Influencia de la variabilidad genética entre donante y receptor, de los alelos GSTM1 y GSTT1, en la incidencia de la enfermedad injerto contra receptor aguda en pacientes sometidos a trasplante alogénico de precursores hematopoyéticos

Dpto. de Fisiología Humana, Histología Humana, Anatomía Patológica y Educación Física y del Deporte Facultad de Medicina Universidad de Málaga TESIS DOCTORAL Influencia de la variabilidad genética entre donante y receptor, de los alelos GSTM1 y GSTT1, en la incidencia de la enfermedad injerto contra receptor aguda en pacientes sometidos a trasplante alogénico de precursores hematopoyéticos ALEJANDRO CONTENTO GONZALO 2016! AUTOR: Alejandro Contento Gonzalo http://orcid.org/0000-0002-0771-0887 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es Dpto. de Fisiología Humana, Histología Humana, Anatomía Patológica y Educación Física y del Deporte Facultad de Medicina Universidad de Málaga Dra. Martina Álvarez Pérez, Profesor Asociado del Área de Conocimiento de Anatomía Patológica CERTIFICA: Que D. Alejandro Contento Gonzalo, ha realizado personalmente y bajo mi dirección el trabajo de Tesis Doctoral titulado: “Influencia de la variabilidad genética entre donante y receptor, de los alelos GSTM1 y GSTT1, en la incidencia de la enfermedad injerto contra receptor aguda en pacientes sometidos a trasplante alogénico de precursores hematopoyéticos”. Y para que conste, en cumplimiento de las disposiciones vigentes expide el presente en En Málaga, a 18 de enero de 2016 Dra. Martina Álvarez AGRADECIMIENTOS Han sido muchas las personas que, de manera más o menos directa, han hecho posible la realización de esta tesis. Es inevitable que siempre quede alguien a quien no se le cite explícitamente, mis disculpas por anticipado y mi agradecimiento. La realización de esta tesis no hubiera sido posible sin la colaboración, el apoyo y el ánimo por parte de muchas personas a las cuales me gustaría mostrar mi agradecimiento. Agradecer en primer lugar a Antonio Jiménez Velasco, mi consejero y el motor de todo este trabajo, muchas gracias por motivarme con el conocimiento y la ciencia. Por la confianza depositada en mí durante todo este tiempo, poniendo a mi disposición la oportunidad de trabajar en colaboración con un equipo excelente y con todos los medios necesarios a mí alcance. A la Dra. Martina Álvarez, directora de esta tesis, por su gran profesionalidad y su apoyo constante en cada pregunta, duda y valoración global del texto. Por su imprescindible colaboración en la corrección y valoración final del texto. A todo el departamento de Anatomía Patológica donde inicie los cursos del doctorado y tan amablemente me trataron. A mi Jefe de servicio, Ana Isabel Heiniger Mazo, sin su confianza en mí a la hora del trabajo diario, no podría haber comenzado este trabajo. A todo el personal del Servicio de Hematología (secretarias, enfermeras, auxiliares, de la planta y de los diferentes laboratorios). Y por último siendo de enorme importancia para mí, a mi mujer María del Mar, mi hijo Nicolás, mis padres y hermanos, pues sin su apoyo, ánimo y paciencia, habría sido imposible la realización de esta Tesis. ABREVIATURAS 1RC: Primera remisión completa. 2RC: Segunda remisión completa. ADN: Acido desoxirribonucleico. ALO: Alogénico. BuCy: Busulfán + Ciclofosfamida. CDs: células dendríticas. CsA: Ciclosporina. CTLs: Linfocito T citotóxicos. Cy: Ciclofosfamida. D+: Donante que expresa GSTM1 o GSTT1. D-: Donante que no expresa GSTM1 o GSTT1. DE: Donante no emparentado. DnE: Donante no emparentado. EICR: Enfermedad injerto contra receptor. EICRag: Enfermedad injerto contra receptor aguda. EICT: Enfermedad injerto contra tumor. FISH: Hibridación por fluorencia in situ. FI: Fallo implante. G-CSF: Factor estimulante de colonias granulociticas. GST: Glutatión s transferasa. ICT: Irradiación corporal total. IFN gama: Interferón gama. INV: Inversión. LA: Leucemia aguda. LLA: Leucemia linfoblastica aguda. LMA: leucemia mieloblástica aguda. mHH: Antígeno menor de histocompatibilidad. MTX: Metotrexato. NR: No remisión. PHP: Precursores hematopoyéticos. R+: Receptor que expresa GSTM1 o GSTT1. R-: Receptor que no expresa GSTM1 o GSTT1. RCP-TI: Transcriptasa reversa. RFLPs: Fragmentos de restricción de longitud variable. SCU: Sangre de cordón umbilical. SG: Supervivencia global. SHC: sistema histocompatibilidad. SLE: Supervivencia libre de enfermedad. SNP: Polimorfismo de nucleótido único SSCP: Single strand conformation polymorphism STRs: Repeticiones en tándem de secuencias cortas. TIR: Terapia de intensidad reducida. TPH: Trasplante de precursores hematopoyéticos. TRM: Mortalidad relacionada con el trasplante. VNTR: Repeticiones en tándem de número variable. INDICE I.INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………… 13 I.1. POLIMORFISMOS EN FAMILIA GST……………………………………………………. 14 I.1.1. Subclase M (mu)………………………………………………………………………….. 14 I.1.2. Subclase T (theta)……………………………………………………………………….. 16 I.1.3. Subclase P (pi)……………………………………………………………………………… 18 I.2. ALTERACIONES DE LAS GST Y SU RELACIÓN CLÍNICA………………………. 18 I.2.1 Fármacos………………………………………………………………………………………. 18 I.2.2. Neoplasias……………………………………………………………………………………. 19 I.2.3. Enfermedades hematológicas……………………………………………………… 20 I.2.3.1 Leucemias agudas.……………………………………………………………………… 20 I.2.3.2 Enfermedad injerto contra receptor…………………………………………. 22 I.2.3.3 Síndrome mielodisplásico………………………………………………………….. 24 I.2.3.4 Trasplante hematopoyético………………………………………………………. 24 I.3. POLIMORFISMOS GENETICOS…………………………………………………………… 26 I.3.1. Tipos de variación polimórficas…………………………………………………… 26 I.4. LEUCEMIA AGUDA Y TRASPLANTE HEMATOPOYETICOS……………………. 32 I.4.1. Trasplante hematopoyético…………………………………………………………. 39 I.4.1.1 Historia………………………………………………………………………………………. 41 I.4.1.2 Fuente de progenitores……………………………………………………………… 45 I.4.1.3 Enfermedad injerto contra receptor…………………………………………. 46 I.4.1.3.1 Clínica……………………………………………………………………………………… 48 I.4.1.3.2 Factores de riesgo…………………………………………………………………… 51 I.4.1.3.3 Gradación………………………………………………………………………………… 52 I.4.1.3.4 Tratamiento………….………………………………………………………………… 54 II. HIPOTESIS Y OBJETIVOS….………………………………………………………………. 57 III. MATERIAL Y METODOS….…………………………………………………………………. 63 III.1. Tipo de estudio….…………………………………………………………………………. 63 III.2. Población estudiada.….………………………………………………………………… 63 III.2.1. Variables estudiadas….……………………………………………………………… 63 Figura. 1. El gen GSTM1 es parte del cluster de genes GST Mu-clase en 1p13.3, GSTM4 GSTM2-GSTM1-GSTM5GSTM3 (parte superior del diagrama). El gen GSTM1 (cuadro negro) se compone de 8 exones, que varían en tamaño desde 36 hasta 112pb, mientras que los intrones varían 87 a 2641 pb. GSTM1 se incrusta en una región con amplia homologías y flanqueado por dos regiones de 4,2 kb casi idénticas (gris cajas). El alelo nulo GSTM1 surge por recombinación homóloga de la izquierda y la derecha de 4,2 kb, lo que resulta en una deleción de 16kb que contiene todo el gen GSTM1 (parte inferior del diagrama). El punto de supresión no puede ser localizado con precisión debido a gran cantidad de secuencias repetitivas entre ambas región [7]. I.1.2. Subclase T (theta) Esta subfamilia consta de dos genes, GSTT1 y GSTT2, que se encuentran en 22q11.2 y separados por unos 50 kb [Figura 2]. Ambos genes tienen cinco exones con idénticos intrón / exón fronteras, pero que comparten sólo el 55% de identidad de aminoácidos. Aproximadamente el 20% de los caucásicos son homocigotos para un alelo nulo GSTT1, GSTT1 * 0. La delección del gen GSTT1 no incluye la del GSTT2. El análisis de una sección de 119-kb que contiene el GSTT1 y GSTT2 reveló una extensa homología. Al igual que el GSTM1 * 0, la supresión GSTT1 * 0 probablemente se deba a una recombinación homóloga [8]. !16 Está altamente conservada durante la evolución y juega un papel importante en la biotransformación de fase II de un número de fármacos y productos químicos industriales, por ejemplo: citostáticos, los hidrocarburos y derivados halogenados de hidrocarburos [8]. Figura. 2. El gen GSTT1 es parte del cluster de genes GST Theta-clase en 22q11.2 (parte superior del diagrama). GSTT1 y GSTT2 están separados por aproximadamente 50 kb. GSTT2 se encuentra cara a cara con un gen que codifica la D tautomerase dopachrome (DDCT). El GSTT2 y DDCT genes se han duplicado en una repetición invertida. El gen GSTT1 (cuadro negro) consta de cinco exones, que varían en tamaño desde 88 hasta 195 pb, mientras que los intrones varían desde 205 hasta 2363 pb. El gen GSTT1 se incrusta en una región con amplia homologías y flanqueado por dos regiones de 18 kb, HA3 y HA5 (cuadros grises), que tienen más del 90% de homología. El alelo nulo GSTT1 surge por recombinación homóloga de la izquierda y la derecha repite 403 pb, lo que resulta en una deleción de 54 kb que contiene el gen GSTT1 completo (parte inferior del diagrama) [8]. !17 I.1.3. Subclase P (pi) El gen GSTP1 se encuentra en el 11q13, es de 2,8 kb de longitud y contiene siete exones la cual codifica una proteína de 209 aminoácidos. GSTP1 se expresa en muchos tejidos incluyendo en el tejido mamario, donde es la GST predominante. Varios polimorfismos de único nucleótido se han descrito en el gen GSTP1. La sustitución de estos aminoácidos se ha visto que afecta la especificidad del sustrato en la unión enzimática [9]. I.2. ALTERACIONES DE LAS GST Y SU RELACIÓN CLÍNICA La familia de las isoenzimas GST tienen afinidades de unión relativamente baja a substratos específicos, y por otro lado, reconocen y / o desintoxican una amplia gama de sustratos. El mecanismo por el cual GST puede modular la resistencia a los quimioterápicos sigue siendo aun una cuestión de debate. El principal mecanismo propuesto es la conjugación con el glutatión. Otros estudios proponen nuevas posibilidades, como la participación en la unión de drogas en la salida de la célula. I.2.1. Fármacos La presencia de algún alelo nulo en las GST también puede conferir resistencia a los agentes de quimioterapia utilizados en la actualidad para tratar el cáncer. Sin embargo, en contraste con el papel de las GST en la carcinogénesis del medio ambiente, los genotipos GST con menor actividad de la enzima puede ser una ventaja para los individuos sometidos a tratamiento quimioterápico, porque reduce la desintoxicación y potencialmente aumentaría la eficacia de los medicamentos citotóxicos [9,10]. !18 Medicamentos contra el cáncer que se ha demostrado que sean sustratos para GST son, por ejemplo, el Clorambucil, Melfalán, Ciclofosfamida, Esteroides, etc. Existe evidencia también de un papel de las GST en la modulación de los efectos de drogas mediante la inactivación de los hidroperóxidos generados por diferentes fármacos como lo son la Adriamicina, Mitomicina C, Carboplatino y Cisplatino [10]. I.2.2. Neoplasias Diversos estudios han sugerido una asociación entre el genotipo nulo GSTM1 y un mayor riesgo para desarrollar diversos cánceres relacionados con el uso del tabaco. Un metaanálisis sobre 12 trabajos de casos controles sobre el riesgo de cáncer de pulmón y el estado de portador GSTM1 clasificó el genotipo nulo GSTM1 como factor de riesgo independiente de características moderado para todos los subtipos histológicos de cáncer pulmonar [11]. En pacientes con cáncer de mama la deleción del gen GSTM1 o el GSTT1 ha sido relacionada con una mayor supervivencia y menor incidencia en las recaídas de la enfermedad principalmente cuando ambos genes estaban deleccionados [12]. En los pacientes con tumores del sistema nervioso central como es el caso de los oligodendrogliomas anaplásicos se ha visto que los pacientes que poseen el genotipo GSTT1 nulo, pueden estar relacionados con una supervivencia menor en comparación con los que expresan el alelo, posiblemente esté relacionado con mayor toxicidad a los fármacos y reducción de la dosis de los mismos. En los pacientes con astrocitoma anaplásico, el B GSTP1 * / * genotipo B puede conferir una ventaja en relación a una mayor supervivencia [13]. Se ha postulado que los individuos con alelos nulos GSTM1 y GSTT1 y también aquellos con transición 105Ile/Val en GSTP1 han aumentado la susceptibilidad !19 para los agentes carcinógenos y de esta manera son más propensos a desarrollar cáncer de próstata. En los últimos años ha sido ampliamente estudiado como un factor de riesgo de desarrollar cáncer de próstata, sin embargo, los resultados son inconsistentes. La principal conclusión de un metaanálisis de 22 estudios sugiere que el polimorfismo GSTM1 nulo confiere un mayor riesgo de desarrollar cáncer de próstata, sin embargo, no se encontró relación entre el GSTT1 y el GSTP1 con el riesgo de mayor incidencia de cáncer de próstata [14]. Al estar estas enzimas involucradas en la destoxificación celular, se han revisado diversas bibliografías y entre ellos varios metaanálisis en los cuales se ha relacionado con mayor incidencia de padecer hepatocarcinoma. En 15 estudios fueron identificados: los cuales evaluaron mayormente la GSTM1 y la GSTT1. Los resultados globales sugieren que puede haber un pequeño riesgo de hepatocarcinoma en individuos con alelo nulo GSTT1 y posiblemente también con genotipos nulos GSTM1. Sin embargo, dado el número relativamente limitado de pacientes que se estudiaron y la heterogeneidad observada entre los estudios, no son concluyentes los mismos [15]. I.2.3. Enfermedades hematológicas I.2.3.1 Leucemia agudas Se trata de una proliferación neoplásica de células inmaduras, llamadas blastos, que pueden ser de diferentes estirpes (mieloide, linfoide, etc.) que proceden de un progenitor hematopoyético con capacidad de maduración alterada y que desplaza a las células normales de la medula ósea. Los polimorfismos de la familia de las GST (GSTM1, GSTP1 y GSTT1) han sido considerados factores de riesgo para desarrollar leucemias agudas (LA) en una !20 serie de estudios, sin embargo los resultados globales de estos estudios son inconsistentes [16]. Para investigar una posible asociación de los polimorfismos de GST con el riesgo de leucemia aguda, se realizó una revisión sistemática y metaanálisis de 30 estudios de casos/control publicados. Para tener en cuenta la posibilidad de heterogeneidad entre los estudios, se realizó un riguroso análisis estadístico. [Tabla 1]. El Odds Ratio combinado de riesgo de leucemia aguda asociada con el genotipo nulo GSTM1, GSTP1 alelo y genotipo GSTT1 nulo fueron 1,22 (intervalo de confianza 95% (IC) 1,07-1,38), 1,07 (IC 95% 1.00-1.13) y 1.19 (IC 95% 1,00-1,41), respectivamente. Se observo un aumento significativo del riesgo de desarrollar leucemia linfoblástica aguda (LLA) asociada con los genotipos GSTM1 y GSTT1 nulo. No se observo evidencia de la relación entre los polimorfismos en GSTP1 y la mayor incidencia de LA. En varios estudios se ponen de acuerdo en el papel que los genotipos GSTM1 y GSTT1 nulo podrían desempeñar en la patogénesis de las leucemias agudas. La asociación significativa de estos genes nulos con el mayor riesgo de desarrollar una leucemia aguda debe ser evaluada con más detenimiento y relacionarlos con respecto a la población, el tabaquismo, los hábitos alimentarios, la etnia y la raza entre otros factores [17]. !21 Tabla 1. Resumen de los diferentes estudios y su relación con el GSTM1 y el riesgo de leucemia aguda. LLA (leucemia linfoblástica aguda) LMA (leucemia mielobastica aguda) t-AML (leucemia mieloblástica relacionada con el tratamiento. a frecuencia de GSTM1 deficiencia en casos. b frecuencia de GSTM1 deficiencia en controles [17]. I.2.3.2. Enfermedad injerto contra receptor La enfermedad de injerto contra receptor agudo y crónica es una de las complicaciones con mayor morbi mortalidad en el periodo post-TPH. En este proceso los linfocitos T del donante reconocen alo antígenos que activan la presentación de antígenos, con la consecuente activación de la cascada inflamatoria produciendo un daño tisular que puede llegar a ser irreversible. Se ha investigado en recientes publicaciones si los polimorfismos de las GST interfieren con el metabolismo de los fármacos utilizados en el tratamiento de !22 acondicionamiento quimioterápico previo a la infusión de precursores hematopoyéticos y de la profilaxis de la enfermedad injerto contra huésped aguda (EICRag) [18]. El Busulfán y los metabolitos de la Ciclofosfamida se conjugan con el glutatión y son catabolizado por algunas de las enzimas de la familia glutatión citosólico Stransferasas. Existen algunos polimorfismos de únicos nucleótidos (SNP) en la región promotora de la glutatión S-transferasa gen A1, los que se han observado con mayor relevancia clínica son: GSTA1 * A, -567T, -69C y -52G; GSTA1 * B, -567g, 69T-y -52A. Se evaluaron los resultados clínicos de 61 pacientes con neoplasias hematológicas, sometidos a Trasplante de Precursores hematopoyético (TPH) alogénico, acondicionado con Busulfán / Ciclofosfamida, se relaciono la incidencia de EICH agudo grado II-IV, con los distintos polimorfismos de la glutatión S-transferasa genotipos A1. Concluyendo en este estudio que el diplotipo GSTA1 * A / * A es un factor de protección independiente para el desarrollo de EICR agudo, en especial para localización cutánea y probablemente hepática también [19]. Siendo estos estudios relevantes para la posible identificación de genotipos antes de un trasplante alogénico y poder permitir modificar algunos regímenes de acondicionamiento o las profilaxis de la enfermedad de injerto contra huésped aguda. !23 I.2.3.3. Síndromes mielodisplásicos Es un grupo heterogéneo de enfermedades clónales de las células hematopoyéticas pluripotentes caracterizado por la presencia de alteraciones morfológicas de las células de las diferentes líneas hematopoyéticas, citopenias y una frecuente evolución a leucemia aguda. En un meta análisis realizado por Dahabreh et al. [20] Analizaron más de 1400 pacientes, en dichas observaciones llegan a la conclusión que el alelo nulo GSTT1 esta relacionado con una mayor incidencia de síndrome mielodisplásico, no obstante continúan sin hallar esta relación con el alelo nulo GSTM1, dichos hallazgos están fundamentados en la susceptibilidad de las líneas celulares hematopoyéticas a mayor toxicidad por diversos fármacos (agentes alquilantes) y metales pesados. I.2.3.4. Trasplante hematopoyético La mortalidad relacionada con el trasplante (MRT) es un obstáculo importante para el éxito de los TPH alogénicos, una amplia variedad de fármacos se utilizan en el TPH alogénico, por esta razón los polimorfismo en diversas enzimas metabólicas podrían afectar el metabolismo de los fármacos y potencialmente influir en la MRT. En el estudio de Terakura et al. [21]. No se encontró asociación significativa entre el alelo nulo GSTT1 y las diversas variantes analizadas relacionadas con el TPH. Sin embargo, un genotipo GSTM1-positivo en los receptores se asoció significativamente con un mayor TRM y una menor supervivencia global [Figura 3]. Estos resultados sugieren que un genotipo GSTM1 nulo en los receptores protege contra TRM después realizarse TPH alogénico, no obstantes estos resultados necesitan más estudios prospectivos y multicéntricos para su validación [114]. !24 Figura 3. Impacto de la deleción homocigota de GSTM1 en TRM después del trasplante de médula ósea de donantes no relacionados. (a) TRM en los pacientes GSTM1-positivas con una enfermedad hematológica fue de 42,9% (n = 166) y que en los pacientes GSTM1-negativos fue de 29,3% (n = 201). (b) TRM dentro de los 200 días después del trasplante en los pacientes GSTM1-positivas con una enfermedad hematológica fue del 28,8% (n = 166) y que en los pacientes GSTM1-negativos fue de 18,7% (n = 201). [21] !25 I.4. LEUCEMIA AGUDA Y TRASPLANTE HEMATOPOYÉTICOS Las leucemias agudas son una proliferación de células inmaduras, blastos, de estirpe linfoide o mieloide, que proceden de un progenitor hematopoyético lesionado con capacidad de maduración alterada y que debido a su crecimiento excesivo desplaza a células normales de la medula ósea. Ello se traduce en síntomas y signos de enfermedad y en alteraciones del hemograma. Sin embargo, en la actualidad, la clasificación exclusivamente morfológica descrita inicialmente por la FAB, tiende a ser reemplazada por una clasificación de neoplasias hematológicas propuesta por la Organización Mundial de la Salud, que las divide según la línea celular afectada, en: neoplasias mieloides, neoplasias linfoides, enfermedades de células mastoides y neoplasias histiocíticas. Dentro de cada categoría, las diferentes enfermedades se definen de acuerdo a una combinación de hallazgos morfológicos, de inmunofenotipo, características genéticas y síndromes clínicos específicos. En adultos su incidencia se estima en 4-5 casos / 100.000 habitantes al año, la leucemia mieloide aguda (LMA) representa el 40% de los casos. En la edad pediátrica la incidencia es de 40 nuevos casos / 1.000.000 habitantes al año, de ellos un 75% son leucemias linfoblasticas [28]. La clasificación de un determinado tipo de leucemia, nos permite dar tratamientos específicos, con mejores resultados. El objetivo principal del tratamiento antineoplásico es erradicar la clona leucémica y restablecer la hematopoyesis normal en la médula ósea, lo cual cada vez es más posible de lograr, siempre que se apliquen tratamientos adecuados a los diferentes grupos pronósticos. !32 El avance tecnológico en la última década se ha reflejado tanto en el desarrollo de técnicas específicas para la identificación de las leucemias, como en el uso de nuevos agentes farmacológicos y biológicos, lo cual en conjunto, resulta en mejores formas de tratamiento para las leucemias agudas, en donde ya no es suficiente el hecho de integrar remisión, sino cada vez lograr sobrevidas más prolongadas e incluso, mayor porcentaje de curaciones. Los adelantos en el tratamiento de la LMA han dado lugar a tasas de remisión completa sustancialmente mejores. El tratamiento deberá ser lo suficientemente intensivo como para lograr una remisión completa, ya que la remisión parcial no ofrece beneficios sustanciales de supervivencia [28,29]. Aproximadamente, de 60 a 70% de los adultos con LMA se puede esperar que logren un estado de remisión completa después del tratamiento apropiado de inducción. Se puede esperar que más de 25% de los adultos con LMA (cerca de 45% de los que logran remisión completa) sobrevivan 3 años o más y es posible que se curen. Las tasas de remisión de LMA en adultos están inversamente relacionadas con la edad, con una tasa esperada de remisión de más de 65% para los pacientes menores de 60 años de edad. Existen datos que indican que una vez que se logra, la duración de la remisión puede ser más corta entre los pacientes de edad más avanzada. Parece que la mayor morbilidad y mortalidad durante la inducción está directamente relacionada con la edad. Otros factores pronósticos adversos son la infiltración del sistema nervioso central, infección sistémica al momento del diagnóstico, recuento elevado de leucocitos (>100.000/mm3), LMA inducida por tratamiento y antecedentes de síndrome mielodisplásico o un trastorno hematológico previo [29]. Su etiología es desconocida, no obstante existen múltiples factores externos e internos que predisponen a su desarrollo. !33 Una vez sospechada esta enfermedad se utiliza las siguientes pruebas complementarias en su diagnostico: Mielograma Es de utilidad para asignar una variedad en concreta de leucemia aguda (LA), presenta un significado clínico importante la presencia de signos morfológicos displásicos, el cual se observa en un 15 % de los pacientes. Citoquímica Es utilizada para ayudar a tipificar el linaje de la LA, se basa fundamentalmente en las tinciones de la mieloperoxidasa, negro sudan y esterasas. Citometría de flujo La caracterización inmunofenotipica se lleva a cabo mediante una amplia batería de anticuerpos monoclonales; algunos de estos reaccionan con antígenos bien definidos, específicos para una determinada línea celular e incluso para un estadio madurativo concreto, otros son menos restrictivos pero cuando se emplean como parte de una serie, también prestan una valiosa contribución diagnostica y pronostica al delimitar nuevas variantes y reconocer leucemias con marcadores linfoides y mieloides. Esta técnica bien empleada, permite identificar la estirpe de la LA correctamente en un 98-99% de los casos. !34 Citogenética El análisis citogenético proporciona una de las pruebas más sólidas disponibles para el pronóstico, prediciendo así resultados tanto de la inducción a remisión como el tratamiento post remisión, según se ve en el estudio del Southwest Oncology Group (SWOG) y el Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) (E-3489) [30]. Las anomalías citogenéticas que indican un pronóstico bueno son la t(8;21), inv(16) o t(16;16) y t(15;17) [Figura 3]. Las características citogenéticas normales presagian una LMA de riesgo regular. Los pacientes con LMA que se caracteriza por supresiones de los grupos grandes o monosomías de cromosomas 5 o 7; por translocaciones o inversiones de cromosoma 3, t(6;9), t(9;22); o por anomalías de cromosoma 11q23 tienen pronósticos particularmente precarios con quimioterapia. Estos subgrupos citogenéticos predicen el resultado clínico en pacientes de edad avanzada con LMA al igual en pacientes jóvenes. Los genes de fusión formados en t (8;21) e inv (16) pueden ser detectados por reacción en cadena de polimerasa relacionada con la transcriptasa inversa (RCP-TI) o hibridación por fluorescencia in situ (FISH) la cual indicará la presencia de estas alteraciones genéticas en algunos pacientes en quienes la citogenética estándar era técnicamente inadecuada [31]. !35 Figura 3. Análisis de los diferentes cariotipos de las leucemias agudas mieloblástica. [30] La gran mayoría de las alteraciones típicas de las LA son reordenamiento equilibrados o balanceados y de varios de ellos se conoce su equivalente molecular o gen de fusión. Biología molecular Es uno de los campos en que más se ha avanzado en él diagnostico, pronostico y como dianas terapéuticas. Actualmente existen clasificaciones basadas en la expresión de determinados genes, por las cuales se toman algoritmos terapéuticos [Tabla 2 y figura 4] [31]. !36 Figura 4. Análisis de SLE y la SG según alteraciones moleculares [31]. Anatomía patológica La pieza analizada es el cilindro óseo, habitualmente de la cresta iliaca. En muchos centros de referencia, utilizan el estudio de medula ósea como factor pronostico de gran relevancia, teniendo en cuenta la celularidad, el grado de afección y la estructura trabecular. !37 SUPERVIVENCIA LIBRE ENFERMEDAD SUPERVIVENCIA GLOBAL Tabla 2. Hallazgos citogenéticas y moleculares usados en la estratificación de riesgos de la LMA [29-30-32]. Riesgo Citogenética Molecular Favorable inv(16) o t(16;16) Normal citogenética: t(8;21) Aislado bialelico CEBPA mutación t(15;17) NPM1 mutación sin FLT3 ITD Intermedio Normal citogenética KIT mutación " inv(16) o t(16;16)" t(8;21) Aislado +8 t(9;11) Pobre Complejo (≥3 anormalidades clonales) Normal citogenética con: FLT3 ITD Monosomia cariotipo −5/−5q o −7/−7q 11q23 reordenamiento otro que t(9;11) inv(3) o t(3;3) t(6;9) t(9;22) !38 Dentro de los aspectos importantes a tomar en cuenta, cuando se planea el tratamiento de un paciente con leucemia aguda se encuentran [32]: 1) clasificación biológica de la leucemia en base a inmunofenotipo, citogenética y alteraciones genéticas moleculares 2) definición de grupos de riesgo en base a factores de impacto pronóstico conocidos 3) evaluación de enfermedad mínima residual para la redefinición de remisión completa y selección de tratamientos de acuerdo a ésta 4) uso de nuevas drogas y esquemas con dosis altas de quimioterapia 5) inmunoterapia 6) tratamientos dirigidos a blancos moleculares 7) avances en el trasplante de células progenitoras hematopoyéticas. I.4.1. Trasplante de precursores hematopoyético El trasplante de precursores hematopoyéticos es un procedimiento médico altamente especializado y complejo. Dentro del trasplante hematopoyético hablamos de dos modalidades: trasplante autólogo y trasplante alogénico. En el trasplante autólogo las células progenitoras infundidas son las del propio enfermo; este procedimiento permite la administración de altas dosis de quimioterapia evitando la aplasia prolongada. La otra modalidad es el Trasplante alogénico, en el que las células progenitoras infundidas son las de un donante emparentado o no emparentado. En los últimos años el trasplante alogénico de precursores hematopoyéticos (TPH) ha sido el arma terapéutica más efectiva para la curación de las leucemias !39 agudas, su eficacia se basa principalmente en el régimen de acondicionamiento y la respuesta inmunológica del donante. Durante las últimas décadas el TPH ha evolucionado desde un procedimiento experimental hasta convertirse en el tratamiento estándar de muchas enfermedades neoplásicas como las leucemias agudas, síndromes mielodisplásicos, linfomas, mieloma múltiple y otras hereditarias, inmunes o genéticas como talasemia, anemia aplásica, enzimopatías etc. También es el tratamiento de elección de enfermedades no malignas, congénitas y adquiridas del Sistema Hematopoyético. El primer trasplante alogénico lo realizó E. Donnall Thomas en 1957. Desde entonces, este procedimiento se ha incrementado exponencialmente, incorporando nuevas indicaciones ya aceptadas o en investigación, que incluyen enfermedades no neoplásicas congénitas y adquiridas como las inmunodeficiencias, anemias, enfermedades metabólicas y autoinmunes, siendo la indicación más frecuente las neoplásicas hematológicas. Los primeros trasplantes alogénicas se comenzaron a realizar a partir de médula ósea de hermanos gemelos, validando su uso y con resultados favorables, posteriormente el conocimiento más profundo del Sistema HLA permitió crear los registros de donantes, en la actualidad existen más de 22 millones de donantes no emparentados en los registros. Esto ha permitido que más de la mitad de los trasplantes en pacientes que no tienen un donante familiar HLA idéntico se realicen a partir de un Donante No Emparentado, hoy en día con el uso de los factores estimulantes de colonias granulociticas, la sangre periférica está utilizándose con mayor frecuencia. Elianne Gluckman en 1989 publicó la realización del primer trasplante con sangre de cordón umbilical, fue en una niña con diagnostico de Anemia de Fanconi. Actualmente existen en los bancos de cordónes una gran cantidad de unidades !40 congeladas, lo cual garantiza que prácticamente todos los pacientes podrían tener opción de utilizar este recurso de precursores hematopoyéticos. Aquellos pacientes que requieren un trasplante de precursores hematopoyéticos de realización urgente, la modalidad del cordón umbilical (SCU) o la del trasplante haploidéntico, pueden permitir que un gran número de pacientes cuya opción terapéutica mejor es el trasplante alogénico sean finalmente trasplantados dada la rápida disponibilidad [32]. I.4.1.1. Historia del Trasplante Hematopoyético Al final de la II guerra mundial tras las bombas atómicas, se estudiaron los daños sufridos por la población que habían sobrevivido a la radiación, llegándose a la conclusión de que el Sistema hematopoyético, era el más sensible a la radiación y que la muerte debida a bajas dosis de radiación era debida principalmente al fallo medular secundario. Investigaciones de TPH en ratones sugieren la posibilidad de realizar trasplantes de médula ósea, si el bazo era protegido con una lámina de plomo, posteriormente Lorenz et al. [31] demostraron cómo dicha protección podía hacerse también con la infusión de células procedentes de la MO. En los años siguientes se desarrolla una intensa actividad investigadora en torno a este fenómeno de protección radiológica y al trasplante alogénico de tejidos. Los hallazgos en roedores posibilitan las experiencias piloto del grupo de E.D.Thomas [32] sobre modelos caninos, que bien se pueden considerar el antecedente inmediato del trasplante de medula ósea (TMO) en humanos. Experimentos posteriores demostraron cómo el efecto protector de la infusión de células de la medula ósea era debido a la transferencia de células vivas y de la producción de inmunotolerancia entre donante y receptor [33]. !41 Fase 3 Fase efectora celular e inflamatoria. -Los efectores celulares principales de la EICR aguda son los linfocitos T citotóxicos y las células NK. -Las citoquinas inflamatorias TNF-a e IL-1 inducen daño tisular directamente mediante la inducción de apoptosis y necrosis. El TNF-a activa las CDs y aumenta la presentación de aloantígenos. Induce la producción de quimoquinas inflamatorias que son las que reclutan linfocitos T, neutrófilos y monocitos a los órganos afectos [37]. I.4.1.3.1. Clínica de la EICR aguda Las características clínicas están marcadas por el efecto citotóxicos de los linfocitos del donante contra las células del receptor, las más frecuentes son las células epiteliales de la piel, células de los conductos biliares y de las criptas en la mucosa intestinal. Se ha denominado históricamente al EICR aguda al evento que ocurría en los primeros 100 días postrasplante. No obstante utilizando los criterios establecidos por el NIH [tabla 3] es la sintomatología y no el momento de aparición la que determina el diagnóstico diferencial entre EICR aguda o crónica, incluso es posible la coexistencia de signos y o síntomas atribuibles tanto a EICR aguda como crónica [38]. !48 Piel Las manifestaciones cutáneas sueles ser eritema maculopapuloso que habitualmente es pruriginosos y/o doloroso, puede ser localizado en palmas, plantas, orejas, mejillas, cuello, cara interna de muslos, tronco y flancos, no obstante las formas generalizadas suelen ocurrir. En sus formas avanzadas puede manifestarse con descamación cutánea, formación de bullas y necrosis epidérmica. La afectación cutánea se clasifica en 4 grados, según la severidad [tabla 4]. El diagnóstico diferencial de la EICRa cutánea incluye los efectos de la quimioterapia ó radioterapia, alergia a fármacos e infecciones virales Hepático La alteración del perfil enzimático hepático suele asociarse a manifestaciones cutáneas y/o intestinales. Estas alteraciones de la bilirrubina y fosfatasa alcalina se asocia al aumento de las transaminasas, cuando esto sucede tenemos que realizar el diagnóstico diferencial con enfermedad veno oclusiva hepática, infecciones, toxicidad por fármacos, etc. La biopsia es de utilidad cuando no existes otro órgano afecto por esta complicación post TPH, cuando se realiza los hallazgos son característicos y patognomónicos [tabla 5]. Digestivo Es la manifestación clínica que suele ser la más severa y en algunos casos la de menor tasa de respuesta al tratamiento inmunosupresor. Las manifestaciones clínicas son anorexia, nauseas, vómitos, diarrea, dolor abdominal de tipo cólico y en casos graves hemorragia. Los diagnósticos diferenciales sueles ser: toxicidad gastrointestinal inducida por el régimen de acondicionamiento, infecciones víricas o bacterianas, por lo que es necesario realizar estudios microbiológicos seriados y la biopsia es necesaria para el !49 establecer el diagnóstico definitivo de EICRa digestivo, dado que los hallazgos anatomopatológicos [39]. Los pacientes que solo presentan síntomas de EICR de localización alta como son: anorexia, dispepsia, náuseas y vómitos, sin diarrea, presentan una mayor tasa de respuesta al uso de esteroides y menor severidad de los síntomas, estos datos clínicos son utilizados a la hora de plantear el uso de tratamientos más intensos. [38,39]. Otros órganos Afecta también al tejido linfoide y de esta manera una disminución de los centros germinales y anomalías en las poblaciones linfoides, analíticamente se manifiesta como inversión del cociente CD4/CD8. Estos daños producidos por la reactividad linfoide aumentan el riesgo de desarrollar infecciones severas en el periodo postrasplante. También se han observado síntomas oftalmológicos como fotofobia, conjuntivitis hemorrágica y formación de pseudomembranas, estas manifestaciones se han asociado a peor supervivencia [36,39]. !50 I.4.1.3.2. Factores de riesgo para el desarrollo de EICR agudo Factores que predisponen a mayor riesgo de EICR agudo - Tipo de acondicionamiento, si es mieloablativo o de intensidad reducida. - Diferencias en el HLA o la utilización de un Donante no emparentado. - Elegir donantes como mujeres con embarazos previos. - Edad, mayores de 45 años en los donantes. - Donante mujer - receptor varón. - Tipo de PHP, mayor en sangre periférica que medula ósea. - Cantidad de linfocitos T infundidos. - Mayor celularidad de CD34. - Tipo de profilaxis de la EICR utilizada. - No alcanzar los niveles deseados del inmunosupresor, mayor evidencia con la ciclosporina. - No utilizar descontaminación intestinal. !51 I.4.1.3.3. Graduación del EICR La enfermedad injerto contra receptor aguda fue clasificada de 0 a 4 según los criterios de Glucsberg et al [41]. La enfermedad injerto contra huésped crónica fue clasificada como limitada o extensa según criterios de Shulman el al [38]. La graduación se realiza teniendo en cuenta el grado de afectación hepática, digestiva y cutánea, estos datos son obtenidos del laboratorio, anatomía patológica y signos clínicos [40]. ! Tabla 3. Clasificaciones EICR, según momento aparición y síntomas [40]. !52 ! Tabla 4. Gradación según afectación por órgano y severidad [40]. ! Tabla 5. Gradación clinica [40]. !53 I.4.1.3.4. Tratamiento y profilaxis Valorando las distintas fases de la fisiopatogenia de la EICR y teniendo en cuenta el conocimiento de los mecanismos implicados en su desarrollo existen diseños de nuevas aproximaciones que están demostrando una eficacia importante tanto desde el punto de vista profiláctico como también terapéutico. Se han diseñado estrategias en relación a la prevención, que son las que actúan sobre las fases I y II de la patogénesis y otras que han sido encaminadas al tratamiento del EICR, estas intentan manipular las fases II y III [40,41]. Pautas estándar de profilaxis La estrategia farmacológica primaria para prevenir la EICR aguda es la utilización de los inhibidores de la calcineurina, enzima fundamental para la activación de los linfocitos T. El Tacrólimus y la Ciclosporina A son similares en cuanto a la eficacia clínica, el mecanismo de acción y los efectos tóxicos incluyendo la hipomagnesimia, la hiperpotasemia, la hipertensión y la nefrotoxicidad [41]. Se han comparado otras estrategias como son la combinación de Tacrólimus/ Metotrexate la cual permitió reducir el riesgo de EICR en trasplante de donante no emparentado, estos estudios sugieren que la combinación de un inhibidor de calcineurina (CsA o Tacrólimus) más Metotrexate, representa el tratamiento de elección en la actualidad [42]. Nuevas estrategias de profilaxis La Ciclofosfamida postrasplante es capaz de generar un efecto citotóxico selectivo sobre los linfocitos T que se encuentran en fase de división celular, sin alterar la viabilidad del resto de poblaciones linfoides. Esto permite realizar trasplantes haploidénticos con depleción in vivo linfoide T con una incidencia de !54 EICR similar al resto de las modalidades de trasplante utilizadas [46]. También existen datos de sus optimistas resultados cuando se utiliza en donantes HLA idénticos, no obstante son resultados que necesitan su análisis a largo plazo [43]. Estrategias de tratamiento de la EICR El tratamiento de elección de la EICR continúa siendo los esteroides, en relación a la dosis existe un estudio donde demuestran que las dosis estándar de 2mg/kg/día de 6 metilprednisolona serían similares en eficacia a dosis más bajas [44]. Además del sistémico, el tratamiento tópico constituye una herramienta clave para el control de la sintomatología sin tener que recurrir al incremento de tratamiento inmunosupresor; en este sentido, la Beclometasoma dipropionato ha mostrado su eficacia en estudios prospectivos randomizados en combinación con dosis bajas de 6 metilprednisolona, aumentando la tasa de respuestas e incluso la supervivencia a un año en pacientes con EICR agudo digestivo e incluso permite obtener un elevado porcentaje de respuestas en ausencia de tratamiento sistémico con esteroides [45]. Varios ensayos clínicos han tratado de validar algún tratamiento para utilizar en aquellos pacientes que son refractarios a los esteroides, también ha sido fallido el intento de valorar respuestas tanto en EICR agudo como crónico en asociar un segundo fármaco inmunosupresor a los esteroides dentro de la primera línea de tratamiento [46], no existe un tratamiento que pueda considerarse estándar, habiéndose empleado Mofetil Micofenolato (MMF), Sirólimus, Alemtuzumab, ATG, Pentostatina, etc. !55 Nuevas estrategias de tratamiento: terapia celular Las estrategias más interesantes desde el punto de vista de la fisiopatología de la EICR, son las terapias celulares, como son el uso de células mesenquimales o linfocitos T reguladores (CD4+/CD25+). También la fotoaféresis extracorpórea ofrece buenos resultados, su mecanismo de acción reside en alterar la proporción de subpoblaciones linfocitarias, mejoraría las manifestaciones cutáneas eritematosas y esclerodermiformes además de las extracutáneas propias de la EICR crónica [47,48]. En relación con el uso de células mesenquimales, se ha fracasado en el intento de emplearlas en la estrategia de profilaxis [47], ya que no se vio menor incidencia de EICR cuando se empleaba desde el día 0 del TPH. En relación al tratamiento, diversos estudios han descrito la eficacia con una tasa de respuestas variable en función de la línea de tratamiento en que se han utilizado, la severidad de la EICH y el órgano afecto [48]. !56 II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS !57 !64 III.1. TIPO DE ESTUDIO Se trata de un estudio retrospectivo de una cohorte de pacientes con leucemia aguda, sometidos a TPH alogénico. III.2. POBLACIÓN ESTUDIADA Se han estudiado en total 92 pacientes diagnosticados entre 1999 y 2009 en el Hospital Regional Universitario de Málaga, incluyendo en la serie también pacientes del Hospital Materno Infantil de Málaga, en total 59 pacientes pertenecieron al hospital de adultos y 33 al pediátrico. El criterio de inclusión fue que los pacientes tuvieran diagnostico de hemopatías malignas y se sometieran a trasplante hematopoyético alogénicos. III.2.1. Variables estudiadas Variables relacionadas con el paciente y la enfermedad de base •Hospital de procedencia: Se considero el hospital donde se realizo el TPH, Hospital Carlos haya / Hospital Materno Infantil (variable cualitativa nominal policotómica). •Edad: valorada en años, (variable cuantitativa continúa). •Sexo: femenino o masculino, (variable cualitativa nominal dicotómica). •Enfermedad de base: se lo considero al diagnóstico previo al TPH, Leucemia mieloblástica aguda (LMA), Leucemia linfoblastica aguda (LLA), LMA secundaria, (variable cualitativa nominal dicotómica). !65 •Respuesta al tratamiento: se valoró la respuesta previa al TPH, 1ª remisión completa (1RC), 2ª remisión completa (RC2), no remisión (NR), (variable cualitativa nominal dicotómica). •Positividad para el alelo GSTM1 y GSTT1 en donante y receptor, (variable cualitativa nominal policotómica). Variables relacionadas con el tratamiento previo al trasplante •Tipo de acondicionamiento utilizado: diferentes tipos de acondicionamiento quimioterápicos y asociados a irradiación corporal total (ICT), (variable cualitativa nominal dicotómica). •Esquema de acondicionamiento con ICT versus (vs) a aquellos que solo utilizaron quimioterapia, se los asocio en ICT vs. ICT + quimioterapia, (variable cualitativa nominal dicotómica). Variables relacionadas con el TPH •Tipo TPH: el tipo de donante utilizado se lo valoro en Donante emparentado (DE) versus donante no emparentado (DnE) (variable cualitativa nominal dicotómica). •Identidad del HLA: se valoró la identidad del HLA del donante ,idéntico en el HLA vs no idéntico, (variable cualitativa nominal dicotómica). •Tipo de progenitor: tipo de precursor utilizado en el TPH,médula ósea (MO), sangre periférica (SP) y sangre cordón umbilical (SCU) (variable cualitativa nominal dicotómica). •EICR agudo: se valoró la aparición de síntomas de EICR, presencia vs ausencia del mismo (variable cualitativa nominal dicotómica). •Grado EICR: grados clínicos de la EICRag. valorado en I, II, III y IV, (variable cualitativa ordinal policotómica). !66 •Grado EICR: grados clínicos agrupados en leves 0-I vs. severos II-IV (cualitativa nominal dicotómica). •Localización EICR agudo: se valoró la localización clínica ,intestinal, cutánea, hepática, mixta (variable cualitativa nominal policotómica). •EICR crónico: se valoró la presencia vs ausencia del mismo (variable cualitativa nominal dicotómica). •Grado EICR crónica: se valoró los grados clínicos del EICR crónico en Leve, moderado o severo (variable cualitativa nominal policotómica). •Tratamiento utilizado en la enfermedad injerto contra receptor aguda, se enumeran los diferentes tipos utilizados (variable cualitativa nominal dicotómica). •Toxicidad hepática: valorado en grado clínicos según afectación de enzimas hepaticas, I, II, III o IV (variable cualitativa ordinal policotómica). •Mortalidad relacionada con el TPH: la mortalidad que sucedió en el momento del TPH, presencia vs ausencia (variable cualitativa nominal dicotómica). •Causas de muerte: análisis de las diferentes causas de muerte en la serie de pacientes (variable cualitativa nominal dicotómica). Variables evento: respuesta, recaída y muerte •Recaída: recaída de su enfermedad de base post trasplante, sí vs. no (variable cualitativa nominal dicotómica). •Respuesta al tratamiento del EICR: respuesta favorable al tratamiento comenzado, si vs. No (variable cualitativa nominal dicotómica). •Evento muerte: presencia vs ausencia de la misma, sí vs. no (variable cualitativa nominal dicotómica). !67 Variables tiempo •SG: cuantitativa continua. Se define como SG al tiempo transcurrido desde el diagnóstico hasta la muerte por cualquier causa o fecha de último control. III.3. Métodos de estudio III.3.1. Extracción y obtención de DNA El ADN genómico fue extraído en los 92 pacientes y donantes de sangre periférica total, unos 30 días antes del trasplante de precursores hematopoyéticos, utilizando procedimientos convencionales (kit de aislamiento de ADN Puregene, Gentra Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.), y se almacenó a -80 Cº hasta que se han realizado las determinaciones mediante la técnica de PCR. III.3.2. Calidad de DNA Utilizamos para medir la concentración y pureza del ADN el espectrofotómetro Thermo Scientific NanoDrop 2000.!Aceptando como indicador la relación de absorbancias a las longitud de onda entre 260nm y 280nm para el ADN. Con un rango de detección de 2ng/µL (dsDNA). !68 III.3.3. Análisis del ALELO NULO/Amplificación de PCR en tiempo real Esta detección se realizó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando la amplificación de los cebadores siguientes: GSTT1 cebador 5 `-TTC CTT ACTO AAC GGT CAC ATC TC -3»; GSTT1 Primer inversa 5 `-TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA -3»; GSTM1 cebador 5 `- GAA CTC AAC GAA AAG CTA AAG C -3», y GSTM1 Primer inversa 5 `- GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G -3». Cada reacción de 25 µl PCR contenía 2,5 µl de 10X tampón de reacción con MgCl2 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 10 ρmol de cada cebador, 100 ρmol / µl cada uno de desoxinucleósidos trifosfato (deoxyATP, el trifosfato de desoxiguanosina, el trifosfato de desoxicitidina, y el trifosfato de timidina, Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CA) en Tris - HCl, 1 unidad de Taq ADN polimerasa HotStar (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), y 100 ng de DNA genómico de plantilla a temperatura de templado de 58 °C durante 40 ciclos. En los alelos nulos, todos los cebadores y sondas hibridan dentro del gen correspondiente. Se determinaron estos alelos nulos antes que el paciente haya sido sometido al trasplante de precursores hematopoyéticos, luego del trasplante se han determinado cada 2-3 meses coincidiendo con la determinación de los alelos nulos de las técnicas de quimerismo. !69 LightCycler: Condiciones de ejecución Se utilizó para realizar la PCR en tiempo real el tecnología LightCycler. Se establecieron condiciones similares para todas las carreras: 100 ng de ADN genómico se añadió a 20 ml de volumen de reacción que contiene 0,4 mmol / l cada cebador, 0,2 mmol / l. anclar y sonda de sensor y 2 ml de sondas de ADN Fast Star LightCycler Maestro de hibridación (Roche Molecular Biochemicals) que incluían tampón, Taq ADN polimerasa y MgCl2. La concentración final Mg2þ en la mezcla de reacción se ajustó a 3,5 mmol / l en todos los casos, a excepción de SRY, que era 4,5 mmol / l. beta globina, que se utiliza como un gen de referencia, se amplificó en la misma ejecución y siguiendo el mismo procedimiento descrito para cada marcador. Los cebadores y sondas para la amplificación beta globina fueron proporcionados en un kit comercial (ADN kit de control LightCycler, Roche). Los condiciones del programa solicitado QRT-PCR fueron probados previamente. Cuantificación de la muestra Con el fin de reducir la variación entre los diferentes ensayos y muestras, se utilizó un procedimiento basado en la cuantificación relativa de los genes diana vs su control en relación con los cálculos de referencia gene.31, se llevaron a cabo automáticamente por el software LightCycler (RelQuant, versión 1.0, Roche). La Eficiencia de cada gen se calcularon a partir de las laderas del punto de cruce (Cp) vs parcelas de concentración de ADN, según el E¼10 fórmula (_1 / pendiente). !70 III.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO En primer lugar se realizó un análisis estadístico descriptivo de la serie. Los resultados se expresaron como porcentajes en las variables categóricas y como medianas (extremos) para las variables continuas. En el análisis univariante se determinó el grado de relación existente entre dos variables cualitativas realizamos tablas de contingencia, utilizando el test de Chi cuadrado, corregido con el test de Fisher en los casos en que el tamaño de la muestra es reducido y se observan pocos eventos. El nivel de significación estadística para apoyar la dependencia de las variables fue de 0.05. Describimos el tiempo hasta el evento desarrollando las curvas de supervivencia mediante el método de Kaplan Meier y para comparaciones las pruebas de log rank obteniendo la función de probabilidad de supervivencia. Para el análisis multivariante, las variables con un valor de P < 0.10 fueron incluidas en los análisis usando el método de riesgo proporcional de Cox para eventos temporales (observaciones incompletas, Cox DR. 1972) o el método de Fine and Gray para la incidencia acumulativa (Fine JP, Gray RJ. 1999), se utilizó para la MRT, EICR aguda y crónica, la recaída, la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global. El análisis estadístico se realizó usando el SPSSv17. !71 III.5. UTILIZACIÓN DE LA EXPRESION DEL ALELO COMO FACTOR PREDICTIVO El análisis de su validez puede obtenerse calculando los siguientes valores: Sensibilidad Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo enfermo, es decir, la probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga en la prueba un resultado positivo. La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test para detectar la enfermedad. Especificidad Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, es decir, la probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo. Se puede definir la especificidad como la capacidad para detectar a los sanos. Valor predictivo positivo Es la probabilidad de padecer la enfermedad si se obtiene un resultado positivo en el test. El valor predictivo positivo puede estimarse, por tanto, a partir de la proporción de pacientes con un resultado positivo en la prueba que finalmente resultaron estar enfermos: !72 Valor predictivo negativo Es la probabilidad de que un sujeto con un resultado negativo en la prueba esté realmente sano. Se estima dividiendo el número de verdaderos negativos entre el total de pacientes con un resultado negativo en la prueba: !73 Figura 7. Regímenes de acondicionamiento empleados. En un 70%, 64 pacientes, el donante fue emparentado (DE), siendo el 30% restante donantes no emparentados. En relación al HLA, sólo en el 13% (12 pacientes) de de los receptores existió disparidad con su donante, la disparidad fue de 9/10 en todos los casos [tabla 6]. Como fuente de progenitores hematopoyéticos se utilizó médula ósea en 41 pacientes (44%), sangre periférica en 43 (46%) y cordón umbilical en 8 (10%). !80 Regimen de acondicionamiento Bucy ICT+ Cy Tipos de Acondicionamiento 28 30.4 64 69.6 92 100.0 ICT+ Cy BuCy Total Frecuencia Porcentaje Tabla 6. Disparidad HLA, tipo progenitores y tipo de donante. !81 Tipo de donante 64 69.6 28 30.4 92 100.0 DE DnE Total Frecuencia Porcentaje Disparidad del HLA 80 87.0 12 13.0 92 100.0 idéntico no idéntico Total Frecuencia Porcentaje Tipo de progenitores 43 46.7 41 44.6 8 8.7 92 100.0 SP MO SC Total Frecuencia Porcentaje La profilaxis de la enfermedad injerto contra receptor aguda en los pacientes sometidos a trasplantes de donante emparentado se realizó con: - Ciclosporina a dosis de 1.5 mg/Kg./12 h iv desde día +1, asociado a Metotrexate intravenoso en pauta corta, a 10 mg/m2 iv los días +1, +3 y +6 post TPH. En los receptores de donante no emparentado se utilizaron combinaciones de: - Tacrólimus a dosis de 0.02 mg/Kg/día intravenoso en infusión continúa desde el día –3 del TPH. -Sirólimus a dosis de 8 mg vía oral comenzando el día –3 del TPH, continuando con 2 mg/día vía oral. -ATG a dosis de 2,5 mg/kg/día los días -5,-4,-3 del TPH. De los 92 pacientes estudiados en la serie un 37 %, 40 pacientes, desarrollaron enfermedad de injerto contra receptor aguda (EICRag.) grado II-IV En relación con el sitio donde fueron las manifestaciones clínicas, observamos que del 37% total de incidencia de EICRag. la localización fue en un 12% cutánea, 3% hepática, 6 % intestinal y en un 13% combinado cutáneo con digestivo [Tabla 7]. Tabla 7. Localización enfermedad injerto contra receptor. !82 LOCALIZACION EICR 14 12.0 3 3.0 5 6.0 12 13.0 34 37.0 CUTANEO HEPATICO INTESTINAL Piel + intest Total Frecuencia Porcentaje IV.2. RESULTADOS DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES GST CON LAS VARIABLES ESTUDIADAS En la serie estudiada observamos que el 75% de los receptores del TPH mostró expresión del alelo del gen GSTT1 (GSTT1+) y el 55% lo fue para el alelo de GSTM1 (GSTM1+), mientras que el 75% de los donantes de precursores hematopoyéticos expreso el alelo GSTT1+ y el 53% fue GSTM1+ [Figura 8]. Figura 8. Distribución en la expresión de los diferentes alelos. !83 Analizamos en los receptores y en los donantes las diferentes combinaciones de la expresión de los alelos GSTM1 y GSTT1, estos fueron los resultados [Figura 9 y tabla 8]. En relación con la expresión de los alelos GSTT1 encontramos que: -El subgrupo en donde tanto donante como receptor expresaban el alelo fue de un 64 %. -El subgrupo de donante positivo (D+) y receptor negativo (R-) fue de un 11 %. -El subgrupo de donante negativo (D-) y receptor positivo (R+) también ha sido de un 11 %. -El subgrupo de donante negativo (D-) y receptor negativo (R-) ha sido de un 14 %. En relación con la expresión del alelo GSTM1 el análisis de los subgrupos fue el siguiente: -Un 20.7 % en el subgrupo que tanto donante como receptor expresaban el alelo GSTM1. -El subgrupo de donante positivo (D+) y receptor negativo (R-) fue de un 22.8 %. -En el subgrupo de donante negativo (D-) y receptor positivo (R+) los resultados fueron de un 23.9 %. -El subgrupo de donante negativo (D-) y receptor negativo (R-) ha sido de un 32.6 %. !84 Figura 9. Expresión de los diferentes alelos en los diferentes subgrupos. D+ (donante positivo) D- (donante negativo) R+ (receptor positivo) R- (receptor negativo) Tabla 8. Frecuencias y porcentajes expresión GSTT1 y GSTM1. !85 GSTT1 10 11.0 10 11.0 13 14.0 59 64.0 92 100.0 D+RD-R+ D-RD+R+ Total Válidos Frecuencia Porcentaje GSTM1 19 20.7 21 22.8 22 23.9 30 32.6 92 100.0 D+RD-R+ D-RD+R+ Total Válidos Frecuencia Porcentaje GSTT1 GSTT1 D+R+D-R-D-R+D+RPorcentaje 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 GSTM1 GSTM1 D+R+D-R-D-R+D+RPorcentaje 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 En relación al análisis del alelo GSTM1 y GSTT1, realizamos una división de subgrupos entre la expresión o no del alelo en los receptores y donantes, fue realizada para relacionar los datos y las variable del TPH con los diferentes subgrupos de expresión del alelo. A la hora de subdividir los grupos del alelo GSTM1 y analizar los resultados, observamos que: - En un 55,4% el alelo era positivo en receptores, siendo un 46,6% negativo - Bajo la hipótesis del presente trabajo, sobre el reconocimiento alogénico del alelo del receptor de aquellos donantes que no lo expresaban, también analizamos el subgrupo donde el receptor expresa el alelo (R+) y el donante no lo presenta (D-), y analizamos este subgrupo frente al resto de los grupos [Figura 11]. -De la misma manera analizamos el subgrupo con expresión opuesta, receptor positivo y donante negativo que fueron del 22,8% frente al resto de los subgrupos. [Figura 12]. !86 !87 R+ / DGSTM1 vs resto combinaciones R+D-Resto Porcentaje 100 80 60 40 20 0 Figura 12. Comparación R+ vs R (izquierda). Comparación de porcentajes de R+/Dvs el resto combinaciones (derecha) R+/ DGSTM1 71 77.2 21 22.8 92 100.0 Resto R+DTotal Válidos Frecuencia Porcentaje Receptor + / Receptor - R -R + Porcentaje 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 R- / D+ GSTM1 vs resto combinaciones restoRD+ Porcentaje 100 80 60 40 20 0 Figura 11. Comparación de porcentajes de R-/D+ vs el resto combinaciones. R-/ D+ GSTM1 19 20.7 73 79.3 92 100.0 RD+ resto Total Válidos Frecuencia Porcentaje R+ / RGSTM1 51 55.4 41 44.6 92 100.0 R + R - Total Válidos Frecuencia Porcentaje Cuando realizamos el análisis de la expresión del alelo GSTT1 en los 4 subgrupos de donantes y receptores, encontramos que en el grupo D+/Rde 10 pacientes en total, 7 (70%) de ellos no desarrollaron EICRag. En el grupo D-/R+, de 10 pacientes 5 (50%) de ellos no presentaron EICRag. Grado II-IV. En el grupo D-/Rde 13 pacientes, 9 pacientes (69%) no desarrollaron EICRag. y en el grupo D+/R+ de 59 pacientes, 37 de ellos (62%) no presentaron EICRag. De este análisis observamos que no hubo diferencias en la incidencia de EICRag. Este análisis no tuvo asociación estadísticamente significativa, estos datos presentaron una de p= 0.6796 [Figura 20]. No observamos relación estadística entre la variabilidad genética entre donante y receptor en la expresión del alelo GSTT1 y la mayor incidencia de EICRag. [Figura 20]. Tampoco relacionamos de forma significativa el resto de las variables del estudio con el alelo GSTT1. Cuando relacionamos las variables del estudio con el EICRag., en el análisis univariante observamos los siguientes resultados reflejados en la tabla 9 según el análisis de la expresión del alelo GSTM1 en los 4 subgrupos de donantes y receptores: -Encontramos que en el grupo D+/Rde 19 pacientes en total, 15 (79%) de ellos no desarrollaron EICRag. -En el grupo D-/R+, de 21 pacientes 8 (38%) de ellos no presentaron EICRag. Grado II-IV. -En el grupo D-/Rde 22 pacientes, 19 pacientes (86%) no desarrollaron EICRag. -En el grupo D+/R+ de 30 pacientes, 16 de ellos (53%) no presentaron EICRag. !88 De este análisis observamos que en los grupos en donde el receptor no expresaba el alelo, tenían una menor incidencia de EICRag. y en el subgrupo donde el R-/Dla incidencia es aún más baja. Este análisis tuvo una de p= 0.0096 [Figura 14]. Tras el análisis anterior decidimos comparar a los receptores que expresaban el alelo GSTM1 (R+) frente a los que no lo expresaban (R-), observamos una menor incidencia de EICRag. en los pacientes que no expresaban el alelo GSTM1, de 41 pacientes en total que no lo expresaban, 34 de ellos (82%) no desarrollaron EICRag., mientras que de 51 pacientes que expresaban el alelo GSTM1, 24 de ellos (46%), no presentaron EICRag., este análisis tuvo un p= 0.0013 [Figura 15]. Bajo la hipótesis de nuestro trabajo del posible reconocimiento alo-inmune de las células del donantes sobre la expresión del alelo en el receptor y tras los resultados anteriormente mencionados comparamos el subgrupo de pacientes R+ / Dfrente al resto de los grupos, de 21 pacientes en el grupo R+/D-, 13 pacientes (62%) presentaron EICRag., en el resto de los grupos, de 71 pacientes en total, 21 de ellos (29%) desarrollaron EICRag., de esta manera encontramos mayor incidencia de EICRag. en el grupo de receptor positivo/ donante negativo, frente al resto de subgrupos con una p= 0.0149 [Figura 16]. Al observar los resultados del subgrupo R+/ Dfrente al resto, decidimos comparar el subgrupo opuesto, R- / D+ frente al resto de subgrupos, de 19 pacientes en total en el grupo R- / D+, 15 de ellos (79%) no presentaron EICRag. En el resto de grupos hubo un total de 73 pacientes, donde 43 de ellos (58%) no desarrollaron EICRag., se observó una p=0,17 [Figura 17]. La incidencia de la EICRag. grado II-IV en los receptores que expresaban el alelo GSTM1 fue del 80% frente al 20% de incidencia de EICRag. en aquellos receptores GSTM1 negativo [Figura 13]. De esta manera observamos que un 59% los pacientes que no desarrollaron EICRag. no expresaban el alelo GSTM1, mientras un 41% de los pacientes lo expresaban. !89 Analizamos el efecto que tuvo la enfermedad injerto contra receptor aguda grado II-IV con la mortalidad y la recaída, no observando asociación estadística significativa en ambas, p= 0,7 y p=0,3 respectivamente [Figura 19 y 20]. Figura 19. La mortalidad con la probabilidad de EICR. Figura 20. La recaída y su relación con la probabilidad de EICR. !96 Figura 20. GSTT1 y la probabilidad de EICR. La profilaxis del EICR se realizó en 76 pacientes con Metotrexate y Ciclosporina, 50 pacientes (65%) no desarrollaron EICR de este subgrupo. En 4 pacientes se utilizó Tacrólimus y Sirólimus, 1 pacientes (25%) de este grupo no desarrollo EICR. En 9 pacientes se utilizó Ciclosporina y Micofenolato, 6 pacientes (66%) no desarrollo EICR. En 3 pacientes se utilizó Tacrólimus y Metotrexate ,1 pacientes (33%) no desarrollo EICR. Estos datos debido al numero reducido de casos por grupo, no tuvo diferencia significativa. El EICRag. grado II-IV, se trató de forma estándar en todos los pacientes con esteroides a 1 mg/kg de peso cada 12 horas. La respuesta al mismo se valoró a los 3 días y a los 7 días, dependiendo de los signos y síntomas clínicos sumado a los hallazgos de laboratorio se catalogó de respuesta parcial, completa, no respuesta o progresión, en base a estos criterios se decidió comenzar una segunda línea donde se utilizaron diferentes fármacos como el Micofenolato de Mofetil, Tacrólimus, ATG o Sirólimus. !97 No se encontraron diferencias en relación a la expresión o no de los alelos GSTM1 y GSTT1 cuando valoramos la respuesta al tratamiento de primera línea del EICR agudo. En aquellos pacientes que necesitaron de segundas líneas de tratamiento tampoco observamos diferencias en la respuesta en aquellos que expresaban o no los alelos GSTM1 y GSTT1. La toxicidad hepática relacionada con el trasplante fue del 13%, 12 pacientes, no observamos mayor toxicidad hepática relacionada con el tratamiento inmunosupresor y quimioterápico en aquellos pacientes que no expresaban el alelo tanto de GSTM1 como de GSTT1. La incidencia en nuestra serie de la enfermedad injerto contra receptor crónica fue del 25%, siendo en un 15% de manifestación extensa. No observando tampoco en estos pacientes relación con la expresión de los alelos GSTM1 y GSTT1 [Tabla 10]. Tabla 10. Frecuencia y porcentaje de EICR crónica y toxicidad hepática. !98 Toxicidad hepatica 80 87.0 12 13.0 92 100.0 no si Total Frecuencia Porcentaje EICR CRONICO 10 10.9 15 16.3 LIMITADO EXTENSO Frecuencia Porcentaje En el análisis multivariante, sólo dos variables se relacionaron de manera significativa con la probabilidad de desarrollar EICRag. grado II-IV [Tabla 11]: - La utilización para el TPH de un Donante no emparentado (p= 0.011). - La expresión del alelo GSTM1 en el receptor del TPH (p= 0.018). Tabla 11. Resultado del análisis multivariante. La mediana se seguimiento de la serie fue de 674 días, con un mínimo de 30 y un máximo de 3735 días. No encontramos diferencias significativas en la supervivencia global de los pacientes en función de la variabilidad genética en la expresión de GSTM1 o GSTT1 entre donante y receptor [Figura 23]. La mortalidad de la serie en estudio ha sido del 53%, 49 pacientes de 92 incluidos, en 28 pacientes la causa fue recaída de su enfermedad de base, en 13 pacientes de causas infecciosas, en 2 pacientes como consecuencia de la enfermedad injerto contra receptor aguda grado IV y en 6 pacientes de diferentes causas como cardiopatías isquémicas y fallo multiorgánico de causa desconocida [Figura 21]. VARIABLE P TIPO DE DONANTE 0,011 Polimorfismo GSTM1 0,018 !99 Figura 21. Frecuencia y causas de muerte. !100 Causas muerte Vivos Otras EICH Recaída Infecciosa CAUSAS DE MUERTE 13 14.1 28 30.4 2 2.2 6 6.5 49 53.3 Infecciosa Recaída EICH Otras Total Válidos Frecuencia Porcentaje Figura 22. Supervivencia global de nuestra serie. !101 Tiempo'en'meses 1401301201101009080706050403020100 Probabilidad'supervivencia 1.0 .9 .8 .7 .6 .5 .4 .3 .2 .1 0.0 Figura 23. Supervivencia global, según los diferentes subgrupos de GSTM1 y GSTT1. !102 Tiempo'en'meses 140120100806040200 Probabilidad'supervivencia 1.0 .9 .8 .7 .6 .5 .4 .3 .2 .1 0.0 GSTT1 D+R+ DCRC DCR+ D+RC Tiempo'en'meses 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Probabilidad'de'supervivencia 1.0 .9 .8 .7 .6 .5 .4 .3 .2 .1 0.0 GSTM1 D+R+ DDRD DDR+ D+RD IV.2.1. Utilización de la expresión del alelo GSTM1 como factor predictivo de EICR Analizamos la sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo negativo y el valor predictivo positivo en la expresión o no del alelo GSTM1 en el receptor sometido a TPH alogénico. Tabla 12. Sensibilidad y especificidad de la expresión del alelo GSTM1. La valoración de la expresión del alelo GSTM1 en el receptor tiene una sensibilidad del 79% (IC 95%: 066-0.93) lo que traduce que de 34 pacientes que desarrollaron EICRag. Grado II-IV , 27 pacientes expresaban el alelo GSTM1. Un especificidad del 59% (IC 95%: 0,45-0,71) esto explica que de 58 pacientes que no desarrollaron EICRag. 34 pacientes no expresaban el alelo GSTM1. Este método diagnostico tiene un valor predictivo positivo de 53% (IC 95%: 0,39-0,67) y un valor predictivo negativo del 83% (IC 95%: 0,71-0,94), este último valor nos podría ser útil para a identificar a aquellos pacientes que van a tener alta probabilidad de no desarrollar EICRag. [tabla 12 ]. Sensibilidad y especificidad de la expresión del alelo GSTM1 24 27 51 47.1% 52.9% 100.0% 41.4% 79.4% 55.4% 34 7 41 82.9% 17.1% 100.0% 58.6% 20.6% 44.6% 58 34 92 63.0% 37.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% Recuento % de R+ Rtodos % de EICRag. Recuento % de R+ Rtodos % de EICRag. Recuento % de R+ Rtodos % de EICRag. R + R - Total no si EICR agudo Total !103 !104 V. DISCUSIÓN !105 la fisiopatología y el desarrollo del EICRag. contribuyó a la logística y el desarrollo" para la terapia dirigida en forma de anticuerpos monoclonales específicos" tales como son el Daclizumab. No existe evidencia de ensayos clínicos donde se observe que los niveles en sangre de esta citoquinas tengan relación con la respuesta al tratamiento con este anticuerpo monoclonal específico. En 1990, Holler et al. [79] observo que el aumento en la monitorización de los niveles séricos de TNF-a precedía al inicio de los síntomas del EICRag. [113]. con estos resultados este grupo propone dividir en grupos de alto y bajo riesgo de padecerlo según los niveles séricos de TNF-a , de esta manera poder intervenir aumentando o manteniendo niveles de inmunosupresores mas elevados o en su defecto utilizar dosis bajas de Timoglobulina para atenuar los síntomas en aquellos pacientes con niveles elevados [107], no aportan datos clínicos de respuesta ni relación entre los niveles y las posibles medidas terapéuticas. Paczesny S et al. [102] realizó un estudio de 35 biomarcadores en las muestras de 21 pacientes que desarrollaron EICRag. sometidos a aloTPH de intensidad mieloablativa, fuente de progenitores similar, edad en rangos similares, en este estudio se utilizó un modelo de regresión logística donde determinaron que una combinación lineal de los valores para el receptor de la IL2 (IL-2Ra), receptor del factor de necrosis tumoral 1 (TNFR1), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), y IL-8 producía el mejor modelo para predecir los síntomas clínicos del EICRag. Los niveles de IL-2Ra y TNFR1 contribuyeron principalmente a la exactitud del modelo (P 0,001 y P 0,003, respectivamente). El HGF fue el único marcador que predijo mejor el grado de EICRag. (p 0,003) y ambos HGF y IL-2Ra se asociaron con especificidad de órganos (p 0,03 y 0,04 respectivamente). Levine JE et al [109] diseñaron un estudio con objetivo de definir estratos de riesgo clínicamente significativo para los pacientes con EICRag. de reciente diagnostico utilizando biomarcadores plasmáticos. Recogieron prospectivamente plasma de 492 pacientes con EICRag. y utilizaron las concentraciones de tres biomarcadores recientemente validados como son el TNFR1 ( receptor 1 del factor de necrosis tumoral ), ST2 y REG3α, de esta manera crearon un algoritmo que calcula la probabilidad de mortalidad no relacionada con el trasplante (MNRT) después de 6 meses de la aparición clínica del EICR. !112 La incidencia acumulada de MNRT aumento al mismo tiempo que aumentaba el score de riesgo para el EICRag. La tasa de respuesta de los tratamientos de primera línea fue más baja en aquellos con scores más altos, estos datos necesitan de confirmación por otros grupos y en ensayos multicentrico [109]. Encontramos numerosos publicaciones en relación con los niveles de las citoquinas que intervienen en el proceso de desarrollo de la EICRag., está documentada la evidencia de que niveles elevados de las citoquinas inflamatorias se relacionan con mayor probabilidad de desarrollo de EICRag., no obstante no hay datos en donde la respuesta al tratamiento tenga relación dichos niveles. Utilización de la determinación al alelo GSTM1 como método diagnostico El diagnóstico temprano del EICRag. podría ayudar a la toma de decisión en medidas terapéuticas en pacientes sometidos a TPH alogénico mieloablativo, no obstante es más interesante la idea de poder predecir aquellos pacientes que lo desarrollaran y de esta manera poder adelantarse en la toma de decisiones. En general las pruebas de cribado deben ser de alta sensibilidad para poder captar a todos los enfermos. Una prueba muy sensible será especialmente adecuada en aquellos casos en los que el no diagnosticar la enfermedad puede resultar fatal para los enfermos. Por otra parte, la especificidad se refiere a la probabilidad de que un sujeto sano sea clasificado adecuadamente. En general, las pruebas confirmatorias del diagnóstico deben ser de alta especificidad, para evitar falsos positivos. No obstante tienen la ventaja adicional de que son propiedades intrínsecas a la prueba diagnóstica, y definen su validez independientemente de cuál sea la prevalencia de la enfermedad en la población a la cual se aplica. La seguridad de una prueba diagnóstica son los valores predictivos de la misma, los conceptos de sensibilidad y especificidad permiten, por lo tanto, valorar la validez de una prueba diagnóstica. Sin embargo, carecen de utilidad en la práctica clínica. Tanto la sensibilidad como la especificidad proporcionan información acerca de la probabilidad de obtener un resultado concreto (positivo o negativo) en función de la verdadera condición del enfermo con respecto a la !113 enfermedad. Cuando un paciente se le realiza alguna prueba se plantea si ante un resultado positivo o negativo en la prueba cuál es la probabilidad de que el paciente esté realmente enfermo o sano. Por medio de los valores predictivos completaremos esta información El concepto de valores predictivos, a pesar de ser de enorme utilidad a la hora de tomar decisiones clínicas y transmitir a los pacientes información sobre su diagnóstico, presenta la limitación de que dependen en gran medida de lo frecuente que sea la enfermedad a diagnosticar en la población objeto de estudio. Cuando la prevalencia de la enfermedad es baja, un resultado negativo permitirá descartar la enfermedad con mayor seguridad, siendo así el valor predictivo negativo mayor. Por el contrario, un resultado positivo no permitirá confirmar el diagnóstico, resultando en un bajo valor predictivo positivo. La utilidad de la expresión del alelo GSTM1 en el receptor como diagnóstico de EICRag. tiene una sensibilidad del 79%, con esto significa que de 34 pacientes que desarrollaron EICRag. 27 pacientes expresaban el alelo GSTM1. La especificidad que obtuvimos fue baja, en torno al 59%, lo que traduce que de 58 pacientes que no desarrollaron EICRag. 34 pacientes no expresaban el alelo GSTM1. El valor predictivo positivo fue de 53% y un valor predictivo negativo del 83%, este último valor nos podría ser útil para a identificar a aquellos pacientes que van a tener alta probabilidad de no desarrollar EICRag. Dada la adecuada sensibilidad de la prueba y el correcto valor predictivo negativo de la misma, la ausencia de expresión del alelo GSTM1 podría utilizarse para valorar y estratificar el riesgo de EICRag. De esta manera sugerimos que podría utilizarse en conjunto con scores de síntomas clínicos, hallazgos analíticos y el uso de otros biomarcadores como los mencionados anteriormente para adelantarse a la aparición de los síntomas clínicos del EICRag. Este subgrupo de pacientes debería ser considerado candidato a alternativas de tratamientos capaces de atenuar o prevenir la respuesta inmune del EICRag. una vez que esta se ha desarrollado [62,101]. Muchos grupos de trabajo han reportado estudios donde analizan solo una citoquinas y su asociación con el EICR, MRT, SG y SLE. La mayoría de esos estudios" son ensayos de un solo centro o estudios retrospectivos en pequeñas" !114 poblaciones. Todavía no sabemos que citoquinas son necesarias y las que podrían servir de biomarcadores específicos del EICRag. Por lo tanto, se considera que las mediciones de una sola citoquinas" son pruebas insuficientes como biomarcadores del EICRag., sobre todo debido a la falta de sensibilidad y especificidad adecuadas. Se requieren futuras investigaciones y estudios prospectivos multicéntricos para establecer cuál es el mejor uso de estos biomarcadores para la EICRag. GSTT1 Y SU VALOR EN EL TRASPLANTE En el año 2001 comenzaron a observar en las publicaciones donde se asociaba el gen de la theta glutatión S-transferasa 1 gen (GSTT1) con la aparición de la hepatitis inmune de Novo después del trasplante hepático, este gen que tiene dos variantes alélicas, GSTT1 (*) A (wild type) y GSTT1 (*) 0 (delección), ha sido catalogado y surgido como un antígeno de histocompatibilidad no HLA con interesantes resultados [51,52,94,100]. Una combinación donde el receptor no expresa el alelo GSTT1 con aquellos donantes que expresan el alelo GSTT1, mostró con alta frecuencia la aparición de hepatitis autoinmunes grave, con la posterior producción de IgG anticuerpos anti-GSTT1 [51]. En relación con el trasplante renal, la falta de coincidencia entre donante y receptor en la expresión del alelo GSTT1, también se asoció con la producción de anticuerpos anti-GSTT1 y episodios de rechazo agudo, se ha observado en la biopsia del injerto estos anticuerpos relacionados con el depósito del complemento C4 [51,52,94]. Estos grupos de trabajo que han estudiado las respuestas inmune en los trasplante de órganos sólidos, como son los de riñón e hígado, argumentan que los antígenos distintos del sistema HLA tales como pueden ser la expresión de la proteína GSTT1 en el periodo post trasplante inmediato, pueden ser dianas para las respuestas !115 aloinmune, de esta manera siendo esta disparidad responsable de la activación del sistema inmune [51]. Martínez-Bravo MJ et al [95] estudiaron la respuesta inmune específica contra GSTT1 en el TPH alogénico con la determinación de la producción de anticuerpos y valoraron su influencia en el desarrollo de la enfermedad injerto contra receptor de localización hepática, se analizaron las muestras de donante y receptor para detectar la presencia de anticuerpos anti-GSTT1 mediante la prueba de ELISA. El desarrollo de EICR hepática, en particular su forma aguda, estaba altamente asociado con disparidad entre donante y receptor en relación al GSTT1 y con la presencia de anticuerpos anti-GSTT1 post-trasplante. En este trabajo concluyen que la disparidad en la expresión del GSTT1 entre donante y receptor podría ser considerado como un nuevo antígeno menor no HLA en relación con la EICR hepática. El mismo grupo de trabajo también estudio la disparidad ausencia/expresión de este gen entre donante y receptor, observando también mayor incidencia de EICRag. Grado II-IV, crónica y de localización hepática en aquellos donde entre donante y receptor existía disparidad en la expresión del alelo. La incidencia del EICRag. que observaron fue del 20% frente al 47,4% en el grupo con disparidad. También fue altamente significativa la mayor incidencia en el desarrollo de EICR hepática grados III-IV (3,8% versus 36,8%) [100]. Cuando realizamos el análisis de la expresión del alelo GSTT1 en nuestra serie, los subdividimos en 4 subgrupos en relación con la expresión o no del alelo GSTT1 entre donante y receptor. Analizamos la incidencia de EICRag. en estos diferentes grupos y encontramos que en el grupo D+/Rde 10 pacientes en total, 3 (30%) de ellos desarrollaron EICRag. En el grupo D-/R+, de 10 pacientes 5 (50%) de ellos presentaron EICRag. Grado II-IV. En el grupo D-/Rde 13 pacientes, 4 pacientes (31%) desarrollaron EICRag. y en el grupo D+/R+ de 59 pacientes, 22 de ellos (38%) presentaron EICRag. De esta manera observamos que la incidencia de EICRag. ha sido similar en todos estos subgrupos. Cuando analizamos la incidencia de EICR por órgano, tampoco se observo diferencia en la manifestación hepática del EICR. !116 La incidencia en nuestra serie de la enfermedad injerto contra receptor crónica fue del 25%, siendo en un 15% de manifestación extensa. No observando tampoco en estos pacientes relación con la expresión de los alelos GSTT1. Estos resultados son discordantes de los obtenidos por el grupo de Martínez-Bravo MJ et al, no obstante en la serie nuestra no valoramos la producción de anticuerpos anti-GSTT1 y de esta manera no podemos realizar similares conclusiones ya que no lo planteamos como objetivo del estudio. La participación de la expresión del alelo GSTT1 en inmunológica, el aloreconocimiento es incuestionable, aunque todavía hay muchos aspectos que quedan por explorar y confirmar, como son el valor de los anticuerpos anti-GSTT1 para poder utilizar esta determinación de forma anticipada, también el confirmar estos resultados y de forma integral con la expresión del alelo [52,94]. El descubrimiento de los últimos años en relación con la producción de anticuerpos anti-GSTT1 en el trasplante de progenitores hematopoyéticos, confirma el papel del alelo GSTT1 como antígeno de histocompatibilidad no HLA en este contexto. APLICACIÓN CLÍNICA El trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos es el tratamiento de elección para la curación de algunas enfermedades hematológicas. Entre un 2550% de los pacientes que reciben un trasplante alogénico a partir de un donante familiar HLA idéntico desarrollan enfermedad injerto contra receptor aguda [53,54]. A pesar de todos estos avances en el tratamiento y la prevención del EICR, aún no somos capaces de predecir que pacientes desarrollaran esta complicación y en que gradación ocurrirá, teniendo tasas tan altas de morbi mortalidad y el gran costo económico que representa para el sistema sanitario. !117 El uso de Timoglobulina de conejo (ATG) en la profilaxis de la EICR se ha evaluado en numerosos estudios prospectivos aleatorizados y multicentrico, observando que la conclusión más común en todos ellos es que permite reducir de manera significativa el riesgo de EICR aguda y aún más la crónica y, sabemos que esto se traduce en un impacto favorable en la calidad de vida postrasplante, no obstante no se ha visto que incremente la supervivencia a largo, por estas razones su uso se limita a aquellos pacientes que sus donantes son no emparentados o presentan cierto grado de disparidad en el HLA [53,101]. Bacigalupo et al [107] randomizaron 170 pacientes en dos grupos, uno recibió ATG en el día + 7 y el otro grupo no recibió este tratamiento, estratificaron a los pacientes según presentaban mayor riesgo de mortalidad relacionada con el trasplante (MRT) y de acuerdo a factores de riesgo ya conocidos la posibilidad de desarrollar EICR, los resultados ofrecen una notable disminución en la MRT de 19% vs 42% y con una disminución de la EICR aguda en aquellos pacientes que fueron estratificados de alto riesgo de padecerla (p: 0.006). Estos trabajos que encontramos en la literatura nos marcan la tendencia a estratificar a los pacientes según riesgo de desarrollar EICR y poder adelantarnos a los síntomas clínicos, en la serie en estudio un 30% de los pacientes fueron no idénticos con sus donantes, esto llevo a que en 10 pacientes tuvimos que utilizar ATG como parte del esquema de acondicionamiento, no observamos diferencia en la incidencia de la EICR en este subgrupo, tampoco la hubo cuando analizamos los TPH idénticos vs. los no idénticos. Es posible plantear estrategias de profilaxis que incluyan la depleción inespecífica de linfocitos T, a su vez si podemos eliminar solo los linfocitos que están activados o en procesos de mitosis podríamos ser más efectivos, ya que son los responsables de la enfermedad injerto contra receptor en fases tempranas del periodo postrasplante inmediato. Existen múltiples fármacos que podrían ser útiles a la hora de plantear este tipo de estrategias de profilaxis, donde la inactivación de los linfocitos se realice antes que la cascada inflamatoria este establecida. Fármacos como lo son el Bortezomib, que es un inhibidor de proteosomas, es capaz de provocar un efecto proapoptótico selectivo frente a linfocitos aloreactivos, de esta manera preservando la viabilidad de los linfocitos inactivos !118 y podría de esta manera conservar la respuesta injerto contra tumor, se ha visto en un ensayo fase II una baja incidencia de EICR grado II-IV en torno al 12 %, algo menor que en las series habituales con pautas estándar de profilaxis tipo Metotrexato + CsA o Tacrólimus + Metotrexato [54]. También existen agentes desmetilantes como son la 5 - azacitidina, que actúan modificando el patrón de metilación de algunos genes promotores, estos pueden estar implicados en el proceso de activación linfocitaria, se realizan modificaciones a nivel epigenético, estas son capaces de bloquear la activación de los linfocitos, disminuyendo el riesgo de EICR en el periodo post TPH [55]. Estos procesos de activación y proliferación linfoide dependen de la activación de diversas vías de señalización intracelular. Los anclaje a la membrana de las diferentes enzimas involucradas en este proceso se realiza mediante la unión de moléculas hidrófobas a las proteínas, al que se le unen grupos farnesilo o geranil - geranilo, se ha visto que los inhibidores de este proceso podrían disminuir el riesgo de EICR, estos fármacos como lo son el Vorinostat, se pueden utilizar en combinación con otros inmunosupresores como el Tacrólimus con unos resultados alentadores, se ha visto una menor incidencia del EICRag. grado II-IV en pacientes sometidos a aloTPH de donante emparentado con acondicionamiento de intensidad reducida [56]. En el 2004 se publicaron los primeros resultados del uso de células mesenquimales (MSC) para el tratamiento del EICRag. refractaria a esteroides, tras los primeros buenos resultados se comenzaron a realizar ensayos clínicos fase I-II donde mostraban que era un tratamiento eficaz y seguro para los pacientes [66]. En el estudio fase II con el mayor número de pacientes publicado hasta el momento, recibieron 1 o 2 dosis de MSC, las tasas de respuestas completas obtenidas fueron superiores al 70%, con respuestas completas en torno al 50%, observando mayor supervivencia global en aquellos pacientes que la alcanzaron [67]. El papel de las MSC en la prevención del desarrollo de EICRag. hemos de indicar que existe poca información y con resultados contradictorios [66,108]. En humanos existe un estudio aleatorizado en el que se administraban 1x106 células/Kg en el momento del injerto (>1x109 leucocitos/L) los pacientes tratados presentaban una tasa menor de EICRag. II-IV (5% vs. 39%), no se han observado diferencias en !119 cuanto a la tasa de EICR y sí en cuanto a la mejoría del injerto hematopoyético en otros estudios realizados [65,67]. En la serie en estudio la profilaxis del EICR se realizó en 76 pacientes con Metotrexato y Ciclosporina, 26 pacientes (35%) desarrollaron EICRag. En 4 pacientes se utilizó Tacrólimus y Sirólimus, 3 pacientes (75%) también desarrollo EICRag. En 9 pacientes se utilizó Ciclosporina y Micofenolato, 3 pacientes (33%) desarrollo EICR. En 3 pacientes se utilizó Tacrólimus y Metotrexato ,2 pacientes (66%) padecieron EICRag. En este trabajo cuando valoramos la respuesta al tratamiento de primera línea del EICRag. no se encontraron diferencias en relación a la expresión o no de los alelos GSTM1 y GSTT1. En aquellos pacientes que necesitaron de segundas líneas de tratamiento tampoco observamos diferencias en la respuesta según la expresión de los alelos. En relación con las diferentes profilaxis y la incidencia del EICRag. no es posible sacar conclusiones dado el corto numero de pacientes y la diversidad de profilaxis utilizadas, no obstante se observa que no hay diferencias en los diferentes subgrupos. Tanto en las profilaxis utilizadas como en los tratamiento de primera y segunda líneas, no hubo diferencias en la incidencia del EICRag. cuando lo analizamos con las expresiones de los alelos GSTT1 y GSTM1. Con todas las herramientas terapéuticas que poseemos en la actualidad y viendo que la incidencia del EICRag. y del crónico no han disminuido en gran proporción en los últimos años, se deja entrever que el eje de la cuestión es la respuesta inmune y el momento en que se desencadena la misma, de esta manera pensamos que con la utilización de scores pronósticos del EICR podríamos adelantarnos en el uso de fármacos con mecanismos de acción antes mencionados o tal vez poder ser más intenso en las profilaxis utilizadas. !120 LA UTILIZACIÓN DE ICT Y LA INCIDENCIA DE EICR Hemos visto que en los últimos 30 años la radioterapia ha sido la piedra angular en la mayoría de los esquemas de acondicionamiento utilizados, en general se utiliza asociada a quimioterapia, la radioterapia combina buena capacidad inmunosupresora y actividad anti-neoplásica en casi la totalidad de las neoplasias hematológicas, con la ventaja adicional de alcanzar sitios como son el sistema nervioso central y los testículos, también posee la ventaja de no presentar resistencia cruzada con los agentes farmacológicos normalmente utilizados en los esquemas de tratamiento previos al TPH [68]. La irradiación corporal total presenta una eficacia y toxicidad que está condicionada por variables como son la dosis total, la dosis fraccionada y el ratio de exposición [68,69]. La dosis total de RT administrada es fundamental y en general a mayores dosis se obtiene mayor eficacia pero también presentan mayor toxicidad relacionada con el procedimiento, sobre todo de tipo gastrointestinal y pulmonar, esta ultima principalmente limita el uso de dosis superiores a 12-13 Gy. Se ha comprobado que el uso de dosis cercanas a 16 Gy, si bien presenta menor recidiva, no se asocia a mejor supervivencia debido a una mayor mortalidad tóxica [68,69]. Es importante también el número de fracciones de radioterapia utilizadas, donde se ha demostrado que el uso de esquemas fraccionados ofrecen un mejor perfil de seguridad. Mayormente se utiliza radioterapia híper fraccionada (más de una dosis al día) y los esquemas más utilizados son 1.2 Gy tres veces al día, 2 Gy dos veces al día o 3 Gy cuatro veces al día [69,70]. En la literatura se recogen datos de que la ICT es un factor de riesgo para el desarrollo de la mucositis post acondicionamiento y de la inflamación intestinal después del TPH, ambas tienen un papel importante en la patogenia y en la aceleración de la EICRag., estos sucesos tienen estrecha relación con la dosis total, no obstante con menores dosis también se asoció con mayor incidencia de EICRag. [70]. El impacto de la intensidad del acondicionamiento en la incidencia de EICRag. sigue siendo un tema de debate, Nakasone H et al [59] analizo 6848 receptores adultos que recibieron TPH alogénico, en donde observaron que independiente de la intensidad del acondicionamiento, en aquellos que se había !121 EN RELACIÓN CON LOS OBJETIVOS SECUNDARIOS 5ª)- Los pacientes que se acondicionaron con irradiación corporal total + Ciclofosfamida tuvieron mayor predisposición de desarrollar enfermedad injerto contra receptor aguda, también se ha observado, que aquellos que recibieron TPH de donante emparentado han presentado menor incidencia de la misma. 6ª)- La toxicidad hepática, la mortalidad, la recaída y la enfermedad injerto contra receptor crónica no fueron diferentes según la presencia/ausencia de los alelos GSTM1 y GSTT1. !128 VII. BIBLIOGRAFIA !129 !130 1Whalen R,!Boyer TD. Human glutathione S-transferases. Semin. Liver Dis.!1998;18(4): 345-58. 2Tocher DR, Leaver MJ, Hodgson PA. 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