Estudio del genoma mitocondrial en la enfermedad multifactorial y otras aplicaciones poblacionales y forenses

UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTADE DE MEDICINA INSTITUTO DE MEDICINA LEGAL ESTUDIO DEL GENOMA MITOCONDRIAL EN LA ENFERMEDAD MULTIFACTORIAL Y OTRAS APLICACIONES POBLACIONALES Y FORENSES Memoria que presenta, para optar al grado de doctor, Ana Mosquera Miguel Santiago de Compostela, marzo de 2010 El Doctor D. Antonio Salas Ellacuriaga, Profesor de la Universidad de Santiago de Compostela y el Doctor D. Ángel Carracedo Álvarez, Catedrático de Medicina Legal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela, CERTIFICAN: Que la presente memoria que lleva por título “Estudio del genoma mitocondrial en la enfermedad multifactorial y otras aplicaciones poblacionales y forenses”, de la licenciada en Biología por la Universidad de Santiago de Compostela Ana Mosquera Miguel, ha sido realizada bajo nuestra dirección, considerándola en condiciones para optar al Grado de Doctor y autorizándola para su presentación ante el Tribunal correspondiente. Y para que así conste, firmamos la presente en Santiago de Compostela, a 17 de marzo de 2010. Prof. Dr. Antonio Salas Ellacuriaga Prof. Dr. Ángel Carracedo Álvarez Ana Mosquera Miguel Agradecimientos Es cierto que ésta es una de las partes más difíciles de escribir de la tesis, a pesar de que la mayoría de las personas que aquí menciono ya saben cuánto les agradezco el apoyo que me han dado de una u otra forma. En primer lugar, quiero darles las gracias a mis directores de tesis, Ángel Carracedo y Antonio Salas. Gracias Ángel por darme la oportunidad de entrar en tu grupo, sin ella nada de esto sería posible. Gracias Toño por permitirme trabajar y aprender contigo y adentrarme en el no tan pequeño mundo de las mitocondrias, aunque con ello me haya convertido un poco en “sheriff”. También quiero agradecerles a Maviki y a Chris las colaboraciones y nuevas oportunidades que me han ofrecido. De mis compañeros, a todos les debo algo porque durante estos cuatro años todos y cada uno de ellos me han ayudado de alguna forma. Vane se merece un agradecimiento especial, por lo que me ha enseñado, por los maratones que hemos corrido juntas (nunca literalmente, claro), y por los buenos ratos, fuera y dentro del laboratorio. A Raquel y Fonde, que me enseñaron el laboratorio y los procesos iniciales, surgiendo algún contratiempo que siempre es divertido recordar. Quiero agradecer también a Meli, Paula y Eva, porque para mí son un gran apoyo en el laboratorio. En general, gracias a todos: Mari, Alex, Nuria, Francesca, María Cerezo, Manu, Alberto, Laura Fachal, Luis, Ana Aradas, Cata, Yarimar, Olalla, Ana Pastoriza, Miguel, Carla, Bea, Montse, Rocío, María Dosil, Ángela, Esther, Jens, Ana Ignacio, Paula y Danel. ¡Espero no olvidarme de nadie! Aunque aparentemente mis amigos no tengan mucho que ver con la realización de la tesis, sí que me han echado algún que otro cable informático; pero sobre todo me han ayudado a salir del laboratorio y olvidarme de mitocondrias, ADNmt y pipetas, que también es importante. Por eso, muchas gracias. En especial quiero agradecer el apoyo que me han dado mis compañeras de piso, Patri y Rocío. Sobre todo Rocío porque, además de sufrirme más tiempo, ha aguantado el “ making of” de la tesis. A mi familia, que siempre se preocupa de cómo va el CSI de Santiago, y que confían en mi incondicionalmente. En especial, gracias a mis primas, Laura y Marta. A mis padres, porque siempre estáis apoyándome en cada paso que doy, sin dejarme retroceder y dándome el empujón necesario para seguir hacia delante. Gracias por poder contar con vosotros para todo. A mi hermano porque, aunque sea basándose en el desconocimiento, sigue creyendo que me acompañará a Estocolmo. ¡Gracias! GRACIAS A TODOS A MIS PADRES ÍNDICE ABREVIATURAS ................................................................................................................... XIII INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1 1 La mitocondria: aspectos generales ................................................................... 3 1.1 Estructura de las mitocondrias ........................................................................................ 3 1.2 Origen endosimbionte de las mitocondrias ................................................................ 4 1.3 Biogénesis mitocondrial y segregación mitótica ....................................................... 6 1.4 Funciones de la mitocondria ............................................................................................. 6 2 El genoma mitocondrial ....................................................................................... 12 2.1 Estructura del ADN mitocondrial .................................................................................. 12 2.2 Herencia materna y ausencia de recombinación .................................................... 14 2.3 Tasa de mutación del genoma mitocondrial ............................................................. 16 2.4 Variabilidad del ADN mitocondrial .............................................................................. 19 2.5 Número de copias y heteroplasmía .............................................................................. 20 3 Análisis de la variabilidad del ADN mitocondrial ....................................... 22 3.1 Evolución de la metodología de genotipado del ADNmt ...................................... 22 3.2 Nomenclatura........................................................................................................................ 27 4 Aplicaciones poblacionales de la variabilidad del genoma mitocondrial .......................................................................................................................... 30 4.1 Generalidades ....................................................................................................................... 30 4.2 Metodología de análisis ..................................................................................................... 31 4.3 Principales aportaciones del ADNmt en genética de poblaciones.................... 32 4.4 Limitaciones del ADNmt ................................................................................................... 36 5 Aplicaciones forenses de la variabilidad del genoma mitocondrial .... 37 5.1 Generalidades ....................................................................................................................... 37 5.2 Tipo de marcadores genéticos ........................................................................................ 38 5.3 Utilidad y limitaciones del ADNmt ................................................................................ 39 ABREVIATURAS ________________________________ XVI • kD: Kilodaltons • mL: Mililitro • mM: Milimolar • MRCA: Most Recent Common Ancestor (antepasado común más reciente) • NADH: Forma reducida del dinucleótido nicotinamida adenina (NAD+) • ng: Nanogramo • nM: Nanomolar • NUMTs: Nuclear mitochondrial pseudogenes (pseudogenes mitocondriales situados en el genoma nuclear) • Pb: Pares de bases • PCR: Polimerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa) • Pm: Peso molecular • pmol: Picomol • rCRS: Revised Cambridge Reference Sequence (CRS revisada) • RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism (Polimorfismo de longitud del fragmento de restricción) • r.p.m.: Revoluciones por minuto • SBE: Single Base Extension (extensión de una única base) • SDS: Dodecil sulfato de sodio • SNP: Single Nucleotide Polymorphism (polimorfismo de un solo nucleótido) • SSCP: Single Strand Conformational Polymorphism (polimorfismo conformacional de cadena única) • STR: Short Tandem Repeat (repetición corta en tándem) • T: Timina • Tm: Temperatura de melting • TMRCA: Time to Most Recent Common Ancestor (tiempo hasta el antepasado común más reciente) • µg: Microgramo • µL: Microlitro • µm: Micrometro • µM: Micromolar INTRODUCCIÓN _________________________________ INTRODUCCIÓN 3 1 La mitocondria: aspectos generales La mitocondria es un orgánulo presente en casi todas las células eucariotas que, además de poseer genoma propio, presenta su propia maquinaria de transcripción, traducción y ensamblaje de proteínas. La razón de su ubicuidad hace referencia a la importante función que desempeña, proporcionar el aporte energético necesario para las células. El número de orgánulos que se presentan en cada célula varía en función del tipo celular y de las demandas energéticas de cada momento. 1.1 Estructura de las mitocondrias Las mitocondrias son orgánulos de doble membrana y de forma típicamente alargada, alrededor de 0’5µm de ancho y hasta 10µm de largo, sin embargo pueden variar considerablemente tanto en forma como en tamaño. La membrana mitocondrial externa es una bicapa lipídica relativamente sencilla, lisa y muy permeable, gracias a la presencia de numerosas porinas, que permiten el paso inespecífico de moléculas de hasta 10kD de tamaño. De esta forma, iones, nutrientes, ATP, ADP, y otras moléculas, pueden pasar a través de esta membrana con facilidad. Por el contrario, la membrana mitocondrial interna solamente es permeable al oxígeno, dióxido de carbono y agua, mientras que el resto de las moléculas necesarias para la mitocondria pasan mediante transporte activo. Además, su estructura es considerablemente más compleja que la de la membrana externa, ya que en ella se localizan proteínas transportadoras, todas las proteínas de la cadena de transporte de electrones y el complejo de la ATP sintasa, esenciales para la función mitocondrial y cuyo número varía dependiendo del tipo celular. Además, la membrana interna también se caracteriza por presentar numerosas invaginaciones que se denominan crestas mitocondriales, permitiendo así aumentar su superficie total. Como consecuencia de la presencia de esta doble bicapa lipídica en el interior de las mitocondrias se diferencian dos espacios. El espacio intermembrana, localizado como su nombre indica entre la membrana externa y INTRODUCCIÓN _________________________________ 4 la interna, juega un papel importante en la fosforilación oxidativa mediante la creación de un gradiente electroquímico. La matriz mitocondrial, de carácter gelatinoso, es el espacio que se encuentra en el interior de la mitocondria, limitado por la membrana interna. En la matriz tienen lugar rutas metabólicas importantes gracias a la presencia de enzimas solubles, cofactores y los substratos necesarios. Por último, la mitocondria posee varias copias de un genoma propio y la maquinaria necesaria para la síntesis proteica (ARNt y ribosomas). Figura 1: Localización y estructura de las mitocondrias. 1.2 Origen endosimbionte de las mitocondrias Las mitocondrias, al igual que los plástidos, presentan muchas semejanzas con las bacterias: su forma, tamaño o la presencia de un genoma circular de doble cadena. Éstas y otras características morfológicas (presencia de doble membrana, químicamente diferente a la nuclear), junto determinadas propiedades bioquímicas y moleculares (no participan en el tráfico vesicular como el resto de orgánulos de membrana simple) y datos paleontológicos llevaron a Lynn Margulis (1976) a formular la teoría endosimbiótica o de la endosimbiosis seriada. Según esta teoría, el origen de las células eucariotas es consecuencia de la sucesiva incorporación simbiogenética de diferentes procariotas, de forma que los organismos endosimbiontes transfirieron parte o todo su material genético al hospedador. _________________________________ INTRODUCCIÓN 5 Hoy en día se acepta que los orgánulos de doble membrana (mitocondrias y plástidos) son el resultado de una o varias simbiosis a partir de las cuales evolucionaron las células eucariotas actuales, adquiriendo así maquinarias bioenergéticas y biosintéticas compartimentalizadas. Análisis de genes mitocondriales y de su distribución y organización en el genoma de diferentes organismos, parecen confirmar que los genomas mitocondriales han derivado de un único ancestro relacionado con la división α de las Proteobacterias, hace aproximadamente 1´5×109 años. Existe mayor controversia con respecto al tipo de célula hospedadora que participó en la simbiosis con la α-proteobacteria, ya que para los defensores del modelo de endosimbiosis en serie, la célula huésped en ese momento ya presentaba núcleo (resultado de una simbiosis anterior entre una arqueobacteria y una proteobacteria). Sin embargo, la hipótesis del hidrógeno propone una simbiosis entre una arqueobacteria metanogénica y α-proteobacteria metanotrófica, surgiendo el núcleo celular y la mitocondria como resultado de un único evento de simbiosis (Dyall et al. 2004; Gray et al. 1999). Figura 2: Representación esquemática de dos de las hipótesis formuladas para explicar el origen de la célula eucariota, el modelo de endosimbiosis en serie (A) y la hipótesis del hidrógeno (B). Imagen modificada de Gray et al. (1999). INTRODUCCIÓN _________________________________ 6 Es posible que filtraciones de ADN durante la división o la lisis de la eubacteria favoreciesen la transferencia de secciones de su genoma al núcleo, y se cree que esto ha contribuido de forma sustancial a la evolución de los genomas eucariotas. Esta redundancia genética podría explicar la posterior reducción del genoma del endosimbionte (Dyall et al. 2004). Actualmente también tienen lugar transferencias de ADNmt al núcleo, originando secuencias no codificantes denominadas NUMTs (nuclear mitochondrial pseudogenes). Sin embargo, parece que la mayoría se originaron a partir de duplicaciones de NUMTs ya existentes en el genoma nuclear (Ramos et al. 2009). 1.3 Biogénesis mitocondrial y segregación mitótica Las mitocondrias no se sintetizan nunca de novo, sino que siempre surgen por crecimiento y división de otras ya existentes. Cada orgánulo ha de duplicar su masa y luego dividirse por la mitad un promedio de una vez por cada generación celular, y para ello han de importar lípidos, nucleótidos y pre-proteínas desde el citosol, de forma que el núcleo juega un papel esencial en la biogénesis mitocondrial (Dyall et al. 2004). En la mayoría de las células, los orgánulos transformadores de energía se dividen durante la interfase y replican su ADN durante todo el ciclo celular, es decir, que presentan un desfase con respecto a estos mismos procesos en las células. Durante la división celular, las mitocondrias se distribuyen de forma aleatoria entre las células hijas y, como se analizará posteriormente, este fenómeno, denominado segregación mitótica, tendrá implicaciones clínicas importantes. 1.4 Funciones de la mitocondria 1.4.1 Producción de energía celular Muchos de los procesos que tienen lugar en las células (metabólicos, biosintéticos,…) son imprescindibles para la supervivencia de las mismas, y requieren aportes de energía para llevar a cabo reacciones endotérmicas. La _________________________________ INTRODUCCIÓN 7 mitocondria es un orgánulo celular que sirve como suministro energético a la célula eucariota, ya que oxida determinados sustratos para obtener adenosina trifosfato (ATP). El número de mitocondrias existentes en una célula viene determinado por los requerimientos energéticos propios de cada tipo celular y de cada momento. Los principales sustratos a partir de los cuales se obtiene energía en la mitocondria son glucosa y ácidos grasos. Es importante asegurar su aporte continuado para el metabolismo oxidativo, y por ello las células animales almacenan ácidos grasos en forma de grasas y glucosa transformándola en glucógeno. Los pasos iniciales del catabolismo, tanto del glucógeno como de las grasas, se llevan a cabo en el citosol, y son sus productos los que son transportados al interior de las mitocondrias, donde tiene lugar la oxidación del piruvato, la βoxidación de los ácidos grasos, la oxidación de los aminoácidos y el ciclo del ácido cítrico. La producción de energía a partir de glucosa y oxígeno, mayoritariamente en forma de ATP, es resultado de dos procesos catabólicos. Inicialmente la glucosa es convertida a piruvato por vía glicolítica en el citoplasma, posteriormente es importado a la mitocondria, transformado en acetil-CoA y oxidado hasta obtener dióxido de carbono y agua. Todo esto tiene lugar gracias a dos sistemas interconectados y muy coordinados: el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y el complejo de la cadena respiratoria. El ciclo de Krebs (ciclo de los ácidos tricarboxílicos o del ácido cítrico) recibe su nombre en honor a su descubridor, quien, en 1937, propuso que los combustibles orgánicos se oxidaban a través de una ruta cíclica. Así, el ciclo del ácido cítrico consiste en una oxidación progresiva del acetil-CoA mediante un ciclo de ocho reacciones, que tiene lugar en la matriz mitocondrial, durante las cuales se desprende CO2. Sin embargo, su contribución más importante al metabolismo consiste en la extracción de electrones de alta energía durante dicha oxidación. Los principales transportadores de electrones son el NADH y el FADH2, y provienen tanto del ciclo de Krebs como de los pasos anteriores (glucólisis, β-oxidación de ácidos grasos, transformación de piruvato en acetil-CoA). INTRODUCCIÓN _________________________________ 8 La cadena respiratoria o sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) consiste en el conjunto de reacciones que comprenden la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa. La cadena de transporte electrónico (ETC, Electron Transport Chain) consiste en la transferencia sucesiva de los electrones de alta energía cedidos por el NADH o FADH2 a cuatro grandes complejos proteicos, situados en la membrana mitocondrial interna. Cada uno de ellos tiene mayor afinidad por los electrones que su predecesor, hasta que finalmente son transferidos al oxígeno, que presenta una afinidad mayor que cualquier otro complejo de la cadena. Son varios los modelos propuestos para explicar el mecanismo mediante el cual la energía liberada en la respiración se utiliza para impulsar la síntesis de ATP, sin embargo, hoy en día se acepta la hipótesis de acoplamiento quimiosmótico, propuesta en 1961 por el bioquímico británico Peter Mitchell y que le valió el Premio Nobel en 1978. Este modelo en su forma más básica propone que la energía del transporte electrónico impulsa un sistema de transporte activo que bombea protones fuera de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana, creando así un gradiente electroquímico entre ambos. Los protones del exterior tienen una tendencia termodinámica a volver a entrar en la matriz para igualar el pH (gradiente químico) y la carga (gradiente eléctrico) a ambos lados de la membrana (Mathews et al. 2002). Este flujo de protones a favor de gradiente es utilizado por la ATP sintasa para impulsar la conversión de ADP+Pi en ATP mediante un proceso denominado fosforilación oxidativa. La cadena respiratoria es la principal fuente de ATP en los organismos aerobios, y se denomina así porque es imprescindible la presencia de oxígeno para que tenga lugar, ya que esta molécula es el aceptor último de los electrones. En la mayor parte de las células, al menos un 90% del oxígeno molecular consumido se utiliza para la fosforilación oxidativa, aunque se conocen otras 200 enzimas que utilizan esta molécula como sustrato. En ausencia de oxígeno la síntesis de ATP se detiene, lo que puede provocar la muerte celular. La evolución de la respiración celular capacitó a los organismos para obtener mucha más energía en comparación con el metabolismo anaerobio. En general, el balance total de energía obtenida mediante la glucólisis anaerobia (transformación de glucosa a piruvato) es de aproximadamente dos moles de ATP, mientras que la oxidación completa de la _________________________________ INTRODUCCIÓN 9 glucosa a CO2 y agua en presencia de oxígeno aporta alrededor de 38 moles de ATP. 1.4.2 Biosíntesis de componentes celulares Las principales funciones biosintéticas de la mitocondria provienen de alguno de los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos e incluyen: • Biosíntesis de ácidos grasos y esteroles: en algunos tejidos el citrato es transportado al citosol, donde es fragmentado para producir acetil-CoA para la biosíntesis de los ácidos grasos. • Biosíntesis de aminoácidos, purinas y pirimidinas: a partir del aspartato y glutamato resultantes de la transaminación del oxalacetato y α-cetoglutarato, respectivamente. • Hemo y otras porfirinas: a partir del succinil-CoA Dado que éstas y otras reacciones tienden a causar una reducción de los intermediarios del ciclo del ácido cítrico, el funcionamiento de éste se iría deteriorando si no hubiera otros procesos que repusieran las reservas de los mismos, se denominan rutas anapletóricas. En la mayoría de las células el flujo de salida del carbono del ciclo se equilibra mediante estas reacciones anapletóricas, de manera que las concentraciones intramitocondriales de los intermediarios del ciclo se mantienen constantes a lo largo del tiempo (Mathews et al. 2002). 1.4.3 Apoptosis celular La apoptosis, o muerte celular programada, es un programa de suicidio celular mediante el cual células individuales son destruidas mientras que se preserva la integridad del tejido circundante. Esta destrucción celular dirigida es crítica en muchos contextos fisiológicos, como la embriogénesis, maduración y respuesta de células inmunes, homeostasis de los tejidos y respuesta al daño celular. La evasión del programa apoptótico promueve la tumorigénesis. Uno de los últimos descubrimientos en relación a la biología mitocondrial es el hecho de que este orgánulo juega un papel importante en la apoptosis celular. El complejo papel de la mitocondria en la apoptosis celular de los mamíferos se puso INTRODUCCIÓN _________________________________ 16 estadísticos inadecuados pueda ser la causa de no haber podido detectarla (Hagelberg 2003; White and Gemmell 2009). En resumen, si la fuga de ADNmt paterno es un fenómeno tan poco frecuente como parece, la probabilidad de que pueda ocurrir recombinación, si es que existe, es muy reducida y no afectaría a las interpretaciones obtenidas a partir de los datos del genoma mitocondrial. Por ello, aunque se ha sugerido que es importante tener en cuenta la posibilidad de herencia paterna (Kraytsberg et al. 2004), siempre hay que considerar y descartar antes toda posibilidad de recombinación artefactual (Bandelt et al. 2005b). 2.3 Tasa de mutación del genoma mitocondrial La tasa de sustitución o evolución depende de la velocidad a la que surgen (tasa de mutación) y se fijan (tasa de fijación) las mutaciones en los linajes. Se ha estimado, mediante estudios comparativos entre las secuencias de ADN de diferentes organismos, que la tasa de sustitución correspondiente al ADNmt es aproximadamente diez veces superior a la del ADNn (Brown et al. 1979), aunque parece que esta diferencia no es uniforme a lo largo de la molécula (Pesole et al. 1999). La ausencia de histonas que protejan el genoma del orgánulo, la fidelidad reducida de los sistemas de replicación y/o reparación del ADNmt y la elevada concentración de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la matriz mitocondrial son algunas de las causas que se barajan para explicar la diferencia entre las tasas de mutación de estos dos genomas. Esta alta tasa de evolución convierte el ADNmt en una herramienta muy útil en genética forense y para el estudio de las poblaciones humanas, ya que permite llevar a cabo análisis de alta resolución de los eventos evolutivos recientes e introducir una escala temporal en la evolución molecular. La tasa de sustitución no es igual en todas las regiones de la molécula de ADNmt ya que, por ejemplo, la región control se caracteriza por presentar una tasa más elevada que la región codificante, aunque es difícil dar una cifra ya que es un tema muy controvertido. Esta diferencia en tasa de sustitución puede deberse a que en la región control la presión selectiva es mucho menor. De hecho, posiciones _________________________________ INTRODUCCIÓN 17 concretas del ADNmt presentan tasas de sustitución muy superiores a la tasa promedio para esta misma zona, llegando algunas a considerarse puntos calientes de mutación o hotspots que serían posiciones más propensas a mutar. Se han llevado a cabo dos tipos de aproximaciones diferentes para estimar la tasa de mutación del ADN mitocondrial. Una de ellas se basa en estudios filogenéticos, en los que se realizan comparaciones inter e intraespecíficas, mientras que la otra estrategia se basa en el estudio de pedigrís o familias que pueden seguirse hacia atrás varias generaciones. Estimas obtenidas a partir de estudios familiares y con datos de la región control aportaron valores bastante diferentes entre sí: Howell et al. (1996) obtienen una tasa de 7’5x10-7 mutaciones por sitio y año, Parsons et al. (1997) sitúan esta cifra en 2’5x10-6 sustituciones/nucleótido/año, Sigurgardottir et al. (2000) en 3’2x10-7 sustituciones/sitio/año, Heyer et al. (2001) en 3’9x10-7 sustituciones/sitio/año, Santos et al. (2005) en 2’4x10-7 sustituciones/sitio/año. Comparaciones filogenéticas proporcionan estimas considerablemente inferiores, entre 2’2×10-8-3’5×10-7 sustituciones/nucleótido/año (Forster et al. 1996; Torroni et al. 1994), a las obtenidas en estudios familiares. La discrepancia entre las estimas basadas en pedigrís y las filogenéticas puede deberse a que las primeras podrían estar sobreestimando el efecto de heteroplasmías y posiciones hotspots, mientras que los estudios filogenéticos tendrían también en cuenta aquellas posiciones que evolucionan más lentamente. Sin embargo, se ha argumentado que no hay un único factor que explique esta discrepancia, sino que sería el resultado combinado de la influencia de hotspots mutacionales, deriva génica, selección purificante y mutaciones recurrentes (Howell et al. 2003; Sigurgardóttir et al. 2000). Se ha propuesto que la aproximación más adecuada para estudiar eventos de historia antigua sería la basada en estudios filogenéticos, porque representan mutaciones que han alcanzado una frecuencia considerable en la población, mientras que para eventos recientes podría ser más apropiado emplear estimas obtenidas a partir de estudios basados en pedigrís, aunque las primeras también funcionan bien para eventos de ≥ 1000 años (Macaulay et al. 1997). Ingman (2000) empleó una tasa de sustitución de 1’7×10-8 sustituciones/sitio/año INTRODUCCIÓN _________________________________ 18 (excluyendo la región control) para datar el origen del hombre moderno. La tasa de mutación del ADNmt empleada con más frecuencia es 1’26×10-8 sustituciones/nucleótido/año (Mishmar et al. 2003), pero sólo tiene en cuenta la variabilidad de la región codificante y no considera el efecto de la selección purificante. La observación de que mutaciones no sinónimas son más frecuentes en ramas jóvenes de la filogenia llevó a pensar que podría deberse a la selección purificante. Así, se propuso una nueva calibración basada en la tasa de acumulación de transiciones sinónimas en el genoma mitocondrial, aunque sólo emplea una pequeña fracción del mismo para su cálculo (3’5x10-8 transiciones sinónimas/sitio/año) (Kivisild et al. 2006). Sin embargo, las estimas promedio de la tasa de sustitución no reflejan el estado real de los hechos, ya que las tasas varían entre los genes codificantes, los de ARNt o ARNr, dentro de la región control, y entre posiciones no sinónimas y sinónimas (Pesole et al. 1999). Aunque es muy importante estimar la tasa de sustitución promedio del ADNmt, desde otros puntos de vista (e.j. forense), es mucho más relevante tener información sobre las tasas de mutación sitioespecíficas. Recientemente, se vio la necesidad de devolverle al ADNmt la credibilidad en lo que a la genética evolutiva se refiere, proponiendo una calibración que corrija la tasa de mutación en función de su dependencia temporal (Soares et al. 2009). Este trabajo confirma el efecto de la selección purificante, que actúa sobre mutaciones ligeramente deletéreas, en ramas jóvenes del árbol mitocondrial. Por ello, se propone un reloj molecular mejorado en el que se considera la variabilidad de todo el genoma mitocondrial y el efecto de selección purificante, obteniendo una tasa de sustitución para la molécula completa de 1’665×10-8 sustituciones/nucleótido/año o una mutación cada 3624 años. Este estudio aporta estimas para la tasa de sustitución de la región codificante, la región control o la tasa de sustituciones sinónimas, además de estimas de la edad de las principales ramas del árbol mitocondrial. Se indican también las posiciones hotspots más importantes, lo que puede ser de gran ayuda en el campo forense. Con esta nueva aproximación se obtienen estimas que coinciden con dataciones obtenidas a partir de registros _________________________________ INTRODUCCIÓN 19 arqueológicos, proporcionando un acercamiento entre las evidencias fósiles y las genéticas. 2.4 Variabilidad del ADN mitocondrial El término polimorfismo fue descrito por Ford en 1940 como la "presencia en una población de dos o más formas alélicas discretas, de las que la de menor frecuencia no puede mantenerse sólo por mutación recurrente". En términos generales se asume que un locus es polimórfico cuando el alelo más común tiene una frecuencia inferior al 99%. El ADN codificante es, en general, poco variable o polimórfico entre los individuos, mientras que las regiones no codificantes, al no estar sujetas a fuerte presión selectiva, presentan mucha mayor variabilidad. Esta es una de las razones que promovió la sustitución del análisis de los polimorfismos clásicos (proteicos) por los polimorfismos de ADN de regiones no codificantes. Los polimorfismos están distribuidos a lo largo de todo el genoma, y se pueden clasificar en polimorfismos de longitud o de secuencia. Los polimorfismos de longitud son causados por inserciones o deleciones de uno o más nucleótidos. Este tipo de polimorfismos son los más frecuentes en el ADN repetitivo (minisatélite y microsatélite), en donde las variaciones entre los alelos se deben a diferencias en el número de copias de la unidad repetitiva. En el ADNmt existen tractos homopoliméricos en los que con cierta frecuencia ocurren inserciones o deleciones de uno o varios nucleótidos. Estos tractos están localizados en las posiciones 16184-16188/16190-16193, 303-309/311-315 y 568-573 de la región control. La explicación más probable para este tipo de polimorfismos es el deslizamiento de la polimerasa durante la replicación del ADN, y este efecto parece ser más frecuente cuando el número de unidades repetitivas sobrepasa un valor umbral. Se ha sugerido que el número crítico para el tracto de poli-citosinas de HVI son 8Cs, mientras que para HVII serían 7Cs (Irwin et al. 2009). En el ADNmt sólo se ha descrito un microsatélite corto entre las posiciones 514 y 523 de la región D-loop del genoma mitocondrial (Bodenteich et al. 1992). Los polimorfismos de secuencia son causados por el cambio de uno o más nucleótidos en una secuencia de ADN. Cuando el cambio sucede en un único INTRODUCCIÓN _________________________________ 20 nucleótido y las dos bases alternativas aparecen en la población en una frecuencia superior a 1%, este tipo de polimorfismo se denomina SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Los SNPs son el tipo de polimorfismo más abundante del genoma humano y la mayoría se encuentran en regiones donde no alteran la función génica. Debido a su abundancia, su simplicidad y su baja tasa de mutación, estos marcadores han despertado un gran interés en distintos campos como el de la genética forense, el antropológico, y por supuesto también el clínico (Sobrino et al. 2005). En el ADNmt las transiciones superan en número a las transversiones en una proporción aproximada de 15:1, y dentro de las primeras, los cambios nucleotídicos entre pirimidinas son más frecuentes que entre purinas (Irwin et al. 2009). 2.5 Número de copias y heteroplasmía Cada célula contiene entre cientos y miles de mitocondrias y a su vez cada mitocondria contiene múltiples copias de la molécula de ADN del orgánulo, al contrario que en el ADN nuclear, donde generalmente sólo existen dos copias de un gen o segmento de ADN. Esta propiedad hace del ADNmt la molécula de elección para el análisis de ADN antiguo y para ciertas aplicaciones forenses donde la obtención de ADNn en buenas condiciones es limitante. Normalmente, las moléculas de ADNmt se distribuyen por la matriz mitocondrial formando complejos nucleoproteicos, llamados nucleoides, que representan las unidades dinámicas y de herencia. Se estima que hay cientos de nucleoides por célula y que cada uno suele contener entre 2-15 moléculas de ADNmt, y parecen estar están unidos a la membrana interna (Malka et al. 2006). Se desconoce cómo está empaquetado el ADNmt, pero se sabe que carece de la protección de histonas característica del genoma nuclear. En principio, todas las moléculas de ADNmt de un tejido son idénticas, denominándose a este estado homoplasmía, pero en ocasiones dentro de una mitocondria, de una célula, en un tejido específico o dentro de un individuo puede coexistir más de un tipo de ADNmt. La existencia de diferentes moléculas de ADNmt dentro de un individuo se conoce como heteroplasmía. _________________________________ INTRODUCCIÓN 21 La región control del genoma mitocondrial, muy interesante desde el punto de vista forense y antropológico por ser muy polimórfica (Greenberg et al. 1983), es el área más frecuentemente analizada y por ello la mayoría de las estimas de tasas de heteroplasmía se basan en estos datos. Estimas iniciales atribuían un valor pequeño o nulo a este fenómeno (Monnat and Reay 1986), sin embargo, estudios posteriores reportaron tasas de heteroplasmías puntuales considerablemente superiores: 13’8% para la región HVI (Tully et al. 2000), 11’6% en la región HVII (Calloway et al. 2000) y 10’5% para ambas regiones (Paneto et al. 2007). Las heteroplasmías de longitud se detectan frecuentemente en los tractos homopoliméricos de HVI y HVII, mientras que el STR dinucleotídico (AC)n, presenta un bajo grado de heterocigosidad. La utilidad forense de este microsatélite es reducida por su herencia inestable, ya que las heteroplasmías pueden aparecer y desaparecer en pocas generaciones (Szibor et al. 2007). En general, las heteroplasmías de longitud se detectan con más frecuencia (52%) que las heteroplasmías puntuales (6%), que habitualmente coinciden con las posiciones nucleotídicas más hipervariables (Irwin et al. 2009). Es importante, además, tener en cuenta que no todas las metodologías empleadas para detectar heteroplasmías presentan la misma sensibilidad. Por ejemplo, la secuenciación directa permite detectar heteroplasmías en las que la proporción del alelo minoritario se encuentre entre 10-20% (Bendall et al. 1996; Irwin et al. 2009), mientras que la pirosecuenciación presenta mucha mayor sensibilidad (1%) (White et al. 2005). Aunque pueden existir posiciones heteroplásmicas en cualquier muestra biológica, algunos tejidos son más susceptibles a sufrir mutaciones y por tanto a presentar dos variantes alélicas para una misma posición, ya sea por sus mayores requerimientos energéticos o por el efecto de cuellos de botella más marcados. Calloway et al. (2000) encontraron que el músculo esquelético era el tejido con mayor tasa de heteroplasmías, en comparación con tejido cardíaco, cerebral y sanguíneo, incrementando su frecuencia con la edad del individuo. También el pelo parece presentar tasas de heteroplasmía superiores al tejido sanguíneo, y las proporciones de las variantes alélicas pueden variar considerablemente entre INTRODUCCIÓN _________________________________ 22 distintas secciones de un mismo pelo (Paneto et al. 2007; Salas et al. 2001a; Tully et al. 2004). Puede que el concepto de homoplasmía sea más aparente que real ya que teniendo en cuenta el alto número de copias del ADNmt y a la elevada tasa de mutación de este genoma, es poco probable la existencia de un único tipo de ADNmt en un individuo. Sin embargo, recientemente han surgido estudios que sugieren que determinados artefactos, como mutaciones fantasma (Brandstätter et al. 2005) y detección de NUMTs (Parr et al. 2006), podrían provocar un porcentaje de heteroplasmías en los electroferogramas superior a la tasa real. 3 Análisis de la variabilidad del ADN mitocondrial De acuerdo con lo mencionado anteriormente, las diferencias entre secuencias de ADNmt son debidas únicamente a mutación, ya que este genoma no experimenta recombinación. El análisis de la variabilidad de este pequeño genoma ha despertado el interés de tres áreas de la genética: poblacional, forense y clínica. 3.1 Evolución de la metodología de genotipado del ADNmt La primera aproximación para el análisis de la variabilidad del ADNmt consistió en la digestión del ADN mediante un enzima de restricción (Denaro et al. 1981) y posterior separación electroforética (RFLPs o Restriction Fragment Length Polymorphisms). Esta metodología se utilizaba fundamentalmente con fines poblacionales, ya que se requería gran cantidad de ADN no degradado. A finales de la década de los años 80 y durante la de los 90, surgieron otras tecnologías para analizar la variabilidad del ADNmt como la SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) (Orita et al. 1989). Esta técnica se basa en la diferente movilidad de las hebras de ADN de una muestra previamente desnaturalizada sobre un gel de acrilamida, en función de la conformación que adopten dichas hebras durante el recorrido electroforético. Es una técnica de screening sencilla, barata y rápida, que se utilizó para la detección de mutaciones puntuales, pero presentaba una difícil estandarización entre laboratorios y sólo detectaba un 90% de las mutaciones. Posteriormente, se desarrollaron variaciones de esta técnica, _________________________________ INTRODUCCIÓN 23 como la RE-SSCP (Restriction Enzyme-SSCP)(Barros et al. 1997) o la FSSCP-OF (Fluorescent-SSCP-Overlapping fragments) (Salas et al. 2001b). El desarrollo de la técnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction) por Kari Mullis (1986) supuso un gran avance en el análisis de la variación genética, ya que permite obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular a partir de una cantidad reducida de muestra. Como consecuencia, se adaptaron las tecnologías de análisis de la variabilidad del ADNmt, surgiendo así, por ejemplo, la metodología PCR-RFLP (Torroni et al. 1992). El CSGE (Conformation-Sensitive Gel Electrophoresis) es una técnica, basada en un principio similar al SSCP, que permite hacer un screening para detectar polimorfismos o mutaciones (Finnilä et al. 2000). Consiste en la amplificación del fragmento de ADN de interés, la adición del fragmento correspondiente de una muestra de secuencia conocida, desnaturalización para permitir la formación de heterodúplex y separación mediante electroforesis. Estos heterodúplex migrarán de forma diferente en el gel de acrilamida si existen mutaciones, lo que permitirá determinar qué fragmentos se deben secuenciar. Sin embargo, el método de elección para la mayoría de los laboratorios fue la secuenciación, ya que permite conocer exactamente qué mutación está presente en el ADN. En el año 1977, se publicaron dos métodos de secuenciación distintos: secuenciación química (Maxam and Gilbert 1977) y secuenciación enzimática (Sanger et al. 1977). La secuenciación química se basa en la ruptura en bases específicas (A, T, G o C) de una molécula de ADN marcada en su extremo 5’ para generar una serie de fragmentos de diferentes longitudes que posteriormente se separan mediante electroforesis en gel. El otro método alternativo es la secuenciación enzimática, en la que se generan fragmentos de diferentes tamaños debido a la interrupción de la síntesis de una cadena de ADN en bases específicas, como consecuencia de la incorporación de análogos de nucleótidos. En la actualidad se utiliza casi universalmente el método dideoxy o enzimático, basado en la metodología de secuenciación de Sanger, puesto que puede aplicarse a fragmentos más grandes, es más rápida y permite ser automatizada. Este sistema requiere el uso de 2´-3´-dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs), que difieren de los deoxinucleótidos (dNTPs) en la sustitución del grupo INTRODUCCIÓN _________________________________ 24 3´-hidroxilo por un hidrógeno; además, cada uno de los cuatro ddNTPs posee marcajes fluorescentes diferentes. Los ddNTPs se añaden al extremo 3’ de la cadena creciente, pero al carecer del grupo 3´-hidroxilo no puede unirse el siguiente nucleósido 5´-trifosfato entrante, por lo que se detiene la síntesis. De esta manera, la inclusión de niveles bajos de dideoxinucleótidos en el medio permite que la síntesis de ADN termine al azar en cualquier sitio, obteniéndose cientos de fragmentos de longitudes que difieren en un único nucleótido. El sistema que se utiliza actualmente de forma mayoritaria es la secuenciación cíclica, que combina la técnica de la PCR con la secuenciación enzimática, y que incrementa la sensibilidad del método (Sullivan et al. 1991). Hasta hace relativamente poco tiempo, la región de elección para el análisis del ADNmt era el segmento hipervariable I (HVI) de la región control, definida por Vigilant (1989) y comprendida entre la posición 16024 y 16365, ya que era la región que presentaba un grado más alto de variación de secuencia (Sullivan et al. 1991). Posteriormente, se incorporó a la rutina el análisis de la región hipervariable II (HVII) situada entre las posiciones 73 y 340, de manera que pasaban a evaluarse alrededor de 610pb, aumentando así el poder de discriminación. Sin embargo, la tendencia es poder analizar cada vez más posiciones, y así en estos últimos años la recomendación es secuenciar la región control completa, comprendida entre la posición 16024 hasta la 16569 y desde la 1 hasta la 576. Sin embargo, a pesar de que la región control del ADNmt es el área con mayor variabilidad de secuencia, tiene un poder de discriminación limitado, no sólo en el contexto forense, sino también desde un punto de vista antropológico o clínico. Esto depende en gran medida de la población de estudio, ya que la filogenia varía enormemente entre las distintas poblaciones, pero algunos haplogrupos están muy mal definidos en las regiones hipervariables, de manera que perfiles que coincidan en estas regiones no tienen por qué pertenecer necesariamente al mismo haplogrupo ni por supuesto al mismo individuo (Álvarez-Iglesias et al. 2009; Quintáns et al. 2004). Además, la región control presenta la tasa de mutación más alta del genoma mitocondrial, por lo que son frecuentes las posiciones recurrentes en la filogenia (homoplasia), pudiendo llevar a errores de interpretación (Chen et al. 1995). _________________________________ INTRODUCCIÓN 25 La situación ideal, sería poder secuenciar siempre genomas completos, sin embargo esto es muy laborioso, costoso y requiere gran cantidad de muestra, por lo que resulta totalmente inviable en la rutina forense y poco frecuente en otros contextos. El análisis de SNPs de la región codificante del genoma mitocondrial ha resultado ser una buena estrategia para solventar estos problemas. El creciente interés por estos marcadores en los últimos años ha ido paralelo al espectacular desarrollo de nuevas tecnologías para su genotipado, que permiten el análisis de varios marcadores a la vez mediante multiplex. El abanico de tecnologías para el genotipado de SNPs actualmente es enorme, sin embargo, a la hora de seleccionar la metodología más adecuada deben tenerse en cuenta aspectos como la sensibilidad, reproducibilidad, precisión, capacidad para analizar reacciones multiplex, volumen de SNPs, calidad/cantidad de las muestras, coste y flexibilidad de la tecnología (Sobrino et al. 2005). En el caso del ADNmt el método más popular para el análisis de la variabilidad de la región codificante es la técnica de minisecuenciación, concretamente empleando el kit de SNaPshotTM (Applied Biosystems). La estrategia de minisecuenciación o SBE (Single Base Extension) es un sistema de detección de SNPs basado en la adición de un único dideoxinucleótido (ddNTP), marcado fluorescentemente, al extremo 3’ de un primer específico y adyacente al polimorfismo. La reacción multiplex puede llevarse a cabo porque los productos de minisecuenciación llevan incorporadas colas no homólogas en su extremo 5´ que permiten que puedan ser separados por tamaño mediante electroforesis en los secuenciadores automáticos. INTRODUCCIÓN _________________________________ 32 y/o menor presión selectiva, pueden aparecer más de una vez en la filogenia (homoplasia). Por ello, una clasificación basada en un bajo número de polimorfismos, especialmente si se encuentran en la región control, puede oscurecer y dificultar la interpretación de la filogenia, de forma que es recomendable considerar la variabilidad del ADNmt en conjunto (Chen et al. 1995; Finnilä et al. 2001; Salas et al. 2007). Hasta hace relativamente poco tiempo, la mayor parte de los estudios de la variación del ADNmt en las distintas poblaciones humanas se habían realizado principalmente por dos métodos: secuenciación directa de la región control (Salas et al. 1998; Vigilant et al. 1991) o por amplificación de la molécula completa de ADNmt en fragmentos solapantes y posterior digestión con enzimas de restricción (Chen et al. 1995; Torroni et al. 1992). En los últimos años, han surgido nuevas tecnologías de alto rendimiento, como CSGE seguido de secuenciación (Finnilä et al. 2001) o secuenciación de genomas completos, que permiten explorar un mayor porcentaje o la totalidad de la variabilidad del genoma mitocondrial, respectivamente. Esta última estrategia es muy laboriosa y supone un gran esfuerzo económico, sin embargo desde sus comienzos (Maca-Meyer et al. 2001; Rieder et al. 1998; Torroni et al. 2001), el número de publicaciones en las que se ha empleado esta metodología ha aumentado considerablemente (Achilli et al. 2008; Álvarez-Iglesias et al. 2009; Herrnstadt et al. 2002; Kong et al. 2006; Yao et al. 2006). Teniendo en cuenta el esfuerzo que supone trabajar con genomas completos, resulta una buena estrategia combinar los datos de la región control con posiciones concretas de la región codificante, analizadas tradicionalmente con RFLPs y en los últimos años con otras tecnologías como la minisecuenciación con SNaPshotTM (AB) (Álvarez- Iglesias et al. 2007; Álvarez-Iglesias et al. 2009; Brandstätter et al. 2003; Quintáns et al. 2004; Roostalu et al. 2007). 4.3 Principales aportaciones del ADNmt en genética de poblaciones A partir del estudio de la variación genética del genoma mitocondrial se ha avanzado de forma considerable en el conocimiento de eventos tan importantes _________________________________ INTRODUCCIÓN 33 como el origen del hombre moderno y los movimientos migratorios que dieron lugar a la colonización de los distintos continentes. También este genoma ha permitido datar estos y otros acontecimientos gracias al empleo de estimas de la tasa de mutación de este marcador. 4.3.1 Origen del hombre moderno En 1981 se publica el primer trabajo (Denaro et al. 1981) en el que se trata de establecer las relaciones filogenéticas entre las poblaciones “africana”, “oriental” y “caucásica” estudiando la variabilidad del ADNmt mediante el uso de un enzima de restricción. Encontraron diferencias en las frecuencias de los fragmentos originados entre los distintos grupos étnicos y sugirieron que todos derivaban de un origen asiático. Rebecca Cann et al., en 1987, siguiendo una línea similar al trabajo anterior, digieren el ADNmt de individuos de poblaciones de Asia, Australia, Nueva Guinea, Europa y África con 12 enzimas de restricción, lo que le permite analizar un mayor porcentaje de la variabilidad de este genoma (Cann et al. 1987). En base a los resultados obtenidos, formulan una hipótesis (bautizada como la hipótesis de la “Eva mitocondrial” en el argot periodístico) que propone que todos los tipos de ADNmt actuales se remontan a un único ancestro que vivió en África hace aproximadamente 200000 años. La hipótesis formulada por Cann et al. está basada en el principio de coalescencia según el cual, asumiendo que hubo un origen único para todos los organismos vivos, se deduce que toda la variación en cualquier segmento del ADN mitocondrial (o nuclear) en las generaciones presentes deben proceder en última instancia de un único ancestro que existió en generaciones previas. El árbol filogenético resultante de este trabajo tiene una especial relevancia ya que sitúa por primera vez los ADNmt africanos en la raíz del árbol y posteriormente se separan las diferentes ramas no africanas. Aunque actualmente esta hipótesis es la aceptada mayoritariamente, existió mucho debate entre estas dos corrientes contrapuestas: • Hipótesis multiregional: propone que, después de la salida de África y posterior dispersión del Homo erectus, características anatómicamente modernas fueron surgiendo en diferentes regiones y se difundieron entre las INTRODUCCIÓN _________________________________ 34 poblaciones gracias al flujo génico entre ellas. Esto explicaría el patrón de evolución compartido entre los humanos mordernos y a su vez las diferencias regionales. Esta hipótesis rechaza totalmente la sustitución total de las formas primitivas por las modernas y está apoyada por evidencias fósiles de continuidad cultural y morfológica entre humanos primitivos y modernos fuera de África (Templeton 1997; Wolpoff et al. 2000). • Hipótesis del origen africano reciente o “Out of Africa”: postula que el hombre moderno se originó en África hace 100000-200000 años y que posteriormente se dispersó por el resto del Viejo Mundo reemplazando las formas humanas primitivas, con poca o ninguna mezcla genética. Esta interpretación ha sido tremendamente controvertida, fundamentalmente debido a la utilización de determinados métodos de reconstrucción filogenética, pero el volumen de evidencias genéticas a favor de esta hipótesis hace que sea la más aceptada. Poco más tarde Vigilant et al. (1991) secuenciaron la región control de 189 individuos de diverso origen geográfico y de nuevo en este trabajo se separan las ramas africanas de las no africanas, situándose las primeras en la base del árbol filogenético. Estudios de PCR-RFLP (Chen et al. 1995; Torroni et al. 1992) revelaron que la mayoría de los ADNmt africanos, asiáticos, europeos y americanos están definidos por al menos un polimorfismo específico de continente. Su alta frecuencia dentro de los principales grupos continentales permite inferir el origen étnico y geográfico, y surgiere que aparecieron posteriormente a la separación de las poblaciones ancestrales humanas que dieron lugar a los principales grupos étnicos modernos. Estudios en los que se analiza el genoma mitocondrial completo (Finnilä et al. 2001; Ingman et al. 2000; Maca-Meyer et al. 2001), apoyan también la hipótesis Out of Africa ya que encuentran que la población africana presenta una mayor diversidad de secuencia como resultado de un tamaño poblacional elevado y constante o de una historia genética más larga. Por el contrario, poblaciones no africanas presentan una filogenia “tipo estrella”, lo que sugiere que sufrieron un cuello de botella a partir del cual recientemente experimentaron una expansión poblacional. _________________________________ INTRODUCCIÓN 35 Hoy en día se acepta que, como consecuencia de las mutaciones que han ido emergiendo en las secuencias a medida que el hombre moderno colonizaba el planeta, los haplogrupos presentan una especificidad geográfica considerable y se pueden asociar con los principales grupos étnicos. De esta forma podemos decir que los haplogrupos L1, L2 y L3 agrupan los linajes de África sub-Sahariana; H, I, J, K, T, U, V, W, y X, engloban la mayoría de los haplogrupos de las poblaciones de Europa, Norte de África y oeste de Asia central y A, B, C, D, E, F, G y M son los haplogrupos que engloban la mayor parte de los linajes de Asia, Oceanía y nativo americanos. Las estimas obtenidas en relación a la edad del antepasado común más reciente o TMRCA (Time to the Most Recent Common Ancestor) para los humanos modernos varían considerablemente entre los diferentes estudios, ya que las tasas de sustitución empleadas también son distintas y fueron mejorando progresivamente: 171500±50000 (Ingman et al. 2000), 198000 ± 19000 (Mishmar et al. 2003), 204700±22100 (Macaulay et al. 2005), 192400±41000 (Soares et al. 2009). 4.3.2 Rutas de dispersión y colonización del planeta El análisis de la variación del genoma mitocondrial también ha contribuido al conocimiento de las rutas de dispersión de las poblaciones humanas. Existen tres hipótesis principales y con el paso del tiempo el peso que ha recibido cada una de ellas ha ido variando, como consecuencia de la aparición de nuevos datos, tanto genéticos como arqueológicos: • Ruta Norte: esta ruta consistiría en la dispersión por el norte de África y Levante, hace aproximadamente 45000 años, y a partir de aquí se habrían dispersado hacia Europa y Asia. De esta forma, todos los haplotipos mitocondriales actuales tendrían que hacer coalescencia en los ADNmt fundadores que llegaron a estas regiones. • Ruta Sur: esta hipótesis propone una dispersión por la costa sur de Asia, procedente del este de África, hace unos 60000 años aproximadamente. A partir de aquí habrían surgido el resto de los ADNmt que podemos encontrar hoy en día (Macaulay et al. 2005). INTRODUCCIÓN _________________________________ 36 • Dos oleadas de dispersión: según esta hipótesis, la colonización del hombre moderno se explicaría mediante las dos rutas anteriores, de forma que primero (hace unos 60000 años) hubo una ola de dispersión por la costa sur de Asia, dando lugar a los tipos de ADNmt del sur y este de Asia, y de Oceanía, y posteriormente (hace 45000 años) otra corriente de dispersión tuvo lugar por el norte de África hasta Oriente Medio, desde donde surgieron movimientos migratorios hacia el norte de Asia y hacia Europa (Maca-Meyer et al. 2001). El ADNmt también ha contribuido al conocimiento de la colonización del Nuevo Mundo (Perego et al. 2009; Torroni et al. 1992), las migraciones iniciales a Nueva Guinea y Australia (Ingman and Gyllensten 2003) y el asentamiento en Europa (Torroni et al. 2006). Figura 6: Representación gráfica de las rutas generales de dispersión de los linajes mitocondriales. Imagen modificada de http://www.familytreedna.com. 4.4 Limitaciones del ADNmt A pesar de que este genoma ha sido y continúa siendo de gran utilidad en el área de la genética de poblaciones, no hay que olvidar que, por sus características propias, se trata de un único marcador y además uniparental. Esto significa que las conclusiones extraídas de su análisis deben ser interpretadas en la medida que _________________________________ INTRODUCCIÓN 37 este locus lo permite. El hecho de ser un único marcador y de no presentar recombinación, facilita su análisis e interpretación de los datos, pero también hay que tener presente que no representa la historia global de las poblaciones humanas sino una historia parcial del componente femenino de dichas poblaciones. Por otra parte, el hecho de que la tasa de mutación varíe considerablemente entre posiciones específicas dificulta la obtención de una estima de la tasa de sustitución promedio para toda la molécula, necesaria para el cálculo de la edad de coalescencia entre dos ramas de la filogenia. 5 Aplicaciones forenses de la variabilidad del genoma mitocondrial 5.1 Generalidades La genética forense consiste en la aplicación de los conocimientos de la genética a la resolución de problemas judiciales, y dentro de ella pueden englobarse diferentes pericias: investigación biológica de parentesco, estudio de vestigios biológicos de interés criminal e identificación genética. Esta área de conocimiento ha avanzado de forma considerable desde sus comienzos, tanto en lo que se refiere al tipo de marcadores analizados como la cantidad/calidad de la muestra requerida. Inicialmente, la genética forense se basaba en el estudio de marcadores genéticos clásicos, antígenos sanguíneos (sistemas AB0, MNS, Rh,…) y proteínas séricas. En la década de los setenta, el análisis de los grupos enzimáticos, obtenidos a partir de hemólisis de eritrocitos, experimentó un gran desarrollo. Sin embargo, estos sistemas aportaban poca información ya que su variabilidad es limitada, por lo que el descubrimiento del sistema HLA (antígenos de los leucocitos humanos) supuso un gran avance para la práctica forense, ya que era el sistema antigénico más polimórfico conocido hasta esa fecha. INTRODUCCIÓN _________________________________ 38 Wyman y White (1980) introdujeron el concepto de identificación genética a través del estudio de RFLPs (Restriction Fragment of Length Polymorphism) y el empleo de estos marcadores genéticos sustituyó en gran medida el uso de los marcadores proteicos clásicos. Las ventajas que aportaba el análisis del ADN eran su mayor variabilidad y estabilidad molecular, ya que las proteínas son más sensibles a la degradación. Poco más tarde, Jeffreys et al. (1985) describieron un método de identificación individual que denominaron “DNA fingerprinting” o huella genética, con importantes aplicaciones en la investigación biológica de la paternidad y en criminalística. Utilizando sondas multilocus analizaban minisatélites situados en diferentes regiones del genoma, obteniendo un patrón de bandas prácticamente específico para cada individuo. Debido a su difícil estandarización e interpretación, se pasaron a analizar RFPLs mediante sondas unilocus, por lo que se necesitaban varias sondas para conseguir el mismo poder de discriminación. Poco después del descubrimiento de la huella genética, la introducción de la PCR permitió el análisis de loci hipervariables (minisatélites y microsatélites) a partir de vestigios biológicos que no podían ser analizados hasta el momento, debido a la limitada cantidad de ADN que podía obtenerse en la mayoría de los escenarios forenses. 5.2 Tipo de marcadores genéticos El estudio de los polimorfismos de ADN se ha centrado mayoritariamente en el análisis de marcadores nucleares, especialmente aquellos situados en cromosomas autosómicos; sin embargo para situaciones concretas (agresiones sexuales) el análisis de polimorfismos de cromosomas sexuales es de gran utilidad. Hoy en día, los marcadores autosómicos de elección son los STRs, aunque en muestras donde no se ha podido obtener un perfil satisfactorio, los SNPs se han posicionado como marcadores alternativos de gran importancia (Musgrave-Brown et al. 2007; Sánchez et al. 2006). En ocasiones, especialmente en contextos forenses, las muestras han estado expuestas a condiciones tan adversas que el análisis del ADN nuclear es inviable debido a su alto grado de degradación o a su escasa cantidad, a veces incluso _________________________________ INTRODUCCIÓN 39 inexistente (pelos sin bulbo). En estos casos, el ADNmt representa prácticamente la única herramienta genética disponible ya que, gracias a sus características, aumenta las probabilidades de éxito del análisis. El genoma mitocondrial puede aportar información de gran utilidad, y en algunas ocasiones suficiente (junto con otras evidencias), para el establecimiento de la identidad o fuente de un determinado espécimen biológico, jugando un papel crucial en la identificación forense. Un ejemplo conocido de la utilidad de este marcador uniparental en el campo forense lo constituye la identificación de los restos del Zar Nicolás II y su familia, los últimos miembros de la dinastía Romanov, asesinados en 1918 a raíz de la revolución Bolchevique (Coble et al. 2009; Gill et al. 1994). 5.3 Utilidad y limitaciones del ADNmt Son varias características de este pequeño genoma las responsables de su gran utilidad a la hora de analizar muestras degradadas, pelos sin bulbo, material esquelético parcialmente degradado o restos fósiles muy antiguos: • Alto número de copias: frente a las dos copias del genoma nuclear y una copia del cromosoma Y. • Su localización en el citoplasma permite el análisis de este genoma en aquellas células que han perdido el núcleo. El principal ejemplo en la práctica forense son los pelos sin bulbo. A lo largo del pelo, su composición va variando ya que se trata de un tejido vivo que se va queratinizando a medida que crece, por ello las células de la zona distal pierden su núcleo y su ADNn. • La elevada tasa de mutación del ADNmt en comparación con el ADNn ha generado un considerable número de polimorfismos en relación al pequeño tamaño del genoma mitocondrial, lo que aumenta el poder de discriminación. • La herencia uniparental y la ausencia de recombinación del ADNmt, permiten la comparación de miembros de un linaje que comparten un ancestro común por vía materna. INTRODUCCIÓN _________________________________ 40 • Su pequeño tamaño facilita la automatización de su análisis, que suele consistir en la amplificación mediante PCR y la secuenciación automática de pequeñas regiones hipervariables y considerablemente informativas (HVI y HVII). Además, en los últimos años ha surgido un gran número de nuevas tecnologías para el genotipado de SNPs, lo que permite aumentar el poder de discriminación del genoma mitocondrial. Sin embargo, las mismas características que hacen que este genoma presente ventajas en situaciones concretas, hacen que en aquellos casos en los que se disponga de ADNn, éste sea el genoma de elección: • Como consecuencia de heredarse por vía materna y no recombinar, el ADNmt sólo aporta información del linaje materno, pero no permite individualizar dentro de éste. • El poder de discriminación no es comparable al del genoma nuclear. • Otra limitación importante es la falta de bases de datos que proporcionen estimas fiables en relación a la frecuencia de un perfil en la población, o a la tasa de mutación sitio-específica. A pesar de ello, existen revisiones con listas de las principales posiciones hotspots que pueden servir de ayuda en el contexto forense (Salas et al. 2007; Soares et al. 2009). • La elevada tasa de mutación de este genoma también puede provocar la aparición de mutaciones somáticas que pueden oscurecer la comparación entre la muestra dubitada y la indubitada, por lo que una única diferencia no supone una evidencia concluyente de exclusión (Paneto et al. 2007). De hecho, se han detectado diferencias en la proporción de las variantes alélicas de una posición heteroplásmica en distintas secciones de un mismo pelo (Salas et al. 2001a), llegando alguna a suponer un cambio de base completo (Tully et al. 2004). Por ello, siempre que sea posible, es recomendable analizar más de una muestra de cabello para confirmar el perfil genético y tener en cuenta las tasas de mutación sitio-específicas. Es necesario destacar la importante labor de grupos como la ISFG o el grupo EDNAP en el ámbito forense, tanto en lo que se refiere al desarrollo de recomendaciones (Carracedo et al. 2000; Parson and Bandelt 2007; Tully et al. _________________________________ INTRODUCCIÓN 41 2001) como la organización de ejercicios colaborativos inter-laboratorio (GHEPISFG). 6 Aplicaciones clínicas de la variabilidad del genoma mitocondrial 6.1 Enfermedades mitocondriales Se puede considerar el trabajo de Luft et al. (1962) como el comienzo de lo que hoy se entiende por “enfermedades mitocondriales”, ya que por primera vez se asocia un estado clínico complejo con un defecto en el control respiratorio mitocondrial. Actualmente ya se conoce un número bastante elevado de desórdenes mitocondriales, clínicamente heterogéneos, que surgen como resultado de la disfunción de la cadena respiratoria mitocondrial. La mitocondria tiene entre 1000 y 3000 proteínas, implicadas en rutas metabólicas importantes, además de la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa. Estas proteínas están codificadas en su mayoría por el genoma nuclear, sin embargo, también la pequeña molécula de ADN mitocondrial codifica para 13 proteínas mitocondriales, por lo que mutaciones en cualquiera de los dos genomas pueden provocar desórdenes mitocondriales. Esta circunstancia condiciona que las enfermedades mitocondriales sigan un patrón de transmisión particular, de forma autosómica, para las alteraciones que tienen lugar en el ADNn, y herencia materna para mutaciones del ADNmt (Herrnstadt and Howell 2004). Estas enfermedades mitocondriales suelen afectar a varios órganos, principalmente al sistema nervioso y muscular. Los desórdenes mitocondriales pueden aparecer a cualquier edad, aunque en general se presentan en edades tempranas cuando la mutación causante es nuclear y durante la adolescencia o edad adulta cuando se trata de una mutación mitocondrial (Patrick Chinnery; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=gene&log$=disease_name& part=mt-overview). En 1988 se asociaron por primera vez mutaciones en el ADNmt con enfermedades humanas (Holt et al., 1988) y desde entonces ha ido creciendo el INTRODUCCIÓN _________________________________ 48 En los últimos años, se ha publicado un número considerable de estudios de asociación que intentan relacionar la variabilidad del genoma mitocondrial con el riesgo de padecer cáncer. Las hipótesis propuestas para explicar esta posible asociación, al igual que para otras enfermedades complejas, tienen su base en el metabolismo energético y la muerte celular programada. Esta idea nace en 1926 cuando Warburg establece que las células cancerosas presentan deficiencias respiratorias y sugiere que pueden ser consecuencia de daños en la mitocondria y una función afectada de la misma. Este fenómeno, conocido como efecto Warburg y caracterizado por el aumento de la glicólisis para producir ATP y por un desequilibrio redox, ha sido el punto de partida para dirigir la búsqueda de los defectos genéticos causantes del cáncer hacia el genoma mitocondrial (Carew and Huang 2002). Actualmente la hipótesis propuesta de forma generalizada consiste en que las variantes del ADNmt modificarían sutilmente la eficiencia de la cadena respiratoria de tal forma que se desacoplaría el equilibrio entre producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la capacidad de detoxificación de las enzimas mitocondriales. Las especies reactivas de oxígeno provocan un mayor estrés oxidativo para la célula, estado que a su vez está relacionado con el daño a macromoléculas celulares (oxidación de proteínas y peroxidación de lípidos) y a sus sistemas genéticos (ADNn y ADNmt), favoreciendo así la consiguiente disfunción mitocondrial. En último término la consecuencia de la variabilidad mitocondrial sería el desarrollo del cáncer (Carew and Huang 2002). En el caso del cáncer de mama se ha propuesto que pueda tener lugar una mayor producción de ROS a nivel local como consecuencia del metabolismo de hormonas (estradiol), lo que podría constituir un efecto adicional (Canter et al. 2005). En 2005 se publicó un trabajo (Canter et al. 2005) en el que estudiaron una variante del ADNmt (10398A) en relación con el riesgo de padecer cáncer de mama en mujeres afroamericanas. Analizaron 654 casos de cáncer de mama invasivo y 605 controles y encontraron asociación estadísticamente significativa (p-valor=0’013). No pudieron confirmar la asociación en una muestra de mujeres “blancas”, por lo que los autores propusieron que el alelo A de este polimorfismo _________________________________ INTRODUCCIÓN 49 solamente confería riesgo a padecer la enfermedad a mujeres afroamericanas mediante interacción con otros factores genéticos o ambientales. En un trabajo posterior (Bai et al. 2007), se analizaron 156 casos de cáncer de mama familiar y 260 controles, ambos grupos formados por mujeres americanas de ascendencia europea, para los cuales se genotiparon determinadas variantes del genoma mitocondrial, algunas de ellas diagnóstico de los principales haplogrupos mitocondriales europeos. Encontraron que tres mtSNPs estaban asociados significativamente con la enfermedad, dos de ellos (9055A y 16519C) confiriendo susceptibilidad frente a la misma, mientras que el 3197C poseía un efecto protector. Mediante un modelo de regresión logística, detectaron que el 13708A aportaba protección frente al cáncer de mama familiar, mientras que el 10398G confería un mayor riesgo. Al evaluar los haplogrupos asociados, encontraron que los individuos pertenecientes al haplogrupo K presentaban mayor riesgo, mientras que los individuos pertenecientes al haplogrupo U presentaban protección. Recientemente ha sido publicado un estudio (Covarrubias et al. 2008) cuyo objetivo era demostrar que la interacción entre diferentes variantes del genoma mitocondrial modifica el riesgo de padecer cáncer de mama. Para ello, emplearon los datos del trabajo anterior (Bai et al. 2007), si bien esto no se dice de forma explícita, y evaluaron las interacciones dos a dos mediante un modelo de regresión logística. Encontraron que el 10398G, de forma individual, representa un aumento de riesgo de padecer cáncer de mama, al igual que la interacción 12308G-10398G (estadísticamente significativa), mientras que 12308G-10398A presentan un efecto protector. Además, parece que el haplogrupo T (12308A-10398A, entre otros polimorfismos) no tiene efecto sobre el riesgo a padecer cáncer de mama, mientras que el haplogrupo U (12308G-10398A) parece poseer un efecto protector. Estos estudios requieren, sin embargo, una reflexión sobre el verdadero significado de una interacción en un contexto haplotípico y, dado que se tratan de los mismos datos, no deben considerarse como evidencias independientes a favor de la asociación del ADNmt con cáncer de mama (comunicación personal de Antonio Salas; datos todavía sin publicar). En los últimos años se han publicado nuevos trabajos intentando descifrar el papel que juega el mtSNP A10398G en relación al cáncer de mama. Setiawan et al. INTRODUCCIÓN _________________________________ 50 (2008), en un estudio de tamaño muestral considerable (1457 casos y 978 controles, distribuidos en tres estudios), no detectaron asociación entre el alelo A y la enfermedad en tres poblaciones de afroamericanas. Czarnecka et al. (2009) genotiparon este SNP en población polaca (44 casos y 100 controles) mediante PCR-RFLP y encontraron una alta asociación estadística entre el alelo G y el riesgo a padecer esta enfermedad. Pezzotti et al. (2009) no detectaron asociación entre el SNP y el riesgo a padecer cáncer de mama en ninguno de los dos estudios (NHS: 1561 casos y 2209 controles; WHS: 678 casos y 669 controles). Sin embargo, analizando la posible interacción con el consumo de alcohol, encontraron que las mujeres no bebedoras presentan menor riesgo de padecer cáncer de mama (21%) si presentan el alelo G en comparación con el alelo A, y que el riesgo aumenta un 56% si portadoras del alelo G consumen alcohol. En resumen, no se han podido replicar adecuadamente las asociaciones detectadas entre el ADNmt y el cáncer de mama, por lo que es difícil sacar conclusiones sobre el papel que juega el genoma mitocondrial en el desarrollo o progresión del cáncer de mama. 6.2.2 Estudios de asociación entre variantes del ADNmt y esquizofrenia La esquizofrenia es un desorden psiquiátrico con una prevalencia del 0’72%, que suele aparecer en la adolescencia tardía y que habitualmente cursa como una enfermedad crónica. Clínicamente es muy heterogénea entre individuos, con una gran variabilidad en la presentación sintomática, e incluso la sintomatología de un individuo puede variar a lo largo de su vida. La heredabilidad de esta enfermedad es del 80% aproximadamente, de forma que los factores de riesgo genéticos juegan un papel importante en el desarrollo de esta enfermedad. La mayoría de los estudios genéticos relacionados con esta enfermedad se basan en análisis de asociación y de ligamiento centrándose en regiones cromosómicas. A pesar de que algunos de ellos han dado resultados positivos y bien replicados, como es el caso de la implicación del sistema dopaminérgico y la posible interacción con otros neurotransmisores, aún no se ha encontrado la causante genética de la esquizofrenia (Costas et al. 2009). _________________________________ INTRODUCCIÓN 51 Como consecuencia de que los loci del genoma nuclear identificados hasta el momento solamente explican una pequeña proporción del riesgo genético de la esquizofrenia, algunos autores han empezado a mirar hacia el otro genoma celular como posible responsable, al menos en parte, de este desorden psiquiátrico. La hipótesis de la implicación del ADNmt en la susceptibilidad genética para la esquizofrenia está apoyada desde varias perspectivas, algunas de las cuales también se proponen para otros desórdenes psiquiátricos (Ben-Shachar 2002; Martorell et al. 2006): • Algunas evidencias sugieren una mayor transmisión materna de este desorden psiquiátrico, ya que el riesgo de tener descendencia con esquizofrenia es mayor si la madre padece la enfermedad que si la padece el padre. Además, el hecho de que la prevalencia de la esquizofrenia sea del 1%, a pesar de que de que la capacidad reproductiva de los pacientes está disminuida (especialmente en varones) y que la mortalidad sea más elevada en jóvenes, ha llevado a sugerir que la transferencia de genes de susceptibilidad pueda involucrar a la línea materna (Doi and Hoshi 2007). • Importancia de la mitocondria en la función neuronal. Las neuronas tienen una membrana celular excitable, polarizada, que permite la entrada de iones desde el espacio extracelular, pudiendo responder así a estímulos exteriores. El mantenimiento de este gradiente es energéticamente muy costoso, por lo que se ha sugerido que un estado energético anormal, como consecuencia de la disfunción mitocondrial, podría causar alteraciones en la función de las neuronas, en su plasticidad y en el circuito cerebral. Esto podría explicar las aberraciones cognitivas y de comportamiento características de la esquizofrenia. • Hipoplasia mitocondrial: deformación y reducción del número de mitocondrias • La esquizofrenia parece compartir varias características con las enfermedades mitocondriales:  Patogénesis en cerebro: metabolismo energético disminuido en el cerebro.  Expresión alterada de genes relacionados con la mitocondria.  Severidad variable. INTRODUCCIÓN _________________________________ 52  Detección de síntomas psiquiátricos en pacientes con enfermedades mitocondriales. • Interacción entre la dopamina, uno de los principales factores etiológicos de la esquizofrenia, y la respiración mitocondrial. Parece que el tratamiento con antipsicóticos, que bloquean los receptores de dopamina D2, reduce la actividad del complejo I de la cadena de transporte de electrones. Marchbanks et al. (2003) genotiparon una variante del gen ND4 (12027T>C) del ADNmt, previamente detectada en heteroplasmía en un paciente con esquizofrenia, en 181 casos de esta enfermedad y 184 controles mediante PCRRFLP. Encontraron una elevada frecuencia de esta variante en heteroplasmía en pacientes (81/181), a pesar de que la frecuencia también era considerablemente alta en el grupo control (43/184). La frecuencia de esta posición heteroplásmica también variaba en función del sexo del paciente, y sugirieron que la población femenina es menos sensible a la presencia de una variante en términos de predisposición para la esquizofrenia, ya que el 38% de los controles femeninos presentaban la heteroplasmía. Poco después, Bandelt et al. (2005c), a raíz de las inconsistencias detectadas en el trabajo anterior (Marchbanks et al. 2003), hicieron hincapié en la importancia de tener en cuenta una serie de medidas para interpretar adecuadamente los datos en un estudio de caso-control antes de concluir la existencia de asociación entre una mutación y una enfermedad. En este tipo de literatura los principales problemas son artefactos de genotipado (digestión enzimática parcial, lectura de secuencias en una sola dirección), ausencia de evaluación filogenética de las mutaciones, no tener en cuenta criterios de patogenicidad o ausencia de estudios funcionales. En un trabajo del 2006 (Martorell et al. 2006) se secuenció el genoma mitocondrial completo de seis pacientes con aparente transmisión materna de esquizofrenia, para ver si eran portadores de mutaciones que pudieran contribuir a la disfunción mitocondrial descrita en este desorden. Encontraron tres mutaciones sin sentido (missense), que se analizaron mediante RFLPs en 95 controles y observaron que solamente la variante T12096A estaba conservada evolutivamente y podía suponer un cambio en la estructura de la subunidad ND4 _________________________________ INTRODUCCIÓN 53 del complejo I. Concluyen que variantes en subunidades del complejo I pueden estar asociadas con desórdenes psicóticos o que la presencia o acumulación de determinadas variantes puede contribuir a la base genética de síntomas específicos de la esquizofrenia. De nuevo, Bandelt et al. (2007), a partir del trabajo de Martorell et al. (2006) proponen evaluar detenidamente las posibles causas de una asociación positiva falsa antes de interpretar prematuramente los datos. Es fundamental eliminar la posibilidad de contaminación cruzada secuenciando fragmentos ampliamente solapantes en ambas direcciones, tener precaución con los resultados de RFLPs y revisar las variantes halladas desde una perspectiva filogenética, siempre comparándolas con rCRS. En 2007 se publica un trabajo (Magri et al. 2007) en el que se pretendía determinar si existían diferencias en la distribución de haplogrupos mitocondriales entre 190 controles y 142 pacientes con esquizofrenia. No encontraron asociación estadística entre ningún haplogrupo y el riesgo a padecer este desorden, aunque sí observaron que individuos pertenecientes al haplogrupo J-T presentaban una edad de aparición de la enfermedad más temprana. En este trabajo no detectaron la variante T12096A hallada en el trabajo de Martorell (2006) en ninguno de los pacientes que parecían presentar herencia materna de la enfermedad (N=13). En un estudio similar (Amar et al. 2007) con población árabe de Israel, observaron que el haplogrupo HV, el linaje más prevalente en esta población, se hallaba sobre-representado en el grupo de pacientes con esquizofrenia, aportándoles un riesgo relativo de 1’8. Bamne et al. (2008), en una primera etapa, secuenciaron el genoma completo de 180 casos de esquizofrenia y 180 controles en pools de ADN, y encontraron dos polimorfismos (G13368A y G13708A) del gen ND5 que podrían sugerir una tendencia en las frecuencias alélicas. En una segunda etapa, secuenciaron el gen ND5 en el primer conjunto de muestras, y en un segundo set compuesto por 244 casos y 508 controles. No encontraron diferencias en las frecuencias alélicas de ninguno de los dos polimorfismos iniciales ni de otras variantes no sinónimas. INTRODUCCIÓN _________________________________ 54 Los autores de un estudio reciente (Ueno et al. 2009) analizaron el genoma mitocondrial completo de 93 casos de esquizofrenia y examinaron la distribución de los principales linajes mitocondriales entre estos pacientes y 784 controles para evaluar la posible asociación entre variantes raras o comunes del ADNmt y la patogénesis de la esquizofrenia. Encontraron tres variantes homoplásmicas raras de la subunidad 6 de la ATP sintasa conservadas evolutivamente (T8843C, G8902A y T8945C) que podrían ser ligeramente deletéreas y tres variantes heteroplásmicas nuevas (G1227A, T5578C, G13418A) potencialmente patogénicas. Sin embargo, no encontraron una distribución de haplogrupos significativamente diferente entre casos y controles. Los trabajos que defienden asociaciones entre el ADNmt y diferentes enfermedades complejas superan mucho en número a aquellos estudios que muestran mayor escepticismo, sin embargo, es necesario ser cautos a la hora de formular conclusiones. Algunos autores pretenden llamar la atención sobre la enorme importancia de interpretar adecuadamente los resultados obtenidos en un estudio de asociación (Bandelt et al. 2007; Bandelt et al. 2009; Bandelt et al. 2005c; Salas et al. 2005b). 6.2.3 Enfermedades infecciosas La variabilidad del genoma mitocondrial se ha asociado recientemente con varias enfermedades infecciosas, entre ellas sepsis severa, SIDA o tuberculosis. La sepsis o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) es un síndrome clínico caracterizado por el fallo multiorgánico tras una infección microbiológica. Es un desorden muy común en el ámbito hospitalario y es una de las principales causa de muerte en pacientes de Unidades de Cuidados Intensivos (UCI). Existen numerosas publicaciones que sugieren la relación entre la disfunción mitocondrial y la sepsis, basándose en: • Parece que la disfunción multiorgánica en la sepsis severa está relacionada con una hipoxia citopática (disoxia), es decir, un deterioro en la respiración celular a pesar de los niveles adecuados de oxígeno a nivel tisular. _________________________________ INTRODUCCIÓN 55 • Se piensa que para una respuesta inmune efectiva ante una sepsis se requiere una gran cantidad de energía. • Se ha propuesto que una posible causa de sepsis y shock séptico pueda ser una respuesta inmune e inflamatoria excesiva caracterizada por altos niveles de ROS, óxido nítrico (NO) y citoquinas. Las consecuencias de esto serían daño al endotelio vascular, respiración tisular disminuida y disfunción de la respiración mitocondrial (menos ATP y consumo de O2). • Se detectaron anormalidades estructurales y bioquímicas en mitocondrias de pacientes sépticos, y reducida actividad de las enzimas mitocondriales en tejido muscular. Posteriormente se asoció la variabilidad del genoma mitocondrial y la sepsis, basándose en supuestos cambios en las actividades de los complejos de la cadena respiratoria que presentarían los distintos linajes mitocondriales. Baudouin et al. (2005) llevaron a cabo un estudio para determinar si el haplogrupo H influía en la supervivencia tras sufrir sepsis. Para ello analizaron la distribución de los haplogrupos mitocondriales en 150 pacientes con infecciones severas y en 542 controles. Encontraron que el haplogrupo H, el más frecuente en poblaciones europeas, es un predictor independiente y robusto del pronóstico durante sepsis severa, ya que pacientes con este haplogrupo presentaban una probabilidad superior de sobrevivir. También presentaban una temperatura basal estadísticamente superior a individuos pertenecientes a otros haplogrupos, lo que concluyeron que podría ser una ventaja adaptativa y una posible explicación para la gran expansión de este haplogrupo a pesar de su relativa juventud. Sin embargo, esta hipótesis sobre las diferencias bioenergéticas entre los haplogrupos T y H no fue confirmada empíricamente (Amo et al. 2008). Yang et al. (2008), en un estudio sobre la distribución de haplogrupos mitocondriales en 181 pacientes Han admitidos en la UCI y 570 controles, concluyen que el haplogrupo R es un fuerte predictor del pronóstico en sepsis severa. No encuentra diferencias significativas en la distribución de los principales subhaplogrupos del haplogrupo R de la población Han. En otro trabajo (Gómez et al. 2009), en el que se genotipó la variante T4216C en 136 pacientes con trauma INTRODUCCIÓN _________________________________ 56 severo admitidos en la UCI, encontraron que ser portador del alelo C estaba significativamente asociado con un mayor riesgo de shock séptico o disfunción multiorgánica tras un trauma severo, con respecto al alelo T. Varios trabajos han asociado también la disfunción mitocondrial con otras enfermedades infecciosas como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o la tuberculosis. Hendrickson et al. (2008) encontraron que los haplogrupos J y U5 son más frecuentes en pacientes infectados por el VIH que desarrollan una rápida progresión de la enfermedad, mientras que los haplogrupos H, UK e IWX parece poseer un fuerte efecto protector frente la progresión del SIDA. Concluyen que la variabilidad del ADNmt entre haplogrupos puede alterar la producción de ATP, ROS o la apoptosis y por eso está correlacionada con la progresión de esta enfermedad. No se ha detectado asociación estadísticamente significativa entre los haplogrupos mitocondriales y la infección de tuberculosis (Houshmand et al. 2007). La enfermedad meningocócica engloba un grupo de síndromes clínicos, de gravedad variable, ocasionados por la bacteria Neisseria meningitidis. Entre ellos se pueden distinguir: • Meningococemia: infección del torrente sanguíneo, que puede variar desde leve a sepsis meningocócica fulminante (infección generalizada). Los síntomas pueden aparecer de forma repentina comenzando por fiebre, decaimiento y aparición de petequias (pequeñas manchas violáceas) en la piel y evolucionar muy rápidamente (fallo circulatorio, fallo multiorgánico, coma), pudiendo ser mortal en pocas horas. • Meningitis meningocócica: infección de las membranas que circundan el cerebro y la médula espinal que cursa con dolores de cabeza, cuello y espalda, fiebre, náuseas, vómitos y rigidez de nuca. • Otras manifestaciones: neumonía meningocócica, artritis,… Atendiendo a las diferencias antigénicas de sus polisacáridos capsulares, se conocen 13 grupos serológicos, aunque la mayoría de las cepas responsables de la enfermedad meningocócica pertenecen a los serogrupos A, B, C, W135 e Y. _________________________________ INTRODUCCIÓN 57 Se estima que el 10% de la población sana son portadores asintomáticos de la bacteria, y su reservorio natural es la nasofaringe. La enfermedad ocurre cuando el microorganismo invade la mucosa nasofaríngea y pasan a la circulación sanguínea. La enfermedad meningocócica puede presentarse a cualquier edad, pero es más frecuente en niños entre uno y cinco años, y es una de las principales causas de muerte por infección en los países industrializados. Se cree que la variabilidad en la respuesta a esta infección depende de factores bacterianos, ambientales y del hospedador, pero los mecanismos moleculares y celulares de la sepsis meningocócica se desconocen. 6.2.4 Autismo y desórdenes del espectro autista El autismo es un trastorno que afecta a la comunicación, interacción, imaginación, planificación y reciprocidad emocional. Los síntomas, en general, son incapacidad de interacción social, aislamiento, estereotipias (movimientos incontrolados de alguna extremidad, generalmente las manos), conductas muy rígidas, negación a cualquier cambio o novedad y repetir una acción determinada muchas veces. Puede pasar desapercibido los primeros meses de vida, hasta que se hace evidente la falta de reciprocidad con el interlocutor. El término “trastornos del espectro autista” (ASD, Autism Spectrum disorders), hace referencia a un fenotipo más amplio que englobaría tanto el autismo como otros trastornos más leves caracterizados por presentar ciertos rasgos autistas (síndrome de Asperger o el síndrome de Rett). La prevalencia de autismo es de uno o dos casos cada 1000, y para los trastornos del espectro autista es de seis cada 1000. Los niños son más susceptibles a padecer este trastorno que las niñas (4:1). El espectro autista es un grupo de desórdenes de etiología y presentación clínica heterogénea que afecta al desarrollo del cerebro. Se desconoce la causa que provoca el autismo, pero estudios en familias y con gemelos monocigóticos sugieren que el componente genético juega un papel importante. Se cree que este trastorno tiene una base genética compleja, aunque no está claro si las causantes son mutaciones raras o combinaciones poco frecuentes de variantes genéticas comunes (hipótesis CD-CV). También se ha postulado que determinados factores JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS __________________ 64 o la detección de errores generados in vitro (mutaciones fantasma, recombinación artificial, etc), conocimiento de las tasas de mutación, etc. Este trabajo de tesis se enmarca en este contexto, y para ello se han estudiado varias cohortes de pacientes de cáncer de mama, esquizofrenia, enfermedad meningocócica y autismo para los que existía una hipótesis bien establecida que defendía un papel importante de distintas variantes mitocondriales con la patología o algunos aspectos clínico/fenotípicos como por ejemplo la aparición temprana de la esquizofrenia y el haplogrupo JT. Al mismo tiempo, también nos hemos interesado por profundizar en el conocimiento del linaje más frecuente existente en poblaciones europeas o de ancestralidad europea (R0) así como en alguna aplicación forense como la utilización de mtSNPs para el genotipado de muestras muy degradadas. Objetivos generales  Análisis de la variabilidad del ADN mitocondrial, mediante el genotipado de determinados polimorfismos dispersos a lo largo del genoma o secuenciación directa, con el objetivo de obtener una visión global de esta variabilidad en las poblaciones europeas y sus posibles aplicaciones biomédicas.  Análisis crítico de los estudios de asociación entre enfermedades complejas y variabilidad del ADNmt (haplogrupos mitocondriales).  Estudio y revisión de los datos publicados de genomas completos en poblaciones europeas, en particular, el linaje R0 que comprende más del ~60% de la variabilidad en estas poblaciones; con la finalidad de actualizar las filogenias involucradas (y su nomenclatura) para que sirvan de marco de referencia para estudios genético poblacionales y forenses. Objetivos específicos  Estudio de la presunta asociación entre linajes y SNPs mitocondriales con el cáncer de mama en dos cohortes diferentes de pacientes con sus respectivos controles sanos. __________________ JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 65  Replicar estudios de asociación entre la variabilidad del ADN mitocondrial y el riesgo a padecer esquizofrenia.  Investigación de la existencia o ausencia del papel del genoma mitocondrial en el riesgo a padecer infección meningocócica mediante un estudio de asociación caso-control.  Analizar la posible asociación entre la variabilidad del ADNmt y el riesgo de padecer autismo, evaluar el potencial papel patogénico de varias mutaciones mitocondriales y determinar si mutaciones realmente patogénicas, causantes de enfermedades mitocondriales, aparecen en la cohorte de autistas.  Discusión sobre las inconsistencias detectadas en publicaciones anteriores en esta línea de investigación, tales como la ausencia de control de la estratificación poblacional, diseño adecuado de muestreo (tamaño muestral), réplica de los resultados, escaso conocimiento filogenético del genoma mitocondrial o planteamiento erróneo de hipótesis.  Selección de un conjunto de SNPs codificantes del ADNmt que permita la clasificación de muestras pertenecientes al haplogrupo R0 en sus sublinajes más frecuentes y que pueda ser utilizada como herramienta de discriminación forense.  Revisión de la nomenclatura de la filogenia del macro-haplogrupo R0, resumen de los conflictos existentes y propuesta de una nomenclatura actualizada y de unos criterios para evitar futuras inconsistencias.  Validación de SNPs para la práctica forense, mediante el análisis de muestras con baja concentración de ADN, cabellos sin bulbo y huesos. MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 69 1 Muestras Para la realización de esta tesis doctoral se han empleado las muestras que se enumeran a continuación. Todas las muestras se han obtenido con consentimiento informado del donante. Los estudios de asociación genético-clínicos realizados han consistido en el genotipado de grupos de casos (pacientes con cáncer de mama, infección meningocócica, esquizofrenia y autismo) y de los respectivos controles. Todas las muestras de ADN han sido extraídas a partir de sangre: • 464 muestras de ADN de pacientes de cáncer de mama esporádico de población española peninsular (Vega et al. 2009). • 453 muestras de ADN de controles (mujeres españolas que no presentaban cáncer de mama) de la población de la península (Vega et al. 2009). • 302 muestras de ADN pertenecientes a casos de cáncer de mama esporádico de la población las islas Canarias (Vega et al. 2009). • 295 muestras de ADN de mujeres de las islas Canarias que no presentaban cáncer de mama (Vega et al. 2009). • 307 muestras de ADN de pacientes de infección meningocócica de población peninsular. • 616 muestras de ADN de controles para infección meningocócica, individuos de población peninsular que no presentaban la enfermedad. • 454 muestras de ADN pertenecientes a pacientes españoles de esquizofrenia. • 159 muestras de ADN de pacientes españoles de autismo fundamentalmente recogidas en Cataluña. • 137 muestras de ADN de controles para autismo (individuos que no presentaban este trastorno) recogidos en Cataluña. Para el trabajo relacionado con el área de genética de poblaciones se han empleado las siguientes muestras de ADN: MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ 70 • 282 muestras de ADN de individuos sanos de diferentes comarcas de Galicia, obtenidas a partir de muestras de sangre recogidas por el Centro de Transfusión de Galicia. • 135 muestras de ADN, extraídas a partir de manchas de sangre, pertenecientes a individuos sanos de tres regiones de Cantabria (Valle del Pas, Valle de Liébana y Santander). • 101 muestras de ADN pertenecientes a individuos nacidos en Cataluña. • 8 muestras de ADN, extraídas a partir de manchas de sangre, de individuos del País Vasco. En relación al trabajo de validación forense, se han analizado distintos tipos de muestras, pelos, huesos, dientes y diluciones en diferentes concentraciones. 2 Extracción de ADN 2.1 Extracción de ADN a partir de mancha de sangre: fenolcloroformo Para la extracción de ADN de manchas de sangre y saliva se ha utilizado un método de extracción con fenol-cloroformo especialmente diseñado para manchas de fluidos biológicos: • Cortar 1cm2 de tejido y resuspenderlo en 500µL de tampón DLB (Tris-HCl 1M, NaCl 5M, EDTA 0’5M pH 8.0). • Añadir 50µL de SDS al 10% y 5µL de proteinasa K (20 mg/mL). • Incubar toda la noche a 56ºC con agitación suave. • Añadir 20µL de NaCl 5M y 575µL de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1); mezclar por inversión. • Centrifugar 3 minutos a 12000 r.p.m. y pasar la fase acuosa a otro tubo. • Añadir 575µL de cloroformo: alcohol isoamílico y mezclar por inversión. • Centrifugar 3 minutos a 12000 r.p.m. • Pasar la fase acuosa a otro tubo y añadir 1mL de etanol absoluto frío. ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 71 • Mantener durante 15 minutos a –80ºC y centrifugar 15 minutos a 12000 r.p.m. • Vaciar el contenido de los tubos y dejar secar el precipitado al aire. • Resuspender el precipitado en 50-100µL de agua bidestilada estéril e incubar a 56ºC con agitación suave entre 2 y 16 horas. • El rendimiento final es de aproximadamente 35ng/µL. 2.2 Extracción de ADN a partir de sangre La extracción de ADN de las muestras empleadas en los estudios de asociación que se presentan en este trabajo ha sido realizada en los centros de recogida de las muestras y posteriormente enviadas al Instituto de Medicina Legal de Santiago de Compostela. Los protocolos empleados para la extracción de ADN se describen aquí de forma orientativa. La extracción de ADN genómico de casos y controles para el estudio de cáncer de mama se llevó a cabo a partir de linfocitos de sangre periférica, empleando extracción automática de ADN (MagNAPure, Roche, Mannheim, Alemania) y siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. Tanto las muestras de ADN de casos con infección meningocócica como las muestras de los controles de este estudio, fueron extraídas a partir de un volumen de 300µL de sangre total mediante Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Wisconsin, EE.UU.), siguiendo los protocolos recomendados. Para la extracción de ADN de casos de esquizofrenia se utilizó el robot Chemagic Magnetic Separation Module I, siguiendo las instrucciones del fabricante (http://www.chemagen.com) partiendo de un volumen inicial de 5mL de sangre. 2.3 Extracción de ADN a partir de otros vestigios biológicos Las muestras de ADN forenses de tejido óseo (dos dientes y dos huesos) fueron extraídas mediante un protocolo estándar de fenol-cloroformo del Instituto de Medicina Legal de Santiago de Compostela. Los principales pasos de este protocolo se presentan aquí de forma resumida: MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ 72 • Limpieza de huesos y piezas dentarias. • Fragmentación de las epífisis de los huesos y de las piezas dentarias. • Pulverización de fragmentos de hueso y dientes. • Digestión del producto de la pulverización. • Extracción y purificación del ADN. Para la extracción de ADN a partir de pelos se empleó el BioRobot EZ1 (Qiagen, Hilden, Alemania), usando las condiciones propuestas por el fabricante. 3 Genotipado de SNPs de la región codificante mediante minisecuenciación En general, el genotipado de SNPs, dispersos a lo largo del genoma mitocondrial o nuclear, comienza por una PCR multiplex que consiste en amplificar en una misma reacción varias regiones simultáneamente, de forma que cada una de ellas contenga uno o varios de los SNPs de interés. Para que este paso tenga éxito, es necesario diseñar de forma adecuada tanto los primers de PCR como los de minisecuenciación. 3.1 Diseño de primers para una PCR multiplex Las consideraciones más importantes que se deben tener en cuenta a la hora de diseñar un multiplex se podrían resumir en los siguientes puntos: • Número moderado de SNPs. • Tamaño adecuado de los amplicones. • Temperatura de melting (Tm) similar entre todos los primers y sondas. • Especificidad de los primers para la región de interés. • Evitar interacciones entre los primers. • Comprobar la ausencia de formación de estructuras secundarias dentro del propio primer (horquillas). ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 73 • Reducción del número de amplicones, incluyendo más de un SNPs por amplicón, siempre que sea posible. 3.1.1 Selección de SNPs El primer paso en el diseño de un multiplex consiste en la selección de los SNPs de interés. Para ello es esencial tener en cuenta la población de estudio, ya que la informatividad de cada polimorfismo puede variar de una población a otra, y llevar a cabo una revisión bibliográfica previa. En el presente trabajo, se han genotipado SNPs diagnóstico de haplogrupos mitocondriales europeos, así como mutaciones patogénicas confirmadas y posiciones “probablemente” patogénicas. 3.1.2 Diseño de primers Para diseñar los primers de amplificación, el empleo de herramientas bioinformáticas es extremadamente útil. En nuestro caso, se han utilizado los siguientes programas: • Software Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3) Este software, de acceso libre, se ha empleado para el diseño de primers, y permite fijar parámetros como: tamaño de los primers y de los amplicones, rango óptimo para la Tm (60ºC, aproximadamente), proporción de G/C de los oligonucleótidos,... • BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/beta/Blast.cgi) Este programa gratuito pertenece al National Center for Biotechnology Information (NCBI), que contiene una base de datos de secuencias gracias a la cual se puede comprobar la especificidad de los primers diseñados, mediante la evaluación del porcentaje de alineación con otras secuencias. • Autodimer (http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/AutoDimerHomepage/AutoDimerProgramHome page.htm) El autodimer es un programa (descarga gratuita) que chequea si existen potenciales estructuras en horquilla y posibles dímeros de primers del multiplex. Estableciendo un número máximo de identidades, el programa MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ 80 Mutación Primer Forward Primer reverse Tamaño (pb) C.F. (μM) 3243 TATACCCACACCCACCCAAG GGCCATGGGTATGTTGTTAAG 118 0’2 3460 CCGAACGAAAAATTCTAGGC GCGGTGATGTAGAGGGTGAT 153 0’2 3697 GCCTAGCCGTTTACTCAATCC TGAGATTGTTTGGGGCTACTGC 94 0’15 3946/39491 TAGCAGAGACCAACCGAACC GAAGATTGTAGTGGTGAGGGTGT 157 0’2 7445 CCCTACCACACATTCGAAGAA TGGCTTGAAACCAGCTTTG 89 0’2 8993 AATGCCCTAGCCCACTTCTT AGGTGGCCTGCAGTAATGTT 140 0’15 9176 AAATCGCTGTCGCCTTAATC TCATTAGGAGGGCTGAGAGG 154 0’3 10158/10191 TCAACACCCTCCTAGCCTTA GGGTAAAAGGAGGGCAATTT 196 0’3 10663 ACACCCACTCCCTCTTAGCC GGCCATATGTGTTGGAGATTG 110 0’3 11777/11778/ 11832 CACGGGCTTACATCCTCATT GGGGGTAAGGCGAGGTTAG 157 0’2 127061 TGTAGCATTGTTCGTTACATGG AGTTGGAATAGGTTGTTAGCGG 146 0’2 13513/13514 ATTGGCAGCCTAGCATTAGC CAGGGAGGTAGCGATGAGAG 131 0’2 14459/14482/ 14484/14487 CTCCATCGCTAACCCCACTA TTCTGAATTTTGGGGGAGGT 170 0’4 Tabla 11: Primers de amplificación para el multiplex de mutaciones patogénicas confirmadas (Álvarez-Iglesias et al. 2008). Las secuencias de los primers forward y reverse están indicadas en dirección 5’-3’; el tamaño hace referencia al del amplicón resultante; C.F., concentración final de cada pareja de primers en la reacción de PCR. 1, Primers publicados en Quintáns et al. (2004). Posición Primer Forward Primer reverse Tamaño (pb) C.F. (μM) 3394/33972 CCGAACGAAAAATTCTAGGC GCGGTGATGTAGAGGGTGAT 154 0’2 4295 GCATTCCCCCTCAAACCTAA CTAGAAATAAGGGGGTTTAAGCTCCTAT 89 0’2 103941 CCATGAGCCCTACAAACAACT TGAGTCGAAATCATTCGTTTTG 159 0’2 118092 CACGGGCTTACATCCTCATT GGGGGTAAGGCGAGGTTAG 158 0’2 11984 AACCACGTTCTCCTGATCAAA GTGAGTGAGCCCCATTGTGT 111 0’1 Tabla 12: Primers de amplificación para el multiplex de mutaciones potencialmente patogénicas. Las secuencias de los primers forward y reverse están indicadas en dirección 5’-3’; el tamaño hace referencia al del amplicón resultante; C.F., concentración final de cada pareja de primers en la reacción de PCR. 1, Primers publicados en Álvarez-Iglesias et al. (2009); 2, Primers publicados en Álvarez-Iglesias et al. (2008). ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 81 3.3 Purificación enzimática del producto de PCR: ExoSAP-IT® Los productos de PCR, una vez chequeados en un gel de acrilamida y antes de la reacción de minisecuenciación, deben ser tratados con ExoSAP-IT® (USB® Corporation, Cleaveland, Ohio, EE.UU.). ExoSAP-IT® utiliza dos enzimas hidrolíticas, Exonucleasa I, que elimina los primers monocatenarios residuales y cualquier ADN de cadena simple, y fosfatasa alcalina de camarón (Shrimp Alkaline Phosphatase), que se encarga de desfosforilar los dNTPs no incorporados durante la reacción de amplificación, impidiendo así que interfieran en reacciones posteriores. Para ello se incuba 1µL de producto de PCR con 0’5µL de enzima con el siguiente programa: Temperatura (ºC) Tiempo Incubación 37 15’ Inactivación 85 15’ 4 ∞ Tabla 13: Condiciones para la purificación enzimática del producto de PCR mediante ExoSAP-IT®. 3.4 Reacción de minisecuenciación La reacción de minisecuenciación se lleva a cabo con el Kit SNaPshot™ (AB), que contiene un enzima termoestable y sin actividad exonucleasa 3´-5´ (AmpliTaq® FS) y cuatro ddNTPs marcados fluorescentemente: ddNTP Marcador Color A d6G VERDE C dTAMRATM NEGRO G dR110 AZUL T dROXTM ROJO Tabla 14: Marcaje empleado en el SNaPshotTM Kit (AB) A la hora de diseñar las sondas, el objetivo es distribuirlas en el electroferograma en función de su tamaño y de los alelos posibles para cada SNP, y para ello hay que tener en cuenta las siguientes consideraciones: MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ 82 • Las sondas deben abarcar la zona adyacente al SNP, ya sea corriente arriba o corriente abajo del mismo. • Especificidad con el ADN molde, aunque con menores restricciones que para el diseño de primers de PCR. • Evitar interacciones entre sondas. • Las sondas deben presentar tamaños distintos entre ellas, de forma que en la electroforesis no se solapen y se puedan diferenciar bien los alelos de cada sistema. Para ello, se modifica la longitud de las sondas incorporando colas no homólogas de nucleótidos en el extremo 5’. Esto permite incluir un número elevado de marcadores en una sola reacción. El tamaño de la sonda, añadiéndole el nucleótido incorporado, define la posición del marcador y el color del ddNTP determina el alelo del SNP. La reacción de minisecuenciación tiene lugar en un volumen final que puede variar entre 5 y 10µL, en función del número de SNPs a genotipar en una misma reacción, y que comprende 1-3µL de SNaPshot™ kit (AB), 1’5µL de producto de PCR purificado, 0’5-1µL de mix de sondas, completando con agua hasta el volumen final. La reacción se lleva a cabo en un 9700 Thermocycler (AB), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Proceso Temperatura ( º C) Tiempo 25 ciclos Desnaturalización 96 10’’ Anillamiento 50 5’ Extensión 60 30’’ Fin 4 ∞ Tabla 15: Condiciones para la reacción de minisecuenciación con el kit SNaPshot™. Las sondas o primers de minisecuenciación empleados en los diferentes trabajos se resumen en las siguientes tablas donde, entre otros parámetros, se indica la longitud de cada sonda y los alelos del polimorfismo (rCRS-variante, respectivamente). ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 83 Los dos multiplexes con los que se llega a una clasificación de las poblaciones europeas presentan también dos reacciones de minisecuenciación independientes, de 19 y 6 sondas, respectivamente. Los tamaños de dichos primers de extensión varían entre 20 y 64pb. SNP Primer de minisecuenciación Tamaño (pb) Alelo Cadena C.F. ( µ M) 14766 AATGACCCCAATACGCAAAA 20 C-T L 0’2 4529 CTTTGCAGGCACACTCATCAC 21 A-T L 0’16 3010 GGAGATGTTGGATCAGGACATCCC 24 G-A L 0’2 7028 TACACGACACGTACTACGTTGTAGC 25 C-T L 0’16 4580 TTACCTGAGTAGGCCTAGAAATAAACAT 28 G-A L 0’2 3915 (tgac)2TAAGCCTGAGACTAGTTCGGACTC 32 G-A H 0’36 4216 (c)4TACCACTCACCCTAGCATTACTTATATGA 33 T-C L 0’2 10400 (c)10CGTTTTGTTTAAACTATATACCAATTC 37 C-T H 0’4 4769 (gact)3GGGCTATTCCTAGTTTTATTGCTATAGC 40 A-G H 0’4 12308 (c)22CATTGGTCTTAGGCCCCAA 41 A-G L 0’4 3992 t(gact)5CCCTATTCTTCATAGCCGAATACA 45 C-T L 0’36 10873 (c)15GTTGTTGTTGATTTGGTTAAAAAATAGTAG 45 T-C H 0’2 12705 (c)17AACATTAATCAGTTCTTCAAATATCTACTCAT 49 C-T L 0’2 4793 (gact)7CTACTCAGAAGTGAAAGGGGGC 50 A-G H 0’4 4336 ct(gact)7GCTTAAACCCCCTTATTTCTAGGAC 55 T-C L 0’6 6776 act(gact)5CGTGTGTCTACGTCTATTCCTACTGTAAATAT 55 T-C H 0’2 10398 (gact)7ATGAGTGACTACAAAAAGGATTAGACTGA 58 A-G L 0’4 10463 ct(gact)9ATGTAAATGAGGGGCATTTGGTA 61 T-C H 0’6 13966 act(gact)9gaCAATCCCCTATCTAGGCCTTCTT 64 A-G L 0’2 Tabla 16: Primers de minisecuenciación para el multiplex de 19 SNPs modificado a partir de dos multiplexes de un trabajo anterior (Quintáns et al. 2004). Las secuencias de las sondas están indicadas en dirección 5’-3’, las regiones en minúsculas se corresponden con las colas no homólogas; la cadena indica sobre qué hebra del ADNmt ocurre el anillamiento del primer; C.F., concentración final de la sonda en la reacción de minisecuenciación. MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ 84 Tabla 17: Primers de minisecuenciación para el multiplex de seis SNPs. Las secuencias de las sondas están indicadas en dirección 5’-3’, las regiones en minúsculas se corresponden con las colas no homólogas; la cadena indica sobre qué hebra del ADNmt ocurre el anillamiento del primer; C.F., concentración final de la sonda en la reacción de minisecuenciación. SNP Primer de minisecuenciación Tamaño (pb) Alelo Cadena C.F. ( µ M) 9055 CTACTCATGCACCTAATTGGAAGC 24 G-A L 0’125 3197 CCCCGTAAATGATATCATCTCAACTTAG 28 T-C L 0’2 16519 ct(gact)2GACATCTGGTTCCTACTTCAGGG 33 T-C L 0’3 13708 (gact)4CTACTAAACCCCATTAAAGGCCTG 40 G-A L 0’3 11719 ct(gact)7ATTCTCATAATCGCCCACGG 50 G-A L 0’5 8994 act(gact)9GCCTACTCATTCAACCAATAGCCCT 64 G-A L 0’075 ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 85 La minisecuenciación de los 71 SNPs pertenecientes al haplogrupo R0 se llevó a cabo en tres reacciones, con las sondas que se describen en las siguientes tablas: SNP Primer de minisecuenciación Tamaño (pb) Alelo Cadena C.F. ( µ M) 2581 TGATTATGCTACCTTTGCACGGT 23 A-G H 0’2 750 CTCTAAATCACCACGATCAAAAGG 24 A-G L 0’2 709 (gact)3TTACACATGCAAGCATCCCC 32 G-A L 0’2 2706 t(gact)2AGGGTCTTCTCGTCTTGCTGTGT 32 A-G H 0’2 3010 t(gact)3AACCTTTAATAGCGGCTGCACCAT 37 G-A H 0’2 3796 ct(gact)2CTAATAAGTGGCTCCTTTAACCTCTCC 37 A-G L 0’1 3847 (gact)5ATTACTCCTGCCATCATGACCC 42 T-C L 0’2 4580 ct(gact)3TTACCTGAGTAGGCCTAGAAATAAACAT 42 G-A L 0’2 6253 ct(gact)6TGTTCCTGCTCCGGCCTCCACT 48 T-C H 0’1 6296 (gact)6AACAGGTTGAACAGTCTACCCTCC 48 C-T L 0’2 6365 ct(gact)7GATGGCCCCTAAGATAGAGGAGAC 54 T-C H 0’2 10810 act(gact)5CAACAATTATATTACTACCATTGACATGACT 54 T-C L 0’2 6776 ct(gact)6CGTGTGTCTACGTCTATTCCTACTGTAAATAT 58 T-C H 0’3 12858 act(gact)8GCAGCCATTCAAGCAATCCTATA 58 C-T L 0’3 7337 (gact)10TGATTTGAGAAGCCTTCGCTTC 62 G-A L 0’3 12957 (gact)9CAACAAATAGCCCTTCTAAACGCTAA 62 T-C L 0’3 13759 (gact)10TTCTCATTACTAACAACATTTCCCCC 66 G-A L 0’1 14766 t(gact)11CAATGACCCCAATACGCAAAA 66 C-T L 0’3 14365 ct(gact)11GTTAGCGATGGAGGTAGGATTGGT 70 C-T H 0’3 15218 (gact)11TCCTCAGATTCATTGAACTAGGTCTG 70 A-G H 0’3 14770 (gact)11GAATGAGTGGTTAATTAATTTTATTAGGGG 74 C-T H 0’3 4550 ct(gact)13GCGCTAAGCTCGCACTGATT 74 T-C L 0’3 14470 t(gact)13CCTCAATAGCCATCGCTGTAGTATA 78 T-A/C L 0’4 13708 ct(gact)13CTACTAAACCCCATTAAAGGCCTG 78 G-A L 0’3 Tabla 18: Primers de minisecuenciación para el multiplex 1 de Álvarez-Iglesias et al. (2009). Las secuencias de las sondas están indicadas en dirección 5’-3’, las regiones en minúsculas se corresponden con las colas no homólogas; la cadena indica sobre qué hebra del ADNmt ocurre el anillamiento del primer; C.F., concentración final de la sonda en la reacción de minisecuenciación. MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ 86 SNP Primer de minisecuenciación Tamaño Alelo Cadena C.F. ( µ M) 951 CTTTATTGGGGAGGGGGTGAT 21 G-A H 0’2 4336 AGGGATGGGTTCGATTCTCAT 21 T-C H 0’2 39151 (gact)2GAAGCCTGAGACTAGTTCGGACTC 32 G-A H 0’2 4745 gactAATGAACCATAACCAATACTACCAATCA 32 A-G L 0’2 3992 ct(gact)3CCCTATTCTTCATAGCCGAATACA 38 C-T L 0’3 4310 TCTGATAAAAGAGTTACTTTGATAGAGTAAATAATAGG 38 A-G L 0’4 4727 ct(gact)5TACTCTCCGGACAATGAACCAT 44 A-G L 0’2 7028 act(gact)4TACACGACACGTACTACGTTGTAGC 44 C-T L 0’2 4769 ct(gact)4ACCAATCAATACTCATCATTAATAATCATAAT 50 A-G L 0’2 7645 (gact)6GCTACTTCCCCTATCATAGGAGAGCT 50 T-C L 0’2 4793 t(gact)5ATAATCATAATAGCTATAGCAATAAAACTAGGAAT 56 A-G L 0’4 8473 ct(gact)6AAAAATATTAAACACAAACTACCACCTACC 56 T-C L 0’2 8269 (gact)8gacTGAAATAGGGCCCGTATTTACCCTATA 62 G-A L 0’06 9066 ct(gact)8GTGTAGAGGGAAGGTTAATGGTTGATAT 62 A-G H 0’3 8592 act(gact)11GCCTACCCGCCGCAGTACT 66 G-A L 0’1 10044 (gact)9TTAAGGCGAAGTTTATTACTCTTTTTTGAA 66 A-G H 0’6 9150 t(gact)12CCTAGAAATCGCTGTCGCCTT 70 A-G L 0’2 10394 ct(gact)9CTGGCCTATGAGTGACTACAAAAAGGATTAGA 70 C-T L 0’3 8602 (gact)13CGCCGCAGTACTGATCATTCTA 74 T-C L 0’4 9088 (gact)10AGTAGAATTAGAATTGTGAAGATGATAAGTGTAG 74 T-C H 0’2 13404 ct(gact)11ATCATCCACAACCTTAACAATGAACAAGATAT 78 T-C L 0’3 3936 t(gact)14TGCGGCGTATTCGATGTTGAA 78 C-T H 0’6 8271 (gact)15GGGCCCGTATTTACCCTATAGC 82 A-T L 0’3 8598 act(gact)15ACCCGCCGCAGTACTGATCAT 84 T-C L 0’4 961 (gact)15CGTAAAGAGTGTTTTAGATCACCCCC 86 T-G L 0’06 Tabla 19: Primers de minisecuenciación para el multiplex 2 de Álvarez-Iglesias et al. (2009). Las secuencias de las sondas están indicadas en dirección 5’-3’, las regiones en minúsculas se corresponden con las colas no homólogas; la cadena indica sobre qué hebra del ADNmt ocurre el anillamiento del primer; C.F., concentración final de la sonda en la reacción de minisecuenciación. 1, Primers de minisecuenciación publicados en Quintáns et al. (2004). ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 87 Tabla 20: Primers de minisecuenciación para el multiplex 3 de Álvarez-Iglesias et al. (2009). Las secuencias de las sondas están indicadas en dirección 5’-3’, las regiones en minúsculas se corresponden con las colas no homólogas; la cadena indica sobre qué hebra del ADNmt ocurre el anillamiento del primer; C.F., concentración final de la sonda en la reacción de minisecuenciación. 1, Primers de minisecuenciación publicados en Quintáns et al. (2004). Las sondas de minisecuenciación diseñadas para el multiplex de mutaciones patogénicas confirmadas (Álvarez-Iglesias et al. 2008) y para las seis posiciones adicionales potencialmente patogénicas se muestran en las siguientes tablas. Para genotipar las posiciones 3949, 14484 y 14487 fue necesaria la utilización de SNP Primer de minisecuenciación Tamaño (pb) Alelo Cadena C.F. ( µ M) 2259 TCCCAAACATATAACTGAACTCCTCA 26 C-T L 0’2 5250 TTCTTCGATAATGGCCCATTTGGGCA 26 T-C H 0’2 5263 act(gact)2GGCTTTTTGCCCAAATGGG 30 C-T L 0’2 8869 t(gact)2TTATGAGCGGGCACAGTGATT 30 A-G L 0’6 9336 act(gact)3TTCCACTCCATAACGCTCCTC 36 A-G L 0’15 10211 (gact)4gactgactgactTCCCCCGCCCGCGTCCCTTT 36 C-T L 0’15 10166 ct(gact)4GGCTACATAGAAAAATCCACCCC 41 T-C L 0’3 123081 (c)22CATTGGTCTTAGGCCCCAA 41 A-G L 0’4 13105 ct(gact)4CACTCAAGCACTATAGTTGTAGCAGGA 45 A-G L 0’2 12705 ct(gact)3AACATTAATCAGTTCTTCAAATATCTACTCAT 46 C-T L 0’2 11719 ct(gact)7ATTCTCATAATCGCCCACGG 50 G-A L 0’4 12438 t(gact)6CTAACAAAAAAAACTCATACCCCCA 50 T-C L 0’15 13101 ct(gact)7GAAGCGGATGAGTAAGAAGATTCC 54 A-C H 0’2 15452 t(gact)8GCCCTCGGCTTACTTCTCTTC 54 C-A L 0’4 15773 act(gact)9CCTGAATCGGAGGACAACCA 59 G-A L 0’1 8994 act(gact)9GCCTACTCATTCAACCAATAGCCCT 64 G-A L 0’06 11140 act(gact)7CATATTTTATATCTTCTTCGAAACCACACTTAT 64 C-T L 0’2 1438 ct(gact)10GTCGAAGGTGGATTTAGCAGTAAACT 68 A-G L 0’06 14872 (gact)12CTCCTTGGCGCCTGCCTGAT 68 C-T L 0’4 15904 (gact)10TTTCATCTCCGGTTTACAAGACTGGTGTATTA 72 C-T H 0’1 15833 act(gact)9GACAAGTAGCATCCGTACTATACTTCACAACAATC 74 C-T L 0’2 14869 gac(gact)13GCTCACTCCTTGGCGCCTGCCT 77 G-A L 0’2 MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ 88 primers degenerados debido a la posibilidad de co-existencia de dos mutaciones adyacentes, lo que provocaría dificultades en anillamiento de la sonda. Mutación Primer de minisecuenciación1 Tamaño (pb) Alelos Cadena C.F. (µM) 10158 ACAACTCAACGGCTACATAGAAAAA 25 T-C L 0’2 3946 cGAACTAGTCTCAGGCTTCAACATC 25 G-A L 0’2 10663 gactgCAATATTGTGCCTATTGCCATACTAG 31 T-C L 0’2 3460 (gact)2gGCTACTACAACCCTTCGCTGAC 31 G-A L 0’2 10191 (gact)4AGTGCGGCTTCGACCCTATA 36 T-C L 0’3 14459 (gact)2gacCTCAGGATACTCCTCAATAGCCATC 36 G-A L 0’2 14484 (gact)3ATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAAC V A 40 T-C L 0’5 3243 (gact)4gaACAGGGTTTGTTAAGATGGCAG 40 A-G L 0’2 11777 (gact)5gCAAACTACGAACGCACTCACAGT 44 C-A L 0’2 7445 (gact)5TCGAAGAACCCGTATACATAAAATCTAG 48 A-G/C L 0’2 12706 (gact)9GCGGTAACTAAGATTAGTATGGTAATTAGGA 52 T-C H 0’2 3949 (gact)7gaAGTCTCAGGCTTCAACATC R AA 52 T-C L 0’2 14487 (gact)7Gctgtagtatatccaaagacaacca y CA 56 T-C L 0’6 13513 (gact)8TTCCTCACAGGTTTCTACTCCAAA 56 G-A L 0’1 13514 (gact)10gTGCGGTTTCGATGATGTGG 60 A-G H 0’2 3697 (gact)9ctAAACTCAAACTACGCCCTGATC 60 G-A L 0’2 11778 (gact)9gaGAAGTCCTTGAGAGAGGATTATGATG 64 G-A H 0’3 11832 (gact)8 gacTCAAACTCTACTCCCACTAATAGCTTTTT 64 G-A L 0’1 9176 (gact)1ogATCCAAGCCTACGTTTTCACACTTC 70 T-C/G L 0’2 14482 (gact)10GCACATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAAC 73 C-A/G L 0’6 8993 (gact)12gaCCTACTCATTCAACCAATAGCCC 76 T-G/C L 0’2 Tabla 21: Primers de minisecuenciación para el multiplex de mutaciones patogénicas confirmadas de Álvarez-Iglesias et al. (2008). Las secuencias de las sondas están indicadas en dirección 5’-3’, las regiones en minúsculas se corresponden con las colas no homólogas; la cadena indica sobre qué hebra del ADNmt ocurre el anillamiento del primer; C.F., concentración final de la sonda en la reacción de minisecuenciación. Para las sondas correspondientes a las mutaciones 3949, 14484 y 14487 se utilizaron primers degenerados que se señalan siguiendo el código IUB (posiciones marcadas en negrita). ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 89 Posición Primer de minisecuenciación Tamaño (pb) Alelo Cadena C.F. ( µ M) 3394 TTACCGAACGAAAAATTCTAGGC 23 T-C L 0’2 3397 (gact)3GGGGCCTTTGCGTAGTTGTA 32 A-G H 0’2 4295 ct(gact)2GGGGGTTTAAGCTCCTATTATTTACTC 37 A-G H 0’2 10394 Ct(gact)2CTGGCCTATGAGTGACTACAAAAAGGATTAGA 42 C-T L 0’2 11809 (gact)5CATAATCCTCTCTCAAGGACTTCAAAC 47 T-C L 0’2 11984 (gact)7ACTAGTCACAGCCCTATACTCCCTC 53 T-C L 0’2 Tabla 22: Primers de minisecuenciación para el multiplex 3 de Álvarez-Iglesias et al. (2009). Las secuencias de las sondas están indicadas en dirección 5’-3’, las regiones en minúsculas se corresponden con las colas no homólogas; la cadena indica sobre qué hebra del ADNmt ocurre el anillamiento del primer; C.F., concentración final de la sonda en la reacción de minisecuenciación. 3.5 Purificación enzimática del producto de minisecuenciación: SAP Durante este proceso se eliminan los grupos fosfato de los extremos 5’ del ADN y de los ddNTPs no incorporados en la reacción de minisecuenciación para evitar interferencias en la electroforesis. Esto se consigue mediante el tratamiento de los productos de minisecuenciación con SAP (USB®), una fosfatasa alcalina de camarón (Shrimp Alkaline Phosphatase) termolábil y con actividad altamente específica. El volumen final de la reacción anterior (5-10µL) es tratado con 0’5-1µL de SAP. Temperatura ( º C) Tiempo Incubación 37 60’ Inactivación 85 15’ 4 ∞ Tabla 23: Condiciones para la purificación enzimática del producto de minisecuenciación mediante SAP. 3.6 Electroforesis capilar y análisis de resultados La preparación de los productos de minisecuenciación purificados para la electroforesis capilar implica la adición a 2µL de dicho producto de 9’5µL de formamida (HiDiTM Formamide, AB) y 0’3µL de marcador interno de peso MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ 96 • Para un volumen de 11µL de producto de secuenciación purificado enzimáticamente, añadir 1’1µL de EDTA 125mM, 1’1µL de NaOAc 3M y 27’5µL de etanol absoluto. • Dar un vórtex a la placa y centrifugar 45 minutos a 3700 r.p.m. • Dar la vuelta a la placa rápidamente sobre un papel de filtro y centrifugar un minuto a 200 r.p.m. • Añadir 38’5µL de etanol 70% y centrifugar 15 minutos a 3700 r.p.m. • Dar la vuelta a la placa rápidamente sobre un papel de filtro y centrifugar un minuto a 200 r.p.m. • Introducir la placa abierta en la estufa durante 5-10 minutos y cuando esté completamente seca, resuspender en 11µL de formamida. 4.6 Electroforesis capilar y análisis de resultados Las secuencias que fueron tratadas con una purificación alcohólica fueron resuspendidas en formamida HiDiTM (AB) mientras que aquellas secuenciadas con BigDye® (AB) y purificadas mediante filtración en placa se resuspendieron en solución de inyección. La electroforesis capilar tuvo lugar en tres secuenciadores: ABI PRISM 3100® Genetic Analyzer (AB), ABI PRISM 3130xl® Genetic Analyzer (AB), y ABI PRISM 3730xl® Genetic Analyzer (AB) con las condiciones de los módulos por defecto de cada secuenciador. Las secuencias resultantes fueron analizadas con el programa Sequencing Analysis 5.3.1 (AB), y alineadas con la Secuencia de Referencia de Cambridge revisada (rCRS) (Andrews et al. 1999), utilizando el programa SeqScape 2.5 (AB). 5 Secuenciación de genomas mitocondriales completos 5.1 Amplificación de fragmentos solapantes Para la obtención de los diferentes fragmentos solapantes mediante los que se amplifica todo el genoma mitocondrial, se emplearon 5ng de muestra de ADN, 4µL de QIAGEN Multiplex PCR Kit (Qiagen), 5pmoles de cada primer, y se completa con agua hasta un volumen final de 10µL. ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 97 La amplificación se llevó a cabo en un 9700 Thermocycler (AB). Las condiciones de PCR, que se resumen en la siguiente tabla: Proceso Temperatura ( º C) Tiempo Inicio Activación enzimática 95 15’ Ciclos (35) Desnaturalización 94 30’’ Anillamiento 58 1’30’’ Extensión 72 1’30’’ Fin Extensión final 72 10’ 4 ∞ Tabla 29: Condiciones para la reacción de PCR mediante la que se amplifica el genoma mitocondrial completo en 11 fragmentos solapantes. Se emplearon los primers desarrollados por Torroni (2001) para amplificar todo el genoma mitocondrial humano en 11 fragmentos solapantes con un tamaño medio de 1800 bases aproximadamente. En la siguiente tabla se muestra el tamaño de cada amplicón resultante y las secuencias de los primers de PCR empleados: Primers de amplificación Amplicón Tamaño amplicón (pb) Nombre Secuencia (5’→3’) Posición 5’ Posición 3’ 1 1.845 14897F CTAGCCATGCACTACTCACCAG 14897 14918 155R AATAGGATGAGGCAGGAATCAA 155 134 2 1.759 16488F CTGTATCCGACATCTGGTTCCT 16488 16509 1677R GTTTAGCTCAGAGCGGTCAAGT 1677 1656 3 1.832 1404F ACTTAAGGGTCGAAGGTGGATT 1404 1425 3235R CTTAACAAACCCTGTTCTTGGG 3235 3214 4 1.784 2900F CAATAACTTGACCAACGGAACA 2900 2921 4683R TTAGAAGGATTATGGATGCGGT 4683 4662 5 1.771 4381F ACCTATCACACCCCATCCTAAA 4381 4402 6151R ACTAGTCAGTTGCCAAAGCCTC 6151 6130 6 1.747 5871F GCTTCACTCAGCCATTTTACCT 5871 5892 7617R TCTTGTAGACCTACTTGCGCTG 7617 7596 7 1.980 7239F GCATACACCACATGAAACATCC 7239 7260 9218R TTGGTGGGTCATTATGTGTTGT 9218 9197 8 1.740 8910F CTTACCACAAGGCACACCTACA 8910 8931 10649R AGGCACAATATTGGCTAAGAGG 10649 10628 9 1.769 10457F TCATATTTACCAAATGCCCCTC 10457 10478 12225R AGTTCTTGTGAGCTTTCTCGGT 12225 12204 10 1.816 12014F CTCACCCACCACATTAACAACA 12014 12035 13829R AGTCCTAGGAAAGTGACAGCGA 13829 13808 11 1.873 13477F GCAGGAATACCTTTCCTCACAG 13477 13498 15349R GTGCAAGAATAGGAGGTGGAGT 15349 15328 Tabla 30: Listado de los primers empleados en la amplificación del genoma mitocondrial en 11 fragmentos solapantes (Torroni et al. 2001). MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ 98 5.2 Purificación del producto de PCR en gel de agarosa El objetivo de este paso es permitir la extracción del fragmento de tamaño deseado, eliminando primers, dNTPs y otras impurezas que pueden interferir en reacciones posteriores. Para la preparación del gel de agarosa se pesan 0’8g de agarosa y se diluyen en 100mL de tampón TBE 1X (Tris/Borato/EDTA, tampón de electroforesis) aplicando calor, y se añaden 4µL de bromuro de etidio. Tras la electroforesis, se extrae la banda de interés empleando una pipeta Pasteur. La agarosa con la banda extraída del gel será introducida en tubos eppendorf de 1’5mL para continuar con su purificación. Para esta purificación se utiliza el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) según las recomendaciones del fabricante. 5.3 Reacción de secuenciación La secuenciación se llevó a cabo empleando BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (AB). Se añaden 3µL de producto de PCR purificado, 0’5µL de kit, 2’5µL de buffer 5X, 10pmoles del primer y agua hasta completar un volumen final de 12’5µL. La secuenciación se llevó a cabo en un 9700 Thermocycler (AB): Proceso Temperatura (ºC) Tiempo Inicio 96 3’ Ciclos (25) Desnaturalización 96 30’’ Anillamiento 50 15’’ Extensión 60 4’ Fin 4 ∞ Tabla 31: Condiciones para la reacción de secuenciación de fragmentos grandes del ADNmt con BigDye®. Para la secuenciación de cada amplicón se emplean en general tres primers forward (excepto para el amplicón seis), y las condiciones se detallan en la siguiente tabla (Torroni et al. 2001): ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 99 Primers de secuenciación Amplicón Nombre Secuencia (5’→3’) Posición nucleotídica 5’ Posición nucleotídica 3’ 1 14948F CACATCACTCGAGACGTAAA 14948 14967 15564F ATTTCCTATTCGCCTACACA 15564 15583 131R ACAGATACTGCGACATAGGG 131 112 2 16522F TAAAGCCTAAATAGCCCACA 16522 16541 584F TAGCTTACCTCCTCAAAGCA 584 603 1060F AAGACCCAAACTGGGATTAG 1060 1079 3 1445F GAGTGCTTAGTTGAACAGGG 1445 1464 2047F TTTAAATTTGCCCACAGAAC 2047 2066 2509F ATCACCTCTAGCATCACCAG 2509 2528 4 3085F ATCCAGGTCGGTTTCTATCT 3085 3104 3598F CTCAACCTAGGCCTCCTATT 3598 3617 4010F ACACCCTCACCACTACAATC 4010 4029 5 4410F CAGCTAAATAAGCTATCGGG 4410 4429 5014F CCTCAATTACCCACATAGGA 5014 5033 5544F TCAAAGCCCTCAGTAAGTTG 5544 5563 6 6041F CCTTCTAGGTAACGACCACA 6041 6060 6600F CACCTATTCTGATTTTTCGG 6600 6619 7 7336F CGAAGCGAAAAGTCCTAATA 7336 7355 7937F TTCAACTCCTACATACTTCCC 7937 7957 8459F AACTACCACCTACCTCCCTC 8459 8478 8 8975F TCATTCAACCAATAGCCC 8975 8992 9589F AAGTCCCACTCCTAAACACA 9589 9608 10147F ACATAGAAAAATCCACCCCT 10147 10166 9 10498F TAGCATTTACCATCTCACTTCT 10498 10519 11081F ATAACATTCACAGCCACAGA 11081 11100 11644F CCTCGTAGTAACAGCCATTC 11644 11663 10 12114F ACATCATTACCGGGTTTTC 12114 12132 12600F ATTCATCCCTGTAGCATTGT 12600 12619 13134F AGCAGAAAATAGCCCACTAA 13134 12153 11 13568F TTACTCTCATCGCTACCTCC 13568 13587 14103F CTCTTTCTTCTTCCCACTCA 14103 14122 14603F GAAGGCTTAGAAGAAAACCC 14603 14622 Tabla 32: Listado de los primers empleados en la secuenciación del genoma mitocondrial (Torroni et al. 2001). 5.4 Purificación post-secuenciación y electroforesis capilar Este paso es idéntico a los explicados en la sección 4.5.2 y 4.6, aunque de forma alternativa se puede llevar a cabo la purificación con MontageTM SEQ96 Sequencing Reaction Cleanup Kit (Millipore) seguido de una purificación con SephadexTM G-10 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia), empleando las recomendaciones del fabricante. MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ 100 6 Análisis estadísticos 6.1 Contraste de hipótesis: Test χ2 En el contraste de hipótesis, la hipótesis nula (H0) es que no existe asociación entre el SNP y el estatus de la enfermedad, mientras que la hipótesis alternativa (H1) asume que sí hay asociación. La finalidad del test χ² es comprobar si existe independencia entre la variable estatus de la enfermedad (caso-control) y la presencia o ausencia de una determinada variante genética. Ello se realiza comparando lo “observado” (frecuencias muestrales) frente lo que cabría esperar en caso de que efectivamente fuesen independientes. Obviamente, diferencias entre lo observado y lo esperado existirán siempre, pero el test χ² permite discernir si dichas diferencias pueden ser atribuidas al azar o si efectivamente existe asociación entre las variables. El p-valor obtenido para un test χ² nos indica la probabilidad de que los resultados observados se deban únicamente al azar, de ahí que consideremos que existe asociación cuando un p-valor es pequeño (en muchas ocasiones, α=0’05 es considerado el “umbral de decisión”). Para este análisis se utilizaron programas informáticos que crean tablas de contingencia 2 x 2. SNP1 Caso Control Alelo rCRS a b a +b Variante c d c + d a + c b + d Total Tabla 33: Tabla de contingencia para los valores observados. SNP1 Caso Control Alelo rCRS Variante Tabla 34: Tabla de contingencia para el cálculo de los valores esperados. ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 101 Con estos datos se calcula el valor del estadístico χ2, que es la suma de los cuadrados de la diferencia absoluta entre los valores observados y esperados en relación al valor esperado: El valor de χ2 puede ser comparado con valores tabulados cuando el tamaño muestral es muy grande. Existen tablas con estos valores en función del umbral de decisión seleccionado (α) y de los grados de libertad. Los grados de libertad son igual al producto del número de filas menos 1, (r-1), por el número de columnas menos 1, (k-1). Así, para el caso en el que se estudie la relación entre dos variables dicotómicas (tabla 2x2) los g.l. son 1. El test χ2 es un test no dirigido (test de planteamiento bilateral), que indica si existe o no relación entre dos factores pero no en qué sentido se produce tal asociación. De ser cierta la hipótesis nula, el valor obtenido debería estar dentro del rango de mayor probabilidad según la distribución χ² correspondiente. El p-valor que usualmente reportan la mayoría de paquetes estadísticos es la probabilidad de obtener, según esa distribución, un dato más extremo que el que proporciona el test. Si el p-valor es muy pequeño (usualmente se considera p<0’05) es poco probable que se cumpla la hipótesis nula y se debería de rechazar. Cuando los valores observados sean iguales o inferiores a cinco, se emplea el test exacto de Fisher. 6.2 Cálculo de Odds Ratio (OR) El Odds Ratio (OR) es el cociente entre la probabilidad de que un evento suceda entre la probabilidad de que no suceda. Es una medida que cuantifica el efecto de la variable genética sobre el estatus de la enfermedad. I.C.= Siempre toma valores positivos:  El valor neutro es uno: no asociación  Valores mayores de uno indican factor de riesgo MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ 102  Valores menores de uno indican factor protector El I.C. permite cuantificar la significancia del valor de OR obtenido. Sin embargo, habitualmente, sólo se tiene en cuenta un OR estadísticamente significativo (es decir, aquel cuyo intervalo de confianza no contiene el uno) si éste va acompañado de un valor de P significativo para un test de contraste de hipótesis. 6.3 Corrección por test múltiple Cuando realizamos un test de asociación (como el χ²) existe una probabilidad (igual a 0’05 si hemos considerado ese “umbral de decisión”) de cometer un error cuando consideremos que existe asociación entre una variante y la enfermedad. El problema es que cuando se estudian varios SNPs la probabilidad de que alguno de ellos aparezca como estadísticamente asociado, para el umbral de decisión adoptado y debido al azar, aumenta de forma proporcional al número de SNPs o hipótesis estudiadas. La forma de solucionarlo es, generalmente, restringiendo el “umbral de decisión”, que debe ajustarse en función del número de hipótesis planteadas. Existen varios métodos para corregir el umbral de significación en estos casos, entre ellos: • Corrección Bonferroni: corrige el umbral de decisión dividiéndolo por el número de test que se están llevando a cabo. Es excesivamente conservativo y, sin embargo, la corrección universalmente aceptada. • Test de permutación test: consiste en obtener N p-valores permutando la variable estatus de la enfermedad en casos y controles, es decir, obtener una distribución empírica de los valores de χ2 cuando cambiamos las etiquetas de casos y de controles a los individuos de nuestra muestra, pero manteniendo los genotipos. El p-valor corregido será igual a la proporción de los N pvalores menores que el p-valor original. ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 103 6.4 Análisis de supervivencia: log Rank Se denomina análisis de supervivencia al conjunto de técnicas que permiten estudiar la variable “tiempo hasta que ocurre un evento” y su dependencia de otras posibles variables explicativas, que a su vez pueden ser fijas en el tiempo (sexo, marcadores genéticos,…) o variables. El tiempo de supervivencia se define como el tiempo transcurrido desde el acontecimiento o estado inicial hasta el estado final. En nuestro caso, el objetivo era analizar si existían diferencias significativas en las curvas de supervivencia de pacientes de esquizofrenia en función de sus linajes mitocondriales. Para comparar si las diferencias observadas en dos curvas de supervivencia pueden ser explicadas o no por el azar, se empleó la prueba log Rank, que compara el número de eventos observados en cada grupo con el número de eventos esperados. El número esperado de pérdidas para un grupo se calcula multiplicando el número total de pérdidas en un periodo dado por la proporción de pacientes en ese grupo. Se emplea la prueba χ² para analizar si existen diferencias entre las pérdidas observadas y esperadas, siendo la hipótesis nula que las distribuciones de supervivencia son iguales en ambos grupos. 6.5 Regresión logística Los modelos de regresión logística son modelos estadísticos en los que se desea conocer la relación entre una variable dependiente cualitativa dicotómica (regresión logística binaria o binomial) o con más de dos valores (regresión logística multinomial) y una o más variables explicativas independientes (covariables), ya sean cualitativas (dicotómicas) o cuantitativas. La ecuación logística de partida es: Siendo P(y=1|x) la probabilidad de que y tome el valor uno en presencia de las covariables x (x1, x2, …xn). b0 es la constante del modelo o el término independiente, n es el número de covariables, bi los coeficientes de las covariables MATERIAL Y MÉTODOS ________________________ 104 y xi las covariables que forman parte del modelo. La ecuación inicial del modelo es de tipo exponencial, aunque su transformación logarítmica (logit) permite su uso como una función lineal: Los modelos de regresión logística tienen dos finalidades: • Explicativa: cuantifica la importancia de la relación existente entre cada una de las covariables y la variable explicativa, teniendo en cuenta la presencia de otros factores. • Predictiva: construye un modelo que permite predecir el valor de la variable dependiente (clasifica individuos dentro de las categorías de esta variable) dada la presencia de determinadas covariables. También permite analizar el peso a cada una de las variables independientes como predictoras de la variable dependiente. En nuestro caso, la variable explicativa es dicotómica y hace referencia al estatus de la enfermedad (0 en caso de ausencia de la enfermedad y 1 para presencia). 6.6 Análisis filogenéticos Las estimas de diversidad genética, como la divergencia de secuencia que presentan los genomas de dos especies o individuos, se obtienen mediante la comparación de dichas secuencias. Para la obtención de las estimas de divergencia de secuencia (δ) inter e intrapoblacionales se puede emplear, entre otros, el método Nei y Tajima de máxima verosimilitud, que considera la proporción de posiciones compartidas entre dos haplotipos en relación al número total de bases. Sin embargo, los métodos basados en parsimonia son más comunes en el análisis de secuencias mitocondriales. Así por ejemplo, se pueden emplear algoritmos tales como “Reduced-Median” o “Median-Joining”, que asumen la existencia de reconstrucciones filogenéticas alternativas igualmente parsimoniosas que pueden explicar los mismos estados de carácter. Las relaciones filogenéticas entre un ________________________ MATERIAL Y MÉTODOS 105 grupo de organismos pueden representarse gráficamente mediante árboles filogenéticos que consisten en nodos (unidades taxonómicas) conectados por ramas. Para poder distinguir entre un carácter ancestral y uno derivado es necesario que este tipo de árbol tenga una raíz o “outgroup” (grupos externos). El árbol elegido es el que requiere el mínimo número de eventos mutacionales para explicar la distribución de los caracteres entre los individuos a estudiar. En ocasiones existen ambigüedades en los datos que se resuelven mediante la formación de redes para indicar los caminos filogenéticos alternativos. Además, se pueden obtener estimas sobre la escala temporal de eventos evolutivos aplicando la tasa de mutación del genoma mitocondrial. Por ejemplo, a partir de la tasa de divergencia de secuencia de dos linajes y empleando una tasa de substitución adecuada, se puede estimar el tiempo que hace desde que ambos linajes divergieron, o lo que es lo mismo, calcular la edad del antepasado común más reciente (TMRCA) de ambos. 6.7 Otros análisis realizados De forma puntual se han utilizado otros procedimientos que se describen brevemente a continuación: 1.1.1 Análisis de ancestralidad El programa Structure (http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html) permite, mediante un modelo basado en clusters, inferir la estructura poblacional de una muestra y asignar para cada individuo una probabilidad de pertenencia a diferentes clusters (membership). En nuestro caso se empleó un panel de 34 SNPs informativos de ancestralidad (AIMs, Ancetral Informative Markers) (Phillips et al. 2007) que se caracterizan por presentar distribuciones de frecuencias alélicas muy contrapuestas entre los principales grupos poblacionales, africanos, nativo americanos y europeos. De esta forma, gracias al genotipado previo de muestras pertenecientes a estos grupos poblacionales, se pudo estimar la ancestralidad de nuestras muestras, intentando controlar así el efecto de estratificación poblacional. RESULTADOS ___________________________________ 112 ___________________________________ RESULTADOS 113 RESULTADOS ___________________________________ 114 ___________________________________ RESULTADOS 115 Artículo 2: New Population and Phylogenetic Features of the Internal Variation within Mitochondrial DNA Macro-Haplogroup R0 Vanesa Álvarez-Iglesias, Ana Mosquera-Miguel, María Cerezo, Beatriz Quintáns, María Teresa Zarrabeitia, Ivon Cuscó, María Victoria Lareu, Óscar García, Luis Pérez-Jurado, Ángel Carracedo, Antonio Salas (2009) PLoS ONE 4(4) Nuevas características poblacionales y filogenéticas de la variación interna dentro del macro-haplogrupo R0 del ADN mitocondrial ABSTRACT/RESUMEN: Contexto: El macro-haplogrupo R0 engloba al linaje de ADN mitocondrial (ADNmt) más abundante en Eurasia occidental, el haplogrupo H (~40%). Los sublinajes de R0 están mal caracterizados en la región control y por ello es necesario el análisis de polimorfismos diagnósticos de la región codificante para ganar la resolución en estudios poblacionales y clínicos. Metodología/Resultados principales: En este trabajo se secuenció la región hipervariable I (HVS-I) de 518 individuos de diferentes regiones del norte de Iberia. Los ADNmt pertenecientes a R0 (57%) se genotiparon con un set de 71 SNPs de la región codificante que caracterizan los principales sub-linajes, además de otras ramas menores, de R0. Se encontraron niveles moderados de estratificación poblacional en el norte de la Península Ibérica; por ejemplo, el haplogrupo V alcanza la máxima frecuencia en Cantabria (norte-centro de Iberia), mientras que las frecuencias son menores en Galicia (noroeste de Iberia) y Cataluña (noreste de Iberia). Cuando se compararon con otras poblaciones europeas y de Oriente Medio, se observó que los haplogrupos H1, H3 y H5a mostraban picos de frecuencia en la región Franco-Cantábrica, disminuyendo hacia este y sur de Europa. Además, se ha caracterizado un nuevo clado del haplogrupo H autóctono del País Vasco, H2a5, mediante secuenciación de genomas completos. RESULTADOS ___________________________________ 116 Su edad de coalescencia, 15668 años de antigüedad, data del periodo inmediatamente posterior al Último Máximo Glacial. Conclusiones/Importancia: En contraste con otros sub-linajes del haplogrupo H que experimentaron una re-expansión fuera del refugio Franco- Cantábrico después de la última glaciación (por ejemplo, H1 y H3), H2a5 probablemente permaneció confinado a esta área hasta la actualidad. ___________________________________ RESULTADOS 117 RESULTADOS ___________________________________ 118 ___________________________________ RESULTADOS 119 RESULTADOS ___________________________________ 120 ___________________________________ RESULTADOS 121 RESULTADOS ___________________________________ 128 ___________________________________ RESULTADOS 129 RESULTADOS ___________________________________ 130 ___________________________________ RESULTADOS 131 RESULTADOS ___________________________________ 132 ___________________________________ RESULTADOS 133 Artículo 4: Investigating the Role of Mitochondrial Haplogroups in Genetic Predisposition to Meningococcal Disease A Salas, L Fachal, S Marcos-Alonso, A Vega, F Martinón-Torres, JM Martinón Sánchez, F Pardo Sánchez, A Mosquera-Miguel, M Fondevila, V Álvarez-Iglesias, JM Sánchez Granados, M Silveira Cancela, JL García Rodríguez, S Rey García, C Calvo Monge, V Pineda Solas, C Pérez Caballero Macarrón, JA Alonso Martín, D Arjona Villanueva, P Azcón González de Aguilar, X Allué Martínez, A Concha Torre, JL Ruibal Francisco, M González- Ripoll Garzón, F Giménez Sánchez, A Reparaz Romero, M Ortiz Pallares, ML Millán Millares, MC Martínez Padilla, R Gómez Zafra, Á Castellanos Ortega, J Casado Flores, A Ferrer Barba, A Hurtado Doce, A Bustinza Arriortua, ML Navarro Gómez, E Esteban Torné, S Cañadas Palazón, C Calvo Macías, E Morteruel Arizkuren, J López Bayón, S Martínez Regueira, JL Pérez Navero, MT Alonso Salas, MM Ballesteros García, JI Muñoz Bonet, S Pantoja Rosso, E Bernaola Iturbe, C Goñi Oraven, F Alvarado Ortega, N Molini Menchón, S Fernández Cebrián, M Baca Cots, MF Martins Prata, E Ocete Hita, M Sánchez Fernández, I Quintela Fernández, R López Peña. (2009) PLoS ONE 4(12) Evaluando el papel que juegan los haplogrupos mitocondriales como factores genéticos de predisposición a la enfermedad meningocócica ABSTRACT/RESUMEN: Contexto y objetivos: La enfermedad meningocócica constituye una de las principales causas de muerte por infección en los países industrializados. La gran diversidad en la presentación clínica y en el pronóstico de las infecciones causadas por Neisseria meningitidis son el resultado de interacciones complejas entre el ambiente y el perfil genético del hospedador. En este trabajo se evaluó si el acervo genético mitocondrial confiere susceptibilidad a la enfermedad meningocócica (EM). Metodología/Resultados principales: Se llevó a cabo un estudio prospectivo a través de una red nacional de investigación en EM (red ESIGEM, Estudio Sobre la Influencia Genética en la Enfermedad Meningócocica, http://www.esigem.org) que incluye 41 hospitales españoles. Los casos en este RESULTADOS ___________________________________ 134 estudio son 307 pacientes pediátricos con EM confirmada, lo que representa la mayor serie de pacientes de EM analizada hasta la fecha. Para la comparación, se emplearon dos colecciones independientes de muestras de controles (CG1 [N= 917] y CG2 [N= 616]), emparejados por etnicidad. Se analizó en casos y controles una selección de 25 SNPs del ADNmt (mtSNPs), algunos de ellos característicos de las principales ramas europeas de la filogenia mitocondrial. Además, se le genotiparon 34 marcadores informativos de ancestralidad (AIMs) a los casos y al grupo control CG2, con el objetivo de monitorizar la estratificación poblacional que pudiese estar oculta. Como grupos de clasificación de nuestros casos y controles se emplearon muestras conocidas de población con ancestralidad africana, nativo americana y europea (N = 711). Un total de 39 individuos (incluidos 14 gitanos) fueron eliminados de los análisis estadísticos principales debido a su ascendencia (reportada a priori como) no española o a los resultados de los AIMs indicando una pertenencia europea menor del 95%. Los análisis de asociación de los restantes 268 casos contra CG1 sugirieron una sobrerrepresentación del alelo A del SNP sinónimo G11719A (test Chi-cuadrado de Pearson; P-valor ajustado= 0’0188; OR [95% IC]= 1’63 [1’22-2’18]. Sin embargo, cuando se compararon los casos frente a CG2, no se pudo replicar la asociación positiva. No se ha observado ninguna asociación debido a diferencias en la distribución de haplogrupos entre casos y controles, ni entre el haplogrupo y alguna variante clínica. Conclusiones: No encontramos evidencias de asociación entre los mtSNPs y la enfermedad meningocócica después de monitorizar cuidadosamente el efecto de confusión de la sub-estructura poblacional. En las poblaciones humanas, la variabilidad del ADNmt está particularmente estratificada debido a su pequeño tamaño poblacional efectivo en comparación con marcadores autosómicos, por lo que se debe tener especial cuidado en la interpretación de señales que aparentemente indicarían asociaciones positivas en estudios de asociación casocontrol del ADNmt. ___________________________________ RESULTADOS 135 RESULTADOS ___________________________________ 136 ___________________________________ RESULTADOS 137