Efecto de Ganirelix en cultivos organotípicos de miomas uterinos en presencia de hormonas ováricas

Trabajo de Fin de Grado RAQUEL MARÍA SUÁREZ LÓPEZ Tutorizado por María Teresa Acosta Almeida y Ana Salas Pérez Grado en Biología. Junio 2020 Efecto de Ganirelix en cultivos organotípicos de miomas uterinos en presencia de hormonas ováricas Effect of Ganirelix on organotypic cultures of uterine leiomyoma under the influence of ovarian steroids ÍNDICE Resumen ................................................................................................. 1 Abstract .................................................................................................. 1 Introducción ............................................................................................ 3 Etiología y desarrollo de los leiomiomas uterinos ........................................................ 3 Tratamientos existentes ............................................................................................... 6 Cultivos organotípicos para el estudio de leiomiomas uterinos .................................. 7 Hipótesis ................................................................................................. 8 Objetivos ................................................................................................. 9 Materiales y métodos.............................................................................. 9 Obtención de las muestras biológicas .......................................................................... 9 Cultivo organotípico y ensayo del fármaco ................................................................ 10 Tinción histológica ...................................................................................................... 12 Extracción de ARN y proteínas .................................................................................... 12 Limpieza del ARN con DNasa y cuantificación del ARN .............................................. 14 Cuantificación de proteínas ........................................................................................ 14 PCR cuantitativa (qPCR) y Western Blot ..................................................................... 15 Resultados ............................................................................................ 18 Tinción histológica ...................................................................................................... 18 Cuantificación de ARN y proteínas ............................................................................. 20 Discusión ............................................................................................... 24 Conclusiones ......................................................................................... 27 Conclusions ........................................................................................... 27 Agradecimientos ................................................................................... 28 Bibliografía ............................................................................................ 28 1 Resumen Los leiomiomas uterinos son los tumores benignos más frecuentes del aparato reproductor femenino que afectan a un gran porcentaje de mujeres en edad reproductiva. En ocasiones, esta patología provoca la aparición de síntomas que reducen la calidad de vida de las pacientes, por lo que es necesario la aplicación de tratamientos que permita extirpar o reducir el tamaño de los miomas. La administración de antagonistas de GnRH constituye una de las terapias farmacológicas más utilizadas para la reducción de estos tumores, aunque su aplicación a nivel sistémico provoca efectos secundarios no deseados que limitan la duración del tratamiento. Recientemente, se ha demostrado que la aplicación de antagonistas de GnRH directamente sobre cultivos tradicionales de leiomioma inhibe su crecimiento y estimula el proceso apoptótico, lo cual se debe a la capacidad de estos medicamentos de interactuar de manera competitiva con los receptores de GnRH presentes en estos tejidos. En este estudio, investigamos el efecto de Ganirelix, un antagonista de GnRH, sobre la proliferación y apoptosis en cultivos organotípicos de leiomioma bajo la influencia de las hormonas ováricas en condiciones fisiológicas similares a las presentes durante la fase proliferativa y la fase secretora del ciclo ovulatorio. Palabras clave: fibroma, leiomioma, cultivo organotípico, estrógeno, progesterona, análogo de GnRH, Ganirelix, apoptosis. Abstract Uterine leiomyomas are the most frequent benign tumors of the female reproductive system, affecting a large proportion of women in reproductive age. Occasionally, this pathology causes severe symptoms that negatively affects the quality of life of patients. Therefore, therapies aimed at reducing tumor size or surgical removal of tumor are needed. GnRH antagonists are widely used as a non-invasive treatment to reduce the size of myomas, although they cause undesirable secondary effects that limits their systemic use to a short period of time. Recent studies demonstrated that GnRH antagonists inhibit growth and triggers apoptosis in leiomyoma cells under culture 2 through competitive binding to GnRH receptors expressed in tumor tissues. In this study, we tried to assess the effect of Ganirelix, a GnRH antagonist, on cell proliferation and apoptosis using organotypic cultures of uterine leiomyoma under the influence of ovarian steroids, simulating the physiological conditions of the proliferative and the secretory phases of the menstrual cycle. Keywords: fibroid, leiomyoma, organotypic culture, estrogen, progesterone, GnRH analogue, Ganirelix, apoptosis. 3 Introducción Los leiomiomas uterinos, también denominados fibromas uterinos, son los tumores benignos más frecuentes en mujeres en edad reproductiva, con una incidencia del 40% en mujeres caucásicas y del 60% en mujeres de raza negra en torno a los 35 años, que se eleva al 70% y más del 80% respectivamente a los 50 años (Pavone et al., 2018). A menudo, la presencia de estos tumores pasa inadvertida por la ausencia de síntomas, que se manifiestan en el 15-30% de las mujeres con leiomiomas y afectan a la calidad de vida de estas (Serdar & Bulun, 2013). Entre la sintomatología asociada a esta patología se incluye dolor en el área lumbar, fatiga, dolor abdominal, sangrado excesivo durante la menstruación y dificultades durante la concepción y el embarazo (Neri et al., 2019). La severidad de estos síntomas depende del número, tamaño y localización de los tumores, que alteran la anatomía y funcionalidad de los tejidos del útero (Zepiridis et al., 2016; Sohn et al., 2018). Por ejemplo, los fibromas submucosos, que crecen hacia la cavidad uterina, suelen estar asociados a sangrado menstrual abundante y anemia, así como problemas de implantación del embrión y complicaciones del embarazo y el parto; mientras que los miomas subserosos, que se desarrollan hacia la cavidad peritoneal, pueden provocar síntomas de tipo comprensivo solo si alcanzan cierto tamaño, como molestias abdominales, disuria y estreñimiento. Por otro lado, los fibromas intramurales, que se desarrollan en el miometrio, también afectan a la capacidad reproductiva (Eldar-Geva et al., 1998; Serdar & Bulun, 2013; Ali & Al-Hendy, 2017; Neri et al., 2019). Además, la aparición de estos síntomas no solo es debido a la masa y tamaño de los leiomiomas, sino también a la producción de moléculas de señalización que alteran la actividad de los tejidos adyacentes al tumor (Zepiridis et al., 2016). Etiología y desarrollo de los leiomiomas uterinos Los leiomiomas uterinos tienen un origen monoclonal a partir de células madre somáticas del miometrio. Aunque todavía no se han establecido con exactitud aquellos mecanismos que provocan la transformación de células normales en células iniciadoras de leiomiomas, parece que son varios los factores implicados en el origen y expansión de estos tumores, tales como alteraciones genéticas, epigenéticas e influencia de 4 hormonas sexuales y factores de crecimiento (Islam et al., 2013). Con respecto al desarrollo de los leiomiomas, se ha observado que estos tumores son especialmente sensibles a la presencia de hormonas ováricas, que estimulan la proliferación de las células de mioma y una producción excesiva de matriz extracelular (ECM por sus siglas en inglés), lo cual concuerda con el hecho de que estos tumores aparecen solamente después de la menarquia y experimentan una regresión después de la menopausia (Serdar & Bulun, 2013). A nivel histológico, los leiomiomas destacan por la presencia de un exceso de matriz extracelular de carácter fibroso desorganizado, razón por la cual estos tumores también reciben el nombre de fibromas. En comparación con los tejidos no afectados del miometrio, se ha comprobado que en los leiomiomas existe sobreexpresión de genes que codifican diversos componentes de la matriz extracelular, tales como colágeno, fibronectinas, lamininas, proteoglucanos, integrinas y proteasas involucradas en la remodelación de la matriz extracelular (Islam et al., 2018). Además, se ha observado que los leiomiomas presentan una disposición y orientación anormal de las fibras de colágeno con respecto al miometrio. Esta excesiva acumulación de matriz extracelular, aparte de provocar la aparición de los síntomas asociados a la alteración anatómica del útero, también actúa como reservorio de factores de crecimiento que, al liberarse durante los procesos de remodelado de la matriz extracelular, activan diversas vías de transducción que conducen, en última instancia, al desarrollo y expansión del tumor (Koohestani et al., 2013; Islam et al., 2018). Como ya se mencionó anteriormente, los leiomiomas uterinos dependen de las hormonas ováricas, estrógeno y progesterona, para su desarrollo y mantenimiento. En las células de leiomioma, se ha comprobado que existe una sobreexpresión de los receptores de estrógeno (ERα y ERβ) en comparación con el miometrio sano, lo cual justifica su mayor sensibilidad a la presencia de esta hormona en el medio. Asimismo, también se ha observado que estos tumores presentan mayores cantidades de aromatasa, una enzima clave en el proceso de conversión de andrógenos en estradiol (E2), de manera que los leiomiomas son capaces de producir suficiente estrógeno para mantener su crecimiento. La acción del estrógeno incluye la activación de la expresión 5 de diversos genes implicados en la patogénesis de los leiomiomas, tales como factores de crecimiento, colágenos y receptores de estrógeno y progesterona (Borahay et al., 2015; Moravek et al., 2015; Salas et al., 2020). Por otro lado, también se ha observado que existe una mayor cantidad de receptores de progesterona en las células de leiomioma con respecto al miometrio no afectado (Tsigkou et al., 2015). La progesterona es responsable del desarrollo del tumor, ya que estimula la proliferación celular y la acumulación de matriz extracelular al modular la expresión de diversos factores de crecimiento, como EGF y PCNA, y moléculas implicadas en inhibir el proceso de apoptosis (Borahay et al., 2015; Patel et al., 2016). Otra característica llamativa de los leiomiomas uterinos es la presencia de alteraciones genéticas que podrían contribuir a la iniciación y desarrollo de estos. Las anomalías genéticas más frecuentes se corresponden con mutaciones en el gen MED12 y traslocaciones o sobreexpresión del gen HMGA2. Se ha observado que entre el 50 y el 85% de los tumores presentan mutaciones en MED12, la mayoría de ellas situadas en el exón 2 (Galindo et al., 2018; Mello et al., 2018). MED12 (Mediator complex subunit 12, por sus siglas en inglés) es un componente del Complejo Mediador, que interactúa con la ARN polimerasa II y regula el inicio de la transcripción, el crecimiento celular y la diferenciación, por lo que la presencia de mutaciones en este gen podría estar relacionada con al alteración del desarrollo y de los patrones de expresión de las células que dan lugar a los leiomiomas (Mello et al., 2018). Por otro lado, HMGA2 (high-mobility group AT-hook 2, por sus siglas en inglés) es un factor de transcripción que induce cambios conformacionales en la estructura de la cromatina, lo cual afecta a los procesos de crecimiento, diferenciación, apoptosis y transformación celular (Galindo et al., 2018). En torno al 40-50% de los leiomiomas uterinos presentan anomalías citogenéticas detectables, de las cuales un 20% corresponden a reordenaciones cromosómicas que se producen corriente arriba del promotor del gen HMGA2, provocando una sobreexpresión de este en los tumores que presentan esta anomalía. Sin embargo, también se ha observado una mayor expresión de este gen con respecto al miometrio sano en leiomiomas en los que esta alteración se encontraba ausente, por lo que se ha planteado la existencia de otros mecanismos 6 reguladores de la expresión de este gen, como la actuación de microARNs (Mello et al., 2018). Destaca también el hecho de que ambas alteraciones genéticas, la mutación en MED12 y la reordenación cromosómica en HMGA2, son mutuamente excluyentes (Mäkinen et al., 2017). Sin embargo, a la luz de recientes estudios se ha observado la presencia de mutaciones en MED12 y sobreexpresión de HMGA2 de manera simultánea en un mismo tumor (Galindo et al., 2018; Mello et al., 2018). Tratamientos existentes Hasta la fecha, el tratamiento definitivo para la eliminación de los leiomiomas uterinos es la histerectomía, pero esta no resulta una opción deseable para las mujeres que desean tener hijos. Por ello, ha sido necesario buscar tratamientos alternativos, ya sea métodos conservativos como la miomectomía o técnicas menos invasivas, como la embolización de arterias uterinas y la aplicación de ultrasonidos de alta intensidad, las cuales, sin embargo, no están exentas de riesgo y no garantizan que no se produzca un rebrote del tumor (Neri et al., 2019). Por otro lado, la administración de fármacos constituye una opción preferible para aquellas mujeres que desean evitar los procesos de cirugía y mantener su capacidad reproductiva. El objetivo de estos medicamentos es reducir la influencia de las hormonas ováricas sobre los leiomiomas y, de esta manera, inhibir el crecimiento y expansión del tumor. No obstante, por el momento el empleo de estos fármacos suele limitarse a un corto período de tiempo debido a los efectos secundarios que provocan, y normalmente se recetan como terapia preoperatoria para reducir el tamaño de los tumores y mejorar los síntomas asociados a esta patología. Además, tras la suspensión del tratamiento, los leiomiomas recuperan en poco tiempo su tamaño inicial (Ali & Al-Hendy, 2017). Algunos de los medicamentos más utilizados son los moduladores selectivos del receptor de progesterona, los análogos de GnRH y los inhibidores de aromatasa. Los agonistas de GnRH fueron los primeros fármacos que se utilizaron para el tratamiento de los leiomiomas uterinos. Su administración a nivel sistémico provoca una estimulación inicial de las células gonadotrópicas de la hipófisis, que posteriormente concluye con la inhibición del eje hipofisario-gonadal. De esta manera, se reduce la cantidad de hormonas ováricas circulantes, lo cual permite que se reduzca el tamaño de 7 los tumores y el alivio de los síntomas asociados. Sin embargo, esta reducción drástica del nivel de estrógenos induce una serie de efectos secundarios característicos de la menopausia, desde sofocos y sequedad vaginal hasta consecuencias más graves, como desmineralización y pérdida de densidad ósea, por lo que la duración de estos tratamientos es limitada. Por otro lado, los antagonistas de GnRH actúan mediante inhibición competitiva de los receptores de GnRH hipofisarios, por lo que se consigue una inhibición inmediata del eje hipofisario-gonadal, al contrario que en el caso de los agonistas de GnRH, lo cual permite una menor duración del tratamiento en comparación con estos últimos (Parsanezhad et al., 2012). Desde hace años se sabe de la presencia de receptores de GnRH en tejidos no hipofisarios, incluidos los leiomiomas uterinos (Parker et al., 2007). Esto implica que las células en los que estos receptores están presentes son capaces de responder a la acción de GnRH y sus análogos. De hecho, se ha comprobado que la aplicación local de análogos de GnRH sobre cultivos de leiomiomas uterinos provoca una inhibición de la proliferación en las células que conforman estos tumores y un mayor nivel de apoptosis, además de inhibir la expresión de genes que codifican componentes de la matriz extracelular, la cual es un elemento clave en la formación de estos tumores (Chen et al., 2005; Britten et al., 2012; Malik et al., 2016). Por tanto, el desarrollo de sistemas eficaces y seguros para aplicar estos fármacos a nivel local en el propio tumor constituye una opción interesante, ya que de esta manera se conseguiría tratar los leiomiomas evitando los efectos secundarios que provoca su aplicación sistémica. Cultivos organotípicos para el estudio de leiomiomas uterinos El desarrollo de modelos en los que se pueda estudiar la fisiología de los leiomiomas uterinos, así como su respuesta ante distintos factores, tales como la aplicación hormonas ováricas y fármacos, resulta esencial para la comprensión de los mecanismos mediante los cuales se originan y expanden, así como para la realización de ensayos preclínicos con tratamientos potencialmente eficaces y seguros para su administración a mujeres con este tipo de tumores. En este sentido, los primeros modelos utilizados para el estudio de los leiomiomas uterinos estaban basados en animales, como la rata EKER o los xenotransplantes, que tienen el inconveniente de no representar de manera 14 Limpieza del ARN con DNasa y cuantificación del ARN Con el objetivo de eliminar de la muestra obtenida de ARN cualquier resto de ADN que hubiera podido quedar, se trató con DNasa I libre de RNasa (Promega). Para ello, se realizó una mezcla de 10 µL tampón 10X, 1 µL de RNasin (40 u/µL), 10 µL de DNasa (1 u/µL) y 54 µL de Agua-DEPC por cada muestra de 25 µL de ARN, con lo que al final resultaba un volumen de 100 µl por tubo de reacción. A continuación, se incubaron los tubos en un termociclador de pre-PCR modelo MultiGene II (Labnet) a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se añadió a cada uno de los tubos 100 µL de una mezcla de fenol/cloroformo en proporción 3:1, se mezcló mediante vórtex y se centrifugó durante 5 minutos a 18.000 rpm a 4 °C. Después, se recogió el sobrenadante y se le añadió 10 µL de acetato sódico (3 M, pH 5.2) y 300 µL de etanol absoluto y se dejó precipitar toda la noche a -80 °C. Al día siguiente, se centrifugaron los tubos a 18.000 g y 4 °C durante 15 minutos, tras lo cual se desechó el sobrenadante y se lavó el pellet con etanol al 80%. Después de volver a centrifugar a 18.000 g durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y se dejó secar el pellet para, a continuación, resuspenderlo en 25 µL de Agua-DEPC. Finalmente, se realizó la cuantificación a partir del valor de absorbancia del ARN mediante un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific). Cuantificación de proteínas Para realizar la cuantificación de las proteínas extraídas, se utilizó el kit de ensayo de proteínas Pierce Micro BCA (Thermo Fisher Scientific). Previamente, se diluyeron las muestras de proteínas 200 veces y se elaboró una curva patrón con un gradiente de concentraciones de BSA de entre 0,5 y 200 µg/mL. El reactivo de trabajo (WR) se preparó con 25 partes de reactivo MA (carbonato sódico, bicarbonato sódico y tartrato de sodio en 0,2 N de NaOH), 24 partes de reactivo MB (solución al 4% ácido bicinconínico en agua) y 1 parte de reactivo MC (solución de sulfato cúprico al 4% en agua pentahidratado). Las muestras se colocaron en una placa de 96 pocillos, en la cual se añadieron primero 150 µL del reactivo de trabajo a cada pocillo y, seguidamente, 150 µL de cada muestra. Posteriormente, se incubó la placa a 37 °C durante dos horas, tras lo cual se midió la 15 absorbancia de las muestras a 562 nm en el lector de placas EnSpire Multimode Plate Reader (PerkinElmer). PCR cuantitativa (qPCR) y Western Blot Por cuestión de tiempo, no fue posible realizar la cuantificación de la expresión génica mediante PCR cuantitativa y Western Blot tal y como se tenía planeado, por lo que a continuación se detallarán brevemente los marcadores que se pretendían analizar para cada uno de los métodos. Por un lado, mediante la técnica de Western Blot se pretendía analizar el nivel de expresión génica de los marcadores recogidos en la Tabla 1, los cuales presentan relación con el proceso de proliferación y apoptosis. Se indica, además, los anticuerpos primarios y secundarios que se utilizarían para detectar cada una de estas proteínas. Tabla 1. Marcadores que se pretendían estudiar mediante el ensayo de Western Blot en las muestras extraídas, junto con los anticuerpos destinados a su detección, la casa comercial que los suministra y el tamaño esperado de las proteínas detectadas. En el caso de la enzima poli-(ADP-ribosa) polimerasa (PARP), el anticuerpo aplicado detecta tanto la proteína íntegra como PARP rota (cleaved). La beta actina se utiliza como proteína control para normalizar los valores de los otros marcadores. Por otro lado, se habría realizado la retrotranscripción del ARN extraído y purificado para, posteriormente, someter el ADNc obtenido a un proceso de PCR cuantitativa con el objetivo de determinar el nivel de expresión génica de los marcadores recogidos en la Tabla 2, los cuales se corresponden con genes que codifican componentes de la matriz Marcador Anticuerpo primario (1) Anticuerpo secundario (2) Casa comercial Tamaño esperado (kDa) Bcl-2 Mouse IgG1 Anti-mouse IgGk-HRP Santa Cruz Biotechnology (1 y 2) 26 PCNA Mouse IgG2a Anti-mouse IgGk-HRP Santa Cruz Biotechnology (1 y 2) 35 Caspasa-3 Rabbit IgG Goat anti-rabbit IgG Abcam (1) y Bethyl (2) 17 PARP Rabbit IgG Goat anti-rabbit IgG ThermoFisher (1) y Bethyl (2) 135 85 (cleaved) Beta actina (control) Mouse IgG1 Anti-mouse IgGk-HRP Santa Cruz Biotechnology (1 y 2) 43 16 extracelular, marcadores de apoptosis y el gen driver HMGA2. En este último caso, se pretendía comparar el nivel de expresión de este gen en los miomas con respecto a su miometrio pareado. Con respecto al gen driver MED12, se deseaba comprobar, mediante amplificación y secuenciación del ADN extraído a T0, si existía mutación de este gen en los miomas estudiados y, de ser así, si se encontraba en un estado de homocigosis o de heterocigosis, en cuyo caso la amplificación del ADNc obtenido permitiría saber cuál de los alelos se estaba expresando. Además, en la tabla se incluyen los dos genes de expresión constitutiva o housekeeping PUM1 (Pumilio homolog 1, por sus siglas en inglés) y GNB2L1 (Guanine nucleotidebinding protein subunit beta-2-like-1, por sus siglas en inglés) que se habrían utilizado para normalizar los valores de expresión génica de los genes diana, puesto que presentan una expresión estable independientemente del tratamiento aplicado (Cañete et al., 2013; Almeida et al., 2014). 17 Gen Forward (5’ → 3’) Reverse (5’ → 3’) Longitud del amplicón (pb) Matriz extracelular COL1A1 GAGGGCCAAGACGAAGACATC CAGATCACGTCATCGCACAAC 140 FN1 GAGAATAAGCTGTACCATCGCAA CGACCACATAGGAAGTCCCAG 200 DPT TGACAGACAATGGAACTACGC TGCTGTAGCGACAACAGTAAAA 203 VCAN GAAGGCTTGTTTGGACGTTGG ACGGAATCCATAAGTCCTGACTC 193 Apoptosis APAF1 AGGCTAAAGACCGTCTCCGC GCTTTCAACACCCAAGAGTCCC 94 BAX TGGGCTGGACATTGGACTTCC CCGCCACAAAGATGGTCACG 175 BBC3 (PUMA) AGCCAAACGTGACCACTAGC CACGGGCAGAGCACAGGATT 179 BCL2L1 (BCL-XL) TTGGATCCAGGAGAACGGCG TGAAGCGTTCCTGGCCCTTT 92 BIRC5 (SURVIVIN) GGACCACCGCATCTCTACATTCA AGTCTGGCTCGTTCTCAGTGG 116 CASP1 TATGCCTGTTCCTGTGATGTGG CTCTTTCAGTGGTGGGCATCTG 97 CASP3 ACCAAAGATCATACATGGAAGCG CCCTGAGGTTTGCTGCATCG 176 CASP8 GCCTGAGAGAGCGATGTCCT TGAGGCATCTGTTTCCCCATGT 112 FAS ACACTGTGACCCTTGCACCA AGAAGACAAAGCCACCCCAAGT 117 FASLG TCCGAGAGTCTACCAGCCAGAT CCAGAGGCATGGACCTTGAGT 141 TNFRSF10A/DR4 ATCGGCTCAGGTTGTGGAGG CACCTGTCAAATCTGCCGGC 187 TNFRSF10B/DR5 TCACAGTTGCAGCCGTAGTCT AGCTTCTGTCCACACGCTCA 132 TNFSF10 (TRAIL) CCCTGCTGGCAAGTCAAGTG TTGCTTCTTCCTCTGGTCCCA 176 Genes drivers y housekeeping HMGA2 AGAGTCCCTCTAAAGCAGCTCA CAACTGCTGCTGAGGTAGAAATCG 196 MED12-TUR-F y 3R TTCTAACGTGCCCCCTTGTT GTTGGAACTGATCTTGGCAGG 352 MED12 Int1F/Int2R GCCCTTTCACCTTGTTCCTT TGTCCCTATAAGTCTTCCCAACC 291 PUM1 GACGCTATGGTGGACTACTTCT TGGAACGCACCTGATGTTCTG 142 GNB2L1 GAGTGTGGCCTTCTCCTCTG GCTTGCAGTTAGCCAGGTTC 224 Tabla 2. Marcadores que se pretendían analizar mediante qPCR. Se incluye la secuencia de los cebadores forward y reverse utilizados para amplificar cada uno de estos genes, así como la longitud del amplicón obtenido. Los genes housekeeping PUM1 y GNB2L1 se utilizaron para normalizar los valores de qPCR. Todos los marcadores se amplificaron a partir de ADNc a excepción de MED12 Int1F/Int2R, que se amplificó a partir de ADN. 18 Resultados Tinción histológica Mediante el análisis histológico de las secciones de mioma, fue posible estudiar la evolución de los tejidos a lo largo del tiempo y bajo cada uno de los tratamientos aplicados. En la Figura 2, puede observarse la comparación de una sección de mioma correspondiente a T0 con respecto a los controles negativos (OH) de los tiempos 6 y 9. En ellos puede observarse la morfología típica de estos tejidos, es decir, la presencia de células de núcleos fusiformes y una abundante cantidad de matriz extracelular, aunque a medida que avanza el tiempo de cultivo se aprecia una pérdida gradual de la estructura del mioma así como del número y morfología de las células con respecto al mioma inicial. Figura 2. Microfotografías a 20x de secciones del mioma L17 teñidas con hematoxilina-eritrosina correspondientes a T0 y a los controles negativos de los tiempos 6 y 9. Los núcleos celulares aparecen teñidos de violeta (señalados con flechas) y el citoplasma y la matriz celular de rosado. En las muestras tratadas con fármacos, independientemente de si se les aplicó o no tratamiento hormonal, pudo observarse la presencia de núcleos con acumulación de eosina y picnosis características del proceso apoptótico, en el que se produce una condensación de la cromatina nuclear, tal y como se señala en la Figura 3. Además, al analizar las secciones que recibieron solamente tratamiento hormonal, sin adición de fármaco, se puede apreciar que la estructura tisular y la morfología celular típica de estos tejidos se mantiene de manera más duradera en las muestras que fueron tratadas con estrógeno y progesterona, en comparación con las que fueron tratadas exclusivamente con estrógenos, en las cuales llama la atención la presencia de algunos núcleos picnóticos. 19 Figura 3. Microfotografías a 20X de las muestras del mioma L17 de cada uno de los tratamientos con fármaco y hormonas de T6 y T9. En las secciones a las que se les aplicó el fármaco, las flechas señalan los núcleos en los que se aprecia una acumulación de eosina (color rojizo). E = E2, P = P4, F = fármaco (Ganirelix). 20 Cuantificación de ARN y proteínas A continuación, se recogen las tablas de datos referentes a la extracción y cuantificación del ARN y las proteínas obtenidas. En el caso de las muestras correspondientes a T0, se incluyen también los valores cuantificados para las secciones de miometrio pareado de cada uno de los miomas, tanto para el ARN (Tabla 1) como para las proteínas (Tabla 5). Cabe destacar que el protocolo empleado ha sido optimizado de manera que sea posible extraer ADN, ARN y proteínas a partir de una misma muestra con la suficiente calidad y cantidad de todos ellos. En primer lugar, con respecto a los valores de ARN cuantificados, llama la atención las concentraciones relativamente elevadas que pudieron obtenerse a partir de muestras tan pequeñas, así como su grado de pureza, que se establece mediante los ratios A260/A280 y A260/A230 determinados por el espectrofotómetro. El primer ratio permite comprobar si la muestra se encuentra contaminada por proteínas, las cuales presentan un pico de absorbancia a 280 nm, mientras que el segundo parámetro permite establecer si están presentes contaminantes que absorben a 230 nm, como sales caotrópicas y fenoles utilizados durante el proceso de extracción. En el caso de la relación A260/A280, la obtención de valores cercanos a 2 indica que la muestra de ARN presenta un adecuado nivel de pureza, mientras que el valor de A260/A230 obtenido debe encontrarse entre 1,5 y 2,2. En las Tablas 1-4, se observa que la mayoría de las muestras presentan unos ratios que se adecúan a las condiciones descritas, por lo que se puede afirmar que la pureza del ARN extraído mediante este protocolo es bastante buena. Tabla 3. Datos de la cuantificación de ARN en las muestras correspondientes al T0 de cada muestra de mioma y miometrio, obtenidas mediante espectrofotómetro NanoDrop ND-1000. Se incluye la concentración de ARN en ng/µL y los ratios de pureza de las muestras cuantificadas. Concentración (ng/µL) A260/A280 A260/A230 L16T0 293,64 2,02 1,93 M16T0 406,38 2,12 2,13 L17T0 588,25 2,03 2,04 M17T0 399,79 2,07 2,01 L18T0 457,56 2,08 2,02 M18T0 783,49 2,14 2,09 21 Tabla 4. Datos de la cuantificación de ARN correspondientes a las muestras de L16 a T6 y T9 para cada uno de los tratamientos. Para T9 solo se incluye una réplica de cada tratamiento, ya que la placa en que se encontraban las otras dos se contaminó con un hongo y tuvo que ser desechada. Se recoge la concentración en ng/µL y los ratios de pureza. Tabla 5. Datos de la cuantificación de ARN correspondientes a las muestras del mioma L17 a T6 y T9 para cada uno de los tratamientos. Se recoge la concentración en ng/µL y los ratios de pureza. T6 T9 Concentración A260/A280 A260/A230 Concentración A260/A280 A260/A230 OH 239,93 2,07 2,03 186,3 2,05 1,92 101,07 1,99 2,02 369,28 2,09 1,98 264,13 2,04 1,89 419,89 2,08 1,94 F 307,77 2,06 2,01 278,03 2,1 1,91 250,59 2,03 2,05 198,06 2,05 2,03 152,93 2 1,85 131,97 2,04 1,82 E 211,55 2,03 2,14 179,43 2,06 1,99 200,68 1,97 1,97 371,93 2,04 1,98 243,58 2,01 2,06 302,69 2,09 2,06 EF 338,32 2,09 2,11 118,41 2,05 1,92 247,63 2 1,93 290,82 2,08 1,94 245,37 2,05 2,12 309,88 2,05 1,98 EP 307,94 2,05 1,94 139,78 2,02 1,83 348,05 2,02 1,97 254,78 2,02 1,86 247,59 2,01 1,82 203,46 2,05 1,99 EPF 172,55 2,01 1,86 317,28 2,08 1,86 195,84 2 2,03 187,83 2,05 1,87 144,45 1,97 1,68 195,98 2 1,8 T6 T9 Concentración A260/A280 A260/A230 Concentración A260/A280 A260/A230 OH 253,88 2,05 1,92 540,83 1,76 2,02 296,55 2,03 1,95 - - - 289,01 2,01 1,86 - - - F 390,56 1,85 1,98 382,1 1,9 2,08 122,09 1,94 1,67 - - - 275,69 1,82 2 - - - E 259,98 1,99 2,03 148,92 1,96 1,86 110,61 1,9 1,95 - - - 413,62 1,89 2,12 - - - EF 352,79 1,85 2,11 585,73 1,95 1,96 140,67 1,9 1,71 - - - 195,51 1,99 1,92 - - - EP 303,65 1,99 1,93 378,32 1,99 1,89 241,47 1,99 1,86 - - - 261,38 2,01 1,79 - - - EPF 504,62 2,06 1,85 202,7 1,95 1,78 166,22 1,92 1,57 - - - 398,2 2,01 1,83 - - - 22 En cuanto a las proteínas, se adjuntan las tablas de valores expresados como concentración de proteínas (µg/µL) en las muestras analizadas, tanto de los miomas y miometrios a T0 (Tabla 5) como de las muestras de T6 y T9 sometidas a los distintos tratamientos (Tabla 6). Cabe destacar que el kit Micro BCA empleado para realizar la cuantificación es bastante sensible a la presencia de pequeñas cantidades de proteínas en las muestras, lo cual permite detectar y determinar el contenido proteico de muestras relativamente pequeñas o diluidas. Además, este kit es compatible con un amplio rango de productos presentes en la mayoría de las soluciones que se utilizan para resuspender proteínas, a diferencia de otros kits. Asimismo, mediante este método se obtienen curvas patrón con valores de correlación (R2) cercanos a 1, lo cual nos permite estimar la concentración de proteínas de una muestra en base a su absorbancia a partir de la ecuación de la recta obtenida, siempre que su valor caiga dentro del rango de concentraciones que se han utilizado para elaborar la curva patrón. La Figura 4 muestra una de estas gráficas calculadas durante la cuantificación de las proteínas de las distintas muestras. T6 T9 Concentración A260/A280 A260/A230 Concentración A260/A280 A260/A230 OH 148,73 2,05 2,02 225,45 2,04 2,04 327,09 2,1 2,02 104,08 1,91 2,07 255,7 2,08 2,06 - - - F 311,53 2,12 2,04 163,24 1,99 1,71 401,63 2,1 2 740,1 2,06 2,11 288,91 2,11 2,04 566,74 2,1 2,07 E 358,65 2,1 2,07 26,64 1,56 1,98 520,29 2,08 2,09 411,38 2,07 2,06 326,95 2,09 2 22,4 1,61 2,07 EF 419,73 2,1 2,04 137,99 1,89 2,03 409,87 2,09 2,03 439,83 2,05 2,1 305,61 2,1 2,04 348,47 2,03 2,05 EP 275,97 2,08 2,01 83,76 1,85 2,08 345,78 2,1 2,06 215,76 2,04 2,1 357,56 2,1 2,05 256,78 2,04 2,08 EPF 113,59 2,04 1,97 130,16 1,98 2,04 138,15 2,04 1,83 419,58 2,07 2,09 430,15 2,09 2,02 305,15 2,06 2,04 Tabla 6. Datos de la cuantificación del ARN de las muestras de L18 a T6 y T9 para cada uno de los tratamientos. Se recoge la concentración en ng/µL y los ratios de pureza. 23 Figura 4. Curva patrón elaborada para la cuantificación de las proteínas contenidas en las muestras correspondientes a L18T6 para los distintos tratamientos. En la esquina superior derecha se observa la ecuación de la recta obtenida y el valor de correlación (R2) Concentración de proteínas (µg/µL) L16T0 4,19 M16T0 3,64 L17T0 2,53 M17T0 2,42 L18T0 1,96 M18T0 2,70 Tabla 7. Datos de la cuantificación de proteínas correspondientes a las muestras de miomas y miometrios de T0, expresados como concentración de proteínas. 30 Matsuo, H., Maruo, T., & Samoto, T. (1997). Increased expression of Bcl-2 protein in human uterine leiomyoma and its up-regulation by progesterone. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 82(1), 293-299. Mello, J. B., Barros-Filho, M., Abreu, F., Cirilo, P., Domingues, M., Pontes, A., & Rogatto, S. (2018). MicroRNAs involved in the HMGA2 deregulation and its co-occurrence with MED12 mutation in uterine leiomyoma. 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