Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del sur de España

Departamento de Bioquímica, Biología Molecular e Inmunología Facultad de Medicina IMPLICACIÓN DE PERFILES INMUNO-GENÉTICOS DE LA RESPUESTA INMUNE CITOTÓXICA EN LA SUSCEPTIBILIDAD Y/O EVOLUCIÓN DE PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA DEL SUR DE ESPAÑA GEMA GEMA DURÁN OGALLA Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TESIS DOCTORAL IMPLICACIÓN DE PERFILES INMUNO-GENÉTICOS DE LA RESPUESTA INMUNE CITOTÓXICA EN LA SUSCEPTIBILIDAD Y/O EVOLUCIÓN DE PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA DEL SUR DE ESPAÑA Gema Durán Ogalla Málaga, año 2016 AUTOR: Gema Durán Ogalla http://orcid.org/0000-0003-0745-047X EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España A mi marido, a mis padres y a mis hermanas Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España AGRADECIMIENTOS No hubiera imaginado hace unos meses que llegaría este momento. Una travesía que comenzó hace un par de años, y que como en las grandes batallas que han surcado nuestros mares, ha pasado por momentos de gloria y otros cercanos a la derrota, casi de estar a la deriva, de no encontrar el faro que la guíe, pero que finalmente ha llegado a su puerto, a su destino, y todo ello gracias a la ayuda de una magnífica “tripulación” de viaje. A mis directores de tesis, los doctores Manuel Benavides Orgaz y Rocío Lavado Valenzuela, por haber confiado en mí para este proyecto, por la ayuda prestada no sólo en conocimientos científicos, también en lo personal y humano, por animarme en los momentos difíciles y felicitarme las victorias. A mi tutor, el Dr. Abelardo Caballero González, por hacerme comprender y recordar el maravilloso mundo de la inmunología y darle una visión clínica y actual a este proyecto. A mi amiga y gran profesional Marta Gómez Torres, que además de organizar y ocuparse de la extracción de muestras para esta tesis, me ha acompañado en esas largas tardes completando la base de datos. Al Dr. José Manuel Jerez Aragonés, profesor de la ETSI Informática de la Universidad de Málaga, por su buena disposición y su valiosa aportación en el análisis cluster de este proyecto. A mis compañeros del servicio de Oncología, que me han acompañado en el camino, compartiendo su tiempo y opiniones, escuchando mis dudas y quejas. A los pacientes con cáncer de mama que han donado desinteresadamente muestras para este proyecto y que constituyen el objetivo final de este trabajo. Al Hospital Regional Universitario Carlos Haya, especialmente a la Sección de Oncología Médica y al Servicio de Inmunología, y a la fundación IMABIS, por haber puesto a mi disposición todos los recursos necesarios para que pudiera desarrollar satisfactoriamente esta tesis doctoral. Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España A mis amigos, compañeros inseparables, aquellos que siempre han estado ahí, a pesar de mis escasas salidas, de no estar en sus celebraciones, de perderme momentos irrepetibles, y sin embargo no han dejado de arroparme, de animarme y acompañarme en este viaje, a todos ellos muchas gracias. A mi familia, por el cariño, la comprensión y el apoyo que me han brindado toda la vida, que ha hecho posible que llegue a ser lo que soy, en especial a mis padres y hermanas. Y como no a mi marido, el timón de esta travesía, que me ha hecho llevar a “buen puerto” este proyecto. A él le debo que esta tesis vea la luz, por animarme en los momentos donde yo he querido bajarme del barco y por llevarme de la mano y acompañarme en el viaje. Y sé que este viaje no es el último, me espera el más importante, el de ser madre. A ella, que aun sin conocerla ya me ha robado el corazón y se ha convertido en el centro de mi vida. Gracias Valeria por compartir este momento con nosotros. Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN 1 1. Epidemiología y etiopatogenia del cáncer de mama en España. 3 2. Cáncer de mama y subtipos moleculares. 6 3. Inmunología tumoral. 7 3.1. Introducción. 7 3.2. Teoría de la inmunovigilancia. 8 3.3. Eliminación tumoral. 11 3.4. Escultura inmunológica e immunoediting. 14 3.5. Inmunovigilancia/immunoediting en humanos. 17 4. Moléculas implicadas en la respuesta inmune: Complejo Mayor de Histocompatibilidad y receptores NKG2D y CTLA-4. 19 4.1. Un poco de historia. 19 4.2. Genética del Complejo Mayor de Histocompatibilidad. 20 4.3. Antígenos HLA clase I y II. 21 4.3.1. Estructura. 21 4.3.2. Polimorfismo del sistema HLA clase I y II. 23 4.3.3. Funciones de las moléculas HLA clase I y II. 24 4.3.4. Asociación HLA y enfermedad. 26 4.4. Familia de genes MIC. 27 4.4.1. Estructura de los genes MICA. 28 4.4.2. Polimorfismos de MICA. 29 4.4.3. Función biológica de MICA. 30 4.4.4. Mica en la inmunología tumoral. 32 4.5. Moléculas LMP y TAP. Procesamiento antigénico. 32 4.5.1. Procesamiento y presentación por MHC clase I: implicación de LMP y TAP. 33 4.5.1.1. Proteosomas y generación de péptidos. 34 4.5.1.2. Transporte peptídico y ensamblaje dentro del retículo endoplásmico. 36 4.6. Otras moléculas relacionadas con el sistema inmune y el MHC: NKG2D y CTLA-4. 39 4.6.1. El receptor NKG2D. 39 4.6.1.1. NKG2D e inmunidad antitumoral. 40 4.6.1.2. Mecanismos de escape que involucran al sistema NKG2DNKG2DL. 42 4.6.2. El receptor CTLA-4. 43 5. Sistema inmune y cáncer de mama. 46 4 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España En España, como en casi todos los países desarrollados, el CM representa la neoplasia más frecuente en la mujer y la primera causa de muerte por cáncer en la población femenina, sobre todo en mujeres entre 35 y 45 años, con más de 25000 casos nuevos anuales (29%) y 6000 defunciones (15,5%). La mayoría de los casos se diagnostican entre los 45 y 65 años. La probabilidad de desarrollar un CM a lo largo de la vida se encuentra entre el 8-10% (es decir, que una de cada 10-12 mujeres españolas va a desarrollar un CM) (SEOM 2014). Aun así, la incidencia y mortalidad del CM en España se encuentra entre las más bajas a nivel de Europa. Igualmente, la supervivencia para este tumor, está por encima de la media Europea, con una tasa de supervivencia a los 5 años superior al 83% (siendo la media Europea entre 76-80%) (De Angelis R et al., 2014). La etiopatogenia del CM es desconocida y probablemente multifactorial. Entre los factores de riesgo clásicos destacan (Senkus E et al., 2013; Madigan MP et al., 1995): - Edad y género: es un tumor 100 veces más frecuente en mujeres que en hombres y aumenta exponencialmente con la edad hasta los 50 años. - Historia personal de CM: haber padecido un CM aumenta el riesgo de desarrollo de la mama contralateral (1% al año en mujeres premenopáusicas y del 0,5% al año para posmenopáusicas). Las lesiones no proliferativas (cambios fibroquísticos, papilomas, fibroadenomas) no están asociadas con un aumento del riesgo de CM. Este riesgo sí está aumentado en las lesiones proliferativas, ligeramente (RR 1,3-2) en las que no presentan atipia (fibroadenoma complejo, hiperplasia, papilomas intraductales) y más evidente (RR 4-6) en lesiones con atipia (hiperplasia lobulillar o ductal con atipia), siendo todavía mayor si son lesiones multifocales. - Historia familiar y factores genéticos: solo entre un 15-20% de los casos tienen historia familiar. Tener un familiar de primer grado con CM duplica el riesgo. Se estima que el 5-10% de los casos se deben a mutaciones en la línea germinal de los genes BRCA1 y BRCA2. Ambos son genes supresores de tumores localizados en los cromosomas 17 y 13 respectivamente, de herencia autosómica dominante. En estos casos, hablamos de CM hereditario. Generalmente se reconocen por aparecer a edades muy tempranas y/o estar asociados a antecedentes familiares muy importantes. Otros genes de alta penetrancia que suponen mayor riesgo son p53 (síndrome de Li-Fraumeni), PTEN (síndrome de Cowden) y STK1 (síndrome de Peutz-Jeghers) entre otros. No obstante, la mayoría de los CM se desarrollan en mujeres sin antecedentes familiares y se consideran por ello esporádicos. - Factores dietéticos y estilo de vida: las diferencias geográficas en la incidencia del CM están en probable relación con la dieta y el estilo de vida. El sobrepeso parece aumentar el riesgo de CM en mujeres posmenopáusicas, sin embargo, en mujeres premenopáusicas parece tener un efecto contrario, siendo menor el riesgo de CM en 5 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España mujeres con un índice de masa corporal (IMC) mayor o igual a 31 kg/m2. La actividad física parece aportar un modesto efecto protector. Entre los factores dietéticos cabe destacar el aumento de riesgo de CM con sobreexpresión de receptores hormonales asociado al consumo de alcohol, así como el posible aumento de riesgo relacionado con el consumo de grasas. - Factores hormonales: la relación entre niveles estrogénicos y el desarrollo de CM está claramente establecida. La exposición prolongada a alta concentración de estrógenos aumenta el riesgo de CM. Se consideran factores de riesgo: menarquia precoz (antes de los 12 años), menopausia tardía, nuliparidad, tratamiento hormonal sustitutivo. Entre los factores protectores podemos destacar: lactancia materna y primer parto a edad temprana (Stuebe AM et al., 2009). El riesgo asociado al uso de anticonceptivos es todavía controvertido. - Factores ambientales y ocupacionales: las radiaciones ionizantes, fundamentalmente en la infancia y la adolescencia, son factores de riesgo para el desarrollo de CM. En cuanto a los factores ocupacionales, se ha encontrado asociación entre ciertas profesiones–sanitarios, farmacéuticos, profesores, telefonía y radio, industria químicay el CM, aunque es difícil separar la profesión de los hábitos de vida y el nivel social. - Bifosfonatos: varios estudios han demostrado un papel protector de los bifosfonatos orales (Goss PE et al., 2011). Debido a que la densidad ósea baja se relaciona con un menor riesgo de CM, no está claro si el efecto protector de los bifosfonatos es real o existe un factor de confusión relacionado con la densidad ósea. Los factores de riesgo clásicos explican menos del 50% de los casos observados, siendo además la mayoría de ellos no modificables. Por otra parte, el control de los modificables no produciría una franca y significativa disminución de su incidencia, por lo que por ahora no existe una clara posibilidad de evitar su aparición (Madigan MP et al., 1995). Por el contrario, la detección precoz ha demostrado ser un método eficaz para disminuir la mortalidad. A pesar de ciertas controversias, los resultados de los estudios realizados hasta el momento son consistentes. De la mayoría de ellos se concluye que la realización de mamografías periódicas conduce a una disminución del riesgo de morir por CM (Hakama M et al., 2008; Shopper D y de Wolf C, 2009; Gabe R y Duffy SW, 2005). Sobre esta base, existe un consenso generalizado en la conveniencia de la puesta en marcha de programas de cribado de carácter poblacional. Entre otros organismos, la Unión Europea, en el año 2003, estableció sus recomendaciones de cribado poblacional de cáncer, incluyendo entre ellos el de CM mediante mamografía bienal en las mujeres de 50 a 69 años. Prácticamente todos los países europeos, aun con modelos organizativos diferentes, han puesto en marcha programas de cribado. En España, la Estrategia en Cáncer del Sistema Nacional de Salud del año 2009 también recomienda la realización de este cribado 6 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España estableciendo los criterios mínimos para su puesta en marcha y desarrollo (Ministerio de Sanidad y Política Social, 2010). En este momento, todas las mujeres españolas entre 50 y 69 años tienen acceso a un programa de cribado de CM. Hace ya más de 20 años, con el inicio en España de los primeros programas, se constituyó la Red de Programas de Cribado de Cáncer (inicialmente de CM), que ha permitido, además de compartir información y experiencias en este campo, la coordinación entre todas las Comunidades Autónomas a fin de consensuar las bases para su puesta en marcha, desarrollo y evaluación conjunta (Ascunce N et al., 2013). 2. Cáncer de mama y subtipos moleculares. El CM se considera una enfermedad heterogénea, debido al amplio espectro de características clínicas, patológicas y moleculares en su forma de presentación. Existen dos grandes grupos histológicos: el carcinoma ductal infiltrante (CDI), que representa el subtipo más frecuente de CM, seguido por el carcinoma lobulillar infiltrante (CLI) (entre un 10-15% de los casos). Diversos estudios, con resultados consistentes, muestran diferencias en cuanto al perfil molecular y supervivencia de estos dos grandes grupos histológicos de CM, de tal manera, que el CLI tiene un patrón de crecimiento diferente, con tendencia a mayor tamaño, con frecuencia receptores de estrógenos negativos (RE-) y receptores de progesterona positivos (RP+) y menos agresivos que su homólogo el CDI. Sin embargo, clásicamente, estos dos tipos de CM se han tratado de forma similar en cuanto a la terapia sistémica adyuvante, de acuerdo al tamaño tumoral, grado histológico, estatus hormonal y estatus Her2 (Jemal A et al., 2011). Más recientemente, estudios de perfiles de expresión génica han identificado diferentes subtipos moleculares de CM, que se correlacionan con salidas diferentes en cuanto a respuesta de tratamiento sistémico y pronóstico. Esta clasificación molecular propone 4 tipos de CM (Perou CM et al., 2000; Sorlie T et al., 2001): - Luminal A: tumores que se caracterizan por expresión de receptores de estrógneos (RE) y progesterona (RP) (> 20%), Her2 negativo, Ki67 bajo (< 14%), score bajo de riesgo de recurrencia en test genéticos. - Luminal B (her2 negativo): tumores que se caracterizan por expresión de RE y Her2 negativo y al menos uno de :  Ki 67 alto.  RP negativo o bajo.  Riesgo de recurrencia alto en test genéticos. 7 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España - Luminal B (her2 positivo): tumores que se caracterizan por expresión de RE, Her2 sobreexpresado o amplificado, cualquier valor de Ki67 y cualquier nivel de expresión de RP. - Cerb2: Her2 sobreexpresado y amplificado. Receptores hormonales (RH) negativos. - Basal like: Triple negativo, RH negativos, Her2 negativo. Hoy se sabe que el subtipo molecular está relacionado con el pronóstico de la enfermedad y supervivencia, de tal manera que aquellos tumores con un fenotipo molecular Luminial A son los que se relacionan con una mayor supervivencia. FIGURA 2: Supervivencia libre de enfermedad (SLE) según subtipo molecular en pacientes sin afectación ganglionar y quimioterapia adyuvante (Parker J et al., 2009). Actualmente, esta clasificación molecular del CM forma parte de la práctica clínica habitual, y es decisiva en la evaluación pronóstica de la enfermedad, así como en la elección del tratamiento sistémico. De acuerdo con las guías clínicas de St. Gallen 2013, la decisión sobre el tratamiento sistémico adyuvante debería de basarse en el fenotipo intrínseco determinado por RE/RP, Her2 y ki67, con la ayuda de test genéticos, siempre que sea posible (Mamma Print, Oncotype DX), sobre todo para tumores luminales, donde no esté claro el uso de la quimioterapia (Senkus E et al., 2013). 3. Inmunología tumoral. 3.1. Introducción. El sistema inmunológico es una extraordinaria maquinaria implicada en el mantenimiento de la integridad del organismo y en la regulación de su propia función, para adaptar sus estrategias de reconocimiento molecular en un contexto dinámico. Estas 8 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España estrategias son moduladas por la naturaleza del estímulo antigénico, el estado interno de sus componentes y el microambiente local, que determinarán una respuesta de tolerancia o inmunidad efectora. La generación de una respuesta inmunológica eficiente frente a antígenos extraños, debe acompañarse necesariamente de una regulación rigurosa de la activación inmunológica para prevenir daños colaterales. Se sabe, que una de las funciones más importantes del sistema inmunológico es conferir protección frente a patógenos externos como virus, bacterias y parásitos. Sin embargo, ha sido un tema muy debatido si la prevención del cáncer es una función primaria del sistema inmune. El cáncer es una enfermedad que se inicia debido a una acumulación de cambios genéticos y epigenéticos que ocurren en una célula normal, alterando su crecimiento y supervivencia. Además se considera una enfermedad de “microambiente e inmunidad”. Es decir, multitud de señales son emitidas dentro del microambiente tumoral tanto por células estromales y endoteliales como por células neoplásicas, interaccionando entre ellas. Y células del sistema inmune son decisivas en determinar la progresión versus la latencia, o bien la eliminación de la lesión neoplásica iniciada. 3.2. Teoría de la Inmunovigilancia. Paul Ehrlich (Ehrlich P, 1909) fue uno de los primeros en introducir el concepto de inmunovigilancia al plantear la idea de que el sistema inmune podría ejercer un efecto represor sobre la formación de tumores. De manera llamativa, al mismo tiempo (1891) Willian B Coley hizo la sorprendente observación de que en algunos pacientes con cáncer que desarrollaban infecciones bacterianas, también experimentaban una regresión de su tumor. Posteriormente, Coley realizó un experimento usando cultivos bacterianos inactivados por el calor que inoculaba en pacientes con cáncer y enfermedad avanzada, experimentando algunos pacientes una marcada reducción tumoral, prolongando la supervivencia después del tratamiento. Las toxinas de Coley (Coley WB, 1991), como las conocemos actualmente, son productos bacterianos con un fuerte potencial inmunogénico. Finalmente, el concepto de vigilancia inmune contra el cáncer, no fue ampliamente estudiado hasta después de los años 40 (1950s) con los trabajos de Medawar y colaboradores, los cuales mostraron la existencia de antígenos tumorales en sus estudios de trasplantes de tejidos (Medawar P, 1944). Los primeros experimentos con cepas no emparentadas de ratón apuntaban a que el sistema inmune era capaz de reconocer y destruir tumores trasplantados entre ellas, pero al introducir cepas singénicas se observó, que el mecanismo desarrollado era de rechazo a un tejido no emparentado, en vez de rechazar el tejido tumoral. Sin embargo, posteriormente, se demostró que los ratones podrían estar inmunizados contra trasplantes singénicos de tumores inducidos por carcinógenos químicos, virus o por otras causas, estableciéndose la existencia de antígenos tumorales específicos, lo que supuso un empuje decisivo para la hipótesis de la inmunovigilancia, ya que claramente no podría haber 9 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España inmunovigilancia tumoral si no hubiera estructuras distintivas en las células tumorales que pudieran ser reconocidas por el sistema inmunológico (Klein G, 1966; Old LJ and Boyse EA, 1964). Las células del sistema inmune serían así capaces de detectar la presencia y reconocer estructuras específicas de la superficie celular tumoral, o bien responder ante moléculas solubles secretadas por el propio tumor. En base a este mayor conocimiento de la inmunología tumoral, Burnet y Thomas sugirieron que los linfocitos eran los responsables de reconocer y eliminar las células transformadas, y que por lo tanto, la principal función de la inmunidad celular era proteger al organismo de enfermedades neoplásicas, quedando así formalmente postulada la “teoría de la inmunovigilancia tumoral” (Burnet FM, 1964, 1970, 1971; Thomas L, 1959, 1982). Tras la aparición de la teoría de la inmunovigilancia se desarrollaron diferentes experimentos encaminados a probar si individuos inmunocomprometidos mostrarían un incremento en la incidencia de tumores espontáneos o inducidos químicamente. Algunos grupos trabajaron con ratones a los que sometían a una timectomía neonatal como mecanismo para inducir inmunosupresión, pero los resultados no eran consistentes (Burstein NA y Law LW, 1971; Grant GA y Miller JF, 1965; Nomoto K y Takeya K, 1969; Sanford BH et al., 1973). Por una parte, estos ratones inmunodeprimidos experimentaban una mayor susceptibilidad a tumores inducidos por virus y linfomas espontáneos comparados con ratones inmunocompetentes. Pero, por otro lado, esa mayor prevalencia de neoplasias que se veía, podría ser explicada por el resultado de una mayor susceptibilidad del huésped imunocomprometido a infecciones por virus oncogénicos y la estimulación antigénica mantenida por un estado de infección crónica daría lugar a un incremento en la proliferación de linfocitos, mutaciones somáticas y por último la formación de linfomas. La identificación y caracterización de ratones nude atímicos permitió estudiar la formación del tumor en un huésped con un daño inmunológico genético (Flanagan SP, 1996; Pantelouris EM, 1968). El trabajo de Osias Stutman (Stutman O, 1974, 1975, 1979) representó uno de los más importantes y extensos estudios en este tipo de ratones y permitió analizar si la inmunovigilancia tenía lugar en un entorno fisiológico. Stutman encontró que la cepa de ratones nude CBA/H no desarrollaba más tumores inducidos químicamente, ni presentaba un menor tiempo de latencia tras la inyección del carcinógeno metilcolantreno (MCA) en comparación con las cepas salvajes, confirmándose este hecho también por otros investigadores (Rygaard J y Povlsen CO, 1974a, 1974b). Dado que los resultados obtenidos utilizando ratones nude fueron más concluyentes que los que aportaron los trabajos realizados con ratones inmunodeprimidos experimentalmente, unido al limitado conocimiento de los defectos inmunológicos de los ratones nude en ese tiempo, estos resultados fueron muy convincentes, lo que hizo que se abandonara la hipótesis de la inmunovigilancia. 10 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España Retrospectivamente se sabe, en referencia a esos experimentos, que existen algunos puntos controvertidos, como por ejemplo, el conocimiento actual de que los ratones nude no están totalmente inmunocomprometidos. Aunque dichos ratones poseen menos células T que los ratones salvajes, presentan poblaciones de linfocitos portadores de receptores para células Tαβ funcionales (Meleckar JR y Sherman LA, 1987; Hunig T, 1983). Por tanto, no es posible predecir el efecto de estas células T sobre la formación del tumor cuando se comparan con los controles salvajes. Entre mediados de la década de los 70 y 90, se hicieron varios experimentos en un intento de retomar el concepto de la inmunovigilancia. El descubrimiento de las células Natural Killer (NK) llevó a considerar la posibilidad de que este tipo de células funcionaban como efectoras de la imnunovigilancia, aunque no se llegó a tener un entendimiento preciso de las mismas (Herberman RB y Holden HT, 1978). Entre 1994 y 1998, dos hallazgos claves renovaron el interés en el proceso de la inmunovigilancia en cáncer. El primero de ellos, el conocimiento de que la producción endógena de interferón gamma (INF γ) protegía al huésped contra el crecimiento de tumores trasplantados y la formación de tumores espontáneos o químicamente inducidos (Dighe AS et al., 1994; Kaplan DH et al., 1998). La segunda de las claves provino de la observación de que la cepa de ratones C57BL/6 que perdían porfirina (componente de los gránulos citolíticos de linfocitos T citotóxicos y células NK que actúa como importante mediador en la eliminación de células tumorales linfocito-dependiente) era más propensa a desarrollar tumores inducidos por el carcinógeno metilcolantreno (MCA) y presentaba una mayor incidencia de linfomas espontáneos diseminados que los ratones salvajes (Street SE et al., 2001; Van der Broek MF et al., 1996; Smyth MJ et al., 2000; Russel JH y Ley TJ, 2002; Street SE et al., 2002). Estas observaciones mostraron que los componentes del sistema inmune estaban implicados en el control del desarrollo de tumores primarios. Sin embargo, a pesar de la fuerte evidencia de la existencia por parte del sistema inmune, de una función de inmunovigilancia frente a tumores, es conocido que individuos inmunocompetentes desarrollan neoplasias, siendo algunas de ellas refractarias a los tratamientos. Esta realidad clínica puede ser explicada por un fallo inicial, en la respuesta innata y adaptativa, por parte del huésped, para erradicar las células transformadas. Ese fallo, junto con la estimulación mantenida del sistema inmune favorece el crecimiento de tumores con una reducida inmunogenicidad. El término de cáncer immunoediting enfatiza el papel dual que ejerce el sistema inmune tanto en la eliminación como en la formación de la neoplasia durante los periodos de equilibrio y escape (Dunn GP et al., 2002, 2004a, 2004b; Shankaran V et al., 2001). 11 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España FIGURA 3: Las tres fases del proceso de Cancer Immunoediting (Dunn GP et al., 2004a). Cancer immunoediting es un proceso dinámico compuesto de tres fases: eliminación, equilibrio y escape. La fase de eliminación representa el concepto clásico de la inmunovigilancia frente al cáncer. Equilibrio es el periodo de latencia mediado por el sistema inmune después de una destrucción incompleta del tumor en la fase de eliminación. Y por último, la fase de escape se refiere al crecimiento final del tumor que ha escapado al control inmunológico en la fase de equilibrio. 3.3. Eliminación tumoral. La fase de eliminación comprende el concepto original de inmunovigilancia del cáncer. Representa la forma más completa del proceso conocido como immunoediting sin llegar a progresar a sus otras dos fases. Representa una forma de “supresión extrínseca” del tumor por parte del sistema inmune, solo después de que las células transformadas hayan burlado sus propios mecanismos “intrínsecos” de control (Macleod K, 2000). No obstante, desencadenantes, como por ejemplo una infección por un virus potencialmente oncogénico, pueden estimular la inmunidad, al mismo tiempo, junto con la activación de los mecanismos de supresión tumoral “intrínsecos”. El rechazo inmunológico sobre el desarrollo de un tumor, así como la defensa del huésped de patógenos infecciosos, requiere una respuesta integrada que envuelve a ambos brazos del sistema inmune (las respuestas innata y adaptativa). (Figura 4a). 12 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España FIGURA 4: Cancer Immunoediting (Dunn GP et al., 2002). Se propone, que el inicio de la respuesta anti-tumoral ocurre, cuando células del sistema inmune innato llegan a alertarse de la presencia del crecimiento de un tumor, debido al daño que se produce sobre el tejido local, como resultado de mecanismos como la angiogénesis e invasión tisular (Carmeliet P y Jain RK, 2000; Hanahan D y Folkman J, 1996; Hanahan D y Weinberg RA, 2000; Sternlich MD y Werb Z, 2001). La remodelación que tiene lugar en el estroma tisular durante este proceso, daría lugar a moléculas pro-inflamatorias, que junto con quimocinas producidas por las propias células tumorales (Vicari AP y Caux C, 2002), atraerían a células de la respuesta inmune innata hacia ese punto de daño local (Matzinger P, 1994). Consistente con este “modelo de daño tisular”, es posible que las células dendríticas (CDs) actúen como centinelas que monitorizan el estrés tisular, el daño, o la transformación celular. Y que esas “señales de daño” puedan tomar la forma de proteínas de “choque caliente”(heat-schokHSPs), (liberadas como resultado del daño producido por células tumorales o necrosis), productos de degradación de la matriz extracelular o factores proinflamatorios (incluyendo citoquinas liberadas por degradación de células tumorales y células reactivas de la respuesta innata del huésped). Algunas de esas citoquinas (por ejemplo interleuquina 1 (IL-1), factor de necrosis tumoral α (FNTα), interferón tipo I (INF-tipo I), factor estimulante de macrófagos (GM-CSF) e interleuquina 15 (IL-15)), pueden promover la 13 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España diferenciación de las células dendríticas y activarlas por diferentes mecanismos, favoreciendo por tanto la interacción entre células dendríticas, células NK y células T. Las células NK, los macrófagos, las células Tγδ+ y/o las células T NK pueden ser reclutadas rápidamente al lugar de daño tisular y reconocer moléculas inducidas por las propias células tumorales, en su proceso de transformación, o bien por la incipiente respuesta inflamatoria, así como ligandos de estrés a través de los receptores NKG2D. (Figura 4b). Además, las células T y células T NK son capaces de detectar el desarrollo incipiente tumoral, vía interacción receptor de célula T (TCR) con compuestos peptídicos asociados al tumor presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), o bien compuestos glico-lipídicos expresados en células tumorales, presentados por CD1 (molécula presentadora de antígenos no clásica), respectivamente (Smyth MJ et al., 2002). Estas células del sistema inmune del huésped, podrían entonces emplear mecanismos citotóxicos efectores encaminados a eliminar las células transformadas y secretar interferón que controlaría el crecimiento tumoral y amplificaría la respuesta inmune por diferentes mecanismos. Se sabe que el interferón γ (IFN-γ) que es liberado inicialmente en el sitio del tumor, es capaz de inducir la producción local de citoquinas que reclutarían más células del sistema inmune innato hacia el tumor. Adicionalmente se llevan a cabo un número de procesos que son dependientes del IFN-γ, incluyendo entre ellos efectos anti-proliferativos (Bromberg JF et al., 1996), proapoptóticos (Kumar A et al., 1997), y angiostáticos, dando lugar por otro lado, a la muerte de células tumorales (Coughlin C et al., 1998; Luster AD y Leder P, 1993; Qin Z y Blankenstein T, 2000). De manera similar, los productos resultantes de la degradación de la matriz celular donde asienta el tumor, pueden producir un circuito de feedback entre la infiltración del tumor por macrófagos (IL-12) y células NK (IFN-γ) (Hodge-Dufour J et al., 1997; Bancroft GJ et al., 1991). En la siguiente fase, antígenos tumorales que son liberados por una gran variedad de células muertas junto con el entorno de señales propiciado por la respuesta inmune innata favorecen el desarrollo de una respuesta inmune adaptativa específica tumoral (Figura 4c). Las CD inmaduras que fueron reclutadas inicialmente al lugar del tumor, sufren una activación, o bien por exposición a citoquinas liberadas durante la respuesta inmune innata, o bien por interacción con células NK existentes en el infiltrado tumoral Gerosa F et al., 2002). Estas CD activadas son capaces de reconocer antígenos tumorales, bien directamente por ingestión de restos de células tumorales que han sufrido apoptosis, o bien vía indirecta mediante transferencia de compuestos de células tumorales como resultado de unión de proteínas de choque con antígenos tumorales (Li Z et al., 2002; Srivastana P, 2002). Una vez activadas, pueden adquirir un fenotipo maduro y en respuesta a quimocinas y/o citoquinas, migrar a los ganglios linfáticos donde inducen la activación de células T CD4+ Th1 específicos para el tumor. Las células Th1 facilitan el desarrollo de linfocitos T CD8+ específicos del tumor, a través de la vía de presentación antigénica de péptidos tumorales por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I en células dendríticas (Huang AY et al., 1994). En algunos casos, los péptidos derivados de antígenos tumorales, son presentados directamente a células 20 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España de los Workshop Internacionales de Histocompatibilidad que desde 1964 se celebran periódicamente. 4.2. Genética del complejo mayor de histocompatibilidad. Las moléculas HLA están codificadas por genes localizados dentro del MHC. Estudios citogenéticos han mapeado la región del MHC humano en la porción distal de la banda p21.3 del brazo corto del cromosoma 6, abarcando unas 4000 kilobases (kb) (4x 10 6 nucleótidos) (Breuning MH et al., 1977). Es una zona genómica compleja que contiene al menos 50 genes distintos ordenados en tres regiones: clase I, clase II y clase III. Estos genes son polimórficos, presentan una localización cercana, y en general se heredan en bloque en forma de haplotipo, de acuerdo con las leyes de Medel como caracteres codominantes simples. La región de clase I codifica las moléculas HLA-A, B y C y se caracteriza por un alto grado de polimorfismo en la mayoría de las especies de vertebrados. Existen otros genes de clase I humanos que presentan una secuencia homóloga con las moléculas clásicas de clase I, conocidos como genes “no clásicos”. Incluyen las moléculas HLA-E, F, G, H y un grupo de cinco genes MIC (MIC A, B, C, D y E). Estos últimos muestran un menor grado de polimorfismo y únicamente MIC A y MIC B, situados entre el Factor de Necrosis Tumoral (TNF) y el locus HLAB, se expresan. La región de clase II comprende unas 1000-1200 kb y se divide en seis subregiones denominadas DR, DQ, DP, DO, DN y DM. En esta región también se encuentran dos grupos de genes no-HLA. El primero de ellos está formado por los genes ABC transportadores de péptidos antigénicos, denominados genes TAP1 y TAP2 (Spies T et al., 1989) cuyos productos se asocian en forma de heterodímeros, el cual está implicado en el transporte de los péptidos antigénicos desde el citoplasma hasta el lumen del retículo endoplásmico. El segundo grupo está formado por los genes LMP2 y LMP7 (Monaco JJ y McDevitt HO, 1986) que están relacionados con el proteosoma y contienen múltiples centros catalíticos. La región de clase III comprende unos 680 kb, ocupa la porción central del MHC y no tiene correlación estructural ni funcional con las regiones de Clase I y II. Incluye genes que codifican proteínas implicadas en el sistema inmune tales como los genes del complemento C4, C2 y Factor B, los genes TNFα y TNFβ y los genes HSP70. También aparecen en esta región genes que no tienen asociación con el sistema inmune. Por último aquí se localizan los genes BAT2 (G2) y BAT3 (G3) asociados a células B. 21 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España FIGURA 5: MHC en el brazo corto del cromosoma 6. Este grupo de genes se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel como caracteres codominantes simples. La región genética de un cromosoma que contiene todos los genes HLA (salvo los que codifican la β2-microglobulina) se denomina haplotipo HLA. 4.3. Antígenos HLA de clase I y II. 4.3.1. Estructura. En euterios, la región clase I contiene un conjunto de genes metópicos cuya presencia y orden está conservada entre especies. Estas moléculas se expresan en todas las células humanas, excepto en los glóbulos rojos, las células germinales, las células de embriones preimplantación y el sincitiotrofoblasto (Comiskey M et al., 2000). Algunas células, como las neuronas, los monocitos y los hepatocitos, presentan niveles bajos de moléculas MHC-I (menos de 10 3 por célula) (Abbas AB y Lichtman AH, 2009). Los genes MHC clase I (MHC-I) codifican glucoproteínas, con estructura de inmunoglobulina: presenta una cadena pesada tipo α que se subdivide en tres regiones: α1, α2 y α3. Estas tres regiones están expuestas al espacio extracelular y están unidas a la membrana de la célula mediante una región transmembrana. La cadena α está siempre asociada a una molécula de microglobulina β2 que está codificada por una región independiente en el cromosoma 15. 22 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España FIGURA 6: Estructura de una molécula MHC de clase I. La principal función de los productos génicos de la Clase I es la presentación de péptidos antigénicos intracelulares a los linfocitos T citotóxicos (CD8+). El péptido antigénico se aloja en una hendidura que se forma entre las regiones α1 y α2 de la cadena pesada, mientras el reconocimiento del MHC-I por parte del linfocito T citotóxico se hace en la cadena α3. En esta hendidura conformada por las regiones α1 y α2, se presentan péptidos entre 8 y 11 aminoácidos, razón por la cual la presentación del péptido antigénico debe pasar por un proceso de fragmentación dentro de la propia célula que lo expresa. Los genes MHC clase II (MHC-II) codifican glucoproteínas con estructura de inmunoglobulina, pero en este caso el complejo funcional está formado por dos cadenas, una α y una β (cada una de ellas con dos dominios, α1, α2, β1 y β2). Cada una de las cadenas está unida a la membrana por una región transmembrana, y ambas cadenas están enfrentadas, con los dominios 1 y 2 contiguos, en el exterior celular (Abbas Ab y Lichtman AH, 2009). FIGURA 7: Estructura de una molécula MHC de clase II. Estas moléculas se expresan sobre todo en las células presentadoras de antígeno (dendríticas y fagocíticas, así como los linfocitos B), donde presentan péptidos antigénicos extracelulares procesados a los linfocitos T cooperadores (CD4+). El péptido antigénico se aloja 23 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España en una hendidura formada por los dominios α1 y β1, mientras el reconocimiento del MHC-II por parte del linfocito T cooperador se hace en la cadena β2. En esta hendidura conformada por las regiones α1 y β1, se presentan péptidos de entre 12 y 16 aminoácidos. FIGURA 7: Representación estructural de las moléculas HLA clase I y II. 4.3.2. Polimorfismo del sistema HLA clase I y II. Los genes MHC se expresan de forma codominante. Esto quiere decir que los alelos (variantes) heredados de ambos progenitores se expresan de forma equivalente. - Como existen tres genes Clase I, denominados en humanos HLA-A, HLA-B y HLA-C, y cada persona hereda un juego de cada progenitor, cualquier célula de un individuo podrá expresar seis tipos diferentes de moléculas MHC-I. - En el locus de Clase II, cada individuo hereda un par de genes HLA-DP (DPA1 y DPA2, que codifican las cadenas α y β), un par de genes HLA-DQ (DQA1 y DQA2, para las cadenas α y β), un gen HLA-DRα (DRA1) y uno o dos genes HLA-DRβ (DRB1 y DRB3, -4 o -5). Así, un individuo heterocigoto puede heredar seis u ocho alelos de clase II, tres o cuatro de cada progenitor. El juego de alelos presente en cada cromosoma se denomina haplotio MHC. En humanos, cada alelo HLA recibe un número. Por ejemplo, para un individuo dado, su haplotipo puede ser HLA-A2, HLA-B5, HLA-DR3, etc. Cada individuo heterocigoto tendrá dos haplotipos MHC, uno en cada cromosoma (uno de origen paterno y otro de origen materno). Los genes MHC son enormemente polimórficos, lo que significa que existen muchos alelos diferentes en los diferentes individuos de la población. El polimorfismo es tan grande que en una población mixta (no endogámica) no existen dos individuos que tengan exactamente el mismo juego de genes y moléculas MHC, excepto los gemelos idénticos. 24 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España Las regiones polimórficas de cada alelo se encuentran en la zona de contacto con el péptido que va a presentar al linfocito. Por esta razón, la zona de contacto de cada alelo de molécula MHC es muy variable, ya que los residuos polimórficos del MHC forman hendiduras específicas en las que sólo pueden introducirse cierto tipo de residuo del péptido, lo cual impone un modo de unión muy preciso entre el péptido y la molécula MHC. Esto implica que cada variante de molécula MHC podrá unir específicamente solo aquellos péptidos que encajen adecuadamente en la hendidura de la molécula MHC, que es variable para cada alelo. De esta manera, las moléculas de MHC tienen una especificidad amplia para la unión de péptidos, puesto que cada molécula de MHC puede unir muchos, pero no todos los tios de péptidos posibles. Esta es una característica esencial de las moléculas MHC: en un individuo concreto, bastan unas pocas moléculas diferentes para poder presentar una vasta variedad de péptidos. Por otro lado, dentro de una población, la existencia de múltiples alelos asegura que siempre habrá algún individuo que posea una molécula MHC capaz de cargar el péptido adecuado para reconocer un patógeno concreto. La evolución del polimorfismo de MHC asegura que una población será capaz de defenderse frente a la enorme diversidad de patógenos existentes, y que no sucumbirá ante la presencia de un nuevo patógeno o un patógeno mutado, porque al menos algunos individuos serán capaces de desarrollar una respuesta inmune adecuada para vencer al patógeno. Las variaciones en las secuencias de MHC (responsables del polimorfismo) resultan de la herencia de diferentes moléculas MHC, y no son inducidas por recombinación, como ocurre con los receptores de los antígenos. 4.3.3. Funciones de las moléculas HLA clase I y II. Ambos tipos de moléculas presentan antígenos a los linfocitos T, responsables de la respuesta inmune específica para eliminar el patógeno que a su vez es el orgien de la producción de dichos antígenos. Sin embargo, las moléculas HLA de clase I y II corresponden a dos vías diferentes de procesamiento de los antígenos y se asocian con dos sitemas diferentes de defensa inmunitaria. Los linfocitos T de un individuo concreto presentan una propiedad denominada restricción MHC: sólo pueden detectar un antígeno si éste viene presentado por una molécular MHC del mismo individuo. Esto se debe a que cada linfocito T tiene una especificidad dual: el receptor del linfocito T (denominado TCR por T cell recptor) reconoce algunos residuos del péptido y simultáneamente algunos residuos de la molécular MHC que lo presenta. Esta propiedad es muy importante en el trasplante de órganos, e implica que, durante su desarrollo, los linfocitos T deben “aprender” a reconocer las moléculas MHC propias del individuo, mediante el proceso complejo de maduración y selección que tiene lugar en el timo. Las moléculas MHC sólo pueden presentar péptidos, lo que implica que los linfocitos T, dado que sólo pueden reconocer un antígeno si viene asociado a una molécula MHC, sólo 25 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España puden reaccionar ante antígenos de origen proteico (procedentes de patógenos) y no a otro tipo de compuestos químicos (ni lípidos, ni ácidos nucleicos, ni azúcares). En cambio, la molécula CD1 de estructura similar a las MHC-I ( tres cadenas α y una β2-microglobulina) presenta antígenos no peptídicos, generalmente lípidos a linfocitos T. Cada molécula MHC puede presentar un único péptido cada vez, dado que la hendidura de la molécula sólo tiene un espacio para alojar un péptido. Sin embargo, una molécula MHC dada tiene una especificidad amplia, porque puede presentar muchos péptidos diferentes (aunque no todos). Las moléculas MHC adquieren péptidos que presentan en el exterior de la membrana celular durante su propia biosíntesis, en el interior celular. Por tanto, los péptidos que presentan las moléculas MHC provienen de patógenos que están en el interior celular, y ésta es la razón por la cual los linfocitos T, que sólo identifican péptidos cuando están asociados a moléculas MHC, solo detectan patógenos asociados a células y desencadenan una respuesta inmune contra patógenos intracelulares. Es importante resaltar que las moléculas HLA-I adquieren péptidos que provienen de proteíans citosólicas, mientras que las moléculas HLA-II adquieren péptidos de proteínas contenidas en vesículas intracelulares. Por ello, las moléculas HLA-I presentarán péptidos propios, péptidos procedentes de patógenos ingeridos en fagosomas. Las moléculas HLA-II, por su parte, presentarán péptidos procedentes de patógenos ingeridos en vesículas (éste tipo de moléculas sólo se expresan en células con capacidad fagocítica). Las moléculas MHC sólo se expresan de forma estable en la membrana celular si tienen un péptido cargado: la presencia del péptido estabiliza la estructura de las moléculas MHC, las moléculas “vacías” se degradan en el interior celular. Las moléculas MHC cargadas con un péptido permanecen en la membrana durante días, el tiempo suficiente para asegurar que un linfocito T adecuado reconozca el complejo e inicie la respuesta inmunitaria. FIGURA 9: Procesamiento de péptidos asociados a moléculas MHC-I: proteínas presentes en el citosol son degradadas por el proteosoma, y los péptidos resultantes son internalizados por el canal TAP en el retículo 26 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España endoplásmico, donde se asocian con las moléculas recién sintetizadas de MHC-I. Los complejos péptido-MHC-I pasan al aparato de Golgi, donde son glucosilados, y de ahí a las vesículas secretoras, que se fusionan con la membrana celular, de forma que los complejos quedan expuestos hacia el exterior, permitiendo el contacto con los linfocitos T circulantes. En cada individuo, las moléculas HLA pueden presentar tanto péptidos extraños (procedentes de patógenos) como péptidos procedentes de proteínas propias del individuo. Esto implica, que en un momento dado, sólo una pequeña proporción de las moléculas HLA de una célula presentarán un péptido extraño: la mayor parte de los péptidos serán propios, dando que son más abundantes. Sin embargo, los linfocitos T son capaces de detectar un péptido presentado por sólo el 0,1-1% de las moléculas HLA para iniciar una respuesta inmune. Los péptidos propios, por otro lado, no pueden iniciar una respuesta inmune (excepto en los casos de las enfermedades autoinmunes), porque los linfocitos T específicos para los antígenos propios son destruidos o inactivados en el timo. Sin embargo, la presencia de péptidos propios asociados a las moléculas HLA es esencial para la función supervisora de los linfocitos T: estas células están constantemente patrullando el organismo, verificando la presencia de péptidos propios asociados a las moléculas HLA y desencadenando una respuesta inmune en los casos raros en los que detectan un péptido extraño. 4.3.4. Asociación HLA y enfermedad. El conocimiento actual de la estructura y función biológica de las moléculas HLA proporciona la basa para tratar de comprender los mecanismos de uno de los principales enigmas de la biología y la medicina moderna, que consiste en la asociación entre ciertos componentes del sistema HLA y la susceptibilidad o resistencia a determinadas enfermedades (Dausset J, 1981). Actualmente se conocen cientos de enfermedades, la mayoría de ellas infecciosas o autoinmunes, asociadas con uno o más genes clásicos y no clásicos de la región MHC (Brewerton DA et al., 1973; Schlösstein L et al., 1973; Contu L et al., 1998; Ma JJ et al., 1998; Noble JA et al., 2008). Una gran parte de estas asociaciones se producen con respecto a los antígenos clásicos HLA clase I y clase II, debido principalmente a su mejor caracterización y por las ventajas técnicas de identificación. 27 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 2: ENFERMEDADES Y HLA. Enfermedades Alelos HLA Artritis reumatoide Diabetes mellitus insulino-dependiente Esclerosis múltiple Pénfigo vulgar Lupus eritematoso sistémico Miastenia gravis Enfermedad de Grave Hepatitis crónica autoinmune Soriasis Espondiloartropatía DR4 DR3, DQ3.2 DR2 DR4, DR6 DR2, DR3 DR3 DR3 DR3, DQ2 Cw6 B27 Respecto a HLA y cáncer, se han llevado a cabo diversos estudios de asociación en humanos, que han arrojado resultados muy variables en función principalmente de la localización geográfica del estudio. Muchos de estos trabajos sobre polimorfismo de los antígenos de histocompatibilidad y su asociación con enfermedades neoplásicas se han llevado a cabo en cáncer cervical. En tres de estos estudios se encontró asociación entre el alelo DQB1 *06 y aumento del riesgo a padecer la enfermedad (Ghaderi M et al., 2000, 2002; Dehaghani AS et al., 2002), aunque estos resultados no se han confirmado en trabajos realizados en otras áreas geográficas (Hamsiková E et al., 1999; Wu Y et al., 2007; Madeleine MM et al., 2002). Este mismo patrón de resultados se ha observado en otros tipos tumorales, como cáncer colorrectal (de Jong MM et al., 2005; Chatzipetrou MA et al., 1999; Lee JE et al., 1996) y cáncer de mama, donde los resultados publicados vuelven a ser dispares dependiendo fundamentalmente de la procedencia geográfica del grupo de estudio (Chaudhuri S et al., 2000; Subirá ML et al., 1979; Lindenberg P et al., 1986; Goepel JR et al., 1991; Gourley C et al., 2003). 4.4. Familia de genes MIC. El descubrimiento de esta familia se debe a dos grupos de trabajo distintos; uno encabezado por Bahram en 1994 (Bahram S et al., 1994), quien le da el nombre de genes MHC class I (Chain-related genes MIC), por otro lado Leelayuwat y su grupo de investigadores, que también en 1994 descubren esta familia de genes, pero ellos les dieron el nombre de PERB (Leelayuwat C et al., 1994). 28 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España Posteriormente por convención internacional se acuerda nombrarlos de manera genérica genes MIC, aunque es importante señalar, que este acrónimo no define por completo la funcionalidad de esta familia de genes, ya que no son moléculas presentadoras de antígeno, su expresión está restringida a ciertos tejidos y no son inducidas por las mismas moléculas que para las moléculas clásicas del MHC (Mendoza Rincon FJ, 2007). Esta familia se compone de dos genes (MICA y MICB) y 4 pseudogenes, cuya ubicación se muestra esquemáticamente en la siguiente figura. FIGURA 10: Ubicación de los genes de la familia MIC en la región de clase I del HLA. Se muestran los genes para las moléculas de clase I HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F y HLA-G, así como los dos genes (MICA y MICB) y cuatro pseudogenes (MICC, MICD, MICE y MICF) de la familia MIC. 4.4.1. Estructura de los genes MIC. Los genes MICA y MICB están localizados a 46,4 y 141,2 kb respectivamente del centrómero en dirección al locus del HLA-B en el cromosoma 6. Son inusualmente largos comparados con los genes del HLA, que tienen una longitud promedio de 3,5 kpb. Sin embargo, la estructura genómica general semeja aquella de los genes de clase I del MHC, donde distintos dominios están codificados por distintos exones (Barclay An, 1999). MICA posee un primer intron muy largo, donde existen sitios de unión para factores de transcripción como NF-KB (Molinero LL et al., 2004). El gen de MICA codifica para un RNAm de 1382 nucleótidos (nt) que contiene un marco de lectura abierta de 1149 nt, originando un polipéptido de 383 aminoácidos (aa) con un peso molecular de 43 kDa (Bahram S et al., 1994). Esta longitud varía de acuerdo al número de repeticiones de alanina del segmento transmembrana de diferentes alelos. El gen de MICB genera un transcrito de 2376 nt y un marco de lectura abierto de la misma longitud que MICA, con quien comparte un 83% de similitud de secuencia aminoacídica. La homología entre MICA y otros genes del HLA de clase I es muy baja, siendo del 15 al 21 % en el dominio α1, 19% al 30 % en el dominio α2 y 32 al 60 % en el dominio α3. Esta baja homología entre miembros de la familia de genes MIC y los genes de clase I del HLA es reflejo de una diversificación muy temprana en la evolución. El polipéptido de MICA neosintetizado de 383 aa, contiene un péptido líder para traslocación al retículo endoplásmico, tres dominios extracelulares α1, α2 y α3, un segmento 29 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España hidrofóbico de transmembrana y una cola citoplasmática relativamente corta. En células epiteliales polarizadas se observa que la cola citoplasmática dirige a esta molécula a la superficie basocelular (Suemizu HM et al., 2002). El dominio α3 carece de la secuencia de unión al correceptor CD8. La presencia de 8 sitios de N-glicosilación en MICA y 5 en MICB, contrasta con el único sitio de glucosilación de las moléculas clásicas de clase I, el que a su vez está ausente en MICA y MICB. La proteína MICA nativa está altamente glicosilada, lo que incrementa su peso molecular de 43 (péptido desnudo) a 65 KDa (proteína madura). Además, no requiere de β2-microglobulina ni del procesamiento antigénico o de las proteínas TAP para su expresión en superficie (Groh V et al., 1998; Zwirner NW et al., 1998). La estructura cristalina de MICA ha revelado algunas características inusuales para una molécula codificada en el MHC de clase I (Li P et al., 1999). Se confirmó que MICA no está asociada a la β2-microglobulina y se observó que la posible hendidura de enlace del péptido es demasiado estrecha para acomodar un ligando, lo que sugiere que MICA no es una molécula presentadora de antígenos. FIGURA 11: Estructura cristalográfica de MICA: a) La estructura de los dominios α1, α2 y α3 responden a la estructura general de las moléculas de clase I del MHC, pero b) la hendidura formada por los dominios α1 y α2 es demasiado estrecha para contener un péptido, comparado con la molécula clásica HLA-B27. 4.4.2. Polimorfismo de MICA. Al igual que los genes de clase I HLA, MICA y MICB son polimórficos y se expresan de forma codominante (Moliner LL et al., 2002), conociéndose hasta la fecha más de 60 alelos de MICA y 30 alelos de MICB. La mayoría de los sitios polimórficos varían en posiciones nucleotídicas no redundantes, con predominancia en los dominios α2 y α3. Una lista actualizada de los alelos de MICA y MICB se encuentra en el sitio de internet de la agrupación inglesa The Anthony Nolan Trust (http://www.anthonynolan.org.uk/HIG/index.htlm). La gran divergencia entre MICA y MICB reside dentro de los respectivos exones del segmento transmembrana. A diferencia de MICB, MICA posee variaciones en el número de repeticiones de la secuencia en tándem GCT, que codifica para diferente número de alaninas (Mizuki N et al., 1997). Basado en el número de estas repeticiones, los alelos se denominan A4, 36 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España encontró una tercera subunidad proteosómica inducida por el IFNγ, denominada MECL-1 (LMP10), la cual reemplaza a la subunidad Z. La localización de estas subunidades en la región cromosómica de clase II y su inducción por el IFNγ hizo pensar que podrían jugar un papel en la presentación del antígeno. Se ha sugerido que este cambio en los componentes del proteosoma incrementaba la variedad de péptidos que podrían ser producidos dentro de una célula (Nandi De et al., 1996). Esto se confirmó realizando experimentos en animales que carecían de subunidades LMP para ver su implicación en la presentación de antígenos. Los ratones que carecen de LMP7 muestran una expresión reducida de MHC de clase I. Igualmente los ratones que carecen de LMP2 son menos eficientes en la presentación de un antígeno del virus de la gripe (influenza) y muestran una respuesta citotóxica pobre frente a este antígeno in vivo, aunque sí expresan niveles normales de las moléculas de clase I del MHC. Parece ser que estas subunidades del proteosoma no son esenciales para el proceso de la presentación del antígeno por clase I, aunque sí lo incrementan (York IA et al., 1999). 4.5.1.2. Transporte peptídico y ensamblaje dentro del retículo endoplásmico. a) El transportador TAP. TAP es una proteína heterodímera formada por dos subunidades TAP1 y TAP2, cuyos genes codificantes se encuentran en la región cromosómica del MHC de clase II (Monaco JJ, 1992). Cada subunidad TAP tiene una región hidrofóbica N-terminal y un dominio de unión a ATP C-terminal citosólico. TAP1 y TAP2 pertenecen a la superfamilia de transportadores ABC, formada por proteínas de membrana transportadoras de diversas moléculas cuya función es dependiente de ATP. Todas las proteínas ABC contienen el motivo Walker A GX4BX[ST], el motivo Walker B [RK]X3GX3L[hidrofobico]3 y el motivo Walker C [LIVMFY]S[SG]GX3[RKA][LIVMYA]x[LIVFM][AG] (Walker LE y Reisfeld RA, ). A partir de los análisis de hidrofobicidad y de los alineamientos de secuencia con otros transportadores ABC relacionados, se dedujo el modelo básico de la proteína TAP. Su estructura está formada por seis dominios transmembrana más tres o cuatro hélices adicionales predecidas para las diferentes regiones amino-terminales. Los dominios transmembrana se encuentran unidos a los dominios de unión a nucleótidos, que a su vez contienen los motivos Walker A y B, localizados en el citosol y necesarios para la unión e hidrólisis de la molécula ATP. El dominio C interacciona directamente con el último loop citosólico (E) de los dominios transmembrana (Lankat-Buttgereit B y Tampé R, 1994). 37 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España FIGURA 16: Estructura del transportador TAP. El dominio N-terminal de TAP1 y TAP2 es muy hidrofóbico y está formado por cuatro o tres hélices transmembranarias. El dominio de unión a nucleótidos consta de los motivos Walker A y B (A, B) y motivo Walker C que interacciona con el motivo E presente en el último loop citosólico de los dominios transmembranarios. En la primera etapa del transporte se produce una asociación biomolecular en el cual el péptido se una a la molécula TAP independientemente de ATP. Seguidamente tiene lugar la isomerización del complejo TAP, desencadenando la hidrólisis del ATP y la translocación del péptido a través de la membrana. La actividad ATPásica es específica de sustrato, habiéndose demostrado en numerosos estudios el transporte selectivo de los péptidos de 8-12 aminoácidos mediado por TAP a través de la membrana del retículo endoplásmico (Androlewicz MJ y Cresswell P, 1994). Los estudios de transfección en RMA-S, una línea celular murina de linfocitos T mutada para el gen tap2, y en las células humanas con mutaciones en los genes tap, han establecido que el ensamblaje y la presentación del antígeno defectiva en estas células, es corregida por la adecuada expresión de las proteínas TAP (Spies T y DeMars R, 1991; Powis SJ et al., 1991). También, se ha observado que los ratones knock out para el gen tap1 no son capaces de presentar antígenos citosólicos a los linfocitos TCD8+. Además, debido a la ausencia de expresión de moléculas clase I del MHC en su superficie, estos ratones carecen de linfocitos TCD4-8+ (Van Kaer L et al., 1992). Otras evidencias muestran, que en las células tap-negativas, el transporte peptídico dentro del retículo endoplásmico está mediado por una secuencia señal N-terminal. Además, se conoce la existencia de una familia homocigótica tap2-/- en la cual se ve reducida la expresión de moléculas de MHC de clase I en la superficie celular y la cantidad de linfocitos T citotóxicos. Sorprendentemente, estos individuos no muestran un incremento en la susceptibilidad de las infecciones víricas. Los antígenos parecen que son transportados al interior del retículo endoplásmico de forma independiente de TAP, aunque en condiciones normales TAP parece ser la vía predominante (De la Salle H et al., 1997). En algunos tejidos tumorales se ha observado una disminución en la expresión del ARNm de tap, o también mutaciones de tap, sugiriendo que la supresión de la expresión de tap puede ser un 38 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España mecanismo utilizado por las células tumorales para escapar de la respuesta inmunitaria (Seliger B et al., 1997). b) Papel de las moléculas acompañantes en el ensamblaje. Además de las ya mencionadas, el ensamblaje y la carga de las moléculas del MHC de clase I requiere de otras proteínas. Al menos existen cuatro proteínas (calnexina, calreticulina, ERp57 y tapasina), que están involucradas en el ensamblaje de la cadena pesada y de la cadena β2-microglobulina (Koopmann JO et al., 1997). La principal molécula involucrada en el ensamblaje de las moléculas de clase I es la calnexina. Esta proteína transmembranaria del retículo endoplámisco comparte con la calreticulina, una proteína homóloga y soluble, la propiedad de unirse a los glicano monoglicosilados (Hammond C y Helenius A, 1995). La calnexina se asocia a la cadena pesada libre y posteriormente se produce la asociación con la cadena β2-microglobulina. Una vez unida la cadena pesada de MHC de clase I con la cadena β2-microglobulina, es la proteína soluble calreticulina la que se encuentra unida el heterodímero del MHC clase I. También se ha observado la existencia de una proteína de 48KD asociada a TAP y denominada tapasina (Sadasivan B et al., 1996), que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. En las células tap-negativas, tanto tapasina, como los dímeros clase I-β2-microglobulina están asociados a la calreticulina. Esto sugiere que, en las células normales, la tapasina podría hacer de puente entre el complejo calreticulina-cadena pesada-β2-microglobulina y la molécula TAP (Figura 17) Las moléculas de clase I interactúan con el complejo TAP mediante la tapasina. Las funciones de la molécula tapasina son las de aumentar los niveles de TAP incrementando así la eficacia del transporte peptídico y asociarse con las moléculas de clase I facilitando el ensamblaje y la carga de éstas. La proteína ERp57 es un miembro de la familia enzimática tioredoxina. Estos enzimas catalizan la isomerización de los puentes de sulfuro de las proteínas, asegurando las correctas uniones intracatenarias o intercatenarias. Estos enzimas son denominados tioloxidoreductasas, porque pueden catalizar tanto la reducción como la oxidación de los puentes disulfuro dependiendo del potencial redox. Se ha sugerido que la formación de los puentes disulfuro se inicia cuando las cadenas pesadas de clase I están asociadas con la calnexina y se completa después de la unión a la molécula β2-microglobulina y la asociación con la calreticulina, siendo ERp57 la tiol-oxireductasa que facilita esta formación (Cresswell P et al., 1999). 39 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España FIGURA 17: Asociación del péptido con el MHC de clase I. c) Presentación antigénica independiente de TAP. Aunque los proteosomas son los principales responsables de la generación de la mayoría de los péptidos presentados por clase I, otras proteasas también pueden generar péptidos antigénicos susceptibles de ser presentados por moléculas de clase I. Quizás la evidencia más clara de la generación de péptidos independientemente de los proteosomas es la presentación de los péptidos derivados de las secuencias señal. Estas secuencias son liberadas de las proteínas cuando éstas son traducidas y transportadas a su vez dentro del retículo endoplásmico, donde una peptidasa separa el péptido de la proteína. Hay varios ejemplos de estos péptidos o proteínas que pueden ser presentadas por el MHC de clase I. De hecho, la molécula HLA-A2, en ausencia de TAP, es capaz de presentar péptidos. Las moléculas de clase I no clásicas como HLA-E y Qa también se unen a las secuencias señal, pero en este caso, la presentación es dependiente de TAP, aunque no se bloquea por los inhibidores proteosómicos (York IA et al., 1999). Las moléculas CD1 no están codificadas en el MHC, pero comparten características estructurales comunes con las moléculas MHC de clase I y también están asociadas a la proteína β2-microglobulina (Melián A et al., 1996; Jayawardena-Wolf J y Bedelac A, 2001). Como las moléculas de clase I, CD1 requiere de la β2-microglobulina para el transporte a la superficie celular. Sin embargo, el transporte de CD1 a la superficie parece ser independiente de TAP (Brutkiewicz RR et al., 1995). Estas moléculas, presentan a los linfocitos T, ligandos glucolipídicos. 4.6. Otras moléculas relacionadas con el sistema inmune y el MHC: NKG2D y CTLA-4. 4.6.1. El receptor NKG2D. NKG2D fue identificado por primera vez en 1991 por Houchins y colaboradores, como un DNA complementario (cDNA) expresado por células NK humanas (Houchins JP et al., 1991). El papel de esta molécula fue ignorado hasta 1999, cuando NKG2D fue identificado como receptor de una molécula relacionada con el MHC de clase I, MICA (MHC class I chain related 40 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España A) (Bauer S et al., 1999). Desde entonces, NKG2D y sus ligandos fueron objeto de intensa investigación. NKG2D es una molécula de transmembrana de tipo II que pertenece a la familia de las lectinas de tipo C. A diferencia de otros miembros de la familia NKG2, NKG2D no se asocia con CD94 y se expresa en forma constitutiva como homodímero en superficie celular en todas las células NK y linfocitos T γδ y αβ CD8+. Este homodímero se una a la proteína adaptadora DAP10 en humanos y a DAP12 o DAP10 en ratones (Wu J et al., 1999; Chang C et al., 1999). La proteína DAP10 no contiene motivos ITAM, pero tiene un motivo YxxM, que está implicado en la unión a la subunidad p85 de la fosfatidil inositol 3 quinasa (PI3K) y a Grb, mientras que DAP12 contiene un motivo ITAM citoplasmático que recluta y activa a las tirosin-quinasas Syc o ZAP-70, que disparan una cascada de eventos que desembocan en el desarrollo de la citotoxicidad. Por otra parte, su expresión aumenta además por el efecto de IL-12 e IFNα en células NK y por IL-15 en linfocitos TCD8+ (Moser JM et al., 2002; Wu J et al., 1999; Roberts AI et al., 2001; Ho EL et al., 1998). NKG2D puede actuar como molécula coestimuladora en células NK cuando éstas reciben señales de activación a través de NKp30, NKp46 o NKp80, o como estructura primaria de reconocimiento de ligando sobre células blancas (Bryceson YT et al., 2006). Esta función dual hace que NKG2D sea una molécula muy versátil (Diefenbach A et al., 2002; Long EO, 2002; Gilfillan S et al., 2002), clave durante respuestas inmunes innatas y adaptativas. La estimulación de células NK a través de NKG2D gatilla una señal tan intensa que es capaz de sobrepasar a la señal inhibitoria disparada por el reconocimiento de moléculas de clase I de MHC por parte de los receptores inhibitorios KIRs conduciendo a la lisis de la célula blanco. 4.6.1.1. NKG2D e inmunidad anti-tumoral. Actualmente sabemos que las poblaciones celulares linfocitarias efectoras de una respuesta anti-tumoral son los linfocitos T citotóxicos (con TCR αβ o TCR γδ) y las células NK, las que forman parte de los infiltrados linfocitarios que se detectan en los tumores (TILs: tumor infiltrating lymphocytes). Por otra parte, conocemos la existencia de variados mecanismos de escape tumoral (Rabinovich GA et al., 2007). Se han publicado recientemente algunas revisiones acerca de cómo debería abordarse la potenciación de la respuesta inmune contra las células tumorales (Ward S et al., 2002; Foss FM, 2002; Busche A et al., 2006; Swann JB y Smyth MJ, 2007), pero las estrategias de inmunoterapia anti-tumoral ensayadas hasta el presente con este receptor, no han conducido a resultados clínicos exitosos (Pérez-Díez A y Marincola FM, 2002). El desafío para los inmunólogos consiste pues en comprender los mecanismos por los cuales los tumores evitan desencadenar una respuesta inmune eficiente y desarrollar nuevas estrategias de inmunoterapia o terapia génica que conduzcan al disparo de señales de activación inmune óptimas y la eliminación de factores responsables del escape tumoral, la reaparición de los tumores primarios y las metástasis. Por otra parte, muchas de las terapias actualmente 41 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España empleadas llevan el desarrollo de reacciones autoinmunes, tal como es el caso del vitíligo observado en pacientes con melanoma que recibieron transferencia de linfocitos T citotóxicos propagados ex vivo (Swann JB y Smyth MJ, 2007; Dudley ME et al., 2002). Experimentos in vitro han demostrado que las células NK son capaces de disparar una citotoxicidad NKG2D-dependiente contra células tumorales provenientes de tumores epiteliales y no epiteliales (Pende D et al., 2001, 2002). En algunos casos, NKG2D fue el único receptor involucrado en el reconocimiento de las células tumorales, por lo que las moléculas blanco reconocidas, en particular MICA, son de interés para su estudio exhaustivo como candidatas a ser empleadas en el desarrollo de estrategias de terapia génica o inmunoterapia anti-tumoral. FIGURA 18: MICA en tumores: la expresión de MICA también es inducida por la neotransformación, y los tumores que expresan MICA pueden ser eliminados por células que expresan NKG2D, tales como las células NK y linfocitos TCD8+, contribuyendo a la inmunovigilancia. En años recientes se han publicado dos estudios realizados en ratones en los que se investigó el papel de la molécula NKG2D como estructura de reconocimiento de células tumorales (Busche A et al., 2006; Diefenbach A et al., 2001; Cerwenka A et al., 2001). En uno de ellos, se demostró que la expresión ectópica de Rae 1 y H60 en células tumorales de ratón por transducción con adenovirus, induce el rechazo de los tumores in vivo en ratones singénicos de una manera NKG2D-dependiente, en un fenómeno mediado por células NK y linfocitos TCD8+ citotóxicos. El re-desafío de los animales sobrevivientes con los tumores transducidos o inclusive con los tumores salvaje, permitió demostrar que las células efectoras de la respuesta inmune anti-tumoral fueron los linfocitos TCD8+ citotóxicos y que el desafio original generó memeria inmunológica. Mas recientemente, utilizando un modelo murino humanizado de células de cáncer de pulmón transducidas y células NK humanas o murinas, se demostró que la sobre-expresión de MICA promueve una fuerte respuesta anti-tumoral. Asimimo, se ha demostrado que la sobre-expresión de ciertos NKG2D-Ls en líneas celulares derivadas de gliomas humanos, produce un crecimiento retardado de estas células en ratones atímicos (Friese MA et al., 2003). Sin embargo, en este trabajo no se estudiaron los mecanismos involucrados en el crecimiento demorado de los tumores. 42 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España NKG2D, además de ser importante en el control y establecimiento de tumores y metástasis que expresan sus ligandos, protege al huesped de la iniciación de tumores, ya que la neutralización de NKG2D en ratones induce un aumento en la incidencia de tumores generados con carcinógenos químicos (Smyth MJ et al., 2005). Además, ratones que presentan una disminución sistémica de la expresión de NKG2D en células NK y linfocitos TCD8+ no son capaces de rechazar tumores qu expresan MICA (Wiemann K et al., 2005). Recientemente se ha demostrado que los TILs de pacientes con melanomas expresan NKG2D y que este receptor es importante para el reconocimiento del tumor por parte del estos linfocitos (Maccalli C et al., 2007), reforzando la idea de que NKG2D es importante en la inmunidad anti-tumoral también en humanos. Pese a la expresión de NKG2D en TILs y de NKG2DL en diversos tumores humanos, éstos continúan con su desarrollo, lo que se debe a la existencia de diversos mecanismos de escape que comprometen a las células NK y más específicamente a NKG2D. 4.6.1.2. Mecanismos de escape que involucran al sistema NKG2D-NKG2DL. Hasta el momento se ha descrito diversos mecanismos que contribuyen al escape de la respuesta inmune mediada por células NK. Entre ellos se destaca la secreción de citoquinas inmunosupresoras (Glick AB, 2004), la expresión de isoformas solubles de HLA-G (Rouas-Freiss N et al., 2005) y el reclutamiento de Tregs al microambiente tumoral (Ghiringhelli F et al., 2005). Sin embargo, el hecho de que células tumorales que expresen altos niveles de NKG2DL sean altamente susceptibles al reconocimiento y destrucción mediados por NKG2D in vitro, y a la vez estén infiltrados por células NKG2D+ sugiere que existen mecanismos que in vivo alteran el normal reconocimiento y desarrollo de funciones efectoras por el sistema NKG2D-NKG2DL. Esto podría resultar en la selección de variantes tumorales que impiden este reconocimiento. En primer lugar se demostró que el ectodominio de MICA puede ser secretado in vitro al medio de cultivo y detectado in vivo en suero de pacientes con cáncer, lo que afecta la funcionalidad de células citotóxicas por interferencia en la interacción con el receptor NKG2D (Groh V et al., 2002; Salih HR et al., 2002). El clivaje involucra la acción de metaloproteasas y recientemente se ha demostrado que MICA se asocia en la superficie celular con la proteína ERp5 y que ésta interacción es requerida para el clivaje de MICA y la secreción del ectodominio soluble (Kaiser BK et al., 2007). El clivaje de MICA no solo genera variantes tumorales con baja expresión de MICA sino que induce la internalización de NKG2D en células NK y linfocitos T CD8+ y, consecuentemente una disminución de su expresión en superficie. De esta manera las células citotóxicas se ven impedidas de reconocer a las células tumorales. Otro mecanismo de escape que involucra al sistema NKG2DL-NKG2D es mediado por TGFβ. Esta citoquina inmunosupresora (Wahl SM et al., 2006) tiene un doble efector sobre el sistema NKG2DLNKG2D. Por un lado regula negativamente la expresión de MICA y otras NKG2DL en la superficie de células tumorales (Friese MA et al., 2004) y por otro lado induce una disminución en la expresión de NKG2D en linfocitos T CD8+ y células NK, lo que evita el reconocimiento y destrucción de distintos tipos celulares (Castriconi R et al., 2003; Smyth MJ et al., 2006) sin afectar la expresión de perforina y FasL (Lee JC et al., 2004). El TGF-β además de ser secretado por los tumores, es expresado en la superficie de las células Treg, que en el microambiente 43 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España tumoral inducen una disminución de NKG2D en las células NK. Recientemente se ha demostrado otro mecanismo de escape que evita el reconocimiento de los tumores por células NK en forma dependiente de NKG2D. Éste involucra la expansión selectiva de linfocitos T CD4+NKG2D+ en la sangre de pacientes con tumores. Esta población poco convencional de células tienen un fenotipo supresor, ya que la forma soluble de MICA (sMICA) no induce una disminución en la expresión de NKG2D en esta población (en oposición a lo que ocurre en linfocitos T CD8+NKG2D+) sino que la estimula para producir FasL soluble, lo que induce una expansión de las células T CD4+NKG2D+ con fenotipo supresor y un arresto del ciclo celular en linfocitos T CD4+NKG2Dy CD8+NKG2Dque serían los mediadores de la inmunidad antitumoral (Groh V et al., 2006). De esta manera, este mecanismo contribuye a que los tumores logren escapar al reconocimiento por el sistema inmune. Los mecanismos de escape que involucran al sistema NKG2D-NKG2DL se encuentran resumidos en la siguiente figura. FIGURA 19: Mecanismos de escape tumoral que involucran a NKG2D y sus ligandos. Se muestran los tres mecanismos de escape que involucran a NKG2D descritos hasta el momento: MICA es clivada de la superficie de ciertos tumores por metaloproteasas (MMPs) y junto con TGF-β (secretado por el tumor y/o por células Treg) induce una disminución en la expresión de NKG2D en linfocitos T CD8+ y en células NK. Los tumores que expresan bajos niveles de NKG2DL son entonces deficientemente reconocidos por las células citotóxicas que además demuestran baja expresión de NKG2D. Además Fas soluble secretado por una población de células NKG2D+CD4+ supresoras induce la expansión autocrina de esta población e induce el arresto del ciclo celular de células CD4+NKG2D-. 4.6.2. El receptor CTLA-4. El gen CTLA-4 (cytotoxic T-Lymphocyte antigen 4), también conocido como CD152, es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y ha sido localizado en humanos, en el 44 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España cromosoma 2 (Egen JG et al., 2002; Rudd CE y Schneider H, 2003). Este gen presenta cuatro exones: los exones 1 y 2 codifican la región extracelular de la molécula, mientras el exón 3 codifica la región transmembrana y el 4 la región intracelular (Ling V et al., 1999; Dariavach P et al., 1998). En relación con la evolución de esta molécula, CTLA-4 presenta un alto grado de conservación. El dominio intracelular de CTLA-4 está 100% conservado en mamíferos, mientras que el dominio extracelular presenta una variabilidad mayor. Esto sugiere la existencia de una presión selectiva en la conservación de los mecanismos que median la dimerización de CTLA-4 y la señalización a través de su dominio intracitoplasmático (Teft WA et al., 2006; Ling V et al., 1999). La molécula CD28 ha sido mapeada en la misma región cromosómica que CTLA-4 (Brunet JF et al., 1987; Dariavach P et al., 1998; Harper K et al., 1991; Lafage-Pochitaloff M et al., 1990; Alegre ML et al., 2001). Estas dos moléculas presentan una gran similaridad estructural y homología en sus secuencias génicas, lo que les permite compartir los mismos ligandos –las moléculas B7-1 y B7-2- (Sharpe AH y Freeman GJ, 2002). Sin embargo, CTLA-4 se une a sus ligandos con mayor afinidad y avidez que CD28 (Linsley PS et al., 1991, 1994). Esto sugiere que las señales inhibitorias son dominantes sobre las señales coestimuladoras. La alta avidez de CTLA-4 por B7 se debe en gran parte a la estructura de homodímero de CTLA-4, que le permite unirse bivalentemente a B7 (Stamper CC et al., 2001), mientras que CD28 solo puede unirse monovalentemente a B7 (Collins AV et al., 2002; Van der Merwe PA y Davis SJ, 2003). CD28 se expresa constitutivamente en los linfocitos T, por el contrario, CTLA-4 se expresa en la superficie de los Linfocitos T en reposo en niveles muy bajos, sólo a medida que el linfocito T se activa, los niveles de CTLA-4 en la superficie celular se elevan. La expresión de CTLA-4 a bajos niveles es suficiente para inducir una señal negativa en los linfocitos T (Vandenborre K et al., 1999); por esta razón su expresión está estrictamente regulada por dos mecanismos: el primero es la redistribución de las moléculas CTLA-4 que se encuentran en la región intracelular, el segundo es el incremento de sus síntesis (Frauwirth KA y Thompson CB, 2002; Pioli C et al., 2000). La mayoría de las moléculas CTLA-4 se acumulan intracelularmente en lisosomas donde son degradadas rápidamente con el fin de regular su expresión (Iida T et al., 2000); solo un pequeño grupo de moléculas CTLA-4 se expresan en la superficie del linfocito T, pero de una manera muy dinámica. Esta distribución de CTLA-4 es regulada a través de una interacción del dominio intracitoplasmático de CTLA-4 con AP-1, el cual media el transporte de CTLA-4 desde el aparato de Golgi hasta la superficie celular (Schneider H et al., 1999). El transporte de CTLA-4 a endosomas y lisosomas para su almacenaje o degradación es mediado por la interacción de la molécula CTLA-4 que se encuentra en la superficie celular con AP-2; esta interacción sólo sucede cuando los residuos de tirosina del dominio intracitoplasmático de CTLA-4 no han sido fosforilados (Shiratori T et al., 1997; Bradshaw JD et al., 1997). De esta forma, en ausencia de estimulación, CTLA-4 será degradado, y en presencia de activación de TCR, CTLA-4 contenido en los lisosomas es secretado aumentando su expresión en la superficie celular. En el caso de los linfocitos T memoria, éstos tienen una gran 45 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España cantidad de CTLA-4 intracelular, el cual es expresado mucho más rápidamente en la superficie del linfocito T de memoria activado, en comparación con la velocidad de su expresión durante la activación de los linfocitos T vírgenes. Adicionalmente, CTLA-4 es retenido en la superficie del linfocito T de memoria activado un tiempo considerablemente más largo que en el caso del linfocito T virgen activado (Teft WA et al., 2006; Jago CB et al., 2004). Al igual que CD28 y CTLA-4, los patrones de expresión de las moléculas B7-1 y B7-2 en la superficie celular de la célula presentadora de antígenos (APC) son diferentes. B7-2 es expresada constitutivamente en las APCs y su expresión aumenta rápidamente después de la activación, alcanzando un pico de expresión a las 24 horas (Lenschow DJ et al., 1993; Fraser JH et al., 1999); por el contrario, la molécula B7-1 solo se expresa después de la activación, alcanzando un pico a las 47-72 horas. Con base a estas diferencias y a otros datos cristalográficos y moleculares, investigadores concluyen que B7-2 es el principal ligando de CD28 (coestimulador), y B7-1, el principal ligando de CTLA-4 (inhibidor) (Teft WA et al., 2006). Se han postulado dos mecanismos que median los efectos inhibitorios de CTLA-4: uno de ellos es la señalización negativa transmitida a través del dominio intracitoplasmático de esta molécula, que aumenta paralelamente a la activación del TCR; Actualmente no se conocen claramente las señales transmitidas por CTLA-4. Se han propuesto tres modelos para explicar los niveles en los que posiblemente actúa CTLA-4: inhibición temprana de las señales de activación inducidas por el TCR, inhibición de las señales de activación inducidas por el TCR y CD28, inhibición de las señales coestimuladoras dependientes de CD28 (Appleman LJ et al., 2000). Independientemente de la vía de señalización usada por CTLA-4, las señales transmitidas por esta molécula inhiben la acumulación de AP-1, NF-ҝβ y NFAT en el núcleo de los linfocitos T activados, disminuyendo de esta manera la síntesis de citoquinas (Fraser JH et al., 1999; Olsson C et al., 1999). CTLA-4 también regula la proliferación celular inhibiendo la ciclina D3, las ciclinas dependientes de cinasas 4 y 6 y la degradación del inhibidor del ciclo celular p27 (Brunner MC et al., 1999). Otros estudios han demostrado que CTLA-4 disminuye los niveles de actividad de ERK y JNK, induciendo de esta manera la inhibición de la síntesis de IL-2 (Calvo CR et al., 1997). El segundo mecanismo propuesto es la inhibición de la activación celular debido al antagonismo competitivo de la coestimulación mediada por CD28. Las señales de activación en los linfocitos T permiten la reorientación de CTLA-4 que se encuentra en el espacio intracelular hacia la superficie celular y principalmente hacia las balsas esfingolipídicas para participar en la sinapsis inmunológica (Egen JG y Allison JP, 2002; Linsley PS et al., 1996). De esta manera, CTLA-4 está disponible para competir con CD28 por B7. Debido a su mayor afinidad, CTLA-4 secuestra moléculas B7 y reduce la cantidad disponible de coestimulación dependiente de CD28. A diferencia de la señalización negativa intracelular, este segundo mecanismo no requiere la presencia del dominio intracitoplasmático de CTLA-4 y está regulado por los niveles de expresión de CTLA-4 en la superficie celular. Este hallazgo explica por qué la expresión de CTLA-4 está finamente regulada y altamente compartimentalizada, puesto que la presencia de 52 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España 53 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España 1. Objetivo principal. Evaluar perfiles inmunogenéticos de susceptibilidad y protección frente al cáncer de mama en nuestra área geográfica y su correlación con variables clínicas de la enfermedad. 2. Objetivos secundarios: 2.1. Estudiar la distribución de frecuencias de las variantes polimórficas de diferentes genes del sistema inmune, relacionados con la respuesta citotóxica antitumoral, en pacientes con cáncer de mama del Sur de España y en controles sanos de la misma área geográfica (HLA-B*, HLA-DRB1*, MICA-A, NKG2D, LMP, TAP y CTLA-4). 2.2. Comparar las frecuencias de las variantes polimórficas de los diferentes genes estudiados entre pacientes con cáncer de mama y controles sanos. 2.3. Establecer asociaciones de susceptibilidad o protección entre los genes del sistema inmune estudiados y el cáncer de mama en nuestra área geográfica. 2.4. Establecer correlaciones entre los diferentes perfiles inmunogenéticos analizados con variables clínicas de la enfermedad, así como los subtipos moleculares del cáncer de mama. 54 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España 55 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España III. MATERIAL Y METODOS 1. Población de estudio. 57 1.1. Pacientes. 57 1.2. Controles. 57 1.3. Tamaño muestral. 57 2. Material. 57 2.1. Equipamiento. 57 2.2. Material fungible. 58 2.3. Soluciones. 59 2.4. Softwares y programas específicos. 59 3. Métodos. 60 3.1. Obtención y almacenamiento de las muestras de sangre periférica. 60 3.2. Extracción del ADN. 60 3.3. Cuantificación del ADN. 60 3.4. Preparación de las muestras de ADN. 60 3.5. Determinación de las variantes alélicas de los genes de clase I (HLA-B+) y clase II (HLA-DRB*). 61 3.6. Alelos del microsatélite de la región transmembrana de MICA. 64 3.7. Determinación de las variantes alélicas de los genes LMP2, LMP7, TAP1 y TAP2. 68 3.8. Determinación de la variante polimórfica del gen NKG2D. 71 3.9. Determinación de las variantes polimórficas de CTLA-4. 75 56 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España 4. Análisis estadístico de los resultados. 79 57 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España 1. Población de estudio. 1.1. Pacientes. Se incluyeron en el estudio de forma prospectiva un grupo de 200 pacientes con cáncer de mama, pertenecientes a la provincia de Málaga, diagnosticadas y tratadas entre diciembre 2008 y febrero 2013, en las diferentes unidades de Oncología Médica de los hospitales Regional Universitario de Málaga, Comarcal de Antequera, Comarcal de Vélez Málaga y Costa del Sol. Con un seguimiento máximo de 5 años, para la gran mayoría de ellas. De cada paciente se obtuvo una muestra de sangre periférica de 15 ml, así como información clínica relevante sobre antecedentes personales y familiares, tipo de cáncer, tratamiento realizado y seguimiento (Ver ANEXO 1). Todas las participantes fueron informadas del estudio y aceptaron ser incluidas en él, obteniendo su consentimiento informado según el modelo de formulario que se presenta en el ANEXO 2. Los criterios para la inclusión al estudio fueron: - Mujer diagnosticada de cáncer de mama. - Tiempo transcurrido desde el diagnóstico a la inclusión inferior a 1 año. - De origen español. - Procedente de la provincia de Málaga. 1.2. Controles. Se incluyeron en el estudio un grupo de 169 controles sanos, donantes voluntarios de sangre, pertenecientes a la misma región geográfica que las pacientes, con similar edad y raza. El ADN de estos controles se encontraba conservado en una genoteca a -80ºC en el servicio de Inmunología del Hospital Regional Universitario de Málaga. 1.3. Tamaño muestral. El tamaño muestral empleado nos asegura una potencia del 70% para detectar diferencias en el contraste de la hipótesis nula (Ho: P1=P2) mediante una prueba de X2 bilateral para dos muestras independientes, teniendo en cuenta que el nivel de significación es del 5%, y asumiendo que la proporción en el grupo de referencia (controles) es del 15% y la proporción en el grupo experimental (casos) es del 250%. 2. Material. 2.1. Equipamiento. 58 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España - Agitador magnético (J.P. Selecta S.A., Barcelona, España). - Analizador de imagen y transiluminador Autochemi System, UVP. (Bioimaging System). - Balanza de precisión (Mettler Plisoi-S, Toledo, España). - Campana de flujo laminar (Telstar Mini-V/PCR, Barcelona, España). - Centrífugas: Multifuge 3 L-R (Heraeus) y Heraeus Multifuge X3R (Thermo Scientific). - Congeladores -80ºC (Heraeus), monitorizados por el Biobanco Andaluz. - Cubetas de electroforesis horizontal BioRad Wide Mini-Sub Cell GT (BIORAD). - Equipos informáticos dotados de los programas necesarios para albergar las bases de datos y software de análisis estadístico. - Extractor automático de ácidos nucleicos BIO ROBOT EZ1 (QIAGEN). - Frigorífico Combi. Nevera 4ºC y congelador -20ºC. (Liebherr_International AG, Bulle, Suiza). - Fuentes de electroforesis PowerPAC 3000 (Bio-Rad, California, Estados Unidos). - Juegos de micropipetas Eppendorf Research Plus (p10, p100, p200 y p1000) (Eppendorf). - Luminex LABScan TM 100. - Microcentrífugas: Centrifuge 5424 (Eppendorf) y Biofuge Pico (Heraeus). - Microondas Samsung M63 (Samsung, Seúl, Corea del Sur). - Micropipeta automática 10-200 μl LVWR International. - Micropipeta muticanal Finnpipette (Thermo Electron Corporation). - Namodrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific). - PCR –real Time Roche LightCycler 480 (LC 480). - Sistema de agua Milli-Q gradient (Multipore, Massachusetts, Estados Unidos). - Secuenciador automático 3130 XL Genetic Analyzer (Applied Biosystem-Hitachi). - Termobloque Eppendorf Termomixer Compact (Eppendorf). - Termociclador Applied Biosystems GeneAmp PCR System 2720 (Applied Biosystems). - Timer CMX3 (VWR, Pensilvania, Estados Unidos). - Vortex (VWR). 2.2. Material funglible. - Agarosa (Sigma-Aldrich, Misuri, Estados Unidos). - Agua destilada libre de nucleasas (Promega). - Agua Milli-Q (Millipore). - AmpliTaq DNA polimerase (Roche, Basilea, Suiza). - Azul de bromoferol (Sigma-Aldrich). - Bromuro de etidio (Sigma-Aldrich). - Cebadores para PCR (Biomol). - Etanol absoluto (Merk KGaA, Darmstadt, Alemania). - Enzimas Bbv I y Mse I (New England BioLabs Inc.). - Enzima Mae III (Roche). - Gene Amp 10X PCR Buffer II & MgCl2 solution (Roche). 59 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España - Guantes de latex Nursia (Palex Medical SA., Barcelona, España). - Kit extracción de ADN EZ1® DNA Blood 350 μl kit (48) (QIAGEN). - Kits LABTypeTM SSO Class I B Locus Typing Test (One Lambda). - Kits LABTypeTM SSO Class II DRB1 Typing Test (One Lambda). - Matraces (VWR). - Marcador de peso molecular Nº V (Boehringer Mannherm, grupo Roche). - PE-Conjugated Streptavidin (LT-SAPE) (One Lambda). - Pipetas Pasteur (VWR). - Probetas (VWR). - Puntas de micropipeta ART (Molecular Bioproducts, Grupo Thermo Fisher Scientific). - Sacarosa (Sigam-Aldrich). - Set de deoxinucleótidos trifosfato (dNTP) (Roche). - TaqMan GTX Master Mix (2X) (Applied Biosystems). - TaqMan GTX Genotyping Assay (20X). - TBE 10X (Sigma-Aldrich). - Tubos 1,5 ml (Eppendorf). - Tubos 200 μl (Eppendorf). 2.3. Soluciones. - Solución de bromuro de etidio: 0,2 g de bromuro de tidio. 20 ml de agua destilada. Agitar bien y mantener a 4ºC en oscuridad. - Solución de etanol al 70%: 70 ml de etanol absoluto. 30 ml de agua destilada. - Tampón de carga: 0,25 g de azul de bromoferol. 40 g de sacarosa. 100 ml de agua destilada. Agitar bien y conservar a 4ºC. - TBE IX: 50 ml de TBE 10X. 450 ml de agua destilada. 2.4. Softwares y programas específicos. - Luminex 100 IS Software. 60 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España - HLA Fusion 330 Software. - Genemapper Sofware versión 4.0. - R-Project versión 3.2.2. 3. Métodos. 3.1. Obtención y almacenamiento de las muestras de sangre periférica. De cada paciente se recogieron 15 ml de sangre en 3 tubos de 5 ml cada uno con anticoagulante (citrato). Se centrifugaron a 3500 revoluciones por minuto (rpm) durante 5 minutos, a fin de separar la capa de leucocitos (“buffy coat”) del resto de componentes sanguíneos. La capa de leucocitos de uno de los tubos se empleó para la extracción de ADN, mientras que las otras dos se aislaron y se almacenaron a -80ºC en tubos de 1,5 ml convenientemente rotulados e identificados. 3.2. Extracción del ADN. El ADN de cada paciente se extrajo a partir del “buffy coat” en el Bio Robot EZ1, utilizando el kit EZ1® DNA Blood 350 μl kit (48) (QIAGEN), según el protocolo descrito por el fabricante. Se partió de un volumen inicial de muestra de 350 μl y se programó un volumen de elución de 200 μl en todos los casos. 3.3. Cuantificación del ADN. La cuantificación de los ácidos nucleicos obtenidos se realizó a partir de 1 μl de muestra en el equipo Nanodrop 1000 Spectrophotometer, siguiendo las instrucciones del fabricante. El “blanco” se realizó con agua destilada. 3.4. Preparación de las muestras de ADN. A partir de cada una de las muestras madre de ADN, una vez reconocida su concentración, se prepararon diluciones de trabajo de 100 ng/μl. Los volúmenes de agua destilada y de ADN de la muestra madre que había que añadir en cada caso se calcularon mediante la fórmula: Ci x Vi = Cf x Vf 61 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España Donde C representa concentración, V volumen y los subíndices i y f indican “inicial” y “final” respectivamente. Las diluciones de trabajo a 100 ng/μl se conservaron a 4ºC y las muestras madre se conservaron en una genoteca a -80ºC. 3.5. Determinación de las variantes alélicas de los genes HLA de clase I (HLA-B*) y clase II (HLA-DRB*). La determinación de los alelos clase I y II se llevó a cabo mediante la técnica PCR-SSO (polymerase chain reaction, sequence specific oligonucleotide), utilizando para ello el kit comercial LABType SSO Typing (One Lambda) específico para cada locus. Esta tecnología utiliza sondas de oligonucleótidos específicos de secuencia (SSO) unidas a microesferas cifradas de forma fluorescente para identificar alelos codificados mediante el ADN de muestra. LABType aplica la tecnología Luminex para el método de tipificación inversa de ADN de SSO. Primero, el ADN de destino se amplifica por PCR utilizando un cebador específico de grupo. El producto de PCR está biotinilado, lo que permite su detección con estreptavidina conjugada con r-ficoeritrina (SAPE). El producto de PCR se desnaturaliza y se vuelve a hibridar con sondas de ADN complementarias conjugadas con microesferas cifradas de forma fluorescente. Un analizador de flujo, LABScan TM 100, identifica la intensidad de fluorescencia de la ficoeritrina en cada microesfera. La asignación de la tipificación de HLA se basa en el patrón de reacción comparado con patrones asociados a secuencias de ganes HLA publicadas. Los componentes del sistema son los siguientes: - Mezcla optimizada previamente y probada de microesferas con sondas unidas de forma covalente. - Tampones de reacción de hibridación para facilitar la unión del ADN de destino a la sonda. - Tampón de lavado para quitar el ADN no unido. - Tampón con SAPE para diluir la solución de SAPE de reserva. - Reactivos de amplificación de ADN (mezcla de cebador específico de loci optimizado previamente para HLA). - D-mix (amplificación formulada especialmente). La cantidad de cebadores y las concentraciones de los reactivos del kit están ajustadas para una amplificación óptima de muestra de ADN a una concentración de 20 μg/μl. 68 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España FIGURA 20: Patrón de picos obtenidos al tipar los alelos del exón 5 de MICA. En la imagen se encuentra el resultado de tres muestras, dos de ellas heterocigotas (se observan dos picos de fluorescencia que se corresponden con dos tamaños de fragmento distintos, y por tanto, con dos alelos) y una homocigota (un solo pico de fluorescencia). Según el patrón de picos obtenido para estos individuos, pueden deducirse los siguientes tipajes: muestra A06_5_02 →MICA-A4/A6; muestra A07_6_01 →MICA-A6/A6; muestra A08_7_02 →MICA-A4/A5.1. 3.7. Determinación de las variantes alélicas de los genes LMP2, LMP7, TAP1 y TAP2. En nuestro trabajo seleccionamos 7 polimorfismos de nucleótido simple (SNP) de estos genes, que han sido documentados en la literatura por su relación con el riesgo de cáncer. TABLA 11: Selección de polimorfismos de los genes LMP/TAP. Gen Alelo SNP Sustitucion nucleótido Posición aminoácido Sustitución aminoácido LMP2 LMP2 rs17587 CGC→TGC 60 Arg→Cys LMP7 LMP7 rs2071543 CAG→AAG 145 Gln→Lys TAP1 TAP1.1 TAP1.2 rs1057141 rs1135216 ATC→GTC GAC→GGC 333 637 Ile→Val Asp→Gly TAP2 TAP2.1 TAP2.2 TAP2.3 rs1800454 rs241447 rs241448 GTA→ATA ACA→GCA TAG→CAG 379 665 687 Val→Ile Thr→Ala Stop→Gln 69 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España La determinación de estos polimorfismos se realizó mediante la técnica de PCR a tiempo real. En la actualidad, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) a tiempo real es la técnica más sencilla para la detección de ácidos nucleicos (ADN y ARN). La PCR a tiempo real se basa en el principio del método de la PCR desarrollado por Kary Mullis en la década de los 80, que permite detectar ADN a partir de pequeñas cantidades, ampliándolas hasta más de un billón de veces (Mullis KB, 1990). Es una técnica que combina la amplificación y la detección en un mismo paso, al correlaionar el producto de la PCR de cada uno de los ciclos con una señal de intensidad de fluorescencia. Posee características importantes como alta especificidad, amplio rango de detección (de 1 a 107 equivalentes genómicos de la secuencia blanco) y rapidez en la visualización del producto ya que no es necesario realizar un electroforesis posterior. Para la amplificación por PCR a tiempo real, además de los reactivos, es necesario emplear un fluoróforo. Los fluorófos utilizados para seguir la amplificación del ADN durante la PCR pueden ser de dos tipos: - Fluoróforos con afinidad por el ADN. - Sondas específicas para fragmentos del ADN, es decir, que sólo emiten fluorescencia cuando se ha amplificado un fragmento de ADN de interés (blanco). Los equipos para llevar a cabo la PCR a tiempo real incluyen un termociclador y una unidad capaz de detectar señales fluorescentes (fluorómetro) para monitorear el progreso de la reacción de amplificación, así como un hardware y un software para la captura y el análisis de datos respectivamente. El equipo usado en nuestro trabajo fue Roche Lightcycler 480 (LC 480) mendiante sondas Single Probe. Permite trabajar en el formato de 384 pocillos. El protocolo resumido para el genotipaje de los polimorfismos de LMP2, LMP7, TAP1 y TAP2 fue el siguiente: 3.7.1. Preparación de la PCR. Todas las mezclas de PCR se realizaron en la zona de preamplificación y en condiciones de esterilidad (campana de fluja laminar). Una vez estandarizadas las muestras de ADN a 25 ng/μl, se procedió a realizar las siguientes mezclas de reacción para el ensayo de amplificación para: - Los polimorfismos LMP2 (rs17587), LMP7 (rs2071543), TAP1.1 (rs1057141), TAP1.2 (rs1135213), TAP2.1 (rs1800454) y TAP2.3 (rs241448): 70 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 12: Mezcla de amplificación. Reactivos Placa de 384 pocillos x 1 Volumen (μl) TaqMan GTX Master Mix (2X) 2,5 TaqMan Genotyping Assay (20X) 0,25 DNA molde 1 H2O libre de nucleasas 1,25 Volumen final 5 - El polimorfismo TAP2.2 (rs241447): TABLA 13: Mezcla de amplificación. Reactivos Placa de 384 pocillos x 1 Volumen (μl) TaqMax GTX Master Mix (2X) 0,25 TaqMax Genotyping Assay (20X) 6. Primer F 10 μM 7. Primer R 10 μM 0,25 0,25 Sonda 1 (200 nM) Sonda 2 (200 nM) 0,25 0,25 AND molde 1 H2O libre de nucleasas 0,5 Volumen final 5 Posteriormente se procedió a la realización de la PCR mediante el siguiente programa: 71 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 14: Descripción del programa de amplificación. Etapa Nº ciclos Modelo de análisis PreIncubación 1 Ninguno Amplificación 40 Cuantificación Temperatura (ºC) Modelo de adquisición Tiempo (seg) Tasa de Aceleración (ºC/seg) 92 Ninguno 15 2,5 60 Simple 60 2,5 72 Ninguno 1 4,8 Enfriamiento 1 Ninguno 3.7.2. Lectura de los resultados. 3.8. Determinación de la variante polimórfica del gen NKG2D. En este trabajo se ha estudiado el polimorfismo de nucleótido simple (SNP) de NKG2D Thr72Ala (A/G) (rs2255336), situado en la región que codifica la parte transmembrana de este receptor. Para ello se usó la técnica de PCR y posterior digestión con enzimas de restricción (PCR-RFLP). Se trata de una amplificación de una secuencia genética con restricción posterior del producto obtenido. Las enzimas o endonucleasas de restricción reconocen una secuencia de nucleótidos determinada, dentro de una molécula de ADN y la cortan en un punto en concreto conocido como diana de restricción. El número de fragmentos que se obtienen es equivalente a las veces que se encuentra repetida la diana. El tamaño de los fragmentos, dependerá de la separación entre dos lugares de restricción continuos; y los cambios, ya sean por recombinación o mutación, conducirán a diferentes perfiles de restricción. El protocolo resumido para el genotipaje de NKG2D Thr72Ala (A/G) por la técnica PCRRFLP fue el siguiente: 3.8.1. Preparación de la PCR. 72 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España Todas las mezclas de PCR se realizaron en la zona de preamplificación y en condiciones de esterilidad (campana de fluja laminar). La secuencia de los cebadores utilizados fue la siguiente: NKG2D-F: 5´-GAGGTATTTATGTTCTGTTCTGG-3´. NKG2D-R: 5´-TCTACTTCTCTGTTGTCACTTAC-3´. La amplificación se realizó en un volumen final de reacción de 25 μl. Los diferentes reactivos necesarios para llevar a cabo la PCR se mezclaron manualmente teniendo en cuenta las siguientes condiciones para cada muestra: TABLA 15: Mezcla de amplificación. Reactivo Volumen (μl) Concentración final NKG2D-F (10 μM) 1 0,4 μM NKG2D-R (10 μM) 1 0,4 μM dNTPs (10 mM) 0,5 0,2 mM Mg2+ (25 mM) 1,5 1,5 mM Tampon 10X 2,5 1X Ampli Taq (5 u/μl) 0,4 2 u H2O dest. 16,1 ADN (50 ng/μl) 2 4 ng/μl Volumen final 25 La reacción de PCR tuvo lugar en placas de PCR con 96 pocillos y de 200 μl que se colocaron en un termociclador previamente programado según la siguiente tabla: 73 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 16: Condiciones de PCR para el genotipaje de NKG2D Thr72Ala (A/G) por PCR-RFLP. Nº de ciclos Temperatura (ºC) Tiempo 1 94 94 10 min 45 seg 40 56 72 45 seg 50 seg 1 72 5 min 1 4 Ilimitado Para testar la calidad de la amplificación, se comprobaron los productos de PCR mediante una electroforesis en gel de agarosa al 4% con bromuro de etidio. El proceso detallado del procedimiento se explica a continuación. 3.8.1.1. Electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis en gel de agarosa puede tener diversas aplicaciones, siendo la separación de moléculas de ADN en función de su tamaño una de las más utilizadas. En determinados soportes, como el gel de agarosa, el medio (gel) ofrece una resistencia notable al avance de las moléculas cuando éstas se someten a un campo eléctrico, por lo que la movilidad depende mucho del tamaño de la molécula. La agarosa es un polisacárido cuyas disoluciones poseen la propiedad de permanecer líquidas por encima de aproximadamente 50ºC y formar un gel semisólido al enfriarse. Este ge está constituido por una matriz tridimensional de fibras poliméricas embebida en una gran cantidad de medio líquido que retarda el paso de las moléculas del ácido nucleico. La velocidad a la que migran las moléculas depende de dos factores: el tamaño de la molécula y el diámetro de los poros de la matriz, que a su vez depende directamente de la concentración a la que se encuentre la agarosa, siendo mayor el tamaño del poro a menores concentraciones del polisacárido. - Preparación del gel: Se fabricaron geles de agarosa al 4% siguiendo el siguiente procedimiento: 1. Añadir la cantidad de agarosa apropiada al TBE 1X. 74 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España 2. Mover y calentar en el microondas a potencia media (90-100ºC) durante aproximadamente 2 minutos. Asegurarse de que no queden grumos. 3. Enfriar hasta 50ºC, moviéndolo para evitar que gelifique. 4. Añadir el volumen de bromuro de etidio necesario para que alcance en el gel una concentración final de 0,5 μg/ml y mezclarlo muy bien. El bromuro de etidio es un fluorocromo que se intercala en la doble hélice de ADN, lo que nos permitirá visualizar las bandas iluminando el gel con luz ultravioleta. 5. Verter cuidadosamente la mezcla en el portageles para evitar la formación de burbujas, colocar los pienes y dejar gelificar (a 37ºC unos minutos). La gelificación debe tener lugar sobre una superficie nivelada para que el gel tenga un grosor uniforme. - Electroforesis: Cuando el gel solidificó, se retiraron con cuidado los peines, se introdujo con el portageles en la cubeta de electroforesis y se cubrió con la cantidad suficiente de TBE 1X. Posteriormente se pipeteó un volumen de 5 μl del producto de PCR en tubos estériles de 1,5 ml y se añadió 2 μl de tampón de carga en cada muestra. Se cargaron las muestras en los pocillos de gel (a partir del segundo pocillo) de manera consecutiva, mientras que el primer pocillo se añadió 1 μl del marcador de peso molecular (Moleculer Weight Marker V, Roche) junto con 1 μl de tampón de carga. A continuación, se conectó el sistema a la electricidad, comprobando previamente que los pocillos se encontraban en el extremo del gel más cercano al cátado. La electroforesis se realizó a 100 voltios (V) durante un tiempo de 30 minutos. Tras finalizar la carrera se visualizaron las bandas iluminándolas con luz ultravioleta en el equipo de imagen. 3.8.2. Digestión enzimática. La digestión de los productos de PCR se realizó en un volumen final de reacción de 25 μl. Se llevó a cabo con la enzima Mae III con la que se obtenían dos fragmentos de 217 pb y 54 pb para el alelo A (72 Thr; ACA) y un fragmento de 271 pb para el alelo G (72 Ala; GCA), teniendo en cuenta las siguientes condiciones para cada muestra: 75 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 17: Condiciones para la digestión enzimática. Reactivo Volumen Enzima Mae III 1 μl ADN (producto PCR) 1 μg Incubación Buffer 12,5 μl (2X) H2O Variable Volumen final 25 μl 3.8.3. Lectura. Los fragmentos obtenidos tras el tratamiento con la endonucleasa fueron separados mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 4% (procedimiento detallado anteriormente). Para ello, las muestras y patrones mezclados con el tampón de carga se depositaron en los pocillos con ayuda de una pipeta (25 μl del producto de la digestión enzimática más 5 μl del tampón de carga). Igualmente se colocó en el primer pocillo 1 μl del marcador de peso molecular (Moleculer Weight Marker V, Roche) junto con 1 μl del tampón de carga. Se realizó la electroforesis a 100 V durante 30 minutos. Una vez concluida, se colocó el gel en el equipo de imagen y se iluminó con luz ultravioleta (UV), capturando digitalmente una imagen de los resultados. 3.9. Determinación de las variantes polimórficas del gen CTLA-4. En nuestro trabajo se han analizado dos polimorfismos de nucleótido simple (SNP) de CTLA-4. El primero de ellos es el polimorfismo +49 A/G, denominado así porque se trata de un cambio (adenina-guanina) en la posición del nucleótido 49 en el exón 1 del gen CTLA-4, que da lugar a un cambio de aminoácido, de alanina a treonina. El segundo de ellos es el -1661 A/G localizado en la región del promotor del gen. Para ello se usó la técnica PCR-RFLP, utilizada y descrita anteriormente para la determinación de la variante polimórfica de NKG2D. El protocolo resumido para el genotipaje de los polimorfismos de CTLA-4 +49 G/A y - 1661 A/G por la técnica PCR-RFLP fue el siguiente: 3.9.1. Preparación de la PCR. Todas las mezclas de PCR se realizaron en la zona de preamplificación y en condiciones de esterilidad (campana de flujo laminar). Temperatura de incubación: 55ºC Tiempo de incubación: 1 h 76 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España La secuencia de cebadores fue la siguiente: - CTLA-4 +49 G/A (rs231775): CTLA-4- +49 G/A F: 5´-AGTCTCACTCACCTTTGCAG-3´. CTLA-4- +49 G/A R: 5´GCTCTACCTCTTGAAGACCT-3´. - CTLA-4 -1661 G/A (rs4553808): CTLA-4 -1661 F: 5´-CTAAGAGCATCCGCTGCACCT-3´. CTLA-4 -1661 R: 5´-TTGGTGTGATGCACAGAAGCCTTTT-3´. La amplificación se realizó en un volume final de 25 μl. Los diferentes reactivos necesarios para llevar a cabo la PCR se mezclaron manualmente tenieno en cuenta las siguientes condiciones para cada muestra: - CTLA-4 +49 G/A: TABLA 18: Mezcla de amplificación. Reactivo Volumen (μl) Concentración final CTLA-4 F (10 μM) 1 0,4 μM CTLA-4 R (10 μM) 1 0,4 μM dNTPs (10 mM) 0,5 0,2 mM Mg2+ (25 mM) 0,3 0,3 mM Tampon 10X 2,5 1X Ampli Taq (5 u/μl) 0,4 2 u H2O dest. 17,3 ADN (50 ng/μl) 2 4 ng/μl Volunen final 25 - CTLA-4 -1661 G/A: 77 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 19: Mezcla de amplificación. Reactivo Volumen (μl) Concentración final CTLA-4 -1661 F (10 μM) 1 0,4 μM CTLA-4 -1661 R (10 μM) 1 0,4 μM dNTPs (10 mM) 0,5 0,2 mM Mg2+ (25 mM) 1,5 1,5 mM Tampon 10X 2,5 1X Ampli Taq (5 u/μl) 0,4 2 u H2O dest. 16,1 ADN (50 ng/ μl) 2 4 ng/μl Volumen final 25 La reacción de PCR tuvo lugar en tubos de PCR de 200 μl que se colocaron en un termociclador previmante programado según el siguiente procedimiento: - CTLA-4 +49 G/A: TABLA 20: Condiciones de PCR para el genotipaje de CTLA-4 +49 G/A por PCR-FRLP. Nº de ciclos Temperatura (ºC) Tiempo 1 94 94 4 min 30 seg 30 56,4 72 10 seg 30 seg 1 72 4 min 1 4 Ilimitado - CTLA-4 -1661 G/A: 84 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España 85 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España 1. Análisis descriptivo de las variables clínicas en pacientes. Se analizaron un total de 200 pacientes diagnosticadas de cáncer de mama en la provincia de Málaga, entre Diciembre del 2008 y Febrero del 2013, con un seguimiento máximo de 5 años. El punto de corte para el análisis de datos fue con fecha de 13 de Julio del 2015. La edad media al díagnóstico de cáncer de mama fue de 52,54 años. De las 200 pacientes, 84 eran premnopáusicas (42%) en el momento del diagnóstico de la enfermedad, 68 de ellas tenían antecedentes familiares¹ de dicha enfermedad (34%) y en 11, la enfermedad debutó con afectación bilateral² (5,5%) al diagnóstico. El subtipo histológico más frecuente encontrado fue el carcinoma ductal infiltrante en 180 pacientes (90%), mientras que la variante lobulillar representó solo un 5,5% del total (11 pacientes). La mayoría de los tumores eran de grado histológico II y III (41,5% para cada uno de ellos), y hasta un 78,5% de ellos expresaban receptores hormonales para estrógenos y/o progesterona. Dentro de la clasificación por subtipos moleculares, el más frecuente fue el Luminal B/Her negativo, estando presente en 80 pacientes (40,2% de la muestra), seguido del Luminal A (60 pacientes, 30,1%), Luminal B/ Her2 positivo (25 pacientes, 12,6%), triple negativo (18 pacientes, 9,1%) y por último el subtipo Her2 positivo puro (16 pacientes, 8%). En cuanto al estadiaje³ de la enfermedad, del total de 200 pacientes, 10 de ellas eran estadio IV al diagnóstico (10%). La mayoría de las pacientes fueron diagnosticadas en estadios iniciales de la enfermedad (25,9% en estadio IA y 32,5% en estadio IIA). Con respecto al tratamiento efectuado, en 197 pacientes se realizó cirugía de la mama (en 3 pacientes, estadios IV al diagnóstico, no se contempló la opción quirúrgica como tratamiento). La técnica que se realizó con más frecuencia fue la cirugía conservadora de la mama más ganglio centinela en 79 pacientes (39,5%), seguida de mastectomía más linfadenectomía en 58 pacientes (29%). En un 82% de las pacientes se administró tratamiento complementario con quimioterapia, siendo el esquema más usado la quimioterapia basada en antraciclinas y taxanos (44,5%). Un total de 155 pacientes (77,5%) recibieron tratamiento hormonal, siendo el fármaco más usado el tamoxifeno en 84 pacientes (42%), seguido de los inhibidores de aromatasas (27%). El 81% de las pacientes recibió tratamiento local con radioterapia. Respecto al seguimiento, sólo un grupo de 57 pacientes completó un total de 5 años desde el diagnóstico de la enfermedad hasta que se realizó el punto de corte de cierre de la base de datos. En este periodo, un total de 14 paciente fallecieron (3 de ellas de causa no relacionada con la enfermedad neoplásica), siendo la mediana de supervivencia global (SG) para este grupo de pacientes de 572 días (IC 95%: 538-1714) (Figura 21). A lo largo de todo el seguimiento, 20 pacientes recayeron de su enfermedad, con una mediana de supervivencia 86 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España libre de enfermedad (SLE) de 17621 días (IC 95%: 16423-19188) (Figura 23). A los tres años de seguimiento el 94% de las pacientes permanecían vivas (Figura 22). 1. Se incluyeron antecedentes familiares de cáncer de mama de primero y/o segundo grado, además de aquellos casos donde se cumplían criterios clínicos para síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario. 2. En el caso de afectación bilateral del cáncer de mama en el momento del diagnóstico, la estadificación de la enfermedad se realizó teniendo en cuenta el tumor más grande, al igual como se determina en la práctica clínica habitual. 3. Se refiere al estadiaje posquirúrgico, salvo para 3 pacientes con estadio IV, donde no se realizó cirugía, y el estadiaje de la enfermedad fue clínico. Se utilizó la 7ª edición del manual de la AJCC para cáncer de mama, 2010. Las siguientes tablas y figuras muestran un resumen del análisis descriptivo de las variables clínicas en el grupo de pacientes: TABLA 24: Edad al diagnóstico en cáncer de mama. Edad (años) n % <45 59 29,5 45-54 62 31 55-64 42 21 >64 37 18,5 Total 200 100 TABLA 25: Estado hormonal al diagnóstico. Estado hormonal n % Premenopáusica 84 42 Perimenopáusica 18 9 Posmenopáusica 98 49 Total 200 100 87 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 26: Antecedentes familiares (AF). TABLA 27: Enfermedad bilateral (EB). AF n % Sí 68 34 No 132 66 Total 200 100 EB n % Sí 11 5,5 No 189 94,5 Total 200 100 88 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 28: Características de la enfermedad. n % Tipo histológico: - In situ - Ductal infiltrante - Lobulillar infiltrante - Mixto: ductal y lobulillar 3 180 11 6 1,5 90 5,5 3 Grado histológico: - GH-I - GH-II - GH-III - No conocido 30 83 83 4 15 41,5 41,5 2 Expresión hormonal: - Sí - No 157 43 78,5 21,5 Subtipo molecular: - Luminal A - Luminal B/Her2- - Luminal B/Her2+ - Her2+ - Triple negativo 60 80 25 16 18 30,1 40,2 12,6 8 9,1 89 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 29: Distribución por estadios (posquirúrgicos) de cáncer de mama (*existen 3 pacientes más, no intervenidas con cirugía, donde el diagnóstico se hizo de forma clínica). Estadio n % IA 51 25,9 IB 0 0 IIA 64 32,5 IIB 34 17,3 IIIA 23 11,7 IIIB 4 2 IIIC 9 4,6 IV 7 3,5 Total 197* 100 90 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 30: Tratamiento realizado. n % Cirugía - No cirugía - Cirugía conservadora + GC - Cirugía conservadora + LA - Mastectomía + GC - Mastectomía + LA 3 79 42 18 58 1,5 39,5 21 9 29 Hormonoterapia - No administrada - Tamoxifeno - Inhibidor aromatosa - Secuencial: Tam-IA - Secuencial: IA-Tam 45 84 54 16 1 22,5 42 27 8 0,5 Radioterapia - Sí - No 162 38 81 19 91 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España FIGURA 21: Supervivencia global (SG) para el subgrupo de pacientes fallecidas. FIGURA 22: Supervivencia global (SG) para el grupo total de pacientes. 92 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España FIGURA 23: Supervivencia libre de enfermedad (SLE). 2. Análisis descriptivo y comparativo de las variables moleculares en pacientes y controles. 2.1. Distribución de los alelos de HLA clase I (HLA-B*) y clase II (HLA-DRB1*). 2.1.1. Distribución de los alelos HLA de clase I HLA-B*. Se realizó el genotipado del locus HLA-B* en un total de 200 pacientes de cáncer de mama y 169 controles sanos. Tal como se muestra en la tabla 31, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos en la distribución de las frecuencias de las variantes elélicas del locus HLA-B, salvo para tres de ellas; HLA-B15, que se halló incrementada en pacientes respecto a controles de forma estadísticamente significativa, siendo p= 0,013; HLA-B35 y HLA-B38, que se encontraron incrementadas en controles respecto a pacientes, también de manera significativa, siendo las p= 0,022 y p= 0,028 respectivamente. Sin embargo, cuando se realizó la corrección por el número de alelos (test de Bonferroni), se perdió la significación estadística en los tres casos. 93 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 31: Comparación de la distribución de los alelos del locus HLA-B* de clase I en pacientes y controles. HLA-B* Pacientes 2n= 400 (%) Controles 2n= 338 (%) P Pc 07 32 8 25 7,7 NS - 08 21 5,2 18 5,6 NS - 13 5 1,2 7 2,2 NS - 14 26 6,5 20 6,2 NS - 15 30 7,5 10 3,1 0,013 0,364 18 43 10,8 25 7,7 NS - 27 11 2,8 6 1,9 NS - 35 38 9,5 49 15,1 0,022 0,616 37 4 1 1 0,3 NS - 38 9 2,2 18 5,6 0,028 0,784 39 2 0,5 3 0,9 NS - 40 18 4,5 7 2,2 NS - 41 6 1,5 7 2,2 NS - 42 1 0,2 0 0 NS - 44 60 15 51 15,7 NS - 45 12 3 4 1,2 NS - 47 2 0,5 0 0 NS - 49 10 2,5 7 2,2 NS - 50 6 1,5 8 2,5 NS - 51 30 7,5 35 10,8 NS - 52 8 2 8 2,5 NS - 53 7 1,8 1 0,3 NS - 100 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 38: Distribución de frecuencias de genotipos y alelos de los polimorfismos TAP 1.1 y TAP 1.2 en pacientes y controles. SNP Genotipo/Alelo Pacientes n= 200 (%) Controles n= 169 (%) P TAP 1.1 (rs1057141) AA AG GG A G HWE 144 72 51 25,5 5 2,5 339 84,75 61 15,25 0,786 117 69,2 50 29,6 2 1,2 284 84,02 54 15,97 0,256 0,560 0,380 0,345 TAP 1.2 (rs1135216) AA AG GG A G HWE 148 74 49 24,5 3 1,5 345 86,25 55 13,75 1 122 72,2 46 27,2 1 0,6 290 85,79 48 14,20 0,204 0,594 0,552 0,387 Para el análisis de estos dos polimorfismos del gen TAP 1 se usaron 5 modelos genéticos (codominante, dominante, recesivo, sobre-dominante y aditivo). La significación estadística en cualquier modelo se consideró como una posible asociación del polimorfismo con el riesgo de cáncer de mama. Sin embargo, no se encontró asociación estadísticamente significativa entre los dos polimorfismos estudiados de TAP 1 y el riesgo de cáncer de mama en la población estudiada (Tablas 39 y 40). 101 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 39: Asociación entre el polimorfismo TAP 1.1 y el riesgo de cáncer de mama. Genotipo TAP 1.1 Pacientes n=200 (%) Controles n=169 (%) OR IC p AIC Codominante: - AA - AG - GG 144 72 51 25,5 5 2,5 117 69,2 50 29,6 2 1,2 1 1,21 0,49 0,76-1,91 0,09-2,58 0,465 513,4 Dominante: - AA - AG-GG 144 72 56 28 117 69,2 52 30,8 1 1,14 0,73-1,79 0,560 512,6 Recesivo: - AA-AG - GG 195 97,5 5 2,5 167 98,8 2 1,2 1 0,47 0,09-2,44 0,345 512 S-dominante: - AA-GG - AG 149 74,5 51 25,5 119 70,4 50 29,6 1 1,23 0,78-1,94 0,380 512,2 Aditivo: 200 54,2 169 45,8 1,06 0,70-1,59 0,782 512,9 102 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 40: Asociación entre el polimorfismo TAP 1.2 y el riesgo de cáncer de mama. Genotipo TAP 1.2 Pacientes n=200 (%) Controles n=169 (%) OR IC P AIC Codominante: - AA - AG - GG 148 74 49 24,5 3 1,5 122 72,2 46 27,2 1 0,6 1 1,14 0,40 0,71-1,82 0,04-3,94 0,594 513,9 Dominante: - AA - AG/GG 148 74 52 26 122 72,2 47 27,8 1 1,10 0,69-1,74 0,695 512,8 Recesivo: - AA-AG - GG 197 98,5 3 1,5 168 99,4 1 0,6 1 0,39 0,04-3,79 0,387 512,2 S-dominante: - AA-GG - AG 151 75,4 49 24,5 123 72,8 46 27,2 1 1,15 0,72-1,84 0,552 512,6 Aditivo: 200 50,2 169 45,8 1,04 0,68-1,61 0,854 512,9 2.4.2. Distribución de las variantes alélicas de TAP 2. Se analizaron tres SNP para el gen TAP 2: TAP 2.1 (rs1800454), TAP 2.2 (rs241447) y TAP 2.3 (rs241448) en pacientes con cáncer de mama y controles sanos, según la siguiente distribución: 103 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 41: Distribución de los polimorfismos estudiados. Polimorfismo Pacientes (n) Controles (n) TAP 2.1 200 169 TAP 2.2 198 150 TAP 2.3 200 165 Las siguientes tablas muestran la distribución de las frecuencias de genotipos y alelos para cada uno de los polimorfismos en pacientes y controles. Únicamente se encontraron diferencias estadísticamente significativas cuando se compararon las frecuencias de genotipos y alelos entre los dos grupos para el polimorfismo TAP 2.1, siendo el genotipo GG más frecuente en controles que en pacientes (p= 0,008) y los genotipos AG y AA más frecuentes en pacientes que en controles con una p de 0,043 y 0,033 respectivamente. TABLA 42: Distribución de frecuencias de genotipos y alelos del polimorfismo TAP 2.1 en pacientes y controles. SNP Genotipo/Alelo Pacientes n= 200 (%) Controles n= 169 (%) p TAP 2.1 (rs1800454) GG AG AA G A HWE 141 70,5 53 26,5 6 3 335 83,75 65 16,25 0,793 139 82,2 30 17,8 0 0 308 91,12 30 8,87 0,367 0,008 0,043 0,033 104 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 43: Distribución de frecuencias de genotipos y alelos del polimorfismo TAP 2.2 en pacientes y controles. SNP Genotipo/Alelo Pacientes n= 198 (%) Controles n= 150 (%) p TAP 2.2 (rs241447) AA AG GG A G HWE 109 55,1 70 35,4 19 9,6 288 72,72 108 27,27 0,150 79 52,7 58 38,7 13 8,7 216 72 84 28 0,684 0,658 0,525 0,765 TABLA 44: Distribución de frecuencias de genotipos y alelos del polimorfismo TAP 2.3 en pacientes y controles. SNP Genotipo/Alelo Pacientes n= 200 (%) Controles n= 165 (%) p TAP 2.3 (rs241448) TT CT CC T C HWE 107 53,5 74 37 19 9,5 288 72 112 28 0,291 77 46,7 75 45,5 13 7,9 229 69,39 101 30,60 0,463 0,193 0,102 0,584 Para el análisis de estos tres polimorfismos, al igual que en los genes anteriores, se usaron 5 modelos genéticos (codominante, dominante, recesivo, sobre-dominante y aditivo). La significación estadística en cualquier modelo se consideró como una posible asociación del polimorfismo en concreto, con la susceptibilidad de padecer cáncer de mama. Se encontró una asociación estadísticamente significativa entre el polimorfismo TAP 2.1 y el riesgo de cáncer de mama, siendo el modelo codominante el más significativo, como podemos observar en la tabla 45. En cambio, no hubo asociación significativa cuando se compararon los polimorfismos TAP 2.2 y TAP 2.3 en pacientes y controles con el riesgo de cáncer de mama (Tablas 46 y 47). 105 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 45: Asociación entre el polimorfismo TAP 2.1 y el riesgo de cáncer de mama. Genotipo TAP 2.1 Pacientes n=200 (%) Controles n=169 (%) OR IC P AIC Codominante: - GG - AG - AA 141 70,5 53 26,5 6 3 139 82,2 30 17,8 0 0 1 0,57 0 0,35-0,95 0 0,004 502,8 Dominante: - GG - AG-AA 141 70,5 59 29,5 139 82,2 30 17,8 1 0,52 0,31-0,85 0,008 505,9 Recesivo: - GG-AG - AA 194 97 6 3 169 100 0 0 1 0 0 0,033 505,5 S-dominante: - GG-AA - AG 147 73,5 53 26,5 139 82,2 30 17,8 1 0,60 0,36-0,99 0,043 508,9 Aditivo: 200 54,2 169 45,8 0,5 0,31-0,79 0,004 503,7 106 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 46: Asociación entre el polimorfismo TAP 2.2 y el riesgo de cáncer de mama. Genotipo TAP 2.2 Pacientes n=198 (%) Controles n=150 (%) OR IC P AIC Codominante: - AA - AG - GG 109 55,1 70 35,4 19 9,6 79 52,7 58 38,7 13 8,7 1 1,14 0,94 0,73-1,80 0,44-2,02 0,808 481,4 Dominante: - AA - AG-GG 109 55,1 89 44,9 79 52,7 71 47,3 1 1,10 0,72-1,68 0,658 479,6 Recesivo: - AA-AG - GG 179 90,4 19 9,6 137 91,3 13 8,7 1 0,89 0,43-1,87 0,765 479,7 S-dominante: - AA-GG - AG 128 64,4 70 35,4 92 61,3 58 38,7 1 1,15 0,74-1,79 0,525 479,4 Aditivo: 198 56,9 150 43,1 1,03 0,75-1,43 0,837 479,7 107 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 47: Asociación entre el polimorfismo TAP 2.3 y el riesgo de cáncer de mama. Genotipo TAP 2.3 Pacientes n=200 (%) Controles n=165 (%) OR IC P AIC Codominante: - TT - CT - CC 107 53,5 74 37 19 9,5 77 46,7 75 45,5 13 7,9 1 1,41 0,95 0,91-2,18 0,44-2,04 0,260 505,9 Dominante: - TT - CT-CC 107 53,5 93 46,5 77 46,7 88 53,3 1 1,31 0,87-1,99 0,193 504,9 Recesivo: - TT-CT - CC 181 90,5 19 9,5 152 92,1 13 7,9 1 0,81 0,39-1,70 0,584 506,3 S-dominante: - TT-CC - CT 126 63 74 37 90 54,5 75 45,5 1 1,42 0,93-2,16 0,102 504,0 Aditivo: 200 54,8 165 45,2 1,13 0,82-1,56 0,443 506,0 2.5. Distribución de los alelos de NKG2D. Se genotipó el punto polimórfico de NKG2D Thr72Ala en 200 pacientes con cáncer de mama y 169 controles sanos. La tabla 48 muestra la distribución de las frecuencias de genotipos y alelos para este polimorfismo en pacientes y controles. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas cuando se compararon las frecuencias de genotipos y alelos entre los dos grupos. 108 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 48: Distribución de frecuencias de genotipos y alelos del polimorfismo NKG2D Thr72Ala en pacientes y controles. SNP Genotipo/Alelo Pacientes n= 200 (%) Controles n= 169 (%) P NKG2D Thr72Ala GG AG AA G A HWE 134 67 61 30,5 5 2,5 329 82,25 71 17,75 0,634 106 62,7 58 34,3 5 3 270 79,88 68 20,11 0,477 0,390 0,434 0,787 Para el análisis de este polimorfismo del gen NKG2D se usaron 5 modelos genéticos (codominante, dominante, recesivo, sobre-dominante y aditivo). La significación estadística en cualquier modelo se consideró como una posible asociación del polimorfismo con la susceptibilidad de padecer cáncer de mama. No se encontró asociación estadísticamente significativa cuando se comparó este polimorfismo en pacientes y controles con el riesgo de cáncer de mama (Tabla 49). 109 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 49: Asociación entre el polimorfismo NKG2DThr72Ala y el riesgo de cáncer de mama. Genotipo Thr72Ala NKG2D Pacientes n=200 (%) Controles n=169 (%) OR IC p AIC Codominante: - GG - AA - AA 134 67 61 30,5 5 2,5 106 62,7 58 34,3 5 3 1 1,2 1,26 0,77-1,87 0,36-4,48 0,689 514,2 Dominante: - GG - AG-AA 134 67 66 33 106 62,7 63 37,3 1 1,21 0,79-1,85 0,390 512,2 Recesivo: - GG-AG - AA 195 97,5 5 2,5 164 97 5 3 1 1,19 0,34-4,18 0,787 512,9 S-dominante: - GG-AA - AG 139 69,5 61 30,5 111 65,7 58 34,3 1 1,19 0,77-1,84 0,434 512,3 Aditivo: 200 54,2 169 45,8 1,18 0,80-1,72 0,399 512,2 2.6. Distribución de las variantes alélicas de CTLA-4. Se analizaron dos puntos polimórficos del gen CTLA-4 (CTLA-4+49 A/G y CTLA-4-1661 A/G) en 200 pacientes con cáncer de mama y 169 controles sanos. La siguiente tabla muestra la distribución de las frecuencias de genotipos y alelos de cada polimorfismo en pacientes y controles. Para el polimorfismo CTLA-4+49 A/G, en el grupo control, se observó que el alelo A fue significativamente más frecuente que el alelo G (p= 0,020), sin embargo, no se encontraron otras diferencias en la distribución de genotipos entre pacientes y controles. En el caso del polimorfimo CTLA-4-1661 A/G, en el grupo de pacientes se objetivo que el alelo A fue 116 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España p= 0,62 CT TT todos 3 27,3 1 9,1 11 100 72 38,1 15 7,9 189 100 75 37,5 16 8 200 100 LMP7 p= 0,74 CC CA AA todos 8 72,7 3 27,3 0 0 11 100 146 77,2 40 21,2 3 1,6 189 100 154 77 43 21,5 3 1,5 200 100 TAP 1.1 p= 0,15 AA AG GG todos 6 54,5 4 36,4 1 9,1 11 100 138 73 47 24,9 4 2,1 189 100 144 72 51 25,5 5 2,5 200 100 TAP 1.2 p= 0,19 AA AG GG todos 7 63,6 3 27,3 1 9,1 11 100 141 74,6 46 24,3 2 1,1 189 100 148 74 49 24,5 3 1,5 200 100 TAP 2.1 p= 1,00 GG AG GG todos 8 72,7 3 27,3 0 0 11 100 133 70,4 50 26,5 6 3,2 189 100 141 70,5 53 26,5 6 3 200 100 TAP 2.1 p= 0,73 AA AG GG todos 5 45,5 5 45,5 1 9,1 11 100 104 55,6 65 34,8 18 9,6 187 100 109 55 70 35,4 19 9,6 198 100 TAP 2.3 TT CT 5 45,5 5 45,5 102 54 69 36,5 107 53,5 74 37 117 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España p= 0,93 CC todos 1 9,1 11 100 18 9,5 189 100 19 9,5 200 100 TABLA 56: Descriptivo de los polimorfismos en función del tipo histológico del tumor. Variable Valores n Ductal (%) n In situ (%) n Lob (%) n Mixto (%) n Total (%) CTLA4-49 p= 0,27 AA AG GG todos 93 51,7 71 41,1 13 7,2 180 100 2 66,7 0 0 1 33,3 3 100 8 72,7 3 27,3 0 0 11 100 2 33,3 4 66,7 2 0 6 100 105 52,5 81 40,5 14 7 200 100 CTLA4-1661 p= 0,61 AA AG GG todos 118 65,6 61 33,9 1 0,6 180 100 3 100 0 0 0 0 3 100 9 81,8 2 18,2 0 0 11 100 4 66,7 2 33,3 0 0 6 100 134 67 65 32,5 1 0,5 200 100 NKG2DT72A p= 0,18 AA AG GG todos 4 2,22 55 30,6 121 67,2 180 100 0 0 2 66,7 1 33,3 3 100 1 9,1 4 36,4 6 54,5 11 100 0 0 0 0 6 100 6 100 5 2,5 61 30,5 134 67 200 100 LMP2 p= 0,16 CC CT TT todos 101 56,1 65 36,1 14 7,8 180 100 3 100 0 0 0 0 3 100 3 27,3 6 54,5 2 18,2 11 100 2 33,3 4 66,7 0 0 6 100 109 54,5 75 37,5 16 8 200 100 LMP7 CC CA AA 136 75,6 42 23,3 2 1,1 2 66,7 0 0 1 33,3 10 90,9 1 9,1 0 0 6 100 0 0 0 0 154 77 43 21,5 3 1,5 118 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España p= 0,11 todos 180 100 3 100 11 100 6 100 200 100 TAP 1.1 p= 0,68 AA AG GG todos 130 72,2 45 25 5 2,8 180 100 2 66,7 1 33,3 0 0 3 100 9 81,8 2 18,2 0 0 11 100 3 50 3 50 0 0 6 100 144 72 51 25,5 5 2,5 200 100 TAP 1.2 p= 0,89 AA AG GG todos 133 73,9 44 24,4 3 1,7 180 100 2 66,7 1 33,3 0 0 3 100 9 81,8 2 18,2 0 0 11 100 4 66,7 2 33,3 0 0 6 100 148 74 49 26,5 3 3 200 1,5 TAP 2.1 p= 0,83 GG AG AA todos 126 70 48 26,7 6 3,3 180 100 3 100 0 0 0 0 3 100 7 63,6 4 36,4 0 0 11 100 5 83,3 1 16,7 0 0 6 100 141 70,5 53 26,5 6 3 200 100 TAP 2.2 p= 0,62 AA AG GG todos 98 55,1 62 34,8 18 10,1 178 100 3 100 0 0 0 0 3 100 4 36,4 6 54,5 1 9,1 11 100 4 66,7 2 33,3 0 0 6 100 109 55 70 35,4 19 9,6 198 100 TAP 2.3 p= 0,88 TT CT CC todos 97 53,9 65 36,1 18 10 180 100 2 66,7 1 33,9 0 0 3 100 4 36,4 6 54,5 1 9,1 11 100 4 66,7 2 33,3 0 0 6 100 107 53,5 74 37 19 9,5 200 100 119 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 57: Descriptivo de los polimorfismos en función del grado histológico del tumor. Variable Valores n GH1 (%) n GH2 (%) n GH3 (%) n Desc (%) N Total (%) CTLA4-49 p= 0,70 AA AG GG todos 17 56,7 11 36,7 2 6,7 30 100 43 51,8 36 43,4 4 4,8 83 100 44 53 31 37,4 8 9,6 83 100 1 25 3 75 0 0 4 100 105 52,5 81 40,5 14 7 200 100 CTLA4-1661 p= 0,08 AA AG GG todos 20 66,7 10 33,3 0 0 30 100 59 71 24 28,9 0 0 83 100 53 63,9 30 36,1 0 0 83 100 2 50 1 25 1 25 4 100 134 67 65 32,5 1 0,5 200 100 NKG2DT72A p= 0,97 AA AG GG todos 1 3,3 8 26,7 21 70 30 100 2 2,4 28 33,7 53 63,9 83 100 2 2,4 24 28,9 57 68,7 83 100 0 0 1 25 3 75 4 100 5 2,5 61 30,5 134 67 200 100 LMP2 p= 0,65 CC CT TT todos 16 55,3 11 36,7 3 10 30 100 44 53 34 41 5 6 83 100 48 57,8 27 32,5 8 9,6 83 100 1 25 3 75 0 0 4 10 19 54,5 75 37,5 16 8 200 100 LMP7 p= 0,41 CC CA AA todos 23 76,7 6 20 1 3,3 30 100 66 79,5 15 18,1 2 2,4 83 100 61 73,5 22 26,5 0 0 83 100 4 100 0 0 0 0 4 100 154 77 43 21,5 3 1,5 200 100 TAP 1.1 AA AG GG 22 73,3 8 26,7 0 0 55 66,3 26 31,3 2 2,4 63 75,9 17 20,5 3 3,6 4 100 0 0 0 0 144 72 51 25,5 5 2,5 120 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España p= 0,54 todos 30 100 83 100 83 100 4 10 200 100 TAP 1.2 p= 0,73 AA AG GG todos 22 73,3 8 26,7 0 0 30 100 58 69,9 24 28,9 1 1,2 83 100 64 77,1 17 20,5 2 2,4 83 100 4 100 0 0 0 0 4 100 148 74 49 24,5 3 1,5 200 100 TAP 2.1 p= 0,28 GG AG AA todos 23 76,7 7 23,3 0 0 30 100 54 65,1 26 31,3 3 3,6 83 100 61 73,5 20 24,1 2 2,4 83 100 3 75 0 0 1 25 4 100 141 70,5 53 26,5 6 3 200 100 TAP 2.2 p= 0,40 AA AG GG todos 20 69 5 17,2 4 13,8 29 100 45 54,9 30 36,6 7 8,5 82 100 42 50,6 33 39,8 8 9,6 83 100 2 50 2 50 0 0 4 100 109 55 70 35,4 19 9,6 198 100 TAP 2.3 p= 0,73 TT CT CC todos 19 63,3 7 23,3 4 13,3 30 100 43 52,4 32 39 7 8,5 82 100 43 51,2 33 39,3 8 9,5 84 100 2 50 2 50 0 0 4 100 107 53,5 74 37 19 9,5 200 100 121 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 58: Descriptivo de los polimorfismos en función de la afectación ganglionar al diagnóstico. Variable Valores n N0 (%) n N1 (%) n N2 (%) n N3 (%) n Total (%) CTLA4-49 p= 0,53 AA AG GG todos 47 50,5 37 39,8 9 9,7 93 100 33 49,2 31 46,3 3 4,5 67 100 17 68 7 28 1 4 25 100 7 58,3 4 33,3 1 8,3 12 100 105 52,5 81 40,5 14 7 200 100 CTLA4-1661 p= 0,77 AA AG GG todos 64 68,8 28 30,1 1 1,1 93 100 42 62,7 25 37,3 0 0 67 100 18 72 7 28 0 0 25 100 7 58,3 5 41,7 0 0 12 100 134 67 65 30,5 1 67 200 100 NKG2DT72A p= 0,46 AA AG GG todos 2 2,1 28 30,1 63 67,7 93 100 2 3 24 35,8 41 61,2 67 100 1 4 6 24 18 72 25 100 0 0 1 8,3 11 91,7 12 100 5 2,5 61 30,5 134 67 200 100 LMP2 p= 0,42 CC CT TT todos 54 58,1 32 34,4 7 7,5 93 100 35 52,2 24 35,8 8 11,9 67 100 10 40 14 56 1 4 25 100 8 66,7 4 33,3 0 0 12 100 109 54,5 75 37,5 16 8 200 100 LMP7 p= 0,45 CC CA AA todos 76 81,7 15 16,1 2 2,1 93 100 47 70,2 19 28,4 1 1,5 67 100 20 80 5 20 0 0 25 100 8 66,7 4 33,3 0 0 12 100 154 77 43 21,5 3 2,5 200 100 TAP 1.1 AA AG GG 69 74,2 22 23,7 2 2,1 45 67,2 20 29,9 2 3 18 72 6 24 1 4 9 75 3 25 0 0 144 72 51 25,5 5 2,5 122 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España p= 0,92 todos 93 100 67 100 25 100 12 100 200 100 TAP 1.2 p= 0,84 AA AG GG todos 71 76,3 21 22,6 1 1,1 93 100 47 70,2 19 28,4 1 1,5 67 100 18 72 6 24 1 4 25 100 9 75 3 25 3 0 12 100 148 74 49 24,5 3 1,5 200 100 TAP 2.1 p= 0,62 GG AG AA todos 68 73,1 23 24,7 2 2,1 93 100 43 64,2 22 32,8 2 3 67 100 20 80 4 16 1 4 25 100 8 66,7 4 33,3 0 0 12 100 141 70,5 53 26,5 6 3 200 100 TAP 2.2 p= 0,36 AA AG GG todos 56 60,9 29 31,5 7 7,6 92 100 33 50 23 34,9 10 15,2 66 100 11 44 13 52 1 4 25 100 7 58,3 4 33,3 1 8,3 12 100 109 55 70 35,4 19 9,6 198 100 TAP 2.3 p= 0,36 TT CT CC todos 55 59,1 31 33,3 7 7,5 93 100 33 48,5 25 36,8 10 14,7 68 100 10 41,7 13 54,2 1 4,2 24 100 7 58,3 4 33,3 1 8,3 12 100 107 53,5 74 37 19 9,5 200 100 123 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 59: Descriptivo de los polimorfismos en función de la afectación metastática al diagnóstico. Variable Valores n M0 (%) n M1 (%) n Total (%) CTLA4-49 p= 0,67 AA AG GG todos 98 51,6 78 41 14 7,4 190 100 7 70 3 30 0 0 10 100 105 52,5 81 40,5 14 7 200 100 CTLA4-1661 p= 1,00 AA AG GG todos 127 66,8 62 32,6 1 0,5 190 100 7 70 3 30 0 0 10 100 134 67 65 32,5 1 0,5 200 100 NKG2DT72A p= 0,15 AA AG GG todos 5 2,6 55 28,9 130 68,4 190 100 0 0 6 60 4 40 10 100 5 2,5 61 30,5 134 67 200 100 LMP2 p= 0,44 CC CT TT todos 102 53,7 73 38,4 15 7,9 190 100 7 70 2 20 1 10 10 100 109 54,5 75 37,5 16 8 200 100 LMP7 p= 0,53 CC CA AA todos 147 77,4 40 21,1 3 1,6 190 100 7 70 3 30 0 0 10 100 154 77 43 21,5 3 1,5 200 100 TAP 1.1 AA AG GG 135 71 50 26,3 5 2,6 9 90 1 10 0 0 144 72 51 25,5 5 2,5 124 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España p= 0,58 todos 190 100 10 100 200 100 TAP 1.2 p= 0,53 AA AG GG todos 139 73,2 48 25,3 3 1,6 190 100 9 90 1 10 0 0 10 100 148 74 49 24,5 3 1,5 200 100 TAP 2.1 p= 0,18 GG AG AA todos 133 70 52 27,4 5 2,6 190 100 8 80 1 10 1 10 10 100 141 70,5 53 26,5 6 3 200 100 TAP 2.2 p= 0,54 AA AG GG todos 102 54,3 68 36,2 18 9,6 188 100 7 70 2 20 1 10 10 100 109 55 70 35,4 19 9,6 198 100 TAP 2.3 p= 0,49 TT CT CC todos 100 52,6 72 37,9 18 9,5 190 100 7 70 2 20 1 10 10 100 107 53,5 74 37 19 9,5 200 100 En cambio sí hubo diferencias estadísticamente significativas cuando se analizaron los diferentes polimorfismos estudiados en función de las variables clínicas: estado hormonal al diagnóstico, estadío patológico de la enfermedad y subtipo molecular. Así pues, para la variable estado hormonal al diagnóstico, la diferencia estadísticamente significativa se encontró en los polimorfismos de de TAP 1.1 (p= 0,05) y TAP 2.1 (p= 0,03). Para el polimorfismo TAP 1.1, el genotipo más frecuente encontrado en las pacientes fue el AA, seguido del AG, mientras que el GG fue muy poco frecuente. Sin embargo, cuando las pacientes se dividían en función de su estado hormonal al diagnóstico, para el grupo de mujeres premenopáusicas, estas diferencias se acentuaban aún más, representando el genotipo AA el 81% de ellas. Para el polimorfismo TAP 2.1, el genotipo GG resultó ser el más frecuente entre las pacientes, seguido del AG y muy poco representado el AA. En cambio, al 125 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España dividirse las pacientes en función de su estado hormonal al diagnóstico, para el grupo de mujeres peri-menopáusicas cambiaba esta tendencia, aumentando de forma significativa el genotipo AA con respecto a los otros subgrupos (Tabla 60). TABLA 60: Descriptivo de los polimorfismos en función del estado hormonal al diagnóstico. Variable Valores n Peri (%) n Pos (%) n Pre (%) n Total (%) CTLA4-49 p= 0,37 AA AG GG todos 9 50 6 33,3 3 16,7 18 100 49 50 44 44,9 5 5,1 98 100 47 56 31 36,9 6 7,1 84 100 105 52,5 81 40,5 14 7 200 100 CTLA4-1661 p= 0,85 AA AG GG todos 11 61,1 7 38,9 0 0 18 100 67 68,4 30 30,6 1 1 98 100 56 66,7 28 33,3 0 0 84 100 134 67 65 32,5 1 0,5 200 100 NKG2DT72A p= 0,63 AA AG GG todos 0 0 3 16,7 15 83,3 18 100 2 2 32 32,6 64 65,3 98 100 3 3,6 26 30,9 55 65,5 84 100 5 2,5 61 30,5 134 67 200 100 LMP2 p= 0,87 CC CT TT todos 11 61,1 5 27,8 2 11,1 18 100 52 53,1 39 39,8 7 7,1 98 100 46 54,8 31 36,9 7 8,3 84 100 109 54,5 75 37,5 16 8 200 100 LMP7 p= 0,26 CC CA AA todos 15 83,3 3 16,7 0 0 18 100 78 79,6 17 17,4 3 3,1 98 100 61 72,6 23 27,4 0 0 84 100 154 77 43 21,5 3 1,5 200 100 TAP 1.1 AA 10 55,6 66 67,3 68 81 144 72 132 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España FIGURA 25: Análisis biclustering en función de la variable clínica antecedentes familiares. FIGURA 26: Análisis biclustering en función de la variable clínica recidiva de la enfermedad. 133 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España FIGURA 27: Análisis biclustering en función de la variable clínica subtipo molecular. El siguiente paso que nos propusimos era saber si los perfiles genéticos identificados en cada cluster tenían alguna significación clínica y biológica. Para ello decidimos analizar si los tumores de las pacientes que pertenecían a cada cluster compartían similares características clínico-patológicas, así como su salida clínica. En este trabajo, debido a la limitación de tiempo no hemos podido incluir el análisis final, por lo que sólo analizamos el cluster con mayor número de pacientes (n= 15) encontrado en la comparación de la variable clínica subtipo molecular (luminales frente al resto). La siguiente tabla muestras las características clínicopatológicas analizadas de cada paciente y sus resultados. 134 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España TABLA 64: Características clínico-patológicas de las pacientes. NC: no conocido. †: fallecida. Edad GH N+ T Recaída CM-6 48 GH2 No T1 No CM-13 60 GH-1 No T1 † CM-48 45 GH-2 Sí T2 No CM-49 47 GH-2 Sí T2 Sí CM-60 48 GH-2 No T2 No CM-68 51 GH-2 No T1 No CM-72 62 GH-2 No T1 No CM-80 59 GH-2 Sí T2 No CM-82 62 NC Sí T3 No CM-130 50 GH-1 No T1 No CM-132 42 GH-2 Sí T1 No CM-148 38 NC Sí T2 No CM-182 64 GH-3 No T2 No CM-183 42 GH-3 No T2 No CM-188 48 GH-2 No T2 No Como hemos dicho anteriormente, estas pacientes eran todas portadoras de tumores luminales, y por lo tanto con expresión hormonal en mayor o menor medida. La mayoría de ellas (85,6%) tenían una edad ≥ 45 años y tumores de bajo grado histológico (GH1 o 2) (73,3%). El 53,3% de ellas no tenía afectación ganglionar al diagnóstico y el 66,6% tenían tumores > 2 cm. Sólo una paciente del cluster había recaído en el seguimiento de la enfermedad y una de ellas había fallecido, aunque por causa no relacionado con su cáncer de mama. 135 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España V. DISCUSION 136 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España 137 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España La tumorigénesis es un proceso que involucra múltiples pasos, que a su vez producen cambios genéticos que finalmente conducen a la transformación progresiva de una célula normal en una célula neoplásica. Durante este proceso que da lugar al desarrollo de los tumores, cada cambio genético confiere algún tipo de ventaja adicional para el crecimiento y eventualmente el establecimiento de metástasis (Hanahan D y Weinberg RA, 2000). Se ha sugerido que existen seis alteraciones esenciales en la fisiología de las células que colectivamente permiten la transformación celular. Estas alteraciones provocan: - Autosuficiencia en la producción de factores de crecimiento. - Pérdida de respuesta a señales inhibitorias del crecimiento celular. - Evasión de o resistencia a la apoptosis. - Adquisición de potencial replicativo ilimitado. - Promoción de la angiogénesis sostenida. - Invasión de tejidos (capacidad de metastatizar). Se sabe que estas células, en su proceso de neotransformación expresan neoantígenos que pueden ser reconocidos por el sistema inmune del organismo. A través del reconocimiento de estos antígenos tumorales, el sistema inmune es capaz de atacar a las células transformadas, destruyéndolas antes de que el tumor se forme como una masa celular de un tamaño detectable clínicamente. A pesar del rol del sistema inmune como efector de una respuesta inmune anti-tumoral, en muchos casos las células tumorales no son eliminadas de forma eficiente. Esto se debe a que los tumores han desarrollado una gran variedad de mecanismos de escape que les permite evadir la respuesta inmune del organismo. Algunos autores consideran que no existe “escape” del tumor porque la respuesta inmune contra el tumor, al igual que contra los tejidos normales, se caracteriza por la ignorancia, tolerancia y supresión (Restifo NP et al., 2002). Sin embargo, existen evidencias que indican que el sistema inmune selecciona durante la formación del tumor, variantes que están mejor adaptadas para sobrevivir en un ambiente inmunológicamente intacto (Dunn GP et al., 2002), de una manera muy parecida a lo que hace con virus, bacterias y parásitos. Por ejemplo, los tumores que se forman en huéspedes inmunocompetentes son menos inmunogénicos que los tumores que se desarrollan en ausencia de un sistema inmune intacto. De esta manera en los tumores que se generan bajo la presión del sistema inmune, se seleccionan aquellas células más resistentes a los mecanismos efectores citotóxicos, produciendo variantes tumorales con inmunogenicidad reducida o que adquieran otros mecanismos que les permitan evadir o suprimir el ataque inmune, y que tienen más probabilidades de sobrevivir en el hospedador inmunocompetente (Shankaran V et al., 2001). Por lo tanto, se puede decir que el sistema inmune ejerce una doble acción, por una parte, protectora sobre el hospedador, y por otra, una acción modeladora sobre el tumor en desarrollo. 138 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España Por otro lado se sabe que el sistema inmune no es el mismo en todos los individuos, sino que entre unos y otros se encuentran variaciones en el repertorio de células efectoras y de moléculas implicadas en el reconocimiento antigénico. Por un lado, estas variaciones son producto de reordenamientos genéticos a nivel de las células linfoides que dan lugar al receptor clonotípico propio de estas células (TCR). Cada clon, a través de su TCR, reconoce específicamente una secuencia peptídica proveniente del procesamiento antigénico llevado a cabo en el interior de las células. En este caso, la célula tumoral procesaría péptidos característicos que funcionarían como antígenos tumorales, que al ser presentados unidos a las moléculas de HLA, deberían ser reconocidos por algunos de estos clones de linfocitos. Estas moléculas, codificadas por el MHC, se caracterizan por su alto grado de polimorfismo y son las responsables de proporcionar el contexto adecuado para el reconocimiento de los antígenos por parte de los linfocitos T, ejerciendo así un papel crucial en el desarrollo y control de la respuesta inmune. Todas estas variaciones polimórficas, son funcionalmente aptas, por lo que no pueden considerarse mutaciones patogénicas, sino simplemente modificaciones que introducen la variabilidad necesaria, dotando así al organismo de la capacidad de detección de un amplio conjunto de patógenos, tejidos dañados o células transformadas y al mismo tiempo haciendo que cada individuo tenga un repertorio inmunológico propio y responda de forma única. Sin embargo, se sabe que estas variaciones que dan lugar a polimorfismos funcionalmente aptos pueden afectar a la susceptibilidad frente a distintas enfermedades. Existen múltiples evidencias en la literatura de que la susceptibilidad genética al cáncer puede deberse, entre otras, a variaciones heredadas de los genes del MHC, así como de otras moléculas implicadas en el reconocimiento antigénico. Las variantes polimórficas de este sistema genético si bien no pueden considerarse de alta penetrancia respecto a su influencia en el cáncer, podrían englobarse dentro del grupo de genes de baja penetrancia, que actuando conjuntamente entre sí junto con factores ambientales, pueden afectar a la susceptibilidad o bien a la protección a padecer la enfermedad. Los genes MHC son enormemente polimórficos, lo que significa que existen muchos alelos diferentes en los distintos individuos de la población. El polimorfismo es tan grande que en una población mixta (no endogámica) no existen indiviudos que tengan excactamente el mismo juego de genes y moléculas MHC, excepto los gemelos idénticos. Las regiones polimórficas de cada alelo se encuentran en la zona de contacto con el péptido que va a presentar al linfocito. Por esta razón, la zona de contacto de cada aleleo de molécula MHC es muy variable, ya que los residuos polimórficos del MHC forman hendiduras específicas en las que sólo pueden introducirse cierto tipo de residuo peptídico, lo cual impone un modo de unión muy preciso entre el péptido y la melécula MHC. La evolución del polimorfismo MHC asegura que una población será capaz de defenderse frente a la enorme diversidad de patógenos existentes, y que no sucumbirá ante la presencia de un nuevo 139 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España patógeno o un patógeno mutado, porque al menos algunos individuos serán capaces de desarrollar una respuesta inmune adecuada para vencer al patógeno. Las variaciones en las secuencias de MHC (responsables del polimorfismo) resultan de la herencia de diferentes moléculas MHC, y no son inducidas por recombinación, como ocurre con los receptores de antígenos. La herencia de alelos específicas de HLA clase I y II pueden promover la generación de células T específicas para la eliminación de patógenos, además de correlacionarse con resistencia a tumores, particularmente aquellos ligados a etiología viral (Wank R et al., 1993; Apple RA et al., 1994; Nawa A et al., 1995). Por otra parte, en muchos tumores, las alteraciones somáticas pueden contribuir a la regulación a la bja de la expresión de genes HLA clase I en las células tumorales (Marincola FM et al., 2000). Estas alteraciones podrían contribuir potencialmente a la evasión inmune y podrían presentar un paso más en el proceso de tumorogénesis. Hay también evidencias de que los tumores de mama HLA clase I negativos tienen un potencial metastático y una agresividad clínica mayor (Concha A et al., 1991; Goepel JR et al., 1991). Si la inmunovigilancia es importante durante la tumorogénesis, ciertos individuos que porten determinados alelos podrían ser más susceptibles o resistentes a tipos específicos de cáncer. La presentación de antígenos tumorales al sistema inmunológico tiene lugar a través del sistema HLA clase I. Los polimorfismos que dan lugar a los diferentes alelos de HLA se encuentran localizados fundamentalmente en la región que conforma el sitio de unión al péptido. Este hecho puede afectar a la afinidad del sitio de enlace por determinados antígenos en función del polimorfismo existente, lo que explicaría que algunos de los alelos pudieran encontrarse asociados a determinadas enfermedades. Actualmente se conocen cientos de enfermedades, la mayoría de ellas infecciosas o autoinmunes, asociadas con uno o más genes clásicos y no clásicos de la región MHC (Brewerton DA et al., 1973; Schlösstein L et al., 1973; Contu L et al., 1998; Ma JJ et al., 1998; Noble JA et al., 2008). Sin embargo, si nos referimos a la bibliografía, observamos que a lo largo de los años los estudios de frecuencias de moléculas HLA y cáncer realizados han arrojado resultados muy dispares, encontrándose que las asociaciones halladas varían a menudo en función del área geográfica donde se haya llevado a cabo el estudio. De este modo, podemos encontrar alelos que confieran suscetibilidad o una enfermedad en determinadas áreas, pero no en otras (Ghaderi M et al., 2000,2002; Dehaghani AS et al., 2002; Hamsiková E et al., 1999; Wu Y et al., 2007; Madeleine MM et al., 2002; de Jong MM et al., 2005; Chatzipetrou MA et al., 1999; Lee JE et al., 1996; Chaudhuri S et al., 2000; Subira ML et al., 1979; Lindenberg P et al., 1986; Gourley C et al., 2003). Una de las posibles explicaciones a este fenómeno va ligada a la función primordial de las moléculas HLA, que es presentar a células del sistema inmunológico péptidos intracelulares o de antígenos exógenos, fundamentalmente procedentes de patógenos infecciosos. Esto ha tenido como consecuencia que este sistema molecular se haya visto sometido a una presión ambiental de selección, provocada por el conjunto de patógenos propios de la zona, que ha 140 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España desembocado finalmente en que puedan encontrarse variaciones significativas de las frecuencias de los diferentes alelos dependiendo del área geográfica. En nuestro trabajo, al comparar las frecuencias de los alelos HLA en pacientes con CM y controles sanos, se encontraron diferencias estadísticamente significativas en tres alelos HLA (B15, B35 y B38). HLA-B15 se hayó incrementada en pacientes respecto a controles (p= 0,013) y HLA-B35 y -B38 se encontraron aumentadas en controles respecto a pacientes (p= 0,022 y p= 0,028 respectivamente). Sin embargo, cuando se realizó la corrección por el número de alelos (test de Bonferroni) se perdió la significación estadística en los tres alelos. Si lo comparamos con lo publicado en la literatura, no se encontró diferencia en la frecuencia del alelo HLA-B7 entre pacientes y controles. Subira y colaboradores (1997) realizaron un estudio de frecuencias de HLA en 50 pacientes españolas con CM y controles sanos mediante métodos serológicos, encontrándose un aumento de la frecuencia del alelo HLA-B7 en pacientes. Posteriormente, el grupo de Lavado y colaboradores (2005) obtuvo el mismo resultado cuando comparó las freuencias de los alelos HLA entre mujeres diagnosticadas de CM del Sur de España y controles sanos de la misma área geográfica, con la diferencia de la técnica utilizada, que es este caso se hizo mediante tecnología molecular (PCR-SSP) y con un tamaño muestral mayor, confiriendo al estudio un mayor poder estadístico. Estos datos sugieren que el alelo de clase I HLA-B7 pudiera estar relacionado con una susceptibilidad a padecer CM. En nuestro trabajo no hemos encontrado esta asociación entre HLA-B7 y un aumento del riesgo de padecer CM. Los motivos pueden ser múltiples. Aunque nuestro grupo de pacientes pertenece a la misma área geográfica que el de Lavado y colaboradores, en nuestro caso contábamos con un grupo de pacientes con antecedentes familiares (34%), pudiendo contribuir a las diferencias de los resultados. Por otra parte diferencias secundarias a la técnica de análisis de los alelos. Aunque en ambos trabajos se usaron técnicas moleculares, en nuestro trabajo, el análisis de los alelos HLA se realizó mediante PCR-SSO, una técnica de más alta resolución, mientras que en el grupo de Lavado mediante PCR-SSP. Por otra parte, también se han llevado a cabo por otros grupos estudios de asociación en los que se han analizado frecuencias de HLA clase II en pacientes con CM. Como resultado de estos trabajos han sido sugeridos como protectores frente al CM los alelos HLA-DRB1* 1101 y DQB1* 03032 (Chaudhuri S et al., 2000). En nuestro trabajo sólo se analizó HLA-DRB1, no encontrándose diferencias estadísticamente significativas en la distribución de frecuencias entre pacientes con CM y controles sanos. Al igual que en el grupo de Lavado y colaboradores (2005), esta discrepancia en los resultados puede explicarse teniendo en cuenta que el grupo de pacientes utilizado por Chaudhuri y colaboradores está compuesto exclusivamente por mujeres diagnosticadas a edad temprana (early-onset), es decir, con menos de 40 años, en cuya categoría nosotros incluimos únicamente 29,5% de pacientes. Así mismo, aunque ambas poblaciones de estudio son caucasoides, pertenecen a áreas geográficas muy distintas, lo que podría influir en las frecuencias de los alelos obtenidas en los diferentes estudios. 141 Implicación de perfiles inmuno-genéticos de la respuesta inmune citotóxica en la susceptibilidad y/o evolución de pacientes con cáncer de mama del Sur de España Cuando la eliminación de células tumorales a través de mecanismos de citotoxicidad en los que interviene el MHC ha sido eludida, queda la vía de la respuesta citotóxica a través de las células NK. El reconocimiento de las células tumorales por parte de la inmunidad innata utiliza receptores de la línea germinal no reordenados y por tanto carece del reconocimiento específico con restricción del MHC (Papazahariadou M et al., 2007; Sfondrini L et al., 2003). En el caso de las células NK, el reconocimiento está regulado por diferentes tipos de receptores. Por un lado están los receptores Kir (killer inhibition receptors), reconocen MHC clase I, por lo que las células NK son capaces de identificar a los tumores mamarios que pierdan moléculas MHC clase I durante la carcinogénesis (Moretta L et al., 1994; Moretta L et al., 2002; Stein MN et al., 2006). Otro receptor importante lo constituye NKG2D, que reconoce células transformadas. El daño del ADN celular en lesiones preneoplásicas o tumores invasivos es un factor que regula a los ligandos NKG2D, lo que explicaría que las células tumorales sean reconocidas por el sistema inmune innato, y como consecuencia, antiven la respuesta adaptativa. NKG2D es un receptor activador expresado en células T CD8+, células T γδ y células NK. En las células T, NKG2D actúa como receptor co-estimulador, mientras que en las células NK éste puede inducir directamente citotoxicidad. Como NKG2D no tiene dominio intracelular, la molécula adaptadora DAP10 es esencial para la señalización. La unión del ligando con el receptor NKG2D permite la fosforilación del dominio citoplasmático de DAP10, promoviendo la activación de la vía PI3K/GrB-2, y a su vez activación de MEK y ERK. Se sabe de la existencia de un polimorfismo de nucléotido simple (SNP) (rs2255336 G->A) en la región transmembrana de NKG2D, el cual se caracteriza por la sustución de una alanina por treonina, dando lugar al cambio de nucleósido guanina por adenosina. Este es el único SNP conocido que se encuentra en la región transmembrana del receptor, cerca del sitio de unión de la proteína adaptadora DAP10 y se ha visto que puede estar asociado con disminución de la función de las células NK y células T (Kabalak G et al., 2010; Hayashi T et al., 2006). En la literatura podemos observar la implicación de este polimorfismo con neoplasias y enfermedades autoinmunes. Así por ejemplo, se ha visto que mujeres con cáncer de cérvix y que son portadoras de la variante génica NKG2D 72Thr podrían estar protegidas frente a la progresión de la enfermedad a estadíos más avanzados (Roszak A et al., 2012). Igualmente, esta variante génica podría proteger también frente a la incidencia del lupus eritematoso sistémico (LES) (Piotrowski P et al., 2012). Por último, en un trabajo realizado sobre población alemana y española se vió que el genotipo GG de NKG2DThR72Ala se asoció de forma estadísticamente significativo con el desarrollo de LES en la cohorte alemana y con una tendencia a la significación en la cohorte espalola (Kabalak G et al. 2010). En nuestro trabajo se genotipó este punto polimórfico de NKG2DThr72Ala en pacientes con CM y controles sanos, no encontrándose diferencias estadísitcamente significativas cuando se compararon las frecuencias de genotipos y alelos entre los dos grupos.