Diseño, síntesis y estudio de "alfa, gamma"-nanotubos peptídicos

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA DISEÑO, SÍNTESIS Y ESTUDIO DE α,γ-NANOTUBOS PEPTÍDICOS TESIS DOCTORAL MANUEL AMORÍN LÓPEZ Santiago de Compostela, 2005 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA DISEÑO, SÍNTESIS Y ESTUDIO DE α,γ-NANOTUBOS PEPTÍDICOS Memoria que, para optar al grado de Doctor por la Universidad de Santiago de Compostela, presenta MANUEL AMORÍN LÓPEZ Santiago de Compostela, 2005 D. JUAN R. GRANJA GUILLÁN, PROFESOR TITULAR DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA: INFORMA: Que la memoria adjunta titulada: “Diseño, Síntesis y Estudio de α,γ-Nanotubos Peptídicos” que, para optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas, presenta D. Manuel Amorín López, ha sido realizada bajo mi dirección, en los laboratorios del Departamento de Química Orgánica. Considerando que constituye trabajo de Tesis, autorizo su presentación en la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, se expide el presente certificado en Santiago de Compostela, a 20 de Julio de 2005. Fdo.: Manuel Amorín López Fdo.: Juan R. Granja Guillán AGRADECIMIENTOS: Quisiera dar las gracias y compartir este trabajo con todas aquellas personas que de una forma más o menos relevante han contribuido a que esta tesis doctoral haya sido posible. - En primer lugar, al Prof. Juan Granja, por la dirección de este trabajo, su ayuda, enseñanzas y buenos consejos durante el reto que supuso el comenzar un proyecto totalmente novedoso. También a los Profesores Luis Castedo, M. Reza Ghadiri (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) y Hagan Bayley (Universidad de Oxford) por haberme permitido tener la experiencia de trabajar en sus laboratorios. - Al Ministerio de Educación y Ciencia por la concesión de una beca FPU. - A los Ministerios de Educación y Ciencia, y Ciencia y Tecnología (PB97-0524, SAF2001-3120, SAF2004-01044) y a la Xunta de Galicia (PGIDT00PXI20912PR, PGIDT02BTF20901PR, PGIDT04BTF209006PR) por la financiación de este trabajo. - A la Universidad de Santiago de Compostela por sus instalaciones y medios, entre los que cabe destacar los servicios de apoyo a la investigación, así como al personal que en ellos trabaja: Servicio de Masas (Esteban, Isabel, etc), RMN (Manuel, Ramón y Mencha) y Rayos X (Antonio). - A aquellas personas con las que he pasado numerosas horas en el laboratorio: los integrantes del grupo: (Roberto, Rebeca, María José, etc.), los técnicos de laboratorio: (María, Rosa, Áurea, Muras, etc.), y todos aquellos que me han acompañado en el laboratorio durante estos años (Juan, Jorge, Emilio, Verónica, Cris, Eduardo, Iago, Checho, etc.). - A mis amigos y a todos aquellos de los que me hubiese podido olvidar. - A mis padres y a mi hermana con los que he compartido menos horas de lo que me gustaría durante estos años. A mis padres y a mi hermana. ABREVIATURAS δ desplazamiento químico (ppm) Aa aminoácido Aib ácido aminoisobutírico γ-Ach ácido 3-aminociclohexanocarboxílico Aca ácido 3-aminocicloalcanocarboxílico ACN acetonitrilo Boc tert-butiloxicarbonilo (Boc)2O anhídrido de di-tert-butoxicarbonilo β3-HAla β-Homoalanina β3-HLeu β-Homoleucina β3-HTrp β-Homotriptófano c cuadruplete CD dicroísmo circular Cys cisteína d doblete DIC N,N´-diisopropilcarbodiimida DCM diclorometano DIEA diisopropiletilamina DMAP N,N-dimetilaminopiridina EDC 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida EM espectrometría de masas EMAR espectrometría de masas de alta resolución EM-IE espectrometría de masas de impacto electrónico eq equivalente ES espectrometría de masas de electrospray FAB masas de bombardeo con átomos rápidos Fm 9-fluorenilmetil Fmoc 9-fluorenilmetiloxicarbonilo Hag homoalilglicina (ácido 2-aminohex-5-enoico) HATU hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazole-1-yl)- 1,1,3,3,-tetrametiluronio HBTU hexafluorofosfato 2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3,- tetrametiluronio HOBt 1-hidroxibenzotriazol HPLC cromatografía líquida de alta eficiencia J constante de acoplamiento IE impacto electrónico Maldi-Tof espectrometría de masas de ionización mediante desorción por láser asistida mediante matriz Maldi-Tof-Ar maldi de masas exactas MBHA resina 4-metilbenzohidrilamina MOPS ácido 3-[N-Morfolino]propanosulfonico MSAR masas de alta resolución MHz megahertzio MWNT nanotubo de carbono formado por múltiples nanotubos coaxiales NMM N-metilmorfolina PAM resina 4-hidroximetil-fenilacetamidametilo ppm partes por millón py piridina Rf factor de retención Rink amida ácido 4-(2´,4´-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil) fenoxiacético RMN resonancia magnética nuclear s singlete SWNT nanotubo de carbono formado por un solo nanotubo coaxial t triplete TBTU O-(Benzotriazol-1-ilo)-N,N,N´,N´-tetrametiluronio tetrafluoroborato TEM microscopía de transmisión de electrones TFA ácido trifluoracético TIS Triisopropilsilano Tos Tosilo LEYENDA: HC-número: ciclohexapéptidos. TC-número: ciclotetrapéptidos. OC-número: ciclooctapéptidos. OC3:1-número: (3α,1γ)-ciclooctapéptidos (3 α-Aa por cada γ-Aa). CAPÍTULO 1: ESTRUCTURAS TUBULARES Capítulo 1 2 Estructuras tubulares El desarrollo de materiales y estructuras de tamaño cada vez menor constituye uno de los mayores retos de la ciencia y la tecnología actuales. El objetivo es obtener materiales de dimensiones nanométricas que posean nuevas propiedades físicas, electrónicas o químicas. Las primeras técnicas para preparar estos materiales se basaban en métodos físicos (nanofísica) que suponían la construcción de materiales mediante la degradación de otros de mayores dimensiones (top-down). Sin embargo, al aumentar el grado de miniaturización y complejidad, surge un problema: las partículas son de un tamaño demasiado pequeño para ser fabricadas mediante estos procesos. Por ello, en los últimos años, se ha recurrido a nuevos métodos basados en procesos químicos (nanoquímica),1 que pretenden su construcción mediante la manipulación de moléculas hasta alcanzar el tamaño y la forma adecuadas (bottom-up). No obstante, estas estructuras son demasiado grandes para ser sintetizadas mediante la formación controlada de enlaces covalentes, usando las estrategias clásicas de los químicos sintéticos, por lo que se ha recurrido a su formación a partir de varias unidades simples que se organizan y se unen entre sí espontáneamente mediante enlaces no covalentes. Esta técnica se conoce como autoensamblaje molecular,2,3 y se basa en equilibrios de asociación y disociación que conducen a la estructura termodinámicamente más estable, en la que las distintas subunidades están unidas mediante fuerzas de enlace débil (puentes de hidrógeno, van der Waals, etc.). Para lograr la formación de estas estructuras supramoleculares mediante esta técnica, es fundamental el diseño racional de la/s unidad/es básica/s y el control del proceso de ensamblaje. Durante los últimos treinta años los químicos orgánicos como Cram4 y Lehn5 han estudiado las bases de los procesos de autoensamblaje, lo que ha permitido construir diversas estructuras de mayor o menor complejidad y asentar las bases de una nueva rama de la química, la química supramolecular. Gracias a estos estudios también se han podido establecer las bases termodinámicas de los procesos de autoensamblaje, lo que en muchos casos ha permitido predecir de forma apropiada la estructura supramolecular. Para las construcciones supramoleculares mediante procesos de autoensamblaje molecular se emplean todas aquellas fuerzas de enlace débil que son responsables del estado de agregación de la materia, así como de multitud de sistemas de autoensamblaje existentes tanto en la naturaleza como en la química sintética. Todas las fuerzas intermoleculares son, en el fondo, interacciones entre una carga positiva y otra negativa, bien sean cargas formales (iones) para dar lugar a sales, o bien sean dipolos 1) Wouters, D.; Schubert, U. S. “Nanolithography and Nanochemistry: Probe-Related Patterning Techniques and Chemical Modification for Nanometer-Sized Devices” Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 2480-2495. 2) El autoensamblaje molecular consiste en el ensamblaje espontáneo de moléculas para formar estructuras estables y está dirigido por enlaces no covalentes; a diferencia de la autoorganización, que es la distribución espacial de las moléculas, átomos o iones, buscando un mínimo energético donde las posiciones no son fijas ni están controladas por la naturaleza química de los mismos; ejemplos de autoorganización son: cristales moleculares, cristales líquidos, micelas, emulsiones, etc. Para un estudio sobre estos procesos, véase: Whitesides, G. M.; Mathias, J. P.; Setho, C. T. “Molecular Self-Assemby and Nanochemistry: A Chemical Strategy for the Synthesis of Nanostructures” Science, 1991, 254, 1312-1319. 3) Para una visión general de la importancia de la química supramolecular y de los procesos de autoensamblaje: Science 2002, 295, 2395-2421 y Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002, 99, 4762- 5188. 4) Cram, D. J. “The Design of Molecular Hosts, Guests, and Their Complexes (Nobel Lecture)” Angew. Chem. Int. Ed. 1988, 27, 1009-1112. 5) Lehn, J.-M. “Supramolecular Chemistry-Scope and Perspectives Molecules, Supermolecules, and Molecular Devices (Nobel Lecture)” Angew. Chem. Int. Ed. 1988, 27, 89-112. 3 Capítulo 1 permanentes o inducidos.6 Entre las distintas fuerzas no covalentes utilizadas en procesos de ensamblaje podemos mencionar todas las fuerzas no covalentes que se conocen como débiles (van der Waals, interacciones π−π, ion-dipolo, dipolo-dipolo, etc.); además de estas fuerzas, una de las que más habitualmente se ha empleado en química supramolecular son los puentes de hidrógeno, gracias a su direccionalidad e intensidad, haciéndola más versátil en este tipo de procesos. Debido a que todas estas fuerzas son muy débiles, los procesos de autoensamblaje están gobernados por un conjunto de interacciones que cooperan conjuntamente. El balance energético es muy importante, en el que la entropía juega un papel muy importante ya que los procesos de autoensamblaje suponen la agregación de múltiples moléculas, por lo que el factor entrópico es generalmente negativo. H R R R R R R R R N O N O N O N HN NO N N H OH O H O H H H N HN H N HO N H O N H N O N H O N O O O O O H H N H H O O H N O H H O H O H O O H H O ONN NO N N ON H H O H N N H N ON H N H N N HO N O O R R R R S S S S S S S S Figura 1: Derecha: Modelo de la estructura de los nanotubos de carbono. Izquierda: Modelo de autoensamblaje de un nanotubo peptídico formado por D,L-ciclopéptidos. Una de las nanoestructuras de mayor interés es aquella que posee forma tubular - los nanotubos (cilindros huecos de dimensiones nanométricas)-, por su potencial aplicación en áreas tan diversas como las tecnologías de separación e inclusión molecular, catálisis, fabricación de nanofibras y alambres microscópicos, uso en dispositivos ópticos y electrónicos, vehículos para la administración de medicamentos, canales transmembránicos (que atraviesen la membrana celular), etc.7 En los últimos años se han preparado diversos tipos de nanotubos -que se diferencian en su composición química-, entre los cuales han adquirido gran importancia los nanotubos de carbono y los peptídicos (figura 1). Para los nanotubos de carbono, que se forman por descargas eléctricas sobre carbono grafito, ya se han encontrado diversas aplicaciones tecnológicas como, por ejemplo, puntas de aparatos de AFM (microscopio de fuerzas 6) Willians, D. H.; Westwell, M. “Aspects of weak interactions” Chemical Society Reviews 1998, 27, 57-62. 7) Ejemplos sobre aplicaciones biotecnológicas de nanotubos: Martin, C. R.; Kohli, P. “The Emerging Field of Nanotube Biotechnology” Nature Reviews 2003, 2, 29-37. 4 Estructuras tubulares atómicas) o como microconductores.8 Los nanotubos peptídicos se prepararon mediante procesos de autoensamblaje molecular a partir de ciclopéptidos sencillos.9 Hoy en día existen otros ejemplos de nanotubos orgánicos, unos obtenidos directamente de la naturaleza y otros a partir de un trabajo de diseño en el laboratorio. Las estructuras tubulares más destacadas preparadas últimamente son las formadas por ciclopéptidos10, ciclodextrinas,11 oligofenilacetilenos,12 lípidos,13 etc. También existen numerosos ejemplos de nanotubos inorgánicos.14 8) Edelmann, F. T. “Fullerene Pipes, Tube-in-tube Membranes, and Carbon-Nanotube Tips: Adding New Dimensions to Molecular Technology” Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1381-1387. 9) a) Brea, R., J.; Granja, J. R. “Self-Assembly of Cyclic Peptides in Hydrogen-Bonded Nanotubes”. In Dekker Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology; Marcel Dekker Inc.; 2004, pp 3439- 3457. b) Bong, D. T.; Clark, T. D.; Granja, J. R.; Ghadiri, M. R. “Self-Assembling Organic Nanotubes” Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 988-1011. 10) Ghadiri, M. R.; Granja, J. R.; Milligan, R. A.; McRee, D. E.; Khazanovich, N. “Self-assembling organic nanotubes based on a cyclic peptide architecture” Nature 1993, 366, 324-327. 11) Harada, A.; Li, J. y Kamachi, M. “Synthesis of a tubular polymer from threaded cyclodextrins” Nature 1993, 364, 506-518. 12) Moore, J. S. “Shape-Persistent Molecular Architecture of Nanoscale Dimension” Acc. Chem. Res. 1997, 30, 402-413. 13) Schnur, J. M. “Lipid Tubules: A Paradigm for Molecularly Engineered Structures” Science 1993, 262, 16691676. 14) Greta, R. P.; Krumeich, F.; Nesper, R. “Oxidic Nanotubes and Nanorods-Anisotropic Modules for a Future Nanotechnology” Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2446-2461. 5 Capítulo 1 1.1. NANOTUBOS DE CARBONO En 1991, Iijima15 observó la formación de nanotubos de grafito al preparar fulerenos mediante la evaporación de carbono por descarga de un arco de corriente continua en atmósfera de argón a baja presión. En el extremo negativo del electrodo de grafito aparecían, además de las partículas esféricas esperadas, agujas de grafito con diámetros comprendidos entre 4 y 30 nm y longitudes mayores de 1µm. Dichas agujas se examinaron mediante microscopia de transmisión de electrones (TEM), resultando estar compuestas cada una de ellas por varios tubos coaxiales (entre 2 y 50), cuyos extremos por lo general se encontraban cerrados (figura 2). La estructura de las capas se estudió mediante microscopia de difracción de electrones; observándose que cada tubo estaba constituido por una lámina de hexágonos de carbono enrollada de manera helicoidal (figura 2c). Además, la orientación de la lámina respecto al eje del cilindro era variable (figura 2d). En 1992, el mismo laboratorio propuso un modelo de crecimiento de estas estructuras que justificaba, entre otros hechos, el cierre de los extremos de los tubos como causa de la presencia de pentágonos y hexágonos (similares a los que hay en los fulerenos).16 Figura 2: Superior: Imagen de microscopio de efecto túnel, mostrando una estructura helicoidal de 1,3 nm de diámetro de un nanotubo de carbono de una única pared (SWNT), e imagen de un microscopio electrónico (TEM) de un nanotubo de carbono. Inferior: Esquema que muestra la disposición helicoidal de un tubo de carbono, desenrollado para mayor claridad. Las líneas de hexágonos sombreados describen una hélice alrededor del eje. 15) Iijima, S. “Helical microtubules of graphtic carbon” Nature, 1991, 354, 56-58. 16) Iijima, S.; Ajayan, P. M.; Ichihashi, T. “Growth model for carbon nanotubes” Phys. Rev. Lett., 1992, 69, 3100-3103. 6 Estructuras tubulares En 1992, Pederson y Broughton dedujeron mediante cálculos semiempíricos que un determinado tubo de grafito era capaz de succionar dos moléculas de HF (nanocapilaridad),17 y propusieron el uso de estas estructuras como contenedores más o menos selectivos (según las dimensiones de los cilindros) de distintas moléculas. Al año siguiente, Iijima y Ajayan consiguieron rellenar nanotubos de grafito con plomo gracias a la capilaridad de éstos;18 posteriormente, incluso se obtuvieron metales monodimensionales en el interior de estos buckytubos.19 En estos últimos años se han desarrollado otras técnicas para la obtención de diferentes tipos de nanotubos.20 Éstos se clasifican en dos grandes grupos atendiendo al número de capas que los forman: nanotubos de carbono formados por un solo nanotubo coaxial (SWNTs) y nanotubos de carbono formados por múltiples nanotubos coaxiales (MWNTs). El número de capas y su tipo condicionan las propiedades de los nanotubos, pudiéndose comportar como materiales conductores o aislantes.21 Lo más destacable de estos nanotubos son sus potenciales aplicaciones nanotecnológicas, como por ejemplo, en electrónica (componentes de circuitos electrónicos), fabricación de “nanocomposites” (esto es, fibrillas microscópicas formadas por un núcleo de metal recubierto de carbono), moldes para la obtención de alambres nanométricos, encapsulación de pequeñas cantidades de sustancia (para aislarla, bien de campos eléctricos, bien de la atmósfera), etc.6,22 17) Pederson, M. R.; Broughton, J. Q. “Nanocapillarity in flurellene tubules” Phys. Rev. Lett. 1992, 69, 2689-2692. 18) Ajayan, P. M.; Iijima, S. “Capillarity-induced filling of carbon nanotubes” Nature, 1993, 361, 333- 334. 19) Guerret-Piecourt, C.; Le Bouar, Y.; Loiseau, A.; Pascard, H. “Relation between metal electronic structure and morphology of metal compounds inside carbon nanotubes” Nature, 1994, 372, 761-765. 20) Rao, C. N. R.; Govindaraj, A.; Gundiah, G.; Vivekchand, S. R. C. “Nanotubes and nanowires” Chem. Eng. Sci. 2004, 59, 4665-4671. 21) a) Louie, S. G. “Electronic properties, junctions, and defects of carbon nanotubes” Top. Appl. Phys. 2001, 80 (Carbon nanotubes), 113-145. b) Baughman, R. H.; Zakhidov, A. A.; de Heer, W. A. “Carbon Nanotubes-the Route Toward Applications” Science 2002, 297, 787-792. 6) Ejemplos sobre aplicaciones biotecnológicas de nanotubos: Martin, C. R.; Kohli, P. “The Emerging Field of Nanotube Biotechnology” Nature Reviews 2003, 2, 29-37. 22) a) Bachtold, A.; Hadley, P.; Nakanishi, T.; Dekker, C. “Logic Circuits with Carbon Nanotubes Transistors” Science 2001, 294, 1317-1320. b) Ijima, S. “Carbon nanotubes: past, present, and future” Physica B, 2002, 323, 1-5. Dalton, A. B.; Collins, Steve; Razal, J.; Munoz, E.; Ebron, V. H.; Kim, Bog G.; Coleman, Jonathan N.; Ferraris, John P.; Baughman, R. H. “Continuous carbon nanotube composite fibers: properties, potential applications, and problems” Journal of Materials Chemistry 2004, 14, 1-3. 7 Capítulo 1 Figura 8: Izquierda: α-hemolisina en una membrana lipídica. Derecha: Acuoporina. Otro ejemplo natural de la formación de canales mediante esta estrategia aunque no de tipo proteico, es el caso de la anfotericina. Se trata de un macrociclo poliénico polihidroxilado que se asocia con una molécula de ergoesterol para dar un dímero; y a su vez, estos dímeros se asocian entre sí para dar una supramolécula compuesta por ocho unidades de anfotericina y ergoesterol (figura 9). Dos de estos octámeros permiten la generación de un canal entre los dos lados de una membrana lipídica, que es la base del mecanismo de acción de este agente antimicrobiano. Dado que el ergoesterol no está presente en células animales, la anfotericina (a pesar de su alta toxicidad) se ha convertido en uno de los últimos recursos hospitalarios para el tratamiento de infecciones sistémicas de hongos como por ejemplo el aspergilus. HO H H H H O O O OH H 2 N OH COOH H OHOH OH OHOHOHO CH 3 H 3 C H 3 C OH OH CH 3 H Figura 9: Izquierda superior: Anfocetaracina. Izquierda inferior: Ergoresterol. Derecha: Anfotericina y ergoresterol, que se asocian para dar canales al juntarse con otra unidad equivalente. Este modelo de formación de nanotubos ha inspirado a un gran número de químicos en el desarrollo de estrategias eficientes para la obtención de estructuras tubulares. Un ejemplo interesante lo constituyen los trabajos de Matile y colaboradores con polibisfenoles, que en membranas lipídicas se autoensamblan unos con otros dejando entre ellos un canal central, lo que da lugar a nanotubos capaces de transportar 14 Estructuras tubulares iones u otras moléculas (figura 10).46 De cada fenilo cuelga una cadena peptídica con un número variable de Aa (3-5); las repulsiones entre los péptidos determinan que los fenilos se orienten dejando espacio para intercalar otra cadena peptídica del siguiente oligo. La formación de estas hojas plegadas β conduce finalmente al “barril molecular” mediante la asociación de 4 a 6 unidades de oligofenoles. Adicionalmente, las cadenas laterales de los péptidos se disponen proyectándose hacia el interior y el exterior del nanotubo de forma alterna, de tal forma que se pueden modular las propiedades internas y externas del canal. Gracias a este especial diseño, el grupo de Matile ha centrado su trabajo en el desarrollo de sistemas de transporte,47 biosensores,48 sistemas catalíticos,49 etc.46 Figura 10: Superior: Oligobisfenoles utilizados en la síntesis de los barriles beta y modelo de uno de estos nanotubos formados, en el que las distintas cadenas polipeptídicas se representan mediante una flecha. Inferior: Distintos modelos de nanotubos en membranas lipídicas preparados por el grupo de Matile. 46) Sakai, N.; Mareda, J.; Matile, S. “Rigid-Rod Molecules in Biomembrane Models: From Hydrogen- Bonded Chains to Synthetic Multifunctional Pores” Acc. Chem. Res. 2005, 38, 79-87. 47) a) Sakai, N.; Matile, S. “Synthetic multifunctional pores: lessons from rigid-rod β-barrels” Chem. Comm. 2003, 20, 2514-2523. b) Talukdar, P.; Bollot, G.; Mareda, J.; Sakai, N.; Matile, S “Synthetic Ion Channels with Rigid-Rod π -Stack Architecture that Open in Response to Charge-Transfer Complex Formation” J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6528-6529. 48) Das, G.; Talukdar, P.; Matile, S. “Fluorometric Detection of Enzyme Activity with Synthetic Supramolecular Pores” Science 2002, 298, 1600-1602. 49) Litvinchuk, S.; Bollot, G.; Mareda, J.; Som, A.; Ronan, D.; Shah, M. R.; Perrottet, P.; Sakai, N.; Matile, S. “Thermodynamic and Kinetic Stability of Synthetic Multifunctional Rigid-Rod β-Barrel Pores: Evidence for Supramolecular Catalysis” J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 10067-10075. 15 Capítulo 1 Otro de estos ejemplos utiliza la química de coordinación como base del autoensamblaje molecular de unidades rígidas de oligo(3,5-piridinas) que, al coordinarse con Pd (II), dan lugar a una estructura con forma de prisma hueco; la longitud del canal depende del número de piridinas del oligo, mientras que el tamaño del conducto viene determinado por la tendencia del Pd a adoptar, cuando está unida a la 1,2-etanodiamina, ángulos de 90º entre las dos piridinas a las que se coordina (figura 11).50 Figura 11: Oligo(3,5-piridina)s de diferente tamaño que se coordinan a Pd (II). 50) a) Aoyagi, M.; Biradha, K.; Fujita, M.; “Quantitative Formation of Coordination nanotubes Templated by Rodlike Guest” J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 7457-7458. b) Aoyagi, M.; Tashiro, S.; Tominaga, M.; Biradha, K.; Fujita, M. “Spectroscopic and crystallographic studies on the stability of self-assembled coordination nanotubes” Chem. Comm. 2002, 18, 2036-2037. 16 Estructuras tubulares 1.3.3. SECCIONES DE UN DISCO QUE SE ENSAMBLAN EN TORNO A UN EJE CENTRAL DEJANDO UN CANAL INTERNO Este tercer modelo se basa en la construcción de estructuras tubulares a partir de moléculas capaces de asociarse formando rosetas, que posteriormente propaguen su crecimiento a lo largo del eje perpendicular a dicha roseta. Uno de los ejemplos más espectaculares es la cápside del virus del mosaico del tabaco (TMV), que está compuesto por 2130 subunidades proteicas idénticas que se enrollan sobre una molécula de ARN formada por 6400 residuos nucleotídicos. El proceso de formación es tan favorable que, en condiciones fisiológicas, las unidades básicas se autoensamblan para recomponer un virus que posee intacta su capacidad infectiva (figura 12). El autoensamblaje está íntimamente ligado a la idea del reconocimiento molecular, ya que el reconocimiento de las subunidades guía la construcción de la supramolécula. Las unidades de proteína TMV se ensamblan a gran escala con la ayuda del ARN que actúa como guía del proceso. Figura 12: Esquema de un proceso de autoensamblaje del virus del mosaico del tabaco, en el que 2130 subunidades se van ensamblando en torno a un eje central (cadena de ARN) para dar lugar a las partículas de virus con dimensiones de 300 nm de longitud. Los nanotubos de fosfolípidos13,51 han merecido especial atención, pues constituyen otro ejemplo de formación de nanotubos a partir de componentes naturales, dando lugar a la encapsulación de diversos compuestos.52 Dependiendo de las condiciones y disolventes empleados, las cadenas polares pueden orientarse hacía el exterior mientras que las cadenas apolares quedan dispuestas en el interior o viceversa. La formación de estos nanotubos es facilitada por las interacciones hidrófobas entre cadenas y por la forma cónica de los fosfolípidos. 13) Schnur, J. M. “Lipid Tubules: A Paradigm for Molecularly Engineered Structures” Science 1993, 262, 1669-1676. 51) a) Masuda, M.; Shimizu, T. “Lipid Nanotubes and Microtubes: Experimental Evidence for Usymmetrical Monolayer Membrane Formation from Unsymmetrical Bolaamphiphiles” Langmuir 2004, 20, 5969-5977. b) Dang, T. X.; Farah, S. J.; Gast, A.; Robertson, C.; Carragher, B.; Egelman, E.; Wilson-Kubalek, E. M. “Helical crystallization on lipid nanotubes: Streptavidin as a model protein” J. Struc. Biol. 2005, 150, 90-99. 52) Yang, B.; Kamiya, S.; Shimizu, Y.; Koshizaki, N.; Shimizu, T. “Glycolipid Nanotube Hollow Cylinders as Substrates: Fabrication of One-Dimensional Metallic-Organic Nanocomposites and Metal Nanowires” Chem. Mater. 2004, 16, 2826-2831. 17 Capítulo 1 Figura 13: Modelo de nanotubo formado por un lípido, quedando las cabezas polares hacia el interior y las cadenas apolares hacia el exterior, dejando un hueco que depende de las características de las moléculas. Basándose en este modelo, Percec y colaboradores han desarrollado moléculas anfipáticas con forma de cuña que poseen, al igual que los fosfolípidos, una cadena o grupo polar en un extremo del benceno mientras que en las posiciones 3, 4 y 5 se disponen tres cadenas alquílicas. Estas moléculas se agrupan de forma hexagonal quedando los grupos hidrofílicos hacia el interior y los hidrofóbicos hacia el exterior, formando una columna hexagonal que deja un canal interno (figura 14).53 Figura 14: Esquema del proceso de autoensamblaje de moléculas anfipáticas con forma de cuña desarrolladas por el grupo de Percec. Estas estructuras se autoorganizan originando cristales líquidos. De esta forma la utilización de cadenas alquílicas adecuadamente funcionarizadas permite su 53) a) Percec, V.; Johansson, G.; Ungar, G.; Zhou, J. “Fluorophobic Effect Induces the Self-Assembly of Semifluorinated Tapered Monodendrons Containing Crown Ethers into Supramolecular Columnar Dendrimers Which Exhibit a Homeotropic Hexagonal Columnar Liquid Crystalline Phase” J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 9855-9866. b) Percec, V.; Ahn, C.-H.; Bera, T. K.; Ungar, G.; Yeardley, D. J. P. “Coassembly of a Hexagonal Columnar Liquid Crystalline Superlattice from Polymer(s) Coated with a Three-Cylindrical Bundle Supramolecular Dendrimer” Chem. Eur. J. 1999, 5, 1070-1083. 18 Estructuras tubulares polimerización, dando lugar a materiales rígidos y porosos que consolidan la estructura tubular a lo largo de todo el sistema (figura 15).54 Figura 15: Modelos de nanotubos derivados de 3,4,5-trihidroxibenzoico formando cristales líquidos y posterior polimerización dando lugar a estructuras porosas rígidas. De modo similar a como vimos en los trabajos de Percec, las rosetas desarrolladas por el grupo de Fenniri se autoensamblan en torno a un eje central (figura 16),55 formando anillos de seis miembros, gracias a la formación de tres puentes de hidrógeno entre cada subunidad. Figura 16: Superior: Diseño de diversas moléculas que dan lugar a rosetas. Inferior: Esquema del autoensamblaje de las rosetas desarrolladas por el grupo de Fenniri, en el que además del orificio interno, el nanotubo está decorado en su parte externa con éteres corona que permiten coordinar Na+. 54) a) Ungar, G.; Liu, Y.; Zeng, X.; Percec, V.; Cho, W.-D. “Giant Supramolecular Liquid Crystal Lattice” Science 2003, 299, 1208-1211. b) Zeng, X.; Ungar, G.; Liu, Y.; Percec, V.; Dulcey, A. E.; Hobbs, J. K. “Supramolecular dendritic liquid quasicrystals” Nature 2004, 428, 157-160. 55) a) Fennini, H.; Mathivanan, P.; Vidale, K. L.; Sherman, D. M.; Hallenga, K.; Wood, K. V.; Stowell, J. G. “Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization” J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 3854-3855. b) Fenniri, H.; Deng, B.-L.; Ribbe, A. E. “Helical Rosette Nanotubes with Tunable Chiroptical Properties” J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 11064-11072. c) Moralez, J. G.; Raez, J.; Yamazaki, T.; Motkuri, K. “Helical Rosette Nanotubes with Tunable Stability and Hierarchy” J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 8307-8309. 19 Capítulo 1 Otras moléculas que se ensamblan siguiendo este modelo lo constituyen los calixarenos. Atwood y colaboradores han sintetizado p-sulfonatocálix[4]areno que se autoensamblan dando lugar a nanotubos, gracias a la adición de N-óxidos de piridina, y que se coordinan con iones Na+ de los sulfatos.56 El grupo de Kim también ha empleado calixarenos en la formación de sus nanotubos, que han sido usados como moldes para la formación de nanohilos de plata. Las subunidades de cálix[4]hidroquinonas se van autoensamblando a modo de rosetas, gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre los grupos fenólicos. El bajo potencial de oxidación de las hidroquinonas se emplea para inducir la formación de hilos metálicos de Ag de 0,4 nm de diámetro cuando los nanotubos se ponen en presencia de sales de plata (figura 18).57 Figura 17: Nanotubos formados por calixarenos logrados en el grupo de Atwood.56 Figura 18: A: Visión de los nanotubos de cálix[4]hidroquinonas en base a los datos de rayos X. B: Estructura de cálix[4]hidroquinonas. C y D: Visión superior y lateral de los nanohilos de Ag y su envoltorio orgánico formado por las cálix[4]hidroquinonas.57 56) Orr, G. W.; Barbour, L. J.; Atwood, J. L. “Controlling Molecular Self-Organization: Formation of Nanometer-Scale Spheres and Tubules” Science 1999, 285, 1049-1052. 57) a) Hong, B. H.; Bae, S. C.; Lee, C.-W.; Jeong, S.; Kim, K. S. “Ultrathin Single-Crystalline Silver Nanowire Arrays Formed in an Ambient Solution Phase” Science 2001, 294, 348-351. b) Hong, B. H.; Lee, J. Y.; Lee, C.-W.; Kim, J. C.; Bae, S. C.; Kim, K. S. “Self-Assembled Arrays of Organic Nanotubes with Infinitely Long One-Dimensional H-Bond Chains” J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 10748-10749. 20 Estructuras tubulares Otro ejemplo sencillo lo conforman los trabajos con diversos péptidos hidrofóbicos, tales como: (Phe-Phe), (Leu-Phe), (Phe-Leu) y (Leu-Leu); que cristalizan dejando un canal hidrofílico formado por los NH y C=O; mientras que las cadenas laterales de los aminoácidos quedan hacia el exterior de modo similar a los lípidos. El número de dipéptidos por vuelta en los nanotubos varía entre cuatro y seis unidades, siendo el diámetro de van der Waals del nanotubo de 10 Å.58 Figura 19: Estructura de dipéptidos Phe-Phe vista a lo largo del eje c. En el interior hay moléculas de agua representadas como esferas. 58) Gorbitz, C. H. “Nanotube Formation by Hydrophobic Dipeptides” Chem. Eur. J. 2001, 7, 5153-5159. 21 Capítulo 1 1.3.4. FORMACIÓN DE ESTRUCTURAS TUBULARES A PARTIR DE MOLÉCULAS CON FORMA DE DISCO La existencia de anillos que se autoensamblan dando lugar a canales, constituye el último diseño desarrollado para la construcción de nanotubos, cuyos únicos representantes hasta ahora son los generados en el laboratorio. Uno de los primeros ejemplos publicados se basaba en ciclodextrinas,11 que se ensamblan mediante la combinación de los procesos de autoensamblaje molecular con uniones covalentes. Las ciclodextrinas se ensamblan a lo largo de un polietilénglicol para dar lugar a un rotaxano, y a continuación se hacen reaccionar los grupos hidroxílicos de las ciclodextrinas con cloroepidrina para formar uniones covalentes. Finalmente, se suprime el “hilo director” mediante la hidrólisis básica de los grupos dinitroanilina que actúan como “nudos”. En este caso, la química no covalente nos permite controlar el tamaño del nanotubo, ya que dicho tamaño depende de la longitud del oligómero del etilénglicol y una vez formado covalentemente ya no va a variar en sus dimensiones. De esta manera, su tamaño no depende del proceso aleatorio de autoensamblaje, además de formarse un nanotubo con una elevada estabilidad cinética. Figura 20: Proceso de formación de los nanotubos mediante la unión covalente de ciclodextrinas. Los nanotubos peptídicos a partir de ciclopéptidos son, sin lugar a dudas, el diseño de este tipo que ha tenido un mayor desarrollo en los últimos años. Las distintas unidades ciclopeptídicas que forman el nanotubo están unidas entre sí mediante puentes de hidrógeno a través de los grupos amida de su esqueleto peptídico. Por tanto, la formación del nanotubo se produce en las condiciones que favorecen el autoensamblaje molecular. El requisito fundamental de este proceso es que el péptido adopte una conformación plana y que exista complementariedad entre grupos aceptores y dadores de puentes de hidrógeno entre distintas subunidades.59,60 11) Harada, A.; Li, J. y Kamachi, M. “Synthesis of a tubular polymer from threaded cyclodextrins” Nature 1993, 364, 506-518. 59) a) Bong, D. T.; Clark, T. D.; Granja, J. R.; Ghadiri, M. R. “Self-assembling organic nanotubes” Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 988-1011. b) Hartgerink, J. D.; Clark, T. D.; Ghadiri, M. R. “Peptide nanotubes and beyond” Chem. Eur. J. 1998, 4, 1367-1372. 60) Ghadiri, M. R. “Self-assembled nanoscale tubular ensembles” Adv. Mater. 1995, 7, 675-677. 22 CAPÍTULO 2: NANOTUBOS PEPTÍDICOS Capítulo 2 Figura 26: Nanotubo formado por ciclooctapéptidos de estereoquímica opuesta que se van alternando a lo largo del nanotubo. Un caso particular de formación de nanotubos que no cumple las reglas básicas para su formación, es el del ciclo[(L-Gln)5-]. Dicho pentapéptido se ensambla siguiendo un modelo como el que se indica en la figura 27. Los estudios realizados mediante microscopía de fuerzas atómicas, han permitido observar una estructura tubular ligeramente curvada con dimensiones apropiadas para un nanotubo peptídico.70 El principio de formación de los nanotubos es muy diferente al postulado para los D,L-nanotubos, debiéndose dicha formación no a la conformación plana sino a una estructura distorsionada, estabilizada por puentes de hidrógeno intramoleculares, que le permiten al ciclopéptido apilarse con otras subunidades mediante la formación de puentes de hidrógeno intermoleculares. Figura 27: Autoensamblaje paralela de los nanotubos de ciclo[(L-Gln)5-]. 70) a) Okamoto, H.; Takeda, K. “Molecular Design and Morphology of Peptide Nanotubes: toward the novel drug delivery materials” J. Drugs Delivery Science and Technology 2005, 15, 97-107. b) Okamoto, H.; Nakanishi, T.; Nagai, Y.; Kasahara, M.; Takeda, K. “Variety of the Molecular Conformation in Peptide Nanorings and Nanotubes” J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2756-2769. c) Okamoto, H.; Nakanishi, T.; Nagai, Y.; Takeda, K.; Obataya, I.; Mihara, H.; Azehara, H.; Mizutani, W. “Theoretical Prediction and Atomic Force Microscope Observations of the Protein Nanotube Consisting of Homo-1-Amino Acid Penta-Peptide Nanorings” Jpn. J. Appl. Phys. 2003, 42, 676-679. 30 Nanotubos peptídicos Como se ha mencionado, son muchas las aplicaciones propuestas para los nanotubos peptídicos; por ello no sorprende que, desde su primera preparación, se desarrollasen algunas aplicaciones tales como: biosensores, materiales fotosensibles, agentes antimicrobianos o sistemas de transporte selectivo. Uno de estos ejemplos es el primer sensor, que posee una marcada selectividad por tamaños. Para ello, se formó una monocapa de organosulfuro sobre una superficie de oro en la que se pueden ensamblar los ciclopéptidos que poseen aminoácidos hidrófobos, dando lugar a nanotubos capaces de detectar y transportar iones dependiendo del tamaño. La detección de estos iones se realiza mediante voltimetría y espectroscopia, mostrando, por ejemplo, una selectividad redox del [Fe(CN)6]-3 frente al [Mo(CN)8]-4. Los estudios realizados han demostrado la fiabilidad de la difusión según el tamaño.72 El gran potencial de esta estrategia se basa en la posibilidad de que al variar el ciclopéptido, su tamaño o el tipo de aminoácidos que lo componen, o las cadenas alquílicas de los organosulfurados se puede lograr modular los potenciales eléctricos, etc. El grupo de Ghadiri ha investigado la formación y estabilización de nanoclusters metálicos en la superficie de cristales de nanotubos peptídicos compuestos por ciclo[(L-Gln-D-Ala-L-Gln-D-Ala)2-],59 en el cual los grupos carboxilo sirven como núcleo para la deposición de óxido de cobre (I). El nanocompuesto resultante se caracterizó por TEM (microscópico electrónico) y EELS (electron energy loss scopy), que a su vez actuaban como núcleos para la cristalización de otros compuestos. Dadas las múltiples posibilidades de desarrollo de estas estructuras supramoleculares como: cambios en la superficie externa e interna, tamaño del ciclo, etc.; es de esperar que se sigan aumentando y mejorando las aplicaciones de los nanotubos incluyendo: catálisis, nuevas aplicaciones biológicas, propiedades electrónicas,73 propiedades ópticas, ingeniería molecular, etc. 72) Motesharei, K.; Ghadiri, M. R. “Diffusión-Limited Size-Selective Ion Sensing Based on SAM- Supported Peptide Nanotubes” J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 11306-11312. Motesharei, K.; Ghadiri, M. R. “Diffusion-limited size-selective ion sensing based on SAM-supported peptide nanotubes” [Erratum to document cited in CA128:32011] J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1347. 59) a) Bong, D. T.; Clark, T. D.; Granja, J. R.; Ghadiri, M. R. “Self-assembling organic nanotubes” Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 988-1011. b) Hartgerink, J. D.; Clark, T. D.; Ghadiri, M. R. “Peptide nanotubes and beyond” Chem. Eur. J. 1998, 4, 1367-1372. 73) a) Okamoto, H.; Kasahara, M.; Takeda, K.; Shiraishi, K. In Theoretical Possibility of Semiconductive Properties in Peptide Nanotubes, Proceedings of the 25th International Conference on the Physics of Semiconductors, Osaka, Japan, Sept. 17-22, 2000; Miura, N., Ando T., Eds.; Springer: Berlin, 2001; ia457FC1 (I041). b) Okamoto, H.; Kasahara, M.; Takeda, K.; Shiraishi, K. “Theoretical possibility of semiconductive properties in peptide nanotubes” Springer Proceedings in Physics 2001, 87, 1637-1638. 31 Capítulo 2 2.2. NANOTUBOS PEPTÍDICOS EN DISOLUCIÓN Hasta el momento, los D,L-nanotubos peptídicos se han caracterizado mediante TEM, difracción de electrones y FT-IR, pero ninguno de ellos a dado lugar a cristales de forma y tamaño adecuados para su resolución a nivel atómico a través de estudios de rayos X. Con la finalidad de establecer las bases termodinámicas del proceso de autoensamblaje y obtener monocristales aptos para difracción de rayos X, se sintetizó el ciclo[(L-Phe-D-MeN-Ala)4-] (1) (figura 28). En éste, los grupos Me situados en los nitrógenos de las alaninas bloquean el crecimiento del nanotubo al sustituir en una de las caras del ciclopéptido los grupos dadores de puentes de hidrógeno, de tal forma que, tanto la falta de dichos grupos como los impedimentos estéricos originados por el metilo, impiden la formación de redes de enlace de hidrógeno características de los nanotubos. Dichos ciclopéptidos están, por tanto, predispuestos a formar dímeros que pueden ser solubles en disolventes orgánicos y obtener información sobre la dinámica del proceso y sus bases termodinámicas.74 A partir de los estudios en disolventes apolares del ciclopéptido (1) se determinó la constante de asociación y las diferentes variables termodinámicas del proceso de autoensamblaje: [Ka(293)(CDCl3) = 1,26 x 103 M-1; Ka(293) (84% CCl4/16% CDCl3) = 1,4 x 104 M -1; ∆ Hº(298)(CDCl3) = -11,0 Kcal mol-1, ∆ Sº(298) (CDCl3) = -23,7 cal K-1 mol-1]. Es por tanto, como cabría de esperar, un proceso dirigido entálpicamente gracias a la formación de ocho puentes de hidrógeno, pero entrópicamente desfavorable. Es importante mencionar que la contribución de cada puente de hidrógeno es únicamente de entre 0,5 y 0,7 Kcal mol-1 (2,0 y 3,0 KJ mol-1), valores que están muy lejos de lo que cabría esperar para este tipo de interacciones en medios apolares.75 N O N O N O N H NN O N N CH3 OH O CH3CH3 O H CH3 H N H N H N H O N CH3 O N CH3 O NN CH3 O N O O O O O H CH3 N CH3 NCH3 N CH3 N H3C HN N H NH H N CH3 H3C O O O O CH3 O O OCH3O L-Phe L LL LL-Phe D-Ala D-Ala D-Ala D-Ala D D D D (1) Figura 28: Esquema de la formación del dímero de ciclo[(L-Phe-D-MeN-Ala)4-] (1). Para mayor claridad, se ha omitido la representación de algunos restos. 74) Ghadiri, M. R.; Kobayashi, K; Granja, J. R.; Chadha, R. K.; McRee, D. E. “The Structural and Thermodinamic Basis for the Formation of Self-Assembled Peptide Nanotubes” Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 93-95. 75) a) Sartorius, J.; Schneider, H.-J; “A general scheme based on empirical increments for the prediction of hydrogen-bond associations of nucleobases and of synthetic host-guest complexes” Chem. Eur. J. 1996, 2, 1446-1452. b) Prins, L. J.; Reinhoudt, D. N.; Timmerman, P. “Noncovalent synthesis using hydrogen bonding” Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2328-2426. 32 Nanotubos peptídicos Los datos en estado sólido mediante difracción de rayos X permitieron corroborar los anteriores estudios, observándose que los anillos adoptaban una conformación plana, apilándose en láminas β antiparalelas, de manera que los grupos amida de los enlaces peptídicos se situaban paralelos al eje del tubo, dejando una cavidad interior de aproximadamente 7,5 Å de diámetro. Estos dímeros quedaban estabilizados por la formación de ocho enlaces de hidrógeno entre cada par de ciclopéptidos, con una distancia N…O de 2,90 Å. Además se observó que la cavidad interna contenía moléculas de agua desordenadas en su interior, lo que suponía una clara evidencia del carácter hidrofílico del orificio del nanotubo. N O N O N O N H NN O N N CH3 OH O CH3CH3 O H CH3 H N H N H N H O N CH3 O N CH3 O NN CH3 O N O O O O O H CH3 N O N O N O N H NN O N N CH3 OH O CH3CH3 O H CH3 H O N N N O O NN N NN H O CH3 H O CH3 HO CH3O HO CH3 O N O N O N O N H NN O N N CH3 OH O CH3CH3 O H CH3 H N H N H N H O N CH3 O N CH3 O NN CH3 O N O O O O O H CH3 N CH3 NCH3 N CH3 N H3C HN N H NH H N CH3 H3C O O O O CH3 O O O CH3O N CH3 NCH3 N CH3 N H3C HN H N NH N H CH3 H3C O O O O CH3 O O O CH3O D-Phe D-Ala L-Phe L-Phe D-Ala D-PheD-Phe L LL L L L L L Ciclo[(L-Phe-D-MeNAla)4-] (1) Ciclo[(D-Phe-L-MeNAla)4-] (2) 2-2 (antiparalela) 1-2 (paralela) L-Phe 1-1 (antiparalela) D-Ala D-Ala D-Ala D-Ala L-Ala L-Ala L-Ala L-Ala L-Ala D-Phe D D D D D DD D Figura 29: Esquema que ilustra la estrategia seguida para medir las estabilidades relativas de las láminas β paralela (1-2) y antiparalela (1-1 y 2-2). Para mayor claridad, se han omitido las cadenas laterales en los dibujos de los dímeros. La presencia de los metilos unidos a los nitrógenos bloqueando una de las caras del anillo, determinó que, al dimerizar, los péptidos sólo podían adoptar una lámina β antiparalela en la que los restos homoquirales estaban enfrentados: (1-1, figura 29). Sin embargo, los estudios realizados con mezcla racémica formada por los péptidos 1 y 2, mostraban que, además de formarse los dímeros homoquirales 1-1 y 2-2, también se formaba el heterodímero de 1-2.76 La lámina β de este último dímero es paralela, lo que permitió estudiar la estabilidad relativa de ambas láminas. En las disoluciones de 1 ó 2 se identificó en el 1H RMN la señal de los hidrógenos de los enlaces amida en láminas antiparalelas, siendo los ocho puentes de hidrógeno idénticos; y resonando a 8,73 ppm. En la mezcla racémica se observó la aparición de una nueva señal a δ 8,49 ppm que correspondía a las láminas paralelas (1-2). A partir de las intensidades relativas de ambas señales se determinó que la lámina β antiparalela era 0,8 Kcal mol-1 (3,3 KJ mol-1) más estable que la paralela. 76) Kobayashi, K.; Granja, J. R.; Ghadiri, M. R. “β-Sheet Peptide Architecture: Measuring the Relative Stability of Parallel vs. Antipararel β-Sheet” Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 95-98. 33 Capítulo 2 L D LD L D L D Ala Phe Ala Phe Ala Phe Ala Phe Ala Ala Phe Ala Phe Phe Ala Phe L D LD L D L D Ala Phe Ala Phe Ala Phe Ala Ala Ala Phe Ala Phe Phe Ala Phe Phe L D LD L D L D Ala Phe Ala Phe Ala Phe Ala Phe Phe Ala Phe Ala Ala Phe Phe Ala 1-2 1-1 2-2 Figura 30: Esquema que representa los dímeros donde se señalan las interacciones entre sus cadenas laterales, para los dímeros 1-1, 2-2 y 1-2. Para demostrar que el resultado anterior no se debía a diferentes interacciones entre las cadenas laterales en uno y otro dímero (figura 29), se sintetizó el péptido ciclo[(L-Phe-D-MeN-Ala-L-Leu-D-MeN-Ala)2-] (3) (figura 31). El eje de simetría de este ciclopéptido es de orden 2 (frente al eje C4 de 1 y 2), por lo que podía dar lugar a dos dímeros antiparalelos diastereoméricos, que se diferencian en las distintas interacciones entre las cadenas laterales (figura 31). Una mayor proporción de uno de esos dímeros en disolución indicaría que las interacciones entre las cadenas laterales juegan un papel importante en la estabilización o desestabilización de los dímeros. Sin embargo, el espectro de 1H RMN de una disolución de 3 indica que la proporción de ambos dímeros es prácticamente la misma. Es decir, las interacciones entre las cadenas laterales no contribuyen de forma significativa a la estabilidad de las láminas β. L D L D L D L D Ala Phe Ala Leu Ala Phe Ala Leu Ala Ala Phe Ala Leu Phe Ala Leu L D L D L D L D Ala Phe Ala Leu Ala Phe Ala Ala Ala Leu Ala Phe Leu Ala Leu Phe Ciclo[(L-Phe-D-MeN-Ala-L-Leu-D-MeAla-)2-] 3 Figura 31: Esquema que representa los dos posibles dímeros que se forman a partir del ciclopéptido 3. 34 Nanotubos peptídicos La existencia de dímeros también se ha estudiado mediante fluorescencia empleando para ello un ciclopéptido como el ciclo[Ala-D-Leu-MeAla-D-Leu-LysNDI-Me- D-Leu-MeAla-D-Leu], al que se le ha modificado la cadena lateral de la lisina con un fluoróforo (NDI).77 La presencia del fenómeno de transferencia de fluorescencia (escímeros) en disolución del ciclopéptido en CHCl3 permitió estimar una Ka ~ 102, valor similar a los medidos mediante RMN y que dista mucho de los observados en los anteriores ciclopéptidos. Figura 32: La proximidad entre los grupos cromóforos del ciclopéptido ciclo[Ala-D-Leu-MeAla-D-Leu- LysNDI-Me-D-Leu-MeAla-D-Leu] “NDI = ácido 1,4,5,8-naftalenetetracarboxílico diimida” permite cuantificar mediante fluorescencia la proporción de dímero/monómero. Una de las grandes ventajas que tiene esta tecnología es que permite, al menos teóricamente, controlar el diámetro interno del nanotubo cambiando el número de Aa de la unidad básica, siempre y cuando se mantengan los principios básicos del autoensamblaje.78 Es por esto que se han realizado diversos estudios en disolución utilizando estos nanotubos trucados. Los trabajos realizados por el grupo de Lorenzi79 con hexámeros {ciclo[(D-Leu-L-Leu)2-D-Leu-L-MeN-Leu-] y ciclo[(D-Leu-L-MeN- Leu)3-]} encontraron la formación de dímeros con una constante de asociación de 80 M-1, a pesar de que en posteriores trabajos del grupo de Ghadiri con ciclo[(L-Phe-D- MeN-Ala)3-], éstos no mostraban evidencias de autoensamblaje. Los estudios con anillos mayores a los octapéptidos, como decapéptidos y dodecapéptidos N-metilados, tampoco se obtuvieron evidencias de la formación de dímeros, debido a que se pliegan bien en una o múltiples conformaciones. Como cabría de esperar, los estudios de los ciclotetrapéptidos empleando el péptido ciclo[(D-Phe-L-AllN-Ala)2-] no ha mostrado evidencias de autoensamblaje. Otro efecto estudiado lo constituye la naturaleza del grupo alquilante y la sustitución de los α-Aa, encontrándose que no existen claras diferencias entre Me, All, Pr, etc. Por el contrario, cuando el aminoácido N-alquilado es diferente a la Ala (o Leu en los trabajos de Lorenzi) no se encuentran evidencias de un proceso de dimerización, así el ciclo[(L-Phe-D-MeN-Ala)4-] posee una Ka = 1260 M-1 mientras que el ciclo[(L-MeN-Phe-D-Ala)4-] no dimeriza. La explicación de este hecho se ha atribuido a los impedimentos estéricos entre las cadenas laterales de los Aa y el metilo. Otro reto, abordado por el grupo de Ghadiri, fue la captura del dímero mediante uniones covalentes (figura 33) entre los dos ciclopéptidos que lo componen, con lo que se amplía la diversidad y aplicaciones de estos ciclopéptidos. Para ello, en estos dímeros 77) Horne, W. S.; Ashkenasy, N.; Ghadiri, M. R. “Modulating Charge Transfer through Cyclic D,L-α- Peptide Self-assembly” Chem. Eur. J. 2005, 11, 1137-1144. 78) Clark, T. D.; Buriak, J. M.; Kobayashi, K.; Isler, M. P.; McRee, D. E.; Ghadiri M. R. “Cylindrical β-Sheet Peptide Assemblies” J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8949-8960. 79) a) Saviano, M.; Lombardi, A.; Pedone, C.; Di Blasco, B.; Sun, X. C.; Lorenzi, G. P. “A structural two-ring version of a tubular stack of β-ring in crystals of a cyclic D,L-hexapeptide” J. Incl. Phenom. 1994, 18, 27-36. b) Sun, X. C.; Lorenzi, G. P. “On the Stacking of β-Ring: The Solution Selfassociation Behavior of Two Partially N-Methylated Cyclo(hexaleucines)” Helv. Chim. Acta 1994, 77, 1520-1526. 35 Capítulo 2 covalentes, se trata de añadir una estabilidad cinética a las supramoléculas, caracterizados por su estabilidad termodinámica. Se estudiaron dos ciclopéptidos que se diferenciaban en la estructura de los grupos reactivos responsables de la formación de los enlaces covalentes, el primero de los cuales constaba de dos homoalilglicinas (Hag), mientras que el segundo contenía dos cisteínas. En el primero, se utilizó una reacción de metátesis para capturar el dímero, que se veía favorecida cuando dicho dímero (ciclo[(D-MeAla-L-Phe-D-MeAla-L-Hag)2-]) enfrenta las Hag dejando las olefinas próximas, facilitando la reacción.80 Figura 33: Proceso de captura covalente del dímero: ciclo[(D-MeAla-L-Phe-D-MeAla-L-Hag)2-]. Este diseño podría mejorarse, ya que la segunda reacción de metátesis no parece especialmente favorable, como lo demuestra el hecho de que el producto de la primera reacción se pueda aislar y se necesiten tiempos prolongados de reacción para completar la segunda ciclación. La importancia del autoensamblaje como fuerza directora del proceso se evidencia al comprobar que cuando esta reacción se lleva a cabo en presencia de disolventes que inhiben la formación del dímero (DMF, EtOH), no se observa la formación de los productos de metátesis. El segundo ejemplo utiliza Cys y la oxidación entre los grupos tioles para formar disulfuros. Este proceso, como en el caso anterior, está dirigido por el autoensamblaje molecular que favorece la formación de dímeros, aunque en este caso se observa la formación de otras especies como polímeros o monómeros plegados. Son estas últimas especies las que al reducirse inducen o facilitan la formación de los dímeros covalentes. Figura 34: Péptido ciclo[(L-Phe-D-MeN-Ala-L-Cys-D-MeN-Ala)2-], siendo el enlace covalente formado S-S (X = S). 80) a) Clark, T. H.; Kobayashi, K.; Ghadiri, M. R. “Covalent Capture and Stabilization of Cylindrical β-Sheet Peptide Assemblies” Chem. Eur. J. 1999, 5, 782-792. b) Clark, T. D.; Ghadiri, M. R. “Supramolecular Design by Covalent Capture. Design of a Peptide Cylinder via Hydrogen-Bond- Promoted Intermolecular Olefin Metathesis” J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 12364-12365. 36 Nanotubos peptídicos El desarrollo de interruptores moleculares también ha sido estudiado con este tipo de dímeros. En este caso se han seleccionado, como conectores covalentes de los dímeros, grupos azobenceno, con el objetivo de usar sus propiedades ópticas como sensores para el almacenamiento de datos. El azobenceno puede existir en dos conformaciones E-Z. En la conformación Z los dos ciclopéptidos unidos por el azobenceno están orientados de forma que pueden dar un dímero entre los dos ciclopéptidos unidos covalentemente, mientras el isómero E da lugar a especies de mayor peso molecular (polímeros o oligómeros), donde cada ciclopéptido se encuentra unido a dos péptidos diferentes. La interconversión entre E-Z se realiza irradiando, con la longitud de onda adecuada, luz ultravioleta para los isómeros Z Æ E y luz visible para el proceso inverso. Esta interconversión es clara en disolución; pero no ocurre así cuando se encuentra formando películas en la interfase (figura 35).81 Figura 35: Proceso de interconversión entre los estados E-Z del azobenceno y por tanto formación de dímeros o polímeros. 81) a) Vollmer, M. S.; Clark, T. D.; Steinem, C.; Ghadiri, M. R. “Photoswitchable hydrogen-bonding in self-organized cylindrical peptide systems” Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1598-1601. b) Steinem, C.; Janshoff, A.; Vollmer, M.S.; Ghadiri, M. R. “Reversible photoisomerization of self-organized cylindrical peptide assemblies at air-water and solid interfaces” Langmuir 1999, 15, 3956-3964. 37 Capítulo 2 2.3. NANOTUBOS PEPTÍDICOS EN MEMBRANAS LIPÍDICAS Hay que destacar que en la síntesis de nanotubos mediante el autoensamblaje de ciclopéptidos es posible modificar las propiedades de los mismos dependiendo de las características del ciclopéptido que lo constituye, de tal forma que se pueden establecer de antemano las propiedades del nanotubo o las condiciones más apropiadas para su formación simplemente seleccionando la secuencia de los ciclopéptidos precursores. Por ejemplo, el diámetro interno del nanotubo está determinado por el tamaño del ciclopéptido, esto es, el número de aminoácidos que lo componen (7,5 Å para los ciclooctapéptidos y unos 13 Å para ciclos de 12 aminoácidos). Otra propiedad que puede ser modulada es la topología de la superficie externa, que depende de las cadenas laterales de los aminoácidos utilizados, ya que al ensamblarse el ciclopéptido deja éstas expuestas hacia el exterior del nanotubo. Debido a esto, se prepararon ciclopéptidos constituidos por aminoácidos con cadenas laterales no polares que se ensamblan en las bicapas lipídicas, formando nanotubos que atraviesan las bicapas y por las que se transportan de manera muy eficaz iones pequeños como K+ y Na+.82 Los estudios realizados sobre modelos sintéticos de membranas fosfolipídicas, tanto en liposomas como en membranas planas, confirman está disposición a la formación de conductos transmembranosos y al desarrollo de un transporte de iones altamente eficientes. El transporte es selectivo en base al tamaño y/o en función de la polaridad de los compuestos, ya que el interior de los nanotubos peptídicos es hidrofílico.83 Figura 36: Nanotubo insertado en una bicapa lipídica. 82) Ghadiri, M. R.; Granja, J. R.; Buehler, L. K. “Artificial transmembrane ion channels from selfassembling peptide nanotubes” Nature 1994, 369, 301-304. 83) La difusión del agua en el interior de los nanotubos se estudió teóricamente: Engels, M.; Bashford, D. and Ghadiri, M. R. “Structure and Dynamics of Self-Assembling Peptide Nanotubes and the Channel-Mediated Water Organization and Self-Diffusion. A Molecular Dynamics Study” J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 9151-9158. 38 Nanotubos peptídicos Los estudios de FT-IR llevados a cabo con el ciclo[(L-Trp-D-Leu)3-L-Gln-D- Leu-], mostraron que la orientación del nanotubo no es perpendicular a la membrana lipídica, sino que éste se desvía unos 15º de la perpendicular,84 siguiendo la inclinación habitual de las cadenas lipídicas. El primer ciclopéptido estudiado ciclo[L-Gln-(D-Leu-L-Trp)3-D-Leu-] mostró una conductividad de 107 iones s-1 tanto de los Na+ como de los K+. Los estudios de patch clamp (figura 37) confirmaron que el transporte de estos iones es tres veces más rápido que el que se produce a través del canal que genera un compuesto natural como la gramidicina A. Variando el número de Aa de los ciclopéptidos se pueden generar canales de diferentes dimensiones, permitiendo el transporte de pequeñas moléculas que no pueden ser transportadas por los ciclooctapéptidos. El decapéptido ciclo[Gln-(D-Leu-Trp)4-D- Leu-] forma canales en liposomas y es capaz de transportar glucosa o ácido glutámico.85,86 Este comportamiento se puede explicar por el tamaño del poro interno para los diferentes ciclopéptidos: D-L-octa-, deca-, dodecapéptidos poseen un diámetro interno de van der Waals de unos ~7, ~10 y ~13 Å respectivamente. Figura 37: En este estudio de pach clamp se puede ver la apertura y cierre de los canales que generan el ciclo[L-Gln-(D-Leu-L-Trp)3-D-Leu-]. 84) Kim, H. S.; Hartgerink, J. D.; Ghadiri, M. R. “Oriented Self-Assembly of Cyclic Peptide Nanotubes in Lipid Membranes” J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 4417-4424. 85) Granja, J. R.; and Ghadiri, M. R. “Channel-Mediated Transport of Glucose across Lipid Bilayers” J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 10785-10786. 86) Sánchez-Quesada J.; Kim, H. S.; Ghadiri, M. R. “A Synthetic Pore-Mediated Transmembrane Transport of Glutamic Acid” Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2503-2506. 39 Capítulo 2 Ranganathan y colaboradores han utilizado como análogos de ciclopéptidos macrociclos de bisureas preparadas a partir de cisteínas.92 A pesar de su flexibilidad, estas moléculas cristalizan como nanotubos, estableciendo puentes de hidrógeno entre las ureas tal y como se aprecia en la figura 44. Figura 44: Esquema de un nanotubo formado por dos ureas por macrociclo. También el grupo de Ranganathan ha formado nanotubos usando ciclodepsipéptidos en los que, en estado sólido, se establecen interacciones π-π entre los fenilos y las piridinas que componen el depsipéptido, como forma promotora del apilamiento de los mismos sin que se observe la formación de puentes de hidrógeno que estabilicen el nanotubo (figura 45).93 Tal como se muestra en la figura 45, los grupos amida se orientan en el plano del macrociclo y no intervienen en la formación de los puentes de hidrógeno que estabilizan el nanotubo. 92) Ranganathan, D.; Lakshmi, C.; Karle, I. L. “Hydrogen-Bonded Self-Assembled Peptide Nanotubes from Cystine-Based Macrocyclic Bisureas” J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 6103-6107. 93) Ranganathan, D.; Haridas, V.; Gilardi, R.; Karle, I. L. “Self-assembling aromatic-bridged serinebased cyclodepsipeptides (serinophanes): a demonstration of tubular structures formed through aromatic π-π interactions” J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 10793-10800. 46 Nanotubos peptídicos Figura 45: (a) y (b) representan dos depsipéptidos diferentes que dan lugar a nanotubos. 47 Capítulo 2 48 CAPÍTULO 3: OBJETIVOS Capítulo 3 50 Objetivos El objetivo de este trabajo es el diseño, síntesis y estudio de las propiedades de nuevos nanotubos peptídicos cuya cavidad interior sea diferente a la de los preparados hasta el momento y que además puede permitir en un futuro su modificación. Estos nanotubos posibilitarían el desarrollo de sistemas de transporte moleculares más selectivos en base a sus propiedades físicas y químicas, y no sólo por tamaño; así como el desarrollo de nuevos contenedores moleculares o nanotubos con propiedades catalíticas o capaces de reconocer distintos tipos de moléculas. Los nanotubos peptídicos preparados hasta ahora (capítulo 2) no permiten modificar las propiedades del nanotubo mediante la introducción de diferentes grupos funcionales sin distorsionar la estructura ni la conformación plana necesaria para la formación de nanotubos. Los nanotubos de alfa y beta Aa tienen una cavidad interior de carácter hidrofílico que se debe a la presencia de los grupos amida que forman puentes de hidrógeno con otras subunidades (figura 22, capítulo 2). Se cree que las interacciones de esta red de puentes de hidrógeno con los pares electrónicos del oxígeno del H2O, son las responsables de la hidrofilia del nanotubo, como lo demuestra el hecho de que sean capaces de transportar iones82 y azúcares85 o la presencia de moléculas de H2O en los cristales de estos nanotubos.74,94 La especial composición de estos ciclopéptidos, en los que se alternan L- y D-Aa,95 determina que todas las cadenas laterales de los distintos Aa queden orientados hacia el exterior del nanotubo, mientras que el Hα queda orientado paralelamente al eje del tubo, dejando hueco el interior de la supermolécula. Por tanto, no es posible modificar el carbono α u orientar la cadena lateral de los α-Aa sin distorsionar la conformación plana con el objetivo de cambiar las propiedades internas del nanotubo L,D-. H RR N O N O N O N H N N O N N H OH O H O H H H O Figura 46: Disposición plana de los ciclopéptidos necesaria para la formación de nanotubos, donde las cadenas laterales de los α-Aa quedan hacia el exterior para no interferir en la formación de éstos, y ninguno de los grupos se proyecta hacia el interior. Nuestro primer objetivo fue diseñar un ciclopéptido que pudiese formar nanotubos mediante un proceso de autoensamblaje molecular, que a su vez permitiese 82) Ghadiri, M. R.; Granja, J. R.; Buehler, L. K. “Artificial transmembrane ion chanels from selfassembling peptide nanotubes” Nature 1994, 369, 301-304. 85) Granja, J. R.; and Ghadiri, M. R. “Channel-Mediated Transport of Glucose across Lipid Bilayers” J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 10785-10786. 74) Ghadiri, M. R.; Kobayashi, K; Granja, J. R.; Chadha, R. K.; McRee, D. E. “The Structural and Thermodinamic Basis for the Formation of Self-Assembled Peptide Nanotubes” Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 93-95. 94) Clark, T. D.; Buriak, J. M.; Kobayaski, K.; Isler, M. P.; McRee, D. R.; Ghadiri, M. R. “Cylindrical β-sheet Peptide Assemblies” J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8949-8962. 95) Los β-aminoácidos que forman los ciclopéptidos pueden ser todos de la misma quiralidad o de quilaridad alternada, ya que en ambos casos los ciclopéptidos dan lugar a la conformación plana necesaria para la formación de nanotubos: a) Seebach, D.; Matthews, J. L.; Meden, A.; Wessels, T.; Baerlocher, C.; McCusker, L. B.; “Cyclic-β-peptides. Structure and tubular stacking of cyclic tetramers of 3-aminobutanoic acid as determined from powder diffraction data” Helv. Chim. Acta 1997, 80, 173-182. b) Clark, T. D.; Buehler, L. K., Ghadiri, M. R. “Self-Assembling Cyclic β3-Peptide Nanotubes as Artificial Transmembrane Ion Channels” J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 651-656. 51 Capítulo 3 funcionalizar su interior. Para ello, pensamos en utilizar ciclopéptidos compuestos por γ-aminoácidos, como por ejemplo el 4-aminobutírico, que permitiría modificar las propiedades del nanotubo si el carbono 3, en la conformación plana que da lugar al nanotubo, quedase proyectado hacia el interior de la cavidad (figura 47).96 Las modificaciones de este carbono (R2 diferente de H) permitirían por tanto variar las propiedades del nanotubo. Sin embargo, esta conformación, con R2 orientado hacia el interior de la cavidad, no es la más estable; y probablemente, en disolución, este péptido se plegaría para adoptar una conformación diferente a la deseada. La introducción de sustituyentes en los carbonos 2 y 4 del aminoácido podría favorecer esta conformación, aunque probablemente induciría al ciclopéptido hacia otros tipos de plegamientos no deseados o dificultaría su apilamiento para la formación de nanotubos. Para prevenir estos plegamientos decidimos utilizar ácidos 3-aminociclicoalcanocarboxílicos de geometría cis (γ-Aca) (figura 48). En concreto, pensamos en usar el ácido 3-aminociclohexanocarboxílico (γ-Ach) (n = 1), que en su conformación silla más estable dejaría a ambos sustituyentes orientados ecuatorialmente, favoreciendo la conformación plana del ciclopéptido necesaria para la formación de nanotubos (figura 48). El sustituyente del carbono C2 del anillo, en disposición ecuatorial, quedaría orientado hacia el interior del canal sin intervenir en el proceso de autoensamblaje. H OHO O N N O H N N H OH N O H N HN HN NH H N N H NH O O O O O OR 1 R 1 R 1 R 2 R 2 R 2 23 4 1 R 2 R 2 R 2 Figura 47: Ciclopéptido formado por el ácido 4-aminobutírico y α-Aa. OH N R 2 C3 C2 C1 ( ) n Figura 48: Modelo de la disposición de los γ-Aca en la estructura de los α,γ-ciclopéptidos. El primer motivo estructural propuesto para este estudio fue la alternancia de α,γ-aminoácidos: un ciclopéptido en el que se alternasen los α-Aa con los γ-Aca, y en el que estos últimos deberían favorecer la conformación plana. 96) Revisión de la nomenclatura de péptidos y ciclopéptidos: Jones, J. H. “A short guide to abbreviations and thin use in peptide science” Int. J. Peptide Sci. 1999, 5, 465-471. 52 Objetivos H H OHO O N N OH N N H OH N O N 123 HN HN NH H N N H NH O O O O O O R 1 R 1 R 1 R 2 R 2 R 2 D D D S S S R R R Figura 49: En la izquierda se representa un ciclopéptido formado por α-Aa y γ-Ach, mientras que en la derecha se muestra el modelo en perspectiva de la conformación plana precursora de nanotubos. Las interacciones puente de hidrógeno entre los C=O y los NH del esqueleto peptídico con otras subunidades debe conducir a la formación de nanotubos. Para facilitar la visión de este modelo se han suprimido las cadenas laterales de los α-Aa. La quiralidad de los Aa es altamente importante, ya que sólo ciclopéptidos en los que los α-aminoácidos de configuración natural -L- se alternan con γ-aminoácidos cíclicos (γ-Aca) de configuración (1S,3R) pueden adoptar la conformación plana necesaria para la formación de nanotubos (figura 49). En realidad, dado que los γ-Aca poseen un número impar de átomos (5) al igual que los α-Aa (3) (figura 48), en principio podríamos sustituir cualquier α-Aa de los D,L-α-péptidos por un γ-Aca, siempre y cuando los α-Aa de configuración natural (L) los sustituyamos por el isómero (1R,3S) y los D-Aa los intercambiemos por el (1S,3R) (figura 49).97 Por ello, en este trabajo nos planteamos, como objetivo simultáneo, confirmar la hipótesis de que el anillo cicloalcánico del γ-Aca es equivalente a un Cα voluminoso. Esta hipótesis la podríamos confirmar mediante el desarrollo de otros motivos estructurales, tales como (3 α-Aa por cada 1 γ-Aca), en el cual 2 α-Aa (D, por ejemplo) de un D,L-ciclooctapéptido se sustituyen por 2 γ-Aca de configuración (1S,3R), y obtener nanotubos peptídicos. 97) Dada esta equivalencia estereoquímica, a lo largo de este trabajo utilizaremos la nomenclatura D-γ-Ach para referirnos al (1S,3R)-3-aminociclohexanocarboxílico y la L-γ-Ach para referirnos al isómero (1R,3S). 53 Capítulo 3 NH NH HN HN N H NH H N HN O O O O O O O R 3 OR 1 R 3 R 1 R 2 R 2 Ciclo[(D-γ -Ach-L-Aa-D-Aa-L-Aa) 2-] O R 2 O R 1 O O R 1 R 2 O R 1 O O O R 2 R 1 R 2 H NH N NH NH N H HN HN HN L LL L D D D D Ciclo(L-Aa-D-Aa)4-] D LL Ciclo(L-γ-Ach-D-Aa)3-] HN HN NH H N N H NH O O O O O O Ciclo(L-Aa-D-Aa)3-] HN HN NH H N N H NH O O O O O O R 2 R 2 R 2 R 1 R 1 R 1 1 2 3 4 51 2 3 1 2 3 N O O N D L RN O O N H H H H H Figura 50: Esquema de ciclopéptidos formados por α-aminoácidos (izquierda) y de otros formados por α,γ-ciclopéptidos (derecha). Los R pueden corresponder a iguales o a diferentes Aa, pero siempre respetando la estereoquímica. 54 Objetivos 3.1. MODOS DE ESTUDIO Para estudiar estas nuevas estructuras supramoleculares se pueden plantear tres estrategias diferentes. La primera consistiría en un estudio en estado sólido, para lo cual se prepararían ciclopéptidos que se autoensamblen mediante un cambio de las condiciones del medio en las que se disuelve el péptido (cambio de pH, polaridad, etc.), tal como realizó Ghadiri en sus primeros estudios.10,67 Por ejemplo, ciclopéptidos formados por Gln y γ-Ach podrían ser solubles en disoluciones fuertemente ácidas, mientras que una lenta basificación conduciría a la formación del nanotubo. El estudio de estos nanotubos se tendría que realizar mediante microscopía electrónica, difracción de electrones o rayos X si se formasen cristales de tamaño adecuado. Otra posibilidad sería anclar y hacer crecer los nanotubos sobre superficies de oro o mica y estudiarlos mediante microscopio de fuerzas atómicas (AFM).98 Para estos estudios se requeriría al menos una Cys en la secuencia del ciclopéptido para facilitar su anclaje (figura 51 A).72 La segunda alternativa se basaría en el estudio de los procesos de autoensamblaje en disolución con ciclopéptidos que tuviesen bloqueada una de sus caras, por ejemplo, con grupos metilo que sustituyesen a los protones de las amidas y por tanto que sólo pudiesen dar lugar a dímeros (figura 51 B).74,78 La adecuada elección de los aminoácidos permitiría estudiar estas especies en disolución y determinar los factores termodinámicos y estructurales que gobiernan estos procesos, utilizando para ello la resonancia magnética nuclear. Los estudios en disolución nos proporcionarían además una gran información sobre la dinámica del autoensamblaje, aunque menos información sobre los nanotubos propiamente dichos. La tercera estrategia supondría estudiar la formación de nanotubos mediante la puesta a punto de alguna de las propiedades características de los mismos, como por ejemplo, el transporte molecular o iónico (figura 51 C).82,85 Para ello, se sintetizarían ciclopéptidos compuestos por Aa hidrofóbicos (como Trp o Leu) capaces de solubilizarse en bicapas fosfolipídicas y de ensamblarse en el interior de las mismas dando lugar a canales transmembranales. El transporte de iones u otras especies de un lado a otro de la bicapa, impulsadas por la presión osmótica o la diferencia de potencial electrostático, sería un claro indicio de la formación de nanotubos. En este trabajo hemos abordado estas tres estrategias para determinar la formación de nanotubos, aunque hemos dedicado un mayor esfuerzo al estudio en 10) Ghadiri, M. R.; Granja, J. R.; Milligan, R. A.; McRee, D. E.; Khazanovich, N. “Self-Assembling organic nanotubes based on a cyclic peptide architecture” Nature 1993, 366, 324-327. 67) Hartgerink, J. D.; Granja, J. R.; Milligan, R. A.; Ghadiri, M. R.; “Self-Assembling peptide Nanotubes” J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 43-50. 98) Song, S. H.; Park, K. M.; Chang, S. M.; Nakamura, C.; Miyake, J.; Kim, W. S. “Analysis of the Structure and Morphology of Oligopeptide SAM using XPS and AFM” Molecular Crystals and Liquid Crystals 2003, 407, 531-536. 72) Motesharei, K.; Ghadiri, M. R. “Diffusión-Limited Size-Selective Ion Sensing Based on SAM- Supported Peptide Nanotubes” J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 11306-11312. Motesharei, K.; Ghadiri, M. R. “Diffusion-limited size-selective ion sensing based on SAM-supported peptide nanotubes” [Erratum to document cited in CA128:32011] J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1347. 74) Ghadiri, M. R.; Kobayashi, K; Granja, J. R.; Chadha, R. K.; McRee, D. E. “The Structural and Thermodinamic Basis for the Formation of Self-Assembled Peptide Nanotubes” Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 93-95. 78) a) Clark, T. D.; Buriak, J. M.; Kobayashi, K.; Isler, M.; P.; McRee, D. E.; Ghadiri M. R. “Cylindrical β-Sheet Peptide Assemblies” J. Am. Chem. Soc. 1998, 35, 8949-8960. 82) Ghadiri, M. R.; Granja, J. R.; Buehler, L. K. Artificial transmembrane ion channels from selfassembling peptide nanotubes. Nature 1994, 369, 301-304. 85) Granja, J. R.; and Ghadiri, M. R. “Channel-Mediated Transport of Glucose across Lipid Bilayers” J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 10785-10786. 55 Capítulo 5 62 Síntesis de γ-aminoácidos y metodología de síntesis de ciclopéptidos 63 5.1. SÍNTESIS DEL N-Boc-cis-3-AMINOCICLOHEXANOCARBOXÍLICO (Boc-γ-Ach-OH) Los objetivos planteados para este trabajo consistieron en la preparación de nuevos nanotubos peptídicos a partir de ciclopéptidos que contuviesen gamma aminoácidos cíclicos. La orientación del carbono C2 del anillo hacia el interior del orificio central del nanotubo debía conferirle un carácter hidrofóbico que los diferenciaría de los α-nanotubos. Con este propósito se diseñaron péptidos cíclicos formados por γ-Ach alternados con α-Aa. En dicho diseño, para que el ciclopéptido pudiese adoptar la conformación plana necesaria para el proceso de autoensamblaje, era fundamental el empleo del (1R,3S)-3-aminociclohexanocarboxílico = L-γ-Ach alternado con α-aminoácidos de configuración D [o bien la combinación: (1S,3R)-3-aminociclohexanocarboxílico (D-γ-Ach) con α-aminoácidos de configuración L]. Sólo esta especial alternancia de enantiómeros permitiría la conformación plana del ciclopéptido, necesaria para el proceso de autoensamblaje y para que las cadenas laterales de los distintos aminoácidos no interfirieran en el apilamiento de los ciclopéptidos. La síntesis enantioméricamente pura del γ-Ach propuesto para este proyecto fue nuestro primer objetivo. Según los precedentes bibliográficos existían dos métodos alternativos para la preparación del γ-Ach. El primero de ellos, realizado por el grupo de Allan, se basaba en la reducción del ácido 3-metoxibenzoico con Na en NH3, para dar lugar a la 3-carboxiciclohexanona (figura 53). El posterior tratamiento de esta ciclohexanona con hidroxilamina, seguido de una nueva reducción con Na en NH3 de la oxima resultante, conducía al 3-aminociclohexanocarboxílico que resultaba ser mayoritariamente el isómero cis. Los autores también llevaron a cabo una resolución del ácido 3-oxociclohexanecarboxílico mediante la cristalización en presencia de brucina.105 Figura 53: Síntesis del 3-aminociclohexanocarboxílico a partir del 3-metoxibenzoico.105 En el segundo método (figura 54) se empleó como sustancia de partida el 3-nitrobenzoico que se hidrogenó en medio básico acuoso en presencia de Ni Raney a 100 atmósferas de presión de H2 y 150 ºC, obteniéndose el ácido 3-aminociclohexanocarboxílico con un rendimiento del 76%. Es interesante mencionar que en estas condiciones se obtenía mayoritariamente el isómero cis. Para confirmar dicha obtención y facilitar su purificación, se trató el compuesto con hidróxido de bario para inducir la forma de la lactama bicíclica (sólo es posible en los isómeros cis), que posteriormente se hidrolizó por calentamiento con HCl.106 105) Allan, R. D.; Johnston, G. A.; Twitchin, B. “Synthesis of Analogues of cis-3- aminocyclohexanecarboxilic Acid” Aust. J. Chem. 1981, 34, 2231-2236. 106) Palaima, A.; Staniulyte, Z.; Podeniene, D. “Synthesis of derivatives of cis-3- aminocyclohexanecarboxylic acid” Chemija 1997, 54, 92-96. 1) Na/NH3 2) brucina Na/NH3 OMe COOH O COOH NH2 COOH NOH COOH NH2OH NH2 COOH + Capítulo 5 64 Figura 54: Síntesis del 3-aminociclohexanocarboxílico a partir del 3-nitrobenzoico.106 Debido a la sencillez que entrañaba este segundo método, basado en la hidrogenación del m-nitrobenzoico comercial, se optó por él, pero partiendo del m-aminobenzoico comercial, disponible en nuestro laboratorio en gran cantidad. El principal inconveniente de esta estrategia era que debíamos poner a punto la resolución del aminoácido, ya que la anterior estrategia basada en la resolución del ácido 3-oxociclohexanocarboxílico con brucina no era aplicable en ésta. Para poder realizar esta hidrogenación a más de 100 atmósferas y a 150 ºC de temperatura se empleó un reactor Parr. Así, se sometió una disolución de m-aminobenzoico que contenía 1 eq. de NaOH y Ni Raney con H2 a una presión de 100 atm, y a 150 ºC de temperatura. Se observó que tras 4 h la presión disminuía a 80 atm, aunque por ccf se podía constatar aún la presencia de la sustancia de partida, por lo que se volvió a recargar con H2 hasta las 100 atm, dejando la mezcla a 150 ºC durante 8 h adicionales. Una vez concluida la reacción, la mezcla se filtró sobre celita y se acidificó con HCl (10%) hasta pH 2 para evitar la formación de la lactama. El producto se estudió por RMN de protón, y aunque no se pudo determinar la relación entre diastereoisómeros cis-tras debido a la complejidad de su 1H RMN, decidimos proceder a la protección sin mayor purificación. Figura 55: Síntesis propuesta para la obtención del γ-Ach. La protección del grupo amino se realizó con anhídrido de Boc en medio básico, sin embargo, la reacción requería de una gran proporción de éste para completar el proceso. Este problema con la protección surgía siempre que intentábamos realizarla sin eliminar las sales que acompañan al aminoácido. Sin embargo, estas dificultades desaparecían cuando se eliminaban las sales, lo cual se llevó a cabo mediante una columna de intercambio iónico (Dowex AG 50 WX 8). La posterior protección en dioxano/agua empleando como base DIEA condujo al compuesto deseado con un rendimiento global del 65%. El aminoácido resultante se cristalizó de una mezcla 2:1 CH2Cl2/hexano, resaltando que en esta primera cristalización se obtenía únicamente el isómero cis con un rendimiento del 50%, mientras que de las aguas madres se recuperaba una mezcla de isómeros cis/trans en una relación aproximada de 2:1. Esto nos permitió establecer que la hidrogenación da lugar a ambos isómeros en una relación aproximada de 85:15. 106) Palaima, A.; Staniulyte, Z.; Podeniene, D. “Synthesis of derivatives of cis-3- aminocyclohexanecarboxylic acid” Chemija 1997, 54, 92-96. NH2 COOH Ni Raney 100 atm H2 150 ºC NH2 COOH NHBoc COOH (Boc)2O H2O/dioxano Base + NHBoc COOH Ni/Raney 100 atm H2 150ºC CO HCl NH NO2 COOH NH2 COOH NH2 COOH 10% BaOH Síntesis de γ-aminoácidos y metodología de síntesis de ciclopéptidos 65 Una vez sintetizado el Boc-γ-Ach-OH se procedió a estudiar su resolución. Para ello se hicieron diferentes intentos de cristalización con diversas aminas quirales. En la tabla 1 se muestra un resumen de los estudios realizados. Figura 56: Esquema de la resolución del ácido cis-3-aminociclohexocarboxílico con (+)R-1-feniletanamina. Amina quiral Disolventes en que se cristaliza Proporción disolventes [α]D20 (c=1,0 en MeOH) Brucina Diferentes disolventes Varias +0 Quinina Diferentes disolventes Varias +0 (-)efedrina AcOEt/éter 1:1 +7 (-)feniletanamina CHCl/hexano 2:1 + 49,8 (+)feniletanamina CHCl/hexano 2:1 - 50,5 Tabla 1: Resultados de la resolución obtenidos con diferentes aminas. La utilización de brucina en las condiciones de resolución descritas por el grupo de Allan, no dio ningún resultado positivo, y no se obtuvo bajo ninguna de las condiciones estudiadas, cristales de pureza adecuada. Tampoco resultaron positivos los estudios realizados con quinina, con la que no conseguimos que cristalizase el Boc-γ-Ach-OH. Con efedrina se obtuvieron unos cristales en los que la rotación óptica del Aa, una vez eliminada la amina quiral, era de [α]D20= +7. El principal inconveniente de este método era la baja solubilidad de la efedrina en los disolventes estudiados (CHCl3, CH2Cl2, etc.), lo que hacía muy difícil reproducir o mejorar estos resultados. Finalmente se encontró que la utilización de 1 eq de (+)R-1-feniletanamina en DCM/hexano daba lugar a cristales cuyas rotaciones ópticas, después de eliminar la amina, registraban un valor promedio de [α]D20= -35; sin embargo, estas rotaciones se correspondían con excesos enantioméricos no superiores al 66%. Para mejorar la pureza óptica era necesario repetir el proceso de cristalización un par de veces, obteniéndose finalmente cristales que contenían el Boc-γ-Ach-OH con una actividad óptica de [α]D20= -50 (c=1,0 en MeOH). Para determinar la pureza enantiomérica y el enantiómero resuelto, fue necesario desproteger el grupo Boc para compararlo con los datos del Aa desprotegido publicado. El tratamiento con TFA del Boc-γ-Ach-OH, seguida de la eliminación de sales mediante una columna de intercambio iónico, dio lugar al ácido 3-aminociclohexanocarboxílico (γ-Ach), con una rotación óptica de ([α]D20 = -5,3 (c=1,0 en H2O)), similar a la Et Ph NHBoc COOH (+)R-1-feniletanamina CHCl3/hexano 2:1 NHBoc COO ácido citrico 5% H3N NHP COOH P = Boc P = Fmoc 1) TFA/CH2Cl2 2) FmocCl, Na2CO3 Capítulo 5 66 publicada anteriormente, y que nos permitió concluir que el isómero levorrotatorio se corresponde con el (1R,3S)-γ-Ach.105 Una ventaja de este método frente a la resolución con brucina es que es posible obtener ambos enantiómeros, ya que la (-)S-1-feniletanamina también es comercial y económicamente asequible. Este método también permite la recuperación de la amina, ya que los cristales de la resolución se disuelven en CH2Cl2 y se lavan con ácido cítrico al 10% para eliminar la amina, la cual se podría recuperar de las aguas de lavado, aunque para este trabajo no se llevó a cabo. Una determinación de la pureza enantiomérica más precisa se llevó a cabo mediante el método de Marfey (figura 57),107 que consiste en la derivatización (mediante una reacción de sustitución nucleófila aromática) del aminoácido con el reactivo 2-(5-fluoro-2,4-dinitrofenilamino)propanamida. La posterior separación de la mezcla diasteromérica resultante mediante el HPLC permitió cuantificar la relación diasteromérica y con ello la relación entre ambos enantiómeros. La derivatización con el reactivo de Marfey de la mezcla racémica del γ-Ach permitió obtener las condiciones de separación de ambos diasteroisómeros (RS y SS). Posteriormente se inyectó el enantiómero resuelto, cuya rotación óptica era de [α]D20 = -50 (c=1,0 en MeOH), resultando una relación 97,5:2,5 y por tanto un e.e. del 95%. Como se aprecia en los cromatogramas de la figura 58, cuando el (+) (1S,3R)-γ-Ach se derivatiza tiene un tiempo de retención de 23,5 min, mientras que el del derivatizado del (-) (1R,3S)-γ-Ach es de 15,5 min. NH 2 COOH + H NCH C CH 3 NH 2 O F O 2 N O 2 N NH CHC H 3 CNH 2 O NO 2 O 2 N N H HOOC S S Figura 57: Reacción del γ-Ach con el reactivo de Marfey mediante una sustitución nucleófila aromática, para dar lugar al correspondiente diasteroisómero. La síntesis del Fmoc-γ-Ach-OH se realizó a partir de la desprotección del Boc-γ-Ach-OH ya resuelto con TFA/CH2Cl2 y posteriormente se protegió empleando FmocCl y Na2CO3 en dioxano/H2O (capítulo 11). 105) Allan, R. D.; Johnston, G. A.; Twitchin, B. “Synthesis of Analogues of cis-3- aminocyclohexanecarboxilic Acid” Aust. J. Chem. 1981, 34, 2231-2236. 107) Marfey, P. “Determination of D-amino acids. II. Use of a bifunctional reagent 1,5-difluoro-2,4- dinitrobencene” Carlsberg. Res. Commun. 1984, 49, 591-596. Síntesis de γ-aminoácidos y metodología de síntesis de ciclopéptidos 67 Figura 58: Cromatograma del HPLC de cada uno de los enantiómeros derivatizados con el reactivo de Marfey. El diasteroisómero obtenido del aminoácido dextrorrotatorio [(1S,3R)-γ-Ach] posee un tiempo de retención de 23,5 min, mientras que el obtenido del levorrotatorio [(1R,3S)-γ-Ach] es de 15,5 min. Condiciones: 20% a 40% de MeCN/H2O en 40 min. (0,1% de TFA). La N-metilación del Boc-γ-Ach-OH se llevó a cabo por tratamiento con NaH y yodometano sobre el Boc-γ-Ach-OH resuelto. Es importante asegurarse de que la alquilación del γ-Ach tiene lugar de forma total, ya que resulta muy complicada la separación de la sustancia de partida y del producto de reacción. En el espectro de RMN hay que destacar el desdoblamiento del protón Hγ, debido al equilibrio conformacional de los grupos carbamato (cis/trans). Esta isomerización cis/trans complica en gran medida el espectro y desgraciadamente dificulta la posterior caracterización de los péptidos lineales sintetizados.108 Figura 59: Equilibrio del enlace amida entre las formas cis y trans. 108) La alquilación del nitrógeno de la amida reduce la energía entre las formas cis y trans a aproximadamente 2,1 KJ/mol, mientras que esta diferencia es de 10,9 KJ/mol para los aminoácidos convencionales: Stewart, D. E.; Sarkar, A.; Wampler, J. E. “Occurrence and role of cis peptide bonds in protein structures” J. Mol. Biol. 1990, 214, 253-260. N COOH Me O O N COOH Me O O Capítulo 5 68 5.2. SÍNTESIS DEL N-Boc-cis-3-AMINO-2-METILCICLOHEXANO- CARBOXÍLICO Un segundo objetivo sintético que nos fijamos en este trabajo fue la preparación de algún derivado del γ-Ach que estuviese sustituido en el carbono 2 del ciclohexilo. Por su sencillez sintética, nos planteamos la preparación del ácido 3-amino-2- metilciclohexanocarboxílico (2-MeAch), ya que ésta se podía llevar a cabo a partir del ácido 3-amino-2-metilbenzoico utilizando una estrategia sintética similar a la aplicada en la obtención del γ-Ach. Figura 60: Síntesis propuesta para la obtención de los diferentes diasteroisómeros del ácido N-Boc-3-amino-2-metilciclohexanocarboxílico. Confiábamos en que, en estas condiciones de reacción, la termodinámica del proceso podía favorecer la formación del producto más estable, el isómero trans-trans frente al cinético cis-cis (figura 61). Este segundo isómero también tiene un gran interés, pues permitiría desarrollar tapas moleculares de nanotubos manteniendo intacto el esqueleto peptídico del ciclopéptido, ya que dicho grupo podría impedir la aproximación de otra subunidad ciclopeptídica a una distancia que permitiese formar los puentes de hidrógeno. Figura 61: La hidrogenación del ácido 3-amino-2-metilciclohexanocarboxílico conduce a una mezcla de cuatro diasteroisómeros. Modelos de los ciclopéptidos resultantes que contienen los 2-MeAch trans-trans y cis-cis en los que se puede observar la diferente orientación del metilo. NO2 COOH Ni Raney 100 atm H2 150 ºC NH2 COOH NHBoc COOH (Boc)2O H2O/dioxano DIEA C1 C2 C3 Me NO2 COOH NH2 COOH NH2 COOH trans-trans NH2 COOH NH2 COOH cis-cistrans-cis cis-trans NH2 COOH NH2 Me COOH N H NN O N O N H O N OO O H Me Me Me HH H H2 Ni Raney +++ N H NN O N O N H O N OO O HMe Me Me HH H Epimerización Epimerización Síntesis de γ-aminoácidos y metodología de síntesis de ciclopéptidos 69 Los otros dos isómeros tendrían un menor interés sintético, aunque podrían ser transformados en los correspondientes isómeros cis-cis o trans-trans, a través de epimerizaciones en medio básico (figura 61). El tratamiento del 3-nitro-2-metilbenzoico en las condiciones anteriormente desarrolladas (H2 100 atm, Ni (Raney), NaOH) condujo a una mezcla compleja de isómeros, cuyo espectro de RMN no permitía determinar ni la relación de isómeros ni su identificación. Por ello procedimos a la protección del grupo amino (anhídrido de Boc, DIEA, dioxano/agua) de la mezcla previamente pasada a través de una columna de intercambio iónico, para eliminar las sales. El RMN de protón permitió identificar la existencia de los cuatro diasteroisómeros a los que designamos A:B:C:D, y que se encontraban en relación aproximada 3:3:1:3 (otros intentos de hidrogenación variando la presión y la temperatura no proporcionaron una relación de diasteroisómeros significativamente diferente). La identificación se realizó en base a los Me en C2 del producto protegido con Boc, los cuales presentaban unos desplazamientos de 1,03 (A), 0,98 (B y C, en un principio se pensó que se trataba de un único isómero) y 0,84 ppm (D) en CDCl3. Su separación mediante columna de gel de sílice no fue posible. Los isómeros A y D eran poco solubles en CH2Cl2 o CHCl3; esta menor solubilidad en estos disolventes permitió hacer extracciones selectivas de los isómeros B y C mediante repetidos lavados de la mezcla de los cuatro diasteroisómeros, obteniéndose fracciones enriquecidas en A y D, por un lado, y otras en B y C, correspondientes a las disoluciones cloradas. La cristalización en MeOH de la mezcla A-D condujo al isómero D puro, mientras que de las aguas madres se obtuvo el isómero A en relación 9:1 con D. De igual manera, por cristalización en CHCl3/hexano de la mezcla de B y C, se lograron cristales puros de B, y otros cristales de diferente aspecto y textura que se identificaron como el isómero C, por lo que al final se obtuvieron entre 2-150 mg puros o casi puros de cada uno de los diasteroisómeros. El estudio de dichos diasteroisómeros mediante RMN y rayos X nos permitió determinar su estructura. La resonancia magnética nuclear de 13C resultó ser una técnica que aportó gran información estructural para la identificación de cada uno de los esteroisómeros. En la tabla 2 se detallan los desplazamientos químicos estimados para dichos carbonos dependiendo de la orientación de los sustituyentes.109 Dicha identificación se basó en que la orientación axial de cada uno de los tres grupos da lugar a un mayor apantallamiento del carbono del anillo. Así, el carbono C1 tendría teóricamente su señal a mayor campo para el isómero cis-trans. Al isómero trans-cis le correspondería un C3 a mayor campo y sería el cis-cis el que tendría el C2 más apantallado. Una detenida observación de los distintos 13C nos llevó a plantear como posibles estructuras: cis-trans = A, trans-trans = B, trans-cis = C y cis-cis = D (figura 62). La orientación axial de los metilos del C2 también está basada en el desplazamiento químico; el isómero D es el único que está orientado axialmente y que aparece a un campo de 8,2 ppm, mientras que para los otros tres aparece entre 14,7 y 15,9 ppm. 109) Pretsch, E.; Cler, T.; Seibl, J.; Simon, W. Versión española: Castells. J.; Camps, F. “Tablas para la elucidación estructural de compuestos orgánicos por métodos espectroscópicos.” Ed. Alhambra, Madrid, 1980. Capítulo 5 70 COOH Me COOH NHBoc Me COOH NHBoc Me COOH NHBoc Me NHBoc cis-trans (A)trans-trans (B)trans-cis (C)cis-cis (D) Figura 62: Configuración propuesta para cada diasteroisómero (del ácido N-Boc-3-amino-2- metilciclohexanocarboxílico) en base a los 13C RMN. Determinación teórica109 Datos experimentales cistrans transtrans trans -cis cis-cis A exp. DMSO B exp. CDCl3 C exp. DMSO D exp. CDCl3 Cα(COOH) C1 45,6 49,5 46,0 46,0 42,9 50,0 44,2 45,8 Cα(Me) C2 40,5 42,5 40,0 38,0 36,4 39,6 36,0 33,7 Cα(NH) C3 60,4 63,0 58,0 60,0 49,9 54,0 49,1 51,9 Me 14,7 16,5 15,9 8,2 Tabla 2: Datos experimentales y teóricos de los carbonos C1, C2 y C3 del anillo de los diferentes diasteroisómeros. En negrita, los datos a mayor campo para cada diasteoisómero, que en un principio se asignaron a una orientación axial. Todo parece indicar que los isómeros de mayor interés son B y D, que por fortuna pudimos confirmar gracias a la obtención de cristales de tamaño adecuado de ambos diasteroisómeros. El diasteroisómero B cristalizó de una mezcla CHCl3/hexano (2:1), mientras que el diasteroisómero D cristalizó de etanol. La difracción de rayos X confirmó las estructuras propuestas, como se puede apreciar en las figuras 63 y 64. Figura 63: Ortep del diasteroisómero B (trans-trans). 109) Pretsch, E.; Cler, T.; Seibl, J.; Simon, W. Versión española: Castells. J.; Camps, F. “Tablas para la elucidación estructural de compuestos orgánicos por métodos espectroscópicos.” Ed. Alhambra, Madrid, 1980. Síntesis de γ-aminoácidos y metodología de síntesis de ciclopéptidos 71 Figura 64: Ortep del diasteroisómero D (cis-cis). También realizamos un intento de resolución de B con (-)S-1-feniletanamina, obteniendo unos cristales que, una vez filtrados y extraída la amina, presentaban un [α]D20 = +20,4 (c=1,0 en MeOH). Dado que sólo disponíamos de unos pocos mg no fue posible realizar una segunda resolución; sin embargo, este primer intento era suficiente para comprobar que la resolución con feniletanamina era también factible. De esta manera se demostró que es posible la obtención de los diferentes diasteroisómores del ácido 3-amino-2-metilciclohexanocarboxílico y que además, los dos que más nos interesaban (B y D), podían ser obtenidos mediante cristalizaciones selectivas. Capítulo 6 78 α,γ-Ciclopéptidos N-metilados 79 Los primeros estudios los realizamos con ciclopéptidos especialmente diseñados para la formación de dímeros, de tal manera que pudiera analizarse el proceso de autoensamblaje en disolución y establecerse las bases termodinámicas y estructurales de los mismos. Nuestro primer objetivo fue estudiar un hexapéptido en el que se alternasen los α y γ-aminoácidos. Esta elección se basaba en que el tamaño del ciclopéptido resultante, 24 eslabones, es similar al de los estudiados para D,L-ciclooctapéptidos, aunque el número de grupos dadores y aceptores de puentes de hidrógeno es únicamente seis. La adecuada preorganización de los ciclopéptidos resulta de gran importancia en los procesos de autoensamblaje. Nótese que para compuestos con grupos capaces de formar cuatro puentes de hidrógeno y dependiendo de la orientación ADAD (Aceptor- Dador- Aceptor-Dador), se puede llegar a valores >104 M -1,75 mientras que los D,L-ciclooctapéptidos que dan lugar a dímeros formados por ocho puentes de hidrógeno presentan en el mejor de los casos una constante de asociación de 2500 M-1. Esto implica que la preorganización de los ciclopéptidos, para dar lugar a los dímeros, tiene un elevado coste entrópico que no poseen otros sistemas más rígidos. Además, ni la orientación de los puentes de hidrógeno es la más idónea ni la distancia intermolecular entre los dos péptidos que forman el dímero es la más adecuada para formar un puente de hidrógeno. Por todo ello la contribución de cada puente de hidrógeno es únicamente de 2,0 KJ/mol (0,5 Kcal/mol), un valor demasiado pequeño para este tipo de interacciones.76 HN HN NH H N N H NH O O O O O OR 1 R 1 R 1 Ciclo[(D-Aa-L-γ-Ach) 3 -] interacción γ interacción α O HOH N H N N H O N O N HO N H O cara γ cara α O HOH N H N N H O N O N HO N H O H HO O N N N HO N O H O N H N O H O HOH N H N N H O N O N HO N H O H HO O N N N HO N O H O N H N O H Figura 69: Superior derecha: Esquema que muestra la orientación de los grupos dadores y aceptores de los α y γ-aminoácidos hacia caras diferentes del ciclopéptido, cuando la secuencia entre α y γ-Aa es alternada. Izquierda: Nanotubo al que daría lugar el ciclohexapéptido de la derecha. Para mayor claridad, las cadenas laterales han sido suprimidas. En el diseño de estos ciclopéptidos es importante tener en cuenta las novedosas características de estos nanotubos, en los que existen dos tipos de interacciones debido a 75) a) Sartorius, J.; Schneider, H.-J; “A general scheme based on empirical increments for the prediction of hydrogen-bond associations of nucleobases and of synthetic host-guest complexes” Chem. Eur. J. 1996, 2, 1446-1452. b) Prins, L. J.; Reinhoudt, D. N.; Timmerman, P. “Noncovalent synthesis using hydrogen bonding” Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2328-2426. 76) Kobayashi, K.; Granja, J. R.; Ghadiri, M. R. “β-Sheet Peptide Architecture: Measuring the Relative Stability of Parallel vs. Antiparallel β-Sheets” Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 95-98. Capítulo 6 80 que los ciclopéptidos están formados por α y γ-aminoácidos. Tanto los α como los γ-aminoácidos están compuestos por un número impar de átomos, lo que implica que cuando el péptido adopta la conformación plana necesaria para el autoensamblaje, los aminoácidos disponen sus grupos C=O y NH orientados hacia el mismo lado del plano. La disposición alternada de α y γ-Aa provoca que todos los grupos C=O y NH de los γ-aminoácidos queden orientados hacia una cara del ciclopéptido, mientras que hacia la otra cara se situarían los grupos correspondientes a los α-aminoácidos (figura 69). Así, a la hora de interaccionar estos ciclopéptidos mediante una hoja β plegada antiparalela, los grupos C=O y NH de la cara α lo harían con los α-Aa de la siguiente subunidad y de la misma forma la cara γ interaccionaría con la cara γ de la otra subunidad (figura 70). Por lo tanto, el nanotubo se basaría en la alternancia de interacciones de las caras α con las interacciones de las caras γ a lo largo del mismo. Otra visión de los nanotubos muestra que están formados por unidades diméricas unidas entre sí mediante hojas plegadas β antiparalelas. Así, por ejemplo, entre las caras γ de los ciclopéptidos se forman dímeros y estas unidades diméricas se unen entre sí mediante hojas plegadas β antiparalelas a través de sus caras α o viceversa. α,γ-Ciclohexapéptidos N-metilados 81 6.1. α,γ-CICLOHEXAPÉPTIDOS N-METILADOS118 Decidimos comenzar el estudio de este nuevo diseño de nanotubos peptídicos analizando los hexámeros formados por tres aminoácidos α y tres γ alternados. Para establecer las bases estructurales de estos nanotubos era necesario diseñar dos ciclopéptidos diferentes que permitiesen analizar ambos tipos de interacciones. Las interacciones γ-γ se podían estudiar con ciclopéptidos en los que el protón amida de los α-aminoácidos se sustituye por grupos metilo. De la misma forma, las interacciones α-α podían ser estudiadas mediante ciclopéptidos con γ-aminoácidos N-metilados (figura 70). N N O HO HO O N N Me N N Me OMe N O H N O O H H N ON Me O N H N Me O Me O Ciclo[(L-γ-Ach-D- Me N-Ala) 3 -] (HC-1) HN N NH N N H N O O O O O O Me Me Me Me Me N H NN O N O N H O N O Me Me OO NNN H O N H O NN O Me Me O O H Ciclo[(L- Me N-γ-Ach-D-Phe) 3 -] (HC-2) N HN N H N NNH O O O O O O Me Me Me H O a b Figura 70: Superior: Ciclohexapéptido con los α-Aa (Ala) N-metilados, que daría lugar a dímeros que permitirían estudiar el puente de hidrógeno dado por los γ-Ach. Inferior: Ciclohexapéptido con los γ-Ach N-metilados, que daría lugar a dímeros que permitirían estudiar el puente de hidrógeno dado por los α-Aa. Nuestro primer objetivo fue el hexapéptido ciclo[(L-γ-Ach-D-MeN-Ala)3-] (HC-1) (figura 70 a), que se preparó siguiendo el esquema sintético comentado 118) a) Amorín, M.; Castedo, L. Granja, J. R. “New Cyclic peptide Assemblies with Hydrophobic Cavities: The Structural and Thermodynamic Basic of a New Class of Peptide Nanotubes” J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2844-2845. b) Amorín, M.; Villaverde, V.; Castedo, L. Granja, J. R. “New α,γ-peptide tubulets” Drug Del. Sci. Tech. 2005, 15, 87-92. c) Brea, R. J.; Amorín M.; Castedo, L.; Granja, J. R. “Methyl-Blocked Dimeric α,γ-Peptide Nanotube Segments: Formation of a Peptide Heterodimer through Backbone–Backbone Interactions” Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 5710-5713. Capítulo 6 82 anteriormente (capítulo 5, página 76). Como sustancia de partida empleamos el Boc-MeN-Ala-OFm. Hay que subrayar también los buenos rendimientos (69%) observados en la etapa de ciclación, llevada a cabo a una concentración de 6 mM. Además, está ciclación resultó ser sorprendentemente rápida, a pesar de que estábamos formando un macrociclo de 24 eslabones.119 La elección de la MeN-Ala se debió a los precedentes anteriores,76,78 en los que la desfavorable interacción entre el grupo N-metilo y los sustituyentes del carbono β de las cadenas laterales de los aminoácidos dificultaba la formación de dímeros. Figura 71: La proporción de monómero-dímero varía con la concentración de HC-1 (25 ºC). Los primeros análisis de 1H RMN, tanto en disolventes apolares como polares, muestran que el ciclopéptido adopta una conformación plana altamente simétrica, dada la simplicidad de su RMN, ya que sólo se pueden observar las señales correspondientes a una MeN-Ala y a un γ-Ach, es decir, los tres MeN-Ala y los tres γ-Ach son equivalentes. La constante de acoplamiento (J) posee un valor entre 7,5 y 8,2 Hz que se ajusta a la orientación trans (entre los protones Hγ y NH) tanto en disolventes polares como apolares (CCl4, CDCl3, MeOH y DMSO).120 En disolventes apolares se observa que el desplazamiento químico de algunas señales (especialmente los protones de las amidas) depende de la concentración (figura 71), desapantallándose cuando aumenta la concentración; así por ejemplo, la señal de amida se desplaza de 7,05 ppm (2,43 mM) a 119) La reacción de ciclación se siguió mediante HPLC analítico, observándose que una vez añadido el agente de acoplamiento ya no se detectaba la sustancia de partida en el cromatograma. 76) Kobayashi, K.; Granja, J. R.; Ghadiri, M. R. “β-Sheet Peptide Architecture: Measuring the Relative Stability of Parallel vs. Antiparallel β-Sheets” Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 95-98. 78) Clark, T. D.; Buriak, J. M.; Kobayashi, K.; Isler, M. P.; McRee, D. E.; Ghadiri M. R. “Cylindrical β-Sheet Peptide Assemblies” J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8949-8960. 120) Smith, L. J.; Bolin, K. A.; Schawalb, E. H.; MacArthur, M. W.; Thornton, J. M.; Dobson, C. M. “Analysis of main chain torsion angles in proteins: prediction of NMR coupling constants for native and random coil conformations” J. Mol. Biol. 1996, 255, 494-506. 8.0 6.0 C = 0,97 mM C = 4,8 mM C = 9,7 mM C = 27,8 mM NH H α (Ala) α,γ-Ciclohexapéptidos N-metilados 83 7,47 ppm (27,78 mM). Se puede entender que este desplazamiento químico es debido a un equilibrio rápido entre monómero y dímero, dando una señal promedio según la contribución de cada especie. Las señales del protón de la amida se desplazan más de 1 ppm entre la más diluida (2,43 mM) y la más concentrada. La formación de dímeros implica la formación de puentes de hidrógeno y por tanto los protones de la amida se desapantallan. También se observa que el Hα de la Ala y el Hγ del γ-Ach, al quedar situados próximos al grupo carbonilo, se desplazan ligeramente a campo más bajo al aumentar la concentración, aunque en este caso el desplazamiento es únicamente de 0,15 ppm.121 H H N N Me O O O N N O H H H H H H Me Figura 72: Disposición de los puentes de hidrógeno que se forman entre los γ-aminoácidos del ciclopéptido ciclo[(L-γ-Ach-D-MeN-Ala)3-] (HC-1). Otra evidencia de la existencia de un proceso de equilibrio entre monómero y dímero se obtuvo al realizar un RMN a baja temperatura (189 K) y baja concentración (0,5 mM) en CH2Cl2 (figura 73). A esta temperatura el equilibrio es más lento que la escala de tiempo del RMN, por lo que se puede observar ambas especies, monómero y dímero, en equilibrio. Así por ejemplo, la señal del NH del dímero aparece a un campo de 7,79 ppm, mientras que la señal del monómero resuena a 6,49 ppm. La señal del Hα de la Ala de la especie dimérica aparecen a 5,31 ppm, solapada por el disolvente, mientras que a 4,80 ppm se observa la señal correspondiente a la especie monomérica. 121) La variación del campo de los CαH es característica de láminas β. a) Maynard, A. J.; Sharman, G. J. Searle, M. S. “Origin of β-Hairpin Stability in Solution: Structural and Thermodynamic Analysis of the Folding of a Model Peptide Supports Hydrophobic Stabilization in Water” J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1996-2007. b) Haque, T. S.; Gellman, S. H. “Insights on β-Hairpin Stability in Aqueous Solution from Peptides with Enforced Type I´ and Type II´ β-Turns” J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 2303-2304. Capítulo 6 84 Figura 73: 1H RMN del ciclo[(L-γ-Ach-D-MeN-Ala)3-] (HC-1) (0,5 mM) en CH2Cl2 y a 198 K. En estas condiciones se pueden apreciar las señales de monómero y de dímero, tal como aparecen marcados en el espectro. Para el cálculo de las variables termodinámicas se midieron los desplazamientos de los NH a diferentes temperaturas (a intervalos de 10 K en un rango de temperaturas comprendido entre 243-313 K) y a diferentes concentraciones (3 × 10-2 - 5 × 10-4 M) usando la ecuación de regresión no lineal, que correlaciona los desplazamientos de los NH con la constante de asociación para un proceso en equilibrio entre monómero y dímero (modelo de LaPlanche)122: δobs = δdim + (δmon-δdim)[-1 + (1 + 8KaC)½]/(4KaC) [donde C corresponde a la concentración del experimento, mientras que Ka, δmon y δdim son valores calculados a partir de los datos observados (δobs)]. Para las condiciones estudiadas se calcularon los valores de las Ka a diferentes temperaturas. La correlación entre el log Ka con el inverso de la T (conocido como representaciones de Van´t Hoff) nos permite obtener una recta a partir de la cual se relaciona la ∆ H con la pendiente y la ∆ S con la coordenada en el origen. Los valores termodinámicos de este proceso son: ∆ Hº298 = -34,1 KJ mol-1 y ∆ Sº298 = -69,8 J K-1 mol-1. Es por tanto un proceso dirigido entálpicamente, aunque entrópicamente desfavorable, ya que el paso de monómero a dímero implica un aumento del orden.123,124 122) LaPlanche, L. A.; Thompson, H. B.; Rogers, M. T.; “Chain Association Equilibria. A Nuclear Magnetic Resonance Study of the Hydrogen Bonding of N-Monosubstituted Amides” J. Phys. Chem. 1965, 69, 1482-1488. 123) Searle, M. S.; Westwell, M. S.; Williams, D. H. “Application of a generalized enthalpy-entropy relationship to binding co-operativity and weak associations in solution” J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1995, 2, 141-151. 124) Dunitz; J. D. “Win some, lose some: enthalpy-entropy compensation in weak intermolecular interactions” Chem. Biol. 1995, 2, 709-712. pp m ( f1 ) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 NH dímero NH monómero H α Ala monómero Hα Ala dímero y CH2Cl2 α,γ-Ciclohexapéptidos N-metilados 85 La Ka 298 = 230 M-1 es ligeramente superior a las encontradas por Lorenzi en sus hexámeros (en los que también se formaban 6 puentes de hidrógeno),79 pero ligeramente inferiores a los mejores datos obtenidos para los α-ciclooctámeros. La contribución por puente de hidrógeno es similar a las reportadas por Ghadiri,74,78 estimadas en torno a 2,0-3,0 KJ/mol (0,5-0,7 Kcal/mol) por puente de hidrógeno, ya que se estima una contribución de 2,20 KJ mol-1 (0,53 Kcal mol-1) por puente de hidrógeno en la formación de estos dímeros, valor similar a los obtenidos para los D,L-ciclooctámeros. Como cabría esperar para este tipo de procesos, una disminución de la constante dieléctrica del medio conduce a mayores Ka, tal como se observa en el estudio realizado con la mezcla de CDCl3/CCl4 2:3 en el que la constante de asociación es aproximadamente de 2,5 x 104 M-1. Figura 74: Izquierda: Gráfica en la que se han representado los desplazamientos químicos observados en el RMN frente a la concentración, las líneas representadas corresponden al ajuste según la ecuación (1). Derecha: Representación de Van´t Hoff de las Ka observadas frente al inverso de la temperatura. La técnica de IR permite caracterizar de forma bastante precisa el tipo de estructura secundaria que adoptan los péptidos. Los trabajos de Krimm125 y otros posteriores han demostrado que las señales de vibración de los grupos C=O y los N-H pueden describir el tipo de motivo estructural del que forman parte, ya que las bandas IR de α-hélice (n+4), 310 α-hélice (n+3), β-lámina (n+2) o giro (n+1) son características 79) a) Saviano, M.; Lombardi, A.; Pedone, C.; Di Blasco, B.; Sun, X. C.; Lorenzi, G. P. “A structural two-ring version of a tubular stack of β-ring in crystals of a cyclic D,L-hexapeptide” Incl. Phenom. 1994, 18, 27-36. b) Sun, X. C.; Lorenzi, G. P. “On the Stacking of β-Ring: The Solution Selfassociation Behavior of Two Partially N-Methylated Cyclo(hexaleucines)” Helv. Chim. Acta 1994, 77, 1520-1526. 74) Ghadiri, M. R.; Kobayashi, K.; Granja, J. R.; Chadha, R. K.; McRee, D. E. “The Structural and Thermodinamic Basis for the Formation of Self-Assembled Peptide Nanotubes” Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 93-95. 78) Clark, T. D.; Buriak, J. M.; Kobayashi, K.; Isler, M. P.; McRee, D. E.; Ghadiri, M. R. “Cylindrical β-Sheet Peptide Assemblies” J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8949-8962. 125) a) Krimm, S.; Bandekar, J. “Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides and proteins” In Advances in protein Chemistry; Anfinsen, C. B.; Edsall, J. T., Richards, F.M., Eds.; Academic Press: Orlando, FL, 1986; pp 181-364. b) Demirdöven, N.; Cheatum, C. M.; Chung, H. S.; Khalil, M.; Knoester, J.; Tokmakoff, A. “Two-Dimensional Infrared Spectroscopy of Antiparallel β-Sheet Secondary Structure” J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 7981-7990. δobs = δdim + (δmonδ dim)[-1 + (1 + 8KaC)½]/(4KaC) (1) Capítulo 6 86 de cada estructura. Las bandas más importantes corresponden a: el modo de vibración llamado amida Ia (vibración del C=O en la componente perpendicular al plano de la amida), la vibración amida Ib (que corresponde al C=O en su componente paralela), que suele ser más débil y también está relacionada con la vibración del carbonilo libre, mientras que la llamada amida IIII es la vibración en el plano del N-H y es la vibración del C-N. Finalmente la vibración amida A es el stretching del grupo amida. A modo de ejemplo, en la tabla 3, se muestran los resultados de varios estudios hechos con diferentes motivos estructurales. Motivo estructural Modo de vibración: Amida Ia (perpendicular) Modo de vibración: Amida Ib (paralela) Modo de vibración: Amida II (paralela) Lámina β antiparalela, para β -Poli(L-alanina) 1632 (S) 1694 (W) 1524 (S) (paralela) 1545 (W) (perpendicular) Lámina β , antiparalela para GlynI 1636 (S) 1685 (W) 1517 (W) (paralela) Lámina β , Antiparalela para β -(GluCa)n 1624 (S) 1693 (W) 1560 (S) (perpendicular) Hélice α, para Poli(L-alanina) 1658 (S) 1516 (W) (paralela) 1545 (S) (perpendicular) Hélice α, para Poli(L- glutámico) 1653 (S) 1510 (W) (paralela) 1550 (S) (perpendicular) Hélice 310, para α-Poli(L- aminoisobutírico) 1656 (S) 1545 (S) (perpendicular) Tabla 3: Ejemplos de diferentes estructuras secundarias de péptidos y sus respectivas bandas de IR, que reflejan el motivo estructural que forman. S (fuerte), M (media) y W (débil).125 El péptido HC-1 muestra en su IR (293 K, CHCl3, ver anexo 1) las bandas típicas de una hoja plegada β antiparalela: amida Ib 1669 cm-1,126 amida Ia a 1626 cm-1 y la banda de la amida IIII a 1542 cm-1 confirman la estructura propuesta de lámina β antiparalela. Otra información importante que nos aporta el IR es la banda del N-H (amida A), que se puede correlacionar con la distancia N…O (de un puente de hidrógeno) a través de la frecuencia de la amida A, de tal forma que la frecuencia aumenta a medida 125) a) Krimm, S.; Bandekar, J. “Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides and proteins” In Advances in protein Chemistry; Anfinsen, C. B.; Edsall, J. T., Richards, F.M., Eds.; Academic Press: Orlando, FL, 1986; pp 181-364. b) Demirdöven, N.; Cheatum, C. M.; Chung, H. S.; Khalil, M.; Knoester, J.; Tokmakoff, A. “Two-Dimensional Infrared Spectroscopy of Antiparallel β-Sheet Secondary Structure” J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 7981-7990. 126) Relacionado con la vibración del carbonilo no implicado en la formación de puentes de hidrógeno. α,γ-Ciclohexapéptidos N-metilados 87 que lo hace la fuerza del puente de hidrógeno (por tanto menor longitud de onda (λ)). El valor de esta banda, cuando está implicado un enlace puente de hidrógeno, aparece en torno a 3300 cm-1, mientras que cuando éste no está implicado el valor de la banda es de unos 3400 cm-1. El HC-1 muestra una banda propia de vibración a 3318 cm-1 del N-H, característica de una asociación puente de hidrógeno N-H … O=C. Sin embargo, esta banda que se observa experimentalmente no nos permite medir la distancia directamente, ya que dicha banda está desdoblada, por el efecto conocido como resonancia de Fermi, con la amida II, apareciendo una banda amida B de pequeña intensidad entre 3100-3000 cm-1. A partir de la intensidad de estas señales y de la diferencia de longitud de onda se pueden calcular los valores fundamentales de νAº, que es lo que permite determinar distancias d-(N…O) según Krimm. Por ejemplo, la α-Ply(L-alanina) presenta las bandas νA 3307 cm-1 y νB 3058 cm-1; esto da νAº no perturbada de 3279 cm-1 y por lo tanto la distancia es de 2,84 Å. En nuestro caso, no hemos podido hacer esta discriminación entre las dos bandas, sin embargo este valor es bastante similar al real, por lo que estimamos que una banda de 3318 cm-1 correspondería a una distancia entre 2,85-2,95 Å. Finalmente se trató de obtener otra prueba de la existencia de dímeros. Para ello se consiguió cristalizar el ciclopéptido HC-1 en CHCl3 equilibrado en una atmósfera de hexano después de 2-4 días. Los cristales incoloros resultantes difractaron con una buena calidad, sin embargo resultó que dichos cristales obtenidos bajo estas condiciones están maclados en una proporción próxima al 50%, no siendo posible su resolución. Otros intentos de cristalización en distintas condiciones y disolventes resultaron infructuosos. Para el estudio de las interacciones entre los α-Aa, es decir, de las caras α, decidimos sintetizar el ciclo[(D-Phe-L-MeN-γ-Ach)3-] (HC-2), para lo cual utilizamos la misma estrategia indicada en el capítulo 5 (página 76), partiendo en este caso del Boc-γ-MeN-Ach-OH. Este péptido también adopta una conformación plana y altamente simétrica (C3), tanto en disolventes polares como apolares, con una constante de acoplamiento (JNH,Hα = 9,0-9,5 Hz) que es característica de una disposición trans del enlace amida.120 En CDCl3, la señal correspondiente a los NH de la Phe es constante a 8,7 ppm, incluso a concentraciones tan diluidas como 2 x 10-4 M (0,2 mM), o calentando a 60 ºC. En los RMN realizados en proporciones de metanol próximas al 90%, condiciones en las que el péptido precipita, la señal de la amida también se observa a similar desplazamiento químico. Todo esto implica la existencia de un dímero con una altísima constante de asociación, que estimamos superior a 106 M-1 en CDCl3, que es la mayor Ka encontrada hasta el momento para este tipo de estructuras supramoleculares. El IR (293 K, CHCl3, ver anexo 1) del HC-2 muestra la banda de la amida A (correspondiente a una interacción de los NH con los carbonilos) a 3303 cm-1, característica de un enlace puente de hidrógeno que sugiere una menor distancia entre las dos subunidades peptídicas que la existente entre las del dímero del HC-1. El péptido también muestra las bandas típicas de una hoja plegada β a 1665 cm-1 y 1625 cm-1 de la amida I y a 1527 cm-1 de la amida IIII. La fuerza de esta interacción también fue confirmada por la espectrometría de masas (EM-FAB) en la que se observan las señales correspondientes al dímero a [2MH]+ 1718,3 umas y al monómero a [MH]+ 859,3 umas. 120) Smith, L. J.; Bolin, K. A.; Schawalb, E. H.; MacArthur, M. W.; Thornton, J. M.; Dobson, C. M. “Analysis of main chain torsion angles in proteins: prediction of NMR coupling constants for native and random coil conformations” J. Mol. Biol. 1996, 255, 494-506. Capítulo 6 94 El segundo péptido sintetizado ciclo[(D-Phe-L-MeN-γ-Ach)2-] TC-2 muestra en su espectro de protón una conformación plana con simetría C2 característica del ciclopéptido. Esta conformación plana se aprecia tanto en disolventes polares como apolares, mostrando una JNH,Hα = 10,0 Hz. En cloroformo, el espectro muestra que los NH de la Phe se desplazan a campo bajo al incrementarse la concentración del péptido y al bajar la temperatura (figura 81). Esto es característico, al igual que ocurría con el hexámero HC-1, de un proceso de asociación entre monómero y dímero más rápido que la escala de tiempos de RMN; y por tanto lo que observamos es una señal promedio de los NH entre el monómero y el dímero. Dicha señal aparece entre δ 6,0-7,8 ppm según la concentración y temperatura. Figura 81: Ampliación (8,5-4,0 ppm) del espectro 1H RMN en CDCl3 a 25 ºC del péptido TC-2 a cuatro concentraciones diferentes. A partir de los desplazamientos de los NH de las Phe a diferentes concentraciones (50-2 mM) y temperaturas (233-313) y usando la ecuación mediante regresión no lineal anteriormente utilizada,130 se pudo obtener la constante de asociación, encontrando que a 298 K, en CDCl3, la Ka es de 15,0 M-1. Además mediante representaciones de Van´t Hoff (log Ka frente a 1/T) se obtuvieron las variables termodinámicas del proceso de dimerización para TC-2: ∆H° 298 = - 30,8 KJ mol-1 y ∆ S ° 298 = - 82,0 J K-1 mol-1.131 El IR (CHCl3 a 293 K)125 de este péptido muestra dos bandas características de una vibración amida A de los N-H. Una de ellas, a 3411 cm-1, es característica de un 130) {δobs = δdim+ (δmon - δdim)[-1 + (1+8KaC)½] /(4KaC); δ(NH) son los desplazamientos de los 1H NMR y C la concentración total de péptido. 131) Valor que corresponde a una contribución de 0,5 Kcal mol-1 por enlace puente de hidrógeno, un valor similar al obtenido para los D,L-ciclooctapéptidos. 125) a) Krimm, S.; Bandekar, J. “Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides and proteins” In Advances in protein Chemistry; Anfinsen, C. B.; Edsall, J.T., Richards, F.M., Eds.; Academic Press: Orlando, FL, 1986; pp 181-364. b) Demirdöven, N.; Cheatum, C. M.; Chung, H. S.; C = 200 mM C = 80,4 mM C = 20,1 mM C = 5,0 mM α,γ-Ciclotetrapéptidos N-metilados 95 N-H libre (especie monomérica), mientras que la otra a 3300 cm-1, es propia de un N-H que forma puentes de hidrógeno (dímero). También se observaron las bandas a 1673 cm-1 (amida Ib), 1627 cm-1 (amida Ia) y 1522 cm-1 (amida IIII), que son típicas de una estructura de lámina β. Una prueba concluyente de que el ciclopéptido TC-2 da lugar a dímeros, la proporcionó la resolución por difracción de rayos X de un cristal del péptido que cristaliza formando dímeros. El cristal se obtuvo por cristalización en tetracloroetano, equilibrado mediante difusión con una atmósfera de hexano. Los cristales incoloros muestran la existencia de ciclotetrapéptidos con una conformación plana y formando dímeros unidos por cuatro puentes de hidrógenos, con una distancia N…O comprendida entre 2,91-3,08 Å (figura 82). El volumen de van der Waals dentro del ciclopéptido es de sólo 10 Å3, no dejando espacio en su interior para la encapsulación de alguna molécula. Como se puede observar, los grupos amida se orientan ligeramente hacia el interior de la cavidad, no siendo lineales los puentes de hidrógeno, lo que podría explicar la pequeña constante de asociación observada. Figura 82: Izquierda: Visión superior del dímero del TC-2. Derecha: Visión lateral del dímero, donde se aprecia la existencia de cuatro puentes de hidrógeno entre ambos ciclopéptidos. Un segundo tipo de cristal se obtuvo por cristalización del péptido de una disolución de MeOH, equilibrada en atmósfera de hexano. En este caso, probablemente debido a que el disolvente compite por los puentes de hidrógeno, no se observa la formación del dímero (figura 83). La estructura cristalina está formada por el ciclopéptido en una conformación plana similar a la mostrada en el dímero cristalizado en cloroformo. No obstante los C=O y NH del esqueleto peptídico crean puentes de hidrógeno con seis moléculas de H2O y una de metanol por ciclopéptido; tres de estas moléculas de H2O están desordenadas en la estructura cristalina entre seis posiciones diferentes, mientras que la molécula de metanol existe en dos posiciones diferentes. Khalil, M.; Knoester, J.; Tokmakoff, A. “Two-Dimensional Infrared Spectroscopy of Antiparallel β-Sheet Secondary Structure” J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 7981-7990. Capítulo 6 96 Figura 83: Visión de la estructura cristalina obtenida por difracción de rayos X del cristal del TC-2 en MeOH. Los puntos rojos corresponden a los oxígenos del H2O. En resumen, hemos demostrado que ciclopéptidos formados por dos α-Aa y dos γ-Ach alternados pueden dar lugar a puentes de hidrógeno a través de las interacciones α-α. La formación de nanotubos no parece factible debido a la imposibilidad de formar interacciones estables a través de las caras γ. Sin embargo, este hecho podría deberse a la distorsión generada por los grupos metilo que bloquean la cara α, fenómeno ya observado en el hexapéptido, y que puede estar amplificado por la tensión anular del ciclopéptido, pues se trata de un macrociclo de 16 eslabones con fuertes restricciones geométricas. α,γ-Ciclooctapéptidos N-metilados 97 6.3. α,γ-CICLOOCTAPÉPTIDOS N-METILADOS132 A continuación abordamos el estudio de los octámeros cíclicos, con la esperanza de que el aumento del tamaño del anillo a 32 eslabones y la mayor libertad conformacional, no dificulten la disposición del péptido a adoptar la conformación plana requerida para el autoensamblaje. Por otro lado, la formación de los ocho puentes de hidrógeno debería favorecer su asociación (figura 84). Los principios de formación de estos nanotubos son idénticos a los ya descritos anteriormente, existiendo dos tipos de interacciones alternadas a lo largo del nanotubo, las α-α y las γ-γ. Por tanto, sintetizamos los modelos peptídicos sencillos para estudiar por separado dichas interacciones. Siguiendo la estrategia sintética anteriormente mencionada (capítulo 5, página 76) se prepararon los ciclopéptidos ciclo[(L-γ-Ach-D-MeN-Ala)4-] (OC-1) como modelo de la interacción γ-γ y el ciclo[(D-Phe-L-MeN-γ-Ach)4-] (OC-2) como modelo de la interacción α-α (figura 85). Ciclo[(D-γ-Ach-L-Aa) 4 -] N H NH NH O OR HN O OR H N HN HN O O RNH O O R N H N H N OO O N H NN HO N O HO N N NN H OH H O H H H N H N HO N H O N O O O O N O O H H N H N H N OO O N H NN HO N O HO N N NN H OH H O H H H N H N HO N H O N O O O O N O O H H Figura 84: Nanotubo al que darían lugar los ciclooctapéptidos. Para mayor claridad, las cadenas laterales han sido suprimidas. 132) Amorín, M.; Castedo, L.; Granja, J. R. “Self-Assembled Peptide Tubelets with 7 Å Pores” Chem. Eur. J. 2005, 11, 6539-6547. Capítulo 6 98 N O Ciclo[(L-γ-Ach-D- Me N-Ala) 4 -] (OC-1) N H N NH O OMeMe N O O MeMe H N N HN O O Me Me N O O Me Me Ciclo[(L- Me N-γ-Ach-D-Phe) 4 -] (OC-2) N NH N O O HN O O N HN N O ONH O O O O H N H N HO NN OH N Me OMe N O N Me O O Me O O N OO ON H N Me N N NN H Me H Me NN H Me O O O O OO ON Me NO H N N N Me H Me H NN H O O Me N Me N MeO NN OMe N H OH N O N H O O H O N Me Me Me Me Me Figura 85: Superior: Ciclooctapéptido OC-1 compuesto por 4 N-Metil Ala, que daría lugar a dímeros que permitirían estudiar la hoja plegada β antiparalela en la que participan los grupos amida de los γ-Ach (cara γ-γ). Inferior: Ciclooctapéptido OC-2 formado por 4 γ-Ach N-Metilados, que daría lugar a dímeros que permitirían estudiar los puentes de hidrógeno dados por los grupos amida de las Ala (cara α-α). Una vez preparado el péptido ciclo[(L-γ-Ach-D-MeN-Ala)4-] (OC-1) se purificó por HPLC usando fase normal y un gradiente de (MeOH/CH2Cl2) y se caracterizó mediante MS, FTIR, RMN y rayos X. Este péptido muestra en disolución, independientemente de su polaridad, una conformación mayoritariamente plana, siendo la constante de acoplamiento JNH,Hγ = 7,4-8,2 Hz. En disolventes como el cloroformo, el espectro se complica por el desdoblamiento de muchas de las señales características del mismo. La intensidad de estas señales depende de la concentración y de la temperatura. Se observa que las señales más desapantalladas (figura 86) aumentan al incrementarse la concentración o al disminuir la temperatura. Siendo este comportamiento característico de un equilibrio lento en la escala de tiempos del RMN entre el monómero -en el que las señales están más apantalladas, y que es la especie mayoritaria a bajas concentraciones- y su dímero -en el que la proximidad de los dos ciclopéptidos y la formación de los puentes de hidrógeno desapantalla las señales más características, siendo ésta la especie mayoritaria a elevadas concentraciones o bajas temperaturas-. A temperatura ambiente las señales son más anchas, probablemente debido a que a estas temperaturas estamos próximos a la coalescencia; sin embargo, a 283 K las señales resultan bastante afiladas y bien resueltas (figura 86). α,γ-Ciclooctapéptidos N-metilados 99 Figura 86: 1H RMN a diferentes temperaturas del OC-1 en CDCl3, donde se aprecia el equilibrio entre la especie monomérica y su dímero. Protón Dímero (ppm) Monómero (ppm) NH 8,12 6,76 Hα Ala 5,59 5,31 Hγ γ-Ach 3,82 3,59 Tabla 4: Desplazamientos de los diversos protones del ciclopéptido OC-1 para el monómero y el dímero. En base a los experimentos de RMN calculamos la relación entre dímero y monómero a diferentes concentraciones (30-2 mM) y temperaturas (243-283 K), lo cual nos permitió estimar las Ka a diferentes temperaturas mediante ajuste no lineal usando la ecuación [P]t = {∆Iobs/Ka}·{2∆Isat(1-(∆Iobs/∆Isat))2}, donde P corresponde a la concentración total de péptido de cada experimento, Ka es la constante de asociación calculada, ∆Iobs es la relación de péptido que está como dímero y ∆Isat es todo el péptido está en forma de dímero, siendo la Ka 298 = 60 M-1 (Ka 273 = 340 M-1). A partir de las Ka a diferentes temperaturas y realizando representaciones de log Ka frente a 1/T (K) (análisis de Van´t Hoff), calculamos los parámetros termodinámicos para el proceso de dimerización de OC-1: ∆H°298 = -38,2 KJ mol-1 y ∆S°298 = -94,2 J K-1 mol-1. La energía libre por cada puente de hidrógeno es 1,27 KJ mol-1 (0,3 Kcal mol-1), lo que implica que el enlace es más débil que el del hexámero HC-1 [2,20 KJ mol-1 (0,5 Kcal mol-1)]. Esto puede ser debido a la contribución entrópica, causada por la gran flexibilidad del anillo. El estudio de IR (CHCl3 a 293 K)125 muestra una banda a 3315 cm-1 característica de una vibración asociada al N-H que corresponde a la formación de un puente de hidrógeno, lo que nos hacía suponer la existencia de dímeros. El IR también muestra las bandas típicas de una hoja plegada β a 1672 y 1627 cm-1 (amida I) y 1540 cm-1 (amida IIII). 125) Krimm, S.; Bandekar, J. “Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides and proteins” In Advances in protein Chemistry; Anfinsen, C. B.; Edsall, J.T., Richards, F.M., Eds.; Academic Press: Orlando, FL, 1986; pp 181-364. 8.0 7.0 4.0 6.0 5.0 263 K 4 mM 243 K 283 K NHdímero NHmonómero Η αdímero Η αmonómero Ηγ dímero Ηγmonómero Capítulo 6 100 En un intento por confirmar la estructura dimérica mediante difracción de rayos X, se sometió el ciclopéptido OC-1 a las condiciones de cristalización anteriormente descritas (cloroformo/atmósfera de hexano), obteniéndose unos cristales de tamaño y consistencia adecuada para su resolución. Para gran sorpresa nuestra, el péptido no cristalizó formando estructuras diméricas sino que se plegó, en una conformación tipo “silla de montar”, con los cuatro ciclohexanos situados en los cuatro vértices de dicha estructura (figura 87). Las distintas subunidades empaquetan sus caras convexas: dejando una subunidad entre las caras convexas de otras dos subunidades (vista desde los ejes c y a; figura 87 y 88) sin que entre ellas se establezca ningún puente de hidrógeno, sino que la estructura presenta moléculas de H2O que forman puente de hidrógeno con los ciclopéptidos. Esta especial disposición del ciclopéptido y su empaquetamiento con las otras subunidades da lugar a canales continuos a lo largo de los tres ejes, generando una estructura poroso tipo zeolita orgánica.133 Los canales que dan lugar a esta estructura están ocupados por H2O (a pesar de no usarse como disolvente). El agua se encuentra ordenada formando clusters, en los que las moléculas crean una red tridimensional de puentes de hidrógeno entre ellas y los C=O y los NH de los ciclopéptidos. Figura 87: Representación mediante modelo de varillas de tres OC-1, obtenidos al cristalizar en CHCl3. A pesar de que el agua ha recibido más atención científica, tanto experimental como teórica y tecnológica, que cualquier otra sustancia, no se entienden completamente las interacciones de una molécula de H2O con sus vecinas.134 Por ello, se requiere una información detallada de pequeños clusters de H2O que permita 133) Batten, S. R.; Robson, R. “Interpenetrating Nets: Ordered, Periodic Entanglement” Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 1460-1494. 134) Ludwig, R. “Water: From Clusters to the Bulk” Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 1808-1827. α,γ-Ciclooctapéptidos N-metilados 101 entender el comportamiento macroscópico del agua. Gracias al trabajo realizado en estos últimos años se ha conseguido caracterizar agrupaciones de 6,135 8,136 10,137 etc.138 moléculas de agua, confinadas en el interior de diversos sustratos, encontrándose configuraciones muy diferentes como pequeños agregados de agua/hielo o polímeros que se encuentran en el paso intermedio entre los clusters y el agua macroscópica. Sin embargo, el crecimiento de grandes clusters de agua y cómo se unen para formar las redes tridimensionales es todavía un gran reto. La estructura del agua aquí presente puede aportar un mayor entendimiento de la estructura del agua y del crecimiento de los clusters. Por cada dos moléculas de ciclopéptido existen 33,5 moléculas de agua en 34 posiciones. Estas moléculas forman redes tridimensionales en las que se ha podido determinar la posición de la mayor parte de los oxígenos. Las moléculas de agua crean puentes de hidrógeno entre ellas, y otras los generan también con los ciclopéptidos; además, una de las moléculas actúa de unión entre los canales de agua.139 135) Moorthy, J. N.; Natarajan, R.; Venugopalan, P. “Characterization of a Planar Cyclic Form of Water Hexamer in an Organic Supramolecular Complex: An Unusual Self-Assembly of Bimesityl-3,3´- Dicarboxylic Acid” Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 3417-3420. 136) a) Atwood, J. L.; Barbour, L. J.; Ness, T. J.; Raston, C. L.; Raston, P. L. “A well-Resolved Ice-like (H2O)8 Cluster in an Organic Supramolecular Complex” J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 7192-7193. b) Blanton, W. B.; Gordon-Wylie, S. W.; Clark, G. R.; Jordan, K. D.; Wood, J. T.; Geiser, U.; Collins, T. J.“Synthesis and Crystallographic Characterization of an Octameric Water Complex, (H2O)8” J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 3551-3552. 137) Haug, G. H.; Tiedemann, R. “An intermolecular (H2O)10 cluster in a solid-state supramolecular complex” Nature 1998, 393, 671-673. 138) Para un amplio estudio sobre clusters de agua: a) Infantes, L.; Motherwell, S. “Water clusters in organic molecular crystals” Cryst Eng Comm, 2002, 4, 454-461. b) Infantes, L.; Chisholm, J.; Motherwell, S. “Extended motifs from water and chemical functional groups in organic molecular crystals” Cryst Eng Comm, 2003, 5, 480-486. 139) a) Ball, P. “H2O: A Biography of Water” Weldenfeld and Niclolsar, London, 1999. b) Chem. Rev. 2002, 102 número especial. c) Zubavicus, Y.; Grunze, M. “New Insights into the Structure of Water with Ultrafast Probes” Science 2004, 304, 974-976. Capítulo 6 102 Eje a: Eje b: Eje c: Figura 88: Estructura del OC-1, obtenido mediante resolución de rayos X del cristal formado a partir de una disolución de CHCl3 y atmósfera de hexano. Vista tridimensional de dicha estructura a lo largo de los ejes a, b y c. La primera columna representa únicamente los ciclopéptidos, en los que se pueden apreciar los canales formados; la segunda columna representa el volumen ocupado por las moléculas de H2O incluidas en los poros; y la tercera muestra el péptido con el agua. La adición de CCl4 a una disolución del OC-1 en CHCl3 dio lugar a un cristal (monoclínico) cuya resolución permitió confirmar la predisposición de estos ciclopéptidos para formar dímeros. En dicho cristal las dos subunidades ciclopeptídicas están unidas entre sí a través de ocho puentes de hidrógeno cuyas distancias N…O varían entre 2,84 y 2,93 Å. El ciclopéptido adopta una conformación plana pero con forma ovalada, cuya distancia Cα-Cα es de 8,06 Å para el eje menor y de 12,05 Å para el mayor. Los grupos C=O y NH que intervienen en el puente de hidrógeno no se disponen perpendicularmente al eje del ciclopéptido, sino que aparecen apuntando hacia el interior de la cavidad. Esta distorsión de los puentes de hidrógeno puede explicar la baja constante de asociación encontrada en estos péptidos. α,γ-Ciclooctapéptidos N-metilados 103 Figura 89: Visión superior y lateral del OC-1, obtenido por resolución de los cristales del ciclopéptido cristalizado en CHCl3/CCl4. El orificio interior del dímero, con un volumen de van der Waals de aproximadamente 230 Å3, parece estar ocupado por moléculas de CCl4 o CHCl3 desordenadas, aunque para el refinado de la estructura se recurrió a la eliminación de la contribución del disolvente, de tal manera que se consiguió un R final de 0,11 (para dicha eliminación se usó la función SQUEEZE del programa PLATON,140 siendo el R inicial de 0,18). La estructura del cristal está formada por capas de dímeros, uno de los cuales se encuentra sobre cuatro dímeros de la siguiente capa, de tal forma que da lugar a canales hidrofóbicos a lo largo del eje b, en el que se alternan los dominios hidrofóbicos de las cavidades internas del dímero con los orificios generados por los metilos de las Ala y ciclohexilos de las cuatro unidades peptídicas de la siguiente capa, siendo la distancia entre planos equivalentes de 10,5 Å. Figura 90: Visión de los dímeros a lo largo del eje b (izquierda) y c (derecha) de los cristales del ciclopéptido OC-1. El ciclo[(L-MeN-γ-Ach-D-Phe)4-] (OC-2), preparado a partir del Boc-MeN-Ach- OFm, fue el péptido seleccionado para estudiar la interacción α-α característica de los nanotubos formados por α,γ-ciclooctapéptidos. Una vez ciclado en disolución y purificado por HPLC, el péptido fue caracterizado por espectroscopia de masas, IR y 140) Para la función SQUEEZE del programa PLATON, ver: Spek, A. L. 2001, PLATON, Universidad de Utrecht, Holanda; van der Sluis, P.; Spek, A. L. Acta Cryst. 1990, A46, 194-201. “R es una medida del grado de cuerdo entre los factores de estructura experimentales y los factores de estructura calculados con el modelo resuelto.” Capítulo 6 110 Figura 97: Representación de los datos de la tabla ajustados mediante una recta. Valor de la intensidad de la transferencia de NOE entre dímeros “y” frente a los tiempos de mezcla “x” para calcular la velocidad de interconversión entre dímeros. La amida A (293 K, CHCl3) del HC-5 a 3303 cm-1 es típica de la existencia de un enlace puente de hidrógeno, y las bandas a 1664 y 1627 cm-1 de la amida I y a 1529 cm-1 de la amida IIII son típicas de una hoja plegada β. El HC-6 también muestra bandas similares a 3303, 1661, 1624 y a 1525 cm-1. De igual modo que en los otros péptidos (HC-2 y HC-3), también el HC-5 (EM-FAB+) muestra el pico correspondiente al dímero a 1777,8 [2MH+] y al monómero 889,4 [MH+]; el HC-6, sin embargo, no presenta el pico del dímero. La cristalización del HC-6 en CHCl3 equilibrado con atmósfera de hexano dio lugar a un cristal en el que se aprecia la existencia de un único dímero de los tres posibles rotámeros. El dímero resultante es aquel en el que una Ser se solapa con una Phe y cada OH de la Ser genera un enlace puente de hidrógeno con el carbonilo de un ciclopéptido que forma parte de otro dímero. Los dos ciclopéptidos dan lugar a un dímero asimétrico orientado de forma antiparalela e interaccionando a través de seis puentes de hidrógeno con una distancia N…O que varía entre 2,89-2,99 Å, presentando uno de los anillos del γ-Ach dos conformaciones diferentes dentro de la estructura cristalina. El interior del dímero lo ocupa una molécula de CHCl3 (figura 98). En el resto de la estructura hay 7,8 moléculas de CHCl3 desordenadas en múltiples posiciones; tres de ellas están fijas, mientras que la del interior del dímero aparece desordenada en tres posiciones. 0,100 0,225 0,090 0,210 0,075 0,170 0,050 0,120 0,025 0,060 0,020 0,045 0,010 0,000 x = tiempo de mezcla (s) y = intensidad transferida α,γ-Ciclooctapéptidos N-metilados 111 Figura 98: Derecha: Imagen superior del dímero HC-6. Inferior: Imagen lateral del dímero, en cuyo interior se aprecia una molécula de CHCl3. Para el estudio de la influencia de la cadena lateral en los ciclooctapéptidos se pensó en el ciclo{[L-Ser(Bn)-D-MeN-γ-Ach-L-Phe-D-MeN-γ-Ach]2-} (OC-5) que posee simetría C2, de tal manera que en este caso pueden darse dos dímeros: uno es el dímero alternado en el que los fenilos de las Phe se enfrentan a las Ser del otro ciclopéptido; mientras que en el segundo las Phe y las Ser de cada dímero estarían enfrentados con sus homólogas (figura 99). Esperábamos que esta segunda conformación, se viese favorecida por la existencia de puentes de hidrógeno entre las cadenas laterales de las Ser desprotegidas. Una vez sintetizado, siguiendo la estrategia ya mencionada (capítulo 5, página 76) se obtuvo el péptido ciclo{[L-Ser(Bn)-D-MeN-γ-Ach-L-Phe-D-MeN-γ-Ach]2-} (OC-5), cuyo espectro de resonancia magnética nuclear de protón confirma la estructura plana y la formación de dos dímeros: donde los protones de la amida resuenan a: NHSer a 8,67 ppm y NHPhe a 8,59 ppm, junto con otro conjunto de señales en menor intensidad (6:1), cuyos protones amida aparecen a: NHSer a 8,59 ppm y NHPhe a 8,28 ppm, mostrando claramente una predisposición mayoritaria para uno de los dímeros. Capítulo 6 112 N NH N O O HN O O N HN N O O NH O O OR RO R = Bn; OC-5 R = OH; OC-6 Pd/C, H 2 Me Me Me Me Figura 99: Representación de los dos posibles rotámeros a los que daría lugar el ciclooctapéptido OC-6. La interacción puede ser: Phe-Phe y Ser-Ser (Izquierda) o Phe-Ser (Derecha). La presencia del NOE entre los Hβ de la Ser con Hβ de la Phe sugiere que el dímero mayoritario es aquel en el que se enfrentan las Ser con las Phe (anexo 1). Figura 100: NOESY donde se aprecia el NOE entre los protones β de la Ser y de la Phe del ciclopéptido OC-5. N H O N H N O Me N O O N H O Me N N H O Me N OMe O N O Me Me N O N HHO O N N H O ON Me Me O N HON O O H H N H O N H N O Me N O O N H O Me N N H O Me N OMe O N O Me Me N O N HHO O N N H O ON Me Me O N HON OH ppm ( t2 ) 3.003.50 3.00 3.50 ppm (t1 Η β Phe Η β Phe Η β Ser Η β Ser α,γ-Ciclooctapéptidos N-metilados 113 El tratamiento con H2 en presencia de 10% de Pd/C permite eliminar el grupo protector (Bn) de la serina. En el RMN de protón vuelve a aparecer una especie mayoritaria, en la cual el ciclopéptido adopta la conformación plana, formando puentes de hidrógeno con otra subunidad. En este caso también existe una segunda especie en una relación similar a la observada para el péptido bencilado (6:1). Esperábamos que la eliminación del Bn diese lugar a un nuevo equilibrio, en el que ahora la especie dominante fuese el dímero eclipsado, gracias a la formación de puentes de hidrógeno Ser-Ser, pero los espectros bidimensionales indican que la especie mayoritaria vuelve a ser el dímero alternado (Ser-Phe), observándose señales características de esta forma (figura 102). Se aprecian las señales del dímero mayoritario: NHSer a 8,96 ppm y NHPhe a 8,65 ppm, y las del dímero minoritario: NHSer a 8,14 ppm y NHPhe a 8,49 ppm. Una posible explicación de esta forma mayoritaria podría hallarse en la formación de puentes de hidrógeno entre el grupo hidroxilo de la serina y el anillo aromático.143 Sin embargo, esta interacción no está presente en el OC-5, en el que también es la forma mayoritaria. Por otro lado, sí figura en el hexámero HC-6, en el que la especie mayoritaria corresponde al dímero en el que Ser y Ser pueden formar puente de hidrógeno. Otra explicación más plausible tiene en cuenta los diferentes impedimentos estéricos entre cadenas laterales de las Phe y las Ser; provocando que la conformación plana más estable esté ligeramente curvada, de tal forma que los dos dímeros resultantes formen puentes de hidrógeno de diferente longitud. Figura 102: Izquierda: 1H RMN del ciclopéptido OC-6. Derecha superior: NOESY donde se aprecian los picos de los NH del dímero mayoritario (NOE) y del dímero minoritario, así como los picos de interconversión entre ambos dímeros. Derecha inferior: NOESY donde se muestran los picos NOE entre HβPhe-HβSer. (*: señales del dímero minoritario, Ser-Ser). De este modo, el dímero eclipsado tendría unos puentes de hidrógeno Phe-Phe ligeramente más cortos que los Ser-Ser. Esta interpretación está de acuerdo con los desapantallamientos químicos observados para los protones amida, en los que los NH de la Ser-Ser constituyen las señales más apantalladas que podrían corresponder a un puente de hidrógeno de mayor longitud (figura 103). En la segunda forma, los dos ciclopéptidos acomodan mejor sus puentes de hidrógeno, apareciendo ahora mucho más próximos y desapantallados los NH. Como se 143) Un puente de hidrógeno entre OH y anillos aromáticos supone una estabilización de 12,5 Kcal mol-1 (3 Kcal mol-1): Cheney, B. V.; Schulz, M. W.; Cheney, J.; Richards, W. G. “Hydrogen-Bonded Complexes Involving Benzene as a H Acceptor” J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 4195-4198. Capítulo 6 114 puede apreciar en la figura 102, el protón de la amida de la Phe se encuentra ligeramente más apantallada que en el dímero mayoritario, pero esto se compensa con una mayor interacción del NH de la Ser con el carbonilo de la Phe. El pico de intercambio mediante NOE con transferencia de saturación (STD) permitió estimar la velocidad de interconversión entre dímeros con una velocidad de 1,5-10 ms, ya que a 10 ms se observó un NOE de intensidad del 100%; y el dato de 1,5 ms se estimó a partir de la separación de las señales de ambos dímeros en un campo de 750 MHz (que corresponde a 1,5 ms). Figura 103: Posible estructura plegada de los péptidos OC-5 y OC-6. Izquierda: Enlaces entre Ser-Ser y Phe-Phe. Derecha: Enlaces entre Ser-Phe. Los IR (CDCl3 a 293 K) confirman la estructura tipo β de los péptidos OC-5 [1660, 1625 (amida I); 1523 cm-1 (amida IIII)] y OC-6 [1660, 1620 (amida I); 1524 cm-1 (amida IIII)]. La banda del N-H a 3311 cm-1 para el OC-5 y a 3317 cm-1 para el OC-6 coinciden con lo esperado para estos péptidos que forman dímeros fuertes. A pesar de múltiples intentos de cristalización, y del buen aspecto de los cristales preparados a partir de OC-5 y OC-6, éstos no llegaron a difractar, y por tanto no pudimos obtener información en estado sólido. (3α,1γ)-Ciclooctapéptidos N-metilados 6.4. (3α,1γ)-CICLOOCTAPÉPTIDOS N-METILADOS Uno de los objetivos planteados en este trabajo era demostrar una equivalencia entre α-Aa y γ-Aa (que podríamos considerar como “α-Aa voluminoso”, en el que el carbono α sería el anillo cicloalcánico), así como el desarrollo de nuevas estructuras ciclopeptídicas capaces de autoensamblarse en estructuras supramoleculares de forma tubular cuyas cavidades internas tienen diferentes propiedades. Además, nos interesaba el estudio de un nuevo motivo peptídico, en el que sustituyésemos los dos α-Aa de los D,L-octapéptidos por dos γ-Aa. Este tipo de estructuras, a las que hemos denominado 3α,1γ, presenta como principales novedades: un tamaño de anillo de 28 eslabones intermedio entre los D,L-ciclooctapéptidos (24 eslabones) y los α,γ-ciclooctapéptidos (32 eslabones) y una cavidad interior que proyecta únicamente dos metilos de los grupos ciclohexilos, lo que da lugar una simetría C2 frente a la simetría C3 del hexámero y a la C4 del octámero. NH NH HN HN N H NH H N HN O O O O O O O R 3 OR 1 R 3 R 1 R 2 R 2 Ciclo[(L-γ-Ach-D-Aa-L-Aa-D-Aa) 2 -] O R 2 O R 1 O O R 1 R 2 O R 1 O O O R 2 R 1 R 2 H NH N NH NH N H HN HN HN LL D DD D Ciclo[(L-Aa-D-Aa) 4 -] L N H NH NH O OR HN O OR H N HN HN O O RNH O O R Ciclo[(L-γ-Ach-D-Aa) 4 -] D D Figura 104: Diseño de diferentes ciclopéptidos formados por α-Aa y por α,γ-Aa. Como se puede observar en la figura 105, la formación de nanotubos a partir de estos ciclopéptidos se basaría en la formación de puentes de hidrógeno entre los grupos amida del esqueleto peptídico. Al igual que ocurría con los α,γ-ciclopéptidos, los 3α,1γ-ciclopéptidos presentan dos caras no equivalentes. En una de ellas los grupos 115 Capítulo 6 dadores y aceptores de puentes de hidrógeno son de los D-α-Aa (cara α-α), mientras que en la otra se encuentran el L-γ-Ach y el L-α-Aa (cara α-γ) o sus enantiómeros. Debido a ello, la formación de nanotubos se basa en interacciones entre láminas β antiparalelas en las que interaccionan la cara α de uno de los ciclopéptidos con la cara α del siguiente; o las caras α-γ entre sí. Por tanto, siguiendo con la metodología de los estudios en disolución de ciclopéptidos predispuestos para formar únicamente estructuras diméricas, se hace necesario preparar dos péptidos diferentes. Nos propusimos, por tanto, la preparación de ciclopéptidos en los que bloquearíamos la cara α-γ con el ciclo[(L-MeN-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-1), mientras que la interacción entre la cara α-α las estudiaríamos con el péptido ciclo[(L-Ser(Bn)-D-MeN- Ala-L-γ-Ach-D-MeN-Ala)2-] (OC3:1-2) (figura 106). N N Ciclo[(D-γ-Ach-L-Aa-D-Aa-L-Aa) 2 -] N N H O N H H O O O O N H NH H OO N HO N OH NH NH HN HN N H NH H N HN O O O O O O O R 1 OR 1 R 1 R 1 R 1 R 1 NN H H O O N H N O H O H NN H O HO N N H O N O N H N H H O O O O N H O H NH O N HO N OH N H N H O O H O H N H N O O NN H O HO N N H Figura 105: Modelo de (3α,1γ)-nanotubos peptídicos formados por autoensamblaje molecular de ciclopéptidos del tipo ciclo[(D-γ-Ach-L-Aa-D-Aa-L-Aa)2-]. En el nanotubo se pueden observar dos tipos de puentes de hidrógeno diferentes, las interacciones antiparalelas entre las caras (α-α) y las (α-γ). Para mayor claridad, las cadenas laterales han sido suprimidas. 116 (3α,1γ)-Ciclooctapéptidos N-metilados Ciclo[(L- Me N-γ-Ach-D-Phe-L- Me N-Ala-D-Phe) 2 -] (OC 3:1 -1) NH N HN HN N NH N N O O O O O O O O Ciclo{[L-Ser(Bn)-D- Me N-Ala-L-γ-Ach-D- Me N-Ala] 2 -} (OC 3:1 -2) N O N O H Me Me N NH N NN H N H N HN O O O O O O O O NN O O H Me O H O N O Me N H N O N O N H N H OO N N O Me Me OMe N N HO O N Me OH N Me Me Me Me O Me N O N O Me H H NN Me O N O N O HH OH N N O N O N O Me H O Me O N O H N Me O N H OMe N O N N Me Me Me Me OBn BnO Me Figura 106: Superior: El ciclo[(L-MeN-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-1) es el modelo seleccionado para el estudio de la hoja plegada β antiparalela entre las caras (α-α). Inferior: El ciclo{[L-Ser(Bn)-D-MeN-Ala-L-γ-Ach-D-MeN-Ala]2-} (OC3:1-2) es el modelo seleccionado para el estudio de la hoja plegada β antiparalela entre las caras (α-γ). Para la preparación de estos ciclopéptidos se varió un poco la estrategia anteriormente descrita para los ciclopéptidos. En la figura 107 se ilustra la metodología seguida para la preparación de parte de estos ciclopéptidos. En este caso se seleccionó una estrategia más lineal preparándose de forma correlativa dipéptidos, tripéptidos y tetrapéptidos. Estos tetrapéptidos se transformaron posteriormente en los octapéptidos que tras la desprotección se ciclaron para dar lugar a los correspondientes (3α,1γ)-ciclooctapéptidos. El ciclopéptido OC3:1-1 se preparó a partir del dipéptido Boc-L-MeN-Ala-D-Phe- OFm que posteriormente, tras eliminar el grupo Boc con TFA/CH2Cl2, se acopló con Boc-D-Phe-OH usando HATU como agente de acoplamiento. El tripéptido resultante se trató nuevamente con TFA/CH2Cl2 y a continuación se acopló el Boc-L-MeN-γ-Ach-OH, obteniéndose el tetrapéptido Boc-L-MeN-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe-OFm. Dicho tetrapéptido se transformó en el correspondiente octapéptido por desprotección del grupo Boc de la mitad del tetrapéptido, mientras que la otra mitad se trató con piperidina, procediendo al acoplamiento de ambos péptidos. Su ciclación se realizó en 117 Capítulo 6 disolución, de forma similar a las ya descritas; y posteriormente se purificó, lo cual permitió obtener el péptido deseado, tal como se muestra en el esquema general de la figura 107. Boc-D-Aa-L- Me N-Aa-OFm H 2 -D-Aa-L- Me N-Aa-OFm 1) C-desprotección 2) N-desprotección 3) Ciclación: TBTU, DIEA, CH 2 Cl 2 2) D-Boc-D-Aa-OH, HATU, DIEA, CH 2 Cl 2 FmOH, EDC, HOBt, DMAP, CH 2 Cl 2 TFA, CH 2 Cl 2 Boc-L- Me N-Aa-OH Boc-L- Me N-Aa-OFm 1) TFA, CH 2 Cl 2 CICLOOCTAPÉPTIDO 2) D-Boc-D-Aa-OH, HBTU, DIEA, CH 2 Cl 2 1) TFA, CH 2 Cl 2 2) D-Boc-D-Aa-OH, HBTU, DIEA, CH 2 Cl 2 1) TFA, CH 2 Cl 2 Boc-L- Me N-Aa-D-Aa-L- Me N-Aa-OFmBoc-D-Aa-L- Me N-Aa-D-Aa-L- Me N-Aa-OFm OCTAPÉPTIDO Lineal Acoplamiento entre el N- desprotegido y el C- desprotegido: HBTU, DIEA, CH 2 Cl 2 C-desprotección N-desprotección Figura 107: Esquema seguido para la síntesis de los OC3:1-1, OC3:1-2, etc. El OC3:1-1, una vez purificado, se caracterizó por MS: [MH]+ 1037,6 umas. El espectro de RMN en disolventes polares presenta una gran complejidad, algo que atribuimos a un equilibrio conformacional entre varias especies que equilibran lentamente en la escala de tiempos del RMN. Sin embargo, en disolventes apolares, el espectro se simplifica, mostrando señales debidas al equilibrio entre dos especies (monómero/dímero). Las señales del dímero las asignamos a las más desapantalladas que a su vez son las que aumentan con la concentración: los NH de la Phe1 del dímero están a δ 8,80 ppm, los NH de la Phe2 a 8,31 ppm y las señales de los NH de los monómeros a δ 7,49 y 7,10 ppm.144 144) El protón a 7,10 ppm se identificó al realizar los experimentos bidimensionales (anexo 1). 118 (3α,1γ)-Ciclooctapéptidos N-metilados Figura 108: 1H RMN a diferentes concentraciones del ciclo[(L-MeN-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-1), donde se aprecian algunas señales características del dímero (**) y monómero (*). Se observan claramente las 1H del dímero (**): NH (8,80 y 8,31 ppm) y Hα Ala (5,89 ppm); y los 1H del monómero (*): NH (7,49 ppm) y Hα Phe (4,86 ppm), todos ellos a 293 K. Los experimentos bidimensionales no permitieron confirmar la estructura dimérica, debido a que aquellos protones más significativos no presentaban un NOE característico por estar orientados hacia el exterior del dímero o demasiado alejados. La única señal que podría ser característica, era el NOE entre los protones de las amidas NH Phe1 y NH Phe2, que sin embargo no se observó (capítulo 11 y anexo 1). Los experimentos de RMN a diferentes concentraciones y temperaturas (313-233 K) nos permitieron estimar una Ka 293 = 92 M-1 y una contribución: ∆H°298 = -47,8 KJ mol-1 y ∆S°298 = -126,1 J K-1 mol-1. Es por tanto un proceso dirigido entálpicamente (gracias a la formación de ocho puentes de hidrógeno) pero entrópicamente desfavorable. El IR (en CHCl3 a 293 K) muestra las bandas características de una lámina β plegada a 1669, 1627 (amida I) y 1525 cm-1 (amida IIII), valores comparables a los de los ciclopéptidos estudiados previamente. De igual manera, se observa una banda a 3310 cm-1 (amida A) característica de la existencia de un enlace puente de hidrógeno. La confirmación definitiva de la estructura dimérica la obtuvimos mediante rayos X. La cristalización del ciclopéptido OC3:1-1 se realizó en CH2Cl2 equilibrado en una atmósfera de hexano, obteniéndose un cristal incoloro (ortorrómbico) después de 24 h. Los ciclopéptidos forman un dímero a través de ocho puentes de hidrógeno y presentan una estructura ovalada. La distancia N…O entre las subunidades unidas mediante puentes de hidrógeno varía entre 2,9 y 3,0 Å. Los dímeros están alineados formando canales a lo largo del eje a, de tal forma que la estructura cristalina está constituida por capas en las que se van alternando los planos de dímeros: cada dímero de una capa se sitúa sobre cuatro dímeros de la capa adyacente, siendo la distancia entre capas equivalentes de 13,8 Å. La distancia Cα-Cα entre las alaninas es de 12,2 Å (y la distancia media entre las Phe es de 12 Å), mientras que el espacio de van der Waals entre los H de los C2 es de sólo 4,0 Å, quedando por tanto una cavidad de van der 28,76 mM 14,38 mM 3,60 mM pp m ( t1 ) 5.06.07.08.0 ** ** ** * * 1,80 mM 119 Capítulo 6 Ciclo[(L-γ-Ach-D-Phe1-L- Me N-Ala-D-Phe2) 2 -] (OC 3:1 -5) NH NH HN HN N NH N HN O O O O O O O O Me Me O N N N H O N Me H O O O O N H N Me H OO N HO N OH N H N HO Me OH N H N O O NN H O Me O N N H Figura 118: Péptido ciclo[(L-γ-Ach-D-Phe1-L-MeN-Ala-D-Phe2)2-] (OC3:1-5) y modelo del dímero correspondiente. El siguiente péptido sintetizado, el ciclo[(L-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-5), se diseñó con el objetivo de identificar los efectos que tenía el metilo en la α-Ala en el proceso de autoensamblaje. El espectro de protón de este péptido, para nuestra sorpresa, es bastante complejo. Lo más llamativo es observar que los tres grupos amida aparecen ligeramente desapantallados y a similar campo magnético (como señales anchas), no apreciándose diferencia entre los protones situados hacia el exterior de la cavidad y los dispuestos hacia el interior. Estos datos nos hicieron pensar en una estructura totalmente diferente a la del dímero cíclico en conformación plana; por ejemplo, en algún tipo de plegamiento en el que los tres grupos participan en la formación de puentes de hidrógeno. No obstante, en el RMN parece observarse únicamente tres NH diferentes, tal como lo confirma la correlación 15N-1H (anexo1). Estas señales se desplazan a campo bajo al disminuir la polaridad del medio (adición de CCl4). Aparentemente, dichas señales no presentan un desplazamiento significativo con la concentración, aunque uno de los Hα se ve afectado, circunstancia que nos lleva a suponer que podrían existir procesos de asociación. Sin embargo los experimentos bidimensionales en disolventes CDCl3 no aportan ningún dato que nos permita, de momento, determinar la estructura de este péptido en disolventes apolares. 126 (3α,1γ)-Ciclooctapéptidos N-metilados ppm ( t1 ) 4.505.005.506.006.507.007.50 ++ * + ** 15,0 mM 7,5 mM 3,75 mM Figura 119: 1H RMN del ciclopéptido OC3:1-5 en CDCl3/CCl4 1/1 a 25 ºC. En estas condiciones los NH (+) aparecen todos juntos entre 7,50-7,40 ppm. Sin embargo, se aprecia un cambio en el Hα de las Phe (**), la señal se va desplazando a campo bajo al ir disminuyendo la concentración. pp m ( t1 ) 5.06.07.08.0 ** 30,0 mM ** 7,5 mM 1,9 mM ** Figura 120: 1H RMN del ciclooctapéptido OC3:1-5 en CDCl3 a 25 ºC a diferentes concentraciones. Se puede observar como el Hα Phe (**) se desplaza a campo bajo al disminuir la concentración. 127 Capítulo 6 Resulta de interés mencionar que la adición de metanol produce un cambio drástico en la estructura del ciclopéptido, en el que las señales de los NH se desapantallan; incluso una de ellas (NH Phe2) aparece a un campo próximo a 9 ppm (figura 121). El segundo protón que se aprecia es el del γ-Ach, lo que indica que éstos forman un puente de hidrógeno bastante fuerte, mientras que el tercer protón de la amida permanece oculto entre las señales aromáticas. Como se puede observar, todos los protones del ciclohexilo aparecen claramente definidos, lo cual nos lleva a deducir que están en un ambiente muy diferente. Esta estructura es independiente de la concentración y se produce tanto en CD3OH como en otros disolventes polares como DMSO y acetona. Los espectros bidimensionales NOESY/ROESY sugieren un plegamiento del péptido, ya que, por ejemplo, existen NOEs entre: el protón amídico de la Phe2 (8,81ppm) con el Hα del γ-Ach y del NHAch con el Hα Phe1. Estas señales sólo parecen posibles en una estructura plegada como la que se muestra en la figura 122 (capítulo 11 y anexo 1). ppm ( t1 ) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 NHAch NHPhe CHCl3 H2O Figura 121: 1H RMN del ciclopéptido OC3:1-5 en CD3OH. Los valores de la vibración del IR (CHCl3 a 293 K) en este caso son ligeramente diferentes a los esperados para hojas plegadas β: 1687, 1652 (amida I) y 1537 cm-1 (amida IIII), mientras que el valor de la amida A es 3324 cm-1. Los reiterados intentos por obtener cristales que nos permitiesen establecer claramente la estructura del péptido resultaron fallidos, ya que aunque se obtuvieron cristales, éstos resultaron demasiado inestables (CHCl3) o no difractaron (C2H2Cl4) para poder ser utilizados en difracción de rayos X. Dadas estas dificultades, decidimos preparar un segundo péptido ciclo{[L-Ser(Bn)-D-γ-Ach-L-Phe-D-MeN-Ala]2-} (OC3:1-6), en el que sustituimos la Phe2 por una Ser con el objetivo de diferenciar claramente los L-aminoácidos. 128 (3α,1γ)-Ciclooctapéptidos N-metilados N NH HN HN O O Bn Bn O Me O HN HN O Bn NH Bn O O NMe O Figura 122: Posible estructura plegada en MeOH del ciclo[(L-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-5). Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-γ-Ach-L-Phe-D- Me N-Ala] 2 -} (OC 3:1 -6) NH NH HN HN N NH N HN O O O O O O O O OBn BnO Me Me N N N H O N Me H O OO O N H N Me H OO N HO N OH N H N H O O Me O H N H N O O NN H O Me O N N H H H Figura 123: Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-γ-Ach-L-Phe-D-MeN-Ala]2-} (OC3:1-6) y dímero formado mediante autoensamblaje molecular. Los IR en CDCl3 muestran bandas muy similares para ambos péptidos; OC3:1-6: 1684, 1655, 1630 y 3327 cm-1; mientras que las bandas del OC3:1-5 son: 1687, 1652, 1637 y 3324 cm-1. Cada péptido sólo posee una banda correspondiente a la amida A, con un valor que hace suponer la existencia de un puente de hidrógeno débil. En este caso, los 1H RMN del OC3:1-6 -tanto en disolventes apolares como polareshan mostrado un comportamiento muy similar al OC3:1-5. El RMN en CD3OH no aportó datos nuevos a la estructura, en parte porque los experimentos bidimensionales realizados no tenían la calidad suficiente, aunque afortunadamente el OC3:1-6 cristalizó en MeOH (figura 124). Se encontró que el péptido no existe como dímero sino que presenta una estructura tipo 8 en la que se puede apreciar que el NH del γ-Ach y el NH de la Ser forman puentes de hidrógeno simultáneamente con el mismo carbonilo (γ-Ach), mientras que el NH de la Phe se halla hacia el exterior formando un puente de hidrógeno con el disolvente. 129 Capítulo 6 Figura 124: Rayos X del ciclopéptido OC3:1-6 cristalizado en MeOH. Izquierda: Se muestran los puentes de hidrógeno que existen en la estructura. Derecha: Ortep de la estructura. Obtenidos estos resultados, volvimos a hacer un estudio del OC3:1-6 en CDCl3, dado que en este caso los NH y los Hα se diferencian mejor, gracias a la sustitución de una Phe por una Ser. Los espectros de RMN bidimensionales (NOESY y ROESY) muestran dos NOEs muy interesantes: NH Ser con Hα MeN-Ala y NH γ-Ach con Hα Ser (este NOE no es posible en el plegamiento tipo 8 de la figura 124). Esto parece indicar que el plegamiento podría ser de tipo “silla de montar” formando puentes de hidrógeno intramolecular. 130 (3α,1γ)-Ciclooctapéptidos N-metilados pp m ( t2 ) 5.005.506.006.507.007.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 ppm (t 1 NH Ser H α MeN-Ala NH γ -Ach Hα Ser Figura 125: NOE entre los NH γ-Ach con Hα Ser (NOESY en 40:60 CDCl3/CCl4). A partir de estos datos, se deduce que estos ciclopéptidos no adoptan la conformación plana necesaria para la formación del dímero, sino que se pliegan. Comparando los ciclopéptidos en los que el γ-Ach no participa en la formación de los puentes de hidrógeno: OC3:1-1 (los dos γ-Ach y los dos α-Aa N-metilados), OC3:1-4 (los dos γ-Ach N-metilados), OC3:1-5 y OC3:1-6 (los dos α-Aa N-metilados), se observa una gran influencia según la posición de los grupos metílicos (γ-Ach o α-Aa). La presencia de los metilos en los γ-Ach parece tener un mayor efecto del esperado ya que facilita la conformación plana. Sin embargo, cuando éste falta tiende a formar puentes de hidrógeno intramoleculares. Este efecto puede estar propiciado por el N-Metilo del α-Aa que da una congestión estérica en la conformación plana, que es liberada al plegarse. Resulta evidente que los impedimentos estéricos entre el carbonilo y el metilo juegan un papel determinante en la formación plana. Cuando suprimimos el metilo de los α-Aa el péptido puede adoptar una mejor conformación plana, lo que le permite dar lugar a una mayor Ka. Si mantenemos este grupo y eliminamos el metilo de los γ-Ach, las repulsiones entre los metilos y los carbonilos de las Ala siguen existiendo y el péptido se pliega a través del α-Aa, lo cual a su vez le permite formar puentes de hidrógeno intramoleculares estabilizando la estructura. Decidimos acometer el mismo estudio con la otra interacción (cuyo estudio se inicio con OC3:1-2 y OC3:1-3). En este caso los metilos están situados en los α-Aa y por tanto no era previsible encontrar el mismo tipo de comportamiento. De todos modos, apostamos por eliminar de forma selectiva dos de los grupos metilos y sintetizar en primer lugar el ciclopéptido ciclo{[L-Ser(Bn)-D-MeN-Ala-L-γ-Ach-D-Ala]2-} (OC3:1-7) (figura 126). Este péptido vuelve a mostrar una conformación plana apropiada para la 131 Capítulo 6 formación de dímeros, estructura que podemos confirmar por el desplazamiento observado para los protones: 8,70 ppm NH Ser (J = 9,5 Hz); 7,91 ppm NH γ-Ach (J = 8,9 Hz); mientras que el protón situado en el exterior de la estructura: 6,55 NH Ala (J = 6,5 Hz). Al igual que en otros péptidos anteriormente preparados, se puede observar que el proceso de autoensamblaje molecular posee una elevada Ka > 104, ya que su espectro de 1H RMN es independiente de la concentración (hasta 0,2 mM). Ciclo{[L-Ser(Bn)-D- Me N-γ-Ala-L-γ-Ach-D-Ala] 2 -} (OC 3:1 -7) NH NH HN NN H N H N HN O O O O O O O O OBn BnO Me Me N ON O H Me Me NO N O H H O H O N O H N H N O N O H NN H O N O N O HMe OH N N HO O N Me OH N Figura 126: Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-MeN-Ala-L-γ-Ach-D-Ala]2-} (OC3:1-7) y modelo del dímero formado por autoensamblaje molecular. ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 Hα MeN-Ala Hα Ala ppm (t2) 4.905.005.105.205.305.405.505.605.70 5.00 5.50 ppm (t1 * * ** Figura 127: 1H RMN del ciclopéptido OC3:1-7. NH que participan en la formación del dímero: NH Ser (8,70 ppm) y NH γ-Ach (7,91 ppm) aparecen marcados con (*), mientras que el NH que no participa en la formación del dímero: NH Ala (6,55 ppm) se ha marcado con (**). Derecha: ROESY del ciclopéptido OC3:1-7 (entre 5,8-4,8 ppm): la presencia de un NOE entre Hα MeN-Ala (5,34 ppm) y el Hα Ala (5,06 ppm) es indicativo de la existencia de un dímero. Los experimentos bidimensionales de este péptido muestran claramente la existencia de un NOE entre los Hα de la MeN-Ala (5,34 ppm) y la Ala (5,06 ppm), algo sólo posible en la estructura dimérica. El IR (CHCl3 a 293 K) posee las bandas típicas de una hoja plegada β a 1683, 1651, 1616, 1543 cm-1; y las bandas de la amida A: 3312 y 3417 cm-1. La presencia de 132 (3α,1γ)-Ciclooctapéptidos N-metilados esta banda a 3417 cm-1 la atribuimos al N-H que no participa en la formación de puentes de hidrógeno. La elevada constante de asociación (> 104 M-1) del ciclopéptido OC3:1-7 resultó sorprendente, ya que los resultados obtenidos con los α,γ-ciclopeptídicos nos hacían pensar que los ciclopéptidos en los que el γ-Ach forma puentes de hidrógeno daban lugar a dímeros con mayor dificultad, debido a la menor polaridad de dichos enlaces. Por otro lado, de nuevo se evidencia que la N-metilación de los ciclopéptidos ejerce una gran influencia sobre la conformación del ciclopéptido (orientación de los C=O y NH) y por tanto sobre la formación de los dímeros. El siguiente péptido sintetizado fue el ciclo{[L-Ser(Bn)-D-Ala-L-γ-Ach-D-MeN- Ala]2-} (OC3:1-8) (figura 128), cuyo espectro de RMN en cloroformo presenta unas señales claramente diferenciadas y afiladas que parecían indicar que se trataba de una conformación plana, y que formaba un dímero con una elevada Ka, ya que el RMN era independiente de la concentración. Sin embargo, fue asombroso comprobar que el protón más apantallado correspondía a la Ser, cuando debería de participar en la formación de puentes de hidrógeno si se tratase de una estructura dimérica (figura 128). Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-Ala-L-γ-Ach-D- Me N-Ala] 2 -} (OC 3:1 -8) N NH N HN N H NH H N HN O O O O O O O O OBn BnO Me Me N ON O H H H NO N O H Me O H O N O Me N H N O N O H NN H O N O N O Me H OMe N N HO O N H OH N Figura 128: Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-Ala-L-γ-Ach-D-MeN-Ala]2-} (OC3:1-8) y modelo del dímero formado por autoensamblaje molecular. 133 Capítulo 6 ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 Figura 129: 1H RMN del ciclopéptido OC3:1-8 en CDCl3: 7,97 ppm (NH γ-Ach); 7,37-7,27 ppm (NH Ala y Bn); 6,59 ppm (NH Ser). Nuevamente resultó muy difícil determinar la estructura secundaria del ciclopéptido en disolución debido a la elevada simetría. De todas formas, podemos afirmar que éste no adopta la conformación plana y que la falta de dos metilos permite el plegamiento en el que el protón amida del γ-Ach forma un enlace puente de hidrógeno muy fuerte -cuando no debería de formarlos si se tratase de un dímero (figura 128)-, mientras que la Ser queda orientada hacia el exterior de la estructura sin participar en la formación de puentes de hidrógeno. En CD3OH, los NH están más desapantallados: [9,20 ppm (NH γ-Ach); 8,09 ppm (NH Ala); 7,70 ppm (NH Ser)]. Todas estas evidencias llevan a suponer que este ciclopéptido adopta una conformación no plana también en este disolvente. (Los bidimensionales, tanto en CDCl3 como en CD3OH, no permitieron determinar la estructura secundaria). De nuevo la posición del Me que bloquea la cara determina la estructura secundaria del ciclopéptido, de tal forma que en los MeN-α-Aa unidos al extremo N-terminal del γ-Ach favorecen la conformación plana. Sin embargo, cuando el enlace se produce por el extremo C-terminal, el péptido se pliega, posiblemente debido a la formación de un puente de hidrógeno intramolecular. 134 (3α,1γ)-Ciclooctapéptidos N-metilados ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 Figura 130: 1H RMN del ciclopéptido OC3:1-8 en CD3OH: 9,13 ppm (NH γ-Ach); 8,02 ppm (NH Ala); 7,63 ppm (NH Ser). El IR (CHCl3 a 293 K) muestra bandas a 1671 y 1629 cm-1 de la amida I y a 1521 cm-1 de la amida IIII. La banda del N-H a 3326 cm-1 coincide con la de un N-H que participa en un enlace puente de hidrógeno, mientras que la banda a 3432 cm-1 es típica de un N-H que no participa en la formación de dichos enlaces. Ciclopéptido Vibración Amida Ia Vibración Amida Ib Vibración Amida IIII Vibración Amida A OC3:1-1 1627 1669 1525 3310 OC3:1-2 1631 1673 1528 3313/3412 OC3:1-3 1632 1673 1542 3310/3413 OC3:1-4 1642 1681 1515 3296/(3403) OC3:1-5 1652 1687 1537 3324 OC3:1-6 1655 1684 1530 3327 OC3:1-7 1616, 1651 1683 1543 3312/(3417) OC3:1-8 1629 1671 1521 3326/3432 Tabla 5: Bandas del IR en CHCl3 de los diferentes OC3:1. (OC3:1-4 y OC3:1-7 poseen bandas, respectivamente, a 3403 y 3417 cm-1 del N-H que no participa en la formación del dímero). El análisis de los datos de IR parece confirmar que el OC3:1-1 es un dímero más fuerte, pues sólo se aprecia la banda de la amida A correspondiente al dímero. Por el contrario, los péptidos OC3:1-2 y OC3:1-3 muestran la banda del dímero y la del monómero. Esta última banda presenta un valor muy similar a la amida A, de los N-H, 135 Anexo 1: Datos de RMN Boc-L-Leu-D-MeN-Ala-OFm ppm (t1) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 ppm ( f1 ) 50100150 22 Anexo 1: Datos de RMN Boc-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe-OFm ppm (t1) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 Boc-D-γ-Ach-L-Phe-D-MeN-Ala-OFm ppm (f1) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 23 Anexo 1: Datos de RMN Boc-D-MeN-γ-Ach-L-Phe-D-Ala-OFm ppm (f1) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 Boc-D-Ala-L-γ-Ach-D-MeN-Ala-OFm ppm (t1) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 24 Anexo 1: Datos de RMN 11.6. Ciclopéptidos N-metilados 11.6.1. Ciclohexapéptidos ppm (f1) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 Ciclo[(L-γ-Ach-D-MeN-Ala)3-] (HC-1) ppm ( t1 ) 50100150 25 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(D-Phe-L-MeN-γ-Ach)3-] (HC-2) ppm (f1) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 ppm ( f1 ) 50100150 26 Anexo 1: Datos de RMN ppm ( t1 ) 50100150 ppm ( f1 ) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-MeN-γ-Ach]3-} (HC-3) 27 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(L-Ser-D-MeN-γ-Ach)3-] (HC-4) ppm (t1) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 ppm ( t1 ) 50100150 28 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{L-Ser(Bn)-D-MeN-γ-Ach-[L-Phe-D-MeN-γ-Ach-]2-} (HC-5) ppm (t1) 0.05.0 29 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[L-Ser-D-MeN-γ-Ach-(L-Phe-D-MeN-γ-Ach)2-] (HC-6) ppm ( t1 ) 0.0 5.0 ppm (t1) 50 100 150 30 Anexo 1: Datos de RMN pp m ( t1 ) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 11.6.2. Ciclotetrapéptidos Ciclo[(D-γ-Ach-L-MeN-Ala)2-] (TC-1) ppm ( t1 ) 50100150 31 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(L-Phe-D-MeN-γ-Ach-L-Ser-D-MeN-γ-Ach)2-] (OC-6) pp m ( t1 ) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0 ppm (t1) 8.008.509.00 ppm ( t1 ) 50100150 38 Anexo 1: Datos de RMN 11.6.4. (3α,1γ)-Ciclooctapéptidos ppm ( f1 ) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0 Ciclo[(L-MeN-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-1) ppm ( f1 ) 50100150 39 Anexo 1: Datos de RMN ppm ( f1 ) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-MeN-Ala-L-γ-Ach-D-MeN-Ala]2-} (OC3:1-2) ppm (t1) 50100150 40 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Leu-D-MeN-Ala-L-γ-Ach-D-MeN-Ala]2-} (OC3:1-3) ppm ( f1 ) 50100150 ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 41 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-MeN-γ-Ach-L-Phe-D-Ala]2-} (OC3:1-4) ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 ppm ( t1 ) 50100150 42 Anexo 1: Datos de RMN ppm ( t1 ) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 Ciclo[(L-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-5) (en CD3OH) ppm ( t1 ) 50100150 43 Anexo 1: Datos de RMN ppm ( f1 ) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-γ-Ach-L-Phe-D-MeN-Ala]2-} (OC3:1-6) (en CD3OH) ppm ( t1 ) 50100150 44 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-MeN-Ala-L-γ-Ach-D-Ala]2-} (OC3:1-7) ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 ppm ( f1 ) 50100150 45 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-Ala-L-γ-Ach-D-MeN-Ala]2-} (OC3:1-8) ppm ( t1 ) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 ppm (t1) 50100150 46 Anexo 1: Datos de RMN 11.7. α,γ-Nanotubos peptídicos sólidos; síntesis en fase sólida Ciclo{[(1S,3R)-γ-Ach-L-Gln]3-} (HC-7) ppm ( f1 ) 0.05.010.0 47 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[L-Ser-D-MeN-γ-Ach-(L-Phe-D-MeN-γ-Ach)2-] (HC-6) NOESY (CDCl3, 750 MHz); (Ampliación 3,5-2,5 ppm : 9,2-7,0 ppm): ppm (t2) 3.00 7.50 8.00 8.50 9.00 ppm (t1 NOESY (CDCl3, 750 MHz); (Ampliación 9,2-7,6 ppm : 9,2-7,6 ppm): ppm (t2) 8.008.509.00 8.00 8.50 9.00 ppm (t1 54 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[L-Ser-D-MeN-γ-Ach-(L-Phe-D-MeN-γ-Ach)2-] (HC-6) ROESY (CDCl3, 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 ppm (t 1 ROESY (CDCl3, 750 MHz); (Ampliación 9,2-6,5 : 4,3-2,0 ppm): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 2.50 3.00 3.50 4.00 ppm (t 1 55 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[L-Ser-D-MeN-γ-Ach-(L-Phe-D-MeN-γ-Ach)2-] (HC-6) ROESY (CDCl3, 750 MHz); (Ampliación 9,0-7,7 ppm : 9,0-7,7 ppm): ppm (t2) 8.008.50 8.00 8.50 9.00 ppm (t1 56 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(L-γ-Ach-D-MeN-Ala)4-] (OC-1) NOESY (CDCl3; -10 ºC; concentración: 5 mM; 750 MHz): ppm ( t2 ) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 ROESY (CDCl3; -10 ºC; concentración: 5 mM; 750 MHz): ppm (t2) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 57 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Phe-D-MeN-γ-Ach-L-Ser(Bn)-D-MeN-γ-Ach]2-} (OC-5) COSY (CDCl3, 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 NOESY (CDCl3, 750 MHz): ppm ( t2 ) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 58 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Phe-D-MeN-γ-Ach-L-Ser(Bn)-D-MeN-γ-Ach]2-} (OC-5) NOESY (CDCl3, 750 MHz); (Ampliación 3,8-2,5 ppm : 3,8-2,5 ppm): ppm ( t2 ) 3.003.50 3.00 3.50 ppm (t1 NOESY (CDCl3, 750 MHz); (Ampliación 9,0-8,0 ppm : 9,0-8,0 ppm): ppm ( t2 ) 8.50 8.50 ppm (t1 59 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Phe-D-MeN-γ-Ach-L-Ser(Bn)-D-MeN-γ-Ach]2-} (OC-5) ROESY (CDCl3, 750 MHz): ppm (t2) 0.05.0 0.0 5.0 ppm (t1 ROESY (CDCl3, 750 MHz); (Ampliación 3,8-2,5 ppm : 3,8-2,5 ppm): ppm (t2) 3.003.50 3.00 3.50 ppm (t1 60 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Phe-D-MeN-γ-Ach-L-Ser(Bn)-D-MeN-γ-Ach]2-} (OC-5) ROESY (CDCl3, 750 MHz); (Ampliación 9,0-8,0 ppm : 9,0-8,0 ppm): ppm (t2) 8.108.208.308.408.508.608.708.808.90 8.10 8.20 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70 8.80 8.90 ppm (t1 61 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(L-Phe-D-MeN-γ-Ach-L-Ser-D-MeN-γ-Ach)2-] (OC-6) COSY (CDCl3, 500 MHz): ppm (f2) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 ppm (f1 NOESY (CDCl3, 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 ppm (t1 62 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(L-Phe-D-MeN-γ-Ach-L-Ser-D-MeN-γ-Ach)2-] (OC-6) NOESY (CDCl3, 750 MHz); (Ampliación 4,0-2,5 ppm : 4,0-2,5 ppm): ppm (t2) 3.003.50 3.00 3.50 ppm (t1 NOESY (CDCl3, 750 MHz); (Ampliación 9,5-0,5 ppm : 9,4-7,7 ppm): ppm ( t2 ) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 8.00 8.50 9.00 ppm (t1 63 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(L-Leu-D-MeN-Ala-L-γ-Ach-D-MeN-Ala)2-] (OC3:1-3) NOESY (CDCl3; -18 ºC; concentración: 65,50 mM; 750 MHz); (Ampliación 6,8-4,7 ppm : 6,3-4,7 ppm): ppm (t2) 5.005.506.00 5.00 5.50 6.00 ppm (t1 ROESY (CDCl3; -18 ºC; concentración: 65,50 mM; 750 MHz): ppm (t2) 0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 ppm (t1 70 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-MeN-γ-Ach-L-Phe-D-Ala]2-} (OC3:1-4) COSY (CDCl3; 25 ºC; 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 ppm (t1 NOESY (CDCl3; 25 ºC; 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 ppm (t1 71 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-MeN-γ-Ach-L-Phe-D-Ala]2-} (OC3:1-4) NOESY (CDCl3; 25 ºC; 750 MHz); (Ampliación 9,0-8,1 ppm : 9,0-8,1 ppm): ppm ( t2 ) 8.208.308.408.508.608.708.808.90 8.20 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70 8.80 8.90 ppm (t1 ROESY (CDCl3; 25 ºC; 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 ppm (t1 72 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(L-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-5) COSY (CDCl3:CCl4 70:30; 25 ºC; 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 TOCSY (CD3OH; 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 ppm (t1 73 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(L-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-5) NOESY (CDCl3:CCl4 70:30; 25 ºC; 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 NOESY (CDCl3:CCl4 70:30; 25 ºC; 750 MHz); (Ampliación 6,2-5,4 ppm : 6,5-4,5 ppm): ppm (t2) 5.505.605.705.805.906.006.10 5.00 5.50 6.00 ppm (t1 74 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(L-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-5) NOESY (CD3OH, 750 MHz): ppm ( t2 ) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 ppm (t1 NOESY (CD3OH, 750 MHz); (Ampliación 5,1-4,0 ppm : 9,0-1,6 ppm): ppm (t2) 4.505.005.50 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 75 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(L-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-5) ROESY (CDCl3:CCl4 70:30; 25 ºC; 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 ppm (t1 ROESY (CDCl3:CCl4 70:30; 25 ºC; 750 MHz); (Ampliación 5,5-4,7 ppm : 5,5-4,7 ppm): ppm (t2) 4.804.905.005.105.205.305.40 4.80 4.90 5.00 5.10 5.20 5.30 5.40 ppm (t1 76 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(L-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-5) ROESY (CD3OH, 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 ppm (t1 Correlación 15N- 1H (CDCl3:CCl4 70:30; 25 ºC; 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 120.0 125.0 130.0 ppm (t1 77 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo[(L-γ-Ach-D-Phe-L-MeN-Ala-D-Phe)2-] (OC3:1-5) Correlación 15N- 1H (CD3OH; 25 ºC; 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 100.0 105.0 110.0 115.0 120.0 125.0 130.0 135.0 ppm (t1 78 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-γ-Ach-L-Phe-D-MeN-Ala]2-} (OC3:1-6) COSY (CDCl3:CCl4 40:60; 25 ºC; concentración: 40 mM; 500 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 COSY (CD3OH; 25 ºC; 750 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 79 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-Ala-L-γ-Ach-D-MeN-Ala]2-} (OC3:1-8) COSY (CDCl3, 500 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 TOCSY (CDCl3, 500 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 86 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-Ala-L-γ-Ach-D-MeN-Ala]2-} (OC3:1-8) NOESY (CDCl3, 500 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 ROESY (CDCl3, 500 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1 87 Anexo 1: Datos de RMN Ciclo{[L-Ser(Bn)-D-Ala-L-γ-Ach-D-MeN-Ala]2-} (OC3:1-8) COSY (CD3OH, 500 MHz): ppm (t2) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0 5.0 ppm (t1 88 ANEXO 2: DATOS DE RAYOS X Anexo 2: Datos de rayos X Ácido (trans,trans)-3-amino-2-metilciclohexanocarboxílico COOH NH2 Los cristales se obtuvieron por cristalización de 5 mg en CHCl3/hexano. Difractómetro: Nonius “MACH3”. Programas: XCAD4 -CAD4 Diffractometer Data Reduction- (Harms, K.; Wocadlo, S. University of Marburg, Marburg, Germany, 1995); WinGx (Farrugia, L. J. J. Appl. Cryst. 1999, 32, 837-838); PSISCANS -Psi-scan Empirical Absorption Correction- (North, A. C. T.; Phillips, D. C.; Mathews, F. S. Acta. Crystallogr. Sect A 1968, 24, 351-359); SADABS -Multiple Equivalent Absorption Correction- (Area-Detector Absorption Correction; Siemens Industrial Automation, Inc.: Madison, WI, 1996); SHELXL-97 -Crystal Structure Refinement- (G. M. Sheldrick, Institute für Anorganische Chemie, Universitat Gottingen, D-37077 Göttingen, Germany); PARST - Geometrical Calculations- (Nardelli, M. J. Appl. Cryst. 1995, 28, 659). Table 1. Identification code 2001jg01 Empirical formula C13 H23 N O4 Formula weight 257.32 Temperature 293(2) K Wavelength 1.54184 Å Crystal system Triclinic Space group P -1 Unit cell dimensions a = 5.286(6) Å α= 77.60(10)° b = 11.500(10) Å β= 78.73(18)° c = 12.512(15) Å γ = 89.84(16)° Volume 728.0(14) Å3 Z 2 Density (calculated) 1.174 Mg/m3 Absorption coefficient 0.707 mm-1 F(000) 280 Crystal size 0.56 x 0.08 x 0.04 mm3 Theta range for data collection 3.94 to 64.35°. Index ranges -6<=h<=0, -13<=k<=13, -14<=l<=14 Reflections collected 2722 Independent reflections 2722 [R(int) = 0.0000] Completeness to theta = 64.35° 99.4 % Absorption correction Empirical (DIFABS) Max. and min. transmission 0.9723 and 0.6930 2 Anexo 2: Datos de rayos X Refinement method Full-matrix least-squares on F2 Data / restraints / parameters 2722 / 0 / 167 Goodness-of-fit on F2 1.838 Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.2270, wR2 = 0.5892 R indices (all data) R1 = 0.4135, wR2 = 0.6309 Largest diff. peak and hole 0.829 and -0.952 e.Å-3 Plano ab: 3 Anexo 2: Datos de rayos X Plano ac: Plano bc: 4 Anexo 2: Datos de rayos X Ácido (cis,cis)-3-amino-2-metilciclohexanocarboxílico COOH NH2 Los cristales se obtuvieron por cristalización de 5 mg en etanol. Difractómetro: Nonius “MACH3”. Programas: XCAD4 -CAD4 Diffractometer Data Reduction-; E-STATS -Distribution of E-Statistics-; STDANAL -Analysis of Standard Intensities-; PSIABS -Psi-scan Empirical Absorption Correction-; SHELXL-97 -Crystal Structure Refinement-; PARST -Geometrical Calculations-. Table 1. Identification code 2001jg03 Empirical formula C13 H23 N O4 Formula weight 257.32 Temperature 293(2) K Wavelength 1.54184 Å Crystal system Triclinic Space group P −1 Unit cell dimensions a = 5.3423(2) Å α= 85.730(6)° b = 11.4359(10) Å β= 81.101(4)° c = 11.9361(5) Å γ = 87.365(6)° Volume 718.01(7) Å3 Z 2 Density (calculated) 1.190 Mg/m3 Absorption coefficient 0.717 mm-1 F(000) 280 Crystal size 0.72 x 0.16 x 0.04 mm3 Theta range for data collection 3.76 to 73.45° Index ranges -6<=h<=6, 0<=k<=14, -14<=l<=14 Reflections collected 3045 Independent reflections 2891 [R(int) = 0.0637] Completeness to theta = 73.45° 99.9 % Absorption correction Psi-scan Max. and min. transmission 0.9628 and 0.709 Refinement method Full-matrix least-squares on F2 Data / restraints / parameters 2891 / 0 / 256 Goodness-of-fit on F2 1.054 5 Anexo 2: Datos de rayos X Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0516, wR2 = 0.1369 R indices (all data) R1 = 0.0720, wR2 = 0.1522 Extinction coefficient 0.011(2) Largest diff. peak and hole 0.430 and -0.290 e.Å-3 Plano ab: 6 Anexo 2: Datos de rayos X Plano ac: Plano bc: 7 Anexo 2: Datos de rayos X Plano bc: 14 Anexo 2: Datos de rayos X Cristal del HC-6: Table 1. Identification code jg06ma1n Empirical formula 2(C45H62N6O7), 7(HCCl3), H0.8C0.8Cl2.4 Formula weight 2527.41 Temperature 110.0(1) K Wavelength 0.71073 Å Crystal system Monoclinic Space group P 21 Unit cell dimensions a = 15.143(3) Å α= 90° b = 25.610(5) Å β= 93.753(4)° c = 15.681(3) Å γ = 90° Volume 6068(2) Å3 Z 2 Density (calculated) 1.383 Mg/m3 Absorption coefficient 0.584 mm-1 F(000) 2623.2 Crystal size 0.74 x 0.42 x 0.39 mm3 Theta range for data collection 1.35 to 26.51° Index ranges -18<=h<=18, -31<=k<=31, 0<=l<=19 Reflections collected 51477 Independent reflections 23971 [R(int) = 0.0399] Completeness to theta = 26.51° 97.8 % Absorption correction Semi-empirical from equivalents Max. and min. transmission 0.796 and 0.666 Refinement method Full-matrix least-squares on F2 Data / restraints / parameters 23971 / 439 / 1332 Goodness-of-fit on F2 1.018 Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0922, wR2 = 0.2393 R indices (all data) R1 = 0.1372, wR2 = 0.2811 Absolute structure parameter 0.00(7) Largest diff. peak and hole 1.084 and -0.798 e.Å-3 15 Anexo 2: Datos de rayos X Plano ab: Plano ac: 16 Anexo 2: Datos de rayos X Plano bc: 17 Anexo 2: Datos de rayos X Ciclotetrapéptidos Obtencióción de cristales del péptido TC-2 para análisis por rayos X. Cristal del TC-2 en C2H2Cl4: 3 mg del péptido se disolvieron en 0,5 mL de C2H2Cl4 y se equilibró mediante difusión con 5 mL de hexano, resultando cristales de forma espontanea después de 2-4 días. Cristal del TC-2 en MeOH: 3 mg del péptido se disolvieron en 1mL de MeOH y se equilibraron con 5 mL de hexano, resultando cristales de forma espontanea después de 2-4 días. Análisis de los datos cristalográficos de los cristales de TC-2 en CHCl3 y de TC-2 en MeOH. Los datos fueron recogidos en un difractómetro Bruker SMART 1000 a baja temperatura (110 K) equipado con un tubo sellado (Mo Kα) y un monocromador de grafito altamente ordenado. Todos los cálculos fueron hechos en un IBM-compatible PC usando los programas: SMART; SAINTT; SADABS y SHELX-97; WinGx; SIR97; ORTEP3; y PARST. 18 Anexo 2: Datos de rayos X Cristal del TC-2 en C2H2Cl4: Table 1. Identification code jg10ma1n Empirical formula C34 H44 N4 O4 Formula weight 572.73 Temperature 110.0(1) K Wavelength 0.71073 Å Crystal system Monoclinic Space group P2(1) Unit cell dimensions a = 11.7406(19) Å α= 90° b = 21.343(3) Å β= 110.975(3)° c = 13.412(2) Å γ = 90° Volume 3138.1(9) Å3 Z 4 Density (calculated) 1.212 Mg/m3 Absorption coefficient 0.080 mm-1 F(000) 1232 Crystal size 0.98 x 0.82 x 0.49 mm3 Theta range for data collection 1.86 to 28.28° Index ranges -15<=h<=14, -27<=k<=28, 0<=l<=17 Reflections collected 25482 Independent reflections 13987 [R(int) = 0.0181] Completeness to theta = 28.28° 95.8 % Absorption correction SADABS Max. and min. transmission 0.9619 and 0.9258 Refinement method Full-matrix least-squares on F2 Data / restraints / parameters 13987 / 1 / 778 Goodness-of-fit on F2 1.018 Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0356, wR2 = 0.0841 R indices (all data) R1 = 0.0416, wR2 = 0.0880 Absolute structure parameter 0.1(5) Largest diff. peak and hole 0.246 and -0.178 e.Å-3 19 Anexo 2: Datos de rayos X Plano ab: Plano ac: 20 Anexo 2: Datos de rayos X Plano bc: 21 Anexo 2: Datos de rayos X Cristal del TC-2 en MeOH: Table 1. Identification code jg07ma1n Empirical formula C69 H102 N8 O15 Formula weight 641.79 Temperature 110(2) K Wavelength 0.71073 Å Crystal system Monoclinic Space group P21 Unit cell dimensions a = 12.9029(17) Å α= 90° b = 14.6931(19) Å β= 107.321(2)° c = 19.457(3) Å γ = 90° Volume 3521.5(8) Å3 Z 2 Density (calculated) 1.211 Mg/m3 Absorption coefficient 0.085 mm-1 F(000) 1384 Crystal size 0.54 x 0.39 x 0.15 mm3 Theta range for data collection 1.10 to 28.29° Index ranges -17<=h<=16, -17<=k<=19, 0<=l<=25 Reflections collected 23385 Independent reflections 15139 [R(int) = 0.0231] Completeness to theta = 28.29° 94.9 % Absorption correction SADABS Max. and min. transmission 1.0000 and 0.8705 Refinement method Full-matrix least-squares on F2 Data / restraints / parameters 15139 / 14 / 867 Goodness-of-fit on F2 1.029 Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0631, wR2 = 0.1652 R indices (all data) R1 = 0.0970, wR2 = 0.1899 Absolute structure parameter 0.0(11) Extinction coefficient 0.0018(6) Largest diff. peak and hole 1.241 and -0.430 e.Å-3 22 Anexo 2: Datos de rayos X Plano ab: Plano ac: 23 Anexo 2: Datos de rayos X Plano ab: Plano ac: 30 Anexo 2: Datos de rayos X Plano bc: 31 Anexo 2: Datos de rayos X Cristal del OC-2:∗ Table 1. Identification code 2003jg05 Empirical formula C68H88N8O8 Formula weight 1145.47 Temperature 100.0(1) K Wavelength 1.5418 Å Crystal system Monoclinic Space group C2 Unit cell dimensions a = 26.7257(3) Å α= 90° b = 29.7095(4) Å β= 111.969(1)° c = 22.5651(3) Å γ = 90° Volume 16615.8(4) Å3 Z 8 Density (calculated) 0.916 Mg/m3 Absorption coefficient 0.481 mm-1 F(000) 4928 Crystal size 0.3 x 0.25 x 0.1 mm3 Theta range for data collection 2.11 to 60.16° Index ranges -30<=h<=27, -33<=k<=33, 0<=l<=25 Reflections collected 67045 Independent reflections 23772 [R(int) = 0.0455] Completeness to theta = 60.16° 99.1 % Absorption correction Semi-empirical from equivalents Max. and min. transmission 0.94848 and 0.80064 Refinement method Full-matrix-block least-squares on F2 Data / restraints / parameters 23772 / 50 / 1511 Goodness-of-fit on F2 1.037 Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0717, wR2 = 0.1976 R indices (all data) R1 = 0.0765, wR2 = 0.2025 Absolute structure parameter 0.05(18) [estimated, but not refined] Extinction coefficient 0.00080(5) Largest diff. peak and hole 0.468 and -0.256 e.Å-3 ∗ www.ccdc.cam.ac.uk/data (CCDC-265525) 32 Anexo 2: Datos de rayos X Dímero 1: Plano ab: Plano ac: 33 Anexo 2: Datos de rayos X Plano bc: 34 Anexo 2: Datos de rayos X Dímero 2: Plano ab: Plano ac: 35 Anexo 2: Datos de rayos X Plano bc: 36 Anexo 2: Datos de rayos X (3α,1γ)-ciclooctapéptidos Obtención de cristales de los péptido OC3:1-1 y del OC3:1-6 para análisis por rayos X. El péptido OC3:1-1 se cristalizó de 3 mg de péptido purificado por HPLC que se disolvieron en 1mL de CH2Cl2 y se equilibró mediante difusión con 5 mL de hexano, resultando cristales incoloros después de 2-4 días. El péptido OC3:1-6 se cristalizó a partir de 5 mg disueltos en 0,5 mL de MeOH, resultando cristales de forma espontánea después de 2 días. Análisis de los datos cristalográficos del péptido OC3:1-1. Los datos fueron tomados en un difractómetro Bruker a baja temperatura (100 K) en un Bruker Nonius FR591 KappaCCD2000 equipado con un ánodo rotatorio FR591 KappaCCD 2000 (Cu Kα) y Osmic multilager confocal optics. Todos los cálculos se realizaron en un IBM- compatible PC usando los programas: COLLECT; HKL Denzo and Scalepack; SORTAV y SHELX-97; WinGx; SIR2002; ORTEP3; PLATON (SQUEEZE); y PARST. Análisis de los datos cristalográficos del péptido OC3:1-6. Los datos fueron tomados en un difractómetro Bruker SMART 1000 a baja temperatura (120 K) equipado con un tubo sellado (Mo Kα) y un monocromador de grafito altamente ordenado. Todos los cálculos se realizaron en un IBM-compatible PC usando los programas: SMART; SAINTT; SADABS y SHELX-97; WinGx; SIR97; ORTEP3; y PARST. 37 Anexo 2: Datos de rayos X Cristal del OC3:1-1 Table 1. Identification code 2003jg07 Empirical formula C60H76N8O8, H2O Formula weight 1055.3 Temperature 100.0(1) K Wavelength 1.5418 Å Crystal system Orthorhombic Space group C 2 2 21 Unit cell dimensions a = 21.9089(18) Å α= 90° b = 28.648(2) Å β= 90° c = 22.991(2) Å γ = 90° Volume 14430(2) Å3 Z 8 Density (calculated) 0.971 Mg/m3 Absorption coefficient 0.53 mm-1 F(000) 4528 Crystal size 0.17 x 0.1 x 0.08 mm3 Theta range for data collection 2.54 to 54.24° Index ranges 0<=h<=23, 0<=k<=30, -24<=l<=24 Reflections collected 69791 Independent reflections 8800 [R(int) = 0.071] Completeness to theta = 54.24° 99.8 % Absorption correction Semi-empirical from equivalents Max. and min. transmission 0.958 and 0.363 Refinement method Full-matrix least-squares on F2 Data / restraints / parameters 8800 / 1310 / 805 Goodness-of-fit on F2 1.761 Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.1527, wR2 = 0.3756 R indices (all data) R1 = 0.1605, wR2 = 0.3903 Absolute structure parameter 0.1(5) Largest diff. peak and hole 1.31 and -0.501 e.Å-3 38 Anexo 2: Datos de rayos X Plano ab: Plano ac: 39