Caracterización neuropatológica y evaluación preclínica de potenciales estrategias terapéuticas en modelos animales transgénicos de la enfermedad de Alzheimer

F acult ad de Cie ncias Depart amen t o de Biología Celular , Genética y Fisiología Área de Biología Celular Laura Isabel T rujillo Estrada Car act eriz ación neur opa t oló gic a y ev aluación pr eclínica de pot enciales estr a t eg ias t er apéuticas en modelos animales tr ansgénic os de la en f erm edad d e Alzheimer TE SIS DOCT ORAL Málaga 2015 AUTOR: La ura Isabel Trujillo Estrada http://orcid.org/ 0000 - 00 01 - 6696 - 450 5 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está sujeta a una licencia Creative Commons: Reconoc imiento - No comercial - SinO braDerivada (cc - by - nc - nd): Http://c reativecommons. org/licences/b y - nc - nd/3.0/es Cualquie r parte de esta obra se puede reproducir si n autoriz ación pero con e l reconoci miento y at ribución de los aut ores. No se puede h acer uso comercial d e la obra y no se pued e alterar, transfor m ar o h acer obras deri vadas. Esta Tesis Do ctoral está depositad a en el Repositorio In stitucional de la Univ ersidad de Málaga (RIU MA): riuma.uma.es      Ca r d a n Direct o r acteri z d e pote n n imales Dpto . o res: Dra. A z ación n n ciales transg Biología C Á rea d Fac u Univ e TESI S A ntonia Guti M n europ a estrat e énicos C elular, Ge n d e Biología u ltad de Ci e e rsidad de M S DOC T érrez Pére z M álaga, 20 1 a tológi c e gias te de la e n n ética y Fisi o Celula r e ncias M álaga T ORA L Memoria p r Dña. Laura Opt a z y Dr. Davi 1 5 c a y ev a rapéuti c n ferme d o logía r esentada p Isabel Truj a r al Grado Univer s d Baglietto - a luació n c as en d ad de A p or la Licen j illo Estrad a de Doctor sidad de M - Vargas n preclí n model o A lzhei m ciada a para p or la álaga n ica o s m e r  Facultad de C iencias Departamen t o de Biología Celular, Gen ética y Fisiología Área de Biología Ce lular Dra. Antonia Gutiér rez Pérez Campus Universi tario de Teatino s, s/n 29071 M álaga Tlf.: 952133 344 agutierrez@u ma. e s Dra. Dña. A nt onia G utiérrez Pérez , Catedrática del Departamento de Biología Celular, Genética y Fisi ología de la Facultad de Ciencias de la U niversidad de Málaga, Dr. D. David Baglie tt o Varga s, Assistant Project Scien tist at Departm ent of Neurobio logy and Behavior, University of Califo rnia (EEUU), INFORMAN Que Dñ a. L aura Isabel Tru ji llo Estrada ha realizado bajo su dirección e l trabajo experimen t al que ha l levado a la redacci ón de la presente memoria de Te sis Doctoral, titulada “C aracterizaci ón neuropatológica y evaluación preclínica de potenciales estrategias ter apéuticas en modelos animales tr ansgénic o s de la enfermeda d de A lz heimer” . Considerando que constituye trabajo de Tesis Doctoral, aut oriz amos su presentación para optar al Gr ado de Doctor. Y para que a sí con ste y surta los ef ectos oportun os , f ir man el pre s ente d ocumento en Mála g a, a 29 de Junio de 2 015. Fdo.: Antonia Gutiérrez Pérez Fdo.: D avid Baglietto Va rg as Facultad de Ciencias Departamento de Biologí a Celular, Genética y Fisiología Área de Biología Celular Campus Universitario de Teat inos, s/n 29071 Málaga Tlf.: 952131 956 Prof. Dr. D. José Becerra Ratia , Catedrático de Biología Celular y Director del Departamento de Biología Celula r, Genética y Fisiología de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Málaga, INFORMA Que Dña. Laura Isabel Trujillo Estrada ha realizado el trabajo experimental, que ha llevado a la redacción de la presente memoria de Tes is Doctoral bajo la dirección de la Dra. Antonia Gutiérrez y el Dr. David B aglietto-Vargas, en los laboratorios del Área de Biología Celular del Departa mento de Biología Celular, G enética y Fisiología de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Málaga. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, firmo el pr esente documento en Málaga, a 29 de Junio de 2015. Fdo.: D. José Becerra Ratia Tesis  Doctor al  Proye cto s El presente trabajo de Tesis Doctoral se ha financi ado por los siguientes proyectos de investigación : Centro de Investigación Biomédica en Red en Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Programa 1: Enfermedad de Alzheimer y otras dem encias degenerativas. Entidad financiera: Instituto de Salud Carlos II I. Ministerio de Ciencia e Innovación, Ref. grupo CB06/05/1116. IP: Dra. Antonia Gutiérrez. Duración: 2007-2015 (renovable). Mecanismos de señalización de la respuesta inflamatoria en la enfermedad de Alzheimer: control de la activación microglial como est rategia terapéutic a neuroprotectora. Entidad financiera: Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovación, Ref. PI09/099. IP: Dra. Antonia Gutiérrez Pérez. Duración: 2010-2012. Oligómeros tóxicos del Abeta como agentes caus antes de la disfunción del citoesqueleto y los procesos proteolíticos en la enfermedad de Alzheimer: búsqueda de nuevas dianas terapéuticas . Entidad financiera: Instituto de Salud Carlos III. Ministerio de Econom ía y Competitividad, Ref. PI12/01431. IP: Dra. Antonia Gutiérrez Pérez. Duración: 2013-2015. Activación glial en el proceso neuroinflama torio: una potencial diana terapéutica para la enfermedad de Alzheimer. Subproyecto 02 del Proyecto Colaborativo Intramural. Entidad financiera: Centro de Investigación Biomédica en Red en En fermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Proyecto Intramural Colaborativo . Ref. PI2010/08 . IP Subproyecto 02: Dra. Antonia Gutiérrez Pérez. Duración: 2010-2013. Propiedades emergentes de la relación neurona-glia que subyacen a neurodegeneración y demencia en la enfermedad de Alzheimer. Ce ntro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED ). Proyecto Intramural Colaborativo. Entidad financiera: Ref. 2013/01. I P Subpr oyecto 05: Dra. Antonia Gutiérrez Pérez. Duración: 2013-2015. Evaluación in vivo de un compuesto de interés. Desarrollo preclínico y estudio previo de entrada a fases clínicas de un nuevo fármaco (Proyecto OTRI). Entidad financiera: Neuron Biopharma, Ref. Contrato OTRI 8.06/5.02. 3621. IP: Dra. Antonia Gutiérrez Pérez. Duración: 2010-2013 . Dña. Laura Isabel Trujillo Estrada, durante est e tiempo ha disfrutado de una beca predoctoral adscrita a créditos de investigación (Proyect o SAS PI0496/09), una beca de Formación del Profesorado Universitario (FPU) del Ministerio de Educación (convocatoria 2009), y un contrato de Investigación con cargo a Proyecto de Investigación.                        La ciencia será siempre una búsqueda, jamás un descubrimiento real. Es un viaje, nunca una llegada. Karl Popper Tesis  Doctor al  A breviatura s   7nAChR : subunidad alfa 7 del receptor nicotínico de acetilcolin a a: alve us A  Abeta :  -amiloide A  i :  -am iloide intracelular ACh : acetilcolina AChE : acetilcolinesterasa AChEIs : inhibidores de la acetilcolinesterasa AD: Alzhe imer’s Disea se ADAM : del inglés A desintegrin and metalloprotease ADEVA : análi sis de la varianza AICD : dom inio intracelular del APP AINE: a ntinflamatorios no esteroi deos ANOVA: análisis de la varianza (del inglés ANalysis Of VAriance) APOE : Apolipoproteín a E APP : Pr oteína precur sora  -amiloide  APP : fracción APP beta soluble BACE : enzima de corte del APP en el sitio beta BDNF : facto r neurot rófico de rivado del ce rebro. BF: telencé falo basal (del i nglés basal forebrain ) CA : Cuer no de Am mon CatD: Catepsina D CCK: Col ecistoquini na CD : del ing lés cluster of differentiation CE : Corteza entorrinal ChAT : colinacetiltransferasa (del inglés ch oline acetyltransferase ) COX : Cicl ooxigenasa CR: Calretinina CTF : fragmento C-terminal DAB: 3-3’-dia minobe ncidina tetrahid rochlorhí drico DABCO : 1,4-diazabiciclo[2 .2.2.]-octano DEPC: Dietilpirocarbonato DN: den sidad numéri ca EA : dnfermedad de Alzheimer EC, Ent: entorhinal cortex ELISA: del inglés Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay EM: Electron microscopy eNOS: Sintasa del óxi do nítri co end otelial ERK : del i nglés extrace llular-sign al-regul ated kinases FAD : Alzheimer familiar (del inglés, Familial Alzheimer’s Disease ) FPP : Farnesil pirofosf ato g: capa g ranular del giro de ntado GABA : Áci do gamm a am ino butíri co GAD: Glutam ato descar boxila sa GAPDH: del inglés glyceralde hyde-3-phosphat e dehydro genase GD: giro denta do GDNF: del inglés glial cell line-d erived neurotr ophic factor GFAP : Proteína glial fibrilar ácid a (del inglés glial fibrillary acidic protein ) GGPP : Geranil geranilp irofosfato GSK-3 : Qui nasa glucóge no sintasa 3 h: hilio de l giro den tado hBDB: núcleo hori zontal de l a banda diago nal de Broca HE: heterocigoto HIPP : interneu ronas del hilo asoc iadas a la vía perforant e (del inglés hi lar interne urons of perform ant pathway ) HMG-CoA : 3- hidroxi- 3-met ilglutaril -coenzim a A HO: homocigoto HSP : Proteína del choque térmico (del inglés Heat schok protein ) Iba1 : del ing l és ionized cal cium bi nding adapter molecule 1 IDE : Enzima degrad adora de insulina IFN-  Interferón ga mm a Ig: Inmuno globuli na IGF-1: Factor de crecimiento insulínico de tipo 1 (del inglés i nsulin-like g r owth facto r -1) IL : Interleuquina IN: intern eurona iNOS : Sintasa del óxido nítrico indu cible KI : knock-in KO : knockout LAMP2: del inglés L ysosome -associat ed membr ane protein 2 LC3: del inglés Light c hain 3 Li: Litio, Lithium Lond; L: Mutación London de APP LRP1 : del inglés Low de nsity lipoprotein receptor - related prot ein 1 LTD : depresi ón a largo plazo LTP : potenciaci ón a largo plazo m: capa mol ecular del giro de ntado Tesis  Doctor al  A breviatura s  M1: esta dio clásico de activación de los m acrófagos M2: estadio alternativo de activación d e los macrófagos MAP: Pr oteína de u nion a mi crotúbulos MCI : del inglé s Mild cognitive impa irment me: capa m olecular exter na del gir o dentado MET: microsc opía electrónica de transmisión MHC : Com plejo mayor de histocom patibil idad mi: capa m olecular interna del giro dentado MMP : Metaloproteasas de matriz MT : Mi crotúbul os NBM: Núcle o basal de Meynert ND: nu mmerical density NeuN: núcleos neuronales NF: Neurofilamento NFs : Factores neurotróficos NFTs : Ovillos neurofibrilares (d el inglés neurofibrilla ry tangles) NGF : Factor de crecim iento nervioso NMDA : Áci do N-metil-D-aspártico NO : óxi do nítri co NPY: Neuropéptid o Y NT: Neur otrofi nas O-LM : interneuron as del s tratu m oriens-l acunoso- moleculare p75 NTR : Receptor de neurotrofinas p75 PB: Tampón fosfato PBS: Tampón fosf ato salino PCR : Reacción en ca dena de la polim erasa PDGF : Facto r de crecim iento deriva do de pl aquetas Per: Perirhinal cortex PET : Tomografía por emision d e positrones PHF : filamentos apareados helicoid ales PLP: Paraformald ehído, L-lisina, Metaperyodato sódico PP : Proteínas fosfatasas PPAR  : Del inglés peroxisome proliferator- activated receptor-gamma PrP : proteí na pri ónica PS : Presenilina PV: Parvalbú mina RC: rojo congo RE : retículo endoplasmático ROS : especies reactivas de oxígeno RSG: corteza retrosplenial granula r RT-PCR : Reacción e n cadena de la polimerasa con transcriptasa in versa S, SUB: Subí culo SAP: Sapori na sAPP  : Fracción APP al fa soluble sAPP  : Fracción APP beta soluble SD: Standar d deviation SDS: Dodecilsulfato sódico SL: Mutacione s Swedis h y London de APP slm: stratum l acunosum-moleculare SLu: stratum lucidum SM: Sept um medial SNC : Sistema nervioso central so: stratum oriens SOM: Somatostatina sp: strat um pyrami dale sr: stratum radiatum SST : Receptores de som atostatina Swe, S : mutación Swedis h de l a APP Syn : sina ptofisi na TEMED: del inglés Tetramethyl enediami ne Tg : transgén ico TG : red Trans Golgi TGF-  : Factor de crecim iento transform ante beta Th : Linfocito T hel per Tio-S, Thio-S: Tioflavina S TLR : del ing lés Toll like rece ptor TNF-  : Facto r de necrosis tum oral  , del inglés Tumor nec rosis factor TPBS: Buffer PBS Tween 20 TREM2 : del inglés triggering receptor expressed on myeloi d cells 2 TrkA: del ingl és tropomyo sin-related kinase A Ub: Ubiquitina V1: corteza visual primaria vBDB: núcleo verti cal de la banda di agonal de Broca VChAT: Transportador vesicular de ChAT VGAT: Transportador vesicular de GABA VGLUT : t ransportador vesicular de glutam ato VIP: Polipéptid o intestinal vasoactivo WB: Western blot WT: genotipo salvaje (d el inglés wild type) Índi ces Tesis  Doctor al  Índice INTRODUCCIÓN 1 1.1. La enfermedad de Alzheimer 3 1.1.1. Tipos de Alzheimer. Factores de riesgo 4 1.1.2. Neuropatología 6 1.1.3. Biogénesis y degradación del  -amiloide 8 1.1.3.1. APP 8 1.1.3.2. Presenilinas: PS1 y PS2 9 1.1.3.3. Procesamiento de APP 10 1.1.3.4. El péptido  -amiloide (A  ) 12 1.1.3.4.1. Tipos de depósitos extracelulares de  -amiloide 13 1.1.3.4.2. Formas oligoméricas del  -amiloide 14 1.1.3.4.3. Acumulación intracelular de  -amiloide 14 1.1.3.4.4. Degradación del  -amiloide 16 1.1.4. Ovillos neurofibrilares intr acelulares y la proteína Tau 16 1.1.5. Pérdida neuronal y sináptica 18 1.1.6. Neuroinflam ación 19 1.1.6.1. Microglía 20 1.1.6.2. Astroglía 22 1.1.6.3. Citoquinas y radic ales libres 23 1.1.7. Hipótes is de la Enfermedad de Alzheime r 24 1.1.7.1. Hipótesis de la cascada amiloi de 24 1.1.7.2. Hipótesis de l a neurodegeneración del citoesqueleto neuronal 25 1.1.7.3. Hipótesis colinérgica 25 1.1.7.4. Hipótesis neurovascular 26 1.1.7.5. Hipótesis inflamatoria 26 1.1.7.6. Otras hipótesis de l a EA 26 1.2. Modelos transgénicos de Alzheimer 27 1.2.1. Modelos transgénicos monogénicos basados en APP 28 1.2.2. Modelos transgénicos monogénicos basados en PS 29 1.2.3. Modelos transgénicos bigénicos PS1/APP 30 1.2.4. Modelos transgénicos basados en TAU 30 1.2.5. Animales transgénicos inducibles 32 1.3. Estrategias terapéuticas para el Alzheimer 34 1.3.1. Estrategias terapéuticas basadas en A  35 1.3.2. Estrategias centradas en Tau 37 1.3.3. Estrategias colinérgicas 39 1.3.4. Terapias antiinflamatorias 39 1.3.5. Terapias antioxidantes y uso de factores neurotróficos 40 1.3.6. Estatinas 41 1. Tesis  Doctor al  Índice  1.3.7. Terapia con células madre 41 1.3.8. Terapia multim odal 41 1.4. Planteamiento del trabajo y objetivos 42 Bibliografía 44 MATERIAL Y MÉTO DOS 61 2.1. Animales de experimentación 63 2.1.1. Animales con dieta suplementada con litio 66 2.1.2. Animales tratados con el com puesto NST0037 (nueva estatina no comercial; Neuron Bio) 66 2.1.3. Animales modificados genéticamente: APP/IL4 -/- 67 2.1.4. Delimitación anatómica de las regiones de estudio 69 2.1.4.1. La formación hipo campal 69 2.1.4.2. Áreas corticales 72 2.1.4.3. Núcleos del telencéfalo basal 73 2.2. Preparación del tejido para microscopía óptica 75 2.2.1. Fijación 75 2.2.2. Crioprotección y congelación 75 2.2.3. Obtención de secciones en el micrótomo de congelación 76 2.3. Tinciones histológicas 76 2.3.1. Tinción general con violeta de cresilo 76 2.3.2. Tinción de placas amiloid es fibrilares con rojo congo 77 2.3.3. Marcaje fluorescente de placas amiloides fibrilares con Tioflavina S 77 2.4. Técnicas inmunohistoquímicas pa ra microscopía óptica a campo claro y fluorescencia 78 2.4.1. Marcaje inmunohistoquím ica para microscopía óptica convencional 79 2.4.1.1. Marcaje inmunohistoquímico doble para microscopía convencional con revelado DAB-Níquel/DAB 83 2.4.1.2. Marcaje inmunohistoquímico múltiple (5x) a microscopía de campo claro para diferenciar células principales de interneuronas 83 2.4.2. Marcaje inmunohistoquím ico doble/triple para microscopía de fluorescencia 85 2.4.3. Controles de la técnica inmunohistoquím ica 87 2.5. Obtención de imágenes microscópicas 87 2.5.1. Imágenes para microscopía convencional de campo claro 87 2.5.2. Imágenes para microscopía de fluorescencia 88 2.5.3. Procesamiento de imágenes 88 2.6. Microscopía electrónica de transmisión (MET) 89 2.6.1. Fijación y conservación 89 2.6.2. Obtención de las secciones 89 2.6.3. Deshidratación e inclusión en plano 89 2. Tesis  Doctor al  Índice 2.6.4. Montaje y tallado de las secciones en bloq ues de resina 90 2.6.5. Ultramicrotomía 91 2.6.6. Protocolo general d e la técnica inmunohistoquímica para MET 91 2.6.7. Observación y obtención de las imágenes 93 2.7. Cuantificación mediante estereología 93 2.7.1. Fraccionador óptico 94 2.7.2. Densidad numérica 96 2.7.3. Nucleador: tamaño de placas 97 2.8. Cuantificación mediante análisis de imagen 99 2.8.1. Estudio de la carga amiloide: plaque loading 99 2.8.2. Estudio del área ocupada por distro fias 100 2.8.3. Análisis de la compactación de las placas de  -amiloide 101 2.8.4. Estudio del halo oligom érico de las placas de Abeta 102 2.8.5. Estudio de la m orfología microglial en los animales APP y APP/IL4 -/- 102 2.9. Estudios bioquímicos 104 2.9.1. Disección del hipocampo y la corteza 104 2.9.2. Aislamiento de ARN y proteínas a partir de los núcleos del cerebro 104 2.9.2.1. Aislamiento de ARN 105 2.9.2.2. Aislamiento de proteínas totales 106 2.9.3. Retrotranscripción 106 2.9.4. RT-PCR en tiempo real 107 2.9.5. Western-Blot (WB) 111 2.9.6. ELISA (Del inglés Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay ) 112 2.10. Estudios de comportamiento 113 2.10.1. Estudios de comportam iento para el tratamiento de litio 114 2.10.1.1. Pru eba “Open field” 114 2.10.1.2. Pru eba de rec onocimiento de objetos 114 2.10.2. Estudios de comportam iento en animales PS1/APP y PS1 a los 12 meses de edad 115 2.11. Análisis estadístico de datos 116 2.12. Apéndice 117 2.12.1. Genotipado 117 2.12.2. Tampones para inm unohistoquímica 119 2.12.3. Soluci ón fijadora 119 2.12.4. Soluci ón crioprotectora 120 2.12.5. Portaobjetos gelatinizados 120 2.12.6. Soluci ón de revelado 120 2.12.7. Proto colo de deshidratación y montaje 121 2.12.8. Medio de montaje para inm unohistoquímica fluorescente 121 2.12.9. Preparación de m icroscopía electrónica de transmisión (MET) 121 2.12.10. Tinciones 122 2.12.11. Gel de agarosa para electroforesis 123 Tesis  Doctor al  Índice  de  figura s  visual primaria (V1) de animales PS1/APP a los 12 meses de edad 190 Figura 3.2.23. Déficits de comportamiento en animales transgénicos PS1/APP y PS1 de 12 meses de edad 192 Figura 3.2.24. Proceso degenerativo en la EA familiar con mutaciones en PS1 198 3.3. In vivo m odification of Abeta plaque toxicity as a novel n europrotective lithium-mediated therapy for Al zheimer’s disease pathology Figure 3.3.1. Lithium treatment im proved the behavioral/memory deficiencies of PS1/APP mice 218 Figure 3.3.2. Lithium treatment im proved the behavioral/memory deficiencies of PS1/APP mice 219 Figure 3.3.3. Lithi um treatment avoided neuronal loss in the hippocam pus of PS1/APP mice 221 Figure 3.3.4. Lithium treatmente reduced dystrophic pahtology in the hippocampous of PS1/APP m ice 222 Figure 3.3.5. Lithium treatment reduced the dystrophic pathology associated to Abeta plaques 224 Figure 3.3.6. Lithium treatment reduced the dystrophic pathology associated to Abeta plaques 225 Figure 3.3.7. Lithium treatment reduced the si ze of the extracellular Abeta plaques 227 Figure 3.3.8. Lithium treatment increased the compaction of the extracell ular Abeta plaques 228 Figure 3.3.9. Lithium treatm ent reduced the oligomeric halo of the extracellular Abeta plaques 229 Figure 3.3.10. Lithium treatment decreased the Abeta toxicity 230 Figure 3.3.11. Lithium increased the astrocyte activation 232 Figure 3.3.12. Lithium increased the astrocyte activation and the Hsps levels 233 Figura suplementaria 1. El tratamiento con litio evita la pé rdida neuronal colinérgica en el NBM de ratones PS1/APP 238 Figura suplementaria 2. El tratamiento con litio prom ueve la protección de los plexos axonales colinérgicos y disminuye la form ación de distrofias en el hipocampo de anim ales PS1/APP 239 Figura suplementaria 3. El tratam iento con litio evita la pérdida hipocampal de ChAT en el modelo transgénico PS1 241 3.4. Evaluación preclínica en un mo delo transgénico de Alzheimer del potencial terapéutico de una nueva estatina Figura 3.4.1. Representación esquemática de las principales etapas implicadas en la biosíntesis del colesterol 246 Figura 3.4.2. El tratam iento con el compuesto NST0037 reduce significativamente la carga amiloide 249 Tesis  Doctor al  Índice  de  figura s  Figura 3.4.3. El com puesto NST0037 reduce significativamente la carga amiloide fibrilar del hipocampo 250 Figura 3.4.4. Estudio del efecto de NST0037 sobre la cantidad y tamaño de las placas fibrilares en CA1 252 Figura 3.4.5. El tratam iento con el compuesto NST0037 reduc e notablemente la carga de A  42 253 Figura 3.4.6. El tratam iento con el compuesto NST0037 reduce la carga de A  42 en el hipocampo del modelo PS1/APP 254 Figura 3.4.7. El tratam iento con NST0037 reduce la carga amiloide en el subículo del modelo PS1/APP 255 Figura 3.4.8. El tratam iento con NST0037 produ ce una disminución de los depósitos de Abeta oligomérico 257 Figura 3.4.9. El tratam iento con la estatina NST0037 reduce la patología axonal asociada a placas 259 Figura 3.4.10. El tratam iento con NST0037 reduce significativamente la cantidad de distrofias axonales 260 Figura 3.4.11. Correlación positiva entre la carga de Abeta y las distrofias APP 261 Figura 3.4.12. El tratamiento con NST0037 disminuye la acumulación del marcador de autofagia LC3b en las distrofias axonales asociadas a placas 264 Figura 3.4.13. El tratamiento con NST0037 protege de la pérdida de interneuronas SOM-positivas en el hi pocampo de ratones transgénicos 266 Figura 3.4.14. Estudio cuantitativo del efecto de NST0037 sobre la población de interneuronas SOM-positivas en el hipocampo de ratones transgénicos 267 Figura 3.4.15. El tratamiento con N ST0037 disminuye la p atología axonal colinérgica en el hipocampo 269 Figura 3.4.16. Estudio cuantitativo de la patologí a axonal colinér gica en la región de CA1 270 Figura 3.4.17. Estudi o cuantitativo de la patología axonal colinérgica en el subículo 271 Figura 3.4.18. El tratam iento con NST0037 no pr otege a la población colinérgica del núcleo basal de Meynert 272 Figura 3.4 .19. El tratamiento disminuye el procesamiento de APP a través de la vía amiloidogénica 275 Figura 3.4.20. El tratamiento no afecta a los niveles de  -secretasa 275 Figura 3.4.21. La estatina disminuye la actividad  -secretasa 276 Figura 3.4.22. El tratam iento redujo los niveles de expresión de APOE 278 Figura 3.4.23. El tratam iento redujo la pérdida de expresión NPY 281 3.5. Efecto de la deleción de IL-4 sobre la progresión de la patologí a en un modelo modelo transgénico de Alzheimer 291 Figura 3.5.1. Aumento de la patología a miloide en el hipocampo de los animales APP/IL4 -/- 296 Tesis  Doctor al  Índice  de  figura s  Figura 3.5.2. Patología amiloide en la región de CA1 y el giro dentado de los animales APP y APP/IL4 -/- 297 Figura 3.5.3. La deficiencia de IL-4 induce un aumento significativo de la car ga amiloide 298 Figura 3.5.4. Estudio comparativo del tamaño y la densidad de las placas amiloides durante la progresión de la patología en CA1 300 Figura 3.5.5. Increm ento en los niveles de A  en los animales APP/IL4 -/- 301 Figura 3.5.6. Aum ento de la activación microglial en el hipocampo en los animales APP-APP/IL4 -/- 303 Figura 3.5.7. Activación microglial en los animales APP-APP/IL4 -/- 304 Figura 3.5.8. La m icroglía activada muestra un aspe cto menos ramificado en los animales APP/IL4 -/- 305 Figura 3.5.9. Activación microglial en el subículo de los animales APP-APP/IL4 -/- 307 Figura 3.5.10. Increm ento en los niveles de expresión (ARNm) para los marcadores microgliales Ib a1 y CD45 en los animales APP/IL4 -/- 308 Figura 3.5.11. La m icroglía muestra un fenotipo de activación clásico M1 en los animales APP/IL4 -/- 309 Figura 3.5.12. Activación astroglial en el hipocam po de los ani m ales APP- APP/IL4 -/- 310 Figura 3.5.13. Activación glial alrededor de las placas en el hipocampo 312 Figura 3.5.14. Activación glial y patología distrófic a alrededor de las placas en el hipocampo 313 Figura 3.5.15. Aum ento de la patología axonal en el hipocampo de los animales APP/IL4 -/- 315 Figura 3.5.16. Aum ento de distrofias axonales positivas para fosfo-Tau (AT8) en el hipocampo de animales APP/IL4 -/- 316 Figura 3.5.17. Patología distrófica asociada a pl acas de Abeta en los animales APP-APP/IL4 -/- 318 Figura 3.5.18. Niveles de oligómeros solubles de Ab eta en el hipocampo 319 Figura 3.5.19. La expresión del marcador m icroglial CD36 está reducida en los animales APP/IL4 -/- 321 Figura 3.5.20. La activación microglial conlle va efectos beneficiosos y perjudiciales a lo largo de la EA 326 Figura 3.5.21. Modelo de acción de las estrategias terapéuticas centradas en la polarización microglial 327  Tesis  Doctor al Índice  de  tabla s  INTRODUCCIÓN 1 Tabla 1.1. Resumen de los principales m odelos tr ansgénicos murinos para la EA 32 Tabla 1.2. Resultados obtenidos en ensayos en fase clínica 3 con drogas centradas en el A  36 MATERIAL Y MÉTO DOS 61 Tabla 2.1. R elación de marcadores estudiados mediante inmunohistoquím ica Tabla 2.2. Relación de anticuerpos primarios utilizados en los estudios inmunohistoquím icos Tabla 2.3. Relación de anticuerpos secundarios utilizados en los estudios inmunohistoquím icos de microscopía óptica de campo claro 80 81 83 Tabla 2.4. Relación de anticuerpos secundarios utilizados en los estudios inmunohistoquím icos de microscopía de fluorescencia 86 Tabla 2.5. C omplejos de estreptavidi na conjugada a fluorocrom o 87 Tabla 2.6. Relación de anticuerpos secundarios ac oplados a oro uti lizados en los estudios inmunohistoquímicos de MET 93 Tabla 2.7. Pasos para la purificación de ARN usando el sistema ABI Prism 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems) 105 Tabla 2.8. Reactivos utilizados para la prep aración de la mezcla de reacción 2X (Retromix) 107 Tabla 2.9. Ma rcadores analizados a nivel de ARNm mediante RT-PCR 107 Tabla 2.10. Relación de los reactivos empleados para la amplificación por PCR a tiempo real empleando SYBR-green I Tabla 2.11. Relación de los reactivos empleados para la amplificación por PCR a tiempo real empelando sondas Taqman 109 109 Tabla 2.12. Programa predeterm inado de amplific ación para PCR a tiempo real 110 Tabla 2.13. Secuencia de cebadores empleados en la PCR Tabla 2.14. Sondas Taqman para RT-PCR 110 110 Tabla 2.15. Relación de reactivos y volúmenes necesarios para obtener geles de poliacrilamida-SDS (14% de acrilam ida) en tampón Tricina 111 Tabla 2.16. Relación de reactivos y volúmenes necesarios para obtener geles de poliacrilamida-SDS (10% de acrilam ida) en tampón Glicina 111 Tabla 2.17. Marcadores detectados me diante Western-blot 112 RESULTADOS 129 3.1. Early neuronal loss and axonal/presy naptic damage is associated with accelerated amyloid-  accumulation in PS1/APP Alzheime r’s disease mice subiculum Table 3.1.1. Summary of the mayor neuropathological findings in the PS1M146/APPSweLondon transgenic model 148 2. 3. 1. Tesis  Doctor al  Índice  de  tabla s  3.2. Degeneración de neuronas colinérg icas del telencéfalo basal en modelos transgénicos de la enfermedad de Alzheimer Tabla 3.2.1. Resumen de los déficits colinérgicos descritos en diferentes modelos animales de la EA 159 Tabla 3.2.2. Funciones en las que está implicado el telencéfalo basal 203 3.3. In vivo modification of Abeta plaque toxicity as a novel ne uroprotective lithium-mediated therapy for Al zheimer’s disease pathology Tabla 3.3.1. Abeta accum ulation was not modified in the lithium treated PS1/APP mice 226 3.4. Evaluación preclínica en un modelo transgénico de Alzheimer d el potencial terapéutico de una nueva estatina Tabla 3.4.1. Datos de densidad num érica (células/mm 3 ) para la población de interneuronas somatostatina 265 DISCUSIÓN 335 Tabla 4.1. Ve ntajas y limitaciones del uso de m odelos animales transgénicos en la investigación de la enfermedad de Alzheimer 337 4. Intro ducció n 1. Tesis  Doctor al  Introducción  3  Las característica s clínicas y anatomopatológicas de la enfermedad de Alzheimer (EA) fueron descritas por primera vez en 1906 por el psiquiatra y neuropatólogo alemán Alois Alzheimer 1 . Sus hallazgos se basaron en el estudio de una paciente de 51 años, llamada Auguste Deter (Fig. 1.1), que presentaba un cuadro grave de delirios, pérdida de memoria, desorientación y trastornos de la conducta y el lenguaje, y que finalmente falleció en estado de total invalidez tras cuatro años y medio de evolución clínica. La EA se puede definir como un proc eso neurodegenerativo progre sivo e irreversible caracterizado por la pérdida progresiva de mem oria, de habilida des intelectu ales y de razonamiento, así como por desorientación espacio-temporal, cam bios de humor, alteraciones conductuales, afasia (dism inución progresiva de l a capacidad del lenguaje), apraxia (alteración de los gesto s e incapaci dad de realizar tar eas rutinarias) y agnosia (incapacidad de r econocim iento de personas o cosas) (Reiman y Caselli, 1999; Van Strien 1 El 3 de Noviembre de 1906 Alzheimer dio a conocer sus hallazgo s en el 37th Meeting of South-WestGerman Psychiatrists en Tübingen con una conferencia titulada ‘‘ Sobre un proceso patológico peculiar grave de la corteza cerebral‘‘ . Un año más tarde se publicaron en Alzheimer A. (1907). Über eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde. Allgemeine Zeits chrift fur Psychiatri e und Psychisch-gerichtliche Medizin ., 64 :146-148. Figura 1.1. Alois Alzheimer y su paciente . Auguste Deter (1850-1906) a la izquier da y el Dr. Alois Alzheimer (186 4-1915) a la der echa. 1.1. La enfermedad de Alzheimer Tesis  Doctor al  Introducción  4  y col., 2009). Estas alteraciones se deben a daños selectivos en regiones cerebrales implicadas en estos procesos, tales como el hipocam po, la corte za entorrinal, la am ígdala y el telencéfalo basal. El curso clínico de la EA suele durar 8-1 0 años, pudiendo llegar hasta los 25 (Gies y Lessick, 2009). La muerte del paciente suele atr ibuirse a enfermedades no relacionadas o indirectamente r elacionadas, pero un 20% de las mu ertes son directamente atribuibles a las demencias o a las complicaciones en la fase t erm inal (Reiman y Caselli, 1999) como la m alnutrición y la neumonía. En l a actualidad, el Alzheimer es la forma m ás común de demenci a (50-75%; Fig. 1.2) entre las personas mayores de 65 años 2 . La prevalencia de la enfermedad está por debajo del 1% en individuos menores de 65, pero muestra un incr em ento casi exponencial con la edad, y en personas de 85 a ños la incidencia es del 30% en el mundo occidental, ascenciendo al 63,9% en personas mayores de 90 años (Prince y c ol., 2013). El incremento de la población de edad avanzada, debido al aumento de la esper anza de vida, hace que esta patología se haya convertido en el tercer problem a de salu d más grave en los países desarrollados (detrás de los acciden tes cardiovasculares y el c áncer). Existen alrededor de 800.000 enfermos diagnosticados en España y 35 millones a nivel mundial. Se calcula que en el año 2050, 115 millones de personas en el mundo se encontr arán afectadas por la EA (Neugroschl y Sano, 2010; ver h ttp://www.alz.org/downloads/fact s_figures_2014.pdf). La ausencia de marcadores biológicos para la enferm edad de Alzh eim er hace que el análisis neuropatológico post mortem sea crucial para el diagnóstico definitivo de la enfermedad. El Alzheimer es, hoy, una enferm edad incurable, y a unque existen fármacos que mejoran los síntom as, ninguno es totalmente efectivo (ver A pdo. 1.3). 1.1.1. Tipos de Alzheimer. Factores de riesgo. Se diferencian dos formas de l a enf ermedad según la edad de i ni cio, su incidencia y las causas de aparición, aunque ambos tipos cursan con los mism os síntomas y lesiones histopatológicas (ver revisiones Gomez-Isla y col., 2008; Perl, 2010; Ballard y col., 2011; Bagyinszky y col., 2014): 2 Datos obtenidos del estudio World Alzhe imer Report 2014 (h ttp://www.alz.co.uk/research/world-report- 2014) Figura 1.2. Distribución de los tipos de demencia en una muestra poblacional . Fuente: Estudio Poblacional de Prevale ncia de Deme ncia. Tomado del informe “Estado del arte de la enferm edad de Alzheimer en España”, realizado por PW C (2013). Tesis  Doctor al  Introducción  5  I. Alzheimer esporádico: (95-98% de los casos). Aparece alrededor de los 60-65 años de edad. Es de origen multifactorial y el princ ipal factor d e riesgo es la edad (ver revisión B allard y col., 2011). II. Alzheim er familiar (FAD; del inglés Familial Alzheimer Disease ): (3- 5% d e lo s casos). También conocido como presenil o de inicio tem prano, se caracteriza por su aparición entre los 35 y 40 años de edad. Se debe a la trans misión autosóm i ca dominante, con un 100% de penetración, de mutaciones en los gen es que codifican para la Pro teína precursora amiloide (APP), la Presin ilina 1 (PS1) o la Presinilina 2 (PS2) (ver revisiones O’Brien y Wong, 2011; Karch y col., 2014; Calero y col., 2015): A. En el gen APP se describió la primera m utación relacionada con el Alzheimer, pero afecta a un bajo porcentaje de personas (10%). E s t e g e n s e localiza en el cromosoma 21 (Goate y col., 1991) y se han descr ito 32 mutaciones relacionadas con la e nferm edad de Alzheimer (para de talle ver www.molgen.ua.ac.be/ADmutations/). De hecho, su duplicación (co mo ocurre e n el Síndrom e de Down) causa Alzheimer a edades tempran as (ver revisión Thinakaran y Koo, 2008). B. El gen PS1 s e localiza en el crom osoma 14. Su mutación es la causa más común de las f ormas fam iliares de la EA (30-50% antes de los 55 años, 70% del Alzheim er familiar total; Sherrington y col., 1995), conoci éndose 185 mutaciones distintas, entre ellas la F176L que portaba Auguste Deter (Müller y col., 2013). C. El gen PS2 se localiza en el cromosoma 1 (Rogaev y c ol., 1995). Se han descrito alrededor de 14 mutacione s en este gen asociadas con e l Alzheimer (Czech y col., 2000). Además de mutaciones en estos genes, la EA se asocia con determ inados porlimorfismos genéticos (ver revisiones Karch y col., 2014; Calero y col., 2015): D. Apolipoproteína E (APOE). Se localiza en e l crom osoma 19. Existen tres isoformas de esta proteína, E2, E3 (la más com ún) y E4 3 (Strittm atter y col., 1993; Yu y col., 2014). Parece actuar como una chaperona del A  , capaz de estabilizar los depósitos fibrilares y evitar su elim inación ( B ales y col., 1999) y parece intervenir en el proceso neuroinflamatorio (Tai y col., 2015) y causar alteraciones sinápticas, entre otros efectos (Yu y col ., 2014). E. CLU . Este gen se localiza en el cromosoma 8 y codifica para parte de l a cadena  de la proteína clusterina (conocida como Apolipoproteína J). S u 3 La isoforma E4 de la APOE está considerada el mayor factor de riesgo del Alzheimer esporádico, tras la edad, incrementando su riesgo en tres veces en individuos qu e p orta n una copia del alelo y en 15 veces en indivi duos homocigotos. Hay pruebas de que la herenci a del alel o  2 puede conferir protección contra el desarrollo de la enferm edad de Alz heimer (Sel koe, 200 1). Tesis  Doctor al  Introducción  12  O’Brien y Wong, 2011). Adem ás, se ha sugerido que la producción d e A  podría ocurrir principalmente en las llam adas balsas lipídicas ( lipid rafts ) (ver revisión Selkoe, 2008). 1.1.3.4. El péptido  -amiloide (A  ) El péptido A  (4 kDa) se origina a partir de la región de APP localizada tan to e n el dominio extracelular como en el transmembrana, lo que le confie re propiedades agregativas. Normalmente, el A  acaba en Val 40 ( A  40 ) en el extrem o C-terminal, pero un pequeño porcentaje ( 10%) lo hace en Ala 42 ( A  42 ), aumentando así su h idrofobicidad, por lo que tiend e a agregarse y formar fibrillas. Las mutaciones de scritas en el Alzheimer familiar (Fig . 1.9) actúan aum entando la producción relativa de A  42 (Ashe y Zahs, 2010). Figura 1.9. Esquema de la secuencia peptídic a de APP, las mutaciones famili a r e s y s i t i o s d e procesamien to. La secuencia del A  está encuadrada en la caja de color amarillo. El rectángulo az ul delimi ta el dominio de membrana. Las flechas de arriba indican la zona d e corte de las secretasas. Las mutaciones puntuales que se han encontrado en casos de la EA familiar está n destacadas en color; la mayoría de ellas están alrededor del sitio de procesamiento de la  -secretasa y aumentan la producción de A  42, aunq ue la más famosa (APP SWE ) causa un cambio de aminoácido en la zona adyacente al punto d e corte de  -secretasa y actúa aumentando el procesamie nto por B ACE. Las mutacion es Flemish y Artic/Dutch actúan incrementando la agregación de A  . Recientem ente, Jonsson y col. (2012 ), han descr ito una m utaci ón en APP (A673T), cerca del sitio de corte d e  -secretasa, asociada con una reducción en el riesgo de paceder la enferm edad (Modifi cado de Evin y Weidem ann, 2002 ). La producción de A  no es únicam ente un proceso pato lógico, sino que se genera de forma normal y este péptido aparece t anto en el plasm a como en el líquido cefalorraquídeo de individuos s anos. De hecho su s niveles endógenos parecen seg uir el ritmo circadiano, siendo mayores durante la vigili a (Kang y col., 2009). Así, i nc luso durante el envejecimiento norm al, aunque de forma más a cusada en la EA, se originan péptidos A  insolubles que se depositan en el parénquima cerebral y en la p ared de los vasos sanguíneos cerebrales (Selkoe , 2004; Gomez-Isla y col., 2008). En cuanto al papel fisiológico del A  , hasta hace relativam ente poco tiempo apenas se disponía de información. Trabajos r ecientes sugieren que e st e péptido podría tener un papel crucial en el mantenimiento de la tasa basal y en la regu lación de la liberación de vesículas desde terminales pres i nápticos excitatorios (Abramov y col., 2009). Además, se le atribuye un papel como regulador negativo a niveles postsiná pticos c uando se encuentra V β-secret asa α-s ecre tasa γ- s e cr et asa NL 11 0 2 0 3 0 40 I 67 0/671 Swedish 717 Lo ndon NH 2 ---TEEISEV KM DA EFRHDS GYE V H HQKL VFF A E DVG S N K GA II GL M V G G VV IA T V I V IT L V M L KKK---CO OH C 692 Flemish Q 693 Artic/Ducth I 714 Austrian M 715 French 716 Florida P 723 Australian V β-secret asa α-s ecre tasa γ- secretasa NL 11 0 2 0 3 0 40 I 67 0/671 Swedish 717 Lo ndon NH 2 ---TEEISEV KM DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF A E DVG SNKGAII GLMVG GVVIA T V I V IT LVM L KKK---CO OH C 692 Flemish Q 693 Artic/Ducth I 714 Austrian M 715 French 716 Florida P 723 Australian Tesis  Doctor al  Introducción  13  a altas concentraciones (ver rev isión Palop y Mucke, 2010). De hecho, se ha descrito que concentraciones picomolares de Aβ mejoran la plasticidad sinápt ic a y la m emoria (Puzzo y col., 2008; Morley y col., 2010). Por otro lado, los monómeros de A  42 parecen ejercer un papel neuroprotector (Giuffrida y col., 2009). Todos estos dato s apuntan a la pérdida de función del Aβ com o otra causa de la patología de la EA. 1.1.3.4.1. Tipos de depósitos extracelulares de  -amiloide Las placas amiloides o seniles son agregados proteicos extracel ulares formados por el péptido A  y se dividen en (ver revisi ones Selkoe, 2001; Perl, 2010): - Placas neuríticas: depósitos extracelulares de aspecto filam entoso (Dickson, 1997). Asociadas a estas placas aparecen neuritas distróficas (inmunop ositivas para Tau, APP, Ubiquitina o ChAT) y células de la microglía, mientras que la astroglía se localiza en la periferia (Duyc kaerts y col., 2009; Fig. 1.10). Se subdividen en placas primitivas (esféricas y sin núcleo compacto, que aparecen en z onas cercanas a los axones y las sinapsis) y placas c lásicas ( nú cleo amiloide denso , redondo y compacto y un halo alrededor, que se asocian especialm ente a lo s vasos). - Placas difusas: son depósitos extracelulares no fibrilares ( no congofílicos). Son zonas difusas o amorfas sin núcleo compacto, con poca o ninguna microglía y no suelen poseer neuritas distróficas ni astroglía (Selkoe, 2001). Figura 1.10. Placas neuríti cas de un ratón transgénico de la EA . A) Triple inmunohistoq uím ica para GFAP (astroglía), Iba1 (microglía) y 4G8 (placas de A  ) , donde se observa la disposici ón de la micro - y astroglía alrededor de las placas, la prim era en contacto íntim o y la segunda en la perife ria. B) Triple inmunohi stoquím ica para A  42 (amiloide), APP (marcador de di strof ias) y VGlu t 1 ( transport ador vesicul ar de glutamato). Alrededor de las placas amiloides neuríticas apa rece n neuritas distróficas (en este caso positivas para APP y VGlut1). C) Triple inmunohistoquímica para GFAP (astrogl ía), Syn (Si naptofis ina) y 4G8 (placa), que muestra la relación entre las placas (azul), n euritas distróficas (rojo) y la astro glía (verd e). (Imágenes ori ginales del grupo). En las placas seniles además de A  , se acumulan otras moléculas como APOE, APOJ,  2-macroglobulina, IL-1  , IL-6, com ponentes del sistema del com plemento, zinc, cobre, hierro, componentes de la matriz extracelular ( como ICAM 1, trombospondina, heparán sulfato), catepsina D, e tc. (ver revisión Thal y col., 2006; Duyckaerts y col., 2009). Tesis  Doctor al  Introducción  14  1.1.3.4.2. Formas oligoméricas del  -amiloide Hasta hace una década, la EA se caracterizaba por la formación de fibras insolubles de A  que se depositaban extracelularmente, form ando las placas seni les, motivo por el cual se generó la hipótesis de la cascada amiloide (ver Apdo. 1 .1.7.1). Sin embargo, hoy en día se piensa que estas placas no son el principal agente cau sa l de los problemas sinápticos o la pérdida neuronal, ya que no siempre el número de placas am iloides correlaciona con la severidad de la patología (Muc ke y col., 2000). Se ha descrito la existencia de form as tóxicas solubles 6 d e A  oligom érico capaces de generar estos daños, al difundir por el parénquima cerebral provocando pérdida sináptica y fallos cogni tivos en las fases tempranas de la EA (Haass y Selkoe, 2007; Benilova y col., 2012; Viola y Klein, 2015). En cuanto al proceso de oligom erización-fibrilización, existen distintos estudios que sugieren que las proteínas amiloides se agregan formando distin tos interm ediarios (ver revisión Sakono y Zako, 2010) de entre 8 (dímeros) y 100 kDa (S hankar y col., 2008). Brevemente, en primer lugar, la asociación de pequeños n-oligóm eros solubles ( LMW -A  , del inglés L ow Molecular Weight ), resultaría en ensamblajes de peso molecular más alto, incluyéndose en este grupo a las estructuras anulares, paranúcl eos, ligandos difusibles derivados del A  (ADDLs, del inglés A  -derived difusible ligands , cuyos niveles correlacionan bien con los fallos cognitivos y pueden inhibir l a L T P e n e l h i p o c a m p o ) (Lambert y col., 1998; Haass y Selkoe, 2007), A  *56 (Lesné y col., 2006), am iloesferoides (Noguchi y col., 2009), y las protofibrillas (PFs; Walsh y col. , 1997). Éstas excederían los límites de solubilidad y se deposita rían como fibrillas amiloid es en conformación de hoja  plegada (ver revisión Goldsbury y col., 2005). Los mecanismos p or los cuales se producen estos ensamblajes no están claramente definidos. 1.1.3.4.3. Acumulación intracelular de  -amiloide En principio , el A  fue identificado formando parte de l as placas extracelulares y f u e en los años 80 cuando se identificó su existencia en el interio r celular (A  i). El A  i está presente, frecuentemente, en neuronas que contienen ovillos neu rofibrilares, por lo que ambas patologías podrían estar l igadas (Blurton-Jone s y LaFerl a , 2006). La acumulación de A  i puede ser un acontecimiento temprano en la EA (Bayer y Wirths , 2010), ya que aparece en las células piramidales del hipocampo y la corteza e ntorrinal (regiones con afecciones patológicas m ás evident es) de pacientes con defectos cognitivos leves y los niveles parecen descender con la formación de l as placas. Esta acum ulación intracelular se da, incluso, en individuos sanos (ver revisión LaFerla y col., 2007). El A  puede acumularse de form a intracelular por dos motivos. El pri mero, que una vez sintetizado no sea secreta do (la proteína APP puede estar e n el Golgi, RE, etc., por lo 6 El término “soluble” hace referencia a cualquier forma de A  que es soluble en un tampón acuoso y que permanece en soluci ón después de centri fugar a alta velocidad. Tesis  Doctor al  Introducción  15  que el A  podría gen erarse en estos compartim entos y quedarse en el inte rior celular). El o tr o se rí a q u e, tr as se r s e c re ta d o a l e x te ri o r, el A  s ea reinternalizado a través de diferentes transportadores específicos, como l a subunidad  7 del receptor nicotínico (  7nAChR; Wang y col., 2000), el receptor LDLR de APOE (Zerbinatti y col. , 2006) o l os r eceptores NMDA (Bi y col., 2002). Los endosomas son un sitio probable de generación de A  , ya que la enzima BACE-1 necesita un pH ácido para su actividad ópt im a, por l o que la proteína APP podría ser interna lizada por endocitosis desde el exterior, y sufrir proteólis is en el interior endosom al; de hecho, el bloqueo de la internaliz ación de APP hace que se reduzcan los niveles de A  (ver revisión LaFerla y col., 2007). El A  i se acumula predominantemente en l os cuerpos multivesic ulares d e las neuronas, donde se asocia con la patología sináptica (Takahashi y c ol., 2002). Estos cuerpos se pueden fusionar con la membrana plasmática liberando e l A  al espacio extracelular como exosom as cuyo papel es d esconocido pero que p odrían funcionar como semillas de nucleación para la formación de las placas o como m edio de propagación del amiloide a través del cerebro (Rajendran y Annaert, 2012). El A  i puede afectar a la función mitocondrial y del proteasoma, provocar una disfunción sináptica y facilitar la hiperfosforilación de Tau ( LaFerla y col., 2007), provocar un d éficit en la LTP (Billings y col., 2005) y l a muerte neuronal (Li y col., 2009b; ver revisión Bayer y Wirths, 2010) (Fig. 1.11) 7 . 7 E n m o d e l o s d e l a EA , e l A  i se observó por primera vez en ratones PS1 que mostraba n neuro degene ración sin formación de placas. Posterio rmente, se h a dem ostrado ac umu lación intracelular e n otros model os, en algunos de los cuales se ha co rrleaci onado con la pérdida neuro nal: PS1 M146L APP SDL , APP SL PS1 M156L , Tg2576, 3xTg-A D, 5xFAD, APP Arc , etc. (ver revisión Bayer y Wirths, 2 010). Figura 1 .11. Efect os patológic os del A  intraneuronal. E l A  , producido intracelularmente o tom ado desde fuentes extracelulares, tiene v arios efectos patológicos e n la función de la célula y sus orgánulos. E l A  i puede presentarse en form a monom érica que s e p u e d e a g r e g a r e n o l i g ó m e r o s y é s t o s puede n mediar l os eventos patol ógicos observados in vivo . El A  i puede contrib uir a la patología de la EA al facilitar la hiperfosfor ilación de Tau, alterar la f unción mitocondrial y del proteasoma, la homeostasis del calcio y provoca r la disfunci ón sinápt ica. ROS: especies reactivas de oxígeno (Modificado de LaFerla y col., 2007). Tesis  Doctor al  Introducción  16  1.1.3.4.4. Degradación del  -amilo ide La acumulación de A  tiene lugar por un desbalance entre su producción y eliminación (ver revisiones Evin y Weidem ann, 2002; Thal y col. , 2006; Duyckaerts y col., 2009). El incremento en la secreción de A  ocurre en pacien tes con EA familiar con mutaciones en l os genes APP , PS1 o PS2 . Los casos de Alzheimer esporádico, sin embargo, no muestran signos de un incremento en su producción, y se ha sugerido que una disminución de su degradación y una reducción en el drenaje per ivascular pueden explicar el incremento en la cantidad de A  de estos pacientes (Miners y col., 2014). Para la degradación del A  existen distintos tipos de proteasas que degradan las distintas formas del péptido (De Strooper, 2010). La neprelisina e s u n a z i n c - metaloproteasa capaz de hidrolizar péptidos circulantes, que se e n c u e n t r a a n c l a d a a l a membrana plasmática y es capaz de eliminar el A  insoluble asociado a ésta. Los niveles de neprelisina disminuyen con el envejecimiento (Farris y col., 2007), provocando un aumento de A  . La enzima degradadora de insulina ( IDE ) es una tiol metaloproteas a que reconoce sustratos con estructura en hoja  -plegada. Aparece como una proteína soluble citosólica, aunque también puede e ncontrarse asociada a membran a. Es capaz de degradar el A  e n su estado m onomérico, pero no cuando éste se agrega y forma fibrillas insolubles. También participan en la degradación del A  l a s enzimas convertidoras de endotelina (ECE1 y ECE2) y las metaloproteasas de matriz (MMPs; Yan y col., 2006). El A  puede ser degrad ado, además, intracelularmente vía autofagia (Nixon, 2007; Mizushima y Komatsu, 2011; Nixon y Yang, 2011; Friedman y col., 2015) o vía lisosomal . Así, se ha descrito que la enzima lisosomal catepsina B degra da A  (Muelle r- Steiner y col., 2006). Por último, se ha implicado a las células gliales en la eliminación de A  del parénquima mediante fagoc itosis (Lee y Landreth, 2010) y l a secreción de enzimas proteolíticas como neprelisina e IDE. Por este motivo se están encaminando esfuerzos hacia la generación de terapias de inmunización que potencien e l proceso fagocítico (Sokolowski y Mandell, 2011). 1.1.4. Ovillos neurofibrilares intracelulares y la proteína Tau La proteína Tau es un péptido cuya función es estabilizar los microtúbulos ( MTs) del citoesqueleto y favorecer su polim erización (ver revisión Schol z y Mandelkow, 2014), por lo que es crítica para la supe rvivencia celular, ayudando a man tener la estructura interna de la célula. Esta proteína se encuentra codificada por el gen MAPT (cromosoma 17) (Neve y col., 1986). En el cerebro a dulto hum ano se producen 6 isoforma s m ediante procesamiento alternativo 8 (ver revisiones Duyckaer ts y col., 2009; Wang y col., 2013). 8 Las isoform as que se generan se diferencian por las 3 (3R-Tau) o 4 (4R-Tau ) repeti ciones del mot ivo de unión a tubuli na en el extremo C-terminal, siendo la isoforma 4 R-Tau la de m ayor afinidad por los microt úbulos. Tesis  Doctor al  Introducción  17  Cuando se produce una hiperfosforilación anómala de Tau (Fig. 1 .12), los MTs se desorganizan y la proteína Tau, al ser insoluble, tiende a agre garse form ando filam entos apareados helicoidales (PHF), pasando de la zona axonal a la som atodendrítica, donde estos filamentos se unen formando los ovillos neurofibrilares i ntra celulares (NFTs) 9 , característicos de la EA (Morishi ma-Kawashima e Ihara, 2002). A l despolimerizars e los MTs se originan fallos en el transporte axonal y en todos los p rocesos que dependen de él. Además, una extensa fosforilación de Tau inhibe la actividad de l proteasoma (Gendron y Petrucelli, 2009; Wang y col., 2013). La acum ulación de Tau se presenta de tres formas: en el cuerpo celular de las neurona s como NFTs, en las dendritas c omo neuropil threads , y en los axones formando la corona neurítica de las placas seniles. La hiperfosforilación de Tau se da en las neuronas con degene ración neurofibrilar y en las n euritas distróficas alrededor de los depósitos amiloides, dando lu gar a placas neuríticas (Du yckaerts y col., 2009). Figura 1.12. Formació n de ovillos neurofibrilares. Tau es una proteín a estabilizadora de microtúbulos que al ser fosforilada, provoca una desestabilización de éstos. La proteína Tau hip erfosforilada s e ag rega form ando pares de fila ment os helic oidal es que, final ment e, orig in an l os NFT s, im plica dos en la dege ner aci ón n e u r o n a l . E n e l r e c u a d r o d e l a i z q uierda se m uestra la estructu ra de la proteína Tau con 4 repeticiones d el motivo de uni ón a tubul ina (4 R-Tau). (Mo dificado de Quer furth y LaFerla, 2010). El estado de fosforilación de una prote ína dep ende de la activi dad de las enzimas quinasas y fosfatasas que actúan sobre ella. Se conocen más de 20 quinasas diferentes implicadas en la fosforilación de Tau, de las cuales las más co nocidas son la proteína quinasa dependiente de ciclina (CDK-5) y la quinasa glucógeno s i n t a s a 3 ( G S K - 3 ) (Kimura y col., 2014) y las proteínas fosfatasas PP-1 y PP-2A. Estas enzimas se han considerado como dianas terapéut icas para atenuar la hiperfosfo rilación de Tau (ver Adpo. 1.3.2). La existencia de grandes cantidades de A  o estrés oxidativo en l as células, puede 9 Debido a la presencia de NFTs intracelulares, formados por la prot eína Tau hiperfosf orilada, la EA es una taupatía (Lee y col., 2001), término que agrupa a distintas enf ermedades con depósito anormal de T au hiperf osforilad a en neuronas y célul as gliales. Existen unas 40 m utaciones de Tau ligada s a la demencia frontot emporal, m ientras que ningu na ha sido descrita e n fam ili as con EA. Tesis  Doctor al  Introducción  18  provocar una desregulación en la actividad de las quinasas de T au, provocando su hiperfosforilación y la generación de NFTs. Además, se ha propu esto que el m etabolismo de APP regula la proteostasis de Tau (Moore y col., 2015). Asim ismo, Tau puede sufrir otras m odificaciones postraduccionales, com o glicosilación, ace tilación, ubiquitinación, etc., que afectan a su agregaci ón (Iqbal y Grundke-Iqbal, 2008; Wang y col., 2013). Datos recientes han sugerido que las formas solubles de A  y Tau pueden jugar un papel más im portante que las placas y ovillos en el daño sinápt ico y la demencia (McDonald y col., 2012). De hecho, aunque se había propuesto qu e el número total de ovillos predice la pérdid a neuronal en la EA, ésta últim a super a a la formación de ovillos (Gomez-Isla y col., 1997) y est udios recientes indican que es l a acumulación anormal de especies solubles de Tau en la sinapsis la que pueda estar más relacionada directamente con la muerte neuronal (Perez-Ni evas y col., 2013; Spires-Jones y Hym an, 2014). 1.1.5. Pérdida neuronal y sináptica La EA es u na enfermedad caracterizada por una extensa y selecti va de gener ación neuronal que afecta a regiones y tipos celulares concretos (Duy ckaerts y col., 2009), como el área CA1 del hipocampo y la capa II de la corteza entorrinal (CE) (Gomez-Isla y col., 1996; Kordower y col., 2001; Price y col., 2001), el bulbo olfa torio y el núcleo olfatorio anterior (Ter Laak y col., 1994), la amígdala (Vereecken y col. , 1994), el núcleo basal de Meynert (Vogels y col., 1990), la parte medial de la sustancia negra, la parte rostral del locus coeruleus (Busch y col., 1997) y el núcleo del rafe (Aletrino y col., 19 92). Los tipos c elulares afectados por la patología incluyen el sist ema colinérgico de lo s ganglios basales. En personas de edad avanzada y en pacientes c on demencia existen disfunciones colinérgicas importa ntes en el sistema nervioso ce ntral (SNC), relacionadas con la pérdida de memoria (Bartus y col., 1982). El sistema GAB Aérgico y glutamatérgico también se encuentran afectados. En los casos preclínicos de EA , en l os que no existe demencia aunque ya aparecen las p rimeras placas y NFTs, las neu ronas colinérgicas del telencéfalo basal (W hitehouse y col., 1981) y las noradrenérgic as del locus coeruleus (German y col., 1992) son las más afectadas, mientras que la r egión CA1 del hipocampo y la CE no muestran una d isminución neuronal (Giannakopoulos y co l., 1998). Sin embargo, en las fases tardías de la enfermedad, se produce una pérdida m asiva de neuronas hipocampales y corticales ( Pri ce y col., 2001). El declive cogn itivo se correlaciona estrechamente con la pérdida neuronal. Las causas y los m ecanis mos de muerte neuronal se desconocen, aunque poseen un papel importante la generación de especies reactivas de oxígeno, la sobreactivación de receptores de aminoácidos excitadores como el glutamato y el incremento en la concentrac ión citoplasm ática de calcio. Los modelos animales transgénicos de la EA recapitulan algunas d e l a s l e s i o n e s histopatológicas observadas en l os pacientes, pero no todas (ve r Apdo. 1.2). Es de destacar, que la mayoría de estos modelos presentan escasa muerte neurona l, siendo esta Tesis  Doctor al  Introducción  19  característica su principal lim itación. No obstante, se ha desc rito pérdid a neuronal selectiva en el hipocampo (Casas y col., 2004; Schmitz y col., 2004; Ramos y col., 2006; Jimenez y col. 2008), la neocorteza (Chris tensen y col., 2008), la cortez a entorrinal (Lazarov y col., 2006; Moreno-Gonzalez y col., 2009 ) y otras regiones cerebrales (Ribe y c ol., 2005; Lee y col., 2006; Devi y Ohno, 2010; Perez y col., 2011). La EA también se caracteriza por una pérdida muy acusada de las conexiones sinápticas, lo que gener a los fallos en las funciones cognitiva s y la memoria característicos. Numerosos estudios histológicos y bioquímicos realizados en mue stras post mortem d e pacientes han demostrado una disminución en las sinapsis y en s us proteínas asociadas, en la corteza y el hipocampo (Terr y col., 1991; Scheff y Price, 20 03; Scheff y col., 2007). Por ejemplo, se ha determinado un 30% de pérdida en la densidad sin áptica (Davies y col., 1987) y la disminución de inmunorreactividad para sinaptofisina en hipocampo y corteza de personas que presentaban det erioro cognitivo leve o EA leve (Overk y Masliah, 2014). Estos datos indican que anterior a la m uerte neuronal, existen fallos/alteraciones a nivel sináptico, y son éstas las que m ejor correlacionan con las defi ciencias cognitivas en los pacientes (Tampellini y Gouras, 2010). La acumulación de A  está asociada con la pérdida de la función sináptica y espinas dendríticas y con la formació n de neuritas distróficas, actuando sobre los procesos de m emoria y aprendizaje (Sm all, 20 08). L auren y col., (2009) han revelado una base molecular p ara l a función antisináptica d el A  , al ident ificar un receptor específico para el A  42 oligom érico que m edia la supresión de la LTP, increm enta la depresión a largo plazo (LTD) y reduce la densidad de espina s dendríticas. 1.1.6. Neuroinflamación La reacción inflamatoria que caracteriza a la mayoría de las enfer m edades neurodegenerativas im plica la activación de componentes de la r espuesta inmune innata (microglía y astroglía; Heneka y col., 2015a). La respuesta inm une adaptativa y la infiltración de linfocitos T se da en menor grado en la EA. Mie ntras que la respuesta inflamatoria es necesaria y crucial si el agente desencadenante es un patógeno o una célula dañada, la respuesta inflam atoria aberrante o crónica causa gra ves daños tisulares. Así, el proceso neuroinflamatorio puede sobreactivarse, lo que resulta en un daño celular y la pérdida de la función neuronal en la EA ( Heneka y O’Banion, 200 7; Perry y col., 2010; Heneka y col., 2015b; Heppner y col., 2015), al igual que en ot ras enfermedades neurodegenerativas, como el Park inson (Mena y García de Yebenes , 2008). El proceso inflamatorio se produce tras el depósito extracelula r del A  y s e caracteriza por una activación de la microglía y la aparició n d e astrocitos r eactivos, que pueden generar productos tóxicos que provoquen la muerte neuron al, tales como citoquinas inflamatorias, aminoácidos excitadores y ROS (Mrak y Griffin, 2005). Debido a que es el A  el qu e inicia el proceso inflam atorio, son las zonas en las qu e más A  se deposita, Tesis  Doctor al  Introducción  20  como el hipocampo, el subículo y l a corteza ento rrinal, las q ue muestran mayor activación microglial. Ade m ás, este proceso se ha asociado con la form ació n de placas de A  y ovillos neurofibrilares, ya que un ambiente inflamatorio puede activar las quinasas de Tau (ver revisión McNaull y col., 2010). Aún se desconoce si la neu roinflamación es una consecuencia secundaria al proceso de neurodegeneración en la EA o es una de las causas que provocan su aparición y desa rrollo (Wyss-Coray, 2006; G lass y col., 2010). 1.1.6.1. Microglía El SNC es un órgano inmunológicamente privilegiado, ya que tien e un sistema inmune endógeno liderado por células inmunocompetentes propias: la microglía. Ésta se presenta en el cerebro como un agente pro tector con diferentes funciones: p roliferación, motilidad y migración, comunicación intercelular, fagocitosis y proteostasis. El efecto del envejecimiento sobre la microglía no conlleva necesariamente la pérdida de estas funciones, sino que implica una disfunción de las m ismas y una respu esta hipe rreactiva (Gomez-Nicola y Perry, 2015). De hecho, se ha observado que la microglía muestra cambios morfológicos y moleculares con el envejecim iento y prog resión de la EA, una mayor capacidad proliferativa y la presencia de microglía “dist rófica”, caracterizada por la fragmentación, pérdida de prolonga ciones, etc. (Baron y col., 2 014; Mosher y Wyss-Coray, 2014; Streit y col., 2014), algo que también se ha observado en m odelos de la EA. La implicación de m icroglía en la EA se encuentra apoyada por estu dios que muestran que variantes genéticas en moléculas relacionadas con la m icroglía, c o m o TREM2 (Guerreiro y col., 2013), están asociadas con un incremento en el riesgo de Alzheim er esporádico. Clásicamente, la microglía se diferencia en microglía e n reposo (resi dente o quiescente), y en m icroglía reactiva o activada, con caracterís ticas funcionales sim ilares a los macrófagos sanguíneos. La mic roglía, al igual que l os macró fagos periféricos, se activa dando lugar a diversos fenotipos funcionales, que pueden tener propiedades neurotóxicas o neuroprotectoras según la señal d e activación que reciban (ver revisión Varnum e Ikezu, 2012; Cherry y col., 2014; Latta y col., 2014; Tang y Le, 2015; Fig. 1.13): - Activación clásica: Los macrófagos activados clásicamente o M1 son inducidos por IFN-  , TNF-  y / o l i g a n d o d e r e c e p t o r e s T L R ( toll like receptor ), como pueden ser los lipopolisacáridos ( LP S; endotoxinas de la membrana externa de bacterias Gram negativas). Muestran un fenotipo Th1 (proinflamatorio) y produc en IFN-  , IL-2, IL-1  , IL-6, IL-12, IL-18, TNF-  , ROS y óxido nítrico (NO). Poseen una mayor expresión de MHCII y CD86 e interv ienen en la presentación anti génica asociada a las células Th1. Los macrófagos M 1 tienen una gran actividad an tim icrobiana y constituyen un importante mecanismo de defensa. La activación c lásica tam bién causa la liberación de enzimas proteolíticas que puedan conduci r al det erior de l a matriz extracelular, degrada ndo la integridad celular. Tesis  Doctor al  Introducción  21  Figura 1.13. Clasifi cación de la activación microgl ial. Se muestran los distintos estadios de activación microgli al, así como la función de cada uno de ellos. Los macró fagos M2 son m ás hete rogéneos que los M1 y se subdivi den en M2a, M2b y M2c. El tipo M2a es act ivado por IL-4/Il-13 y conduce a una respu esta inmune Th2 clásica. Se encargan de la resolución d e la inflamac ión y la f agocito sis. Los M2b son activados por com plejos inm untes (IgG-ant ígeno) y por TLR/IL-1R , y repres entan un estadio intermedio entre el M1 y el M2a. Estos macrófagos eliminan especies reactivas de oxígeno y nitrógeno liberadas durante la activación M1. Por último, los M2c se activan por IL-10 y tienen una funci ón inmunosupres ora, siendo importa ntes en la rem odelación tisular (Modi ficado de Latt a y col., 2014). - Activación alternativa: Los macr ófagos activados alternativamen te (M2) muestran un fenotipo Th2 (antiinflam atorio) y están involucrados en la r esolución de la inflamación y reparación del tejido, inhibiendo la producción d e IFN-  . Los macrófagos M2 producen IL-4, IL-5, IL-10 y TGF-  y se diferencian de los M1 por la p resencia de marcadores d e su perficie como el receptor de m a nosa (CD206) y Arginasa-1. Otros marcadores com o Ym 1/Ym2, AMCase y FIZZ1, son tam bién característicos del estadio M2 pe ro son expresados también por otras células. Los macrófagos M2 se dividen en M2a (caracterizados por la presenci a del receptor IL- 1Ra y de Arginasa), M2b (cuyo marcador específico es CD86) y M2 c (que parece tener actividad reguladora y antiinflam antoria). Todavía no se conoce el papel de la microglía en la EA. Por un lado, el A  puede atraer y activar la microglía ( Malm y col., 2005; Meyer-Luehman n y col., 2008), provocando que las placas se encuentren envueltas por sus prolo ngaciones, constituyendo así la m icroglía una barrera físic a frente a la toxicidad de la placa al evitar su expansión. De hecho, las áreas de las placas no cubiertas por la microglía son menos com pactas y están asociadas con una distro fia axonal más severa (Condello y col., 2 015). Además de esta barrera celular físi ca, la fagocitosis activa de A  oligomérico por la microglía Tesis  Doctor al  Introducción  28  misma y que se utilizan en ensayos preclínicos (Epis y col., 20 10). Cuando la demencia se diagnostica, los pacientes ya muestran cambios histopatológicos severos, por lo que los modelos son de gran utilidad pa ra la búsqueda de biomarcadores de las fases iniciales de la enfermedad. 1.2.1. Modelos transgénicos monogénicos basados en APP La identificación de mutaciones en APP asociadas al FAD permitió la generación de modelos transgénicos que sobreexpresan la forma mutada y no mut ada de esta proteína 11 . El primer ratón trasngénico APP que mostraba una patología amil oide fue desarrollado por el grupo de Games y col. (1995). Este modelo, PDAPP 12 , sobreexpresa el APP V717F (mutación Indiana) bajo el control del prom otor del factor de c recim iento plaquetario (PDGF; del inglés p lateled-dervid growth factor ), y muestra déficits cognitivos a los 4 meses de edad (Chen y col., 2000) y las placas amiloides a los 6 meses (Games y col., 1995). Además, este modelo muestra neuritas distróficas, pérdid a sináptica, astroc itosis y microgliosis (Neha y col., 2014). No presenta ovillos ni pérdid a neuronal. En 1996, el grupo de Hsiao y col. generó la línea Tg2576 , que sobreexpresa la isoforma 695 del APP c on la doble mutación Swedis h ( K670N, M671L) bajo el control del promotor de la proteína priónica de hámster (PrP), m ostrando u n increm ento de 5 veces en la cantidad de A  40 y de 14 veces en la ratio A  42/40 y una gran cantidad de placas (9-11 meses) y neuritas distróficas (Woodhouse y col., 2009). Además, se produce una pérdida de inmunorreactividad para sinaptof isina en el hipocampo aunque sin pérdida neuronal (Irizarry col., 1997), activación microglial con producción de citoquinas (El Khoury y col., 2007) y déficits cognitivos a partir de los 5 meses. No present a ovillos neurofibrilares. El m odelo APP23 sobreexpresa la isoforma humana APP751 con la doble mutación Swedish bajo control del promotor Thy- 1 murino (Sturchler-Pierrat y co l., 1997). Presenta depósitos de A  a l o s 6 m e s e s y d é f i c i t s c o g n i t i v o s d e s d e l o s 3 m e s e s ( P r u t y c ol., 2007), activación glial (Borne mann y col., 2001), pérdida sináptica, h iperfosforilación de Tau (aunque no aparecen ovillos) y neuritas distróficas (Sturch ler- Pierrat y Staufenbiel, 2000). La pérdida neuronal es moderada en la neocorteza y el hipocampo (Bondolfi y col., 2002), pero es acusada en el locus coeruleus (Heneka y col., 2006). Además, este modelo muestra una prominente angiopatía amiloide (Beckm ann y col., 2003). El m odelo con la m utación Swedish bajo el prom otor PrP (del inglés, prion protein ), denom inado C3-3 (Borchelt y col., 1996), no es capaz de desarrolla r placas extracelulares, incluso a los 18 meses. 11 Hoy en día existen más de 40 tipos difere ntes de anim a les tran sgénicos APP y más de 20 que expr esan APP junto co n otros gene s relaciona dos, com o PS1 y TAU (www.alzforum .org). 12 Este m odelo fu e utilizado para estud iar el papel APOE en la de po sición del A  , al ser cruzado con un ratón knockout para APOE. En aus encia de APOE, la deposi ción del péptido amiloide se red uce significativamente, sugirien do un papel de esta apol ipoproteí na en la deposici ón am iloide (Ba les y col., 1997). Tesis  Doctor al  Introducción  29  En 2001, Chishti y col. describieron el modelo TgCRND8 , que sobreexpresa el APP con las mutaciones Swedish e Indiana , bajo el prom otor PrP, que m uestra daño cognitivo y placas a los 3 meses (ver revisión Webster y col., 2014). Por ú ltimo, el m odelo J20 , que expresa las mutaciones del modelo anterior pero bajo el prom oto r PDGF, fue desarrollado por Mucke y col. (2000). En éste, los primeros déficits cogniti vos se observan muy temprano (1-2 meses); sin em bargo, los déficits no progresan co n la edad y no se han observado en animales de edades avanzadas (Karl y col., 2012). Las placas aparecen a los 5-7 meses, acompañada por una reducción en los niveles de sinap tofisina. Presenta, además, pérdida neuronal tem pran a acompañada por activación gli al (W right y col., 2013). 1.2.2. Modelos transgénicos monogénicos basados en PS El estudio con ratones transgén icos que sobreexpresan la forma humana mutada de PS1 muestran que esta sobreexpresión incrementa los niveles de A  42 (Borchelt y col., 1996; Citron y col., 1997; Jankowsky y col., 2004; Elder y c ol., 2010a). Estos niveles también aparecen elevados en ratones transgénicos PS2 (Oyama y col., 1998) y en knock- in para PS1 (Nakano y col., 1999). Aunque e stos resultados confirman que l a mutación en PS tiene un efecto en el procesamiento de APP, los t rasngénicos P S1 no muestran formación de placas amiloides (Borchelt y col., 1996), y esto p uede ser debido a que el A  de ratón tiene propiedades de agregación diferentes al hum ano ( Jankowsky y col., 2007), específicamente en su tendencia a no for m ar agregados fibrilare s, aunque Tanemura y col. (2006) encontratron inclusiones positivas para Rojo congo y Tioflavina S en neuronas piramidales del hipocampo que reco rdaban a NFTs en el modelo konck-in PS1 I213T . Debido a la falta de patología de placas, los ratones transgéni cos PS han sido m enos utilizados que los APP. No obstante, estos modelos muestran pér dida neuronal y sináptica relacionada con la edad, así como patología vascular y daño en la neurogénesis hipocampal (ver revisión Elder y col., 2010a ). En este sentido, Chui y col . (1999), fueron los primeros en describir un fenotipo neurodegenerativo en el ratón transgén ico PS1 L286V , mostrando una pérdid a neuronal en el hipocampo y la neocorteza. Además, se ha mostrado una pérdida sináptica en modelos con la mutación M146L (Rutten y co l., 2005) y A246E (Priller y col., 2007). Se ha propuesto que las mutaciones en PS incrementan l a susceptibilidad neuronal al daño excitotóxico, ya que las neuro nas con mutaciones en PS1 liberan una cantidad excesiva de calcio desde el RE (Sm all, 200 9). Por otro lado, se ha observado una reducción en la fosforilación del residuo Ser9 de G S K - 3  que se relaciona con un incremento en su actividad enzim ática, en modelos PS1 (Tanemura y col., 2006; Dewachter y col., 2008), dando lugar a la hiperfosforilación de Tau. Además, se ha mostrado un incremento en el estrés oxidativo y la peroxidación lipíd ica y proteí ca en ratones PS1. Por último, se han dete ctado déficits de aprendiza j e y m e m o r i a e n m o d e l o s trasngénicos para PS, aunque s on sutiles (ver revsión Elder y c ol., 2010a). Tesis  Doctor al  Introducción  30  1.2.3. Modelos transgénicos bigénicos PS1/APP Los ratones transgénicos que c o e x p r e s a n P S 1 y A P P d e s a r r o l l a n n umerosos depóstios amiloides, mucho más temprano que los animales de la mism a edad que expresan solo uno de los genes m utados ( Borchelt y col., 1996; Matarin y col., 2015). Por ello, se empezaron a g enerar anim ales doble transgénicos. En 1998, Holcomb describió el modelo APPxPS1 , que sobreexpresa la APP SWE b a j o el promotor PrP y la PS1 M146L bajo el promotor PDGF. Los primeros déficits cognitivos aparecen a l os 4-5 meses (Dine ley y col., 2002). El m odelo PS1 dE9 /APP SWE , bajo el promotor PrP en un única inserción genómica, presenta déficits cognitivos a los 3 meses (Jankowsky y col., 2001) con fallos en el laberinto acuático de Morris a los 12 (Lalonde y col., 2005). La am iloidosis cerebral está presente desde las 6- 8 sem anas y muestra una intensa activación glial (Ruan y col., 2009) y neuritas positiv as para Tau (Kurt y col., 2003). No obstante, no presenta una pérdida neuronal masiva, au nque algunas poblaciones presentan déficits significativos, como las neu ronas catecolami nérgicas del locus coeruleus (O’Neil y col., 2007) y las interneuronas del hipocampo (Popovic y col., 2008). Flood y col. (2002), describieron el m odelo APP/PS1 KI, que porta las mutaciones Swedish y London d e APP y las mutaciones M233T/L235P de PS1 , y usa un prom otor endógeno para dirigir la expresión de la secuencia humana del A  , por lo que la patología se desarrolla en ausencia de sobreexpresión de APP o PS1 . Este m odelo presenta déficits cognitivos a los 7 meses (Bruce-Keller y col., 2011) y una pérd ida neuronal en CA1 a los 10 m eses de edad (Casas y col., 2004). El m odelo PS1/APP (que sobreexpresa PS1 M146L , bajo el promotor HMG-CoA reductasa, junto con la isoforma 751 d el APP c on la doble mutación Swed ish y l a m u t a c i ó n London ), generado por el grupo de Blanchard y col. (2003), presenta m uerte nueronal en hipocam po y corteza entorri nal (Ramos y col., 2006; Moreno-González y col., 2009; Baglietto-Vargas y col., 2010). E n este modelo aparecen las placas extracelulares a partir de los 3-4 meses, y presenta activación glial desde edades muy tempranas (Jiménez y col., 2008). No presenta ovillos ovill os neurof ibrilares. El modelo 5xFAD , fue descrito por Oakley y co l. (2006) y presenta la doble mutación sueca y las mutaciones Florida (I716V) y London (V717I) en el gen APP , y dos mutaciones en PS1 (M146L+L286V). Desarrolla déficits cognitivos a los 3 meses de edad (Ohno y col., 2006) y presenta A  intraceular a los 1,5 meses y deposición extracelular a partir de los 2 meses. Adem ás, presenta pérdida neuronal a part ir de los 9 meses, que afecta a las neuronas noradrenérgicas ( Kalinin y col., 2012) y colinér gicas (Devi y Ohno, 2010), así como de células piram idales en la corteza cerebral y el sub ículo (Oakley y col., 2006). 1.2.4. Modelos transgénicos basados en TAU A pesar que no se identificado ninguna mutación en Tau en los p acientes de Alzheimer, los ovillos neurofibrilares sólo se encuentran en an imales transgénicos que Tesis  Doctor al  Introducción  31  sobreexpresan la forma humana mutada de TAU 13 , aunque en ausencia de mutaciones TAU los modelos si poseen Tau hiperfosforilado especialm ente en las neuritas distróficas. La línea de animales AL Z7 expresa TAU bajo el promotor murino Thy-1 en su isoforma c on cuatro repeticiones (Götz y col., 1995). Estos ani males desarrollan axonopatía central y periférica, con axones dilatados, esférico s y filamentos helicoidales que no llegan a formar o villos. La línea 8c sobreexpresa TAU hum ano con los 14 exones. E s t e a n i m a l p r e s e n t a T a u e n n e u r i t a s y s i n a p s i s , p e r o n o e n l o s cuerpos celulares (Duff y col., 2000). Los anim ales Htau se obtienen por el cruce de animales TAU knockout y animales 8c (Andorfer y col., 2003) y expresan exclusivamente l a s 6 i s o f o r m a s n o r m a l e s humanas, sin el Tau murino. Estos animales presentan NFTs y una extensa muerte celular. Existen otro s animales t ransgénicos para Tau que expresan varia s mutaciones en el gen, como P301L, P301S, V337M y G272V. Los animales t ransgénicos par a la Tau hum ana mutada en P301L presentan NFTs a edades tempranas, aunque no existe m uerte cel ular (Götz y col., 2001). Los animales P301S , presentan filam entos de Tau a l os 6 m eses, NFTs a edades tempranas, atrofia en el hipocampo y la corteza entorrinal, pérdida sináptica, activación glial y muerte celular (Allen y col., 2002; Yoshiyam a y col., 2007). Los animales transgénicos APPxTAU, como el Tg2576xP301L (Lewis y col., 2001), poseen depósitos de A  a la misma edad que los progenitores Tg2576, aunque con una patología neurofibrilar incremen tada, sugiriendo un proceso de sinergia entre la patología amiloidea y la t aupatía. Por otro lado, la reducción endógena d e T a u m e j o r a o i n c l u s o rescata completamente los daños inducidos por el A  . En 2003, Oddo y col. desarrollaron un modelo triple transgénico, 3xTg-AD , con mutaciones e n los genes para APP (APP SWE ), Tau (P301L) y PS1 (M146L), bajo el promotor Thy-1.2 murino. Est e modelo muestra daños cognitivos a edades tempranas (3-5 meses; Webster y col., 2014). La a cum ulación de A  intracelular es el primer evento, seguido de la hiperfosforila ción de Tau, deposición de A  extracelular y aparición de NFTs (Oddo y col., 2003; Mastrange lo y Bowers, 2008). Además presenta una pérdida noradrenérgica (Manaye y col., 2013 ) y colinérgica (Girao da Cruz y col., 2012), y una a ct ivación microglial. Sin embargo , no hay una pérdida neuronal en el hipocampo, aunque si presenta disfunción sinápti ca. Este modelo ofrece la posibilidad de probar la interacción entre A  y Tau (Oddo y col., 2007). Sin embargo, la expresión de los tres genes a la vez, no permite analizar la im plicación patológica de cada uno en la EA. Un año después, Boutajangout y col. (2004), desar rollaro n un animal triple tg PS1xAPPxTAU sin mutaciones en TAU ( P S 1 M146L , APP751 SL , hTAu3R), que muestra placas a partir de los 2,5 meses, acumulación somatodendrítica de Tau, neuritas distróficas con Tau hiperfosforilado. Sin e mbargo, no existen NFTs ni a los 18 m eses. 13 En la EA no aparece as ociada ninguna mutación en el ge n TAU , por lo que estos model os no son útile s para c onocer l as causas de la enfermedad, a unque sí lo son para co no ce r s u re la ci ón co n e l pé pt id o A  en lo s animales que desarrollan plac as (Duyckaerts y col., 2008). Tesis  Doctor al  Introducción  32  1.2.5. Animales transgénicos inducibles Un modelo inducible permite el estudio de la formación de las p lacas tras la inactivación del transgen (hAPP695 SI ), simulando como si la patología amiloide no progresara (aunque tampoco revierte, ya que los depósitos son e stables). La inac tivación del transgen simula el p aro de la producción de A  que se esperaría tras la aplicación de un tratamiento que inhibiera las enzimas secretasas. El núcleo ami loide p roduce la misma inflamación y está rodeado por neuritas distróficas (Jankowsky y col., 2005). También, se han generado transgénicos inducib les para Tau (SantaCruz y col. , 2005). En la Tabla 1.1 se muestran los principales ratones transgénico s para l a EA desarrollados. Pese a todo, aún no se ha conseguido obtener un modelo que reúna todos los aspectos d e la enfermedad, lo que refleja las lim itaciones de u tilizar un sistem a roedor para reproducir una enfermedad hum ana que involucra varias décadas de desarrollo y que afecta a las funciones cognitivas superi ores. Sin e m bargo, estas línea s reproducen algunas de las características de la EA y se utilizan para la realización de e nsayos preclínicos (Van Dam y De Deyn, 2011). Recientem ente se h an desarrollado ratas transgé nicas como modelos de la EA (Do Ca rm o y Cuello, 2013). De éstas, las ratas TgF344-AD coexpresan e l APP SWE humano y el PS1d9 (Cohen y col., 2013) y desarrollan las lesion es típicas observadas en los ratones transgénicos de la enfermedad, mostrando, adem ás, t aupatía y m uerte neuronal, y, por tanto, mimetizan aún m ás la patología. Tabla 1.1. Resumen de los principales modelos transgénicos muri no s para la EA. En la tabla se muestra el tipo de animal, el nom bre de la línea por el que se conoce, las mutaciones o genes sobreexpresa dos, las características patológicas más notables y la referencia biblio gráfica. P S1: Presenilina 1; h APP: proteína precursora amiloide humana; NFTs : ovillo s neurofibrilares; S: m utación sueca (K670N/M671L); L: mutación londinen se (V717I); I: muta ción indiana (V717F); F: mutación fl orid a (I716V); D: mutació n Dutch ; KO: knockout ; KI: knock-in ; 4R: isoform a de Tau con 4 repet iciones (Datos obtenidos de Ba yer y Wirth s, 2008; Ashe y Za hs, 2010; y el resto de referencias i ndicadas). MODELOS MONOGÉNICOS GEN LÍNEA MUTACIÓN CARACTERÍSTICAS REFERENCIAS PS1 S9 PS1dE9 Increm enta la formación de placas Thinakaran y c ol., 1996 S8-4 HuPS1 Sin placas amiloides Borchelt y col., 199 7 N-5 hAAP A246E Sin placas ami loides Borche lt y col., 1997 PS1 KO Sin PS1 Inviable Shen y col., 1997 APP PDAPP hAPP I (V71 7F) Depósitos desde los 6 m eses. Gliosis. Sin NFTs Games y col., 1995 Tg2576 hAPP69 5 S (K670N/M67 1L) Placas desde los 9-11 m eses. Fallos siná pticos. Sin NFTs. Hsiao y col., 1996 C3-3 hAPP 695 S Sin placas amiloides Borchelt y col., 1996 APP23 hAPP75 1 S Placas desde los 6 m eses. Gliosis. Muert e celular. Sin NFTs Sturchler Pierat y col., 1997 APP Dutch hAPP75 1 D (E693Q ) Angiopatía amiloid e cerebral Herzig y col., 2001 CRND8 hAPP69 5 SI Placas desde los 3 m eses. Increm ento de A  42 /A  40 Chishti y col., 2001 Tesis  Doctor al  Introducción  33  hAPP69 5 hAPP69 5 SL inducib le Con la inhibició n génica el tama ño de los depósitos amiloides se redu ce Jankowsky y co l., 2005 J20 APP SI Placas desde l os 5-7 meses. Déficits cognitivos 1-2 meses Mucke y col., 2 000 TAU ALZ7 Sobre-exp resión de 4 repeticio nes de tau (4R) Presentan a xonopatía sin form ación de NFTs Götz y col., , 1995 JNPL3 4R Tau P301L NFT Lewis y col., 2000 8c Expresi ón de tau humano Tau en ne uritas y si napsis, n o en som as Duff y col. , 2000 Tau P301L 4R Tau P301L Sin muerte celular y con NFT de aparició n tem prana Götz, 2001 Tau P301S 4R Tau P301S Fallos sinápticos (3 m eses). Microgliosis y muerte celular. NFTs a edade s tem pranas Allen y co l., 2002; Yoshiyama y col., 2007 Tau V337M 4R Tau V337M NFT desde 6 meses Tanemura y col., 2001 Tau R406W 4R Tau R406 W NFT desde 1 8 meses Tatebayash i y col., 2002 HTau TauKO x 8c Existe m uerte neuronal sin NFTs Andorfer y col., 2003 rTg4510 4R Ta u P301L inducib le NFT y pé rdida neur onal. Inhibici ón no e vita form ación de nuev os NFT Ramsden y col., 20 05; SantaCruz y col., 2005 DM-hTau 2-3-4R Tau K257T/P3 01S NFT desde 6 meses Rosenmann y col., 2008 MODELOS BIGÉNICOS GEN LÍNEA MUTACIÓN CARACTERÍSTICAS REFERENCIAS PS1/ APP AP/PS C3-3xN -5 APP S x HuPS1 A246E Depósitos extracelulares des de los 9 meses Borchelt y col., 199 6 PSAPP Tg2576 x PS1 M146L Depósitos ext racelulares desde los 6 meses de edad Holcomb y col., 1998 PS1d9/ APPs PS1d9 x APPs Placas desde la s 6-8 semanas. Activación glial. Jankowsky y co l., 2001 PS1/APP PS1 M146L x APP SL Depósitos extracelulares des de los 3-4 meses de e dad. Gliosis. Muerte de neuronas piram idales y de int erneur onas Blanchard y col., 2003; Ramos y col., 2006 APP SL PS1 KI APP751 SL x PS1 KI (M233T/L235P) Patología muy agresiva. Pérdida de ne uronas CA1 desd e los 6 me ses Casas y col., 2004 5xFAD APP751 SFL x PS1 (M146L/L286V ) Niveles altos de A  42 desde 1 ,5 meses. Placas extra-celulares desde 2 m eses Oakley y col., 2 006 APP/ TAU TAPP Tg2576 x Tau JNPL3 Placas desde 8,5 meses. NFT Lewis y col., 2001 APP SWE Tau VLW APP S x Tau G272V /P301L/ R406W Placas desde 9 meses. NFT a 25 m eses. Muerte ne uronal a 16 meses Ribé y col ., 2005; DaRocha-So uto y c ol., 2011 MODELOS TRIGÉNICOS GEN LÍNEA MUTACIÓN CARACTERÍSTICAS REFE RENCIAS PS1/ APP/ TAU 3xTg-AD PS1 M146L x APP S x Tau P301L Placas desde 6 meses. NFT desde 9 meses. Fallos sinápticos Oddo y col., 20 03 PS1/APP/ TAU PS1 M146L xAPP751 SL , hTAU(3R ) Placas (2,5 meses) y axones distróficos. Sin NFT Bouta jangout y col., 2004 Tesis  Doctor al  Introducción  34  Aunque la patogénesis de l a EA no se conoce completam ente, se h an desarrollado diversas estrategias farmacológicas para su tratamiento (http:/ /www.alz.org/trialmatch), aunque hasta la fecha no existe ninguna eficaz en parar o retra sar la enfermedad. El proceso de desarrollo y aprobación de un fármaco es largo y costoso y se lleva a cabo a través de diferentes fases (Fig. 1.15). Las prim eras fases ( no clínicas) incluyen los ensayos in vitro e in vivo . P a ra é s t o s ú lt im o s se u ti l iz a n m o d el o s a n im a l es , qu e pa r a l a EA, como se ha comentado previamente, existen multitud (ver Apdo. 1 . 2 ) . E s l a e f i c a c i a d e l fármaco en los ensayos preclínicos la que determina el paso de éste a fases clínicas en humanos. Los ensayos clínicos en humanos, diseñados para determ inar la seguridad, la posología adecuada, la eficacia, las reacciones adversas y los efectos del uso a largo plazo de un medicamento nuevo, se realizan en tres fases sucesiv as (f ases 1, 2 y 3) y en cada fase se evalúa un número progresivam ente mayor de individuos. La pri mera fase suele realizarse con individuos sanos, utilizándose pacientes en las fases posteriores. Figura 1.15. Evoluci ón de un tratamiento farmacol ógico. Desde el diseño de un fármaco hasta su aprobación es necesario pasar por diversas fases, tanto preclín icas com o clínicas. El empleo de m odelos animal es en fases preclínicas es crucia l para conoce r in vivo el efecto del fárm aco. La presente Tesis Doctoral 1.3. Estrategias terapéuticas para el Alzheimer Tesis  Doctor al  Introducción  35  emplea m odelos anim ales de la EA tanto para caracterizar el pro ceso neurodegenerativo de la enfermedad, como para eval uar el posible ef ect o terapéut ico de pot enciales fá rmacos. En la actualidad se dispone de dos tipos de terapias sintom átic as aprobadas, cuyos efectos son limitados y mejoran algunos de los síntomas, pero n o tratan las causas que subyacen a la enfermedad (Huang y Mucke, 2012): - Inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChEIs): éstos son donep ezil (de Aricept, Eisai/Pfizer), galantamina (de Razadyne, Jonson&Jonson) y rivas tigmina (de Exelon, Novartis). Los AChEIs incrementan los niveles de acetil colina (ACh) al evitar su degradación por la enzima acetilcolinesterasa (AChE), mejorando la transmisión colinérgica. Los ensayos clínicos han probado una p equeña mejora en la cognición de los pacientes, pero ésta no es permanente, most rando un declive con el tiempo (Craig y col., 2011). - Antagonistas no competitivos de los receptores glutamatérgicos N-metil-D- aspartato (NMDA): la memantina. L a descarga excesiva de glutama to está relacionada con procesos neurodegenerativos (excitotoxicidad de l glutamato y posterior desequilibrio de la homeostasis del calcio) en trasto rnos tanto agudos (isquemia) como crónicos (EA). El clorhidrato de memantina actú a como modulador de la transmisión glutam atérgica (Reisberg y col., 2003). A continuación, se muestran las principales estrategias terapéu ticas ensayadas hasta el momento (ver revisiones Huang y Mucke, 2012; Ubhi y Masliah, 2013; Chiang y Koo, 2014; Franco y Cedazo-Minguez, 2014; Schneider y col., 2014). 1.3.1. Estrategias terapéuticas basadas en A  La hipótesis de la cascada am iloide (ver Apdo. 1.1.7.1), que si túa la deposición d el péptido  como un evento central en la EA, ha potenciado el uso de estrategias terapéuticas encaminadas a reducir la producción del péptido, f acilitar su eliminación y/o evitar su agregación (ver r evis ión Karran y col., 2011; Karran y Hardy, 2014; Schneider y col., 2014). Algunos de estos fárm acos han alcanzado la fase cl ínica 3 (Tabla 1.2). Para disminuir la producción de A  , se han diseñado inhibidores de  - y  - secretasa (ver Apdo. 1.1.3.3). Los inhibidores de  -secretasa, semagacestat y avagacestat, no han mostrado un efecto positi vo sobre el declive cognitivo, y además, muestran diversos efectos secundarios debi d o a l a g r a n v a r i e d a d d e s u s t r atos de esta e nzim a, pese a los resultados obtenidos en mode los transgénicos de la EA y en f a s e 1 ( B a t e m a n y c o l . , 2009). El tarenflurbil (R-Flurbiprofeno) es un AINE (antiinflam atori os no e steroide o) que actúa como modulador de  -secretasa, sin afectar al procesamiento de Notch, y se ha estudiado en fase 3 (Karran y Hardy, 2014). Con respecto a los inhibidores de BACE-1 (Rajendran y Annaert, 2012), su gran sitio catalítico dificulta e sta diana, a unque los Tesis  Doctor al  Introducción  36  inhibidores MK-8931 (Merck) y L Y2886721 (Eli Lilly) se encuentr a n e n f a s e c l í n i c a mostrando una reducción del 80-90% de los niveles de A  en el líquid o cefalorraquídeo (Chiang y Koo, 2014; Menting y Claassen, 2014). Sin em bargo, ha y dudas sobre su eficacia en pacien tes con EA m oderada, donde las placas de A  ya se han formado, ya que los inhibidores de BACE-1 evita n la producción del péptido, per o no tienen por qué afectar a los péptidos ya existentes. Una alternativa, para la disminuc ión de la producción del péptido, consistiría en desviar el metabolism o del APP hacia la ruta no amiloidogénica (ver Apdo. 1.1.3.3). Por otro lado, dado que los péptidos de A  se generan principalm ente en el compartim ento endosomal, se ha propuesto éste como una diana ef ectiva, utilizando, por ejemplo, agentes que neutralizan su pH (Rajendran y Annaert, 20 12). Tabla 1.2. Resultados obtenidos en ensayos en fase clínica 3 co n drogas centr adas en el A  ( A d a p t a d o de Karran y Hardy, 2014). ADAS-cog: del inglés Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive Subsc ale (Mohs y col., 1997 ) ; ADSC-A DL: Alzheimer’s Diseas e Cooperative St udy-Activities of Daily Livin g Inventory (Galasko y col., 1997) ; CDR-SB: Clinica l Dementia Rating-Sum of Boxes (Morris, 1993) . Para facilitar su eliminación se propone la activación de proteasas extracelulares capaces de degradar el A  (Yamada y Nabeshima, 2000). Asimismo, el agonista de APOE4, bexaroteno (Targetin®), que regula la expresión de APOE4 , es un tratam iento del linfoma de células T y está siendo ensayado en fase 2 por su ef ecto en la eliminación del A  (Chiang y Koo, 2014). Se han estudiado agentes capaces de inhibir la agregación del péptido amiloide (Yamada y Nabeshima, 2000), como la rifam picina (Tomiyama y col ., 1997), los bezofuranos (Howlett y col., 1999), el PBT2 (Lannfelt y col., 2 008), el scyllo-inositol, que mostró eficacia en fase 2 (Salloway y col., 2011) y el tramipro sate (ensayado en fase 3; Karran y Hardy, 2014). Por otro lado, las chaperonas, que m arcan las proteínas mal plegadas para su degradación, como l as proteínas del choque tér m ic o ( H SP , d e l i n g lé s heat shock protein ), pueden suprimir la agregación del A  (Ubhi y Masliah, 2013). Así, s e ha Tesis  Doctor al  Introducción  37  visto que una chaperona, el dominio Brichos, puede actuar en el ciclo de fibrilización- oligomerización del A  , al interaccionar con el A  f ibrilar, conduciendo a una reducción en la formación de oligóm eros tóxicos sin afectar a la carga fi brilar (Cohen y col., 2015). Las estrategias más recientes se han centrado en la inmunoterapia para el péptido A    Wisniewski y Goñi, 2015). La inmunización pasiva se ha ensayado e n f as e 3 co n l o s fármacos bapineuzumab (Elan/Pfizer/Jonson&Jonson) y solanezumab (Eli Lilly), sin beneficios sobre el declive c ognitivo (Iqbal y col., 2014; K arran y Hardy, 2014). La inmunización activa contra el A  , elimina las placas en un modelo transgénico APP (Schenk y col., 1999); sin embargo, el ensayo de inmunoterapia activa usando el péptido A  42 (AN1792, Elan), terminó en fase 2 de bido al desarrollo de me ningoencefalitis (Chiang y Koo, 2014). Posteriormente, se desarrolló un anticuer po monoclonal, m Ab158, contra las protofibrillas del A  , cuya versión humanizada, BAN2401, ha entrado en fase 3 sin efectos positivos sobre la cogn ición (Lannfelt y col., 2014 ). El fracaso de la inmunoterapia puede deberse a que el tratamien to de la enfermedad en una fase moderada sea demasiado tarde, y debería aplicarse e n una fase asintom ática. Por ello, en la actualidad, se encuentran en proceso vario s est udios centrados e n etapas tempranas de la EA (Miller, 2012; Karran y Hardy, 2014). Uno de ellos, la iniciativa para la prevención del Alzheim er (API, del inglés Alzheimer’s Prevention Initiative ) implica a 200 miembros de una población colombiana, portadores de una mut ación en PS1 (E280A; Fleisher y col., 2012), que recibi rán crenezumab (un anticuerpo anti-A  ) durante 5 años. La red de Alzheimer hereditari o dom inante (DIAN, del inglés The Dominantly Inherited Alzheimer’s Network ) incluye a 160 portadores de mutaciones del Alzheimer familiar que se tratarán con gantenerum ab (anticuerpo anti-A  de Roche) y solanezumab (de Lilly) durante 2 años. Por último, el Estudio del tratamiento antiamil oideo en la enfermedad de Alzheimer asintomática o estudio A4 ( en inglés, Anti-Amyloid Treatment in Asymptomatic Alzheimer’s Disease study ), se lleva a cabo en 1000 pacientes cognitivamente normales pero que han dado positivo en análisis por PET, y recibirán sol anezumab durante 3 años. Los primeros resultados de esta inmunoterapia en fase asintom ática se obtendrán en 2016. 1.3.2. Estrategias centradas en Tau Los fallos en las terapias basadas en A  han hecho que haya crecido el interés en estrategias terapéuticas centradas en Tau (ver revisión Huang y Mucke, 2012; Iqbal y col., 2014; Schneider y col., 2014). 14 La inm unoterapia activa consiste en la administración de un in m unógen o para estimular la produ cción endógena de anti cuerpos; m ientras que la i nmunotera pia pasiva e mplea ant icuerpos p re generad os. Esta estrategia podría eliminar el A  del cerebro mediante tres mecanismos: (i) opsonización d el A  , segui do de fagocitosis; (ii) la eliminación del A  en la periferia mediada por anticuerpos , qu e estimula un equilibrio con el tejido cerebral, disminuyendo su carga amiloide; y ( iii) uni ó n d e l o s a n t i c u e r p o s a l o s m o n ó m e r o s , induciendo un cambio conformaci onal que dism inuye su capacida d de oligom erización y/o fibrilización. Tesis  Doctor al  Introducción  44  Objetivo 2. Estudiar el efecto sobre la progresión de la patología de potenciales estrategias neuroprotectoras en modelos transgénicos de la EA. Mediante técnicas celulares y moleculares, junto con estudios cognitivos, se dete rm inará el posible efecto neuroprotector del tratamiento oral crónico con carbonato de litio, así como del compuesto NST0037 (estatina no com ercial), en modelos trans génicos PS1/APP de esta enferm edad. Objetivo 3. Analizar el efecto de la deficiencia de la interleuquina antiinflamatoria IL-4 sobre la progresión de la patología en un modelo transgénico de la EA. Con idea de evaluar el impacto del sistema inmune innato en la progresió n de la patología y la posible modulación de dicho sist ema como futura estrategia t erapéutica, en este objetivo nos centraremos en el papel de la interleuquina antiin flamatoria IL-4 en la patología de la EA. Para llevar a cabo este objetivo se elim ina rá gené ticamente la expresión del gen IL-4 en el modelo transgénico APP mediante cruce con un ratón IL4 KO (Jackson Lab). El hipocampo del nuevo modelo generado APP/IL 4 -/- s e r á analizado mediante técnicas mol eculares e inm unohistoquímicas. BIBLIOGRAFÍA Abramov E, D ole v I, Fogel H, Ciccotosto GD, Ruff E, Slutsky I. (2009). Am yloid-  a s a positiv e endogenous regulator of release probability at hippo cam pal synap ses. Nat Neurosci ., 12(12):1567-1576. Aisen PS, Gauthier S, Ferris SH, Saumier D, Haine D, Garceau D, D uong A, Suhy J, Oh J, Lau WC , Sampalis J. (2011). Tramipr osate in mild-to-m oderate Alzheimer' s disease - a randomized, doub le-blind, placebo-controlled, multi-centre stud y (th e Alphase Study). Arch Med Sci., 7( 1):102-111. Aletrino MA, Vogels OJ , Va n Domburg PH, Ten Donkelaar HJ. ( 1 9 9 2 ) . C e l l l o s s i n t h e n u c l e u s raphes dorsalis in Alz heim er’s disease. Neurobio l Aging , 13:461-468. 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Material y méto dos Tesis  Doctor al  Material  y  método s  63  En el presente trabajo se han empleado ratones transgénicos ( tg ) para la enfermedad de Alzheimer, pertenecientes a los siguientes genotipos:  Ratones simple transgénicos PS1 M146L (con fondo genético C57BL/6), que sobreexpresan la forma humana de la Presenilina-1 con la mutaci ón M146L, bajo el control del prom otor HMGCoA-reductasa.  Ratones simple transgénicos APP SL , en adelante APP, con fondo genético C57BL/6, que sobreexpresan el APP 751 humano con las mutaciones Swedish (KM670/671NL) y London (V717I) del Alzh eimer familiar (Fig. 2.1), bajo el control del promotor Thy-1, espec ífico de células principales.  Ratones doble transgénicos PS1 M146L /APP 751SL , en adelante PS1/APP, con fondo genético C57BL/6. Estos rat ones se obtuvieron por cruce d e ratones transgénicos homocigotos PS1 M 146L ( HO; PS1 +/+ ), con ratones tg APP 751SL (Fig. 2.1) heterocigotos (HE; APP +/– , Transgenic Alliance). Ver cruces en Fig. 2.2 (parentales recuadrados en negrita). Los ratones perte necen a la generación F6-F10 de los r atones tg heterocigotos.  Ratones doble transgénicos PS1 dE9 /APP S (línea 85), en adelante PS1d9/APP. Estos ratones sobreexpresan e l gen APP en su isoforma 695 con la mutación Swedish ( A P P S : K594M/M596L) y el gen PS1 que presenta una deleción del exón 9 (PS1 dE9 ), bajo el control del prom otor PrP. Estos animales (con fondo genético C57BL/6) proceden de Jackson Laboratory (Bar Harbor, M aine) (Jankowsky y col., 2004). 2.1. Animales de experimentación Tesis  Doctor al  Material  y  método s  64  Figura 2.1. Esquema de las mutaciones familiares del Alzheimer que contiene la secuencia aminoacídic a de la proteína APP 751 humana en el animal transgénico APP SL y e n e l d o b l e t r a n s g é n i c o PS1 M146L /APP 751SL . En el esquema se muestra la secu encia de la proteína APP, indi cando la doble mutación que pres entan los animal es PS1/APP. Se trata de las mutaciones Swedish (doble mutación que afecta a los aminoácidos 670 y 671[ KM670/671NL]) y London (en el aminoácido 717[V717 I ]). La secuencia en amarillo son los aminoácido s que forman la proteína  -amiloide tras s u procesam iento, la cual no se ve a fectada directamente por las mutaciones. La zona en azul es la fracción de membrana y las flechas indican las zonas de corte de las enzimas im plic ad as e n el procesamiento. Por pro cesamiento alternativo, se pueden producir 8 isoform as diferent es de APP, siendo la i soform a 751 la sob reexp resada en este m odelo.  Ratones Thy-Tau22, en adelante TAU, que expresan la forma human a de Tau de 4 repeticiones, con las mutaciones G272V y P301S, bajo el control del promotor Thy1.2 (Schindowski y col., 2006). Además, como controles se han utilizado ratones no transgénicos ( wildtype , WT) del mismo fondo genético. Los animales, pertenecientes a l os difere ntes genotipos, fueron analizados a diferentes edades (2, 4, 6, 9, 12 y 18 meses) y, e n cada diseño experim ental, las muestras de diferentes genoti pos y edades fueran procesadas de form a simultánea. Los animales transgénicos PS1 M146L /APP 751SL , así como parentales PS1 y APP para formar las correspondientes colonias y generar los dobles trans génicos, han sido suministrados por la in dustria farm acéutica Sanofi (París, Fran c i a ) a t r a v é s d e C h a r l e s - River Laboratories (Francia). Los anim ales TAU de las diferente s edades analizadas fueron suministrados tam bién por Sanofi. La generación y caracterización ini cial de los ratones transgén icos PS1 M146L /APP 751SL ha sido previamente descrita (Blanchard y col., 2003). Los anim ales se mantuvieron en el Estabulario de los Servicios Centrales de Investigación de la U niversidad de Málaga bajo condiciones de temperatura media controlada de 21±1 °C y un fo toperiodo de 14 horas de luz y 10 de oscuridad. Durante el tiempo de per m anencia en el E stabulario, los animales tuvieron libre acceso al agua y una dieta ad libitum estándar. A los 8-9 días del parto, se tomaban muestras de ADN de las crí as para realizar el genotipado mediante PCR convencional, seguida de una electrofor es is en la que se buscaba la presencia de la banda c orrespondiente a los transgenes APP ( cruces APP x WT y PS1 x APP) o PS1 (cruces PS1 HE x WT y PS1 HE x PS1 HE ) (Apéndice 2.12.1) humanos mutados. β-secretasa α-se cret asa γ- se cr et a s a NL 1 10 20 3 0 40 I 670/671 Sw edish 717 London NH 2 -- -TEEISEV KM D A E F RHDS G YEV HHQ KLV FFA E D VGS N K G A I I G LM VG G V V I A T VI V I T LVM L KKK- --C OOH β-secretasa α-se cret asa γ-secr etasa NL 1 10 20 30 40 I 670/671 Sw edish 717 London NH 2 -- -TEEISEV KM DAEFRHDSG YEVHHQKLVFFAE DVGSNKGAIIGLMVGG VVIATVI V I TLVM LKKK- --C OOH Tesis  Doctor al  Material  y  método s  65  A. Mantenimiento de parentales heteroc igotos para APP (APP +/– ): B. Mantenimiento de parentales homocigoto s para PS1 (PS1 +/+ ): C. Generación de animales PS1 +/+ / APP +/– : Figura 2.2. Manteni miento de paren tales y generaci ón de animales dobl e tran sgén icos P S1/APP . Para el manteni miento de los progeni tores APP heterocigot os (A) basta c on la realización de cruces con hembras WT, sie ndo la mitad de la descendencia APP heteroci gota (APP HE ). Sin e m bargo, el m antenimiento de los progenitores PS1 (B) requiere varios cruces sucesivos para recu perar la homocig osis de los mismos (rendim iento PS1 HO de cru ces P S1 HE x P S 1 HE =1/4). Además, cada cierto tiem po se requiere la introducción en la cadena de nuevos W T para el m a n t e n i m i e n t o d e l v i g o r h í b r i do. Por último, para la generación de lo s animal es doble tg (C) se cruzaron machos APP HE c o n h e m b r a s P S 1 HO resultantes de los cruces anteriores (recuadros en negrita), generándose la mitad de los animales PS 1/APP y la o tra mitad animales PS1 HE . El protoc olo de g enotipado se muestra e n el Ap éndice 2.1 2.1. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el RD 1201/2005 del 10 de Octubre (BOE 21/10/2005) para el mantenim iento y uso de animale s de laboratorio, y de acuerdo con el Real Decreto 53/2013 del 1 de febrero (BOE 08/02 /2013) para la protección Tesis  Doctor al  Material  y  método s  66  de los animales utilizados en experimentación. Además los exper imentos fueron aprobados por el Com ité de Uso de Animales para la Investigación de l a Un iversidad de Málaga. El número de animales utilizados, así como el estrés y sufrimiento de éstos durante la manipulación y experimentación fueron reducidos al máximo, de a cuerd o a la regla de las 3R (reemplazar, reducir y refinar). 2.1.1. Animales con dieta suplementada con litio Para el estudio del tr atam iento con litio se emplearon anim ales transgénicos PS1 M146L y PS1 M146L /APP 751SL (n=25 por grupo). A estos anim ales se les administró una dieta de libre acceso con un contenido de 1,2 g de carbonato de litio po r kg de producto (Harlan Laboratories), mientras que a los animales control se les administró una dieta estándar. El grupo tratado recibió, además, un suplemento de cloruro sódico (0,7%) en la bebida. El tratamiento se prolongó durante 6 m eses, desde los 3 hasta los 9 meses de edad. Los anim ales se pesaron semanalm ente y no se detectaron pérdida s significativas de peso (29,20±1,09 g vs. 27,50±2,2 g para l os animales PS1/APP c o ntrol y tratados, respectivam ente). El contenido plas mático de litio se determinó a partir de la arteria ocular y los niveles se mantuvieron estables durante todo el tratamiento y dentro del rango terapéutico: 0,44±0,07 mEquiv/l (n=10) después de 71 días de tr atamiento o 0,38±0,05 mEquiv/l (n=10) al final del tratamiento. Este tratamiento fue bien tolerado por los animales ya que la m ortalidad durante el mismo fue muy baja (0% en el caso de los animales PS1 control; 0% en los PS1 litio; 20% en los PS1/APP control; 7,4% en los PS1/APP tratados con litio) . 2.1.2. Animales tratados con el compuesto NST0037 (nueva estati na no comercia l; Neuron Bio) Estos animales fueron tratados y suministrados por la empresa N euron Bio (España). El fármaco consiste en una estatina no comercial, NST0037, dise ñada por la propia empresa (Fig. 2.3). Se ha descrito que este compuesto tiene cap acidad neuroprotectora y antiinflamatoria, y es hipocoles terolém ico y antiepiléptico (pa ra m ás información acerca de la patente de esta estatina ver http://www.google.com/patents/E P2241561A1?cl=en.). Los animales, todos transgénicos PS1d9/APP, se dividieron en tr es grupos (A, B y C). El grupo A lo conforman los animales que han recibido una d ieta enriquecida en NST0037, e l grupo B recibió una dosis menor del compuesto, y el grupo C corresponde al grupo control que recibió una die ta normal. Ambas dosis fueron bien toleradas p or los animales y, según Neuron Bio, no afectaron a la mortalidad de l os animale s tra tados en comparación con los individuos controles. Adem ás, los individuo s bajo tratamiento no mostraron ningún efecto adverso al t ratam iento, indicando la bu ena tolerancia de este fármaco. El t ratam iento se prol ongó durante 6 meses (iniciándos e a los 6 meses de edad y finalizando a los 12 meses de edad de los anim ales). Tesis  Doctor al  Material  y  método s  67  2.1.3. Animales modificados genéticamente: APP/IL4 -/- Para com probar in viv o el pap el de las interleuquinas antiinflam atorias sobre el proceso de activación m icroglial en la EA, se realizó el cruce de un ratón knockou t (KO) de IL-4 (IL4 -/- ) de origen comercial (Jackson Laboratory) con un modelo transg énico de la enfermedad de Alzheimer. En primer lugar se eligió el modelo bi génico PS1d9/APP en lugar de un APP, por presentar el doble transgénico una patolog ía mayor. Una vez conseguida la homocigosis para IL4 -/- mediante retrocruces, los animales PS1/APPxIL4 -/- se envejecieron hasta 6, 12 y 18 meses. Estas edades se s elecci onaron en base a datos previos. En contra de lo esperado en nuestra hipótesis inicial, los animales PS1/APPxIL4 -/- de 6, 12 y, más patentemente, a los 18 meses de edad, presentaban menor acumulación de A  y m enor deposición de placas extracelulares, una menor degeneración de neuronas GABAérgicas y una menor activación glial. Inicialmente, estos r esultados parecían contradecir nuestra hipótesis d e trabajo, indicando que la ause ncia de IL-4 ejercía una función protectora dentro del des arrollo de la patolog ía de est os modelos. Dentro de las posibles explicaciones para intentar esclarecer esta ap arente c ontroversia, existía la posibilidad de que se estuviera produciendo una selección de los animales con menor patología. Para comprobarlo, realizamos las curvas de supervive ncia de los distintos modelos (Fig. 2.4). A pesar de que los parentales IL4 -/- y PS1d9/APP son viables, l os PS1d9/APPxIL4 -/- presentaban una muy elevada mortalidad en el primer trimestre d e vida. De hecho, casi el 80% de los animales PS1/APPxIL4 -/- fallecen durante los tres primeros meses de vida. A los 6 meses de edad, cuando comenzam os el análisis fenotípico, la m ortalidad suponía un valor de casi el 95%. En base a estos datos, creemos que lo m ás razonable para explicar los datos observados es la enorme selección de los animales PS1/APPxIL4 -/- . Es posible que los animales que sobreviven a los primeros meses de vida sean l os que presentan un efecto reducido de las proteínas transgénicas. De esta forma, los únic os supervivientes son aquellos ratones PS1/APPxIL4 -/- sin prácticamente patología. Los animales PS1/APPxIL4 -/- de un mes no presentaron ninguna patología clásica de la EA ( pl acas d e Abeta, neuroinflamación, neurodegeneración, etc.). Figura 2.3. Fórmula química d e la estatina no comercial NST0037 diseñada por Neuron Bio . Esta molécula, (1S, 2S,6R,8S,8aR)- 1, 2,6,7,8,8a-hex ahidro-3,7-dimetil-8[2 - [(2R,4R)-tetrahidro-4-h idroxi-6-oxo-2H-piran-2-yl]etil]-1- naftalenil- 2-etil-b utirato, nombrada aquí com o NST0037, es un agente con potencial neuropr otector, adem ás de tener la capacidad de reducir los nivel es lipídicos ( colesterol y triglicéridos) en san gre, con capacidad antiepilép tica. Además, este compuesto es más seguro que las estatinas comerci ales, mostrando ni veles de toxicid ad por debajo de los mostrados por la simvastatina. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  68  No conocemos las causas que determ inan esta alta tasa de mortal idad perinatal. Como posible hipótesis de trabajo, y teniendo en cuenta que tan to IL-4 com o PS1 son necesarias para la maduración del sistema inmune, la alta tasa de muerte observada en los primeros meses, podría ser debida a f allos en la maduración pos t n a t a l d e l s i s t e m a i n m u n e . Para intentar paliar este efecto no deseado, e inesperado, se d ecidió cambiar de modelo de E A y s e p r o c e d i ó a c r u z a r l o s K O d e I L - 4 c o n e l m o d e l o a n i m a l A PP SL , preservando, de esta manera, la función de PS1 y  -secretasa en el sistema inmune. Hasta la fecha, los nuevos animales en homocigosis APP/IL4 -/- presentan una menor tasa de mortalidad (60% de supervivencia en el primer trimestre; Fig. 2.4). Los animale s KO de IL-4 fueron cruzados con los APP por al menos t res generaciones con el fin de conseguir la homocigosis IL4 -/- . El genotipo de los distintos ratones fue comprobado mediante PCR utilizando técnicas estándar y los cebadores recomendados por J ackson (ver Apéndice 2.12.1). Para distinguir la heterocigosis de la homocigosis, la expresión de IL-4 fue también ensayada, mediante RT-PCR, en las células de los gangli os linfáticos y del bazo de los animales. Como se ha comentado, l os ratones hom ocigotos IL4 -/- proceden de Jackson Laboratory. Estos animales pres entan una expresión reducida de IgE e IgG1 y de otros marcadores cuya expresión depende de IL-4. La producción de cit oquinas derivadas de Th2, como IL-10, también está reducida. La morfología microglia l está alterada en estos animales y estas células no expresan el marcador Ym1. La generación de los modelos PS1/APPxIL4 -/- (descartado por las razones anteriormente descritas) y APP/IL4 -/- (utilizado en esta Tesis Doct oral) ha sido realizada en el Estabu lario de la Universidad de Sevilla en colabor ación con el grupo del Dr. Javier Vitorica, con quien nuestro grupo mantiene proyectos coordinados de investigación. Figu ra 2.4. Curva d e supervivencia de los animale s PS1/APPxIL4 -/- , PS1d9/APP, IL4 -/- , APP/IL4 -/- y A P P . Se muestra la alta mortalidad observada en los animales PS1/APPxIL4 -/- e n los tres primeros meses de vid a (donde el porcentaje de supervi vencia está alrededor del 20%). Sin embarg o, la supe rvivenci a de los animales APP/IL4 -/- e s simi lar a l a observa da en l os animales APP. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  69  Fig. 2.5. Locali zación la formaci ón hipocampal. El hipocam po se localiza en la superfic ie media del lóbulo temporal. 2.1.4. Delimitación anatómica de las regiones de estudio 2.1.4.1. La formación hipocampal Esta form ación se encuentra severamente afectada en la enfermedad de Alzheimer y tiene una gran importancia en las funciones cognitiv as (m emoria y aprendizaje; Cooper y Lowenstein, 2002). Esta formación es una porción de la corteza cerebral que forma una especie de cuerno a lo largo de la curvatura del ventrículo lat eral (Fig. 2.5) y que está situada en el lóbulo temporal medial. La formación hipocam pal está constitu ida por el subículo, el hi pocampo propio (o cornu ammonis , CA) y la circunvolución dentada o giro dentado, todos los cua les constituyen la alocorteza de Brodm ann (ver revisión Andersen y col., 2008). En la parte rostral, el hipocampo aparece dorsalmente tras los niveles de los núcleos septales, delimitado inferiormente por el tálamo dorsal, superi ormente por el cuerpo calloso y dorsolateralm ente por el córtex parietal. Medialmente , el límite de la formación hipocámpica está formado por el giro dentado y la fim bria del h ipocam po. Posteriorm ente se curva y se extiende ventralm ente hacia el área am igdaloide, con las cortezas perirrinal y entorrinal, entre otras, definiendo sus límites laterales a est os niveles. Por su parte, el subículo aparece más caudalmente y limita dorsalmente con el cu erpo calloso y la corteza retrosplenial granular y lateral mente con CA1 y el giro dentado d e l h i p o c a m p o . S u p a r t e ventral limita lateralmente con CA1 y el c uerpo calloso y centr almente con la parte posteromedial del área am igdalohipocampal. Más caudalmente, el subíc ulo dorsa l lim ita dorsalmente con el postsubículo y el cuerpo calloso; lateralmente con CA1 y centralmente con el giro dentado del hipocampo. El subículo se continúa late ralmente con la corteza de la circunvolución parahipocámpica y el área de la perialocortez a. El subículo es el área de transición entre el hipocam po y la corteza entorrinal y es esen cial para el flujo de información en el hipocampo. El hipocampo está presente en las áreas de Bregma –0,94 a –4,04 m m , m i e n t r a s q u e el subículo aparece más caudalmente, en l os niveles –2,46 a –4, 36 mm (Franklin y Paxinos, 2007; Fig. 2.6). Tesis  Doctor al  Material  y  método s  76  2.2.3. Obtención de secciones en el microtomo de congelación Para las técnicas inmunohistoquímicas y tinciones histológicas realizadas se emplearon secciones de 40  m d e grosor cortadas en el plano coronal (Fig. 2.11) que se obtuvieron en un microtomo de congelación (Leica, CM- 1325) . Las secciones se recogieron de forma seriada free- floating en placas m ultipocillos con PBS y 0,02% de azida sódica (para evitar el crecimiento fúngico). Las secciones se distribuyeron en 7 series (una serie por pocillo) de t al form a que dentro de una serie los cortes consecutivos distaban entre sí 280  m; por tanto, cada pocillo contiene una representación rostrocaudal de un 1/7 del total del cerebro y, además, en cada serie encontramos un núm er o suficiente de secciones d e l a s d i s t i n t a s r e g i o n e s d e e s t u d i o , p a r a l o s e s t u d i o s c u a n t i t ativos (estereología). Asimism o, esta distribución seriada de los cerebros permite la realización de una técnica distinta para cada serie, de tal forma que pode mos analizar múl tiples marcadores y hacer un estudio comparativo en un mismo animal a lo largo del eje ro strocau dal. Las placas qu e contenían las secciones seriad as se alm acenaron a 4°C durante v arios meses, renovando regularmente el tampón PBS con azi da sódica. Cada experimento e staba compuesto por un grupo de tamaño muestral n=3-6 anim ales por genotipo. 2.3.1. Tinción general con violeta de cresilo El colorante violeta de cresilo (C 18 H 15 N 3 O 3 ; C1791), de naturaleza basófila, se une a ARN, A DN y proteínas asociadas localizadas en el núcleo y dispe rsas también en forma de Figura 2.11. Esquema de la orientación de una sección en plano coronal de un cerebro de ratón. 2.3. Tinciones histológicas Tesis  Doctor al  Material  y  método s  77  gránulos por el citoplasm a de manera que m arca todas las célula s (fundamentalmente el núcleo) de un color azul-vio leta. El violeta de cresilo se em pl ea al 1% diluido en agua desionizada. A esta mezcla se le añade ácido acético glacial, e n una concentración del 1% (apéndice 2.12.10). Esta tinción se ha utilizado para la correcta delim itación de las regiones de estudio. Para esta tinción s e llevó a cabo el siguiente prot ocolo: - Los cortes se montaron sobre portaobjetos gelatinizados y se de jaron secar durante una noche en la estufa a 37 °C para su adhesión al vidrio. - Se hidrataron los cortes con PBS 0,1M durante 20 minutos y con H 2 O destilada durante 5 minutos. - Incubación con la solución de viol eta de cresilo (5-10 minutos) . - Lavar con H 2 O destilada (30 segundos) para eli minar el exceso de colorante. - Deshidratación: e tanol de 70° ( 1 minuto), etanol de 96° con áci do acético al 10% (2 minutos), etanol absoluto (5 m i nutos) y xileno (15 minutos). - Montaje con DPX. 2.3.2. Tinción de placas amiloides fibrilares con rojo congo El rojo congo (C 32 H 22 N 6 Na 2 O 6 S 2 ) se usa de forma específica para el marcaje de  - amiloide fibrilar, ya que se une de forma específica las fibras amiloides de los depósitos extracelulares con conformación de hoja plegada  (Wu y col., 2007). Igualmente, puede marcar esta conformación en los ovillos neurofibrilares de aque llas células que los presenten. Este colorante se ha utilizado com o contratinción pa ra delimitar la distribución de diversos marcadores en relación a las placas de  -amiloide. Esta tinción es visible tanto a microscopía óptica convencional como a microscopía de fluores cencia. Para realizarla se llevaron a cabo los siguiente s pasos, todos en agitación: - Lavar las secciones en PBS 0,1M ( 3 lavados de 10 minutos) para elim inar los restos de azida sódica. - Incubar en rojo congo al 20% en etanol absoluto (ver apéndice 2 .12.10) durante 3 minutos. - Lavar el tejido en PBS 0,1M (3 lavados de 10 minutos) para elim inar el exceso de colorante. - Montar las secciones en portaobjetos gelatinizados (ver apéndic e 2.12.5) y dejar secar. - Deshidratación y montaje con DPX (ver apéndice 2.12.7). 2.3.3. Marcaje fluorescente de pla cas amiloides fibrilares con Tioflavina S La Tioflavina S (Tio-S) es una fluoresceína verde que marca de form a específica l as placas seniles, al unirse a las fibras de  -amiloide en conformación de hoja plegada  , y Tesis  Doctor al  Material  y  método s  78  también a los ovillos neurofibrilares. Para esta tinción se r ea lizó el siguiente protocolo (Bussiere y col., 2004): - Lavar las secciones en PBS 0,1M (3 lavados de 10 minutos). - Lavar 10 minutos en agua destilada. - Incubar 10 minutos en la solución de Tioflavina S (ver apéndice 2.12.10) en oscuridad. - Lavar en etanol al 50% (2 x 5 minutos). - Lavar en agua destilada (2 x 5 minutos). - Montar las secciones sobre portaobjetos gelatinizados y dejar s ecar unos minutos. Finalmente, colocar el cubreobjet os, utilizando como medio de m ontaje DABCO (ver apéndice 2.12.8). Las muestras se conservan en oscuridad a 4 °C. La técnica inmunohistoquímica se b asa en la especificidad de la reacción antígeno- anticuerpo para detectar la presencia de una o varias moléculas en un tejido. Las secciones de cereb ro de los diferentes animales (genotipos y/o tratamient os en su caso) y edades fueron siempre procesadas en paralelo, empleando las mismas sol uciones para minimizar las condiciones de variabilid ad en el proceso de inm unomarcaje. En determ inados casos, para aumentar/mejorar la exposición del a n t í g e n o a d e t e c t a r fueron necesarios uno o varios pretratam ientos: - Permeabilización con detergente (anticuerpos anti-CatD, anti-LA MP2 y anti- LC3b): Las seccion es se preincubaron durante una noche a 4°C con tampón PBS 0,1M a pH 7,4 con Tx-100 al 0,2% para increm entar la capacidad de penetración 2.4. Técnicas inmunohistoquímicas para microscopía óptica a campo claro y fluorescencia Tesis  Doctor al  Material  y  método s  79  del anticuerpo primario a través de los sistemas de membranas c elulares. Al día siguiente se comenzó con el pr otocolo general de inm unohistoquí mica. - Tratamiento con calor (anticuerpos para CatD, ChAT, LAMP2, LC3b , p75, Tau fosforilado, Ubiquitina): Tras lavar los c ortes con PBS 0,1M (3 x 10 minutos), se realizó una incubación en tampón citrato sódico pH 6 (apéndice 2.12.2) a 80°C durante 30 minutos, en agitación en un baño termostático (Unitr onic, 320 UR; Selecta). A continuaci ón, se dejaron enfriar durante 15 m inutos y se lavar on en PBS 0,1M (3 x 10 minutos). Posteriorm ent e, se procedió al protocolo convencional. - Tratamiento con ácido fórmico (anticuerpos para  -amiloid e): Tras lavar l os cortes con PBS 0,1M (3 x 10 minutos), se realizó una incubación en áci do fórmico al 85% durante 5 minutos. A continuación, se lavó con PBS (3 x 10 m inu tos) y se procedió con el protocolo general. El protocolo general de inmunohistoquímica utilizado constó de los siguientes pasos 1 : - Lavar el tejido en PBS 0,1M para eliminar los restos de azida s ó d i c a ( 3 x 1 0 minutos). - Inhibición de la peroxidasa e ndógena con H 2 0 2 al 3%/m etanol al 10% en PBS 0,1M pH 7,4, durante 20 minutos. - Lavar con PBS (3 x 10 m inutos). - Bloqueo de la avidina, biotina y las proteínas de unión a bioti na que se encuentran de forma endógena, mediante el kit de bloqueo de avidina-biotin a durante 30 minutos en cada solución, con un paso i nterm edio de un lavado d e 10 minutos en PBS. - Lavar con PBS (1 x 10 m inutos). - Incubación en el anticuerpo prim ario (ver m arcadores utilizados , anticuerpos y condiciones en Tablas 2.1 y 2.2). En aquellos casos en los que el anticuerpo estaba desarrollado en ratón, se r ealizó un paso de bloqueo previo con PBS 0,1M 0,2% de Tritón X-100 y BSA al 5% durante 30 minutos, con el objeto de m inimizar reacciones inespecíficas. 2.4.1. Marcaje inmunohistoquímico p ara microscopía óptica conve ncional - Incubar las seccion es a 22 °C en agitación continua, en uno de los anticuerpos primarios (Tablas 2.1 y 2.2) diluidos en PBS con 0,2% de Tritón X-100 y 0,1% de azida sódica. - Lavar con PBS 0,1M (3 x 10 m inutos). 1 Todos los pasos de incubación y de la vados de la técnica inm un ohistoq uímica que se descri ben a continuaci ón, se realizaron con agitación constante (agitador d e rotación circular Nahita 685 y asimétrico tridimiension al Heidolph Polymax 1040). Tesis  Doctor al  Material  y  método s  80  - Incubar durante 70 minutos a temperatura ambiente con el anticu erpo secundario biotinilado correspondiente (Tab la 2.3), a una dilución de 1/50 0 en el mism o diluyente que el anticuerpo primario. - Lavar con PBS 0,1M (3 x 10 m inutos). - Incubar en una solución de Estre ptavidina (ExtrAvidin®) conjuga da a peroxidasa de rábano a 1/2000 en PBS 0,1M con 0,2 % de Tritón X-100 durant e 90 minutos. - Lavar con PBS 0,1M (3 x 10 m inutos). - Para la visualización de la reacción de la peroxidasa, las sec ciones se i ncubaron en una solución de revelado, 3-3’ d iaminobencidina tetrahidroclorh ídrico (DAB) al 0,05% en tampón Tris clorhídrico 50 mM, 0,03% de níquel sulfato amónico y peróxido de hidrógeno al 0,03% en PBS (ver apéndice 2.12.6). Es te revelado permite la visualización del marcador en color azul oscuro. - Montar las secciones en portaob jetos gelatinizados y dejar seca r. - Deshidratación y montaje con el m edio DPX. Tabla 2.1. Relación de marcad ores estudiados mediante inmunohis toquímica MARCADOR CARACTE RÍSTICA  -amiloide Fragmento peptídico generado por el procesamiento proteolítico de la proteína precurso ra amiloide (A PP) en la vía amiloidogé nica. El anticuerp o 6E10 reconoce los primeros 17 residuos aminoacídi cos del péptido A  , y por tanto también reconoce form as precurs oras. El anticuerpo 4G8 reconoce el fra gmento generado tras el proce samiento d e APP que incluye los am inoácidos 17 a 24 de la secuencia del  -amiloide. Tam bién reconoce las formas precurs oras A  42 Péptido amiloid e de 42 amino ácidos. Co nstituyente principal d e las placas extracelulares, ya que tiende a ag regarse y genera r formas fibr ilares. Aβ oligomérico Formas oligoméricas del péptido amiloide de pe queño tamaño (1 2- 24 mers). Se ha dem ostrado que son las especies más neurotóxicas. Para su de tección se ha utilizado el anticuerpo OC. Colinacetil- trasnsferas a (ChAT) Enzima en cargada d e la síntesis de acetilcolina. Perm ite identi ficar las neuronas y terminales colinérgicos. APP Proteína precursora amiloide que tras su procesam iento por las presenilinas da lugar al  -amiloide. El anticuerpo utilizad o reconoce el fragmento C-term inal. Calretinina (CR) Proteína ligadora de calcio que se expresa en las subpoblacione s de inter neuronas GABAérgi cas que in hiben a ot ras interneur onas. Catepsina D (CatD) Es una proteasa lisosomal acídica y, por tanto, se puede usar c omo marcador de este orgá nulo. GFAP Proteína g l ial fibrilar ací dica que forma los filamentos interm edios de células astrogliales. Es un marcador específico de los astrocitos. Hsp27 (HSPB 1) “Heat shock p rotein 27”. Peque ñas proteínas liberadas en situación de estrés que actúan com o chaper onas, ayudan do al plega miento de otras prot eína s. Iba1 Molécula a daptadora (del inglés “ionized calcium bind i ng adapter molecu le 1” ) que se expresa específicamente e n microg lía y monocitos activad os. Suele asociarse co n procesos inflamat orios cróni cos. LAMP2 Proteína lisosomal asociada a me m brana. Intervie ne en procesos de autofagia. Es Tesis  Doctor al  Material  y  método s  81  un bue n marcador de lisosom as. LC3-b “Light chain 3” . Es una prote ína de uni ón a mi crotúbul os (MAP) que se puede presentar en dos estados: LC3-a (cito sólica, formada p or escisi ón del ext remo C- terminal de LC3) o LC3-b (asociada a vesículas autofágicas tras la lipidación de LC3-a. Se considera de a utofa gia). MAP-2 “Microtub ule associated protein-2 ”. Proteína abundante en el sistema nervioso, que se asocia con la tubulina de los m icrotúbulos. Adem ás, inte racciona c on otros element os del citoesq ueleto como son los neurofilam entos y la a ctina. Marcador dendrítico. Neurofilamento (NF) Es una pr oteína de los filamentos interm edios im plicados en el mant enimient o del citoesqueleto neuronal, principalmente en los axones. Neuropeptid o Y (NPY) Producido por una subpob lación de interneuronas GABAérgicas. Es tá implicado en la inhi bición presi náptica de la liberación de neurotransmis ores y facilita la retención de memoria. Está presente en una subpobl ación espe cíf ica de interne uronas del hip ocampo, y colocaliza m ayorit ariam ente con somatostatina en las células O-LM y HIPP. NeuN Marcador específico de núcle os de neur onas m aduras de ve rtebrad os. p75NTR Receptor de neurotrofi na de baja afinidad ( Low-Affinity Nerve Growht Factor Receptor ). Miembro de la superfamilia de los receptores del factor de n ecrosis tumoral. Parvalb úmina (PV) Proteí na ligadora de calcio expresada en determinadas subpoblac iones de interneuronas GABAérgicas, com o las células en cesto. Sinaptofisina Glicopr oteína ácida que se une a Ca ++ , forma parte de la mem brana d e las vesículas sinápticas. Se utiliz a como marcador de sin apsis, al encontrars e en los terminales sináptico s. Somato statina (SOM) Neuropé ptido sinteti zado por una subpoblac ión de interneur onas GABAérgicas, como por e jem plo las células OL-M e HIPP del hipocam po y las cé lu las de Martinotti en la corteza cerebral. Tau fosfo rilada Tau es una pr oteína estruct ural de unió n a microtú bulos (MAP ). En la EA, su forma hiperfosforilada se encuen tra formando acúmulos intracelu lares. El anticuerp o AT8 reconoce un epítope de los filamentos helicoidal es pareados de Tau sensi ble a fosfori lación (Ser 202/Thr 2 05), cor respondient e a Tau40 humano. Ubiquitina Proteína ubi cua altam ente cons ervada, q ue se une a proteínas qu e van a ser degradadas vía proteasom a (p roceso de ubiqu itinización). VGAT Transportador vesicular GABA. Es una proteína integral d e m emb r ana d e vesículas sinápt icas que c ontienen neu rotransm isores inhi bidore s, como el GABA. Ma rcador de sin apsis GABAé rgicas. VGluT1 Transpor tador Vesicular d e Glu tam ato. Tran sporta glutamato al i nterior de las vesículas sinápticas. Marcador d e sinapsis glutamatérgicas. VIP Péptido intestin al vasoactivo. Es un neurotransmisor, perteneci ente a la familia del glucag ón generad o por un a subpoblació n de inter neuronas GAB Aérgicas. Tabla 2.2. Relación de anticuerpos primarios utiliza dos en los estudi os in munohistoquímicos ANTICUERP O PRIMARIO DILUCIÓN DE USO INCUBACI ÓN (TIEMP O Y TEMPERATUR A) ANIMAL DE OBTENCIÓN REFERENCIA Anti-A  42 1 :5000 24 h; 22 °C Conejo Abcam; Ref.: 39377 Anti- A  oligomérico (OC) 1:5000 24 h; 22 °C Cone jo Millipore; Ref.: AB2286 Anti-A  1-17 1:5000 24 h; 22 °C Ratón Covance; Ref.: Tesis  Doctor al  Material  y  método s  82  (6E10 ) SIG-39320 Anti-A  (4G8) 1:2000 24 h; 22 °C Ratón Covance; Ref.: SIG-39240 Anti-colin- acet iltransf erasa (ChAT) 1:1000 24 h; 22 °C Cabra Chemicon; Ref: AB144P Anti-AP P 1 :200000 24 h; 22 °C Cabra Meridian life sciences; Ref.: Q2B100G Anti-AP P 1 :20000 24 h; 22 °C Conejo Sig m a; Ref.: A8 717 Anti-Calretini na 1:5000 24 h; 22 °C Conejo Sw ant; Ref.: 7699/4 Anti-Cat D 1:100 48 h; 22 °C Cabra Santa Cruz Biotechn ology; Ref.: sc-6494 Anti-GF AP 1:2000 24 h; 22 °C Pollo Chemicon; Ref.: AB5541 Anti-GF AP 1:10 000 24 h; 22 °C Conejo D ako; Ref.: z0334 Anti-Hsp2 7 1:1000 24 h; 22 °C Conejo Sigma; Ref.: HPA000497 Anti-Ib a1 1:2000 24 h; 22 °C Cabra Abcam; Ref.: ab5076 Anti-Ib a1 1:1000 24 h; 22 °C Conejo Wako; Ref.: 019- 19741 Anti-LAMP 2 1:500 24 h; 22 °C C onejo Abcam; Ref.: AB37024 Anti-LC3- b 1:1000 24 h; 22 °C Conejo Cell Signaling; Ref.: #2775 Anti-MAP -2 1:5000 24 h; 22°C Conejo Chem icon; Ref.: AB5622 Anti- Neurofilamento M (150 K Da) 1:500 72 h; 22 °C Conej o Chem icon; Ref.: AB1981 Anti-NP Y 1:5000 4 8 h; 22 °C Conejo S igm a; Ref.: N 9528 Anti-Ne uN 1:10 00 24 h; 22 °C Ratón Chemicon; Ref.: MAB377 Anti-p 75 1:1000 24 h; 22 °C Conejo Prom ega; Ref.: G323A Anti- Parvalb úmina 1:5000 4 8 h; 22 °C Conejo Swant; Ref.: PV-28 Anti- Sinaptofisina 1 :1000 24 h; 22 °C Conejo Abcam; Ref.: AB14692 Anti- Sinaptofisina 1:100 24 h; 22 °C Pollo Abcam; Ref.: AB130436 Anti-SO M 1:1000 48 h; 22 °C Cabra Sant a Cruz; Re f.: D-20 Anti-Tau fosforilada (AT8) 1:250 24 h; 4 °C Ratón Pierce; Ref.: MN1020 Anti-Ubiquiti na 1:50 00 24 h; 22 °C Conejo Dako; Ref.: Z0458 Anti-VGAT 1:5000 2 4 h; 22 °C Cobaya Calbiochem; Ref.: 676780 Tesis  Doctor al  Material  y  método s  83  Anti-VGluT1 1:10000 7 2 h; 22 °C Cobaya Chemicon; Ref.: AB5905 Anti-VI P 1:5000 48 h; 22 °C Conejo AntibodyBcn; Ref.: AC20077 Tabla 2.3. Relación de anticuerpos secundarios u tilizados en los estudios inmu nohistoquímicos de microscopía óptica de campo claro ANTICUERP O SECUNDARIO (BIOTINILADO) DILUCIÓN DE USO INCUBACI ÓN (TIEMP O Y TEMPERATUR A) REFERENCIA Anti-IgG d e cabra desarrollado en caballo 1:500 70 m in; 22 °C Vector Lab.; Ref.: BA-9500 Anti-IgG de cobaya desarrollada en cabra 1:500 70 mi n; 22 °C Vector Lab.; R ef.: BA-7000 Anti-IgG de cone jo desarrollado de cabra 1:500 70 m in; 22 °C Vector Lab.; Ref.: BA-1000 Anti-IgG d e pollo desarrollado en cabra 1:500 70 min; 22 °C Vector La b.; Ref.: BA-9010 Anti-IgG d e ratón desarrollado en cabra 1:500 70 min; 22 °C Vector La b.; Ref.: BA-9200 2.4.1.1. Marcaje inmunohistoquímico doble para microscopía con vencional con revelado DAB-Níquel/DAB - Realizar el protocolo de inmunohistoquím ica adecuado según el prim er antígeno a detectar. - Una vez revelado con DAB-Níquel, lavar con PBS 0,1M (3 x 10 minutos). - Posteriormente i ncubar con el segundo anticuerpo primario, se guido del correspondiente secundario y Extravidin-peroxidasa, según el pr otocolo típico para inmunohistoquím ica. - A continuación, revelar con una disolución de DAB 0,05%-Tris clorhídrico y peróxido de hidrógeno al 0,01% en PBS 0,1M. Este revelado permite la visualización del marcador en color marrón. - Tras otros tres lavados de 10 minutos con PBS 0,1M, montar l a s secciones en portaobjetos gelatinizados y dejar secar. - Deshidratación y montaje con el medio DPX. 2.4.1.2. Marcaje inmunohistoquímico múltiple (5x) a microscopía de campo claro para diferenciar células prin cipales de interneuronas. Cuando se emplea una batería de varios anticuerpos e l proceso n o difiere mucho del anterior. Para este marcaje múltiple (5x) se han empleado un to tal de cinco anticuerpos primarios: los anticuerpos anti-SOM, anti-PV, anti-VIP y anti-C R (característicos de neuronas G ABAérgicas) y el anticuerpo anti-NeuN (que marca los núcleos de todas las neuronas). Esta combinación perm ite diferenciar las células pri ncipales glutamatérg icas (marcadas sólo con el anticuerpo para NeuN) de las interneurona s GABAérgicas Tesis  Doctor al  Material  y  método s  84  (marcadas con NeuN y además con uno o varios de los otros cuatr o anticuerpos primarios). Se eligió este com plejo procedimiento experimental, en lugar de l clásico inmunomarca je con anticuerpos contra GABA o G AD67 para el marcaje de todas la s interneuronas, porque observamos que el número de somas inmunopositivos para estos ma rcadores siempre era menor que e l número de somas detectados empleando anticuerpos c o n t r a S O M o P V , q u e son subpoblaciones de interneurona s GABAérgicas. Estas diferenc ias entre los distintos inmunom arcajes, que también han sido observadas por otros autor es (Wouterlood y Pothuizen, 2000), puede deberse a la distinta preservación del antígeno que reconocen los anticuerpos en el tejido, la penetración del anticuerpo, la l oc alización intracelular del epítope (en el cuerpo celular o en los botones axonales) o simp lemente debido a que las interneuronas GABAérgicas no son uni formes en cuanto a los nive les de GABA o GAD67. En el día 1, se realizaron los b loqueos de peroxidasa endógena y de avidina/biotina y se procedió a la incub ación secuencial con los anticuerpos prim arios específicos para interneuronas que expresan SOM , PV, CR y VIP, de uno en uno, cu briendo así casi todos los tipos de interneuronas según su contenido neuroquímico (Miy oshi y col., 2007). Cada anticuerpo primario se incubó una noche. Tras las 24 horas de i ncubación del anticuerpo contra SOM, los cortes se lavaron con PBS 0,1M (10 m inutos, 3 v eces) y, a continuación, se pasó a la incubación del anticuerpo anti-PV, y así consecuti vam ente con anti-CR y anti- VIP, hasta el día 4. Tras la incubación con este último anticue rpo primario, en el día 5, se procedió a la incubación con los anticuerpos secundarios biotinilados específicos para los respectivos anticuerpos primarios (anti-cabra para SOM y anti-c onejo para los otros tres), seguido de la incubación en estrep tavidina-peroxidasa y revelad o con DAB-Ni. De este modo se consigue que las interneuronas presenten un m arcaje azu lado en el soma y sus prolongaciones. Tras el revelado, se procedió al lavado de l os cortes en PBS (3 x 10 minutos) y la incubación con el anticuerpo anti-NeuN durante tres noches a 4 °C, hasta el día 8. Posteriormente, el d ía 9 , se incubaron los cortes e n el a nticue rpo secundario biotinilado específico (anti-ratón) y en la estreptavidina-peroxidasa, seguido del revelado del producto de inmunorreacción, esta vez únicam ente con DAB. Así, se consig ue que todas las neuronas maduras posean un marcaje nuclear de color marrón. De este modo, las interneuronas tendrán un doble ma rcaje (azul en el citoplasma y marrón en e l núcleo), m i e n t r a s q u e e l r e s t o d e l a s n e u r o n a s ( l a s c é l u l a s p r i n c i p a l e s ) presentarán sólo un marcaje nuclear m arrón (Fig. 2.12). Finalm ente, las secciones se montar on y se deshidrataron como se ha mencionado en el apartado anterior. Se procesaron los controles apropiados para evitar cualquier fa lso positivo debido a la reactividad cruzada entre los sistemas de revelado (omisión de los anticuerpos primarios). Para una discriminación inequívoca de las diferente s reacciones de estreptavidina-perox idasa, la primera (para in terneuronas) fue siem pre realizada con DAB- níquel (azul), m ientras que la segunda (NeuN) se realizó sólo c on DAB (marrón claro). Tesis  Doctor al  Material  y  método s  85  Además, la diferente localización espacial (compartimento celul ar) de los epítopes para interneuronas (citoplasma) y NeuN (núcleos) garantizaba complet amente la corre cta visualización no solapada de ambas reacciones y, por tanto, la interpretación de los resultados. Figura 2.12. Esquema de la inmun ohistoquímica múltiple para el marcaje diferencial de interneuronas y célul as prin cipales del subíc ulo a microscopía conve ncional d e campo claro. De izquierda a derecha: 1.- Representaci ón de los tipos neuro nales sin procesar (NP: Ne urona principa l; IN: in terneuronas). 2.- Las interneuronas se m arcan en azu l tras el revelado con DAB-Ni de los anticuerpo s específi cos para el contenido neuroquí mico de las interneuronas (SOM, PV, CR y VIP). 3.- Fina lmente, tanto las interneuron as como las neuronas pri ncipales se marcan en marr ón con NeuN tras re velar con DAB, quedando las células principales con marcaje nuclear m arrón y las interneuronas con doble m arcaj e. 2.4.2. Marcaje inmunohistoquímico doble/triple para microscopía de fluorescencia Para los estudios de co localización a m icroscopía confocal de d istintos marcadores, se realizaron diversas combinaciones de anticuerpos primarios, evidenciadas con anticuerpos secundarios y/o estreptavidina acoplados a fluorocr om os (Fig. 2.13). - Se llevó a cabo el protocolo general de inmunohistoquímica come ntado anteriormente hasta la incubación del anticuerpo primario. - A continuación se lavó con PBS (3 x 10 minutos). - Posteriormente se incubó en el segundo anticuerpo primario dura nte el tiem po correspondiente al mismo. - Lavar con PBS (3 x 10 m inutos). - En el caso de una inmunohistoquím ica triple de fluorescencia se incubó en el tercer anticuerpo prim ario. - Se lavó con PBS (3 x 10 minutos). - Se procedió a incubar en el pri mer anticuerpo secundario para e l primer anticuerpo primario acoplado al fluorocrom o Alexa 568 (1/1000) 2 (Tabla 2.4) durante 1 hora. - Lavar con PBS (3 x 10 m inutos). 2 En este paso se puede incuba r en un anticuerp o secundario biot inilado en lugar de incuba r con un secundari o acoplado a un fluorocrom o, para posterio rmente proce der a la incubaci ón de la strepta vidina fluorescente (Tabla 2.5; ver Fig. 2. 13). Tesis  Doctor al  Material  y  método s  92   Solución crioprotecci ón al 30%. 10 minutos. - Lavar con PBS 0,1 M (1 x 10 m inutos). - Incubar las secciones en la “so lución de bloqueo 1” (PBS 0,1 M/Tx-100 0,01%/azida sódica 0,1%/BSA 1%; ver apéndice 2.12.9) a temperat ura ambiente durante 30 minutos. - Incubar las secciones con el ant icuerpo primario ( u tilizando co m o diluyente la solución de bloqueo anterior) dur ante 48 horas (Anticuerpos Tab la 2.3). - Lavar con PBS 0,1 M (3 x 10 m inutos). - Incubar las secciones en la “s olución de bloqueo 2” (PBS 0,1 M/ BSA 0,8%/gelatina de pescado 0,1%; ver apéndi ce 2.12.9) durante 30 minutos. - Incubar las secciones en el anticuerpo secundario (Tabla 2.6) c onjugado con partículas d e oro de 1,4 nm (NANOGOLD), diluido a 1/100 en la “ solución de bloqueo 1” (PBS 0,1 M/Tx-100 0,01%/azida sódica 0,1%/BSA 1%) du ra nte 1 noche a temperatura am biente. - Lavar con la “ solución de bloque o 2” (PBS 0,1 M/BSA 0,8%/gelati na de pescado 0,1%) (3 x 5 minutos). - Lavar con PBS 0,1 M (3 x 5 m inutos). - Postfijar las seccion es con gl utaraldehído (2%) en PBS 0,1 M du rante 10 minutos. - Lavar con agua destilada (2 x 3 minutos). - Lavar con citrato sódico 0,02 M, pH 7,0 (3 x 5 minutos). - Preparar el kit HQ SILVER TM (intensificador de la marca) usando cantidades iguales de cada uno de los tres componentes. Mezclar el mismo v olum en de la solución A (iniciador) y B (mode rador). A continuación, añadir la misma cantidad de la solución C (ac tivador). Revelar durante 5-10 minutos 3 . - Lavar en agua destilada (2 x 3 minutos). - Lavar en PB 0,1 M (1 x 10 minutos). - Gold toning : Sustituye a las partículas de plata manteniendo la amplificac ión de su tamaño y evitando su eliminación por el posterior t ratam iento p or e l os mio, ya que el oro no se ve alterado por e l tratamiento con osmio.  Cloruro de oro 0,05% en agua destilada en oscuridad y a 4 ° C durante 10 minutos.  Tiosulfato sódico 0,3% en agua destilada e n oscuridad y a 4 ° C (2 x 10 minutos). - Lavar en PB 0,1 M (3 x 10 minutos). - Incubar las secciones en una solución del 1% de tetraóxido de o smio (4%) en tampón PBS a 4 ° C y oscuridad durante 45 m inutos. 3 El kit de plata se inactiva con la temperatura, por ello, en f unción d el calor del laboratorio, se dejará un tiem po de incubación diferente que oscila entre los 5-10 mi nuto s. En ningún caso, se dejará más de 11 minut os aproxi madam ente. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  93  - Lavar en PBS 0,1 M (2 x 10 minutos). - Deshidratación de las seccione s e inclusión en plano (Apdo. 2.6 .3). Tabla 2.6. Relación de anticuerpos secundarios acoplado s a oro utilizados e n l o s e s t u d i o s inmunohistoquímicos de MET ANTICUERP O SECUNDARIO ANIMAL DE OBTENCIÓN DILUCIÓN DE USO INCUBACI ÓN (TIEMP O Y TEMPERATUR A) REFERENCI A Anti-IgG d e conejo acopla do a oro C abra 1:100 24 h; 22 °C NanoPr obes; Ref.: 2004 2.6.7. Observación y obtención de las imágenes La observación de l os cortes ultrafinos se realizó en un micros copio electrónico de transmisión (JEOL JEM-1400) de los Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación de la Universidad de Málaga. Este m ismo microscopio electrónico se utilizó para la obtención de las imágenes digitales. La estereología es una r am a de la morfometría que permite la ad quisición de información tridimensional y cuantitativa a partir de imágenes bidimensionales, como es el caso de secciones de t ejido (Ma yhew, 1986; 1992). Constituye un conjunto de métodos simples que combina la probabilidad geométrica y la estadística para la cuantificación de características geométricas tridi mensionales de objetos, como e l volumen, área, longitud, número y conectividad (Howard y Reed, 1998). Son m étodos no ses gados, carentes de error sistem ático y la estim ación de los parámetros no está inf luida ni por la forma del objeto, ni por su distribución y/o tamaño, lo que constituyen g randes ventajas metodológicas. Además, con una muestra muy pequeña de sujetos y pocas secciones (6-7 2.7. Cuantificación mediante estereología Tesis  Doctor al  Material  y  método s  94  secciones) se obtienen coeficientes de error y de variación ace ptablemente bajos (Royet, 1991). Para la cuantificación de diferen tes poblaciones pueden utiliza rse dos aproxim aciones estereológicas: el fraccionador óptico (West y col., 1991) que permite obtener una estimación del número total de entidades de una estructura, y p or otra parte, la determinación de la densidad con el disector óptico (Jinno y col., 1998; 2003; 2 006), la utilización de este estimador c onllevó la determinación del fac tor de encogimiento que presenta la región a estudiar. Con ambos estimadores se emplea el mismo siste ma de computación, que comprende un microscopio convencional (Olympus BX61), una cámara digital (Olympus DP71), el progr ama infor mático Ne wCAST (C omput er Assisted Stereological Toolbox, Olympus) c on el sistema VIS 2.61.1.0 (Vi siopharm Integrator System, Visiopharm®) y un microcator (Prior ProScan), que monit oriza los m ovimientos del eje z con una resolución de 0,5  m (ver Fig. 2.14). Figura 2.14. Imagen y esquema rep resentativo de los distintos c o m p o n e n t e s d e l s i s t e m a d e a n á l i s i s estereológico C.A.S.T. Aproximadam ente por cada cerebro se analizaron 7-10 secciones s eriadas, de uno de los hemisferios cerebrales , separada una de otra 280  m, obteniendo de esta manera una representación de toda la zona de estudio, desde regiones rostr a l e s h a s t a l a s c a u d a l e s . S e empleó una media entre 3-6 animales de cada genotipo y/o tratam iento y edad para realizar las distintas estimaciones. El área estudiada fue seleccionada utilizando el objetivo de 10x/0.40, mientras que el muestre o se realizó con el objetivo d e inm ersión 100x/1.35. A continuación se detallan los parámetros, y la aproximación es tereológica utilizad a, para cada uno de los m arcadores celulares estudiados. 2.7.1. Fraccionador óptico El fraccionador óptico es un estim ador que resulta de la combin ación del disector óptico y un muestreo sistemático d e l a s s e c c i o n e s ( e l f r a c c i o n a dor) (West y col., 1991; Schmitz y Hof, 2005). En este estimador, el conteo de partícula s se lleva a cabo por el disector óptico, además requiere que las secciones sean uniform es y muestreadas sistemáticam ente, puesto que van a constituir una fracción de l a región a ser analizada. El Tesis  Doctor al  Material  y  método s  95  fraccionador óptico no se ve afectado por los encogimientos que pueda sufrir el tejido y puede ser utilizado para secciones congeladas, en vibratomo y e n parafina. La fórmula del fraccionador óptico se com pone de los siguientes parám etros: xQ hsf x asf x ssf N 1 1 1   Figura 2.15. ssf: fracción m uestre ada de las secciones. L a fracción m uestreada de las seccione s es la proporción entre las secciones a nalizadas y el número total de secciones por anim al (n secciones). En este caso 1/7. Las secciones analizadas son m uestreadas de form a sis temática (Howard y Reed, 1998). Figura 2.17. asf: fracción muestreada de área. La fracción m uestreada de área, es el cociente entre el área de la ventana de conteo (áre a del disector óptico) y el área de la cuadrícula. En el muestreo sistemático, la cuantificación no se realiza en t odo el tejido sino que se cont a rán el número de partículas que se encuentren contenidas en disectores ópticos (áreas específicas de tejido), que se ha y an distribuidos sistemáticamente en una plantilla p reviam ente diseñ ada (Howard y Reed, 1998). Las p artículas contadas s on las situadas dentro de la rej illa o las que cortan las líneas d e inclusión (partículas en lila), mientras q ue las situad as fuera de la rejilla o en contacto con las lí n eas de exclu sión o sus extensi on es quedan sin contar (partículas amarillas). Figura 2.16. hsf: fracción muestread a de altura. La fracción muestreada de altura, es la razón entre la altura de la ventana de conteo (disector óptico) y la altura de la sección de tejido. Las distancias tanto del disector com o el de la sección se calcularon con el microcator (Howard y Reed, 1998). ssf : fracción muestrea da de las secciones (Fig. 2.15). hsf : fracción muestreada en al tura (Fig. 2.16). asf : fracción muestreada de á rea (Fig. 2.17). Q : núm ero de part ículas co ntadas p or indi viduo. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  96  2.7.2. Densidad numérica En el presente trabajo se ha realizado el recuento de diferente s poblaciones neuronales (SOM, NPY, NeuN, ChA T, PV, entre otras) empleando la técnica estereol ógica del disector óptico, dado como d ensidad numérica (DN) en número de neuronas por volumen (células/mm 3 ). El uso del disector óptico co mo procedimiento de m uestreo es tá considerado como el mejor m étodo para una estimación precisa de la densidad num érica de células. El programa informático NewCAST requiere que los objetos bajo i nvestigación (en nuestro caso células inmunomarcadas) sean muestreados de manera uniforme, es decir, en un área determ inada cada objeto debe tener la misma probabilida d de ser contado. Se delimita el área de la región a medir y se determina el porcent aje de la muestra que se quiere estudiar (entre el 10 y 50% del total) y el programa rea liza un muestreo de la zona seleccionada al azar, en regiones equidistantes (el primer punt o seleccionado es al azar y los consecutivos se marcan c on una distancia preseleccionada), mediante el comando meander sampling o muestreo en form a de m eandro. El área se selecciona manualm e nte con el objetivo de 4x ó 10x, dependiendo de la facilidad para d elimitar la zona, y el muestreo se realiza con el objetivo de 100x de inmersión. Para cada animal se midieron una media de 6-8 secciones seri adas, cada una separada por 280  m (ya que se mu estrea una fracción de 1/7 y los cortes tiene 40  m de grosor), pertenecientes a un hemisferio cerebral, obteniendo así una repre sentación global a lo largo d el eje rostro-caudal (Fig. 2.15). Para la estimación de la densidad numérica, el programa emplea cuadrículas o ventanas, denominadas counting frames o ventanas de conteo, con un área de 902,52  m 2 , en combinación con el método del disector óptico, que es un método de e stim ación del número de perfiles somáticos en un volumen de referencia de la m uestra, que e n este caso fue de 10  m d e g r o s o r p o r e l á r e a d e l a v e n t a n a d e c o n t e o . S e d e l i m i t ó u n área de guarda de 3  m por encima y por debajo del volumen de referencia. Las cuadrí culas se distribuyeron de forma equidistante e scaneando entre un 10 y un 40% d e la muestra según el caso. Teniendo en cuenta los límites de inclusión y exclusió n de la cuadrícula (Fig. 2.17), se realizó el conteo de aquellos somas inmunomarcados de ntro del volumen seleccionado; así, se tienen en cuenta sólo los som as que se en cuentran dentro de los disectores que forman parte de la plantilla, mientras que aquel los que no se encuentran en los disectores no son cuantifica dos. Se evita, por tanto, el se sgo de que el experimentador seleccione las áreas de tejido en las que aparezca la m ayor den sidad de partículas o aquellas que mejor se visualicen , ya que el conteo depende del lugar en el que se encuentren los disectores. Además, el muestreo sistemático no p rovoca la sobreestimación numérica, pues evita que un mism o cam po sea cuantificado en rep etidas ocasiones, como podría suceder con el muestr eo al azar (Royet, 1991). Tesis  Doctor al  Material  y  método s  97  Teniendo en cuenta el área de la región m arcada, la altura en e l e j e z , e l g r o s o r d e l corte y el núm ero de perfiles som áticos contados, se p uede dete rminar el núm ero de neuronas por unidad de volumen o densidad numérica (DN), según la ecuación: donde Q es el número de somas; A es el sumatorio de las áreas, es decir, el área de la ventana de conteo (902,52  m 2 ) por el núm ero de ventanas cuantificadas, y h es la altura del disector (10  m), resultando un volumen de referencia de 9025,2  m 3 . Así, se obtiene la densidad numérica de cada una de las secciones de cada anim a l, se realiza su media y se muestran lo s resultados en células/mm 3 . Posteriorm ente, s e realizó la media entre los animales de cada grupo de edad y genotipo y se presentó junto a su desviación estándar. 2.7.3. Nucleador: tamaño de placas La isotropía se define como la uniformidad en la distribución a lo largo de todas las posibles orientaciones en 2D o 3D. En la práctica se combina si empre con la posición uniform emente aleator ia de los el ementos de test en el espacio, de manera que el diseño del protocolo de m edición sobre una estructura garantice el encuent r o i s o t r ó p i c o a l a z a r ( I U R , del térm ino inglés Isotropic Uniform Random ) entre la sonda de medida y la estructura. En algunos casos, como la esfera, la propia estructura es estadíst icam ente isotrópica. El nucleador se basa e n la generación de rayos isotrópicos desd e un punto fijo definible (no arbitrario) interi or del objeto a medir (por ejem plo, una célula o un depósito amiloide), o bien desde un punto generado UR en el interior de un subespacio discreto (por ejemplo, un nucléolo). Si las secciones son IUR, entonces las d irecciones de los rayos deben ser isotrópicas en 2 dim ensiones (2D). La orientación de una línea vien e dada por el ángulo ω que for m a relativo a un eje predeterminado, y por lo tanto, por el punto en que corta a una circunferencia imaginaria, que a su vez, representa un ángulo . Es preciso que todos los án gulos tengan igual probabilidad de ocurrir. De modo que para lograr la isotropía e n 2D hay que generar al azar un número de ángu los uniformemente distribuido entre 0° y 180° (Fig. 2.18A). En la cuantificación del tamaño de l as placas marcadas con Tiof lavina S, se empleó el método estereológico. La medida de las placas se realizó en un 20% de la región a estudiar, empleando un tam año de disector óptico de 6022,8  m 2 y el objetivo de 4 0x. El área se determinó e m pleando el nucleador ( 2D IUR, bidimensional isotropic uniform random ), que permite estim ar áreas de perfiles. Se trata de líneas ra diales (5 en nuestro caso) que permiten determinar el centro y los límites de las pl acas, obteniéndose su área en  m 2 (Fig. 2.18B). Posteriormente, las placas se agruparon por cate gorías de t am año y se representaron gráficam ente. DN Tesis  Doctor al  Material  y  método s  98  Figura 2.18. Cuantificación del área de las placas mediante el nucleador. A) Principio de isotropía en el que se ba sa la técnica del nucleador. B) Mediante esta metodol o gía, se cuantifican las placas incluidas en los disectores. Para la medida del área se marca el centro de la pl aca y el punto de corte d e los 5 radios con el borde de la misma. Finalmente, para determinar el número de placas por unidad de á rea, se cuantificó el número de placas marcadas con Tio-S mediante estereo logía, em pl eando una fórmula similar a la empleada para la densidad numérica, aunque sin ten er en cuenta la altura del disector, debido al gran grosor de algunas placas: donde Q es el número de placas marcadas con Tioflavina S y A es el sumatorio de las áreas, es decir, el área de la ventana de conteo (6022,8  m 2 ) por el número de ventanas cuantificadas. Así, se obtuvo el número de placas por área de c ada sección del animal, se separaron por rango (<200  m 2 , 200-500  m 2 , 500-2000  m 2 y >2000  m 2 ) y se representó l a media obtenida junto a la desviación estándar. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  99  2.8.1. Estudio de la carga amiloide: plaque loading Las secciones teñidas con Tioflavina S o Abeta42 fueron fotogra fiadas utilizando un microscopio Olympus BX61 e m pleando el program a de captura de im ágenes Cell-A (Olympus), o usando el microscopio Nikon modelo Eclipse 80i con el programa ACT-2U- respectivamente, como s e ha descrito en los apartados 2.5.2 y 2 .5.1, manteniendo la mism a intensidad de luz y sin v ariar ni el brillo ni el con traste, co n el objetivo de 4x. Se analizaron una m edia de 6-7 secciones para cada animal PS1/APP analizado ( n=5/edad), de cada una de las edades (2, 4, 6, 12 y 18 meses). Las imágenes seleccionadas fueron calibradas en el programa Vis ilog 6.3 (Noesis, Francia) y se delimitó el área de interés a cuantificar. Esta i magen se binarizó determinando siempre el mism o u mbral, establecido en 128 de un rango que oscila entre 0 y 255, de esta manera sólo aparec erían visibles en la pantalla (siendo así cuantificables) las zonas teñidas. Se realizó la sum a del área seleccionada y la im agen que resultó de la binarización (Fig. 2.19), obteniéndose una zona de punteado que corresponde a la zona teñida. Para conocer el porcentaje de área teñida se realizó un a relac ión entre el área inicial (100%) y la obtenida tras la bi narización. Esta medida permite establecer comparaciones entre individuos. Por tanto, la carga amiloide fibrilar se defi n ió com o el porcentaje del área total de la región de interés teñ ida con Tioflavina S o Abeta42. 2.8. Cuantificación mediante análisis de imagen Tesis  Doctor al  Material  y  método s  100  Figura 2.19 . P roceso de binarizaci ón co n e l programa de análisi s de imagen Visi log 6.3. En la ima gen de la izquierda se puede observar la fotografía original sin proce sar, con el área de interés seleccionada; y, a la derecha, la misma imagen tras el proceso de binarización. La ti nción con Tioflavina S aparece como un punteado a zul. Tras el sumatorio de ambas im ágenes obtenemos la inferior, en la que t enemos el área inmunopositiva de la región de interés. El plaque lo ading corresponderá a la relación entre esta ú ltima área con respecto al área tota l de la re gión (señala da en rojo e n la imagen s uperior i zquierda ). 2.8.2. Estudio del área ocupada por distrofias Las secciones inmunomarcadas con anti-NPY o anti-ChAT se fotogr afia ron utilizando un microscopio Nikon Eclipse 80i con el objetivo de 1 0 x , t a l y c o m o s e describió en el apartado 2.5.1. Se fotografiaron 5 secciones po r animal de cada uno de los grupos (edad y/o tratamiento, según el diseño experim ental corr espondiente en cada caso). Para el análisis de imágenes se utilizó el program a Visilog 6.3 (Noesis, Francia). El área ocupada por las distrofias se identificó por un umbral que se mantuvo constante para todas las imágenes (Fig. 2.20). La región de estudio se delimit ó manualmente, y los somas presentes en dicha área fueron eliminados también manualmente p ara evitar falsos positivos. S e representó el porcentaje del área total d e la reg ión que estaba ocupada por las distrofias. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  101  Figura 2.20. Proces o de cuantificación del porcentaje de área de una región ocupada por las distrofi as mediante el empleo del programa Visilo g 6.3. De la misma forma que medimos el plaque loadin g (ver F ig. 2.14), analizam os aquí el área ocupada por las distrofias axona les en nuestra región de interés. En la imagen de la derec ha vemos la imagen binarizada c orrespon diente a l as distr ofias. 2.8.3. Análisis de la compactación de las placas de  -amiloide El análisis de la compactación de las placas de  -amiloide se llevó a cabo en los animales tratados con litio y en los animales control. Las secc iones hipocampales inmunoteñidas con anti-Abeta42 se fotografiaron utilizando un microscopio Nikon Eclipse 80i (ver Apdo. 2.5.1), con el objetivo de 10x. Se analizaron 5 sec ciones por a nimal y 5 animales por grupo, utilizando el programa de análisis de image n Visilog 6.3 (Noesis, Francia). La densidad de inmunotinción para Abeta42 se identificó mediant e un umbral que se mantuvo a lo largo de todo el experimento (Fig. 2.21). La i m age n, en escala de grises, se binarizó para estimar su densidad óptica que fue definida como los píxeles por unidad en relación al tamaño de la placa (en  m 2 que se midió utilizando el mismo program a). Figura 2.21 . Cuantific ación de la comp actación de las placas . Mediante el program a Visilog, las im ágenes de la inmunohi stoquím ica para Abeta42 reveladas con DA B (con es te método de revela do se aprecian mejor las diferencias en la compactaci ón que con DAB-níquel, que e nma scara dichas diferencias) se pas aron a escalas de gri ses. Mediante un um bral se determinó la marca pos itiva que se utilizó para determinar la densidad óptica de cada una de las placas. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  108  además, se ha pro puesto que puede actuar como una chaperona qu e se une directamente al A  m odulando su agre gación y deposición in vitro. CD45 Del inglés cluster of differentiatio n 45 . Marcador de la microglía y macrófagos activados. GDNF Del inglés g l ial cell line-d erived neurotrophic factor . Factor neurotrófi co producido por la astrog lía que participa en la superviven cia ne uronal . GFAP Proteína gli al fi brilar acídica que forma los fil amentos interm edios de células astrogliales. Es un marcador e specífico de los astrocitos. Iba1 Molécula a daptadora (del inglés “ionized calcium bind i ng adapter molecu le 1” ) que se expresa específicamente e n microg lía y monocitos activad os. Suele asociarse co n procesos inflamat orios cróni cos. IL-6 Interle uquina p roinflam atoria pro ducida por macrófago s y célul a s T. MMP-3 y MMP-9 Metalopep tidasas de matriz 3 y 9. Proteasas implicadas en la de gradac ión de la matriz extracelular. NPY Neurotra nsm isor producido por un a subpoblación de interneu ronas GAB Aérgicas. Está presente en una subpoblaci ón específica de inter neuronas d el hipoc ampo, y colocaliza mayoritariam ente con s omatostatina e n las células O- LM y HIPP. NT-5 Neurotrofina 5. Neurot rofina r elacionada con el factor de creci miento nervioso que part icipa en la s uperviven cia neuronal. SOM Neuropé ptido sinteti zado por una subpoblac ión de interneur onas GABAérgicas, como por e jem plo las células OL-M e HIPP del hipocam po y las cé lu las de Martinotti en la corteza cerebral. TNF-  Factor d e nec rosis tumoral alfa. Es una citoquina proinflam ator ia pro ducida principalmente por m acrófagos ac tivados. Activa la v ía extrínse ca de la a poptosis. Durante el transcurso de este trabajo hem os e mpleado dos método s para asociar el producto de PCR específico am plificado a una señal fluorescente . Uno de ellos consiste en el uso de cebadores específicos j unto con el fluoróforo de unión al ADN bicatenario SYBR- green I . El otro m étodo em pleado para detectar el producto específico amplificado por fluorescencia es Taqman Gene Expression Assay® Mix 20X (denominado comúnmente como Sondas Taqman). El procedimie nto a seguir para preparar la PCR a tiempo real es ligeramente diferente en función de qué método usemos para dete ctar la amplificació n de la diana estudiada. En el caso de que empleemos SYBR-green I, junto con un par de c ebadores específicos diseñados para una diana en concreto, se debe hacer en primer lugar un ensayo preliminar con diferentes cantidades de partida de ADNc. Ade m ás , se debe llevar a cabo un protocolo de disociación del producto de PCR obtenido para c onocer la especificidad de nuestros cebadores durante la reacción. Una vez comprobada dich a especificidad y la eficiencia de la reacción en el ciclo threshold (ciclo de PCR en el que la curva de amplificació n de la diana en cuestión se distingue del ruido de fondo o fluorescencia background) , pasaremos a cuantificar la expresión de la diana deseada con respecto al housekeeper (GAPDH) tanto en las muestras problem as como controles, emplea ndo la ecuación de Livak y Schmittegen (2 -ΔΔC t ), para calcular la expresión relativa de la diana en cuestión (Livak y Schmittgen, 2001). Para preparar las reaccion es de PCR empleando SYBR-green I seguimos los volúm en es especificados en la Tabla 2 .10. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  109  Tabla 2.10. Relación de los reacti vos emplead os para la a m plifi cación por PCR a tiempo real empleando SYBR-green I. En la tabla se indica el compone nte de la reacción y las cantid ades necesarias para una reacción. Componentes de la reacción Volumen (µl) FastStart SYBR-Green ® Ma ster Mix 2X 10 Cebadore s (Sentido/ Antisentido) 0,6 (de cada cebado r) ADNc pro ducto de retrotransc ripción 1 Agua + DEPC 7,8 Total 20 En el caso de usar Sondas Taqman, no es necesario llevar a cabo t a l e s comprobaciones antes de la cuantificación, pues esta sondas sum inistradas po r Applied Biosystemns han pasado previamen te controles pertinentes que no s garantizan tanto su especificidad como la eficiencia de amplificación para la diana e n e l c i c l o threshold . El detalle de los com ponentes de esta reacción se especifica en la Tabla 2.11. Tabla 2.11. Relación de los reacti vos emplead os para la a m plifi cación por PCR a tiempo real empleando sondas Taqman. En la tabla se indica el compone nte de la reacción y las cantid ades n ece sarias para una reacción. Componentes de la reacción Volumen (µl) Taqman® Uni versal P CR Master Mix 2X 10 Taqman Ge ne Expression Assay® M ix 20X 1 ADNc pro ducto de retrotransc ripción 1 Agua + DEPC 8 Total 20 Una vez preparadas las reaccion es según la mezcla de volúmenes detallada en placas de 96 pocillos compatibles con al guno de los termocicladores empleados para PCR a tiempo real, pasam os a realizar la am plificación siguiendo el p rograma detallado en la Tabla 2.12. La señal fluorescente emitida por los productos de la PCR fue detectada por el lector acoplado en el termociclador y su intensidad es proporci onal a la cantidad de copias generadas del amplicón durante la reacción. Para poder cuantifi car l as cantidades i n iciales presentes de una diana determinada mediante RT-PCR en tiempo re al, nos basamos en el concepto de Cycle thresh old , ciclo threshold o Ct, punto en el que la fluorescencia alcanza un umbral a partir del cual el increm ento en la cantidad de ADN amplificado es exponencial. El valor umbral o threshold se d eterminó automáticam ente por el s oftware SDS v1.7 o v3.2. En la Tabla 2.13 se muestra la secuencia de lo s cebadores em pleados y en la Tabla 2.14 las sondas Taqman utilizadas. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  110  Tabla 2.12. Program a predeterminado de amplificación para PCR a tiempo real. Estas condicione s han sido previ amente est ablecidas por Applied B iosystem s. Etapas iniciales 40 ciclos Activaci ón de Taq- polimerasa Desnaturali zación ADNc Desnaturali zación ADNc Hibridación/ Elongación 2 mi nutos 50 º C 10 m inutos 95 ºC 15 segu ndos 95 ºC 1 m inuto 60 ºC Tabla 2.13. Secuencia de ce b adores empl eados en la PCR . En esta tabla se muestra el marcador analizado, la denominación de los cebadores muri nos up y low y la secuencia espec ífica e m pleada para la realización de la RT-PCR a tiempo real y el núm ero de acceso. PROTEÍNA NOMBRE SECUENCI A (5’→3’) Nº ACCESO  -actina B-ACTup AAGATCATTGCTCCTCCTGAGC NM_0 07393.2 B-ACTlo AGCTCATCGTACTCCTGCTTGC Colinacetil- transferas a (ChAT) CHATup GTAACAG CCCAGGAGAGCAGGTCGG N M_009891 CHATlo TCATTCAGC CAGTATTCAGAGACCC GDNF G DNFup AGCTGCCAG CCCAGAGAATT N M_010275.3 GDNFlo G CACCCCCGATTTTTGC GFAP GFAPu p CTCCAACCTCCAGATCCGAG NM_0102 77 GFAPlo TCTGACACGGATTTGGTG TCC NPY NPYmm UP CATCAATCT CATCACCAGACAG A NM_023456 NPYmm LO AAGGGTCTT CAAGCCTTGTTC SOM SOMmm UP AGGATTTGCCCCAGGC AGCT NM_0 09215 SOMmmLO TGCAG CCAGCTTTGCGT TCC Tabla 2.14 . Sondas Taqm an para RT-PC R . Se indican las sondas Taqman de Applied Biosy stems, con su referencia, utilizadas para el a nálisis d e expresión de ARN m me dianteRT-PCR Real Time. SONDA REFERENCIA APOE Mm01307193_ g1 CD45 Mm01293577_ m 1 IBA1 Mm 00 479862_g1 IL-6 Mm00446190_ m 1 MMP-3 Mm00440295_ m 1 MMP-9 Mm00442991_ m 1 NT-5 Mm01701591_ m 1 TNF-  Mm00443258_m1 Para comprobar que durante el proceso de amplificación con sond as Taqman no se habían producido dímeros de cebadores, que l a secuencia amplifi cada era la correcta y que existía una cantidad detectable, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (apéndice 2.12.11). Una vez en l a c ubeta de electroforesis q ue contiene el tampón TBE 10x, se cargaron las muestras junto con tampón de carga y un ma rcador de 100 pares de bases (10 ng/ml; Superladder-low 100bp ladder, Gensura Laborato ries INC.) como patrón. Se cargaron 8  l de patrón junto con 4  l de tampón de carga, así como 5  l de m uestra y 5  l de tampón de carga y se inició la electroforesis a un voltaje constante de 190 V. Finalmente, los geles fueron visualizados bajo la luz ultraviol eta y se fotografiaron con una cámara Polaroid®. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  111  2.9.5. Western-Blot (WB) Esta técnic a permite la cuantific ación de proteínas específicas presentes en el tejido. Comienza con la electroforesis de las proteínas en geles desnat ura lizantes de poliacrilamida-SDS (apéndice 2.12.12) o poliacrilamida-SDS-Urea (apéndice 2.12.13), para separar las en relación su m ovilidad electro forética. Dicha separación depende del tamaño de la proteína en cuestión: las proteínas de mayor peso molecular migran una menor distancia que aquellas con m enor peso molecular, y se sep a r a n e n t r e e l l a s m á s o menos dependiendo de la concentración de acrilamida del gel de corrido. La realización del gel será diferente en función del tam año de la proteína a visua lizar, de manera que para proteínas de gran peso molecular se utilizará un porcentaje baj o de poliacrilamida (el gel poseerá poros de mayor tamaño) y viceversa. Los geles de poliac rilamida-SDS usados e n el presente trabajo han varia do del 10-14% de acrilamida. El gel de poliacrilamida-SDS puede realizarse en tampón glicina o en tampón tricina, en función del peso m olecular de las proteínas a separar. En es te trabajo se han utilizado geles de tricina al 14% y geles de glicina al 10%. Las cantidades de reactivos utilizados para preparar dichos geles se e specifican en la Tabla 2.15 y en la Tabla 2.16. Tabla 2.15. Relación de reacti vos y volúmenes necesarios para o btener geles de poliacrilamida-SDS (14% de acrilamida) en tampón Tricina. Reactivos Gel de Corrido ( Running ) Gel de Empaque ( Stacking ) Acrilamida + Bisacrilam ida (49,5%) 1,52 ml 2 02 µl Tris-HCl 2,5M pH 8 .45 1,8 ml 620 µl Agua 1,72 m l 1,64 m l SDS (10%) 47 µl 30 µl TEMED 10 µl 5 µl Persulfato A m ónico ( 50%) 10 µl 15 µl Tabla 2.16. Relación de reacti vos y volúmenes necesarios para o btener geles de poliacrilamida-SDS (10% de acrilamida) en tampón Glicina. Reactivos Gel de Corri do ( Running ) Gel de Empaque ( Stacking ) Bis/Acri lamida ( 40%) 2,5 m l 0,5 ml Running Buffer 2,5 m l 1,26 m l SDS (10%) 100 µl 25 µl Agua 4,86 m l 3,18 m l TEMED 20 µl 5 µl Persulfato A m ónico ( 50%) 20 µl 10 µl Antes de comenzar con la electrof oresis, las muestras se prepar aron ajustando la cantidad de proteína a cargar y se m ezclaron con el tampón de d isociación 8X, que contiene 2,3% de SDS, 10% de  -mercaptoetanol, 20% de glicerol y 0,005% de azul de bromofenol en un tampón de 10 mM Tris-HCl a pH 6,8. Posteriormente, estas muestras fueron cargadas en los geles y s e corrieron a un voltaje consta nte de 90 V, en el caso de usar el tampón tricina, o de 160V , si el tampón era glicina. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  112  Una vez terminada la electrofore sis, se transfirieron las prote ínas desde el gel hasta una m embrana de nitrocelulosa o P VDF (si la electroforesis es c on gel SDS-Urea). La transferencia se llevó a cabo usando el sistema en sándwich (Bi o-Rad), en una cubeta de tampón de transferencia, durante 90 min. a 310 mA. Una v ez ter minada l a transferencia, lavamos la m embrana con PBS, y bloqueamos con leche al 5% en 0, 1% (v/v) de Tween-20 en PBS 0,1 M (TPBS) pH 7,4 durante 30 minutos. Las proteínas tr ansferidas a la membrana se observan m ediante tinción con rojo Ponceau’s al 0,1 % en ácido acético 5%. A continuación, incubamos la membrana con el anticuerpo primario (en TPBS-leche al 1,5%) durante toda la noche a 4 °C. La relación de los antic uerpos empleados y sus características más relevantes se detallan en la Tabla 2.17. Te rminada la incubación, lavamos la m embrana con TPBS (3 x 5 m inutos) e incubamos en el anticuerpo secundario acoplado a la enzima peroxidasa de rábano, capaz de procesar un sustra to (ECL-plus) originando un producto quimiolum iniscente cuya señal será propo rcional a la cantidad de proteína específica de la muestra. La señal qu imiolum iniscente obtenida se revela en cuarto oscuro utilizando películas fotog ráficas (Hyperfil-ECL, Am ersha m; revelador y fijador Kodad). Todos los anticuerpos secundarios se incuban como mínim o durante 1 hora a temperatura ambiente en TPBS. La señal quimiolum iniscente es re cogida c on el sistema de captación IQ LAS 4000 mini gold. Finalmente, la intensidad de l as bandas de las películas se determinará utiliz ando el software PCBAS v 2.0 sobre las imágenes escaneadas (Epson 3200). Tabla 2.17. Marcadores detectados mediante Western-blot . Se indica la dilución de u so, el tamaño de la banda reconocida, el a nimal de ob tención y la referencia junto a la casa comercial. ANTICUERP O PRIMARIO DILUCIÓN DE USO BANDA RECONOCI DA ANIMAL DE OBTENCIÓN REFERENCI A Anti-A  (6E10) 1 :5000 4,5 kD a (1 m er) Ratón Sign et; Ref.: 6E10 Anti-AT 8 1:100 0 66 kDa Ratón Thermo-Scientific; ab34719 Anti-ChAT 1:1000 68 kDa Cabra Millipore; Ref.: AB144P Anti-Hsp2 7 1:10 00 2 7 kDa Conejo Sigma; SAB4 501456 Anti-Hsp6 0 1:1000 80 kDa Ratón Santa Cruz Biotech.; Ref.: sc-1052 Anti-Hsp7 0 1:50 00 7 0 kDa Conejo Neo m arkers; MA 3-028 Anti-LC3 1:1000 16 kDa (LC3 -I) 12 kD a (LC3-II) Con ejo Cell signaling ; 2775 Anti-Ubiquiti na 1:1000 66 kDa Ratón Therm o Scient ific; Ubi- 1 2.9.6. ELISA (Del inglés Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay) Esta técnica permite determinar cuantitativamente l a cantidad d e proteína presente en una muestra m ediante una reacción colorim étrica. Para llevarla a cabo son necesarios dos anticuerpos que reconozcan dos epítopos de una m isma proteína. El prim er anticuerpo se encuentra fijado a la base del pocillo y actúa com o anticuerpo de captura, mientras que el segundo actúa com o anticuerpo de d etección y será el encargado de desencadenar la Tesis  Doctor al  Material  y  método s  113  respuesta colorimétrica. Dicha señal colorimétrica se produce u tilizando, bien un anticuerpo de detección conjugado con HRP (peroxidasa de rábano ) (Kit ELISA A  x-42), o bien un anticuerpo secundario conjugado con HRP ( Kit ELISA A  40) que deberá reconocer al anticuerpo de detección. El primer paso es preparar la curva patrón con el estándar y el tampón de dilución suministrado por el kit. Seguidamente, preparam os nuestras m ues tras siguiendo las indicaciones de cada kit. Se añaden cada una de las muestras y las diferentes diluciones de l a c u r v a p a t r ó n a l o s p o c i l l o s d e l a p l a c a d e E L I S A q u e y a c o n t ienen el anticuerpo de captura unido. Se incuba toda la noche con el anticuerpo de det ección a 4 °C. Posteriormente, se hacen 4 l avados con el tampón de lavado del kit y se reincuba con el anticuerpo secundario durante 30 minutos a temperatura ambiente . Transcurrido este tiempo se repiten los 4 lavados y se incuba con la solución de cromógeno estabilizado durante 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. En este tiempo se generará color según la cantidad de proteína presente en l a muestra. Pasados 3 0 minutos añadimos una solución para parar la reacción en zimática y medim os la absorba ncia de cada punto. Los experimentos de comportam iento se llevaron a cabo en las in stalaciones de l Estabulario de la Universidad de Málaga, siempre en el periodo d e l u z d e l c i c l o d e luz/oscuridad y el experimentador fue siempre ciego al genotipo de los animales. Los animales se adaptaron d urante 6 días a las cond ic iones experime ntales antes de empezar las pruebas de com portamiento. Para minimizar el estrés, todos los animales se movieron a la habitación donde éstas se realizaban en su caja y se mantuviero n en la habitación de 2.10. Estudios de comportamiento Tesis  Doctor al  Material  y  método s  114  experimentación durante 1 hora para que se habituaran la nueva localización, posteriormente, fueron m anipul ados por el experimentador. 2.10.1. Estudios de comportamiento p ara el tratamiento de litio Todos los experimentos se llevaron a cabo con ratones macho de la mism a edad. Se utilizaron ratones WT (n=10), PS1 (n=10), PS1/APP control (n=9) y PS1/APP tratados con litio (n=9). 2.10.1.1. Prueba “Open Field” Esta prueba no sólo permite la habituación de los anim ales al l ugar donde luego realizarán la prueba de reconocimiento de objetos, sino también nos posibilita examinar la función motora al medir la activ idad locomotora espontánea. En esta prueba, los anim ales se sitúan en el centro de un recip iente cuadrado (45 x 45 cm) y se les deja explorar durante 5 minutos (Fig. 2.24). Entr e prueba y prueba, el recipiente se lim pia con etanol de 70 ° . La actividad locom otora es monitorizada (Ethovision, Noldus, The Netherl ands) y se cuantifica la distan cia recorrida y l a velocidad. 2.10.1.2. Prueba de reconocimiento de objetos Esta prueba se basa en la tendencia natural de los roedores a e xplorar objetos. Aquí, hemos utilizado un protocolo modificado (Davis y col., 2013), b asado en la preferencia por el “objeto fam iliar viejo” sobre el “objeto f amiliar reciente” y la preferencia por una nueva localización. Después de 60 minutos habituándose al open field , los anim ales se expusieron a 4 objetos idénticos con una forma triangular y los exploraron dur ante 10 minutos (muestra 1). Tras 2 horas, los ratones re cibieron una segunda muestra co n otros cuatros objetos idénticos entre sí, pero diferentes a los primeros (muestra 2). Esta segunda muestra fue explorada durante 10 m inutos. Tras 2 horas de intervalo, los ratones fueron sometidos a la prueba (test), que tuvo una duración de 5 minutos. En la prueba , dos objetos de ambas F i g u r a 2 . 2 4 . “ O p e n F i e l d Test”. El ratón se sitú a en el centro del recipiente y se deja explora r librem ente durante 5 minut os. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  115  muestras 1 y 2 (“familiar viejo” y “fam iliar reciente”, respect ivam ente) se colocaron en una configuración en form a de cua drado, de manera que un objeto viejo y uno reciente estaban pres entes en una posición familiar mientras que los otr os dos estaban desplazados a una nueva posición (Fig. 2.25). Todos los objetos fueron validado s, y se utilizaron de plástico para evitar preferencias por parte del animal debido al material de fabricación , y para facilitar la limpieza evitando señales por olor. Las dos muestras de objetos fueron diferentes en tamaño, forma y color. Tanto el recipiente donde se llevó a cab o la prueba, com o los objetos, se limpiaron con etanol de 70 ° entre prueba y prueba. El tiem po que pasó cada animal explorando cada objeto fue anali zado observacionalmente. De hecho, la medida básica fue el tiempo qu e pasó el ratón explorando el objeto durante las fases de muestra y durante la prueba (test). Se calcularon dos í ndices de discriminación para la prueba: la ratio de recon ocimiento de objeto (tiempo total explorando objetos “familiares viejos”/tiempo total de ex ploración) y la ratio de reconocimiento de localización (tiempo total explorando objetos desplazados/tiem po total de exploración). El tiempo fue registrado sólo cuando el ratón tocada el objeto con la nariz o con la uña. Dar vueltas alrededor, aproximarse al objeto o es tar cerca del mismo no se consideró exploración. Además, la actividad locomotora se midió también con el software Ethovision XT 7.0 (Noldus, The Netherlands). Figura 2.25. Protoc olo de la prueba de reconocimiento de objetos. Se muestran los tiempos u tilizados en cada una de las m uestras y la disp osición de los objetos en ést as. 2.10.2. Estudios de comportamiento en animales PS1/APP y PS1 a los 12 m eses de edad Para evaluar el daño cognitivo de l os animales tg PS1/APP y PS1 a los 12 meses de edad, se realizó una prueba de reconocimiento de objetos a esto s anim ales junto con animales WT de la mism a edad. El procedimiento que se siguió fu e e l m i s m o q u e e l descrito para los animales t ra tados con litio (ver Apdo. 2.10.1 .2), pero con la diferencia de que en este caso el test duró 10 minutos en lugar de 5 (Fig. 2. 25). El análisis de los resultados se llevó de la mism a forma descrita en el apartado a nterior. Tesis  Doctor al  Material  y  método s  116  En general, durante este estudio los v alores han sido represen t ados como la m edia del grupo ± la desviación estándar (S D). En l os estudios bioquímico s, l a mayoría de los datos se han expresado con respecto al gr upo control (WT, valor de referencia 1). El análisis estadístico de l os datos se realizó introduciendo l o s d a t o s e n e l p r o g r a m a estadístico Sigma Stat 3.5 (Advisory Statistics for Scientists) , m ediante el análisis de la varianza (ADEVA) de una o dos vías para estudiar las posibles d iferencias entre la edad y/o el genotipo estudiado, segui da d e los grados de libertad. P ara las pruebas post-hoc s e empleó la prueba de Tukey, Bonferroni o Newman-Keuls. Cuando la distribución de los datos segu ía una distribu ción norm al se realizó una prueba Kruskal-W allis. En los c asos en los que fue imposible utilizar pruebas de comparaciones múltipl es, se aplicó la prueba T de Student de dos colas ( prueba bilateral con intervalo de confian za del 95-99%). El nivel de significación en la s pruebas es de p<0,05, señalado con una estrella (*), p<0,01 señalado con dos estrellas (**), o p<0,001 señalado con tres (***). 2.11. Análisis estadístico de datos Tesis  Doctor al  Material  y  método s  117  2.12.1. Genotipado PS1 SECUE NCIA PRODUCT O DETECTADO TAMAÑO PS. F 5’ GCACAGAAAGGGAGTCAC AAG 3’ Transgén 450 pb PS. R 5’ TAA TTGGTCC ATAAAAGGC 3’ Myo.F 5’ TTACGTCCATC GTGGACAGC 3’ WT 250 pb Myo.R 5’ T GGGCTGGGT GTTTAGCCTTA 3’ REACTIVO (Concentración inicial) VOLUMEN CONCE NTRACIÓN FI NAL PS.F (10 µM) 2,5 µl 0,5 µM PS.R (10 µM ) 2,5 µl 0,5 µM MyO.F (1 0 µM) 2,5 µl 0,5 µM MyO.R ( 10 µM) 2,5 µl 0,5 µM dNTPs (10 µM ) 1 µl 0, 2 µM MgCl 2 (25 µM) 3 µl 1,5 mM Buffer 5x 10 µl Go Taq Fle xi DNA polymerase ( 5U/ µl) 0,25 µl H 2 O MilliQ 24,75 µl gADN 1 µl Volumen final 50µl CICLOS PCR: 1. 95 °C 15 min. 2. 94 °C 45 s. 3. 55 °C 45 s. 4. 72 °C 45 s. 2.12. Apéndice Tesis  Doctor al Resultado s  y  Discusión 220  We thus analyzed, at the hippocampal form ation, the SOM and NPY expression by qPCR; the number of SOM or NPY i mmunopositive som ata, by stereological quantification, and th eir axonal dystrophy loading. Li thium produced an effective prevention of the neurodegenerative proce ss exhibited by this neuronal population in PS1/APP mice (Fig. 3.3.3). In fact, the mR NA expression for both neuropeptides, SOM and NPY, was virtually identical in lithiu m -treated PS1/APP mice, as compared with control groups (Fig. 3.3.3A). Furthermore, ster eological determinati on of the SOM or NPY cell number (Fig. 3.3.3B and C) further dem ons trated the protective effect of lithium on these neurons in hippocampus proper (O-LM cel ls) and dentate gyrus (HIPP cells). PS1 and WT m ice displayed not differences and li thium treatm ent of PS1 mice did not alter the expression of either SOM or NPY neuropept ides (see Fig. 3.3.3A) or the num ber of SOM or NPY positive cells (data in Fig. 3 .3.3C were pooled from WT, PS1 control and lithium groups). For subsequent experiments, only PS1 control and PS1 lithium mice were included. The same samples were used for the stereo logical quantification of SOM or NPY cell number at the entorhinal cortex, another early affected br ain region. As previously reported (Moreno-Gonzalez et al., 2009), double transgenic mice displayed in this cortical region a significant decrease in the num ber of both SOM (4,207±1,119 cell/mm 3 , n=4, vs 8,596±803 cell/mm 3 , n=6, for control PS1/APP and PS1 mice, resp ectively, p<0.05; 52.2±13.1% of reduction) and NPY (1,770±227 cell/mm 3 , n=4, vs 3,062±363 cell/mm 3 , n=6, for control PS1/APP and PS1 m ice, resp ectively, p<0.05; 58.4±7.1% of reduction) immunopositive GABAergic cells. However, af ter lithium treatment, the num ber of both neuronal populations did not differ between PS1/APP and PS1 groups (7,087±1,097 cell/mm 3 or 3,003±423 cell/mm 3 , n=4, for SOM and NPY, respectively; 17.6±12.8% or 1.9±13.8% of reduction). Thus, early lithium intervention was highly effective pre venting the SOM/NPY neuronal loss in both the hippocampal form a tion and the e ntorhinal cortex of PS1/APP model. Another prominent pathological feature of this neuronal population in our PS1/APP mice is the extensive developm ent of axona l dystrophies associated to Abeta plaques (Sanchez-Varo et al., 2012) (Fig. 3.3.4). Impor tantly, lithium treatment produced, in parallel with the preven tion of the SOM/NPY cell loss, a prominent reduction of the axonal dystrophy pathology in these cells. In fact, lit hium treated PS1/APP mice displayed an obvious and highly significant decrease ( − 60.2%) in the NPY positive dystrophic area (Fig. 3.3.4A). Also, there was a decrease in th e AT8- and S OM-positive dystrophies (Fig. 3.3.4B). Therefore, lithium avoided SOM/NP Y neurodegeneration and im proved the cell integrity, reducing the axonal degeneration of this highly vulnera ble neuronal population. PS1control+lithium PS1/APPcontrol PS1/APPlithium S O M p o siti v e cells H i ppo c a m pus (to tal cell n u mb er) 0 100 00 200 00 300 00 400 00 500 00 600 00 De n t ate Girus (t otal cell numb e r) 0 2000 4000 6000 8000 1000 0 1200 0 W T/PS1 Contr ol+lit hium P S1xA PP Control P S1xA PP Lit h i u m Hi ppo c a m pus pr oper De nt a t e Gyr u s Tuk ey p<0 . 05 Tuke y p< 0.05 N PY p o si t i ve cel l s H i p poc ampus ( t ota l c e l l numbe r) 0 500 0 1000 0 1500 0 2000 0 2500 0 3000 0 D e nt at e G i ru s (t ot al c e l l nu m b er) 0 2 000 4 000 6 000 8 000 1 0000 1 2000 W T /P S 1 c o n t ro l + lith iu m PS 1 x A P P con t r ol PS 1 x A P P L i t hi um Hi ppo c a m pu s pr ope r D e n t at e G y r u s Tukey p<0. 05 Tu k e y p < 0. 05 Hippocampu s proper Dentate gyrus * * * * Hippocampu s proper Dentate gyrus Total cell number SOM  positive  cells NPY  positive  cells 60000 40000 20000 0 8000 4000 12000 0 Total cell number 0 10000 20000 30000 8000 4000 12000 0 B PS1/APP control PS1 control PS1/APP lithium so sp sr SOM NPY so sp sr so sp sr so sp sr so sp sr so sp sr b1 b2 b3 b4 b5 b6 Figure 3.3. 3. Lithium treatment avoid ed neuronal loss in the hippocampu s of PS1/APP mic e. (A) The expression of SOM and NPY ( n=20 mice per g roup) wa s signific antly lower in PS1/APP control group (AN OVA F(4,96)=49.63, p=0.00001 and F(4 ,96)=27.24, p=0.0001, for SOM and NPY r espectively, post-hoc Tukey *p<0. 05). WT, PS1 (co ntrol or lithium) and PS 1/A PP lithium dis played no differences . B) SOM (b1-b3) or N PY (b4-b6) immunolabe led sections through CA1 sub field of PS1 contro l or PS1/APP control and lith ium g roups. C) Total SOM or NPY cell number in hippocampus proper and dentate g yrus was assessed by s tereo logy (n=5 per genotype and treatmen t). WT and PS1 g rou ps d isplayed no differences and data were p ooled. Only con trol PS1/APP d isplayed a s ignificant reduction in SOM (ANOVA F (2,22)=14.57, p=0.00002 o r F (2.22)=11.84, p=0.0008 for hippocampus p roper and dentate gyrus, respectively) and N PY (ANOVA F (2 ,22)=17.02, p=0.0001 or F(2 ,22)=6.87, p=0.008 for h ippocampus proper and dentate gyr us, respective ly) c ell nu mber, follo wed by Tukey post-hoc m ultiple compa rison test *p<0 .05. Scale bars: b1-b6, 100 μ m. so, s tratum oriens ;s p , stratum pyramidale ;s r , stratum radiat um . A SOM E x p r es si o n W T P S 1 C o n t r o l P S 1 L i t h i u m P S 1 x A P P C o n t r o l P S 1 x A P P L i t h i u m SOM (relat ive unit s) 0 1 Tu k e y p< 0 . 0 5 Tukey p< 0.05 N PY Ex press ion W T P S 1 C o n t r o l P S 1 L i t h i u m P S 1 x A P P C o n t r o l P S 1 x A P P L i t h i u m NPY ( Relat ive Un tis) 0 1 T u key p < 0. 05 SOM (relative units) NPY (relative units) * * 0 1 0 1 WT PS1control PS1lithium PS1/APPcontrol PS1/APPlithium C Figure 3. 3.4. Lithium tre atment reduc ed dystrophi c pathology in the hippo campus of P S1/APP mice. A) NPY-positive dys trophies (blac k arrows) in C A1 subfield of PS1/APP control ( a1) and lithium mice (a2 ) (open arrows: NPY ce ll bodies). (a3) Quantitative analysis (n=4 m ice per group; 6 sections per anima l) demonstrated the exis tence of a significant reduc tion of NPY-positive d ystrophic area ( μ m2) in PS 1/APP lithium. B) Co-localizati on of SOM (green) an d AT8 (re d) in dystrop hies asse ssed using confocal micros cop y. In PS1/APP contro l mice (b1 to b3), SOM positive dys trophies (arro ws), surround ing Abeta plaque (aster isk), w ere positive for AT8. L ithium produced a reduction in both SOM (b4) and AT8 (b5 ) positive dystroph ies and in the co-localization between SOM and AT8 in dystr ophies (b6) . Scale bars: a1 and a2, 100 μ m; b1-b6, 20 μ m. so , stratum o riens ;s p , stratu m pyram idale ;s r , stratum radiatum . A Control Litihium a2 a1 so sp so sp sr a3 NPY po si tiv e d ystro ph ie s in C A 1 C on t r o l Li t hi um NPY dys t ro ph ic a rea (  m2 ) 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 p = 0 . 000 3 d3 p=0.0003 NPY positive dystrophies in CA1 Control Lithium NPY dystorphic area (  m 2 ) 0 2000 4000 6000 B Control Lithium b1 b2 b3 b4 b5 b6 * * SOM AT 8 Mer ged 1000 3000 5000 Tesis  Doctor al Resultado s  y  Discusión 223  3.3.3. Lithium treatment ameliorated axon al/synaptic pathology by reducing abnormal intracellular protein accumulation PS1/APP mice accumulated phospho-tau, LC3 -II and u biquitinated proteins in axonal dystrophies surrounding Abeta plaques (F ig. 3.3.5-3.3.6; see also Sanchez-Varo et al., 2012; Torres et al., 2012). Thus, in agre ement with the preservation of SOM/NPY neurons, lithium also reduced both the total AT 8-positive p hospho-tau levels, determined by western blots (Fig. 3.3.5A), and the AT8-positive dystrophies, detected by immunohistochemistry (Fig. 3.3.5B). Furtherm or e, lithium also reduced the steady-state levels of both LC3-II and ubiquitinated proteins (see Fig. 3.3.6A). In fact, the steady-state levels of both LC3-II and ubiquitinated pro teins were similar to those observed in the PS1 lithium group. Immunohistochemistry also de monstrated a dram atic reduction in both ubiquitin- and LC3-positive dystrophies, surro unding the Abeta plaques (Fig. 3.3.6B). Thus, lithium reduced the num ber of dystrophi es and the accum ula tion of intracellular proteins. This lithium-mediated reduction of the axonal dystrophic pathology could also ameliorate the synaptic degene ration. Thus, we determ ined (by western blots) the levels of the classic presynaptic marker synaptophys in (not shown). Control PS1/APP mice displayed a consistent and significant reduction (0.72±0.12 vs 1.00±0.14 for PS1/APP and PS1 control, respectively, n=7 per phenotype, Tukey p<0.05) whereas a completely recovery was detected in lithium-treated PS1/A PP mice (0 .96±0.16 for PS1/APP lithium , n=9). Taken together, these data indicated that the chronic lithium trea tment m arkedly reduced the plaque associat ed axonal dystrophy pathology, in parallel with a reduction on the abnormal intracellular accum ulation of protei ns and/o r autophagic vesicles, in this PS1/APP model. Furthermore, lithium al so decreased the putative presynaptic degeneration observed in this transgenic mouse model. 3.3.4. Lithium treatment substantially modifi ed the morphology and toxicity of the extracellular Abeta plaques Next, we tested whether lith ium treatm ent could alte r Abeta accumulation in PS1/APP hippocampus. Data (Table 3.3.1) indicate d the absence of m odi fications on either i) total monom eric Abeta (quantified by we stern blot and 6E10 antibody), ii) soluble Abeta42 (quantified by ELISA using solub le extracts) or iii) Abeta plaque load (determined using either anti-Abeta42 or 6E 10 antibodies). However, we did observe a highly significant reduction ( − 62.7%) in th e size of the Abeta plaques in lithium-treated PS1/APP mice, as compared with PS1/APP control group (Fig. 3.3.7A and quantitatively in b1). In fact, when the di stribution of the different si zes of the Abeta p laques was analyzed (Fig. 3.3.7b2), the treated group displa yed a marked increase (4 fold) in the number of sm all plaques (<200 μ m 2 ), with the consequent re duction in the number of B Control Lithium b1 b2 b4 b3 * * * * * * * A PS1/APP Li PS1/APP Control PS1 B ‐ actina 50 AT 8  ‐ Actin AT8 PS 1 P S1APP C o n tr o l PS1A PP L i th i u m Relati v e units 0 1 2 3 4 Tukey p<0 . 05 Relative Units PS1 PS1APP  Li PS1APP  Control AT 8 * Figure 3. 3.5. Lithium treatment re duced the dy strophic pathol ogy as sociated to Abeta plaques . A) Representa tive western blot (n =7 mice per group) and quantitative analys is of phosphorylated tau, determined us ing AT8 clone, of total prote ins from PS1 control, PS1 /APP control and PS1/APP lithium - treated mice. For quantifica tion, the AT8 levels we re r eferred to PS1 control group. The AT8 le vels were s ignificantly increased in PS1/APP control mice (ANOVA F(2,18)=22 .66, p =0.0001; Tukey *p<0.05) wher eas PS1 control and PS1/APP lith ium di s played no differences. B) R epresentative AT8 positive dys trophies surrounding Abeta plaques fro m control (b1 and b2) or lithium trea ted (b3 and b4) PS1/APP mice. Scale bars: b1 and b3, 50 μ m; b2 and b4, 100 μ m. A B Control Lithium Ubiquitin/Congo R ed b1 b2 so sp sr LC3/Congo Red so sp sr so sp sr b3 b4 so sp sr PS1/APP CL i C Li PS1 170 120 80 50 40 28  -Actin LC3-II Ubiquitin Lithium effect on LC 3- II an d Ub- p ro te in s P S1 Control PS1 Lithium PS 1 A PP Control PS 1 APP Lithium Re la tiv e U n its 0 1 2 3 4 5 6 7 LC3- II Ubi q ui tin Tukey p< 0.05 Tukey p<0.05 Tukey p<0. 05 Tukey p< 0.05 Tukey p<0. 05 Lithium effect on LC3-II and Ub-proteins Ubiquitin Relative Units PS1 Lithium PS1 Control PS1/APP Control PS1APP Lithium * * * * * Figure 3.3.6. Lithium treatment reduced t he dy strophic pathology associated to Abeta plaques. A) Representative western b lots and quantitative analysis of stead y-state levels of LC3- II and ubiquitinated protein s in PS1 and PS1/APP contro l and treated mice ( n=4 per genotype and treatment). A c lear and sign ificant accumulation of bo th LC3-II (ANO VA F(3,12)=32.52, p= 0.001) and ubiquitinated proteins (AN OVA (F(3,12)=63 .67, p=0.00001) was obse rved in P S1/APP control m ice. Lithium treatment reve rsed this pathology. The post-hoc analysis , u sing Tukey test *p <0.05, was indica ted in the figure. B) Ub iquitin (b1 and b2) and LC3 (b3 and b4) i mmunolabeled hippocampal sections (counters tained with Congo red for Abeta plaques ) of control and lithium tr eated PS1/APP mice cor roborated the accumulation of both marke rs, associated w ith dystrophic neurites su rrounding amylo id plaques (b1 and b3) and the patent lithium reduction (b2 and b4) in the presence of ubiquitin and LC3 pos itive dystrophies. Inse rts in b1-b4 showed higher magnification deta ils of the dys trophies surrounding Abe ta plaques. Scale bars : b1 to b4, 200 μ m; insets, 25 μ m. so, stratum oriens ;s p , stratum pyramidale ;s r , stratum radiatum . Tesis  Doctor al Resultado s  y  Discusión 226  medium and large size Ab eta plaques. Table 3.3.1. Abeta accumulati on was not mo difie d in the lithium treated PS1/APP mice. Data are mean±SD. Control Lithium Soluble Abeta42 ELISA 27.57±10 .74 3 0.14±6.47 (pg/m l) n = 7 n = 7 Total Abeta Western blots 1.0±0. 26 0.98±0.60 (relative units) 6E10 n = 18 n = 25 Abeta load Imm unohistochemi stry 6.83± 1.99 4.40±1.81 (% of area) 6E10 n = 5 n = 5 Abe ta42 load Imm unohistochem istry 5.09± 2.31 3.65±1.03 (% of area) Abeta 42 n = 5 n = 5 This reduction of plaque size, in absence of a p arallel reduction on the total Abeta deposition, could arise of a higher Abeta compaction. Inte restingly, higher plaque compaction could reduce the Abeta pathology (Cohen et al., 2009). W e thus determined the plaque compaction by quantifying the op tical density of Abeta42 immunostained plaques, randomly selected by the stereol ogical m icroscope (n=800 plaques from 5 different sections and 6 differe nt control or treated mice; see Cohen et al., 2009). Although the plaque compaction was heterogeneous in both groups (Figure 3.3.8A), our data demonstrated the existence of a highly increase (82%) in the plaque com paction (calculated as Pixels / μ m 2 ) in the lithium treated PS1/APP m ice (Fig. 3.3.8B). The increase in plaque com paction could i nvolve a reduction of the putative toxic oligomeric Abeta that surrounded or aroused from plaques (the plaque “halo”; Koffie et al., 2009). To quantitatively determine this possibi lity, the Abeta plaques were first stained with Thioflavin S followed by immunostaining with the conformation-specific OC antibody, which recognizes fibrillar Abeta oligom ers. Representative double labeled images, and the quantification of the plaque oligom eric halo, is shown in Fig. 3.3.9 (a1 to a6, and a7, respectively). As expected, lith ium treatm ent produced a significant reduction of the OC-positive plaq ue halo which might resu lt in less toxic plaques. To examine the im pact of lithium treatment on the toxic ity of the Abeta plaques, we quantified the NPY dystrophic area and th e corresponding Abeta area in individual plaques. Using unbiased stereological c ounts in NPY and 6E10 double immunostained sections (Fig. 3.3.10A), we first calculated th e proportion of Abeta plaques devoid of NPYdystrophies. As shown, treated PS1/APP mice displayed a small, but significant, increase in the proportion of plaques without associated NPY dystrophies (Fig. 3.3.10B). More relevant, when the NPY dystrophic ar ea was normalized by the corresponding Abeta plaque area, we observed a s ubstantial reduction of the NPY dystrophic area per plaque in the treated PS1/APP m ice (Fig. 3.3.10C). Since this reduction of the dyst rophic area could just reflect the decrease in plaque size, we also plotted single NPY-dystrophic area versus the corresponding Abeta plaque area, for both control and treated PS1/APP mice. As A Control a1 Lithium sp so sr a2 sp so sr Figure 3.3. 7. Lithium treatment reduc ed the size of the extracellul ar Abeta plaques . Lithium treatment reduced the s ize of Abeta deposits. Plaques were im munostained wi th anti-Abeta42 antibody. Representa tive images (a1 and a2 ) and quantitative analysis (b1 and b2) of Abe ta plaque size from the CA1 subfield of control and lith ium-treated PS1/APP mice. (b1 ) The individual plaque size ( μ m2) was quantitatively as sessed from 25 sections o f 6 different control or lith ium treated PS1/APP mice . (b2) The plaque s ize distribu tion was determined by calculating the nu mber of plaques falling into distinct area categories (ranging f rom <200 μ m2 to >2000 μ m2 ). For each category, the differ ence between control and lithiu m was deter mined by t-tes t, *p<0.05. Scale bars : A, 200 μ m. so, stratum oriens ;s p , stratum pyramidale ;s r , stratum radiat um . Ab et a P l aqu e Si ze Cont r ol Li t hi um Pla q u e Siz e (  m2 ) 100 0 200 0 300 0 400 0 500 0 p = 0. 000 001 a3 p=0.000001 0 2000 4000 Plaque size (  m 2 ) 1000 3000 5000 Pl aque Si ze Di st r i buti on Pl a q ue Si z e (  m2 ) <200 200-500 500 - 2000 >200 0 N umber Plaque s /  m2 0 20 40 60 80 100 120 C ont r ol Li t h i um p<0. 0 5 p<0. 0 5 p<0. 0 5 p<0. 0 5 a4 * * * * 0 40 120 Number Plaques/  m 2 80 Plaque size (  m 2 ) 100 60 20 PS1/APPcontrol PS1/APPlithium B b1 b2 Figu re 3.3.8. Lithiu m treatme nt increased the comp action of th e extracellular Abeta plaq ues. A) Lithium treatment inc reased the Abeta plaque compac tion. Signal density of Abeta42 immunostained plaques from control (a1, a2) and lithium-treated (a3, a4) mice we re measured in the CA1 subfie ld of hippocampus. B) Optica l densities (pixe l/ μ m2) o f plaques from 5 sections/mo use and 5 mice per group was represe nte d in the graph. Scale bars: A, 25 μ m. A Control Lithium a1 a2 a4 a3 Plaque Compaction Co nt ro l L i t hi um Pi xel s /  m2 0 1 2 3 4 p = 0 . 000 00 6 b5 Plaques/  m 2 p=0.000006 Control Lithium B Thio-S A  (OC) Merge Control Lithium A a1 a2 a3 a4 a5 a6 Figure 3.3. 9. Lithium treatment reduc ed the oligomeric halo of the extrace llular Abeta plaque s. Plaque oligomer ic halo, cons idered as the d iffer ence between OC - and Thio -S-s tained areas w as reduced by lithiu m. Plaques were sequentially s taining with Thio -S and the OC antibody. (a1-a6 ) Representative images of a similar s ize plaque in the CA1 reg ion of control (a1-a3 ) or lithium-t reated (a4-a6) mice show ing the plaque halo. (B) S imilar size plaques (< 200 μ m2) we re analyzed (15 plaques per animal, n=3 mice per group). S cale bars: A, 20 μ m. B OC-immunopositive ThioS n egative Plaque halo C o ntr o l L ithi um Abeta plaque hal o (  m2 ) 0 50 100 150 200 250 p = 0. 00 7 c7 Abeta plaque halo (  m 2 ) 0 100 200 p=0.007 Control Lithium 50 150 250 Tesis  Doctor al Resultado s  y  Discusión 236  oligomeric halo (which is recognized by the conformation specific polyclonal OC antibody) of the Abeta plaques, thus diminishing the plaque toxicity. The processes contributing in the Abeta a ggregation, plaque formation or plaque compaction are actually unknown. It has been suggested that astroc ytes could play a prominent role by lim iting the plaque gr owth and the plaque-associated dystrophy formation (Ojha et al., 2011; Kraft et al., 2013). Moreover, activated astrocytes m ay release, among different factors, Hsps (Re nkawek et al., 1994; Tayl or et al., 2007), which could induce the Abeta aggregation, reducing its potential toxicity (Ojha et al., 2011; Mannini et al., 2012; Cascella et al., 2013). In agreement with thes e data, our results strongly suggest the involvement of astrocytes and extracellular Hsps as m ediators of the lithium effect on plaque toxicity. In f act, we demonstrate sim ultaneous higher astrocyte activation with higher incorpora tion of Hsps in the Abeta plaques and reduced oligomeric plaque halo in lithium treated PS1/APP m ice, co mpared with controls. It is noteworthy the lithium-dependent in crease of Hsp70 and Hsp27 in the p laque core. Although further experiments should be done, this particular lo calization suggests that these Hsps could be implicated in the Abeta nucle ation and plaque compaction. CONCLUSION Our data demonstrate that the early chronic lithium treatment signif icantly ameliorates the patho logical progress ion in this PS1/APP AD model. Lithium could reduce neuronal/axonal degeneration by increasing the Abeta compaction and, in consequence, producing smaller Abeta plaques with lower to xic halo. Lithium could influence directly neurons but, as we have shown in this wor k, this compound has a novel therapeutic effect through astrocytes inducing chaperones releas e which have the capacity to modulate the Abeta compaction /toxicity. To the best of our knowledge, this is the first tim e that this therapeutic eff ect of lithium on Abeta plaque quality has been reported. T hese data reveal a novel lithium-mediated m echanism capable of altering the course of the disease in an amyloidogenic AD model. These Abeta-m odi fying mechanism might represent an innovative therapeutic approach to the, so fa r, continuing negative outcomes of AD clinical trials aimed to clear A beta plaques once they have already formed, and to the current inability to prevent plaqu es from forming in the first place. RESULTADOS SUPLEMENT ARIOS: EL TRATAMIENTO CON LITIO PROTEGE DE LA DEGENERACIÓN COLINÉR G ICA EN MODELOS DE ALZHEIMER Con posterioridad a la publicación de estos resu ltados, se realizó un nuevo tratamiento con cloruro de litio en anim ales PS1/APP igual al descrito (ver Apdo. 2.1.1) en los experimentos anteriores de este bloque de Resultados, pero en este caso el tratamiento tuvo una duración de 3 meses (desde los 9 a lo s 12 m eses de edad de los animales). Por Tesis  Doctor al Resultado s  y  Discusión 237  tanto, se inició antes de la pérdida de células coliné rgicas en los núcleos del telencéf alo basal y de la alteración de sus terminales en el plexo de la capa yuxtapiramidal de CA1, que como se ha descrito en el Bloque 3.2. de Resultados y Discusi ón, tiene lugar a los 12 meses en los anim ales PS1/APP, PS1 y TAU. En este experi mento se utilizaron cinco grupo de animales: W T sin tratar, PS1 control (sin tratam iento), PS1 litio, PS1/APP control y PS1/APP tratados con litio, y el objetivo fu e analizar el efecto terapéutico de este tratamiento en fases avanzadas de la patolog ía, y en concreto, teniendo en cuenta el proceso neurodegenerativo tardío de la población colinérgica, nos centramos en el posible efecto neuroprotector del tratamiento sobre es ta población neuronal de l telencéf alo basal. En primer lugar, se procedió a analizar la densidad num érica de células colinérgicas en el NBM (Fig. Suplementaria 1). Se cu antificó sólo este núcleo debido a que disponíamos de hem icerebros, ya que el otro hemicerebro se utiliz ó para los estudios bioquímicos y moleculares. Por la disposición del sep tum medial y el núcle o vertical de la banda diagonal de Broca, en la línea media de l cerebro, fue difícil conservarlo en todos los hemicerebros, por lo que nos lim itamos a est udiar la población colinérgica del NBM. La cuantificación estereológica (tam año del frame : 926,39  m 2 ; 40% de área escaneada) de las células ChAT-positivas del NBM reveló qu e el tratamiento con litio evitaba la pérdida neuronal observada en los anim ales PS1/APP a los 12 meses de edad y descrita en el Bloque 3.2 de Resultados y Discusión de esta Te sis. Se observa una reducción significativa en el número de células/mm 3 en los animales PS 1 y PS1/APP control con respecto a lo s WT (–26,01±0,16%) y un incremento del 25,37±10,16% e n los animales PS1/APP litio con respecto a los PS1/APP sin tratar (n=4, 5 secciones/anim al; ADEVA de 1 vía, post- hoc de Tukey, ***p<0,001, **p<0,01). Otro de los eventos patológicos relaciona dos con la población co linérgica descritos en esta Tesis, es la alteración del plexo colinérgico de la capa yuxtapiram idal de CA1 en determinados m odelos tg de la EA (PS1/APP, PS1 y TAU). El tratamie nto con litio en los animales PS1/APP redujo dicha alteración (Fi g. Suplem entaria 2). La inmunohistoquímica para ChAT en secciones de hipocampo, contrate ñidas con rojo congo para la visualización de las placas fibrilares de Abeta, mostró una m ayor inmunorreactividad en el plexo yuxtapiramidal en los anim ales PS1/APP litio qu e en aquéllos sin trat ar. Esto estaría en concordancia con el efecto protector del litio s obre la población neuronal colinérgica, y a que al proteger a las neuronas de la degene ración, se evitará tam bié n la degeneración del plexo axonal en las regiones dian a. Por otro lado, se puede observar como el tratamiento con litio provocó una marcada reducción de la patolog ía distrófica coli nérgica, ya que se apreció una menor cantidad de neuritas distró ficas positivas para ChAT alrededor de las placas de A  en los anim ales PS1/APP tratados que en aquéllos sin tratar (ver detalles en Fig. Suplementaria 2C). 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 WT PS1 mant PS1/APP mant PS1/APPl i *** ** *** ** DN (células/mm 3 ) T ratamiento con litio: 9-12 meses (NBM) control control litio PS1/APP control PS1/APP litio A B1 B2 Figura Suple mentaria 1. El tratami ento con litio ev ita la pé rdida neuron al colin érgica en el NB M de rat ones PS1/ APP. A) Dens idad numérica (célu las/mm 3 ) p a r aC h A Te ne lN B M ,a l o s1 2 meses de edad, obtenida mediante estereología. Los grupos PS1 y PS1/APP contro l mostraron una reducción significativa en e l número de células ChAT, mientras que no se detectaron cambios entre los animales W T y los PS1/APP tratados con litio (WT vs PS1/APP control: – 26,01±0,16%; PS1/APP control vs PS1/APP litio: + 25,37±10,16%). B) Sec ciones del NBM inmunoteñidas con anti-ChAT de animales PS1/APP con trol (B1) y tratado con litio ( B2). Datos representados med iante la media±SD y analizados por un ADEVA de 1 vía (F(3,12) =16,98, p=0,0001) , seguido de un post-hoc de Tukey, ***p <0,001, **p<0,01. n=4 por gr upo, 5 secciones por animal. Barras de escala: 200  m. –26,01 % +25,37 % B PS1/APP control PS1/APP litio A1 A2 Figu ra Suplementaria 2. El tratamient o con litio pro mueve la protección de los plexos axonal es col inérgicos y dism inuy e la formación de distrofias en e l hipocampo de ani mal es PS1/APP. Secciones hipocampa les inmunoteñidas pa ra ChAT (con contra tinción de rojo congo para las palcas de Abeta) de ratones PS1 /APP controles (A1) y tratados con litio (A2). Se observó un aumento de la inervación co linérgica hipoca mpal en l os anima les tratados (A2 y detalle en B2) en comparac ión con los no tratados (A1 y de talle en B1). Asimis mo, se observa una reducc ión en la patología distr ófica colinérgica con el tr atamiento (flechas negras en A1 y A2); ver de talles de placas con distro fias en animales no tratados (C1) y tr atados (C2 y C3). Ba rras de escala: A, 200  m; B-C, 50  m. so, st ratum oriens ;s p : stratum pyram idal ;s r : st ratum rad iatum ;s l m : strat um lacunosum- moleculare . B1 B2 so sp sr slm so sp sr C1 C2 C3 T ratamiento con litio: 9-12 meses (Hipocampo) Tesis  Doctor al Resultado s  y  Discusión 240  En relación con la recuperación de los te rminales colin érgicos en el hipocam po de los anim ales PS1/APP tratados con litio, ev aluam os los niveles del marcador ChAT mediante W estern- blot en el hipocampo de anim ales PS1 control y PS1 litio (Fig. Suplementaria 3). Así, se observó que el tratam iento con litio recupera los niveles hipocampales de ChAT en los animales PS1, no obteniéndose diferenc ias significativas en dichos niveles entre los anim ales WT y PS1 tratados c on litio, mientras que si se obtuvieron diferencias significativas entre lo s anim ales WT y PS1 sin tratar (n=3 animales/grupo; ADEVA de 1 vía, post-hoc de Tukey, *p<0,05) No se determinaron los niveles d e ChAT en los animales PS1/APP tratados y sin tratar ya que, como se mostró en el Apdo. 3.2. de Resultados, no se observaron diferencias en los niveles de ChAT entre los animales WT y PS1/APP a los 12 m eses de edad, debido, probablemente a la g ran cantida d de distrofias colinérgicas pr esente en el hipocampo de los animales PS1/APP a esta edad, que podría enm a scarar la reducción de los niveles de ChAT medidos por WB. Hubiese sido muy interesante analizar por estereología la población de neuronas colinérgicas en los animales PS1 tratados con litio, si n embargo todos los animales se destin aron a estudios moleculares, ya que el sacrifico de los m ismos fue con anterioridad al conocimiento de la existenc ia de perdida neuronal colinérgica en este modelo transgénico. Se plantea la posibilidad de repetir este expe rimento para incluir animales PS1 y TAU y com probar el efecto neuroprotector del litio en los grupos colinérgicos de estos modelos. Este efecto neuroprotector de l litio sobre la población colinérgica podría explicarse por la acción inhibitoria de esta fármaco sobre la enzim a GSK-3  (quinasa de Tau) y por tanto, por la reducción de la fosforilación de Tau (Bhat y col., 2004; Avila y col., 2010; Hernandez y col., 2013). La menor fosforilación de Tau se relaciona con una mejora del citoesqueleto y el transporte axonal, y por tanto con una menor form ación de distrofias y una menor degeneración neuronal (L eroy y col., 2012). Como se ha descrito en el Bloque 3.2. de Resultados, ex iste una relación entre la hiperfosforilación de Tau y la disfunción colinérgica, que podría explicar el efecto beneficioso del tratamiento con litio sobre la preser vación de esta población neuronal. Y es que, aunque las causas de la degeneración coliné rgica no se conocen aún, se ha descrito que esta población muestra degeneración neur ofibrilar (Sassin y co l., 2000), acum ulando Tau fosforilado y ovillos neurofibrilares en los estadios tempranos de la enferm edad (Mesulam y col., 2004). 0 0,5 1 1,5 2 1 Figura Suplem entaria 3. El tratamie nto con litio ev ita la pé rdida hipocamp al de ChAT en el modelo tran sgénico P S1. Western-blo t rep resentativo de los niveles de C hAT en el hipocampo de animales W T, PS1 litio y PS1 con trol (A) a los 12 meses de edad. La cuantificac ión (B) reveló una recuperac ión de los niveles de ChAT en los animales PS1 tra tados con litio, mient ras que se obtuvieron diferenc ias significativas entre los anima les WT y PS1 control. Los datos se representa ron como la media±SD y se analizaron por un A DEVA de 1 vía ( F(2,39)=8,90, p= 0,0007), seguido de un post-hoc de Tukey, *p<0,05. n=3 animales por grupo. WT PS1 Litio PS1 Control ChAT  -Actin 50- WT * Unidades relativas PS1litio PS1control A B T ratamiento con litio: 9-12 meses (Hipocampo) Tesis  Doctor al Resultado s  y  Discusión 242  REFERENCES Araujo F, Tan S , Ruano D, Sch oemaker H, Benavides J, Vi torica J. (1996). Molecular and pharm acological characterization of native cortical gam ma-aminobuty ric acid(A) rece ptors containi ng bot h alpha(1 ) and alpha(3) s ubuni ts. J Biol Chem., 271:27902–27911. 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Tesis  Doctor al Resultado s  y  Discusión 245  INTRODUCCIÓN La asociación entre la enfermedad de Alzh eimer y los niveles de colesterol en sangre ha crecido en la última década (ver revisi ones Maulik y col., 2013; Barone y col., 2014), proponiéndose la llamada hipótesis del colesterol de la EA. La prim era evidencia de esta relación fue hallada por Sparks y col. (1990) al observar que los pacientes con enfermedad coronaria avanzada tenían placas sen iles similares a las obs ervadas en los pacientes de la EA. Posteriormente, proporcionaron la prim era prueba de que el colesterol puede influir en la producción de A  , mostrando que una dieta rica en colesterol provocab a la formación de placas en el cerebro de conejos (Sparks y col., 1994). A partir de ahí, se han de sarrollado estudio s epidemiológicos que estab lecen que la hipercolesterolem ia en la edad adulta se correlaciona con un incremento en el riesgo de padecer EA (Ricciarelli y col ., 2012), proponiéndose el colester ol como un factor de riesgo de la enfermedad (Pappolla y col., 2003). Por otro lado, los estudios epidem iológicos han mostrado una disminución en la prevalencia de la EA en pacientes tratados con estatinas, fármacos utilizados para reducir los niveles de colesterol (Wood y col., 2014). En este sentido, el estudio Rotterdam (Haag y col., 2009) , m ostró que las estatinas se correlacionan con una reducción de ca si el 50% en el rie sgo de padecer Alzheimer. Resultados positivos también fueron obtenidos en un ensayo clínico en fase II con atorvastatina (Sparks y col., 3.4. Evaluación preclínica en un modelo transgénico de Alzheimer del potencial terapéutico de una nueva estatina 0% 20% 40% 60% 80% 100% GRUPO  AG R U P O  BG R U P O  C % placas C Grupo A Grupo B Grupo C <200   m 2 200 ‐ 500 500 ‐ 1000 >1000 Grupo A Grupo C A1 A2 so sp sr slm Figu ra 3.4.4. Es tudio del ef ecto de NST0037 sobre la cant idad y ta maño d e las placas fibrila res en CA1. A) La tinción con Tiofla vina S en la región CA1 del hipocampo mues tra un descenso en la cantidad de placas (p lacas/mm 2 ) en el grupo A ( A1) comparado con el g rupo control ( A2). La cantidad de p lacas (B) es más a lta en el grupo control que en los grupos tratados para todos los rangos de ta maño analizados (<200  m 2 , 200 -500  m 2 , 500-1000  m 2 y >1000  m 2 ). No se observaro n cambios en los p orcentaje s de la s placas por tamaño entre los diferentes grupos ( C). Los datos representan la med ia±SD y fueron analizados por un ADEVA de 1 vía (placas/ mm 2 F(11,84) =43,61, p<0,000 1; %placas F (11,84)=287,1, p<0,0001), s e g u i d od eu n pos t-hoc Tukey, ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05. n=5- 11 por grupo, 5 secciones por animal. Barr as de escala: A1-A2, 200  m. so: st ratum oriens ;s p : stra tu m pyramida el ;s r : s tratum r adiatum ;s l m : stra tum lacunosum- molecular e . A 0 10 20 30 40 50 60 70 <200  mm 2 200 ‐ 500 500 ‐ 1000 >100 0 * *** ** *** *** *** placas/mm 2 B *** *** *** *** ** Gru po A Gru po B Grupo C Rango de tamaños (  m 2 ) CA1 GD a so sp sr slm g h m A B C Grupo A Grupo B Grupo C Figu ra 3.4.5. El tra tamiento co n el compuest o NST0037 reduce not ablemente la carga de A  42. El tratam iento pro vocó un patente descenso en la acumulación e xtracelular de A  42 en el hipocampo de los ani males tratados (A y B) en comparac ión con el grupo control (C) . Imágenes a mayores au mentos de CA1 y GD (r ectángulo blanco) se muestran en la Fig. 3.4.6 . Como se pued e ver en las imágenes de detalle (D , E y F) las placas de los anima les tratados (D y E) eran mas compac tas (más densas) que en el grupo cont rol (F). Barras de escala: A-C, 50 0  m; D-F, 50  m. GD: g iro dentado; a: alveus ;s o : stra tum oriens ;s p : strat um pyramidale ;s r : s tratum rad iatum ;s l m : s tratum lacunosum- moleculare ;m : capa molecular; g: capa granular; h: hilio. D E F FTO 40X PLACA GRUPO B E D 0 5 10 15 20 25 30 *** –35,86 % –50,13% Carga de A  42 en CA1 C 0 5 10 15 20 25 30 *** –32,26 % –18,71 % Carga de A  42 en GD Gru po A Grupo B Grup o C Grupo A CA1 GD B1 B2 m g h A1 A2 so sp sr Grupo C slm Figura 3.4. 6. El tratamiento con e l compuesto NST0 037 r educe la c arga de A  42 en el hipocampo del m odelo PS 1/APP. T anto e n la región CA1 (A, C) como en el GD (B, D) se observa una marcada reducción en la carga de A  42 en e l grupo A (A1-B1) co mparado con el grupo cont rol (A2- B2) (ca rga en CA1 en relac ión al grupo C: –35,86±16 ,83% en el grupo A; –50,13±18,21% en el B; carga en el GD en re lación al grupo C: –18,71±9,35% en A; –32,26±20,34% en B) . Lo s datos representan la media±SD y fueron analiz ados mediante un ADEVA de 1 vía (C A1 F(2,100)= 39,42, p<0,0001; GD F(2 ,101)=25,78, p<0,0001), seguido de un post-hoc de Tuke y, ***p<0,001. n =5-11 por grupo, 5 secciones por anima l. Barras de escala: A-B, 200  m. GD: g iro denta do; so: stra tum oriens ; sp: stratum pyram idale ;s r : st ratum rad iatum ;s l m : s tratum l acunosum- molecula re ; m: capa molecular; g: capa granu lar; h: hilio. Gru po A Grupo B Grupo C A *** 0 5 10 15 20 25 30 35 40 –39,40 % –41,75 % Grupo A Grupo C C1 C2 D1 D2 Figu ra 3.4.7. El trata miento c on NST0037 red uce la carga amiloide en el subíc ulo del mode lo PS1/APP. A) El tratamiento provocó una dis minución significa tiva en la carga amiloide del subiculum comparada con l a carga de A  42 presente en los ani males con trol (en r elación con el grupo C : – 41,75±22,00% para el grupo A; –39,40±16,06% para B). B -D) En la tin ción inmunohistoquímica se observa una menor ca rga amiloide en el grupo A ( B1, C1, D1) en co mparación con el grupo C (B2, C2, D2) . Los datos muestran la med ia ±SD y fueron analizados mediante un ADEVA de 1 vía (F( 2,67)=22,81, p<0,0001), s eguido de un post-hoc de Tukey, ***p <0,001. n=5-11 por g rupo, 4 secciones por ani mal. Barras de escala: B1-B2 , 500  m; C1-C 2, 100  m; D1-D2, 50  m. SUB: subiculum . Carga de A  42 en el subículo B1 B2 Grupo A Grupo C CA1 SUB Tesis  Doctor al Resultado s  y  Discusión 256  resultados revelaron una m arcada disminuci ón en dicha carga (n=5-11, 4 secciones/an imal; ADEVA de 1 vía, post-hoc de Tukey, ***p<0,001; Fig. 3.4.7A) en los grupos A (– 41,75±22,00%) y B (–39,40±16,06%) respecto al gr upo C. Del mismo m odo a lo que se apreció en el hipocampo, se observa una m ayor compactación de las placas en el subículo de los animales tratados y una menor inm unotinción general de es ta región (Fig. 3.4.7C- D). Para complem entar el estudio de la pato logía am iloide se empleó el anticuerpo OC que reconoce las formas oligoméricas del A  y, por tanto, de mayor potencial tóx ico (Fig. 3.4.8). Con este inmunom arcaje se encontró, de la misma manera que ya se había observado para el A  fibrilar y el A  42, una reducción muy notable en la cantidad de depósitos oligoméricos en los anim ales tratad os (se analizó el grupo A como representante de los animales tratados) tanto en el ár ea CA1 del hipocampo (Fig. 3.4.8A1-B1) como en el giro dentado (Fig. 3.4.8A2-B2), indica ndo que este tratamiento conduce a una m enor toxicidad del péptido A  , como se intuía por la menor com pactación de las placas inmunoteñidas con A  42, observada tanto en el hi pocampo (Fig. 3.4.5) como en el subículo (Fig. 3.4.7). 3.4.2. Efecto neuroprotector del tratamiento con NST0037 El siguiente paso consistió en analizar el efecto protector del tr atamiento, ya que la EA se caracteriza por una pérd ida neuronal y sináptica, junto con una patología axonal que se visualiza como neuritas distróficas. Sin em bargo, una de las princi pales limitaciones del uso de modelos anim ales de la EA es la ausencia de muerte neuronal. No obstante, aunque en este modelo PS1d9/APP no hay una pé rdida neuronal m asiva, algunas poblaciones muestran déficits significativos, como las cateco laminérgicas del locus coeruleus (O’Neil y col., 2007) y las interneuronas del hipocam po (Popovic y col., 2008; Takahashi y col., 2010). Datos no publicados de nuestro grupo, además han puesto de m anifiesto que existe una pérdida de interneuronas so matostatina en el hipocam po, y una pérdida de las células colinérgicas de los núcleos basales en este modelo (presente trabajo, ver Apdo. 3.2 de Resultados y Discusión). 3.4.2.1. El tratamiento con NST0037 redujo la acumulación de ne uritas distróficas La presencia de neuritas distróficas cons tituy e, junto con la apar ición de los depósitos de A  y los ovillos neurofibrilares, una lesión histo patológica de la EA (Góm ez- Isla y col., 2008). Además, esta patología ne urítica ha sido reconoc ida como uno de los primeros indicadores de la enferm edad (S u y col., 1998; Dickson y col., 1999; Dickson y Vickers, 2001), y es también uno de los primeros eventos patológicos que acontecen en los distintos m odelos transgénicos del Alzheim er (ver revisión Duyckaer ts y col., 2008). Las neuritas distróficas se observan como grandes dilataciones de procesos , principalmente de Figura 3. 4.8. E l tratamiento con NST0 037 p roduce una di sminución de los d epósitos de Abeta oligomérico. Como se observa para la inmunohistoquímica con el anticuerpo OC ( Abeta oligomé rico), e l grupo A muestra una reducción en la cantidad de depósitos OC-pos itivos, tanto en CA1 (A1 ) como en el GD (A2) en co mparación con el grupo C (B1 y B2) . Barras de escala: 200  m. GD: giro den tado; so: s tratum oriens ;s p : strat um pyramidale ;s r : str atum r adia tum ;s l m : strat um lacunosum- moleculare ; m: capa molecular; g: capa granular; h : hilio. OC (A  oligomérico) CA1 GD so sp sr slm m g h A1 A2 B1 B2 Grupo A Grupo C Tesis  Doctor al Resultado s  y  Discusión 258  naturaleza axonal/presináptica, al rededor de las placas amilo ides. La existencia de neuritas distróficas apoya la existencia de un proceso neurodegenera tivo temprano en este modelo animal. El inmunom arcaje con el anticuerpo para el fragmento C-term inal de APP, que reconoce tanto la forma completa de la APP como a sus fragmentos C-term inales (CTFs), muestra la localización de APP tanto en el so ma como en las porciones proxim ales de las dendritas apicales de las célul as piramidales de CA1 (Fig. 3.4.9B), y con menor intensidad en las células granulares del giro denta do (Fig. 3.4.9C). Adem ás, se apreció un intenso marcaje de las fibras m usgosas desde la región hilar hasta el stratum lu cidum de CA3 (Fig. 3.4.9). Se observan, adem ás, neuritas distrófi cas APP-positivas alrededor de las placas amiloides (detalles en Fig. 3.4.9D), que aum ent aban en número y tamaño en los animales no tratados (Fig. 3.4.9B y C). La estrecha asocia ción existente entre las neuritas distróficas y los depósitos de A  ha sido evidenciada en muestras hum anas y en otros modelos transgénicos (Su y col., 1998; Dickson y col., 1999; Woodhouse y col., 2009; Sanchez- Varo y col., 2012; Gowrishankar y col., 2015). La cuantificación estereológica (tamaño del frame : 918,43  m 2 ; 20% del área escaneada) de la densidad de distrofias APP-positiv as (número de neuritas dis tróficas APP/mm 3 ; Fig. 3.4.10C) mostró una dismi nución significativa (n=5-11, 4-5 secciones/anim al; ADEVA de 1 vía, post-hoc de Tukey, *p<0,05) en los grupos tratados (con respecto al grupo C: –44,50±23,10% en el grupo A y –37,29±22,13% en el grupo B) en el área CA1, que queda patente en las im ágenes (Fig. 3.4.10A-B). El análisis de corre lación entre la densidad numéric a de las distrofias APP-positivas y la carga amiloide pa ra A  42 en los tres grupos analiza dos, reveló una correlación positiva entre am bos parámetros indicando una re lación caus al entre la s placas y el daño axonal (Fig. 3.4.11; n=5-11, 5 secciones/an imal). 3.4.2.2. El tratamiento con NST0037 redujo la acumulación de vesículas autofágicas en las neuritas distróficas Para ver la naturaleza au tofágica de las vesículas acumuladas en las neuritas distróficas, se realizó una inmunotinción a m icroscopía óptica para LC3b, ampliam ente utilizado como m arcador de autofagia. La au tofagia (aquí se consid erará autofagia a la macroautofagia; ver revisión Arias y Cuervo, 2 011) es un proceso en el que se forman vesículas de doble membrana que rodean una porción de citosol (autofagosoma) y que, mediante transporte retrógrado, son di rigidas a fusionarse con los lisosom as (autolisosomas), donde su contenido es dige rido. El llam ado “flujo autofágico” (Chu, 2006) consiste en el eq uilibrio entre la form ac ión de los autofagosom as y su posterior eliminación por los lisosom as, de manera que si se produce un incorr ecto funcionamiento del tráfico vesicular o de la función lisosom al, las vesícu las autofágicas se acum ulan, Grupo A Grupo C C1 C2 A1 A2 B1 B2 D1 D2 D3 D4 so sp sr slm m g h CA1 GD CA2/3 D1 D2 D3 D4 Figu ra 3.4.9. El tratamient o con la estatina N ST0037 reduce la pato logía axonal asociada a placas. I mágenes representa tivas de secc iones hipocampales inmunoteñidas con un anticuerpo pa ra APP ( c ontra tinción con ro jo congo para las pla cas de A  ) de ratones del grupo control (grupo C) y tr atados (grupo A ). Se observa una reducción en e l número de placas ro jo congo positiva s (flechas b lancas) y en la cantidad d e distrofia s APP-positivas que se asocian a d ichas placas asociadas con e llas en CA1 (B1- B2) y e l GD (C 1- C 2) del grupo tra tado. D) Detalles de placas rodeadas por distrofias APP-pos itivas. Barras de escala: A, 1000  m; B-C, 200  m; D, 25  m. GD: g iro dentado; so: stratum o riens ;s p : stratum pyramid ale ;s r : strat um r adiatum ;s l m : stratum la cunosum-mole culare ; m: capa molecular; g: capa granular; h: hilio. so sp sr slm sm g h 0 40000 80000 120000 160000 200000 * –44,50 % –37,29 % DN (neuritas APP/mm 3 ) Gru po A G rupo B G rupo C C A1 A2 A3 Grupo A Grupo B Grupo C B1 B2 Figu ra 3.4.10. El t ratamient o con NST0037 re duce significa tivamente la cant idad de dist rofias axonales. A-B) Imágenes r epresentativas para el inmunoma rcaje con APP (marcado r de distrofias ) en secciones de CA1 de los grupos A ( A1), B (A2) y C (A3) . C) La cuantificación estereológica mostró una reducción significativa en la densidad numé rica de distr ofias APP en los g rupo s de ani males tratados (en re lación con el grupo C: –44,50±23,10% para e l grupo A; –37,29±22,13% para C). Los datos se representan co mo la media± SD, y fuer on analizados mediante un ADEVA de 1 vía ( F(2,21 )=6,297, p=0,0072) , seguido de un post-hoc de Tukey, *p<0,05. n=5 -11 por grupo, 4-5 secciones por ani mal. Barra s de escala: A, 500  m; B, 50  m. so: s tratum oriens ;s p : stratum p yramidale ;s r : st ratum rad iatum ; slm: stra tum lacu nosum-molecular e. so sp sr slm R² = 0,8598 0 50000 100000 150000 200000 250000 0 1 02 03 0 Carga amiloide para A  42 DN (neuritas/mm 3 ) p<0,05 R = 0,93 A R² = 0,8097 0 50000 100000 150000 200000 250000 01 0 2 0 3 0 p<0,001 R = 0,90 B Carga amiloide para A  42 DN (neuritas/mm 3 ) R² = 0,5196 0 50000 100000 150000 200000 250000 01 0 2 0 3 0 p<0,05 R = 0,72 C Carga amiloide para A  42 DN (neuritas/mm 3 ) 0 50000 100000 150000 200000 250000 01 0 2 0 3 0 p<0,001 R 2 = 0,720 R = 0,85 Carga amiloide para A  42 DN (neuritas/mm 3 ) D Figura 3.4.11. Correlaci ón positiva entre la carga de Abeta y las distrofias APP. Gru po A Gru po B Gru po C Tesis  Doctor al Resultado s  y  Discusión 268  Por tanto, el tratamiento con el com pue sto NST0037 evitó la neurodegeneración de células SOM y mejoró la in tegridad celular, reducie ndo la degeneración axonal. 3.4.2.4. El tratamiento con NST0037 no pr eviene la pérdida de neuronas colinérgicas, aunque sí la formación de distrofias axonales Como se ha descrito en el Capítulo 3.2 de Resultados y Discusión, existe una pérdida significativa de la población colinér gica en los núcleos basales ( s eptum medial, núcleo vertical de la banda diagona l de Broca y núcleo basal de Meynert) de este modelo transgénico PS1d9/APP. Aunque otros autores no han descrito una disminución en el número de células ChAT m edido por densidad óptica en las estructuras del telen céfalo basal de este modelo, si se ha descrito una pérdida de actividad de la enzim a ChAT en corteza e hipocampo (Pérez y col., 2007) y una reducción de los niveles de acetilcolina (Zhang y col., 2012). Asimismo, se han observa do distrofias colinérgicas en corteza e hipocampo a partir de los 2-3 m ese s de edad (Pérez y col., 2007). En la Fig. 3.4.15 se observa el patrón de inmunomarcaje del hipocam po con el anticuerpo para ChAT (A), enzim a de síntesis de la acetilco lina, colinac etiltransferasa (de l inglés Cholin-Acetyl-Transferase ), apreciándose un plexo sobre la capa piramidal de CA1, como se ha descrito previam ente en el Apdo. 3.2 de Resultados y Discusión. Se observan, además, distrofias para este m arcador alre dedor de las placas (teñ idas con rojo congo; Fig.3.4.15B). Se ha analizado cuantitativam ente el plexo de la capa piramidal (n=5 -11, 5 secciones/anim al; ADEVA de 1 vía, post-hoc de Tukey, p>0,05), y no se ha observado ningún cambio con el tratamiento (F ig. 3.4.16A y C). Sin embargo, sí que se ha observado una disminución en las distrofias para Ch AT (n=5-11, 5 secciones/anim al; ADEVA de 1 vía, post-hoc de Tukey, ***p<0,001) con el tratamiento. Esta disminución (Fig. 3.4.16B) es más patente en el grupo A (–53,29±28,23% con respecto a C) que en el grupo B (– 36,67±28,48% con respecto a C). La disminución en las distrofias colinérgicas tam bién fue patente en el subículo de estos animal es (Fig. 3.4.17) (con respecto al grupo C: – 58,54±17,51% en el grupo A; –48,70±16,24% en el grupo B; n=5-11, 5 secciones/anim al; ADEVA de 1 vía, post-hoc de Tukey, ***p<0,001; Fig. 3.4.17B). Las distrofias se encontraban, predominantem ente, alrededor de áreas inmunonegativas, que corresponden a placas amiloides. No obstante, esta dism inuc ión en la cantidad de distrofias c on el tratamiento no parece preven ir la pérdida de trasmisión colin érgica en el plexo yuxtapiramidal de CA1 com o ya hemos comentado (Fig. 3.4.16C). El tratamiento no previene la pérdida neur onal en el núcleo basal de Meynert, ya que la cuantificación estereológica (tamaño del frame : 918,43  m 2 ; 40% del área escanead a) de la densidad numérica de esta población (númer o de célu las/mm 3 ), no m ostró cambios significativos entre los tres grupos de est udios (Fig. 3.4.18), mostrando una ausencia de Grupo A Grupo C B1 B2 B3 A1 A2 B2 B3 Figu ra 3.4.15. El tratamient o con NST0037 disminuye la pat ología axonal colinérg ica en el hipocampo. Secciones hipocampa les de los grupos tratados A (A1) y C (A2) inmunoteñidas con un anticuerpo para ChAT . Se observó un descenso en l a cantidad de neur itas distró ficas para ChAT con el tratam iento. Estas dis trofias están localizadas alrededor de las placas de Abeta (teñidas con rojo congo; para deta lles ver B ). Barra s de escala: A, 500  m; B1 y B4, 50  m; B2 y B3, 25  m. GD: giro dentado; so: st ratum oriens ;s p : stratum pyramid ale ;s r : s tratum rad iatum ;s l m : stra tum lacunosu m- moleculare ; m: capa molecular; g: capa granular; h: hilio. so sr slm m g h sp CA1 GD CA2/3 B4 0 20 40 60 80 Fibras ChAT en la capa yuxtapiramidal (% ) C 0 0,1 0,2 0,3 0,4 *** Distrofias colinérgicas en CA1 (% ) –53,29 % –36,67 % B Gru po A Gru po B Gru po C so sp sr slm A1 A2 A3 Grupo A Grupo B Grupo C * * * * * * * * Figura 3.4 .16. E studio cuantitativo de la patolog ía axonal c olinérgi ca en la región de CA1 . A) Secciones de CA1 inmunoma rcadas con anti-ChAT de animales de grupos tratados (A1-A2) y c ontrol (A3). Se observa un descenso en e l número de distr ofias ChAT -positivas ( flechas) con el tratam iento. B) Esta obser vación fue corroborada cuantita tivamente (en rela ción con el grupo C : –53,29±28,23% para el g rupo A; y –36,67±28,48% para B ). C) Sin embargo, no se obser varon cambios en el plexo colinérgico localizado en la regi ón yuxtapiramidal del stratu m oriens de C A1 ( detalle inserto en A1, delimitado por la línea blanca). Los datos se representan como la med ia±SD y fue ron an alizados por un ADEVA de 1 vía (pa ra B, F(2,114) =14,11, p<0,0001; para C, F(2,114)=2,730, p= 0.0695), seguido de un post-hoc de Tuke y: para B, ** *p<0,001; para C, p>0,05 . n=5-11 por g rupo, 5 secc iones por anima l. Barra s de escala: A, 200  m; deta lles e inse rto en A1, 50  m. so: s tratum or iens ;s p : stra tum pyramidale ;s r : stratum radiatum ;s l m : stratum l acunosum-mole culare . sp so 1 2 3 1 2 3 B Gru po A Gru po B Gru po C 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 *** –58,54 % –48,70 % Distrofias ChAT subiculares ( % ) A2 Grupo C * * * * * * * * A1 Grupo A * * * * Figura 3.4. 17. Estudio c uantitativo de la patología a xonal coliné rgica e n el subículo. A) Se detectó un descenso en el nú mero de distrofias ChAT -positivas ( flechas blancas) en los grupos tratados (A1) re specto al grupo control ( A2). Las dis trofias se di sponían alrededor de las placas de Abeta (as teriscos ). B) Esta obse rvación fue co rroborada por la cuantificación del porcentaje del á rea subicula r ocupadas por distro fias ChAT (en re lación al grupo control C : –58,57 ±17 ,51% en el grupo A; –48,70±16,24% en el B) . Los datos se representan median te la media±SD y fue ron analizados mediante un AD EVA de 1 vía ( F(2,93)= 28,49, p<0,0001), segu ido de un post-hoc de Tukey, ***p<0,001. n=5-11 por grupo, 5 secciones por animal. Barras de e scala: A, 200  m; detalles, 50  m. * * * 1 2 1 2 Figura 3.4.1 8. El tratamiento con NST0037 no pr otege a la población colinérgica del núcleo basal de Meyner t. A-B) Imágenes de micr oscopía de campo claro de neuronas ChAT en el núc leo basal de Meyner t. El número de somas ChAT (fle chas blancas; detalles en B) fue simi lar en los grupos tratados (A1 y A2) y en el gr upo control (A3 ). C) No se detecta ron diferencia s en la densidad numéric a (célula s/mm 3 ) de células ChAT en el NBM entre los tres grupos de estudios (tra tados y sin tratar ). La línea discontinua indica e l valor de la densidad numér ica de las células colinérg icas de los WT de 12 meses (15003,59±1642,47 células /mm 3 ). Los datos se represen tan como la med ia±SD, y fueron analizados med iante un ADEVA de 1 vía (F (2,19)=0,4104, p=0,6692) , seguido de un post-hoc de Tukey, p >0,05. n=5-11 por g rupo, 2 secciones por anima l. Barras de esca la: A, 200  m; B1, 100  m; B2-B3, 50  m. A1 A2 A3 Grupo A Grupo B Grupo C B1 B2 B3 DN (células/mm 3 ) C Gru po A Grupo B G rupo C 0 5000 10000 15000 1 WT 12 meses Tesis  Doctor al Resultado s  y  Discusión 273  efecto neuroprotector de este tratamient o sobre la población co linérgica (n=5-11, 2 secciones/anim al; ADEVA de 1 vía, post-hoc de Tukey, p>0,05). No obstante, es de destacar, que las células del NBM proyectan a la corteza y no al hipocampo, aunque es de esperar que no haya diferencias en las cé lulas del SM y de VDB (que proyectan a hipocampo), pues no hay diferencias de com por tamiento entre los diferentes nú cleos colinérgicos del telencéfalo basal analizados en el Capítulo 3.2 de Resultados y Discusión. En este caso, solo hemos podido analizar la población colinérgica del N BM debido a que solo disponemos de hem icerebros sagitale s para inmunohistoquím ica, ya que el otro hemicerebro fue destinado a los estudios m o leculares. El co rte por la línea media del cerebro para obtener dos hem i cerebros daña la zona del septum m edial y no puede ser utilizada para estudios microscóp icos. DISCUSIÓN Numerosos estudios ep idemiológicos y clínicos en pacientes tratado s con estatinas han mostrado una redu cción en el riesgo de pa decer Alzheimer y dem e ncia (ver revisiones Silva y col., 2013; Barone y col., 2014; Wood y col., 2014). Además, pacientes de la EA tratados con estatinas han presentado una mejo ra de la función cogni tiva y de las m arcas neuropatológicas d e la enfermedad, com o las placas neu ríticas y los NFTs (Sparks y col., 2006; Li y col., 2007). Hay pruebas de que las estatinas pueden tener propiedades pleiotrópicas independientes de su efecto sobre el colesterol, como la inhibición de la producción de intermediarios isoprenoides (Col e y col., 2005), la elim inación de péptidos de A  (Glebov y Wlater, 2012), efectos sobre la m icroglía (Kuipers y col., 2006), efectos antioxidantes (Shishehbor y col., 2003) y efectos antiapoptóticos (Zacco y col., 2003; Tanaka y col., 2004). En el presente trabaj o hemos demostrado que la administración crónica en la dieta de una nueva estatina (n o com ercial), redujo sig nificativamente la acumulación extracelular de placas de A  y el proceso neurode generativo de ciertas poblaciones neuronales, en el modelo transgénico PS1d9/APP. La acumulación de A  se considera un evento central en la pato logía de la EA (Hardy y Selkoe, 2002), ya que, por diversos mecanism os, es capaz de inducir alteraciones neuríticas, pérdida/disfunción siná ptica y, finalm ente, muerte neuronal. En el modelo PS1d9/APP la aparición de estos depósitos extracelulares de A  sucede a edades m uy tempranas (4 m eses; Jankowsky y col., 2004; García-Alloza y col., 2006), siendo el hipocampo un área severam ente afectada. Además , la apar ición de los depósitos amiloide s está, en efecto, acompañada de activación glia l (Ruan y col., 2009), distrofias axonales (Kurt y col., 2003), déficits cognitivos (Jankowsky y col. , 2001; 2004) y de un proceso selectivo de pérdida neuronal (O’N eil y col., 2007; Popovic y col., 2008). [Document text truncated for crawler view.]