Análisis, impacto y evolución de biofilms fotosintéticos en espeleotemas. El caso de la Cueva de Nerja

Facultad de Ciencias Departamento de Microbiología Análisis, impacto y evolución de los biofilms fotosintéticos en espeleotemas. El caso de la Cueva de Nerja Yolanda del Rosal Padial AUTOR: Yolanda del Rosal Padial http://orcid.org/0000-0003-0910-1214 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es A mis padres Gracias… A la Prof. Dra. Mariona Hernández Mariné por todo lo que me ha enseñado, por su esfuerzo y dedicación en la elaboración de esta memoria pero, sobre todo, por el cariño con el que ha endulzado tantas horas de trabajo. Mil gracias por ser mi maestra y amiga. Al Prof. Dr. Eduardo Martínez Manzanares por ayudarme siempre y aportar luz en momentos de tinieblas. Gracias a sus enseñanzas, consejos y humanidad ha sido posible realizar este trabajo que ya culmina. Al Prof. Dr. Fernando Marín, mi mentor, por confiar en mí e iniciarme en este maravilloso mundo de la investigación del medio subterráneo, en general y de la Cueva de Nerja, en particular. Al Prof. Dr. Francisco Javier Barón, por sus numerosas horas de explicación, siempre dispuesto a ayudarme con los números, en las múltiples ocasiones en que lo necesité. A los servicios de microscopía de los Centros Científicos i Tecnológicos de la Universidad de Barcelona y de la Universidad Autónoma de Barcelona, especialmente y con mucho cariño, a Mónica. A la Unidad de Análisis de Imagen de la Universidad de Barcelona y al grupo de investigación de Microbiología Ambiental y Patrimonio Cultural del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla, cuyos trabajos han sido imprescindibles para la realización de esta memoria. Al Departamento de Microbiología de la Universidad de Málaga por permitirme formar parte de su excepcional equipo científico y humano. Al Consejo Científico Asesor de la Cueva de Nerja por auspiciar, en todo momento, los proyectos de investigación destinados a la conservación y difusión de la cavidad, entre ellos, el que ha permitido la elaboración de esta tesis. A la Fundación Cueva de Nerja, sin cuya financiación no hubiera sido posible. A Cristina, amiga y compañera de innumerables experiencias vividas en el maravilloso el mundo subterráneo, gracias. A mi familia. A mis padres y a mi hermana por su apoyo y confianza incondicional. A Manu, por hacer realidad este sueño de vida y formar parte de ella. A mis hijas, Noa y Marina…. porque son mi vida…. os debo muchas horas de juego. A todos, gracias. 16 CAPITULO 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo general … … … … … … … … … 45 3.2. Objetivos específicos … … … … … … … … 45 CAPITULO 4. BIOFILMS FOTOSINTÉTICOS EN LA CUEVA DE NERJA 4.1. Antecedentes en el estudio de los biofilms fotosintéticos en la Cueva de Nerja 47 4.2. Inventario de biofilms fotosintéticos en la Cueva de Nerja … … … 53 4.3. Criterios de selección de las zonas de control … … … … … 55 4.4. Descripción de las zonas de control … … … … … … 57 CAPITULO 5. EVOLUCIÓN DE LOS BIOFILMS FOTOSINTÉTICOS DE LA CUEVA DE NERJA RELACIÓN CON LOS FACTORES AMBIENTALES 5.1. Introducción .. … … … … … … … … 67 5.2. Objetivos … … … … … … … … … … 70 5.3. Material y Método .. … … … … … … … 70 5.3.1. Selección de las zonas de control … … … … … 70 5.3.2. Iluminación de las zonas de experimentación … … … … 71 5.3.3. Realización de fotografías … … … … … … 71 5.3.4. Procesado digital de imágenes. Cálculo de la variable verde … … 72 5.3.5. Monitorización de los parámetros ambientales … … … 81 17 5.3.6. Análisis estadístico … … … … … … … 83 5.4. Resultados … … … … … … … … … 85 5.4.1. Parámetros ambientales … … … … … … 85 5.4.1.1. Temperatura del aire … … … … … … 85 5.4.1.2. Humedad relativa del aire … … … … … 86 5.4.1.3. Concentración de dióxido de carbono del aire … … 88 5.4.1.4. Radiación fotosintética activa (PAR) … … ... 89 5.4.2. Biofilms fotosintéticos … … … … … … … 90 5.4.2.1. Representación gráfica … … … … … 92 5.4.2.2. Resultados por zonas de control … ... ... ... 109 5.4.2.3. Evolución del tamaño de los biofilms … … … 117 5.4.2.4. Modelos de regresión … … … … … 120 5.4.2.5. Correlación con los factores ambientales … … … 121 5.4.2.6. Variabilidad del tamaño de los biofilms … … … 122 5.4.2.7. Análisis de los cambios de tamaño de los biofilms … … 122 5.4.3. Zonas de experimentación … … … … … … 125 5.5. Discusión … … … … … … … … … 130 CAPITULO 6. ANÁLISIS DE LOS BIOFILMS FOTOSINTÉTICOS: ESTRUCTURA, BIODIVERSIDAD, ESTADO FISIOLÓGICO DE LOS MICROORGANISMOS Y RELACIÓN CON EL SUSTRATO 6.1. Introducción … … … … … … … … … 139 6.2. Objetivos … … … … … … … … … … 143 18 6.3. Material y Método … … … … … … … … 143 6.3.1. Selección de las zonas y toma de muestras … … … … 143 6.3.2. Técnicas de microscopía … … … … … … 145 6.3.2.1. Microscopía estereoscópica y de campo claro ... ... 146 6.3.2.2. Microscopia de Barrido Láser Confocal (CSLM) ... ... 146 6.3.2.3. Microscopía electrónica de barrido (SEM) ... ... ... 149 6.3.2.4. Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) ... ... 150 6.3.3. Análisis molecular … … … … … … … 150 6.4. Resultados … … … … … … … … … 155 6.4.1. Resultados del análisis microscópico por zonas de muestreo … … 155 6.4.2. Tabla resumen … … … … … … … … 188 6.4.3. Resultados del análisis molecular … … … … … 189 6.5. Descripción de los morfotipos y morfoespecies … … … … … 195 6.5.1. Cl. Cyanophyceae, O. Chroococcidiopsidales, F. Chroococcidiopsidaceae 195 6.5.2. Cl. Cyanophyceae, O. Chroococcales, F. Aphanothecaceae … … 200 6.5.3. Cl. Cyanophyceae, O. Chroococcales, F. Microcystaceae … … 205 6.5.4. Cl. Cyanophyceae, O. Chroococcales, F. Chroococcaeae … … 208 6.5.5. Cl. Cyanophyceae, O. Synechococcales, F. Leptolyngbyaceae … 209 6.5.6. Cl. Cyanophyceae, O. Oscillatoriales, F. Microcoleaceae … … 212 6.5.7. Cl. Cyanophyceae, O. Nostocales, F. Nostocaceae … … … 215 6.5.8. Cl. Chlorophyceae, O. Chlamydomonadales, F. Coccomyxaceae … 217 6.5.9. Cl. Chlorophyceae, O. Chlorophyceae incertae sedis, F. Chlorophyceae 218 6.5.10. Cl. Trebouxiophyceae, O. Prasiolales, F. Prasiolaceae … … 222 6.5.11. Cl. Bacillariophyceae, O. Naviculales, F. Diadesmidaceae … … 227 19 6.5.12. Cl. Cyanidiophyceae, O. Cyanidiales, F. Cyanidiaceae … … 229 6.6. Discusión … … … … … … … … … … 232 CAPITULO 7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 7.1. Conclusiones … … … … … … … … … 241 7.2. Recomendaciones … … … … … … … … 244 BIBLIOGRAFIA … … … … … … … … … 247 Anexo 1 Inventario biofilms fotosintéticos y planimetría … … … 275 Anexo 2 Coeficientes estadística … … … … … … 305 Anexo 3 Espectroscopia Raman análisis de Black Carbon … … … 325 Anexo 4 Resultados biología molecular (bacterias y arqueas) … … 331 20 21 CAPITULO 1 INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES 1.1. Cuevas El término cueva posee definiciones en función de una amplia variedad de criterios (Ford, 1988). Según Curl (1996), es “un espacio hipogeo, de cualquier tamaño, formado por disolución, que, en la mayoría de los casos, no cuenta con una entrada accesible para los humanos”. Una visión más antropocéntrica la define como “un espacio hipogeo accesible para los humanos” (Gillieson, 1996; Hill y Forti, 1997; Northup y Lavoie, 2001). Para White (1984) una cueva es “toda oquedad en la roca que actúa como conducto para un flujo de agua, ocasional o continuo, entre puntos de entrada, como las simas o diversos conductos preferenciales de infiltración y puntos de salida, como los manantiales o goteos”. Existen numerosos criterios para la clasificación de las cuevas como, por ejemplo, basados en el proceso de formación, la composición de la roca o del sedimento en el que se desarrolla (Palmer, 1991), la relación con el entorno (Worboys et al., 1982) o criterios de protección y gestión ambiental (Gillieson, 1996). No obstante, mediante el empleo de un único criterio no es posible realizar una clasificación completa y genérica de todos los elementos que engloba el término cueva. Desde un punto de vista heurístico, se puede establecer la siguiente clasificación que comprende los principales tipos de cuevas (Klimchouk, 2004): 22 1. Cuevas volcánicas: se forman mediante diferentes procesos. De ellos, el más significativo es la solidificación de la superficie de la lava que fluye de un volcán, que actúa como aislante térmico bajo el cual la lava continua desplazándose hasta que la erupción termina. El resultado es un hueco en el interior del tubo por el que circuló la lava. Estas cuevas también se denominan “tubos de lava”. 2. Cuevas glaciares: formadas a partir de la fusión del hielo de los glaciares en las grietas y zonas de contacto con la roca, debido al agua que resulta de la fusión del hielo más superficial del glaciar. 3. Cuevas de grieta: se pueden formar en cualquier roca, debido a la actividad de fuerzas de disyunción. Dentro de este grupo se incluyen las cuevas tectónicas. 4. Cuevas marinas: producidas por la erosión de las olas marinas o de grandes lagos. Se pueden formar a partir de varios tipos de rocas que se localizan en zonas costeras acantiladas. 5. Cuevas de tubería: se desarrollan en sedimentos de grano fino mal consolidados tales como turba, margas, arcillas y, especialmente, loess, a partir de la eliminación, por transporte, de pequeños clastos suspendido en agua. 6. Cuevas de erosión: se forman en rocas de características similares a la pizarra, debido a la acción mecánica de las corrientes de agua. Son numerosas en los acantilados. 7. Cuevas de disolución o kársticas: engloban a la mayoría de cuevas naturales (Engel, 2010) y se desarrollan, principalmente, en roca caliza y similares, aunque también surgen a partir de otras litologías como dolomías, evaporitas, silicatos, basaltos y granitos. Estas cuevas representan elementos geológicos característicos de los paisajes kársticos (Figura 1.1). Con el término karst (procedente de la palabra karst, nombre alemán de la región eslovena de Carso) se alude a una forma de relieve originada, esencialmente, por la disolución de rocas, como la caliza, dolomía, yeso, etc., que se componen por minerales solubles en agua. Cuando las cuevas se forman mediante otros procesos (transporte, fusión, erosión, etc.) también se emplea el término pseudokarst (Gillieson, 1996). Las cuevas kársticas presentan importantes interacciones con los 23 humanos y, probablemente, son las mejor estudiadas desde un punto de vista científico. Estas formaciones se pueden clasificar en cavidades de alta, moderada o baja energía, en función de que presenten un intercambio de energía elevado, medio o prácticamente nulo con el exterior (Heaton, 1986). Las cuevas de alta energía se caracterizan por presentar condiciones ambientales con importantes fluctuaciones de origen natural, por lo que difícilmente son alteradas por factores antrópicos. En cambio, las cuevas de baja energía presentan condiciones ambientales muy estables y son fácilmente alterables por factores antrópicos. Figura 1.1. Teórico sistema de cuevas kársticas. Modificado de Gillieson (1996). Las cuevas constituyen ambientes muy especializados caracterizados por una temperatura uniforme, elevada humedad, escasa o nula iluminación (Hernández-Mariné et al., 1999) y poca materia orgánica. En la mayoría de los casos, las cuevas presentan una comunicación con el medio externo que las convierte en zona de tránsito entre los sistemas ecológicos epigeo e hipogeo (Prous et al., 2004). En esta zona se pueden producir pequeñas fluctuaciones climáticas inducidas por variaciones atmosféricas en el exterior que serán más acentuadas en la entrada de la cueva mientras que, en la parte más profunda, las variables ambientales suelen permanecer prácticamente constantes. En relación con el intercambio de energía y materia orgánica con el exterior, las cuevas pueden ser consideradas ambientes prácticamente aislados (Cigna, 1993). 24 1.2. Microbiota asociada a cuevas. Biofilms Los microorganismos forman el conjunto de seres vivos con mayor cantidad de biomasa del planeta y también el más extendido. Gracias a su gran capacidad de adaptación a las condiciones ambientales han colonizado la práctica totalidad de los ambientes descritos, incluidos los extremos. Este hecho les otorga un papel relevante en la mayoría de los procesos biogeoquímicos de la Tierra (Pace, 1997; Whitman et al., 1998). Las cuevas son ambientes muy específicos, con escasos recursos nutricionales y energéticos (Delay y Juberthie, 1981), por lo que resultan hábitats hostiles para muchos grupos de microorganismos (Cunningham et al., 1995; Engel et al., 2001; Barton y Northup, 2007). En las cuevas, el grupo de microorganismos que habitualmente prolifera, en primer lugar, es el que integra a los microorganismos de metabolismo quimiolitotrofo: bacterias y arqueas que obtienen su energía a partir de la oxidación de compuestos inorgánicos y emplean el anhídrido carbónico como fuente de carbono. El grupo de microorganismos heterótrofos suele ser menos numerosos y se localiza en zonas de acumulación de materia orgánica como, por ejemplo, excrementos de animales o sedimentos detríticos arrastrados por el agua al interior de la cueva (Humpreys, 1991; Bottrell, 1996). El grupo de microorganismos fotoautótrofos se desarrolla, de forma exclusiva, en zonas iluminadas (Albertano, 2012). La entrada de microorganismos desde el exterior al interior de la cueva se puede llevar a cabo a través de varios medios de transporte como, por ejemplo, el agua de infiltración, las corrientes de aire, la fauna o mediante sedimentación a través de poros, fisuras o pequeños huecos en la roca. La colonización posterior de las diferentes zonas de la cavidad estará en función de las condiciones ambientales y de la biorreceptividad de los diferentes sustratos, es decir, su potencialidad de ser colonizados (Guillitte, 1995; Miller et al., 2009). Así, todos los sustratos, naturales o artificiales, en las condiciones adecuadas, son susceptibles de ser colonizados (Di Pippo et al., 2009; Warscheid y Braams, 2000). Los trabajos sobre la microbiota de cuevas se iniciaron en el siglo XIX, principalmente en Europa (Caumartin, 1963). Desde entonces, un amplio espectro de microorganismos ha sido identificado habitando en el interior de cavidades. En este medio subterráneo, procariotas, 25 actinobacterias, hongos, levaduras y algas representan el conjunto de microorganismos principalmente identificados (Jurado et al., 2010). Las bacterias son los microorganismos más representativos de la microbiota de cuevas, en especial, las actinobacterias de los géneros Agromyces, Arthrobacter, Microbacterium, Nocardia, Nocardioides and Streptomyces (González et al., 2005), responsables del característico olor de algunas cuevas (Northup y Lavoie, 2001). También se han descrito bacterias relacionadas con el ciclo del nitrógeno y del azufre, como los géneros Nitrosomonas y Nitrobacter (Fliermans et al., 1974) y Thiobacillus, Beggiatoa y Thiotrix (Sarbu, et al., 1996) respectivamente. Otros géneros identificados son Leptothrix, Gallionella y Clonothrix (Caldwell y Caldwell, 1980; Davis et al., 1990), bacterias capaces de oxidar el hierro y el manganeso, cuya presencia también sugiere su participación en el depósito de manganeso y hierro en este medio hipogeo. Microorganismos del filo Proteobacteria también han sido identificados en cavidades, llegando a representar el grupo más abundante en algunos casos (González et al., 2005). Las arqueas son un grupo de procariotas morfológicamente similar a las bacterias. En un principio, el desarrollo de este grupo microbiológico estuvo asociado a ambientes extremos pero, posteriormente, fue descrito en numerosos y variados ambientes naturales (DeLong et al., 1999). Aunque en menor número, también se han realizado trabajos sobre arqueas en cavidades como, por ejemplo, Wind Cave en Dakota del Sur (EEUU), donde se identificaron hasta veinte filotipos diferentes de Crenarchaeota y dos de Euryarchaeota (Chelius y Moore, 2004). Otros trabajos sobre el guano de murciélagos en Domica Cave (Eslovaquia) determinaron que la mayoría de las arqueas pertenecían a la división Crenarchaeota (Chroňáková et al., 2009). Los hongos precisan de una fuente de materia orgánica para su desarrollo. En las cuevas, el aporte principal de materia orgánica procede de restos de organismos muertos y excrementos. Otros elementos de naturaleza orgánica, como madera y sus derivados, que se introducen en las cuevas con motivo de su habilitación turística pueden constituir una importante fuente nutricional para el desarrollo de estos microorganismos (Docampo et al., 2011). Los hongos más comunes identificados en este medio son los filamentosos (Zygomycetes) (Northup y Lavoie, 2001). En la cueva de Lascaux (Francia) el desarrollo masivo del hongo Fusarium solani representa el inicio de sucesivas crisis biológicas en la cavidad que han provocado un cambio 32 frente a una elevada radiación luminosa. Esta composición pigmentaria y la resistencia a la desecación que les otorga una importante capa mucilaginosa compuesta de heteropolisacáridos, proteínas y ADN y segregada por ellos mismos, permite su evolución en el medio hipogeo iluminado. En general, en cavidades kársticas, las cianobacterias se disponen en mosaicos o cinturones según las condiciones ambientales (Roldán et al., 2004a). Así, las cianobacterias cocoides, rodeadas por grandes cantidades de exopolisacaridos, como las del género Gloeothece y la ubicua filamentosa Scytonema julianum (Kütz.) Menegh., son abundantes en zonas próximas a las entradas, en áreas iluminadas y con goteo, mientras que Nostoc punctiforme (Kütz.) Hariot o formas filamentosas tales como Leptolyngbya sp., Microcoleus sp., Schizothrix sp. o diversas especies del género Scytonema son más abundantes en zonas profundas y con poca luz. En las zonas más profundas de cavidades, con muy poca o ninguna luz, una humedad relativa generalmente elevada, pocas variaciones durante el ciclo diurno y pequeñas diferencias entre las temporadas secas y la época de lluvias, suelen proliferar cianobacterias filamentosas con vainas calcificadas y con pigmentos accesorios, tales como Geitleria calcarea Friedmann, Herpyzonema pulverulentum Hernández-Mariné & Canals, Iphinoe spelaeobios Lamprinou and Pantazidou, Loriellopsis cavernicola Hernández-Mariné & Canals y Scytonema ocellatum Lyngb. ex Bornet & Flahault (Hernández-Mariné et al., 2001). Respecto a la humedad, para el desarrollo de los biofilms en general, parece ser más determinante la duración de los periodos secos y el número de períodos húmedos (GladisSchmacka et al., 2014) que la cantidad total de agua disponible (Büdel et al., 2009). En relación con la disponibilidad de agua, algunos organismos han desarrollado estrategias de supervivencia durante períodos de sequía (Potts, 1999), que incluyen el empleo de agua retenida en el sustrato y la formación de compuestos protectores tales como sacarosa o trehalosa (Potts, 2001). Por grupos taxonómicos, las algas verdes pueden sobrevivir con una humedad ambiental elevada, mientras que las cianobacterias necesitan agua líquida o un 100% de humedad ambiental para realizar la fotosíntesis. No obstante, cianobacterias como Chroococcidiopsis sp. y Nostoc commune Vaucher, pueden legar desecarse sin morir (Alpert, 2006) y recuperarse rápidamente en condiciones favorables y, por tanto, soportar fluctuaciones de humedad y sobrevivir en los hábitats más extremos durante largos períodos (Potts, 2001; Wierzchos et al., 2006; Ramírez et al., 2011). 33 En relación con su desarrollo en el sustrato, en cuevas han sido descritos biofilms fotosintéticos epilíticos (sobre el sustrato), criptoendolíticos (en poros y oquedades), casmoendolíticos (en grietas) y endolíticos (bajo superficies translúcidas) (Golubic, 1981). En base a la textura, Gillieson (1996) determinó que los sustratos lisos presentan menor colonización por microorganismos fotosintéticos en relación con los sustratos rugosos. El desarrollo de estos biofilms en el sustrato puede implicar procesos de biodeterioro como, por ejemplo, discoloración, erosión, disgregación, ruptura, cristalización, disolución o alteración química, proceso especialmente dañino en sustratos calcáreos (Lefevre, 1974; Hernández-Marine et al., 2003; Sáiz-Jiménez, 2011; Albertano, 2012) que, en el caso de cianobacterias endolíticas, pueden inducir la exfoliación de las capas superficiales del sustrato (Krumbein, 1988). Por su parte, Ramírez et al. (2010) demostraron que la presencia de biofilms puede aportar estabilidad y protección al sustrato. Frente a condiciones ambientales adversas, algunos biofilms desarrollan estrategias de cooperación y resistencia que les permiten sobrevivir. En este sentido, resulta impreciso extrapolar características específicas de especies cultivadas por separado en un laboratorio a la realidad de un biofilm, donde coexisten múltiples especies (Albertano, 2012). Por ello, y debido a las dificultades que conlleva reproducir con precisión las complejas interacciones entre el biofilm y el sustrato, son más eficaces y productivas aquellas investigaciones que pueden llevarse a cabo in situ (Hernández-Mariné et al., 1999, 2003, Roldán et al., 2004a, 2004b). El estudio de los biofilms fotosintéticos que afectan a las pinturas paleolíticas de la famosa cueva de Lascaux, en Francia, fue el primero que se desarrolló en relación al biodeterioro producido por microorganismos fotosintéticos en el medio hipogeo (Lefèvre et al., 1969). Desde entonces, esta forma de biodeterioro ha sido ampliamente investigado, tanto en cuevas como en otros monumentos hipogeos (Roldán et al., 2004a; Mulec et al., 2009; Lamprinou et al., 2009; Roldán y Hernández-Mariné, 2009; Urzi et al., 2010; Albertano, 2012; del Rosal et al., 2014b, entre otros). La información obtenida ha ofrecido, a los gestores de estos monumentos hipogeos, eficaces herramientas para el control de este tipo de colonización, acorde con una adecuada conservación del sustrato y, por tanto, del patrimonio (del Rosal et al., 2010, 2014a). Sus resultados han puesto de manifiesto que, en general, los organismos fotosintéticos hallados en cuevas son los mismos que los identificados en otros monumentos hipogeos con categoría de Patrimonio Cultural (Roldán et al., 2004b, Mulec y Kosi, 2009; del Rosal et al., 2010, 2014). 34 35 CAPITULO 2 LA CUEVA DE NERJA 2.1. Descripción La Cueva de Nerja se ubica en el sector oriental de la provincia de Málaga, unos cinco kilómetros al este del pueblo costero de Nerja, sobre la vertiente meridional de Sierra Almijara. Fue descubierta en 1959 y abierta al público un año más tarde, tras su acondicionamiento turístico. La cavidad es una de las principales cuevas turísticas de España, con una media actual en torno a los 400.000 visitantes anuales. La cavidad, declarada Bien de Interés Cultural con categoría de Zona Arqueológica, alberga una secuencia crono-cultural y paleoambiental comprendida entre 25.000 y 3.600 años antes del presente y además constituye uno de los yacimientos más ricos del sur peninsular en manifestaciones artísticas prehistóricas, ya que cuenta con más de trescientos grupos pictóricos y grabados parietales catalogados, pertenecientes al Paleolítico Superior y a la Prehistoria Reciente (Sanchidrián, 1994). La Cueva de Nerja constituye, además, un elemento destacado del Patrimonio Natural de Andalucía, con importantes valores geológicos y biológicos (del Rosal et al., 2009) que han motivado su declaración como Lugar de Relevancia Geológica Internacional. La cavidad tiene una superficie total aproximada de 35.000 m2 y un volumen del orden de los 300.000 m3. Su desarrollo es prácticamente horizontal, entre las cotas 123 y 191 m s.n.m. (S.E.M., 1985) y cuenta con tres bocas de acceso, dos torcas subcirculares ubicadas a 161 y 162 36 m s.n.m y una entrada más amplia, a cota 158 m s.n.m., habilitada para la visita turística. A efectos prácticos, en la Cueva de Nerja se distinguen dos sectores: una zona habilitada para el turismo (Galerías Turísticas) y una zona no habilitada (Galerías Altas y Nuevas), que sólo recibe visitas ocasionales de investigadores y grupos reducidos de espeleoturistas (Fig. 2.1). Las Galerías Turísticas, con un volumen de 106.286 m3 y una superficie de 9.371 m2, corresponden, aproximadamente, a un tercio del total de la cueva y se dividen las salas de Vestíbulo, Belén, Cascada, Fantasmas, Cataclismo, Mina y Torca. Figura 2.1. Modificado de SEM, 1985. Grupo de Exploraciones Subterráneas de la Sociedad de Excursionistas de Málaga. Plano topográfico de la Cueva de Nerja, la parte más al sur corresponde al sector de las Galerías Turísticas. Los trabajos de acondicionamiento turístico de la cavidad comenzaron en septiembre de 1959, con la búsqueda de un acceso más viable y menos complicado que la pequeña torca empleada por los descubridores. Tras la apertura de la entrada, ésta se protegió con la construcción de un pequeño edificio de acogida. Los diferentes desniveles existentes dentro de la cueva se solventaron mediante la construcción de escaleras, algunas de considerable altura. En un primer momento, la visita se realizaba sobre el suelo original, salvo en la Sala del Cataclismo, donde se construyó un vial de hormigón de recorrido circular utilizando, en ocasiones, material de la propia cavidad, principalmente la arena procedente de la erosión de los mármoles sacaroideos en los que se desarrolla la gruta. Posteriormente, se construyeron viales de hormigón 37 en todas las salas del sector turístico. En algunas salas, el recorrido de la visita turística se delimitaba mediante cuerdas ensambladas en bases de cemento y postes de hierro mientras que, en otras, existían barandillas de hierro y madera algo más elaboradas. Además, se instaló un sistema de iluminación artística de gran potencia formado por proyectores con bombillas incandescentes, de hasta 1.500 watios. En algunas zonas de la cavidad se instalaron luces de colores y dispositivos de sonido que amenizaban el recorrido del visitante durante los primeros años. Un sistema de lámparas de menor potencia iluminaba de forma directa los caminos. Los trabajos de acondicionamiento para el uso turístico de la Cueva de Nerja culminaron el 12 de junio de 1960, con el acto de inauguración de la cavidad, el I Festival de Música y Danza Cueva de Nerja (Liñán et al., 2010). 2.2. Geología y mineralogía La cavidad se desarrolla en mármoles dolomíticos triásicos de la unidad alpujárride de Almijara (Andreo y Carrasco, 1993). Los mármoles, muy diaclasados y con una potencia de hasta 500 metros, son permeables por fracturación y karstificación y constituyen el acuífero de la vertiente meridional de Sierra Almijara (Pérez y Andreo, 2007). Una de las características más destacables de la Cueva de Nerja es la abundancia y variedad de espeleotemas, formaciones de carbonato cálcico depositado a partir de aguas de infiltración. El estudio de dichos espeleotemas ha aportado información acerca de la historia geológica del sistema kárstico en el que se localizan y de las condiciones paleoambientales, además de caracterizar los distintos tipos de formaciones, analizar sus alteraciones y ayudar a predecir su posible evolución futura (Reyes et al., 1993; Caballero et al., 1995; Jiménez de Cisneros et al., 2006). El análisis mineralógico realizado a espeleotemas localizados en diferentes puntos de la Cueva de Nerja indicó que los componentes principales eran la calcita, el aragonito y la dolomita. En el moonmilk, además se determinó huntita, magnesita e hidromagnesita. El estudio sobre los procesos de alteración desarrollados en espeleotemas de la Cueva de Nerja y determinó al aragonito como componente mayoritario de las muestras seguido de calcita y dolomita. El análisis de los elementos traza (Sr, Mn, Mg, Fe) indicó que el contenido en Fe y Mn era mayor en las muestras que forman costras de alteración. 38 2.3. Hidrodinámica e hidroquímica En la actualidad, la cueva está situada en la zona no saturada del acuífero, varios metros por encima del nivel piezométrico. Sobre la cavidad, el espesor del epikarst y la zona no saturada es muy variable: de 4 a 50 metros en el primer tercio de la cavidad y mayor de 90 metros en las zonas profundas. El agua que gotea desde el techo de la cueva se infiltra a través de fisuras y fracturas de los mármoles y procede tanto del agua de lluvia como del riego de una pequeña superficie de jardín que se encuentra por encima de la cueva (Andreo y Carrasco, 1993; Liñán et al., 2008). El goteo dentro de la cavidad es, en general, muy bajo, entre 10-100 m3/año en condiciones pluviométricas promedio, con máximos en primavera-verano y mínimos en otoñoinvierno. El análisis realizado para determinar el tiempo de tránsito del agua de lluvia a través del epikarts de las Galerías Turísticas indica la existencia de dos tipos de infiltración (Liñán et al., 1999, Andreo et al., 2005): uno lento, en torno a 8 meses, que predomina todo el año, y otro un poco más rápido, de aproximadamente 2 meses, que sólo se produce cuando los niveles de recarga son muy importantes en magnitud o intensidad. En las Galerías Altas y Nuevas, el flujo de agua de goteo muestra una variación estacional diferente, con máximos en otoño-invierno y mínimos en primavera-verano. Desde un punto de vista hidroquímico, en la Cueva de Nerja hay dos tipos principales de agua: en la zona más cercana al exterior y en el resto de la cueva (Andreo et al, 1993). El primer tipo procede de un pozo cercano, se utiliza para regar el jardín y, posteriormente, se filtra en la cueva y el segundo tipo es de origen meteórico, como lo demuestra su composición química e isotópica (Liñán et al., 1999). El agua dentro de la cueva está sobresaturada en calcita durante todo el año, por lo que produce depósito de carbonato cálcico. 2.4. Microclima El análisis de la amplia gama de datos ambientales disponible ha permitido determinar la variación “natural” de los parámetros controlados y la influencia antropogénica en la cavidad 39 (Carrasco et al., 1999, 2002; Liñán et al., 2014). No obstante, se debe tener en cuenta que los datos empleados en el análisis se obtuvieron tras la apertura de la cavidad a la visita turística. Por un lado, una completa estación meteorológica ha permitido determinar los principales parámetros climáticos en el entorno inmediato de la cavidad. Así, en el exterior de la cueva, la temperatura media diaria del aire está comprendida entre 13 ºC (Enero) y 26 ºC (Agosto), con un valor medio anual de 19 ºC (Carrasco et al., 1999; Carrasco et al., 2002; Liñán et al., 2007). Los valores medios de humedad relativa del aire están comprendidos entre el 61 y el 69 %, con un valor medio anual del 66 % y la precipitación media del área es de 487 mm/año (Liñán et al., 2007), con una marcada estación húmeda durante los meses de octubre a enero y una estación seca que comprende el período estival. Por otro lado, en el interior de la cueva existe una red de control ambiental integrada por diversos sensores que actualmente miden, con periodicidad horaria, la temperatura, la humedad relativa y la concentración de 222Rn y CO2 del aire, entre otros parámetros (Carrasco et al., 2002; Liñán et al., 2009; Liñán et al., 2014). Los resultados obtenidos han permitido determinar los valores de los principales parámetros ambientales de la Cueva de Nerja, tanto en el sector turístico como en el no habilitado (Tabla 2.1). En las Galerías Turísticas, la temperatura media del aire aproximada es de 18 ºC y su evolución sigue un patrón similar al del exterior, con valores máximos durante el verano y mínimos en invierno, aunque con un desfase de casi un mes con respecto a la temperatura exterior. La temperatura del aire aumenta hacia las zonas más internas (Galerías Altas y Nuevas), excepto durante el período estival, momento en el que la mayor temperatura exterior produce una inversión del gradiente térmico. La humedad relativa del aire de la cueva sigue la evolución de la humedad relativa del aire exterior, con un desfase de seis meses aproximadamente (Vadillo et al., 2001). El valor medio diario de la humedad relativa del aire de las Galerías Turísticas varía entre el 64 y el 92 %. A escala anual, este parámetro muestra valores mínimos en otoño-invierno, más elevados en primavera y máximos en verano, alcanzándose valores de saturación, como consecuencia del 40 incremento del caudal de goteo, menor ventilación natural de la cavidad y la llegada de masas de aire más húmedo desde las zonas más internas de la cavidad (Liñán y del Rosal, 2014). La concentración media anual de CO2 en las Galerías Turísticas es de aproximadamente 667 ppm y varía dependiendo de la época del año: en invierno, cuando menor es el número de visitantes, mayor es la capacidad de ventilación natural de la cavidad y menor es el caudal de goteo, se alcanzan valores diarios similares a los de la atmósfera exterior; en verano, cuando la visitabilidad es máxima, el índice de ventilación natural es menor y el caudal de goteo es más elevado se alcanzan valores diarios próximos a los 2000 ppm (Liñán et al., 2014). (Tabla 2.1). La temperatura de la roca permanece entre 1 y 2 ºC por debajo de la temperatura del aire de la cueva (Carrasco et al., 2002). A escala diaria se producen variaciones de los parámetros ambientales durante el horario en el que la cueva permanece abierta al público, debidas encendido de los focos de iluminación y a la presencia de visitantes. En el sector turístico, se producen incrementos de la temperatura del aire (entre 0,2-0,6 ºC), pequeños incrementos en la humedad relativa del aire (del orden del 2 al 3 %) así como incrementos en la concentración de CO2, que disminuyen durante las horas de cierre hasta llegar a la recuperación de los valores iniciales, previos al comienzo de la visita. En verano, esta recuperación puede no ser total, produciéndose un efecto acumulativo, especialmente notable durante la celebración del Festival de Música y Danza (Carrasco et al., 2002). En las Galerías Altas y Nuevas, se ha determinado que el aire es más cálido, más húmedo y tiene menor concentración de CO2 que el aire de las Galerías Turísticas, en sintonía con su ubicación, más alejada de la entrada de la cueva, más profunda con respecto a la superficie y con un reducido número de visitantes (Liñán et al., 2014). El valor medio de la temperatura del aire en las Galerías Altas y Nuevas supera casi en un grado centígrado el valor medio de temperatura del aire del sector turístico. Los valores de humedad relativa varían entre el 92 y el 100 %, con un valor medio prácticamente de saturación. Del mismo modo, el contenido medio de CO2 del aire en el sector no visitable de la cueva es inferior al medido en las Galerías Turísticas (Tabla 2.1). 41 Belén Cascada Cataclismo Hércules Inmensidad (sc/c) Lanza H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 n 2050 1006 1923 1791 846 438 260 Max 29,87 19,91 19,67 19,73 19,59 19,87 19,49 Min 6,52 15,64 16,15 15,89 18,97 19,67 19,27 Med 18,38 17,76 18,09 18,76 19,31 19,76 19,37 V (%) 26,87 6,78 4,60 2,98 0,87 0,26 0,30 n 1708 970 401 1870 592 415 - Max 98 78 100 100 100 110 - Min 30 46 53 67 73 102 - Med 67 64 90 92 92 104 - V (%) 18 10 11 8 9 2 - n - 439 1369 615 538 353 88 Max - 1401 1185 1423 1181 1946 1239 Min - 456 357 400 400 350 350 Med - 682 563 756 607 516 540 V (%) - 33 24 29 25 30 40 n - - 1217 - - - 321 Max - - 719 - - - 526 Min - - 80 - - - 90 Med - - 201 - - - 241 V (%) - - 79 - - - 47 CO2 (ppm) Radón (Bq/m3) Galerías Altas y Nuevas Tª (ºC) H.R. (%) Exterior Galerías Turísticas Tabla 2.1. Valores medios de temperatura, humedad relativa y concentración de CO2 y 222Rn del aire en el exterior y en el interior de la Cueva de Nerja, calculados a partir de datos horarios correspondientes al período 2008 -2013 (Liñán et al., 2014). La concentración media anual de radón del aire del sector turístico y del no habilitado es similar, con valores de 201 y 240 Bq/m3 respectivamente (Liñán et al., 2014). Las concentraciones mínimas de radón corresponden a los meses de otoño-invierno y las concentraciones máximas a los meses de primavera-verano (Cañete, 1997; Dueñas et al., 1999; del Rosal et al., 2010b; Liñán et al., 2014). Los trabajos realizados por Liñán y del Rosal (2014) pusieron de manifiesto la existencia de un patrón estacional en la circulación del aire interior así como de una nueva vía de entrada a la red kárstica de la Cueva de Nerja, aspecto que necesariamente debe ser tenido en cuenta para su adecuada gestión y conservación. 48 El resto de salas de las Galerías Turísticas ha permanecido en total oscuridad desde la colmatación de la entrada natural, hace unos 3.000 años, hasta su habilitación para la visita turística llevada a cabo en 1959. Estos trabajos incluyeron la instalación de un sistema de iluminación eléctrica que, progresivamente, ha ido cambiando a lo largo de los años. En un principio, este sistema estuvo formado por lámparas incandescentes de 1500 watios que, posteriormente, fueron sustituidas por luces frías de menor potencia. La aplicación de esta medida permitió una bajada del consumo eléctrico de 200.000 a 136.000 watios, desde 1989 a 1993 y un “apreciable descenso de la cantidad algas” (Marín, 1998). A principios de la década de los 90 comenzó la instalación de un sistema de fibra óptica que no finalizó debido, principalmente, a las continuas averías derivadas de la elevada humedad ambiental. En la actualidad la iluminación se realiza, principalmente, mediante lámparas fluorescentes de bajo consumo de 7, 11 y 18-20 watios que se emplean en los diversos tipos de iluminación: escénica, viales y de emergencia. Para iluminar grandes superficies se emplean, además, lámparas de halogenuro metálico de 70 watios (Figura 4.1). Figura 4.1. Diferentes lámparas de iluminación empleadas en la cueva de Nerja. De izquierda a derecha, halogenuro metálico (70 w), fluorescente para iluminación escénica (20 w) y fluorescente para iluminación vial (7 w). En total, el número de lámparas empleadas en el interior de la cueva ronda las 200 unidades, todas ellas con temperatura de color blanco frío. El tiempo de actividad de este sistema de iluminación es de unas 8 horas diarias, que engloba tanto el horario de apertura de la cueva como los trabajos de mantenimiento e investigación. Durante los meses de julio y agosto, debido a la modificación del horario de apertura de la cueva, el sistema de iluminación permanece encendido durante 10 horas al día, aproximadamente. Esta iluminación de las Galerías Turísticas se controla desde el exterior de la cueva, a través de un cuadro eléctrico ubicado en el edificio de 49 acogida, si bien existen pequeños paneles en el interior de la cavidad, para el control especifico de infraestructuras. Para evitar problemas derivados de los posibles cortes de suministro eléctrico, se dispone de baterías UPS y de generadores de corriente. El desarrollo de biofilms fotosintéticos en las Galerías Turísticas debió comenzar tras la apertura de la cueva al público, aunque no se dispone de documentación sobre este hecho. La iluminación de las Galerías Altas y Nuevas es de carácter escénico y se lleva a cabo mediante lámparas de halogenuro metálico de 70 watios. Este sistema de iluminación se controla mediante un cuadro eléctrico ubicado en la entrada al sector no habilitado y se activa, exclusivamente, durante las visitas a la zona, que se limitan al desarrollo de la actividad de espeleoturismo o de campañas de investigación. Los escasos periodos de iluminación de este sector de la cueva no han favorecido, hasta el momento, la presencia de microorganismos fotosintéticos. Los trabajos de investigación de los biofilms fotosintéticos de la Cueva de Nerja comenzaron en 1985, a cargo de Ruiz et al. (1992) quienes investigaron los microorganismos fotosintéticos que colonizaban paredes y estalactitas con agua de escorrentía en el interior de la cavidad. Su trabajo se centró en lo que estos investigadores denominaron “manchas de fieltro”, agregados coloniales de aspecto gelatinoso, así como en otros de aspecto pulverulento y seco (Figura 4.2). El estudio, basado en la observación directa de varias zonas que mostraban colonización de biofilms fotosintéticos, puso de manifiesto la existencia de una estacionalidad en la disponibilidad de agua líquida en el sustrato, con mínimos durante el invierno, que se relacionaban con cambios morfológicos de las colonias. De hecho, este parámetro se consideró el más influyente en el aspecto de las colonizaciones. La identificación de los microorganismos fotosintéticos de los biofilms mostró a la cianobacteria Gloeocapsa sp. como el grupo más abundante en las paredes, mientras que los géneros Oedogonium, Cladophora o incluso Microspora predominaban mayoritariamente en las estalactitas. Durante este estudio también se realizaron experimentos sobre la resistencia de los biofilms a la privación de luz. Para ello se mantuvo en total oscuridad, durante 6 meses, una superficie colonizada de aproximadamente 0,75 m2. Transcurrido este período no se observaron variaciones ostensibles en el aspecto 50 macroscópico de las colonias. Finalmente, el seguimiento de las zonas durante el período 19851990, no identificó un aumento en la cantidad de algas del interior de la cueva, ni en superficie, ni en densidad de las colonizaciones. Figura 4.2. Imagen macroscópica de las dos texturas identificadas por Ruiz et al. (1992) en los biofilms fotosintéticos de la Cueva de Nerja. A la izquierda, “manchas de fieltro” con textura gelatinosa y, a la derecha, microorganismos con textura pulverulenta. En el año 2000, el equipo de investigación dirigido por el profesor Marín desarrolló un nuevo trabajo sobre los biofilms fotosintéticos (Marín y Marín-Olalla, 2000). En esta ocasión se limpiaron, con agua a presión y un cepillo rotatorio de cerdas suaves, cuatro superficies colonizadas por biofilms fotosintéticos (Figura 4.3.). Posteriormente se llevó a cabo el seguimiento de las zonas limpiadas mediante la observación directa de las zonas y la comparación de imágenes de las mismas, obtenidas con una periodicidad mensual. Los resultados indicaron que aquellas superficies de mayor consistencia y colonizadas por microorganismos que se incrustaban en el sustrato, mostraban una apariencia completamente libre de microorganismos fotosintéticos tras la limpieza, pero transcurridos unos meses, el aspecto de la superficie se tornaba degranulado y pulverulento. Este fenómeno se consideró un efecto desestabilizador o alterativo del sustrato. Por otro lado, la limpieza de zonas con biofilms 51 fotosintéticos de textura gelatinosa y fácilmente desprendibles del sustrato, fue igualmente efectiva y no mostró formas de alteración de la superficie en los meses posteriores. Figura 4.3. Una de las superficies limpiada mediante cepillado y agua a presión. A la izquierda, aspecto antes de la limpieza y, a la derecha, aspecto después de la misma (Marín y Marín-Olalla, 2000). En el año 2006, se llevó a cabo otro ensayo de limpieza de espeleotemas (Garrido et al., 2007). En esta ocasión se emplearon dos diluciones de biocidas: una de agua saturada en calcita y peróxido de hidrógeno (15 %) (Faimon et al., 2003) y otra de agua saturada en calcita e hipoclorito cálcico (2 %) (Iliopoulou-Georgoudaki et al., 1993). En el caso de las zonas tratadas con peróxido de hidrógeno fue necesario aplicar tres tratamientos, espaciados entre sí un par de semanas, para conseguir un resultado satisfactorio de la limpieza (Fig. 4.4). Las zonas tratadas con hipoclorito cálcico, mostraron una intensa colonización fúngica de la superficie limpiada pocos días después de la aplicación del biocida. Para eliminar esta colonización fúngica, se llevó a cabo una nueva aplicación de biocida, en este caso, destinada a eliminar los hongos y restos de microorganismos muertos que permanecían en el sustrato y constituían la fuente nutricional de estos hongos (Fig. 4.4). En ambos casos, se realizó el seguimiento de las zonas tratadas a lo largo de un año, basado en la observación directa y la comparación de fotografías de las zonas limpiadas, obtenidas periódicamente. La recolonización del sustrato por microorganismos fotosintéticos transcurrido un año del proceso de limpieza se definió como “prácticamente 52 inapreciable”. En 2011, las zonas que habían sido limpiadas mediante las metodologías descritas anteriormente mostraban de nuevo colonización por microorganismos fotosintéticos. Figura 4.4. Arriba, imágenes de la zona limpiada con peróxido de hidrógeneno, antes y después del tratamiento. Abajo, imágenes de la zona limpiada con hipoclorito cálcico, antes y después del tratamiento. Han sido muchas las técnicas empleadas para eliminar los biofilms fotosintéticos del interior de las cuevas, tanto físicas como químicas. La limpieza de las colonias mediante procesos físicos no es recomendable debido a que facilita la dispersión de propágulos (Rajczy, 1989; Hazslinszky, 2002) o a los posibles daños producidos en el sustrato. En relación con los biocidas, su principal desventaja es la toxicidad hacia el medio (Caumartin, 1977). De éstos, los compuestos clorados han sido los más ampliamente empleados a pesar de que el cloro, aun a baja concentración, puede afectar a la microbiota autóctona de la cueva y alterar el equilibrio del ecosistema subterráneo. Por otro lado, el cloro también disminuye el pH del sustrato y favorece los procesos de disolución de la calcita. (Faimon et al., 2003). La alternativa a estos compuestos se planteó mediante el empleo de una disolución de peróxido de hidrógeno (15 %) y agua saturada en calcita que minimiza la agresión del sustrato carbonatado (Faimon et al., 2003). En 53 cualquier caso, la puesta en práctica de cualquier protocolo de limpieza basado en el empleo de biocidas debe incluir la retirada del medio de la materia orgánica muerta producida, de cara a evitar la colonización masiva del medio por microorganismos fúngicos, tal y como ha sido descrito en la Cueva de Lascaux (Bastian et al., 2010). En esta cueva, la limpieza intensiva y periódica con biocidas durante años dio lugar al desplazamiento de la microbiota autóctona de la cueva que fue reemplazada por comunidades de microorganismos resistentes a los biocidas. En la actualidad, la microbiota de la cueva de Lascaux es el resultado de un largo periodo de impacto humano (visitantes, ventilación artificial, tratamientos con biocidas) que ha motivado la pérdida del equilibrio entre las poblaciones de microorganismos que forman este ecosistema y favorecido la colonización masiva del medio por microorganismos fúngicos (Bastian et al., 2010). 4. 2. Inventario de biofilms fotosintéticos en la Cueva de Nerja Además de consultar la información disponible, se planteó la necesidad de conocer el estado actual de colonización fotosintética de la Cueva de Nerja. Para ello, se elaboró un inventario que identificó y ubicó cada una de las zonas colonizadas por biofilms fotosintéticos en el interior de la Cueva de Nerja. Su resultado se presenta en el Anexo 1 de la presente memoria. Este inventario integra un conjunto de imágenes de cada una de las zonas colonizadas así como su ubicación en el correspondiente plano topográfico de la sala en la que se encuentra (Fig. 4.5). Durante el desarrollo de este trabajo se pudo comprobar que la presencia de organismos fotosintéticos en la cueva continuaba limitada a la zona de las Galerías Turísticas a excepción de las salas de la Mina y de la Torca, ubicadas fuera del recorrido turístico. En estas dos salas, el sistema de iluminación se activa de forma puntual debido a que su acceso está restringido a personal de mantenimiento e investigador. En la Sala de la Mina, en oscuridad total la mayor parte del año, no se ha identificado colonización fotosintética y en la Sala de la Torca las zonas de colonización fotosintética se deben a la entrada de luz natural a través de las dos torcas presentes en la sala. En el resto de las salas de las Galerías Turísticas, los biofilms fotosintéticos se localizan en el entorno de las lámparas de luz eléctrica y su número es proporcional al tamaño de la sala y al número de fuentes de iluminación. En total, fueron identificados 114 puntos de los 54 cuales, más del 50 % se ubicaban en la Sala del Cataclismo (Tabla 4.1.). La elaboración de este inventario permitió identificar lámparas en avanzado estado de deterioro e incluso en desuso, que fueron sustituidas por otras nuevas o retiradas del interior de la cueva. Figura 4.5. A la izquierda, sección de plano de la Sala del Belén, a la derecha, ejemplo de una imagen que forma parte del catálogo (Bel-3). Sala Galerías Turísticas Nomenclatura puntos Total de puntos/sala Sala de la Torca Tor-1/Tor-4 4 Sala del Vestíbulo Ves-1/Ves-4 4 Sala del Belén Bel-1/Bel-16 16 Sala de la Cascada Cas-1/Cas-18 18 Sala de los Fantasmas Fan-1/Fan-10 10 Sala del Cataclismo Cat-1/Cat-62 62 Tabla 4.1. Planos que integran el catálogo, Nomenclatura y número de puntos en cada uno de ellos. 55 4.3. Criterios de selección de las zonas de control Para la consecución de los objetivos propuestos en la presente memoria, se seleccionaron una serie de zonas colonizadas por biofilms fotosintéticos, que serían controladas y analizadas durante el periodo de estudio. La selección de estas zonas de estudio se basó en los siguientes criterios: a) Textura del biofilm. Se seleccionaron zonas que mostraban colonización por biofilms con diferentes texturas. En general, se identificaron tres texturas principales: una gelatinosa, con colonias en forma de agregados de 1-2 cm de diámetro, conocido anteriormente como “manchas de fieltro” (Ruiz et al., 1992), otra pulverulenta, de distribución más homogénea en el sustrato y otra semi-gelatinosa, con mayor consistencia de los biofilms, en relación con la textura pulverulenta. Los diferentes tipos de textura se relacionaron con la presencia de agua líquida en el sustrato. Así, la textura gelatinosa se observó en biofilms con disponibilidad de agua líquida constante, la semi-gelatinosa en biofilms con disponibilidad de agua líquida estacional y la pulverulenta en biofilms que no disponían de agua líquida (visible) a lo largo del año. b) Fuente de iluminación. Se seleccionaron zonas iluminados por luz natural y artificial. En este último caso, también se seleccionaron zonas iluminadas por lámparas de halogenuro metálico de 70 w y por lámparas fluorescentes de 20 w y 7 w. c) Distancia al recorrido turístico. Formaron parte de nuestro estudio zonas que se encontraban a diferente distancia del recorrido turístico. En base este criterio, se establecieron las siguientes ubicaciones: Próxima (inferior a 1 m); Intermedia (entre 1 y 5 m); Alejada (superior a 5 metros) y Ausente (en una sala no visitable). d) Disponibilidad de agua líquida y propiedades hidroquímicas del agua. En base a este criterio se seleccionaron zonas cuyo sustrato mostraba agua líquida estacional o permanente y otras con ausencia. 56 e) Aplicación de un tratamiento de limpieza. Se seleccionaron zonas que habían sido limpiadas mediante alguno de los tratamientos descritos en el apartado 4.1 de la presente memoria, así como otras en las que no se habías realizado limpiezas previas. En base a estos criterios se seleccionaron 10 zonas de control, con evidente colonización por biofilms fotosintéticos, que fueron identificadas con las siglas Ne.1, Ne.2, Ne.3, Ne.4, Ne.7, Ne.8, Ne.9, Ne.10, Ne.11 y Ne.12 (Tabla 4.2). Zona control Recorrido turístico Fuente luz principal Agua líquida Textura biofilm Tratamiento limpieza Ne.1 Alejada F. blanco 20 W No Pulverulenta Ca(ClO)2 (2 %) Ne.2 Alejada F. blanco 20 W No Pulverulenta No Ne.3 Intermedia F. blanco 20 W No Pulverulenta No Ne.4 Ausente Natural No Pulverulenta No Ne.5 Alejada Experimentación No --- --- Ne.6 Alejada Experimentación No --- --- Ne.7 Intermedia F. blanco 20 W No Pulverulenta H2O2 (15 %) Ne.8 Intermedia H.M. blanco 70 W No Pulverulenta No Ne.9 Intermedia F. blanco 20 W No Pulverulenta No Ne.10 Próxima F. blanco 7 W Si Semi-gelatinosa Agua a presión/ H2O2 (15 %) Ne.11 Próxima F. blanco 20 W Si Pulverulenta/Gelatinosa No Ne.12 Próxima F. blanco 20 W Si Pulverulenta/Gelatinosa No Ne.13 Alejada Experimentación No --- --- Ne.14 Alejada Experimentación No --- --- Tabla 4.2. Descripción de las zonas de control en base a los criterios de selección. Leyenda: F. (Fluorescente), H.M. (Halogenuro Metálico). Además, se seleccionaron otras 4 zonas que no mostraban colonización fotosintética a simple vista y fueron denominadas: Ne.5, Ne.6, Ne.13 y Ne.14. Estas zonas formaron parte de un experimento destinado a conocer la colonización primaria por microorganismos fotosintéticos de varios espeleotemas iluminados mediante diferentes tipos de lámparas (leds y fluorescentes) y 57 colores (verde y blanco) (Tabla 4.2). La elección del color blanco fue debida a que, actualmente, es el color empleado para la iluminación de los monumentos, en general, y de la Cueva de Nerja, en particular. La elección del color verde se basó en Roldán et al. (2006), cuyos resultados recomiendan la iluminación de obras de arte mediante luz verde para prevenir o limitar el desarrollo de organismos fotosintéticos. 4.4. Descripción de las zonas de control La descripción de las zonas seleccionadas se presenta continuación junto con la nomenclatura de cada una de ellas, entre paréntesis, correspondiente al inventario de zonas colonizadas que se presenta en el Anexo 1 de la presente memoria. Ne.1 (Cat-57): Se ubica en la Sala del Cataclismo, alejada del recorrido turístico. El biofilm fotosintético es de textura pulverulenta y pocos milímetros de espesor. Se desarrolla en la cara transversal de dos espeleotema fracturados y ubicados en el suelo (Fig. 4.6). No se observa agua líquida en el sustrato. Ausencia de zonas de goteo en el entorno. La fuente de iluminación principal de la zona es una lámpara fluorescente (20 W). Uno de los espeleotemas de esta zona (el más grande, a la derecha de la imagen) fue limpiado en el año 2006 mediante dilución de hipoclorito cálcico en agua saturada en calcita (2 %). Figura 4.6. Imagen de la zona Ne.1 (noviembre de 2011). 64 Ne.5: Se localiza en la Sala del Cataclismo, alejada del recorrido turístico, a unos 10 metros de los puntos de control Ne.1 y Ne. 2. La zona seleccionada es un espeleotema que se encuentra en oscuridad, sin evidencia de colonización fotosintética y ausencia de agua en el sustrato (Fig. 4.16). Figura 4.16. Imagen de la zona Ne.5 (noviembre de 2011). Ne.6: Se localiza en la Sala del Cataclismo, alejada del recorrido turístico y próxima las zonas Ne.5, Ne.1 y Ne.2. La zona seleccionada es un espeleotema que se encuentra en oscuridad, sin evidencia de colonización fotosintética y ausencia de agua en el sustrato (Fig. 4.17) Figura 4.17. Imagen de la zona Ne.6 (noviembre de 2011). 65 Ne.13: Se localiza en la Sala del Belén, a una distancia media del recorrido turístico. La zona seleccionada es un espeleotema de la pared de la sala y se encuentra en oscuridad. Esta superficie no muestra evidencias de colonización fotosintética y no se observa agua líquida en el sustrato (Fig. 4.18) Figura 4.18. Imagen de la zona Ne.13 (noviembre de 2011). Ne.14: Se localiza en la Sala del Belén, a unos 5 metros de la zona Ne. 13 y a una distancia media del recorrido turístico. La zona seleccionada es un espeleotema que forma parte de la pared de la sala y se encuentra en oscuridad, sin evidencias de colonización fotosintética y sin agua líquida en el sustrato aunque el suelo (sedimento) se inunda en varias ocasiones a lo largo del año (Fig. 4.19). Figura 4.19. Imagen de la zona Ne.14 (noviembre de 2011). 66 67 CAPITULO 5 EVOLUCIÓN DE LOS BIOFILMS FOTOSINTÉTICOS DE LA CUEVA DE NERJA. RELACIÓN CON LOS FACTORES AMBIENTALES 5.1. Introducción En la actualidad, las estrategias de conservación del patrimonio frente a la contaminación microbiológica recomiendan la puesta en práctica de actuaciones preventivas. Prevenir el biodeterioro es la mejor estrategia de control y para conseguirlo, es imprescindible conocerlo. No existe una única técnica que permita el estudio integral de los procesos de biodeterioro. Diseñar estrategias de prevención y control del biodeterioro generado por biofilms precisa conocer la naturaleza del agente de alteración (biofilm) así como del sustrato alterado. No obstante, también es importante conocer cuánto y por qué cambia la alteración. Esta información permitirá identificar aquellos factores que más influyen en la evolución del biofilm así como predecir situaciones futuras. Un único examen de una zona de alteración puede informar sobre su estado en un momento concreto pero no informa sobre la tasa de alteración, que precisa de inspecciones durante un intervalo de tiempo. En estos casos, el análisis de fotografías realizadas a lo largo de un periodo de tiempo constituye una eficaz herramienta de trabajo y permite identificar cambios que escaparían a un simple análisis visual. Esta metodología, conocida como fotomonitorización, fue empleada por Thornbush y Viles (2008), quienes obtuvieron información cualitativa y cuantitativa relacionada con la progresión de la suciedad y el deterioro de la fachada de edificios 68 en el centro de Oxford (Inglaterra). Doehne y Pinchin (2008) emplearon el análisis de imágenes digitales para determinar daños sincrónicos en la superficie de piedra del Monasterio de Howden (Reino Unido) y correlacionarlos con condiciones ambientales inusuales, tales como fuertes vientos y Rogerio-Candelera et al. (2008) monitorizaron el crecimiento microbiano en una tumba de la Necrópolis de Carmona (España). A pesar de que el análisis de fotografías puede aportar valiosa información para los trabajos de conservación de los sustratos, es importante no sobrevalorar su objetividad (Doehne y Price, 2010). En este sentido, Winkler (1985) ofreció un gráfico alarmante de deterioro basado únicamente en el análisis de dos imágenes. Por tanto, aunque esta técnica permite obtener información útil relativa al biodeterioro de una superficie, a la hora de establecer la precisión de los resultados obtenidos hay que tener en cuenta posibles alteraciones debidas a otros factores, como las variaciones ambientales (Thornbush y Viles, 2008). En relación con los factores ambientales, es interesante conocer cuáles intervienen en el desarrollo de los biofilms que producen biodeterioro y en qué medida lo hacen. En el medio subterráneo, la disponibilidad de luz es el factor que determina si los microorganismos que colonizan las paredes y los espeleotemas serán mayoritariamente autótrofos (cianobacterias y algas) o heterótrofos (bacterias y hongos) (Albertano, 2012). Por otro lado, la disponibilidad de agua es indispensable para el desarrollo de biofilms fotosintéticos (Gladis y Schumann, 2011). No obstante, aun se desconoce por qué, en ocasiones, no se desarrolla este tipo de biofilms aun cuando se presentan las condiciones ambientales favorables. La información sobre la relación entre el desarrollo de estos biofilms y las condiciones ambientales podría permitir comprender aspectos como el planteado anteriormente. En este sentido, Cuzman (2014) investigó la relación entre la evolución del microclima y el desarrollo de biofilms fotosintéticos en catacumbas con luz natural, a lo largo de un año. En cuevas no turísticas la presencia de biofilms fotosintéticos muestra un gradiente que disminuye desde las zonas más externas hacia las más internas, acorde con la disminución de la luz natural que caracteriza a este tipo de cuevas (Roldán et al., 2004a). En las cuevas turísticas, el desarrollo de biofilms fotosintéticos es independiente de su proximidad al medio exterior, pues su presencia se debe a las lámparas de luz eléctrica que emiten luz con intensidad constante durante el periodo en el que se encuentran activas. El desarrollo de este tipo de biofilm puede 69 producir el deterioro de los espeleotemas o, en su caso, de las pinturas rupestres, si las hubiera. Conocer la influencia del microclima de la cueva, así como de otros factores ambientales, en la evolución de estos biofilms resulta una eficaz herramienta para el diseño de estrategias de control que limiten o prevengan su desarrollo. En la Cueva de Nerja, el clima exterior influye directamente en los registros y fluctuaciones del microclima interior. Según la clasificación climática de Köppen (Köppen, 1936) el clima en el entorno de la Cueva de Nerja corresponde a un clima templado húmedo con veranos secos y calurosos, también denominado clima mediterráneo. En el exterior de la cueva, una completa estación meteorológica ha registrado datos ambientales desde principios de la década de los 90. El análisis de series de datos correspondientes a más de 10 años ha permitido determinar los principales parámetros climáticos en el entorno de la cavidad. Así, en exterior de la cueva, la temperatura media del aire oscila entre 13,2 ºC (enero) y 25,9 ºC (agosto), con un valor medio de 18,8 ºC y la precipitación media del área es de 487 mm/año, con una marcada estación húmeda durante el otoño y el invierno (Liñán et al., 2007). En una escala de tiempo anual, en el interior de la cueva las variaciones de temperatura del aire son un reflejo de las variaciones de temperatura del aire exterior, más o menos amortiguadas y desfasadas en el tiempo, en función de la distancia a la superficie y a las entradas de la cueva. En relación con las variaciones de humedad relativa del aire de las Galerías Turísticas, éstas también reflejan las variaciones de la humedad del aire exterior durante el período invernal y muestran una clara influencia de las Galerías Altas y Nuevas durante los meses estivales. Así, la humedad relativa del aire es máxima en el sector turístico durante el verano debido a un aumento del caudal de goteo, a una disminución del grado de ventilación natural de la cueva (menor evaporación del aire) y a la llegada de aire desde las zonas más húmedas de la cueva, las Galerías Altas y Nuevas (Liñán y del Rosal, 2014). Finalmente, la concentración de dióxido de carbono del aire muestra una curva normal con máximos en el verano y mínimos en el invierno, directamente relacionada con la afluencia de visitantes. A escala diaria, los tres parámetros citados muestran incrementos y descensos relacionados con el horario de visita de la cueva. Así, se producen incrementos de la temperatura del aire (entre 0,2-0,6 ºC) en las diferentes salas de las Galerías Turísticas debido al aporte de 70 calor por los focos de iluminación y por los visitantes (Carrasco et al., 1999, 2002). Los descensos que se observan diariamente se deben al cierre de la cueva y apagado de la iluminación durante el mediodía y al finalizar el horario de visita. La temperatura de la roca permanece entre 1 y 2 ºC por debajo de la temperatura del aire de la cueva y también presenta modificaciones diarias, aunque con menor amplitud que en el aire, con incrementos diarios entre 0,02 y 0,15 ºC (Carrasco et al., 1999, 2002). La entrada de visitantes también genera pequeños incrementos en la humedad relativa del aire, del orden del 2 al 3 % y de la concentración de CO2 que, puntualmente en verano, puede superar la concentración de 2000 ppm (Carrasco et al., 1999, 2002). Las variaciones observadas en los biofilms fotosintéticos de la Cueva de Nerja y las fluctuaciones determinadas en el microclima sugieren, por un lado, un crecimiento positivo del biofilm y, por otro, la relación de este crecimiento con el microclima de la cavidad. 5.2. Objetivos Evaluar, desde un punto de vista cuantitativo, el crecimiento de varios biofilms durante un periodo de tiempo y determinar su relación con el microclima de la cueva así como con otros factores ambientales que pudieran condicionar su desarrollo. Evaluar la colonización primaria de espeleotemas por organismos fotosintéticos. 5.3. Material y Métodos 5.3.1. Selección de las zonas de control Los biofilms controlados en este estudio se localizan en las zonas descritas en el apartado 4.4. Descripción de las zonas de control de la presente memoria. Todas las zonas descritas en este apartado forman parte de este estudio a excepción de la zona Ne.4 (Torca) que se desarrolla debido a luz natural que accede a la cueva por una de las torcas de la sala donde se ubica. Del 71 total de las zonas controladas, 11 presentaban desarrollo de biofilms fotosintéticos (Ne.1, Ne.2, Ne.3, Ne.7, Ne.8, Ne.9, Ne.10, 11 y Ne.12) y 4 se encontraban libres de colonización (Ne.5, Ne.6, Ne.13 y Ne.14) y formaron parte del ensayo de iluminación y colonización primaria de espeleotemas por microorganismos fotosintéticos. 5.3.2. Iluminación de las zonas de experimentación Las zonas de esperimentación se encontraban libres de biofilms fotosintéticos y fueron somentidas a diferentes tipos de iluminación. La zona Ne.5 fue iluminada mediante 3 lámparas leds que emitían luz de color verde (5 W/lámpara, OSRAM). La separación entre las lámparas y la zona a iluminar fue de 0,5 m. La zona Ne.6 fue iluminada con 1 lámpara fluorescente de ahorro energético que emitió luz de color verde (18 W, OSRAM) separada unos 0,9 m de la superficie iluminada. La zona Ne.14 fue iluminada mediante 1 lámpara fluorescente de ahorro energético que ofrecía luz blanca con temperatura de color blanco frío (18 W, OSRAM) separada 1 m de la superficie iluminada. La zona Ne.13 fue iluminada mediante 3 lámparas leds que emitieron luz blanca con temperatura de color blanco frío (5 W/lámpara, OSRAM) separada unos 0,8 m de la superficie iluminada. La selección de la iluminación se basó en la iluminación actual de la cueva y en los resultados obtenidos por Roldán et al. (2006). La distancia de separación entre las lámparas y el sustrato estuvo condicionada por las geomorfología de la zona de trabajo. 5.3.3. Realización de fotografías En cada uno de los puntos de control se tomaron fotografías, con una periodicidad aproximadamente quincenal, durante el periodo comprendido entre los meses de abril de 2011 y febrero de 2013, ambos inclusive. Las zonas Ne.13 y Ne.14 fueron incorporadas al estudio 11 meses más tarde que el resto de las zonas. Las imágenes, de 3072 x 2304 píxeles, se obtuvieron con una cámara digital FUJIFILM modelo FinePix S5700, de 7,1 megapíxels, equipada con zoom óptico de 10x y zoom digital 72 aproximado de 4,8x. La cámara se dispuso en modo “automatico”, que la obliga a realizar los ajustes considerados óptimos en el momento de hacer la foto. Dado que, por lo angosto del terreno, se descartó el empleo de trípode durante la realización de fotografías, se procuró que todas las imágenes de una misma zona de control fueran realizadas a la misma distancia y con la misma perspectiva. En total se obtuvieron 13 series de imágenes, con una media de 65 imágenes por cada serie a excepción de las series correspondientes a las zonas Ne.13 y Ne.14 que quedaron formadas por 39 imágenes debido a que su fotomonitorización se inició más tarde. 5.3.4. Procesado digital de imágenes. Cálculo de la variable verde Para poder comparar la evolución de biofilms próximos, en cada zona de control se delimitaron dos superficies que fueron identificadas con los subíndices 1 y 2 (a excepción de las zonas Ne.10 y Ne.5 donde sólo se delimitó una). Cada una de estas superficies delimitadas se relacionó con la presencia de un biofilm. Para acotar cada biofilm se emplearon, como puntos de referencia, manchas o deformidades del sustrato, por su carácter inalterable frente a rotaciones, traslaciones, etc. El marcado de cada uno de estos puntos de referencia y, por tanto, la delimitación de los biofilms, se realizó manualmente en cada una de las fotografías. Antes de proceder al recorte de cada una de las zonas, algunas imágenes fueron rotadas para ajustar la calidad del recorte. Así, en cada serie se realizaron hasta dos rotaciones diferentes, para cada una de las dos zonas delimitadas (Fig. 5.1). Se obtuvieron 25 zonas para su análisis digital (Figs. 5.2 a-m). Figura 5.1. Resultado de la rotación y recorte de las zonas Ne.1.1 y Ne.1.2 (dcha. e izda. respectivamente) obtenidas en el punto de control Ne.1. 73 Figura 5.2a. Zona de control Ne.1, con la delimitación de los dos biofilms monitorizados (1: azul y 2: rojo). Figura 5.2b. Zona de control Ne.2, con la delimitación de los dos biofilms monitorizados (1: azul y 2: rojo). 80 DIRECTORIO RANG H RANG S RANG V Ne.1 40-120 0-1 0.15-0.85 Ne.2 40-120 0-1 0.15-0.85 Ne.3 50-120 0-1 0.25-0.75 Ne.5 60-120 0-1 0.25-0.75 Ne.6 60-120 0-1 0.25-0.75 Ne.7 40-160 0-1 0.10-0.75 Ne.9 40-120 0-1 0.15-0.75 Ne.10 40-180 0-1 0.10-0.75 Ne.11 40-120 0-1 0-15-0-85 Ne.12(1) 50-120 0-1 0.15-0.75 Ne.12(2) 70-120 0-1 0.15-0.75 Ne.13 60-120 0-1 0.25-0.75 Ne.14 60-120 0-1 0.25-0.75 Tabla 5.1. Rangos empleados en las series de imágenes de cada una de las zonas de control. Los mismos rangos se aplicaron a todas las imágenes de una misma serie (zona), a excepción de la serie correspondiente al punto de control Ne.12, que precisó de rangos diferentes en cada una de las dos zonas seleccionadas. Los rangos seleccionados pudieron variar entre las series para evitar errores derivados del color de la roca, la presencia de sombras u otras incidencias que se consideraron de interés. Posteriormente se determinó el número de pixeles que se encontraban dentro de los rangos definidos para el color verde (Fig. 5.3). El numero de píxeles verdes es independiente del ángulo de rotación sobre el eje x-y de la imagen pero no del tamaño. Para evitar este error, se normalizan los resultados obteniendo el número de píxeles totales de la superficie analizada basado en la proporción de verde en la imagen, que es independiente del tamaño de ésta. Con este cálculo se obtuvo el tamaño de cada uno de los biofilms en cada imagen, identificado como variable verde y empleado en el análisis estadístico. 81 Figura 5.3. Cuantificación de los pixeles que se encuentran dentro de los rangos establecidos. Los parámetros que pueden afectar al resultado obtenido en cada caso derivan de diferencias en la posición de la cámara, del recorte manual de cada imagen y del empleo de una escala manual. Para calcular el error cometido debido a los factores citados anteriormente, se analizó 10 veces la misma imagen y se determinó un coeficiente de variación de resultados inferior a 1%. Por tanto, aquellas variaciones de verde inferiores a este porcentaje se consideraron dentro del margen de error aceptado durante el cálculo estadístico. 5.3.5. Monitorización de los parámetros ambientales El control del microclima interior de la cueva se llevó a cabo durante el periodo comprendido entre el 6 de enero de 2012 y el 18 de febrero de 2013. Para ello se instalaron tres sensores en diferentes ubicaciones de las Galerías Turísticas: uno próximo a la entrada (Belén), otro en la zona intermedia (Cascada) y un tercero en la zona más profunda (Cataclismo). Estos sensores (datalogger VAISALA MI70) provistos con sondas HMP1554, registraron datos horarios de temperatura (T), humedad relativa (RH) y concentración de dióxido de carbono (CO2) del aire. 82 Figura 5.4. Arriba: planta de las Galerías Turísticas con la ubicación de las zonas controladas y de los sensores. Debajo: asignación de los datos registrados por los sensores a cada una de las zonas y distancia que los separa. A cada una de las zonas controladas se le asignaron los datos obtenidos por el sensor más próximo. La figura 5.4 muestra la ubicación de las zonas de control y de los sensores, así como la distancia entre cada una de las zonas y el sensor más próximo, que recibió el nombre de la sala en la que se ubicó. Mediante un sensor quantum (Modelo LI-188B), se determinó la intensidad luminosa recibida por cada uno de los biofilms y en las zonas de experimentación objeto de estudio. Para estimar la cantidad de luz recibida se ubicó el sensor en el área central de la zona de control y se realizaron dos medidas, una con el sensor paralelo a la superficie y otra con el sensor dirigido hacia la fuente de luz. Las lecturas se realizaron cuando el sensor mostró un valor estable durante, al menos, 10 segundos. El resultado informó sobre la radiación fotosintética activa o PAR (energía luminosa comprendida entre 400 nm y 700 nm) y ofreció datos en unidades de Sensor Zona Ne.1 Ne.2 Ne.3 Ne.5 Ne.6 Ne.7 Ne.12 Ne.8 Ne.9 Ne.10 Ne.11 Ne.1 3 Ne.14 Distancia (m) 7 8 25 3 3 32 43 27 10 23 22 5 5 Sala del Cataclismo Sala de la Cascada Sala del Belén 83 micromol de fotones por metro cuadrado por segundo (µmol.m-2.s-1). Este parámetro no se midió en continuo debido a que su valor se estima constante, salvo cambios notables en el sistema de iluminación, que fueron evitados durante el transcurso del presente estudio. No obstante, dado que la radiación fotosintética activa puede variar en función de la casa comercial que suministre la lámpara, entre otros factores, se realizaron varias medidas a lo largo del periodo de estudio en cada una de las zonas de control que permitieron calcular la radiación fotosintética activa media en cada zona. 5.3.6. Análisis estadístico El análisis estadístico de los datos obtenidos mediante el análisis de imágenes y la monitorización ambiental se llevó a cabo con los softwares Excel y SPSS.20. El estudio descriptivo de las variables consideradas permitió conocer su evolución a lo largo del periodo de estudio. Mediante el programa R Core Team (2013) se elaboraron diagramas de cajas que mostraron la evolución de las variables verde, T, RH, y CO2 durante el periodo de estudio. Este gráfico aportó información relacionada con la variabilidad de los resultados, los rangos intercuartílicos, los valores extremos y los valores atípicos (ubicados entre 1,5 y 3 veces el rango intercuartílico a partir de las aristas del rectángulo) dentro de cada mes de estudio. Para determinar relación del tamaño del biofilm con los factores ambientales monitorizados se realizó un análisis de regresión, que consideró a las variables ambientales explicativas (T, RH y CO2) y al tamaño del biofilm (verde) variable explicada. Para homogeneizar las escalas de medida de las variables y evitar errores producidos por diferencias entre el peso específico por unidad de las variables en el análisis de regresión se empleó el valor estandarizado que identificó a las variables con el subíndice z. Los datos de las variables ambientales correspondieron a la media de los registros horarios obtenidos el mismo día en el que se tomó la imagen, pero también se empleó el valor medio de estos datos y los registros horarios obtenidos 0, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 días antes de tomar la foto, respectivamente. Así, se identificaron las variables ambientales con los subíndices z.0, z.1, z.2, z.3, z.4, z.5 y z.6. 84 El resultado del análisis de regresión ofreció modelos que seleccionaron las variables ambientales relacionadas con el tamaño del biofilm y descartaron aquellas que no aportaron información. Para la interpretación de los resultados se evaluaron los coeficientes (B) de los modelos propuestos, el error asociado a cada uno de ellos (error típ.) y, en su caso, el grado de correlación de estas variables con la variable explicada (tamaño del biofilm). El valor del Factor de Inflación de la Varianza (FIV) y la representación gráfica de las variables ambientales permitió evaluar la colinealidad de las mismas. Para cada uno de los modelos de regresión se obtuvo un coeficiente de correlación múltiple (R) y un coeficiente de determinación (R2), que informaron sobre proporción de variabilidad de la variable dependiente (verde) que podía ser explicada por el conjunto de variables independientes. No obstante, R2 presenta el inconveniente de que, a medida que aumenta el número de variables que participan en el modelo, mayor es su valor, por tanto, en la interpretación de los datos se empleó el coeficiente de determinación corregido (R2 corregido), que modificó el valor de R2 en función del número de observaciones y de variables que participan en la ecuación. Los resultados de la radiación fotosintética activa (PAR) se emplearon en la interpretación de los resultados pero no formaron parte del análisis estadístico dado que su valor se supone constante. Mediante un análisis de varianza de Student para muestras relacionadas se determinaron diferencias estadísticamente significativas entre el tamaño del biofilm durante el verano y el invierno de un mismo año, así como durante los inviernos de años sucesivos (para un nivel de significación de p = 0,05). 85 5.4. Resultados 5.4.1. Parámetros ambientales En la tabla 5.2 se presentan los coeficientes del análisis descriptivo de las variables ambientales que fueron monitorizadas en el interior de la cueva, obtenidos a partir de registros horarios. variable Sala N Mínimo Máximo Media Desv. CV Temperatura (ºC) Belén 340 11,83 19,29 16,73 1,83 11 Cascada 284 17,47 19,67 18,60 0,50 3 Cataclismo 336 17,59 19,47 18,48 0,68 4 Humedad relativa (%) Belén 341 37,57 100 83,11 16,60 20 Cascada 293 53,01 100 92,36 13,70 15 Cataclismo 304 70,3 98,61 90,48 6,78 7 Dióxido de Carbono (ppm) Belén 322 454 1260 667 202 30 Cascada 260 447 1320 649 177 27 Cataclismo 335 408 1337 732 223 30 Tabla 5.2. Datos descriptivos para las variables ambientales Temperatura, Humedad Relativa y concentración de dióxido de carbono en el aire obtenidos a partir de registros horarios durante el periodo de estudio. 5.4.1.1. Temperatura del aire La temperatura del aire de las Galerías Turísticas de la cueva osciló entre un valor mínimo de 11,83 ºC y máximo de 19,67 ºC, registrados en la sala del Belén y de la Cascada, respectivamente. La evolución de la temperatura del aire de la cueva durante el periodo de estudio dibujó una curva con valores máximos durante el verano y mínimos durante el invierno, 86 semejante a la evolución de la temperatura del aire exterior (Liñán et al., 2007). Por salas, se observó un gradiente que aumentaba hacia las zonas más profundas, con un valor medio anual similar en las dos salas más profundas. La Sala del Belén fue la que mostró mayor oscilación de los registros de temperatura, con un coeficiente de variación del 11 % y valores comprendidos entre 11,83 y 19,29 ºC con un valor medio de 16,73 ºC. A escala anual, los registros máximos se observaron durante el verano y un descenso durante el otoño que culminó en los valores más bajos durante el invierno. En la Sala de la Cascada, en la zona intermedia de las Galerías Turísticas, la evolución de esta variable fue similar a la observada en la Sala del Belén, pero con menor oscilación. En esta sala la temperatura del aire osciló entre 17,47 y 19,67 ºC, con un valor medio de 18,60 ºC y un coeficiente de variación del 3 %. Los registros más altos correspondieron al verano, durante el otoño la temperatura descendió y se alcanzaron los registros más bajos durante el invierno. En la Sala del Cataclismo la temperatura del aire osciló entre 17,59 y 19,47 ºC con un valor medio de 18,48 ºC. El coeficiente de variación para esta sala fue del 3 %. A escala anual, los registros más elevados se obtuvieron durante el verano y el otoño. A partir de noviembre, la temperatura comenzó a disminuir hasta alcanzar los valores más bajos en el invierno. Los registros observados durante las primeras semanas del otoño podrían ser debidos a la llegada a esta sala de aire más cálido procedente de las Galerías Altas y Nuevas de la cueva, en función del modelo de circulación de las corrientes de aire descrito para la cavidad (Liñán y del Rosal, 2014). 5.4.1.2. Humedad relativa del aire Durante el periodo de estudio la humedad relativa del aire de las Galerías Turísticas de la cueva estuvo comprendida entre el valor mínimo de 37,57 %, registrado en la sala del Belén y un valor máximo de 100 %, registrado en las salas del Belén y de la Cascada. En las tres salas monitorizadas, la humedad relativa más alta del aire se observó durante el verano y las primeras semanas del otoño y la más baja durante el invierno. Este incremento de humedad relativa al 87 inicio de la época estival podría estar relacionado con un aumento del caudal de goteo (Carrasco et al., 2002; Liñán et al., 2008) y con la llegada a la zona turística, desde la zona más interna de la cavidad, de masas de aire más húmedo (Liñán y del Rosal, 2014). En relación con el valor medio de humedad relativa durante el periodo de estudio, se observó un gradiente que aumenta desde la zona más externa hacia la más profunda, si bien en esta zona se distorsiona levemente. La interpretación de los resultados de este parámetro debe tener en cuenta el registro de posibles datos erróneos de saturación ambiental (100 %) en las Salas del Belén y de la Cascada, motivados por la condensación de agua en la sonda de medida del sensor. En la Sala del Belén, el valor medio de humedad relativa durante el periodo de estudio fue de 83,11 %, con valor mínimo y máximo de 37,57 y 100 %, respectivamente y coeficiente de variación del 20 %. A escala anual, los datos más elevados de humedad relativa se observaron durante el verano, con valores de saturación durante los meses de junio, julio, agosto y septiembre. Esta sala mostró numerosos episodios de incremento y descenso de humedad relativa, que podrían estar relacionados con periodos de lluvia en el exterior, dado que el pequeño espesor del techo de esta sala permite la filtración rápida de agua de origen meteórico. Por otro lado, estos episodios también podrían estar relacionados con la llegada de agua de riego del entorno de la cavidad (Carrasco et al., 1996) o con fallos en el funcionamiento de los depósitos de agua del exterior que dan lugar a la filtración de agua a la cueva. En la sala de la Cascada la humedad relativa estuvo comprendida entre el 53,01 y el 100 %, con un valor medio de 92,36 % y un coeficiente de variación del 15 %, durante el periodo de estudio. La evolución de este parámetro en la sala mostró tres periodos de saturación ambiental, registrados durante la primavera, el verano y el invierno, respectivamente. Durante la primavera y el invierno, el periodo de saturación ambiental fue más corto que el registrado durante el verano. Por otro lado, los episodios de saturación ambiental observados durante la primavera y el invierno no coinciden con el patrón histórico de humedad relativa en esta sala y podrían ser debidos a la presencia de agua de condensación en la sonda del sensor. La sala del Cataclismo fue la que mostró menor variación de humedad relativa, con registros comprendidos entre el 70,30 y el 98,61 %, un valor medio 90,48 % y un coeficiente de variación del 7 %.. Durante el periodo de estudio, la humedad relativa de la sala dibujó una curva 88 con registros de humedad más bajos durante el invierno, incrementos durante la primavera y valores máximos durante el verano y principio del otoño. Posteriormente, se observó un descenso progresivo hasta alcanzar, de nuevo, valores más bajos durante el invierno. En esta sala no se registraron datos de saturación ambiental aunque sí muy próximos. La ausencia de condensación en la sonda del sensor evitó que en este sensor se registraran datos erróneos como los observados (probablemente) en las salas del Belén y de la Cascada. 5.4.1.3. Concentración de dióxido de carbono en el aire La concentración de dióxido de carbono en las Galerías Turísticas de la cueva está directamente relacionada con las visitas y la tasa de ventilación (Cañete, 1997). Habitualmente, este parámetro alcanza los registros más elevados durante los meses de mayor visitabilidad y menor ventilación natural, que corresponden a julio y agosto (Carrasco et al., 2002; Liñán et al., 2008). Durante el periodo de estudio la concentración de dióxido de carbono de la cueva estuvo comprendida entre 408 y 1337 ppm, ambos registros obtenidos en la sala del Cataclismo. En todas las salas las mayores concentraciones se obtuvieron durante el verano y las más bajas durante el invierno. Igualmente, en todos los casos se registró un pico de dióxido de carbono durante el mes de octubre que podría estar relacionado con cambios de la ventilación natural o la celebración de algún evento “extraordinario” en la cueva que hubiera motivado la presencia de público durante la noche. En la sala del Belén, la concentración de dióxido de carbono del aire estuvo comprendida entre 454 y 1260 ppm, con un valor medio de 667 ppm y un coeficiente de variación de 30 %. Este parámetro mostró las concentraciones más bajas durante el invierno y las más elevadas durante el verano, con máximos en agosto y mínimos en invierno, durante diciembre y enero. En la sala de la Cascada, la concentración de dióxido de carbono estuvo comprendida entre 447 y 1320 ppm, con un valor medio de 649 ppm y un coeficiente de variación de 27 %. En esta sala los registros más elevados se obtuvieron durante el verano y los más bajos durante el invierno. 89 En la sala del Cataclismo la concentración media de dióxido de carbono durante el periodo de estudio fue de 732 ppm y los registros máximo y mínimo fueron 1337 y 408 ppm, respectivamente. El coeficiente de variación de este parámetro fue de 30 %. La evolución de este parámetro, al igual que sucedió en las otras salas, mostró los registros más elevados durante el verano y los más bajos durante el invierno. A partir de septiembre, la concentración de dióxido de carbono en la sala comienza a disminuir hasta alcanzar los registros más bajos durante el invierno. 5.4.1.4. Radiación fotosintética activa (PAR) Todos los biofilms que forman parte de este estudio se encuentran iluminados artificialmente por lámparas de luz eléctrica. No obstante, tal y como se ha indicado anteriormente, todas las lámparas no son iguales y, en aquellos casos en que sí lo son, no se ubican a la misma distancia del sustrato. Para medir la radiación fotosintética activa media (PAR) a la que estuvo sometida cada una de las zonas de control durante el periodo de estudio se llevaron a cabo tres campañas de medida: al principio, a mitad y al final de dicho periodo. El motivo por el cual se realizaron tres campañas cuando, en teoría, la iluminación debía ser constante, fue debido a que, aunque las bombillas fundidas son reemplazadas por otras de características semejantes, con frecuencia las nuevas no proceden de la misma casa comercial que la retirada, por lo que suelen mostrar pequeñas diferencias entre ellas. Por otra parte, al envejecer, el filamento de la bombilla pierde grosor y presenta mayor resistencia al paso de la corriente, lo que incrementa la radiación de las longitudes de onda corta y aumenta su eficacia. Los resultados de radiación fotosintética activa obtenidos se muestran en la tabla 5.3. Los resultados mostraron que los biofilms de las zonas Ne.10 (iluminación vial) y Ne.12 (iluminación escénica) presentaban una radiación notablemente superior al resto de zonas colonizadas, con resultados del orden de 9 µmol.m-2.s-1. Por otro lado, los biofilms menos iluminados, con PAR inferior a 4 µmol.m-2.s-1, fueron Ne.1, Ne. 2, Ne.3, Ne.9 y Ne.11, todos ellos iluminados mediante lámparas fluorescentes de ahorro energético forman parte de la iluminación escénica. 96 Figura 5.9. Gráficos de evolución de las variables verde, T, CO2 y RH correspondientes al biofilm Ne.3(1). 97 Figura 5.10. Gráficos de evolución de las variables verde, T, CO2 y RH correspondientes al biofilm Ne.3(2). 98 Figura 5.11. Gráficos de evolución de las variables verde, T, CO2 y RH correspondientes al biofilm Ne.7(1). 99 Figura 5.12. Gráficos de evolución de las variables verde, T, CO2 y RH correspondientes al biofilm Ne.7(2). 100 Figura 5.13. Gráficos de evolución de las variables verde, T, CO2 y RH correspondientes al biofilm Ne.8(1). 101 Figura 5.14. Gráficos de evolución de las variables verde, T, CO2 y RH correspondientes al biofilm Ne.8(2). 102 Figura 5.15. Gráficos de evolución de las variables verde, T, CO2 y RH correspondientes al biofilm Ne.9(1). 103 Figura 5.16. Gráficos de evolución de las variables verde, T, CO2 y RH correspondientes al biofilm Ne.9(2). 104 Figura 5.17. Gráficos de evolución de las variables verde, Temp, CO2 y RH correspondientes al biofilm Ne.10(1). 105 Figura 5.18. Gráficos de evolución de las variables verde, T, CO2 y RH correspondientes al biofilm Ne.11(1). 112 días antes de tomar la fotografía. La variable más correlacionada con el tamaño del biofilm fue la humedad relativa del aire. El biofilm Ne.7(1) presentó un coeficiente de variación del 8 %. Su evolución fue distinta a la observada en el resto de biofilms analizados. Comenzó con un pequeño descenso del tamaño al inicio del primer invierno (mínimo diciembre 2011) y un tamaño, aproximadamente constante después, que se mantuvo durante la primavera hasta alcanzar el verano, cuando comenzó un incremento que perduró hasta el otoño y se mantuvo durante el invierno (máximo enero 2013). En suma, este biofilm mostró un crecimiento casi constante a lo largo del estudio, con un tamaño más pequeño al principio y mayor al final. No se observaron meses con elevada variabilidad y tan sólo se determinó un resultado atípico durante mayo de 2012 (Fig. 5.11). Como era de esperar, se determinaron diferencias estadísticamente significativas entre el tamaño del biofilm durante el invierno y el verano de 2012 (p: 1,3E-06) y también durante el invierno de 2012 y de 2013 (p: 2,9E-5). El incremento de tamaño anual fue del 9 %. Los modelos ofrecidos presentaron un porcentaje de variabilidad explicada comprendida entre 27,6 y 46,9 %. El mayor poder explicativo correspondió al modelo que empleó registros ambientales desde 6 días antes de tomar la fotografía. Los factores ambientales más correlacionados con el tamaño del biofilm fueron la humedad relativa y la concentración de dióxido de carbono del aire (esta ultima de forma inversa). El biofilm Ne.7(2) presentó un coeficiente de variación para el tamaño del 3 %. Al igual que el biofilm Ne.7.1, durante el primer invierno mostró una disminución del tamaño (mínimo febrero 2012), que continuó con un leve incremento durante la primavera, más acentuado durante el verano, el otoño y el invierno, momento en el que el biofilm mostró el mayor tamaño (máximo enero 2013). No se observaron meses con elevada variabilidad de resultados y los registros atípicos se registraron en el mes de mayo (Fig. 5.12). Se determinaron diferencias estadísticamente significativas entre el tamaño del biofilm durante el invierno y el verano de 2012 (p: 0,0015) así como entre el invierno de 2012 y de 2013 (p: 7,7E-05). El incremento anual del tamaño fue del 6 %. Los modelos ofrecidos por el análisis de regresión mostraron un porcentaje de variabilidad explicada comprendida entre 25,7 y 38,2 %. El mayor poder explicativo correspondió al modelo que empleó registros ambiéntales desde 6 días antes de tomar 113 la fotografía. La variable más correlacionada con el tamaño del biofilm fue la humedad relativa del aire. El biofilm Ne.8(1) mostró un coeficiente de variación del tamaño del 4 %. Su evolución comenzó con una disminución durante el primer invierno, seguida de un aumento durante la primavera hasta alcanzar los registros más elevados, que perduraron durante el verano y el otoño. Al final del otoño, el tamaño comenzó a disminuir hasta alcanzar los registros más bajos durante el invierno siguiente (mínimo febrero 2013). A escala mensual, los meses que registraron los tamaños mayores también mostraron la mayor variabilidad. No obstante, el dato atípico se observó en febrero de 2012, que no destacó por su elevada variabilidad (Fig. 5.13). Se determinaron diferencias estadísticamente significativas en el tamaño del biofilm durante el invierno y el verano de 2012 (p: 0,0079). En cambio, estas diferencias no se determinaron entre los tamaños de los inviernos de 2012 y de 2013 (p: 0,1363) Los modelos de regresión ofrecidos mostraron un porcentaje de variabilidad explicada muy pequeña, comprendida entre 17,7 y 33,6 % correspondiendo el mayor poder explicativo al modelo que empleó registros ambiéntales desde 4 días antes de tomar la fotografía. La variable más correlacionada con el tamaño del biofilm fue la temperatura del aire. El biofilm de la zona Ne.8(2) presentó un coeficiente de variación del tamaño del 11 %. Su evolución comenzó con un descenso durante el invierno (mínimo febrero 2012), seguido de un incremento progresivo durante la primavera hasta alcanzar los tamaños más elevados durante el verano y el otoño y un nuevo descenso en el invierno. Abril y mayo fueron los meses con mayor variabilidad de tamaño y en marzo de 2012 y enero de 2013 se obtuvieron resultados atípicos (Fig. 5.14). Se determinaron diferencias estadísticamente significativas entre el tamaño del biofilm durante el invierno y durante el verano de 2012 (p: 2,3E-07) así como entre el tamaño durante el invierno de 2012 y de 2013 (p: 0,0051), asociadas a un incremento del tamaño del 4 %. El análisis de regresión ofreció modelos con un porcentaje de variabilidad explicada comprendida entre 67,0 y 77,2 %, correspondiendo el mayor poder explicativo al modelo que empleó registros ambientales desde 2 días antes de tomar la fotografía. La variable ambiental más correlacionada con el tamaño del biofilm fue la temperatura del aire. 114 El biofilm de la zona Ne.9(1) presentó un coeficiente de variación del 17 %. A diferencia de la evolución de los biofilms descritos hasta el momento, el biofilm comenzó a aumentar el tamaño desde el primer invierno (mínimo febrero 2012) y durante la primavera hasta alcanzar los registros más elevados en verano y otoño, con un tamaño casi constante (máximo octubre 2012). Al inicio del segundo invierno se observó un descenso que continuó durante varios meses hasta finalizar el periodo de estudio. Los meses con mayor variabilidad fueron marzo y mayo y durante febrero de 2012 y abril se observaron valores atípicos (Fig. 5.15). Se determinaron diferencias estadísticamente significativas entre el tamaño del biofilm en invierno y en verano de 2012 (p: 4E-06) y también entre el tamaño durante el invierno de 2012 y de 2013 (p: 0,0043) relacionadas con un incremento del tamaño del 11 %. Los modelos propuestos para el tamaño del biofilm y su relación con las variables ambientales ofrecieron un porcentaje de variabilidad explicada comprendida entre 55,1 y 66,4. El mayor poder explicativo correspondió al modelo que empleó registros ambientales obtenidos el mismo día en el que se tomó la foto. La variable ambiental con mayor correlación con el tamaño del biofilm fue la temperatura del aire. El biofilm Ne.9(2) mostró un coeficiente de variación del 29 %. Su evolución comenzó con un pequeño descenso, durante el primer invierno (mínimo febrero 2012), seguido de aumento durante la primavera hasta llegar al otoño, cuando mostró el mayor tamaño (máximo octubre 2012). A partir de otoño comenzó un nuevo descenso que perduró hasta el invierno, sin llegar a alcanzar el tamaño inicial. El mes con mayor variabilidad de resultados fue mayo y abril y octubre se observaron resultados atípicos (Fig. 5.16). Se determinaron diferencias estadísticamente significativas entre el tamaño del biofilm en invierno y verano de 2012 (p: 1,7E-07) así como entre el tamaño registrado en el invierno de 2012 y de 2013 (p: 0,0177) relacionadas con un aumento de la superficie del biofilm del 10 %. El análisis de regresión ofreció modelos con un porcentaje de variabilidad explicada comprendida entre 62,1 y 68,8 %, correspondiendo el mayor poder explicativo al modelo que empleó registros ambientales obtenidos el día en el que se tomó la foto. Al igual que se observó en Ne 9(1), la variable ambiental más correlacionada con el tamaño del biofilm fue la temperatura del aire. En la zona Ne.10(1) el tamaño del biofilm presentó un coeficiente de variación del 2 %. Su evolución mostró una dinámica totalmente diferente a las observadas hasta el momento. Así, el tamaño del biofilm permaneció casi constante, con una leve disminución durante el invierno y 115 la primavera, hasta alcanzar el registro más bajo (mínimo junio). Durante el verano y el otoño, el tamaño aumentó progresivamente hasta alcanzar el tamaño mayor durante el segundo invierno, cuando permanece casi constante. Se observaron numerosos meses con notable variabilidad de registros, a destacar, febrero, marzo, abril y diciembre de 2012. Los meses que registraron valores atípicos fueron agosto 2012 y enero 2013 (Fig. 5.17). Se determinaron diferencias estadísticamente significativas entre el tamaño del biofilm durante el invierno y el verano de 2012 (p: 0,0041) pero no se observaron estas diferencias entre el tamaño del biofilm durante el inverno de 2012 y de 2013 (p: 0,1873). El análisis de regresión ofreció modelos con un porcentaje de variabilidad explicada comprendida entre 40,2 y 61,0 % correspondiendo el mayor poder explicativo al modelo que empleó registros ambiéntales obtenidos de hasta 5 días previos a la realización de la fotografía. Las tres variables ambientales mostraron asociación significativa con el tamaño del biofilm en grado semejante. La humedad relativa ambiental fue la variable que mostró mayor correlación con el tamaño del biofilm, pero con relación inversa. El biofilm Ne.11(1) mostró un coeficiente de variación del tamaño del 8 %. Su evolución comenzó con un descenso durante el primer invierno hasta la primavera, cuando se alcanzaron los tamaños más pequeños (mínimo mayo 2012). A partir del verano aumentó el tamaño del biofilm hasta el otoño, cuando se registraron los tamaños más elevados (máximo octubre 2012). Durante el siguiente invierno se observó un nuevo descenso del tamaño del biofilm, que finalizó con un tamaño menor que al principio. La mayor variabilidad se observó en los meses de mayo y agosto y los registros atípicos en los meses de enero y marzo de 2012 (Fig. 5.18). No se observaron diferencias significativas entre el tamaño del biofilm durante el invierno y el verano de 2012 (p: 0,1084) pero si fueron determinadas entre el tamaño durante el invierno de 2012 y de 2013 (p: 0,0144), siendo un 3 % más pequeña el área ocupada por el biofilm durante el segundo invierno. Los modelos propuestos por el análisis de regresión presentaron un porcentaje de variabilidad explicada comprendida entre 28,3 y 53,7 %. El mayor poder explicativo correspondió al modelo que empleó registros ambientales desde 4 días previos a la realización de la fotografía. La humedad relativa ambiental fue la variable que mostró mayor correlación con el tamaño del biofilm, pero con relación inversa. El biofilm Ne.11(2) presentó un coeficiente de variación del tamaño del 19 %. La evolución del tamaño del biofilm no fue igual a la observada en la zona Ne. 11(1). En esta 116 ocasión, se observó un incremento del tamaño al inicio del estudio y, posteriormente, en primavera, el tamaño comenzó a disminuir hasta alcanzar el valor más bajo (mínimo mayo 2012). Durante el verano se produjo un nuevo incremento que perduró hasta el otoño (máximo octubre 2012) cuando, de nuevo, comenzó a decrecer y continuó durante el invierno. Los meses con variabilidad de registros mayor fueron los de la primavera, especialmente mayo de 2012, y no se determinaron valores atípicos para esta variable en Ne. 11(2) (Fig. 5.19). No se determinaron diferencias significativas entre el tamaño del biofilm registrado durante el inverno y el verano de 2012 (p: 0,9377) y tampoco entre el tamaño durante el invierno de 2012 y de 2013 (p: 0,3371). El porcentaje de variabilidad explicada ofrecida por los modelos estuvo comprendida entre 35,4 y 52,9 %, correspondiendo el mayor poder explicativo al modelo que empleó registros ambiéntales obtenidos de hasta 2 días previos a la realización de la fotografía. La humedad relativa ambiental fue la variable que mostró mayor correlación con el tamaño del biofilm, pero con relación inversa. El biofilm Ne.12(1) mostró un coeficiente de variación del tamaño del 9 %. Su tamaño fue muy similar durante el periodo de estudio, con leves incrementos y descensos durante el primer invierno. Posteriormente, en primavera y verano, se registraron los tamaños mayores (máximo junio 2012) y, desde finales de verano y hasta el invierno siguiente, se produjo un descenso del tamaño hasta alcanzar los registros más bajos (mínimo enero 2013). Se observó una notable variabilidad de resultados durante el mes de diciembre de 2012 y los registros atípicos correspondieron a los meses de marzo y agosto de 2012 y enero de 2013 (Fig. 5.20). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre el tamaño del biofilm registrado en el invierno y el verano de 2012 (p: 0,7820). En cambio, estas diferencias sí fueron observadas entre el tamaño registrado en invierno de 2012 y de 2013 (p: 0041), siendo el tamaño al final del estudio un 12 % inferior al registrado al inicio. Los modelos ofrecidos presentaron un porcentaje de variabilidad explicada muy pequeño, comprendido entre 16,6 y 21,6 %. De ellos, el mayor poder explicativo correspondió al modelo que tuvo en cuenta los registros ambientales de hasta 1 día antes de la realización de la fotografía. La variable que mostró asociación significativa con el tamaño del biofilm fue la concentración de dióxido de carbono del aire. El biofilm Ne.12(2) mostró un coeficiente de variación del tamaño del 48 %. Su evolución fue casi lineal y, principalmente, decreciente, salvo un pequeño incremento al 117 principio del estudio que albergó el tamaño máximo (diciembre 2011). Posteriormente, se observó una disminución del tamaño que perduró hasta el final del periodo de estudio (mínimo febrero 2013). Los meses de diciembre de los años 2011 y 2012 mostraron la mayor variabilidad de resultados y en marzo, abril y octubre de 2012 se determinaron registros atípicos (Fig. 5.21). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre el tamaño del biofilm durante el invierno y el verano de 2012 (p: 0,2583). En cambio, estas diferencias sí se determinaron entre el tamaño del biofilm durante el invierno de 2012 y de 2013 (p: 0,0122). En este caso, la superficie ocupada por el biofilm también disminuyó un 4 %. El análisis de regresión ofreció modelos estadísticamente no significativos, con porcentaje de variabilidad explicada inferior al 10 %. No se observó correlación entre el tamaño de este biofilm y las variables ambientales monitorizadas. 5.4.2.3. Evolución del tamaño de los biofilms. En base a la representación gráfica obtenida para la evolución del tamaño de cada uno de los biofilms, fueron identificados 4 patrones de comportamiento, denominados, respectivamente Patrón de Evolución 1, 2, 3 y 4 (Fig. 5.22). Patrón 1 59% Patrón 2 17% Patrón 3 12% Patrón 4 12% Evolución biofilms Figura 5.22. Incidencia de cada uno de los Patrones de Evolución de los biofilms descritos. 118 El 59 % de los biofilms monitorizados mostró un desarrollo según el Patrón de evolución 1, el 17 % según el Patrón de evolución 2 y el 24 % restante según los Patrones de evolución 3 y 4, distribuido este porcentaje de forma equitativa. La descripción de los cuatro tipos de evolución observada es la siguiente: Patrón de evolución 1: comenzó con un descenso del tamaño durante el otoño e invierno del primer año de estudio, hasta alcanzar los registros más bajos durante el invierno. Posteriormente, en primavera, se observó un incremento que perduró hasta el verano, cuando se alcanzaron los registros máximos que se mantuvieron casi constantes hasta la mitad del otoño, cuando se observó un nuevo descenso hasta alcanzar tamaños pequeños durante el invierno (Fig. 5.23). Esta evolución muestra notables semejanzas con la evolución de las variables ambientales monitorizadas, que se presentan de forma conjunta en los diagramas de cajas. Los biofilms que mostraron este patrón de evolución fueron Ne.1(1), Ne.1(2), Ne.2(1), Ne.2(2), Ne.3(1), Ne.3(2), Ne.8(1), Ne.8.(2), Ne.9(1) y Ne.9(2), que equivalen a la mayoría de los biofilms monitorizados (59 %). La ubicación de estos biofilms es, en todos los casos, las salas más profundas de las Galerías Turísticas: las salas de Cascada, Fantasmas y Cataclismo. Invierno Primavera Verano Otoño Invierno Invierno Otoño Figura 5.23. Esquema de la evolución de los biofilms según el Patrón 1. Patrón de evolución 2: se observó un tamaño aproximadamente constante durante el invierno, seguido de una disminución durante la primavera hasta alcanzar los tamaños más pequeños durante el verano. Seguidamente, durante el otoño, se observó un nuevo incremento que continuó hasta el siguiente inverno, cuando los tamaños se mantuvieron aproximadamente constantes (Fig. 5.24). Al comparar esta evolución con la evolución de las variables ambientales 119 se vislumbra una relación inversa de los registros. Los biofilms que mostraron este patrón de evolución fueron Ne.10(1), Ne.11(1) y Ne.11(2), ubicados en la Sala del Belén, la más externa de las Galerías turísticas. Primavera Verano Otoño Invierno Invierno Figura 5.24. Esquema de la evolución de los biofilms según el Patrón 2. Patrón de evolución 3: los biofilms relacionados con esta evolución mostraron crecimiento durante todo el periodo de estudio, con un tamaño más pequeño al principio del estudio (invierno del primer año) y mayor al final del mismo (invierno del segundo año) (Fig. 5.25). Este tipo de evolución no muestra relación aparente con la evolución de las variables ambientales. Este patrón de evolución se observó en los biofilms Ne.7(1) y Ne.7(2), ubicados en la Sala del Cataclismo. Otoño Inverno Otoño Inverno Figura 5.25. Esquema de la evolución de los biofilms según el Patrón 3. 1 20 Patrón de evolución 4: los biofilms relacionados con este patrón mostraron un decrecimiento prácticamente constante a lo lardo del periodo de estudio, con un mayor tamaño al principio y menor al final (Fig. 5.26). Los biofilms que mostraron esta evolución fueron Ne.12(1) y Ne.12.(2), ubicados en la Sala del Cataclismo. Otoño Inverno Otoño Inverno Figura 5.26. Esquema de la evolución de los biofilms según el Patrón 4. 5.4.2.4. Modelos de regresión El análisis de regresión lineal múltiple permite explorar y cuantificar la relación estadística entre una variable, considerada dependiente y otras consideradas independientes o predictoras. En nuestro estudio, se analizó la relación entre el tamaño de los biofilms (variable verde) y los factores ambientales (variables de temperatura, humedad relativa y concentración de dióxido de carbono del aire). La información ofrecida por el coeficiente R2 corregida nos permite conocer el porcentaje de tamaño de los biofilms que puede ser explicado mediante las variables ambientales (Tabla 5.4). En general, se observó que el conjunto de variables ambientales analizadas pudo explicar en torno a un 50 % del tamaño determinado en los biofilms. Los modelos que presentaron mayor poder explicativo se relacionaron con el Patrón de evolución 1 y correspondieron a los biofilms Ne.1(1), Ne.1(2), Ne.2(1), Ne.2(2), Ne.3(1), Ne.3(2), Ne.8(2), Ne.9(1) y Ne.9(2). Destacamos el biofilm Ne.8(1), que presentó una evolución según el Patrón 1 y ofreció modelos con una 121 variabilidad explicada notablemente inferior. Los modelos correspondientes a los biofilms Ne.10(1), Ne.11(1) y Ne.11.(2), que mostraron un Patrón de evolución 2, también mostraron buen poder explicativo, aunque inferior, en términos generales a los anteriormente citados. Los biofilms Ne.7(1) y Ne.7(2), relacionados con el Patrón de evolución 3 y el biofilm Ne.12(1) relacionado con el Patrón de evolución 4, ofrecieron modelos que mostraron una variabilidad explicada muy pequeña. En el caso del biofilm Ne.12(2), los modelos obtenidos no se consideraron estadísticamente significativos por el programa de análisis. zona R 2 corregida zona R 2 corregida Ne.1(1) 0,596-0,679 Ne.8(1) 0,177-0,336 Ne.1(2) 0,301-0,394 Ne.8(2) 0,670-0,772, Ne.2(1) 0,472-0,618 Ne.9(1) 0,551-0,664 Ne.2(2) 0,478-0,546 Ne.9(2) 0,621-0,688 Ne.3(1) 0,746-0,82 Ne.10(1) 0,402-0,610 Ne.3(2) 0,754-0,815 Ne.11(1) 0,283-0,537 Ne.7(1) 0,276-0,469 Ne.11(2) 0,354-0,529 Ne.7(2) 0,257-0,382 Ne.12(1) 0,166-0,216 Tabla 5.4. Rango de coeficientes de R2 corregida relacionados con los diferentes modelos de regresión de la variable verde en cada una de las zonas de estudio. Ne.12.2 ofreció modelos no significativos. En relación con el periodo de antelación a la realización de las fotografías considerado para el registro de las variables ambientales, los resultados obtenidos no mostraron diferencias notables entre la variabilidad explicada de los modelos en relación con el número de días de antelación a la toma de fotografías (desde 0 hasta 6) que había sido considerado por el análisis estadístico. 5.4.2.5. Correlación con los factores ambientales A pesar de que el análisis de regresión estadística consideró el conjunto de las variables ambientales en la descripción de la relación con el tamaño de los biofilms, este análisis de regresión también ofreció información sobre los coeficientes no estandarizados (B), que definen la ecuación de regresión en puntuaciones directas, así como los coeficientes estandarizados (β), 128 Figura 5.27. Gráficos de evolución de las variables verde, T, CO2 y RH correspondientes al biofilm Ne.13(1). 129 Figura 5.28. Gráficos de evolución de las variables verde, T, CO2 y RH correspondientes al biofilm Ne.13(2). 130 5.5. Discusión Los microorganismos fotosintéticos aerofíticos (fundamentalmente cianobacterias y algas) son importantes componentes de biofilms fotosintéticos en cuevas (Roldán y HernándezMariné, 2009), siempre que se den las condiciones ambientales y nutricionales favorables. Además de estas variables, el proceso de colonización también depende, por un lado, de la receptividad del sustrato que favorecerá o perjudicará su colonización por microorganismos (Gullitte, 1995) y, por otro lado, de la capacidad de colonización de estos organismos, directamente sobre el sustrato o sobre otros organismos que lo hayan colonizado previamente (Miller et al., 2009). Limitar e incluso evitar el desarrollo de estos organismos precisa controlar y poner en práctica una serie de premisas durante los trabajos habituales de mantenimiento (Ashurst y Ashurst, 1988) así como durante la iluminación de las superficies. En este sentido, los trabajos que determinan la eficacia de estas actuaciones son cada vez más numerosos (Frattini et al., 2006; Doehne y Pinchin, 2008; Cuzman et al., 2014). En este capítulo se ha analizado la evolución de biofilms fotosintéticos que colonizan espeleotemas del interior de la Cueva de Nerja. Para ello se han empleado series de imágenes digitales de los biofilms, datos ambientales y bibliografía. La monitorización de las variables ambientales de temperatura, humedad relativa y la concentración de dióxido de carbono del aire permitió conocer su evolución durante el periodo de estudio. Los resultados mostraron evoluciones similares para las tres variables, que presentaron un pequeño rango de variación. El valor medio de humedad relativa y de temperatura del aire en la mayoría de cuevas investigadas de centro Europa es de 85-95 % y 5-8 ºC, respectivamente (Czerwik-Marcinkowska y Mrozińska, 2011). En la Cueva de Nerja, el valor medio anual de la humedad relativa del aire se encuentra en sintonía con estos resultados pero la temperatura media anual es mayor, con un valor aproximado de 19 ºC. En nuestro estudio se observó que ambas variables ambientales, junto con la concentración de dióxido de carbono del aire mostraban una dinámica anual semejante, condicionada, principalmente, por la afluencia de visitantes a la cueva y el patrón de ventilación natural de la cavidad (Liñán y del Rosal, 2014). 131 Por salas, el valor medio de estas variables ambientales mostró un gradiente que aumentaba hacia las salas más profundas de la cueva (ocasionalmente distorsionado), donde las oscilaciones fueron menores, probablemente, debido a una menor influencia del medio exterior. El análisis de fotografías realizadas periódicamente a las zonas de control ha permitido reconocer cambios despreciables mediante un análisis visual humano (Kuhn et al., 2007). La utilización de técnicas de fotomonitorización en nuestro estudio dotó de una dimensión cuantitativa el crecimiento de los biofilms fotosintéticos durante un periodo de tiempo. Los resultados indicaron que, en general, los biofilms que colonizan el mismo espeleotema o espeleotemas muy próximos mostraron un desarrollo sincrónico. La evolución sincrónica de los biofilms, relacionada con los cambios en el ambiente, también ha sido descrita por Doehne y Pinchin (2008) durante su estudio del biodeterioro de las paredes del Monasterio de Howden (Inglaterra). El estudio de la evolución de los diferentes biofilms fotosintéticos permitió la descripción de cuatro patrones de evolución. De ellos, el más común fue el Patrón de evolución 1, que se caracterizó por un mayor tamaño del biofilm durante el verano y menor durante el invierno. Este patrón fue observado en todos los biofilms localizados en las salas más profundas de la cueva, a excepción de los biofilms de las zonas Ne.7 y Ne.12. Los biofilms que mostraron el Patrón de evolución 1 se desarrollaron sobre espeleotemas con textura aparentemente porosa y sin disponibilidad de agua líquida visible. Este Patrón de evolución 1, fue el que mostró mayor correlación con el microclima de la cueva. Así, el análisis de regresión determinó que, hasta un 80% de los tamaños de los biofilms que mostraron este patrón, podía ser explicado por el conjunto de variables ambientales: temperatura, humedad relativa y concentración de dióxido de carbono del aire. Esta relación de dependencia de los biofilms y las variables ambientales también fue determinada por Cuzman et al., (2014) durante su investigación en las catacumbas Santi Marco, Marcelliano y Damaso (Italia). En relación con la correlación observada entre el tamaño de los biofilms y cada una de las variables ambientales de forma individual, todos los biofilms que se relacionaron con el Patrón de evolución 1 mostraron mayor correlación con la humedad relativa del aire, a excepción de Ne.2(1) y Ne.2(2) que mostraron mayor correlación con la concentración del dióxido de carbono 132 del aire y los biofilms de las zonas Ne.8 y Ne.9, que mostraron mayor correlación con la temperatura del aire. Dado que ambos biofilms se relacionan con los registros ambientales obtenidos por el mismo sensor y en base a las notables diferencias observadas entre los registros de humedad relativa de esta la sala obtenidos durante nuestro estudio y la información bibliográfica disponible (Carrasco et al., 1999, 2000, 2002) planteamos la posibilidad de que los datos de humedad relativa registrados por el sensor de la Sala de la Cascada respondan a un fallo de su funcionamiento debido, probablemente, a la condensación de agua sobre la sonda. La influencia determinada de la humedad relativa del aire en el tamaño de los biofilms podría estar relacionada con la capacidad de los organismos fotosintéticos de obtener agua del aire o con fenómenos de condensación de agua sobre la superficie de los espeleotemas. Estos eventos de condensación de agua, observados en períodos de elevada humedad relativa ambiental en diversas zonas de la Sala del Cataclismo (IICN, 2014), permitirían a los microorganismos fotosintéticos disponer de agua líquida y favorecerían su reproducción. Esta relación de la evolución de los biofilms fotosintéticos con la presencia de agua líquida también fue observada en biofilms que colonizaban monumentos en Méjico, donde la sequía representaba un factor de estrés para los organismos que precisaban de estrategias de adaptación para su supervivencia (Ramírez et al., 2011). El Patrón de evolución 2, se relacionó con biofilms de las zonas Ne.10 y Ne.11, cuyo tamaño fue mayor en invierno y menor en el verano y se ubicaron en la Sala del Belén, la más externa de la cueva. El análisis estadístico ofreció modelos que relacionaron el tamaño de los biofilms y las variables ambientales con un porcentaje de variabilidad explicada entre el 50 y 60 %. La variable más correlacionada con el tamaño de los biofilms fue, de nuevo, la humedad relativa del aire pero en relación inversa. Esta relación inversa entre la humedad relativa del aire y el tamaño del biofilm resulta una incongruencia en base a la información disponible sobre los requerimientos nutricionales y ambientales de los organismos fotosintéticos aerofíticos (Häubner et al., 2006; Gladis y Schumann, 2011). No obstante, podría estar relacionada con la presencia estacional de agua líquida en los sustratos donde se desarrollan los biofilms con Patrón de evolución 2, ubicados en la Sala del Belén. Esta sala presenta un reducido grosor del techo por lo que la filtración del agua de lluvia es muy rápida. Estos episodios de lluvia, que aportan agua 133 líquida al sustrato, son más abundantes durante el invierno, cuando la humedad relativa del aire es menor y viceversa y podrían justificar el resultado de los modelos de regresión. El Patrón de evolución 3 se observó en la pareja de biofilms de la zona Ne.7, en la Sala del Cataclismo y se caracterizó por un crecimiento, prácticamente constante, durante todo el periodo de estudio. Los modelos de regresión obtenidos indicaron que el conjunto de variables ambientales monitorizadas podría explicar, como máximo, un 45 % del tamaño de los biofilms. Este resultado indica que la presencia de otros factores que influyen en el tamaño de los biofilms en mayor grado que las variables ambientales. Los biofilms que presentaron esta evolución mostraron mayor correlación con la humedad relativa del aire. El Patrón de evolución 4 se observó en la pareja de biofilms de la zona Ne.12, ubicados en la Sala del Cataclismo, que mostró una reducción del tamaño a lo largo del periodo de estudio. En este caso, los biofilms mostraban diferencias morfológicas notables. El biofilm Ne.12(1), de aspecto gelatinoso, se desarrollaba sobre una columna de aparente escasa porosidad y con agua líquida. Los modelos obtenidos para este biofilm indicaron una baja relación estadística entre su tamaño y las variables ambientales monitorizadas, con un coeficiente de variabilidad explicada comprendido entre el 10-20 %. En este caso, se plantea la influencia de otras variables en el tamaño del biofilm, no consideradas en el modelo. En este caso, la variable más correlacionada con el tamaño del biofilm fue la concentración de dióxido de carbono en el aire. Estos datos se encuentran en sintonía con los resultados obtenidos durante el estudio del rendimiento fotosintético de este biofilm, que determinaron una mayor respuesta al CO2 en términos de Producción (ETR) frente a los biofilms de la zona Ne.8 (que mostraron Patrón de evolución 1) (López-Figueroa et al., 2014). El biofilm Ne.12(2), de textura pulverulenta, se desarrolló sobre una columna anexa, de aspecto poroso y sin evidencia de agua líquida durante el periodo de estudio. El análisis de regresión para este biofilm no ofreció modelos estadísticamente significativos que relacionaran su evolución con las variables ambientales. La evolución sincrónica de los biofilms de la zona Ne.12 planteó la existencia de un factor común que condicionara su desarrollo, no considerado por los modelos estadísticos. En este caso, la presencia de agua líquida podría ser el factor más relacionado con el tamaño de ambos biofilms pero tan sólo se observó en el sustrato del biofilm Ne.12(1) así como en algunos 134 gours del entorno, en este caso de forma estacional. No obstante, la proximidad de ambas zonas con el sustrato colonizado por Ne.12(2) podría permitir la llegada de agua líquida mediante procesos de difusión. Por otro lado, la bibliografía disponible sobre la Cueva de Nerja informó que el suelo del entorno de la zona Ne.12, formado por sedimento, acumulaba abundantes monedas, arrojadas por los visitantes, con anterioridad al comienzo de nuestro estudio. La presencia de estas monedas en el suelo podría favorecer la impermeabilización parcial del suelo de los gours y permitiría la presencia de agua acumulada durante mayor periodo de tiempo. La limpieza de monedas esta zona favorece la filtración de agua en el sedimento, limita su disponibilidad y podría estar relacionada con la disminución progresiva de tamaño observada en los biofilms Ne.12(1) y Ne.12(2). En relación con el periodo de antelación de los registros ambientales a la toma de las fotografías no observaron cambios sustanciales entre los modelos obtenidos con los datos ambientales del mismo día de la fotografía y los que emplearon datos ambientales registrados desde 1 a 6 días antes de ésta (Anexo 2). En este sentido, parece que las condiciones ambientales a lo largo de todo el periodo de estudio estuvieron más relacionadas con el crecimiento de los biofilms que las de un periodo limitado de tiempo, en nuestro caso, de hasta 6 días previos a la obtención de las imágenes. Por tanto, la intensidad y la duración de los periodos húmedos y secos parecen ser más determinantes en el crecimiento de los biofilms fotosintéticos que los periodos de tiempo considerados, de hasta 6 días, en nuestro análisis estadístico. La humedad relativa del aire fue la variable que mayor correlación mostró con el tamaño del biofilm en la mayoría de los casos de estudio que también mostraron una baja correlación con la temperatura y la concentración de dióxido de carbono del aire que parecen no ser limitantes para el desarrollo de estos biofilms en la Cueva de Nerja. Estos datos se encuentran en sintonía con numerosos estudios que identificado a la disponibilidad de agua como el factor ambiental más importante para el crecimiento de microorganismos fotosintéticos aeroterrestres (Haubner et al., 2006; Gladis y Schumann, 2011). No obstante, algunos organismos fotosintéticos no dependen de la disponibilidad de agua líquida en el medio porque son capaces utilizar el vapor de agua (Nienow, 1996; Gustavs et al., 2011), probablemente mediante el empleo de la parte hidrofóbica de su pared celular o mediante osmolitos (Nienow, 1996 y sus referencias). Por otro lado, las cianobacterias son capaces de sobrevivir durante períodos de 135 sequía mediante adaptaciones fisiológicas, protección frente a la pérdida de agua con paredes celulares gruesas, presencia de una matriz de EPS y un morfotipo simple y mediante la formación de agregados en su interior (Gorbushina, 2007; Ramirez et al. 2011). Las algas verdes aeroterrestres también pueden paliar el estrés osmótico de la desecación mediante la biosíntesis y acumulación de osmolitos orgánicos, tales como polioles (Gustavs et al., 2011). En ambos casos, los microorganismos tienen la capacidad de recuperar rápidamente su eficiencia fotosintética en condiciones de humedad favorables (Haübner et al., 2006). Predecir el desarrollo de biofilms fotosintéticos en el interior de la Cueva de Nerja no es tarea fácil, los modelos de regresión determinaron que el conjunto de variables ambientales monitorizadas podía explicar un porcentaje del tamaño de los biofilms fotosintéticos y, para explicar el resto, se debían tener en cuenta otros factores. Por ello, otras variables ambientales como la radiación fotosintética activa (PAR), la presencia de nutrientes o los criterios de selección de las zonas de control (descritos en el apartado 4.3. Criterios de selección de las zonas de control de la presente memoria), también se tuvieron en cuenta durante el análisis de la evolución de estos biofilms. En relación con la cercanía del biofilm al recorrido turístico, no observó relación entre ésta y el desarrollo de los biofilms. Así, biofilms que se encontraban a distancias equivalentes del recorrido turístico, mostraron crecimientos muy diferentes (por ejemplo, Ne.7 y Ne.8) y biofilms desarrollados a diferente distancia del recorrido, mostraron crecimiento semejante (Ne.2 y Ne.11). En base a la tasa de radiación fotosintética activa (PAR) recibida por cada biofilm, algunos biofilms fotosintéticos de ambientes con escasa iluminación pueden sobrevivir y reproducirse incluso con intensidad de luz inferior al punto de compensación de la fotosíntesis (Mulec, 2005), esto es, el estado en el cual se equilibran el CO2 absorbido con el desprendido, sin ganancia ni pérdida de peso seco y con un valor de fotosíntesis neta igual a cero. Las cianobacterias y diatomeas tienen un punto de compensación de la fotosíntesis comprendido entre 5 y 6 µmol de fotones m-2.s-1, mientras que el equivalente para las algas verdes es del orden de 21 µmol de fotones m-2.s-1 (Hill, 1996). No obstante, en cuevas turísticas de Eslovenia, se determinó crecimiento de algas con intensidad de iluminación del orden de 0,33 µmol de fotones 136 m-2.s-1 (Mulec, 2005) y Martincic et al. (1981) identificó algas en cuevas que sobrevivían con un rango de intensidad lumínica comprendido entre 0,5 y 1 µmol de fotones m-2.s-1. Por tanto, en cuevas, la capacidad de heterotrofía debe jugar un importante papel, similar al determinado en algas plantónicas y bentónicas (Tuchman, 1996). En relación con el tipo de iluminación de las cuevas, Byoung-Woo (2002) recomendó instalar las lámparas de iluminación a una distancia de los espeleotemas de, al menos, dos metros. En nuestro estudio, la intensidad de iluminación (PAR) determinada en las zonas de control se encuentra por debajo del punto de compensación de las algas y, en la mayoría de los casos, también por debajo del punto de compensación de las cianobacterias y diatomeas. En cuanto a la relación de la variable PAR con el crecimiento de los biofilms, el valor más bajo de PAR se correspondió con una pequeña tasa de crecimiento, observada en la pareja de biofilms de la zona Ne.2. Sin embargo, los valores más elevados de PAR, determinados en las zonas Ne.12 y Ne.10, no se correspondieron con un aumento de tamaño que, por el contrario, permaneció aproximadamente constante e incluso disminuyó durante nuestro estudio. Durante la interpretación de los resultados, se tuvo en cuenta que el valor PAR adjudicado a cada uno de los biofilms se obtuvo en la parte central de las zonas de control (de los biofilms) y no se corresponde, necesariamente, con el valor PAR en el perímetro del biofilm, zona por donde se determinó el cambio de tamaño. Esta discrepancia de intensidad aumenta a medida que aumenta la superficie del biofilm y por tanto, no consideramos fiable establecer una relación entre el factor PAR de nuestro estudio y el crecimiento de los biofilms. Por otro lado, los datos obtenidos ofrecen información útil sobre la iluminación y el desarrollo de organismos fotosintéticos en los espeleotemas de la Cueva de Nerja. En base al tipo de iluminación, se observó que los biofilms iluminados con una lámpara de halogenuro metálico, Ne.9(1) y Ne.9(2), mostraron un notable crecimiento anual, con un valor del 10 y 11 %, muy superior al que mostraron biofilms con PAR semejante e iluminados con lámparas fluorescentes de ahorro energético. Otro factor que podría estar relacionado con el desarrollo de los biofilms fotosintéticos es la presencia de murcielaguina en el sustrato. En este sentido, el biofilm Ne.3(2) mostró el mayor crecimiento anual, que alcanzó el 27 % y su pareja, Ne.3(1), creció un 6 % para el mismo periodo. La presencia de abundante murcielaguina entre los pliegues del espeleotema sobre el que se desarrollan ambos biofilms podría ser un elemento potenciador de su crecimiento. Los 137 excrementos de murciélago aportan productos de descomposición orgánica, nutrientes esenciales para el metabolismo de los microorganismos fotosintéticos, tales como fósforo y nitrógeno orgánico y, por otro lado, favorecen la humedad del sustrato mediante la absorción y retención de agua del aire. El empleo de biocidas durante tratamientos de limpieza previos a nuestro estudio también pudo favorecer el desarrollo de los biofilms. De hecho, los biofilms Ne.7(1) y Ne.7(2) que se desarrollaron sobre sustratos que habían sido limpiados con una dilución de peróxido de hidrógeno y agua saturada en calcita (15 %) mostraron un crecimiento anual del 9 y 6 %, respectivamente. La superficie colonizada por el biofilm Ne.1(1), que fue limpiada con dilución de hipoclorito cálcico en agua saturada en calcita (2 %), también creció un 6 %. Estos biofilms mostraron un mayor crecimiento que otros, de características ambientales semejantes, que no habían sido sometidos a limpieza con biocida. Ambas limpiezas podrían haber favorecido la biorreceptividad posterior de los sustratos y, con ello, una recolonización más rápida por los organismos, además favorecer la persistencia de los más resistentes. Respecto al biofilm Ne.1(2), destacamos que, aunque es la pareja de Ne.1(1), se desarrolla sobre un espeleotema diferente que no fue limpiado con biocida y mostró un crecimiento del 3 %. El sustrato sobre el que se desarrolla el biofilm Ne.10(1) también fue limpiado con peróxido de hidrógeno y agua saturada en calcita (15 %), pero el biofilm no mostró un crecimiento estadísticamente significativo. Este hecho pudría deberse a la presencia de otros factores ambientales que influyeron en el desarrollo del biofilm como, por ejemplo, la presencia de una colonia de colémbolos que se nutrió de los organismos fotosintéticos durante el periodo estival y podría haber contribuido a la reducción de tamaño observada durante este periodo. Otra pareja de biofilms con diferente evolución fue la correspondiente a la zona Ne.8. En este caso, los modelos asociados a los biofilms Ne.8(1) y Ne.8(2) fueron muy diferentes entre sí, por lo que se plantea la influencia de otros factores cuya naturaleza desconocemos en el crecimiento de ambos biofilms. Finalmente, en relación con la colonización primaria de los sustratos, los microorganismos fotosintéticos (microalgas, cianobacterias, etc.) pueden colonizar superficies de 144 Punto de control Junio (2007) Noviembre (2008) Junio (2011) Noviembre (2012) Febrero (2014) Julio (2014) Ne.1 - - x x x x Ne.2 - - x x x - Ne.3 - - x x - - Ne.4 X(4) x(4) - - x x Ne.5 - - x x - - Ne.6 - - x x - - Ne.7 - - x x - - Ne.8 x - x x x x Ne.9 - X x x - - Ne.10 - - x x x x Ne.11 - - x(3) x(3) x(3) x(3) Ne.12 - x(2) x(2) x(2) - - Ne.13 - - - x x - Ne.14 - - - x - - Tabla 6.1. Campañas de muestreo de las diferentes zonas de control. Leyenda: (x) muestra, (-) no muestra, (nº) número de muestras obtenidas. Las campañas de muestreo se llevaron a cabo en junio (2007), noviembre (2008), junio (2011), noviembre (2012), febrero (2014) y julio (2014) (Tabla 6.1). Las muestras se obtuvieron mediante raspado suave, con bisturí estéril, de una pequeña superficie se sustrato colonizada por biofilm fotosintético. El material desprendido fue depositado directamente en placas de Petri con medio de cultivo BG11 (½) (Stanier et al., 1971) o medio BBM (Bischoff y Bold, 1963), ambos solidificados con agar (1 %) (MERCK). En cada campaña también se recolectaron lascas desprendidas de sustrato colonizado y, puntualmente, se obtuvieron porciones de sustrato colonizado, de aproximadamente 0,25 cm2 de superficie, que se emplearon para estudiar la penetración del biofilm y la composición química del sustrato. De cada muestra, una parte fue examinada directamente o procesada para su análisis posterior y el resto fue cultivado para el aislamiento de los diferentes organismos fotosintéticos. 145 Adicionalmente y de forma puntal se obtuvieron muestras de zonas concretas cuyos resultados completan los datos taxonómicos ofrecidos en este capítulo. Estas muestras se identificaron con las siglas 3c-2, Ne.ama y Ne.14.suelo (Fig. 6.1). Figura 6.1. A la izquierda y arriba, zona de muestreo Ne.14.suelo, debajo, Ne.ama y a la derecha, 3c-2. 6.3.2. Técnicas de microscopía La metodología empleada en el desarrollo de este estudio incluye las siguientes técnicas de microscopía: estereoscópica, de campo claro, de barrido láser confocal (CLSM), electrónicas de transmisión (TEM) y de barrido (SEM). A ésta última se le incorporó el modo de electrones retroproyectados (BSE) y la difracción de rayos X (DRX). Las características de especies individuales se observaron mediante microscopía convencional y CLSM y las técnicas de microscopía electrónica como auxiliares. La identificación taxonómica se basó en los caracteres morfológicos reconocidos en las muestras sin procesar y en la observación de las colonias que se desarrollaron en las placas de agar, de 146 acuerdo con la bibliografía de referencia. La identificación de las diferentes morfoespecies de microalgas y morfotipos de cianobacterias se basó en Ettl y Gärtner (1995), Komarek y Anagnostidis (1998, 2005) y Komárek (2013). También se utilizó bibliografía especializada, que se detalla en el apartado 6.5 de la presente memoria, correspondiente a la descripción de cada uno de los taxones hallados. 6.3.2.1. Microscopía estereoscópica y de campo claro La observación directa de material de campo y de cultivos vivos de las muestras se llevó a cabo mediante un microscopio óptico Axioplan (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) y las imágenes fueron captadas mediante una cámara digital AxioCam MRc5 y procesadas con el software Axioplan LE. Esta microscopía permitió identificar los constituyentes autótrofos de las muestras (algas y cianobacterias) así como la presencia, grosor, disposición y agrupamiento de sus respectivas envolturas (sustancias poliméricas extracelulares (EPS) (Rippka et al., 1979). 6.3.2.2. Microscopia de Barrido Láser Confocal (CSLM) La técnica CSLM proporciona información sobre la arquitectura y la heterogeneidad en el interior de los biofilms (Davey y O'Toole 2000), evitando los inconvenientes de otros procesos (Neu y Lawrence 1997; Lawrence y Neu, 1999) entre ellos, la pérdida de viabilidad de los organismos de la muestra. Así, el CSLM permite realizar secciones ópticas horizontales o sagitales de biofilms intactos, vivos o no y de gran grosor, reconstruir y caracterizar su estructura tridimensional (Roldán et al., 2007) y observar las interacciones entre los organismos y las superficies a las cuales se adhieren (Lawrence y Neu, 1999). La mayor parte de las muestras de la Cueva de Nerja fueron observadas mediante esta técnica en los días posteriores a su recolección. Esta técnica también fue empleada para observar muestras sin procesar ,obtenidas a partir de los cultivos de enriquecimiento y de los aislamientos. En algunos casos, las muestras se fijaron con solución de paraformaldehido al 3 % en tampón fosfato alcalino (Phosphate Buffer Solution, PBS) 0,1 M Sacarosa 60 mM y se mantuvieron a 4 147 ºC. Alicuotas de las muestras, tanto frescas como fijadas, se marcaron con la lectina Concanavalina A (Con-A Alexa-Fluor 488, Molecular Probes, Inc, Eugene, OR) (Schüßler et al., 1997) para observar los polisacáridos extracelulares que forman la matriz que rodea a los biofilms. También se usó el marcador específico de DNA, Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) que se une a las regiones ricas en adenina-timina y permitió observar células vivas (Roldán et al., 2004b). El montaje de las muestras, debido a su grosor, rigidez y opacidad precisó de placas Mat-teck (MatTek Corporation, Ashland, MA, USA), a las que se añadieron pequeñas cantidades de PBS para evitar la deshidratación de la muestra durante la observación. La observación de las muestras se llevó a cabo mediante un microscopio confocal espectral Leica TCS-SP5 (Leica Microsystems Heidelberg GMBH, Mannheim, Germany), equipado con ocho líneas de láser y cinco canales de detección. Las longitudes de onda de excitación de los láseres son las siguientes: diodo azul (405 nm), Argón (458, 476, 488 y 514 nm), diodo naranja (561 nm) y HeNe (594 y 633 nm). De ellas, tan solo se emplearon algunas y en diferentes proporciones junto con los objetivos Plan Apocromáticos: 10x(0.4 AN), 40x(1.250.75 AN), 63x(1.4 AN). La línea 405 nm se empleó para detectar el DNA marcado con Hoechst 33258 y la fluorescencia espontánea azul de algunas vainas. La línea láser Ar-488 nm, con emisión a 500550 nm, se empleó para observar los EPS, marcados previamente con Con-A. Esta información permitió observar los mecanismos de adhesión entre los microorganismos y entre éstos y el sustrato. La morfología del sustrato se observó mediante el empleo del microscopio confocal en modo reflexión, usando la misma línea de láser Ar 488 nm y recogiendo la señal a 480-495 nm. También las líneas láser 488 nm, con emisión entre 500-800, 594 nm, con emisión entre 670-790 nm y 561 nm, con emisión entre 575-625 nm, se emplearon para observar los pigmentos fotosintéticos de microalgas y cianobacterias (clorofilas y ficobiliproteinas) que presentan fluorescencia natural. La información obtenida permitió determinar la morfología y el estado fisiológico de los microorganismos, así como su posición en el sustrato y respecto al resto de organismos o sustancias fluorescentes. Para determinar la relación espacial de los pigmentos fotosintéticos y los EPS, se adquirieron imágenes de la misma zona en los diferentes canales de forma secuencial, para evitar 148 el solapamiento de las diferentes señales de fluorescencia. Se realizaron secciones ópticas horizontales (x-y) a lo largo del eje z de la muestra. Posteriormente, estas secciones fueron recopiladas para hacer la reconstrucción xyz (3D) de la muestra. Los límites superior e inferior de la captación se adquirieron utilizando la autofluorescencia de los pigmentos y, en algunos casos, la fluorescencia de la Con-A como marcador, tomando como límites las secciones, de la primera a la última, que mostraban fluorescencia. El número de secciones que se captaron, así como la distancia entre sección y sección, fueron elegidas en función de cada muestra. Las imágenes se adquirieron en los formatos de 512 x 512 píxeles y de 1024 x 1024 píxeles y fueron captadas en un rango dinámico de 8 bits (256 niveles de grises). El procesamiento de imágenes se realizó con el programa informático Imaris versión 6.1 (Bitplane AG Zürich, Switzerland) y el Leica (Las AF) y con el programa abierto Fiji (GNU General Public License). Una vez procesadas las series, se obtuvieron imágenes tridimensionales de los biofilms (Roldán et al., 2004c) que mostraron la distribución de los organismos y su relación con el sustrato. Una de las funciones empleadas de este programa, denominada “Extended”, permitió observar el biofilm dividido en tres secciones, que representan la proyección de intensidad máxima de fluorescencia para los planos x-y, x-z, y-z y. Además, el equipo Leica TCS-SP5 está acoplado a un detector espectral que permite obtener el espectro de emisión de los fluorocromos naturales presentes en las cianobacterias y microalgas del biofilm (Roldán et al., 2004b). Para ello, es necesario definir un rango de longitudes de onda dentro de las cuales se adquiere una colección de imágenes x-y que muestran la intensidad de fluorescencia para cada rango de longitud de onda predeterminado. El procesamiento de dichas series permite obtener el gráfico correspondiente al espectro real de emisión de cada muestra (Roldán et al., 2004b, 2004c). El análisis de la fluorescencia se llevó a cabo mediante la elección de regiones de interés (ROIs), equivalentes a 1 µm2 para cada x-y-λ de imágenes de la zona de tilacoidal de las cianobacterias y de los cloroplastos de las algas. Gracias a esta función fue posible caracterizar la emisión de los diferentes tipos de pigmentos fotosintéticos e identificar cianobacterias y algas y, dentro de ellas, las pertenecientes a distintos grupos filogenéticos (Roldán et al., 2004b). Conocer aspectos sobre la intensidad de fluorescencia también aporta información sobre la fisiología de los organismos (Roldán y Hernández-Mariné, 2007, del Rosal et al., 2012; Roldán et al., 2014). 149 6.3.2.3. Microscopía electrónica de barrido (SEM) La microscopía SEM fue empleada para caracterizar la superficie de los sustratos colonizados, el aspecto general y la morfología de los biofilms, así como su relación con el sustrato (Jembrith et al., 2000; Hernández-Mariné, et al., 2004; Welton, et al., 2005; Schreiner, et al., 2007). También se aplicaron dos técnicas de análisis complementarias: espectroscopía de rayos X (Energy Dispersive X-ray, EDX) y electrones retrodispersados (Back Scattered Electron, BSE). La primera realizó un microanálisis cualitativo y cuantitativo de los componentes de la muestra (Jembrih et al., 2000, Schreiner et al., 2007) y la segunda aportó información relativa a la naturaleza química o composicional de la muestra y a su topografía (Jembrih et al., 2000, Schreiner et al., 2007). El procesado de las muestras se llevó a cabo mediante fijación en glutaraldehído (0,2 %) y paraformaldehído (2 %) en tampón cacodilato 0,1 M. Para mejorar la conductividad de las muestras se postfijaron en una solución de tetróxido de osmio (1 %). El deshidratado se realizó mediante gradiente de etanol y el secado mediante punto crítico. Finalmente, las muestras fueron recubiertas con carbono y observadas a microscopio. La observación de las muestras se llevó a cabo mediante un Microscopio Electrónico de Barrido con electrones retrodifundidos (BSE) y rayos X de energía dispersiva (EDX) (Quanta 200, FEI þ EDAX). Los espectros de rayos X fueron adquiridos en una tensión de aceleración de 20 kV, con una corriente de haz de 10 Torr y un tiempo de adquisición de 30 s. Tras el análisis elemental de las muestras, algunas de ellas fueron recubiertas con oro para mejorar la calidad de las imágenes obtenidas y evaluar con mayor precisión las relaciones entre los organismos así como entre éstos y el sustrato (Hernández-Mariné et al. 2004). Esta técnica de microscopía también empleó un equipo Jeol 6510 con tensión de aceleración de 15KV. En este caso, se empleó la misma técnica de preparación pero se obvió la metalización con oro para evitar interferencias durante la obtención de imágenes. Parte de las muestras de las zonas Ne.4 y Ne.1 fueron incluidas en bloques de resina y cortadas para su observación a microscopio. La fijación de las muestras se llevó a cabo mediante una mezcla de paraformaldehído (2 %) y glutaraldehído (2,5 %) en tampón cacodilato (0,1 M) durante 2 horas. Posteriormente, fueron lavadas en este tampón e impregnadas en frío con resina 150 epoxy (Epofix Struers) en moldes de 25 mm de diámetro. La impregnación en resina se realizó al vacío, mediante un equipo BUEHLER modelo CAST'N VAC. Posteriormente se realizaron 2 cortes planoparalelos (base y techo de la probeta) con sierras de isometría de precisión Lowspeed (BUEHLER). La superfície a observar se pulió con carburo de silicio de tamaño de grano sucesivo P200, P400 y P800, mediante el empleo de pulidora (LAPMASTER 1.5). El pulido “espejo” de la superficie se consiguió mediante polvo de diamante de tamaño de grano de 1 y 0.1 µm y pulidora PRESI modelo GEOPOL-GEOROD. 6.3.2.4. Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) El empleo de la microscopía TEM aportó información sobre la presencia, el tamaño, forma y disposición de los orgánulos dentro de las células y de las relaciones entre distintos grupos de organismos y de su integridad o estado de degradación celular y subcelular. Para la fijación química de las muestras procedentes de cultivo se utilizó una mezcla de paraformaldehído (2 %) y glutaraldehído (2,5 %) en tampón cacodilato (0,1 M) durante 2 horas. Posteriormente, las muestras se lavaron en este tampón y fijaron en una solución de tetróxido de osmio (1 %). La deshidratación se realizó mediante una serie graduada de acetona y, tras esto, las muestras fueron incluidas en resina Spurr (Sigma Aldrich) (Spurr, 1969). Los cortes ultrafinos, obtenidos a partir del bloque, fueron teñidos con los metales pesados acetato de uranilo y citrato de plomo (2 %) (Hernandez-Marine et al. 2004). El equipo empleado para el examen de los cortes fue un microscopio JEOL 1010 TEM (Jeol, Japón) a 80 kV de aceleración. 6.3.3. Análisis molecular Para completar la información aportada por las técnicas de microscopía, se emplearon técnicas de análisis molecular para la identificación de cianobacterias y eucariotas. En las muestras analizadas mediante técnicas moleculares también se identificaron las bacterias y arqueas asociadas a los biofilms, cuyos resultados se pueden consultar en el Anexo 3 de la 151 presente memoria que integra parte del informe emitido por el IRNAS-CESIC (Sevilla) (Jurado et al., 2015). Las muestras analizadas mediante biología molecular se obtuvieron en las zonas Ne.1, Ne.2, Ne.4, Ne.8, Ne.10, Ne.11, Ne.11(b) y Ne.13. La extracción de los ácidos nucleicos se realizó siguiendo el método de Griffiths et al. (2000), que permite el análisis en paralelo del ADN y ARN. En un tubo Eppendorf de 1,5 ml con 150-200 mg de muestra natural se añadieron perlas de vidrio de 2 y 4 mm de diámetro, 500 µl de tampón de extracción CTAB (Tris 100 mM, NaCl 1,4 M, EDTA 20 mM, bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) 2%; pH 8) y 500 µl de fenol:cloroformo:isoamilalcohol (25:24:1, pH 8). La mezcla se homogenizó con un equipo Fast-Prep 24 (MP Biomedicals) y ciclo de 15 s a una velocidad de 5,5 m/s y centrifugación 5 min a 12500 rpm. El sobrenadante se purificó con 500 µl de cloroformo:isoamilalcohol (24:1), se agitó durante 5-10 s y se centrifugó de nuevo. La precipitación de los ácidos nucleicos se llevó a cabo con 50 µl de acetato de sodio (3M) y 500 µl de isopropanol, centrifugado durante 30 min a 12500 rpm, lavado del precipitado con etanol (70 %) y secado a temperatura ambiente. Este precipitado se disolvió en 80 µl de agua ultra pura libre de ARNsa (Sigma-Aldrich) y se cuantificó la concentración de ADN y ARN resultante con un equipo NanoDrop 1000 (Thermo Scientific), siguiendo las instrucciones del fabricante. Del producto de la extracción, 50 µl se emplearon para la purificación del ARN y el resto para análisis del ADN. Para aislar el ARN se eliminó el ADN con la enzima RNase-Free DNase (Quiagen GmbH). Para ello, se añadieron 20 µl del tampón de reacción RDD (suministrado con la enzima), 5 µl de la enzima ADNsa y 125 µl de agua ultra pura libre de ARNsa. La reacción enzimática se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 10 minutos. El ARN se purificó en 14 µl de agua ultra pura libre de ARNsa empleando el RNeasy Minielute Cleanup Kit (Quiagen). Para el análisis de las comunidades microbianas metabólicamente activas, se sintetizó el ADN complementario (ADNc) mediante la reacción de retrotranscripción catalizada por la enzima SuperScript II Reverse Tanscriptase (Invitrogen Life Technologies). Se siguió el protocolo detallado por el fabricante y los cebadores Cya 781R (5’-GAC TAC TGG GGT ATC TAA TCC CAT T-3’) para cianobacterias (Nübel et al., 1997), 907R (5’-CCC CGT CAA TTC 152 ATT TGA GTT T-3’) para bacterias (Teske et al., 1996) y 915R (5’-GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT-3’) y para arqueas (Groβkopf et al., 1998). La identificación de cianobacterias, bacterias y arqueas se realizó mediante la secuenciación del gen ARN ribosómico 16S. La identificación de eucariotas se realizó con el gen ARN ribosómico 18S. Los genes se amplificaron mediante PCR con las parejas de cebadores Cya 106F (5’-CGG ACG GGT GAG TAA CGC GTG A-3’) y Cya 781R para cianobacterias (Nübel et al., 1997), 616F (5’-AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3’) y 907R para bacterias (Juretschko et al., 1998; Teske et al., 1996), Arch109F (5’-ACK GCT CAG TAA CAC GT-3’) y 915R para arqueas (Groβkopf et al., 1998) y, EUKA (5’-AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT3’) y EUKB (5’-TGA TCC TTC TGC AGG TTC ACC TAC-3’) para eucariotas (Diez et al., 2001). Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador iCycler de BioRad (Hercules, California, EE.UU.). Las reacciones se prepararon en tubos de 0,2 ml (Greiner BioOne, Monroe, EE.UU.). Cada reacción se realizó con 5 µl de tampón de PCR 10x BioTaq (Bioline, Randolph, EE.UU.), 1,5 µl de MgCl2 (solución stock 50 mM), 1 µl de de una mezcla de los cuatro nucleótidos (dNTP) (2 mM) (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.), 0,5 µl de cada cebador de concentración 50 µM, 0,25 µl de la ADN polimerasa BioTaq (Bioline, Randolph, EE.UU.) y ADN molde. El volumen final de la reacción se completó hasta 50 µL con agua ultra pura. Para cada reacción, como ADN molde se añadieron unos 10-20 ng de extracto de ADN, mientras que para el análisis del ARN, se añadieron 1-2 µl de una dilución 1:10 del ADNc. El protocolo de amplificación por PCR fue: 5 min de desnaturalización inicial a 94 ºC; 30 ciclos de 2 min a 94 ºC, 15 s a 55 ºC y 2 min a 72 ºC, seguidos de 10 min de extensión final a 72 ºC. Los resultados de las reacciones de PCR se comprobaron mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa (1% p/v) y los productos amplificados se purificaron usando el kit JETquick Spin (Genomed), y fueron conservados a -20 ºC hasta su uso en el análisis de DGGE y la construcción de genotecas. El análisis de DGGE precisó de una segunda PCR sobre el producto amplificado de los genes de ARNr. Los cebadores utilizados para cianobacterias y bacterias fueron el 341F-GC (5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’) (Neefs et al., 1990) y el 518R (5’-GCG GGG GCA CGG GGG G-3’) (Neefs et al., 1990) y para arqueas: el Arc344F-GC (5’-TCG CGC CTG CTG CYC CCC GT-3’) (Groβkopf et al., 1998) y el 518R. La composición de la mezcla de reacción fue idéntica a la utilizada en la primera reacción de amplificación y utilizando como ADN molde 1 l del 153 producto de PCR purificado del gen ARNr 16S. Los protocolos de PCR utilizados fueron los anteriormente citados. La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) permitió separar los productos de PCR con tamaños parecidos o iguales en base a la reducción de su movilidad electroforética al desnaturalizarse parcialmente la doble cadena de ADN. El resultado es un patrón de bandas que representa a la comunidad microbiana de la muestra analizada. La técnica se realizó según Muyzer et al. (1993) con modificaciones. Se utilizaron geles de 20 x 16 x 0,1 cm con un 8% (p/v) de acrilamida:bisacrilamida (37,5:1) (Bio-Rad) en tampón TAE 0,5X (Tris 20 mM, ácido acético glacial 10 mM, EDTA 0,5 mM), con un gradiente de agentes desnaturalizantes (urea 7M, formamida desionizada 40% (v/v)) de 30-50%. La zona superior del gel, donde se sitúan los pocillos para cargar las muestras, se completó con una solución de acrilamida sin agentes desnaturalizantes. La polimerización de los geles se catalizó con N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TEMED) y una solución al 10% de persulfato amónico (APS). Una vez preparado el gel, se mantuvo dos horas a temperatura ambiente hasta su completa polimerización. La electroforesis se realizó en tampón TAE 0,5X con el equipo de electroforesis vertical D-Code System (Bio-Rad), conectado a una fuente de alimentación Consort E-865 (Consort NV). Antes de cargar las muestras, los geles ya polimerizados se sometieron, durante 20 minutos, a las condiciones electroforéticas determinadas para estos experimentos (60 ºC y 200 V), tras lo cual se cargaron 10 µl de ADN mezclados con 5 µl de tampón de carga de electroforesis (Tris-HCl 50, sacarosa 0,25 g/ml, azul de bromofenol 1 g/l, SDS 5 mg/ml). La electroforesis se llevó a cabo durante 3,5 horas y, una vez finalizada, los geles se tiñeron con bromuro de etidio (10 µg/ml). La observación se realizó con un transiluminador EX-26.MX (Vilber Lourmat) que emite luz de 312 nm de longitud de onda y las imágenes se captaron con un equipo Kodak EDAS-290 (Kodak) y el programa Kodak 1D v. 3.5.4. Imaging Scientific System (Kodak). Las genotecas se construyeron a partir de los productos de PCR purificados de los genes ARNr 16S y 18S, que fueron clonados mediante el kit comercial TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen, California, EE.UU.) y siguiendo las instrucciones del fabricante. El vector empleado fue el plásmido pCR4-TOPO (Invitrogen). Tras la transformación, las células se sembraron en placas de LB con ampicilina e incubaron a 37 ºC durante, aproximadamente, 18 h. 256 Gladis-Schmacka, F., Glatzel, S., Karsten, Ulf., Böttcher, H. Y Schumann, R. 2014. Influence of local climate and climate change on aeroterrestrial phototrophic biofilms, Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research, 30(4), 401-414. Golubic, S., Friedmann, E.I. y Schneider, J. 1981. The lithobiontinc ecological niche, with special reference to microorganisms. Journal of Sedimentary Petrology, 51, 475-478. Golubic, S. y Schneider, J. 2003. Microbial endoliths as internal biofilms. En: Krumbein, W.E. Dornieden, T., Volkmann, M.,Paterson, D.M. y Zavarzin, G.A. (Eds.). Fossil and Recent Biofilms. A natural History of Life on Earth. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht: 249–263. Gómez-Bolea, A., Alvaro, I., Llop, E., Sammut, S. y Hernández-Mariné, M. 2014. Indoors diversity in phototrophic biofilms at St. Paul’s Catacombs (Malta). En: Sáiz-Jiménez (Ed.). The Conservation of Subterranean Cultural Heritage, 83-88. González, J.M., Laiz, L. Portillo, C. y Sáiz-Jiménez, C. 2005. Microbial communities inhabiting caves with Palaeolithic paintings. ICOM Committee for Conservation 14th Triennial Meeting, 1, 381385. Gorbushina, A.A. 2007. Life on the rocks. Environmental Microbiology, 9, 1613-1631. Griffiths, R.I., Whiteley ,A.S., O’Donnell, A.G. y Baile, M.J. 2000. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA-and rRNA-based microbial community composition. Applied and Environmental Microbiology, 66, 5488-5491. Grilli-Caiola, M., Billi, D. y Friedmann, E.I. 1996. Effect of desiccation on envelops of the cyanobacterium Chroococcidiopsis sp. (Chroococcales). European Journal of Phycology, 31, 97105. Grokopf, R.F., Janssen, P.H. y Liesack, W. 1998. Diversity and structure of the methanogenic community in anoxic rice paddy soil microcosms as examined by cultivation and direct 16S rRNA gene sequence alignments. Bioinformatics, 20, 2317-2319. Guillitte, O. 1995. Bioreceptivity: a new concept for building ecology studies. Science of Total Environmet, 167, 215-220. 257 Guiry, M.D. 2015. En: Guiry, M.D. y Guiry, G.M. (Eds.) AlgaeBase. World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway. http://www.algaebase.org Acceso 23/10/2015. Gustavs, L., Gors, M. y Karsten, U. 2011. Polyol patterns in biofilm-forming aeroterrestrial green algae (Trebouxiophyceae, Chlorophyta). Journal of Phycology, 47(3), 533-537. Habe, F. 1981. Beritch der commission fur karstschutz und schauholen del UIS. En: Proccedings 8th International Congress of Speleological Society, Kentucky (USA), 2, 442-443. Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41, 95-98. Hanagata, N. 1998. Phylogeny of the subfamily Scotiellocystoideae (Chlorophyceae, Chlorophyta) and related taxa inferred from 18S ribosomal RNAgene sequence data. Journal of Phycology, 34, 1049-1054. Hariot, P. 1891. Le genre Polycoccus Kützing. Journal de Botanique, 5, 29-32. Häubner, N., Schumann, R. y Karsten, U. 2006. Aeroterrestrial microalgae growing in biofilms on facades - response to temperature and water stress. Microbial Ecology, 51, 285-293. Hauer, T., Mühlsteinová, R., Bohunická, M., Kaštovský, J. y Mareš, J. 2015. Diversity of cyanobacteria on rock surfaces. Biodiversity and Conservation, 24, 759-779. Hazslinszky, T. 2002. U bersicht der Lampenflorabeka¨mpfung in Ungarn. En: Hazslinszky, T. (Ed.). International Conference on Cave Lighting, Budapest, Hungary, Hungarian Speleological Society, 41-50. Heaton, T. 1986. Caves: a tremendous range of energy environments on Earth. National Speleological Society News, August, 301-304. Hernández-Mariné, M., Asencio-Martínez, A., Canals, A., Ariño, X., Aboal, M. y Hoffmann, L. 1999. Discovery of populations of the lime incrusting genus Loriella (Stigonematales) in Spanish caves. Archiv für Hydrobiologie, Supplement Algological Studies, 94, 121-138. 258 Hernández-Mariné, M., Roldán, M., Clavero, E., Canals, A. y Ariño, X. 2001. Phototrophic biofilm morphology in dim light. The case of Puigmoltó skinhole. En: Elster, J., Seckbach, J., Vincent, W.P. y Lhotsky, O. (Eds.). Algae and extreme environments, Nova Hedwigia, Beih. 123, 237253. Hernández-Mariné. M., Clavero, E. y Roldán, M. 2003. Why there is such luxurious growth in the hypogean environments? Algological Studies, 109, 229-239. Hernández-Mariné, M., Clavero, E. y Roldán, M. 2004. Microscopy methods applied to cyanobacteria. Limnética, 23, 179-186. Hernández-Mariné, M. y Roldán, M. 2005. Adherence of hormogonia to substrata is mediated by polysaccharides produced by necridic cells. Algological Studies, 117, 239-249. Hill, W.R. 1996, Effects of light. En: Stevenson, R.J., Bothwell, M.L.y Lowe, R.L. (Eds.). Algal ecology: freshwater benthic ecosystems. San Diego, Academic Press, 121-144. Hill, C.A. y Forti, P. 1997. Cave minerals of the world, 2nd Ed. Huntsville, National Speleological Society, 463 pp. Hodac, L., Hallmann, C., Rosenkranz, H., Faßhauer y F., Friedl, T. 2012. Molecular Evidence for the Wide Distribution of Two Lineages of Terrestrial Green Algae (Chlorophyta) over Tropics to Temperate Zone. International Scholarly Research Network, doi:10.5402/2012/795924 Hueck-van der Plas, E.H. 1965. The biodeterioration of materials as a part of hylobiology. Material und Organismen, 1, 5-34. Hueck-van der Plas E.H. 1968. The microbiological deterioration of porous building materials. International Biodeteriorarion Bulletin, 4, 11-28. Humphreys, W.F. 1991. Experimental re-establishment of pulse-driven populations in a terrestrial troglobite community. Journal of Animal Ecology, 60, 609-623. Huppert, G., Burri, E., Forti, P. y Cigna, A. 1993. Effects of tourist development on caves and karst. Catena supplement, 25, 251-268. 259 Iliopoulou-Georgoudaki, J., Pantazidou, A. y Theoulakis, P. 1993. An assessment of cleaning photoautotropic microflora: The case of ‘‘Perama’’ cave, Ioannina Greece. Memoires de Biospeologie, 20, 117-120. Instituto de Investigación Cueva de Nerja ( IICN). 2015. Memoria Científica 2014. Fundación Cueva de Nerja, Inédito, 541 pp. Jembrih, D., Neelmeijer, Ch., Schreiner, M., Peev, M., Clausen, Ch. y Krejsa, P. 2000. Microchimica, 133, 151-157. Jiménez de Cisneros, C., Caballero, E. y Vera, J.A. 2006. Extracción de inclusiones fluidas en espeleotemas de la Cueva de Nerja. En: Karst, cambio climático y aguas subterráneas, Publicaciones del IGME, Serie Hidrogeología y aguas subterráneas, 18, 333-337. Jones, M.V. 1995. Fungal Biofilms; eradication of a common problem. En: Wimpenny, J., Handley P., Gilbert, P., y Lappin-Scott H.M. (Eds.). The Life and Death of Biofilm. Cardiff, Bioline, 157-160. Jordá-Pardo, J.F. 1986. La Prehistoria de la Cueva de Nerja. Trabajos sobre la Cueva de Nerja, 1, Patronato de la Cueva de Nerja, Málaga, 339 pp. Jurado, V., Porca, E. y Sáiz-Jiménez, C. 2010. Control de un brote fúngico en la Cueva de Castañar de Ibor. En: Durán, J.J. y Carrasco, F. (Eds.). Cuevas: Patrimonio, Naturaleza, Cultura y Turismo, Madrid, Asociación de Cuevas Turísticas Españolas, 611-620. Jurado, V., Novakova, A., Hernández-Mariné, M. y Sáiz-Jiménez, C. 2014. Cueva del Tesoro, Rincón de la Victoria, Málaga: a treasure of biodiversity. En: Sáiz-Jiménez (Ed.). The Conservation of Subterranean Cultural Heritage, 207-213. Jurado, V., Galocha, I, Domínguez, I., Rogerio, M.A. y Sáiz-Jiménez. 2015. Estudio microbiológico de la Cueva de Nerja. Investigación de los organismos implicados en el biodeterioro. IRNAS-CSIC, Sevilla, Inédito, 50 pp. 260 Juretschko, S., Timmermann, G., Schmid, M., Schleifer, K.-H., Pommering-Röser, A., Koops, H.P. y Wagner, M. 1998. Combined molecular and conventional analyses of nitrifying bacterium diversity in activated sludge: Nitrosococcus mobilis and Nitrospira-like bacteria as dominant populations. Applied and Environmental Microbiology, 64, 3042-3051. Keshari N. y Adhikary, S.P. 2013. Characterization of cyanobacteria isolated from biofilms on stone monuments at Santiniketan, India. Biofouling, 29(5), 525-536. Klimchouk, A. 2004. Caves. En: Gunn, J. (Ed.). Encyclopedia of caves and karst science, 203-205. Komárek, J. 1992. Diversita a moderní klasifikace sinic (Cyanoprocaryota) [Diversity and modern classification of Cyanobacteria (Cyanoprokaryota). - inaugural dissertation, not published. Komárek, J. y Hindák, F. 1975. Taxonomy of the new isolated strains of Chroococcidiopsis (Cyanophyceae). Archiv für Hydrobiologie, 13, 311-329. Komárek, J. y Anagnostidis, K. 1998. Cyanoprokaryota I: Chroococcales. En: Ettl, H,. Gärtner, G., Heynig, H. y Mollenhauer, D. (Eds.). Süsswasserflora von Mitteleuropa 19/1. Gustav Fischer, Jena/Stuttgart/Lübeck/Ulm, 548 pp. Komárek, J. y Anagnostidis, K. 2005. Cyanoprokaryota 2: Oscillatoriales. En: Büdel, B., Krienitz, L., Gärtner, G. y Schagerl, M, (Eds.). Süsswasserflora von Mitteleuropa 19/2. Elsevier GmbH, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 759 pp. Komárek, J., Kastovsky, J. y Jezberová, J. 2011. Phylogenetic and taxonomic delimitation of the cyanobacterial genus Aphanothece and description of Anathece gen. nov. European Journal of Phycology, 46(3), 315-326. Komárek, J. 2013. Cyanoprokaryota 3: Heterocytous Genera. En: Büdel, B., Gärtner, G., Krienitz, L. y Schagerl, M. (Eds.). Süsswasserflora von Mitteleuropa 19/3. Spektrum Akademischer Verlag, 1130 pp. Komárek, J. y Hauer, T. 2013. CyanoDB.cz - On-line database of cyanobacterial genera. - Word-wide electronic publication, Univ. of South Bohemia & Inst. of Botany AS CR, http://www.cyanodb.cz. Acceso 16/10/2015. 261 Komárek, J., Kaštovsky, J., Mareš, J. y Johansen, J.F. 2014. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera), using a polyphasic approach. Preslia, 86, 295–335. Köppen, W. 1936. Das geographische System der Klimate. En: Köppen W, Geiger R (Eds.). Handbuch der Klimatologie, Gebrüder Borntraeger, Berlin, 1-44. Krienitz, L., Hegewald, E., Hepperle, D. y Wolf, M. 2003. The systematics of coccoid green algae: 18S rRNA gene sequence data versus morphology. Biologia, 58, 437–446. Krumbein, W.E. 1988. Microbial interactions with mineral materials. En: Houghton, D.R., Smith, R.N. y Eggins, H.O.W. (Eds.). Biodeterioration, 7, Elsevier, London, 78-100. Kuhn, A.R., Klein, J.A. y Stevens, W.R. 2007. The digital blink comparison technique as a diagnostic aid for medical imaging. Computer-Assisted Radiology and Surgery, 2, 62-64. Kumar, C.G. y Anand, S.K. 1998. Significance of microbial biofilms in food industry: a review. International Journal of Food Microbiology, 42, 9-27. Kumar, R. y Kumar, A.V. 1999. Biodeterioration of stone in tropical environments. En: Neville, A. (Ed.). Research in Conservation, The Getty Conservation Institute, Los Angeles, 85 pp. Kützing, F.T. 1843. Phycologia generalis oder Anatomie, Physiologie und Systemkunde der Tange. Mit 80 farbig gedruckten Tafeln, gezeichnet und gravirt vom Verfasser, 458 pp. Laiz, l., Groth, I., Gonzalez, I. y Sáiz-Jiménez, C. 1999. Microbiological study of the dripping waters in Altamira cave (Santillana del Mar, Spain). Journal of Microbiology, 36, 129-138. Lamenti, G., Tiano, P. y Tomaselli, L. 2000. Biodeterioration of ornamental marble statues in the Boboli Gardens (Florence, Italy). Journal of Applied Phycology, 12, 427-433. Lamprinou, V., Pantazidou, A., Papadogiannaki, G., Radea C. y Economou-Amili, A. 2009. Cyanobacteria and associated invertebrates in Leontari cave. Fottea, 9, 155-164. 262 Lamprinou, V., Danielidis, D.B., Economou-Amilli, A. y Pantazidou, A. 2012. Distribution survey of Cyanobacteria in three Greek caves of Peloponnese. International Journal of Speleology, 4(2), 267-272. Larcher, W. 1995. Physiological Plant Ecology. Springer, Berlin, 506 pp. Laundon, J. 1985. Desmococcus olivaceus–the name of the common subaerial green algae. Taxonomy, 34, 671-672. Lawrence, J. R., Korber, D.R., Hoyle, B. D., Costerton, J. W. y Caldwell, D. E. 1991. Optical sectioning of microbial biofilms. Journal of Bacteriology, 173, 6558-6567. Lawrence J. y Neu T.R. 1999. Confocal Laser Scanning Microscopy for Analysis of Microbial Biofilms. Methods in Enzymology, 310, 131-144. Lefèvre, M. y Laporte, G.S. 1969. The “maladie verte” of Lascaux. diagnosis and treatment. Studies in Speleology, 2, 35-44. Lefèvre, M. 1974. La “maladie verte” de Lascaux. Studies in Conservation, 19, 126-156. Liñán, C., Andreo, B., Carrasco, F. y Vadillo, I. 1999. Hidrodinámica e hidroquímica de las aguas de goteo de la Cueva de Nerja. En: Andreo, B., Carrasco, F. y Durán, J.J. (Eds). Contribución del estudio científico de las cavidades kársticas al conocimiento geológico, 393-402. Liñán, C., Simón, M. D., del Rosal, Y. y Garrido, A. 2007. Estudio preliminar del clima en el entorno de la Cueva de Nerja (Andalucía, provincia de Málaga) En: Durán et al. (Eds.). Cuevas turísticas: aportación al desarrollo sostenible. Publicaciones del Instituto Geológico y Minero de España, Madrid, Serie Hidrogeología y Aguas Subterráneas, 24, 159-168. Liñán, C., Carrasco, F., Vadillo, I. y Garrido, A. 2008. Estudios hidrogeológicos en la Cueva de Nerja (Málaga). En: López-Geta et al. (Eds.). Agua y Cultura. Publicaciones del IGME, serie: Hidrogeología y aguas subterráneas, 25, 673-683. 263 Liñán, C., Carrasco F., Calaforra, J.M., del Rosal, Y., Garrido, A. y Vadillo, I. 2009. Control de parámetros ambientales en las Galerías Altas y Nuevas de la Cueva de Nerja (Málaga). Resultados preliminares. En: Durán, J.J. y López-Martínez, G. (Eds.). Cuevas Turísticas, cuevas vivas. Actas del II Congreso español sobre cuevas turísticas, ACTE, 131-144. Liñán, C., del Rosal, Y., Montesino, A. y Garrido, A. 2010. Plan de difusión del Patrimonio Cultural y Natural de la Cueva de Nerja (Málaga, Andalucía). En: Durán y Carrasco (Eds.), Cuevas: Patrimonio, Naturaleza, Cultura y Turismo, Madrid, ACTE, 35-46. Liñán, C. y del Rosal, Y. 2014. Natural Ventilation of Karstic Caves: New Data on the Nerja Cave (Malaga, S of Spain). En: B. Andreo et al. (Eds.). Hydrogeological and Environmental Investigations in Karst Systems, Environmental Earth Sciences 1, 505-511. Liñán, C., del Rosal, Y. y Carrasco, F. 2014. Control de parámetros ambientales en el sector no habilitado de una cueva turística: la Cueva de Nerja (Málaga, España). En: Calaforra y Durán (Eds.). Iberoamérica subterránea. Actas del I Congreso Iberoamericano y V Congreso español sobre cuevas turísticas, ACTE, 229-238. López-Figueroa, F., Korbee, N., Celis-Plá, P., Jerez, C., Álvarez-Gómez, F., del Rosal, Y. y HernándezMariné, M. 2014. Monitorización del estado fisiológico de los biofilms de la Cueva de Nerja (Málaga) mediante la fluorescencia in vivo de la clorofila a asociada al Fotosistema II. En: Calaforra, J.M. y Durán, J.J. (Eds.). Iberoamérica subterránea, Madrid, ACTE, 485-495. Lowe, R.L., Kociolek, P., Johansen, J.R., Van de Vijver, B., Lange-Bertalot, H. & Kopalová, K. 2014. Humidophila gen.nov., a new genus for a group of diatoms (Bacillariophyta) formerly within the genus Diadesmis: species from Hawaii, including one new species. Diatom Research, 29(4), 351360. Lyons, R. G. 1992. Radon hazard in caves: a monitoing and management strategy. Helictite, 30(2), 33-40. Macedo, M.F., Miller A.Z., Dionísio, A. y Saiz-Jimenez C. 2009. Biodiversity of cyanobacteria and green algae on monuments in the Mediterranean Basin: an overview. Microbiology, 155, 3476-3490. 264 MacIntryre, H.L., Kana, T.M., Anning, T. y Geider, R. 2002. Photoacclimation of Photosynthesis irradiance response curves and photosynthetic pigments in microalgae and cyanobacteria. Journal of Phycology, 38, 17-38. Mangin, A. y D’Hulst, D. 1995. Fréquentation des grottes touristeques et conservation. Méthode d’approche pour en étudier les effects et proposer une réglementation. Simposio Internazionale Grotte turistiche e Monitoraggio Ambientale, Stazione Scient, Bossea, Italia, 117-145. Mangin, A., Bourges, F. y D’Hulst, D. 1999. La conservation des grottes ornées: un problème de stabilité d’un système naturel (l’exemple de la grotte préhistorique de Gargas, Pyrénées françaises). Proceedings of the National Academy of Science, Paris, 295-301. Margalef, R. 1952. Materiales para una flora de las algas del NE. de España, IV a. Cyanophyceae. Collectanea Botanica, 3(10), 210-229. Marín, F. 1998. Acta Consejo Científico Asesor de la Cueva de Nerja. Nerja, 4 de febrero de 1998. Inédito, 6 pp. Marín, F. y Marín-Olalla, E. 2000. Factores biológicos implicados en la conservación de la Cueva de Nerja. Memoria final de las actividades realizadas durante el año 2000. Instituto de Investigación Cueva de Nerja, Inédito, 78 pp. Martincic, A., Vrhovshek, D. y Batic, F. 1981, Flora v jamah z umetno osvetlitvijo. Bioloski Vestnik, 29(2), 27-56. Mikhailyuk, T.I., Sluiman, H.J., Massalski, A., Mudimu, O., Demchenko, E.M., Kondratyuk, S.Y. y Friedl, T. 2008. New streptophyte green algae from terrestrial habitats and an assessment of the genus Interfilum (Klebsormidiophyceae, Streptophyta). Journal of Phycology, 44(6), 1586-1603. Miller, A.Z., Dionisio, A., Laiz, L., Macedo, M.F. y Sáiz-Jinénez, C. 2009. The influence of inherent properties of building limestones on their bioreceptivity to phototrophic microorganisms. Annals of Microbiology, 59, 705-713. 265 Miller, A.Z., Rogerio-Candelera, M.A., Laiz, L., Wierzchos, J., Ascaso, C., Sequeira-Braga, M.A., Hernández-Mariné, M., Maurício, A., Dionísio, A.; Macedo, M. F. y Saiz-Jiménez, C. 2010. Laboratory-induced endolithic growth in calcarenites: biodeteriorating potential assessment. Microbial Ecology, 60, 55-68. Mulec, J. 2005. Algae in the karst caves of Slovenia. Tesis doctoral, Ljubljana, Slovenia, University of Ljubljana, 149 pp. Mulec, J., Kosi, G. y Vrhovsek, D. 2008. Characterization of cave aerophytic algal communities and effects of irradiance levels on production of pigments. Journal of Cave and Karst Studies, 70, 3–12. Mulec, J. y Kosi, G. 2009. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies, 71(2), 109-115. Muyzer, G. y Smalla, K. 1998. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology, 73, 127-141. Nägeli, C. 1849. Gattungen einzelliger Algen, physiologisch und systematisch bearbeitet. Neue Denkschriften der Allg. Schweizerischen Gesellschaft für die Gesammten Naturwissenschaften 10(7), 139 pp. Neefs, J.M., Van de Peer, Y., Hendriks, L. y De Wachter, R. 1990. Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences. Nucleic Acids Research, 18, 2237-2317. Němcová, Y., Eliáš, M., Škaloud, P., Hodač, L. y Neustupa, J. 2011. Jjenufa Gen. Nov.: a new genus of coccoid green algae (Chlorophyceae, incertae sedis) previously recorded by environmental sequencing. Journal of Phycology, 47, 928-938. Neu, T. y Lawrence, J.R. 1997. Development and structure of microbial biofilms in river water studied by confocal laser scanning microscopy. FEMS Microbiology Ecology, 24, 11–25. Nienow, J.A. 1996. Ecology of subaerial algae. Nova Hedwigia Beiheft, 112, 537–552. 272 Schreiner, R.P., Tarara, J.M. y Smithyman, R.P. 2007. Deficit irrigation promotes arbuscular colonization of fine roots by mycorrhizal fungi in grapevines (Vitis vinifera L.) in an arid climate. Mycorrhiza, 17, 551-562. Schüßler, A., Meyer, T., Gehrig, H. y Kluge M. 1997. Variations of lectin binding sites in extracellular glycoconjugates during the life cycle of Nostoc punctiforme, a potentially endosymbiotic cyanobacterium. European Journal of Phycology, 32, 233-239. Silverberg, B. A. 1975. Some structural aspects of the pyrenoid of the ulotrichalean alga Stichococcus. Transactions of the American Microscopical Society, 84(4), 550-565. Smith, T. y Olson, R. 2007. A taxonomic survey of lamp flora (Algae y Cyanobacteria) in electrically lit passages within Mammoth Cave National Park, Kentycky. International Journal of Speleology, 36, 105-114. Sociedad de Excursionistas de Málaga, S.E.M. 1985. La Cueva de Nerja. Grupo de Exploraciones Subterráneas de la Sociedad Excursionista de Málaga, Málaga, 87 pp. Solecki, R. 1972. Shanidar: the Humanity of Neanderthal Man. London: Allen Lane, 222 pp. Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, R y Cohen-Bazire, G. 1971. Purification and properties of unicellular blue-green algae (Order Chroococcales). Bacteriological Reviews, 35, 171-205. Tandeau, N. 1977. Occurrence and nature of chromatic adaptation in Cyanobacteria. Journal of Bacteriology, 82-91. Teske, A., Wawer, C., Muyzer, G. y Ramsing, N.B. 1996. Distribution of sulfate-reducing bacteria in a stratied fjord Mariager Fjord, Denmark) as evaluated by most-probable-number counts and DGGE of PCR-amplied ribosomal DNA fragments. Applied and Environmental Microbiology, 62, 1405-1415. Thornbush, M.J. y Viles, H.A. 2008. Photographic monitoring of soiling and decay of roadside walls in central Oxford, England. Environmental Geology, 56(3-4), 777-787. 273 Tiano, P., Acolla, P. y Tomaselli, L.1995. Phototrophic biodeteriogens in lithoid surfaces: an ecologycal study. Microbial Ecology, 29, 299-309. Tinaut, A., Lara, M.D. y Ruíz-Avilés, F. 2002. Entomofauna de la Cueva de Nerja (Málaga). Fundación Cueva de Nerja, Inédito,128 pp. Tomaselli, L., Lamenti, G., Bosco, M. y Tiano, P. 2000. Biodiversity of photosynthetic microorganisms dwelling on stone monuments. International Biodeterioration and Biodegradation, 46, 251-258. Tuchman, N.C. 1996. The role of heterotrophy in alga. En: Stevenson, R.J., Bothwell, M.L. y Lowe, R.L. (Eds.). Algal Ecology:Freshwater Benthic Ecosystems, San Diego, Academic Press, 299-316. Urzi, C., De Leo, F., Bruno, L. y Albertano, P., 2010. Microbial diversity in Paleolithic caves: a study case on the phototrophic biofilms of the Cave of Bats (Zuheros, Spain). Microbial Ecology, 60, 116-129. Vadillo, I., Liñán, C., Carrasco, F. y Andreo, B. 2001. Control of environmental parameters for management and conservation of Nerja Cave (Malaga, Spain). Kras, 49, 48-49. Vaucher ex Bornet et Flahault, 1888. Annales des Sciences Naturelles; Botanique, VII, 7, 181. Vinogradova, O.N., Kovalenko, O.V., Wasser, S.P., Nevo, E. y Weinstein-Evron, M. 1998. Species diversity gradient to darkness stress in blue–green algae/cyanobacteria: a microscale test in a prehistoric cave, Mount Carmel, Israel. Israel Journal of Plant Sciences, 46, 229-238. Vischer, W. 1960. Reproduktion und systematische Stellung einiger Rinden-und Bodenalgen. Schweiz. Zeitschr. Hydrol. 22, 330-349. Walker, J.J. y Pace, N.R. 2007. Endolithic microbial ecosystems. Annual Review of Microbiology, 61, 331-347. Warscheid, T.H. y Braams, J. 2000. Biodeterioration of stone: a review. International Biodeterioration and Biodegradation, 46, 343-368. 274 Weber, C.F. 2009. Introducing mothur: Open Source, platform-independent, community supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology, 75, 7537-7541. Welton, R.G., Silva, M.R., Gaylarde, C., Herrera, L.K., Anleo, X., De Beile, N y Modrý, S. 2005. Techniques applied to the study of microbial impact on building materials. Materials and structures, 38(284), 883-893. Wierzchos, J., Ascaso, C., McKay, C.P. 2006. Endolithic cyanobacteria in halite rocks from the hyperarid core of the Atacama Desert. Astrobiology, 6, 415-422. White, W. B. 1984. Geomorphology and Hydrology of Karst Terrains. Nueva York: Oxford University Press, 464 pp. Whitman, W.B., Coleman, D.C. y Wiebe, W.J. 1998. Prokaryotes: the unseen majority. Proceedings of the National Academy Science, 95, 6578–6583. Whitton. B.A. 2012. Ecology of Cyanobacteria II: their diversity in space and time. Springer, London, 760 pp. Winkler, E. M. 1985. A durability index for stone. Actes 5th International Congress on Deterioration and Conservation of Stone, 151–56. Lausanne, 25–27 sept .1985. Wittrock, V.B. y Nordstedt, C.F.O. 1880. Algae aquae dulcis exsiccatae, Lund, 7, 301-350. Worboys, G., Davey, A. y Stiff, C. 1982. Report on cave classification. Cave Management in Australia, 4, 11-18. Zammitt, G., Billi, D., Shubert, E., Kaštovský, J. y Albertano, P. 2011. The biodiversity of subaerophytic phototrophic biofilms from Maltese hypogea. Fottea, 11, 187-201. 275 ANEXO 1 Inventario de zonas colonizadas por biofilms fotosintéticos: imágenes y planimetría 276 277 INVENTARIO 1. SALA DEL VESTIBULO Ves-1 Ves-2 Ves-3 Vest-4 278 INVENTARIO 2. SALA DEL BELÉN Bel-1 Bel-2 Bel-3 Bel-4 Bel-5 Bel-6 279 Bel-7 Bel-8 (Ne.11) Bel-9 (Ne.10) Bel-10 Bel-11 Bel-12 280 Bel-13 Bel-14 Bel-15 Bel-16 Bel-17 Bel-18 281 INVENTARIO 3. SALA DE LA CASCADA Cas-1 Cas-2 Cas-3 Cas-4 Cas-5 Cas-6 288 Cat-13 Cat-14 Cat-15 Cat-16 Cat-17 Cat-18 289 Cat-19 Cat-20 Cat-21 Cat-22 Cat-23 Cat-24 290 Cat-25 Cat-26 Cat-27 Cat-28 Cat-29 Cat-30 291 Cat-31 Cat-32 Cat-33 Cat-34 Cat-35 Cat-36 292 Cat-37 Cat-38 Cat-39 Cat-40 (Ne.7) Cat-41 Cat-42 293 Cat-43 Cat-44 Cat-45 Cat-46 Cat-47 Cat-48 294 Cat-49 Cat-50 (Ne.3) Cat-51 Cat-52 Cat-53 Cat-54 295 Cat-55 Cat-56 Cat-57 (Ne.1 y Ne.2) Cat-58 Cat-59 Cat-60 296 Cat-61 Cat-62 Cat-63 297 SALA DE LA TORCA Tor-1 Tor-2 (Ne.4) Tor-3 (Ne.4) Tor-4 (Ne.4) 305 ANEXO 2 Coeficientes estadística 306 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) ,550 ,083 6,640 ,000 RH.z.0 ,973 ,182 1,254 5,354 ,000 ,668 ,682 ,543 ,188 5,324 T.z.0 -,020 ,166 -,027 -,120 ,905 ,537 -,021 -,012 ,202 4,948 CO2.z.0 -,580 ,132 -,726 -4,409 ,000 ,224 -,609 -,447 ,380 2,634 (Constante) ,392 ,096 4,066 ,000 RH.z.1 ,978 ,212 1,296 4,620 ,000 ,702 ,664 ,536 ,171 5,840 T.z.1 -,205 ,220 -,273 -,931 ,360 ,544 -,176 -,108 ,156 6,410 CO2.z.1 -,369 ,139 -,475 -2,650 ,013 ,261 -,454 -,308 ,419 2,385 (Constante) ,432 ,092 4,692 ,000 RH.z.2 ,845 ,185 1,139 4,569 ,000 ,743 ,628 ,482 ,180 5,571 T.z.2 -,067 ,188 -,089 -,356 ,724 ,619 -,063 -,038 ,178 5,608 CO2.z.2 -,319 ,121 -,427 -2,642 ,013 ,346 -,423 -,279 ,426 2,347 (Constante) ,428 ,088 4,878 ,000 RH.z.3 ,732 ,167 1,009 4,393 ,000 ,770 ,607 ,448 ,198 5,061 T.z.3 ,008 ,178 ,010 ,044 ,965 ,652 ,008 ,004 ,181 5,510 CO2.z.3 -,267 ,114 -,355 -2,355 ,025 ,358 -,379 -,240 ,458 2,185 (Constante) ,354 ,080 4,406 ,000 RH.z.4 ,935 ,170 1,162 5,496 ,000 ,796 ,686 ,497 ,183 5,457 T.z.4 -,113 ,174 -,147 -,653 ,518 ,652 -,111 -,059 ,161 6,194 CO2.z.4 -,291 ,105 -,355 -2,776 ,009 ,303 -,430 -,251 ,500 2,001 (Constante) ,336 ,077 4,346 ,000 RH.z.5 ,951 ,171 1,181 5,551 ,000 ,799 ,684 ,497 ,177 5,646 T.z.5 -,127 ,180 -,162 -,704 ,486 ,655 -,118 -,063 ,151 6,631 CO2.z.5 -,290 ,113 -,343 -2,570 ,015 ,346 -,398 -,230 ,451 2,218 (Constante) ,358 ,076 4,689 ,000 RH.z.6 ,901 ,173 1,135 5,208 ,000 ,788 ,655 ,481 ,179 5,572 T.z.6 -,108 ,173 -,140 -,624 ,537 ,657 -,103 -,058 ,170 5,897 CO2.z.6 -,278 ,108 -,332 -2,573 ,014 ,329 -,394 -,238 ,514 1,947 Ne.1.1 Ne.1.1 Ne.1.1 Ne.1.1 Ne.1.1 Ne.1.1 Ne.1.1 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Estadísticos de colinealidad Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.1.1. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.1.1 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,813 ,660 ,629 ,4735391 ,660 21,368 3 33 ,000 Ne.1.1 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,798 ,636 ,596 ,4802821 ,636 15,751 3 27 ,000 Ne.1.1 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,802 ,643 ,610 ,4863671 ,643 19,240 3 32 ,000 Ne.1.1 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,810 ,656 ,625 ,4780445 ,656 20,988 3 33 ,000 Ne.1.1 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,849 ,721 ,697 ,4334489 ,721 29,355 3 34 ,000 Ne.1.1 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,848 ,719 ,695 ,4377169 ,719 29,886 3 35 ,000 Ne.1.1 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,832 ,693 ,667 ,4544031 ,693 27,074 3 36 ,000 RZona Variables predictoras Resumen del modelo R2R2 corregida Error típ. de la estimación Estadísticos de cambio Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.1.1. 307 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) ,497 ,083 5,978 ,000 RH.z.0 ,636 ,182 1,052 3,494 ,001 ,514 ,520 ,456 ,188 5,324 T.z.0 -,022 ,166 -,039 -,133 ,895 ,403 -,023 -,017 ,202 4,948 CO2.z.0 -,406 ,132 -,651 -3,075 ,004 ,134 -,472 -,401 ,380 2,634 (Constante) ,442 ,096 4,599 ,000 RH.z.1 ,543 ,211 ,935 2,573 ,016 ,519 ,444 ,387 ,171 5,840 T.z.1 -,038 ,220 -,066 -,173 ,864 ,413 -,033 -,026 ,156 6,410 CO2.z.1 -,293 ,139 -,490 -2,109 ,044 ,141 -,376 -,317 ,419 2,385 (Constante) ,457 ,093 4,892 ,000 RH.z.2 ,387 ,188 ,687 2,061 ,048 ,542 ,342 ,291 ,180 5,571 T.z.2 ,094 ,191 ,164 ,492 ,626 ,489 ,087 ,069 ,178 5,608 CO2.z.2 -,225 ,122 -,397 -1,835 ,076 ,231 -,308 -,259 ,426 2,347 (Constante) ,483 ,090 5,351 ,000 RH.z.3 ,303 ,171 ,535 1,770 ,086 ,578 ,294 ,238 ,198 5,061 T.z.3 ,201 ,183 ,346 1,097 ,281 ,546 ,188 ,147 ,181 5,510 CO2.z.3 -,224 ,117 -,381 -1,917 ,064 ,245 -,317 -,258 ,458 2,185 (Constante) ,432 ,089 4,841 ,000 RH.z.4 ,345 ,189 ,561 1,826 ,077 ,599 ,299 ,240 ,183 5,457 T.z.4 ,161 ,193 ,274 ,837 ,409 ,555 ,142 ,110 ,161 6,194 CO2.z.4 -,201 ,117 -,321 -1,722 ,094 ,241 -,283 -,227 ,500 2,001 (Constante) ,424 ,083 5,107 ,000 RH.z.5 ,342 ,184 ,556 1,854 ,072 ,607 ,299 ,234 ,177 5,646 T.z.5 ,213 ,193 ,359 1,104 ,277 ,566 ,183 ,139 ,151 6,631 CO2.z.5 -,259 ,121 -,401 -2,134 ,040 ,246 -,339 -,269 ,451 2,218 (Constante) ,398 ,082 4,867 ,000 RH.z.6 ,324 ,185 ,538 1,748 ,089 ,597 ,280 ,228 ,179 5,572 T.z.6 ,139 ,185 ,239 ,754 ,456 ,563 ,125 ,098 ,170 5,897 CO2.z.6 -,149 ,116 -,235 -1,289 ,205 ,289 -,210 -,168 ,514 1,947 Ne.1.2 Ne.1.2 Estadísticos de colinealidad Ne.1.2 Ne.1.2 Ne.1.2 Ne.1.2 Ne.1.2 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.1.2. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.1.2 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,662 ,438 ,387 ,4748150 ,438 8,567 3 33 ,000 Ne.1.2 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,624 ,389 ,321 ,4788533 ,389 5,737 3 27 ,004 Ne.1.2 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,601 ,361 ,301 ,4937192 ,361 6,035 3 32 ,002 Ne.1.2 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,636 ,404 ,350 ,4914723 ,404 7,470 3 33 ,001 Ne.1.2 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,641 ,411 ,359 ,4816511 ,411 7,903 3 34 ,000 Ne.1.2 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,665 ,442 ,394 ,4707879 ,442 9,248 3 35 ,000 Ne.1.2 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,623 ,388 ,337 ,4863661 ,388 7,609 3 36 ,000 Estadísticos de cambio Zona Variables predictoras R R2R2 corregida Error típ. de la estimación Resumen del modelo Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.1.2. 308 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) -,495 ,081 -6,114 ,000 RH.z.0 -,402 ,174 -,566 -2,310 ,028 ,510 -,389 -,248 ,193 5,192 T.z.0 ,348 ,159 ,507 2,192 ,036 ,610 ,372 ,236 ,216 4,631 CO2.z.0 ,623 ,127 ,827 4,900 ,000 ,765 ,667 ,527 ,407 2,460 (Constante) -,372 ,107 -3,463 ,002 RH.z.1 -,445 ,232 -,595 -1,922 ,067 ,484 -,372 -,253 ,181 5,522 T.z.1 ,549 ,241 ,725 2,276 ,033 ,625 ,429 ,300 ,171 5,845 CO2.z.1 ,494 ,156 ,609 3,169 ,004 ,714 ,551 ,418 ,471 2,122 (Constante) -,432 ,100 -4,322 ,000 RH.z.2 -,305 ,205 -,460 -1,493 ,147 ,514 -,272 -,191 ,172 5,814 T.z.2 ,415 ,209 ,600 1,985 ,057 ,610 ,351 ,253 ,178 5,608 CO2.z.2 ,419 ,132 ,598 3,173 ,004 ,692 ,514 ,405 ,459 2,177 (Constante) -,425 ,100 -4,246 ,000 RH.z.3 -,294 ,194 -,453 -1,518 ,140 ,490 -,271 -,195 ,185 5,396 T.z.3 ,436 ,207 ,641 2,107 ,044 ,608 ,364 ,271 ,178 5,603 CO2.z.3 ,370 ,129 ,530 2,868 ,008 ,668 ,470 ,368 ,484 2,067 (Constante) -,427 ,097 -4,427 ,000 RH.z.4 -,310 ,206 -,437 -1,506 ,143 ,467 -,265 -,184 ,177 5,654 T.z.4 ,391 ,212 ,563 1,843 ,075 ,585 ,319 ,225 ,160 6,254 CO2.z.4 ,443 ,125 ,603 3,544 ,001 ,708 ,543 ,433 ,516 1,940 (Constante) -,412 ,089 -4,624 ,000 RH.z.5 -,321 ,200 -,459 -1,603 ,119 ,444 -,277 -,189 ,170 5,883 T.z.5 ,319 ,212 ,463 1,503 ,143 ,561 ,261 ,178 ,147 6,791 CO2.z.5 ,517 ,129 ,702 4,017 ,000 ,728 ,585 ,475 ,457 2,189 (Constante) -,414 ,086 -4,834 ,000 RH.z.6 -,332 ,193 -,484 -1,721 ,095 ,420 -,291 -,203 ,175 5,713 T.z.6 ,317 ,201 ,465 1,578 ,124 ,532 ,269 ,186 ,160 6,255 CO2.z.6 ,532 ,125 ,714 4,252 ,000 ,717 ,601 ,501 ,491 2,035 Ne.2.1 Ne.2.1 Ne.2.1 Ne.2.1 Ne.2.1 Ne.2.1 Ne.2.1 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Estadísticos de colinealidad Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.2.1. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.2.1 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,808 ,653 ,618 ,4446390 ,653 18,794 3 30 ,000 Ne.2.1 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,775 ,600 ,548 ,5121925 ,600 11,504 3 23 ,000 Ne.2.1 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,738 ,544 ,495 ,5100453 ,544 11,121 3 28 ,000 Ne.2.1 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,722 ,521 ,472 ,5238844 ,521 10,532 3 29 ,000 Ne.2.1 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,743 ,552 ,507 ,5012192 ,552 12,332 3 30 ,000 Ne.2.1 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,753 ,567 ,525 ,4855360 ,567 13,535 3 31 ,000 Ne.2.1 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,746 ,556 ,515 ,4863944 ,556 13,369 3 32 ,000 Resumen del modelo Zona Variables predictoras R R2R2 corregida Error típ. de la estimación Estadísticos de cambio Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.2.1. 309 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) -,107 ,103 -1,038 ,308 RH.z.0 ,259 ,222 ,313 1,169 ,251 ,737 ,209 ,137 ,193 5,192 T.z.0 ,253 ,202 ,315 1,248 ,222 ,730 ,222 ,146 ,216 4,631 CO2.z.0 ,169 ,162 ,192 1,045 ,305 ,659 ,187 ,123 ,407 2,460 (Constante) ,004 ,125 ,035 ,972 RH.z.1 ,078 ,269 ,093 ,291 ,773 ,701 ,061 ,040 ,181 5,522 T.z.1 ,507 ,280 ,597 1,813 ,083 ,752 ,354 ,247 ,171 5,845 CO2.z.1 ,090 ,181 ,099 ,500 ,622 ,593 ,104 ,068 ,471 2,122 (Constante) -,094 ,115 -,814 ,423 RH.z.2 ,243 ,236 ,313 1,026 ,314 ,718 ,190 ,130 ,172 5,814 T.z.2 ,354 ,242 ,439 1,466 ,154 ,730 ,267 ,185 ,178 5,608 CO2.z.2 ,011 ,152 ,013 ,070 ,945 ,551 ,013 ,009 ,459 2,177 (Constante) -,056 ,115 -,485 ,631 RH.z.3 ,124 ,223 ,158 ,556 ,582 ,703 ,103 ,068 ,185 5,396 T.z.3 ,514 ,238 ,625 2,161 ,039 ,749 ,372 ,264 ,178 5,603 CO2.z.3 -,021 ,148 -,025 -,144 ,887 ,526 -,027 -,018 ,484 2,067 (Constante) -,091 ,117 -,774 ,445 RH.z.4 -,027 ,250 -,032 -,110 ,913 ,666 -,020 -,013 ,177 5,654 T.z.4 ,608 ,257 ,725 2,366 ,025 ,740 ,397 ,290 ,160 6,254 CO2.z.4 ,055 ,151 ,063 ,366 ,717 ,545 ,067 ,045 ,516 1,940 (Constante) -,088 ,111 -,792 ,434 RH.z.5 -,114 ,249 -,136 -,459 ,650 ,640 -,082 -,056 ,170 5,883 T.z.5 ,613 ,264 ,738 2,322 ,027 ,725 ,385 ,283 ,147 6,791 CO2.z.5 ,133 ,160 ,150 ,832 ,412 ,600 ,148 ,102 ,457 2,189 (Constante) -,060 ,112 -,541 ,592 RH.z.6 -,017 ,251 -,020 -,069 ,945 ,653 -,012 -,008 ,175 5,713 T.z.6 ,601 ,261 ,703 2,301 ,028 ,722 ,377 ,281 ,160 6,255 CO2.z.6 ,049 ,163 ,052 ,299 ,767 ,537 ,053 ,037 ,491 2,035 Ne.2.2 Ne.2.2 Ne.2.2 Ne.2.2 Ne.2.2 Ne.2.2 Ne.2.2 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Estadísticos de colinealidad Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.2.2. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.2.2 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,766 ,587 ,546 ,5664476 ,587 14,219 3 30 ,000 Ne.2.2 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,757 ,573 ,518 ,5940290 ,573 10,305 3 23 ,000 Ne.2.2 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,743 ,552 ,504 ,5893024 ,552 11,520 3 28 ,000 Ne.2.2 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,753 ,566 ,522 ,6027203 ,566 12,626 3 29 ,000 Ne.2.2 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,741 ,549 ,504 ,6069290 ,549 12,183 3 30 ,000 Ne.2.2 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,734 ,539 ,494 ,6041854 ,539 12,064 3 31 ,000 Ne.2.2 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,723 ,522 ,478 ,6328644 ,522 11,664 3 32 ,000 Resumen del modelo Zona Variables predictoras R R2R2 corregida Error típ. de la estimación Estadísticos de cambio Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.2.2. 310 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) ,132 ,088 1,504 ,142 RH.z.0 ,590 ,192 ,587 3,077 ,004 ,863 ,472 ,254 ,188 5,324 T.z.0 ,367 ,175 ,385 2,093 ,044 ,842 ,342 ,173 ,202 4,948 CO2.z.0 -,087 ,139 -,084 -,625 ,536 ,660 -,108 -,052 ,380 2,634 (Constante) ,150 ,095 1,574 ,128 RH.z.1 ,518 ,209 ,504 2,477 ,020 ,883 ,437 ,211 ,174 5,731 T.z.1 ,459 ,218 ,453 2,107 ,045 ,876 ,382 ,179 ,156 6,403 CO2.z.1 -,048 ,139 -,045 -,345 ,733 ,658 -,068 -,029 ,427 2,343 (Constante) ,110 ,094 1,170 ,251 RH.z.2 ,490 ,189 ,473 2,597 ,014 ,877 ,423 ,202 ,182 5,490 T.z.2 ,512 ,192 ,489 2,662 ,012 ,879 ,431 ,207 ,179 5,599 CO2.z.2 -,050 ,124 -,048 -,406 ,688 ,658 -,073 -,032 ,433 2,310 (Constante) ,090 ,089 1,015 ,318 RH.z.3 ,471 ,168 ,459 2,800 ,009 ,885 ,444 ,205 ,199 5,015 T.z.3 ,491 ,180 ,470 2,727 ,010 ,886 ,434 ,200 ,180 5,541 CO2.z.3 ,010 ,116 ,009 ,085 ,933 ,669 ,015 ,006 ,462 2,166 (Constante) ,024 ,086 ,279 ,782 RH.z.4 ,603 ,184 ,541 3,283 ,002 ,898 ,496 ,232 ,184 5,437 T.z.4 ,380 ,188 ,357 2,025 ,051 ,883 ,332 ,143 ,160 6,238 CO2.z.4 ,060 ,114 ,053 ,532 ,599 ,655 ,092 ,038 ,503 1,987 (Constante) ,054 ,089 ,610 ,546 RH.z.5 ,518 ,199 ,473 2,605 ,014 ,874 ,408 ,199 ,177 5,642 T.z.5 ,410 ,209 ,389 1,965 ,058 ,871 ,319 ,150 ,149 6,694 CO2.z.5 ,083 ,131 ,072 ,631 ,532 ,680 ,108 ,048 ,454 2,204 (Constante) ,061 ,092 ,666 ,510 RH.z.6 ,560 ,209 ,517 2,683 ,011 ,860 ,413 ,220 ,180 5,546 T.z.6 ,358 ,210 ,342 1,699 ,098 ,845 ,276 ,139 ,165 6,051 CO2.z.6 ,060 ,135 ,051 ,441 ,662 ,632 ,074 ,036 ,509 1,966 Ne.3.1 Ne.3.1 Ne.3.1 Ne.3.1 Ne.3.1 Ne.3.1 Ne.3.1 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Estadísticos de colinealidad Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.3.1. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.3.1 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,880 ,775 ,754 ,5001807 ,775 37,820 3 33 ,000 Ne.3.1 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,901 ,812 ,791 ,4714436 ,812 37,490 3 26 ,000 Ne.3.1 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,902 ,813 ,795 ,4942354 ,813 44,927 3 31 ,000 Ne.3.1 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,910 ,829 ,812 ,4807369 ,829 51,545 3 32 ,000 Ne.3.1 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,914 ,835 ,820 ,4651047 ,835 55,830 3 33 ,000 Ne.3.1 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,895 ,801 ,784 ,5037109 ,801 45,653 3 34 ,000 Ne.3.1 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,875 ,766 ,746 ,5452546 ,766 38,115 3 35 ,000 Resumen del modelo Zona Variables predictoras R R2R2 corregida Error típ. de la estimación Estadísticos de cambio Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.3.1. 311 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) ,300 ,086 3,496 ,001 RH.z.0 ,730 ,188 ,725 3,875 ,000 ,862 ,559 ,314 ,188 5,324 T.z.0 ,350 ,172 ,367 2,035 ,050 ,826 ,334 ,165 ,202 4,948 CO2.z.0 -,253 ,136 -,244 -1,854 ,073 ,594 -,307 -,150 ,380 2,634 (Constante) ,272 ,103 2,645 ,014 RH.z.1 ,630 ,226 ,613 2,784 ,010 ,871 ,479 ,256 ,174 5,731 T.z.1 ,368 ,236 ,364 1,561 ,131 ,844 ,293 ,144 ,156 6,403 CO2.z.1 -,108 ,151 -,101 -,713 ,482 ,614 -,139 -,066 ,427 2,343 (Constante) ,270 ,094 2,872 ,007 RH.z.2 ,566 ,189 ,565 2,999 ,005 ,871 ,474 ,241 ,182 5,490 T.z.2 ,472 ,192 ,467 2,454 ,020 ,860 ,403 ,197 ,179 5,599 CO2.z.2 -,157 ,124 -,155 -1,270 ,214 ,601 -,222 -,102 ,433 2,310 (Constante) ,252 ,090 2,796 ,009 RH.z.3 ,502 ,171 ,507 2,931 ,006 ,875 ,460 ,226 ,199 5,015 T.z.3 ,489 ,183 ,485 2,669 ,012 ,870 ,427 ,206 ,180 5,541 CO2.z.3 -,097 ,118 -,094 -,826 ,415 ,610 -,145 -,064 ,462 2,166 (Constante) ,192 ,085 2,240 ,032 RH.z.4 ,714 ,182 ,658 3,932 ,000 ,901 ,565 ,282 ,184 5,437 T.z.4 ,342 ,185 ,330 1,842 ,075 ,865 ,305 ,132 ,160 6,238 CO2.z.4 -,093 ,113 -,084 -,827 ,414 ,576 -,143 -,059 ,503 1,987 (Constante) ,192 ,084 2,297 ,028 RH.z.5 ,706 ,187 ,661 3,783 ,001 ,896 ,544 ,278 ,177 5,642 T.z.5 ,309 ,196 ,300 1,579 ,124 ,859 ,261 ,116 ,149 6,694 CO2.z.5 -,062 ,123 -,055 -,504 ,618 ,616 -,086 -,037 ,454 2,204 (Constante) ,220 ,087 2,541 ,016 RH.z.6 ,732 ,197 ,683 3,717 ,001 ,878 ,532 ,290 ,180 5,546 T.z.6 ,301 ,198 ,291 1,518 ,138 ,837 ,249 ,118 ,165 6,051 CO2.z.6 -,119 ,127 -,102 -,937 ,355 ,553 -,156 -,073 ,509 1,966 Ne.3.2 Ne.3.2 Ne.3.2 Ne.3.2 Ne.3.2 Ne.3.2 Ne.3.2 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Estadísticos de colinealidad Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.3.2. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.3.2 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,885 ,783 ,763 ,4909980 ,783 39,700 3 33 ,000 Ne.3.2 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,883 ,780 ,754 ,5101925 ,780 30,687 3 26 ,000 Ne.3.2 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,894 ,800 ,780 ,4946435 ,800 41,285 3 31 ,000 Ne.3.2 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,899 ,809 ,791 ,4894983 ,809 45,155 3 32 ,000 Ne.3.2 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,911 ,830 ,815 ,4599160 ,830 53,763 3 33 ,000 Ne.3.2 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,903 ,816 ,800 ,4728176 ,816 50,317 3 34 ,000 Ne.3.2 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,887 ,787 ,769 ,5139334 ,787 43,112 3 35 ,000 Resumen del modelo Zona Variables predictoras R R2R2 corregida Error típ. de la estimación Estadísticos de cambio Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.3.2. 312 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) ,450 ,069 6,513 ,000 RH.z.0 ,553 ,151 1,083 3,649 ,001 ,206 ,536 ,470 ,188 5,324 T.z.0 -,062 ,138 -,128 -,448 ,657 ,089 -,078 -,058 ,202 4,948 CO2.z.0 -,518 ,110 -,987 -4,726 ,000 -,245 -,635 -,608 ,380 2,634 (Constante) ,357 ,086 4,162 ,000 RH.z.1 ,515 ,188 1,035 2,736 ,011 ,218 ,473 ,432 ,174 5,731 T.z.1 -,174 ,196 -,354 -,885 ,384 ,065 -,171 -,140 ,156 6,403 CO2.z.1 -,359 ,126 -,691 -2,857 ,008 -,214 -,489 -,451 ,427 2,343 (Constante) ,397 ,079 5,051 ,000 RH.z.2 ,426 ,158 ,912 2,697 ,011 ,262 ,436 ,389 ,182 5,490 T.z.2 -,049 ,161 -,104 -,304 ,764 ,154 -,054 -,044 ,179 5,599 CO2.z.2 -,360 ,104 -,762 -3,475 ,002 -,172 -,529 -,501 ,433 2,310 (Constante) ,384 ,076 5,060 ,000 RH.z.3 ,382 ,144 ,851 2,645 ,013 ,304 ,424 ,380 ,199 5,015 T.z.3 -,044 ,155 -,096 -,284 ,778 ,179 -,050 -,041 ,180 5,541 CO2.z.3 -,313 ,099 -,666 -3,151 ,004 -,147 -,487 -,453 ,462 2,166 (Constante) ,348 ,073 4,785 ,000 RH.z.4 ,488 ,154 ,976 3,160 ,003 ,349 ,482 ,418 ,184 5,437 T.z.4 -,102 ,158 -,214 -,648 ,521 ,198 -,112 -,086 ,160 6,238 CO2.z.4 -,342 ,096 -,667 -3,570 ,001 -,184 -,528 -,473 ,503 1,987 (Constante) ,320 ,068 4,685 ,000 RH.z.5 ,540 ,152 1,085 3,547 ,001 ,381 ,520 ,457 ,177 5,642 T.z.5 -,137 ,160 -,286 -,859 ,396 ,215 -,146 -,111 ,149 6,694 CO2.z.5 -,343 ,100 -,654 -3,420 ,002 -,129 -,506 -,440 ,454 2,204 (Constante) ,342 ,061 5,639 ,000 RH.z.6 ,557 ,138 1,123 4,035 ,000 ,399 ,563 ,477 ,180 5,546 T.z.6 -,126 ,139 -,264 -,907 ,371 ,241 -,152 -,107 ,165 6,051 CO2.z.6 -,395 ,089 -,733 -4,426 ,000 -,173 -,599 -,523 ,509 1,966 Ne.7.1 Ne.7.1 Ne.7.1 Ne.7.1 Ne.7.1 Ne.7.1 Ne.7.1 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Estadísticos de colinealidad Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.7.1. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.7.1 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,674 ,454 ,404 ,3947334 ,454 9,134 3 33 ,000 Ne.7.1 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,592 ,351 ,276 ,4250270 ,351 4,683 3 26 ,010 Ne.7.1 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,595 ,354 ,292 ,4140633 ,354 5,671 3 31 ,003 Ne.7.1 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,582 ,339 ,277 ,4125623 ,339 5,477 3 32 ,004 Ne.7.1 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,649 ,421 ,369 ,3910902 ,421 8,004 3 33 ,000 Ne.7.1 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,660 ,436 ,386 ,3857990 ,436 8,769 3 34 ,000 Ne.7.1 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,715 ,511 ,469 ,3605885 ,511 12,201 3 35 ,000 Resumen del modelo Zona Variables predictoras R R2R2 corregida Error típ. de la estimación Estadísticos de cambio Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.7.1. 313 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) ,517 ,064 8,129 ,000 RH.z.0 ,480 ,140 1,088 3,442 ,002 ,147 ,514 ,472 ,188 5,324 T.z.0 -,126 ,127 -,302 -,989 ,330 ,007 -,170 -,136 ,202 4,948 CO2.z.0 -,396 ,101 -,871 -3,915 ,000 -,256 -,563 -,536 ,380 2,634 (Constante) ,439 ,079 5,547 ,000 RH.z.1 ,445 ,174 ,996 2,557 ,017 ,172 ,448 ,416 ,174 5,731 T.z.1 -,175 ,182 -,397 -,964 ,344 ,020 -,186 -,157 ,156 6,403 CO2.z.1 -,301 ,116 -,646 -2,595 ,015 -,230 -,454 -,422 ,427 2,343 (Constante) ,470 ,071 6,575 ,000 RH.z.2 ,385 ,144 ,927 2,678 ,012 ,221 ,433 ,396 ,182 5,490 T.z.2 -,083 ,146 -,199 -,569 ,574 ,103 -,102 -,084 ,179 5,599 CO2.z.2 -,303 ,094 -,722 -3,215 ,003 -,191 -,500 -,475 ,433 2,310 (Constante) ,457 ,068 6,700 ,000 RH.z.3 ,365 ,130 ,916 2,815 ,008 ,265 ,445 ,409 ,199 5,015 T.z.3 -,096 ,139 -,236 -,690 ,495 ,119 -,121 -,100 ,180 5,541 CO2.z.3 -,265 ,089 -,636 -2,976 ,006 -,174 -,466 -,432 ,462 2,166 (Constante) ,415 ,066 6,303 ,000 RH.z.4 ,434 ,140 ,998 3,105 ,004 ,301 ,476 ,428 ,184 5,437 T.z.4 -,138 ,143 -,334 -,970 ,339 ,139 -,167 -,134 ,160 6,238 CO2.z.4 -,271 ,087 -,608 -3,130 ,004 -,195 -,478 -,431 ,503 1,987 (Constante) ,398 ,062 6,437 ,000 RH.z.5 ,466 ,138 1,089 3,379 ,002 ,325 ,501 ,459 ,177 5,642 T.z.5 -,169 ,145 -,410 -1,167 ,251 ,151 -,196 -,158 ,149 6,694 CO2.z.5 -,260 ,091 -,578 -2,868 ,007 -,141 -,441 -,389 ,454 2,204 (Constante) ,423 ,056 7,504 ,000 RH.z.6 ,461 ,128 1,079 3,593 ,001 ,341 ,519 ,458 ,180 5,546 T.z.6 -,134 ,129 -,324 -1,034 ,308 ,183 -,172 -,132 ,165 6,051 CO2.z.6 -,312 ,083 -,671 -3,755 ,001 -,183 -,536 -,479 ,509 1,966 Ne.7.2 Ne.7.2 Ne.7.2 Ne.7.2 Ne.7.2 Ne.7.2 Ne.7.2 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Estadísticos de colinealidad Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.7.2. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.7.2 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,617 ,380 ,324 ,3638425 ,380 6,754 3 33 ,001 Ne.7.2 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,558 ,312 ,232 ,3929091 ,312 3,928 3 26 ,019 Ne.7.2 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,568 ,323 ,257 ,3763673 ,323 4,927 3 31 ,007 Ne.7.2 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,570 ,325 ,261 ,3699494 ,325 5,128 3 32 ,005 Ne.7.2 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,611 ,373 ,316 ,3539169 ,373 6,548 3 33 ,001 Ne.7.2 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,611 ,374 ,318 ,3494596 ,374 6,763 3 34 ,001 Ne.7.2 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,656 ,431 ,382 ,3350761 ,431 8,833 3 35 ,000 Resumen del modelo Zona Variables predictoras R R2R2 corregida Error típ. de la estimación Estadísticos de cambio Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.7.2. 320 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) -,437 ,069 -6,320 ,000 RH.z.0 -,730 ,120 -1,246 -6,077 ,000 -,504 -,722 -,711 ,325 3,074 T.z.0 ,396 ,121 ,665 3,274 ,002 -,071 ,490 ,383 ,331 3,018 CO2.z.0 ,176 ,121 ,295 1,454 ,155 -,156 ,242 ,170 ,332 3,015 (Constante) -,410 ,075 -5,494 ,000 RH.z.1 -,839 ,142 -1,309 -5,899 ,000 -,397 -,727 -,727 ,308 3,243 T.z.1 ,433 ,151 ,704 2,867 ,007 ,018 ,458 ,353 ,252 3,971 CO2.z.1 ,263 ,141 ,440 1,861 ,072 -,005 ,317 ,229 ,271 3,692 (Constante) -,481 ,069 -6,930 ,000 RH.z.2 -,841 ,129 -1,505 -6,504 ,000 -,386 -,755 -,755 ,251 3,979 T.z.2 ,550 ,135 ,972 4,080 ,000 -,009 ,585 ,473 ,237 4,223 CO2.z.2 ,215 ,108 ,384 1,980 ,056 -,007 ,330 ,230 ,358 2,790 (Constante) -,533 ,070 -7,645 ,000 RH.z.3 -,632 ,105 -1,243 -6,019 ,000 -,469 -,723 -,715 ,331 3,019 T.z.3 ,412 ,111 ,749 3,701 ,001 -,024 ,542 ,440 ,345 2,900 CO2.z.3 ,170 ,126 ,259 1,347 ,187 -,119 ,228 ,160 ,383 2,612 (Constante) -,529 ,073 -7,200 ,000 RH.z.4 -,572 ,104 -1,144 -5,488 ,000 -,439 -,691 -,687 ,361 2,772 T.z.4 ,339 ,114 ,622 2,981 ,005 ,002 ,461 ,373 ,360 2,779 CO2.z.4 ,205 ,132 ,321 1,561 ,128 -,066 ,262 ,195 ,371 2,698 (Constante) -,478 ,077 -6,235 ,000 RH.z.5 -,564 ,108 -1,054 -5,230 ,000 -,446 -,673 -,667 ,401 2,495 T.z.5 ,343 ,124 ,604 2,756 ,009 ,014 ,433 ,352 ,339 2,952 CO2.z.5 ,163 ,156 ,229 1,042 ,305 -,071 ,178 ,133 ,337 2,970 (Constante) -,458 ,079 -5,838 ,000 RH.z.6 -,557 ,120 -,966 -4,643 ,000 -,333 -,623 -,614 ,403 2,479 T.z.6 ,470 ,151 ,804 3,110 ,004 ,105 ,471 ,411 ,261 3,828 CO2.z.6 ,023 ,157 ,036 ,149 ,883 ,010 ,026 ,020 ,296 3,383 Ne.11.2 Ne.11.2 Ne.11.2 Ne.11.2 Ne.11.2 Ne.11.2 Ne.11.2 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Estadísticos de colinealidad Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.11.2. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.11.2 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,732 ,535 ,494 ,4197942 ,535 13,050 3 34 Ne.11.2 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,728 ,530 ,484 ,4270787 ,530 11,636 3 31 ,000 Ne.11.2 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,755 ,569 ,529 ,4073980 ,569 14,104 3 32 ,000 Ne.11.2 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,731 ,534 ,492 ,4201358 ,534 12,611 3 33 ,000 Ne.11.2 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,695 ,482 ,435 ,4428391 ,482 10,252 3 33 ,000 Ne.11.2 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,680 ,463 ,414 ,4512102 ,463 9,471 3 33 ,000 Ne.11.2 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,637 ,406 ,354 ,4713225 ,406 7,757 3 34 ,000 Resumen del modelo Zona Variables predictoras R R2R2 corregida Error típ. de la estimación Estadísticos de cambio Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.11.2. 321 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) -,129 ,161 -,802 ,428 RH.z.0 -,411 ,360 -,395 -1,141 ,262 ,198 -,195 -,171 ,187 5,360 T.z.0 ,052 ,326 ,053 ,160 ,874 ,227 ,028 ,024 ,206 4,852 CO2.z.0 ,785 ,256 ,718 3,062 ,004 ,456 ,470 ,458 ,407 2,458 (Constante) -,045 ,184 -,245 ,808 RH.z.1 -,224 ,421 -,207 -,532 ,599 ,317 -,100 -,085 ,166 6,024 T.z.1 ,091 ,418 ,087 ,218 ,829 ,353 ,041 ,035 ,158 6,310 CO2.z.1 ,700 ,272 ,617 2,576 ,016 ,531 ,438 ,410 ,441 2,266 (Constante) -,056 ,172 -,324 ,748 RH.z.2 -,242 ,359 -,242 -,674 ,505 ,270 -,117 -,101 ,174 5,732 T.z.2 ,064 ,352 ,064 ,181 ,858 ,294 ,031 ,027 ,180 5,563 CO2.z.2 ,638 ,229 ,623 2,780 ,009 ,492 ,436 ,416 ,447 2,239 (Constante) -,063 ,169 -,371 ,713 RH.z.3 -,219 ,330 -,227 -,664 ,511 ,233 -,113 -,100 ,193 5,170 T.z.3 ,059 ,342 ,061 ,173 ,864 ,276 ,030 ,026 ,181 5,513 CO2.z.3 ,587 ,223 ,580 2,630 ,013 ,465 ,411 ,395 ,464 2,154 (Constante) -,037 ,181 -,203 ,841 RH.z.4 -,339 ,387 -,313 -,876 ,387 ,186 -,147 -,133 ,181 5,517 T.z.4 ,201 ,391 ,197 ,514 ,611 ,260 ,086 ,078 ,157 6,353 CO2.z.4 ,527 ,241 ,481 2,190 ,035 ,413 ,347 ,333 ,479 2,086 (Constante) ,033 ,174 ,190 ,850 RH.z.5 -,406 ,390 -,379 -1,041 ,305 ,172 -,171 -,158 ,175 5,726 T.z.5 ,284 ,405 ,278 ,700 ,489 ,256 ,116 ,106 ,147 6,817 CO2.z.5 ,479 ,259 ,429 1,853 ,072 ,374 ,295 ,282 ,432 2,313 (Constante) -,016 ,160 -,100 ,921 RH.z.6 -,283 ,367 -,270 -,773 ,445 ,210 -,126 -,113 ,176 5,667 T.z.6 ,145 ,361 ,144 ,401 ,690 ,261 ,066 ,059 ,166 6,017 CO2.z.6 ,574 ,230 ,516 2,491 ,017 ,435 ,379 ,365 ,501 1,996 Ne.12.1 Ne.12.1 Ne.12.1 Ne.12.1 Ne.12.1 Ne.12.1 Ne.12.1 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Estadísticos de colinealidad Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.12.1. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.12.1 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,511 ,261 ,194 ,9340301 ,261 3,895 3 33 ,017 Ne.12.1 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,541 ,292 ,216 ,9619077 ,292 3,854 3 28 ,020 Ne.12.1 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,510 ,260 ,193 ,9468811 ,260 3,867 3 33 ,018 Ne.12.1 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,483 ,233 ,166 ,9497541 ,233 3,448 3 34 ,027 Ne.12.1 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,438 ,192 ,122 ,9951584 ,192 2,766 3 35 ,056 Ne.12.1 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,408 ,167 ,097 1,0036708 ,167 2,400 3 36 ,084 Ne.12.1 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,453 ,205 ,141 ,9682107 ,205 3,185 3 37 ,035 Resumen del modelo Zona Variables predictoras R R2R2 corregida Error típ. de la estimación Estadísticos de cambio Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.12.1. 322 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) -,129 ,147 -,874 ,388 RH.z.0 -,190 ,329 -,231 -,576 ,569 -,011 -,100 -,100 ,187 5,360 T.z.0 ,131 ,298 ,167 ,439 ,664 ,031 ,076 ,076 ,206 4,852 CO2.z.0 ,081 ,234 ,094 ,345 ,732 ,041 ,060 ,060 ,407 2,458 (Constante) -,010 ,166 -,061 ,952 RH.z.1 -,260 ,381 -,312 -,682 ,501 ,031 -,128 -,127 ,166 6,024 T.z.1 ,310 ,378 ,384 ,819 ,420 ,094 ,153 ,153 ,158 6,310 CO2.z.1 -,007 ,246 -,008 -,027 ,979 ,050 -,005 -,005 ,441 2,266 (Constante) -,025 ,149 -,169 ,866 RH.z.2 -,223 ,312 -,293 -,713 ,481 -,053 -,123 -,122 ,174 5,732 T.z.2 ,272 ,306 ,360 ,889 ,380 ,013 ,153 ,153 ,180 5,563 CO2.z.2 -,089 ,199 -,115 -,448 ,657 -,070 -,078 -,077 ,447 2,239 (Constante) -,032 ,145 -,220 ,827 RH.z.3 -,247 ,281 -,336 -,877 ,387 -,078 -,149 -,148 ,193 5,170 T.z.3 ,290 ,292 ,393 ,994 ,327 -,004 ,168 ,167 ,181 5,513 CO2.z.3 -,104 ,190 -,134 -,544 ,590 -,086 -,093 -,092 ,464 2,154 (Constante) -,016 ,146 -,110 ,913 RH.z.4 -,447 ,312 -,551 -1,433 ,161 -,097 -,235 -,235 ,181 5,517 T.z.4 ,442 ,315 ,579 1,403 ,169 ,005 ,231 ,230 ,157 6,353 CO2.z.4 -,086 ,194 -,105 -,445 ,659 -,056 -,075 -,073 ,479 2,086 (Constante) -,068 ,140 -,484 ,632 RH.z.5 -,367 ,313 -,458 -1,171 ,249 -,047 -,191 -,191 ,175 5,726 T.z.5 ,372 ,326 ,488 1,144 ,260 ,037 ,187 ,187 ,147 6,817 CO2.z.5 -,039 ,208 -,046 -,187 ,853 ,002 -,031 -,031 ,432 2,313 (Constante) -,109 ,133 -,821 ,417 RH.z.6 -,158 ,306 -,201 -,516 ,609 ,026 -,084 -,084 ,176 5,667 T.z.6 ,198 ,301 ,264 ,659 ,514 ,070 ,108 ,108 ,166 6,017 CO2.z.6 -,015 ,192 -,018 -,077 ,939 ,031 -,013 -,013 ,501 1,996 Ne.12.2 Ne.12.2 Ne.12.2 Ne.12.2 Ne.12.2 Ne.12.2 Ne.12.2 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Estadísticos de colinealidad Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.12.2. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.12.2 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,108 ,012 -,078 ,8536169 ,012 ,129 3 33 ,942 Ne.12.2 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,161 ,026 -,079 ,8705010 ,026 ,248 3 28 ,862 Ne.12.2 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,168 ,028 -,060 ,8232305 ,028 ,319 3 33 ,812 Ne.12.2 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,190 ,036 -,049 ,8100758 ,036 ,423 3 34 ,738 Ne.12.2 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,250 ,062 -,018 ,8024284 ,062 ,777 3 35 ,515 Ne.12.2 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,199 ,039 -,041 ,8067210 ,039 ,493 3 36 ,689 Ne.12.2 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,112 ,013 -,067 ,8074943 ,013 ,157 3 37 ,924 Resumen del modelo Zona Variables predictoras R R2R2 corregida Error típ. de la estimación Estadísticos de cambio Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.12.2. 323 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) -,024 ,180 -,134 ,894 RH.z.0 ,293 ,287 ,253 1,022 ,315 -,017 ,181 ,176 ,486 2,058 T.z.0 -,288 ,310 -,253 -,931 ,359 -,213 -,165 -,161 ,402 2,487 CO2.z.0 -,160 ,301 -,157 -,533 ,598 -,173 -,095 -,092 ,341 2,931 (Constante) -,072 ,191 -,379 ,707 RH.z.1 ,229 ,323 ,197 ,708 ,484 -,048 ,130 ,128 ,427 2,345 T.z.1 -,133 ,365 -,120 -,365 ,718 -,157 -,068 -,066 ,304 3,289 CO2.z.1 -,222 ,342 -,218 -,650 ,521 -,173 -,120 -,118 ,292 3,423 (Constante) ,009 ,186 ,046 ,964 RH.z.2 ,151 ,327 ,132 ,462 ,648 -,060 ,084 ,083 ,392 2,552 T.z.2 -,315 ,354 -,284 -,891 ,380 -,171 -,160 -,159 ,315 3,174 CO2.z.2 ,020 ,318 ,020 ,062 ,951 -,109 ,011 ,011 ,295 3,387 (Constante) -,020 ,175 -,113 ,910 RH.z.3 ,328 ,250 ,315 1,310 ,200 -,012 ,229 ,222 ,498 2,007 T.z.3 -,194 ,293 -,174 -,661 ,513 -,214 -,118 -,112 ,416 2,401 CO2.z.3 -,352 ,316 -,316 -1,114 ,274 -,229 -,196 -,189 ,358 2,791 (Constante) -,056 ,178 -,317 ,753 RH.z.4 ,450 ,288 ,417 1,564 ,128 -,015 ,270 ,263 ,396 2,522 T.z.4 -,085 ,302 -,075 -,281 ,781 -,213 -,050 -,047 ,392 2,552 CO2.z.4 -,546 ,373 -,498 -1,461 ,154 -,233 -,254 -,245 ,243 4,117 (Constante) -,235 ,189 -1,248 ,222 RH.z.5 ,587 ,272 ,525 2,158 ,039 -,005 ,361 ,343 ,427 2,342 T.z.5 ,206 ,317 ,179 ,649 ,521 -,191 ,116 ,103 ,333 3,003 CO2.z.5 -1,079 ,427 -,844 -2,529 ,017 -,301 -,414 -,402 ,226 4,417 (Constante) -,178 ,174 -1,021 ,315 RH.z.6 ,387 ,255 ,336 1,517 ,139 -,061 ,259 ,237 ,500 2,002 T.z.6 ,330 ,350 ,287 ,944 ,352 -,206 ,165 ,148 ,265 3,773 CO2.z.6 -,952 ,368 -,834 -2,586 ,014 -,354 -,416 -,405 ,235 4,249 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Estadísticos de colinealidad Ne.13.1 Ne.13.1 Ne.13.1 Ne.13.1 Ne.13.1 Ne.13.1 Ne.13.1 Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.13.1. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.13.1 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,277 ,077 -,012 1,0493609 ,077 ,860 3 31 ,472 Ne.13.1 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,217 ,047 -,051 1,0549180 ,047 ,478 3 29 ,700 Ne.13.1 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,196 ,038 -,058 1,0612982 ,038 ,400 3 30 ,754 Ne.13.1 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,326 ,106 ,020 1,0059377 ,106 1,227 3 31 ,316 Ne.13.1 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,355 ,126 ,041 ,9948814 ,126 1,485 3 31 ,238 Ne.13.1 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,466 ,217 ,142 ,9411929 ,217 2,872 3 31 ,052 Ne.13.1 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,465 ,216 ,143 ,9494087 ,216 2,939 3 32 ,048 Resumen del modelo Zona Variables predictoras R R2R2 corregida Error típ. de la estimación Estadísticos de cambio Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.13.1. 324 Coeficientes tipificados B Error típ. Beta Orden cero Parcial Semiparcial Tolerancia FIV (Constante) ,009 ,179 ,048 ,962 RH.z.0 ,165 ,285 ,144 ,580 ,566 -,038 ,104 ,101 ,486 2,058 T.z.0 -,412 ,308 -,366 -1,337 ,191 -,222 -,234 -,232 ,402 2,487 CO2.z.0 ,070 ,299 ,070 ,234 ,816 -,108 ,042 ,041 ,341 2,931 (Constante) -,054 ,193 -,278 ,783 RH.z.1 ,136 ,327 ,116 ,416 ,681 -,091 ,077 ,075 ,427 2,345 T.z.1 -,276 ,369 -,246 -,749 ,460 -,198 -,138 -,136 ,304 3,289 CO2.z.1 -,043 ,346 -,042 -,124 ,902 -,159 -,023 -,023 ,292 3,423 (Constante) ,008 ,186 ,043 ,966 RH.z.2 ,101 ,328 ,088 ,309 ,759 -,111 ,056 ,055 ,392 2,552 T.z.2 -,304 ,354 -,272 -,858 ,398 -,209 -,155 -,153 ,315 3,174 CO2.z.2 -,001 ,318 -,001 -,002 ,998 -,154 ,000 ,000 ,295 3,387 (Constante) -,017 ,178 -,093 ,927 RH.z.3 ,189 ,255 ,180 ,739 ,465 -,097 ,132 ,127 ,498 2,007 T.z.3 -,202 ,299 -,180 -,677 ,504 -,247 -,121 -,116 ,416 2,401 CO2.z.3 -,269 ,322 -,239 -,834 ,411 -,250 -,148 -,143 ,358 2,791 (Constante) -,046 ,183 -,250 ,804 RH.z.4 ,269 ,296 ,247 ,909 ,370 -,102 ,161 ,155 ,396 2,522 T.z.4 -,088 ,310 -,077 -,283 ,779 -,233 -,051 -,048 ,392 2,552 CO2.z.4 -,431 ,384 -,390 -1,123 ,270 -,258 -,198 -,192 ,243 4,117 (Constante) -,202 ,196 -1,028 ,312 RH.z.5 ,426 ,283 ,377 1,506 ,142 -,082 ,261 ,246 ,427 2,342 T.z.5 ,186 ,329 ,160 ,564 ,577 -,210 ,101 ,092 ,333 3,003 CO2.z.5 -,948 ,444 -,735 -2,137 ,041 -,319 -,358 -,350 ,226 4,417 (Constante) -,143 ,180 -,793 ,434 RH.z.6 ,263 ,264 ,229 ,997 ,326 -,100 ,174 ,162 ,500 2,002 T.z.6 ,289 ,361 ,252 ,800 ,430 -,201 ,140 ,130 ,265 3,773 CO2.z.6 -,802 ,380 -,705 -2,108 ,043 -,329 -,349 -,342 ,235 4,249 Ne.13.2 Ne.13.2 Ne.13.2 Ne.13.2 Ne.13.2 Ne.13.2 Ne.13.2 Coeficientes Zona Coeficientes no estandarizados t Sig. Correlaciones Estadísticos de colinealidad Descriptivos de las variables que integran los modelos propuestos para la zona Ne.13.2. Cambio R2Cambio en F gl1 gl2 Sig. Cambio en F Ne.13.2 (Constante), CO2.z.0, T.z.0, RH.z.0 ,261 ,068 -,022 1,0445025 ,068 ,754 3 31 ,528 Ne.13.2 (Constante), CO2.z.1, T.z.1, RH.z.1 ,212 ,045 -,054 1,0665112 ,045 ,454 3 29 ,716 Ne.13.2 (Constante), CO2.z.2, T.z.2, RH.z.2 ,217 ,047 -,048 1,0623259 ,047 ,495 3 30 ,689 Ne.13.2 (Constante), CO2.z.3, T.z.3, RH.z.3 ,294 ,087 -,002 1,0264582 ,087 ,981 3 31 ,414 Ne.13.2 (Constante), CO2.z.4, T.z.4, RH.z.4 ,306 ,093 ,006 1,0226392 ,093 1,066 3 31 ,378 Ne.13.2 (Constante), CO2.z.5, T.z.5, RH.z.5 ,412 ,170 ,090 ,9784995 ,170 2,117 3 31 ,118 Ne.13.2 (Constante), CO2.z.6, T.z.6, RH.z.6 ,398 ,159 ,080 ,9811647 ,159 2,012 3 32 ,132 Zona Variables predictoras R R2R2 corregida Error típ. de la estimación Estadísticos de cambio Resumen del modelo Significación de los modelos y bondad de ajuste de los mismos para la zona Ne.13.2. 325 ANEXO 3 Análisis microscopía Raman El análisis de microscopía Raman fue realizado por la Unitat Raman de los Centres Científics i Tecnològics Universitat de Barcelona (UB). Este análisis empleó para la descripción de la capa de sustrato negra observada bajo el biofilm fotosintético de la zona Ne.1 Conclusiones del estudio: 1. Las regiones negras/oscuras presentan unos espectros típicos del carbono amorfo tipo black carbon. 2. Esas regiones muestran también la banda típica del fosfato correspondiente a la hidroxiapatita. 3. Las zonas menos oscuras o blancas indican muy poco carbono amorfo o en algunos casos nada. Pero se puede a veces detectar en estas regiones la banda de la hidroxiapatita en cantidad menor que en las zonas oscuras. 4. La zona 08 no presenta bandas correspondiendo al carbono amorfo y tampoco a la hidroxiapatita. 5. La zona 09 no presenta bandas correspondiendo al carbono amorfo. A potencia muy alta, se puede detectar un poco de hidroxiapatita. 326 Espectros originales nerja1-02: 400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600 1 800 2 000 2 200 2 400 2 600 2 800 Raman intensity 200 400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600 1 800 Raman Shift (cm-1) nerja1-02-x100-0,5mW nerja1-02-x100-1,5mW nerja1-02-x100-2,5mW nerja1-02-x100-6mW nerja1-02b-x100-1,5mW -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 Y (µm) -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 X (µm) 2 µm Espectros corregidos nerja1-02: 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Raman intensity 200 400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600 1 800 Raman Shift (cm -1 ) nerja1-02-x100-0,5mW nerja1-02-x100-1,5mW nerja1-02-x100-2,5mW nerja1-02-x100-6mW 1595.9 428.6 957.3 1347.6 327 Espectros originales nerja1-03: 500 1 000 1 500 2 000 2 500 3 000 3 500 Raman intensity 200 400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600 1 800 Raman Shift (cm-1) nerja1-03-x100-0,5mW nerja1-03-x100-1,5mW nerja1-03-x100-2,5mW nerja1-03-x100-6mW Espectros corregidos nerja1-03 (baseline sustraction): 0 50 100 150 200 250 300 350 Raman intensity 200 400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600 1 800 Raman Shift (cm -1 ) nerja1-03-x100-0,5mW nerja1-03-x100-1,5mW nerja1-03-x100-2,5mW nerja1-03-x100-6mW 328 Espectros originales nerja1-04: 500 1 000 1 500 2 000 2 500 3 000 3 500 Raman intensity 200 400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600 1 800 Raman Shift (cm-1) nerja1-04-x100-1,5mW nerja1-04-x100-2,5mW nerja1-04-x100-6mW Espectros corregidos nerja1-04 (baseline sustraction): 300 400 500 600 700 800 900 1 000 1 100 1 200 Raman intensity (a.u.) 200 400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600 1 800 Raman Shift (cm -1 ) nerja1-04-x100-1,5mW nerja1-04-x100-2,5mW nerja1-04-x100-6mW 329 Espectros originales nerja1-05: 300 400 500 600 700 800 900 1 000 1 100 1 200 1 300 1 400 1 500 1 600 Raman intensity 200 400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600 1 800 Raman Shift (cm-1) nerja1-05-x100-0,5mW nerja1-05-x100-1,5mW nerja1-05-x100-2,5mW -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 Y (µm) -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 X (µm) 2 µm Espectros corregidos nerja1-04 (baseline sustraction): 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 Raman intensity (a.u.) 200 400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600 1 800 Raman Shift (cm -1 ) nerja1-05-x100-0,5mW nerja1-05-x100-1,5mW nerja1-05-x100-2,5mW 336