Prevalencia y desarrollo larvario de Cephenemyia spp. en corzos del norte de España

Néstor Martínez Calabuig Prevalencia y desarrollo larvario de Cephenemyia spp. en corzos del norte de España Facultade de Veterinaria Grado en Veterinaria Año 2020 Modalidad del Trabajo Experimental Trabajo de Fin de Grado 1 Licencia Esta obra pertenece a NÉSTOR MARTÍNEZ CALABUIG, y está sujeta a la licencia Reconocimiento-Compartir Igual 4.0 Internacional de Creative Commons. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/ 2 Resumen Cephenemyia spp. (Diptera: Oestridae) es la causante de una miasis nasofaríngea obligatoria y específica del corzo que se encuentra ampliamente extendida en el continente europeo donde ha sido descrita desde el pasado siglo y que en las dos últimas décadas está adquiriendo relevancia en España. Se ha llevado a cabo un estudio con un total de 37 corzos fallecidos por distintas causas en el norte de España entre los años 2018 y 2020. Para visualizar las larvas del díptero se abrió longitudinalmente la cabeza de los corzos y se examinó la tráquea, faringe, laringe, sacos retrofaríngeos, cavidad oral y nasal. Una vez identificadas las larvas, se comprobó que todas eran C. stimulator. Para el análisis de los resultados se consideraron diferentes factores intrínsecos y extrínsecos. La prevalencia de infestación por C. stimulator fue del 43,2%, con una intensidad media de 16,9±22,47 larvas/animal. En total se obtuvieron 271 larvas que se localizaron sobre todo en los cornetes nasales (46,9%) y en los sacos retrofaríngeos (35,8%) y, en menor proporción, en la glotis (14,7%), la boca (1,5%) y la tráquea (1,1%). La edad y el sexo de los animales influyeron de forma significativa en la prevalencia de esta miasis, así los animales adultos (55,5%) presentan 11,7 veces más riesgo de padecer una miasis por C. stimulator que los jóvenes (0%), probablemente debido a que, estos últimos al pasar más tiempo ocultos entre la vegetación están menos expuestos a las moscas de Cephenemyia. La prevalencia en los machos (60%) fue superior que en las hembras (23,5%); el comportamiento de defensa territorial al que se ven obligados los primeros los expone más a la actividad de las moscas, de modo que el riesgo de verse infestados por Cephenemyia es 4,65 veces superior al de las hembras. En las condiciones del estudio se observó que tanto el clima, como la causa de la muerte no influyeron de forma significativa en la prevalencia de esta miasis. La clasificación de las larvas según su estadio de desarrollo reveló que la mayoría eran larvas 3 (59%), seguidas por larvas 2 (39%) y larvas 1 (2%). La prevalencia por larvas de C. stimulator fue más elevada durante la primavera (64,3%) que en invierno (30%) y otoño (0%), siendo la primavera la única estación en la que se hallaron los 3 estadios larvarios; la mayor prevalencia observada en esta estación se debe a que en esta época pueden coexistir en un mismo animal larvas procedentes de distintas temporadas. En la actualidad, la infestación por C. stimulator es una miasis prevalente en el norte de España y que, por su difícil control y repercusiones negativas sobre la salud de los corzos, podría suponer un serio problema para las poblaciones de este ungulado silvestre. Palabras clave: Corzo, Cephenemyia stimulator, desarrollo larvario, prevalencia, miasis, España. 3 Abstract Cephenemyia spp. (Diptera: Oestridae) is the cause of a nasopharyngeal myiasis, which is obligatory and specific to roe deer and is widely spread in Europe where it has been described since the last century and that in the last two decades is gaining relevance in Spain. A study has been carried out with a total of 37 roe deer that have died from different causes in the north of Spain between 2018 and 2020. To visualize the diptera larvae, the roe deer heads were opened lengthwise and the trachea, pharynx, larynx, retropharyngeal sacs, oral and nasal cavities were examined. Once the larvae were identified, they were found to be all C. stimulator. For the analysis of the results, different intrinsic and extrinsic factors were considered. The prevalence of C. stimulator infestation was 43,2%, with a mean intensity of 16,9±22,47 larvae/animal. A total of 271 larvae were obtained, mostly in the nasal turbinates (46,9%) and in the retropharyngeal sacs (35,8%) and, to a lesser extent, in the glottis (14,7%), the mouth (1,5%) and the trachea (1,1%). The age and sex of the animals significantly influenced the prevalence of this myiasis, so that adult animals (55,5%) have 11,7 times more risk of suffering from a C. stimulator myiasis than young animals (0%), probably because the latter spend more time hidden among vegetation and have less exposure to Cephenemyia flies. Prevalence in males (60%) was higher than in females (23,5%); the territorial defence behaviour of males exposed them to fly activity, so that the risk of being infested by Cephenemyia is 4,65 times higher than that of females. Under the conditions of the study, it was observed that climate and cause of death did not significantly influence the appearance of this myiais. The classification of the larvae according to their stage of development indicated that most of them were larvae 3 (59%), followed by larvae 2 (39%) and larvae 1 (2%). The prevalence of C. stimulator larvae was higher during spring (64,3%) than during winter (30%) and autumn (0%) months, spring being the only season when larvae belonging to the 3 stages were found; this higher prevalence in spring is due to the fact that larvae from different seasons can coexist in the same animal at this time. Nowadays, C. stimulator infestation is a well established myiasis in northern Spain and, due to its difficult control and negative repercussions on the health of the roe deer, could mean a serious problem for the populations of this wild ungulate. Keywords: Roe deer, Cephenemyia stimulator, larval development, prevalence, myiasis, Spain. 4 Resumo Cephenemyia spp. (Diptera: Oestridae) é a causante dunha miase nasofarínxea obrigatoria e específica do corzo que se atopa amplamente estendida no continente europeo onde está a ser descrita dende o pasado século e que nas dúas últimas décadas está adquirindo relevancia en España. Levouse a cabo un estudo cun total de 37 corzos falecidos por distintas causas no norte de España entre os anos 2018 e 2020. Para visualizar as larvas do díptero abriuse lonxitudinalmente a cabeza dos corzos e examinouse a traquea, farinxe, larinxe, sacos retrofarínxeos, cavidade oral e nasal. Unha vez identificadas as larvas, comprobouse que todas eran C. stimulator. Para a análise dos resultados consideráronse diferentes factores intrínsecos e extrínsecos. A prevalencia de infestación por C. stimulator foi do 43,2%, cunha intensidade media de 16,9±22,47 larvas/animal. En total obtivéronse 271 larvas que se localizaron sobre todo nos cornetes nasais (46,9%) e nos sacos retrofarínxeos (35,8%), e en menor proporción na glote (14,7%), boca (1,5%) e traquea (1,1%). A idade e o sexo dos animais influíron de forma significativa na prevalencia desta miase, así os animais adultos (55,5%) presentan 11,7 veces máis risco de padecer unha miase por C. stimulator que os novos (0%), probablemente debido a que, estes últimos ao pasar máis tempo ocultos entre a vexetación están menos expostos ás moscas de Cephenemyia. A prevalencia nos machos (60%) foi superior que nas femias (23,5%); o comportamento de defensa territorial ao que ven obrigados os primeiros exponos á actividade das moscas, de xeito que o risco de verse infestados por Cephenemyia é 4,65 veces superior ao das femias. Nas condicións do estudo observouse que tanto o clima, como a causa da morte non influíron de forma significativa na aparición desta miase. A clasificación das larvas segundo o seu estadio de desenvolvemento revelou que a meirande parte eran larvas 3 (59%), seguidas polas larvas 2 (39%) e larvas 1 (2%). A prevalencia por larvas de Cephenemyia foi máis elevada durante a primavera (64,3%) que en inverno (30%) e outono (0%), sendo a primavera a única estación na que se acharon os 3 estadios larvarios; a maior prevalencia observada nesta estación débese a que nesta época poden coexistir, nun mesmo animal, larvas procedentes de distintas tempadas. Na actualidade, a infestación por Cephenemyia é unha miase prevalente no norte de España e que, polo seu difícil control e repercusións negativas sobre a saúde dos corzos, podería supoñer un serio problema para as poboacións deste ungulado silvestre. Palabras chave: Corzo, Cephenemyia stimulator, desenvolvemento larvario, prevalencia, miase, España. 5 Índice 1. Introducción .......................................................................................................................... 7 1.1. Miasis nasofaríngeas que afectan a los cérvidos ................................................................ 8 1.2. Morfología de Cephenemyia spp. ..................................................................................... 10 1.3. Ciclo biológico de Cephenemyia spp. .............................................................................. 12 1.4. Cronobiología de la infestación por Cephenemyia en corzos .......................................... 14 1.5. Prevalencia e intensidad de infección por Oestrinae en corzos ........................................ 15 1.6. Factores de riesgo en la infección por Cephenemyia ....................................................... 16 1.6.1. Factores intrínsecos o dependientes del hospedador ................................................. 16 1.6.2. Factores extrínsecos o dependientes del medio ......................................................... 17 1.7. Acción patógena y signos clínicos ................................................................................... 17 2. Objetivos ................................................................................................................................. 19 3. Material y métodos .................................................................................................................. 20 3.1. Animales muestreados...................................................................................................... 20 3.2. Recolección de las larvas ................................................................................................. 21 3.3. Análisis estadísticos ......................................................................................................... 25 4. Resultados y discusión ............................................................................................................ 26 4.1. Identificación de los parásitos hallados ............................................................................ 26 4.2. Prevalencia e intensidad de parasitación por larvas de C. stimulator .............................. 27 4.3. Prevalencia e intensidad al tener en cuenta los distintos factores de riesgo ..................... 30 4.3.1. Prevalencia e intensidad al tener en cuenta los factores dependientes del hospedador .......................................................................................................................... 30 4.3.2. Prevalencia e intensidad al tener en cuenta los factores dependientes del medio ..... 35 4.4. Cronobiología y desarrollo de las distintas fases larvarias de C. stimulator en el área de estudio ..................................................................................................................................... 41 4.4.1. Desarrollo larvario en función de las zonas climáticas ............................................. 41 4.4.2. Desarrollo larvario en función de la época del año ................................................... 43 5. Conclusiones ........................................................................................................................... 45 6. Bibliografía ............................................................................................................................. 46 6 Abreviaturas • a.C.: antes de cristo • ANOVA: análisis de varianza • ºC: grados Celsius • CO2: dióxido de carbono • DE: desviación estándar • kg: kilogramos • km: kilómetros • km/h: kilómetros por hora • L1: larvas 1 • L2: larvas 2 • L3: larvas 3 • m: metros • mm: milímetros • Nº: número • OR: odds ratio • PBS: Phosphate Buffered Saline • s.: siglo 7 1. Introducción El corzo (Capreolus capreolus) es un mamífero rumiante y ungulado que pertenece a la familia Cervidae y como tal, cumple dos características típicas de esta: por un lado, en el caso de los machos, disponen de unas cuernas que renuevan anualmente; y por otro lado, pisan sobre los dos dedos centrales de cada extremidad que se encuentran protegidos por pezuñas (Fidalgo et al., 2009). Alcanzan un peso medio de 25 kg y es el cérvido de menor tamaño que habita en España, aunque se trata de uno de los pocos mamíferos salvajes que se encuentra en expansión gracias a su buena adaptación a los bosques de la península ibérica (Fernández & Valls, 2008; Fidalgo et al., 2009). El celo tiene lugar en los meses de verano, en el que suceden combates entre los machos, pero no tan violentos como en otras especies de cérvidos. Tras la fecundación, con el objetivo de que las crías nazcan en la época de mayor disponibilidad de alimento, hay un periodo de diapausa embrionaria que consiste en que se detiene el desarrollo del óvulo fecundado hasta la reanudación del ciclo en los meses de noviembre – diciembre con la implantación y comienzo de la gestación. De esta forma los partos se concentran en la primavera durante los meses de abril – mayo, en los que nacen una o dos crías (Fernández & Valls, 2008; Fidalgo et al., 2009). Como consecuencia del pequeño tamaño de su rumen, deben seleccionar el alimento más nutritivo y digestible y debido a su corto tracto digestivo necesitan alimentarse frecuentemente e ingerir pequeñas cantidades. Además, se adaptan excelentemente a las condiciones alimentarias del hábitat en el que se encuentren (Fidalgo et al., 2009). Presentan un pelaje de color gris oscuro en los meses de invierno (Ilustración 1) y más rojizo según se van acercando los meses de verano. Tienen una mancha de color blanquecino en la parte trasera, cuya forma varía entre hembras y machos (Darmangeat, 2014). Por lo general, son animales solitarios y leales a la zona que habitan. Se inclinan por los lugares que combinan áreas abiertas y zonas boscosas. El territorio que ocupan los machos es mayor que el de las hembras, y en ocasiones, un macho puede ocupar el territorio de varias hembras (Fidalgo et al., 2009). Ilustración 1. Hembra de corzo en busca de alimento durante el invierno de 2018 en La Pernía (Palencia). 8 1.1. Miasis nasofaríngeas que afectan a los cérvidos Zumpt (1965) definió el término miasis como ‘‘la infestación de animales vertebrados vivos con larvas de dípteros, las cuáles durante al menos un cierto periodo se alimentan de los tejidos vivos o muertos del hospedador, líquidos corporales o comida ingerida’’. La familia Oestridae está formada por distintos géneros cuyas larvas son parásitos obligados de vertebrados, generalmente mamíferos. En función de su localización los oéstridos pueden causar miasis cutáneas (Hypodermatinae y Cuterebrinae), intestinales (Gasterophilinae) y nasofaríngeas (Oestrinae). En la Ilustración 2, se resume, la clasificación taxonómica de Cephenemyia spp. y Pharyngomyia spp., así como de sus principales hospedadores. Ilustración 2. Clasificación taxonómica de Cephenemyia spp. y Pharyngomyia spp. 15 del corzo que llevarían a la muerte del animal y por tanto del parásito. Por ello siempre se encontrarán larvas en distintos estadios de desarrollo en los corzos parasitados (Angulo-Valadez et al., 2010; Arias et al., 2016; Pajares, 2016). 1.5. Prevalencia e intensidad de infección por Oestrinae en corzos Las miasis en cérvidos son conocidas desde hace siglos cuando Aristóteles ya hablaba sobre su presencia en ciervos (s. IV a.C.). Sin embargo, el estudio de las miasis nasofaríngeas en corzos es mucho más reciente. Actualmente la cefenemiosis se encuentra ampliamente distribuida en Europa, pero no fue hasta el año 2001 cuando se describió el primer caso de C. stimulator en corzos en nuestro país. Se trataba de un corzo que presuntamente ya estaba infestado y que se trajo de Francia en 1997 a una finca de caza de Castilla-La Mancha. Posteriormente, a mediados de la década de los 2000 se hallaron corzos autóctonos parasitados en el área noroeste del país (Pajares, 2009; Arias et al., 2012; Fidalgo, 2012; Pajares et al., 2017). Se han encontrado resultados discordantes entre prevalencias e intensidades obtenidas de estudios realizados en diferentes países de Europa. En un estudio realizado durante 3 años en Hungría se obtuvo una prevalencia de infestación por C. stimulator del 34,6% y una intensidad de unas 5 a 9 larvas por animal. Esa intensidad se veía incrementada progresivamente desde abril a agosto (Király & Egri, 2007). Otro trabajo llevado a cabo durante 8 años en República Checa obtuvo unas prevalencias entre 16,1 a 42,9% por año con una intensidad media similar al obtenido en el estudio húngaro, con 6 a 11 larvas por animal. Sin embargo, en contraposición con el estudio anterior, llegaron a la conclusión de que la intensidad de infestación fue mayor en los meses de mayo disminuyendo gradualmente hasta septiembre (Salaba et al., 2013). Otra investigación realizada hace varias décadas en Polonia describió una prevalencia de hasta el 85% con una intensidad media de 32 larvas por corzo (Dudzinski, 1970). Este estudio se contrapone con uno realizado en ese mismo país más recientemente por Kornaś et al. (2016) en el que se observó una prevalencia relativamente baja del 13% y una intensidad acorde al obtenido en los trabajos realizados en Hungría y República Checa, con 1 a 10 larvas por hospedador. Entre los años 2012 y 2013 se realizó un informe a partir de los datos obtenidos de corzos de diversos puntos de la península ibérica, predominando los ejemplares obtenidos en el noroeste. La prevalencia obtenida fue de un 16,50% siendo el número de positivos más elevado en Galicia, Asturias y León. Si únicamente se tenían en cuenta los ejemplares analizados en el resto de las 16 provincias de Castilla-León y en Castilla-La Mancha la prevalencia disminuía significativamente hasta un 5,83% (Fidalgo et al., 2013). En otro estudio llevado a cabo en el año 2012 en la provincia Lugo se obtuvo una positividad del 57% con una intensidad media de 5 larvas por corzo. A parte de estos datos, si se tenían en cuenta únicamente corzos hallados muertos en la región montañosa de los Ancares la media de larvas encontrados en estos fue muy alta (67 larvas), posiblemente motivo de su deceso (Arias et al., 2012). Por último, otro trabajo reciente realizado en las comunidades de Galicia y Asturias reflejó una prevalencia en corzos del 31,6% con una intensidad media de 19,67±21 larvas por hospedador (Pajares et al., 2017). Todos estos estudios llevan a la conclusión de que independientemente del origen de la infestación y de su distribución y entrada en España, actualmente es un problema que está presente y se ha establecido en la península ibérica. Esto podría conllevar un riesgo para la población de corzos en nuestro país debido al difícil control de la enfermedad y los problemas que puede ocasionar en su estado de salud (Calero-Bernal & Habela, 2013). 1.6. Factores de riesgo en la infección por Cephenemyia 1.6.1. Factores intrínsecos o dependientes del hospedador Según un estudio realizado por Dudziński (1970) en Polonia los corzos machos estaban más infestados que las hembras y los jóvenes más que los de mayor edad. Sin embargo, en un trabajo más reciente llevado a cabo por Kornás et al. (2016) en ese mismo país, se observó que los machos y los animales de más edad eran los más infestados. Király & Egri (2007) en un estudio realizado, entre los años 2002 y 2005, en Hungría observaron que tanto la prevalencia como la intensidad eran superiores en los jóvenes que en los adultos; hecho que fue atribuido a una menor respuesta inmune o a una menor eficiencia de comportamiento defensivo frente al vuelo de las moscas por parte de los animales jóvenes. Otra investigación realizada en corzos abatidos en Galicia y Asturias reflejó una mayor prevalencia de infestación en adultos, aunque eran los ejemplares jóvenes los que albergaban una mayor carga parasitaria. Del mismo modo, también se observó que los machos fueron los más parasitados, pero la carga de Cephenemyia era superior en las hembras positivas. Esto se achacó a la mayor competencia de territorio entre los machos que hace que en ocasiones ocupen zonas donde el alimento escasea o es de menor calidad de forma que decae su sistema inmunitario (Pajares, 2016; Pajares et al., 2017). 17 Un informe realizado por Fidalgo et al. (2013) a partir de corzos obtenidos en distintos puntos de la península trató de establecer un criterio en función del grado de condición corporal de los corzos. Sin embargo, este estudio no mostró diferencias significativas entre los corzos parasitados y los sanos observando valores normales para la especie en ambos. 1.6.2. Factores extrínsecos o dependientes del medio Pajares (2016) y Pajares et al. (2017) en corzos de Galicia y Asturias encontraron diferencias de infestación por C. stimulator entre los corzos procedentes de zonas montañosas y de clima oceánico. El número de animales positivos en ambas zonas fue similar, aunque los corzos abatidos en el área montañosa tenían una mayor carga parasitaria. Al considerar los meses del año, no se observaron larvas entre agosto y noviembre, ni en enero, ni febrero, mientras que, en diciembre se hallaron larvas de primer y segundo estadio. Estos resultados llaman un poco la atención, aunque como su autor relata pudieron ser debidos a un menor número de animales muestreados en ese periodo o a la dificultad para visualizar las L1 en animales con una baja carga parasitaria debido a su ínfimo tamaño. En el mes de marzo únicamente se detectaron L2 mientras que en los meses siguientes hasta julio se encontraron larvas de los 3 estadios, aunque predominaban las L3. Además, se observó que tanto en las áreas de montaña como en las de clima oceánico la prevalencia de infestación era mayor cuando las temperaturas mínimas eran más elevadas y las precipitaciones escasas. 1.7. Acción patógena y signos clínicos C. stimulator puede causar problemas de salud en su hospedador. En primer lugar, la presencia de las moscas adultas volando alrededor de su hospedador para la larviposición genera a estos estrés y nerviosismo. Consecuencia de ello, corren descontroladamente, sacuden la cabeza, golpean las patas contra el suelo y aumenta su estado de alerta con el fin de librarse del díptero, de forma que disminuye la ingestión y el aprovechamiento del alimento ingerido. Esta circunstancia ha hecho que, en las zonas endémicas, los corzos eviten salir a áreas abiertas durante el mediodía, momento y zona, en el que las moscas desarrollan su mayor actividad (Calero-Bernal & Habela, 2013; Kornaś et al., 2016; Pajares, 2016). A parte del estrés, la presencia de las larvas en las vías aéreas superiores origina un cuadro de sinusitis con toses, estornudos, descarga nasal y dificultad respiratoria o para tragar el alimento. Las espinas y ganchos de Cephenemyia dificultan su expulsión por parte del hospedador. Estas no son hematófagas, sino que se alimentan de proteínas plasmáticas y anticuerpos de los líquidos que se originan como consecuencia del proceso inflamatorio originado por las lesiones de la mucosa debido a sus ganchos y espinas. Además de este daño mecánico, las larvas segregan proteasas liberando óxido nítrico que contribuye a irritar y erosionar la mucosa nasal y favorece 18 infecciones bacterianas secundarias. También se alimentan de mucina y colágeno de la membrana basal (McMahon, 1989; Angulo-Valadez et al., 2010; Calero-Bernal & Habela, 2013; Pajares, 2016). En el examen histopatológico de los sacos retrofaríngeos se observa dilatación de estos, con erosión y deterioro de las células epidérmicas (McMahon, 1989). El número de larvas es el que determinará la gravedad de la situación. La presencia de entre 30 y 80 larvas, pueden ser suficiente para ocasionar una alta mortalidad consecuencia de la inmunosupresión, debilidad, reducción de la condición corporal, inapetencia, letargo, pérdida de la capacidad reproductiva, presa más fácil para sus depredadores, etc., así como tener repercusiones para los cazadores ya que obtienen canales con reducido peso o trofeos de menor valor cinegético (Arias et al., 2016; Kornaś et al., 2016; Pajares, 2016). En determinadas ocasiones las larvas también pueden morir en el interior del hospedador sin llegar a completar su ciclo. Estas larvas se necrosan y se descomponen formándose un foco de inflamación alrededor que da lugar a un absceso que puede fistulizar hacia el exterior. En otras situaciones las larvas pueden realizar una migración errática causando cuadros y lesiones en la zona en la que se implanten, incluso provocar problemas neurológicos cuando migran y se establecen en el cerebro (Kornaś et al., 2016; Pajares, 2016). 19 2. Objetivos Teniendo en cuenta la creciente detección de la infestación por Cephenemyia spp. en corzos, hemos planteado un estudio encaminado a conseguir los siguientes objetivos: 1. Determinar la prevalencia e intensidad de infestación por Cephenemyia en corzos del norte de España. 2. Identificación específica de las larvas de Cephenemyia. 3. Determinar la influencia de distintos factores como la edad, sexo y procedencia de los animales sobre la prevalencia e intensidad de la infestación. 4. Establecer la cronobiología de las distintas fases larvarias del parásito en el área de estudio. 20 3. Material y métodos 3.1. Animales muestreados El estudio se llevó a cabo entre septiembre de 2019 y marzo de 2020, estudiándose un total de 37 cabezas de corzo que se habían obtenido entre los años 2018 y 2020 y que procedían de distintas zonas de Galicia y Cantabria. La mayoría de las cabezas fueron remitidas por el Servicio de Patrimonio Natural de la Xunta de Galicia y procedían de animales muertos de forma accidental (Tabla 2). Las muestras fueron enviadas en bolsas de plástico numeradas y herméticas en las que se incluían la cabeza y el cuello del animal, junto con una ficha en la que se indicaban distintos datos referentes al mismo y que se reflejan en la Tabla 2. En el caso de los corzos abatidos en las cacerías se aportaba un documento para verificar la legalidad de la actividad realizada (datos del titular del coto de caza, así como del cazador y modalidad de caza) a parte de los datos incluidos en la Tabla 2. Tabla 2. Distribución de los animales en función de las distintas variables. Factor Categoría Nº animales Sexo Macho 20 Hembra 17 Edad Adulto viejo 20 Adulto joven 6 Joven 6 Causa de la muerte Accidental 28 Natural 5 Cacería 4 Área climática Montaña 3 Interior 27 Costa 7 Provincia Lugo 34 Cantabria 3 Año 2018 11 2019 21 2020 5 Estación del año Primavera 14 Verano 8 Otoño 5 Invierno 10 Una vez en el laboratorio de Parasitología y Enfermedades parasitarias de la Facultad de Veterinaria, se mantuvieron en congelación (-20º C) hasta su posterior procesado. 21 La edad de los animales se determinó a través del método de erupción, remplazamiento y desgaste dentario, considerándose 3 grupos de edad: joven (< 2 años), adulto joven (2-5 años) y adulto (> 5 años). Solo se pudo calcular la edad de 32 corzos, en los 5 restantes no fue posible estudiar su dentadura por lo que únicamente se conocía si eran jóvenes o adultos. Para el estudio del área climática de procedencia de los corzos se han considerado 3 zonas, basándonos en la altitud de la zona y su distancia del mar: Montaña (altitud >900 m), Costa (<40 km del mar) e Interior (altitud <900 m y >40 km del mar). Finalmente, al considerar la época del año, debido al escaso número de corzos en alguno de los meses, se han agrupado teniendo en cuenta la estación en la que se produjo su muerte (primavera, verano, otoño e invierno). 3.2. Recolección de las larvas El instrumental necesario para la apertura de las cabezas, así como el material para conservar las larvas en caso de que estas fueran positivas, fue el siguiente (Ilustración 4): • Guantes • Mono de trabajo • Gafas de protección • Pinzas de distintos tamaños • Pinzas con diente de ratón • Mango de bisturí del número 4 • Hoja de bisturí del número 22 • Tijeras • Tenazas • Sierra de sable • Placas Petri • Regla • Bolígrafo • Papel • Pipeta Pasteur • Etanol al 70% • PBS (Phosphate Buffered Saline) • Tubos de plástico de distintos volúmenes Las cabezas, se descongelaron a temperatura ambiente durante 12 horas, realizándose a continuación el siguiente protocolo: 1. Inspección externa: en primer lugar, se colocaba la cabeza del corzo/a sobre la mesa y se hacía una inspección externa a contrapelo en busca de lesiones y parásitos externos Ilustración 4. Instrumental necesario para la inspección, disección y conservación. 22 que, en caso de existir, también eran recolectados y conservados en tubos de ensayo con etanol al 70%. En este examen externo, también se prestaba atención al desgaste de los dientes para poder establecer la edad estimada del animal (Ilustración 5). También se inspeccionaron los ollares con objeto de ver larvas que se encontraran entrando o saliendo del hospedador. 2. Inspección interna: una vez finalizada la inspección externa se colocaba la cabeza apoyada sobre las cuernas en el caso de los machos o sobre el hueso frontal en las hembras. Con el bisturí se efectuaba un corte de la piel a lo largo de la línea media de la cara ventral del cuello y la cabeza. Una vez localizada la tráquea, se abría con la tijera y se anotaba la presencia de larvas de Cephenemyia spp. u otros parásitos. A continuación, se procedía al corte de los cartílagos laríngeos con ayuda de las tenazas, y de esta forma Ilustración 5. Clasificación de los corzos en base a su edad. (a) ejemplar joven en el que se aprecia la corona de los dientes con el esmalte blanquecino sin apenas desgaste; (b-c) ejemplares adultos en los que se observa una retracción de la encía mostrando el cuello y el inicio de la raíz del diente (b) y un gran desgaste de las piezas dentarias además de una coloración amarillenta (c). 23 se accedía a la faringe y sacos retrofaríngeos. En caso de encontrar larvas en el individuo, estas se iban extrayendo una a una por medio de las pinzas hasta que los sacos se vaciasen y se depositaban sobre una placa Petri con PBS, para su limpieza. Posteriormente, se retiraba la mandíbula inferior de la cabeza y se separaba la piel de la parte dorsal de la cabeza, quedando el hueso al descubierto. De esta forma, se sujetaba la cabeza en vertical, y se efectuaba un corte sagital con la sierra de sable a bajas revoluciones, para evitar la destrucción de las larvas en caso de su presencia. Así, se podía observar los cornetes nasales de ambos lados, una de las localizaciones más frecuentes de las larvas (Ilustración 6). Ilustración 6. Proceso de disección de las cabezas. (a-c) colocación de la cabeza y apertura de piel y tráquea; (d-e) acceso a faringe, sacos retrofaríngeos e inicio de los cornetes nasales; (f) separación de la piel de la parte dorsal de la cabeza; (g) exploración de los cornetes nasales. 24 3. Conservación de las larvas: tras recolectar todas las larvas de un animal y anotar su procedencia anatómica, se lavaron en PBS, se midieron y se almacenaron en tubos con etanol al 70% hasta su posterior estudio. Todos los tubos eran numerados con el código del corzo al que pertenecían. Aquellas larvas que se encontraban muy degeneradas, fragmentadas o putrefactas se contabilizaron y midieron, pero se prescindió de ellas en el estudio morfológico (Ilustraciones 7 y 8). 4. Identificación y clasificación de las larvas: Una vez procesadas todas las cabezas, se procedió al estudio de las larvas recogidas. En primer lugar, se clasificaron en función de su estado de desarrollo en larvas 1, 2 ó 3, teniendo en cuenta los siguientes parámetros: • Longitud total. • Color de la cutícula. • Grado de desarrollo de las placas respiratorias (forma y color). Para ello, se volvió a realizar otra medición de las larvas para comprobar si estas se habían retraído por efecto del medio de conservación (solución de etanol al 70%). Ilustración 7. Diferentes estadios larvarios (L1, L2 y L3) de Cephenemyia spp. en solución de PBS tras su extracción. Ilustración 8. Medición de una larva de Cephenemyia spp. (L3: 27 mm). 31 Como se refleja en la Gráfica 3, en los animales menores de 2 años no se hallaron larvas de C. stimulator (0%), mientras que, en los adultos jóvenes se detectó menor prevalencia (33,3%) que en los viejos (60%). No obstante, mediante la prueba de Fisher se comprobó que no existían diferencias significativas entre los 3 grupos de edad (p = 0,064). No obstante, al dividir a los animales en dos grupos de edad, la prevalencia (55,5%) fue superior en los adultos mayores de 2 años que en los jóvenes (0%), siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p = 0,002). El valor del odds ratio fue de 11,771, lo que significa que los corzos adultos tienen casi 12 veces más riesgo de padecer una miasis por C. stimulator que los jóvenes. Estos resultados coinciden con los hallados por Kornaś et al. (2016) quienes solo observaron infestaciones por este parásito en corzos con edades comprendidas entre 3 y 8 años. Asimismo, nuestros resultados son similares a los hallados por Pajares (2016) quien observó una prevalencia netamente superior en los adultos (62%) que en los jóvenes (23%). Además, Pinnyey et al. (2017) en Hungría, también detectaron prevalencias ligeramente superiores en corzos mayores de 6 años que en los que tenían 4 ó 5 años, aunque estas diferencias no fueron significativas. El incremento de la prevalencia de infestación por C. stimulator con la edad de los animales podría deberse a que los corcinos que nacen entre los meses de abril – mayo pasan gran parte del día ocultos entre la vegetación y así evitan estar expuestos a la larviposición de las moscas que se da entre los meses de abril a septiembre. Sin embargo, Dudzinski (1970) en Polonia y Király & Egri (2007) en Hungría señalaron mayor prevalencia en los animales jóvenes, atribuyendo este hecho a una menor respuesta inmune o a su menor capacidad defensiva frente al vuelo de las moscas. Respecto a la intensidad media de parasitación (Gráfica 4) fue superior en los adultos jóvenes (20,5±14,5) que, en los viejos (15,8±24,76), aunque con ANOVA estas diferencias no fueron significativas (p > 0,05). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Jóvenes Adultos jóvenes Adultos viejos PREVALENCIA (%) Gráfica 3. Prevalencia de C. stimulator al considerar la edad. 32 Estos resultados podrían deberse a que, en otros oéstridos, como Hypoderma spp., Panadero et al. (2009) comprobaron que hay una respuesta parcialmente protectora que ocasiona que en las reinfestaciones haya menor número de larvas, por lo que los animales jóvenes primoinfestados presentan intensidades de infestación superiores a los de más edad. Sin embargo, Pajares (2016) obtuvo mayor intensidad de infestación por C. stimulator en corzos menores de 2 años (23,33±23,71) que en los adultos (14,61±15,90), aunque estas diferencias no fueron significativas. Asimismo, Király & Egri (2007) y Pinnyey et al. (2017), en corzos de Hungría, obtuvieron valores significativamente superiores en los jóvenes que en los adultos. En ciervos del sur de España, Ruíz-Martínez & Palomares (1993) encontraron una prevalencia e intensidad de parasitación por Cephenemyia auribarbis y Pharyngomyia picta significativamente más elevada en cervatillos y en adultos mayores de 5 años. Posteriormente, en la misma zona de estudio Bueno-de La Fuente et al. (1998) en la misma zona comprobaron que los ciervos adultos estaban parasitados más frecuentemente que los jóvenes. 4.3.1.2. SEXO Al considerar el sexo de los animales se observó (Gráfica 5) que la prevalencia fue netamente superior en los machos (60%) que en las hembras (23,5%). Con el test de Fisher se constató que el sexo influye en la prevalencia de infestación por C. stimulator en corzos (p = 0,045); asimismo, se cotejó que el valor de OR era de 4,65, lo que nos indica que los machos tienen más riesgo de infestarse que las hembras. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Jóvenes Adultos jóvenes Adultos viejos LARVAS/ANIMAL Gráfica 4. Intensidad media de parasitación por C. stimulator al tener en cuenta la edad de los corzos. 33 Estos resultados coinciden con los de otros autores (Dudzinski, 1970; Kornaś et al., 2016; Pajares, 2016; Pajares et al., 2017) quienes también señalaron una mayor prevalencia de infestación en los machos. Esto puede ser debido a que, aunque son animales fieles a la zona que habitan, el territorio ocupado por los machos es mayor que el que ocupan las hembras, lo que provoca competencias territoriales entre muchos ejemplares. Esto hace que muchos machos no tengan su territorio propio y deambulen abandonando los bosques en busca de otros lugares donde asentarse exponiéndose más a zonas abiertas y alimentándose en lugares donde el alimento escasea o es de peor calidad, decayendo así su sistema inmunitario (Fidalgo et al., 2009; Pajares, 2016). Con relación a la intensidad media de parasitación (Gráfica 6), al igual que la prevalencia, esta fue superior en los machos (21,1±24,45) que en las hembras (4,5±4,5). No obstante, debido al escaso número de hembras positivas (4), las diferencias no resultaron significativas (p > 0,05). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Hembras Machos LARVAS/ANIMAL Gráfica 6. Intensidad media de parasitación por C. stimulator al tener en cuenta el sexo. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Hembras Machos PREVALENCIA (%) Gráfica 5: Prevalencia de C. stimulator al tener en cuenta el sexo. 34 Estos resultados coinciden con los obtenidos por Király & Egri (2007) quienes también encontraron intensidades de infestación superiores en los machos. Por el contrario, Pajares (2016) observó mayor intensidad de infestación en hembras, aunque estas diferencias no fueron significativas. Al igual que ocurría con la prevalencia, el hecho de que los machos presentasen mayores intensidades de parasitación podría estar motivado por una mayor exposición, ya que al tratar de vigilar sus territorios se exponen a ser infestados por un número mayor de moscas. Del mismo modo, el mayor gasto de energía de los machos durante la época de apareamiento (julio – agosto) hace que decaiga su respuesta inmunitaria disminuyendo la eficacia de sus mecanismos de defensa frente a las moscas suponiendo un aumento de su carga parasitaria. Además, el desarrollo de las astas también conlleva altos requerimientos energéticos que disminuyen la resistencia del animal (Pinnyey et al., 2017). Por su parte, Bueno-de La Fuente et al. (1998) en su estudio sobre P. picta y C. auribarbis en ciervos del sur de España también observaron prevalencias e intensidades de infestación superiores en los machos que en las hembras, mientras que Ruíz-Martínez & Palomares (1993) no encontraron diferencias significativas entre ambos sexos. 4.3.1.3. CAUSA DE LA MUERTE Al tener en cuenta la causa de la muerte de los corzos, se observa que la gran mayoría de los casos fue debida a causas accidentales como atropellos, electrocución o despeñamientos; siendo la prevalencia (Gráfica 7) en estos superior (50%) a la hallada en los animales abatidos en cacerías (25%) o muertos por causas naturales (20%). No obstante, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p > 0,05); pensamos que esta falta de significación podría deberse al escaso número de casos en alguna de las categorías (Tabla 2). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Accidental Natural Cacería PREVALENCIA (%) Gráfica 7. Intensidad media de parasitación por C. stimulator al tener en cuenta la causa de la muerte. 35 Por el contrario, la intensidad de parasitación (Gráfica 8) fue más elevada en los corzos muertos de forma natural (95±0) que en los fallecidos de forma accidental (12,50±10,20) y que en los abatidos en cacerías (1±0) y estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p > 0,05), ya que como en el caso de la prevalencia hubo un escaso número de muestras positivas al considerar la causa de la muerte. Cabe destacar que, de los 5 corzos fallecidos por causa natural, 4 de ellos eran corcinos de pocas semanas de edad y no albergaban larvas de este parásito. Sin embargo, llama la atención que el único corzo adulto muerto por enfermedad fue el más parasitado de todos los animales muestreados con un número de larvas muy por encima de la media (95 larvas); este hecho coincide con lo mencionado por Arias et al. (2016) quienes señalaron que cuando los corzos albergan entre 30-80 larvas puede causar una alta mortalidad. Asimismo, coincide, con lo indicado por otros autores (Arias et al., 2012; Calero-Bernal & Habela, 2013; Kornaś et al., 2016; Pajares, 2016) quienes comprobaron que cuando la intensidad de infestación es elevada, las larvas causan graves problemas respiratorios e incluso una neumonía por aspiración, por lo que, posiblemente, este corzo de no haber muerto por causas naturales habría sido presa fácil para sus depredadores. 4.3.2. Prevalencia e intensidad al tener en cuenta los factores dependientes del medio 4.3.2.1. ZONA CLIMÁTICA DE PROCEDENCIA En la Gráfica 9 se observa que hubo una mayor prevalencia de la infestación en las zonas de interior (48,2%) y esta fue ligeramente inferior en las áreas montañosas (33,3%) y las costeras (28,6%). Con la prueba exacta de Fisher se constató que estas diferencias no eran significativas (p > 0,05) y, por tanto, en las condiciones de este estudio, el clima no influye en la aparición de esta miasis. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Accidental Natural Cacería LARVAS/ANIMAL Gráfica 8. Intensidad media de parasitación por C. stimulator al considerar la causa de la muerte. 36 Estos resultados coinciden con los de Pajares (2016) y Pajares et al. (2017) quienes hallaron prevalencias algo superiores en los corzos procedentes del área de montaña (39%) que en los de clima oceánico (30%), aunque también, en su caso, estas diferencias también carecían de significación estadística. En cuanto a la intensidad media de parasitación (Gráfica 10), al igual que ocurría con la prevalencia, esta es más elevada en las zonas de interior (20±23,88) siendo mucho menor en las áreas de montaña y de costa (6±0 y 2,5±1,5, respectivamente). No obstante, hay que tener en cuenta que el número de ejemplares examinados fue bastante superior en las áreas de interior. Sin embargo, Arias et al. (2012) en corzos hallados en la Reserva Nacional de los Ancares, una zona de clima de montaña, describieron una intensidad media de 67 larvas por animal. Por otro lado, Pajares (2016) relató una intensidad media de infestación significativamente superior en las zonas de montaña en relación a las de clima oceánico. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Costa Interior Montaña PREVALENCIA (%) Gráfica 9. Prevalencia de C. stimulator en las distintas zonas climáticas. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Costa Interior Montaña LARVAS/ANIMAL Gráfica 10. Intensidad media de parasitación por C. stimulator en las distintas zonas climáticas. 37 4.3.2.2. PROVINCIA La prevalencia de infestación en los corzos procedentes de la provincia de Lugo (44,1%) fue ligeramente superior a la hallada en los de Cantabria (33,3%) (Gráfica 11) y debido al escaso número de animales procedentes de Cantabria (Tabla 2) no permitió el estudio estadístico de los datos. Estos resultados son algo superiores a los obtenidos por Fidalgo et al. (2013) quienes en un estudio llevado a cabo en casi todo el territorio español entre 2012 y 2013 hallaron una prevalencia del 16,5%. Sin embargo, si se tenían en cuenta únicamente los corzos de las provincias de Asturias, Lugo y León la prevalencia aumentaba hasta un 22%, dejando entrever que la positividad era mayor en el noroeste de la península ibérica. Asimismo, Pajares (2016) reseñó una prevalencia del 31,6% en corzos obtenidos en las provincias de Lugo y Asturias. Por otra parte, Arias et al. (2012) describieron prevalencias del 57% en corzos muestreados en Lugo en el año 2012. En cuanto a Cantabria no hay datos de otros estudios en esta provincia con los que poder comparar aunque los resultados sirven para concienciar de que este parásito se encuentra también presente en esta provincia y que el norte de España es la región peninsular donde mayor es la presencia de la infestación por C. stimulator. Teniendo en cuenta la intensidad larvaria se puede observar una gran diferencia entre ambas provincias (Gráfica 12), aunque dicha desigualdad puede ser fruto de que el número de cabezas muestreadas en Lugo es muy superior al de Cantabria (18±22,82 y 1±0, respectivamente). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Lugo Cantabria PREVALENCIA (%) Gráfica 11. Prevalencia de C. stimulator al considerar las provincias. 38 Los resultados obtenidos en la provincia de Lugo son muy similares a los obtenidos por Pajares (2016) en Lugo y Asturias (19,67±21) entre 2012 y 2014. 4.3.2.3. AÑO Teniendo en cuenta los tres años en los que se llevó a cabo el muestreo, se observa que entre 2018 y 2019 existe una tendencia creciente de la infestación (Gráfica 13). Sin embargo, la prueba exacta de Fisher no mostró diferencias significativas entre los distintos años (p > 0,05). Sería conveniente continuar con el muestreo en 2020 para comprobar si esa tendencia ascendente es algo puntual del año 2019 o se prolonga durante el tiempo puesto que si la prevalencia sigue incrementándose, estaríamos ante un importante problema sanitario para las poblaciones de corzos del norte de España, por las repercusiones negativas de esta miasis en la salud de los corzos y por las dificultades para controlar el parásito (Calero-Bernal & Habela, 2013; Pajares, 2016). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Lugo Cantabria LARVAS/ANIMAL Gráfica 12. Intensidad media de parasitación por C. stimulator en cada provincia. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2018 2019 2020 PREVALENCIA (%) Gráfica 13. Prevalencia de C. stimulator según el año de estudio. 39 En cuanto a la intensidad media de infestación (Gráfica 14) fue muy similar entre los años 2018 y 2019 (18±9,42 y 19,6±25,63, respectivamente), pero muy superior a la obtenida en el año 2020 (1±0). No obstante, hay que tener en cuenta que solo se dispuso de un animal positivo en el año 2020, por lo que no se ha podido aplicar un tratamiento estadístico a los datos. Estos resultados son similares a los hallados por Király & Egri (2007) quienes también hallaron intensidades medias de infestación similares entre años consecutivos (9,8% en 2002 y 8,8% en 2003); asimismo, Pinnyey et al. (2017) obtuvieron prevalencias similares en los años 2014 y 2015 (9,1 y 8,5, respectivamente). Sin embargo, Pajares (2016) halló una intensidad media muy superior en el año 2012 (26,75±27,93) con respecto a 2013 (13±10,68) y 2014 (18,75±18,15). 4.3.2.4. ÉPOCA DEL AÑO En la gráfica 15 se muestra la distribución de la prevalencia al tener en cuenta la época de captura o muerte del animal y se observa que esta fue mayor durante la primavera (64,3%) que, en verano (50%) e invierno (30%), siendo nula en los meses de otoño. La prueba exacta de Fisher señaló que no existían diferencias significativas (p = 0,068) en la prevalencia obtenida en las distintas épocas del año. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 2018 2019 2020 LARVAS/ANIMAL Gráfica 14. Intensidad media de parasitación por C. stimulator según el año. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Primavera Verano Otoño Invierno PREVALENCIA (%) Gráfica 15. Evolución de la prevalencia por C. stimulator en función de la estación del año. 40 Si comparamos nuestros resultados con los obtenidos por Pajares (2016) estos son bastante similares, ya que en su estudio tampoco se observaron larvas durante los meses de otoño estando estas presentes en mayor medida durante los meses de marzo a julio. Este autor atribuyó la ausencia de larvas durante los meses de agosto a noviembre a un menor número de muestras analizado, al igual que en el presente estudio. No obstante, se debe señalar que, en otoño, en el caso de estar infestados, la mayoría de las larvas serían de primer estadio y estas pueden pasar desapercibidas si se considera que su tamaño es ínfimo (1-3 mm) y su coloración más clara, por lo que fácilmente pueden camuflarse entre la mucosidad nasal del corzo. En contraposición, Dudzinski (1970) en corzos de Polonia sí que describió la presencia de larvas durante todo el año. En cuanto a la intensidad media de infestación (Gráfica 16), al igual que la prevalencia, fue mayor durante la primavera (24,2±27,06) que en verano e invierno (12,5±6,54 y 1±0, respectivamente). No obstante, debido al bajo número de muestras positivas en alguna de las categorías no fue posible aplicar el análisis de varianza a este factor. En general, nuestros resultados coinciden con los de Pajares (2016) quien observó las mayores intensidades de infestación en primavera y principios de verano. Salaba et al. (2013) en la República Checa también detectaron una mayor intensidad de infestación durante el mes de mayo y esta iba decreciendo progresivamente hasta el mes de septiembre. Sin embargo, Király & Egri (2007) en Hungría, hallaron que la intensidad larvaria aumentaba progresivamente desde abril a agosto. Los diferentes resultados obtenidos en los diversos países pueden deberse al clima de la región o al año de estudio, ya que la expulsión de las L3 por parte del hospedador puede adelantarse o retrasarse en función de las condiciones climáticas. Por ello, en nuestro país puede que las temperaturas comiencen a suavizarse antes que en otros países del norte de Europa de forma que las L3 abandonen antes a su hospedador, así como que, en la actualidad, como consecuencia del cambio climático, las temperaturas se están elevando en todo el planeta, pudiendo haber variaciones con resultados de estudios realizados en la década anterior. 0 10 20 30 40 50 60 Primavera Verano Otoño Invierno LARVAS/ANIMAL Gráfica 16. Evolución de la intensidad media de C. stimulator en función de la estación del año. 47 Fidalgo, L. E.; López, A. M.; Pérez, J. M.; Martínez, C. (2013). Informe Final del proyecto: ''Bases epidemiológicas para el control de Cephenemyia stimulator en corzos en España'': Universidade de Santiago de Compostela y Fundación FEDENCA. Király, I.; Egri, B. (2004). A Tolna megyei őzállomány orrgaratbagócs fertőzöttségéről [Nasopharyngeal bot infestation of the roe deer population of Tolna county]. 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