Estrés oxidativo como diana de tratamiento experimental del Síndrome X Frágil

!!!!!! ! ! Biología Celular, Genética y Fisiología Facultad de Ciencias Universidad de Málaga Instituto de Investigación Biomédica de Málaga ESTRÉS OXIDATIVO COMO DIANA DE TRATAMIENTO EXPERIMENTAL DEL SÍNDROME X FRÁGIL ! Memoria de Tesis Doctoral presentada por FRANCISCO MANUEL GARCÍA GUIRADO Licenciado en Biología para optar al grado de Doctor por la Universidad de Málaga Málaga, 2015 AUTOR: Francisco Manuel García Guirado http://orcid.org/0000-0003-1662-2691 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es !!!!!! ! ! ! ! !!!!!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!!!!! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! ! Doña YOLANDA DE DIEGO OTERO, Doctora en Biología, coordinadora del grupo PAIDI CTS-546 y CoIR del grupo de Investigación en Salud Mental del área 2 del IBIMA. ! ! ! ! CERTIFICA que Don FRANCISCO MANUEL GARCÍA GUIRADO, licenciado en Biología por la Universidad de Málaga, ha realizado bajo su dirección y en el Instituto de Investigación Biomédica de Málaga-IBIMA el trabajo titulado: “ESTRÉS OXIDATIVO COMO DIANA DE TRATAMIENTO EXPERIMENTAL DEL SÍNDROME X FRÁGIL”, reuniendo el mismo las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor. Málaga, 14 de Octubre de 2015 Dra. Yolanda de Diego Otero Directora !!!!!! ! ! !!!!!! ! ! Don FRANCISCO JAVIER RUIZ ALBERT, Profesor Contratado Doctor del Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Málaga CERTIFICA que Don FRANCISCO MANUEL GARCÍA GUIRADO, licenciado en Biología por la Universidad de Málaga, ha realizado bajo su tutoría y en el Instituto de Investigación Biomédica de Málaga-IBIMA el trabajo titulado: “ESTRÉS OXIDATIVO COMO DIANA DE TRATAMIENTO EXPERIMENTAL DEL SÍNDROME X FRÁGIL”, reuniendo el mismo las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor. Málaga, 14 de Octubre de 2015 Dr. Francisco Javier Ruiz Albert Tutor !!!!!! ! ! !!!!!! ! ! Yo, FRANCISCO MANUEL GARCÍA GUIRADO, declaro que soy autor del presente trabajo de investigación titulado “ESTRÉS OXIDATIVO COMO DIANA DE TRATAMIENTO EXPERIMENTAL DEL SÍNDROME X FRÁGIL”,, y que ha sido realizado en el Instituto de Investigación Biomédica de Málaga-IBIMA, bajo la dirección de la Dra. Yolanda de Diego Otero, y como tutor al Dr. Francisco Javier Ruiz Albert. Y para que así conste, firmo el presente certificado en Málaga, 14 de Octubre de 2015. Fdo. Francisco Manuel García Guirado !!!!!! ! ! ! !!!!!! ! ! AGRADECIMIENTOS Las pipetas dejan paso a las palabras y son muchas las que he escrito sobre el Síndrome X Frágil. Ahora en las postrimerías de este otoño malagueño, me acerco a la obtención del titulo de Doctor (PhD) y, por tanto, a la consecución de un sueño. Es en este momento en el cual quiero que el estéril blanco del folio se convierte en palabras de agradecimiento. Se que estás palabras que escribo no llegarán a cumplir mis expectativas, ya que no serán capaces de transmitir todo el agradecimiento que tengo. A mi familia, Papá, Mamá y Nacho, pilares que sois de mi, de mi educación, de mi ser, de mi forma de actuar y de mi manera de entender a la vida. Sin vosotros a mi lado no me entiendo. No hay en este mundo papel que soporte la infinita gratitud que tengo hacia vosotros. Cada palabra de ánimo han sido para mi alma, un cosquilleo y se ha sentido en el corazón como una sístole de esperanza. Mamá y Papá, en vuestros desvelos y en vuestras palabras siempre encuentro el apoyo necesario que me hace crecer. Por vosotros he llegado hasta aquí y a vosotros os brindo todo lo que hago. Mi mayor orgullo es decir que mis padres están leyendo estas líneas y que han puesto lo mejor que tenían, en todo momento, para ayudarme a que esto se haga realidad. Nacho, Rocío y Alba gracias por estar conmigo y por darme los momentos de alegría, necesarios para poder seguir investigando. Como algo tan pequeño hace que quiera sacar lo mejor de mi. Cuando hablas de alguien y se te llena los pensamientos de alegría, cuando piensas en esa persona y quieres hacer lo mejor, cuando en esos momentos donde desearías romper con todo y después de una palabra de ella quieres arreglarlo todo, cuando esa persona te acompaña y te da su animo y aliento en el momento adecuado; sabes ya, que esa persona es la mejor. Bea tu lo eres, te agradezco que estés a mi lado en estos momentos y que hayas estado en estos últimos años dando lo mejor que tenias (todo lo que tienes) para hacer que el día de hoy sea una realidad y que me encuentre tan cercano a mi sueño. Muchas gracias por todo el amor y por todo lo que me das. Siempre seremos nosotros. A Francis, hermano no de carne pero de sentimiento similar (biólogo/cofrade como yo), y Rocío que deciros si desde que comencé a formarme como biólogo !!!!!! ! ! siempre habéis estado y desde los primeros días de la carrera me habéis visto crecer y llegar ser lo que soy. Gracias por el cariño que me dais, la confianza que mostráis en mi y por hacerme vivir unas de las mejores sensaciones que se puede vivir. Tengo en ti, Francis, a un amigo y un hermano. Pablo y Alex, nunca creí que de la carrera me iban a quedar a dos de los mejores amigos que tengo pues tengo que decir que me equivocaba, yo puedo decir, sin lugar a duda, que tengo a dos compañeros de la carrera que son mis amigos y me siento orgulloso de decir que sois parte de esta tesis doctoral. A la doctora Yolanda de Diego, gracias, por darme la oportunidad de desarrollar esta tesis doctoral bajo su dirección y por todos los consejos y enseñanzas que me has brindado durante este tiempo. Lourdes, ya te dije que ibas a aparecer en estas letras, entre Cajales, Saras Borrel y Severos Ochoas nos pasamos los días de comportamiento y de tratamiento en el animalario. Atesoraré y guardaré cada una de las palabras, consejos y gesto de comprensión que has tenido conmigo. Gracias por enseñarme tanto, por darme tan buenos consejos y sobretodo por enseñarme que este trabajo puede ser bonito; sabes de sobra que te deseo lo mejor y que aquí tienes a un amigo. Guillermo, zamarrillero, cofrade y sobretodo amigo. Gracias por estar allí cuando te he necesitado, por escucharme, por hacerme participe de tu vida y sobretodo por abrirme las puertas de esta casa que es IBIMA. Contigo empezó todo. Cristina, Elena y Raul, los principios suelen ser difíciles pero con vosotros al lado no resulto nada complicado aprender todas las técnicas necesarias para arrancar. Cristina gracias por escuchar las primeras exposiciones y por darme parte de tu sabiduría en cada consejo. Elena, gracias por tu enseñanza de los westerns y de las PCRs, y Raul gracias por los consejos y ayuada en los primaros días de esta tesis. Kike y Pedro, pues esto ya esta aquí. Hay gente de las que sabes que nunca vas a olvidar, de las que siempre se tendrá algo que aprender y que son irremplazables. Os acordáis de las noches donde solucionábamos el mundo, o las noches donde me solucionasteis mi mundo; pues es eso lo que ha contribuido a que esta tesis sea una realidad. Me aceptasteis como era y me acogisteis con mi defectos. Vosotros dos sois los que en momentos de debilidad, tuvisteis el coraje de decirme lo que !!!!!! ! ! pensabais, los que me hicisteis que viera las cosas como eran, me mostrasteis la realidad y me centrasteis en lo realmente importante, la ciencia. Nunca una distancia es demasiado grande para que diga que tengo en vosotros a dos grandes amigos (uno un padrazo como el Bernabéu de grande y otro un gran melómano que más lo quisiera Radio 3). Por vosotros siempre escuchare buena música aunque el indi sigue sin ser lo mío. Sois dos de las personas más estupendas que he conocido. Francis que en estos últimos tiempo has estado cerca y que si quería aprender algo de lo que hacías siempre estabas dispuesta a enseñarme. Gracias por todas tus palabras, tus consejos y sobretodo por sacarme de la rutina del trabajo en los momentos oportunos (seguir tu ritmo es complicado). Mari Carmen, gracias por escucharme y por la compañía durante la escritura, girarme y ver que estabas me daba seguridad de que lo que estábamos haciendo tenía algún sentido. Rajaa gracias por estar siempre ahí, por escucharme y sobretodo acogerme en el Clínico. Pablo, técnico auxiliar del laboratorio, gracias por todas las buenas palabras y de que no me faltará ni gloria. La vieja guardia siempre tendrá al mejor guerrero en ti. No quiero dejar pasar la oportunidad de dar las gracias a todos los compañeros de trabajo del Hospital Civil por cada momento compartido y de ayuda que me habéis dado. He llegado a sentirme querido e integrado en el laboratorio en cada momento, sois geniales y simplemente únicos. Por ultimo, quiero agradecer a mis Titulares de Zamarrilla su compañía y el haberme guiado a lo largo del periodo de licenciatura y en este periodo predoctoral; gracias por darme una vida llena de aprendizajes, amor, experiencias y sobre todo de felicidad. En cada rezo hacia Ti, Madre, he encontrado fortaleza y el aliento que sólo Tu sabes dar. !!!!!! ! ! !!!!!! ! ! ÍNDICE DE ABREVIATURAS UTILIZADAS EN EL TEXTO Y EN LAS FIGURAS ! • AGG – Triplete de adenina-guanina-guanina • AMPA - Ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionico • ANOVA-Análisis de la varianza • ApoApocinina • RNA Ácido ribonucleico • mRNARNA mensajero • CbCerebelo • CGGTriplete de citosina-guanina-guanina • CPCorteza Prefrontal • DAB – Diaminobencidina • DIDiscapacidad intelectual • DNAÁcido desoxirribonucleico • DNAcDNA complementario • Fmr-1 - gen de discapacidad intelectual ligado al sitio frágil 1 (fragile mental retardation) • EDTAácido etilendiaminotetraacético • FMRP Proteína codificada por el gen de Fmr1 (fragile mental retardation protein) • FRAXA -Fragilidad A del cromosoma X • FXTAS - Tremor/ataxia relacionado con el X frágil • FXPOI -Insuficiencia ovárica primaria asociada al X frágil • GSHGlutatión reducido • GSSGGlutatión oxidado • Hipoc - Hipocampo • hnRNPRibonucleoproteínas • KOKnockout • LTD -Depresión a largo plazo • LTP -Potenciación a largo plazo • MDAÁcido malondialdehído !!!!!! ! ! • MelMelatonina • mGluRReceptor metabotrópico de glutamato • NESSeñal de exportación nuclear • NLSSeñal de localización nuclear. • NMDAÁcido N-metil-D-aspartato • NOS - Sintasa del oxido nítrico • PBTampón fosfato • PBSTampón fosfato salino • PCR -Reacción en cadena de la polimerasa • ProtProteínas • RNasaRibonucleasa • ROS -Especies reactivas de oxígeno • RPMRevoluciones por minuto • RT-PCR - Reacción en cadena de transcripción reversa-PCR • SDS-PAGE - Electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecil sulfato sódico • SMART - Sistema de seguimiento por vídeo que permite registrar comportamiento social • SNC -Sistema nervioso central • SXF -Síndrome X Frágil • TBARSSustancias que reaccionan al ácido tíobarbitúrico • TAEBuffer Tris-acetato-EDTA • UVUltravioleta • Vit CVitamina C (ácido ascórbico) • Vit EVitamina E (α-tocoferol) • VTN -Varones transmisores normales • WB – Western blot • WTWild type • Xq27.3Brazo largo del cromosoma X, región 27.3 !!!!!! ! ! ÍNDICE !!!!!! ! ! !!!!!! ! ! INTRODUCCIÓN ! 1. BREVE RESEÑA HISTÓRICA ...................................................................................................... 1 2. FENOTIPO DEL SÍNDROME X FRÁGIL .................................................................................... 3 3. HERENCIA ...................................................................................................................................... 6 4. EL GEN FMR1 ................................................................................................................................ 9 5. SILENCIAMIENTO GÉNICO DE FMR1 .................................................................................... 13 6. LA PROTEÍNA FMRP, “FRAGILE MENTAL RETARDATION PROTEIN" ............................... 15 7. CARACTERÍSTICAS DE MODELOS ANIMALES DEL SXF .................................................. 20 • ESPINAS DENDRÍTICASNEUROTRANSMISIÓN ...................................................... 24 • EPILEPSIA E HIPERSENSIBILIDAD .............................................................................. 26 • ATENCIÓN E HIPERACTIVIDAD ................................................................................... 27 • COMPORTAMIENTO REPETITIVO ............................................................................... 27 • ANSIEDAD ......................................................................................................................... 28 • DEFECTOS COGNITIVOS ................................................................................................ 29 8. TRATAMIENTO Y ENSAYOS EXPERIMENTALES ............................................................... 31 • ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE GLUTAMATO ................................................ 32 • MODULADORES DE N-METIL-D-ASPÁRTICO ........................................................... 34 • MODULACIÓN AMPA ..................................................................................................... 35 • MODULACIÓN DE LA SINTASA KINASA GLUCOGÉNICA 3 (GSK3)……….…… 35 • INHIBIDORES DE LA RECAPTACIÓN DE SEROTONINA……….. ........................... 37 • MODULADORES DEL ÁCIDO γ-AMINOBUTIRICO (GABA) ..................................... 37 • DIANAS EN RUTAS DE SEÑALIZACION INTRACELULAR ..................................... 40 • REGULACION DE LA MATRIZ DE METALOPEPTIDASA-9 (MMP9) ...................... 41 • RECEPTORES DE CANNABINOIDES ............................................................................ 41 9. EL ESTRÉS OXIDATIVO Y EL SÍNDROME X FRÁGIL ......................................................... 44 • GENERACIÓN DE ROS Y RNS ........................................................................................ 47 • DEFENSA ANTIOXIDANTE ENDOGENA ..................................................................... 49 • COMPUESTOS TERAPÉUTICOS ENSAYADOS ........................................................... 52 o Inhibidor de la proteína rac 1 ................................................................................ 52 o Vitamina e ............................................................................................................. 54 o Vitamina c ............................................................................................................. 55 o Apocinina ............................................................................................................. 57 o Estatinas ................................................................................................................ 59 ! ! INTRODUCCIÓN 2! A pesar de que en 1969 Lubs descubriera el sitio frágil en el brazo largo del cromosoma X en la banda Xq27.3, no fue hasta unos años después cuando se pudieron repetir los experimentos de Lubs. En 1977 Sutherland hace el descubrimiento de que, dependiendo de la composición del medio donde los linfocitos son cultivados, el sitio de rotura se observará o no. Se ve que los medios deficientes en ácido fólico son necesarios para que se manifieste la fragilidad del cromosoma X (Sutherland GR, 1977). Una vez descubierto esto, se prueba en diferentes familias con aparente discapacidad intelectual ligada al X y se observa que está presente en alta proporción (Turner G y col. 1980). De esa manera se establece la presencia del sitio de fragilidad FRAXA, presente en el cromosoma X, como criterio de diagnóstico del síndrome. Sin embargo la presencia de otros 2 sitios frágiles en Xq28, hace poco eficaz esta técnica de diagnóstico ya que patologías diferentes podían confundirse por la presencia de fragilidad, y muchos casos de afectados no mostraban la fragilidad citogenética, lo que limitaba su utilidad. Y en contadas ocasiones podía ser usado para detectar a los portadores pues no manifestaban la fragilidad. Por lo que la utilización de técnicas modernas más efectivas ha permitido una mejora significativa del diagnóstico del síndrome. Por está característica se nombra esta patología al asociarse a un sitio frágil, que aparece como una banda isocromática al final del brazo largo del cromosoma sexual X que puede observarse al microscopio de una preparación de células en metafase para estudios de citogenética (Krawczun y col, 1985; Verdyck, P y col.2015). Figura 1. Visualización de los cromosomas X en pacientes femeninos y masculinos con el cromosoma X con fragilidad en su extremo inferior. En la parte derecha se muestra a una mujer con un cromosoma X normal y otro con fragilidad, mientras que en su izquierda se muestra un hombre con un cromosoma X frágil y el pequeño cromosoma Y. La flecha nos indica el sitio de rotura Xq27.3. INTRODUCCIÓN 3! El elevado número de mutaciones en genes ligados al cromosoma X, que causan discapacidad intelectual, explica el elevado número de varones frente al reducido número de mujeres (Stevenson RE y col., 2000). La ausencia en varones de un segundo cromosoma X hace que no se puedan compensar posibles mutaciones genéticas. Durante las últimas décadas se han ido identificando hasta 124 genes que causan diferentes formas o síndromes que llevan a la discapacidad intelectual ligada al cromosoma X (XLMR), estas condiciones representan el 16% de todos los tipos de discapacidad intelectual de origen genético hereditario. Por lo que también se han mapeado numerosos genes ligados a formas de discapacidad intelectual (DI) con un tipo de herencia autosómica (Chelly J and Mandel JL, 2001, Neri G and Chiurazzi P, 1999). Numerosos genes identificados codifican para proteínas que tienen su función en la ruta Rho/Rac GTPasa, que está implicada en un gran número de procesos celulares como la remodelación de actina lo que afecta a la formación y maduración de las espinas dendríticas, que alterará el correcto establecimiento y mantenimiento de las sinapsis neuronales (Chelly J & Mandel JL, 2001). La forma más recurrente de XLMR es el Síndrome X Frágil (SXF), causado por una expansión inestable de las repeticiones CGG en el gen FMR1 que tras un proceso de metilación su transcripción se verá silenciada, lo que lleva a la perdida de la proteína FMRP, una proteína que funciona como transportadora de RNA (RNA binding protein). Desde 1991, y debido a trabajos de Verker (Verker AJ. y col., 1991), importantes estudios se han ido desarrollando para comprender el SXF, desentrañar la genética del gen Fmr1 y la función de la proteína FMRP. 2. FENOTIPO DEL SÍNDROME X FRÁGIL Los varones con mutación completa presentan comúnmente una baja incapacidad intelectual respecto a la media (el promedio del QI es de 40-50) (Hagerman PJ y col., 2009). Mientras que las mujeres con mutación completa presentan discapacidad en el aprendizaje, con un 25 % de incapacidad intelectual (De Vries y col, 1996). Las discapacidades que presentan las mujeres son: discapacidad visoespacial, problemas en la memoria de trabajo, procesamiento de la información y atención (Freund LS y col., 1993). INTRODUCCIÓN 4! Las manifestaciones físicas en varones afectados por SXF son poco evidentes al nacimiento, y muy sutiles en la primera infancia. Las características fenotípicas descritas en el síndrome incluyen macroorquidismo (tamaño aumentado de los testículos sobre todo en la etapa postpuberal), orejas grandes y prominentes, macrocefalia, mandíbula alargada y alteraciones del tejido conectivo que provoca articulaciones hiperextensibles, pies planos, prolapso de la válvula mitral y piel suave (Hagerman PJ y col., 2009). Los pacientes con el SXF muestran normalmente otitis recurrentes, estrabismo, reflujo gastroesofágico, apnea y problemas de sueño y convulsiones, en muchos casos llegan a desarrollar epilepsia (Gross C y col., 2015). Los varones que presenta al SXF tienen un comportamiento muy característico en el que se puede incluir hiperactividad, impulsividad, problemas de atención, ansiedad, labilidad emocional, así como unas series de características propias del autismo donde se incluirían el pobre contacto visual, la timidez, ausencia o problemas del lenguaje, agitación impulsiva de las manos, hiperexcitación o sobre-reacción a estímulos sensoriales (olores, luces, ruidos, nuevos ambientes y multitud de gente) y problemas en el comportamiento social (Hagerman PJ y col., 2009; Berry-Kravis & Potanos, 2004; Wang H y col., 2010). Diferentes estudios demostraron que hay un aumento de la actividad del sistema sensorial simpático como respuesta a estímulos electrodermales (Miller LJ y col., 1999), así como una respuesta pupilar distinta, variabilidad en tasa cardiaca (Boccia ML & Roberts JE. 2000) y anormalidad en la entrada de estímulos que puede demostrarse con los estudios de inhibición por prepulso (Hessl D y col., 2008). Los desórdenes de la ansiedad se dan tanto en varones como en mujeres con SXF, en estos se incluyen mutismo selectivo, poco contacto visual, aislamiento social y aparición de distintas fobias, entre ellas la fobia social (Hagerman y col., 2009; De Vries y col., 1996; Sullivan K y col. 2007). En mujeres con SXF la sintomatología es más leve, se exhibe más variabilidad y es menos frecuente la aparición de las características físicas o los problemas médicos, pero a veces presentan problemas de atención, impulsividad y déficit en la ejecución de funciones incluso cuando su CI está dentro del rango normal (Hagerman PJ y col., 2009; Berry-Kravis E & Potanos, 2004; De Vries y col., 1996; Wang H y col., 2010). Respecto a los rasgos autistas que son comunes en las mujeres con SXF pueden INTRODUCCIÓN 5! aparecer timidez extrema, mutismo selectivo, fobias específicas, ansiedad social y déficit en cuanto a la socialización. El desarrollo del lenguaje, ciertamente, se retrasa en muchos de los individuos con SXF. No es de extrañar que tanto mujeres como varones con SXF mantengan elementos pre lingüísticos a lo largo de su vida, sin embargo llegan a obtener la capacidad de comunicarse pero el desarrollo de las habilidades lingüísticas a lo largo de su vida es ciertamente menor que en individuo sin la enfermedad (Gross C y col., 2015). Figura 2. Características fenotípicas más comunes del SXF. Modificado desde Saldarriaga W et al, 2014. Estrabismo Orejas grandes y evertidas Discapacidad mental Hipotonia (niños) Clonus (adultos) Convulsiones Problemas de sueño Escoliosis Prolapso de la valvula mitral Obesidad o Extrema delgadez Cara alargada Prognatismo mandibular Paladar hendido Defecto dentario Frente amplia Macroorquidismo Pie plano Hiperextensibilidad y problemas de las articulaciones INTRODUCCIÓN 6! 3. HERENCIA El SXF es una enfermedad genética con una herencia dominante ligada al cromosoma sexual X, caracterizada por tener una penetrancia incompleta y ser parte del grupo de enfermedades causadas por mutaciones en el gen del discapacidad intelectual X frágil (FMR1), denominadas trastornos asociados al X frágil (TASXF). En este conjunto de enfermedades engloba al SXF, el síndrome de tremor/ataxia asociado al X frágil (FXTAS) y el síndrome de insuficiencia ovárica primaria asociada al X frágil (FXPOI) (Rooms L Kooy RF, 2011). El SXF presenta la característica del fenómeno de anticipación, es decir, que dentro de una misma familia la enfermedad se puede manifestar antes y tener una clínica más severa al trasmitirse a la siguiente generación. En el SXF se cumple perfectamente con lo expuesto por Sherman en su famosa paradoja: 1) el riesgo de transmisión de la enfermedad aumenta en sucesivas generaciones y 2) se encuentran varones normales portadores que transmiten la enfermedad a todas sus hijas, que serán por tanto portadoras sanas (Fu et al, 1991). Las mujeres se caracterizan por poseer dos cromosomas sexuales X en cada una de las células de su organismo, siendo portadoras si el gen FMR1 presenta una expansión en el rango de premutación o mutación completa en uno de los dos cromosomas. Las diferencias fenotípicas presentes entre una mujer portadora de una premutación y otra con mutación completa se explica por los distintos niveles de expresión de la proteína de la discapacidad intelectual (FMRP) y por la inactivación que ocurre fisiológicamente al azar en uno de los dos cromosomas sexuales, el cromosoma X mutado o el normal en cada célula del organismo. Hay mujeres portadoras normales que no tienen los rasgos característicos del síndrome, aunque 1/3 de las mujeres portadoras de la mutación completa pueden tener algún grado de DI, en la mayoría de los casos la sintomatología es leve, pero excepcionalmente en algunos casos los niveles bajos de FMRP provocan un fenotipo físico y neuropsiquiatrico similar al observado en varones afectados. En las mujeres portadoras la probabilidad de que su descendencia herede el cromosoma alterado es del 50% (Reyniers y col, 1993, DyerFriedman J y col, 2002, De Vries BB y col, 1996). INTRODUCCIÓN 7! En este Síndrome se describió por primera vez una forma de mutación nueva denominada mutación dinámica, se observo una zona del gen Fmr1 que resultó ser inestable y que cambiaba de tamaño pasando de un estadío de premutación cuando en el gen se encuentra una expansión de 55-200 del triplete CGGn. Esta zona de repeticiones, debido a la pérdida de tripletes AGG que estabilizarían la secuencia cada 9-11 repeticiones, sufre una inestabilidad y tendrá riesgo de cambiar el número de tripletes CGGn en la siguiente generación para que, en muchos casos se expande a tamaños que duplican y hasta quintuplican el número de repeticiones. La prevalencia de portadores de premutación es en la población general es de una de cada 113-259 mujeres y de cada uno de cada 260-813 varones (Hagerman PJ, 2008). El estado premutado del gen no afecta sustancialmente a la expresión de la proteína FMRP, sin embargo, aumenta la expresión del mRNA que codifica el gen Fmr1, lo que en determinadas circunstancias determina la aparición de FXTAS de expansiones sobre 100 repeticiones de CGG van emparejadas a mutación completa y SXF en la consiguiente generación (Tassone F y col. 2007).!La presencia de la premutación en el gen Fmr1 no provoca manifestaciones fenotípicas en los portadores (tanto varones como en mujeres), sin embargo se ha descrito que la expansión de los alelos premutados sólo se produce por vía materna, y la probabilidad de que esto suceda depende de la edad de la madre, del número de las repeticiones y del número de interrupciones AGG presentes en el gen Fmr1 con un tamaño de la premutación. Los alelos premutados suelen expandirse al pasar a la descendencia y si superan los 200 tripletes de CGG, en un embrión varón que a diferencia de la mujer solo tienen un cromosoma sexual X, el individuo estará afectado por el síndrome manifestando algún grado de sintomatología. Al existir un estadío de premutación hay una excepción a esta generalidad que son los varones transmisores normales (VTN), que suelen ser los abuelos maternos de estos niños afectados. Los VTN son intelectualmente normales, sin embargo transmitirán el gen Fmr1 premutado a todas sus hijas (que correspondería al 50% de la descendencia total) y no suele presentar sintomatología neuropedríatica. Todos los hijos varones de un VTN serán sanos pues del par de cromosomas sexuales heredan el cromosoma Y del padre (Reyniers et al, 1997) Las mujeres portadoras (hijas de un VTN) presentan riesgos diferentes de trasmitir la enfermedad a su descendencia de los calculados para una portadora con INTRODUCCIÓN 8! mutación completa que expresa en algún grado la enfermedad y que recibió el gen de la hija de un VTN (generación III), esto es un ejemplo del fenómeno de anticipación genética, al que nos hemos referido anteriormente . (Fu y col, 1991). Figura 3. Genealogía de una familia que trasmite la mutación causante de distintos desórdenes relacionados con el SXF. El síndrome se diagnostica analizando el gen Fmr1 para detectar la expansión de las repeticiones de CGGn. Símbolos cuadrados indican varón y redondos indican mujer. Símbolos en blanco indican un genotipo normal, en negro indican individuos con una mutación completa, y símbolos con un punto indican individuos portadores y rayados con un punto representan portadores con expresión fenotípica parcial. Tomado de Pintado E y col., 1995 (Pintado E y col., 1995). El fenotipo clínico de las personas portadoras de una premutación, está íntimamente relacionado con la toxicidad producida por los niveles altos de mRNA codificado por el gen FMR1, sin embargo la proteína FMRP se expresa ,aunque en pequeña cantidad, pero suficiente para que no se desarrolle el fenotipo completo del SXF. Las mujeres portadoras de la premutación tienen incrementado el riesgo de desarrollar tremor/ataxia relacionado con el X frágil (FXTAS) (Hagerman RJ y col., 2001) e insuficiencia ovárica primaria asociada al X frágil (FXPOI) (Allingham-Hawkins y col., 1999). Se ha descrito recientemente que la premutación del gen FMR1 puede generar fenotipos con problemas neurológicos como tremor, ataxia o demencia (tremor/ataxia asociado al x frágil (FXTAS) en la edad adulta, teniendo más presencia en varones (40%) que en mujeres (8-16%) (Tassone F & Hagerman R, 2012).La premutación en mujeres puede asociarse a una insuficiencia ovárica primaria (FXPOI, entorno al 20 % de las mujeres portadoras que han heredado el cromosoma X con la premutación de su padre NTM), manifestándose con el cese prematuro de la INTRODUCCIÓN 9! menstruación o menopausia precoz. Tanto varones como mujeres que poseen premutación manifiestan mayor frecuencia de enfermedades autoinmunes, incluyéndose hipotiroidismo y fibromialgia. (Pugin A y col., 2014). Evidencias recientes sugieren que los adultos portadores de una premutación en el cromosoma X (55-200) también presentan un alto riesgo de sufrir problemas de ansiedad, se ha demostrado que hay alteraciones en el sistema límbico debido a reducción en los niveles de FMRP y/o elevada cantidad del mRNA de FMR1 que podría explicar este riesgo. Aun así poco se han estudiado los problemas psiquiátricos (incluido la ansiedad) en niños y adolescente con premutación (Cordeiro L y col., 2015). 4. EL GEN FMR1 El gen del discapacidad intelectual asociado al X frágil (Fragile Mental Retardation 1 gene, FMR1) está localizado en la posición Xq27.3 del cromosoma sexual X. (Verker AJ. y col., 1991). El gen FMR1 fue identificado en 1991 mediante el uso de la técnica de clonación posicional (Verker AJ y col., 1991). Este gen se caracteriza además, por la presencia de un triplete polimórfico en su secuencia 5´UTR (5´untrasnlated region) del primer exón, en la zona reguladora no codificante del promotor (Verker AJ. y col., 1991; Oberle L y col., 1991). La expansión en el número de este triplete da lugar a cuatros tipos de alelos diferentes de la zona de repeticiones: alelo normal estable (5-54 tripletes), alelo gris a veces inestable y precursores de los alelos premutados (45-54 tripletes), alelo premutados (55-200 tripletes), y alelo mutado (> a 200 tripletes) (Fernandez-Carvajal I y col., 2009, Nolin S.L. y col., 2003; Bagni C y col., 2012). Los alelos premutados tienen la peculiaridad de pasar a alelos mutados en la siguiente generación debido a su inestabilidad, tal como se ha hablado anteriormente (Nolin S.L. y col., 2003). El mecanismo molecular que conduce a la expansión de los trinucleótidos implica un inadecuado apareamiento de las cadenas de DNA durante la replicación del material INTRODUCCIÓN 10! genético durante la división de las células (Schlötterer C. y col., 1992), o también durante la reparación de DNA mal copiado por la polimerasa (Sinden R.R; 2001). Figura 4: Diagrama representando los estados de la mutación del Gen Fmr1 implicado en varias patologías como el Síndrome X-frágil, FXTAS y FXPOI. Como habíamos comentado anteriormente las interrupciones de tripletes AGG se localizan de forma periódica entre repeticiones CGGn, la presencia de las interrupciones estabiliza la secuencia en el ADN lo que reduce el riesgo de expansión de los alelos intermedios (45-54 CGG) o premutados (55-200 CGG) (Yrigollen C.M y col., 2012). En alelos de población normal el triplete AGG se localiza cada 910 tripletes CGG (Eichler y col., 1996). Cuando no se intercala AGG queda una larga cadena de trinucleótidos CGG que tiene una alta probabilidad de expandirse y dar lugar a un alelo premutado grande, especialmente cuando el número de tripletes repetidos esté por encima de 30 CGG seguidos (Nolin S.L y col., 1999; Crawford y col., 2000). Los alelos premutados apenas tienen interrupciones del triplete AGG, siendo por lo tanto muy inestables. Al pasar de una generación a otra pueden expandirse y transformarse en una mutación completa (Oberle L y col., 1991). Hecho diferencial por el cual el estudio de las interrupciones AGG está siendo realizado actualmente por numerosos laboratorios de diagnóstico, ya que el riesgo de transmitir la enfermedad varia en función de la edad de la madre, el número de tripletes y las interrupciones AGG como se apuntó anteriormente (Ver tabla 1). Esto fue calculado y extensamente estudiado en el trabajo Yrigollen CM y col., 2014 (Yrigollen CM y col., 2014). INTRODUCCIÓN 11! Tabla 1. Estimación del riesgo de expansión de una premutacion del gen FMR1 hasta una mutación completa. Esta depende no sólo del número de repeticiones CGG sino también del número y distribución de las interrupciones AGG y la edad materna como se puede observar en la tabla. Los alelos grises que contienen entre 45 y 54 unidades del trinucleótidos, CGG, se dice que son los precursores de los alelos premutados, a este rango se denomina zona gris y serán inestables dependiendo de si han perdido las interrupciones AGG que aparecerían cada 9-10 tripletes CGG (Oostra B.A. y col., 2001). En algunos pacientes con SXF se puede observar mediante la técnica del Southern blot o por PCR, varios tamaños de fragmentos (CGG) en diferentes células sanguíneas. La presencia de una premutación junto a la mutación completa se encuentra en el 20-40% de los pacientes varones, y se la denomina “mosaicismo somático”. Sobre el 3 % de los varones con SXF, la metilación no es completa y se denomina mosaicismo de metilación, suelen expresar un bajo nivel de proteína FMRP, en estos casos el nivel de discapacidad intelectual correlaciona con el porcentaje de células que están expresando a la proteína (Nolin S.L. y col., 1994; Rousseau F. y col., 1994). También se ha sugerido que debería existir mosicismo de tejido, ya que se describen en estudios moleculares 0"AGG 1"AGG 2"AGG 20 0,4-1,5 0,1-0,5 0 30 1,6-6,34 0,5-2,2 0-0,1 40 6,5-23,1 2,3-9,1 0,1-0,5 20 1,5-22,7 0,5-8,9 0-0,5 30 6,4-56,3 2,2-30 0,1-2,1 40 23,1-85,0 9,1-65,3 0,5-8,6 20 22,7-84,7 8,9-64,8 0,5-8,4 30 56,3-96,0 30-98 2,1-28,7 40 85,0-99,1 65,3-97,2 8,6-63,8 20 84,7-99 64,8-97,2 8,4-63,3 30 96,0-99,8 89-99,3 28,7-88,3 40 99,1-100 97,2-99,8 63,8-97,1 20 99,0-99,9 97,2-99,8 63,3-88,2 30 99,8-100 99,3-100 88,3-99,3 40 100 99,8-100 97,1-99,8 20 99,9-100 99,8-100 88,2-100 30 100 100 99,3-100 40 100 100 99,8-100 Número"de" tripletes"CGG"en" la"premutación" materna Riesgo"de"expansión" a"mutación"según" número"de"CGG"(%) Edad"de"la" madre Riesgo"de"expansión"a"mutación"completa" dependiente"de"CGG"y"de"interrupciones"AGG"(%)" 55-59 70-79 80-89 90-99 >99 3,7 5,3 31,1 57,8 80,1 100 60-69 INTRODUCCIÓN 18! Figura 6: Interacción de la proteína FMRP con otras proteínas y el ARNm, en complejos ribonucleoproteicos que funcionan en el transporte del ARNm del nucleo al citoplasma, así como regulando su traducción. El producto del gen FMR1 (FMRP) tiene una alta expresión en el cerebro, y es una proteína implicada en el transporte desde el núcleo hasta el soma y las dendritas y a su vez regula la traducción de mRNAs, una gran cantidad de ellos importantes en la función sináptica. En neuronas FMRP no sólo está localizada en la región pericarial sino que también se encuentran en dendritas y espinas dendríticas (Kaufmann WE y col., 2002). En pacientes afectados, la ausencia de la proteína se asocia a una morfología anormal de las espinas dendríticas (Hinton y col., 1991; Rudelli y col., 1985). La proteína FMRP puede dividirse estructuralmente dividida en tres principales regiones funcionales: región N-terminal, región central y una región C-terminal (Nelson y col., 2013). • La región N-terminal es caracterizada por la presencia de dos dominios de Tudor (TD) (Ramos y col., 2006) que pueden unirse a cadenas simples de ácidos nucleicos y funcionan como la señal de localización nuclear (dominio NLS) que permite a la proteína internarse en el núcleo para unir los mRNA. Recientemente se ha demostrado que en la región N-terminal posee dos motivos Agenet, los cuales se creen que sirven como plataformas para la unión proteína-proteína (Myrick y col., 2015). Esta región amino terminal sería capaz de unirse o interactuar con los canales de potasio (K+) y tiene también un dominio KH0. INTRODUCCIÓN 19! • La región central contienen dos dominios homólogos a KH (dominio KH1 y dominio KH2) que poseen alto grado de homología con los dominios hnRNP K, es la región por la que se une los mRNA. Además la región central se caracteriza por poseer la señal de exportación nuclear (dominio NES) que permite a la proteína transportar los mRNA desde el núcleo al citoplasma. • La región C-terminal es la región que más conservada se encuentra a lo largo de las diferentes especies. Se caracteriza por la presencia de una caja RGG que contienen un triplete Arginina-Glicina-Glicina (Arg-Gly-Gly) bien conservado (Darnell y col., 2001; Menon y col., 2004; Sjekloca y col., 2009). Además se ha visto que la región carboxilo-terminal es capaz de interactuar con los canales de calcio (Ferron y col., 2014) Varios de los dominios a los que hemos hecho referencia anteriormente son capaces de unir a moléculas de RNA y participar en el transporte de RNA al citoplasma así como participar en la regulación de la traducción de distintos RNA a su proteína funcional (Musco y col., 1996; Darnell y col., 2001; Ramos y col., 2006; Valverde y col., 2007; De Rubeis y col., 2012) Una región, conservada a lo largo de las especies, es aquella que se encuentra entre los aminoácidos 438 y 521 situada entre la región central y la caja RGG es modulada por fosforilación. La fosforilación exacta de la serina 499 es la responsable de la modulación de la unión de la proteína FMRP con Dicer, involucrando de esta manera a FMRP en la ruta de los miRNA (Cheever & Ceman, 2009), además parece ser que la traducción de distintos mRNA dependiente de la activación del receptor metabolotrópico de glutamato, mGluR, requiere de la desfosforilación de FMRP (Muddashetty y col., 2011). Debido a la función de FMRP transportando y regulando la expresión de numerosos mRNAs y la interacción con un grupo bastante extenso de otras proteínas que forman un complejo proteico, se puede demostrar su influencia en la excitabilidad celular del sistema nervioso!(Contractor A y col., 2015). INTRODUCCIÓN 20! Figura 7. Interacciones de la proteína FMRP dentro de la neurona. Modificado desde Wang y col. 2015 (Wang H y col., 2015). Se puede ver que FMRP está regulada por Rac1 que a su vez regula a la producción de radicales libres desde la NADPH oxidasa. 7. CARACTERÍSTICAS DE MODELOS ANIMALES DEL SXF. El animal de laboratorio (modelo animal) es una de las piezas fundamentales en las ciencias biomédicas. Son usados como modelos para comprender e investigar las causas de enfermedades que afectan al humano y a los animales, para desarrollar posibles tratamientos y métodos de diagnóstico (Von Hoosier G, 1999; Zuñiga J y col., 2001). Diversos modelos animales de SXF han sido desarrollados, tal es el caso de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster), el pez zebra o zebrilla (Danio rerio), el ratón (Mus muscules) y recientemente en la rata (Rattus norvegicus) (McBride SM y col, 2012; McBride SM y col, 2005; Hamilton SM y col, 2014; Tucker B y col, 2004; Bakker CE y col, 1994). Los mayores esfuerzos se han centrado en la caracterización y desarrollo del modelo animal del ratón con SXF, en particular el ratón Fmr1-knockout (KO), que fue inicialmente creado y caracterizado NADPH& OXIDASE& INTRODUCCIÓN 21! por el consorcio establecido entre grupos holandeses y belgas (Dutch-Belgian Fragile X Consortium) (Bakker CE y col, 1994). En la moscas de la fruta (Drosophila melanogaster) han sido creados mutantes nulos de dFmrp y son viables (Zhang YQ y col., 2001). La anatomía que muestra el mutante es normal, pero su comportamiento está alterado. Los estudios con este modelo animal de deficiencia de dFmrp han evidenciado que la mosca nula presenta un ritmo circadiano anormal (Bushey D y col., 2009; Weisz ED y col., 2015), defectos y errático patrón en la locomoción (Zhang YQ y col., 2001) y un comportamiento de cortejo alterado (McBride SM y col., 2005). El cortejo es un elemento del comportamiento de las moscas que está muy bien estudiado, en este caso la mosca dFmrp nulo es el primer modelo que se utilizó para observar el comportamiento social relacionado con el autismo en moscas. Estudios realizados en 2012 han descrito también problemas en el aprendizaje y memoria en moscas heterocigóticas dfxr (Kanellopoulos AK y col. 2012). La morfología del sistema nervioso central ha sido estudiada en profundidad identificándose ciertas anormalidades en la neuronas, el análisis morfológico de la neuronas de las moscas han encontrado defectos en los axones o dendritas de un subconjunto especifico de neuronas, tales como las células de la unión neuromuscular (NMJ). La pérdida de la proteína dFmrp en las moscas provoca defectos en los cuerpos de setas (un largo neuropilo en la región central del cerebro que es necesario para la memoria a largo y corto plazo) y alteraciones en las ramificaciones axonales de las neuronas (Zhang YQ y col., 2001; McBride SM y col., 1999). La proteína dFmrp en Drosophila juega un papel importante en el control del daño que pueda sufrir el DNA, ya que regula el punto de control G2/M del ciclo celular y la apostosis debido a que favorece el mantenimiento de la estabilidad genómica contra estrés genotóxico, suprimiendo de alguna manera a la expresión de CycB (Liu W y col., 2012). La sobreexpresión de dFmr1 a través del sistema UAS/GAL4 (Upstream Activating Sequence/Gal4 system) lleva a la pérdida de células por apoptosis en todos los tejidos examinados de la mosca adulta. Este fenotipo es dependiente de la actividad de los dominios KH de la proteína dFmrp (Wan L y col., 2000). INTRODUCCIÓN 22! Hay muchas razones que hacen de Drosophila un modelo animal para el desarrollo de nuevos fármacos y buscar nuevos agentes químicos que sean beficiosos para la enfermedad. Respecto al SXF se han identificado en el orden de nueve moléculas que rescatan la letalidad de la ausencia de dFmrp, tres de ellas están implicadas en la ruta inhibitoria GABAérgica. El tratamiento de las rutas del GABA hacen que se recupere la forma de los cuerpos de setas y que las moscan tengan un comportamiento de cortejo normal. Estos datos son consistente ya que concuerdan con lo observado en el SXF, donde se ve una inhibición de la ruta GABAérgica. (Chang S y col., 2008). Otro modelo animal muy utilizado en biología del desarrollo sobretodo para el estudio del desarrollo embriológico es el pez cebra (Danio rerio), esto se debe a que el embrión se desarrolla fuera de la madre y los huevos son transparente por lo que cualquier cambio morfológico puede ser observado desde el exterior. El pez cebra posee tres genes ortólogos de la familia de fmr1 (fmr1, fxr1 y fxr2) que se corresponde con FMRP, FXR1P y FXR2P (Engels y col, 2004; Tucker B y col., 2004; van 't Padje, S y col., 2005). La transcripción de los tres genes miembros de la familia FXR en el pez cebra es similar, en el patrón de expresión, al ratón y a humanos (Tucker B y col., 2004). Para el estudio de la funcionalidad de la proteína FMRP en el desarrollo embrionario del pez, se puede generar knockout mediante la introducción de oligonucleótidos morfolinos antisentido. De esta manera Tucker consiguió observar que había una arborización axonal anormal y defectos en la desfascisculación (Tucker B y col., 2006) Los mayores esfuerzos se han centrado en la caracterización y desarrollo del modelo animal del ratón con SXF, en particular el Fmr1 knockout (KO) mouse. El ratón Fmr1-KO fue inicialmente creado y caracterizado por el consorcio establecido entre grupos holandeses y belgas (Dutch-Belgian Fragile X Consortium) (Bakker CE y col, 1994). El primer ratón Fmr1 KO fue generado usando células madres embrionarias de ratones wild type de la cepa de ratón C57BL/6J (B6), una cepa de ratón muy comúnmente utilizada en investigación. El mutante para Fmr1 se genero mediante el uso de la técnica de recombinación homóloga de un vector en las células germinales (Mansour y col., 1988). Se construye un vector señal que contiene los 5,7 kb del gen fmr1 de ratón cuyo exón 5 está interrumpido por el marcador positivo de resistencia a la neomicina (neo), además de este selector positivo también se introdujo el marcador INTRODUCCIÓN 23! negativo del gen de la timidina kinasa (tk). En esto estriba una de las pocas diferencias entre el ratón knockout de Fmr1 y los humanos, ya que en humanos el silenciamiento del gen se produce por la hipermetilación del promotor del gen mientras que en ratones se produce por la interrupción del gen en si mismo. (Bakker CE et al, 1994). Los machos Fmr1-KO se testaron mediante el uso de RT-PCR, además de acreditar la presencia o ausencia de la proteína FMRP en testículos, hígado, riñones y cerebro con la técnica del Western-Blot. (Bakker CE y col., 1994). Es importante remarcar que la ausencia de la proteína FMRP en estos ratones no provoca reducción en la fertilidad en ninguno de los sexos, al igual que no hay reducción de la fertilidad por el hecho de ser heterozigótica (WT/KO) u homozigótica (WT/WT, KO/KO) para la enfermedad en el caso de las hembras. Por lo cual el gen Fmr1 no es esencial para la espermatogénesis u ovogénesis en ratones (Bakker CE y col., 1994). La presencia de macroorquidismo en los pacientes con SXF es debido a la perdida de FMRP, que es altamente expresada en testículos (Zang M y col., 2007). Los ratones Fmr1-KO tienen testículos significativamente más grandes que ratones WT, aunque la morfología de los mismos no se altera (Bakker CE y col., 1994; SlegtenhorstEegdeman KE y col., 1998, Bakker CE y col., 2000). El aumento del peso de los testículos es debido a un acrecentamiento en la actividad proliferativa de las células de Sertoli de los túbulos seminíferos durante el desarrollo testicular, las células de Sertoli aumentan el número de células germinales en los testículos, así como un aumento del liquido intersticial y por consiguiente el peso. El aumento de la actividad proliferativa no tiene concordancia, tal como se podría pensar, con un posible aumento de la hormona estimulantes de los folículos (FSH) en el plasma de estos animales, ya que se ha observado que no hay un aumento de la concentración de dicha hormona en sangre de los ratones Fmr1-KO (Slegtenhorst-Eegdeman KE y col., 1998). La FSH tiene el efecto trófico de estimular el crecimiento testicular. El análisis de la concentración de los niveles de esta hormona en pacientes con SXF y en ratones nulos no muestra un aumento concomitante de la concentración, por lo que se demuestra que el aumento del tamaño de los testículos no tendría que ver con cambios hormonales (Slegtenhorst-Eegdeman KE y col., 1998). INTRODUCCIÓN 24! La introducción de una copia de FMR1 de humanos (minigenes, plásmidos e incluso YACs) en el ratón Fmr1-KO con la intención de rescatar el fenotipo normal en los ratones KO, han producido el rescate en cuanto al tamaño de los testículos; sin embargo en las anormalidades comportamentales no se consiguió normalizar el fenotipo (Peier AM y col., 2000). La presencia de unos testículos grandes en los ratones Fmr1-KO se considera como el espejo al macroorquidismo presente en pacientes SXF y se puede considerar como un aspecto que valida al modelo de ratón (Kazdaba TM y col., 2014). Sin embargo otros aspectos físicos no difieren entre los animales WT y los Fmr1-KO (Bakker CE y col., 1994; Peier AM y col., 2000). ESPINAS DENDRÍTICASNEUROTRANSMISIÓN La proteína FMRP se encuentra enriquecida en neuronas, particularmente en el soma (cuerpo celular), dendritas y en las espinas postsináptica (Bakker CE y col., 2000, Antar LN y col., 2004, Feng Y y col., 1997, Cook D y col., 2011). Las espinas dendríticas son pequeñas protrusiones a lo largo de las dendritas, se consideran como los sitios de sinapsis, ya que son los sitios que tienen los receptores y las moléculas de señalización que son esenciales para la neurotransmisión sináptica (Nimchinsky EA y col., 2002). El análisis postmorten de tejido cortical de cerebro humano de individuos con SXF muestra un incremento en la densidad de espinas dendríticas respecto a individuos sanos control, con una presencia de una mayoría de las espinas inmaduras y elongadas (Rudelli RD y col., 1985, Hinton VJ y col., 1991, Wisniewski KE y col., 1991, Greenough WT y col., 2001, Mckinney BC y col., 2005, Godfrand JM y col., 1996, Galvez R y col., 2003, Galvez R & Greenough WT, 2005). Un déficit análogo se observa directamente en las espinas dendríticas de las distintas variedades de ratones Fmr1-KO, tanto para el background genético de B6 como el FVB (Grossman AW y col., 2006, Nimchinsky EA y col., 2001, Comery TA y col., 1997, Irwin SA y col., 2002). Estudios del desarrollo de la corteza de ratones jóvenes (de una semana de edad) revelan un incremento de la densidad de las espinas dendríticas y de su longitud en animales mutantes en comparación con los controles sanos, estos datos no aparecen en animales con un mes de edad (Nimchinsky EA y col., 2001). Estos datos también INTRODUCCIÓN 25! fueron observados por estudios de la corteza somatosensorial de ratones Fmr1-KO a las cuatro semanas de edad (Galvez R & Greenough WT, 2005). En este último estudio, además se observó que la maduración de la espinas dendríticas también estaba afectada, ya que los ratones con SXF exhibían un incremento en el densidad de las espinas dendríticas finas (inmaduras) en comparación con los controles (Galvez R & Greenough WT, 2005). Es más podría haber un periodo del desarrollo durante el cual la morfología de las espinas dendríticas se normaliza en ausencia de FMRP, pero esta no se sostiene en el tiempo. En estudios posteriores realizados en otras regiones cerebrales, se han encontrado similar déficit estructural en las espinas dendríticas en ratones de mayor edad, por ejemplo encontramos que en observaciones de ratones Fmr1-KO de 16 semanas de edad poseen mayor densidad de espinas inmaduras en la corteza visual comparado con ratones de la misma edad WT controles (Comery TA y col., 1997). Estos datos sugieren que la expresión de FMRP es necesaria para el desarrollo normal de las espinas dendríticas y que la pérdida de FMRP tiene un impacto negativo en la estructura física de las sinapsis. Como regulador de la traducción de mRNA, FMRP tiene influencia en la síntesis de proteínas que pueden afectar a componentes de las sinapsis localizados en las espinas dendríticas. La potenciación a largo plazo (LTP) y la depresión a largo plazo (LTD) son aumentos o reducciones mantenidas a largo plazo, respectivamente, de la señales que se producen entre dos sinapsis neuronales (Buffington SA y col., 2014, Malenka RC & Bear MF, 2004). Ambas actividades son realmente dependientes de la regulación de la traducción, en función de dar una rápida respuesta a la actividad sináptica y a la función cognitiva. Análisis tanto de LTP y LTD, los cuales se asumen como representantes de la electrofisiología intrínseca del aprendizaje, cognición y memoria (Malenka RC & Bear MF, 2004), han revelado anormalidades en la neurotransmisión de los ratones que tienen carencia del gen Fmr1. La depresión a largo plazo (LTD), depende de la síntesis de proteínas y de la activación de los receptores metabolotrópicos del glutamato (mGluR), está aumentada en el hipocampo y en cultivos celulares de neuronas hipocampales de ratones Fmr1-KO (Huber KM y col., 2006, Nosyreva ED y col., 2006, Nakamoto M y col., 2007). La potenciación a largo plazo (LTP) se corresponde con una disminución de los receptores AMPA así como el aumento o aparición de los receptores de NMDA en la INTRODUCCIÓN 26! superficie celular. La LTP se detecta alterado en ratones Fmr1-KO, esto es debido principalmente a que la proteína FMRP regula la internalización de los receptores AMPA desde la superficie de la membrana celular hacia el citosol y su ausencia produciría una reducción de la internalización de los mismos (Seese RR y col., 2012, Zhao MG y col., 2005). En las últimas observaciones del núcleo acumbens del cerebro de ratones Fmr1-KO, la medida de la neurotransmisión excitatoria basal indica que el déficit en LTP se acompaña por un aumento del ratio en los receptores AMPA/NMDA y una concomitante reducción de los receptores NMDAR en el ratón Fmr1-KO (Neuhofer D y col., 2015). Otro hallazgo indica que, los ratones Fmr1-KO adultos, tienen retraso en la formación del mapa o sistema somatosensorial, debido a las alteraciones de las dendritas y las espinas dendríticas de la cuarta capa de neuronas, producida por una reducción en las sinapsis y en los niveles de proteínas implicadas en la señal de transducción intracelular mediada por glutamato. Pero esto no ocurre en etapas tempranas del desarrollo, donde la traducción de mRNA no se ve alterada en los ratones Fmr1 KO. Estos datos sugieren que es muy importante tener en cuenta la edad en los estudios que se desarrollen con los ratones Fmr1-KO (Till S.M. y col., 2012). Todos estos estudios demuestran que la ausencia de Fmr1 produce alteraciones en las espinas dendríticas y en la actividad normal de las sinapsis, lo que puede contribuir al establecimiento del fenotipo del SXF. Además de darle la importancia necesaria a la proteína FMRP en la regulación de las proteínas que integran la función sináptica, por lo que no es ninguna sorpresa que la ausencia de FMRP tenga como resultado la alteración en las estructuras y funcionamiento de las sinapsis neuronales. EPILEPSIA E HIPERSENSIBILIDAD Aproximadamente entre un 10 y 20 % de los individuos con SXF con mutación completa exhiben cierto grado de epilepsia en su niñez (Incorpora G y col., 2002, Berry-Kravis E, 2002, Berry-Kravis E y col., 2010). Las convulsiones no están asociada al SXF y normalmente se controla mediante el uso de medicamentos anticulvulsivos (Heard TT y col., 2014, Hagerman PJ & Stastrom CE, 2009). INTRODUCCIÓN 27! Diferentes estudios llevados a cabo sobre los ratones Fmr1-KO han visto como se producían convulsiones y ataques epilépticos por exposición de los ratones a sonidos de tipo sirena de alta intensidad (entorno a 125 dB); en lo que se ha pasado a denominar susceptibilidad audiogénica. La susceptibilidad audiogénica en los ratones Fmr1-KO tal como se relata en la bibliografía depende de la edad del ratón y del background genético de la cepa (Bakker CE y col., 1994; Musumeci SA y col., 1999; Heulens I y col., 2012; Pacey LK y col., 2009; Yan QJ y col., 2005; Dolan BM y col., 2013; Musemeci SA y col., 2000; Pietropaolo S y col., 2011; Ding Q y col., 2014; Veeraragavan S y col., 2011; Michalon A y col., 2012; Veeraragavan S y col., 2012). Individuos con el SXF han mostrado hiperestimulación y sensibilización aguda a estímulos sensoriales (Verkerk AJ y col., 1991). En el modelo animal se ha observado déficits en la inhibición por prepulso (PPI), una medida de la puerta sensomotora, que correlaciona con coeficiente intelectual y atención (Braff DL y col., 2001; Frankland PW y col., 2004; Yuhas J y col., 2011; Hessl D y col., 2009) ! ATENCIÓN E HIPERACTIVIDAD Los individuos con SXF suelen ser presentar, por regla general, hiperactividaad y tienen ciertas dificultades con la atención y el control de los impulsos (Hagerman RJ, 2002; Hatton DD y col., 2002; Cornish K y col., 2004; Sullivan K y col., 2006; Barley DB y col., 2008). Se ha observado que la ausencia de FMRP en los pacientes les confiere un aumento drástico déficit de atención correlacionado con la dificultad del problema aumenta, por lo que paciente con SXF tienen más dificultad en aquellos procesos donde se tienen que inhibir/activar respuestas neuronales (Wilding J y col., 2002). COMPORTAMIENTO REPETITIVO Perseverancia o continuidad de acciones repetitivas, tales como movimientos de manos han sido encontrados en personas con SXF (McLennan Y y col. 2011; Wolff JJ y col., 2013; Cordeiro L y col., 2011). Ratones Fmr1 KO han mostrado suave repetición de comportamiento durante las fases de entrenamiento de las diferentes INTRODUCCIÓN 34! circunstancia normales inhibiría la síntesis de proteínas. El exceso en la activación de mGluR provoca un incremento de la actividad LTD o rotura sináptica que podría ser una de las principales causas de la perdida de la plasticidad neuronal en el SXF. Esta teoría abrió la puerta a que desarrollar nuevas estrategias para mejorar la calidad de vida de los pacientes (Bear MF y col., 2004) El receptor que se ha visto con mayor potencial terapéutico en este caso es el mGluR5. Bloqueando este receptor usando antagonistas específicos, se podría reducir la síntesis excesiva de proteínas así como alterar la plasticidad sináptica en el SXF. Lo que nos llevaría al rescate de la condición normal en la transmisión de señales y mejorar el comportamiento (Bear MF y col., 2004). Muchos tratamientos, siguiendo la teoría anteriormente reseñada, han sido extensamente testados en los modelos animales de SXF. Los antagonista de mGluR5 son: 2-metil-6-(feniletilenil)-piridina (MPEP), fenorbam, mavoglurant, STX107, AFQ056, RO-1917523, CTEP, el uso de ellos en tratamientos han encontrado que reversan algunas características fenotípicas de animales con SXF, así como la hipersensibilidad audiogénica, alteraciones en la inhibición del prepulso (PPI) y la hiperactividad en el campo abierto (Chuang SC y col., 2005; Yan QJ y col., 2005; De Vrij FM y col., 2008; Pop AS y col., 2014). Igualmente fue creado un ratón heterocigótico Fmr1-KO con baja expresión de mGluR5, es decir con doble mutación una en el gen Fmr1 y otra mutación que reduce la expresión de mGluR5, lo que resulta en un rescate de algunas de las características del ratón Fmr1-KO (Dolen G y col., 2007). MODULADORES DE N-METIL-D-ASPÁRTICO Nemantina, una droga comúnmente utilizada en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, se ha ensayado como una posible terapia de SXF. Este medicamento modifica la función de las dianas de FMRP y rectifica el desequilibrio que hay entre la activación de receptores por el ácido γ-aminobutirico y el glutamato, todo ello se debe a que modifica la actividad al receptor ionotrópico del glutamato (NMDAR). La INTRODUCCIÓN 35! nemantina es un antagonista no competitivo del receptor del ácido N-metil-Daspártico. (Reisberg B y col., 2003). El grado y dirección de la disfunción del receptor del ácido N-metil-D-aspártico en los ratones Fmr1-KO no está todavía claro y depende de la región cerebral y de la edad ( Huber KM y col., 2002; Hu H y col., 2008; Pilpel Y y col., 2009; Eadie BD y col., 2012). Se realizó un estudio con células cultivadas de Fmr1 KO tratadas y no tratadas con nemantina y se observó un efecto estimulante en la maduración de las espinas dendríticas y en la formación de las sinapsis (Wei H y col., 2012). Se han desarrollado varios ensayos en humanos con la nemantina, en uno de ellos se trato a niños con autismo o desorden en el desarrollo pervasivo (PPD) mostrándose que el 70 % de los sujetos tratado tenían mejoras significativas (Chez MG y col., 2007). Mientras que en otro estudio abierto con 6 niños con SXF se observa que en dos de ellos, el grado de irritabilidad se aumenta mientras que en los restantes hay una respuesta al tratamiento de acuerdo con su puntuación en el test CGI; esto nos ayudaría a decir que la nemantina es un podría ser utilizado en ensayos más amplios controlados con placebo para comprobar si es un posible fármaco para el SXF (Erickson CA y col., 2009) ! MODULACIÓN AMPA Se detecta una excesiva internealización de los receptores AMPARs debido al incremento de la señal de mGluR5 en ausencia de FMRP (Bear MF y col., 2004; Nakamoto M y col., 2007). Se piensa que esta alteración en la internalización de AMPARs es subyacente a los déficits tanto en LTP como en LTD. Añadiremos que se han observado que a niveles bajos de las subunidades GluR1 y GluR2 AMPAR en la corteza de ratones Fmr1-KO (Li J y col., 2002). El objetivo de la modulación positiva de AMPAR es la potenciación de las señales de AMPA y consecuentemente la normalización de LTP y LTD, así como mejorar la cognición. El BDNF también incrementa los niveles de receptores AMPA y esto podría normalizar la forma de las espinas dendríticas. Además, se ha descrito una posible INTRODUCCIÓN 36! correlación entre mutaciones en el gen de BDNF y la epilepsia en pacientes afectados del síndrome (Louhivuori V y col., 2009). BDNF también restaura el modelaje del citoesqueleto (Lauterborn JC y col., 2007) y afectar de alguna manera en el rescate del LTP hipocampal y a la polimerización de filamentos de actina en las espinas dendríticas. A día de hoy solamente se ha desarrollado un ensayo clínico doble ciego placebocontrol que ha medido la eficacia de un fármaco regulador de receptores de AMPA en el SXF. Esta droga incrementa los niveles de BDNF tanto in vivo como in vitro (Lauterborn JC y col., 2000). Interesamente, se vio que breves tratamientos con ampakinas producen elevados niveles de BDNF que duran sorprendentemente largos periodos de tiempo (Lauterborn JC et al, 2003). El ensayo clínico se llevó a cabo con el fármaco CX516, un modulador positivo de los receptores AMPA, que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica y además de aumentar la respuesta de excitación sináptica en el hipocampo, lo que podría inducir el mecanismo de potenciación a largo plazo y quizás mejoraría la memoria y la función cognitiva en las personas con SXF. Este ensayo no muestra ningún efecto positivo del medicamento en la memoria, lenguaje, atención y comportamiento. (Berry-Kravis E y col., 2006) MODULACIÓN DE LA SINTASA KINASA GLUCOGENICA 3 (GSK3) La ruta fisiológica que está detrás de la eficacia del litio en el SXF involucra la manipulación de la enzima GSK3. Se ha observado que en ratones adultos de Fmr1KO los niveles de las dos isoformas de GSK3 son normales, pero tienen una regulación inadecuada de su inhibición por fosforilación (Min WW y col., 2009). En numerosos estudios llevados a cabo tanto en ratones como en la mosca dfmr1-KO, el litio y otros inhibidores selectivos GSK3 incrementan la fosforilación de la GSK3; mejorando de esta manera la morfología de las espinas dendríticas (Choi CH y col., 2011; Mines MA y col., 2010). Recientemente otros inhibidores específicos de la GSK3 han mostrado que tienen un efecto beneficioso en los ratones de Fmr1-KO, tales como mejoras en el comportamiento, mejoras en los parámetros electrofisiológicos como el LTP y en la resolución de problemas donde hay alguna implicación del hipocampo (Chen T y col., 2014; Franklin AV y col., 2014). INTRODUCCIÓN 37! El litio ha sido usado en paciente con SXF para tratar la inestabilidad emocional y el estado agresivo al mismo tiempo, pero los resultados sobre la eficacia del mismo son anecdótico. El tratamiento con litio parece bien tolerado y los resultados de este estudio muestran una mejora en el comportamiento basado en los resultados de los test ABC-C y también sugieren una significativa mejora cognitiva (Berry-Kravis E y col., 2008). Todos estos estudios sugieren que la manipulación/ inhibición de la GSK3 podría ser beneficiosa para los pacientes del SXF, pero se necesitan ensayos complementarios para comprobar su beneficio. INHIBIDORES DE LA RECAPTACIÓN DE SEROTONINA En el 2011, Winarni y col., llevaron a cabo un estudio retrospectivo con 45 niños con SXF, con edades comprendidas entre 12-50 meses. El análisis encontró que los niños con SXF que recibieron SSRI sertlina tienen una mejoría significativa en el lenguaje en comparación con los niños que no recibieron dicho tratamiento. De este estudio surgió un ensayo para el tratamiento del SXF con sertalina en edades comprendidas entre 24 y 68 meses de edad, este está siendo llevado a cabo por UC Davis MIND Institute (ClinicalTrials.gov identifier: NCT01474746). Se mide el efecto de la sertalina en tres dominios generales: desarrollo de habilidades y lenguaje temprano, habilidades de procesamientos sensorial y sintomatología relacionada con la ansiedad, aprendizaje y el espectro autista (ASD) .Los resultados de este ensayo se han presentado recientemente en el 17º International Fragile X Workshop (27-30 Septiembre 2015. Estrasburgo. Francia) y se han demostrado mejoras significativas en el lenguaje tras el uso de sertalina en comparación con Placebo. ! MODULADORES DEL ÁCIDO γ-AMINOBUTIRRICO (GABA) La pérdida de FMRP se asocia a déficits en la neurotransmisión inhibitoria, de las cuales el neurotransmisor más importante es el GABA (Olmos-Serrano JJ y col., 2010). En el modelo de ratón Fmr1 KO se ha demostrado una disminución en la INTRODUCCIÓN 38! neurotransmisión GABAérgica en algunas áreas del cerebro tales como amígdala, corteza somatosensorial e hipocampo (Bear MF y col., 2004). Déficits en el receptor GABA (A) (receptor ionotrópico) se han demostrado pero sin cambios en GABA (B) (receptor metabolotrópico). La disminución de los receptores GABA (A) se debe una reducción de la expresión del mensajero de RNA que codifica para el receptor GABA (A). Así mismo otros estudios han demostrado que el receptor GABA (A) muestra una reducción significativa en diferentes regiones cerebrales (D´Hulst C y col., 2009). En los modelos animales de Drosophila y de ratón de SXF se ha conseguido revertir algunos de los parámetros comportamentales y morfológicos asociado al SXF con compuestos que actúan sobre la vía GABAérgica (Heulens I y col., 2012; Chang S y col., 2008) sugiriendo que la estimulación de dicha subunidad del receptor podría ser un tratamiento experimental viable para el SXF. Tratamientos preclínicos han sido llevados a cabo mediante el uso de diferentes compuestos que actuarían modulando esta vía, como el uso de un compuesto esteroide neuroactivo con múltiples efectos farmacológicos que incluyen la modulación de los receptores nicotin-acetilcolina, activador de los canales de cloro y no selectivo agonista de los receptores GABA (A). Este compuesto está asociado con una reducción de la ansiedad y rescate de la susceptibilidad audigénica en ratones Fmr1 KO (Heulens I y col., 2012). También el agonista de la subunidad δ, gabodoxol, atenúa el déficit de la excitabilidad en la amígdala y reduce la hiperactividad, además de atenuar medianamente el PPI (Olmos-Serrano JJ y col., 2010). Otra molécula probada es la Taurina, que es un agonista del receptor GABA (A), mejora la adquisición de memoria y la retención en los test de evitación pasiva. Pero de esta molécula no se ha observado mejoría en el PPI del hipocampo en cultivo (El Idrissi A y col., 2010). El primer ensayo clínico en pacientes, usando un agonista del receptor GABA para el tratamiento del SXF, fue un ensayo abierto con la droga riluzole. Esta droga está aprobada por la FDA para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrópica, el efecto exacto de la misma no se sabe pero se piensa que es una atenuación del exceso de la INTRODUCCIÓN 39! excitación por glutamato (Obrenovitch TP, 1998). Los estudios preclínicos han determinado que el riluzole trabaja como potencial agonista del receptor GABA (A), el cual se ha visto que está disminuido en el SXF. En este ensayo clínico no se observó mejorías significativas en las diferentes pruebas a las que fueron sometidos los pacientes (Erickson CA y col., 2011). Acomprasato, una droga aprobada por la FDA para el tratamiento de la abstinencia del alcohol es otro compuesto que se está utilizando para el tratamiento del desequilibrio entre las vías de glutamato y GABA. El acomprasato tiene efectos pleitrópicos tanto en los receptores del glutamato (NMDAR) como en los receptores GABA (A). El primer ensayo en pacientes de SXF llevado a cabo con acomprasato fue un ensayo abierto con tres pacientes donde se observó mejorías significativas en las conductas sociales y comunicativas (Erickson CA y col., 2013). Después de este ensayo inicial se pasó a un ensayo clínico abierto en jóvenes con SXF, de los 12 pacientes que siguieron el tratamiento nueve de ellos tuvieron mejoras significativas del comportamiento social e la hiperactividad. Acomprasato está actualmente en la fase II de un ensayo clínico con pacientes de SXF doble ciego placebo/control (clinicaltrials.gov, NCT0911455) Ganaloxona es un modulador neuroesteroideo sintético que se une selectivamente al sitio de unión de los neuroesteroides del receptor GABA (A), que resulta ser opuesto a los sitios de unión de los benzipainas (Nohria V & Giller E., 2007). En ensayo preclínicos con ratones Fmr1-KO previenen las convulsiones por estímulos auditivos (Heulens I y col., 2012). Ahora mismo está siendo utilizado en un ensayo fase II doble ciego placebo/control, (clinicaltrials.gov; NCT01725152). Arbaclofeno (SXT209) es otro tratamiento que se ha probado y que tiene como diana de actuación restablecer el equilibrio en las vías GABA/glutamato en el SXF. La mayor diferencia con los anteriores tratamiento y en especial con el acomprasato y el riluzole es que el arbaclofeno actúa como agonista del receptor ionotrópico GABA (B), en lugar de ser un agonista del receptor GABA (A). En ratones Fmr1-KO el tratamiento con arbaclofeno produce una disminución en la susceptibilidad audiogénica. En adicción a estos datos, el arbaclofeno normaliza la densidad de espinas dendríticas en la corteza visual (Pacey LKK y col., 2011; Henderson C y col., INTRODUCCIÓN 40! 2012). Un ensayo clínico doble ciego placebo/control con arbaclofeno sobre 63 individuos con SXF encontró solamente mejoras significativas en los test de resolución de problemas VAS y en el test de evitación social ABC (Berry-Kravis EM y col., 2012). Hasta hace relativamente poco se estaba llevando a cabo la fase III de un ensayo clínico con esta sustancia, pero resultados negativos hicieron que la empresa Seaside Therapeutics finalizará su ensayo en el SXF. DIANAS EN RUTAS DE SEÑALIZACION INTRACELULAR Recientemente se han propuesto otras dianas terapéuticas para el SXF, basadas en regulación de señales intracelulares. En un modelo animal FXS, el tratamiento metadoxina mejoró deficiencias del aprendizaje, la memoria y la interacción social y normalizó la sobreactivación de las proteínas de traducción de señales intracelulares como Akt y ERK en la sangre y el cerebro de ratones juveniles y adultos. Metadoxina restaura la morfología neuronal anormal, así como reduce la producción excesiva de proteínas, alteraciones fisiopatológicas propias del SXF que serían responsables de problemas de aprendizaje y la memoria. La seguridad y eficacia de MDX en adolescentes y adultos con SXF se ha evaluado en un estudio de fase II, que se completó en 2015 y sus resultados se han presentado en el 17º International Fragile X workshop celebrado en Estrasburgo (Francia), en septiembre de 2015. Los investigadores concluyeron que el tratamiento con MDX durante 6 semanas de adolescentes y adultos con SXF no redujo la hiperactividad aunque si se observa mejoría en atención (Rubin J y col., 2015). Otro compuesto que se ha probado para modular la señal de traducción intracelular mediada por ERK1/2 es la lovastatina, un medicamento que se prescribe ampliamente para el tratamiento de la hipercolesterolemia, puede corregir el exceso de síntesis de proteínas en el hipocampo del ratón modelo de FXS y puede evitar epileptogénesis (Osterweil EK. Y col. 2013). Un reciente estudio reporta un ensayo Clínico abierto para tratar 15 pacientes con SXF utilizando este compuesto durante tres meses describiendo mejoría en parámetros de comportamiento usando el test ABC-C en 12 de los 15 pacientes tratados (Caku A. y col. 2014) INTRODUCCIÓN 41! ! REGULACIÓN DE LA MATRIZ DE METALOPEPTIDASA-9 (MMP9) En el modelo de ratón Fmr1-KO, se muestran elevados niveles de MMP-9 en hipocampo, contribuyendo posiblemente a los fenotipos del SXF. El tratamiento temprano con minociclina, un inhibidor de MMP-9 normaliza las espinas dendríticas inmaduras típicamente propias de los ratones con SXF y redujeron el comportamiento locomotor y el comportamiento alterado en el laberinto elevado (Bilousova TV y col., 2009). Se han ejecutado dos ensayos clínicos que investigaron la efectividad de la minociclina en SXF. El primero, un ensayo abierto en 20 sujetos entre 13-35 años, con un solo deserción como resultado de los efectos adversos. Este estudio preliminar mostró una mejoría significativa en la sub escala de irritabilidad del ABC, en el VAS y en el CGI lo que justificó un segundo ensayo que fue un estudio doble ciego, controlado con placebo en 66 niños y adolescentes de 3.5 a 16 años, detectando una mejoría significativa en el CGI, así como una disminución en los niveles de MMP-9 (Leigh MJ y col., 2013). RECEPTORES DE CANNABINOIDES La movilización de endocannabinoides (eCB) una vez que son activados los receptores mGluR es un hecho probado (Hashimotodani y col., 2005), los receptores mGluR5 están alterados ya que como se ha dicho anteriormente en el ratón Fmr1-KO. Los eCB son derivados desde lípidos de membranas (Zhang L & Alger BE, 2010). El sistema endocannabinoide (ECS) es un modulador clave de la plasticidad sináptica, mejora cognitiva, ansiedad, nocipcepción y epilepsia, todos estas circunstancias están afectadas en el SXF. La administración aguda de un antagonista de CB1R (rimonabant) a ratones con SXF hacen que estos tengan una mejora en la fase de consolidación en la prueba del reconocimiento de objeto reduciendo de esta manera el déficit cognitivo, todo ello sin afectar de ninguna manera a sus congéneres WT. El tratamiento crónico con este INTRODUCCIÓN 42! mismo compuesto reduce el número de espinas inmaduras con un incremento de espinas maduras (Busquets-Garcia A y col., 2013). Se podría, por consiguiente, considerar a este sistema como una diana terapéutica en el SXF ! Figura 9: Diagrama representando las dianas terapéuticas que se han propuesto para tratar el SXF. Muchas de las dianas que se han propuesto han pasado ya a fase de experimentación clínica, y se han desarrollando ensayos independientes por grupos de investigación o ensayos promovidos por la industria farmacéutica. Ejemplos de estos ensayos se recogen en la tabla siguiente. O 2 #+#NADPH###########################O 2- +#NADPH + #+#H + ## NADPH& OXIDASE& Rac1 Inhibitor(Z62954982) Apocynin Vitamin#C#(Ascorbic#acid)# Vitamin#E#(α-Tocopherol)# INTRODUCCIÓN 43! Número! de! registro! del! ensayo! Tipo/Fase!en! la!que!se! encuentra! Fármaco! Población! Diana! Estado! Promotor! Resultados! NCT$ 01894958$ MulticentricoFase$II$ MNZ-2566$ Varones$ adolescentes$y$ adultos$ Antagonista$ NMDA$ En$marcha$sin$ reclutar$ pacientes$ Neuren$ Pharmaceuticals$ Limited$ Pendiente$ NCT$ 01725152$ UnicentricoFase$II$ Ganaxolona$ Adolescentes$y$ niños$ Agonista$GABA-A$ En$marcha$sin$ reclutar$ pacientes$ Marinus$ Pharmaceuticals$ Pendiente$ NTC$ 01474746$ UnicentricoFase$II$ Sertalina$ Niños$ Inhibidor$de$la$ recaptación$de$ serotonina$ En$marcha$sin$ reclutar$ pacientes$ Universidad$de$ California,Davis$ (USA)$ Pendiente$ NCT$ 01911455$ MulticentricoFase$II$ Acamprosato$ Adolescentes$y$ niños$ Modulador$del$ receptor$de$ NMDA$ En$marcha$sin$ reclutar$ pacientes$ Children's$Hospital$ Medical$Center,$ Cincinnati$ Pendiente$ NCT$ 01329770$ Unicentrico$ Fase$II$ Vitamina$C$+$ Vitamina$E$ Adultos,$ Adolescentes$y$ niños$ Antioxidantes$ $ Finalizado$ Hospital$Regional$ universitario$de$ Málaga$ Eficacia$a$nivel$ cognitivo$con$ una$potencia$ del$65%$y$en$ lenguaje$con$ un$49%.$ NCT$ 02126995$ UnicentricoFase$II$ Metadoxine$ MG01CI$ Adultos$y$ adolescentes$ Vitamina$6$ Finalizado$ Alcobra$Ltd.$ Pendiente$ NTC$ 01357239$ MulticentricoFase$II$ Mavaglurant$ (AFQ056)$ Adolescentes$y$ niños$ Antagonista$ mGluR5$ Finalizado$ Novartis$ (Basilea,$Suiza)$ Negativos,$no$ hay$mejoría$en$ el$ comportamien to$medido$con$ la$escala$ABC-C$ (Jacquemont$y$ col.$(2011))$ NTC$ 01015430$ MulticentricoFase$II$ Basimglurant$ Adultos$ Antagonista$ mGluR5$ Finalizado$ Hoffman-La$Roche$ No$hay$eficacia$ NTC$ 01013480$ MulticentricoFase$II$ Arbaclofeno$ (STX209)$ Adultos$y$ adolescentes$ Agonista$GABA-B$ Finalizado$ Seaside$ Therapeutics,$Inc.$ Eficacia$parcial,$ cierra$el$ programa$por$ falta$de$$ financiación$ por$la$ empresa.$ NTC$ 01053156$ UnicentricoFase$II$ Minociclina$ Adolescentes$y$ niños$ Antibiótico$ Finalizado$ Universidad$de$ California,$Davis$ (USA)$ Mejoría$tanto$ en$el$placebo$ como$en$el$ tratamiento$ (Paribello$y$ col.,$2010;$ Leigh$y$col.,$ 2013)$ NTC$ 01120626$ UnicentricoFase$II$ Donepezil$ Adolescentes$y$ niños$ Droga$colonérgica$ Finalizado$ Universidad$de$ Stanford$(USA)$ No$hay$mejoría$ en$los$test$de$ inteligencia$y$ comportament ales$(Sahu$JK$y$ col.,$2013)$ Tabla 3. Resumen de los ensayos clínicos, las moléculas y sus dianas, que se han usado en la intervención terapéutica experimental en humanos con el SXF (Modificado del artículo de Diego Otero y col., 2014). INTRODUCCIÓN 50! Cu, Fe), glucosa, urato, glutatión reducido, bilirrubina y proteínas como albúmina, ceruloplasmina, ferritina y lactoferrina. La superóxido dismutasa (SOD) es la mejor enzima antioxidante y juega un papel importante en la eliminación de O2-. La familia superóxido dismutasa está especializada en la eliminación del radical anión superóxido, derivado de estímulos extracelulares y de la actividad mitocondrial. Se han distinguidos tres isoformas de la superóxido dismutasa características de mamíferos: cobre-zinc SOD (Cu/Zn SOD) codificada por el gen sod1, manganeso SOD (MnSOD) codificada por el gen sod2 y la SOD extracelular (ECSOD) codifica a su vez por el gen sod3. Todas estas isoformas actúan de la misma manera y tienen la misma función, pero tienen distintas estructuras, localización cromosómica, requerimientos de cofactores y compartimentación celular (Miao L & Clair DKS, 2009). Glutatión peroxidasa es el nombre que recibe una familia de múltiples isoenzimas que cataliza la reducción de H2O2 o hidroperóxidos orgánicos a agua o su correspondiente alcohol. Para realizar esta reacción se ayuda del glutatión reducido (GSH) como donador de electrones (H2O2 + 2GSH → GS-SG+ 2H2O). En mamíferos hay cuatro isoformas distintas, siendo la GPX1 la que se localiza en las células gliales, donde la actividad GP es diez veces más activa que en neuronas (Margis R y col., 2008). Catalasas son enzimas importantes en la defensa contra el estrés oxidativo, estas enzimas contienen un grupo ferro-hemo. Las catalasas son enzimas que se responsabilizan de la conversión de peróxido de hidrógeno a agua. Generalmente están localizadas en unos orgánulos que son los peroxisomas, aunque también se pueden encontrar en el citoplasma y mitocondrias. La actividad catalasa es mayor cuanto más cantidad de peróxido de hidrógeno hay las células (Gandhi S & Abramov AY, 2012). 2 O2- + 2 H+ è H2O2 + O2 SUPERÓXIDO DISMUTASA H2O2 è 2 H2O + O2 CATALASA H2O2 + 2GSH è GS-SG+ 2H2O GLUTATIÓN PEROXIDASA GSSG + NADPH + H+ è 2GSH + NADP + GLUTATIÓN REDUCTASA Tabla 4: Principal defensa antioxidante celular. INTRODUCCIÓN 51! Tal como nos hemos referido antes, hay pequeñas moléculas que pueden actuar como antioxidantes, estas pueden ser: GSH. El glutatión reducido es el principal antioxidante en el SNC, resulta ser un tripéptido que contienen a los aminoácidos glutamato, glicina y cisteína, siendo un antioxidante y agente reductor que puede reaccionar, sin la necesidad de enzimas, directamente con los radicales libres. El glutation se encuentra presente a concentraciones de milimolar en las células eucariotas (James SJ y col., 2009) y las mitocondrias poseen entorno al 10-15 % del GSH total (convirtiéndose de esta manera en un importante elemento defensivo del estrés oxidativo que se produce en este orgánulo). Las enzimas glutatión peroxidasa y glutatión reductasa eliminan el H2O2 y mantienen al glutatión es su estado reducido. Diversas líneas de investigación dan evidencias claras de que la reducción del glutatión contribuyen a la fisiopatología de algunos desordenes neuropsiquiátricos, tales como esquizofrenia (Gysin R y col., 2007), desordenes bipolares (Andreazza AC y col., 2008), enfermedad de Parkinson (Serra JA y col., 2001), enfermedad de Alzheimer (Emerit J y col., 2004) y autismo (James SJ y col., 2009). El ratio de GSH que se oxida hacia GSSG es considerado como un indicador reproducible del estado REDOX y puede ser usado como una medida clínica del estado oxidativo de un paciente. Cuando existe un desequilibrio entre los ROS y los sistemas de defensa antioxidantes se produce un estado de estrés oxidativo, que es característico en algunas patologías, como el SXF (el Bekay R y col., 2007). Los pacientes afectados por el síndrome muestran un aumento de la actividad adrenocortical y esto altera el eje HPA (hipotálamo-pituitaria-glándulas adrenal) (Hessl D y col., 2002). Un exceso de hormonas adrenales está involucrado en la inducción del estrés oxidativo en el cerebro. INTRODUCCIÓN 52! Figura 13. Resumen de la producción de ROS en las neuronas. Las fuentes de ROS son muy diversas en las neuronas y su sobreproducción puede tener un efecto negativo sobre las células, siendo sobre ellas y su efecto sobre lo que vamos a actuar. COMPUESTOS TERAPÉUTICOS ENSAYADOS Desequilibrio entre la formación y neutralización de ROS produce una desregulación en la fisiología celular, y por tanto un estrés oxidativo, que probablemente participa en la patogénesis y/o fisiopatología de la enfermedad. Así, el tratamiento con compuestos antioxidantes podría mejorar el curso de la enfermedad y/o prevenir su aparición. Hay distintos compuestos que se conocen que pueden prevenir el daño por radicales libres. INHIBIDOR DE LA PROTEÍNA RAC 1 RAC1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate1) es una pequeña GTPasa de la familia de proteínas Rho que actúa en el encendido y apagado de un amplio rango de funciones celulares. Por ejemplo es esencial para la activación de la NADPH oxidasa, siendo necesaria para un correcto ensamblaje de las diferentes subunidades de la NADPH oxidasa. Además se ha encontrado que la ruta RAC1/NADPH está involucrada en diferentes patologías del cerebro, tales como isquemias, daño físico INTRODUCCIÓN 53! del cerebro por golpes, problemas cognitivos, hemorragia subaracnoidea y en el daño oxidativo típico de algunos desordenes neurodegenerativos (Carrizzo A y col., 2014). Hay diversos mecanismos que regula la actividad de Rac. El ciclo de Rac GTPasa se encuentra entre un estado inactivo donde la proteína se encuentra unida a GDP y un estado activo donde la proteína se encuentra unida a GTP. La proteína GEF (Guanina Exchange factor) facilita la disociación de GDP de Rac1 y por lo tanto permite la entrada de GTP. A través de la interacción de GAP (GTPase-activating proteins) a la Rac 1 se pone en marcha la actividad intrinseca GTPasa haciendo que el GTP se transforme en GDP, por lo que la proteína se vuelve inactiva. En este momento se puede asociar el factor RhoGDI a Rac1 secuestrándola en su estado inactivo. Rac1 también cambia entre dos forma desde el citosol a la membrana a través de ciertas modificaciones post-transcripcionales que son la prenilación de ciertas proteínas, estas modificaciones aparecen ser necesarias para la translocación hacia la membrana (Mack NA y col., 2011; Tejada-Simon MV, 2015). La proteína FMRP y Rac1 interactúa genéticamente a través de la proteína CIFYP 1 y 2, efector de Rac 1, controlando la formación de las espinas dendríticas; indicando que Rac1 es responsable de la mediación del efecto de FMR1 en el desarrollo de las espinas dendríticas (Castets M, y col., 2005). Rac 1 juega un papel en el desarrollo, maduración y mantenimiento de las espinas dendríticas debido a su papel regulador de la remodelación de citoesqueleto de actina. Al menos 4 componentes han sido descrito que poseen función de inhibidor de Rac1: NSC23766,(N6-)2-((4-(Diethylamino)-1-methylbutylamino)-6-methyl-4 pyrimidinyl2-methyl-4,6-quinolinediamine trihydro-chloride) , EHop-016, AZA1 y Z62954982 (isoxazolyl-benzamide). El inhibidor utilizado en este trabajo es Z62954982 (InSolution™ Rac1 Inhibitor II, Millipore) que es una benzamida selectiva que induce la inactivación de Rac1 al interferir la interacción de la unión Rac1-Tiam1 (Ferri, N., y col. 2009). Z62954982 INTRODUCCIÓN 54! VITAMINA E El término vitamina E se refiere a una familia de lípidos provenientes de plantas. Dentro de esta familia hay ocho miembros, los ocho isómeros de esta familia tienen, todos, un anillo aromático, llamado cromano, con un grupo hidroxilo y una cadena polipronoide. Se distinguen entre ellos o bien por poseer un patrón de metilación distinto en el anillo cromano (distinguiéndose alfa-, beta-, deltao gamma-tocoferol) o bien por la presencia de saturación o no en la cadena de polipronoide (saturada corresponderán a los tocoferoles y si es insaturada, a los tocotrienoles). Común a todos los miembros de la familia de vitamina E es la presencia de un grupo hidroxilo fuertemente electrofílico en el anillo cromano capaz de donar un átomo de hidrógeno para reducir radicales libres, por eso la vitamina E es un potente antioxidante (Ulatowski LM & Manor D, 2015). La función de la vitamina E ha sido tradicionalmente adscrita como un nutriente antioxidante. Esta noción es basada en la cantidad tan grande de literatura que demuestra la eficacia y seguridad de la vitamina E como un elemento neutralizador de radicales peróxidos asociados a lípidos, que han sido generados a través de la peroxidación de ácidos grasos poliinsaturados (Burton & Traber, 1990). Las reacciones donde intievienen el tocoferol son reacciones extremadamente rápidas (entorno a 108 M-1s-1) (Atkinson y col., 2008; Atkinson y col., 2010). Muchos de los trabajos de vitamina E han sido realizados en el alfa-tocoferol, ya que es la vitamina E predominante en los tejidos. Numerosos estudios han establecido la evidencia de que la vitamina E juega un papel crucial en el mantenimiento de la salud neurológica. La primera enfermedad neurológica y neuromuscular donde se ve que la deficiencia de vitamina E tiene una importancia especifica fue la ataxia espinocelebral (Sokol RJ, 1988). Se ha utilizado las vitaminas E por ejemplo para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica INTRODUCCIÓN 55! (ELS) ya que en esta enfermedad se ve afectada la enzima SOD1 (Graf M y col. 2005), la enfermedad de Alzheimer (AD) donde el estrés oxidativo esta muy relacionado con ella (Dysken MW y col., 2014) ya que se ha observado que afecta tanto a lípidos produciéndose la peroxidación de los mismo, ácidos nucleicos y oxidación de proteínas y enzimas; la enfermedad de Parkinson (PD) y la enfermedad de Huntington (Kamat CD y col., 2008). Además, la vitamina E redujo la peroxidación lipídica y la deposición amiloide en un modelo de ratón transgénico para la enfermedad de Alzheimer. La vitamina E desarrolla actividad antioxidante en lipoproteínas del líquido cefalorraquídeo en presencia de cantidades fisiológicamente relevantes de oxidantes. VITAMINA C La vitamina C (vit C) es una vitamina soluble en agua que contribuye como un donador de electrones en importantes reacciones biológicas en el cuerpo. La forma activa de la vit C es el ácido L-ascórbico. , que primeramente existe como monoanión ascórbico a pH fisiológico (Dhariwal KR y col., 1991). Muchas especies son capaces de sintetizarla en el hígado a partir de glucosa, pero otras especies como murciélagos, cerdos , peces, primates e incluso humanos no la sintetiza por lo que tienen que suplirse a través de la dieta. INTRODUCCIÓN 56! La toma y distribución de la vit C en el cuerpo está bajo un estricto control homeostático. La entrada de la vit C en las células se produce por transportadores específicos de vitamina C dependiente de sodio (SVCT 1 y 2), estos transportadores intercambian sodio por la vitamina C. En el cerebro el transporte depende de SVCT 2 que gobierna el transporte a través de los plexos coroideos hacia el fluido extracelular y que está alrededor de las neuronas (Rice, M.E. 2000). La versatilidad funcional de la vit C relacionada con la estructura e integridad funcional del cerebro, lleva a pensar que la deficiencia de vit C en el sistema nervioso puede da lugar disfunciones cognitivas. Muchos experimentos han apoyado el papel crucial de la vit C en el cerebro siendo un potente antioxidante y eliminador de ROS, así como de un importante factor en el reciclaje de los antioxidantes del cerebro (por ejemplo la vitamina E, de la que hemos hablado en el anterior punto). La función de la vit C en la integridad de los vasos sanguíneos, el balance REDOX y neuromodulación en el cerebro han llevado a que se desarrollen investigaciones sobre el efecto de la vitamina en el desarrollo del cerebro y el envejecimiento. El desarrollo neuronal y la maduración están comprometidos por falta de vitC, dado que su deficiencia da lugar una disminución del volumen cerebral. El desequilibrio REDOX en el cerebro ha sido asociado con isquemias, Alzheimer y la enfermedad del Huntington (Hansen SN y col., 2014). El ácido ascórbico ha sido utilizado para atenuar la enfermedad de Huntington (Rebec, G.V y col., 2003), como posible tratamiento en la enfermedad de Alzheimer (Heo JH y col., 2013). Junto a estas dos enfermedades, la vit C se ha utilizado para mejorar el estado de demencia de pacientes adultos (Gray, S.L y col., 2008). Usando el modelo animal de Fmr1-KO, nuestro grupo previamente ha demostrado que el estrés oxidativo es el primer factor involucrado en la fisiopatología de Fmr1KO. En cerebros de ratones Fmr1-KO se encontraron incrementos en los niveles de ROS, peroxidación lipídica (medida como TBARS) y oxidación proteica (medido mediante los grupos carbonilos) respecto a ratones sanos-WT. INTRODUCCIÓN 57! La actividad NADPH oxidasa también se observo que esta alta en ratones Fmr1-KO, así como los niveles antioxidantes del glutatión están alterados en los cerebros de los ratones nulos para FMRP (el Bekay R y col., 2007). Este patrón de alteración refleja un desequilibrio entre la formación de ROS y de antioxidantes, lo que provoca un daño oxidativo que se manifiesta con peroxidación lipídica y de proteínas que son marcas del SXF Es por tanto que se llevaron a cabo estudios preclínicos usando antioxidantes como α-tocoferol o melatonina. La administración crónica de antioxidantes hacen que se reviertan ciertas características fenotípicas del ratón con SXF (De Diego-Otero y col., 2009; Romero-Zerbo et al, 2009). También se desarrollo un ensayo clínico controlado con placebo con una combinación de antioxidantes (α-tocoferol y ácido ascórbico) mejorando significativamente el comportamiento y cognición (de Diego-Otero Y y col., 2014). APOCININA La apocinina (apo) fue primeramente descrita por Schmiedeberg en 1883 y extraída desde las raíces de la Apocynum cannabinum, fue el remedio oficial que se usó para los problemas de corazón. En 1971, la apocinina fue identificada durante el aislamiento de los elementos inmunomoduladores desde las raíces de Picrorhiza kurroa. La apocinina es una acetofenina de peso molecular 166,17 kD y cristaliza en el agua, ha sido utilizada como un inhibidor eficiente del complejo NADPH oxidasa en muchos modelos experimentales. APOCININA INTRODUCCIÓN 58! La apocinina es un inhibidor de la translocación de componentes citosólicos del complejo de la NADPH oxidasa presente en las membranas celulares (Peters EA y col., 2001). La activación de la NADPH oxidasa está asociada al reclutamiento de todas las subunidades entorno a la membrana (Smit HF y col., 2001). Podemos considerar este compuesto como un inhibidor selectivo de la actividad NADPH oxidasa y su concomitante producción de ROS, ya que inhibe principalmente a la translocación de la subunidad p47phox (Stolk J y col., 1994). La apocinina presenta un efecto protectivo en distintos órganos como son riñones y corazón, debido a su propiedad de reducir el estrés oxidativo, así se demuestra en el uso beneficioso de la apocinina en el tratamiento del síndrome cardiorrenal tipo 4 (Liu Y y col., 2015). Los derivados de la apocinina inhiben ciertas señales intracelulares que dan como resultado un decrecimiento en la migración de las células en el cáncer de mama. Estos derivados de la apocinina causan un reagrupamiento significativo del citoesqueleto de actina ya que disminuyen los niveles de Rac1 activa y Cdc42. Esta posible relación entre Rac1 y apocinina es lo que le daría a la apocinina un carácter antitumoral (Klees RF y col., 2006). En relación con enfermedades mentales se ha observado que la apocinina protege contra la isquemia global inducida tanto por estrés oxidativo como por daño neuronal del hipocampo y que la inhibición de la producción de ROS por el tratamiento con apocinina preserva la barrera hematoencefálica. Se ha demostrado que los ratones que tienen la p47phox silenciada (también conocido como factor citosólico neutrófilo-NFC) muestran resistencia a la esclerosis lateral amiotrófica inducida (EAE) (van der Veen RC y col. 2000), dando la idea que la apocinina puede ser considerado como un compuesto protector en esta enfermedad y la aplicación de apocinina en ratones con EAE inducida reducen sus signos clínicos (Choi BY y col., 2015). ! ! INTRODUCCIÓN 59! ESTATINAS La síntesis del colesterol es un proceso donde interviene una gran cantidad de enzimas, entre la que se encuentra la 3-hidroxi-3-metil-glutaril Coenzima A reductasa (HMG CoA reductasa). Esta enzima cataliza la conversión de la HMG-CoA a mevalonato, que es un metabolito clave en la biosíntesis de colesterol. Son moléculas que se caracterizan por inhibir la acción de esta enzima, ya que poseen una estructura similar a la molécula HMG CoA. La afinidad de las estatinas por la enzima es de 1.000 a 10.000 veces la del sustrato natural (Wang TJ y col., 2001). Las estatinas son unas de las medicinas más efectiva y ampliamente usadas para la reducción de los niveles de LDL (lipoproteína de baja densidad) de colesterol en sangre y reducir los eventos cardiovasculares (Genest J y col., 2009). A pesar de que todas las estatinas actúan a través del mismo mecanismo, estas pueden estar divididas en dos categorías basadas según su origen: • Derivadas de hongos: Lovastatinas, simvastatina, mevastatina y pravastatina. • Derivados sintéticos: fluvastatina,, atorvastatina, pitavastatina, cerivastatina y rosuvastatina HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS ! 66! OBJETIVOS 1. Analizar el metabolismo del oxido nítrico, medir la concentración de nitritos/nitratos, proteínas nitrosiladas, estrés nitrosativo, y la expresión de las distintas isoformas de la oxido nítrico sintasas (NOS) en áreas cerebrales como cerebelo, corteza e hipocampo. 2. Estudiar la vía de señalización y regulación de la proteína Rac1-GTPasa en los ratones Fmr1-KO en tres áreas cerebrales. 3. Ver el efecto del tratamiento crónico con un inhibidor de Rac1, sobre la densidad de espinas dendríticas y en el comportamiento de ratones Fmr1-KO. 4. Analizar la efectividad del tratamiento crónico con ácido ascórbico (vitamina C) y su combinación con α-tocoferol (vitamina E) en ratones Fmr1-KO. Estudiar el estrés oxidativo en cerebro y la actividad locomotora, ansiedad y aprendizaje mediante pruebas estandarizadas antes y después del tratamiento. 5. Estudiar la efectividad del tratamiento crónico con apocinina, un inhibidor de la subunidad p47 de la NADPH oxidasa. Analizar los parámetros bioquímicos en relación al estrés oxidativo y el comportamiento de los ratones Fmr1-KO antes de después del tratamiento. 6. Estudiar los efectos del tratamiento agudo con dos estatinas (SIM y NTS) inhibidores de la enzima HMG-CoA que a su vez impiden el ensamblaje de Rac1 en el complejo NADPH-oxidasa. Analizar los parámetros bioquímicos en relación al estrés oxidativo y su comportamiento de los ratones Fmr1-KO antes y después del tratamiento. 67! MATERIAL Y MÉTODOS ! 68! MATERIAL Y MÉTODOS 69! 1. MARCAJE Y GENOTIPADO DE LOS ANIMALES. A los ratones a la edad de 21 días se procede al destete, es decir separarlo de la madre. Una vez separados se ponen los machos en una jaula y las hembras en otra jaula, teniendo en cuenta que el cupo por jaula es de 5 animales (5 animales/jaula). Después de la separación en distintas jaulas se le realiza el marcaje. Para ello vamos a proceder al corte de un dedo de la pierna izquierda, de esta manera se diferenciará a los ratones en un futuro. Se aprovecha la ocasión y el dedo cortado se pone en un Eppendorf debidamente rotulado y se congela hasta su uso para la extracción del DNA, de esta manera tenemos el tejido suficiente para realizar la extracción del DNA sin tener que provocarle más daño al animal. Este DNA servirá para el genotipado de los animales, ya que mediante la reacción de PCR con unos determinados primers obtendremos el genotipo de cada ratón. En el caso de que no se haya obtenido el tejido durante el marcaje del ratón se podría recurrir al corte de una pequeña fracción de cola (4-5 mm). La extracción de DNA se basa en la digestión del tejido con proteinasa K en un tampón Tris-HCl 10 mM, NaCl 400 mM, EDTA 2 mM y detergente (lauril sulfato sódicoSDS). Después de la digestión del tejido precipitamos las proteínas mediante el uso de una solución de NaCl 6 N. En el sobrenadante de dicho precipitado se hallará el DNA, el mismo que se precipita con el uso de etanol al 100%. El precipitado se lava con etanol al 70 %, además de ir eliminando posibles sales que estén adherida al DNA. El DNA se deja secar al aire libre para que se elimine el etanol sobrante, una vez pasado 30 minutos se le pone 50 µL de H2O PCR Grade para rehidratar el DNA. Para la digestión del tejido se pone 300 µL de tampón de extracción, 20 µL de proteinasa K (10mg/mL) y 15 µL de una solución de SDS al 20% en H2O miliQ. Dejándose incubar en un baño (Selecta, Unitronic-OR, Barcelona, ESPAÑA) a 56ºC durante 24 horas con agitación constante. La precipitación de las proteínas por sales (salting-out) se realiza poniendo a 100 µL de NaCl 6N en el producto de la digestión, todo se centrifuga a 13000 x g (Eppendorf, Hamburgo, ALEMANIA) durante 15 minutos a 4ºC. En el sobrenadante de dicha precipitación se encontrará el DNA, para MATERIAL Y MÉTODOS 70! precipitarlo le pondremos 600 µL de etanol al 100 %. Centrifugamos a 13000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Al pellet, fracción que contendrá el DNA precipitado se le lava con 100 µL de etanol 70º; para ello lo resuspendemos en esta cantidad de etanol y lo centrifugamos a 13000 x g durante 5 minutos a 4ºC. Eliminamos el sobrenadante y dejamos secar el DNA unos 30 minutos. Una vez seco ponemos 50 µL de H2O PCR Grade para rehidratarlo y se guarda a 4 ºC. Pasada 24 horas desde la extracción, tiempo que sirve para que el DNA se hidrate y se estabilice, se mide su concentración por absorbancia del DNA a 260 nm para ello se utiliza el medidor de absorbancia NanoDrop2000 (THERMO FISHER SCIENTIFIC, Wilmington, USA) donde se medirá la concentración de DNA de la muestra y la pureza de la extracción mediante el valor de 260/280. Conocida la concentración de DNA que se posee en cada muestra, se prepará una dilución para conseguir la concentración de uso de 50 ng/µL. La dilución se realiza en el mismo disolvente donde se resuspende el DNA, H2O PCR Grade. El genotipado se realiza mediante el uso de una PCR con diferentes pares de primers (WT y KO) para distinguir a los ratones WT y KO. En esta PCR se utiliza un kit comercial de SIGMA (SIGMA ALDRICH, RedTaqTM ReadyMixTM PCR Reaction Mix With MgCl2, Missouri, USA), compuesto por una solución mezcla de 0.06 U/cl de la enzima Taq DNA polimerasa, 20 cM Tris-HCl pH 8.3, 100 mM KCl, 3 mM MgCl, 0.02% gelatina, 0.4 mM de una mezcla de dNTP (dATP, dCTP y dGTP, dTTP) y estabilizadores. A este producto se le pone la mezcla de primers correspondiente, así como el DNA. Los primers utilizados tienen estas secuencias WT Forward 5´ -GTGGTTAGCTAAAGTGAGGATGAT3´ Reverse 5´ -CAGGTTTGTTGGGATTAACAGATC3´ KO Forward 5´- ATCTAGTCATGCTATGGATATCAGC3´ Reverse 5´- GTGGGCTCTATGGCTTCTGAGG3´ Tabla 5. Secuencias de los cebadores utilizados en la reacción de PCR MATERIAL Y MÉTODOS 71! Para la realización de la PCR se toman 5 µL del kit comercial de SIGMA, a los que se le añade 0,2 µL de cada primer (forward y reverse) y 1 µL de DNA a la concentración de 50 ng/µL, completándose la reacción hasta 10 µL con H2O. PRODUCTO VOLUMEN (µL) RedTaq ReadyMix-PCR Reaction 5 Primer forward 0,2 Primer reverse 0,2 DNA (50 ng/µL) 1 H2O PCR grade 3,6 Tabla 6. Volumen de cada producto de la reacción de PCR Una vez que se tiene preparada la reacción de PCR, esta es llevada a un termociclador (MBS Satellite 0,2 G Thermal Cycler, THERMO FISHER SCIENTIFIC, Wilmington, USA) con el siguiente programa cargado.!! PASO TEMPERATURA (ºC) TIEMPO CICLOS Activación de la enzima 94 ºC 10 minuto 1 Desnaturalización 94 ºC 30 segundos 35 Hibridación 55 ºC ó 63 ºC 1 minuto Polimerización 72 ºC 30 segundos Polimerización final 72 ºC 10 minutos 1 Conservación 4 ºC Infinito Tabla 7. Programa de PCR utilizados. La hibridación a 55 ºC es utilizada para los primers WT, mientras que la hibridación de 63 ºC es utilizada para los KO La temperatura de hibridación varía en función si la reacción se esta llevando a cabo con los primers de WT (55 ºC) mientras si se está utilizando la pareja de primers para KO la temperatura de hibridación será de 63 ºC. Al producto de la reacción se resolvió mediante la electroforesis en gel de agarosa al 1% en tampón Tris-Acetato-EDTA y 5 µL de intercalante (GoldViewTM Nucleic Acid Stain, Gentaur GMBH, Marienbongard 2, Aachen, ALEMANIA). En cada pocillo se carga las 2 reacciones de la misma muestra previamente mezclada y se le aplica una carga de 85 V (150 mA) durante 60 minutos. El producto de la electroforesis se MATERIAL Y MÉTODOS 72! visualiza bajo luz ultravioleta (UV) en el ImageQuant LAS 4000 (GE HEATHCARE LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK). Lo esperable es que se obtenga una banda de 465 pb en las muestras correspondientes a los ratones normales (WT) y de 800 pb en las muestras correspondiente a ratones mutados (Fmr1-KO). El patrón de peso molecular utilizado contiene 10 bandas (1Kb leader SIGMA ALDRICH, Missouri, USA) con un rango que va desde 100 a 1000 pb con un intervalo de 100 pb entre cada una de ellas. 2. TRATAMIENTOS Se realizaron tratamientos tanto crónico como agudo mediante la administración por vía intraperitoneal (i.p.) de los compuestos: vitamina E (α-tocopherol), estatinas (SIM y NTS, proporcionadas por la empresa NeuronBio) y el inhibidor especifico de Rac1 (Z62954982 (isoxazolyl-benzamide)) a una determinada dosis, diaria en función del tratamiento. En algunos casos se le suministró el tratamiento en el agua de bebida, es el caso de los compuestos: vitamina C (ácido ascórbico) y el inhibidor de la NADPH oxidasa (apocinina) Los grupos de ratones fueron tratados con suero fisiológico (0.9% NaCl) o agua de inyección comercial como control de los tratamientos. COMPUESTO DOSIS VÍA DE ADMINISTRACIÓN TIPO DE TRATAMIENTO Inhibidor Rac 1-! Z62954982 2mg/kg/día Administración intraperitoneal Crónico 30 días Vitamina E (α-tocoferol) 1.5 mg/kg/día Administración intraperitoneal Crónico 30 días Vitamina C (ácido ascórbico) 1.5 mg/kg/día Administración oral Crónico 30 días Inhibidor NADPH oxidasa-Apocinina 8mg/kg/día 32 mg/kg/día Administración oral Crónico 30 días Estatina A SIM 1.5 mg/kg/día Administración intraperitoneal Agudo 7 días Estatina B NTS 1.5 mg/kg/día Administración intraperitoneal Agudo 7 días Tabla 8. Resumen de las dosis de los tratamientos aplicados a los ratones. MATERIAL Y MÉTODOS 73! Las distintas dosis para cada tratamiento fueron preparadas a partir de la droga pura utilizando suero fisiológico estéril como diluyente en el caso de la vitamina E, en el caso del inhibidor de Rac1 se utilizó agua inyectable comercial con DMSO al 10% y en el caso de las estatinas el diluyente fue una sustancia que la misma empresa NeuronBio proporciona. En el caso del tratamiento oral el diluyente va a ser la misma agua filtrada que los ratones beben, en este caso suministrada por el Estabulario de la Facultad de Medicina de Málaga. 3. PRUEBAS DE COMPORTAMIENTO EXPLORACIÓN DE CAMPO ABIERTO-OPEN FIELD EXPLORATION La prueba de exploración de campo abierto da la oportunidad única de medir sistemáticamente la exploración a un nuevo ambiente, la locomoción general y proveer de una aproximación a la ansiedad que sufre los ratones. Repeticiones de la prueba da un método de medida de la habituación a un ambiente familiar. Hay dos factores que tienen influencia en los resultado del comportamiento en este tipo de test la primera es el aislamiento social que se produce y la segunda es el estrés creado por el nuevo ambiente (Prut L y col., 2003). Hay diversas formas que han sido utilizadas para la realización de la prueba del campo abierto, la más común es la que hemos utilizado en esta tesis doctoral que es un laberinto en forma de cubo. El sistema está compuesto por cuatro arenas distintas unidas en forma de cuadrado (2 x 2 arenas), de la cuales cada arena tiene un tamaño de 50 x 50 cm con 50 cm de atura, siendo iluminada por una lámpara de intensidad constante y baja. El material con el que está hecho el laberinto es plástico y tiene una superficie con fondo negro. El movimiento es captado por una cámara encima de las cuatro arenas, pudiéndose registrar el movimiento de cuatro ratones a la vez. El movimiento es registrado y analizado por el programa informático SMART (PANLAB, Barcelona, ESPAÑA), monitorizándose el movimiento que hay en la zona central y periférica de cada arena. MATERIAL Y MÉTODOS 74! Los animales, 30 minutos antes de empezar la prueba, se llevaron a la habitación donde se desarrollaría el comportamiento. Este tiempo sirve para que los animales se aclimaten a la habitación de comportamiento. Para el desarrollo de la prueba se pone al ratón en el centro de la arena, permitiéndose que explore la arena durante 15 minutos. El programa SMART, registró el tiempo de permanencia en la zona central, zona periférica, la distancia total recorrida y el número de cruces entre zonas. Una vez que pasa el tiempo de la sesión el animal retorna a la jaula donde estaba y el laberinto se limpia con agua jabonosa para eliminar posibles olores y así tener claro que el comportamiento se produce sin tener nada que ver el olor. Figura 15. Representación de las zonas del laberinto y laberinto utilizado en el experimento, el fondo del laberinto en lugar de blanco es negro. RECONOCIMIENTO DE OBJETO En esta prueba de comportamiento utilizamos el mismo laberinto utilizado para la prueba del campo abierto (50 x 50 cm) hecho de Plexiglás gris. Esta técnica se basa en el protocolo propuesto por Ventura y colaboradores en su trabajo de 2004, donde estudiaban el efecto de la dopamina en la corteza prefrontal asociándolo a una mejoría en la capacidad de reconocer objetos (Ventura R y col., 2004). Los objetos utilizados en este caso son un cilindro de plástico color violeta con tapa del mismo color de 8 cm de alto y 4 cm de diámetro (Objeto A), y otro cilindro de color blanco con tapón blanco de 8 cm de alto y 5 cm de diámetro (objeto B). MATERIAL Y MÉTODOS 75! En el primer día del test se transportaron los ratones a la sala de comportamiento donde se dejaron 30 minutos para que se aclimataran a la sala. Una vez pasado este tiempo se ponen en la arena durante 50 minutos para que exploren el laberinto, quedando registrado y analizado por el programa SMART (PANLAB, Barcelona, ESPAÑA) lo que ocurre en cada intervalo de 10 minutos para ver si hay una adaptación al laberinto. Después de cada prueba se limpió el laberinto con una solución jabonosa para eliminar los olores que pudieran quedar en el campo abierto, haciéndose de esta manera la prueba siguiente sin dudas de que los ratones siguen el rastro del anterior. El segundo día se procedió a la prueba de reconocimiento de objetos, donde se establece dos sesiones consecutivas. Una sesión pre-análisis donde al animal se le deja unos 10 minutos con dos objetos similares, dos objetos A. Terminada la sesión se saca al ratón y se le pone tres minutos en la misma jaula donde estuvo antes y unos de los anteriores objetos A es sustituido por un objeto B. La sesión análisis dura también 10 minutos y se realiza con dos objetos diferentes (A y B). Los ratones tienen la tendencia natural a explorar los objetos nuevos en comparación con los objetos familiares. En ambos casos se mide la distancia total recorrida por el animal y el tiempo que el ratón está en contacto con cada objeto, siendo definido el contacto con el objeto como cuando el animal con su hocico toca el objeto quedando todo registrado y analizado por el programa SMART (PANLAB, Barcelona, ESPAÑA). Figura 16. Representación de la localización de los objetos durante cada momento del experimento. MATERIAL Y MÉTODOS 82! ! 2. En una placa de 96 pocillos se ponen 5 µL de muestra o dilución de la muestra, así como 5 µL de cada punto de la curva patrón y 5 µL de tampón de extracción que será el blanco de la prueba. 3. A cada muestra se le añade 250 µL de azul de Coomasie (Comassie Brillant Blue G-250) (THERMO FISHER SCIENTIFIC, Wilmington, USA) . 4. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. 5. Leer la placa a una longitud de onda de 595 nm en el VERSAMAX (VERSAmax, microplate reader, MOLECULAR DEVICES INC., Toronto, CANADÁ) 6. Una vez obtenidos los datos de absorbancia tanto para las muestras como para la curva patrón se procede al tratamiento por EXCELL de los resultados obtenidos. Tanto de las muestras como de la curva patrón se realizan duplicados. De la media de los resultados de la curva patrón es con la cual se realiza la recta a través de ella se obtendrá la concentración de proteínas a través de una interpolación de las medias de los dos datos de las muestras. Una vez conocida la concentración de proteínas, se puede calcular el volumen que es necesario cargar en el gel para que las proteína de interés se distinga bien después de hacerle la inmudetección con anticuerpos específicos contra ella. PREPARAR EL GEL DE ELECTROFORESIS. ! En un gel de electroforesis SDS-PAGE se puede distinguir dos fases o dos geles con diferentes funciones: fase/gel de concentración y fase/gel de separación. El gel de concentración sirve para agrupar las muestras en una sola banda aun habiéndose cargado distintos volúmenes en sus pocillos. Mientras que el gel de acrilamida se utiliza para separar las proteínas según su peso molecular. Para la preparación del gel hay que tener en cuenta dos aspectos de importancia: • Cantidad de muestras a cargar. Este dato condicionará el tamaño que va a tener el pocillo de carga, generalmente los utilizados en esta tesis doctoral son de 1 mm ó 1.5 mm ya que son los apropiados para cargar alta cantidad de producto (20 µL). MATERIAL Y MÉTODOS 83! • Tamaño de la proteína a separar. Una vez que se sabe por la bibliografía el tamaño de la proteína a detectar se decide que porcentaje de Acril-Bis acril a utilizar. Si no se supiera el tamaño de la proteína lo más apropiado sería utilizar un gel en gradiente de concentración, el más usual es el de 4-12%. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ! Una vez conocida el volumen de muestra que se necesita para obtener una concentración determinada, se pone en un tubo al cual se le añade 10 µL de tampón de carga Laemmli (Agua miliQ 6 mL; Tris/HCl 0.5 M pH 6.8 2 mL; SDS 10 % 3.2 mL; β-mercaptoetanol 0.8 mL; Azul de bromofenol 0.5% 0.8 mL y Glicerol 3.2 mL). En algunos casos las muestras provienen desde un tratamiento previo del homogenado con anticuerpos o proteínas específicas unidas a bolas de sepharosa para que la proteína a resolver inmunoprecipitado y se separe del total de proteínas del homogenado. INMUNOPRECIPITACIÓN DE RAC 1-GTPase Los inmunoconjugados PAK1-PBD y bolas de sepharosa fueron desarrollados tal como nos indica del Pozo MA y col., 2000 (del Pozo MA y col., 2000). A 80 µg de extracto total de cerebro se le añadieron 30 µL de PAK1-PBD-conjugado con bolas GST sepharosa, dejándose incubar a 4ºC durante una hora con agitación constante. Después se lavan 4 veces con Tris-HCl 25mM pH 7.6, este inmunocomplejo se usa para el análisis por western-blot con anticuerpos anti-Rac1. Posteriormente se calientan las muestras, tanto las que vienen de inmunoprecipitados como las que no han tenido ningún tratamiento, con 10 µL de tampón de carga a 95ºC durante 5 minutos en un termobloque con agitación constante de 800 rpm, pasado este tiempo centrifugamos las muestras a 13000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente; este último paso permite eliminar los posibles desechos que se provoca en la desnaturalización de las proteínas por el efecto del calor y la presencia del βmercaptoetanol. Seguidamente se cargan las muestras en el gel que se encuentra en un tampón de electroforesis (3 g/L Tris; 14,4 g/L Glicina; 1 g/L SDS). Las muestras son separadas en una corriente eléctrica de 80V durante 15 minutos seguida de otra MATERIAL Y MÉTODOS 84! corriente de 120V durante 60-75 minutos, en todos momento el amperaje no supera los 400 mA. Las proteínas se transfieren a una membrana de PVDF usando Trans-Blot Turbo Blotting System (BIORAD,!Hércules, California, USA). TRATAMIENTO INMUNOQUÍMICO DE LAS MEMBRANAS Cuando las proteínas son transferidas a las membranas, hay que darle un tratamiento inmunoquímico para detectar la presencia de la proteína de interés y poder así medir su nivel de expresión. A las membranas, antes de incubarla con el anticuerpo primario, se le tienen que bloquear los sitios de unión inespecíficos para evitar, de esta manera, que el anticuerpo se una a sitios donde no debería y por consiguiente se impide la aparición de falsos positivos. El bloqueo se realiza con leche desnatada en polvo disuelta en PBS-Tween 20 al 0,5 % (SIGMAALDRICH, Missouri, USA) a un porcentaje del 5%. El bloqueo se realiza manteniendo en incubación a las membranas con este tampón de bloqueo durante 30 minutos a 37ºC. Seguido al bloqueo se pone el anticuerpo primario a la dilución requerida para cada uno de ellos y se incuba durante toda la noche a 4ºC en agitación. De esta manera se consigue relentizar la reacción y evitar, también, las uniones inespecíficas del anticuerpo. La dilución del anticuerpo se realiza en el mismo tampón utilizado para el bloqueo de la membrana. Pasado el tiempo de incubación y después del lavado de la membrana con PBS-Tween 20 al 0,5 % (3 veces 5 minutos cada vez), se incuba con el anticuerpo secundario especifico contra la fracción constante de los anticuerpos primarios, son anticuerpos que están desarrollados en especies distinta a donde se forma el anticuerpo primario y es desarrollado específicamente contra la fracción constante del anticuerpo primario. La dilución de este anticuerpo secundario es por norma general 1:2000, realizándose en el mismo tampón de bloqueo. Los anticuerpos secundarios utilizados en los diferentes western blot de esta tesis doctoral están conjugado con peroxidasa de pepino (HRP), que nos servirá para hacer el revelado. MATERIAL Y MÉTODOS 85! Las membranas son reveladas usando un kit de quimioluminiscencia Clarity Western ECL Substrate (BIORAD, Hércules, California, USA) que consta de sustrato para el luminol y otro sustrato de peróxido, que se ponen en una proporción 1:1 sobre la membrana. La detección de las bandas que representan las proteínas estudiadas se realiza por el método de ECL. El resultado de la reacción es observado en el ImageQuant LAS 4000 (GE HEATHCARE LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK) y analizado la intensidad de cada banda se calculó por densitometría utilizando el programa de acceso libre ImageJ (NIH Image). 5. DETERMINACIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO Para la medición del estrés oxidativo en los tejidos tenemos que empezar por la homogenización del tejido en el tampón fosfato a pH 8. Tampón fosfato (PB) pH=8 • 14,19 g PO4HNa2 • 15,60 g PO4H2Na • 1,46 g EDTA Todo ello disuelto en un litro de agua miliQ Para la homogenización del tejido utilizaremos el Kimble® Kontes Disposable PELLET PESTLES (SIGMA-ALDRICH,! Missouri, USA), así como tres ciclo de sonicación de tres segundos cada uno y a 30 mHz de amplitud de la onda (VIBRACELLTM-ULTRASONIC, SONICS & MATERIALS, Conneticut, USA). De este homogenado se separa unos 80 µL para la medición de la peroxidación de las proteínas (grupos carbonilos) del citosol, así como se tomaran 5 µL para medir la concentración de proteínas totales por el método de Bradford. Al restante se le somete a una centrifugación de 2300 x g durante 10 minutos a 4ºC para eliminar restos celulares, después de la centrifugación al sobrenadante se le realiza otra centrifugación a 24000 x g a 4ºC para obtener un precipitado con las proteínas y lípidos de membranas que se resuspenderá en un tampón que contiene la siguiente composición MATERIAL Y MÉTODOS 86! 0.1 M NaCl, 0.5 mM KCl, 6.2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 4.9 mM Glucosa, 0.55 mM KH2PO4, 24 mM NaHCO3. Protocolo 1. Homogeneizar en 1 mL buffer fosfato pH 8 mantenido a 4°C, utilizando un homogeneizador Kimble® Kontes Disposable PELLET PESTLES (SIGMAALDRICH,!Missouri, USA) y tres ciclos de sonicación de tres segundos cada uno y a 30 mHz de amplitud de la onda (VIBRACELLTM ULTRASONIC, SONICS & MATERIALS, Conneticut USA). 2. Separar 5 µL de muestra para medir la cantidad de proteínas totales mediante el uso del método Bradford, 80 µL del homogeneizado total para medir la peroxidación de proteínas y 300 µL para la medición de GSH y GSSG. 3. El resto del homogeneizado se centrifugan a 2300 x g durante 10 minutos a 4°C para eliminar de la muestra los restos celulares. 4. Se pasa el sobrenadante a un tubo nuevo y se vuelve a centrifugar a 24000 x g durante 30 minutos a 4°C. 5. Al precipitado (membranas) se resuspende en 280 µL de tampón con la siguiente composición: 0.1 M NaCl, 0.5 mM KCl, 6.2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 4.9 mM Glucosa, 0.55 mM KH2PO4, 24 mM NaHCO3. DETERMINACIÓN DE LA OXIDACIÓN DE LAS PROTEÍNAS La formación de componentes carbonilos es actualmente el método más general y ampliamente usado como marcador de la oxidación proteica tanto para muestras in vitro como para in vivo. Como marcador del daño oxidativo en las proteínas, el contenido de carbonilos se ha visto que se acumula durante la edad, inflamación crónica y algunas enfermedades relacionadas con la edad (Dalle-Done I y col. 2003, Dean RT y col. 1997). MATERIAL Y MÉTODOS 87! La determinación del nivel de oxidación de proteínas se llevó a cabo analizando el contenido de grupos carbonilos y dieno-conjugados. Para analizar la oxidación de proteínas se sigue el método anteriormente publicado (Levine RL, 2002). A 80 µL de proteínas tanto de citosol como de membrana se le añade la misma cantidad de acido tricloroacético al 20% mantenido en la nevera a 4ºC, esta mezcla se centrifuga a 3300 x g a temperatura ambiente. El precipitado de dicha centrifugación se resuspende en 60 µL de una solución de 2,4-dinitrofenilhidrazina en HCl 2N a 10 mM y se deja incubando durante una hora en oscuridad (cada 15 minutos se le procede a agitación). Pasado ese tiempo se le pone 20 µL de acido tricloroacético al 20 % e incubarlo durante unos 10 minutos. Seguidamente se centrifuga a 12000 x g durante 3 minutos y se resuspende el pellet en 100 µL de NaOH e incuba durante un tiempo de 15 minutos a 37ºC en el baño con agitación. Pasado este tiempo, se centrifuga a 13000 x g durante 5 minutos y se mide a una longitud de onda de 360 nm en el sobrenadante (VERSAmax, microplate reader, MOLECULAR DEVICES INC., Toronto, CANADÁ). Todas las centrifugaciones se realizan a temperatura ambiente Los resultados obtenidos se corresponden a nmol/mg de proteínas, usando el coeficiente de extinción molar de 22 mol-1 cm-1. La cantidad de proteínas oxidadas se expresa en nmol/mg de proteínas. La concentración de proteínas totales se determinó por el método de Bradford, tal como se expuso en un apartado anterior. Protocolo 1. A 80 µL del homogeneizado inicial (citosol) y de la suspensión de membranas se le añaden 80 µL de ácido tricloroacético (TCA) al 20% en agua bidestilada (agua miliQ) mantenido a 4 ºC. 2. Centrifugar a 3300 x g durante 8 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. 3. Al pellet obtenido se resuspende en 60 µL de una solución de 2,4dinitrofenilhidrazina 10mM en HCl 2N, protegida de la luz. MATERIAL Y MÉTODOS 88! 4. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad, agitando cada 15 minutos. 5. Añadir 20 µL de TCA al 20% e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. 6. Centrifugar a 12000 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante, para quedarnos con el precipitado. 7. Añadir 100 µL de NaOH 1M para resuspender el precipitado. 8. Incuba a 37ºC durante 15 minutos. 9. Centrifugar a 13000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. 10. Pasar el sobrenadante a una placa de 96 pocillos y medir la absorbancia a una longitud de onda de 360 nm en el VERSAmax (VERSAmax, microplate reader, MOLECULAR DEVICES INC., Toronto, CANADÁ). Los resultados obtenidos se corresponden a nmol/mg de grupos carbonilos en las proteínas oxidadas, usando el coeficiente de extinción molar de 22 mol-1 cm-1. A= Î x C x b A: Absorbancia C: Concentración de proteínas (nm/mg) b: centímetros de espesor de la cubeta DETERMINACIÓN DE LA OXIDACION DE LIPIDOS DE MEMBRANA La medida del malondialdehido (MDA), el producto derivado de la peroxidación de lípidos más abundante, ha sido extensamente usada como una medida de la oxidación de los lípidos y por tanto un acercamiento del nivel de estrés oxidativo que sufre el tejido. En esta tesis doctoral se ha medido la producción de MDA mediante la cuantificación de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, siguiendo el protocolo propuesto por Esterbaur & Cheeseman en 1990 (Esterbauer H & Cheeseman KH, 1990). MATERIAL Y MÉTODOS 89! Paso a describir brevemente el protocolo. Primeramente se realiza una curva patrón con diluciones seriadas a partir de una concentración inicial de 250 µM de MDA. Se toman 200 µL de cada punto de la curva estándar, así como 200 µL de las muestra de membrana y se le añade 200 µL de una solución de 0.5% de ácido tío barbitúrico (4,6dihidroxipirimidina-2-SH) en ácido tricloroacético al 20%. Se mezcla bien y se deja incubando a 98ºC en durante 10 minutos en un termobloque (SELECTA, Barcelona, ESPAÑA). La cantidad de TBARS producida fue medida por la absorbancia del sobrenadante de esta reacción a 532 nm (VERSAmax, microplate reader, MOLECULAR DEVICES INC., Toronto, CANADÁ). La medida de TBARS fue calcula en función de la absorbancia obtenida y la curva estándar. Como blanco de reacción se utilizó el mismo tampón en el que estaban disueltas las muestras. Los resultados son expresados en nmol MDA/mg proteínas (obtenido por el método de Bradford). Protocolo 1. A 200 µL de muestra (membranas) y a 200 µL de cada punto de la curva patrón y al blanco se le añade 200 µL de una solución, preparada en el momento, de 0.5% de ácido tío barbitúrico (4,6-dihidroxipirimidina-2-SH) en ácido tricloroacético al 20% (mantenido a 4ºC). 2. Mezclar vigorosamente 2 segundos con el vórtex. 3. La mezcla se incuba a 98 ºC durante 10 minutos en el termobloque. 4. Se centrifuga a 12000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Se mide la reacción colorimétrica del sobrenadante a 532 nm de longitud de onda en el espectrofotómetro (VERSAmax, microplate reader, MOLECULAR DEVICES INC., Toronto, CANADÁ). ! Los resultados obtenidos se extrapolan en la curva patrón y se corresponde a equivalentes de malondialdehido (MDA). MATERIAL Y MÉTODOS 90! Curva estándar de malondialdehido (MDA) Número de tubo Concentración MDA (µM) Composición del tubo 1 250 µM 250 µL de 1 mM MDA + 750 µL de H2O 2 125 µM 500 µL del tubo 1 + 500 µL de H2O 3 62.5 µM 500 µL del tubo 2 + 500 µL de H2O 4 31.25µM 500 µL del tubo 3 + 500 µL de H2O 5 15.63µM 500 µL del tubo 4 + 500 µL de H2O 6 7.81 µM 500 µL del tubo 5 + 500 µL de H2O 7 3.91 µM 500 µL del tubo 6 + 500 µL de H2O 8 1.95 µM 500 µL del tubo 7 + 500 µL de H2O 9 0.98 µM 500 µL del tubo 8 + 500 µL de H2O 10 0 µM 200 µL de H2O Tabla 10. Volúmenes necesarios para realizar la curva estándar de MDA. MEDIDA DE LAS ESPECIES REACTIVAS. EXTRACCIÓN DE MACRÓFAGOS PERITONEALES DE RATONES. Los ratones se sacrificaron mediante decapitación y desangrado posterior. Posteriormente, se les inyecta en la parte peritoneal, 10 mL de NaCl 0.9%. Se hace un masaje peritoneal durante 5 minutos, y se realiza una incisión a nivel ventral. Con una pipeta se absorbe el líquido peritoneal enriquecido de macrófagos. Las células se recogen después de una centrifugación a 4 ºC a 6000 rpm durante 5 minutos. Luego, el precipitado celular se resuspende en KR-HEPES. MEDIDA DE LA PRODUCCIÓN DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO (ROS) Las células (106 células /mL), resuspendidas en el tampón de incubación KR-HEPES, se incuban con el agente a 37ºC durante el tiempo requerido. Luego se añade 15 mM MATERIAL Y MÉTODOS 91! luminol/ 2 mg/mL peroxidasa, en la oscuridad. La reacción se dispara con el estímulo (PMA) en la oscuridad y la luminiscencia se mide a 37ºC. Para medir los ROS totales (extra y intracelular) no se lavan las células. La reacción se pone en marcha con el estímulo y se registra la fluorescencia a: Longitud de onda ext= 502 nm. Vent ext = 5 Longitud de onda em= 523 nm. Vent em= 10 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE NITRATOS. La medición de la concentración de nitratos en diferentes áreas cerebrales se llevó a cabo mediante el uso de un kit de medida comercial (ABCAM, Cambridge, UK). El kit comercial es de medida colorimétrica de oxido nítrico, la medida de nitrato/ nitrito se hace en un proceso que se divide en dos etapas. Brevemente paso a describir las dos etapas de las que consta: la primera de ella convierte el nitrato a nitrito utilizando nitrato reductasa y la segunda de ella utilizando el reactivo de Griess para convertir el nitrato a un producto azo purpura. La cantidad de producto azocromóforo refleja la cantidad de oxido nítrico en la muestra. En esta tesis doctoral medimos en este caso la fracción citosólica (extraída tal como hemos hecho referencia anteriormente) de ratones Fmr1-KO y WT-control de dos edades diferentes edades (3 y 6 meses), de cada ratón se extrajo muestras de tres regiones cerebrales importantes en el estudio del SXF (cerebelo, corteza prefrontal e hipocampo). 6. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL mRNA Antes de llevar a cabo esta parte metodológica de la tesis es muy importante tener en cuenta que ha de evitarse la contaminación con enzimas que degraden el RNA (RNAsas), por lo que en todo momento, las soluciones y materiales utilizados fueron tratados con inhibidores de estas enzimas así como que a estos mismos se le sometió a MATERIAL Y MÉTODOS 98! Para determinar los niveles relativos de mRNA de cada uno de los genes estudiados, estos se compararon con β-actina, gen de expresión constitutiva (housekeeping gene), utilizado como referencia estándar en los estudios de Rac1-GTPasa. Para cada gen se utilizó una pareja de cebadores o primers (oligonucleótidos sintéticos de unos 20 nucleótidos de longitud) complementarios a los extremos de la región que se quería amplificar. Los cebadores para las PCRs fueron diseñados a partir de las secuencias de los genes de ratón localizados en la base de datos NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Símbolo Nombre Oligo forward 5’ --- 3’ Oligo reverse 5’ --- 3’ Número de acceso GenBank Temperatura de alineamiento β-actina Actin-beta tacagcttcaccac cacagc aggaaggctggaaaag agc aNM_008381 44.7 ºC rac1GTPasa RASrelated C3 botulinum substrate1 tcctagttgtgggtg tgctg atcggccatttgtcacct ac NM_009007 57.0 ºC Tabla 13. Secuencia de los primers utilizados para las PCRs. (pares de bases, pb) El segundo método se centra en la introducción de una sonda que se une específicamente a una determinada secuencia de un gen, estas sondas suelen estar marcadas en su extremo 5´. La habilidad fluorogénica de estas sondas es capaz de desarrollar un método efectivo de detectar la presencia a tiempo real de productos de amplificados específicos. La PCR a tiempo real para medir la expresión de las diferentes isoformas de NOS en diferentes áreas cerebrales se basó en el uso de sondas fluorogénicas desarrolladas por Applied Biosystems (sondas TaqMan®) (APPLIED BIOSYSTEMS, Weiterstadt, ALEMANIA) capaz de detectar a productos específicos de PCR que se acumulan a lo largo de una reacción de PCR. Estas sondas tienen la característica de poseer en su extremo 5´un flouróforo “reporter dye” y en su extremo 3´un “quencher”, mientras la sonda esté intacta la proximidad de los dos reduce la fluorescencia emitida por el MATERIAL Y MÉTODOS 99! fluoróforo. Si la secuencia diana está presente la sonda se une a ella, además gracias a la actividad 5´nucleasa de la enzima polimerasa Applied Biosystems hot-start DNA 8 (APPLIED BIOSYSTEMS, WEITERSTADT, ALEMANIA)se libera al fluoróforo. Al separarse el fluoróforo del quencher se ve incrementada la intensidad de la fluorescencia del mismo. También se produce la eliminación de la sonda permite que se siga produciendo la extensión del primer, por lo que no se inhibe por tanto el proceso de PCR. Adicionalmente se van liberando fluoróforos desde las sondas en cada ciclo transcurrido, dando como resultado el incremento de la intensidad de la fluorescencia que es proporcional a la cantidad de producto amplificado. Cuanto más molde haya en el principio más rápidamente se incrementará la fluorescencia. De esta manera en los casos donde un gen se expresa mucho se ve que hay mayor cantidad de mRNA por lo tanto, mayor cantidad de cDNA se produce por retrotranscripción por lo cual la cantidad de molde es mayor. Los genes de mayor expresión por lo tanto son los primeros en mostrar fluorescencia, es decir en ciclos tempranos, y los de menor expresión son los que muestra fluorescencia en ciclos más altos. Con estos datos podremos obtener tanto la cantidad total del moléculas teníamos al principio de la reacción (a partir de una curva estándar) como obtener una cantidad relativa de moléculas respecto a un gen de expresión constitutiva (housekeeping gene). Figura 21. Representación de cómo funcionan las sondas TaqMan. MATERIAL Y MÉTODOS 100! Para hacer la cuantificación se debe realizar una curva estándar con diluciones seriadas de una cantidad conocida de cDNA, de modo que las concentraciones de las muestras deberán encontrarse entre las de los estándares. Mientras para saber la diferencia de expresión de un gen vamos a ver la diferencia relativa que se establece entre el gen de interés y un gen de referencia que en nuestro caso fue la GADPH (gen de expresión constitutiva utilizado como referencia estándar en los estudios de las subunidades de NOS). Para la realización de la PCR a tiempo real primeramente tenemos que hacer una mix donde, se añadirá tanto una master mix con todos los elementos para llevar a cabo la PCR, enzimas, buffer y nucleótidos, TaqMan® Universal Master Mix II 2 X (10 µL) como las sondas con los primers para cada gen que serán suministrada en un mismo tubo TaqMan® Gene Expression Assays 20 X (1 µL). Después de hacer el mix se pone en la placa de 96 pocillos especifica para este tipo de PCR (MicroAmp® Optical 96Well Reaction Plates) y seguidamente se pone 9 µL de una solución de cDNA molde y agua libre de RNase con una cantidad de 2 ng de cDNA. Por lo que la reacción tendrá un volumen total de 20 µL. REACTIVO VOLUMEN (µL) TaqMan® Universal Master Mix II 2 X 10 TaqMan® Gene Expression Assays 20 X 1 cDNA template (2 ng)+ RNase-free water 9 Volumen total 20 Tabla 14. Volúmenes necesarios para la PCR con sondas TaqMan A la placa se le pone un adhesivo transparente específico, evitándose que se formen burbujas. Se le da un spin (1000 rpm 1 minuto) para que se eliminen las burbujas del pocillo que puedan interferir en la reacción y todo el producto quede en el fondo del pocillo. Cargamos la placa en la maquina de PCR a tiempo real Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (APPLIED BIOSYSTEMS, WEITERSTADT, ALEMANIA) y elegimos el programa estándar de 2 horas para sondas TaqMan®. MATERIAL Y MÉTODOS 101! Los primers y probes que fueron usadas en esta tesis doctoral están disponible comercialmente por TaqMan Gene Expression Assays (APPLIED BIOSYSTEMS, WEITERSTADT, ALEMANIA) y se corresponde a: Mm 00607939_s1, Mm00435217_m1, Mm00440502_m1 and Mm00435175_m1,) Los cambios relativos en la expresión de los distintos genes se determinaron usando el método 2ΔΔCt, utilizando como gen constitutivo el gen de la GADPH. 7. FIJACIÓN, PREPARACIÓN E INMUNOHISTIQUÍMICA DE LAS SECCIONES CEREBRALES Los animales fueron plenamente anestesiados con 10 µL/g de 5 % hidrato cloral (PROLABO, Fontenay-St.-Bois, FRANCIA) en suero a 0,9% de NaCl. Una vez anestesiado los animales se perfundieron intracardialmente con 0,9 % de NaCl para limpiar a la sangre de los animales, después se paso el fijador por los tejidos para fijarlos (Perfusion Peristaltic Pump Miniplus 3 M312, GILSON VILLIERS-LE-BEL, FRANCIA). Se fijaron los tejidos con fijador Simoyi con glutaraldehido (solución acuosa de 15 % de ácido pírico y 4% de paraformaldehido en PBS 0,1 M). Los cerebros se diseccionaron y se incuban durante 3 horas en el mismo fijador utilizado anteriormente, entonces se elimina el fijador y se pone buffer fosfato (PB) al 0,1 M pH 7,4 durante 2 horas para limpiar al tejido. Los cerebros se criopreservan hasta que se proceda a cortar y su posterior tratamiento inmunoquímico. La crioperservación se realiza poniendo a los cerebros en una solución de 30 % sacarosa en PB 0,1 M pH 7,4 durante 24 horas. Las secciones de giro dentado de 40µm de espesor de secciones coronales fueron obtenidos con el micrótomo de congelación (LEICA FRIGOMOBIL JUNG SM 2000, NUSSLOCH, GERMANY), las secciones se mantuvieron en una solución de 0,05 % de azida sódica (p/v) en PBS a 4ºC hasta que se haga la inmunodetección de las proteínas. La técnica inmunohistoquímica utilizada en este caso fue el marcaje con diaminobencidina peroxidasa (DAB) de secciones coronales seriadas. Brevemente, a MATERIAL Y MÉTODOS 102! las secciones cerebrales se le desactivo la peroxidasa endógena, para posteriormente incubarla con el anticuerpo primario durante 48 horas a 4ºC en agitación suave constate, el anticuerpo primario (Anti-Rac 1 IgG; 1:5000 C-14, SC-217. SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC., CA, USA) está diluido en una solución de 2 % Tritón X-100 y 5 % suero de cabra en PBS 0,1M pH 7,4. Se recupera el anticuerpo primario (para posteriores usos), mientras que al tejido se le da tres lavados con PBS 0,1 M pH 7,4 de 10 minutos cada uno y se incuba con el anticuerpo secundario apropiado a una dilución 1:1000 durante 90 minutos a una agitación constante suave a temperatura ambiente. Seguido a esto se elimina el anticuerpo secundario y se lava otra vez el tejido con PBS 0,1 M pH 7,4 y se incuba durante 90 minutos con el complejo avidina-biotina-peroxidasa (Kit Elite ABC; VECTOR LABORATORIES, California, USA) a una dilución 1:200. En este momento las secciones cerebrales son lavadas tres veces con PBS 0,1M pH 7,4 y dos veces con Tris-HCl 0.2M pH 7.6, e incubada en 0.02% DAB (#075k3729, SIGMA ALDRICH, St. Louis, USA) con 0.003% H2O2 en PBS 0.1M pH 7,4 hasta que se consigue la intensidad de señal que se quiere. La reacción es parada con Tris-HCl 0.2M pH 7.6 y las secciones son montadas en portas poli-lisinados usando medio de montaje Entellan®. 8. ANÁLISIS DE LAS ESPINAS DENDRITICAS POR EL MARCAJE DE GOLGI El método utilizado para el análisis de las espinas dendríticas es el marcaje de Golgi. Brevemente paso a describirlo, a los ratones anestesiado con una sobredosis de pentobarbital sódico se le realiza una perfusión transcardiaca utilizando como fijador a paraformaldehido al 4% en tampón fosfato (PB) 0,1 M pH 7,4 (Perfusion Peristaltic Pump Miniplus 3 M312, GILSON Villiers-Le-Bel, FRANCIA). Después de esto se cortan los cerebros en secciones menores de 1 cm de grosor y se post-fijan durante 3 días en paraformaldehido al 10% en tampón fosfato (PB) 0,1 M pH 7,4. Pasado este tiempo, los bloques de tejidos fueron puestos en una solución de bicromato de potasio al 3 % durante 5 días en oscuridad!(Woolley CS & McEwen BS, 1994). La medida es MATERIAL Y MÉTODOS 103! al menos a 50 µm desde el soma de las neuronas. Se eligieron 5 segmentos de 10 µm de longitud y en el mismo plano de visión. Para el conteo necesitamos el juego constante con el micrómetro del microscopio epifluerescente (OLYMPUS BX41, Tokyo, JAPÓN) para obtener un fino ajuste de la imagen, las imágenes se obtienen a 100 X con su consecuente aceite de inmersión requerido. Sólo se contó a aquellas espinas dendríticas que se diferenciaban de la rama principal.! 9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Todos los datos fueron analizados usando el programa informático SPSS 15, estimando la media de los valores, la desviación estándar, el error estándar de la media, así como las diferencias estadísticas entre los grupos de ratones normales WT y Fmr1-KO; controles y tratados, a través de los instrumentos estadísticos para muestras no relacionadas: t de Student (para analizar dos grupos no relacionados) y el análisis de la varianza ANOVA (genotipo, tratamiento y análisis de varianza de medidas repetidas) seguido por la corrección con el post test de Bonferroni. Se establece como diferencia significativa cuando *p<0.05 y ** p<0.01. MATERIAL Y MÉTODOS 104! ! 105! RESULTADOS ! 106! ! ! RESULTADOS 107! ESTRÉS OXIDATIVO Y METABOLISMO DEL ÓXIDO NÍTRICO! !1. LOS NIVELES BASALES DE NITRITOS/NITRATOS ESTAN REDUCIDOS EN RATONES FMR1-KO. La figura 22 muestra el análisis de la concentración de nitritos/nitratos, que es una medida indirecta del óxido nítrico (NO), analizado mediante el uso del kit comercial (ABCAM, Cambridge, UK) que utiliza la colorimetría resultante de la reacción del óxido nítrico con el reactivo de Griess. La concentración se mide en diferentes áreas cerebrales, tales como hipocampo, corteza prefrontal y cerebelo. Un total de 6 ratones de cada grupo y genotipo, en función de su edad (3 y 6 meses). Los resultados muestran que la producción de nitritos/nitratos en cada área cerebral estudiada e independientemente de la edad, es más baja en los ratones Fmr1-KO en comparación con WT-control. La producción de NO es significativamente baja en el cerebelo e hipocampo de los ratones Fmr1-KO de 3 meses en comparación con los ratones WT-control, en esta edad no se detecta diferencias en la corteza. Mientras, la producción de NO se reduce significativamente en corteza e hipocampo de ratones Fmr1-KO de 6 meses de edad comparado con ratones WT-control, sin embargo en cerebelo no hay diferencias significativas. Las mayores diferencias significativas se muestran en los ratones de 3 meses de edad. Figura 22. Comparación de la concentración nitritos/nitratos en la fracción citosólica de diferentes áreas cerebrales (cerebelo, corteza e hipocampo) de ratones nulos para la proteína FMRP (Fmr1-KO)(n=6) y ratones wild-type (WT) (n=6) de diferentes edades (3 y 6 meses). Los datos están descritos como media de los valores± desviación estándar (*P<0.05 T-test Fmr1-KO versus WT) Figure'1' 0,000' 0,050' 0,100' 0,150' 0,200' 0,250' 0,300' 0,350' Cerebellum( Cortex( Hippocampus( Cerebellum( Cortex( Hippocampus( Nitrito/Nitrato (nmoles/mg proteína) WT'' Fmr1-KO'' *( *( *( 6 meses Cerebelo Corteza Hipocampo Cerebelo Corteza Hipocampo *( *(P<0,05((T(test(no(pareado(WT(vs.(Fmr1-KO( 3 meses WT KO RESULTADOS 114! RAC1 EN EL SÍNDROME X FRÁGIL. 1. ACTIVACIÓN DE RAC1 Para mejorar el conocimiento del efecto de las señales intracelular mediada por las pequeñas moléculas GTPasa, en las alteraciones fisiopatológicas observadas del SXF, se estudió la activación de la proteína Rac1 en extractos de cerebro total, hipocampo, cerebelo y corteza prefrontal. La activación de Rac1-GTPasa fue estudiada mediante la inmunoprecipitación de la forma activa de proteína Rac1-GTPasa. El dominio PAK1-PBD adherido a bolas de agarosa fue usado para que las proteínas Rac1 en su forma activa se unieran específicamente a ellas (debido a que PAK1-PBD se une a la forma de la proteína unida al nucleótido trifosfatado GTP) y se consigue que la proteína activa inmunoprecipite. Se analizó que ocurre en los inmunoprecipitados de homogenados de cerebro completo y las tres principales áreas estudiadas en el SXF. La Figura 26 muestra los resultados de diferentes western-blot con 30 µg de extractos inmunoprecitados de cerebro completo (A), hipocampo (B), cerebelo (C) y con la corteza prefrontal (D). Los animales Fmr1-KO exhibieron una alta diferencia significativa de activación de Rac 1 cuando son comparados con su WT-control correspondiente. La mayor diferencia se encuentran en extracto de cerebro completo, donde hay una activación hasta 4 veces mayor en KO que en WT, mientras que la menor diferencia está en el hipocampo; aun así en todos los casos se percibe diferencias significativas entre Fmr1 KO y WT-control (*p<0.05 Fmr1-KO versus WT; ** p<0.01 Fmr1-KO versus WT). RESULTADOS 115! Figura 26. La activación de Rac1-GTPasa fue medida en extracto de cerebro completo (A), hipocampo (B), cerebelo (C) y corteza prefrontal (D) de ratones WT-control (n=6) y Fmr1-KO (n=6) de 4 meses de edad, a los cuales se le obtuvieron homogenado completo de cerebro o de diferentes áreas diseccionadas. A 80µg de extractos de proteínas se le añadió 30µl de PAK1-PBD conjugado a bolas de sepharosa GST para provocar la inmunoprecipitación de la forma activa de Rac1. Al inmunoprecipitado se le realiza un western-blot y los resultados mostrados son normalizados con la cantidad de Rac1 total. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. La cuantificación de las bandas fue llevada a cabo por el software Image J (desarrollado por el National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) y expresada por la media de intensidad óptica para tres experimentos independientes ±SEM (mean ± SEM) y normalizados con la densidad óptica para el total de Rac1-GTPasa del mismo blot. La significación estadística de los valores de cuantificación fue estudiada usando el test de Student no pareado. Valores *P < 0.05 y **P<0.01 fueron considerados significante [Fmr1-KO grupo vs. WT control grupo]. Cerebro total Rac1 WB PAK1-PBD Pulldown KO WT Total Rac1 - 21 kDa - 21 kDa 0 0,2 0,4 0,6 0,8 Rac1 WB PAK1 PBD Pulldown KO WT Total Rac1 - 21 kDa Corteza prefrontal - 21 kDa 0 0,2 0,4 0,6 0,8 WT KO Rac1 WB PAK1 PBD Pulldown KO WT Total Rac1 - 21 kDa Hipocampo - 21 kDa 0 0,2 0,4 0,6 0,8 WT KO Rac1 WB PAK1 PBD Pulldown KO WT Total Rac1 - 21 kDa Cerebelo - 21 kDa WT KO WT KO Figure 1 Densidad óptica Rac1GTPase /Total Rac1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 * * ** ** * p<0.05 comparan Fmr1-KO vs WT ** p<0.01comparan Fmr1-KO vs WT A) B) C) D) Densidad óptica Rac1GTPase /Total Rac1 Densidad óptica Rac1GTPase /Total Rac1 Densidad óptica Rac1GTPase /Total Rac1 RESULTADOS 116! 2. ANÁLISIS INMUNOHISTOQUÍMICO EN EL GIRO DENTADO DEL HIPOCAMPO Y CORTEZA La proteína Rac1-GTPasa fue analizada tanto en el hipocampo como en la corteza, mediante el uso de técnicas inmunohistoquímicas sobre tejido de ratones Fmr1-KO y ratones WT. En la figura 27 mostramos la inmunohistoquímica de dos áreas cerebrales distintas, el giro dentado del hipocampo (lugar importante de formación de nuevas neuronas) y la corteza. La figura nos muestra evidencia de señal positiva de Rac 1-GTPasa en ambas áreas cerebrales, no hay diferencias aparentes en la inmunodeteción de esta GTPasa cuando son observadas las mismas áreas en los animales WT-control y Fmr1-KO. Figura 27. Inmunodetección de Rac1, Rho-GDI y TIAM1en dos áreas del cerebro: giro dentado del hipocampo y la corteza. El panel representa la detección de la proteína Rac1 por inmunohistoquímica en las áreas cerebrales de ratones de 4 meses de edad control-WT (n=6) y Fmr1-KO (n=6). La señal positiva de cada proteína es mostrada como una señal marrón que marca las células. La inmunohistoquímica de Rac1 no muestra diferencias significativas entre WT-control y Fmr1-KO. Para cada proteína y área de estudio, imágenes representativas en 2 diferente magnificación fueron tomadas: 10X en la izquierda del panel y 20 X en la derecha del panel. Figure 4 RhoGDI Tiam1 WT KO WT KO WT KO GIRO DENTADO, HIPOCAMPO WT KO WT KO CORTEZA PREFRONTAL Rac1 WT KO B) C) 10X 10X 10X 10X 20X 20X 20X 20X RESULTADOS 117! 3. MEDIDA DE LA ACTIVACIÓN DE LA RUTA ERK La proteína Rac1 activa está implicada en la activación de diferentes rutas de señalización intracelular, y sirve de efector de algunas moléculas importantes del metabolismo celular. Una de las rutas más importantes sobre la que actúa Rac1-GTPasa es la protagonizada por las proteínas MAP kinasas (ERK-1/2, p38 y JUNK), que son una serie de proteínas de señalización intracelular que van a activar a distintos elementos celulares para ejercer su acción. Los procesos de activación de las proteínas MAP kinasas tienen que ver y están relacionados con procesos de fosfoliración de ciertos residuos. En estos resultados (figura 28) se muestran como en ratones Fmr1-KO hay una mayor activación de las proteína ERK-1/2 (pERK-1/2), siendo esta diferencia significativa respecto a lo que ocurre en ratones WT. Estos resultados son verificados tanto en western-blot como en estudios por inmunohistoquímica de hipocampo. Esto últimos ensayos revelan un aumento de la señal detectada en ratones Fmr1-KO comparado con controles sanos, cuando se usa anticuerpos específicos para detectar la fosforilación de las proteínas ERK y por tanto la activación. RESULTADOS 118! Figura 28. Activación de ERK-1/2. A) Western-blot de extractos de proteínas (45 mg) en SDS-PAGE, transferido a membrana de PVDF e incubado con anticuerpo específico anti-fosfo-ERK1/2 resuelto por medio de quimioluminiscencia mejorada con luminol. Para verificar incluso las proteínas de carga, las transferencias fueron posteriormente deshibridadas e incubadas con anticuerpos anti-beta actina como proteína de referencia. La cuantificación de las bandas fue llevada a cabo por el software Image J (desarrollado por el National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) y expresada por la intensidad óptica para tres independientes blots ±SEM (mean ± SEM) (* p<0.05 comparan Fmr1-KO vs WT por ANOVA). B) Estudios de cortes de hipocampo por inmunohistoquímica para detectar la fosforilación de las proteínas ERK-1/2 revelado con DAB, revelan un aumento de la señal detectada en ratones Fmr1-KO comparado con controles silvestres. Imágenes representativas de 3 experimentos independientes. WT KO HIPOCAMPO ERK1 P-ERK1 WT KO BASAL ERK 1 (44Kda) β-actina(42Kda) pERK 1 (44Kda) β-actina (42 Kda) 0 40 80 120 160 Densitometria (unidades relativas) Fmr1-KO WT ERK p-ERK WT KO WT KO A B * * p<0.05 comparan Fmr1-KO vs WT 20X 10X RESULTADOS 119! 4. MEDIDA DE LA EXPRESIÓN DEL mRNA DE RAC1 El RNA mensajero y por lo tanto la expresión génica de la proteína Rac1 fue analizado mediante el uso de la PCR a tiempo real con el intercalante SYBER Green. Para la proteína se analizó el mRNA extraído desde cerebros completos y las tres áreas de estudio (cerebelo, corteza prefrontal e hipocampo). Se utilizaron 10 ratones Fmr1-KO y 10 ratones WT-control en este estudio, a los cuales se les extrajo el cerebro y las áreas cerebrales correspondientes se diseccionaron en frio, siguiendo las indicaciones de posición del atlas del cerebro de ratón de Paxinos. Para Rac1 (A) los resultados fueron relativizados con el dato obtenido para el gen de referencia (housekeeping) que en este caso fue ß-actina. En ninguna de las zonas analizadas se encontraron diferencias estadísticamente significativas (*p<0.05 Fmr1KO versus WT). Figura 29. Expresión del gen Rac1 en el cerebro total y áreas especificas del cerebro (cerebelo, corteza prefrontal e hipocampo) de ratones wild type (WT)-control (n=10) y ratones nulo para Fmr1 (Fmr1KO) (n=10). Las regiones se diseccionaron siguiendo al atlas de Paxinos y el RNA total se extrajo según se describe en el material y método (método de fenol-cloroformo y purificación en columna). Los resultados nos muestran que los niveles de mRNA de Rac1 no están afectados por la ausencia de FMRP en las distintas áreas de cerebros de animales con el SXF. Los datos de expresión están relativizados con los valores de un gen constitutivo que en este caso es la β-actina (Mean +/-SEM n=10 cada grupo). El análisis estadístico que se llevo a cabo fue Ttest no pareado. Valores de p< 0.05 fueron considerados significantes. *p < 0.05, fmr1-KO versus WT-control. Figure 5 0 5 10 15 20 CEREBELLUM PREFRONTAL CORTEX HIPPOCAMPUS Rho-GDI/Beta-Actin ratio (%) WT (n=10) KO (n=10) 0 10 20 30 40 50 CEREBELO PREFRONTAL CORTEZA HIPOCAMPO Rac1/ Beta-Actin ratio (%) WT (n=10) FMR1-KO (n=10) CEREBRO TOTAL TCEREBRO TOTAL 0 25 50 100 125 CEREBELLUM PREFRONTAL CORTEX HIPPOCAMPUS Tiam1/ Beta-Actin ratio (%) WT (n=10) KO (n=10) TOTAL BRAIN 75 * p<0,05 A) B) C) RESULTADOS 120! TRATAMIENTOS PARA EL SÍNDROME X FRÁGIL TRATAMIENTO CON EL INHIBIDOR DE RAC1 1. MEDIDA DE LA DENSIDAD DE ESPINAS DENDRITICAS El SXF se ha caracterizado como una sinaptopatología definida así por la presencia de anormalidades en el número de espinas, dinamismo y morfología de las mismas, así como un regulación en los receptores glutamaérgicos de grupo 1 (mGLUR 1 y 5) (Portera-Cailliau C. 2012 ; Till SM. y col., 2015). Para medir la densidad de espinas dendríticas de las neuronas piramidales de la región CA1 del hipocampo, la densidad fue medida en las espinas apicales del estrato radial. El análisis cuantitativo fue llevado a cabo en tejidos marcado de negro y que poseen impregnaciones de Golgi que eran uniformes a lo largo de las secciones. Las neuronas estaban localizadas dentro de la región CA1 de la formación hipocampal y como condición de que no hubiera ninguna región dendrítica sin marcaje a lo largo de la dendrita. La medida es al menos a 50 µm desde el soma de las neuronas. Se eligieron 5 segmentos de 10 µm de longitud del mismo plano de visión. Para el conteo necesitamos el juego constante con el micrómetro del microscopio epifluerescente (OLYMPUS BX41, Tokyo, JAPÓN) para obtener un fino ajuste de la imagen, las imágenes se obtienen a 100 X con su consecuente aceite de inmersión requerido. Sólo se contó a aquellas espinas dendríticas que se diferenciaban de la rama principal. La densidad de espinas fue calculada mediante la división del número de espinas en un segmento por la longitud de dicho segmento y fue expresado como el número de espinas dendrítica por 10µm de dendrita. El valor de las densidades es la media de las espinas dendríticas de 5 fragmentos contabilizados por neurona así como la media de seis células neuronales por animal. Aunque de esta manera subestimamos el valor real de espinas dendríticas, ya que no se contabiliza todas las dendritas ni todas las neuronas, sería una estimación de la densidad. RESULTADOS 121! La fuerte relación que se establece entre Rac 1-GTPasa en la formación y elongación de las espinas dendríticas a través de la polimerización de los filamentos de actina se ha descrito con anterioridad (Newey SE y col., 2005). En esta tesis doctoral hemos estudiado la densidad de espinas dendríticas a través de la tinción Golgi-Cox de las dendritas apicales de las neuronas piramidales de la zona CA1 del hipocampo de cerebros obtenidos desde un grupo de ratones WT-control (n=6) y ratones Fmr1 KO (n=6), en condiciones basales y bajo un tratamiento crónico con el inhibidor Rac1 (Z62954982). Como era de esperar, se muestra un incremento del 38 % en la densidad de espina dendríticas detectadas en el ratón nulo Fmr1-KO comparado con el control (WT), así como se observa una normalización en los niveles de espinas dendríticas de los ratones Fmr1-KO después del tratamiento crónico con 2 mg/kg/día del inhibidor de Rac1. (A) (Basal: 11 ± 3 vs 18 ± 2; Tratamiento: 9 ± 3 vs 10 ± 2) (*p<0.05 Fmr1KO versus WT). En la figura 30B se muestran una imagen representativa de la tinción Golgi-Cox de espinas apicales, observándose el incremento de las espinas dendríticas de ratones Fmr1-KO bajo condiciones basales, sin aplicación de tratamiento alguno (Basal: 11 ± 3 vs 18 ± 2). Mientras que en la figura 30 C se muestra la normalización que se produce en la densidad de espinas dendríticas en los ratones Fmr1 KO después del tratamiento crónico con el inhibidor de la Rac 1!Z62954982 (Tratamiento: 9 ± 3 vs 10 ± 2). RESULTADOS 122! Figura 30. Cuantificación de espinas dendríticas de las zonas apicales de células piramidales de la región CA1 del hipocampo, la región cerebral se diseccionó siguiendo al atlas de ratón de Paxinos. (A) Densidad de espinas en las dendritas apicales fue significativamente alta en los ratones con genotipo Fmr1-KO y es normalizado por el tratamiento crónico de 2 mg/kg/día de Z62954982 (inhibidor especifico de Rac1). (B) Imágenes representativas de dendritas apicales con la tinción de Golgi-Cox, se muestra una mayor densidad de espinas dendríticas en los ratones Fmr1-KO. La densidad de espinas dendríticas se expresa con el número de espinas en un segmento de 10µm de dendrita. (C) Imágenes representativa dendritas apicales con la tinción de Golgi-Cox donde se puede observar una normalización de las espinas dendríticas en los ratones Fmr1-KO después del tratamiento crónico con el inhibidor específico de Rac1. La medida de la espina dendrítica se muestran como su media y el error estándar de medida (mean ± SEM) a lo largo de la dendrita de Fmr1-KO (KO n=6) and controlWT (WT n=6). [*p < 0.05 Fmr1-KO versus WT-control], la comparación fue hecha entre 6 muestras experimentales de cada diferente ratón. Figure 6 10 µm WT-CONTROL 11±3 spines/10 µm 18±2 spines/10 µm 0 5 10 15 20 Nº of spines /10µm WT (n=6) KO (n=6) Basal A) B) C) Fmr1-KO WT-control * * p<0,05 9±3 spines/10 µm 10±2 spines/10 µm 10 µm 0 5 10 15 20 Nº of spines /10µm WT (n=6) KO (n=6) Treated Basal Z62954982 RESULTADOS 123! 2. EFECTO DE LA INHIBICIÓN DE RAC 1 EN EL COMPORTAMIENTO DEL RATÓN Fmr1-KO Para identificar el efecto potencial de la inhibición de Rac1 en el comportamiento asociado al SXF, especialmente en la ansiedad y en el aprendizaje, se realizan diferentes pruebas comportamentales antes y después de la aplicación de un tratamiento crónico con un inhibidor de Rac1. Debido a estos estudios anteriormente mencionados planteamos el uso de un inhibidor de la Rac1, para ver si hay una mejoría en los parámetros comportamentales del ratón. El inhibidor utilizado es InSolution™ Rac1 Inhibitor II, Z62954982 (MIllipore) que es una benzamida selectiva que inhibe la activación de Rac1 al interferir la unión Rac1-Tiam1 (Ferri, N., y col. 2009.). Los ratones Fmr1-KO fueron tratados mediante inyecciones intraperitoneales con un inhibidor especifico para Rac1 (Z62954982) después del tratamiento se sometieron a diferentes pruebas de comportamiento, específicamente laberinto en cruz elevado y reconocimiento de objeto. En condiciones basales, los ratones Fmr1-KO muestran un comportamiento típico de este tipo de ratones donde característicamente hay una respuesta anormal a estímulos que pueden provocar ansiedad. Estos ratones en condiciones basales se mantienen significativamente más tiempo en el brazo abierto que los ratones WT-control (*p<0.05 Fmr1-KO versus WT). El tratamiento con Rac1 reduce el tiempo que los ratones modelo de la enfermedad pasan en el brazo abierto del laberinto en cruz elevado por lo que normaliza la respuesta ansiosa del ratón Fmr1-KO (figura 31 A). En cuanto a los resultados de la prueba de reconocimiento de objeto, en los ratones Fmr1-KO se observa que bajo condiciones basales un incremento significativo (*p<0.05 Fmr1-KO versus WT) en el tiempo de exploración del nuevo objeto mientras que después del tratamiento crónico se ve reducido. Viéndose una mejora en el proceso cognitivo (figura 31 B). Todos estos últimos datos sugieren que la inhibición de Rac1 por Z62954982 reverte las alteraciones observadas en la respuesta ansiosa y las alteraciones cognitivas asociadas a la ausencia de la proteína FMRP en los ratones nulos de Fmr1.