Caracterización de antibiorresistencias y formación de biopelícula en cepas de Klebsiella SPP. de origen alimentario y clínico

Raquel Fernández Pedrero Facultade de Veterinaria Grado en Veterinaria Año 2021 Modalidad del Trabajo: Experimental CARACTERIZACIÓN DE ANTIBIORRESISTENCIAS Y FORMACIÓN DE BIOPELÍCULA EN CEPAS DE KLEBSIELLA SPP. DE ORIGEN ALIMENTARIO Y CLÍNICO Trabajo de Fin de Grado Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 2 Licencia Excepto donde se haga constar explícitamente, esta obra pertenece a Raquel Fernández Pedrero y está bajo una licencia de “Creative Commons Reconocimiento 4.0 Internacional”. Financiación El trabajo experimental del presente TFG ha sido financiado a través del proyecto PID2019- 104439RB-C21/AEI/10.13039/501100011033 de la Agencia Estatal de Investigación (AEI), cofinanciado por la European Regional Development Fund of the European Union: a Way to Make Europe (FEDER); ED431C 2017/57 de la Consellería de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria, (Xunta de Galicia) y FEDER. La autora, Raquel Fernández Pedrero agradece al Ministerio de Educación y Formación Profesional su Beca de Colaboración 2020- 2021. Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 3 ÍNDICE RESUMEN .................................................................................................................................... 5 RESUMO ...................................................................................................................................... 6 ABSTRACT .................................................................................................................................. 7 ÍNDICE DE ABREVIATURAS ................................................................................................... 8 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 10 1.1. Problemática de la resistencia a los antibióticos .................................................... 10 1.2. Antibióticos y mecanismos bacterianos de resistencia .......................................... 12 1.2.1. Antibióticos betalactámicos................................................................................. 12 1.2.1.1. Betalactamasas ....................................................................................... 13 1.2.2. Biopelículas bacterianas y su papel en la transferencia de genes de resistencia . 14 1.3. Papel de los alimentos en la transmisión de patógenos y genes de resistencia .... 16 1.4. Importancia de Klebsiella pneumoniae como patógeno oportunista .................... 17 2. OBJETIVOS DEL ESTUDIO ................................................................................................ 19 3. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................. 20 3.1. Procedencia de las colecciones ................................................................................. 20 3.1.1. Colección de cepas de origen alimentario ........................................................... 20 3.1.1.1. Medio ML ............................................................................................... 20 3.1.1.2. Medio ESBL ............................................................................................ 20 3.1.2. Colección de cepas de origen clínico .................................................................. 21 3.2. Identificación ............................................................................................................ 21 3.2.1. Galerías multipruebas API 20E ........................................................................... 21 3.2.2. Espectrometría de masas MALDI-TOF .............................................................. 22 3.3. Caracterización fenotípica de antibiorresistencias ................................................ 23 3.3.1. Antibiograma: método de difusión disco placa ................................................... 23 3.3.1.1. Preparación del inóculo .......................................................................... 23 3.3.1.2. Inoculación de las placas ........................................................................ 23 Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 4 3.3.1.3. Dispensación de los discos ...................................................................... 23 3.3.1.4. Lectura de los resultados ......................................................................... 24 3.4. Caracterización genotípica de antibiorresistencias ................................................ 26 3.4.1. PCR convencional ............................................................................................... 26 3.4.1.1. Extracción del ADN ................................................................................. 27 3.4.1.2. Mezcla de reacción .................................................................................. 27 3.4.1.3. Amplificación ........................................................................................... 27 3.4.1.4. Revelado de los resultados ...................................................................... 28 3.5. Ensayo de formación de biopelícula ........................................................................ 28 3.5.1. Preparación del pre-inóculo ................................................................................. 28 3.5.2. Inoculación de los modelos ................................................................................ 29 3.5.3. Cuantificación de biopelícula .............................................................................. 29 3.6. Determinación del fenotipo HMV ........................................................................... 29 3.6.1. Medio COLS+ ..................................................................................................... 29 3.6.2. String test ............................................................................................................. 30 3.7. Análisis estadístico de los datos ................................................................................ 30 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................ 31 4.1. Caracterización fenotípica y genotípica de antibiorresistencias ........................... 31 4.2. Ensayo de formación de biopelícula ........................................................................ 36 4.2.1. Efecto de la temperatura de cultivo en la formación de biopelícula ................... 37 4.2.2. Efecto del origen de las cepas en la formación de biopelícula ........................... 39 4.3. Determinación del fenotipo HMV ........................................................................... 40 5. CONCLUSIONES ................................................................................................................. 42 6. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 43 Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 5 RESUMEN La resistencia a los antibióticos está considerada una de las mayores amenazas del siglo XXI a nivel mundial, tanto para la medicina humana como veterinaria. Si bien existen múltiples mecanismos de antibiorresistencia, la producción de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y la formación de biopelícula destacan por su especial relevancia en Klebsiella pneumoniae, un patógeno oportunista de creciente interés clínico, y recientemente considerado además como patógeno de transmisión alimentaria. Los objetivos del presente estudio fueron: la caracterización fenotípica y genotípica de antibiorresistencias en cepas de Klebsiella spp. recuperadas de muestras de carne destinadas a consumo humano y muestras de orina de pacientes con infección del tracto urinario (ITU); el análisis comparativo de la capacidad de formación de biopelícula en cepas de Klebsiella spp. en función de la temperatura de cultivo y el origen de las muestras (alimentario o clínico); y la determinación del fenotipo hipermucoviscoso (HMV). Para ello se caracterizó una colección de 54 cepas de Klebsiella spp., 53 de ellas K. pneumoniae, aisladas a partir de carne de pavo (9), pollo (3), cerdo (1) y muestras de orina de pacientes con ITU (41). Casi el 60% de los aislamientos fueron multirresistentes (MDR), siendo más del 50% de los mismos no sensibles frente a amoxicilina + ácido clavulánico, cefuroxima, cefotaxima, ciprofloxacina y ácido nalidíxico, sin diferencias estadísticamente significativas entre el origen de las muestras (P > 0,05). Se determinó que 28 de las cepas eran productoras de BLEE (54% cárnicas vs 51% clínicas), y se identificó el gen blaCTX-M en 20 de ellas (6 cárnicas vs 14 clínicas) incluidas 2 positivas para blaCTX-M y blaOXA-48 de origen humano. Con respecto a la capacidad de formación de biopelícula, se observó un comportamiento altamente variable entre las cepas estudiadas en relación con la temperatura de incubación y el origen de aislamiento de las mismas, no asociado a un perfil de antibiorresistencia determinado. Por otro lado, 7 de las 54 cepas analizadas (13%) presentaron el fenotipo HMV, todas ellas de origen clínico, y 6 de las 7 con perfil MDR. En conclusión, demostramos una elevada prevalencia de cepas MDR y productoras de BLEE, tanto de origen cárnico como clínico. Encontramos también que las cepas de Klebsiella spp. presentan un comportamiento cepa-dependiente con respecto a la capacidad de formación de biopelícula, no asociado a un perfil de antibiorresistencia determinado. Por tanto, los resultados obtenidos acentúan la necesidad de implantar estudios de monitorización de bacterias MDR y potencialmente patógenas, bajo un enfoque One Health, para frenar la diseminación de resistencias antibióticas. Palabras clave: antibiorresistencia, biopelícula, Klebsiella pneumoniae, ITU, BLEE, OXA-48. Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 6 RESUMO A resistencia aos antibióticos considérase unha das maiores ameazas do século XXI a nivel mundial, tanto para a medicina humana como veterinaria. Aínda que existen múltiples mecanismos de antibiorresistencia, a produción de betalactamasas de espectro estendido (BLEE) e a formación de biopelícula destacan pola súa especial relevancia en Klebsiella pneumoniae, un patóxeno oportunista de crecente interese clínico, e recentemente considerado ademais como patóxeno de transmisión alimentaria. Os obxectivos do presente estudo foron: a caracterización fenotípica e xenotípica de antibiorresistencias en cepas de Klebsiella spp. recuperadas de mostras de carne destinadas a consumo humano e mostras de ouriños de pacientes con infección do tracto urinario (ITU); a análise comparativa da capacidade de formación de biopelícula en cepas de Klebsiella spp. en función da temperatura de cultivo e a orixe das mostras (alimentaria ou clínica); e a determinación do fenotipo hipermucoviscoso (HMV). Para iso caracterizouse unha colección de 54 cepas de Klebsiella spp., 53 delas K. pneumoniae, illadas a partir de carne de pavo (9), polo (3), porco (1) e mostras de ouriños de pacientes con ITU (41). Case o 60% dos illamentos foron multirresistentes (MDR), sendo máis do 50% dos mesmos non sensibles fronte a amoxicilina + acedo clavulánico, cefuroxima, cefotaxima, ciprofloxacina e acedo nalidíxico, sen diferenzas estatisticamente significativas entre a orixe das mostras (P > 0,05). Determinouse que 28 das cepas eran produtoras de BLEE (54% cárnicas vs 51% clínicas), e identificouse o xene blaCTX-M en 20 delas (6 cárnicas vs 14 clínicas) incluídas 2 positivas para blaCTX-M e blaOXA-48 de orixe humana. Con respecto á capacidade de formación de biopelícula, observouse un comportamento altamente variable entre as cepas estudadas en relación coa temperatura de incubación e a orixe de illamento das mesmas, non asociado a un perfil de antibiorresistencia determinado. Doutra banda, 7 das 54 cepas analizadas (13%) presentaron o fenotipo HMV, todas elas de orixe clínica, e 6 das 7 con perfil MDR. En conclusión, demostramos unha elevada prevalencia de cepas MDR e produtoras de BLEE, tanto de orixe cárnica como clínica. Atopamos tamén que as cepas de Klebsiella spp. presentan un comportamento cepa-dependente con respecto á capacidade de formación de biopelícula, non asociado a un perfil de antibiorresistencia determinado. Por tanto, os resultados obtidos acentúan a necesidade de implantar estudos de monitoraxe de bacterias MDR e potencialmente patóxenas, baixo un enfoque One Health, para frear a diseminación de resistencias antibióticas. Palabras chave: antibiorresistencia, biopelícula, Klebsiella pneumoniae, ITU, BLEE, OXA-48. Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 7 ABSTRACT Antibiotic resistance is considered one of the greatest threats of the 21st century worldwide, for both human and veterinary medicine. Although there are multiple mechanisms of antibiotic resistance, extended-spectrum beta-lactamases (ESBL) production and biofilm formation stand out for their special relevance in Klebsiella pneumoniae, an opportunistic pathogen of increasing clinical interest, and newly suggested also as a foodborne pathogen. The aims of the present study were: the phenotypic and genotypic characterization of antibiotic resistance in Klebsiella spp. strains recovered from meat samples intended for human consumption and urine samples from patients with urinary tract infection (UTI); the comparative analysis of biofilm-forming capacity in Klebsiella spp. strains according to the incubation temperature and the origin of the samples (meat or clinical origin); and the determination of the hypermucoviscous phenotype (HMV). With this purpose, a collection of 54 Klebsiella spp. isolates was characterized, 53 of them K. pneumoniae, recovered from turkey meat (9), chicken meat (3), pork meat (1) and human UTI (41). Almost 60% of the isolates were multidrug-resistant (MDR), showing more than 50% of them non-susceptibility against amoxicillin + clavulanic acid, cefuroxime, cefotaxime, ciprofloxacin, and nalidixic acid, without statistically significant differences between both origins (P > 0.05). It was determined that 28 isolates were ESBL-producers (54% meat vs 51% human), and the blaCTX-M gene was identified in 20 of them (6 meat vs 14 human), including 2 positive human strains for both blaCTX-M and blaOXA-48. Regarding biofilm-forming capacity, a highly variable behaviour was observed among the strains in relation to the incubation temperature and the origin of their isolation, not associated with a specific antibiotic resistance profile. On the other hand, 7 of the 54 analyzed strains (13%) exhibited the HMV phenotype, all of them human isolates, and 6 of the 7 with a MDR profile. In conclusion, we demonstrated a high prevalence of MDR and BLEE-producing strains, both of meat and clinical origin. We also found that Klebsiella spp. strains present a strain-dependent behaviour according to biofilm-forming capacity, not associated with a particular antibiotic resistance profile. Therefore, the results obtained emphasize that there is an urgent need of implement monitoring studies of MDR and potentially pathogenic bacteria, under the One Health approach, in order to stop the spread of antibiotic resistance. Keywords: antibiotic resistance, biofilm, Klebsiella pneumoniae, UTI, ESBL, OXA-48. Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 8 ESBL Extended-spectrum betalactamase ETM Ertapenem EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FOF Fosfomicina FOX Cefoxitina GEN Gentamicina HMV Hipermucoviscoso HUCA Hospital Universitario Central de Asturias ITU Infección del tracto urinario LB Caldo Luria-Bertani LREC Laboratorio de Referencia de Escherichia coli MALDI-TOF Matrix-assited laser desorption/ionization time-of- flight MDR Multidrug-resistant bacteria MgCl2 Cloruro de magnesio MH Agar Mueller Hinton ML Agar MacConkey Lactosa NaCl Cloruro de sodio NAL Ácido Nalidíxico NIT Nitrofurantoína OIE World Organisation for Animal Health P P-valor PBP Penicillin-binding proteins PCR Polymerase Chain Reaction ÍNDICE DE ABREVIATURAS AAA Amsterdam Active Attachement ADN Ácido desoxirribonucleico AMC Amoxicilina-Ácido clavulánico AMK Amikacina AMP Ampicilina AMR Antimicrobial resistance ATM Aztreonam BLEE Betalactamasa de espectro extendido CAZ Ceftazidima CIP Ciprofloxacina CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute COLS+ Agar Columbia con sangre CST Colistina CTX Cefotaxima CXM Cefuroxima CHL Cloranfenicol D.O. Densidad Óptica dATP Desoxiadenosina trifosfato dCTP Desoxicitidina trifosfato dGTP Desoxiguanosina trifosfato dNTP Desoxinucleósido trifosfato DOX Doxiciclina dTTP Desoxitimidina trifosfato EARS-Net European Antimicrobial Resistance Surveillance Network ECDC European Centre for Disease Prevention and Control EMA European Medicines Agency Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 9 PDR Pandrug-resistant bacteria SD Desviación estándar SXT Clotrimoxazol Tª Temperatura TGC Tigeciclina TOB Tobramicina TSA Agar Triptona de Soja TSB Caldo Tripticaseína de Soja UE Unión Europea USC Universidad de Santiago de Compostela UV Ultravioleta WHO World Health Organization XDR Extensively drug-resistant Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 16 1.3. Papel de los alimentos en la transmisión de patógenos y genes de resistencia Existen numerosas evidencias científicas que respaldan la hipótesis de que los alimentos pueden actuar como reservorio de microorganismos potencialmente patógenos para el ser humano, especialmente los productos avícolas, que parecen actuar como principal fuente de transmisión de patógenos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Las características intrínsecas de los alimentos (actividad de agua, pH y disponibilidad de nutrientes) suponen un caldo de cultivo ideal para el crecimiento de la mayoría de los microorganismos. Esta situación, junto con una incorrecta manipulación de los productos en los diferentes eslabones de la cadena alimentaria (elaboración, transformación, envasado, almacenamiento, transporte y distribución), favorece la presencia de microorganismos patógenos que pueden llegar al hombre a través de la alimentación y desencadenar graves patologías gastrointestinales y/o extraintestinales, suponiendo uno de los mayores riesgos desde la perspectiva de la salud pública (Díaz-Jiménez et al., 2020a; Herrera, 2015). Asimismo, se ha demostrado que los alimentos, principalmente de origen animal, también pueden actuar como portadores de cepas bacterianas multirresistentes, lo que hace que su consumo sea en la actualidad una de las rutas de transmisión de mayor alcance y complejidad (Marshall & Levy, 2011). El uso inapropiado e indiscriminado de antibióticos en los sistemas intensivos de producción animal, con fines terapéuticos, profilácticos e incluso como promotores del crecimiento hasta el año 2006 (Regulation (EC) No. 1831/2003) ha ejercido una presión selectiva sobre las poblaciones bacterianas del ganado, favoreciendo el predominio y persistencia de microorganismos multirresistentes capaces de alcanzar y colonizar el tracto gastrointestinal del ser humano a través de la cadena alimentaria. Las cepas multirresistentes que residen en el intestino de estos animales pueden contaminar directamente los productos cárnicos y sus derivados durante el sacrificio/procesado o pueden ser liberadas al medio ambiente, contaminado indirectamente otros alimentos a través de mecanismos intermediarios como el suelo o el agua (Imagen 2). En estos ambientes, las bacterias multirresistentes tienen la oportunidad de entrar en contacto con otros microorganismos comensales o patógenos y transmitirles sus mecanismos de resistencia, favoreciendo así su diseminación (Díaz-Jiménez et al., 2020a; García, 2019; Lazarus et al., 2015). Ante este escenario alarmante, la reducción de la presión antibiótica en los animales productores de alimentos, así como la vigilancia de la contaminación y evolución bacteriana, se establece como una prioridad de salud pública que debe abordarse desde un enfoque multi e interdisciplinario en el marco de la estrategia One Health y englobar toda la cadena de producción y abastecimiento de alimentos (de la granja a la mesa) (Díaz-Jiménez et al., 2020a; Herrera, 2015). Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 17 Imagen 2. Ejemplo de cómo se puede producir la transmisión de cepas bacterianas multirresistentes a través de la cadena alimentaria y llegar al ser humano. Fuente: CDC (2019). 1.4. Importancia de Klebsiella pneumoniae como patógeno oportunista K. pneumoniae es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, de elevada ubicuidad, que puede identificarse en el medio ambiente, como comensal en las vías respiratorias superiores y el tracto gastrointestinal de los seres vivos y también como patógeno oportunista. La reciente emergencia de cepas multirresistentes productoras de diferentes betalactamasas (especialmente BLEE), junto con su capacidad de actuar como patógeno oportunista, ha provocado un incremento de la relevancia clínica de esta bacteria, ya que las alternativas terapéuticas frente a los procesos que provoca cada vez se ven más limitadas y la tasa de mortalidad y morbilidad en pacientes infectados es más elevada (De Oliveira et al., 2020; Paczosa & Mecsas, 2016). Si bien es cierto que las infecciones causadas por este microorganismo, entre las que destacan infecciones del tracto respiratorio, infecciones del tracto urinario (ITU) y septicemias, son principalmente de origen nosocomial y comunitario y afectan a individuos inmunocomprometidos, se ha demostrado científicamente que los animales de producción (especialmente las aves) también pueden jugar un papel muy importante como fuente de transmisión de cepas potencialmente patógenas y/o multirresistentes, lo que ha provocado que K. pneumoniae haya sido considerada recientemente como un patógeno de transmisión alimentaria (Díaz-Jiménez et al., 2020a; Riley, 2020). Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 18 El mecanismo de resistencia a antibióticos que posee un mayor impacto en K. pneumoniae es la producción de BLEE. Esta resistencia tiene un componente tanto intrínseco (presencia de genes cromosómicos que codifican betalactamasas de tipo SHV-1 o relacionadas y confieren resistencia frente a aminopenicilinas y carboxipenicilinas y sensibilidad disminuida a ureidopenicilinas) como adquirido, mediante la transferencia horizontal de genes localizados en elementos genéticos transferibles, especialmente plásmidos. Es frecuente que estos elementos genéticos móviles presenten secuencias que codifican para mecanismos de resistencia frente a otras categorías antibióticas, así como frente a metales pesados (Martin & Bachman, 2018; Navarro et al., 2011). Aunque no se ha comprobado científicamente, en la actualidad se baraja la hipótesis de que el uso de carbapenemes para tratar las infecciones causadas por cepas resistentes productoras de BLEE ha ejercido una gran presión selectiva sobre las poblaciones y ha impulsado el desarrollo de la resistencia a estos antibióticos betalactámicos mediante la adquisición de genes plasmídicos codificadores de carbapenemasas, lo que ha provocado que K. pneumoniae sea considerada la especie resistente a carbapenemes más común de la familia Enterobacteriaceae (Martin & Bachman, 2018). Esta alarmante situación, ha llevado a la WHO a clasificar a K. pneumoniae como un patógeno de prioridad crítica y declarar la urgente necesidad de promover la investigación de nuevas alternativas antimicrobianas (WHO, 2017). Por otro lado, esta enterobacteria también se caracteriza por presentar una gruesa cápsula de polisacáridos adherida a la membrana externa que le confiere a sus colonias una apariencia mucoide y que, junto con otros factores de adherencia propios de la especie, favorece la supervivencia de este microorganismo en condiciones adversas (incluida la exposición a moléculas con efecto antibiótico) mediante la formación de biopelículas, uno de sus principales factores de virulencia (Chen et al., 2020). Asimismo, en la literatura científica se describe la existencia de un fenotipo hipermucoviscoso (HMV), caracterizado por una producción incrementada de polisacáridos capsulares, que está relacionado con nuevas variantes hipervirulentas de K. pneumoniae capaces de causar infecciones invasivas en pacientes sanos e inmunocompetentes. A pesar de que la mayoría de infecciones causadas por estas cepas hipervirulentas se han reportado en países del sudeste asiático, su emergencia en las regiones occidentales resulta de particular preocupación y requiere promover su investigación y vigilancia (Decré et al., 2011; Shon et al., 2013). Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 19 2. OBJETIVOS DEL ESTUDIO El objetivo general del presente estudio fue la comparación, bajo un enfoque One Health, de cepas de Klebsiella spp. recuperadas de muestras de carne destinadas a consumo humano y muestras de orina de pacientes intra y extrahopitalarios del Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA). De forma detallada, los objetivos específicos fueron: - OBJETIVO 1: Caracterización fenotípica y genotípica de antibiorresistencias en las cepas de Klebsiella spp. de la colección del estudio, y análisis comparativo de los perfiles de resistencia obtenidos en función del origen de aislamiento de las mismas (alimentario o clínico). - OBJETIVO 2: Análisis comparativo de la capacidad de formación de biopelícula en cepas de Klebsiella spp. en función de la temperatura de cultivo y el origen de las muestras (alimentario o clínico). - OBJETIVO 3: Determinación del fenotipo HMV. Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 20 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Procedencia de las colecciones 3.1.1. Colección de cepas de origen alimentario Las 12 cepas de K. pneumoniae de origen alimentario estudiadas, junto con una cepa resuelta como Raoultella spp./Klebsiella spp. en la identificación por espectrometría de masas MALDI-TOF, fueron recuperadas por el Grupo LREC (Departamento de Microbioloxía e Parasitoloxía de la USC, Campus Terra) a partir de 8 muestras de carne de pavo, 2 de pollo y 1 de cerdo a lo largo del 2020 en el concejo de Oviedo (Asturias). Para su aislamiento microbiológico se siguieron los protocolos III y V descritos previamente, utilizando los medios selectivos y diferenciales MacConkey Lactosa (ML, Oxoid™) y CHROMID® ESBL (ESBL) de bioMérieux respectivamente (Díaz-Jiménez et al., 2020a). 3.1.1.1. Medio ML Se trata de un medio de cultivo sólido que permite llevar a cabo la selección y diferenciación de enterobacterias y otros bacilos Gram negativos. Las sales biliares y el cristal violeta hacen que sea un medio selectivo al inhibir el desarrollo de bacterias Gram positivas y, su contenido en lactosa, lo convierte en un medio diferencial al permitir discriminar aquellos microorganismos fermentadores de los que no lo son, gracias a la presencia de un indicador de pH (rojo neutro). Cuando se produce la fermentación de este azúcar se liberan al medio catabolitos ácidos que provocan una disminución del pH, lo que hace que las colonias fermentadoras adopten una coloración rojiza o rosácea. Los microorganismos no fermentadores de lactosa metabolizan peptona en su lugar, liberando al medio amoníaco e incrementando su pH, lo cual hace que las colonias se mantengan incoloras o se tornen blanquecinas. Al tratarse de una enterobacteria fermentadora de lactosa, las colonias de K. pneumoniae crecidas en este medio (37 ºC, 18-24 horas) adquieren una tonalidad rosácea con un aspecto brillante, mucoide, convexo y redondeado, asociado a la presencia de un halo de precipitación biliar. Aquellas colonias crecidas en este medio durante el procesamiento de las muestras con una morfología compatible con la anteriormente descrita se sembraron por picadura en tubos Vacutainer™ con agar nutritivo con un 0,75% (p/v) de agar y se mantuvieron a temperatura ambiente para su posterior identificación y caracterización. 3.1.1.2. Medio ESBL Se trata de un medio cromogénico, selectivo y diferencial diseñado para la detección de microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae productores de BLEE. Este agar contiene una mezcla de antibióticos, entre los que resalta la cefpodoxima (actúa como indicador de elección para este mecanismo de resistencia), que permite el crecimiento selectivo de Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 21 enterobacterias productoras de BLEE y sustancias cromogénicas, que facilitan su identificación presuntiva en función de la coloración específica adquirida. Las colonias de Klebsiella, Enterobacter, Serratia y Citrobacter spp. son productoras de betaglucosidasa, enzima que degrada los cromógenos presentes en el medio y genera una coloración verde/azulada perfectamente distinguible de la tonalidad que adquieren las colonias de otros microorganismos como Escherichia coli (coloración rosácea/burdeos debido a la producción de betaglucuronidasa) o Proteus, Providencia y Moraganella spp. (tonalidad marronácea a causa de la producción de triptófano desaminasa). En base a su aspecto cromogénico tras la incubación en este medio (37 ºC, 18-24 horas), se seleccionaron todas aquellas colonias productoras de BLEE compatibles con el género Klebsiella spp. según las indicaciones del fabricante, se sembraron por picadura en tubos Vacutainer™ con agar nutritivo con un 0,75% (p/v) de agar y se mantuvieron a temperatura ambiente para su posterior identificación y caracterización. 3.1.2. Colección de cepas de origen clínico En el presente estudio se incluyó, además, una colección de 41 cepas de K. pneumoniae recuperadas a partir de muestras de orina de pacientes intra y extrahospitalarios con ITU en el HUCA durante el primer semestre del año 2020. 3.2. Identificación La identificación de las colonias aisladas en los medios de cultivo ML y ESBL se llevó a cabo mediante métodos fenotípicos y proteómicos, utilizando para ello galerías multipruebas API® 20E de bioMérieux y espectrometría de masas MALDI-TOF, respectivamente. La identificación bacteriana fenotípica se basa en evaluar las características fenotípicas u “observables” de los microorganismos como la morfología de sus colonias, desarrollo y propiedades bioquímicas y metabólicas (Bou et al., 2011). Por otro lado, las técnicas proteómicas abordan el estudio y caracterización del conjunto de proteínas expresadas por un genoma (proteoma), pudiendo revelar un perfil proteico útil para llevar a cabo la identificación bacteriana de una forma precisa y fiable (Siller-Ruiz et al., 2017). 3.2.1. Galerías multipruebas API 20E La batería de pruebas API® 20E constituye un sistema de identificación rápida para bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram negativas, que consta de 20 test bioquímicos estandarizados y miniaturizados y una base de datos. Cada galería está formada por 20 pocillos de plástico, cada uno de los cuales porta un medio de identificación liofilizado junto con un indicador de pH. Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 22 El procedimiento consiste en inocular cada celdilla con una suspensión en agua MiliQ estéril del microorganismo a identificar a partir de una cepa aislada e incubada previamente en un medio de cultivo general, TSA, durante 18-24 horas a 37 ºC, consiguiendo así la rehidratación del medio. Posteriormente, las galerías se incuban a 37 °C durante 18-24 horas para proceder a su lectura. La interpretación de las reacciones se hace mediante comparación con una tabla de lectura proporcionada por la casa comercial donde se indica si el resultado debe considerarse positivo o negativo para cada reacción según la coloración adquirida (cambios de coloración espontáneos o revelados por la adicción de reactivos). 3.2.2. Espectrometría de masas MALDI-TOF La técnica MALDI-TOF MS (Matrix-assited laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) es un método preciso, rápido y fiable que permite llevar a cabo la identificación de microorganismos mediante el análisis de proteínas, principalmente ribosomales (Zárate et al., 2014) . Este sistema emplea el método de la “huella peptídica” que consiste en la obtención de un espectro de masas, específico para cada microorganismo, a partir de los péptidos resultantes de la hidrólisis proteica (March & Bratos, 2016). Para determinar el perfil proteico de una muestra microbiana, esta se deposita en una placa metálica conductora y se mezcla con una matriz orgánica para posteriormente ser introducida en el espectrómetro de masas e irradiada por pulsos cortos de láser ultravioleta (UV), lo que provoca la ionización de las proteínas. Los iones resultantes de este proceso son sometidos a la acción de un campo electromagnético para su aceleración y, a continuación, se trasladan a un tubo con vacío donde se separan según su tiempo de vuelo (diferente para cada partícula en función de su relación masa/carga) hasta llegar al detector final del tubo de vuelo. De esta manera, en función del tiempo de vuelo, se registra un espectro de masas característico que de forma automática se compara con los perfiles de microorganismos conocidos almacenados en la base de datos, hasta lograr su identificación. El software informático que compara los espectros genera un valor numérico (valor de puntuación) basado en las similitudes entre los datos obtenidos y almacenados, considerándose válidos aquellos resultados comprendidos entre 1,7 y 2, para la identificación a nivel de género, y superiores a 2 para la identificación a nivel de especie (Croxatto et al., 2012; Wieser et al., 2012). La identificación bacteriana de las cepas aisladas en este estudio se realizó por duplicado utilizando el equipo MALDI Biotyper® de Bruker Daltonik (Bremen, Alemania), considerándose válidos a nivel de especie solamente aquellos resultados con un valor superior a 2. Todas las cepas de este estudio fueron identificadas como K. pneumoniae excepto la cepa referida como 61-KLEB, que se resolvió como Raoultella spp./Klebsiella spp. Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 23 3.3. Caracterización fenotípica de antibiorresistencias 3.3.1. Antibiograma: método de difusión disco placa La técnica del antibiograma es una herramienta fenotípica que permite determinar in vitro la actividad de un antibiótico, evaluar la sensibilidad de un microorganismo frente a él y, en algunos casos, deducir posibles mecanismos de resistencia (Cercenado & Saavedra-Lozano, 2009). En este estudio se determinó la sensibilidad antimicrobiana de las todas las cepas aisladas (colección de origen alimentario y humano) mediante el de método de difusión discoplaca, una práctica cualitativa y de gran reproducibilidad que consiste en enfrentar un inóculo estandarizado de la cepa bacteriana problema a una serie de discos de papel secante impregnados con una concentración determinada de los antibióticos que se quieren testar, en una placa de Petri con medio Mueller Hinton (MH, Oxoid™). El protocolo utilizado para la realización de este ensayo se detalla a continuación (García, 2019): 3.3.1.1. Preparación del inóculo Con el objetivo de disponer de cultivos frescos a la hora de realizar el antibiograma, las cepas a estudiar se sembraron previamente en una placa de Petri con medio TSA (37 ºC, 18-24 horas). A continuación, se recogió con un asa de siembra un crecimiento equivalente a 3-5 colonias, se suspendió en 5 ml de caldo TSB y, utilizando el fotómetro analizador M-3000 J.P. SELECTA® con una longitud de onda de 620 nm, se ajustó a una turbidez equivalente a 0,5 de la escala de McFarland para su estandarización, consiguiendo una concentración de 1,5x108 bacterias/ml. 3.3.1.2. Inoculación de las placas Se introdujo un hisopo estéril dentro de la suspensión de TSB y, tras rotarlo varias veces contra la pared del tubo para eliminar el exceso de inóculo, se llevó a cabo la siembra superficial en césped de tres placas con el medio MH, cubriendo la totalidad de la superficie de manera homogénea. Posteriormente, se dejó que el medio absorbiera el inóculo durante 5 minutos a temperatura ambiente colocando la placa cerrada y boca arriba. 3.3.1.3. Dispensación de los discos Utilizando los dispensadores automáticos Sensi-Disc™ Dispenser II (BBL™) se colocaron los discos antibióticos (Oxoid™) en las tres placas de MH previamente sembradas, asegurándose de que contactaran por completo con la superficie del agar presionando ligeramente con una pinza esterilizada. A continuación, se dejó que los antibióticos difundieran a través del medio durante un periodo máximo de 15 minutos (placas cerradas, boca arriba y a temperatura ambiente) para posteriormente incubarlas invertidas durante 16-18 horas a 37 ºC. Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 24 3.3.1.4. Lectura de los resultados Para llevar a cabo la lectura e interpretación de los resultados tras la incubación de las placas se midió el diámetro (mm) del halo de inhibición formado alrededor de cada uno de los discos presentes (Imagen 3). Posteriormente, se compararon los resultados obtenidos con los puntos de corte establecidos por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2020) y se clasificaron los microorganismos como resistentes (R), intermedios (I) o sensibles (S) frente a cada uno de los antibióticos analizados (ver Tabla 2). Las familias, categorías y antibióticos empleados en el presente estudio para la determinación de la sensibilidad antimicrobiana, en base a su interés clínico y epidemiológico, fueron los siguientes: • Betalactámicos → penicilinas (ampicilina), penicilinas + inhibidores de betalactamasas (amoxicilina-ácido clavulánico), cefalosporinas de 2ª (cefuroxima) y 3ª generación (cefotaxima y ceftazidima), monobactámicos (aztreonam), carbapenemes (ertapenem) y cefamicinas (cefoxitina). • Fosfomicinas → fosfomicina. • Aminoglucósidos → gentamicina, tobramicina y amikacina. • Tetraciclinas → doxiciclina. Disco impregnado de antibiótico Crecimiento de la cepa problema Halo de sinergia Halo de inhibición AMC 30 ATM 30 CAZ 30 AM 10 CXM 30 TGC 15 Imagen 3: Representación gráfica de un antibiograma siguiendo el método difusión disco-placa en medio MH con cultivo microbiano y halos de inhibición. Cada disco indica el antibiótico del que está impregnado y la cantidad del mismo en µg: AMC, amoxicilina-ácido clavulánico; CAZ, ceftazidima; AM, ampicilina; CXM, cefuroxima; TGC, tigeciclina; ATM, aztreonam. Los halos de sinergia que se observan entorno al disco AMC (en relación con los discos ATM y CAZ), asociados a la producción de BLEE, se explicarán detalladamente en la próxima sección de este trabajo (ver apartado 4.1.). Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 25 • Anfenicoles → cloranfenicol. • Nitrofuranos → nitrofurantoína. • Polimixinas → colistina. • Quinolonas → 1ª generación (ácido nalidíxico) y fluoroquinolonas (ciprofloxacina). • Diaminopirimidinas + Sulfonamidas → trimetropin + sulfametoxazol (clotrimoxazol). • Glicilciclinas → tigeciclina. Tabla 2: Antibióticos empleados en el presente estudio e interpretación de sus halos de inhibición según los puntos de corte establecidos por el CLSI-2020 Antimicrobiano CLSI-2020 (mm) disco R I S Aztreonam ATM30 <=17 18-20 >=21 Amoxicilina-Ácido Clavulánico AMC30 <=13 14-17 >=18 Ceftazidima CAZ30 <=17 18-20 >=21 Ampicilina AM10 <=13 14-16 >=17 Cefuroxima-parenteral y oral CXM30 <=14 15-17 >=18 Tigeciclina TGC15* Cefotaxima CTX30 <=22 23-25 >=26 Ertapenem ETP10 <=18 19-21 >=22 Cefoxitina FOX30 <=14 15-17 >=18 Amikacina AN30 <=14 15-16 >=17 Gentamicina GM10 <=12 13-14 >=15 Tobramicina NN10 <=12 13-14 >=15 Colistina CL10 <=10 >=11 Doxiciclina D30 <=10 11-13 >=14 Fosfomicina IV y oral FOS30 <=12 13-15 >=16 Cloranfenicol C30 <=12 13-17 >=18 Nitrofurantoína FD300 <=14 15-16 >=17 Ciprofloxacina CIP5 <=21 22-25 >=26 Clotrimoxazol SXT25 <=10 11-15 >=16 Ácido Nalidíxico NAL30 <=13 14-18 >=19 *El CLSI no recoge los criterios para la interpretación de los halos de inhibición para la tigeciclina, por ello se utilizaron los puntos de corte establecidos por el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST, 2020): R (<18); S (>=18). Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 32 no se corresponda con la esperada en función del genotipo, ya que las características que puede manifestar un individuo están influenciadas por la interacción entre los componentes genéticos del mismo y las condiciones ambientales en las que se encuentra como la temperatura, osmolaridad, pH, niveles de oxígeno, disponibilidad de hierro y nutrientes, concentración de iones y estrés, entre otras (Pierce, 2016). Además, la variabilidad genética de Klebsiella spp. en relación con el número de diferentes genes de resistencia codificadores de betalactamasas, hace que la producción distinta (sobreproducida, o no) de las enzimas pueda provocar un patrón fenotípico más complejo de interpretar (Navarro et al., 2010). Por otro lado, también se debe considerar que la discordancia entre el perfil genotípico y la expresión fenotípica de un microorganismo puede ser el resultado de ciertos eventos genéticos (como mutaciones o polimorfismos) que interfieren en la detección de secuencias implicadas en la manifestación de un determinado fenotipo. Un ejemplo de ello se observó en el caso de la cepa 106-KLEB, ya que a pesar de no confirmarse mediante PCR la presencia del gen blaSHV, expresó fenotípicamente el perfil de resistencia intrínseca propio de K. pneumoniae, es decir, no mostró sensibilidad frente al grupo de las penicilinas (Martin & Bachman, 2018). Tabla 5: Caracterización genotípica y fenotípica de las cepas de Klebsiella spp. Código Origen Perfil genotípico de antibiorresistencias Perfil fenotípico de antibiorresistencias1 BLEE2 MDR3 49-KLEB Carne de pollo blaCTX-M, blaSHV AMP, AMC*, CXM, CAZ, CTX, ATM, ETM*, CST, SXT, CIP* + + 50-KLEB Carne de pollo blaCTX-M, blaSHV AMP, AMC*, CXM, CAZ, CTX, ATM, SXT, CIP* + + 51-KLEB Carne de pavo blaCTX-M, blaSHV AMP, AMC, CXM, CAZ*, CTX, ATM*, TOB, DOX*, CIP, NAL + + 52-KLEB Carne de pavo blaCTX-M, blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CAZ*, CTX, ATM*, GEN, DOX*, SXT, CIP, NAL* + + 53-KLEB Carne de cerdo blaSHV AMP - - 54-KLEB Carne de pollo blaSHV AMP - - 55-KLEB Carne de pavo blaSHV, blaTEM AMP, AMC, DOX, CIP, NAL, TGC - + 56-KLEB Carne de pavo blaCTX-M, blaSHV AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, TOB, CIP, NAL + + 57-KLEB Carne de pavo blaSHV AMP, AMC*, CTX*, DOX, CHL, SXT, CIP NAL* - + 58-KLEB Carne de pavo blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CTX, GEN, TOB*, DOX, SXT, CIP, NAL* + + 59-KLEB Carne de pavo blaSHV AMP - - 61-KLEB Carne de pavo blaCTX-M AMP, NAL - - 62-KLEB Carne de pavo blaCTX-M, blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, TOB*, DOX*, SXT, CIP, NAL* + + 63-KLEB Hospitalario blaSHV AMP - - 64-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, FOX*, ATM, GEN, DOX, CHL, NIT, SXT, CIP, NAL, TGC + + Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 33 65-KLEB Hospitalario blaSHV AMP - - 66a-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, TOB, NIT*, CIP, NAL + + 67-KLEB Hospitalario blaSHV AMP - - 68-KLEB Hospitalario blaSHV AMP - - 69-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV, blaTEM, blaOXA-48 AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, ETM, GEN, TOB, SXT, CIP, NAL + + 70-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, GEN, DOX, CHL, NIT, SXT, CIP, NAL + + 71-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV, blaTEM, blaOXA-48 AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, ETM, GEN, TOB, DOX*, SXT, CIP, NAL + + 72-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, FOX, ATM, GEN, TOB, DOX, CHL*, NIT*, SXT, CIP. NAL, TGC + + 73-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, AMC*, CXM*, FOX, DOX, CIP, NAL, TGC - + 74-KLEB Hospitalario blaSHV AMP - - 75-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV, blaTEM AMP, AMC*, CXM, CAZ, CTX, ATM, DOX*, SXT, CIP, NAL + + 76-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, AMC*, CXM, CAZ, CTX, FOX, ATM, GEN*, DOX, CHL, NIT, SXT, CIP, NAL, TGC + + 77-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CIP* - - 78-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV AMP, CXM, CAZ, CTX, FOX, ATM, FOF, DOX, CHL*, NIT*, CIP, NAL, TGC + + 80-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, GEN, TOB, AMK*, FOF, CST, CIP, NAL + + 81-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, GEN, DOX, CHL, NIT, SXT, CIP, NAL + + 82-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, FOX, ATM, GEN*, DOX, CHL, NIT, SXT, CIP, NAL, TGC + + 83-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CAZ*, CTX, ATM*, GEN, TOB, FOF, DOX*, SXT, CIP, NAL* + + 84-KLEB Hospitalario blaSHV AMP - - 85-KLEB Hospitalario blaSHV AMP - - 86-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, NIT - - 87-KLEB Hospitalario blaSHV AMP - - 88-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, DOX*, SXT + + 89-KLEB Atención primaria blaSHV AMP - - 90-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, GEN, DOX, CHL, NIT, SXT, CIP, NAL + + 91-KLEB Hospitalario blaSHV AMP - - 92-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, GEN, DOX, CHL, NIT, SXT, CIP, NAL + + 93-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, AMC*, CIP* - - 95-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV, blaTEM AMP, AMC*, CXM, CAZ, CTX, ATM, GEN, TOB, DOX, SXT, CIP + + 96-KLEB Hospitalario blaSHV AMP - - 97-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, AMC - - Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 34 98-KLEB Hospitalario blaSHV, blaTEM AMP, AMC - - 99-KLEB Hospitalario blaSHV AMP - - 100-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV AMP, AMC, CXM, CAZ*, CTX, ATM, TOB, NIT*, SXT*, CIP, NAL + + 101-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, NIT*, SXT, CIP, NAL* + + 102-KLEB Atención primaria blaSHV AMP, FOF*, NIT - - 104-KLEB Hospitalario blaCTX-M, blaSHV, blaTEM AMP, AMC, CXM, CTX, GEN, DOX*, CHL, SXT, CIP, NAL + + 105-KLEB Hospitalario blaSHV AMP, CXM*, FOX*, FOF, DOX, CHL*, NAL*, TGC - + 106-KLEB Hospitalario blaCTX-M AMP, AMC, CXM, CAZ, CTX, ATM, TOB, SXT, CIP, NAL + + 1Perfil fenotípico de antibiorresistencias conforme a los criterios establecidos por el CLSI (2020): AMP, ampicilina; AMC, amoxicilina-ácido clavulánico; CXM, cefuroxima; CAZ, ceftazidima; CTX, cefotaxima; FOX, cefoxitina; ATM, aztreonam; ETM, ertapenem; GEN, gentamicina; TOB, tobramicina; AMK, amikacina; FOF, fosfomicina; CST, colistina; DOX, doxiciclina; CHL, cloranfenicol; NIT, nitrofurantoína; SXT, clotrimoxazol; CIP, ciprofloxacina; NAL, ácido nalidíxico y TGC, tigeciclina. 2Perfil fenotípico BLEE. 3MDR, multirresistente (no sensible a ≥ 1 antimicrobiano en ≥ 3 categorías) de acuerdo con el criterio de Magiorakos et al. (2012). *Valor intermedio de resistencia. Casi el 60% de las 54 cepas de Klebsiella spp. estudiadas fueron MDR, es decir, no presentaron sensibilidad frente a al menos un agente en tres o más categorías de antimicrobianos, de acuerdo con el criterio propuesto por Magiorakos et al. (2012), siendo 9 de ellas de origen alimentario (69,2%) y 23 de origen clínico (56,1%), sin diferencias estadísticamente significativas entre las cepas de origen alimentario y clínico (P > 0,05) (Tabla 6). En el caso de las penicilinas, Klebsiella spp. muestra resistencia natural frente a ellas, debido a la presencia de genes cromosómicos que codifican betalactamasas de tipo SHV-1 o relacionadas, con actividad penicilinasa, lo que hace que todas las cepas sean no sensibles; por este motivo no se tuvo en cuenta esta categoría de cara a la clasificación como MDR (Magiorakos et al., 2012; Martin & Bachman, 2018; Navarro et al., 2011). Genotípicamente se corroboró la presencia del gen blaSHV en 52 de las 54 cepas de Klebsiella spp. estudiadas, 12 de origen alimentario y 40 de origen clínico. En relación con el resto de los antimicrobianos analizados, más del 50% de las cepas fueron no sensibles frente a amoxicilina + ácido clavulánico, cefuroxima, cefotaxima, ciprofloxacina y ácido nalidíxico, observándose también una elevada prevalencia de la resistencia frente a ceftazidima, aztreonam, doxiciclina y clotrimoxazol. Globalmente, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las cepas de los dos orígenes en cuanto a la resistencia a los diferentes antibióticos, excepto frente a la nitrofurantoína (Tabla 6). Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 35 Tabla 6: Prevalencia de la resistencia a antimicrobianos y cepas MDR de Klebsiella spp. Categoría1 Antimicrobiano1 Cepas alimentarias n=13 Cepas humanas n=41 Cepas totales n=54 Cepas alimentarias vs Cepas humanas2 Nº % Nº % Nº % Penicilinas Ampicilina 13 100 41 100 54 100 n.s. Penicilinas + Inhibidores de betalactamasas Amoxicilina + Ácido clavulánico 9 69,2 25 60,9 34 62,9 n.s. Cefalosporinas 2ª generación Cefuroxima 6 46,1 23 56,1 29 53,7 n.s. Cefalosporinas 3ª generación Ceftazidima 6 46,1 20 48,7 26 48,1 n.s. Cefotaxima 8 61,5 21 51,2 29 53,7 n.s. Cefamicinas Cefoxitina 0 0 7 17 7 12,9 n.s. Monobactámicos Aztreonam 6 46,1 20 48,7 26 48,1 n.s. Carbapenemes Ertapenem 1 7,6 2 4,8 3 5,5 n.s. Aminoglucósidos Gentamicina 2 15,3 14 34,1 16 29,6 n.s. Tobramicina 4 30,7 9 21,9 13 24 n.s. Amikacina 0 0 1 2,4 1 1,8 n.s. Derivados del ácido fosfónico Fosfomicina 0 0 5 12,2 5 9,2 n.s. Polimixinas Colistina 1 7,6 1 2,4 2 3,7 n.s. Tetraciclinas Doxiciclina 6 46,1 17 41,4 23 42,5 n.s. Anfenicoles Cloranfenicol 1 7,6 11 26,8 12 22,2 n.s. Nitrofuranos Nitrofurantoína 0 0 14 34,1 14 25,9 0,024 Inhibidores de la síntesis y reducción del folato Clotrimoxazol 6 46,1 18 43,9 24 44,4 n.s. Fluoroquinolonas Ciprofloxacina 9 69,2 23 56,1 32 59,2 n.s. Quinolonas Ácido nalidíxico 8 61,5 21 51,2 29 53,7 n.s. Glicilciclinas Tigeciclina 1 7,6 7 17 8 14,8 n.s. MDR1 9 69,2 23 56,1 32 59,2 n.s. 1Atendiendo a la categorización propuesta por Magiorakos et al. (2012) para definir a las cepas como MDR (no sensibles a ≥ 1 antimicrobiano en ≥ 3 categorías), XDR (no sensibles a ≥ 1 antimicrobiano en todas las categorías exceptuando ≤ 2) o PDR (no sensibles a ningún antimicrobiano de ninguna categoría). 2Determinación del grado de asociación estadística entre las variables mediante la aplicación del test exacto de Fisher de dos colas. Se consideran significativos valores menores a 0,05 (P < 0.05). n.s.: indica la ausencia de diferencias estadísticamente significativas. Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 36 Los resultados obtenidos en el presente trabajo corroboran los datos arrojados por un estudio previo de características similares, llevado a cabo en 2017 por este grupo de investigación, con relación a la elevada presencia de cepas de K. pneumoniae MDR y productoras de BLEE en carne de ave, aunque la prevalencia observada en el actual estudio fue menor (27% de las muestras analizadas en 2017 vs 14% en el estudio 2020). Asimismo, en ambos estudios se apreciaron altas tasas de resistencia frente a cefotaxima, ciprofloxacina, clotrimoxazol, ácido nalidíxico y doxiciclina (Díaz-Jiménez et al., 2020a). Sin embargo, se observaron diferencias de prevalencia relacionadas con el origen de las muestras: mientras que en el estudio del 2017 la prevalencia de K. pneumoniae productora de BLEE fue significativamente más elevada en carne de pavo vs pollo (50% y 4%, respectivamente), en el presente estudio no se observó dicha diferencia (16% y 12%, respectivamente). Por otro lado, la ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre los aislados de origen cárnico y clínico determinada en este trabajo, junto con el hecho de que el muestreo fue realizado en la misma región geográfica y franja temporal, hacen necesario ahondar en el análisis comparativo de las cepas para determinar si existe una relación genómica entre ellas que apoye las recientes evidencias científicas que respaldan la hipótesis de que los alimentos, especialmente los productos avícolas, pueden jugar un importante papel como vehículo transmisor de cepas potencialmente patógenas y/o multirresistentes de K. pneumoniae (Riley, 2020). 4.2. Ensayo de formación de biopelícula Con el objetivo de determinar si existen diferencias en la formación de biopelícula relacionadas con la temperatura de incubación y el origen de las cepas estudiadas, se llevó a cabo la cuantificación de la formación de biopelícula, cultivada en medio LB durante 48 horas, en estático y condiciones aeróbicas, utilizando el método de tinción con cristal violeta. Se observó una gran variabilidad en la capacidad de formación de biopelícula en una selección de 13 cepas de origen alimentario y 13 cepas de origen clínico de Klebsiella spp. (Figura 1), sin existir correlación con el perfil de antibiorresistencias previamente descrito. Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 37 Figura 1. Efecto de la temperatura de incubación y el origen de las cepas de Klebsiella spp. en la formación de biopelícula. Se representan las medias de las absorbancias (D.O. 590 nm, n=3) y su desviación estándar (SD). El asterisco señala diferencias estadísticamente significativas entre las dos temperaturas de incubación (análisis paramétrico tipo t de Student, P < 0,05). 4.2.1. Efecto de la temperatura de cultivo en la formación de biopelícula Basándose en estudios previos en los cuales se habían optimizado las condiciones de ensayo utilizando la cepa tipo K. pneumoniae subsp. pneumoniae CECT143T (medio de cultivo, LB; tiempo de incubación, 48 horas; disponibilidad de oxígeno, condiciones aeróbicas e incubación estática) (Gestoso, 2020), en el presente experimento se quiso comprobar el efecto de la temperatura de incubación en la formación de biopelícula. Para ello, se llevó a cabo el cultivo de la biopelícula a dos temperaturas diferentes: 30 ºC y 37 ºC. Globalmente, no se encontraron diferencias acusadas entre la formación de biopelícula a 30 ºC y 37 ºC, a pesar de que 7 de las cepas estudiadas (4 de origen cárnico y 3 de origen clínico) mostraron un comportamiento significativamente diferente en función de la temperatura de incubación (Tabla 7). Asimismo, se comprobó la ausencia de correlación entre este parámetro y el origen biológico o perfil MDR de las cepas, lo cual apoya los resultados obtenidos en estudios previos llevados a cabo por este grupo de investigación (Díaz-Jiménez et al., 2020b). Cepas de origen alimentario Cepas de origen humano Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 38 Tabla 7: Cuantificación de la formación de biopelícula cultivada a 30 ºC y 37 ºC de las cepas de Klebsiella spp. Código Origen Temperatura de incubación 30 ºC1 Clasificación Temperatura de incubación 37 ºC1 Clasificación 30 ºC vs 37 ºC2 49-KLEB Carne de pollo 1,054 ± 0,365 Moderada 0,393 ± 0,040 Débil 0,044 50-KLEB Carne de pollo 0,769 ± 0,371 Moderada 0,295 ± 0,057 Débil n.s. 51-KLEB Carne de pavo 0,135 ± 0,032 Débil 0,125 ± 0,013 Débil n.s. 52-KLEB Carne de pavo 0,482 ± 0,055 Débil 0,639 ± 0,118 Moderada n.s. 53-KLEB Carne de cerdo 0,368 ± 0,081 Débil 0,260 ± 0,083 Débil n.s. 54-KLEB Carne de pollo 0,283 ± 0,064 Débil 0,476 ± 0,259 Débil n.s. 55-KLEB Carne de pavo 0,459 ± 0,093 Débil 0,218 ± 0,008 Débil 0,046 56-KLEB Carne de pavo 0,419 ± 0,279 Débil 0,695 ± 0,255 Moderada n.s. 57-KLEB Carne de pavo 0,484 ± 0,184 Débil 0,189 ± 0,032 Débil n.s. 58-KLEB Carne de pavo 0,367 ± 0,126 Débil 1,084 ± 0,421 Moderada 0,047 59-KLEB Carne de pavo 0,489 ± 0,118 Débil 0,444 ± 0,127 Débil n.s. 61-KLEB Carne de pavo 0,297 ± 0,096 Débil 0,269 ± 0,048 Débil n.s. 62-KLEB Carne de pavo 0,982 ± 0,132 Moderada 1,789 ± 0,287 Fuerte 0,011 63-KLEB Hospitalario 0,398 ± 0,099 Débil 0,314 ± 0,058 Débil n.s. 64-KLEB Hospitalario 0,439 ± 0,011 Débil 0,433 ± 0,273 Débil n.s. 65-KLEB Hospitalario 0,449 ± 0,123 Débil 1,008 ± 0,156 Moderada 0,008 66a-KLEB Hospitalario 1,763 ± 0,580 Fuerte 1,439 ± 0,578 Moderada n.s. 67-KLEB Hospitalario 0,151 ± 0,014 Débil 0,161 ± 0,049 Débil n.s. 68-KLEB Hospitalario 0,125 ± 0,011 Débil 0,155 ± 0,045 Débil n.s. 69-KLEB Hospitalario 0,415 ± 0,070 Débil 0,332 ± 0,008 Débil n.s. 70-KLEB Hospitalario 0,643 ± 0,162 Moderada 0,184 ± 0,007 Débil 0,039 71-KLEB Hospitalario 0,256 ± 0,116 Débil 0,278 ± 0,153 Débil n.s. 72-KLEB Hospitalario 0,174 ± 0,012 Débil 0,152 ± 0,006 Débil 0,046 73-KLEB Hospitalario 0,195 ± 0,034 Débil 0,154 ± 0,013 Débil n.s. 74-KLEB Hospitalario 0,207 ± 0,040 Débil 0,271 ± 0,025 Débil n.s. 75-KLEB Hospitalario 0,158 ± 0,011 Débil 0,151 ± 0,002 Débil n.s. 1Se recogen las medias de las absorbancias (D.O. 590 nm, n=3) y su desviación estándar (SD). 2Determinación del grado de asociación estadística entre las variables mediante el análisis paramétrico tipo t de Student. Se consideran significativos valores menores a 0,05 (P < 0.05). n.s.: indica la ausencia de diferencias estadísticamente significativas. Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 39 La formación de biopelícula supone una estrategia adaptativa que favorece la supervivencia de los microorganismos en entornos hostiles, los cuales pueden derivar de condiciones ambientales adversas como fluctuaciones de temperatura, humedad, pH, disponibilidad de oxígeno y nutrientes, entre otras (Else et al., 2003). A priori, se podría considerar que las diferentes condiciones ambientales que se dan en el medio repercuten de la misma manera sobre todos los miembros que constituyen una misma especie bacteriana. Sin embargo, la elevada diversidad genética que presentan algunas de estas especies, como es el caso de K. pneumoniae (Martin & Bachman, 2018), hace que la respuesta frente a los diversos factores ambientales (entre los que se encuentra la temperatura) no sea homogénea dentro de la población, mostrando cada cepa un comportamiento individual. No obstante, la gran dispersión que registran las medias de las mediciones (D.O. 590 nm) de la mayoría de las cepas hace necesario reproducir este experimento en las mismas condiciones con el fin de evaluar la repetibilidad del mismo. 4.2.2. Efecto del origen de las cepas en la formación de biopelícula Al analizar desde una perspectiva general los resultados obtenidos en este ensayo, se observó una mayor formación de biopelícula en los aislados procedentes de muestras cárnicas en comparación con los de origen clínico, sin embargo, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (P > 0,05) (Figura 2). La cepa que registró una mayor producción de biopelícula procedía de una muestra de carne de pavo, mostrando una media y una SD de 1,789 ± 0,287 a 37 ºC (D.O. 590 nm), mientras que el aislamiento menos productor de biopelícula fue de origen hospitalario con una media y una SD de 0,125 ± 0,011 a 30 ºC (D.O. 590 nm). Figura 2. Comparación entre la formación de biopelícula de las cepas alimentarias (A) y las cepas humanas (B) de Klebsiella spp., cultivadas a 30 ºC y 37 ºC. Cada símbolo representa la media de las absorbancias (D.O. 590 nm, n=3) de cada cepa individual y las líneas paralelas al eje de abscisas representan el valor promedio de la población. (ns) indica la ausencia de diferencias estadísticamente significativas (análisis paramétrico tipo t de Student, P > 0,05). (A) (B) (A) (B) Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 40 Si bien estudios previos similares sugieren que el entorno de procedencia de las cepas influye en la capacidad de formación de biopelícula, siendo las cepas aisladas a partir de muestras cárnicas más productoras que las de origen humano (Gestoso, 2020), en este estudio la ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos no permitió respaldar esta hipótesis. Tal y como se describió al evaluar el efecto de la temperatura de incubación, las discrepancias observadas en la formación de biopelícula en función del origen de los aislamientos podrían ser debidas a la elevada variabilidad genética de las cepas que integran esta especie bacteriana (Martin & Bachman, 2018). No obstante, la amplia dispersión que presentan las medias de las mediciones (D.O. 590 nm) de la mayoría de las cepas hace que sea necesario repetir este ensayo en las mismas condiciones para poder llegar a una conclusión certera. 4.3. Determinación del fenotipo HMV Siguiendo el procedimiento anteriormente descrito (ver apartado 3.6.), se aplicó el string test a todas las cepas que componen este estudio y se observó que 7 de ellas (13%) resultaron HMV+, todas de origen clínico (17,1%) (Imagen 4). Imagen 4. Hilo viscoso > 5mm que caracteriza una cepa como HMV+. Fuente: Shon et al. (2013). La importancia de llevar a cabo la determinación del fenotipo HMV radica en la estrecha relación que existe entre su expresión y la presencia de determinados factores de virulencia que clasifican a las cepas de K. pneumoniae como hipervirulentas, cepas de gran relevancia clínica debido a su capacidad de provocar infecciones graves en individuos sanos. No obstante, se debe tener presente que un resultado positivo en el string test no implica necesariamente que una cepa sea hipervirulenta, de la misma manera que un resultado negativo es insuficiente para concluir que no lo sea. Para poder determinar si realmente un aislamiento es hipervirulento, es necesario llevar a cabo un estudio más exhaustivo mediante pruebas Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 41 moleculares que determinen los factores de virulencia que caracterizan este genotipo (Catalán- Nájera et al., 2017; González-Ferrer et al., 2021; Shon et al., 2013). Por otro lado, se comprobó que 6 de estos aislamientos HMV+ (85,7%) presentaron un perfil MDR. En la literatura científica la relación existente entre la expresión del fenotipo HMV y el perfil de resistencia antibiótica no está claramente definida, aunque hasta el momento, las cepas HMV+ estudiadas han presentado sensibilidad frente a la mayoría de los agentes antimicrobianos (Catalán-Nájera et al., 2017). Sin embargo, los resultados obtenidos en este estudio sugieren que las cepas que expresan este fenotipo muestran una mayor resistencia a las diferentes categorías antibióticas, lo que presenta un escenario alarmante que requiere de una mayor vigilancia e investigación. Con respecto a la capacidad de producción de biopelícula, solo una de las cepas HMV+ fue incluida en el ensayo de formación de biopelícula (70-KLEB), arrojando unos valores de producción moderada a 30 ºC y débil a 37 ºC, lo que sugeriría que dicha capacidad es independiente de la expresión del fenotipo HMV. No obstante, es necesario incluir todas las cepas HMV+ en un nuevo ensayo en el que se evalúe su capacidad para formar biopelícula y así poder corroborar la hipótesis postulada. Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 48 Karami-Zarandi, M. (2019). Correlation between biofilm formation and carbapenem resistance among clinical isolates of Klebsiella pneumoniae. Ethiopian Journal of Health Sciences, 29(6), 745–750. https://doi.org/10.4314/ejhs.v29i6.11 Rasheed, J. K., Jay, C., Metchock, B., Berkowitz, F., Weigel, L., Crellin, J., Steward, C., Hill, B., Medeiros, A. A., & Tenover, F. C. (1997). Evolution of extended-spectrum β-lactam resistance (SHV-8) in a strain of Escherichia coli during multiple episodes of bacteremia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 41(3), 647–653. https://doi.org/10.1128/aac.41.3.647 Regulation (EC) No. 1831/2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 on additives for use in animal nutrition. Official Journal of the European Union, 268, 18 October 2003, 29-43. Recuperado de: https://eur-lex.europa.eu/legalcontent/en/TXT/?uri=CELEX%3A32003R1831 Reygaert, W. (2018). An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria. AIMS Microbiology, 4(3), 482–501. https://doi.org/10.3934/microbiol.2018.3.482 Riley, L. W. (2020). Extraintestinal Foodborne Pathogens. Annual Review of Food Science and Technology, 11(1), 275–294. https://doi.org/10.1146/annurev-food-032519-051618 Rodrigues, L. R. (2015). Acinetobacter baumannii displays inverse relationship between meropenem resistance and biofilm production. Journal of Chemotherapy, 27(1), 13–15. https://doi.org/10.1179/1973947813Y.0000000159 Sabtu, N., Enoch, D. A., & Brown, N. M. (2015). Antibiotic resistance: what, why, where, when and how? British Medical Bulletin, 116(1). https://doi.org/10.1093/bmb/ldv041 Schwarz, S., Loeffler, A., & Kadlec, K. (2017). Bacterial resistance to antimicrobial agents and its impact on veterinary and human medicine. Veterinary Dermatology, 28(1). https://doi.org/10.1111/vde.12362 Shon, A. S., Bajwa, R. P. S., & Russo, T. A. (2013). Hypervirulent (hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae: A new and dangerous breed. Virulence, 4(2), 107–118. https://doi.org/10.4161/viru.22718 Siller-Ruiz, M., Hernández-Egido, S., Sánchez-Juanes, F., González-Buitrago, J. M., & Muñoz- Bellido, J. L. (2017). Métodos rápidos de identificación de bacterias y hongos. Espectrometría de masas MALDI-TOF, medios cromogénicos. Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clinica, 35(5), 303–313. https://doi.org/10.1016/j.eimc.2016.12.010 Suárez, C., & Gudiol, F. (2009). Beta-lactam antibiotics. Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clinica, 27(2), 116–129. https://doi.org/10.1016/j.eimc.2008.12.001 Fernandez_Pedrero_Raquel_TFG_2020-2021 Raquel Fernández Pedrero 49 Sultan, I., Rahman, S., Jan, A. T., Siddiqui, M. T., Mondal, A. H., & Haq, Q. M. R. (2018). Antibiotics, resistome and resistance mechanisms: A bacterial perspective. Frontiers in Microbiology, 9, 2066. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02066 Türkel, İ., Yıldırım, T., Yazgan, B., Bilgin, M., & Başbulut, E. (2018). Relationship between antibiotic resistance, efflux pumps, and biofilm formation in extended-spectrum βlactamase producing Klebsiella pneumoniae. Journal of Chemotherapy, 30(6–8), 354–363. https://doi.org/10.1080/1120009X.2018.1521773 Van Hoek, A. H. A. M., Mevius, D., Guerra, B., Mullany, P., Roberts, A. P., & Aarts, H. J. M. (2011). Acquired antibiotic resistance genes: An overview. Frontiers in Microbiology, 2, 203. https://doi.org/10.3389/fmicb.2011.00203 Wall, B. A., Mateus, A., Marshall, L., & Pfeiffer, D. (2016). Drivers, dynamics and epidemiology of antimicrobial resistance in animal production. Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAO. Recuperado de: http://www.fao.org/feedsafety/resources/resources-details/en/c/452608/ WHO. World Health Organization. (2017). Global priority list of antibiotic-resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics. Recuperado de: https://www.who.int/medicines/publications/global-priority-list-antibiotic-resistant- bacteria/en/ WHO. World Health Organization. (2020). Antimicrobial Resistance. Recuperado de: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., & Schubert, S. (2012). MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Applied Microbiology and Biotechnology, 93(3), 965–974. https://doi.org/10.1007/s00253-011- 3783-4 Yang, D., & Zhang, Z. (2008). Biofilm-forming Klebsiella pneumoniae strains have greater likelihood of producing extended-spectrum β-lactamases. Journal of Hospital Infection, 68(4), 369–371. https://doi.org/10.1016/j.jhin.2008.02.001 Zárate, M. S., Romano, V., Nievas, J., & Smayevsky, J. (2014). Utilidad de la espectrometría de masas MALDI-TOF en la identificación de bacterias anaerobias. Revista Argentina de Microbiologia, 46(2), 98–102. https://doi.org/10.1016/S0325-7541(14)70055-0