Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida

Tesis Doctoral Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida Carolina Gutiérrez Repiso Málaga, 2015 AUTOR: Carolina Gutiérrez Repiso EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está sujeta a una licencia Creative Commons: Reconocimiento - No comercial - SinObraDerivada (cc-by-nc-nd): Http://creativecommons.org/licences/by-nc-nd/3.0/es Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es Dr. Federico J. Casimiro-Soriguer Escofet y Dr. Eduardo García Fuentes: CERTIFICAN: Que el trabajo que se expone en la memoria de la Tesis Doctoral realizada por Carolina Gutiérrez Repiso con el título “Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida” se ha realizado en el Laboratorio de Investigación del Hospital Regional Universitario de Málaga integrado en el Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), correspondiendo fielmente a los resultados obtenidos. La presente memoria ha sido revisada bajo nuestra dirección, considerando que tiene el contenido y rigor científico necesario para ser sometida a juicio por el tribunal nombrado por la Universidad de Málaga para optar al grado de Doctor. Y para que conste, en cumplimiento de las disposiciones legalmente vigentes a los efectos oportunos, firmamos el presente certificado: Director de la tesis: Director de la tesis: Dr. Federico J. Dr. Eduardo García Fuentes Casimiro Soriguer Escofet Dr. Manuel García Caballero, Catedrático de Cirugía de la Universidad de Málaga. CERTIFICA: Que el trabajo que se expone en la memoria de la Tesis Doctoral realizada por Carolina Gutiérrez Repiso con el título “Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida” ha sido realizado en el Laboratorio de Investigación del Hospital Regional Universitario de Málaga integrado en el Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), correspondiendo fielmente a los resultados obtenidos. La presente memoria ha sido revisada bajo mi tutela, considerando que tiene el contenido y rigor científico necesario para ser sometida al juicio del tribunal nombrado por la Universidad de Málaga para optar al grado de Doctor. Y para que conste, en cumplimiento de las disposiciones legalmente vigentes a los efectos oportunos, firmo el presente certificado: Tutor de la tesis: Dr. Manuel García Caballero Yo, Carolina Gutiérrez Repiso declaro que soy la autora del presente trabajo de investigación titulado “Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida” que ha sido realizado en el Laboratorio de Investigación del Hospital Regional Universitario de Málaga integrado en el Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), bajo la dirección del Dr. Federico J. Casimiro Soriguer Escofet y el Dr. Eduardo García Fuentes. Y para que así conste, firmo el presente certificado: Carolina Gutiérrez Repiso 17 Glosario de abreviaturas _________________________________________ 21 1. Introducción _______________________________________________ 27 1.1 OBESIDAD: CONCEPTO, CAUSAS Y PATOLOGÍAS ASOCIADAS __________ 29 1.1.1 Evolución del hombre hacia la obesidad extrema ________________________ 29 1.1.2 Concepto de obesidad _____________________________________________ 30 1.1.3 Causas de la obesidad ______________________________________________ 30 1.1.4 Clasificación de la obesidad _________________________________________ 36 1.1.5 Concepto de Obesidad Mórbida _____________________________________ 38 1.1.6 Patologías asociadas a la obesidad ___________________________________ 38 1.1.7 Tratamiento de la obesidad _________________________________________ 47 1.1.8 Cirugía de la Obesidad Mórbida ______________________________________ 47 1.1.9 Cirugía metabólica ________________________________________________ 52 1.2 INTESTINO DELGADO _________________________________________ 61 1.2.1 Morfología del intestino delgado _____________________________________ 61 1.2.2 Absorción, síntesis y secreción de triglicéridos __________________________ 67 1.2.3 Papel del intestino en la dislipemia ___________________________________ 82 1.2.4 Papel del intestino en la resistencia a la insulina ________________________ 85 1.3 LIPOGÉNESIS DE NOVO ________________________________________ 89 1.3.1 Complejo piruvato deshidrogenasa (PDH) ______________________________ 91 1.3.2 ATP citrato liasa (ACL) ______________________________________________ 92 1.3.3 Acetil-CoA carboxilasa (ACC) ________________________________________ 93 1.3.4 Ácido graso sintetasa (FAS) _________________________________________ 93 1.3.5 SREBP-1c ________________________________________________________ 94 1.4 GLUCONEOGÉNESIS __________________________________________ 97 1.4.1 Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) ____________________________ 100 1.4.2 Fructosa 1,6-bifosfatasa (FBPasa) ___________________________________ 101 1.4.3 Glucosa 6-fosfatasa (G6Pasa) _______________________________________ 102 1.4.4 Glutaminasa ____________________________________________________ 103 1.4.5 Regulación de la gluconeogénesis ___________________________________ 104 1.4.6 Gluconeogenesis intestinal _________________________________________ 108 2. Hipótesis y Objetivos _______________________________________ 111 2.1 Hipótesis y objetivos _________________________________________ 113 2.1.1 Hipótesis _______________________________________________________ 113 18 2.1.2 Objetivos _______________________________________________________ 114 3. Material y Métodos ________________________________________ 115 3.1 Diseño y sujetos del estudio ___________________________________ 117 3.1.1 Diseño del estudio _______________________________________________ 117 3.1.2 Sujetos del estudio _______________________________________________ 117 3.1.3 Variables de estudio ______________________________________________ 118 3.1.4 Obtención de las muestras de yeyuno ________________________________ 121 3.1.5 Aislamiento e incubación de IECs ____________________________________ 125 3.1.6 Determinación de los niveles de expresión de los genes candidatos ________ 128 3.1.7 Análisis estadístico _______________________________________________ 133 4. Resultados _______________________________________________ 137 4.1 Características generales _____________________________________ 139 4.2 Variables bioquímicas ________________________________________ 140 4.3 Contenido lipídico del yeyuno _________________________________ 140 4.4 Niveles de expresión relativa de los genes implicados en el metabolismo hidrocarbonado y lipídico __________________________________________________ 143 4.4.1 Lipogénesis de novo y síntesis de triglicéridos y quilomicrones ____________ 143 4.4.2 Gluconeogénesis intestinal _________________________________________ 149 4.4.3 Señalización de la insulina _________________________________________ 153 4.5 Caracterización fenotípica y viabilidad de las IECs aisladas __________ 157 4.5.1 Caracterización fenotípica de las IECs ________________________________ 157 4.5.2 Viabilidad de las IECs aisladas ______________________________________ 157 4.6 Efecto de la glucosa e insulina sobre la expresión relativa de los genes estudiados __________________________________________________________ 158 4.6.1 Efecto de la insulina y glucosa sobre los niveles de expresión relativa de los genes implicados en la lipogénesis de novo y la síntesis de quilomicrones __________________ 158 4.6.2 Efecto de la insulina y glucosa sobre los niveles de expresión relativa SREBP-1c _ _______________________________________________________________ 161 4.6.3 Efecto de la insulina y glucosa sobre los niveles de expresión relativa de los genes implicados en la gluconeogénesis intestinal ____________________________________ 162 4.6.4 Efecto de la insulina y glucosa sobre los niveles de expresión relativa de los genes implicados en la señalización de la insulina _____________________________________ 164 19 4.7 Efecto de la leptina sobre la expresión relativa de los genes estudiados 165 4.7.1 Efecto de la leptina sobre la expresión relativa de los genes implicados en la lipogénesis de novo y la síntesis de quilomicrones _____________________________________ 166 4.7.2 Efecto de la leptina sobre la expresión relativa de SREBP-1c ______________ 168 4.7.3 Efecto de la leptina sobre la expresión relativa de los genes implicados en la gluconeogénesis _______________________________________________________________ 168 4.7.4 Efecto de la leptina sobre los genes implicados en la ruta de señalización de la insulina _______________________________________________________________ 169 5. Discusión _________________________________________________ 171 5.1 Lipogénesis de novo y síntesis de quilomicrones ___________________ 173 5.2 Gluconeogénesis ____________________________________________ 181 5.3 Cascada de señalización de la insulina ___________________________ 187 6. Conclusiones ______________________________________________ 191 6.1.1 Lipogénesis de novo y síntesis de quilomicrones________________________ 193 6.1.2 Glucogenogénesis ________________________________________________ 194 6.1.3 Cascada de señalización de la insulina ________________________________ 195 7. Bibliografía _______________________________________________ 197 8. Anexo ___________________________________________________ 225 21 Glosario de abreviaturas Glosario de abreviaturasGlosario de abreviaturas Glosario de abreviaturas 23 2-MAG: 2-monoacilglicerol ACC: acetil-CoA carboxilasa ACL: ATP citrato liasa ADN: ácido desoxirribonucleico Apo B-48: apolipoproteína B-48 Apo B-100: apoliproteína B-100 Apo A-I: apolipoproteína A-I Apo A-IV: apolipoproteína A-IV Apo C: apolipoproteína C Apo C-II: apolipoproteína C-II Apo C-III: apolipoproteía C-III Apo E: apolipoproteína E ARNm: ARN mensajero BME: β-mercaptoetanol CEPT: proteína de transferencia de ésteres de colesterol DAG: diacilglicerol DE: desviación estándar DGAT: acil CoA: diacilglicerol-acil-transferasa DM2: diabetes mellitus tipo 2 EEM: error estándar de la media ELISA: inmunoensayo enzimático Elovl-6: elongasa de ácidos grasos de cadena larga tipo 6 24 FABP: proteína de unión a ácidos grasos FABPpm: proteína de unión a ácidos grasos de membrana plasmática FATP: proteína transportadora de ácidos grasos FAS: ácido graso sintetasa FBPasa: fructosa 1,6-bifosfatasa FTO: gen asociado a la masa grasa y a la obesidad G6Pasa: glucosa-6-fosfatasa GIP: péptido insulinotrópico dependiente de la glucosa GLP1: péptido similar al glucagón tipo 1 GLS: glutaminasa HbA1c: hemoglobina glicosilada HDL-c: lipoproteína de alta densidad HOMA-IR: modelo de evaluación homeostática para determinar la resistencia a insulina HSPG: proteoglicano de heparán sulfato IEC: célula epitelial intestinal I-FABP: proteína de unión a ácidos grasos intestinal IMC: Índice de masa corporal IRS-1: sustrato del receptor de insulina-1 L-FABP: proteína de unión a ácidos grasos hepática LDL-c: lipoproteína de baja densidad LepR: receptor de la leptina 25 LPL: lipoproteína lipasa LRP: proteína relacionada con el receptor LDL MAG: monoacilglicerol o monoglicérido MC4R: receptor de la melanocortina MGAT: acil-coenzima A monoacilglicerol aciltransferasa MTP: proteína de transferencia microsomal OM: obesos mórbidos OM-alta IR: obesos mórbidos con alta resistencia a la insulina OM-baja IR: obesos mórbidos con baja resistencia a la insulina OM-DM2-met: obesos mórbidos con tratamiento con metformina OMS: Organización Mundial de la Salud PC: piruvato carboxilasa PCTV: vesícula transportadora de prequilomicrones PDH: complejo piruvato deshidrogenasa PDHB: piruvato deshidrogenasa subunidad beta PEPCK: fosfoenolpiruvato carboxiquinasa PI3K: fosfatidilinositol-3-quinasa PLTP: proteína de transferencia de fosfolípidos RYGB: bypass gástrico en Y de Roux SCD-1: esteaoril-CoA desaturasa-1 SECO: Sociedad Española de Cirugía de la Obesidad SEEDO: Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 32 desequilibrio continuo entre ingesta y gasto energético contribuye a la obesidad, aunque también influyen factores como la distribución de los macronutrientes en la dieta (Hall y cols., 2012), los componentes del gasto energético (Blaak, 2009) y el metabolismo de nutrientes específicos (Wycherley y cols., 2012). De los numerosos factores que están implicados en el desarrollo de la obesidad nos vamos a centrar en aquellos detallados en la Figura 1. 1.1.3.1 Factores genéticos Numerosos estudios han mostrado la influencia de factores genéticos en el desarrollo de la obesidad. Los estudios realizados en niños adoptados sugieren que el índice de masa corporal (IMC) de un niño adoptado está correlacionado con el de sus padres biológicos en mayor medida que con sus padres adoptivos. Los estudios realizados en gemelos demuestran una alta heredabilidad de la obesidad y la importancia de las diferencias genéticas (Naukkarinen y cols., 2012). Las interacciones gen-ambiente, gen-dieta y gen-gen contribuyen no sólo a las diferencias en el desarrollo de la obesidad, también a la repuesta a los tratamientos y a la intervención. El componente genético de la obesidad podría explicar entre un 40% y un 70% de su varianza (Allison y cols., 1996). La última actualización del Mapa Genético de la Obesidad Humana de 2006, cifra en 127 los genes candidatos para los cuales al menos un estudio muestra una asociación positiva con la obesidad (Rankinen y cols., 2006). Estos estudios han permitido la identificación de dos polimorfismos de un único nucleótido asociados con la obesidad, uno en el intrón del gen asociado a la masa grasa y a la obesidad (FTO del inglés “fat mass and obesity-associated”) y otro en el gen del receptor de la melanocortina 4 (MC4R del inglés “melanocortin 4 receptor”); estos dos polimorfismos de un único nucleótido tan solo explican el 2% de la varianza en el IMC en el adulto (Frayling y cols., 2007, Loos y cols., 2008). Aunque en algunos casos la obesidad se explica mediante un modelo monogénico, en la mayor parte de los casos parece resultar de interacciones poligénicas, aunque no hay que obviar que en la inmensa mayoría de los casos, la obesidad es una patología con un complejo origen multifactorial. Introducción 33 1.1.3.2 Epigenética y obesidad La regulación epigenética de la expresión génica ha emergido en los últimos tiempos como un factor que podría estar involucrado en las diferencias interindividuales presentes en la obesidad. Los mecanismos epigenéticos pueden alterar la función de los genes como respuesta a factores externos como la dieta, agentes farmacológicos o toxinas ambientales (Jirtle y Skinner, 2007). Estos cambios en la actividad génica se pueden propagar de una generación celular a la siguiente. Así, una misma secuencia de nucleótidos en dos individuos puede expresarse o no en función de las marcas epigenéticas específicas que presente. Los principales reguladores epigenéticos en las células de mamíferos son la metilación del ácido desoxirribonucleico (ADN) y la modificación de las histonas (Bollati y Baccarelli, 2010). Uno de los factores de exposición más relevantes es la obesidad materna, la cual puede inducir alteraciones epigenéticas en su descendencia que confieran mayor susceptibilidad a desarrollar obesidad (McAllister y cols., 2009). Hay estudios que muestran que genes relacionados con la obesidad, como la leptina y la proopiomelacortina, están regulados por mecanismos epigenéticos, estando relacionados estos cambios epigenéticos con su desregulación en la obesidad (Shen y cols., 2007). 1.1.3.3 Actividad física Los seres humanos adultos mantienen un equilibrio entre los niveles de ingesta de energía y gasto energético, tal y como se demuestra por la constancia del peso y la composición corporal. El gasto energético está compuesto por tres componentes fundamentalmente: el metabolismo basal, la termogénesis y la actividad física. De todos ellos, sólo la actividad física puede ser controlada por el propio individuo. Por otra parte, la ingesta energética es totalmente voluntaria, por lo tanto los factores en lo que se basa cualquier intento para reducir o controlar el peso son la dieta y el ejercicio físico. Múltiples estudios, han puesto de manifiesto la relación existente entre niveles bajos de actividad física y la obesidad (Marshall y cols., 2004, Soriguer y cols., 2003). Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 34 Hay datos transversales que demuestran una asociación inversa entre la actividad física en el tiempo de ocio y el IMC, y otra asociación, pero directa, entre el tiempo de estar sentado y el incremento de IMC. Hay que tener en cuenta que, en las últimas décadas, ha disminuido considerablemente el esfuerzo físico en el trabajo, lo que ha tenido cierta repercusión en la prevalencia de obesidad (Chaput y Tremblay, 2009). Otro factor a tener en cuenta en la actividad física son los cambios fisiológicos que se producen con la práctica de ejercicio. Hay estudios que muestran que el ejercicio físico agudo provoca cambios en los niveles de hormonas secretadas por el tracto intestinal, lo cual ayuda a explicar la supresión del apetito que se produce a corto plazo después del ejercicio (Martins y cols., 2007). 1.1.3.4 Factores dietéticos y metabólicos Los carbohidratos, las proteínas y las grasas absorbidas son transformados en sustratos que pueden ser, o bien oxidados para obtener energía para los diversos procesos biológicos, o bien ser almacenados (Hall y cols., 2012). Hay estudios que se centran en los efectos que los diferentes macronutrientes tienen sobre el metabolismo. Se sabe que la composición de los alimentos tiene un gran impacto sobre la sensación de saciedad; las proteínas hacen desaparecer la sensación de hambre durante más tiempo que los hidratos de carbono, mientras que los lípidos son los que menos influyen en la sensación de saciedad (Hall y cols., 2012). La variabilidad de la carga glucémica de los alimentos afecta a los niveles de glucosa en sangre y por lo tanto, a la respuesta por parte de la insulina (Foster-Powell y cols., 2002); dietas con bajo índice glucémico pero con alta ingesta de grasas y proteínas parecen promover la saciedad (Johnstone y cols., 2008). Otros estudios se han centrado en el efecto de las dietas con fructosa o el consumo de bebidas que contienen sacarosa (Bray, 2010), así como en el tipo de ácidos grasos que conforman la dieta; se ha descrito que la incidencia de obesidad es menor en aquellas personas que consumen aceite de oliva (Soriguer y cols., 2009a). Otro aspecto en la regulación del peso corporal es la flexibilidad metabólica, es decir, la capacidad de obtener energía mediante la oxidación utilizando como sustrato carbohidratos o grasas en función del tipo de alimento ingerido, cambios en la demanda Introducción 35 energética, factores ambientales… En individuos obesos este proceso no es tan eficiente, de modo que una menor tasa de oxidación de grasas conlleva un balance energético positivo y una acumulación de grasas (Astrup, 2011). El ajuste individual entre la distribución de macronutrientes de la dieta en función de la capacidad oxidativa podría jugar un papel crucial para permitir la estabilidad del peso corporal a corto y largo plazo. Recientemente se ha destacado el papel que la flora intestinal tiene sobre el metabolismo energético y la capacidad de obtener energía del alimento ingerido. Dos grupos principales de bacterias caracterizan la flora intestinal, Bacteroidetes y Firmicutes, cuya eficiencia metabólica varía; los individuos obesos se caracterizan por presentar una mayor proporción de Firmicutes en su flora intestinal, los cuales tienen una mayor capacidad de obtener energía de los alimentos (Turnbaugh y cols., 2006), lo que contribuye a la ganancia de peso. 1.1.3.5 Factores ambientales, culturales y de comportamiento El factor económico juega un papel importante en el desarrollo de la obesidad. Existe una relación inversa entre el coste de los alimentos y la densidad energética de los alimentos; los alimentos ricos en azúcares y grasas son más baratos que los vegetales o los alimentos integrales. Numerosos estudios han evaluado la influencia del nivel socio-económico sobre la obesidad; en países desarrollados los individuos con menor nivel socio-económico son los que padecen obesidad con una mayor frecuencia (McLaren, 2007). El nivel educacional también se ha relacionado con la obesidad, así el riesgo de ser obeso es mayor en personas sin estudios (Soriguer y cols., 2004). La cantidad de estudios que evalúan la asociación entre las horas de sueño y el riesgo de obesidad se ha incrementado en los últimos años. Numerosos estudios encuentran asociación entre una menor duración del sueño y un aumento del IMC (Cappuccio y cols., 2008, Gutiérrez-Repiso y cols., 2014). Los mecanismos por los que la restricción del número de horas de sueño puede incrementar el riesgo de obesidad no están claros. Hay estudios que indican que la restricción del sueño puede aumentar el cansancio diurno y reducir la actividad física (Schmid y cols., 2009), aunque en este Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 36 sentido hay resultados contradictorios (Haghighatdoost y cols., 2012, Patel y cols., 2006). Se ha encontrado que la restricción de sueño durante periodos cortos de tiempo incrementa la ingesta de alimentos (Brondel y cols., 2010). Otros estudios han determinado que las personas que duermen menos ingieren más grasas y hacen dietas, en general, de peor calidad (Haghighatdoost y cols., 2012). Los disruptores endocrinos son sustancias químicas que podemos encontrar en pesticidas, compuestos usados en la fabricación de plásticos y artículos de consumo, residuos industriales contaminantes…. que en el organismo humano actúan alterando el equilibro hormonal. Estos disruptores endocrinos han sido asociados con el incremento de prevalencia de obesidad; actúan alterando el metabolismo de lípidos, la tasa metabólica basal, la regulación del apetito… (McAllister y cols., 2009, De Coster y van Larebeke, 2012). 1.1.4 Clasificación de la obesidad Las medidas antropométricas que se utilizan en la valoración del peso corporal y la obesidad son varias: circunferencia de la cintura, ratio cintura-cadera, IMC, ratio cintura-altura... Tabla 1: Clasificación propuesta por la OMS según el IMC. Tipificación Valores límites de IMC (kg/m2) Infrapeso <18.5 Normopeso 18.5-24.9 Sobrepeso 25-29.9 Obesidad grado I 30-34.9 Obesidad grado II 35-39.9 Obesidad grado III (mórbida) ≥40 Introducción 37 Por consenso científico, hace unos años se aceptó el IMC como método de clasificación del peso corporal. El IMC se define como el cociente entre el peso en kilogramos y el cuadrado de la talla en metros. Aunque el IMC no es un buen indicador de adiposidad en individuos musculados como deportistas, y en ancianos, es el índice utilizado por la mayoría de estudios epidemiológicos. La OMS propone una clasificación de la obesidad en función del IMC (WHO, 2000), que se recoge en la Tabla 1. La Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad (SEEDO) y la Sociedad Española de Cirugía de la Obesidad (SECO) han elaborado un documento de consenso que permite a los distintos profesionales implicados en el tratamiento de la obesidad mórbida una orientación práctica a la hora de desarrollar sus propios protocolos en su ámbito de trabajo. La SEEDO especifica dos categorías para la obesidad mórbida: 4049.9 kg/m2 (obesidad mórbida) y ≥50 kg/m2 (superobesidad mórbida), ya que desde el punto de vista quirúrgico tiene implicaciones a la hora de seleccionar la técnica más adecuada. Además la Sociedad Americana de Cirugía Bariátrica y la SECO incluyen una tercera categoría, la que corresponde a pacientes con IMC ≥ 60kg/m2 (Tabla 2) (Rubio, 2004). Tabla 2: Criterios propuestos para definir la obesidad en grados según el IMC. Tipificación Valores límites de IMC (kg/m2) Obesidad grado I 30-34.9 Obesidad grado II 35-39.9 Obesidad grado III (Obesidad Mórbida) 40-49.9 Obesidad grado IV (Superobesidad) 50-59.9 Obesidad grado V (Super-superobesidad) ≥60 Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 38 1.1.5 Concepto de Obesidad Mórbida En los años ochenta, Van Itallie describió por primera vez el término de obesidad mórbida para referirse al grado de obesidad que compromete la esperanza de vida del individuo (Van Itallie, 1980), un tipo de obesidad rebelde a cualquier tipo de tratamiento médico y que predispone a graves enfermedades y trastornos psicosociales. Esta forma severa de obesidad se define como aquellas personas que presentan un valor de IMC mayor o igual a 40 kg/m2. Numerosos estudios han demostrado un incremento de la mortalidad y morbilidad en pacientes obesos, de forma que cuanto mayor es el sobrepeso mayor es el riesgo vital (Flegal y cols., 2013). Diversos estudios han encontrado una asociación entre el IMC y la mortalidad, describiendo una relación en J o U entre el IMC y los años de vida perdidos (Fontaine y cols., 2003). En el caso de la obesidad mórbida, los riesgos se incrementan de manera drástica, estando su supervivencia limitada por enfermedades coronarias, hipertensión arterial, diabetes mellitus tipo 2 (DM2), síndrome de apnea del sueño y artrosis, entre otras (Sjostrom, 1992). Esta enfermedad crónica presenta una tendencia epidémica en los países industrializados. En EE.UU. pasó de una prevalencia de 0.78% en 1990 al 2.2% en 2000 (Freedman y cols., 2002). En nuestro país los últimos datos del estudio [email protected] presentan una prevalencia de obesidad mórbida ajustada por edad y sexo de 2.34% (1.89-2.79 IC 95%) (datos no publicados). Los datos disponibles reflejan que, en general, la prevalencia de obesidad mórbida es mayor en mujeres y que tiende a aumentar con la edad principalmente en la población femenina. 1.1.6 Patologías asociadas a la obesidad La obesidad es un factor de riesgo muy importante para el desarrollo de enfermedades crónicas de gran prevalencia en países desarrollados, como la hipertensión, dislipemia y DM2. Otras enfermedades que están incrementadas por el exceso de grasa corporal son: enfermedad isquémica coronaria, accidente vascular cerebral, síndrome de hipoventilación y apnea del sueño, esteatohepatitis no alcohólica, Introducción 39 colelitiasis, osteoartrosis e infertilidad (Guh y cols., 2009). Asimismo, existen estudios que asocian la obesidad mórbida con un mayor riesgo de desarrollar diversos tipos de cáncer (Kaidar-Person y cols., 2011). 1.1.6.1 Hipertensión Numerosos estudios han mostrado que existe una asociación entre obesidad e hipertensión. El riesgo de padecer hipertensión es 3.5 veces mayor en pacientes obesos que en individuos normo-peso (Kotchen, 2010). Un 5% de ganancia de peso incrementa la probabilidad de padecer hipertensión en un 20-30% (Vasan y cols., 2001), mientras que una reducción de peso conlleva una disminución de la presión arterial (Dall'Asta y cols., 2009). Los mecanismos que relacionan la obesidad con la hipertensión son complejos e incluyen desajustes en múltiples sistemas: incremento en la actividad del sistema renina-angiotensina-aldosterona, incremento en la actividad del sistema nervioso simpático, desregulaciones metabólicas como la hiperinsulinemia, alteraciones en la secreción de adipoquinas y posibles daños en el tejido adiposo perivascular (Aghamohammadzadeh y Heagerty, 2012). Figura 2: Prevalencia de hipertensión en España según categorías de IMC. Datos del Estudio [email protected] (datos no publicados). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 18.5-24.9 25-29.9 30-34.9 35-39.9 ≥40 Prevalencia hipertensión IMC Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 40 1.1.6.2 Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) La DM2 se asocia estrechamente con la obesidad en ambos sexos y en todos los grupos étnicos. Más del 80% de los casos de DM2 se pueden atribuir a la obesidad. Asociaciones muy claras han sido descritas en grupos étnicos con alta susceptibilidad a la DM2, como es el caso de los indios Pima de Arizona, que presentan una tasa de prevalencia de obesidad y diabetes del 60% y del 40% respectivamente en adultos. En un estudio longitudinal con 23 años de seguimiento, se determinó que la obesidad está fuertemente asociada a la incidencia de DM2, incluso en sujetos sin antecedentes familiares de esta enfermedad (Knowler y cols., 1991). Figura 3: Principales patologías asociadas a la obesidad. El riesgo de DM2 se incrementa con el grado y la duración de obesidad. Estudios como el “Nurses’ Health Study” con 14 años de seguimiento encontraron que Introducción 41 el riesgo más bajo de DM2 se asocia con un IMC inferior a 22 kg/m2, incrementándose gradualmente con el aumento del IMC (Colditz y cols., 1995). El efecto de la obesidad como factor de riesgo para el desarrollo de DM2 es más fuerte en la etapa de adulto joven. En el estudio “European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition-Potsdam Study”, la ganancia de peso en la etapa adulta entre 25-40 años se asoció con un mayor riesgo y un inicio más temprano de la enfermedad que la ganancia de peso después de los 40 años (Schienkiewitz y cols., 2006). Se ha estimado que los individuos con IMC superior a 40 kg/m2 tienen siete veces más probabilidad de desarrollar DM2 que aquellos individuos normo-peso (Mokdad y cols., 2003). Además la ganancia de peso incrementa el riesgo de desarrollar DM2 tanto en hombres como en mujeres. De manera que ganancias ponderales entre 810 kg de peso incrementan el riesgo relativo en 2.7. Por otro lado, la pérdida de peso se asocia con una reducción del riesgo de desarrollar DM2. Figura 4: Prevalencia de DM2 en España según categorías de IMC. Datos del estudio [email protected] (datos no publicados). La DM2, al igual que la obesidad, es una enfermedad de origen multifactorial donde la predisposición genética juega un papel muy importante junto con los factores ambientales. Numerosos estudios han evaluado el papel de la heredabilidad en el 0 5 10 15 20 25 30 35 40 18.5-24.9 25-29.9 30-34.9 35-39.9 ≥40 Prevalencia DM2 IMC Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 48 Se considera que la evolución de las enfermedades asociadas a la obesidad mórbida es paralela a la pérdida de peso. Apenas con pérdidas del 10-20% de peso, podemos observar mejoría, cuando no curación, de alguna o de todas las enfermedades asociadas hasta en un 90% de los pacientes. Son muchas las técnicas que se han desarrollado en los últimos años, quizás debido a que no hay ninguna técnica eficaz en todos los pacientes y a que ninguna de ellas está exenta de complicaciones. El abordaje laparoscópico en estas cirugías también ha tenido un gran impacto dentro de este campo, ofreciendo claras ventajas como son la reducción de la estancia hospitalaria, menor dolor y una recuperación postoperatoria más temprana. La cirugía de la obesidad cuenta con una serie de técnicas que han ido evolucionando a lo largo de los años. Se pueden clasificar en tres grandes grupos:  De procesos malabsortivos: Reducen el acceso del alimento ingerido a aquellas partes del intestino delgado donde la absorción de nutrientes tiene lugar.  De procesos restrictivos: Tienen por objetivo limitar la ingestión de alimentos mediante la reducción de la cavidad gástrica a menos de 30 ml, provocando así la sensación de saciedad.  De procesos mixtos: malabsortivos/restrictivos. 1.1.8.1 Procedimientos malabsortivos a. Bypass yeyunocólico/yeyunoileal Son el primer tipo de intervención de cirugía bariátrica que se ideó. Dentro de sus variantes están el bypass yeyunocólico y el yeyunoileal y en ambas se produce un síndrome de intestino corto extremo. La cirugía consiste en seccionar el yeyuno proximal y anastomosarlo al íleon terminal o al colon transverso dejando como asa ciega prácticamente todo el intestino delgado. Aunque la pérdida de peso era muy efectiva acarreaba graves consecuencias metabólicas: alteraciones electrolíticas, Introducción 49 deshidratación, diarrea y fallo hepático, entre otras, lo que finalmente requería deshacer el bypass. Estas consecuencias llevaron al abandono de esta técnica en los años ochenta y a la búsqueda de otras alternativas. b. Derivación biliopancreática En 1976, Scopinaro inició trabajos experimentales en perros con la intervención que él denominó bypass biliopancreático, que aun conservando la esencia del bypass yeyunoileal resolviese sus problemas. Figura 6: Derivación biliopancreática La técnica quirúrgica inicial consiste en una resección parcial del estómago, y la pequeña bolsa remanente se conecta directamente al segmento final del intestino delgado, evitando completamente el paso a través de la parte superior del intestino. La pérdida de peso se produce porque la mayoría de las calorías y nutrientes son dirigidos al colon donde no son absorbidos (Figura 6). Esta técnica ha superado la prueba del tiempo. En lo referente a la pérdida de peso, los resultados son excelentes, pero no es una técnica exenta de complicaciones. Las secuelas inmediatas más comunes son flatulencia postprandial y esteatorrea. A medio y largo plazo son bien conocidas la ferropenia, el déficit en la absorción de calcio Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 50 con incremento de la reabsorción ósea, anemia, elevación de paratirina o déficit de vitaminas liposolubles (A, K, D). 1.1.8.2 Procedimientos restrictivos a. Gastroplastia vertical En 1981 Fabito introduce el concepto de gastroplastia vertical y, ese mismo año, Laws fue quizás el primero en asociar al grapado en continuidad gástrico un anillo de silastic para calibrar el orificio de salida y así impedir que su dilatación facilitase el vaciamiento del reservorio. Mason modificó la técnica asociando un orificio que atravesaba todo el estómago y facilitaba la colocación del grapado y la anilla. Este tipo de técnica es menos agresiva al respetar la fisiología de la digestión y la absorción de nutrientes; sin embargo en cuanto a la pérdida de peso tiene una menor efectividad. b. Banda gástrica Es la técnica menos agresiva de las restrictivas y además es totalmente reversible. En 1985, Kuzmak coloca la primera banda ajustable, con un anillo de silicona dotado con una cámara interior expansible conectada a un reservorio subcutáneo que permite ajustar el calibre de la banda y, por tanto, el orificio gástrico. El diseño de bandas para colocación laparoscópica, junto con el perfeccionamiento técnico y las bajas complicaciones ha expandido el uso de esta técnica. Las complicaciones intraoperatorias son escasas y las secuelas metabólicas prácticamente inexistentes. Introducción 51 c. Gastrectomía tubular Esta técnica es la primera parte del cruce duodenal y consiste en la extirpación del 80% del estómago. Se comenzó a utilizar como un primer tiempo del cruce duodenal, para adelgazar al paciente antes de proceder a la segunda parte y se vio que tenía muy buenos resultados a corto plazo, por lo que se empezó a utilizar como técnica única. Este tipo de técnica no produce las complicaciones de la malabsorción. Además permite una segunda operación para completar el bypass bilioprancreático si fuera necesario. Otra de las ventajas es que aunque no sea reversible, el estómago se distiende con el tiempo y permite una comida casi normal sin consecuencias serias a largo plazo. 1.1.8.3 Procedimientos mixtos a. Bypass gástrico Mason fue el pionero y precursor de las diferentes variantes de bypass gástrico y, posteriormente de las gastroplastias. Figura 7: Bypass gástrico Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 52 El procedimiento de bypass gástrico en Y de Roux (RYGB, del inglés “Roux-enY gastric bypass”) consiste en la creación de un reservorio gástrico a partir de una pequeña porción de estómago y su unión directa al intestino delgado, evitando así el paso de alimentos a través de una gran parte del estómago y del duodeno. El reservorio gástrico resultante es demasiado pequeño para albergar grandes cantidades de alimento. Además, la absorción de grasa se reduce sustancialmente al evitarse el paso por el duodeno (Figura 7). Las complicaciones son mucho menores que las de la derivación biliopancreática y se deben a la exclusión del duodeno y del yeyuno proximal de la absorción de nutrientes. Entre ellas destaca la anemia y el déficit de calcio. El dumping o síndrome de vaciado rápido es un efecto secundario que puede ser “beneficioso”, ya que limita la ingesta de azúcares refinados en los pacientes. A pesar de ello, son más las ventajas que los inconvenientes que de ella se derivan. Comorbilidades como hipertensión, DM2, apnea obstructiva del sueño, reflujo y asma se resuelven o mejoran en el 80-100% de los casos. La calidad de vida a corto plazo mejora en todos los pacientes, sobre todo en mujeres con DM2. Por todo ello, el bypass gástrico se ha consolidado en nuestros días como una técnica de referencia. 1.1.9 Cirugía metabólica Más del 60% de los sujetos con DM2 son obesos (Kramer y cols., 2010) y la frecuencia se incrementa de manera desproporcionada en aquellos sujetos con un mayor grado de obesidad (Gregg y cols., 2007). El tratamiento de la DM2 hasta ahora se ha basado en modificaciones del estilo de vida y la dieta, asociadas a tratamiento farmacológico con hipoglicemiantes orales o insulinas. La pérdida de peso debería ser el principal objetivo del tratamiento en individuos obesos con DM2, pero sin embargo, con los tratamientos convencionales difícilmente se consigue. De hecho, la ganancia de peso es una de las principales complicaciones del tratamiento con sulfonilureas, insulina o tiazolidinedionas. La falta de un tratamiento farmacológico, junto a las modificaciones del estilo de vida y la dieta que traten el exceso de peso en pacientes con obesidad Introducción 53 severa, hacen de la cirugía bariátrica una alternativa para el tratamiento de la obesidad y la resolución de las comorbilidades asociadas. La cirugía bariátrica fue inicialmente ideada para tratar la obesidad mórbida y se consideraba adecuada para sujetos con un IMC superior a 40 kg/m2, o para individuos con un IMC superior a 35 kg/m2 y con comorbilidades asociadas a la obesidad, tales como la DM2, la hipertensión o la enfermedad cardiovascular (NIH, 1996). Numerosos son los estudios que evalúan la pérdida de peso con la cirugía bariátrica, así como la resolución de las distintas comorbilidades asociadas a la obesidad. Diversos estudios caso-control que incluyen pacientes con DM2 y un IMC de al menos 35 kg/m2 han demostrado una mejora sustancial en el control metabólico e incluso la remisión de diabetes. Además, la cirugía bariátrica puede prevenir de manera eficaz la progresión de la tolerancia alterada a la glucosa hacia DM2 en individuos obesos mórbidos. Un reciente meta-análisis que incluía 621 estudios realizados entre el 1 de enero de 1990 y el 30 de abril de 2006, y un total de 135.246 pacientes con una media de IMC de 47.9 kg/m2, de los cuales el 80% eran mujeres, estima una pérdida de peso general de 38.5 kg o del 55.9%. En un 78.1% de los casos, la DM2 remitió y más de dos años después de la intervención, en un 62% se mantuvo esta remisión; los niveles de insulina disminuyeron significativamente después de la intervención, así como los de hemoglobina glicosilada (HbA1c) y la glucosa en ayunas (Buchwald y cols., 2009). La cirugía bariátrica también está asociada a una mejora del síndrome de apnea obstructiva del sueño (Fritscher y cols., 2007), así como a una reducción de la mortalidad global (Pontiroli y Morabito, 2011), siendo reducida la mortalidad específica asociada a DM2 en más de un 90% (Adams y cols., 2007). Una revisión Cochrane de 2009 que incluye estudios realizados con pacientes con y sin DM2 concluye que la pérdida de peso es mayor con los procedimientos de cirugía bariátrica que con los tratamientos convencionales en sujetos obesos con un IMC superior a 30 kg/m2, y que está acompañada de una mejoría en las comorbilidades como la DM2, hipertensión y una mejoría en la calidad de vida. En este estudio se estimó que la tasa de remisión de la DM2 osciló entre el 57% y el 95% dependiendo del procedimiento quirúrgico así como de la definición de remisión empleada (Colquitt y cols., 2009). Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 54 La comparación directa entre estudios resulta compleja debido a inconsistencias metodológicas, la duración y la severidad de la DM2, así como la propia definición de remisión de diabetes. La Asociación Americana de Diabetes incluye en su definición de remisión de diabetes un valor de HbA1c ≤6%, así como unos niveles de glucosa en ayunas normales con una ausencia de medicación de al menos un año. 1.1.9.1 Cirugía metabólica versus tratamiento médico intensivo A pesar de que son numerosos los estudios que muestran los efectos beneficiosos de la cirugía bariátrica sobre la remisión de la DM2, pocos estudios evalúan la eficacia de la cirugía bariátrica frente a los tratamientos médicos convencionales en pacientes con obesidad mórbida y DM2. Un estudio aleatorio controlado, recientemente publicado, evalúa la remisión de la DM2 en 60 sujetos con un IMC ≥ 35 kg/m2, una duración de la DM2 de al menos cinco años y un valor de HbA1c ≥7%. Estos sujetos fueron asignados de manera aleatoria a tres grupos: uno recibió tratamiento médico convencional, otro se sometió a bypass gástrico y otro a diversión biliopancreática. A los dos años se evaluó la remisión de la DM2 que se definió como una glucosa en ayunas inferior a 100 mg/dl y una valor de HbA1c menor de 6.5% en ausencia de tratamiento farmacológico. En el grupo que recibió tratamiento médico ningún caso de remisión fue descrito, mientras que en el 75% de los pacientes que fueron sometidos a bypass gástrico y en el 95% de los que fueron sometidos a diversión biliopancreática la DM2 remitió (Mingrone y cols., 2012). Un estudio de similares características observó un mejor control glucémico y un aumento de la sensibilidad a la insulina en los pacientes sometidos a bypass gástrico con respecto a los pacientes obesos sometidos a tratamiento médico intensivo. Además, la pérdida de peso fue similar en los pacientes sometidos a bypass gástrico y a gastrectomía, aunque solo en el caso del bypass gástrico la función de la célula β pancreática se restauró (Kashyap y cols., 2013). Introducción 55 1.1.9.2 Cirugía bariátrica en pacientes con IMC<35 kg/m2 y con DM2 Estudios recientes muestran que la cirugía bariátrica también es efectiva para la remisión de la DM2 en pacientes con un IMC entre 30 y 35kg/m2 (Cohen y cols., 2012). La cirugía metabólica para este tipo de pacientes está contemplada por la Federación Internacional de Diabetes (Dixon y cols., 2011) y por el grupo de trabajo de Obesidad de la Sociedad Española de Endocrinología y Nutrición (Lecube y cols., 2012) para pacientes con un pobre control glucémico y con factores de riesgo cardiometabólico asociados en los que los tratamientos alternativos no han tenido éxito. Un reciente meta-análisis de 13 estudios con pacientes diabéticos y con IMC inferior a 35 kg/m2 y con un seguimiento entre 6 y 18 meses, muestra además de la resolución de las distintas comorbilidades asociadas a la diabetes, que un 80% de los pacientes lograron un adecuado control glucémico (HbA1c <7%) sin medicación para la DM2. Además, la tasa de complicaciones producidas por la cirugía fue baja (3.2%) sin registrarse ningún caso de mortalidad (Li y cols., 2012). El mejor control glucémico después de la cirugía metabólica no solo previene o disminuye las complicaciones microvasculares de la DM2, sino que también contribuye a la disminución del riesgo macrovascular (Shah y cols., 2010). 1.1.9.3 Posibles mecanismos que contribuyen a la remisión de la DM2 Los mecanismos por los cuales la cirugía bariátrica produce una rápida mejoría de la hiperglucemia, una reducción de la resistencia a la insulina hepática y una mejora de la secreción de insulina son poco conocidos, aunque la pérdida de peso tiene un papel muy importante en la mejora de la DM2. Hay evidencias que muestran efectos beneficiosos de la cirugía bariátrica en el control glucémico de sujetos con IMC <35 kg/m2 y con DM2 (Reis y cols., 2012), por lo que otros mecanismos aparte de la pérdida de peso están implicados en la mejoría de la DM2. Diversos mecanismos se han propuesto para explicar la mejoría en el metabolismo de la glucosa después de la cirugía bariátrica. El cerebro, el tejido adiposo, el páncreas y el tracto gastrointestinal son muy importantes en la regulación de las Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 56 respuestas anabólicas y catabólicas que dan lugar a la tasa metabólica. El intestino ha ganado atención en los últimos años y su importante papel en la patofisiología de diversas enfermedades metabólicas como la obesidad, la resistencia a la insulina y la DM2 está siendo objeto de estudio. Es por ello que diversos mecanismos que posiblemente influyan en la remisión de la DM2 están vinculados al intestino. a. Disminución de la ingesta calórica La restricción en la ingesta calórica que presentan los pacientes inmediatamente después de haber sido sometidos a cirugía bariátrica afecta de manera determinante al metabolismo de la glucosa. Si la restricción calórica fuera el mecanismo principal que regulase la homeostasis de la glucosa después de la cirugía bariátrica, entonces la tasa de remisión de la DM2 sería la misma para todos los tipos de cirugía. Pero este mecanismo explica sólo en parte la remisión de la DM2, ya que a pesar de ser constante en todos los procedimientos bariátricos, con similares ingestas calóricas se produce una disminución en los niveles de glucosa plasmática más rápida y pronunciada en los procedimientos que involucran un bypass intestinal en comparación con los procedimientos puramente restrictivos (Gumbs y cols., 2005). b. Gluconeogénesis intestinal La gluconeogénesis intestinal juega un papel muy importante en el control del hambre y de la saciedad, y también en la producción endógena de glucosa a través de la modulación de la sensibilidad a la insulina en el hígado (Mithieux, 2010). La gluconeogénesis intestinal es inducida principalmente en condiciones de ayuno o DM2 con bajos niveles de insulina. En ratones sometidos a cirugía RYGB, la deprivación de alimentos en el intestino delgado distal conduce a la inducción de los genes de la ruta de la gluconeogénesis, genes que débilmente son expresados en el estado anterior a la cirugía, por lo que la gluconeogénesis cobra importancia en la homeostasis glucémica (Troy y cols., 2008). La activación de esta vía conlleva la liberación de glucosa a la vena porta, glucosa que puede ser detectada por un sensor portal de glucosa que envía la Introducción 57 señal al cerebro a través de las vías vagales aferentes, promoviendo la disminución de la ingesta de comida y la supresión de la producción de glucosa hepática por la insulina (Troy y cols., 2008). c. Cambios en la resistencia a la insulina La pérdida de peso está asociada a la reducción de la resistencia a la insulina. En este sentido, la cirugía bariátrica es el método más efectivo para conseguir una disminución del peso que se mantenga en el tiempo. Aunque los procedimientos que conllevan una mayor pérdida de peso son los que a su vez consiguen un mayor efecto sobre la resistencia a la insulina (Buchwald y cols., 2009), también es cierto que hay otros factores que son alterados con la intervención quirúrgica. Esto queda reflejado en un estudio en el que pacientes obesos que fueron sometidos a una cirugía RYGB presentaron una mayor sensibilidad a la insulina al año de haber sido intervenidos quirúrgicamente, que aquellos sujetos obesos o con sobrepeso que perdieron peso mediante otras vías, siendo la sensibilidad a la insulina similar a los individuos con IMC normal incluso en aquellos casos en los que los individuos aún mantenían un IMC>30 kg/m2 al año de haber sido sometidos a la cirugía (Bikman y cols., 2008). Los cambios que se producen en la secreción de las hormonas intestinales parecen ser los responsables en parte de la remisión de la DM2, independientemente de la pérdida de peso. El eje enteroinsular es un sistema regulatorio en el que la secreción de insulina por parte de la células β pancreáticas está en parte regulado por las hormonas secretadas por el tracto gastrointestinal. Este sistema participa en la rápida mejoría en el metabolismo de la glucosa que se ha observado tras la cirugía bariátrica. El péptido insulinotrópico dependiente de la glucosa (GIP, del inglés “glucose-dependent insulinotropic peptide”) y el péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1, del inglés “glucagon like peptide 1”) son dos hormonas gastrointestinales secretadas por las células endocrinas de la mucosa intestinal en respuesta a la ingesta de alimentos y son responsables de alrededor del 70% de la secreción de insulina postprandial (Meier y Nauck, 2010). Este es el denominado efecto incretina, el cual se encuentra reducido en pacientes con DM2 hasta el 30% (Nauck y cols., 1986). Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 64 1.2.1.3 Tipos celulares de la mucosa intestinal Las células madre pluripotenciales ocupan sobre todo el tercio inferior de las criptas, donde constituyen el tipo principal. Hay cinco tipos de células epiteliales las cuales derivan de las células madre de las criptas: • Los enterocitos son las células absortivas especializadas en el transporte de sustancias desde la luz del intestino hacia el torrente circulatorio. Son las células más abundantes del epitelio intestinal, representando entorno al 80-90% de las células epiteliales del intestino delgado. Se caracterizan por ser células cilíndricas altas con núcleo de localización basal, que presentan un borde en cepillo en la superficie apical formado por unas 3000 microvellosidades aproximadamente, lo que aumenta la superficie de absorción unas 20 veces. En los cortes para microscopía óptica los enterocitos se reconocen en su conjunto por su borde celular apical irregular que se denomina borde en cepillo o chapa estriada, compuesto por microvellosidades paralelas muy juntas de 1 µm de largo y 0.1 µm de espesor. Los enterocitos poseen numerosas proteínas transportadoras tanto en su membrana apical como en la basal, lo que permite el transporte activo y pasivo de nutrientes desde el intestino. • Células calciformes que son glándulas unicelulares secretoras de moco y otras glicoproteínas, las cuales lubrican y protegen la superficie de la mucosa. Su cantidad aumenta desde el duodeno hasta el final del íleon. • Células enteroendocrinas: secretan hormonas las cuales realizan su acción endocrina y paracrina. Las hormonas secretadas varían a lo largo del intestino (colecistoquinina, secretina, somatostatina,….). Se localizan entre los enterocitos y las células calciformes, fundamentalmente en la base de las vellosidades intestinales. Por lo general aumenta el número de células en el duodeno y el yeyuno, y disminuye en el íleon y aun más en el colon. • Células Paneth: Localizadas en la base de las criptas donde se visualizan como células piramidales, con núcleo basal. Son células granuladas que Introducción 65 secretan péptidos y enzimas antimicrobianas, por lo que se ha sugerido que poseen un papel en el control de la flora bacteriana intestinal. También se ha sugerido su posible papel en la regulación de la composición iónica luminal, inflamación intestinal y digestión (Porter y cols., 2002). Figura 9: Esquema de un enterocito. SER: retículo endoplasmático liso, G: aparato de Golgi y Chy: quilomicrones (Lentz, 1971). • Células M: Se localizan sobre las placas de Peyer o nódulos linfoides grandes. Presentan invaginaciones de la membrana basolateral que son ocupadas por linfocitos. Actúan presentando microorganismos y antígenos que son captados en el lumen intestinal a los linfocitos, participando por tanto en la respuesta inmunológica. La lámina propia se encuentra sustentando el epitelio intestinal. Contiene diferentes tipos celulares: fibroblastos, fibrocitos, miofibroblastos…, que secretan Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 66 diferentes factores de crecimiento esenciales para la proliferación y diferenciación celular. El epitelio de la mucosa intestinal tiene una gran capacidad regenerativa que depende de la actividad de las células madre intestinales que se encuentran en la base de las criptas epiteliales. Las divisiones de las células madre dan lugar a una célula hija y a una célula madre, la cual sigue manteniendo la cadena original de ADN. Las células hijas proliferan, se dividen y se diferencian para producir las diferentes líneas celulares del epitelio intestinal. Los enterocitos, las células calciformes y las células enteroendocrinas sufren el proceso de diferenciación a la vez que van migrando hacia el extremo apical de la microvellosidad, donde o bien se desprenden al lumen intestinal o bien sufren apoptosis, con lo cual la producción de células es compensada por la descamación que se produce en la zona apical de la vellosidad. Las células Paneth en cambio, se diferencia en la base de las criptas (Shaker y Rubin, 2010). Figura 10: Esquema de microvellosidad intestinal. Adaptado de Shaker y cols. (Shaker y Rubin, 2010). Introducción 67 1.2.2 Absorción, síntesis y secreción de triglicéridos Con respecto al metabolismo lipídico, la principal función del intestino es la digestión, absorción, formación y secreción de las grasas de la dieta, con una gran capacidad de respuesta rápida y eficiente a la ingesta de grandes cantidades de alimento. La formación de lipoproteínas intestinales es esencial para la absorción de las grasas y las vitaminas liposolubles de la dieta. La absorción se define como el transporte de grasas y vitaminas liposolubles desde el lumen del intestino hacia el plasma y consiste en tres pasos fundamentales. Primero, las grasas de la dieta son emulsionadas e hidrolizadas en el lumen del intestino. Segundo, los productos hidrolizados son tomados por los enterocitos. Tercero, las grasas son re-sintetizadas en los enterocitos y almacenadas en lipoproteínas que son secretadas al torrente sanguíneo. La digestión de los lípidos comienza en la cavidad oral con la acción de las lipasas linguales y continúa en el estómago con la acción de la lipasa gástrica. En el estómago, los lípidos forman grandes gotas de grasas y cuando llegan al duodeno las sales biliares recubren estas gotas y las rompen, dividiéndose en gotas más pequeñas aumentándose miles de veces la superficie de actuación de las enzimas lipolíticas del páncreas. Este proceso se denomina emulsión de las grasas, y permite el acceso de la lipasa pancreática a los triglicéridos, que actúa sobre las posiciones sn-1 y sn-3 de los triglicéridos dando lugar a dos moléculas de ácidos grasos libres y una de 2monoacilglicerol (2-MAG) por cada triglicérido. Aunque se puede producir la isomerización desde sn-2-MAG hacia sn-1-MAG, esta reacción es lenta. El MAG, ya sea sn-2 o sn-1 puede ser hidrolizado en el lumen intestinal por la colesterol esterasa dando lugar a glicerol y ácidos grasos. Si el grupo acil-sn-2 ha migrado a la posición sn1, puede ser hidrolizado por la lipasa pancreática. A pesar de estas posibles vías de hidrólisis, la mayor parte de 2-MAG permanece sin hidrolizar siendo la forma predominante en la que el MAG es absorbido por los enterocitos. Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 68 1.2.2.1 Absorción de lípidos Las sales biliares desempeñan un papel fundamental en el proceso de transporte luminal y de absorción de los productos de la digestión mediante la formación de micelas que los solubilizan. Las micelas son agregados lipídicos que contienen ácidos biliares, ácidos grasos monoglicéridos, colesterol y fosfolípidos. Debido a que las micelas son solubles, permiten que los productos de la digestión sean transportados a través del medio acuoso de la luz intestinal hasta el borde en cepillo de las células de la mucosa donde son absorbidos al interior del epitelio intestinal. Cuando su concentración es alta, ambos pueden atravesar la membrana del enterocito por difusión, aunque también existen moléculas que facilitan el transporte en contra de gradiente. No se han descrito proteínas específicas para el transporte de monoglicéridos. Para los ácidos grasos se han descrito tres categorías de proteínas transportadoras: proteínas que unen a ácidos grasos de membrana plasmática FABPpm (FABPpm, del inglés “plasma membrane fatty acid-binding protein”), las translocasas de ácidos grasos FAT/CD36 (FAT, del inglés “fatty acid transporter”) y las proteínas transportadoras de ácidos grasos FATP (FATP, del inglés “fatty acid transport protein”). Además de éstas, otras proteínas intracelulares y de la membrana plasmática facilitan el transporte de los ácidos grasos. FABPpm es una proteína de 40 kDa localizada en la periferia de la membrana plasmática que se expresa en órganos con alto requerimiento lipídico. En el intestino delgado su expresión es mayor en el yeyuno e íleon (Masson y cols., 2010). Es idéntica a la enzima aspartato aminotransferasa mitocondrial por lo que se ha propuesto su posible papel en la transferencia de ácidos grasos de cadena larga (Stump y cols., 1993). FATP es una familia de seis proteínas altamente conservada durante la evolución. Cada una de ellas tiene un patrón específico de expresión, siendo FATP4 la que se localiza principalmente en el intestino. Su localización en el intestino correlaciona bastante bien con aquellas zonas de absorción de grasas, de hecho su nivel de expresión es muy alta en el yeyuno y en menor medida en el duodeno, e inexistente en el colon (Stahl y cols., 1999). Introducción 69 FAT/CD36 es una proteína transmembrana altamente glicosilada de 75-88 kDa. Su expresión es ubicua, siendo abundante en el corazón, músculo esquelético, tejido adiposo, intestino y endotelio microvascular. En el intestino, es más abundante en el tercio proximal y prácticamente ausente en íleon y colon. Presenta diversas funciones relacionadas con la absorción de grasas así como en la percepción del sabor de las grasas y la regulación de la ingesta de alimento (Abumrad y Davidson, 2012). 1.2.2.2 Transporte intracelular de ácidos grasos hacia el retículo endoplasmático Una vez en el interior del enterocito, los productos de la hidrólisis de los triglicéridos deben atravesar el citoplasma para llegar al retículo endoplasmático donde son usados para la síntesis de lípidos complejos. Este transporte intracelular hacia el retículo endoplasmático es realizado por las proteínas de unión a ácidos grasos FABP (FABP, del inglés “fatty acid binding protein”) presentes en el citoplasma. Esta familia incluye nueve miembros de FABPs y a la proteína celular de unión al retinol. Existe una gran conservación inter-especie de las secuencias peptídicas de los distintos miembros de la familia FABP, existiendo un 80% de homología entre FABP1 también denominada L-FABP (L-FABP, del inglés “liver fatty acid binding protein”) de humano y de ratón. Sin embargo, hay menos del 39% de homología entre FABP2, también denominada I-FABP (I-FABP, del inglés “intestinal fatty acid binding protein”) y L-FABP dentro de la misma especie. A pesar de las diferencias en las secuencias peptídicas, los miembros de la familia FABP presentan una estructura terciaria similar. En los enterocitos del intestino delgado se expresan I-FABP y L-FABP. El intestino delgado es un ejemplo único de órgano en el que dos miembros de la familia FABP son altamente co-expresados. La I-FABP es exclusiva de intestino, mientras que L-FABP se expresa en otros órganos como pulmón, páncreas, hígado y riñón. Aunque la función de ambas FABPs aún no es bien conocida, los estudios publicados indican que poseen diferentes funciones. En un estudio en ratones genéticamente modificados, mostraron que I-FABP dirige a los ácidos grasos hacia la síntesis de triglicéridos, Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 70 mientras que L-FABP dirige a los ácidos grasos hacia rutas oxidativas y a los MAGs hacia rutas anabólicas (Lagakos y cols., 2011). También se ha descrito el papel de LFABP en la formación de las vesículas transportadoras de pre-quilomicrones que se originan desde el retículo endoplasmático de los enterocitos (Neeli y cols., 2007). 1.2.2.3 Síntesis de triglicéridos En los enterocitos, los ácidos grasos y los MAG son utilizados para la síntesis de triglicéridos en el retículo endoplasmático liso a través de la ruta sn-2-monoacilglicerol. Los ácidos grasos y los MAGs se unen covalentemente para sintetizar diacilglicerol (DAG) por la acil-coenzima-A monoacilglicerol aciltransferasa (MGAT). Hay tres isoformas de MGAT en el retículo endoplasmático: MGAT1, MGAT2 y MGAT3. MGAT1 se expresa en la mayoría de tejidos pero no en el intestino. MGAT2 de expresión más ubicua es la de mayor actividad en el intestino y la que más contribuye a la síntesis de DAG. MGAT2 incrementa su actividad hasta tres veces en respuesta a dietas ricas en grasas, aunque los niveles de expresión no varían, lo que sugiere su regulación a través de procesos post-traduccionales (Cao y cols., 2004). Su patrón de expresión sigue un gradiente desde la zona proximal hasta la distal que correlaciona tanto con la actividad enzimática de la proteína como con el patrón de absorción a lo largo del intestino delgado (Cao y cols., 2004). MGAT3 se expresa en el tracto gastrointestinal siendo en el íleon su expresión hasta cinco veces superior que en el intestino proximal (Cheng y cols., 2003). MGAT3 presenta una alta homología de secuencia con acil Coa:diacilglicerol-acil-transferasa 2 (DGAT2) más que el resto de MGATs, por lo que en presencia de MAG, MGAT3 cataliza la formación de triglicéridos (Cao y cols., 2007). Posteriormente el DAG es acilado por la DGAT1, DGAT2 y por la MGAT3 con actividad DGAT para dar lugar a los triglicéridos. La primera enzima con actividad DGAT que se secuenció fue DGAT1. En ratones carentes de esta enzima, se vio que la producción de quilomicrones disminuía sustancialmente pero no desaparecía (Buhman y cols., 2002), lo que sugirió la presencia de otra enzima que participaba en este proceso. Así posteriormente se describió la Introducción 71 DGAT2 que aunque no tiene homología en la secuencia con DGAT1, si que realiza funciones similares. Así se comprobó en un estudio en ratones carentes DGAT2, donde los niveles circulantes de triglicéridos, ácidos grasos y glucosa se redujeron severamente tras el nacimiento, los ratones presentaron bajo peso al nacer y murieron al poco de nacer (Stone y cols., 2004). DGAT1 se expresa principalmente en la zona proximal del intestino delgado, donde representa el 85-90% de la actividad DGAT, mientras que DGAT2 se encuentra principalmente en el tejido adiposo e hígado. DGAT2 se ha localizado en la cara citosólica de la membrana del retículo endoplasmático, mientras que DGAT1 se ha localizado en el lumen del retículo endoplasmático (Niot y cols., 2009). Los enterocitos también pueden sintetizar DAG a partir de la glucosa a través de la ruta del glicerol fosfato que incluye la conversión de glicerol-3-fosfato a DAG mediante la acción de diversas enzimas. Posteriormente este DAG es convertido a triglicéridos por acción de las enzimas DGAT. Se estima que en el intestino, el 75-80% de los triglicéridos son sintetizados a partir de la ruta del MAG y el resto a través de la ruta del glicerol fosfato. Es importante reseñar que el DAG sintetizado a partir de la ruta del MAG y de la ruta del glicerol-3-fosfato no son metabólicamente equivalentes. Así, el DAG sintetizado a partir de MAG es dirigido hacia la síntesis de triglicéridos de manera exclusiva, mientras que el DAG derivado del glicerol-3-fosfato puede ser usado para sintetizar o bien triglicéridos o bien fosfolípidos (Mansbach y Gorelick, 2007), siendo en el intestino más predominante la síntesis de triglicéridos que la de fosfolípidos. 1.2.2.4 Formación de quilomicrones Los quilomicrones son sintetizados exclusivamente por el intestino durante la fase postprandial para transportar los lípidos obtenidos de la ingesta, principalmente triglicéridos, y las vitaminas liposolubles hacia los tejidos. Los quilomicrones son partículas esféricas, de muy baja densidad (densidad <0.93g/ml) y heterogéneas en tamaño (diámetro 75-450 nm); tienen un gran componente lipídico, muy enriquecido en triglicéridos (85-92%), también contienen fosfolípidos (6-12%), colesterol (1-2%), Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 72 proteínas (1-2%), vitamina E y vitamina A. En el centro se sitúan los triglicéridos, los ésteres de colesterol y las vitaminas liposolubles, mientras que en la superficie se encuentran las apolipoproteínas, el colesterol libre y los fosfolípidos. La cantidad de fosfolípidos presente en estas partículas es suficiente para cubrir entorno al 80% de la superficie de los quilomicrones. Aunque las apolipoproteínas constituyen menos del 1% del total de las partículas de quilomicrones, son esenciales para la formación y secreción de los mismos. Estas proteínas asociadas a los quilomicrones son la apoliproteína B-48 (apo B-48), apolipoproteína A-IV (apo A-IV), apolipoproteína A-I (apo A-I) y apolipoproteína C (apo C). Además, realizan otras funciones como la emulsión de las partículas lipídicas en los ambientes acuosos de la linfa y la sangre, mantenimiento de la integridad estructural de los quilomicrones y unión a los receptores de las superficies celulares en los tejidos periféricos diana. Figura 11: Esquema de un quilomicrón. En humanos, la apo B-48 es una proteína necesaria tanto para la estructura como para la función de los quilomicrones, y además es un marcador proteico específico de este tipo de lipoproteínas. Introducción 73 Hasta hace relativamente poco tiempo, se consideraba que los quilomicrones se sintetizaban para transportar la grasa de origen exógeno. Hay evidencias que indican que el intestino también es capaz de sintetizar lipoproteínas en los estados de ayuna; en modelos animales se ha demostrado que la contribución intestinal de lipoproteínas ricas en triglicéridos a los niveles de triglicéridos plasmáticos en el estado de ayunas es elevada (Haidari y cols., 2002). La cantidad de lípidos transportados durante los periodos postprandiales es varias veces mayor que la transportada durante los periodos de ayuno. Así, en lugar de incrementar el número de quilomicrones, los enterocitos expanden el tamaño de las partículas sintetizadas, pudiendo así aumentar el transporte de grasa durante los periodos postprandiales (Hayashi y cols., 1990a). Esta distinción de tamaño hace que se hable de quilomicrones y VLDL intestinales y se utilice el índice de flotación en unidades Svedberg para distinguirlos. Cuando este índice supera los 400 se denominan quilomicrones y VLDL intestinal cuando el índice se encuentra entre 20 y 400. Un elemento estructural clave de los quilomicrones es la apo-B48, que es integrada co-traduccionalmente, al menos de manera transitoria en la membrana del retículo endoplasmático. En la síntesis de quilomicrones, la proteína de transferencia microsomal (MTP, del inglés “microsomal transference protein”) tiene un papel fundamental, uniéndose a los lípidos y dirigiéndolos en la membrana del retículo endoplasmático. La MTP transfiere estos lípidos a la apo B-48, mientras ésta va penetrando en la luz del retículo endoplasmático rugoso. Además de lípidos complejos, sobre todo triglicéridos, también le son transferidos fosfolípidos y colesterol esterificado. Se postula que la MTP es necesaria para un adecuado plegamiento de la apo B-48 y para la correcta formación de la partícula lipoproteica. Además MTP protege a la apo B-48 recién formada de la proteolisis por parte del complejo ubiquitinproteosoma (Hussain y cols., 2003). La lipidación de la apo B-48 conlleva la liberación de la apo B-48 de la membrana del retículo plasmático y la formación de lipoproteínas ricas en triglicéridos denominadas “lipoproteínas nacientes“, “quilomicrones nacientes” o “partículas primordiales” (Pan y Hussain, 2012). Estos “quilomicrones nacientes” aumentan su tamaño en un proceso denominado “expansión del núcleo” por dos posibles mecanismos: por la adición continua de lípidos, proceso llevado a cabo por la enzima MTP (Tso y Balint, 1986), o bien por la fusión con gotas lipídicas citosólicas Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 80 quilomicrones, partículas de menor tamaño que contienen menos triglicéridos, fosfolípidos y apolipoproteínas y más colesterol esterificado. Estos quilomicrones remanentes se dirigen al hígado para su posterior eliminación. De esta manera los quilomicrones normalmente desaparecen del torrente circulatorio en un periodo de 1214 horas después de la ingesta de alimento. Los mecanismos por los cuales el hígado lleva a cabo la eliminación de los quilomicrones no son del todo conocidos. Las primeras etapas del catabolismo de los quilomicrones remanentes han resultado mas complejas de lo inicialmente postulado, incluyendo una unión inicial de los quilomicrones remanentes a otras moléculas de la superficie celular como son el proteoglicanos de heparán sulfato (HSPGs, del inglés “heparin sulphate proteoglycans”), considerándose a sindecan-1 el principal receptor HSPG para las lipoproteínas remanentes en el hígado (Williams y Chen, 2010), y apoE (Beisiegel y cols., 1989). El receptor scavenger clase B tipo I media también en la unión de los quilomicrones remanentes, para sufrir posteriormente un proceso de endocitosis mediante los receptores de LDL y por proteínas relacionadas con el receptor LDL (LRP, del inglés “LDL receptor related protein”) (Havel y Hamilton, 2004). La apo B-48 carece del dominio de unión a los receptores de LDL, a diferencia de la apo B-100. Sin embargo, los quilomicrones remanentes durante su proceso de catabolismo toma apo E de las HDL. La presencia de apo E en los quilomicrones remanentes facilita su rápido aclaramiento por parte del hígado a través del receptor de LDL, al igual que ocurre con otras lipoproteínas ricas en triglicéridos. La ausencia de apo E tiene como con secuencia un retardo en el aclaramiento de los quilomicrones (Schaefer y cols., 1986). Al igual que ocurre con las lipoproteínas hepáticas que contienen apo B-100, sólo hay una molécula de apo B-48 asociada con cada quilomicrón, y a diferencia de otras apolipoproteínas asociadas a los quilomicrones, ésta no es transferida a otras lipoproteínas en circulación. Así es posible en el hombre distinguir las lipoproteínas ricas en triglicéridos de origen hepático portadoras de la apo B-100 de las de origen intestinal portadoras de apo B-48. El contenido de apo B-48 es determinante del número de partículas de lipoproteínas ricas en triglicéridos intestinales y de sus remanentes. En cambio, el contenido en triglicéridos es un determinante del tamaño de la partícula. Introducción 81 Figura 13: Esquema resumido del metabolismo de los quilomicrones. Los quilomicrones remanentes pueden contribuir directamente a la aterosclerosis, ya que estas partículas pueden penetrar rápidamente en las paredes de las arterias y quedar retenidas en los vasos sanguíneos. Lo que incrementa el riesgo de padecer enfermedad cardiovascular es el incremento del número de quilomicrones y, por lo tanto, el número de quilomicrones remanentes y no el tamaño de los mismos, ya que el incremento en el tamaño de los quilomicrones facilita un mayor transporte de lípidos sin variar el número de partículas (Nakatani y cols., 2011). Y es que en situaciones normales, durante el proceso de absorción lipídica, para adecuarse al incremento en la cantidad de lípidos que tiene que transportar, el intestino produce quilomicrones de mayor tamaño, mientras que el número de quilomicrones no aumenta (Hayashi y cols., 1990a). Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 82 1.2.2.7 Regulación de la síntesis de quilomicrones a través de la alimentación En los últimos años muchos de los estudios realizados sobre el metabolismo lipídico se han centrado en estado postprandial, puesto que el ser humano pasa la mayor parte del día en estado postprandial. La cantidad de grasa necesaria para incrementar de manera significativa los niveles plasmáticos de triglicéridos es de 30-50 gramos, aumentando de manera dosis dependiente la lipemia postprandial. Con cantidades superiores a 80 gramos el aumento es constante (López Miranda J, 2010). Dietas ricas en carbohidratos pueden producir un incremento de los niveles plasmáticos de triglicéridos. Además de la cantidad, el tipo de carbohidratos puede alterar el metabolismo lipídico postprandial. Alimentos con alto índice glucémico incrementan la insulinemia postprandial así como los niveles de apo B-100 y apo B-48 (Harbis y cols., 2004). El consumo de fructosa también se ha relacionado con un aumento de la lipemia postprandial (Chong y cols., 2007). Otro de los factores son los ácidos grasos poliinsaturados n-3 (omega-3) y n-6 (omega-6) cuyo consumo está relacionado con una reducción de la lipemia postprandial (Ooi y cols., 2013). 1.2.3 Papel del intestino en la dislipemia La hiperglucemia es una característica asociada a la DM2, aunque también lo es la alteración del metabolismo lipídico, y es que el metabolismo de los ácidos grasos es un importante regulador de la resistencia a la insulina, elemento clave en la patogénesis de la DM2 (McGarry, 1992). La hipertrigliceridemia postprandial, característica común de la resistencia a la insulina, está atribuida a una sobreproducción por parte del hígado de VLDL (Sparks y cols., 2012). Esta hipertrigliceridemia postprandial es un factor de riesgo cardiovascular muy importante ya que contribuye de manera significativa al desarrollo de aterosclerosis, enfermedad inflamatoria crónica y multifactorial, caracterizada por la acumulación excesiva de colesterol en la capa íntima de la pared arterial y cuyo origen implica una disfunción endotelial, invasión de la pared arterial por Introducción 83 leucocitos y la subsecuente formación de células espumosas. Las partículas ricas en lipoproteínas están implicadas en varios de estos procesos inflamatorios, como la formación de radicales libres, la activación de los leucocitos, la disfunción endotelial y la formación de las células espumosas. La dislipemia es en gran parte debida a la acumulación plasmática de partículas lipoproteicas hepáticas e intestinales ricas en triglicéridos. Esta acumulación es a su vez secundaria a la mayor producción hepática de VLDL, a un defecto en el aclaramiento de las partículas ricas en triglicéridos atribuido principalmente a la disminución de la actividad de la LPL, a una anomalía en la composición apoproteica de las lipoproteínas y al aumento de partículas ricas en triglicéridos en el plasma como resultado de la competencia que se crea entre las partículas ricas en triglicéridos de origen hepático y las de origen intestinal, ya que ambas utilizan la misma ruta catabólica. Un mayor tiempo de permanencia en el plasma de las partículas lipoproteicas ricas en triglicéridos facilita la transferencia de triglicéridos desde estas partículas hacia las LDL y HDL, por acción de las enzimas PLTP y CEPT. Estas LDL y HDL enriquecidas en triglicéridos son sustrato de la lipasa hepática, cuya función es la formación de LDL pequeñas y densas y el incremento del catabolismo de las HDL (Adiels y cols., 2008). Como consecuencia aumenta el número de partículas de LDL pequeñas y densas y baja la concentración de HDL. Los quilomicrones y sus partículas remanentes pueden tener efectos aterogénicos directos al causar daños en las paredes de las arterias, bien sea por la deposición de lípidos o por los efectos oxidativos, inflamatorios o tóxicos que pueden provocar. Además, la acumulación en el plasma de los remanentes de quilomicrones pueden tener efectos aterogénicos de manera indirecta debido a la alteración de las concentraciones plasmáticas de lipoproteínas y/o del metabolismo lipoproteico, a los efectos negativos sobre la sensibilidad a la insulina, a la posibilidad de causar trombosis y a los efectos oxidativos y/o proinflamatorios que de manera indirecta facilitan el desarrollo de aterosclerosis (Krauss, 1998). La acumulación de partículas lipoproteicas ricas en triglicéridos en las paredes de las arterias es el inicio del proceso de aterosclerosis. Los quilomicrones por su Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 84 tamaño, no son capaces de atravesar las paredes de los vasos. Sin embargo, sus remanentes, partículas de menor tamaño, más densas y ricas en colesterol pueden penetrar la pared de los vasos sanguíneos y quedar retenidas en el espacio subendotelial (Proctor y Mamo, 2003). En los procesos de aterosclerosis también se encuentran involucrados los procesos de inflamación. Se ha demostrado que los quilomicrones remanentes están relacionados con esos procesos manteniendo un microambiente proinflamatorio, procoagulante y proaterogénico en la pared arterial, con sus consecuencias deletéreas (Alipour y cols., 2008). También se ha visto que los quilomicrones remanentes están asociados con la apoptosis de células endoteliales (Kawasaki y cols., 2000). En macrófagos y monocitos se ha aislado e identificado un receptor específico de la apo B-48 que únicamente capta remanentes de quilomicrones (Brown y cols., 2000, Varela y cols., 2011). La apo B-48 ha sido aislada de placas aórticas de ateroma en el ser humano (Nakano y cols., 2008). La concentración de colesterol es cuarenta veces superior en las partículas lipoproteicas ricas en apo B-48 que en apo B-100, lo que otorga la posibilidad a estas partículas de liberar cuatro veces más colesterol en la pared vascular que las partículas ricas en apo B-100. De ahí la importancia de los quilomicrones y sus remanentes en los procesos de aterosclerosis (Proctor y cols., 2002). En ayunas, la contribución del intestino a la producción total de triglicéridos por parte del organismo se ha estimado que oscila entre el 10 al 40% de la concentración global de triglicéridos en ratas (Ockner y cols., 1969, Risser y cols., 1978). La producción y secreción basal de lipoproteínas que contienen apo B-48 se encuentra incrementada en el intestino de individuos con DM2 (Curtin y cols., 1996). La contribución del intestino a la hipertrigliceridemia basal también se ha visto incrementada en modelos animales de DM2 (Risser y cols., 1978). Los niveles de apo B-48 en ayunas están asociados a la enfermedad arterial periférica sintomática en pacientes con DM2 (Lapice y cols., 2012), y correlacionan con la enfermedad coronaria arterial (Masuda y cols., 2012). Los niveles séricos de apo B-48 en ayunas correlacionan fuertemente con la lipemia postprandial, y es por esto por lo que se han propuesto como un marcador de lipemia postprandial (Masuda y cols., 2011). Los niveles de apo B-48 Introducción 85 correlacionan con el grosor íntima-media carotídea en individuos con niveles normales de triglicéridos séricos (Nakatani y cols., 2011). Por esto, la concentración de apo B-48 en ayunas podría servir como marcador de riesgo de aterosclerosis, y la relación apo B48/triglicéridos ha sido propuesta como un marcador para la detección temprana de la aterosclerosis, incluso cuando los niveles de triglicéridos no están elevados (YuasaKawase y cols., 2012). 1.2.4 Papel del intestino en la resistencia a la insulina La insulina, la hormona anabólica más importante, promueve la síntesis y almacenamiento de carbohidratos, lípidos y proteínas inhibiendo su degradación (Saltiel y Kahn, 2001). En los estados de resistencia a la insulina, los niveles normales circulantes de insulina son insuficientes para una adecuada regulación del metabolismo. Como resultado de la falta de supresión de la lipolisis en el tejido adiposo, se liberan más ácidos grasos a la circulación. Altos niveles de manera continuada de ácidos grasos en circulación, perpetúan el estado de resistencia a la insulina mediante la inhibición de la captación, almacenaje y oxidación de la glucosa, e incrementando la producción de glucosa hepática (Bergman y Ader, 2000). El contenido de macronutrientes de la dieta puede influir en el desarrollo de la resistencia a la insulina. Así lo muestran estudios que indican que un consumo excesivo de carbohidratos y grasas pueden provocar el desarrollo de la misma (Uauy y Diaz, 2005). En concreto, dietas ricas en fructosa están asociadas al desarrollo de anormalidades metabólicas como la hiperlipemia, hipertensión, ganancia de peso… (Khitan y Kim, 2013). El consumo de fructosa se ha incrementado en las últimas décadas. Una de las razones por las cuales contribuye al incremento de la incidencia de resistencia a la insulina es que es rápidamente absorbida y metabolizada por el hígado. La exposición del hígado a grandes cantidades de fructosa provoca una estimulación de la lipogénesis y una acumulación de triglicéridos, lo que conlleva a una menor sensibilidad a la insulina. Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 86 La dislipemia metabólica es la complicación más común de los estados de resistencia a la insulina y DM2, y se considera que está acentuada por la obesidad así como por factores ambientales como la dieta rica en grasas y el estilo de vida sedentario. Las recientes investigaciones se centran en los procesos fisiológicos en los que el intestino puede exacerbar la dislipemia en los estados de resistencia a la insulina y obesidad, y en cómo se producen estos procesos. El intestino ya no es considerado como un órgano pasivo sino que está activamente implicado en la regulación de la absorción, el transporte intracelular y el metabolismo lipídico, participando así de manera muy importante en el metabolismo lipoproteico. El intestino es un órgano sensible a señales metabólicas. La insulina reduce la secreción de apo B-48 y de quilomicrones en cultivo de explantes fetales de yeyuno (Levy y cols., 1996). A nivel intestinal, los quilomicrones y las partículas remanentes se encuentran incrementados en los estados de resistencia a la insulina (Curtin y cols., 1996). Una de las razones es la sobreproducción de VLDL por parte del hígado y su competición con los quilomicrones por la ruta catabólica que comparten. También se ha descrito que la LPL, enzima necesaria para la lipolisis de los triglicéridos en circulación, y de cuya actividad depende la cantidad de ácidos grasos liberados de los quilomicrones y de VLDL, está estimulada por la insulina (Karpe y cols., 2011). En estados de resistencia a la insulina la actividad de LPL se encuentra disminuida, lo que implica una menor aclaramiento de partículas de quilomicrones y de sus remanentes (Kobayashi y cols., 2007). Además, recientemente se ha descrito que la producción de lipoproteínas que contienen apo B-48 está incrementada tanto en ayunas como en el estado postprandial en modelos animales e individuos con resistencia a la insulina y en DM2 (Duez y cols., 2006, Guo y cols., 2005), encontrándose este aumento asociado con una disminución de la tasa catabólica de los quilomicrones remanentes en pacientes diabéticos (Hogue y cols., 2007). Los mecanismos por los cuales la tasa de producción de lipoproteínas intestinales aumenta en estados de resistencia a la insulina no están aún bien establecidos. En los procesos de resistencia a la insulina y de DM2, los niveles plasmáticos de ácidos grasos libres se encuentran aumentados debido a la saturación de Introducción 87 la capacidad de almacenamiento del tejido adiposo y a la menor supresión por parte de la insulina de la lipolisis intracelular en los adipocitos (Lewis y cols., 2002). Esto provoca que los ácidos grasos libres sean redirigidos hacia otros tejidos que no son el adiposo, alterando así el metabolismo de los mismos. Se ha demostrado que la producción de lipoproteínas intestinales puede estar estimulada por un incremento agudo de los ácidos grasos libres en plasma, mostrando así que no simplemente la disponibilidad de grasa en el lumen intestinal influye en la producción de lipoproteínas intestinales, sino que también la disponibilidad de ácidos grasos libres puede participar en dicho proceso (Duez y cols., 2008). Los mecanismos moleculares que participan en este proceso no están aún descritos. Si los ácidos grasos libres plasmáticos son directamente incorporados a las recién sintetizadas lipoproteínas o si bien, estos ácidos grasos libres estimulan la incorporación de triglicéridos aún se desconoce. En un estudio realizado con el modelo animal de hámster Syrian Golden, modelo de resistencia a la insulina debido a una alimentación rica en fructosa, se sugiere que la producción de partículas lipoproteicas ricas en triglicéridos por parte del intestino puede ser debida a la inducción de la lipogénesis de novo, a un aumento de la síntesis endógena de triglicéridos y de ésteres de colesterol, junto a una mayor estabilidad de apo-B48 intracelular y una mayor expresión de MTP y de apo A-IV. Todo ello contribuye a la formación y secreción de lipoproteínas intestinales de mayor tamaño (Haidari y cols., 2002). Este aumento en la producción de lipoproteínas ricas en triglicéridos de origen intestinal se ha observado en otros modelos animales de resistencia a la insulina (Zoltowska y cols., 2003). En individuos obesos, se ha comprobado que la lipogénesis de novo en el intestino se ve incrementada en los estados de resistencia a la insulina, junto con un incremento de la síntesis de apo B-48 y un aumento en la síntesis y secreción de lipoproteínas ricas en triglicéridos (Veilleux y cols., 2014). Introducción 89 1.3 LIPOGÉNESIS DE NOVO La lipogénesis de novo es una ruta metabólica que sintetiza ácidos grasos cuando hay un exceso de carbohidratos. Estos ácidos grasos pueden ser incorporados a los triglicéridos para almacenar energía. La lipogénesis consta de una serie de reacciones mediante las cuales el acetil-CoA, producto intermediario del metabolismo de la glucosa, se convierte en ácidos grasos. Estas reacciones tienen lugar fuera de la mitocondria. El acetil-CoA es sintetizado en la mitocondria por descarboxilación oxidativa del piruvato y no puede atravesar la membrana mitocondrial. En su lugar, es el citrato el que atraviesa la membrana. Una vez en el citoplasma, la lipogénesis de novo se realiza por medio de dos sistemas enzimáticos ubicados en el citoplasma celular: la acetil-CoA carboxilasa (ACC), que convierte el acetil-CoA en malonil-CoA y la ácido graso sintetasa (FAS, del inglés “fatty acid sinthase”), que cataliza la síntesis de palmitato a partir de una molécula de acetil-CoA y siete de malonil-CoA. El palmitato sintetizado de novo puede ser modificado por la elongasa Elovl-6 (Elovl-6, del inglés “elongation of very long-chain fatty acid family member 6”) y la esteaoril-CoA desaturasa-1 (SCD-1, del inglés “stearoyl-CoA desaturase-1”) para producir otras especies lipídicas. Elovl-6 cataliza la elongación de los ácidos grasos de 12, 14 o 16 carbonos, y para ello usa malonil-CoA como sustrato y NADPH como agente reductor. Mientras, la SCD-1 introduce un doble enlace en la posición ∆9 del ácido graso saturado. Factores dietéticos como la cantidad y el tipo de carbohidratos, el contenido de fibra y el tipo de grasas pueden influir sobre el efecto de los carbohidratos en los lípidos plasmáticos (Frayn y Kingman, 1995). Los niveles de glucosa en sangre pueden estimular la lipogénesis a través de varios mecanismos (Kersten, 2001). Uno de ellos es que el metabolismo de la glucosa a través de la ruta glucolítica aporta la fuente de carbono necesaria para la síntesis de ácidos grasos (Strable y Ntambi, 2010). Otro mecanismo es que la glucosa induce la expresión de los enzimas implicados en la ruta lipogénica (Kersten, 2001), uno de los motivos es porque induce la liberación de insulina, la cual ejerce su regulación sobre los genes lipogénicos a través de la Introducción 97 1.4 GLUCONEOGÉNESIS La producción endógena de glucosa es una función crucial que permite al organismo mantener una concentración de glucosa en plasma en niveles normales en aquellas situaciones en las cuales la captación de glucosa a partir de los alimentos se encuentra ausente, como por ejemplo durante la noche. La glucosa es la principal fuente de energía para el metabolismo de la mayoría de tejidos. El mantenimiento de la concentración de glucosa en sangre en un rango adecuado es importante principalmente por dos razones. Primero, el requerimiento de glucosa por parte del cerebro como fuente de energía; en estado postprandial el cerebro utiliza glucosa casi exclusivamente, requiriendo ~117-142 g/día (Institute of Medicine, 2005). El segundo motivo por el cual se produce esta cuidadosa regulación de la concentración de glucosa es porque la glucosa puede llegar a ser tóxica llegando a provocar modificación de proteínas (Degenhardt y cols., 1998) o daño oxidativo (Huebschmann y cols., 2006), así como otros efectos adversos producidos por un exceso de glucosa que se han demostrado en pacientes con DM2 mal controlada (Skyler, 1996). La producción endógena de glucosa se produce principalmente en el hígado, donde la glucosa se produce a partir de la rotura del glucógeno almacenado (glucogenolisis), o bien, de novo (gluconeogénesis). La gluconeogénesis es un proceso en el cual precursores no carbohidratados (piruvato, lactato, glicerol, alanina y glutamina) son convertidos en glucosa. Es el proceso reverso de la glicolisis y tiene lugar en su mayor parte en el citoplasma de la célula. En estado postprandial, el glucógeno se almacena en el hígado y en el músculo esquelético. Esto, junto con la glucosa que se absorbe en el intestino constituye la principal fuente de glucosa para los tejidos periféricos para las siguientes horas. El periodo entre comidas y especialmente durante la noche, cuando no hay ingesta de alimentos, la glucogenolisis libera la glucosa almacenada en forma de glucógeno, de manera que el glucógeno se va agotando. Cuando esto ocurre, la glucosa es sintetizada a través de la ruta gluconeogénica. Por tanto, la función de la gluconeogénesis es proporcionar al organismo glucosa en aquellas condiciones fisiológicas en las cuales los Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 98 depósitos de glucógeno están agotados y no hay absorción de glucosa por parte del intestino. Una de las alteraciones asociadas a la DM2 es el incremento de producción de glucosa endógena, la cual contribuye a la hiperglicemia característica de la enfermedad (Woerle y cols., 2006). Se ha demostrado que la gluconeogénesis se ve incrementada en el hígado durante el ayuno y en la DM2 (Pilkis y cols., 1988), así como en la corteza del riñón durante ayuno prolongado, DM2 y en acidosis metabólica (Adrogue, 1992). En pacientes con DM2 se ha observado un incremento de la gluconeogénesis a partir de diversos sustratos como el lactato, la alanina, el piruvato y el glicerol (Puhakainen y cols., 1992, Stumvoll y cols., 1996). En modelos animales de obesidad, resistencia a la insulina e intolerancia a la glucosa se ha observado un incremento en los niveles de las enzimas implicadas en la gluconeogénesis (Song y cols., 2001, Andrikopoulos y Proietto, 1995). La mayoría de las reacciones de la gluconeogénesis son catalizadas por las mismas enzimas de la ruta glucolítica y proceden a la inversa de los pasos utilizados en la glucolisis. Sin embargo, hay tres pasos irreversibles que son llevados a cabo por enzimas exclusivas de la gluconeogénesis. Estas reacciones son la formación de fosfoenolpiruvato, la formación de fructosa 6-fosfato y la formación de glucosa. Síntesis de fosfoenolpiruvato: Comienza en la mitocondria con la conversión de piruvato a oxalacetato por la piruvato carboxilasa (PC) que usa biotina como coenzima. La ruta continúa en el citoplasma, para lo cual el oxalacetato tiene que atravesar la membrana mitocondrial. Al no poder atravesarla por difusión, es transportado al citoplasma a través de dos mecanismos: o bien, la conversión a fosfoenolpiruvato, reacción llevada a cabo por la PEPCK; o bien, mediante la reducción a malato a expensas de NADH por la malato deshidrogenasa. El malato atraviesa la membrana mitocondrial y es reconvertido a oxalacetato en el citoplasma por la malato deshidrogenasa citosólica usando NADPH2 como coenzima. El oxalacetato es fosforilado a fosfoenolpiruvato por la PEPCK. Posteriormente, el fosfoenolpiruvato se convierte en frucotsa 1,6-bifosfato siguiendo, en sentido contrario las reacciones reversibles de la glucolisis. Introducción 99 Conversión de fructosa 1,6-bifosfato en fructosa 6-fosfato: Es una reacción hidrolítica por la cual se elimina el grupo fosfato en posición 1 de la fructosa por acción de la enzima fructosa 1,6-bifosfatasa (FBPasa). La fructosa 6-fosfato se convierte en glucosa 6-fosfato por la reacción reversible de la glucolisis. Figura 15: Gluconeogénesis. Formación de glucosa a partir de glucosa 6-fosfato: En esta reacción se libera el grupo fosfato en posición 6 de la glucosa por acción de la G6Pasa. Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 100 A continuación se describen algunas de las enzimas que participan en la gluconeogénesis, las cuales son objeto del presente estudio. 1.4.1 Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) La PEPCK es una enzima monomérica de 69 kDa que cataliza la reacción de conversión de oxalacetato en fosfoenolpiruvato. Se expresa principalmente en el hígado y riñón y también en tejido adiposo, glándula mamaria durante la lactancia e intestino delgado (Chakravarty y cols., 2005). Su función en tejidos no gluconeogénicos no está aún muy definida. En el tejido adiposo, por ejemplo participa en la gliceroneogénesis, la formación de glicerol-3-fosfato necesario para la síntesis de los triglicéridos (Hanson y Reshef, 2003). En mamíferos se han descrito dos isoformas, una citosólica y otra mitocondrial, codificadas por genes distintos pero homólogos. La isoenzima citosólica está codificada por el gen PCK1 localizado en humanos en el cromosoma 20q.13.13. La isoenzima mitocondrial está codificada por el gen PCK2 localizado en humanos en el cromosoma 14q.11.2. Ambas isoenzimas son proteínas de 622 y 640 aminoácidos respectivamente, teniendo un 68% de identidad y un 82% de similitud en sus secuencias (Beale y cols., 2007). PEPCK es considerada una enzima clave en la gluconeogénesis, aunque también participa en otras rutas como son la gliceroneogénesis, la síntesis de serina y en la cataplerosis de los intermediarios del ciclo del ácido cítrico (retirada de los aniones del ciclo del ácido cítrico). Los principales factores que incrementan la expresión de la enzima PEPCK son el AMP cíclico, los glucocorticoides y las hormonas tiroideas, mientras que la insulina ejerce un efecto inhibitorio (Hanson y Reshef, 1997). La mayoría de los estudios se han realizado sobre la isoforma citosólica de la PEPCK, siendo considerada un marcador virtual de la gluconeogénesis hepática, si bien en la mayoría de mamíferos, incluyendo humanos, el 50% de la actividad total de la enzima PEPCK corresponde a la isoforma mitocondrial (Hanson, 2009). Tras años de estudio de la isoforma citoplasmática, el consenso general es que alteraciones en la Introducción 101 transcripción del gen que codifica para PEPCK citosólica regulan la actividad total de esta enzima. En modelos animales genéticamente modificados carentes de la enzima PEPCK citosólica en el hígado y que sobreexpresaban la enzima PEPCK mitocondrial, se demostró que la enzima PEPCK mitocondrial contribuía a la producción hepática de glucosa (Mendez-Lucas y cols., 2013), concluyendo que a pesar de su potencial gluconeogénico, coopera con la enzima PEPCK citosólica ajustando los flujos gluconeogénicos a los cambios en los sustratos y energía disponible. Ratas con diabetes inducida por estreptozotocina presentan niveles elevados de ARNm y de actividad de la enzima PEPCK, tanto en el duodeno como en el yeyuno. El tratamiento con insulina durante 10 horas provoca una disminución en los niveles de ARNm, lo cual muestra el efecto inhibitorio de la insulina sobre los niveles de expresión génica de la enzima PEPCK en el intestino delgado de ratas (Rajas y cols., 2000). En ratones transgénicos que sobreexpresaban PEPCK en el hígado se ha descrito una resistencia a la insulina hepática y una tolerancia alterada a la glucosa (Valera y cols., 1994, Sun y cols., 2002). En ratas que sobreexpresaban PEPCK en los riñones se ha mostrado una tolerancia alterada a la glucosa, resistencia a la insulina hepática, así como resistencia a la insulina en músculo y tejido adiposo (Lamont y cols., 2003). 1.4.2 Fructosa 1,6-bifosfatasa (FBPasa) Cataliza la conversión irreversible de fructosa 1,6-bifosfato a fructosa 6-fosfato y fosfato inorgánico. Esta enzima está activada por diversos cationes monovalentes e inhibida competitivamente por fructosa 2,6-bifosfato y alostéricamente por adenosin 5monofosfato y nicotinamida adenina dinucleótido. En mamíferos existen dos genes FBP1 y FBP2 que codifican para dos isoenzimas. FBP1 codifica la FBPasa hepática, que se expresa principalmente en órganos gluconeogénicos. La isoforma codificada por FBP2 se expresa en el músculo estriado y es ampliamente expresada en células no gluconeogénicas. Ambas isoformas comparten un 77% de identidad a nivel proteico. Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 102 En modelos animales de obesidad y resistencia a la insulina se ha mostrado un incremento de la actividad hepática de la enzima FBPasa (Andrikopoulos y cols., 1993, Song y cols., 2001). En ratones que sobreexpresan la enzima FBPasa hepática humana, se ha observado un incremento de la gluconeogénesis a partir de glicerol como resultado de la sobreexpresión de la FBPasa hepática humana (Lamont y cols., 2006). En humanos, un incremento de FBPasa hepática se ha relacionado con un incremento de la producción endógena de glucosa, ya que en pacientes obesos con DM2 se ha observado un incremento de la gluconeogénesis a partir de glicerol (Puhakainen y cols., 1992), sustrato que entra en la ruta gluconeogénica justo antes de la reacción catalizada por la FBPasa. 1.4.3 Glucosa 6-fosfatasa (G6Pasa) La enzima G6Pasa es una enzima crucial en el control de la homeostasis de la glucosa. Cataliza la última reacción bioquímica de la ruta de la gluconeogénesis y glucogenolisis, consistente en la hidrólisis de la glucosa 6-fosfato en glucosa y fosfato inorgánico. La G6Pasa se encuentra embebida en la membrana del retículo endoplasmático. Es un sistema formado por diversas proteínas integrales de membrana, una subunidad catalítica y transportadores de glucosa 6-fosfato, fosfato inorgánico y glucosa. Existen distintas isoformas de la subunidad catalítica que están codificadas por distintos genes: G6PC, G6PC2 y G6PC3. El gen G6PC se expresa principalmente en hígado y riñones, y a niveles mas bajos en intestino e islotes pancreáticos (van de Werve y cols., 2000). En islotes pancreáticos también se expresa el gen G6PC2, codificante para la subunidad catalítica de la G6Pasa específica de islotes pancreáticos (IGRP, del inglés “islet glucose-6phosphatase catalytic subunit-related protein”) llamada así por su expresión selectiva en este tejido (Arden y cols., 1999). Esta subunidad catalítica codificada por G6PC2 es similar en tamaño, 355 aminoácidos, topología y secuencia (alrededor del 50% de identidad a nivel de aminoácido) a la subunidad catalítica codificada por G6PC. Su sobreexpresión in vitro no incrementa la hidrólisis de la glucosa-6-fosfato, y por lo Introducción 103 tanto su papel aún no está bien definido (Arden y cols., 1999). G6PC3 codifica para la isoforma denominada glucosa-6-fosfatasa expresada ubicuamente (UGRP, del inglés “ubiquitously expressed glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein”) que aunque se expresa principalmente en cerebro, músculo y riñón, se ha detectado en todos los tejidos estudiados. La G6Pasa está regulada por la insulina en hígado y riñones (Mithieux y cols., 1996) así como en el intestino delgado (Rajas y cols., 1999). En modelos animales se ha descrito que tanto sus niveles de expresión como sus niveles de actividad enzimática están incrementados durante el ayuno y en la DM2 (Rajas y cols., 1999, Mithieux y cols., 2004b). La G6Pasa está considerada como la enzima crucial para el inicio de la gluconeogénesis en el intestino (Mithieux y cols., 2004b). Un estudio en un modelo animal muestra que durante las primeras horas de ayuno, la inducción del gen de la PEPCK no es suficiente para desencadenar una producción de glucosa detectable en el intestino delgado, a pesar de que su actividad enzimática alcanza los niveles máximos a las 24 horas de ayuno, momento en el cual la actividad de la enzima G6Pasa aún no se ha incrementado (Mithieux y cols., 2004a). Sin embargo, la producción de glucosa por parte del intestino se ha situado entorno al 20% de la producción endógena de glucosa total a las 48 horas de ayuno, momento en el cual ambas enzimas muestran un incremento de su actividad (Mithieux y cols., 2004a, Croset y cols., 2001). Esto ha llevado a sugerir que la enzima G6Pasa es más importante que la enzima PEPCK para la iniciación de la gluconeogénesis intestinal. 1.4.4 Glutaminasa La glutaminasa es una enzima mitocondrial que cataliza la hidrólisis de glutamina a glutamato, amonio y agua. La glutamina es el aminoácido más común en el organismo y juega un papel fundamental en procesos metabólicos como el transporte de nitrógeno, el estado redox celular y en el metabolismo energético. La glutamina también sirve como precursor de la síntesis de proteínas, aminoácidos y/o ácidos nucleicos. Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 104 Hay descritas dos isoformas de la enzima glutaminasa, que provienen de genes relacionados pero diferentes. La glutaminasa hepática se encuentra en el hígado y participa en la regulación de la gluconeogénesis en el hígado y en la síntesis de urea. La otra isoforma, es conocida como glutaminasa renal y no solo se localiza en los riñones, sino que también se encuentra en el intestino y en otros tejidos extra-hepáticos. En el hígado, los principales precursores gluconeogénicos son la alanina y el lactato. Sin embargo, la glutamina no es utilizada como sustrato gluconeogénico debido a la baja afinidad que muestra la glutaminasa hepática por su sustrato, a diferencia de la alta afinidad que muestra la glutaminasa expresada en el intestino (Windmueller, 1984). La principal función de la glutaminasa en el intestino es la regulación del metabolismo del enterocito, ya que la glutamina es la principal fuente de energía del enterocito. 1.4.5 Regulación de la gluconeogénesis La regulación de la gluconeogénesis ocurre a múltiples niveles como la expresión génica, la regulación alostérica por pequeños metabolitos y modificaciones post-traduccionales. Los niveles de expresión de G6Pasa y PEPCK están regulados por hormonas como la insulina (Rajas y cols., 1999, Rajas y cols., 2000), factores de transcripción como SREBP-1c y por enzimas transductores de señales como PI3K (Dickens y cols., 1998). La leptina, es otra hormona implicada en la homeostasis de la glucosa que podría estar implicada en la regulación de la gluconeogénesis. 1.4.5.1 PI3K La PI3K es necesaria para la supresión de la expresión de la G6Pasa por la insulina (Dickens y cols., 1998). Se ha descrito que la activación de PI3K por la insulina se encuentra fuertemente reducida en el hígado de ratones diabéticos (Folli y cols., 1993). En ratones transgénicos se ha mostrado como la sobreexpresión de la subunidad catalítica de PI3K es suficiente para reducir considerablemente la expresión de los genes PEPCK y G6Pasa. Además, la sobreexpresión en un mutante de la subunidad Introducción 105 reguladora p85-α de PI3K, el cual carece de sitio de unión para subunidad catalítica, incrementa la expresión de PEPCK y G6Pasa, así como la producción de glucosa hepática in vivo (Miyake y cols., 2002). En hepatocitos, la activación de PI3K por la insulina juega un papel importante en la síntesis de glucógeno y en la inhibición de la expresión de PEPCK (Sutherland y cols., 1995). Es por ello por lo que la activación de PI3K por la insulina se considera fundamental para la regulación de la gluconeogénesis. 1.4.5.2 SREBP-1c Como hemos comentado anteriormente, SREBP es una familia de factores de transcripción que regulan la expresión de genes que participan en el metabolismo de ácidos grasos, triglicéridos y colesterol (Horton y cols., 2002). Estudios previos también han mostrado que SREBP-1 está involucrado en la regulación de genes que participan en el metabolismo de los carbohidratos, como la G6Pasa y la PEPCK (Yamamoto y cols., 2004). La expresión de SREBP-1c está inducida por la insulina, mientras que el glucagón ejerce el efecto contrario (Foretz y cols., 1999). En hepatocitos de rata, se ha demostrado que la ruta de señalización que implica IRS1-PI3K es esencial para la expresión de SREBP1c inducida por insulina (Matsumoto y cols., 2002). El efecto de la insulina sobre la SREBP-1c podría estar mediado a través de IRS1, ya que en modelos animales de resistencia a la insulina donde la expresión de IRS2 está ausente o disminuida, se induce la expresión tanto de SREBP-1c como de sus genes diana (Shimomura y cols., 2000). Además, la inhibición de la fosforilación de IRS1 anula la inducción de la expresión de SREBP-1c por insulina en hepatocitos de rata in vitro (Matsumoto y cols., 2002). El efecto de la insulina sobre la expresión y síntesis de SREBP-1c implica principalmente a la ruta mediada por PI3K (Matsumoto y cols., 2002). Los genes que codifican para las enzimas gluconeogénicas están regulados negativamente por la insulina. En ratones con diabetes inducida por estreptozotocina, la sobreexpresión de SREBP-1c mediante adenovirus en el hígado dio como resultado el incremento en la expresión de enzimas lipogénicos como FAS y una disminución de la Hipótesis y Objetivos 113 2.1 Hipótesis y objetivos El papel del intestino en la absorción de nutrientes y en el metabolismo de la glucosa a través de la captación de la glucosa y su actividad glucolítica es bien conocido. Sin embargo, en los últimos años, diversos estudios muestran que el intestino es un órgano metabólicamente activo, recibiendo informaciones de la periferia y siendo capaz de modular sus procesos de síntesis y secreción de lípidos en relación a los sutratos, las hormonas y otras sustancias endógenas o exógenas. Este trabajo nace con el objetivo de estudiar el papel del intestino delgado en la regulación de la homeostasis de la glucosa y lipídica en un grupo de obesos mórbidos (OM) sometidos a un intervención de cirugía bariátrica. En dicha intervención, se tomaron muestras de yeyuno con el fin de investigar la relación entre la resistencia a la insulina y el metabolismo de la glucosa y de los lípidos y lipoproteínas en el yeyuno en un modelo humano de obesidad. 2.1.1 Hipótesis  En paciente OM con alta resistencia a la insulina puede existir una alteración de la lipogénesis de novo intestinal y de la producción de quilomicrones.  El intestino puede participar en la regulación de la homeostasis de la glucosa a través de la gluconeogénesis, pudiendo estar ésta modificada por la presencia de una alta resistencia a la insulina.  La metformina podría modificar los niveles de lípidos y de glucosa en el intestino al alterar la lipogénesis y la gluconeogénesis respectivamente.  La glucosa, la insulina y la leptina pueden participar en la regulación de la homeostasis de la glucosa y lipídica a nivel intestinal. Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 114 2.1.2 Objetivos  Evaluar la relación existente entre la resistencia a la insulina/DM2 y la lipogénesis de novo y la síntesis de lipoproteínas en el yeyuno de pacientes OM.  Estudiar el efecto de la glucosa, la insulina y la leptina sobre la lipogénesis de novo y la síntesis de lipoproteínas en células epiteliales intestinales (IECs) aisladas de pacientes OM con baja resistencia a la insulina.  Evaluar la relación existente entre resistencia a la insulina/DM2 y la gluconeogénesis en el yeyuno de pacientes OM.  Estudiar el efecto de la glucosa, la insulina y la leptina sobre la gluconeogénesis en IECs aisladas de pacientes OM con baja resistencia a la insulina.  Evaluar la relación existente entre la resistencia a la insulina/DM2 y la vía de señalización de la insulina en el yeyuno de pacientes OM.  Estudiar el efecto de la glucosa, la insulina y la leptina sobre la vía de señalización de la insulina en IECs aisladas de pacientes OM con baja resistencia a la insulina.  Evaluar el efecto de la metformina sobre la restitución de la homeostasis de la glucosa y lipídica en el yeyuno de pacientes OM. 115 3. 3.3. 3. Material MaterialMaterial Material y Métodos y Métodosy Métodos y Métodos Material y Métodos 117 3.1 Diseño y sujetos del estudio 3.1.1 Diseño del estudio El presente trabajo está realizado en un grupo de pacientes con obesidad mórbida que fueron sometidos a una intervención de cirugía bariátrica por la técnica de RYGB. Consta de un estudio transversal para evaluar los niveles de expresión de ARNm genes implicados en la producción endógena de glucosa y en el metabolismo lipídico del yeyuno, su asociación con la resistencia a la insulina y DM2, así como de un estudio in vitro realizado en IECs donde se evalúa la regulación de los niveles de expresión de genes implicados en la producción endógena de glucosa y del metabolismo lipídico por la glucosa, la insulina y la leptina. 3.1.2 Sujetos del estudio Se consideraron OM a aquellos individuos con un IMC≥ 40 kg/m2 según la clasificación propuesta por la OMS (Tabla 1). El estudio se llevó a cabo en 45 OM que fueron sometidos a una intervención de cirugía bariátrica por la técnica de RYGB. Fueron excluidos del estudio aquellos individuos con enfermedad cardiovascular, inflamación aguda o enfermedad infecciosa o aquellos que estaban recibiendo tratamiento que podía alterar el perfil lipídico. También fueron excluidos los OM con DM2 que estaban recibiendo tratamiento con insulina u otro antidiabético oral. Todos los pacientes siguieron una dieta similar baja en calorías durante dos semanas antes de someterse a la cirugía, independientemente de su estado de obesidad y resistencia a la insulina (630 Kcal/día, Optisource, Novartis Consumer Health S.A.). Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado y el estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital Regional Universitario de Málaga. Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 118 Los OM que formaron parte del estudio se clasificaron en tres grupos en función de su resistencia a la insulina medida a través del modelo de evaluación homeostática para determinar la resistencia a insulina (HOMA-IR, del inglés “homeostasis model assessment of insulin resistance”), tomando como punto de corte el percentil 50 de la distribución de frecuencias del HOMA-IR de aquellos OM sin tratamiento con metformina, y en función de la presencia de DM2 en tratamiento con metformina:  OM con un índice HOMA-IR bajo (HOMA-IR≤4.7) (OM-baja IR)  OM con un índice HOMA-IR alto (HOMA-IR >4.7) (OM-alta IR)  OM con DM2 que estaban recibiendo tratamiento con metformina (OM-DM2met). 3.1.3 Variables de estudio 3.1.3.1 Variables antropométricas A todos los individuos del estudio se les midieron una serie de variables antropométricas las cuales se encuentran recogidas en la siguiente tabla (Tabla 4): Tabla 4: Datos clínicos y antropométricos medidos en los obesos mórbidos Variable Unidades Edad Años Peso Kg Talla m Índice de masa corporal Kg/m2 Cintura cm Cadera cm Material y Métodos 119 3.1.3.2 Variables bioquímicas La medida de los parámetros bioquímicos en el suero se realizó por duplicado en todas las muestras. Las muestras de sangre se tomaron antes de comenzar con la dieta baja en calorías a la que son sometidos los pacientes antes de la cirugía y después de 1012 horas de ayuno. El suero y plasma fueron separados y congelados inmediatamente a - 80°C. Una alícuota de plasma sin congelar se usó para el aislamiento de lipoproteínas. La glucosa, el colesterol, HDL-c, triglicéridos (Randox Laboratories Ltd, Antrium, Reino Unido) y ácidos grasos libres (Wako Chemicals USA, Inc, Richmond, Virginia, EE.UU.) se midieron por métodos enzimáticos estándar. El LDL-c se calculó por la fórmula de Friedewald (Friedewald y cols., 1972): LDL-c= colesterol total - HDL-c - (triglicéridos / 5). La insulina fue analizada por radioinmunoensayo (BioSource International, Camarillo, California, EE.UU.) con una reacción cruzada de proinsulina del 0.3%. El coeficiente de variación inter-ensayo e intra-ensayo fue del 1.9% y 6.3% respectivamente. La apo B-48 fue analizada por inmunoensayo enzimático (ELISA) (Shibayagi Co. Ltd., Shibukawa, Japón). La reacción cruzada con la apo B-100 humana es menor que el límite de detección inferior. El coeficiente de variación intra-ensayo e interensayo fue de 3.5% y 5.7% respectivamente. La sensibilidad de la técnica fue de 2.5 ng/ml. La apo A-IV fue analizada por ELISA (Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts, EE.UU.). El coeficiente de variación intra-ensayo e inter-ensayo fue de 4.6% y 12.2% respectivamente. La sensibilidad de la técnica fue de 0.078 µg/ml. El índice HOMA-IR fue calculado con la siguiente fórmula (Matthews y cols., 1985): HOMA-IR = insulina en ayunas (µIU/ml) x glucosa en ayunas (mmol/l)/22.5. Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 120 3.1.3.3 Separación de lipoproteínas plasmáticas Las lipoproteínas fueron separadas en el plasma por ultracentrifugación (Cardona y cols., 2003): • A 1.5 ml de plasma se le añadió sin mezclar, 1 ml de suero fisiológico salino. La fracción correspondiente a los quilomicrones fue separada del plasma por flotación mediante centrifugación a 35000 rpm en un rotor de 45° (Beckman TLA 100.3) durante 30 minutos a 18°C sin freno. • Del infranadante de la centrifugación anterior, tomamos 1 ml y le añadimos sin mezclar 1ml de solución densidad 1.006 g/ml. La fracción correspondiente a VLDL fue separada del plasma por flotación mediante centrifugación a 55000 rpm en un rotor de 45° (Beckman TLA 100.3) durante 18 horas a 7°C sin freno. • Después de la separación de las VLDL, al infranadante se le añadió 0.385 g de bromuro de potasio y 0.025 g sacarosa. Se disolvió sin formar espuma y se le añadió 25 µl de una solución saturada de azul de Coomassie (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.) para la visualización de las bandas correspondiente a cada uno de los tipos de lipoproteínas restantes. • Posteriormente, y sin mezclar, se le añadió 1 ml de solución de densidad 1.210 g/ml y 2 ml de agua destilada. Material y Métodos 121 • El resto de lipoproteínas IDL, LDL y HDL, se separaron mediante centrifugación en gradiente de densidad a 45000 rpm en un rotor basculante (Beckman SW.60Ti), durante 22h a 7°C, sin freno. • La concentración de colesterol y triglicéridos se midió en cada una de las fracciones por métodos enzimáticos estándar. 3.1.3.4 Preparación de soluciones para la separación de lipoproteínas Todos los reactivos empleados provenían de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.).  Solución de densidad 1.006 g/ml: 11.6 g de ClNa, 0.5 g de Azida Na, EDTA Na 0.41 g, gentamicina sulfato 0.08 g, cloranfenicol 5 g. Completar hasta un litro con agua destilada y ajustar el pH a 7.4.  Solución de densidad 1.21 g/ml: Tomar 100 ml de la solución de densidad 1.006 g/ml y añadir 32.5 g de KBr.  Solución de densidad 1.063 g/ml: Tomar 100 ml de solución de densidad 1.006 g/ml y añadir 8.5 g de KBr. 3.1.4 Obtención de las muestras de yeyuno Las muestras de yeyuno fueron obtenidas durante la cirugía bariátrica por la técnica de RYGB, a 40 cm del ligamento de Treitz. Las muestras fueron lavadas en solución salina de Hank (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.), fraccionadas y preparadas para los ensayos histoquímicos e inmunohistoquímicos, la cuantificación del Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 128 e intensidad de fluorescencia para los dos fluorocromos empleados (Alexa Fluor 488 y APC). • Brevemente, se estableció una primera ventana en función del tamaño y granularidad celular. A partir de aquí, se selecionaron aquellas células que eran CD45-. Tras ello se seleccionaron aquellas que expresaban el antígeno A33 (A33+). • Se analizó tanto el porcentaje de células que expresaban esta molécula de superficie, como la intensidad de fluorescencia mostrada (Shapiro, 2003). 3.1.5.2 Viabilidad de las IECs aisladas Para determinar el número de células viables se realizó un test de exclusión con azul de tripán (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Este método está basado en que las células viables no captan el azul de tripán mientras que las células muertas si lo hacen, por lo tanto se cuentan como muertas las células teñidas de azul y como vivas las refringentes. También se utilizó el kit comercial de luminiscencia CellTiter-Glo® (Promega, Southampton, Reino Unido) que consiste en la adición de un único reactivo a las células en cultivo, que da lugar a la lisis de las células y la generación de una señal luminiscente que es proporcional a la cantidad de ATP liberado por las células viables. Se añade la misma cantidad de reactivo CellTiter-Glo® que de medio hay presente en el pocillo. Se incuba durante dos minutos en agitación a temperatura ambiente y se determina su luminiscencia en el luminómetro (Sinergy Mx, Bio Tek Instruments, Inc. Winooski, Vermont, EE.UU.). 3.1.6 Determinación de los niveles de expresión de los genes candidatos Material y Métodos 129 3.1.6.1 Extracción de ARN de los tejidos y de las IECs aisladas e incubados La extracción de ARN se realizó con el kit comercial de Qiagen Rneasy Mini Kit y Rnase-free DNase Set (Qiagen Science, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante: • Antes de comenzar el protocolo añadimos 10 µl de β-mercaptoetanol (BME) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EEUU) por cada ml de tampón RLT y preparamos el tampón RPE con etanol (Merck, Darmstadt, Alemania). • Todas las centrifugaciones se realizaron a temperatura ambiente en una centrífuga de mesa. • La mucosa del tejido fue raspada suavemente. A este raspado se le añadió 350 µl de tampón RLT con BME y se homogenizó bien con la ayuda de una pipeta. • Centrifugamos el lisado durante 3 minutos a máxima velocidad. Pasamos el sobrenadante a un nuevo tubo y descartamos el precipitado. • Añadimos 350 µl de etanol al 70% y pipeteamos bien. • Transferimos todo la muestra (700 µl) a una columna del RNeasy kit y centrifugamos 15 segundos a 11000 rpm. Descartamos el filtrado. • Añadimos 350 µl de tampón RW1 a la columna y centrifugamos durante 15 segundos a 11000 rpm. Descartamos el filtrado. Para la eliminación de los restos de ADN continuamos con el kit Rnase-free DNase Set (Qiagen Science, Hilden, Alemania): • Preparamos una solución compuesta por 10 µl de solución stock de DNase I y 70 µl de tampón RDD para cada una de las muestras. Mezclamos suavemente por inversión. • Añadimos los 80 µl de la mezcla a la membrana de la columna e incubamos durante 15 minutos a 20-30°C. Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 130 • Añadimos 350 µl de tampón RW1 a la columna y centrifugamos 15 segundos a 11000 rpm. Descartamos el filtrado. • Añadimos 500 µl de tampón RPE (con etanol) y centrifugamos durante 15 segundos a 11000 rpm. Descartamos el filtrado. • Añadimos 500 µl de tampón RPE (con etanol) y centrifugamos durante 2 minutos a 11000 rpm. Descartamos el filtrado. • Realizamos una nueva centrifugación a máxima velocidad durante un minuto para eliminar cualquier posible resto de los tampones empleados. • Colocamos la columna en un tubo de 1.5 ml y añadimos 40 µl de agua a la membrana de la columna. Dejamos reposar la columna un par de minutos. • Centrifugamos durante un minuto a 11000 rpm. Volvemos a cargar el eluído en la columna y repetimos la centrifugación. 3.1.6.2 Cuantificación del ARN La concentración de ARN se midió en un espectrofotómetro NanoDrop ND2000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Boston, Massachusetts, EE.UU.). Además de la concentración nos da información sobre la pureza de la muestra. La relación de absorbancia 260/280 debe de estar cercano a 1.8-2, si el valor es menor, puede indicar la presencia de proteínas, fenoles u otros contaminantes que absorben fuertemente cerca de 280 nm. La relación de absorbancia 260/230 es una medición secundaria que también indica la pureza del ARN. Si el valor es más bajo esto puede indicar la presencia de contaminantes co-purificados que absorben a 230 nm, como solventes y sales. 3.1.6.3 Reversotranscripción En este paso el ARN es convertido a ADNc con el fin de poder estudiar los niveles de expresión de los genes incluidos en el estudio. Material y Métodos 131 Para ello se tomó el volumen correspondiente a 250 µg de ARN y se completó hasta 10 µl con agua libre de ARNasas (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.). A esto se le añadió 4 µl de tampón M-MLV RT 5X (Promega Corporation, Madison, EE.UU.), 2.5 µl de dinucleótidos trifosfato (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, EE.UU.) provenientes de un stock 10mM, 0.5 µl de cebadores al azar de una concentración de 0.1 µgr/ µl (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, EE.UU.) y 1 µl de agua libre de ARNasas. Esta mezcla se introdujo en el termociclador (Eppendorf Instruments, Hamburgo, Alemania) durante 10 minutos a 65°C. Tras este ciclo, se añadió 1 µl de enzima reversotranscriptasa M-MLV a 100U/ µl (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, EE.UU.) y se sometió a un ciclo de una hora a 37°C. Para cada reacción de reversotranscripción se hicieron dos tipos de blancos, uno de muestra y otro de enzima. 3.1.6.4 PCR a tiempo real El estudio de los niveles de expresión de los genes seleccionados se realizó a través de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (RT-PCR, del inglés “real time-polymerase chain reaction”) empleando un termociclador a tiempo real (ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.)). Para estos ensayos se usó el sistema de detección por fluorescencia basado en agentes intercalantes (fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hélice), concretamente utilizamos el KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (Kapa biosystems, Boston, Massachusetts, EE.UU.) que emplea un colorante de referencia pasiva (ROX) para normalizar las variaciones entre los distintos pocillos. Las mezclas empleadas para la RT-PCR se prepararon como se detalla en la Tabla 5. Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 132 Tabla 5: Relación de reactivos y volúmenes empleados para la mezcla de RT-PCR. Reactivo Volumen por muestra (µl) Agua libre de ARNasas y ADNasas 6.8 Cebador sentido 10 mM 0.4 Cebador antisentido 10 mM 0.4 Kapa SYBR Fast 10 ROX 0.4 cADN 2 Todos los cebadores utilizados fueron diseñados con ayuda del software Primer3, disponible en Internet de forma gratuita (http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi). Para llevar a cabo las RT-PCR se empleó el termociclador ABI 7500 Fast RealTime PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.) con el siguiente protocolo de temperaturas que se especifica en la Tabla 6. La expresión de cada uno de los genes estudiados fue relativizada a la expresión del gen 18S utilizando el método del ∆∆Ct (Livak y Schmittgen, 2001). Tabla 6: Protocolo empleado para la realización de RT-PCR Paso Temperatura Duración Activación de la enzima 95°C 20 segundos Desnaturalización 95°C 3 segundos Alineamiento Específica para cada gen 30 segundos Disociación Gradiente de 60°C a 95°C Material y Métodos 133 Los genes que fueron objeto de estudio de expresión, los cebadores, el tamaño de amplificado, los tejidos estudiados y la temperatura de alineamiento de cada uno se detallan en la Tabla 7. En base a la bibliografía disponible y a la función que llevan a cabo se seleccionaron para este estudio los genes que se describen en la tabla Tabla 8. 3.1.7 Análisis estadístico Los análisis estadísticos se hicieron con el programa SPSS versión 11.5 para Windows (SPSS, Chicago, Illinois, EE.UU.). Las comparaciones de los resultados entre los diferentes grupos se hicieron mediante el test de Mann-Whitney. Para el estudio de las diferencias entre las distintas condiciones de incubación de las IECs se utilizó un análisis de la varianza de una vía (ANOVA) de medidas repetidas. El coeficiente de correlación de Spearman se empleó para estimar las correlaciones lineales existentes entre las variables. Modelos de regresión lineal múltiple se usaron para determinar la asociación entre las distintas variables. Los valores se consideraron estadísticamente significativos para una p≤0.05. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (DE) o media ± error estándar de la media (EEM). Tabla 7: Cebadores, tamaños de los amplificados, número de acceso y temperatura de alineamiento de los genes estudiados. Gen Cebadores Tamaño del amplificado (pb) Número de acceso Temperatura alineamiento (°C) 18S Sentido: AGAGAATTTGCCCTCCGACT 150 NM_014473.2 60 Antisentido: AACACTGGATTCCACCTTGG Apo A-IV Sentido: CTGCAGAAGTCACTGGCAGA 200 NM_000482.3 59 Antisentido: ACCTTGTCCCTCAGGTCCTT MTP Sentido: ACCTCAGGACTGCGAAGAAA 208 NM_000253 60 Antisentido: TTGGGATGAGAAGCAAATCC DGAT2 Sentido: CATCCTGAACTGGTGTGTGG 168 NM_012079.4 60 Antisentido: AAGACATTGGCCGCAATAAC ACL Sentido: GAAGCTGACCTTGCTGAACC 237 NM_001096.2 60 Antisentido: CTGCCTCCAATGATGAGGAT PDHB Sentido: GACCAATGGACATGGAAACC 170 NM_000925.3 60 Antisentido: AGCACCAGTGACACGAACAG ACC1 Sentido: ACCACCAATGCCAAAGTAGC 150 NM_133439.2 59 Antisentido: CTGCAGGTTCTCAATGCAAA SREBP-1c Sentido: TGCATTTTCTGACACGCTTC 171 NM_001005291 60 Antisentido: CCAAGCTGTACAGGCTCTCC FAS Sentido: CTTTAGTGGCAGGCTGAAGG 194 NM_004104.4 60 Antisentido: GCAATTTCCCCTGCATCTTA PEPCK Sentido: GAGAGAACTCCAGGGTGCTG 156 NM_002591 60 Antisentido: CCTTGGAGATGCTGAAAAGC G6Pasa Sentido: CTGGAGAAAGCCCAGAGGTG 203 NM_001270397.1 60 Antisentido: AGGACGAGGGAGGCTACAAT FBPasa Sentido: CACTCTGGTCTACGGAGGGA 225 NM_006717005.1 60 Antisentido: TTCAGGAACTCGAGCACGTC GLS Sentido: TTCAGTCCCGATTTGTGGGG 181 NM_014905.4 60 Antisentido: GTCCACTCGGCTCTTTTCCA IRS1 Sentido: CAAGACCATCAGCTTCGTGA 163 NM_005544.2 60 Antisentido: AGAGTCATCCACCTGCATCC p85α Sentido: ACCCCAGTTTTTGTTGCTTG 229 NM_181524.1 58 Antisentido: ACTGCCCAACAAAACCGTCC p110β Sentido: GGATGTTGCCTTATGGCTGT 179 NM_001256045.1 60 Antisentido: CAGGTCATCCCCAGAGTTGT Tabla 8: Resumen de los genes seleccionados en el estudio. Abreviatura Nombre Ruta metabólica Función DGAT2 Diacilglicerol-acil-transferasa 2 Síntesis de triglicéridos Cataliza el paso final en la síntesis de triglicéridos, Esta reacción consiste en la adición de un acil-Coa a un DAG para obtener un triglicérido Apo A-IV Apolipoproteína A-IV Síntesis de quilomicrones Lipoproteína intestinal que forma parte de los quilomicrones. Facilita la incorporación de lípidos a los quilomicrones. MTP Proteína de transferencia microsomal Síntesis de quilomicrones Facilita la adición de lípidos a apo B-48 para formar los quilomicrones ACL ATP citrato liasa Lipogénesis y colesterogénesis Síntesis de acetil-CoA en el citosol PDHB Piruvato deshidrogenasa subunidad β Lipogénesis y colesterogénesis Síntesis de acetil-CoA en la mitocondria ACC1 Acetil-CoA carboxilasa 1 Lipogénesis Produce malonil-CoA a partir de acetil-CoA SREBP-1c Proteína de unión a elementos regulados por esteroles-1c Homeostasis lipídica Factor de transcripción que participa en la regulación de genes implicados en la síntesis de colesterol y ácidos grasos FAS Ácido graso sintetasa Lipogénesis Síntesis de ácidos grasos a partir de acetil-Coa y malonil-CoA PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa Gluconeogénesis Cataliza la conversión de oxalacetato en fosfoenolpiruvato G6Pasa Glucosa-6-fosfatasa Gluconeogénesis Cataliza la conversión de glucosa 6-fosfato a glucosa FBPasa Fructosa-1,6-bifosfatasa Gluconeogénesis Cataliza la conversión de fructosa 1,6-bifosfato a fructosa 6fosfato GLS Glutaminasa Gluconeogénesis Cataliza la conversión de glutamina en glutamato IRS1 Sustrato del receptor de insulina 1 Señalización de insulina Su activación provoca la activación de PI3K p85-α Subunidad reguladora del complejo PI3K Señalización de insulina Estabiliza la subunidad catalítica p110. Su unión con IRS1 provoca la activación de p110 p110-β Subunidad catalítica del complejo PI3K Señalización de insulina Participa en la formación de segundos mensajeros implicados en la regulación del metabolismo de la glucosa y lipídico 137 4. 4.4. 4. Resultados ResultadosResultados Resultados Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 144 ARNm de ACC1 (p=0.011) y FAS (p=0.042) fueron significativamente menores que en el grupo OM-baja IR (Figura 17C y Figura 17D). Los niveles de expresión relativa de ARNm de PDHB (p=0.042) y ACL (p=0.043) fueron significativamente mayores en el grupo de OM-DM2-met que en el grupo OM-baja IR (Figura 17A y Figura 17B). Figura 18: Niveles de expresión relativa de ARNm de los genes implicados en la síntesis de quilomicrones. Los niveles de expresión fueron relativizados a la expresión de ARNm del gen 18S. Los resultados están expresados como media ± EEM. *p<0.05 entre los grupos OM-alta IR y OM-baja IR. Resultados 145 Entre el grupo OM-DM2-met y OM-alta IR solo se encontraron diferencias en la expresión relativa de ARNm de FAS, que fue mayor en el grupo OM-DM2 (p=0.049) (Figura 17D). Los niveles de expresión relativa de apo A-IV fueron significativamente mayores en el grupo de OM-alta IR en comparación con el grupo OM-baja IR (p=0.016) (Figura 18C). No se encontraron diferencias significativas con el grupo de OM-T2D-met ni tampoco en el resto de genes estudiados que están implicados en la síntesis de quilomicrones (Figura 18A y Figura 18B). Los niveles de expresión relativa de ARNm de SREBP-1c fueron significativamente mayores en el grupo OM-alta IR que en el grupo OM-baja IR (p=0.019) (Figura 19). No se encontraron diferencias significativas entre el grupo OMDM2-met y los otros grupos estudiados. Figura 19: Niveles de expresión relativa de ARNm de SREBP-1c. Los niveles de expresión fueron relativizados a la expresión de ARNm del gen 18S. Los resultados están expresados como media ± EEM. *p<0.05 entre el grupo OM-alta IR y OM-baja IR. Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 146 4.4.1.1 Asociaciones con otras variables estudiadas Con respecto al contenido de triglicéridos de los quilomicrones y a las variables contenido de triglicéridos e intensidad de la señal de apo B en el yeyuno, se encontraron diversas asociaciones con algunas de las variables bioquímicas y con los niveles de expresión relativa de los genes implicados en la síntesis de quilomicrones (Tabla 12). Tabla 12: Coeficientes de correlación significativos (p) entre las variables triglicéridos de los quilomicrones, contenido de triglicéridos del yeyuno e intensidad de la señal de apo B en el yeyuno con variables bioquímicas y expresión relativa de genes implicados en la síntesis de quilomicrones. QM triglicéridos Triglicéridos del yeyuno Intensidad de apo B en el yeyuno Glucosa 0.875 (0.001) -0.786 (0.001) -0.675 (0.006) Insulina 0.521 (0.046) -0.632 (0.011) -0.625 (0.013) QM colesterol 0.670 (0.009) -0.596 (0.025) -0.771 (0.001) Triglicéridos 0.836 (<0.001) -0.692 (0.003) -0.661 (0.005) QM triglicéridos -0.791 (<0.001) -0.724 (0.002) Apo B-48 0.774 (<0.001) -0.768 (0.001) -0.674 (0.004) HOMA-IR 0.700 (0.003) -0.774 (0.001) -0.747 (0.001) Triglicéridos del yeyuno -0.791 (<0.001) 0.776 (<0.001) ARNm DGAT2 -0.098 (0.648) -0.327 (0.119) -0.321 (0.126) ARNm apo A-IV -0.171 (0.541) -0.587 (0.027) -0.275 (0.342) ARNm MTP -0.564 (0.028) 0.116 (0.692) 0.451 (0.106) En la Tabla 13 se muestran las diversas correlaciones significativas encontradas entre las variables antropométricas y bioquímicas estudiadas con los niveles de Resultados 147 expresión relativa de los genes implicados en la lipogénesis de novo y en la síntesis de quilomicrones. No se encontraron correlaciones significativas con el resto de variables bioquímicas y antropométricas estudiadas. Tabla 13: Coeficientes de correlación significativos (p) encontrados entre las variables bioquímicas y los niveles de expresión relativa de los genes implicados en el metabolismo lipídico. Cintura IMC Glucosa Insulina HOMAIR Leptina PDHB 0.306 (0.249) 0.238 (0.287) 0.384 (0.048) 0.342 (0.120) 0.495 (0.019) 0.318 (0.340) ACL 0.248 (0.415) 0.512 (0.025) 0.633 (0.004) 0.161 (0.509) 0.605 (0.006) 0.127 (0.709) ACC1 -0.444 (0.050) -0.275 (0.156) -0.143 (0.467) -0.237 (0.226) -0.302 (0.118) -0.089 (0.752) DGAT2 0.310 (0.197) 0.354 (0.070) 0.327 (0.049) 0.569 (0.001) 0.411 (0.033) -0.293 (0.289) MTP 0.201 (0.409) 0.212 (0.287) -0.171 (0.395) 0.187 (0.351) 0.065 (0.746) -0.561 (0.030) Apo A-IV 0.419 (0.046) 0.326 (0.097) 0.487 (0.010) 0.445 (0.020) 0.530 (0.004) 0.204 (0.467) SREBP-1c 0.233 (0.310) 0.212 (0.270) 0.326 (0.049) 0.569 (0.001) 0.540 (0.002) 0.100 (0.713) Entre los niveles de expresión relativa de ARNm de los genes estudiados implicados en la lipogénesis de novo y quilomicrones se encontraron varias asociaciones significativas que se detallan en la Tabla 14. No se encontraron correlaciones significativas entre los niveles de expresión relativa de ARNm de MTP y los niveles de expresión relativa de ARNm del resto de genes estudiados. Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 148 Tabla 14: Coeficientes de correlación significativos (p) encontrados entre los niveles de expresión relativa de ARNm de los genes implicados en la lipogénesis de novo y quilomicrones. ACL ACC1 FAS DGAT2 Apo A-IV SREBP-1c PDHB 0.570 (0.011) -0.407 (0.050) 0.293 (0.211) 0.468 (0.038) 0.388 (0.091) 0.217 (0.331) ACL -0.046 (0.853) 0.029 (0.906) 0.319 (0.213) 0.445 (0.046) 0.212 (0.383) ACC1 0.482 (0.013) 0.133 (0.517) 0.090 (0.662) 0.104 (0.598) FAS 0.495 (0.012) 0.416 (0.043) 0.363 (0.049) DGAT2 0.599 (0.002) 0.684 (0.001) Apo A-IV 0.665 (<0.001) Para evaluar la fuerza de estas asociaciones como posibles predictores de los niveles de expresión relativa de los genes estudiados que participan en el metabolismo lipídico, se realizaron diversos modelos de regresión lineal múltiple para cada uno de estos genes. Cada uno de los modelos fue ajustado por las siguientes variables independientes: glucosa, insulina, ácidos grasos libres, peso, circunferencia de la cintura, leptina y niveles de expresión relativa de ARNm de SREBP-1c. Las variables que mejor explicaron los niveles de expresión relativa de ARNm de los distintos genes fueron principalmente la glucosa, la insulina y los niveles de ARNm de SREBP1-c (Tabla 15). Resultados 149 Tabla 15: Modelos de regresión lineal múltiple para los niveles de expresión relativa de ARNm de cada uno de los genes estudiados en relación al metabolismo lipídico. Variable dependiente R2 Variables independientes significativas PDHB 0.545  Insulina (β=0.370, p=0.037) ACL 0.604  Glucosa (β=1.366, p=0.050)  Ácidos grasos libres (β=0.906, p=0.048) ACC1 0.326  Insulina (β=-0.692, p=0.039)  Circunferencia de la cintura (β=-0.979, p=0.048)  Niveles de expresión relativa de ARNm de SREBP-1c (β=0.499, p=0.036) FAS 0.696  Insulina (β=-0.707, p=0.046) DGAT2 0.267  Niveles de expresión relativa de ARNm de SREBP-1c (β=0.488, p=0.048) MTP 0.129  Insulina (β =-0.746, p=0.047)  Niveles de expresión relativa de ARNm de SREBP-1c (β=- 0.532, p=0.042) Apo A-IV 0.543  Glucosa (β=0.567, p=0.004)  Insulina (β=0.380, p=0.048) SREBP-1c 0.106  Insulina (β=0.696, p=0.031) Variables independientes: glucosa, insulina, ácidos grasos libres, peso, circunferencia de la cintura, leptina y niveles de expresión relativa de ARNm de SREBP-1c. 4.4.2 Gluconeogénesis intestinal Los niveles de expresión relativa de ARNm de GLS (p=0.034), PEPCK (p=0.027) y G6Pasa (p=0.024) fueron significativamente mayores en el grupo OM-alta IR que en el grupo OM-baja IR (Figura 20A, B y D). En el grupo OM-DM2-met, los niveles de expresión relativa de GLS (p=0.050) y G6Pasa (p=0.014) (Figura 20A y D) fueron significativamente mayores que en el grupo Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 150 OM-baja IR, mientras que los niveles de expresión relativa de PEPCK fueron significativamente menores en el grupo OM-DM2-met (p=0.041) (Figura 20B). En el grupo OM-DM2-met, los niveles de expresión relativa de PEPCK fueron significativamente menores que en el grupo OM-alta IR (p=0.001) (Figura 20B). No se encontraron diferencias significativas en los niveles de expresión relativa de FBPasa entre los diferentes grupos. Figura 20: Niveles de expresión relativa de ARNm de los genes implicados en la gluconeogénesis. Los niveles de expresión fueron relativizados a la expresión de ARNm del gen 18S. Los resultados están expresados como media ± EEM. *p<0.05 entre los grupos OM-alta IR y OM-baja IR. ap<0.05 entre los grupos MO-baja IR y OM-DM2-met. 1p<0.05 entre los grupos OM-alta IR y OM-DM2-met. Resultados 151 4.4.2.1 Asociaciones con otras variables estudiadas Se encontraron diversas asociaciones significativas entre los niveles de expresión relativa de los genes implicados en gluconeogénesis intestinal y las variables antropométricas y bioquímicas estudiadas (Tabla 16). No se encontraron correlaciones significativas con los niveles de expresión relativa de ARNm de GLS ni con el resto de variables bioquímicas y antropométricas estudiadas. Tabla 16: Coeficientes de correlación significativos (p) encontrados entre las variables antropométricas y bioquímicas y los niveles de expresión relativa de los genes implicados en la gluconeogénesis. PEPCK FBPasa G6Pasa Peso 0.416 (0.025) 0.216 (0.221) 0.044 (0.798) Cintura 0.446 (0.043) 0.289 (0.136) 0.067 (0.736) IMC 0.398 (0.033) 0.182 (0.310) 0.087 (0.618) PAS 0.318 (0.230) -0.253 (0.255) -0.431 (0.045) Insulina 0.347 (0.048) 0.319 (0.050) 0.461(0.005) HOMA-IR 0.249 (0.192) 0.140 (0.259) 0.424 (0.010) PAS: presión arterial sistólica Diversas asociaciones significativas se encontraron entre los niveles de expresión relativa de los genes implicados en la gluconeogénesis intestinal. Así, los niveles de expresión relativa de ARNm de GLS correlacionaron positivamente con los niveles de expresión relativa de ARNm de FBPasa (r=0.683, p<0.001) y G6Pasa (r=0.703, p<0.001), mientras que los niveles de expresión relativa de ARNm de FBPasa correlacionaron positivamente con los niveles de expresión relativa de ARNm de G6Pasa (r=0.654, p<0.001). Lipogénesis y gluconeogénesis en el intestino delgado de pacientes con obesidad mórbida 152 No se encontraron asociaciones significativas entre los niveles de expresión relativa de ARNm de PEPCK y los niveles de expresión relativa del resto de genes implicados en la gluconeogénesis intestinal. También se encontraron correlaciones significativas entre los niveles de expresión relativa de ARNm de los genes implicados en la lipogénesis de novo y la síntesis de quilomicrones y los genes implicados en la gluconeogénesis que se recogen en la Tabla 17. Tabla 17: Coeficientes de correlación significativos (p) encontrados entre los niveles de expresión relativa de los genes implicados en la lipogénesis de novo y la síntesis de quilomicrones con los niveles de expresión relativa de los genes implicados en la gluconeogénesis. GLS PEPCK FBPasa G6Pasa PDHB 0.482 (0.023) 0.030 (0.895) 0.356 (0.135) 0.619 (0.003) ACL 0.454 (0.051) -0.153 (0.533) 0.356 (0176) 0.598 (0.009) DGAT2 0.305 (0.122) 0.397 (0.037) 0.380 (0.047) 0.430 (0.028) MTP 0.400 (0.043) -0.178 (375) 0.367 (0.078) 0.578 (0.002) Apo A-IV 0.376 (0.048) 0.340 (0.083) 0.433 (0.039) 0.435 (0.030) SREBP-1c 0.345 (0.072) 0.525 (0.003) 0.342 (0.095) 0.403 (0.037) No se encontraron asociaciones significativas de los niveles de expresión de ARNm de ACC1 y FAS con el resto de genes estudiados. Para evaluar la fuerza de estas asociaciones como posibles predictores de los niveles de expresión relativa de los genes estudiados que participan en la gluconeogénesis intestinal, se realizaron diversos modelos de regresión lineal múltiple para cada uno de estos genes. En la mayoría de los casos, los niveles de expresión relativa de ARNm estuvieron asociados a la insulina o a los niveles de expresión relativa de ARNm de SREBP-1c (Tabla 18). Resultados 153 Tabla 18: Modelos de regresión lineal múltiple para los genes implicados en la gluconeogénesis intestinal. Variable dependiente R2 Variables independientes significativas Modelo 1 PEPCK 0.090 Insulina (β=0.387; p=0.041) G6Pasa 0.084 Insulina (β=0.370; p=0.029) Modelo 2 GLS 0.745 SREBP-1c (β=1.053; p=0.019) G6Pasa 0.512 Insulina (β=0.771; p=0.046) Modelo 1: Variables independientes: glucosa, insulina e IMC. Modelo 2: Variables independientes: glucosa, insulina, IMC, leptina y SREBP-1c. 4.4.3 Señalización de la insulina En el grupo OM-alta IR los niveles de expresión relativa de ARNm de IRS1 (p=0.037) y p110β (p=0.049) (Figura 21A y C) fueron significativamente mayores que en el grupo OM-baja IR. En el grupo OM-baja IR los niveles de expresión relativa de ARNm del ratio p85α/p110β fueron significativamente mayores que en el grupo OM-alto IR (p<0.001) y que en el grupo OM-DM2 (p=0.010) (Figura 21D). No se encontraron diferencias significativas entre los grupos OM-alta IR y OMDM2-met en los niveles de expresión relativa de los genes estudiados.