos Virgilio y Ovidio ya mencionaban a “fraga” en sus escritos. El Senador Romano Cato (234-149 a.c) hizo alusión a los usos medicinales de la fresa; sin embargo, posteriormente no aparece referencia alguna de esta especie, ni en escritos griegos ni romanos sobre agricultura. En el siglo XII, el abad Saint Hildegard von Binger, declaró a las fresas no aptas para el consumo porque crecían a lo largo de los caminos, donde las serpientes y sapos trepaban libremente sobre ellas; estas declaraciones tuvieron tanto impacto sobre las personalidades políticas de la época, que ellos también disuadieron a la población de su consumo. Estas creencias se mantuvieron durante varios años entre los europeos, hasta que, a mediados del siglo XVIII, Charles Linnaeus acabó con esta superstición mediante una dieta basada sólo en fresas para demostrar que eran comestibles (Darrow, 1966). El género Fragaria incluye más de 20 especies, clasificadas en cuatro grupos en función de su nivel de ploidía: diploides, tetraploides, hexaploides y octoploides, todas ellas con un número cromosómico básico de 7. Actualmente, la especie cultivada predominante es Fragaria x ananassa Duch. , híbrido octoploide, hermafrodita y con un número cromosómico de 56 . Su origen es probablemente una de las historias más sorprendentes de todas las especies cultivadas. Fragaria x ananassa, resultó de la hibridación fortuita entre dos especies del Nuevo Mundo, F. chiloensis y F.virginiana, ocurrida en un jardín botánico europeo hace aproximadamente 250 años (Darrow, 1966; Capítulo I 4 Wilhelm y Sagen, 1974). La especie silvestre F.virginiana, nativa de Canadá y Estados Unidos, llegó a Europa a finales de 1600 por vías desconocidas y presentaba frutos muy pequeños y blandos, mientras que F. chiloensis llegó a Francia en 1714 gracias a Francois Frezier, un oficial de la armada francesa enviado a Chile, que descubrió cómo los nativos cultivaban F. chiloensis en Concepción. En su desconocimiento, Frezier trajo únicamente plantas de F. chiloensis femeninas, por lo que ésta no pudo expresar su verdadero potencial hasta que, tiempo después, se descubrió a F. virginiana como un polinizador eficaz. Los primeros híbridos de Fragaria x ananassa aparecen alrededor de 1750 en Brest, Francia. En 1817, Thomas A. Knight, inicia un programa de mejora utilizando F. virginiana y F. chiloensis, obteniendo los cultivares “Downton” y “Elton”. La industria de la fresa comercial comienza en Estados Unidos alrededor de 1800 con una selección nativa de F. virginiana , no utilizándose los híbridos importados hasta 1840. Existen asimismo otras dos especies silvestres comerciales, Fragaria vesca y Fragaria moschata, pero en mucha menor escala. La planta de fresa tiene apariencia herbácea (Figura 1), aunque en realidad es una especie leñosa que posee tallos rastreros y cónicos denominados coronas, con estolones, hojas pecioladas con dos estípulas en su base, vellosas, dispuestas en roseta, divididas en tres segmentos aovados y con dientes gruesos en el margen; flores pedunculadas, blancas o amarillentas, solitarias o en corimbos poco nutridos; fruto casi redondo, algo apuntado, rojo, suculento y fragante, y un sistema radicular fasciculado. Introducción 5 Figura 1. Dibujo de plantas de fresa silvestre ( Fragaria vesca ). Otto Wilhelm Thomé, 1885. Fuente: Flora von Deutschland, Österreich und der Schweiz . Gera, Alemania. La fresa es muy apreciada por su delicado sabor, aroma y características nutritivas. La composición del fruto maduro es aproximadamente un 90% de agua y un 10% de sólidos solubles (Hemphill y Martin, 1992), siendo muy alto el contenido en vitamina C; así, una ración de unos 10 frutos contiene los requerimientos nutricionales recomendados de esta vitamina (Maas y col., 1996). Los principales azúcares en fresa son glucosa y fructosa. El ácido cítrico representa el 88% del total de ácidos; además, su contenido en ácido elágico y flavonoides es alto, teniendo efectos claramente beneficiosos para la salud, por la disminución de los riesgos cardiovasculares así como de las enfermedades inflamatorias crónicas. Por otra parte y aunque Capítulo I 6 aún queda mucho por conocer, estudios en algunos compuestos fitoquímicos de la fresa han revelado su acción como anticancerígenos, además de su potencial sobre el sistema inmune, concretamente en las reacciones alérgicas y en el asma, así como en la prevención de la degeneración cerebral asociada a la edad en el ser humano (Hannum, 2004). I.2 Importancia del cultivo La fresa cultivada es uno de los pequeños frutos más valorados y cultivados en todo el mundo, teniendo especial importancia agronómica en España, quinto productor mundial tras China, Estados Unidos, México y Turquía. La costa de Huelva representa la principal zona fresera de Europa con unas 8.000 Ha en monocultivo y una producción en torno a las 260.000 Tm anuales. Resto Europa 17% España 20% Polonia 11% Turkía 24% Alemania 9% Italia 8% Grecia 6% Reino Unido 5% Producción de fresa 2013 Figura 2. Distribución de la producción Europea de la fresa correspondiente al año 2013. Datos provenientes de European Commission Eurostad. (http://ec.europa.eu/eurostat). Introducción 7 En 2013, España fue el segundo productor de fresa en Europa, con el 20% de la producción (Figura 2), tras Turquía con un 24%, y seguida por Polonia con un 11%, pero estos dos últimos países con un área de cultivo considerablemente mayor. Sus cualidades alimentarias tanto para el consumo en fresco como para procesado industrial, además de sus claros beneficios para la salud, hacen que la demanda de este producto a nivel internacional se incremente con el paso del tiempo. Por otra parte, además de su valor económico, tiene importancia como modelo en estudios fisiológicos del desarrollo y crecimiento de frutos no climatéricos (Manning, 1994). La fres a se incluye en el grupo de frutos blandos, caracterizados por sufrir un drástico reblandecimiento al final de su maduración, pudiendo adquirir incluso una consistencia semilíquida (Manning, 1993). Esta pérdida de firmeza constituye la principal causa de disminución de calidad de los frutos, limitando en gran medida la vida postcosecha de esta especie. El hecho de que la mayor parte de la producción española se destine a la exportación y de que la fresa sea un fruto que madura rápidamente, hacen que la búsqueda de métodos que alarguen el periodo de postcosecha tenga especial relevancia, ya que entre un 5-25% de la producción se pierde cada año debido al excesivo reblandecimiento del fruto y a infecciones por patógenos fúngicos y bacterianos. I.3 Mejora de la fresa La fresa es un cultivo muy sensible a la autogamia (Morrow y Darrow, 1952), y como los genotipos son altamente heterozigóticos y se pueden reproducir mediante estolones, normalmente los programas de mejora no han desarrollado cultivares híbridos utilizando líneas autofecundadas (Hummer y Capítulo I 8 Hancock, 2009). Desde las primeras investigaciones iniciadas en Inglaterra en el siglo XIX por Thomas A. Knight (Darrow, 1966), han sido muchos los trabajos encaminados hacia la obtención de nuevos cultivares de fresa. En esta línea, Bringhurst y Voth (Universidad de California, Davis), a mediados del siglo pasado, introdujeron un gran número de importantes cultivares adaptados al clima Mediterráneo, como es el caso de Chandler (1983) o Camarosa (1992) (Hummer y Hancock, 2009). En el siguiente diagrama (Figura 3), se muestra un esquema de la mejora de esta especie, que incluye además de la mejora tradicional, la mejora mediante aproximaciones biotecnológicas (regeneración vía organogénesis, transformación genética y cultivo de protoplastos) como complemento a la mejora clásica. Mejora de la Fresa Mejora Clásica Organogénesis Adventicia Cultivo de Protoplastos Transformación Genética Figura 3. Esquema de las diferentes estrategias utilizadas en la mejora de la fresa Introducción 9 I.3.1. Mejora tradicional Los cultivares modernos de la fresa cultivada proceden de la identificación de genotipos superiores, la hibridación entre ellos y la selección de los mejores descendientes como cultivares potenciales o bien, como posibles parentales para las siguientes generaciones (Graham, 2005). Actualmente, es posible cultivar fresas en climas muy diferentes que van desde las zonas del Mediterráneo moderado a las zonas Subtropicales y de Taiga (Hancock y col., 1991). El desarrollo de estos cultivares dentro de los programas de mejora tradicional, se ha conseguido en su mayoría, abordando problemas similares relacionados con la resistencia a enfermedades y pesticidas, estrés ambiental, calidad de fruto y vida postcosecha (Faedi y col., 2000). Sin embargo, los mejoradores tradicionales encuentran serias dificultades en esta planta, debido fundamentalmente a su propia naturaleza octoploide, fuerte heterozigosis y origen interespecífico (Scott y Lawrence, 1975); además, la base genética del germoplasma es estrecha (Sjulin y Dale, 1987; Dale y Sjulin, 1990). La pérdida de vigor y producción así como del tamaño y otras características de los frutos, se acrecienta con las prácticas de mejora, ya que los principales cultivares de fresa proceden de antepasados comunes (Scott y Lawrence, 1975). Además, incluso en el caso de que un carácter sea controlado por un único gen, los modelos de segregación y recombinación son altamente irregulares e impredecibles en la progenie de semillas (Darrow, 1966; Scott y Lawrence, 1975); por tanto, el éxito en la mejora dependerá de la combinación de factores tanto genéticos como ambientales. Capítulo I 10 I.3.2 Mejora de la fresa mediante aproximaciones biotecnológicas La mejora de la fresa mediante tecnologías basadas en el cultivo in vitro y la Biología Molecular, pueden solventar algunas de las limitaciones de la mejora tradicional, permitiendo desarrollar nuevos cultivares adaptados a las necesidades cambiantes de los consumidores y productores (Debnath y col., 2007). Se han hecho grandes esfuerzos en investigación en Arabidopsis y otras plantas modelo, pero es necesario trasladar estos conocimientos a cultivos hortícolas de interés; de hecho, la fresa, dentro de la familia de las Rosaceae, es una planta idónea para los estudios de genómica funcional (Folta y Dhingra, 2006), que posteriormente podrán aplicarse a otras especies de la misma familia. I.3.2.1 Regeneración in vitro : Organogénesis adventicia La potencialidad que poseen las células diferenciadas para formar plantas completas se denomina totipotencia celular, y ésta se puede expresar vía organogénesis adventicia o embriogénesis somática. En la regeneración a partir de células diferenciadas, éstas suelen revertir al estado meristemático, proceso denominado desdiferenciación, para posteriormente sufrir una serie de divisiones sucesivas formando un tejido de callo desorganizado antes de dar lugar a la nueva estructura (morfogénesis indirecta), o bien, originarla directamente a partir de las células meristemáticas, conociéndose este proceso como re-diferenciación (morfogénesis directa). En horticultura, el uso de hojas, tallos y raíces ha sido una práctica habitual para conseguir individuos nuevos regenerados en algunas especies. De hecho, la técnica de regeneración in vitro es una herramienta muy válida Introducción 11 para la propagación clonal, el mantenimiento de bancos de germoplasma y la ingeniería genética en cultivos hortícolas. La obtención de brotes adventicios en fresa se ha logrado utilizando diferentes explantos (Folta y Dhingra, 2006; Debnath y col., 2007), siendo el disco de hoja el más empleado, tanto de plantas procedentes de invernadero como de cultivo in vitro . Así mismo, se ha obtenido regeneración de brotes a partir del cultivo de embriones somáticos (Wang y col., 1984), aunque el mantenimiento de estos cultivos embriogénicos no fue muy exitoso. Posteriormente, Biswass y col. (2009) obtuvo embriogénesis somática a partir de callo derivado de hoja. En esta especie, son varios los reguladores hormonales empleados en la inducción de organogénesis adventicia, siendo sus combinaciones y concentraciones las principales diferencias entre los trabajos publicados en regeneración; así el tipo y concentración de auxina son muy variables, mientras que la citoquinina BA es la más utilizada (Folta y Dhingra, 2006), aunque en los últimos años se ha incrementado el interés por el uso del tidiazurón (TDZ) en lugar de la benciladenina (Quesada y col., 2007). Además, otros factores pueden afectar a la regeneración de la fresa, como es la incubación previa en condiciones de oscuridad (Liu y Sandford, 1988; Debnath, 2005). En general, la capacidad de regeneración es aceptable, aunque claramente genotipo dependiente (Jones y col., 1988; Nehra y Stushnoff, 1989, 1990b; Passey y col., 2003). La adaptación de las condiciones de cultivo, la combinación hormonal y el manejo, así como el tipo de explanto, han permitido obtener altas tasas de regeneración adventicia en diferentes variedades comerciales de fresa, de manera que este sistema ha sido el empleado con mayor éxito en la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens (Nehra y col., 1990a,b; Mathews y col., 1995; Monticelli y col., 2004), aunque también Capítulo I 18 estrés sufrido durante el cultivo in vitro , puede inducir variación somaclonal, existiendo una respuesta diferencial en función del genotipo (Bairu y Aremu, 2011). Los variantes somaclonales pueden detectarse mediante la aplicación de técnicas morfológicas y moleculares. La evaluación morfológica se basa en la identificación de individuos en función de los distintos caracteres de la planta, así como de su comportamiento en cuanto a producción y reproducción, aunque ésta se ve fuertemente influenciada por los factores ambientales, pudiendo no reflejar su verdadera composición genética (Mandal y col., 2001). Respecto a la evaluación molecular, las variaciones morfológicas visibles ocurren a mucha menor frecuencia que a nivel de ADN (Evans y col., 1984); en esta línea, existen diferentes técnicas para estudiar el genoma de las plantas, entre ellas, métodos citológicos para evaluar la variación en el nivel de ploidía o en el número y estructura de cromosomas, análisis de isoenzimas y proteínas y técnicas basadas en marcadores moleculares como son, el polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), el polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción (AFLP) y los microsatélites (Bairu y Aremu, 2011). Objetivos 21 II. Objetivos En este trabajo se pretenden establecer las bases para mejorar la fresa ( Fragaria x ananassa Duch.) mediante métodos biotecnológicos. Para abordar este objetivo global, se han establecido los siguientes objetivos parciales: 1. Evaluar los efectos de los procesos de regeneración y de transformación genética en la inducción de variabilidad fenotípica. 1a. Desarrollar un método eficiente de regeneración, via organogénesis adventicia, en los cultivares Chandler y Carisma, y evaluación morfológica, en condiciones de invernadero, de líneas del cultivar Carisma procedentes de distintos eventos de regeneración. 2b. Desarrollar un método de transformación, vía Agrobacterium tumefaciens , en el cultivar Carisma y evaluación, en condiciones de confinamiento, de líneas procedentes de distintos sucesos de transformación. 2. Evaluar el papel del gen Fxacad1 , implicado en la síntesis de lignina, en la modificación de la firmeza del fruto de fresa durante la maduración. 3. Establecer un método eficiente de obtención de protoplastos del cultivar Chandler y evaluación de las características agronómicas de los protoclones obtenidos CAPÍTULO III Regeneración vía organogénesis adventicia en los cultivares de fresa Chandler y Carisma. Puesta a punto de un sistema eficiente de transformación genética en Carisma vía Agrobacterium tumefaciens y evaluación del material obtenido Regeneración y transformación 25 III.1. Introducción La fresa cultivada ( Fragaria x ananassa Duch.), un híbrido entre F. virginiana Duch. y F. chiloensis Duch, es una planta dicotiledónea octoploide (2n=8x=56), perteneciente a la familia de las Rosáceas, presente en la mayoría de las áreas cultivables del mundo. La fresa se consume fundamentalmente como fruta fresca, aunque su uso como procesado industrial está ampliamente difundido (conservas, mermeladas, jaleas, zumos...), lo cual la convierte en uno de los principales cultivos de baya (Childers, 1980). Es muy valorada por su contenido en carbohidratos poco calóricos (fructosa, glucosa y xilitol) y por tener un alto porcentaje de fibra; además, constituye una fuente natural de antioxidantes (Heinonen y col., 1988; Wang y col., 1996; Kähkönen y col., 1999), con actividad contra radicales libres (Wang y Jiao, 2000). Meyers y col. (2003) señalaban que, en fresa, los fenoles explican la mayor parte de su actividad antioxidante. La fresa es un cultivo de gran importancia económica en España y particularmente, en Andalucía. Chandler es un cultivar de fresa con excelentes características agronómicas, y ha sido durante años la principal variedad cultivada en España. Se ha empleado como parental en programas de mejora, además de haber sido ampliamente utilizado en el procesado de fruta. Por otro lado, en el IFAPA Centro de Málaga se lleva a cabo un programa de mejora genética, y una de sus selecciones ha sido Carisma, un cultivar vigoroso y de día corto, cuyo buen comportamiento en vivero de altura facilita su multiplicación, presentando una alta capacidad para producir estolones. Es además muy productivo, con frutos grandes y de fácil recolección, teniendo una firmeza entre intermedia y alta, de color rojo, y buen sabor y dulzor. Como características propias de la planta cabría destacar su porte erecto y Capítulo III 26 vigor elevado (Marsal y col., 2000). La utilización de técnicas de ingeniería genética en ambos cultivares, Chandler y Carisma, requiere el desarrollo de protocolos de transformación y el establecimiento previo de sistemas eficientes de regeneración. En fresa, son varios los factores que afectan a la capacidad de regeneración, entre ellos, el genotipo (Jones y col., 1988; Liu y Sandford, 1988; Nehra y Stushnoff, 1989, 1990a; Sorvari y col., 1993; Passey y col., 2003; Singh y Pandey, 2004; Hanhineva y col., 2005), la composición del medio de cultivo y las condiciones de incubación (Liu y Sandford, 1988; Nehra y Stushnoff, 1989), así como el tipo, fuente, y estado de desarrollo del explanto (Nehra y Stushnoff, 1989; Debnath y Texeira da Silva, 2007). De hecho, son numerosos los trabajos realizados sobre organogénesis adventicia de fresa a partir de diferentes explantos (hojas, peciolos, pedúnculos florales, tallos, estípulas, estolones, raíces, protoplastos de mesófilo, cultivo de anteras y embriones inmaduros), siendo el disco de hoja el más utilizado de todos ellos (Nyman y Wallin, 1988; Nehra y Stushnoff, 1989; Debnath, 2005); así, se han obtenido brotes a partir de este explanto en material procedente de campo (Nehra y Stushnoff, 1989), invernadero (Barceló y col., 1998; Debnath, 2005, 2006) o cultivado in vitro (Sorvari y col., 1993; Barceló y col., 1998; Passey y col., 2003; Yonghua y col., 2005). Por otra parte, se ha observado que la regeneración adventicia puede dar lugar a la aparición de variación somaclonal (Nehra y col., 1994; Biswas y col., 2009), y aunque esta técnica puede ser utilizada como herramienta para inducir variabilidad genética (Karp, 1995), si lo que se quiere es mantener la uniformidad y las características de interés agronómico en el material regenerado, lo deseable es evitar o reducir, al menos, la aparición de plantas fuera de tipo. Regeneración y transformación 27 En relación con el proceso de transformación genética de fresa, los primeros trabajos se publicaron en la década de los 90 (James y col., 1990; Nehra y col., 1990 a,b; El Mansouri y col., 1996; Barceló y col., 1998); no obstante, las frecuencias de transformación estaban muy influenciadas por el cultivar y el procedimiento empleado; así, se obtuvo una frecuencia de transformación de un 0,95% en el cultivar Rapella (James y col., 1990) y un 6,5% en Red Coat (Nehra y col., 1990b). En general, la eficiencia de transformación lograda, independientemente del método utilizado, es baja, además de ser genotipo dependiente (Quesada y col., 2007). Por otra parte, durante el proceso de transformación genética pueden aparecer fenómenos de variación somaclonal, ya sea como consecuencia de la regeneración adventicia en sí, o por alteraciones ocasionadas en el genoma de la planta como consecuencia de la inserción del T-ADN (Pineda y col., 2010; Atarés y col., 2011). El primer objetivo de este trabajo ha sido estudiar la capacidad morfogenética mediante organogénesis adventicia del cultivar de fresa Chandler, nuestro cultivar modelo; a continuación, y utilizando el protocolo desarrollado, se estudió la regeneración en Carisma. Posteriormente, se evaluó la posible aparición de variación somaclonal en las plantas obtenidas de este cultivar. El protocolo de regeneración adventicia puesto a punto en este trabajo fue utilizado posteriormente para optimizar un sistema de transformación genética en Chandler (El Mansouri, 1997; Barceló y col., 1998). Tomando como base este protocolo, como segundo objetivo de este trabajo, se ha abordado la transformación vía Agrobacterium tumefaciens en Carisma, habiéndose llevado a cabo la caracterización morfológica y agronómica del material transgénico obtenido de este cultivar. Capítulo III 34 kanamicina y el gen marcador uidA bajo el control del promotor CaMV35S. El vector binario fue introducido en Agrobacterium mediante el método de congelación-descongelación (Holsters y col., 1978). La bacteria fue crecida a 28ºC en medio LB conteniendo 50 mg.l-1de kanamicina. Los explantos utilizados para la transformación fueron hojas completas procedente de plantas micropropagadas en medio N30K suplementado con 0,47 mg.l-1 kinetina. Experimentos preliminares en el cv. Chandler, mostraron que este tipo de explanto tenía mayor capacidad de regeneración que el disco de hoja. Los explantos fueron precultivados en el medio de regeneración, medio basal N30K suplementado con 0,5 mg.l-1 AIB y 2 mg.l-1 BA, durante 10 días antes de la inoculación con A. tumefaciens (Figura 5). A B Figura 5. A: stock de plantas de fresa cultivar Carisma creciendo en medio de multiplicación. B: precultivo de los discos de hoja en el medio de regeneración conteniendo medio basal suplementado con 0,5 mg.l-1 AIB y 2 mg.l-1 BA antes de la infección con Agrobacterium . Después del periodo de inducción, los explantos se colocaron en tubos de 50 ml y se inocularon durante veinte minutos en agitación suave con un Regeneración y transformación 35 cultivo de Agrobacterium crecido durante la noche y diluido a 1/10 en medio basal MS (Figura 6). AB Figura 6. A: cultivo de Agrobacterium tumefaciens en medio líquido. B: infección de los explantos con Agrobacterium tumefaciens. Los explantos infectados fueron secados posteriormente en papel de filtro (Figura 7) y cultivados en el medio de regeneración durante 3 días. A continuación, los discos se transfirieron a medio de selección, el medio optimizado para la regeneración suplementado con 25 mg.l-1 de kanamicina y un antibiótico bactericida, carbenicilina 500 mg.l-1, cefotaxima 250 mg.l-1 ó timentina 100 mg.l-1. Los explantos se recultivaron a medio de selección fresco cada 3-4 semanas. Capítulo III 36 A B Figura 7. Secado de los explantos infectados en papel de filtro (A) y transferencia al mismo medio (B) antes de ser cultivados en medio de selección. Una vez los brotes regenerados alcanzaban un tamaño de, al menos, 0,5 cm de longitud, éstos se separaban del explanto inicial, se identificaban individualmente como clones transgénicos independientes y se multiplicaban en medio N30K 0,47 mg.l-1 kinetina, al cual se le adicionaba kanamicina. El primer cultivo en el medio de microprogación se realizó en presencia de 25 mg.l-1 de kanamicina y en los siguientes se aumentó la concentración hasta 50 mg.l-1, manteniéndose en esta concentración al menos durante tres subcultivos antes de su aclimatación a invernadero, para evitar en la medida de lo posible, la aparición de quimeras. El porcentaje de transformación se calculó como el número de explantos con brotes verdes regenerados en presencia de kanamicina dividido por el número total de explantos inoculados. La naturaleza transgénica de las líneas obtenidas se determinó mediante amplificación por PCR de un fragmento de 220 pb del gen nptII . El ADN se extrajo a partir de hojas jóvenes, pequeñas y sin expandir, a las cuales se les eliminaba el nervio central, procedentes de plantas mantenidas Regeneración y transformación 37 en invernadero. El material vegetal se congelaba en nitrógeno líquido. Para la extracción del ADN, 0,2 g de hojas finamente trituradas se lavaron cuatro veces en tampón de lavado (acetato potásico 100 mM pH 5.0, EDTA 20 mM, PVP 1% y β-mercaptoetanol 1%) (Mercado y col., 1999). Posteriormente, el ADN se extrajo con el kit comercial DNeasy Plant Mini kit (Qiagen). El ADN se cuantificó espectrofotométricamente mediante nanodrop. Los cebadores utilizados para la amplificación del ADN fueron: F: 5´- GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3´; R: 5´-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA3´. La mezcla de reacción para la PCR contenía: cebador F 5µM, cebador R 5 µM, dNTPs 5 µM, tampón 10x 2 mM, agua milliQ, amplitaq (1:20). Las condiciones del termociclador fueron: 95ºC (3´), 35x [94ºC (30´´), 60ºC (30´´), 72ºC (45´´)]; 72ºC (3´); y 10ºC ∞. Se usaron dos controles negativos, correspondientes a los controles macro y micropropagado de Carisma, un control positivo correspondiente al plásmido pGUSINT y un control blanco que tenía sólo agua milliQ. III.2.4 Aclimatación y evaluación morfológica de las líneas transgénicas del cv. Carisma Los clones obtenidos, 27 líneas transgénicas independientes, se aclimataron siguiendo el protocolo puesto a punto por López-Aranda y col. (1994). Las plantas F0 se colocaron en macetas, con tres repeticiones por línea, y se mantuvieron en invernadero de confinamiento para ser evaluadas agronómicamente siguiendo el procedimiento previamente descrito en el apartado III.2.2 (Figura 8). Capítulo III 38 Figura 8. Plantas transgénicas de Carisma mantenidas en macetas y en invernadero de confinamientro para ser evaluadas morfológicamente. Como controles, se utilizaron plantas procedentes de material macropropagado y micropropagado. Una de las líneas transgénicas (clon 36 G) murió durante la F0. Tras la caracterización de la F0, se evaluaron agronómicamente las generaciones F1 y F2, obtenidas mediante propagación vegetativa por estolonado. III.3. Resultados III.3.1. Regeneración adventicia III.3.1.1 Cultivar Chandler Inicialmente, se testó el efecto de la relación citoquinina/auxina en la capacidad de regeneración in vitro de los discos de hoja. Los resultados obtenidos a las 16 semanas de cultivo se muestran en la Figura 9. Regeneración y transformación 39 0 10 20 30 40 50 60 012345678 Concentración de BA (mg/l) AIB 0,5 mg/l AIB 1 mg/l Explantos con brotes (%) LSD Figura 9. Efecto de la concentración de BA e AIB (mg.l-1) sobre el porcentaje de regeneración de explantos de disco de hoja de fresa, cv. Chandler, a las 16 semanas de cultivo. La barra indica el valor de LSD a una P=0,05. La presencia de auxina fue absolutamente necesaria para que la regeneración tuviera lugar, no observándose ésta cuando la auxina estaba ausente en el medio de regeneración. Los mejores resultados se obtuvieron con 0,5 mg.l-1 AIB; concentraciones mayores (1 mg.l-1) tenían un efecto negativo sobre el proceso. Como se esperaba, la benciladenina también era necesaria, estando los niveles óptimos en un rango entre 0,5-2 mg.l-1 Un porcentaje relativamente pequeño de discos de hoja (5-15%) empezaron a regenerar después de 8 semanas, mientras que tras 16 semanas, un mayor número de explantos, alrededor del 50%, habían formado colonias. Inicialmente se eligió una concentración intermedia de BA (1 mg.l-1) para usarla en experimentos posteriores; sin embargo, tras seis subcultivos adicionales en el medio de regeneración, el número medio de colonias de tallos por disco regenerante fue superior en el tratamiento que incluía BA a 2 mg.l-1, 2,9 colonias/explanto en BA 2 mg.l-1 frente a 1,3 y 1,4 en los medios Capítulo III 40 conteniendo BA 0,5 y 1 mg.l-1, respectivamente. Por tanto, la concentración superior de BA se eligió como estándar y se usó para estudiar el efecto del tipo de auxina, así como en los experimentos de regeneración y transformación del cv. Carisma. En un segundo experimento se testó el efecto de un pretratamiento de obscuridad sobre la capacidad de regeneración (Figura 10). Los explantos incubados en medio de regeneración fueron cultivados durante 0, 1, 2 ó 4 semanas en oscuridad y posteriormente transferidos a luz. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 1 2 4 Regeneración de brotes (%) Incubación en oscuridad (semanas) Figura 10. Efecto de la incubación en obscuridad de 1 a 4 semanas sobre el porcentaje de regeneración de brotes en discos de hoja de fresa, cv. Chandler, tras 16 semanas de cultivo. Aunque no se observaron diferencias significativas en los porcentajes de regeneración tras 16 semanas de cultivo, una incubación en obscuridad de una a cuatro semanas, aceleraba el proceso de regeneración observado tras ocho semanas, e incrementaba ligeramente los porcentajes de regeneración Regeneración y transformación 41 tras 16 semanas desde un 47%, sin tratamiento de obscuridad, hasta un 68% después de 1-4 semanas de oscuridad. No se detectaron diferencias claras en el número de colonias por disco regenerante, fluctuando en un rango entre 1,5 (1 semana de obscuridad) y 2,6 (0 y 4 semanas de obscuridad). Después de 16 semanas, sin embargo, brotes incubados durante dos semanas en obscuridad tenían mejor aspecto que los procedentes de otros tratamientos, eligiéndose dos semanas de obscuridad como tratamiento estándar. A continuación, se estudió el efecto del nivel de irradiancia en la regeneración (Figura 11). 0 20 40 60 80 100 0 20 40 80 Explantos con brotes (%) Irradiancia (µmol.m -2 .s -1 ) b aa a Figura 11. Efecto del nivel de irradiancia sobre la regeneración de discos de hoja de fresa, cv. Chandler. Diferentes letras en las columnas indican diferencias significativas con LSD a P=0.05. La luz incrementaba significativamente la regeneración, especialmente en el rango de 20 a 40 µmol.m-2.s-1, durante el periodo de 0 a 16 semanas. El tratamiento de 40 µmol.m-2.s-1 se eligió como estándar porque dió los Capítulo III 42 porcentajes de regeneración más altos, no detectándose diferencias en el numero de colonias por disco regenerante, que variaba entre 1,9-2,2. Finalmente, se estudió el efecto del tipo de auxina, AIB vs AIA, en la capacidad morfogenética. No se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos; sin embargo, el porcentaje de regeneración más alto, 66,7%, se obtuvo con 0,5 mg.l-1 AIB y 2 mg.l-1 BA versus 58,3% en presencia de AIABA a concentraciones equivalentes. Por consiguiente, el primer tratamiento se eligió como estándar. El número de colonias por disco regenerante fue similar en ambos tratamientos. III.3.1.2 Cultivar Carisma Para la regeneración de Carisma se testó el protocolo desarrollado para el cultivar Chandler. Así, los discos de hoja fueron incubados en medio N30K suplementado con AIB 0,5 mg.l-1 y BA 2 mg.l-1 durante 32 semanas, con subcultivos a medio fresco cada 4 semanas. Los explantos se incubaron inicialmente 2 semanas en oscuridad y posteriormente se transfirieron a luz, 40 µmol.m-2.s-1. El aspecto de los cultivos fue muy bueno durante las 4 y 8 primeras semanas; a partir de las 16 semanas, la apariencia de los discos era diferente, presentando un color marrón-negro en lugar de verde, y una textura más gelatinosa. Estas características se generalizarían en todos los explantos a las 24 y 32 semanas del inicio de los cultivos. En la Figura 12 se muestra el aspecto de los discos de hoja regenerando colonias de brotes de origen adventicio. Regeneración y transformación 43 AB BC Figura 12. Diferentes imágenes de discos de hoja, regenerando brotes adventicios en el cultivar de fresa Carisma. A: brote emergiendo de la zona abaxial del disco de hoja. B: colonias adventicias. C: detalle de una colonia de plantas regeneradas. El porcentaje de regeneración obtenido mediante organogénesis adventicia a las 16 semanas, fue de un 22%, aumentando hasta un 51% a las 32 semanas de cultivo, con un número medio de 2,13 colonias por disco regenerante (Tabla 1). Tabla 1. Organogénesis adventicia en discos de hoja de fresa, cultivar Carisma, en medio N30K con 0,5 mg.l-1 AIB y 2 mg.l-1 BA. Tiempo (semanas) Regeneración de brotes (%) Nº brotes/explanto 4 4,0 1,0 8 12,0 1,0 16 22,0 1,4 24 32,0 2,3 32 51,0 2,1 Capítulo III 50 En otros casos, se observó un comportamiento anómalo desde el principio; así, el clon 12 dio una producción baja en la F0 y la F1, desapareciendo finalmente en la F2. La línea 27 sólo produjo una pequeña cantidad de frutos en la última generación, para terminar también muriendo (Tabla 4) ). . Cuando se compara la producción con el control micropropagado, las líneas regenerantes 20, 24 y 48 destacaron por ser las que más producían (Tabla 4). Asimismo, los clones 13, 14, 15, 19, 33 y 39 presentaron una producción media similar a la del control (Tabla 4). Por el contrario, las líneas 3, 11, 26, 29 y 36 dieron una producción muy baja. En la Figura 14 se muestra la distribución de frecuencias de la producción media de las líneas regenerantes de Carisma obtenida en las 3 generaciones, con respecto a la del control micropropagado. 0 5 10 15 20 25 30 0-25 25-50 50-75 75-100 100-125 125-150 150-175 Somaclones de Carisma (%) Producción relativa (% respecto al C micropropagado) Figura 14. Distribución de frecuencias de la producción relativa en las líneas obtenidas mediante regeneración adventicia en Carisma. La producción se calculó como la media de las producciones obtenidas en las tres generaciones, con respecto al control micropropagado. Regeneración y transformación 51 Nueve de las 16 líneas evaluadas, 56.2%, dieron una producción similar o superior al control. Por el contrario, el 25% de las líneas dieron una producción muy baja, inferior al 25% de la producción media obtenida en el control micropropagado. A continuación, se muestra el tamaño de los frutos (Tabla 5). Tabla 5. Peso medio del fruto (g) en somaclones de fresa, cultivar Carisma, obtenidos vía regeneración adventicia a partir de disco de hoja (F0). Posteriormente, las plantas se multiplicaron mediante estolones durante dos generaciones sucesivas (F1, F2). El (*) indica diferencias significativas por test T2 Tamhane a P=0,05. Peso de fruto (g) Línea regenerante F0 F1 F2 Media C micro 7,1 9,5 9,8 8,8±1.5 3 3,8 4,6 3,8 4,1±0.5* 11 4,0 3,9 3,4 3,7±0.3* 12 3,9 6,4 _ 5,1±1.7 13 7,3 9,8 8,8 8,6±1.3 14 7,2 6,0 6,6 6,6±0.6 15 5,4 6,7 5,1 5,8±0.9 19 5,1 10,1 8,3 7,8±2.5 20 7,0 8,4 6,7 7,4±0.9 24 8,2 9,6 8,4 8,7±0.7 26 2,7 5,0 1,7 3,1±1.6* 27 0 0 3,6 -- 29 2,7 7,3 2,8 4,3±2.6 33 6,8 8,5 10,9 8,7±2.0 36 9,9 4,1 3,3 5,8±3.6 39 8,4 7,7 5,4 7,2±1.6 48 6,7 8,6 9,4 8,7±1.4 Capítulo III 52 En general, el peso medio del fruto en las líneas regeneradas fue bajo, y casi siempre inferior al del control micropropagado, siendo las diferencias con el control significativas para las líneas 3, 11 y 26. En la F0, los valores de peso fluctuaron entre 2,7 y 9,9 g; en la generación hija (F1), aumentó ligeramente el peso, hasta situarse en el rango 3,9–10,2 g, fluctuando en la F2 entre 1,7 y 10,9 g. En el control micropropagado el peso de fruto se mantuvo en el rango 7,1 - 9,8 g. El peso medio de frutos procedentes de plantas de Carisma propagadas mediante estolonado, evaluado en otros experimentos por nuestro grupo de trabajo, bajo las mismas condiciones de cultivo, fue de 7,8 gramos. Observando el peso medio de los frutos en las tres generaciones, en general, existe una relación directamente proporcional entre capacidad de fructificación y tamaño de fruto, ya que los clones menos productivos eran también los de menor peso medio de fruto (3, 11, 26, 27 y 29), a excepción del clon 14 que con una producción de 114,7 g por planta, dio frutos con un peso medio de 6,6 g. Asimismo, los clones que más producían (13, 15, 19, 20, 24, 33, 39, 48 y control micropropagado) dieron frutos más grandes. En la Figura 15 se muestra la distribución de frecuencias de los pesos medios de fruto de las líneas regeneradas vía organogénesis adventicia en Carisma, en base al peso relativo de los frutos con respecto al del control micropropagado (100%). De manera similar a lo observado para la producción estimada como g de fruto por planta, el 50% de las líneas dieron frutos cuyo peso estaba comprendido entre el 75-100% del control, mientras que sólo 1 línea, 6.2% del total, dio frutos con un peso inferior al 25% del valor medio obtenido en el control. Regeneración y transformación 53 0 10 20 30 40 50 0-25 25-50 50-75 75-100 100-125 Somaclones de Carisma (%) Peso relativo (% respecto al C micropropagado) Figura 15. Distribución de frecuencias del peso relativo de fruto en las líneas de fresa, cultivar Carisma, obtenidas mediante regeneración adventicia. El peso relativo se calculó como la media de peso en las 3 generaciones con respecto al control micropropagado. En general, las líneas regenerantes más productivas y con frutos de mayor tamaño se correspondían con las de mayor área, tal era el caso de los clones 14, 19, 20, 39 y 48, aunque los clones 13 y 15 con alta producción mostraron un área intermedia. . El clon 29, sin embargo, siendo el que menos fructificó de todos, mostró un área media alta (485,7 cm2). Finalmente, los clones de menor área fueron el 12 y 27, los cuales acabaron despareciendo, así como, el 11 y 36 que ya desde un principio se mostraron como clones poco productivos y con poco vigor. Globalmente, se observó una correlación positiva entre el área de la planta y la producción media (coeficiente de correlación de Pearson de 0,697, significativo a P=0,01), así como entre área y peso medio de fruto (coeficiente de Pearson de 0,664, significativo a P=0,01). En relación con la morfología del fruto, la aparición de anomalías fue la tónica general en los somaclones de Carisma. La anomalía más frecuente fue Capítulo III 54 la aparición de filodios (Tabla 6). Tabla 6. Porcentaje de frutos con presencia de filodios en somaclones obtenidos mediante regeneración adventicia a partir de disco de hoja de fresa, cultivar Carisma (F0); así como en las generaciones (F1, F2), obtenidas por estolonado. Frutos con filodios (%) Línea regenerante F0 F1 F2 C micro 16,7 0,8 0 3 0 0 5,7 11 13,1 2,9 11,3 12 33,3 26,7 13 10,8 0 1,9 14 14,0 4,8 0 15 0 0 0 19 8,1 0 0 20 0 0 0 24 3,5 0 0 26 65,0 14,6 25,0 27 _ _ 0 29 0 0 0 33 0 0 0 36 0 14,3 0 39 0 0 2,9 48 14,6 0,9 0 Más de la mitad de los clones mostraron frutos rojos con filodios; sin embargo, no se observó un comportamiento uniforme en cuanto a su aparición, ya que en algunos somaclones estos desaparecían en el transcurso de las generaciones (14, 19, 24, 48 y control micropropagado), mientras que Regeneración y transformación 55 en otros se mantenían (11, 12 y 26) o sólo aparecían en la F2 (3 y 39), en la F1 (clon 36) o bien, en la generación madre y en la última (13). También hubo clones que nunca presentaron filodios (15, 20, 29 y 33). El clon 12, que mostró un alto porcentaje de estas anomalías en la F0 y en la F1, acabaría muriendo en la F2, tal y como se ha señalado anteriormente. También se observaron otras anomalías entre los frutos de algunos clones: semillas que germinaban precozmente, pulpas anormales y poco hidratadas, así como la aparición de frutos múltiples; sin embargo, estas deformidades, no parecían guardar relación alguna con la presencia de filodios (Figura 16). Destacaron los clones 12 y 26 porque ambos presentaban anomalías diversas en la F0 y F1, o el clon 3, con algunas deformaciones en la F1 que se incrementaron notablemente en la siguiente generación. Los clones 11 y 36 presentaron anomalías en la última generación. Todos estos somaclones con deformaciones diversas, tenían en común que eran poco productivos. El control micropropagado también produjo al principio algunos frutos deformes (frutos múltiples en un mismo receptáculo, a veces con brotaciones precoces de los aquenios), pero sólo en la generación madre (F0). Estas anomalías nunca se observaron en plantas de Carisma propagadas convencionalmente por estolonado y cultivadas en las mismas condiciones (Apartado III.3.4). B A C D F Capítulo III 56 A D BC EF A Figura 16. Imágenes de diferentes anomalías en frutos de somaclones de Carisma: A.: filodios. B: germinaciones de aquenios. C: deformidades del receptáculo. D: distinto grado de aparición de filodios en frutos inmaduros. E: fruto deformado, con presencia de filodios en el borde. F: fruto deforme con aquenio brotado en su extremo. III.3.3 Transformación del cv. Carisma mediada por Agrobacterium tumefaciens La transformación en Carisma se llevó a cabo siguiendo el protocolo desarrollado para el cultivar Chandler (Barceló y col., 1998), aunque en este caso se utilizó hoja completa en lugar de disco de hoja, ya que experimentos previos mostraron que este tipo de explanto tenía mayor capacidad de regeneración que el disco de hoja. Los explantos se transformaron con la cepa de A. tumefaciens LBA4404 conteniendo el vector binario pGUSINT. El agente y nivel de selección empleado, kanamicina 25 mg.l-1, fue el mismo que el usado en Chandler, ya que previamente se comprobó que Carisma tenía una alta sensibilidad a este antibiótico. Se realizaron 3 experimentos de Regeneración y transformación 57 transformación en los que se testó el efecto del antibiótico bactericida (carbenicilina, cefotaxima o timentina) en la eficiencia de transformación. A las pocas semanas de la infección, antes de que los explantos empezaran a regenerar, se observó un cambio de aspecto de los mismos, volviéndose marrones, rizándose en ocasiones, y empezando a producir un callo obscuro, en la zona de corte que, ocasionalmente, viraba hacia verde. Los primordios se desarrollarían a partir del callo verde o verde-marrón, de textura compacta, producido inicialmente en la zona de la estípula y en los bordes de los foliolos, evolucionando posteriormente hacia brotes. En función del antibiótico bactericida empleado, se encontraron diferencias en términos de capacidad de regeneración y precocidad en la respuesta de los explantos inoculados con A. tumefaciens (Figura 17). 0 5 10 15 20 Cefotaxima Carbenicilina Timentina Frecuencia de transformación (%) Antibiótico 8 semanas 16 semanas Figura 17. Frecuencia de transformación, calculada como porcentaje de explantos con brotes a las 8 y 16 semanas de la inoculación con Agrobacterium tumefaciens , en presencia de distintos antibióticos para detener el crecimiento bacteriano. Capítulo III 58 Aunque con carbenicilina se obtuvo una mejor respuesta al inicio de los cultivos, los resultados en capacidad de regeneración, fueron claramente superiores a partir de las 16 semanas en presencia del antibiótico timentina, alcanzandose una frecuencia de transformación superior al 17%. Por el contrario, en presencia de cefotaxima en el medio de selección, no se obtuvo regeneración hasta pasadas las 12 semanas. Este antibiótico resultó ser muy eficiente para detener el sobrecrecimiento de Agrobacterium tumefaciens, pero afectaba negativamente a la capacidad de regeneración. Contrariamente a lo que se había observado previamente en el cv. Chandler (El Mansouri, 1997; Barceló y col., 1998), donde apenas si aparecían quimeras o escapes durante la transformación, éstas se observaron frecuentemente en el cv. Carisma desde las primeras semanas de selección en presencia de 25 mg.l-1 de kanamicina. Los escapes se identificaban como tallos regenerados de aspecto blanquecino mientras que las quimeras aparecían como tallos verdes con presencia de hojas blancas. A las 8 semanas de cultivo, el 7% de los brotes regenerados en el medio suplementado con carbenicilina eran falsos positivos. Por el contrario, este porcentaje fue solo del 1% en el medio suplementado con timentina. Todos los escapes y quimeras eran eliminados una vez detectados, manteniéndose en cultivo sólo los brotes con crecimiento vigoroso y totalmente verdes. Los brotes regenerantes debían alcanzar un tamaño entre 0,5-1 cm de longitud antes de ser separados del tejido madre y micropropagados en medio N30K 0,47 mg.l-1 kinetina. Para asegurar la eliminación de falsos positivos, se siguió una estrategia de selección progresiva. Los brotes regenerados en 25 mg.l-1 kanamicina fueron aislados y micropropagados en presencia de 50 mg.l-1 de kanamicina, manteniéndose en esta concentración durante 3 Regeneración y transformación 59 subcultivos. Posteriormente, se disminuyó la dosis del antibiótico hasta 25 mg.l-1 previamente a su aclimatación. Todos los tallos aislados y cultivados de esta manera sobrevivieron a estos niveles de agente de selección. Las plantas enraizaron en el mismo medio de micropropagación suplementado con el antibiótico kanamicina y el utilizado para contener el crecimiento de Agrobacterium . Se obtuvieron un total de 27 líneas transgénicas independientes, que fueron aclimatadas y transferidas al invernadero para su análisis posterior. El análisis mediante PCR mostró la naturaleza transgénica de todas las líneas evaluadas, como se observa en la amplificación de una banda de 220pb correspondiente al gen nptII en ADN aislado de hojas de las líneas transgénicas (Figura 18). Figura 18. Amplificación por PCR de un fragmento de 220 pb del gen nptII en ADN genómico aislado de hojas de las líneas transgénicas de Carisma. P: plásmido pGUSINT; C: ADN de hojas control. Líneas transgénicas: cada pocillo corresponde con ADN de una línea transgénica independiente. III.3.4 Aclimatación y evaluación morfológica de las líneas transgénicas de Carisma Tras su aclimatación y endurecimiento en invernadero confinado, se procedió a realizar la evaluación morfológica de las 27 líneas transgénicas Capítulo III 66 La tendencia en la producción de frutos a lo largo de las distintas generaciones no fue la misma en todos los clones; así, mientras que en algunos casos (1G, 5G, 9G, 20G, 23G, 24G, 29G, 30G) se observó una disminución desde la generación madre a la primera generación vegetativa, incrementándose en la F2 hasta alcanzar los valores más elevados, en otros, la producción aumentó gradualmente desde la F0 a la F2 (19G, 25G, 26G, 28G, 49G y control macropropagado). En otro grupo de clones, la mayor fructificación se obtuvo en la F0 (11G, 16G, 27G, 31G, 40G, 41G, 42G), y en todos ellos, ésta descendía desde la F0 a la F1, aumentando después en la última generación, pero sin llegar a superar a la producción obtenida en F0. Otras veces, se observó un aumento desde la generación madre a la F1, para luego disminuir (18G, 21G, 37G, 39G, 43G, 44G y control micropropagado). En la Figura 20 se muestra la distribución de frecuencias de los valores de producción relativa de las líneas transgénicas obtenidas con respecto a la producción de los controles macro y micropropagado. El 42,3% de las líneas transgénicas, 11 de 26, dieron una producción similar a los controles micro y macropropagados. Por el contrario, sólo la línea 44G, 3,8% del total de líneas evaluadas, dio una producción inferior al 25% de la obtenida en los controles. Regeneración y transformación 67 0 2 4 6 8 10 0-25 25-50 50-75 75-100 100-125 125-150 Líneas transgénicas (%) Producción relativa (% respecto al control macro y micropropagado) % respecto al C micropropagado % respecto al C macropropagado F Fi ig gu ur ra a 2 20 0. . Producción relativa en clones transgénicos de fresa, cv. Carisma, con respecto a la producción de los controles macro y micropropagado. En la Tabla 10 se muestran los datos de peso medio del fruto en las distintas líneas transgénicas. Los valores medios más altos los alcanzaron los clones 24G, 27G, 29G, 42G, control micropropagado y control macropropagado. Los clones más productivos, 9G, 11G, 27G, 42G y control micropropagado, presentaron un peso medio de fruto alto, aproximadamente 7 g o superior; los clones con una producción intermedia entre ambos controles, 16G, 20G, 23G, 26G, 29G, a excepción de la línea 40G, daban frutos con un peso medio entorno a los 6 g; en general, los clones que menos fructificaban produjeron frutos con un peso medio menor, en torno a 3-4 g, a excepción del clon 24G que con una producción media-baja, dio frutos con un peso medio de 8,9 g, o los clones 1G, 37G, y 39G que dieron frutos entre 6,3 y 6,8 g. Capítulo III 68 Tabla 10. Peso medio de fruto (g) en clones transgénicos de fresa, cv. Carisma, evaluados en invernadero de confinamiento. F0: plantas madre. F1 y F2: generaciones obtenidas mediante estolonado. Peso (%): Valor medio del peso del fruto expresado como porcentaje del control micropropagado. Peso de fruto (g) Línea regenerante F0 F1 F2 Media Peso (%) C Micro 7,4 7,7 10,8 8,6±1,9 100 C Macro 7,5 7 8,8 7,8±0,9 91,0±9,6 1G 4,6 8,5 7,5 6,8±2,0 80,2±25,9 5G 2,9 3,2 4,2 3,4±0,6 39,9±1,6 9G 6,7 6,5 7,5 6,9±0,5 81,3±10,8 11G 7,8 6,8 6,5 7,0±0,7 84,4±22,7 16G 6,9 7,3 8,3 7,5±0,7 88,0±9,6 18G 3 5,4 3,3 3,9±1,3 46,7±20,5 19G 3,6 4,1 5,6 4,4±1,0 51,3±2,7 20G 7,6 6,7 5,9 6,7±0,8 81,1±24,3 21G 5,0 5,6 5 5,2±0,3 62,2±13,6 23G 5,1 5,7 5,6 5,4±0,3 64,4±11,3 24G 9,2 7,2 10,4 8,9±1,6 104,5±17,1 25G 2,8 4,9 4,9 4,2±1,2 48,7±13,4 26G 6,4 6,9 7,1 6,8±0,4 80,5±12,8 27G 10,0 7,1 7,0 8,1±1,7 97,5±35,3 28G 5,0 5,2 7,1 5,7±1,2 66,3±0,8 29G 9,40 7,0 8,9 8,4±1,3 100,1±23,4 30G 5,6 4,0 5,0 4,8±0,8 57,4±15,4 31G 5,4 5,1 5,6 5,4±0,3 63,9±10,8 37G 7,1 8,2 4,5 6,6±1,9 81,3±34,7 39G 7,1 6,5 5,5 6,3±0,8 76,8±23,2 40G 6,7 6,5 8,2 5,0±1,0 83,5±7,1 41G 4,8 -- 5,0 3,2±0,2 36,8±33,1 42G 9,3 9,6 7,9 8,9±0,9 107,7±29,9 43G 4,6 5,4 4,5 4,8±0,5 58,1±15,0 44G 3,0 5,2 1,2 3,1±2,0 39,9±28,3 49G 5,4 10,2 8,9 5,2±2,5 95,5±31,7 Regeneración y transformación 69 A pesar de estas variaciones, no se encontraron diferencias significativas en el peso entre los controles y las distintas líneas. Tampoco se observaron diferencias significativas cuando se analizó el peso relativo con respecto al control micropropagado. En la Figura 21 se observa el peso relativo del fruto expresado como porcentaje con respecto al obtenido en los controles macro y micropropagados. La mayoría de las líneas dieron frutos con un peso situado en los bloques intermedios entre 50-75% y 75-100%. 0 5 10 15 0-25 25-50 50-75 75-100 100-125 Líneas transgénicas (%) Peso relativo (% respecto al C macro y micropropagado) % respecto al C micropropagado % respecto al C macropropagado Figura 21. Peso relativo de fruto con respecto a los controles macro y micropropagados en clones transgénicos de fresa, cv. Carisma. En cuanto a la morfología del fruto, prácticamente todos los clones, incluyendo los controles micro y macropropagados, presentaron filodios en los frutos recolectados, en alguna de las generaciones, exceptuando los clones 30G y 49G, si bien ambas líneas fueron muy poco productivas. En el primer año de evaluación (F0), los filodios se observaron en el 19% de las líneas Capítulo III 70 transgénicas pero no en los controles, apareciendo estas anormalidades principalmente en el mes de Mayo, algunos incluso en Junio, pero nunca en Julio. Durante la evaluación de la F1 y F2, los filodios se observaron en el 80 y 85% de las líneas transgénicas, respectivamente. En ambas evaluaciones aparecieron frutos con filodios en los dos controles. La recolección de frutos en la F1 y F2 se llevó a cabo desde Abril hasta Junio, apareciendo frutos con filodios en Abril y Mayo, pero muy escasamente en Junio. Las líneas transgénicas 1G, 5G, 16G, 31G y 43G destacaron por presentar frutos con filodios durante las 3 evaluaciones y, especialmente, la línea 43G por la abundancia de los mismos. Por otro lado, en 12 de las 26 líneas analizadas se encontraron, en alguno de los años evaluados, otras anomalías como frutos deformes, pulpas anormales y poco hidratadas, aquenios atrofiados y mal distribuidos, a veces brotados. Estas anomalías también aparecieron en algunos frutos del control micropropagado durante las dos primeras generaciones, pero no se observaron en la F2 de ninguno de los controles. Cuando se analizan los datos por años, el porcentaje de líneas transgénicas que presentaron alguna de estas anormalidades fue del 28% durante la F0 y F2 y algo más baja, 11%, en la F1. A continuación se muestran imágenes de frutos transgénicos de Carisma con filodios u otras anomalías (Figura 22). Regeneración y transformación 71 A B C D E F Figura 22. Frutos transgénicos de fresa, cultivar Carisma, presentando diferentes anormalidades. A: fruto con filodios, deformado en la base y en el extremo distal. B: fruto aberrante, con el receptáculo abierto y aquenios brotados. C-F: frutos multilobulados, con filodios. Capítulo III 72 III.4 Discusión III.4.1 Regeneración adventicia El balance hormonal es un factor clave en la regulación de la morfogénesis in vitro (Murashige, 1974). Nuestros resultados muestran claramente que en fresa, las auxinas juegan un papel clave en la diferenciación de brotes, dado que no se observó regeneración en ausencia de este regulador. Nehra y Stushnoff (1989) también señalan la importancia de la auxina en la regeneración de brotes de fresa, aunque ellos usaron AIA en lugar de AIB. Nuestros estudios comparativos entre ambas auxinas en el cultivar Chandler, no revelaron diferencias significativas, aunque se obtuvieron resultados ligeramente superiores en presencia de AIB, lo que confirma las observaciones previas de Liu y Sandford (1988). Para un nivel constante de auxinas de 0,5 mg.l-1, incrementos en la concentración de BA hasta 2 mg.l-1 mejoraron la formación de colonias de tallos. Además, el balance exógeno de citoquininas/auxinas permitió el mantenimiento de la capacidad de regeneración de brotes a través de los subcultivos. Las diferencias en la capacidad de regeneración bajo distintas combinaciones hormonales, podrían ser consecuencia de los niveles homonales endógenos presentes en los distintos tejidos (Nehra y Stushnoff, 1989). Por otro lado, se ha visto que una preincubación en condiciones de obscuridad mejora la morfogénesis en varios géneros, como Cucumis (Punja y col., 1990), Nicotiana (Chandler y col., 1987) y Malus (Fasolo y col., 1989). Este tratamiento parece disminuir la oxidación fenólica de los explantos (George, 1993). Nuestros resultados coinciden con los de Liu y Sandford (1988), quienes también recomendaron un pretratamiento de obscuridad para Regeneración y transformación 73 incrementar la regeneración de brotes en Fragaria x ananassa . Asimismo, Debnath (2006) observó este mismo efecto al utilizar como explantos discos de hoja, pétalos y peciolos. La morfogénesis se incrementa drásticamente por la luz, especialmente a irradiancia entre baja y moderada (10-40 µmol.m-2.s-1) (Murashige, 1974), mientras que niveles superiores de irradiancia podrían tener un efecto inhibitorio debido a la inactivación de la auxina (Fridborg y Eriksson, 1975) o al incremento en la producción de compuestos fenólicos (Andersen y Kasperbauer, 1973). En fresa, Nehra y Stushnoff (1989) recomendaban niveles bajos de irradiancia (12,5 µmol.m-2.s-1) para la regeneración de brotes en el cultivar Redcoat, observando que aumentos progresivos de la misma se traducían en una disminución del porcentaje de discos regenerantes, así como del número de brotes producidos por disco de hoja, llegando incluso a no regenerar bajo niveles de irradiancia de 125 µmol.m-2.s-1. Estos autores explican estos resultados como consecuencia de la interacción entre los reguladores de crecimiento y el nivel de irradiancia en el proceso de regeneración, tal y como habían observado Parthier y col. (1987). Del mismo modo, Nehra y col. (1990c) sólo obtuvieron brotes a partir de callos procedentes de hojas in vitro , cuando el material se incubaba también a baja irradiancia (12,5 µmol. m-2.s-1). Sin embargo, en nuestro caso, y en ambos cultivares, se obtuvieron mejores resultados cuando se empleó una irradiancia moderada, en el rango de 20-40 µmol. m-2..s-1. Respecto al origen del explanto, Liu y Sandford (1988), trabajando con el cultivar Allstar, encontraron diferencias en los requerimientos hormonales para tejidos de hoja derivados de plantas creciendo in vivo o in vitro . En nuestro caso, no se hizo una comparación directa entre las dos fuentes de Capítulo III 74 explanto; sin embargo, los resultados obtenidos en el medio de regeneración optimizado para discos de hoja de plantas creciendo en invernadero fue similar al obtenido cuando los discos de hoja se obtuvieron a partir de material micropropagado. Para evitar problemas de contaminación, en la transformación se utilizaron discos de hoja de brotes creciendo in vitro . En cuanto al tipo de explanto, experimentos preliminares comparando disco de hoja y hoja completa en Chandller, mostraron una mejor respuesta de la hoja completa, por lo que este material fue el que se utilizó posteriormente en Carisma para los experimentos de transformación. El sistema de regeneración adventicia desarrollado en este trabajo fue bastante eficiente, mostrando una baja dependencia del genotipo. No sólo se ha obtenido una alta tasa de regeneración tanto en el cv. Chandler como en Carisma, sino que además, este protocolo se ha utilizado con éxito para la regeneración in vitro de otros cultivares como Rosa Linda, Diamante, Gaviota y Sweet Charlie, con tasas de regeneración entre el 58-71% (Youssef y col., 2004). III.4.2 Valoración agronómica de los regenerantes de Carisma La mayoría de las líneas regenerantes de Carisma mostraron una superficie de la parte aérea inferior al control micropropagado. Además, 2 de las 16 líneas evaluadas, un 12,5%, tuvieron un fenotipo enano. Contrariamente a estos resultados, Biswas y col. (2009), al obtener plantas de fresa a partir de organogénesis directa e indirecta de hoja, embriogénesis somática indirecta también en explantos de hoja y cultivo de ápices caulinares, observaron, en la mayoría de los casos, un vigor superior en el material procedente de cultivo in Regeneración y transformación 75 vitro frente a las plantas control, las cuales se habían obtenido mediante estolonado. Aunque no hubo grandes diferencias en la longitud de los peciolos en Carisma, dos clones tuvieron peciolos de mayor longitud que el control micropropagado. Estos resultados coinciden con los de Youssef (2006), quien al estudiar las características fenotípicas de diez clones independientes regenerados a partir de disco de hoja en los cultivares de fresa Sweet Charlie, Rosa Linda y Gaviota, y siguiendo el mismo protocolo utilizado en este trabajo, no encontró diferencias significativas entre los clones regenerados y el control micropropagado. Nehra y col. (1994) observaron que en el cultivar Redcoat, las plantas propagadas in vitro tenían peciolos significativamente más largos que las propagadas por estolones, mientras que en Veestar no había diferencias. Nuestros resultados coinciden con las observaciones de estos autores para el cultivar Veestar, ya que se obtuvieron diferencias según la línea estudiada. Biswas y col. (2009) también obtenían diferencias fenotípicas en las plantas obtenidas in vitro ; así, los peciolos de las hojas fueron más cortos y gruesos en plantas derivadas de brotes micropropagados, brotes procedentes de organogénesis directa e indirecta, así como de brotes derivados de embriones somáticos, frente a los de plantas control producidas mediante estolonado, siendo también normalmente el color de las hojas más claro en estas plantas. Respecto a la capacidad de estolonado, no se observaron resultados especialmente relevantes. Carisma es una variedad caracterizada por producir un elevado número de estolones (Marsal y col., 2000); sin embargo, nuestros resultados no confirman esta observación, pues los valores obtenidos fueron bajos incluso en el control micropropagado. Aunque no se obtuvieron Capítulo III 82 (James y col., 1990; Nehra y col., 1990a,b; Jelenkovic y col., 1991; Mathews y col., 1995). Utilizando el protocolo de regeneración puesto a punto en este trabajo, Barceló y col. (1998) obtuvieron plantas transgénicas de fresa del cv. Chandler. En esa investigación, el uso de material micropropagado en presencia de kinetina como fuente de explantos fue clave para el éxito del proceso, obteniéndose una frecuencia de transformación del 4,2%. En el presente trabajo, usando explantos de hoja completa derivados de brotes del cv. Carisma proliferando en medio suplementado con kinetina y extendiendo el periodo de precultivo a 10 días, se obtuvieron tasas de transformación superiores. Un pretratamiento de los explantos con kinetina también mejoraba la frecuencia de transformación en tomate (Chy y Philips, 1987). En los cultivares de fresa Jonsok e Hiku, Sorvari y col. (1993) mostraron cómo un pretratamiento de la fuente de explantos con otra citoquinina, BA a 3 mg.l-1, incrementó la respuesta organogénica. En otras especies, como Pinus pinaster (David y col., 1982) y Morus alba (Oka y Ohyna, 1981) se obtuvieron resultados similares. En nuestro caso, brotes de fresa proliferando durante 34 subcultivos en presencia de BA estaban miniaturizados y desarrollaban ligeros síntomas de hiperhidricidad, mientras que aquéllos que proliferaron en presencia de kinetina tenían mejor aspecto. Probablemente, en el último caso, la población de células competentes se incrementa y, como indicaba Potrykus (1991), esto puede resultar en una mejora de la tasa de transformación. McHughen (1993) señaló también la importancia de utilizar un periodo adecuado de precultivo para obtener una transformación eficiente. Incrementos en la duración del periodo de precultivo incrementaban la proporción de células competentes y, por tanto, la probabilidad de que Agrobacterium transfiriera su T-ADN (Nehra y col., 1990b). Obviamente, hay una mayor Regeneración y transformación 83 probabilidad de que ocurran escapes, pero eliminar los antibióticos durante los primeros estados de la organogénesis parece ser importante, ya que éstos interfieren incluso con el desarrollo de las células transformadas (Michelmore y col., 1987; James y col, 1989). El cultivo de explantos en el medio de selección justo después del cocultivo es necesario para impedir la proliferación de sectores no transgénicos. La alta sensibilidad de los tejidos de fresa a kanamicina ha sido observada por varios autores (Nehra y col., 1990b; Barceló y col., 1998; Mathews y col., 1998; Schestibratov y Dolgov, 2005; Husaini y col., 2011). Así, Nehra y col. (1990b), al transformar explantos de disco de hoja del cultivar Redcoat, comprobaron que la kanamicina inhibía la capacidad de regeneración a concentraciones incluso de 25 mg.l-1. De hecho, raramente observaron organogénesis al colocar los explantos inoculados con Agrobacterium inmediatamente después del cocultivo en presencia de kanamicina, por lo que utilizaban un precultivo durante 10 días en medio de regeneración con cefotaxima y carbenicilina únicamente, antes de transferir los explantos al mismo medio, pero suplementado también con kanamicina (50 mg.l-1). Sin embargo, nuestros resultados difieren de los suyos, ya que sí se observó regeneración al colocar los explantos directamente tras el cocultivo en el medio de selección con 25 mg.l-1 kanamicina. El riesgo de obtener quimeras, al usar como explanto estípulas, ha sido señalado en varias ocasiones (Monticelli y col., 2002; Chavali y col., 2003). En nuestros experimentos de transformación en Carisma, dado que la hoja completa contenía estípulas, tratamos de eliminar los posibles meristemos presentes en las mismas mediante cortes en su base con bisturí; aún así, la aparición de quimeras en los brotes transformados fue frecuente, a pesar de Capítulo III 84 la alta sensibilidad de este material a la kanamicina. Para solucionar este problema, se siguió un procedimiento de selección progresiva, donde los brotes regenerados fueron aislados y micropropagados en presencia de 50 mg.l-1 de kanamicina durante al menos 3 subcultivos. Siguiendo este procedimiento, todas las líneas que finalmente sobrevivieron a esta selección progresiva eran transgénicas, como lo demuestra la amplificación de un fragmento del gen nptII en ADN genómico. Adicionalmente, se llevaron a cabo ensayos histoquímicos de actividad GUS en algunas de las líneas, observándose coloración azul en el tejido. Por otro lado, Nehra y col. (1990a) encontraban ciertas dificultades para enraizar los brotes transgénicos obtenidos en presencia de kanamicina (25 mg.l-1). Mathews y col. (1995) sugerían que la falta de esta capacidad podía deberse a la presencia de una alta proporción de células no transformadas en los brotes obtenidos, utilizando el enraizamiento en presencia de kanamicina como marcador de selección de brotes transgénicos. En nuestro caso, tras seguir el procedimiento de selección progresiva, los brotes transgénicos obtenidos enraizaban sin dificultad en presencia de este antibiótico, lo que descarta la presencia de material quimérico. Los resultados obtenidos en Carisma muestran que el antibiótico empleado para contener el sobrecrecimiento de Agrobacterium también era importante en la transformación, obteniéndose los mejores resultados al utilizar timentina, lo cual confirmaba las observaciones previas de Husaini (2010). Carbenicilina, cefotaxima y timentina, en el rango 250-500 mg.l-1, son los antibióticos más frecuentemente utilizados para eliminar o inhibir el crecimiento de Agrobacterium tras la infección de los explantos. Sin embargo, existen numerosos trabajos que muestran un efecto, positivo o negativo, de Regeneración y transformación 85 estos antibióticos en el proceso de regeneración (Padilla y Burgos, 2010). Se ha sugerido que estos antibióticos o parte de los mismos tienen actividad hormonal (Holford y Newbury, 1992; ur Rahman y col., 2004; Shehata y col., 2010). En el caso concreto de la fresa, concentraciones de cefotaxima de 500 mg.l-1 inhiben la regeneración (Husaini, 2010), lo que podría explicar la baja tasa de transformación obtenida en Carisma al utilizar este antibiótico. De manera similar a lo observado en este trabajo, la timentina es más efectiva en la recuperación de plantas transgénicas en otras especies (Tang y col., 2000; Palomo-Ríos y col., 2012). El protocolo de transformación desarrollado en Chandler (Barceló y col., 1989) y aplicado a Carisma, permitía obtener una frecuencia de transformación del 17%; por ello, aunque la falta de vigor y la disminución de la capacidad de regeneración son unos de los principales problemas en la obtención de cultivos transgénicos (Kaeppler y col., 2000), el protocolo desarrollado puede ser útil para ser usado en cualquier aproximación biotecnológica enfocada a la mejora de este cultivar. III.4.4 Evaluación morfológica de las líneas transgénicas de Carisma De manera similar a lo observado en el estudio previo del comportamiento agronómico de las líneas regenerantes de Carisma, se observó una gran variabilidad en el área de la planta entre las distintas líneas transgénicas, así como entre las generaciones evaluadas. Sin embargo, tan sólo una línea mostró escaso crecimiento, con valores de área media en torno al 50% del obtenido en el control. En el estudio de las líneas regenerantes, 2 líneas de las 16 evaluadas mostraron un fenotipo enano. Considerando los valores medios de todas las líneas transgénicas analizadas, el área de planta Capítulo III 86 fue un 87% del obtenido en las plantas micropropagadas. Un valor similar, 82%, se observó al comparar la media de todas las líneas de regeneración adventicia con respecto a su control micropropagado. En un estudio similar con plantas transgénicas del cv. Chandler, llevado a cabo por JiménezBermúdez (2005), no se observaron plantas enanas entre las diferentes líneas independientes transformadas con el gen marcador GUS. Respecto a la producción, se observó una gran variabilidad entre las distintas líneas y los controles, así como en su comportamiento a lo largo de las generaciones. No obstante, los resultados muestran como en la mayoría de ellas, junto al control macropropagado, la producción aumentó en la segunda generación vegetativa. Considerando la producción media durante las 3 generaciones evaluadas, 14 de los 20 clones transgénicos, un 53%, produjo menos que el control micropropagado. Este valor fue muy similar al obtenido en las líneas regenerantes, donde 7 de las 16 líneas, 43,7%, fueron poco productivas. La disminución de la producción en las líneas transgénicas fue debida principalmente a una disminución en el peso medio del fruto. Así, se observó una alta correlación positiva entre producción y tamaño de fruto (coeficiente de correlación de Pearson de 0.751, significativo a P=0.01). Sin embargo, especialmente en las líneas muy poco productivas, también se observó una reducción en el número de frutos por planta. Cordero de Mesa y col. (2002) observaron que el promotor CaMV35S puede inducir una alta expresión del gen GUS en tejido reproductivo de fresa. Sin embargo, no se ha descrito que este gen marcador interfiera con la fructificación; probablemente, la disminución de la fructificación en estas líneas puede deberse a una reducción del vigor de la planta. Los resultados obtenidos en las plantas transgénicas de Carisma son similares a los descritos por Regeneración y transformación 87 Jiménez-Bermúdez (2005) en el cv. Chandler, donde aproximadamente el 50% de las líneas transformadas con el gen GUS produjeron menos que el control, obteniéndose incluso 2 líneas que apenas produjeron frutos. De acuerdo con esta autora, la disminución de la producción en esas líneas transgénicas se puede achacar al proceso de regeneración adventicia in vitro . Por otro lado, de manera similar a lo descrito para las líneas regenerantes, la aparición de filodios en frutos maduros de las líneas transgénicas de Carisma fue muy frecuente, observándose también en los frutos procedentes de los controles micro y macropropagados. Esto induce a pensar que su aparición puede estar ligada al propio genotipo más que al proceso de regeneración o transformación. Además, se observó una mayor aparición de los mismos al principio de la época de fructificación, lo cual podría indicar también una relación con la época del año y las condiciones ambientales (Ariza, 2009). Respecto a otras anomalías observadas en los frutos, todas ellas tuvieron en común que aparecían en clones de baja productividad, y, aunque en un principio se observaron algunas deformaciones en frutos del control micropropagado, éstas desaparecieron en las siguientes generaciones, lo cual podría explicarse como consecuencia de variaciones somaclonales inducidas por el cultivo in vitro , que puede producir cambios fenotípicos no heredables (Kaeppler y col., 2000). La inserción de un transgén en el genoma de una planta puede acarrear pérdidas o alteraciones en la expresión de otros genes, lo que se denomina efecto de posición, con las consiguientes variaciones en el fenotipo o en el comportamiento agronómico de las plantas obtenidas (Miki y col., 2009). Esto se ha utilizado para la inducción de mutagénesis insercional en Capítulo III 88 diferentes especies, entre ellas la fresa (Oosumi y col., 2006). Además de los efectos de posición, se ha demostrado que los genes de selección pueden inducir efectos pleiotrópicos en el transcriptoma de la planta transgénica (Miki y col., 2009). Estos efectos no deseados parecen ser abundantes cuando se utiliza el gen de selección bar , de resistencia al herbicida bialaphos (Miki y col., 2009); sin embargo, El Quakfoui y Miki (2005) no encontraron alteraciones transcriptómicas en plantas de Arabidopsis que expresaban los genes nptII y GUS . Globalmente, el análisis agronómico de las líneas transgénicas de Carisma arrojó resultados similares a los descritos para las líneas de regeneración adventicia, observándose unas tasas similares de variación fenotípica tanto en el crecimiento de la planta como en la producción o la calidad del fruto. Esto sugiere, por tanto, que la mayoría de las variaciones fenotípicas observadas no son debidas ni a la inserción de los transgenes ni al proceso de transformación genética, que supone un periodo de cultivo in vitro más prolongado, sino a variaciones inducidas por el proceso de regeneración adventicia. III.V Conclusiones Se ha puesto a punto un sistema de regeneración adventicia de plantas de fresa a partir de disco de hoja. Los resultados obtenidos indican que las auxinas son cruciales en la morfogénesis de la fresa. Pero además de la relación auxinas/citoquininas, los factores medioambientales, como son una preincubación en condiciones de oscuridad y posterior cultivo a irradiancia moderada, juegan un papel importante en el proceso. Este protocolo de regeneración muestra una baja dependencia del genotipo, obteniéndose tasas de regeneración adecuadas en los cultivares Chandler y Carisma. Regeneración y transformación 89 Las plantas regeneradas del cv. Carisma mostraron una variabilidad fenotípica importante, tanto en el crecimiento vegetativo, la mayoría de ellas tenían una superficie de la parte aérea inferior a la del control micropropagado, como en la capacidad de fructificación, que también disminuyó en casi la mitad de las líneas evaluadas. La disminución de la producción se debió fundamentalmente a una reducción del peso del fruto. El sistema de regeneración adventicia de fresa puesto a punto en este trabajo se utilizó para optimizar la transformación genética del cv. Carisma mediada por Agrobacterium tumefaciens . El antibiótico utilizado para controlar el crecimiento bacteriano tuvo un efecto importante en el éxito de la transformación, debido probablemente a que estos compuestos pueden interferir en el proceso de regeneración. Así, los mejores resultados se obtuvieron con el uso de timentina 100 mg.l-1, alcanzándose una frecuencia de transformación del 17%. Por otro lado, el explanto utilizado para la transformación, hoja completa, puede dar lugar a la aparición de quimeras en fases tempranas de la transformación, por lo que es necesario aplicar una selección progresiva para evitar la recuperación de falsos positivos. En este procedimiento de selección, los tallos regenerados en 25 mg.l-1 de kanamicina son micropropagados durante varios subcultivos en presencia de 50 mg.l-1 de kanamicina antes de su aclimatación. Al evaluar morfológicamente las líneas transgénicas obtenidas, y como ocurrió con los somaclones de Carisma, se observó una gran variabilidad tanto en el área de la planta como en la capacidad de fructificación. La mayoría de las líneas tenían un área de planta inferior al control, y un 53% de ellas produjeron menos que el control micropropagado. Los frutos transgénicos, especialmente en las líneas menos productivas, presentaron una Capítulo III 90 gran variedad de anormalidades fenotípicas, siendo la más frecuente la formación de filodios. Esta anomalía, sin embargo, puede ser consecuencia del propio genotipo, ya que también se observaron filodios frecuentemente tanto en frutos de somaclones como de controles micropropagados. La variabilidad observada en las líneas transgénicas fue de naturaleza similar a la generada en plantas procedentes de distintos eventos de regeneración, por lo que estas diferencias fenotípicas parecen estar más relacionadas con el proceso de regeneración adventicia en sí, que con el proceso de transformación, que incluiría efectos de posición debidos a la inserción del transgen. En consecuencia, dada la alta variabilidad inducida por el cultivo in vitro en Carisma, la utilización de la transformación genética para la mejora de este cultivar requiere obtener un número elevado de líneas transgénicas para elegir aquéllas con características morfológicas y capacidad de producción similares al control. CAPÍTULO IV Caracterización del papel del gen Fxacad1 , que codifica una cinamil alcohol deshidrogenasa, en el proceso de maduración del fruto de fresa Capítulo IV 98 tamaño de los frutos obtenidos anotándose el largo y ancho máximo en mm de los mismos con ayuda de un calibrador. IV.2.3 Extracción de ARN El ARN total se aisló de frutos control y transgénicos, en estadio rojo maduro, siguiendo el protocolo de Asif y col. (2000). Previamente, los aquenios fueron eliminados manualmente, utilizándose solamente el receptáculo para la extracción y purificación del ARN. El ARN obtenido se trató con RNase free DNase I (Invitrogen) y se purificó mediante el kit RNeasy Mini (Qiagen). La concentración de ARN y su pureza se evaluaron mediante el espectrofotómetro NanodropTM ND-1000 (Thermo Scientific) y por electroforesis en geles de agarosa al 1 %. IV.2.4 Análisis de expresión de Fxacad1 mediante PCR cuantitativa a tiempo real (QRT-PCR) Los análisis de expresión del gen Fxacad1 se realizaron mediante QRT-PCR utilizando el sistema iCycler (BioRad), como se describe en Benítez-Burraco y col. (2003). Las secuencias de los primers para la amplificación del gen Fxacad1 fueron 5’-GTTGGAGACAGAGTCGGTGTTG-3’ y 5´-CATCAAGAGGCAAGTTGTCTGG-3’. Cada reacción se realizó por triplicado y los valores de Ct se normalizaron con respecto al valor de Ct correspondiente al gen interespaciador 26S-18S RNA de fresa (BenítezBurraco et al., 2003; Cumplido-Laso et al., 2012; Molina-Hidalgo et al., 2013). Estos valores fueron usados posteriormente para determinar la expresión relativa del gen Fxacad1 de acuerdo con Pedersen (2001). Utilizándose como gen de control el gen interespaciador 26S-18S (primers: Gen Fxacad1 99 5’-ACCGTTGATTCGCACAATTGGTCATCG-3’ y 5’-TACTGCGGG TCGGCAATCGGACG-3’), debido a su expresión constitutiva en fresa. IV.2.5 Análisis estadístico Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS (versión 15). Previamente a la realización del ANOVA, se analizó la homogeneidad de varianzas mediante el test de Levene. La separación de medias se llevó a cabo con el test de Tukey, en el caso de varianzas homogéneas, o T2Tamhane, para las varianzas no homogéneas. En todos los casos se aplicó una P=0,05. IV.3. Resultados IV.3.1 Obtención de plantas transgénicas Para la generación de las plantas transgénicas de fresa, se inocularon unos 300 explantos de discos de hoja con A. tumefaciens AGL1 portando el plásmido PK7WG2, conteniendo la secuencia codificante del gen Fxacad1 . Tras varios meses de cultivo, se obtuvieron más de 100 líneas transgénicas independientes en medio de selección suplementado con 25 mg.l-1 de kanamicina. La frecuencia final de transformación fue del 34,3%, estimada como el número de total de explantos que regeneraron en medio de selección a las 20 semanas de cultivo dividido por el número de explantos inoculados. Los brotes obtenidos fueron micropropagados, al menos durante tres subcultivos, a concentraciones superiores de kanamicina, 50 mg.l-1, para asegurar la ausencia de escapes. Capítulo IV 100 De todas las líneas transgénicas independientes obtenidas se seleccionaron 24 en base a su aspecto y capacidad de multiplicación in vitro, aclimatándose posteriormente en alveolos con una mezcla de substrato 1 y perlita, en túnel de aclimatación (Figura 2). AB Figura 2. A: aspecto de una colonia de brotes adventicios regenerados en medio N30K suplementado con 25 mg.l-1 de kanamicina, a partir de discos de hoja inoculados con el plásmido pK7WG2 conteniendo la secuencia codificante del gen Fxacad1 . B: plantas de fresa transformadas con el gen Fxacad1 , aclimatadas en bandejas de alveolos con una mezcla de substrato 1 y perlita. IV.3.2 Primera evaluación fenotípica de las líneas transgénicas Tras su aclimatación, las plantas transgénicas se mantuvieron en invernadero para su endurecimiento junto a un control micropropagado del cv. Chandler (Figura 3A). En general, no se observaron alteraciones morfológicas en las líneas transgénicas en cuanto al crecimiento, porte, número de hojas o morfología foliar, siendo el aspecto general de las plantas bueno, presentando un color verde intenso y vigor adecuado. Posteriormente, se trasplantaron a macetas de mayor tamaño, y se colocaron en invernadero de confinamiento (Figuras 3B, 3C) para realizar su caracterización morfológica. Gen Fxacad1 101 ABC Figura 3. Cultivo en invernadero de las plantas de fresa transformadas con el gen Fxacad1 , para su evaluación morfológica. A: aspecto de las plantas tras su aclimatación, cultivadas en macetas de 9 cm de diámetro. B: aspecto de las plantas en fase de producción, cultivadas en macetas de 25 cm de diámetro. C: imagen de la línea Cad9 durante su evaluación morfológica. La producción de frutos durante el primer año de muestreo fue muy irregular. La fructificación fue muy escasa en 7 de las 25 líneas analizadas; tres de ellas (Cad30, 39 y 120) no produjeron ningún fruto, mientras que otras 4 líneas (Cad7, 8, 26 y 103) produjeron menos de 10 frutos por planta. El resto de líneas dieron una producción similar a la de los controles procedentes de plantas micropropagadas. Las características morfológicas de los frutos rojos durante el primer año en invernadero de confinamiento (generación F0), se muestran en la Tabla 1. Siete líneas, Cad13, 14, 20, 31, 32, 101 y 111, dieron frutos con un peso ligeramente inferior al de los frutos control de plantas no transformadas. En cuanto al tamaño de fruto, el largo siempre fue inferior al del control en todas la líneas evaluadas, produciendo además las líneas 31 y 111, frutos con el largo y ancho también inferiores al control. Los sólidos solubles obtenidos en cinco líneas (6, 13, 24, 25 y 31), dieron un contenido en grados Brix significativamente superior al del control Chandler. Capítulo IV 102 Tabla 1. Evaluación morfológica de frutos rojos maduros en plantas de fresa, cv. Chandler, transformadas con la secuencia en sentido del gen Fxacad1 durante el primer año de evaluación en invernadero de confinamiento (F0). El (*) indica que existen diferencias significativas con respecto al control no transformado mediante el test T2 Tamhane para todas las variables, a excepción de los parámetros de color L* y b*, donde se aplicó el test de Tukey, ambos a P=0.05. Línea F0 Peso (g) Largo (mm) Ancho (mm) Sólidos Solubles (ºBrix) Color L* a* b* Control 13,2±5,8 37,7±7,2 28,5±4,6 8±1,9 36,2±2,0 39,6±3 21,4±3,2 1 12,3±6,4 34,1±6,4 28,6±5,6 7,5±1,0 36,7±2,6 38,7±3,1 20,7±3,0 5 12,7±4,9 35,3±6,4 29,8±4,4 9,1±1,9 35,7±1,9 39,6±2,3 20,0±2,8 6 13,6±5,4 36,3±6,2 29,7±4,9 9,9±2,4* 36,3±2,1 38,4±3,0 20,5±2,7 9 11,8±4,6 34,6±6,1 27,6±4,4 8,3±1,8 35,5±2,0 39,5±2,7 20,5±2,9 13 9,2± 2,9* 30,5±4,4* 26,8±3,7 9,8±2* 36,1±2,4 40,2±2,7 21±3 14 9,5±4* 32,3±6,1* 26,3±4,2 9,1±1,7 35,7±2,2 39,8±2,7 20,8±3,1 15 11,2±4,9 35,2±6,9 26,7±4,4 8,9±1,8 37,1±2,3 40,9±3 22,2±4,0 20 9,6±2,8* 30,9±4,5* 27,2±3,3 9,1±2,4 36,5±2,4 38,9±3,1 21,0±3,8 24 9,3±4,1 30,8±4,9* 28±5,4 9,7±1,4* 39,6±2,6* 42,6±1,8* 25,2±3,4* 25 11,9±5,3 35,5±5,6 27,5±4,7 9,6±1,7* 35,6±2,4 41,1±3,7 21,4±3,8 31 10,7±4,2* 35,0±5,3* 25,8±4,2* 8,9±1,8* 35,6±2,3 39,3±2,9 21±3,1 32 10,3±3,0* 35,9±5,9 26,1±3,4 8,5±2 36,7±2,9 40,1±2,9 21,6±3,3 37 11,3±4 35,6±5,5 27,2±3,9 7,8±1,7 36,9±3,1 37,6±3,3 21,7±3,7 40 12,7±4,5 38,5± 6,2 27,7±3,9 7,6±1,4 36,1±2,2 38,4±2,8 21,0±3,1 101 9,1±2,2* 31,6±3,7* 26,2±2,4 9,1±2 37,0±3,3 38,9±2,6 21,7±4,4 108 12,4±1,8 35,9±3,2 28,8±1,7 7,9±1,4 39±2,1* 40,0±1,9 23,9±2,2 111 10±4,6* 33,5±6,2* 25,7±4,3* 8,5±1,4 36,4±2,0 40,0±2,7 22,2±3 Gen Fxacad1 103 En relación con el color, no se observaron diferencias significativas entre las distintas líneas estudiadas y el control, para este parámetro, a excepción de la línea 24 que dio valores de L*, a* y b* superiores al control, produciendo fresas más rojas que los frutos Chandler no transformados. La firmeza en los frutos maduros se estimó con un penetrómetro manual. Todas las líneas en las que se obtuvo suficiente número de frutos para evaluar mostraron valores de firmeza similares, variando entre 206,4 g (línea Cad108) y 291,5 (línea Cad40) (Figura 4). En la mayoría de las líneas, estos valores medios fueron ligeramente inferiores a la firmeza de los frutos testigo, siendo estas diferencias significativas en las líneas Cad6, 9, 15, 20, 25 y 31. La disminución media de la firmeza en estas 6 líneas transgénicas con respecto al control fue del 20,8%. ****** 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Firmeza de fruto (g) Líneas Cad Figura 4. Firmeza de frutos rojos maduros en plantas de fresa, cv. Chandler, transformadas con la secuencia en sentido del gen Fxacad1 , durante el primer año de evaluación en invernadero de confinamiento (F0). El (*) indica diferencias significativas con respecto al control no transformado mediante el test T2 Tamhane a P=0.05. Capítulo IV 104 IV.3.3 Análisis molecular de las líneas Cad Los niveles de expresión del gen Fxacad1 se evaluaron en frutos rojos maduros de 11 líneas independientes, recolectados durante el primer año de evaluación en invernadero, mediante QRT-PCR. Tan sólo en la línea Cad20, se observaron niveles de expresión mayores que en el control sin transformar (Figura 5). Por el contrario, 7 de las líneas analizadas (Cad5, 6, 9, 25, 40, 103 y 108) mostraron un importante silenciamiento del gen, mayor del 95%, debido probablemente a un fenómeno de co-supresión. En las líneas Cad15, 31 y 37, los niveles de expresión fueron similares o ligeramente inferiores al control. 0 50 100 150 200 250 300 Control 5 6 9 15 20 25 31 37 40 103 108 Expresión relativa de Fxacad1 Líneas Cad Figura 5. Niveles de expresión relativos del gen Fxacad1 en frutos rojos maduros de plantas de fresa, cv. Chandler, transformadas con la secuencia en sentido de dicho gen, recolectados durante el primer año de evaluación en invernadero de confinamiento (F0). En base a estos resultados, se seleccionaron 6 líneas que presentaban diferente grado de expresión del gen Fxacad1 . Por un lado, las líneas Cad9, Gen Fxacad1 105 25, 40 y 103, con un fuerte silenciamiento del gen (superior al 95%); por otro, la línea Cad15, con niveles de expresión similares al control, y finalmente, la línea Cad20 con niveles de expresión superiores al control. Estas líneas se evaluaron fenotípicamente durante dos años adicionales. IV.3.4 Evaluación fenotípica de las líneas Cad seleccionadas No se observaron grandes diferencias fenotípicas entre las líneas seleccionadas y el control no transformado. Las plantas tenían en general buen aspecto, aunque la línea Cad20 presentaba plantas con un porte algo inferior. En la Figura 6, aparece una imagen del control Chandler mantenido en invernadero de confinamiento. Figura 6. Imagen de las plantas control, cv. Chandler, de las líneas Cad seleccionadas mantenidas en invernadero de confinamiento. Capítulo IV 106 A continuación, se muestra un detalle de las distintas líneas transgénicas seleccionadas (Figura 7). AB CD EF Figura 7. Aspecto de las líneas transgénicas Cad seleccionadas, transformadas con la secuencia en sentido del gen Fxacad1 . A: Cad9. B: Cad15. C: Cad20. D: Cad25. E: Cad40. F: Cad103. En la Tabla 2 se muestran los resultados obtenidos en la evaluación de los frutos maduros durante el segundo año de cultivo en invernadero de confinamiento (generación F1). El peso de los frutos fue, en todos los casos, Gen Fxacad1 107 inferior al obtenido en el control no transformado, destacando las líneas Cad20, 25, 40 y 103 por producir frutos significativamente de menor peso. Lo mismo ocurrió con el calibre, teniendo las líneas Cad20, 25, 40 y 103 una longitud significativamente inferior a la de los frutos control. En cuanto al contenido de sólidos solubles, no se observaron diferencias significativas con el control, a excepción de la línea Cad25 que mostró valores de SS significativamente superiores. Tabla 2. Evaluación morfológica de frutos rojos maduros en plantas de fresa, cv. Chandler, transformadas con la secuencia en sentido del gen Fxacad1, evaluadas durante el segundo año en invernadero de confinamiento (F1). Las líneas seleccionadas, se obtuvieron a partir de la F0 mediante estolonado. El (*) indica diferencias significativas con respecto al control no transformado por test T2 Tamhane a P=0.05. Línea F1 Peso (g) Largo (mm) Ancho (mm) Sólidos Solubles (ºBrix) Color L* a* b* Control 14,0±5,4 40,1±7,4 28,5±4,0 7,3±1,4 34,1±2,4 39±2,4 21,1±3,3 9 11,2±4,5 37,4±4,7 25,7±4,1 8±2,1 34,5±3,5 38,7±4,2 20,2±4,4 15 12,5±5,0 37,9±5,9 27,4±4,2 7,7±1,8 35,3±3,5* 40±3,3* 20,9±3,8 20 10,9±3,9* 35,1±4,9* 26,7±4,2* 7,5±1,7 34,6±3,1 38,2±4,1 20,4±4,8 25 10,2±2,6* 36,2±3,8* 25,8±3,2* 8,8±1,4* 34,1±3,5 39,9±2,9* 21,2±3,1 40 10,6±4,5* 36,6±5,6* 25,0±4,5* 7,7±1,8 34,1±3,0 39,6±3,2 21,1±3,5 103 9,2±4,4* 33,7±7,6* 24,8±5* 8,2±2,2 37,3±4,1* 37,5±4,1 22,0±5 Capítulo IV 114 mismo cultivar por Youssef y col. (2009), al introducir un gen de pectato liasa en sentido, y en el cv. Calypso por Woolley y col. (2001) tras la transformación con un gen que codifica una endo-β-1,4-glucanasa. Los niveles de silenciamiento del gen Fxacad1 en frutos rojos maduros en 7 de las 11 líneas evaluadas fueron superiores al 90% por lo que es esperable que estos frutos tengan una menor actividad CAD, si bien esto tiene que ser corroborado experimentalmente. Tan sólo una de las líneas transgénicas mostró una ligera sobreexpresión del gen. En plantas transformadas con genes de la vía de síntesis de lignina, la reducción o modificación del contenido de este polímero en la pared celular podría causar efectos pleiotrópicos, debido al importante papel que juega la lignina en la fisiología de la planta (e.g. rigidez mecánica de los tejidos, transporte de agua y solutos vía xilema, banda de Caspary). En tabaco, líneas transgénicas con un fuerte silenciamiento del gen CCR mostraron un crecimiento reducido (Boudet, 2000); sin embargo, Zhong y col. (1998) no observaron alteraciones del crecimiento en plantas transgénicas de tabaco con una Cafcoil–coenzima A metiltransferasa silenciada, a pesar de que las plantas presentaban una importante reducción en el contenido en lignina. De la misma forma, plantas doble transgénicas CCR/CAD, con menor contenido en lignina, mostraron un fenotipo normal (Boudet, 2000). En general, en las líneas transgénicas de fresa no se observaron variaciones morfológicas destacables a pesar del fuerte silenciamiento del gen Fxacad1 , con la excepción de una línea que presentaba menor crecimiento. El gen Fxacad1 se expresa en todos los tejidos vegetativos a excepción de la raíz, si bien tanto el patrón como los niveles de expresión en fruto sugieren que está Gen Fxacad1 115 relacionado con la maduración, por lo que su silenciamiento en el resto de tejidos de la planta podría tener un impacto menor. En general, no se observaron diferencias significativas en los parámetros evaluados en los frutos maduros de las líneas transgénicas seleccionadas, a excepción de una ligera disminución del peso y tamaño del fruto en alguna de las líneas. Sin embargo, la reducción del peso de fruto no se correlacionó con el nivel de expresión del gen, lo que sugiere que este efecto podría ser debido a variaciones inducidas durante el cultivo in vitro . Por otro lado, puesto que la vía de flavonoides y monolignoles comparten el mismo precursor, p-coumaril-CoA, al bloquear o reducir la síntesis de lignina podría esperarse una mayor acumulación de antocianos al desviarse el flujo de carbono hacia esa vía. El efecto contrario se ha observado cuando el flujo de carbono hacia los flavonoides está limitado al inhibir la chalcona sintasa (Lunkenbein y col., 2006; Ring y col., 2013). Aunque los niveles de antocinanos no se han medido en las plantas transgénicas, la ausencia de variaciones significativas en el color de los frutos transgénicos con respecto al control sugiere que el contenido de flavonoides no se ha modificado al silenciar el gen Fxacad1 . En cuanto a la firmeza de fruto, ésta fue inferior a la de los frutos controles en todas las líneas seleccionadas en las dos primeras generaciones evaluadas, y similar o ligeramente inferior al control en la tercera generación. Se podría pensar, por tanto, que el silenciamiento del gen reduce la firmeza de fruto maduro; sin embargo, no se encontró correlación entre nivel de expresión del gen Fxacad1 y firmeza, de tal forma que líneas con niveles de expresión similar o superior al control también mostraron una pequeña reducción en la firmeza. Estos resultados sugieren que Fxacad1 no participa, o Capítulo IV 116 tiene un papel menor, en los cambios en textura que sufre la fresa durante su maduración. Sin embargo, sería necesario determinar los niveles de actividad CAD, así como el contenido en lignina, en los frutos transgénicos para corroborar esta hipótesis. Adicionalmente, la actividad CAD en frutos de fresa parece estar codificada por una pequeña familia génica (Blanco-Portales y col., 2002), por lo que la pérdida de función de Fxacad1 podría estar compensada por otro gen de esta familia. Yeh y col. (2014) realizaron estudios funcionales de los genes FaCCR , FaCAD y FaPOD en frutos de fresa mediante su silenciamiento o sobreexpresión transitoria mediante agroinfiltración. La proteína codificada por FaCAD comparte un 98.1% de identidad con Fxacad1 . Los resultados obtenidos no fueron concluyentes puesto que el proceso de agroinfiltración, independientemente de la construcción empleada, incrementó tanto la firmeza de fruto como el contenido en lignina, probablemente como respuesta del fruto a la infección por el patógeno. Así, los incrementos en firmeza de los frutos agroinfiltrados con un RNAi de FaCAD para su silenciamiento o con la secuencia del gen en sentido para su sobreexpresión, fueron similares entre sí y parecidos al obtenido en frutos agroinfiltrados con el plásmido pBI. Lo mismo ocurrió con el contenido en lignina, si bien en los frutos agroinfiltrados con el RNAi, el silenciamiento del gen modificó la calidad de la misma, disminuyendo en un 58% los monómeros de tipo H. Estos resultados no son inusuales, puesto que en la mayoría de trabajos donde se han silenciado genes CAD, no se observaron variaciones en la cantidad total de lignina, pero sí en su composición monomérica (Singh y col., 2010). De acuerdo con Humphreys y Chapple (2002), el proceso de lignificación es suficientemente Gen Fxacad1 117 plástico para permitir que plantas con el gen CAD silenciado formen lignina a partir de hidroxi cianamilaldehidos. A pesar de que los resultados de Yeh y col. (2014) en cuanto al papel de los genes CCR y CAD no fueron concluyentes, estos autores sostienen que existe una correlación entre firmeza y contenido en lignina, ya que la infección con Agrobacterium aumenta ambos parámetros. El incremento en lignina en los frutos agroinfiltrados podría deberse no a un aumento del contenido en monolignoles en respuesta a la infección, ya que no se observó inducción de la expresión de los genes FaCAD y FaCCR tras la agroinfiltración, sino a la polimerización de los monolignoles al aumentar fuertemente la expresión del gen FaPOD27 , que codifica una peroxidasa, como respuesta a la infección por el patógeno (Ring y col., 2013; Yeh y col., 2014). Nuestros resultados con plantas transgénicas estables con bajos niveles de expresión Fxacad1 sugieren que este gen no tiene un papel relevante en la firmeza del fruto de fresa. De manera similar, Gabotti y col. (2015) encontraron que la actividad CAD no estaba relacionada ni con la lignificación ni con la firmeza del fruto de melocotón. ¿Cuál podría ser por tanto el papel de este gen durante la maduración del fruto? Mitchell y Jelenkovic (1995) sugirieron que la actividad CAD podría intervenir en la formación de compuestos volátiles responsables del aroma de la fresa madura. En este sentido, resultados preliminares de la composición de volátiles en alguna de las líneas transgénicas con Fxacad1 silenciado mostraron un perfil de compuestos volátiles diferente al del control. Estas diferencias podrían deberse a un efecto directo del silenciamiento del gen, Capítulo IV 118 aunque también podría tratarse de un efecto indirecto al reconducirse el flujo de carbono hacia otros compuestos tras el bloqueo de la actividad CAD. IV.5 Conclusiones Se han obtenido plantas transgénicas conteniendo el marco abierto de lectura del gen Fxacad1 ; sin embargo, en la mayoría de las líneas se produjo una cosupresión del gen, alcanzándose niveles de silenciamiento en frutos maduros superiores al 90%. La fuerte supresión de este gen no afectó al crecimiento de la planta ni, en general, a la calidad de los frutos en cuanto al peso, forma, color o sólidos solubles. En cuanto a la firmeza de fruto, ésta fue ligeramente inferior al control en la mayoría de las líneas, si bien no se encontró correlación entre el nivel de expresión del gen Fxacad1 y la firmeza. Los resultados obtenidos no parecen indicar que Fxacad1 tenga un papel especialmente relevante en la textura del fruto de fresa; sin embargo, y dado que su expresión aumenta considerablemente durante la maduración del fruto, podría ser que este gen interviniera en otros aspectos del proceso, como son los relacionados con el aroma del fruto. CAPÍTULO V Aislamiento y cultivo de protoplastos en el cultivar de fresa Chandler. Evaluación morfológica de los protoclones obtenidos Aislamiento y cultivo de protoplastos 121 V.1. Introducción Los protoplastos son células aisladas desprovistas de su pared, con potencial para regenerarla, desdiferenciarse, dividirse y proliferar hasta formar un callo del que se puedan regenerar plantas completas. Además de su totipotencia, la posibilidad de acceder a la membrana plasmática hace que los protoplastos sean un material idóneo para la manipulación genética. Por tanto, son una herramienta biotecnológica clave para inducir transferencia génica directa o hibridación somática, de gran importancia en programas de mejora. Así, es posible crear combinaciones génicas únicas de núcleos y/o orgánulos citoplasmáticos, siendo la obtención de híbridos asimétricos y cíbridos la principal aplicación de la fusión de protoplastos (Li y col., 1999; Geerts y col., 2009). Además, los protoplastos se han empleado en numerosos estudios sobre estructura celular, función de membrana, síntesis de productos farmacéuticos y evaluación toxicológica (Davey y col., 2005). Por otra parte, y partiendo de la idea de que la variación obtenida en plantas derivadas del cultivo de protoplastos es mucho mayor que la de aquéllas que proceden de cultivos con crecimiento organizado (Karp, 1993), el cultivo de protoplastos puede tener un enorme valor como fuente generadora de variación somaclonal, ampliando el germoplasma existente por un lado y, por otro, creando variación que pueda ser utilizada dentro de los programas de mejora. No obstante, en fresa son muy escasos los trabajos publicados sobre el cultivo de protoplastos, mereciendo especial consideración las investigaciones realizadas por Nyman y Wallin (1988, 1992a). El aislamiento de protoplastos parece un proceso sencillo, se trata de eliminar la pared celular mediante enzimas que hidrolizan los polisacáridos y mantener los protoplastos en un medio donde el efecto de la desaparición de la pared sea contrarrestado por una presión osmótica apropiada; sin embargo, en la práctica, es un fenómeno complejo donde existe un gran número de Capítulo V 122 factores interrelacionados entre sí, que hacen que el proceso de aislamiento, crecimiento y regeneración de protoplastos tenga como principal característica su falta de reproducibilidad (Andreu y col., 2008), y como consecuencia, las condiciones óptimas varían no sólo entre especies, sino también entre variedades cercanas, existiendo incluso casos donde es completamente imposible obtener protoplastos viables (Warren, 1991; Davey y col., 2005; Andreu y col., 2008). El mantenimiento y cuidado de las plantas antes del aislamiento de los protoplastos es crucial, de modo que, plantas crecidas en condiciones subóptimas raramente permitirán obtener protoplastos viables (Andreu y col., 2008); así, una herida en la planta puede alterar la fisiología de la misma durante horas o días (Potrykus y Shillito, 1986). La luz es otro factor clave (Andreu y col., 2008); protoplastos aislados de plantas crecidas bajo alta irradiancia, suelen ser especialmente sensibles y si sobreviven, proliferan pobremente. La temperatura, la humedad relativa, y el fotoperiodo también afectan al estado fisiológico de la planta, y por lo tanto al éxito en la obtención de los protoplastos. Por otra parte, entre los factores que más influyen sobre la capacidad de los protoplastos y de las células derivadas de los mismos para expresar su totipotencia y producir plantas fértiles, están la fuente de material, el medio de cultivo y los factores ambientales (Davey y col., 2005). La fuente de material más utilizada en la obtención de protoplastos está constituida por células de mesófilo de hojas jóvenes, procedentes de brotes obtenidos in vitro . Otras veces, se han usado suspensiones celulares, en cereales y en tomate, o incluso, cultivos embriogénicos en cítricos (Bhojwani y Dantu, 2013). Se requieren al menos dos enzimas, una pectinasa que separe las células entre si al disolver la lámina media, y una celulasa, para degradar la pared celular; las combinaciones, concentraciones y tiempos de actuación se tendrán que ajustar en cada caso (Sun y col., 2013). La Aislamiento y cultivo de protoplastos 123 plasmólisis antes de la digestión enzimática del material en una solución de azúcar alcohol, reduce los daños citoplasmáticos y la fusión espontánea de protoplastos entre células adyacentes, tal y como señalan Ortín Párraga y Burgos (2003) en melocotón. Tras la digestión enzimática, se requiere purificar los protoplastos viables obtenidos separándolos de los restos de solución enzimática, tejidos, células y protoplastos inviables. Para ello, se han de extremar los cuidados en los lavados, realizando las centrifugaciones a la menor velocidad permitida para su recuperación, así como filtraciones con un tamaño de poro adaptadas a cada material, ya que la principal característica de los protoplastos es su fragilidad (Warren, 1991). En 24 horas los protoplastos deben sintetizar la pared celular, aunque en cereales y leñosas el proceso suele ser más lento (Bhojwani y Dantu, 2013), pero si la formación de la pared celular no es correcta o es demasiado fina, aunque ocurran las divisiones nucleares puede que no se de la citocinesis. La división celular se ve afectada por varios factores, entre ellos, el genotipo, la fuente de material, el método de aislamiento, la viabilidad de los protoplastos, la composición del medio y las condiciones de cultivo. Los protoplastos necesitan una protección osmótica adecuada hasta que sus nuevas paredes primarias sean capaces de contrarrestar la presión de turgencia ejercida por el citoplasma. En ocasiones, una reducción progresiva de la presión osmótica mediante diluciones del medio de cultivo, es crítica para mantener las divisiones mitóticas que permitan formar células hijas (Davey y col., 2005). La densidad de cultivo es importante, y aunque habrá que determinarla en cada caso, normalmente el óptimo se sitúa entre 5x104-1x105 protoplastos.ml-1; en ajo, Metwally y col. (2014), optimizando el protocolo de aislamiento y fusión de protoplastos en dos cultivares de interés, utilizaron una densidad de cultivo de 1x105 protoplastos.ml-1. Los requerimientos nutricionales Plant Cell, Tissue and Organ Culture 54: 29–36, 1998. © 1998 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands. 29 Regeneration and transformation via Agrobacterium tumefaciens of the strawberry cultivar Chandler Marta Barcel´ o1,ImanEl-Mansouri2,Jos´ e A. Mercado1, Miguel A. Quesada2&Fernando Pliego Alfaro2,∗ 1Centro de Investigaci´on y Formaci´on Agraria, Cortijo de la Cruz s/n, 29140 Churriana, M´alaga; 2Dpto. de Biolog´ ia Vegetal, Facultad de Ciencias, Campus de Teatinos s/n, 29071 M´alaga, Spain (∗requests for offprints) Received 7 August 1997; accepted in revised form 20 May 1998 Key words: Fragaria ×ananassa, plant transformation, regeneration, tissue culture Abstract The effects of growth regulator balance and culture conditions on the morphogenetic response of leaf disks from greenhouse grown plants of the strawberry cultivar Chandler, have been studied. Best results were obtained in the presence of 2.46 µM IBA and 8.88 µM BA, where 47% of the cultures regenerated after 16 weeks with 2.9 shoot colonies per regenerating leaf disk. Optimum incubation conditions included two weeks in the dark with subsequent transfer to light (40 µmol m−2s−1, 16 h). The regeneration protocol was also valuable when leaf disks from in vitro grown plants were used as explants. Transformation was attempted using Agrobacterium tumefaciens carryingthe plasmidpBI121. Leaf disks from in vitro cultures proliferatingin the presenceof 2.21 µM kinetin were best explants for transformation. A 4.22% of inoculated explants showed kanamycin resistance after 16 weeks in a medium containing 25 mg l−1of this antibiotic. The transgenic nature of several shoots was also confirmed by the GUS assay and PCR analysis. Abbreviations:BA – benzyladenine;CaMV35S – cauliflowermosaic viruspromoter; CTAB – hexadecyltrimethylammoniumbromide;GUS – beta-glucuronidase(EC 3.2.1.31);IBA – indole-3-butyricacid; LB – Luria Broth base; LSD – least significant difference; NOS – nopaline synthase promoter; NPTII – neomycinphosphotransferase(EC 2.7.1.95); PCR – polymerase chain reaction Introduction Chandler is a strawberry cultivar with excellent traits and has been the leading cultivar grown in Spain during the last few years. It is being used as a main parental line in breeding programs; moreover, it is also a cultivar widely used in fruit processing (J.M. López-Aranda, CIFA, Málaga, 1997, pers. comm.). Genetic engineering of this valuable cultivar requires the development of transformation protocols and the establishment of efficient regeneration systems. Previous studies on strawberry have clearly demonstratedtheimportanceof variousfactorssuch as genotype (Liu and Sanford, 1988), type and source of explant (Nehra et al., 1989), hormonal balance and incubation conditions (Liu and Sanford, 1988; Nehra et al., 1989) on successful regeneration via adventitious organogenesis. Genetic engineering of strawberry has already been reported (James et al., 1990; Nehra et al., 1990a,b); however, transformation frequencies are greatly influenced by the cultivar and the procedure used, e.g. 0.95% transformation frequency has been reported for the cultivar Rapella (James et al., 1990) and 6.5% for the cultivar Red Coat (Nehra et al., 1990b). In this investigation, we have optimized a regeneration protocol for the strawberry cultivar Chandler; afterwards, we have attempted the transformation of the cultivar via Agrobacterium tumefaciens carrying the binary vector pBI121, which had given excellent results in transformation of Fragaria vesca (ElMansouri et al., 1996). ticu2727.tex; 21/10/1998; 10:24; p.1 JS: DISC: CP: PIPS No. 181966 (ticukap:bio2fam) v.1.15 30 Material and methods Plant material and culture conditions Leaf disks, 4 ×4 mm, with the adaxial surface in contact with the medium were used as explants. Leaf disks were obtained from virus-free plants of the Chandler cultivar growing in a greenhouse. Basal medium contained the macroelementsof the N30K mineral formulation (Margara, 1984)with MS microelementsand vitamins (Murashige and Skoog, 1962). The pH of all media was adjusted to 5.7. Aliquots consisting of 25 ml of medium were distributed into 25 ×150 mm test tubes covered with polypropylene kaputs. All media were autoclaved for 15 min at 121 ◦C and 1.05 kg cm−2. Except for dark treatments, standard culture conditions were 25±1◦C temperatureand a 16-h photoperiod under 40 µmol m−2s−1irradiance provided by Sylvania Gro-lux lamps. Experimental designs The effect of growth regulator balance on the morphogenetic response was studied. The growth regulator combinations used were BA (0, 2.22, 4.44, 8.88, 17.76, 35.52 µM) and IBA (0, 2.46, 4.92 µM). The influence of a darkness pre-treatment (1–4 weeks) on explant regeneration capacity was evaluated. Following the dark treatment, explants were transferred to light conditions (40 µmol m−2s−1, 16h photoperiod). In this experiment, the basal medium was supplemented with 4.44 µM BA and 2.46 µM IBA. The effects of different irradiance levels on regeneration, were also evaluated. All explants were preincubatedfor 2 weeksin the dark, andbasal mediumwas supplemented with 4.44 µM BA and 2.46 µMIBA. The effect of auxin (IBA vs. IAA at 2.46 µM) in combination with BA (8.88 µM) was studied. Leaf disks from in vitro plants proliferating in the medium of López-Aranda et al. (1994) were used as explants. In this experiment, explants were preincubated for 2 weeks in the dark. Statistical analysis In all regeneration experiments data were taken after 8 and 16 weeks. The number of regenerating disks as well as the number of colonies per regenerating leaf disk were evaluated. In the first experiment, data were taken throughout 6 subcultures at eight week intervals. At the end of each subculture, newly developed shoot colonies were removed from the explant and the remaining tissue was transferred to new medium for further proliferation. Twenty explants were used per treatment and experiments were repeated twice. A randomized block design was used in all experiments. Arcsine transformation (Sokal and Rohlf, 1981) was applied to the percentages prior to mean separation by LSD. Transformation The Agrobacteriumtumefaciensstrain LBA 4404 containing the non-oncogenic plasmid pAL 4404 and the binary vector pBI121 was used in transformation experiments. The pBI121 plasmid contains the NOS/NPTII gene for kanamycin resistance, and the CaMV35s/GUS chimaeric gene as reporter (Jefferson et al., 1987). The binary vector was mobilized into Agrobacterium by the freeze thaw method (Holsters et al., 1978). Bacteria were grown at 28 ◦CinLB medium containing 50 mg l−1kanamycin. The kanamycin sensitivity of the explants was tested by culturing leaf explants on shoot regeneration medium containing filter sterilized kanamycin at 0, 10, 25 and 50 mg l−1. Callus formation and shoot regeneration were scored after 3, 6 and 10 weeks of culture. Three transformation assays were carried out. In the first one, the leaf disks were obtained from shoots with 4 subcultures, proliferating in the micropropagation medium of López-Aranda et al. (1994). In the second assay, leaves were obtained from shoots of 4-week-old seedlings, growing in MS medium (Murashige and Skoog, 1962). Seed germination was accomplished following the procedure of El-Mansouri et al. (1996) for Fragaria vesca seeds. Finally, in the third transformation assay, the leaf disks were obtained from stock cultures proliferating in a modified López-Arandaet al. (1994)micropropagationmedium in which the only growth regulator used was kinetin at 2.21 µM. In all cases, preculture of the leaf disks in the regeneration medium was used prior to Agrobacterium infection, 3 days in the first and second assays and 10 daysin the thirdcase. Incubation was accomplishedon Petri dishes containing25 ml of the optimumshoot regeneration medium, e.g., basal medium supplemented with 2.46 µM IBA and 8.88 µM BA. After this induction period, explants were placed in 50 ml tubes, inoculated with an overnight grown Agrobacterium culture diluted 1/10 in MS basal medium and gently ticu2727.tex; 21/10/1998; 10:24; p.2 31 shaken for 20 min. The infected explants were blotted dry on sterile filter paper and cultivated on the shoot regeneration medium for 3 days. Explants were then transferred to a selection medium, the medium found optimal for shoot regeneration supplemented with 25 mg l−1kanamycin and 500 mg l−1carbenicillin. In the three assays, shoots regenerated after 16– 20 weeks were multiplied in the medium of LópezAranda et al. (1994) and rooted in MS basal medium, both media containing 25 mg l−1kanamycin. The absence of Agrobacterium contamination was shown by cultivation of leaf fragments of putative transformants on LB medium and by PCR amplification of a 437 bp fragment of the VirD1 gene of the Agrobacterium genome (Lipp-Joao and Brown, 1993). GUS enzyme activity of transgenic shoots was determined by histochemical and fluorogenic assays as reported by Jefferson (1987). For DNA extraction, frozen leaf tissue (0.5 g) was ground with a mortar and pestle in liquid nitrogen and washed with 5 ml of washing buffer (100 mM potassium acetate buffer pH 5.0, 20 mM EDTA, 1% PVP and 1% β-mercaptoethanol). After centrifugation at 3000 gfor 5 min, the pellet was resuspended in 5 ml of extraction buffer (washing buffer supplementedwith 1 mM NaCl, 1% N-laurylsarcosine and 1% CTAB). The extracts were incubated at 65 ◦C for 15 min followed by two extractions with chloroform. The DNA was precipitated with 1 volume of 100% ethanol and incubated at −20 ◦C for 15–30 min. The pellet was washed with 80% ethanol and allowed to dry briefly before being dissolved in 400 µl of TE buffer (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA). Samples were treated with RNase for 1 h and extracted once with phenol and once with chloroform. Finally the DNA was precipitated with two volumes of 100% ethanol, washed with 80% ethanol, allowed to dry and dissolved in an appropriate volume of TE buffer. The DNA of the putative transformants was used to amplify the nptII gene by PCR according to Lipp-Joao and Brown (1993). Results Optimisation of regeneration in cultivar Chandler The effect of the cytokinin/auxin ratio on regeneration is shown in Figure 1. The presence of auxin was absolutely necessary for regeneration to occur. No regeneration was observed when auxin was absent in the medium. Best results were obtained with 2.46 µM Figure 1. Effect of BA and IBA concentration (µM) on regeneration percentage of leaf disks explants of the strawberry cultivar Chandler. Bar indicates the LSD value at p= 0.05. IBA; higher concentrations (4.92 µM) had negative effects on the process. As expected, BA was also required, with optimumlevelsbeing in the range2.22– 8.88 µM. A relatively small percentage of leaf disks (5–15%) had started to regenerate after 8 weeks (data not shown) while after 16 weeks a greater number (around 50%) had formed colonies. Initially, the intermediate BA concentration (4.44 µM) was chosen for use in further experiments, however, after 6 additional subcultures in the regeneration medium, the average numberof coloniesper regeneratingdisk washigher in the treatment including BA 8.88 µM (2.9 colonies vs. 1.3 and 1.4 in the media containing BA 2.22 and 4.44 µM, respectively). Thus, the highestBA concentration was chosen as standard and used to study the effect of auxin type, as well as on transformation assays. Although no significant differences were observed in regeneration percentages after 16 weeks of culture, one to four weeks of dark incubation accelerated the regeneration process observed after 8 weeks and slightly increased the percentages of regeneration at 16 weeks, from 47% (no dark treatment) to a mean value of 68%after 1–4 weeks in the dark. No cleardifferences were detected in the number of colonies per regenerating leaf disk, which fluctuated in the range 1.5 (1 week darkness) to 2.6 (0 and 4 weeks darkness) after 16 weeks, however, shoots of the 2 weeks dark incubation had a better aspect than those of the other treatments, so the 2 weeks treatment was chosen as standard. The effect of irradiance level is shown in Figure 2. Light significantly enhanced regeneration during the 0-16 week period, specially in the 20–40 µmol m−2s−1range. The treatment of 40 µmol m−2s−1 ticu2727.tex; 21/10/1998; 10:24; p.3 32 Figure 2. Effect of irradiance level on regeneration of leaf disks from the strawberry cultivar Chandler. Different letters within a column indicate significant differences at p= 0.05. Table 1. Effect of kanamycin concentration on regeneration of leaf disks from the strawberry cultivar Chandler. Different letters within a column indicate significant differences at p=0.05bythe LSD test Weeks Kanamycin (mg l−1)3 6 10 Regenerating explants (%) 0 96.7a 100a 100a 10 43.4b 21.0b 0b 25 2.6c 0c 0b 50 0c 0c 0b was chosen as standard because it gave the highest percentage of regenerating leaf disks, while no differences could be detected in the number of colonies per regenerating leaf disk, which fluctuated in the range 1.9–2.2. No significant differences were detected between IAA and IBA on regeneration; however, the highest percentage66.7%, was obtainedat 2.46 µM IBA–8.88 µMBAversus 58.30% in the presence of IAA-BA at equimolar concentrations. Thus, the former treatment was chosen as standard. The number of colonies per regenerating leaf disk was similar in both treatments. The presence of kanamycin at 10 mg l−1drastically decreased the organogenic capacity of leaf disks (Table 1). After 6 weeks, 100% disks remained viable in the absence of kanamycin, and only 21% remained viable at 10 mg l−1kanamycin, but none showed signs of regeneration and they were dead after 10 weeks. At 25 mg l−1all explants were dead after 6 weeks, so this concentration was chosen to select transformed plants. Agrobacterium mediated transformation Results obtainedin the transformationassays are summarized in Table 2. In assay 1, using explants from shoots micropropagated in the medium of LópezAranda et al. (1994), which contained BA 1.46 µM, IBA 4.92 µMandGA 30.28 µM, only two explants formed a compact callus which gave a positive response on the GUS assay, resulting in a potential 1.11% transformation frequency. By contrast, seedling-derived explants in the presence of kanamycin started to regenerate at a 4.16% frequency. Three shoots rooted in the presence of 25 mg l−1 kanamycin and two of these plants gave a positive response with the GUS assay (results not shown). In the third transformation assay, leaf disks from shoots proliferating in the presence of 2.21 µM kinetin were used. These leaves had a more normal aspect and a bigger size than those derived from shoots proliferating in the mediumof López-Arandaet al. (1994). With this type of material and a 10 days preculture period, 12 colonies corresponding to independent transformation events were obtained after 16 weeks on selection medium. Thetransformationrate, based on kanamycin resistance, was 4.22%. Nine of these colonies were examined through the GUS assay, 4 of them gave a clear positive response and 2 of them showed a low GUS activity (Figure 3A). The presence of the nptII gene was confirmed by PCR in these 6 clones (Figure 3C). These amplification products were not the results of Agrobacterium contamination since no amplification of the VirD1 gene was obtained with the same samples (Figure 3B). These transformed shoots displayed stable kanamycin resistance when multiplied throughseveralsubculturesin proliferationmediasupplemented with this antibiotic. Transgenic shoots were rooted in the presence of 25 mg l−1kanamycin (Figure 3D) and acclimatized and gave rise to plants phenotypically identical to control plants (Figure 3E). Discussion Hormonal balance is a key factor in regulating morphogenesis in cultured explants (Murashige, 1974). Our results clearly show that in strawberry, auxins play a key role in shoot differentiation since virtually no regeneration was obtained in the absence of this growth regulator. Nehra et al. (1989) also emphasized the importance of auxin in strawberry shoot regeneration although they used IAA instead of IBA. ticu2727.tex; 21/10/1998; 10:24; p.4 33 Figure 3. (A) Fluorogenic assay of the GUS activity. Row 1: extracts of control plants. Rows 2 and 3, extracts from putative transgenic plants. Each well represents an independent plant. The last wells (from left to right) on lines 1 and 3 were empty. On line 2, wells 1, 2, 3, and 4, were strongly GUS-positive, while the fifth was negative; on line 3, 3 and 4 were weakly positive while 1 and 2 were GUS-negative. (B) PCR amplification of the VirD1 gene of A. tumefaciens electrophoresed on 2% agarose gel, arrow indicates the 437 base pairs (bp) fragment amplified. Lanes A correspond to the amplified DNA extracted from two independent Agrobacterium cultures. Lanes 1 to 6 correspond to DNA from the 6 putative independent transgenic plants that showed GUS activity. (C) PCR amplification of the nptII gene electrophoresed on 2% agarose gel; the arrow indicates the 255 bp fragment amplified in the same six transformants analysed in Figure 3B. (D) Transgenic shoot rooted in a medium with 25 mg l−1of kanamycin. (E) Acclimatized transgenic (right) and control (left) plants. ticu2727.tex; 21/10/1998; 10:24; p.5 34 Table 2. Transformation frequency in explants of Fragaria ×ananassa cv. Chandler after continuous selection on 25 mg l−1of kanamycin. Assay 1 Assay 2 Assay 3 Inoculated explants with A. tumefaciens 180 72 284 Number of explants resistant to kanamycin 2 21 150 (prior to first subculture) Morphogenetic response on transformed 2 calli 3 isolated 12 shoot explants after 16 weeks of culture plantlets colonies Transformation frequency based on resistance 1.11 4.16 4.22 to kanamycin (%) Number of transgenic GUS positive 2 calli 2 plantlets 6 colonies∗ ∗The transgenic nature of these 6 colonies was confirmed by PCR analysis. Assay 1: Leaf explants obtained from adult shoots micropropagated in the L´ opez-Aranda et al. (1994) medium. Assay 2: Leaf pieces obtained from 4-week-old seedlings growing in MS medium. Assay 3: Leaf pieces obtained from adult shoots micropropagated in a modified L´ opezAranda et al. (1994) medium in which the only growth regulator used was kinetin at 2.21 µM. Our comparative studies between both auxins did not reveal significant differences, although slightly better results were obtained in the presence of IBA in accordance with previous observations of Liu and Sanford (1988). For a constant auxinlevel of2.46µM, increasing BA concentration up to 8.88 µM enhanced shoot colony formation. Moreover, this optimized exogenous cytokinin/auxinratio allowed the maintenance of the shoot regeneration capacity through subculturing. Preincubation in dark conditions has been shown to enhance morphogenesis in several genera, e.g., Cucumis (Punja et al., 1990), Nicotiana (Chandler et al., 1987) and Malus (Fasolo et al., 1989). This treatment seems to decrease phenolic exudation by explants (George, 1993). Our results agree with those of Liu and Sanford (1988) who also recommended a dark pre-treatment to enhance shoot regeneration in Fragaria ×ananassa. Morphogenesis is greatly enhanced by light especially at low-moderate (10–40 µmol m−2s−1) irradiances (Murashige, 1974), while higher irradiance levels could be inhibitory due to auxin inactivation (Fridborg and Eriksson, 1975) or to increased production of phenolic compounds (Andersen and Kasperbauer, 1973). In strawberry, Nehra et al. (1989) recommend low light levels (12.5 µmol m−2s−1) for shoot regeneration on thecultivar Redcoat; however,for Chandler, better results were obtained in the range 20–40 µmol m−2s−1than at lower or higher irradiance levels. In relation to explant origin, Liu and Sanford (1988) working with the Allstar cultivar, found different hormonal requirements for leaf tissues derived from in vivo or in vitro grown plants. In our case, no direct comparison between the two explant sources was made; however, results obtained in the regeneration medium optimized for leaf disks of greenhouse grown plants were similar to those obtained when leaf disks from micropropagated material were used. To avoid contamination problems on transformation experiments, leaf disks from in vitro grown shoots were used. Several authors have shown the feasibility of transforming strawberry via Agrobacterium tumefaciens, (James et al., 1990; Jelenkovic et al., 1991; Mathews et al., 1995; Nehra et al., 1990a,b). In our case, application of the transformation protocol developed for Fragaria vesca (El-Mansouri et al., 1996) gave poor results in the Chandler cultivar when using explants from shoots cultivated in the López-Aranda et al. (1994) micropropagation medium, probably because Fragaria vesca regeneratesat a faster rate and at a higher frequency than Fragaria ×ananassa.However, use of leaf disks of juvenile origin gave much better results with 4.16% of transformants resulting. The higher regeneration potential of juvenile explants in relation to adult material is a well known phenomenon (Davies and Joiner, 1980; Raviv et al., 1987) and thiscould explainthe observedtransformationfrequencies. Using explants of adult origin derived from shootsproliferatingin a kinetin supplementedmedium and extending the preculture period to 10 days gave also good results (4.22% transformation rate). Kinetin pretreatment of leaf explants also improves tomato transformation frequency (Chy and Philips, 1987). In the strawberry cultivars Jonsok and Hiku, Sorvari et al. (1993) showed that pretreatment of explant sources with BA (13.3 µM) increased the organogenic response. In other species, e.g., Pinus pinaster (David et al., 1982) and Morus alba (Oka and Ohyna, 1981) similar results have been obtained. In our case, shoots ticu2727.tex; 21/10/1998; 10:24; p.6 35 proliferatingfor 3–4 subculturesin the presence ofBA were miniaturized and developed light hyperhydricity symptoms while those proliferating in the presence of kinetin had a much better aspect. Probably in the last case, the population of competent cells would increase and, as indicated by Potrykus (1991), this could result in the improvedtransformationrate. McHughenet al. (1989) and Hamza and Chupeau (1993) have also shown the importance of using an adequate preculture period for efficient transformation. Increasing the duration of the precultureperiod increased the proportion of competent cells and hence the probability that Agrobacteriumwouldtransfer its T-DNA (Nehra et al., 1990b). Obviously, there is a higher chance for escapes, but avoiding the use of antibiotics during early stages of organogenesis seems to be important, since they interfere with development, even of transformed cells (James et al., 1989; Michelmore et al., 1987). The culture of explants on selection medium just after co-culturing is convenient to avoid proliferation of non-transgenic sectors. The developed procedure allows a transformationfrequencyof 4.2% which makes it a valuable protocol to be used in any biotechnological approach for strawberry breeding involving this cultivar. References Andersen R & Kasperbauer MJ (1973) Chemical composition of tobacco leaves altered by near-ultraviolet and intensity of visible light. Plant Physiol. 51: 723–726 Chandler SF, Ragolsky E, Pua E & Thorpe TA (1987) Some morphogenic effects of sodium sulfate in tobacco callus. Plant Cell Tiss. Org. 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