Illamento e caracterización de bacteriófagos de bacterias causantes da mastite bovina

1 FACULTADE DE CIENCIAS MÁSTER en INNOVACIÓN en NUTRICIÓN, SEGURIDADE e TECNOLOXÍAS ALIMENTARIAS Lucía Álvarez López ILLAMENTO E CARACTERIZACIÓN DE BACTERIÓFAGOS DE BACTERIAS CAUSANTES DA MASTITE BOVINA AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIÓFAGOS DE BACTERIAS CAUSANTES DE LA MAMITIS BOVINA ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF MASTITIS RELATED BACTERIA BACTERIOPHAGES Traballo de Fin de Máster Curso 2022/2023 2 3 ÍNDICE 1. INTRODUCIÓN .............................................................................................................7 2. OBXECTIVOS ..............................................................................................................15 3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................16 3.1 Mostras para illamento de bacterias causantes de mastite e bacteriófagos ...........16 3.2 Illamento e identificación de bacterias causantes de mastite .................................16 3.3 Illamento e purificación de bacteriófagos ...............................................................17 3.4 Expansión de fagos ..................................................................................................18 3.5 Illamento de DNA, secuenciación e anotación do xenoma ......................................19 3.6 Estabilidade térmica e a distintos valores de pH .....................................................21 3.7 Comparativa control – leite .....................................................................................22 3.8 Ensaio de infección por fagos ..................................................................................22 3.9 Curva de crecemento de un paso ............................................................................22 3.10 Análise estatístico ..................................................................................................22 4. RESULTADOS E DISCUSIÓN ........................................................................................23 4.1 Identificación bacteriolóxica ....................................................................................23 4.2 Illamento de fagos ...................................................................................................28 4.3 Morfoloxía de placas ...............................................................................................29 4.4 Análise xenómica do fago ........................................................................................30 4.5 Estabilidade térmica e a distintos valores de pH .....................................................40 4.6 Comparativa control – leite .....................................................................................41 4.7 Ensaio de infección por fagos ..................................................................................42 4.8 Curva de crecemento de un paso ............................................................................44 5. CONCLUSIÓN .............................................................................................................46 6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................47 4 RESUMO/RESUMEN/ABSTRACT A resistencia aos antimicrobianos considérase a pandemia silenciosa. Estímase, que no ano 2050 as bacterias multirresistentes provocarán anualmente 10 millóns de mortes. No caso do ganado leiteiro, a mastite é unha das principais patoloxías que require do uso de antibióticos e nos últimos anos estase a complicar o tratamento das mesmas debido ao aumento das resistencias bacterianas. Como consecuencia, estanse a buscar alternativas ao uso de antibióticos, como é o caso dos bacteriófagos, virus que infectan exclusivamente bacterias. Estes virus teñen un rango de lise pequeno e normalmente cada fago so infecta unha especie bacteriana ou as veces a serotipos específicos de unha especie bacteriana. Isto ten como consecuencia que o tratamento con fagos permita eliminar as bacterias patóxenos sen afectar ao resto da microbiota. O obxectivo de este traballo é illar de mostras de leite e de xurro de granxas de bovino leiteiro e de augas de depuradora, bacteriófagos de bacterias causantes de mastite e realizar unha caracterización dos mesmos para valorar o seu posible uno terapéutico. Illouse o fago de Klebsiella pneumoniae a partir de unha mostra de auga residual empregando a cepa K. pneumoniae CECT 8453. O xenoma de este fago foi secuenciado e presentou una lonxitude de 40564 pares de bases e non codifica no seu xenoma nin xenes de virulencia nin de resistencia, factor importante para o seu uso en terapia con fagos. Ademais, o bacteriófago de K. pneumoniae mostrou unha gran estabilidade a distintas temperaturas (-20 a 60ºC) e pH, excepto a pH 12. Tamén se puido comprobar que non hai diferenzas ante a estabilidade de este fago entre o control (tampón SM) e o leite. O seguinte paso a seguir será facer estudios in vitro e in vivo para determinar o potencial terapéutico do fago illado neste estudo. Palabras chave: Mastite bovina, leite, alternativas aos antibióticos, bacteriófagos, Klebsiella pneumoniae, caracterización fenotípica 5 La resistencia a los antimicrobianos se considera la pandemia silenciosa. Se estima, que en el año 2050 las bacterias multirresistentes provocarán anualmente 10 millones de muertes. En el caso del ganado lechero, la mastitis es una de las principales patologías que requieren del uso de antibióticos y en los últimos años se está a complicar el tratamiento de las mimas debido al aumento de las resistencias bacterianas. Como consecuencia, se están a buscar alternativas al uso de antibióticos, como es el caso de los bacteriófagos, virus que infectan exclusivamente bacterias. Estos virus tienen un rango de lisis pequeño y normalmente cada fago solo infecta una especie bacterias o a veces a serotipos específicos de una especie bacteriana. Esto tiene como consecuencia que el tratamiento con fagos permita eliminar las bacterias patógenas sin afectar al resto del microbiota. El objetivo de este trabajo es aislar de muestras de leche y de purín de granjas de bovino lechero y de aguas de depuradora, bacteriófagos de bacterias causantes de mastitis y realizar una caracterización de estes para valorar su posible uso terapéutico. Se aisló el fago de Klebsiella pneumoniae a partir de una muestra de agua residual usando la cepa K. pneumoniae CECT 8453. El genoma de este fago fue secuenciado y presentó una longitud de 40564 pares de bases y no codifica en su genoma ni genes de virulencia ni de resistencia, factor importante para su uso en terapia de fagos. Además, el bacteriófago de K. pneumoniae mostró una gran estabilidad a distintas temperaturas (-20 a 60ºC) y pH, excepto a pH 12. También se pudo comprobar que no hay diferencias ante la estabilidad de este fago entre el control (tampón SM) y la leche. El siguiente paso por seguir será hacer estudios in vitro y in vivo para determinar el potencial terapéutico del fago aislado en este estudio. Palabras clave: Mamitis bovina, leche, alternativas a los antibióticos, bacteriófagos, Klebsiella pneumoniae, caracterización fenotípica 6 Antimicrobial resistance is considered the silent pandemic. It is estimated that by 2050 multidrug-resistant bacteria will cause 10 million deaths annually. In the case of dairy cattle, mastitis is one of the main pathologies that require the use of antibiotics and in recent years, the treatment of the same is becoming complicated due to the increase in bacterial resistance. As a result, alternatives to the use of antibiotics are being sought, such as bacteriophages, viruses that exclusively infect bacteria. These viruses have a small lysis range and normally each phage only infects one species of bacteria or sometimes to specific serotypes of a bacterial species. This means that phage treatment eliminates pathogenic bacteria without affecting the rest of the microbiota. The objective of this work is to isolate milk and slurry samples from dairy cattle farms and sewage treatment plants, bacteriophages of bacteria causing mastitis and perform a characterization of them to assess their possible therapeutic use. The phage of Klebsiella pneumoniae was isolated from a wastewater sample using the K. pneumoniae CECT 8453 strain. The genome of this phage was sequenced and presented a length of 40564 base pairs and it does not encode virulence or resistance genes in its genome, an important factor for its use in phage therapy. In addition, the bacteriophage of K. pneumoniae showed great stability at different temperatures (-20 to 60ºC) and pH, except at pH 12. It was also possible to verify that there are no differences in the stability of this phage between the control (SM buffer) and milk. The next step will be to do in vitro and in vivo studies to determine the therapeutic potential of the phage isolated in this study. Keywords: Bovine mastitis, milk, antibiotic alternatives, bacteriophages, Klebsiella pneumoniae, phenotypic characterization 7 1. INTRODUCIÓN A mastite bovina é unha inflamación das glándulas mamarias das vacas (Sharun, y otros, 2021). Esta enfermidade está causada principalmente por infeccións bacterianas, pero tamén pode deberse a traumas físicos (Cheng & Han, 2020). Actualmente considérase unha enfermidade de gran impacto a nivel de benestar animal (Sharun, y otros, 2021) e a nivel económico debido ás perdas que provoca nas industrias gandeiras e lácteas (Cheng & Han, 2020). Segundo o grado de inflamación da ubre pódense diferenciar tres clases de mastite bovina; clínica, subclínica e crónica. A mastite clínica trátase do tipo de mastite máis fácil de detectar debido a que a ubre adquire unha tonalidade vermella e sofre inchazón. A maiores as vacas presentan febre (Cheng & Han, 2020). Un 40% do casos de mastite son causados por Streptococcus uberis, e Streptococcus dysgalactiae, un 30% por Staphylococcus aureus e un 30% por Escherichia coli (Abebe, Hatiya, Abera, Megersa, & Asmare, 2016). A diferenza da mastite clínica, a subclínica representa un 59,2% dos casos (Abebe, Hatiya, Abera, Megersa, & Asmare, 2016) e caracterizase por unha redución na produción do leite acompañada de un aumento no reconto de células somáticas. Sen embargo, neste caso non se aprecian cambios na ubre, o que dificulta o seu diagnóstico. O terceiro tipo de mastite bovina que se pode distinguir segundo o grado de inflamación da ubre é a mastite crónica. Esta trátase de unha clase de mastite que perdura varios meses (Cheng & Han, 2020). As células somáticas son células propias do organismo que lle serven á glándula mamaria como mecanismo de defensa contra organismos patóxenos. Están constituídas por leucocitos e células epiteliais. Unha vez que un patóxeno ataca as células do interior da glándula mamaria, o sistema inmunitario do organismo responde enviando glóbulos brancos á ubre para neutralizar as bacterias invasoras. Estes glóbulos brancos son os que constitúen maioritariamente o reconto de células mamarias. Por iso se di que un aumento de estas células garda relación coa presenza de mastite bovina (Hernández Reyes & Bedolla Cedeño, 2008). Un reconto por encima de 200000 células somáticas/mililitro de leite indica inflamación na ubre (Izurieta, 2017). Existen tres factores principais que están asociados coa incidencia da mastite bovina, o factor patóxeno, hóspede e ambiental (Cheng & Han, 2020). A mastite bovina está causada por diferentes bacterias. En base á infección bacteriana pódense diferenciar mastites contaxiosas e ambientais. A primeira transmítese de vaca a vaca por malas prácticas durante o muxidura; por exemplo polo uso de equipo en mal estado ou por falta de desinfección dos tetos tras o muxido. Polo tanto, a hixiene é un dos factores claves para previr este tipo de mastite (Cheng & Han, 2020). Dentro dos patóxenos máis comúns na mastite contaxiosa podemos diferenciar; S. aureus, S. agalactiae, Mycoplasma bovis ou Corynebacterium spp. (García Á. , 2004). S. aureus é un patóxeno Gram positivo. Trátase do patóxeno máis frecuentemente illado de mastites bovinas. Está asociado fundamentalmente coa mastite subclínica, aínda que tamén pode causar mastite clínica (Cheng & Han, 2020). Xera infeccións que poden perdurar ao longo 8 da lactación, polo tanto é preciso evitar o contacto entre as vacas sas e as infectadas, reducir o número de animais infectados (San Julián, 2012) e manter a hixiene do ubre das vacas durante o muxido. Este patóxeno pode chegar a reducir a produción de leite (Cheng & Han, 2020). O principal tratamento para paliar a mastite provocada por S. aureus basease no uso de antibióticos (San Julián, 2012), sen embargo, este patóxeno está desenvolvendo resistencia a antibióticos, como os β – lactámicos, debido á formación de biopelículas (Cheng & Han, 2020). S. agalactiae é un patóxeno Gram positivo. Encóntrase tanto no tracto gastrointestinal dos animais, como no medio ambiente. Isto xera que se transmita a través do equipo de muxido e a través da vía oro – fecal polo consumo de auga contaminada (Cheng & Han, 2020). O gando infectado por este tipo de patóxeno presenta un alto reconto de células somáticas asociado a unha diminución na produción de leite (San Julián, 2012). Ao igual que no caso anterior o tratamento basease no uso de antibióticos, como os β – lactámicos (San Julián, 2012). Sen embargo, este patóxeno pode sobrevivir durante moito tempo na ubre das vacas grazas á formación de biopelículas, polo que o tratamento con antibióticos non é o máis axeitado (Cheng & Han, 2020). M. bovis trátase de un patóxeno que causa menos mastites que S. aureus e S. agalactiae. Trátase de unha bacteria que é moi común no tracto respiratorio do gando bovino, pero que pode chegar a transferirse á glándula mamaria. A pesar de ser menos común xera graves enfermidades que producen unha diminución na produción de leite e incluso pode chegar a cesar a produción de este (San Julián, 2012). Ao igual que nos casos anteriores esta bacteria tamén posúe a capacidade de formar biopelículas, o que fai que sexa resistente aos antibióticos. Polo que o único medio de control é o seguimento do gando, separación e sacrificio das vacas infectadas (Cheng & Han, 2020). A mastite ambiental, a diferenza da contaxiosa, está causada por bacterias que proveñen do entorno da vaca, é dicir, do chan, das camas ou do esterco. De forma que as bacterias poden acceder ao teto durante o muxido (Cheng & Han, 2020). De entre as bacterias que causan este tipo de mastite destacan; S. uberis, E. coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp. ou Enterococcus spp. (García Á. , 2004). S. uberis é un patóxeno ambiental asociado tanto a mastites clínicas como subclínicas. Trátase de un patóxeno que habita tanto na pel da vaca como no seu entorno, é dicir, na cama, no chan ou no esterco. Xeralmente, este tipo de patóxeno causa infeccións cando as condicións ambientais son malas ou cando o gando ten feridas nos tetos (San Julián, 2012). Como nos casos anteriores este patóxeno é capaz de formar biopelículas que lle confiren resistencia tanto baixo estrés ambiental como ante o tratamento con antibióticos (Cheng & Han, 2020). E. coli é unha bacteria Gram negativa. Trátase de un dos patóxenos causantes da mastite ambiental, polo que pode encontrarse no entorno onde reside o gando e causa mastite clínica. Os síntomas que provoca este patóxeno na vaca poden ser moi variados, pode causar signos locais que inclúen ubre de cor vermello e inchado ou febre. Nos casos mais graves a produción de leite pode verse diminuída e incluso pode cesar (Cheng & Han, 2020). 9 Klebsiella pneumoniae é unha bacteria Gram negativa. Encontrase na materia fecal bovina, no ambiente ou nas camas de serrín. De entre os casos clínicos de mastite este patóxeno representa entre o 2 ao 9% (Massé, Dufour, & Archambault, 2020). Xera unha diminución na produción de leite, febre e incluso abortos. Xeralmente os brotes de mastite por este patóxeno prodúcense en verán. Presenta baixas taxas de curación bacteriolóxica despois da administración de antimicrobianos (Martín Richard, 2007). Pseudomonas aeruginosa causa mastites crónicas, aínda que tamén pode dar lugar a cadros agudos ou subagudos. Trátase de un patóxeno oportunista, que vive no chan e na auga. A principal causa de infección débese á limpeza dos tetos con auga contaminada. Ademais, trátase dun patóxeno moi resistente ao tratamento con antibióticos debido á capacidade de formación de biopelículas (Cheng & Han, 2020). Enterococcus spp. son patóxenos Gram negativos que causan infeccións ambientais porque residen no entorno do gando. Ao igual que nos casos anteriores trátase de patóxenos que resisten moi ben ao tratamento con antibióticos debido á formación de biopelículas (Cheng & Han, 2020). Entre os anos 2005 – 2011 o Laboratorio Interprofesional Galego de Análise do Leite (LIGAL) e un equipo de investigación da Universidade de Santiago de Compostela (USC) realizaron un estudo acerca dos principais patóxenos causantes de mastite bovina en Galicia (Galego, 2017). Neste estudo demostrouse que hai unha tendencia á baixa de algúns patóxenos como Corynebacterium spp., S. agalactiae ou Staphylococcus epidermidis. Sen embargo, outros patóxenos como S. uberis ou estafilococos coagulasa negativa seguen incrementando a súa presenza (Figura 1) (Galego, 2017). Figura 1. Frecuencia de patóxenos en mostras de leite (Galicia 2005 – 2011) (Galego, 2017) Outro estudo publicado en 2020 mostra unha comparativa da frecuencia dos principais patóxenos causantes de mastite entre dous traballos realizados en Galicia, un en 1998 e outro 16 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Mostras para illamento de bacterias causantes de mastite e bacteriófagos Os bacteriófagos son virus que infectan exclusivamente bacterias e por tanto precisan delas para producir novas partículas víricas. Por iso para poder illar os bacteriófagos, en primeiro lugar é preciso contar con bacterias hóspedes. Poden ser empregadas dous tipos de bacterias. Por un lado as cepas de coleccións de cultivo tipo a Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) da Universidade de Valencia ou tamén se poden empregar cepas salvaxes illadas de diversas matrices. É importante resaltar que nas mostras onde atopamos as bacterias de interese tamén se atopan os bacteriófagos que as depredan, xa que coexisten. Estas bacterias salvaxes son de gran interese para illar bacteriófagos xa que os fagos que atopamos nas mostras soen ter una alta capacidade de infección sobre esas bacterias. Por tanto, no presente estudo o primeiro que se realizou foi o illamento de bacterias causantes de mastite de mostras de leite de vacas con mastite. Para este propósito recolléronse un total de 42 mostras recollidas na provincia de Lugo. As mesmas mostras de leite empregadas para o illamento de bacterias causantes de mastites así coma as 10 mostras de xurro de granxas leiteiras foron empregadas para o illamento de fagos. Como medida de continxencia no caso de non illar fagos das mostras de leite e xurro das explotacións gandeiras decidiuse tamén recoller unha mostra de auga no punta de entrada de unha estación de depuración de augas residuais de Lugo. Estas mostras soen ter unha ampla concentración e diversidade de fagos dado o seu orixe e son as mostras de elección en moitos estudos para o illamento dos mesmos. 3.2 Illamento e identificación de bacterias causantes de mastite Para o illamento e a identificación do patóxeno causante da mastite usáronse distintos medios de cultivo selectivos e diferenciais. As mostras de leite e xurro foron sembradas empregando a técnica de sembra por esgotamento en estría. En primeiro lugar empregouse un medio selectivo especificamente deseñado para o illamento de bacterias Gram positivas causantes de mastite. Este método permite illar os patóxenos S. agalactiae, S. uberis e S. aureus e denominase CHROMagarTM GP Mastitis (15.0 g/L agar, 20.0 g/L peptona e extracto de levadura, 5.0 g sales, 2.4 g mestura cromoxénica e selectiva, 8.0 mL/L factores de crecemento) (CHROMagar, Paris, Francia). Este medio foi incubado a 37ºC durante 24h en condicións aerobias. Tamén se empregou un medio clásico para o illamento de Streptococcus spp. como é o Edwards Medium Base (10.0 g/L péptido dixestivo de tecido animal, 10.0 g/L extracto de carne, 1.0 g/L esculina, 5.0 g/L clorudo sódico, 0.0013 g/L cristal violeta, 0.33 g/L sulfato de talio de 17 tenreira, 15.0 g/L agar) (Oxoid, Basingstoke Hampshire, Reino Unido) suplementado con un 7% de sangre de ovella defibrinada (Thermo Scientific Oxoid, Reino Unido). Este medio foi incubado a 37ºC durante 24h. Para o illamento de S. aureus empregouse o medio de cultivo Baird Parker agar base (10.0 g/L triptona, 5.0 g/L extracto de carne, 1.0 g/L extracto de levadura, 5.0 g/L cloruro de litio, 12.0 g/L glicina, 10.0 g/L piruvato sódico, 20.0 g/L agar) (VWR, Barcelona, España) suplementado con 0.1 g/L de telurio potásico (Sigma-Aldrich, Missuri, Estados Unido), e 50.0 mL de emulsión de xema de ovo. Estas placas foron incubadas a 37ºC durante 48h. Para a identificación e reconto de coliformes en mostras de leite usouse o medio Violet Red Bile Lactose Agar (VRBL) (3.0 g/L extracto levadura, 7.0 g/L peptona, 1.5 g/L sales biliares, 10.0 g/L lactosa, 5.0 g/L cloruro sódico, 0.03 g/L vermello neutro, 0.0002 g/L cristal violeta, 13.0 g/L agar). Este medio foi incubado a 37ºC durante 24h. Dos diferentes medios e mostras empregadas nesta parte do traballo seleccionáronse colonias que tiñan unha morfoloxía típica dos patóxenos de interese para este estudo nos diferentes medios de cultivo empregados, que foron purificadas empregando caldo de BHI (27.5 g/L dixestión enzimática de tecido animal, extracto de cerebro e corazón, 2.0 g/L D(+)-Glucose, 5.0 g/L NaCl, 2.5 g/LNa2HPO4) (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania) suplementado con 15.0 g/L de agar (Liofilchem, Teramo, Italia). Una vez purificados os illados, con unha asa bacteriolóxica seleccionouse una colonia illada e foi transferida a un tubo de caldo BHI con 20% de gliceral e conservadas a -20ºC ata ser usadas. Para confirmar a identidade dos illados, estes foron sembrados no medio Columbia agar base (10.0 g/L peptona de caseína, 5.0 g/L peptona de carne, 3.0 g/L extracto de corazón, 5.0 g/L extracto de levadura, 1.0 g/L almidón, 5.0 g/L cloruro sódico, 13.0 g/L agar) suplementado con 5% de sangue de ovella defibrinada e foron enviados ao LIGAL. A identificación foi realizada empregando un sistema automatizado para a identificación microbiana por espectrometría de masas utilizando tecnoloxía de desorción/ionización láser asistida por matriz - Tempo de voo (MALDI-TOF). Concretamente empregouse o equipo VitekTM (Biomerieux, Marcy-l'Étoile, Francia) e a súa base de datos integrada. 3.3 Illamento e purificación de bacteriófagos Para o illamento de bacteriófagos empregáronse tres tipos de mostras. Por un lado empregáronse as mostras de leite das vacas con mastite e por outro lado empregáronse as mostras de xurro e tamén a mostra de auga residual recollida na depuradora de Lugo. O método empregado foi o descrito por (Van & Kropinski, 2009) con lixeiras modificacións. No caso do leite e xurro fíxose una mestura con volume equivalente de todas as mostras e esa foi empregada para illar os fagos. No caso do leite empregouse un volume de 40 mL e no caso do xurro un peso de 35 gramos. No caso da mostra de auga residual, esta foi centrifugada a 6000 x g durante 10 minutos a 4ºC para precipitar as partículas grosas e as células bacterianas. O sobrenadante foi recollido e filtrado por un filtro de xiringa de 0.22µm. Este filtrado foi o 18 empregado para o illado dos bacteriófagos. Neste punto, as mostras foron mesturadas co mesmo volume de caldo Luria Bertani (LB) (10.0 g/L Triptona, 5.0 g/L Extracto de Levadura, 10.0 g/L NaCl) (Nzytech, Lisboa, Portugal) a concentración 2X suplementado con 10mM de MgSO4 e un cultivo de 12 horas de bacteria hóspede para unha concentración final 1/10. As cepas empregadas para o illamento dos fagos foron as cepas de S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae e C. bovis illadas das mostras de leite, así como as cepas de referencia K. pneumoniae CECT 8453, S. uberis CECT 994 e S. agalactiae CECT 183. As mostras foron incubadas durante 24h a 37ºC e 130 rpm. Despois da incubación, as mostras foron centrifugadas a 6000 x g durante 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi recollido en un novo tubo e mesturado con cloroformo a unha concentración final 1/10 (v/v). Os tubos foron centrifugados novamente a 6000 x g durante 5 minutos a 4ºC. A fase acuosa foi recollida con unha xiringa e filtrada con un filtro de 0.22µm. Para determinar a presenza de fagos utilizouse unha capa de dobre agar. Para isto, empregáronse placas petri con LB agar que foron cubertas con una sobrecapa de 3 mL de LB semisólido (0.7% agar) con 100 µL de un cultivo bacteriano en fase exponencial de crecemento. Una vez solidificada a sobrecapa, puxéronse sobre a súa superficie 5 µL da mostra purificada no paso anterior. Una vez seca a gota as placas foron incubadas a 37ºC durante 24h. Despois de este tempo, determinouse a ausencia de crecemento bacteriano no lugar onde foi depositada a gota. No caso das mostras onde se detectou zona de inhibición, estas foron sometidas a dilucións decimais empregando tampón SM (0.05 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 0.008 MgSO4, pH 7.5). De novo, 5 µL de cada dilución foi sementada en dobre agar ata observar a presenza de placas fáxicas illadas. As placas fáxicas illadas foron repicadas ata ter placas fáxicas con unha morfoloxía única. 3.4 Expansión de fagos Para producir fagos empregouse o método do dobre agar descrito previamente por (Melo, y otros, 2014) con modificacións. Resumidamente, unha placa illada de fago foi pinchada empregando unha parte punzante de unha asa de sembra de un solo uso. Esta empregouse para pinchar un agar de doble capa preparado como se describiu na sección anterior realizando dúas liñas de punto paralelas (Figura 5). Despois pasouse un papel previamente esterilizado por toda a superficie da placa para expandir as partículas fáxicas. 19 Figura 5. Expansión do fago de K. pneumoniae. As placas foron incubadas durante a 37ºC durante 6h. A continuación, a sobrecapa semisólida foi recolectada con un asa Digralsky e introducida en un tubo falcón de 15 mL. Despois foron engadidos 3 mL de tampón SM e os tubos foron axitados a 4ºC durante 3h. Pasado este tempo, os tubos foron centrifugados a 6000 x g a 4ºC durante dez minutos. O sobrenadante foi traspasado a un novo tubo e mesturado con cloroformo para unha concentración final 1/10 (v/v). O tubo foi centrifugado de novo a 6000 x g a 4ºC durante cinco minutos e a fase acuosa foi filtrada empregado un filtro de xeringa de 0.22 µM. Este stock de fagos foi conservado a 4ºC e a súa concentración foi determinada empregando o método de dobre capa e dilucións decimais descrito anteriormente. 3.5 Illamento de DNA, secuenciación e anotación do xenoma Un volume de 200µL do stock do fago usouse para a extracción do DNA empregando o kit comercial PureLink Genomic DNA mini kit (Invitrogen, ThermoFisher Scientific) seguindo o protocolo descrito polo fabricante para mostras de sangue. Para a cuantificación do DNA unha vez extraído empregouse o fluorímetro comercial QubitTM (Invitrogen, ThermoFisher Scientific) e o kit de ensaios de DNAds Qubit™ BR (Invitrogen, ThermoFisher Scientific). Para a secuenciación do xenoma completo do bacteriófago empregouse a plataforma de secuenciación de cuarta xeración de Oxford Nanopore MinION (Oxford Nanopore Technologies (ONT), Oxford, Reino Unido). O proceso foi o seguinte; 400 ng de DNA do bacteriófago foi preparado para a secuenciación empregado o kit comercial Rapid Sequencing kit (ONT) seguindo as instrucións do fabricante. Este kit produce unha fragmentación aleatoria do DNA e engade unha serie de adaptadores que permiten que o DNA poida ser secuenciado. Una vez prepara a mostra, esta foi cargada na célula de secuenciación Flongle (ONT), previamente posta no equipo de secuenciación MinION (ONT). Este equipo ten un tamaño 20 menor a un móbil intelixente actual e pode ser usando simplemente conectándoo a un ordenador portátil de gama media/alta. A célula de secuenciación está composta de una serie de proteínas por as que pasan as cadeas de DNA ao ser secuenciada (Figura 6). O paso dos nucleótidos polo canal da proteína causa un cambio no fluxo de corrente. Este cambio de corrente é característico para cada nucleótido, e é o que se usa para secuenciar o DNA. O software de secuenciación foi o MinKNOW version 22.05.5. Ao final da secuenciación obtéñense os arquivos Fast5, onde se atopan os datos crús de secuenciación. Figura 6. Esquema de secuenciación da tecnoloxía Oxford Nanopore Technologies. Figura creada con Biorender.com O software Guppy versión 6.0.1 (ONT) en modo fast-basecalling foi empregado para realizar o basecalling (transformación da sinais crús do aparato de secuenciación en nucleótidos) dos datos de secuenciación. En este paso obtéñense os arquivos FASTQ que serán empregados para os seguintes pasos. As seguintes análises bioinformáticas foron realizadas a través do servizo Galaxy (Galaxy Community, 2022). Este é un proxecto colaborativo e de acceso libre realizado por diversas institucións educativas e de investigación ao redor do mundo. Permite realizar con calquera ordenador, a través de un navegador web, análises bioinformáticas que requiren de altos recursos informáticos. Isto é posible xa que este servizo usa diferentes servidores de alta potencia localizados en diferentes rexións. Ademais, hai que ter en conta que a maioría de softwares para este tipo de análises traballan en base Linux e requiren certos coñecementos informáticos. Como esta plataforma traballa a través de una interface gráfica en calquera navegador web, calquera persoa con poucos coñecementos informáticos pode realizar análises bioinformáticas que de outro xeito non estarían ao seu alcance. O fluxo bioinformático empregado neste estudo foi o seguinte. Os arquivos FASTQ foron subidos ao servidor europeo de Galaxy (https://usegalaxy.eu/). En primeiro lugar os arquivos FASTQ foron convertidos a formato FASTA empregando a ferramenta FASTQ to FASTA converter (Galaxy Version 1.1.5). Despois os arquivos FASTA foron unidos en un so mediante a ferramenta Merge.files Merge data (Galaxy Version 1.39.5.0). 21 As lecturas obtidas na secuenciación teñen que ser pulidas para eliminar os adaptadores introducidos por o kit durante a preparación das mostras para a secuenciación. Para iso empregase a ferramenta Porechop adapter trimmer for Oxford Nanopore reads (Galaxy Version 0.2.4+galaxy0) (Rrwick, 2017) coa configuración por defecto. O arquivo FASTA obtido neste paso será o empregado para os seguintes procesos. Para coñecer as estatísticas de secuenciación (número de bases secuenciadas, tamaño de lecturas) empregouse a ferramenta NanoPlot Plotting suite for Oxford Nanopore sequencing data and alignments (Galaxy Version 1.36.2+galaxy1) (De Coster, 2018). O seguinte paso foi o de reconstruír o xenoma do fago a partir das lecturas obtidas na secuenciación. Iso denominase De Novo Assembly e realízase mediante o emprego de ensambladores. Esas ferramentas fan un aliñamento das lecturas e conseguen reconstruír o xenoma sen usar ningún outro xenoma como referencia. Das diferentes ferramentas dispoñibles para ensamblar lecturas obtidas ca tecnoloxía ONT empregouse Create assemblies with Unicycler pipeline for bacterial genomes (Galaxy Version 0.5.0+galaxy1) (Wick, Judd, Gorrie, & Holt, 2017) empregando as condicións por defecto. Para visualizar o ensamblaxe obtido empregouse a ferramenta Bandage Image visualize de novo assembly graphs (Galaxy Version 2022.09+galaxy4) (Wick, Schultz, Zobel, & Holt, 2015). O ensamblaxe foi pulido empregando a ferramenta Medaka consensus pipeline Assembly polishing via neural networks (Galaxy Version 1.7.2+galaxy0). Este paso permite corrixir erros de nucleótidos. A ferramenta tRNA prediction (tRNAscan) (Galaxy Version 0.4) foi empregada para determinar a presenza de RNA de transferencia na secuencia do fago (Lowe & Eddy, 1997). Finalmente o xenoma obtido tras o paso de pulido foi anotado (adxudicación de información xenética ao xenoma) nunha plataforma que traballa dunha forma similar a Galaxy denominada Kbase (https://www.kbase.us/) (Arkin, y otros, 2018). Isto foi debido a que ferramenta empregada para a anotación non estaba dispoñible en Galaxy. Esta foi feita co programa RASTtk - v1.073 (Overbeek, y otros, 2014). Finalmente a ferramenta BLAST do NCBI foi empregada para realizar una comparativa do xenoma do fago illado de K. pneumoniae. 3.6 Estabilidade térmica e a distintos valores de pH Para caracterizar o fago e a súa capacidade para poder ser usado en futuras terapias fáxicas estudouse a súa estabilidade ante diferentes condicións. Para avaliar a estabilidade térmica, incubáronse 108 PFU/mL do fago de K. pneumoniae en tampón SM ás temperaturas -20ºC, 4ºC (control), 28ºC, 42ºC e 60ºC durante 24h. Unha vez finalizado o período de incubación, a concentración dos fagos determinouse empregando o método de dobre capa e de dilucións decimais descrito anteriormente. Para avaliar o efecto do pH na estabilidade do fago usouse un tampón de pH universal (150 mM KCl, 10 mM KH2PO4, 10 mM Na3C6H5O7 e 10mM H3BO3) como describen (Ferreira, y otros, 2021). O rango de pH avaliado foi de pH 2 a pH 12 e este foi axustando empregando HCL 2N e NaOH 2N. As mostras foron incubadas á temperatura ambiente durante 24h. Despois dese 22 tempo a concentración de fagos determinouse da mesma forma que no caso da temperatura. En ambos casos realizáronse seis ensaios independentes. 3.7 Comparativa control – leite O principal obxectivo do traballo é illar fagos que poidan ser empregados no tratamento da mastite en vacas leiteiras. Para iso é fundamental caracterizar a estabilidade do fago illado en leite. Isto é fundamental para valorar o seu potencial uso clínico. Para isto comparouse a estabilidade do fago de K. pneumoniae entre a condición control (tampón SM) e o leite enteiro. As mostras foron incubadas a 33ºC durante 24h (Rodríguez, Sánchez Matamoros, Carvajal Valilla, Blanco Murcia, & Sánchez Vizcaíno, 2008) para simular a temperatura da ubre da vaca. Realizáronse seis ensaios independentes. 3.8 Ensaio de infección por fagos A bacteria K. pneumoniae incubouse a 37ºC, 130 rpm ata que se obtivo un valor de densidade óptica medida a 630 nm (DO630) de aproximadamente 0.200. Unha vez acadada esta DO630, preparouse una mestura da bacteria co fago para ter multiplicidade de infección (MOI) de 0.1, 1 e 10. Para o control positivo preparouse unha mostra na que había unicamente bacteria. A DO tanto das mostras a diferentes MOI como a do control positivo (so bacteria) determinouse durante unha semana cada 24h empregando un lector de microplacas (Das, Roma, Italia). Para isto, transferíronse 200 µL das mostras a placas de poliestireno de 96 pocillos. Realizáronse dous ensaios independentes. 3.9 Curva de crecemento de un paso A curva de crecemento de un paso obtívose agregando o fago a MOI máis efectiva (MOI 0.1) a unha suspensión bacteriana exponencial de K. Pneumoniae, DO630 de aproximadamente 0.200, incubada a 37ºC, 130 rpm. Tomáronse mostras periodicamente ata 150 minutos para a titulación de fagos. Realizáronse tres experimentos independentes. 3.10 Análise estatístico As análises estatísticas leváronse a cabo usando o programa estatístico RStudio. En primeiro lugar os números de fagos (PFU) obtidos nos diferentes resultados transformáronse a log10 para obter homoxeneidade de varianza nos datos. Posteriormente, naqueles casos onde a variable cualitativa ou factor estaba determinada por máis de dous compoñentes, a análise estatística realizada foi unha análise de varianza (ANOVA). Sen embargo, cando a variable cualitativa estaba determinada por dous compoñentes, a análise estatística realizada foi un Test-t para mostras independentes. En ambos os casos as mostras consideráronse estatisticamente diferentes para valores de p – valor inferior a 0.05. 23 4. RESULTADOS E DISCUSIÓN 4.1 Identificación bacteriolóxica O primeiro paso do traballo consistiu en intentar illar patóxenos de mostras de leite de vacas diagnosticadas de mastite. A selección dos medios de cultivos empregados no traballo fíxose tendo en conta cales son as principais bacterias implicadas nesta enfermidade. Por sembra das mostras nos distintos medios de cultivo (CHROMagarTM GP Mastitis, Edwards Medium Base, BD Baird – Parker Agar, VRBL) identificáronse os posibles patóxenos causantes da mastite bovina. CHROMagarTM GP Mastitis é un medio cromoxénico e diferencial empregado para a identificación rápida das principais bacterias Gram positivas implicadas na mastite. Neste medio as colonias de S. agalactiae (Figura 7A) aparecen dunha cor azul turquesa, mais con esta cor poden aparecer tamén as colonias de S. dysgalactiae, outra bacteria implica na mastite. As colonias de S. uberis (Figura 7B) aparecen dunha cor azul escura ou metálica. Pero desta cor tamén poden aparecer as cepas de Enterococcus spp., unha bacteria comunmente presente no ambiente e que tamén pode causar mastite. Por tanto, é importante destacar que as colonias típicas poden corresponderse con diferentes especies e necesitan de confirmación posterior. Finalmente, as cepas de cor rosa poden ser presuntivos S. aureus. Este medio foi amplamente avaliado por (Garcia, y otros, 2021) e (Granja, Fidelis, Garcia, & Veiga dos Santos, 2021) en mostras de vacas con mastite clínica e subclínica (Figura 7C). Ambos estudos mostraron unha sensibilidade e especificidade maior do 90% para identificar S. agalactiae/ S. dysgalactiae e S. uberis/ Enterococcus spp. Sen embargo, no caso de S. aureus a sensibilidade do medio CHROMagarTM GP Mastitis foi menor do 50% (Garcia, y otros, 2021) Por ese motivo, neste estudo tamén se empregou o medio Baird Parker Agar para identificar S. aureus (Figura 7D), onde ca frecha se marca unha colonia típica de S. aureus illada dunha mostra de leite co seu halo característico nese medio. Tamén se empregou o medio Edwards Medium Base suplementado con 7% de sangue de ovella defibrinada para illar S. agalactiae. Neste medio as colonias de S. agalactiae van dende unha cor azulada ata ausencia de cor e o halo de inhibición ao seu redor indica presencia de hemólise (Figura 7F). En canto ao medio VRBL empregouse para a detección de bacterias Gram negativas implicadas na mastite bovina como pode ser E. coli ou K. pneumoniae. As colonias típicas illadas poden apreciarse na Figura 7E. 24 Figura 7. Medios de cultivo empregados no traballo. Colonias presuntivas de A) S. agalactiae/ S. dysgalactiae en medio CHROMagarTM GP Mastitis, B) S. uberis/ Enterococcus spp. en medio CHROMagarTM GP Mastitis, C) S. aureus en medio CHROMagarTM GP Mastitis, D) S. aureus en medio BD Baird Parker Agar, E) Coliformes en medio VRBL, F) Colonias azuis en S. agalactiae en Edwards Medium Base. Na Táboa 1 móstrase un resumo das colonias presuntivas encontradas nas diferentes mostras analizadas. É moi importante destacar que se trata de colonias presuntivas e que estas necesitan ser confirmadas posteriormente para saber realmente que tipo de patóxeno en 25 concreto son. En todas as mostras analizadas houbo crecemento de cepas que tiñan una morfoloxía típica de patóxenos causantes de mastite. Varias de esas colonias foron purificadas en BHI e confirmadas polo sistema automatizado VitekTM. Táboa 1. Presenza presuntiva de colonias típicas en cada un dos medios empregados en este estudo. Colonias presuntivas Referencia da mostra CHROMagarTM GP Mastitis VRBL BD BairdParker Agar Edwards Medium Base 2 S. uberis /Enterococcus spp. S. agalactiae/dysgalactiae Coliformes Staphylococcus spp. S. agalactiae 2b S. uberis/Enterococcus spp S. agalactiae/dysgalactiae Coliformes Staphylococcus spp. S. agalactiae 3 S. aureus Coliformes S. aureus S. agalactiae 3b S. aureus Coliformes S. aureus S. agalactiae Tanque S. uberis/Enterococcus spp S. agalactiae/dysgalactiae S. aureus Coliformes Staphylococcus spp. S. agalactiae 9 S. uberis/Enterococcus spp S. agalactiae/dysgalactiae S. aureus Coliformes S. aureus Streptococcus spp. 10 S. uberis/Enterococcus spp S. agalactiae/dysgalactiae Staphylococcus spp. Streptococcus spp. 11 S. uberis/Enterococcus spp S. agalactiae/dysgalactiae S. aureus Coliformes Staphylococcus spp. Streptococcus spp. 12 S. agalactiae/dysgalactiae Streptococcus spp. 13 S. uberis/Enterococcus spp S. agalactiae/dysgalactiae Coliformes Staphylococcus spp. Streptococcus spp. 14 Staphylococcus spp. S. agalactiae 15 S. uberis/Enterococcus spp S. agalactiae/dysgalactiae S. aureus Staphylococcus spp. Streptococcus spp. 16 S. uberis/Enterococcus spp S. agalactiae/dysgalactiae Coliformes Streptococcus spp. 17 S. agalactiae/dysgalactiae Coliformes S. aureus Streptococcus spp. 18 S. agalactiae/dysgalactiae Coliformes S. aureus Streptococcus spp. 19 S. uberis/Enterococcus spp Coliformes Staphylococcus spp. Streptococcus spp. 20 S. uberis/Enterococcus spp S. agalactiae/dysgalactiae Coliformes Staphylococcus spp. Streptococcus spp. 32 Figura 10. Descrición xeral do xenoma do fago K. pneumoniae. 33 Na Táboa 4 aparecen identificados os xenes do xenoma do fago K. pneumoniae. Cabe destacar a importancia de algúns dos xenes. As endolisinas, holinas e lisinas son enzimas claves durante o ciclo lítico dos fagos. As endolisinas son enzimas que hidrolizan a parede celular da bacteria hóspede, permitindo así a liberación da proxenie. As holinas son pequenas proteínas que serven para desencadear e controlar a degradación da parede celular da bacteria hóspede ao final do ciclo lítico de infección viral (Abdelrahman, y otros, 2021). E as lisinas son enzimas que degradan o peptidoglicano bacteriano, polo que son unha fonte prometedora para o uso de antimicrobianos, fronte á resistencia a antibióticos (García, y otros, 2022). Para que o ciclo lítico poida ser levado a cabo son necesarias determinadas enzimas. A proteína de unión a DNA moconatenario é unha destas enzimas, xa que é a encargada de desestabilizar o DNA bicatenario, uníndose de forma non específica á secuencia, pero de forma selectiva e cooperativa ao DNA monocatenario. De esta forma orixínase unha estrutura que é recoñecida polas enzimas implicadas na replicación, reparación e recombinación do DNA (InterPro). Tamén son importantes enzimas como; a DNA ligasa dependentes de ATP, xa que son as encargadas de unir as roturas no esqueleto fosfodiéster do DNA durante a replicación e a reparación (Pan, Lian, Sarre, & Kirsti , 2021). As endonucleasas desempeñan unha función clave no ciclo de vida dos fagos porque son as encargadas do empaquetamento do DNA do bacteriófago (Zhang, y otros, 2017). A exonucleasa é unha enzima encargada da eliminación de secuencias redundantes (Cassuto, Lash, Sriprakash, & Radding, 1971). Finalmente, destaca a primasa que é unha polimerasa de RNA que sintetiza cebadores de RNA durante a replicación do DNA (Griep, 1995). Ademais, para a estruturación dos fagos son importantes enzimas como; as proteínas de andamiaxe de bacteriófagos que son as proteínas encargadas do ensamblaxe dos bacteriófagos. Ou as proteínas da cápside que son as encargadas da formación da cápsula dos bacteriófagos (White, y otros, 2012). 34 Táboa 4. Identificación dos xenes do xenoma do fago K. pneumoniae anotados co programa bioinformático RASTtk - v1.073 (Overbeek, y otros, 2014). Na segunda columna o termino AA refírese a aminoácidos, e dicir o número de residuos de aminoácidos da proteína. Os marcos de lectura abertos obtidos identificados co programa RASTtk foron tamén analizados na páxina web InterPro para obter a afiliación familiar da proteína así como os procesos biolóxicos nos que está implicada, a súa función molecular e o compoñente molecular implicado. No caso da afiliación familiar á proteína, os textos teñen un hipervínculo para que se poda acceder a explicación de cada familia proteica. InterPro GO terms Anotación RASTtk - v1.073 AA Afiliación familiar á proteína Proceso biolóxico Función molecular Compoñente celular Phage S-adenosyl-L-methionine hydrolase (EC 3.3.1.2) 152 Phage protein 66 Phage protein 78 Phage serine/threonine kinase involved in host transcription shutoff Gp0.7 339 Phage DNA-directed RNA polymerase (EC 2.7.7.6) 907 DNA-directed RNA polymerase, phage-type (IPR002092) Transcrición por DNA Actividade RNA polimerasa 5'-3' dirixida por ADN Unión DNA Phage protein 187 Phage protein 59 Phage protein 86 Phage-associated ATPdependent DNA ligase (EC 6.5.1.1) CDS 349 Recombinación DNA Reparación DNA Actividade DNA ligasa Unión ATP Actividade DNA ligasa (ATP) 35 Unión á dobre cadea de DNA Phage protein Gp1.6 88 Phage nucleotide kinase Gp1.7, phosphorylates dGMP to dGDP and dTMP to dTDP 144 SaV-like (IPR021739) Phage protein Gp2.8/Gp7.7 contains HNH endonuclease motif 130 Actividade endonuclease Unión DNA Phage protein Gp1.8 43 Phage protein Gp2, bacterial RNA polymerase inhibitor 50 RNA polymerase inhibitor (IPR016412) Phage single-stranded DNAbinding protein Gp2.5 232 Single-stranded DNA-binding protein, bacteriophage T7 (IPR016411) Unión DNA Phage endonuclease I (EC 3.1.21.2), four-way DNAjunctions resolving 150 Bacteriophage T7, Gp3, endodeoxynuclease I (IPR008029) Integración DNA Proceso viral Actividade desoxirribonucleasa IV Phage endolysin 152 Peptidoglycan recognition protein (IPR015510) Endolysin T7 type (IPR034689) Proceso catabólico do peptidoglicano Liberación viral da célula hospede por citólises Regulación negativa da transcrición viral Actividade Nacetilmuramoil-Lalanina-amidasa Unión ións de zinc 36 Phage protein 39 Phage protein 40 Phage primase/helicase protein Gp4A 577 Twinkle-like protein (IPR027032) Bacteriophage T7 DNA helicase/primase (IPR046394) Replicación DNA Unión ATP Actividade DNA helicasa Actividad DNA primasa Actividade helicasa Unión ións de zinc Unión de DNA monocatenario Actividade 5'-3' DNA helicasa Phage protein Gp4.3 70 Protein of unknown function DUF5471 (IPR035156) Phage protein Gp4.5, inhibitor of host toxin/antitoxin system 104 Inhibitor of toxin/antitoxin system Phage protein Gp4.7 129 Phage DNA-directed DNA polymerase (EC 2.7.7.7) 704 DNA polymerase A (IPR002298) Replicación do DNA Replicación do DNA provocada por o DNA Actividade DNA polimerasa dirixida ao ADN Unión de ácidos nucleicos Unión do DNA 37 Phage protein Gp5.5 suppressor of silencing 101 Protein suppressor of silencing, bacteriophage T7 (IPR022611) Phage protein Gp5.7 70 Phage exonuclease (EC 3.1.11.3) 302 Phage protein Gp6.3 37 Phage protein Gp6.5 82 Bacteriophage T7-like gene 6.5 (IPR020121) Phage virion protein Gp6.7 ejected into infected cell 74 Bacteriophage T7-like, protein 6.7 (IPR020134) Phage virion assembly protein Gp7.3 ejected into infected cell 87 Bacteriophage T7-like virion assembly protein (IPR024281) Phage collar, head-to-tail connector protein Gp8 536 Head-to-tail connector protein, podovirus-type (IPR020991) Portal protein, Caudovirales (IPR038995) Expulsión do xenoma viral a través da envoltura da célula hospede, mecanismo de cola corta Complexo portal vírico Phage capsid assembly scaffolding protein Gp9 320 Capsid assembly scaffolding protein-like (IPR008768) Ensamblaxe da cápsula vírica Phage major capsid protein Gp10A 346 Cápsula viral Phage protein 77 Phage non-contractile tail tubular protein Gp11 193 Tail tubular protein Gp11 (IPR033767) 38 Phage non-contractile tail tubular protein Gp12 792 Phage scaffold protein Gp13, required for Gp6.7 incorporation into virion 137 Probable scaffold protein Gp13, bacteriophage T7 (IPR020335) Phage DNA ejectosome component, internal virion protein Gp14 197 Internal virion protein Gp14 (IPR038996) Expulsión do xenoma viral a través da envoltura da célula hospede Phage DNA ejectosome component, internal virion protein Gp15 752 Internal virion protein Gp15 (IPR038993) Expulsión do xenoma viral a través da envoltura da célula hospede -Phage DNA ejectosome component Gp16, peptidoglycan lytic exotransglycosylase (EC 4.2.2.n1) 1322 Internal virion protein Gp16 (IPR038994) Proceso metabólico do peptidoglicano Expulsión do xenoma viral a través da envoltura da célula hospede Actividade lítica da transglicosilasa Membrana Phage non-contractile tail fiber protein Gp17 778 Bacteriophage T7 tail fibre protein (IPR005604) Phage non-contractile tail fiber protein Gp17 525 39 Phage holin, class II Gp17.5 70 Bacteriophage T7, Gp17.5, holin (IPR019682) Liberación viral da célula hóspede por citólises Phage terminase small subunit Gp18, DNA packaging 86 DNA maturase, bacteriophage T7like (IPR024345) Phage Rz-like lysis protein Gp18.5 149 Spanin, inner membrane subunit Liberación viral da célula hóspede por citólises Phage terminase large subunit Gp19, DNA packaging 586 Terminase, large subunit gp19 (IPR044271) Unión ATP Actividade endonuclease Actividade hidrólisis de ATP 40 4.5 Estabilidade térmica e a distintos valores de pH A temperatura e o pH son factores físicos externos que inflúen na supervivencia dos bacteriófagos xa que desempeñan un papel fundamental na fixación, penetración, multiplicación e viabilidade dos bacteriófagos (Jończyk, Kłak, Międzybrodzki, & Górski1, 2011). A Figura 11 mostra unha representación das PFU/mL (Log10) do fago de K. pneumoniae a distintas temperaturas (ºC); -20ºC, 4ºC (control), 28ºC, 42ºC e 60ºC. Como pode apreciarse este fago é estable a todas as temperaturas. Si comparamos estes resultados co estudo que se realizou en 2020 sobre os efectos beneficiosos do bacteriófago CM8-1 nun modelo de mastite bovina xerada por K. pneumoniae pode determinarse que en ambos os casos o fago é estable a temperaturas comprendidas entre 30ºC e 60ºC (Zhao, y otros, 2021). Sen embargo, no estudo realizado en 2020 non se determinou a estabilidade a temperaturas inferiores a 30ºC, pero si se determinou a estabilidade temperaturas superiores a 60ºC e determinouse que o fago non era estable. No presente estudo sería necesario determinar a estabilidade do fago illado a temperaturas superiores a 60ºC para así realizar unha comparativa. Realizando unha análise estatística por ANOVA pode determinarse que con un p – valor de 0.274 acéptase a hipótese nula (p – valor > 0.05), polo que non hai diferenzas estatisticamente significativas da estabilidade de este fago entre as distintas temperaturas. Que non haxa diferenzas ante a estabilidade de este fago a distintas temperaturas é unha vantaxe xa que á hora de realizar unha terapia con fagos no caso da mastite bovina, o fago non se degradaría nun amplo rango de temperaturas. Figura 11. Estabilidade térmica do fago de K. pneumoniae. Ensaios realizados a diferentes temperaturas (- 20ºC, 4ºC (control), 28ºC, 42ºC e 60ºC) durante 24h. As barras de error representan a desviación estándar de seis ensaios independentes. A Figura 12 mostra unha representación das PFU/mL (Log10) do fago de K. pneumoniae a distintos pH; 2, 3, 4, 5, 6, 7 (control), 8, 9, 10, 11 e 12. Como pode apreciarse este fago é estable a todos os pH, menos a pH 12. Si comparamos estes resultados co estudo que se realizou en 2020 sobre os efectos beneficiosos do bacteriófago CM8-1 nun modelo de mastite bovina 0 2 4 6 8 10 12 -20 428 42 60 Log10 PFU/mL Temperatura (ºC) 41 xerada por K. pneumoniae (Zhao, y otros, 2021) pode determinarse que en ambos os casos o fago é estable a pH comprendidas entre 6 e 10. Sen embargo neste estudo determinouse que o fago non era estable a pH comprendidos entre 2 e 4, pero os meus resultados mostraron estabilidade a pH 3 e 4, ao igual que tamén mostraron estabilidade a pH 11. Realizando unha análise estatística por ANOVA, sen ter en conta o pH 12, pode determinarse que con un p – valor de 0.0288 non se acepta a hipótese nula (p – valor < 0.05), polo que hai diferenzas estatisticamente significativas da estabilidade de este fago entre os distintos pH. Concretamente existen diferenzas significativas entre os pH 4 e 11. Que haxa estas diferenzas estatisticamente significativas entre os pH 4 e 11 non inflúe en canto á estabilidade do fago a estes pH, xa que como podemos ver na Figura 12 é estable. Isto supón unha vantaxe xa que á hora de realizar terapia con fagos, no caso da mastite bovina, o fago non se degradaría a un gran rango de pH. Sen embargo, non podería usarse a un pH 12 porque non é estable. Figura 12. Estabilidade do fago de K. pneumoniae a distintos pH. Ensaios realizados a diferentes pH (2, 3, 4, 5, 6, 7 (control), 8, 9, 10, 11, 12) durante 24h. As barras de error representan a desviación estándar de seis ensaios independentes. Polo tanto, este fago presenta unha excelente tolerancia a medios ácidos e alcalinos, ademais, é termoestable, polo que pode considerarse un bacteriófago con un gran potencial para tratar enfermidades causadas por K. pneumoniae in vivo. 4.6 Comparativa control – leite Determinar a estabilidade do fago unha vez exposto ao leite cru é un factor clave para un posible tratamento da mastite bovina con bacteriófagos. Diversos estudios mostran unha redución do título de fagos despois de unha exposición ao leite cru. No caso de un fago listerial (A511) observouse unha redución do 43% do total de fagos despois de entrar en contacto co 0 2 4 6 8 10 12 3 4 5 6 7 8 10 11 12 Log10 PFU/mL pH 48 Biological Chemistry, 283(11), 7242-7250. doi:https://doi.org/10.1074/jbc.M709398200 Galaxy Community. (21 de Abril de 2022). The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2022 update. Nucleic Acids Res. doi:10.1093/nar/gkac247 Galego, C. (17 de Marzo de 2017). Principales patógenos causantes de mamitis en vacuno de leche en Galicia. Campo Galego. Obtenido de https://www.campogalego.es/principales-patogenos-causantes-de-mamitis-envacuno-de-leche-en-galicia/ García Suárez, P., Martínez Fernández, B., & Rodríguez González, A. (2008). Nuevas alternativas en el tratamiento de la mastitis en el ganado vacuno. Tecnología Agroalimentaria(5), 55-58. Obtenido de http://hdl.handle.net/10261/7668 García, Á. (1 de Enero de 2004). Contagious vs. environmental mastitis. Obtenido de https://openprairie.sdstate.edu/extension_extra/126/ Garcia, N., Fidelis, C. E., Freu, G., Granja, B., Vegia dos Santos, M., & Breno, L. (31 de Abril de 2021). Evaluation of Chromogenic Culture Media for Rapid Identification of GramPositive Bacteria Causing Mastitis. 104(8). Obtenido de https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2021.662201/full García, P., Vázquez, R., Van Raaij, M., Seoane, M., Rivero, V., & Ruiz, S. (22 de Marzo de 2022). Centro de Investigación Biomédica En Red. Obtenido de Enfermedades Respiratorias: https://www.ciberes.org/noticias/estudios-funcionales-y-estructurales-de-unaenzima-antibacteriana-desvelan-subdominios-de-union-yactividad#:~:text=Las%20lisinas%20de%20los%20bacteri%C3%B3fagos,a%20bacterias %20resistentes%20a%20antibi%C3%B3ticos García-Anaya, M., Sepúlveda, D., Rios-Velasco, C., Zamudio-Flores, P., Romo-Chacón, A., & Acosta-Muñiz, C. (Abril de 2020). Stability of listerial bacteriophage A511 in bovine milk fat globules. International Dairy Journal, 103. doi:https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2019.104627 Granja, B., Fidelis, C. E., Garcia, B., & Veiga dos Santos, M. (2021). Evaluation of chromogenic culture media for rapid identification of microorganisms isolated from cows with clinical and subclinical mastitis. Journal os Dairy Science, 104(8), 9115.9129. doi:10.3168/jds.2020-19513 Griep, M. (Agosto de 1995). Primase structure and function. 34(4), 171-178. Obtenido de https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8655184/ Hernández Reyes, J., & Bedolla Cedeño, J. (1 de Septiembre de 2008). Importancia del conteo de células somáticas en la calidad. Revista Electrónica de Veterinaria, 1-34. IACG. (2019). NO PODEMOS ESPERAR: ASEGURAR EL FUTURO CONTRA LAS INFECCIONES FARMACORRESISTENTES. Obtenido de https://www.woah.org/app/uploads/2021/03/iacg-final-summary-es.pdf InterPro. (s.f.). Classification of protein families. 49 Izurieta, G. (20 de Octubre de 2017). Perdidas económicas por altos conteos de células somaticas en leche cruda. Engormix. Obtenido de https://www.engormix.com/ganaderialeche/articulos/perdidas-economicas-altos-conteos-t41133.htm Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., & Górski1, A. (31 de Mayo de 2011). The influence of external factors on bacteriophages—review. Folia Microbiologica, 56(3), 191–200. doi:10.1007/s12223-011-0039-8 Latka, A., Maciejewska, B., Majkowska-Skrobek, G., Briers, Y., & Drulis-Kawa, Z. (Abril de 2017). Bacteriophage-encoded virion-associated enzymes to overcome the carbohydrate barriers during the infection process. Appl Microbiol Biotechnol, 101(8), 3103-3119. doi:10.1007/s00253-017-8224-6 Lowe, T., & Eddy, S. (1 de Marzo de 1997). tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res, 25(5), 955-964. doi:10.1093/nar/25.5.955 Lukianova, A., Evseev, P., Shneider, M., Gornostal, E., Mikhaylova, Y., Shelenkov, A., & Miroshnikov, K. (Julio de 2022). Pre-Treatment With Polysaccharide Depolymerase Enhances the Infective Performance of Klebsiella Phage KP1079. Ural-Siberian Conference on Computational Technologies in Cognitive Science, Genomics and Biomedicine (CSGB), 260-263. doi:10.1109/CSGB56354.2022.9865515 M, H., S, P., M, H., M, I., & M, A. (10 de Marzo de 2017). Bovine mastitis and its therapeutic strategy doing antibiotic sensitivity test. Austin Journal of Veterinary Science & Animal Husbandry, 4(1). Martín Richard, M. (9 de Julio de 2007). Mamitis por Klebsiella. Frisona(158), 110-111. Massé, J., Dufour, S., & Archambault, M. (20 de Febrero de 2020). Characterization of Klebsiella isolates obtained from clinical mastitis cases in dairy cattle. American Dairy Science Association, 103(4), 3392-3400. doi:https://doi.org/10.3168/jds.2019-17324 Mato Iglesias, I. (Mayo de 2020). La mamitis evoluciona, las estrategias para combatirla. Vaca Pinta(17). Obtenido de https://vacapinta.com/media/files/fichero/vp017_especialmamitis_estrategiasparaco mbatirmamitis_castelan.pdf Melo, L., Sillankorva, S., Ackermann, H., Kropinski, A., Azeredo, J., & Cerca, N. (Octubre de 2014). Caracterización del fago vB_SepS_SEP9 de Staphylococcus epidermidis, un miembro único de la familia Siphoviridae. Res Microbiol, 165(8), 679-685. doi:10.1016/j.resmic.2014.09.012 Michaud, P., Da Costa, A., Courtois, B., & Courtois, J. (2023). Polysaccharide lyases: recent developments as biotechnological tools. Crit Rev Biotechnol, 23(4), 233-266. doi:10.1080/07388550390447043 Overbeek, R., Olson, R., Pusch, G., Olsen, G., Davis, J., Disz, T., . . . Stevens, R. (Enero de 2014). The SEED and the Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST). Nucleic Acids Res, 42(D1), D206-D214. doi:10.1093/nar/gkt1226 Pan, J., Lian, K., Sarre, A., & Kirsti , H. (21 de Septiembre de 2021). Bacteriophage origin of some minimal ATP-dependent DNA ligases: a new structure from Burkholderia pseudomallei 50 with striking similarity to Chlorella virus ligase. Scientific reports. doi:https://doi.org/10.1038/s41598-021-98155-w Pan, Y., Fang, H., Yang, H., Lin, T., Hsieh, P., Tsai, F., . . . Wang, J. (Julio de 2008). Capsular polysaccharide synthesis regions in Klebsiella pneumoniae serotype K57 and a new capsular serotype. J Clin Microbiol, 46(7), 2231-2240. doi:10.1128/JCM.01716-07 Pelzek, A., Fischetti, V., Schuch, R., & Schmitz, J. (15 de Octubre de 2008). Isolation of Bacteriophages from Environmental Sources, and Creation and Functional Screening of Phage DNA Libraries. doi: https://doi.org/10.1002/9780470089941.et1303s07 Persson Waller, K., Personson, Y., Nyman, A.-K., & Stengärde, L. (30 de Enero de 2014). Udder health in beef cows and its association with calf growth. 56(1). doi:10.1186/1751-014756-9 Rodríguez, A., Martínez, B., & García, P. (2010). Presente y futuro en el control de la mamitis del ganado vacuno. Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC). Rodríguez, P., Sánchez Matamoros, A., Carvajal Valilla, J., Blanco Murcia, J., & Sánchez Vizcaíno, J. (2008). APLICACIÓN DE LA TERMOGRAFÍA EN EL ESTUDIO DE LA UBRE DE LOS GRANDES RUMIANTES Y EN SUS POSIBLES COMPLICACIONES PATOLÓGICAS. RCCV, 2(2), 66-72. Rrwick. (2017). GitHub. Obtenido de Porechop: adapter trimmer for Oxford Nanopore reads: https://github.com/rrwick/Porechop San Julián, D. (2012). Mamitis bovina. Evolución en Navarra de los microorganismos patógenos que la causan (1990 - 2010). Navarra Agraria(192), 41 - 48. shaheen, m., & Showkat , N. (2016). A treatise on bovine mastitis: disease and disease economics, etiological basis, risk factors, impact on human health, therapeutic management, prevention and control strategy. Advances in Dairy Research, 4(1). doi:10.4172/2329-888X.1000150 Sharun, K., Dhama, K., Tiwari, R., Gugjoo, M. B., Yatoo, M., Patel, S. K., . . . Chaicumpa, W. (17 de Febrero de 2021). Advances in therapeutic and managemental approaches of bovine. Veterinary Quarterly, 41(1), 107–136. doi: 10.1080/01652176.2021.1882713 Singh, A., Padmesh, S., Dwivedi, M., & Kostova, I. (17 de Febrero de 2022). How Good are Bacteriophages as an Alternative Therapy to Mitigate Biofilms of Nosocomial Infections. Infect Drug Resist, 15, 503-532. doi:10.2147/IDR.S348700 Van , R. T., & Kropinski, A. M. (2009). Bacteriophage enrichment from water and soil. Methods Mol Biol, 15-21. doi:10.1007/978-1-60327-164-6_2 White, H., Sherman, M., Brasilès, S., Jacquet, E., Seavers, P., Tavares, P., & Orlova, E. (Junio de 2012). Capsid Structure and Its Stability at the Late Stages of Bacteriophage SPP1 Assembly. Journal of Virology, 86(12), 6768–6777. doi:10.1128/JVI.00412-12 Wick, R., Judd, L., Gorrie, C., & Holt, K. (8 de Junio de 2017). Unicycler: Resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads. PLoS Comput Biol, 13(6). doi:10.1371/journal.pcbi.1005595 51 Wick, R., Schultz, M., Zobel, J., & Holt, K. (15 de Octubre de 2015). Bandage: interactive visualization of de novo genome assemblies. Bioinformatics, 31(20), 3350-3352. doi:10.1093/bioinformatics/btv383 Yan, J., Mao, J., & Xie, J. (Junio de 2014). Bacteriophage polysaccharide depolymerases and biomedical applications. BioDrugs, 28(3), 265-274. doi:10.1007/s40259-013-0081-y Zeinhom, M., Abdel Aziz, R., Mohamed, A., & Bernabucci, U. (29 de Agosto de 2016). Impact of seasonal conditions on quality and pathogens content of milk in Friesian cows. 29(8). doi:10.5713/ajas.16.0143 Zhang, L., Xu, D., Huang, Y., Zhu, X., Rui, M., Wan, T., . . . Gong, Y. (13 de Febreiro de 2017). Structural and functional characterization of deep-sea thermophilic bacteriophage GVE2 HNH endonuclease. Scientific reports. doi:10.1038/srep42542 Zhao, W., Shi, Y., Liu, G., Yang, J., Yi, B., Liu, Y., . . . Gao, J. (1 de Marzo de 2021). Bacteriophage has beneficial effects in a murine model of Klebsiella pneumoniae mastitis. Journal of Dairy Science, 104(3), 3474-3484. doi:https://doi.org/10.3168/jds.2020-19094 Zhao, W., Shi, Y., Liu, G., Yang, J., Yi, B., Liu, Y., . . . Gao, J. (Marzo de 2021). Bacteriophage has beneficial effects in a murine model of Klebsiella pneumoniae mastitis. Journal of Dairy Science, 104(3), 3474-3484. doi:https://doi.org/10.3168/jds.2020-19094