Infectómica y Vacunómica aplicada al estudio del Rotavirus

TESIS DE DOCTORADO INFECTÓMICA Y VACUNÓMICA APLICADA AL ESTUDIO DEL ROTAVIRUS José Gómez Rial ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL USC (EDIUS) PROGRAMA DE DOCTORADO EN AVANCES E NOVAS ESTRATEXIAS EN CIENCIAS FORENSES SANTIAGO DE COMPOSTELA 2020 ! ! 2! DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS Infectómica y Vacunómica aplicada al estudio del Rotavirus D. JOSE GOMEZ RIAL Presento(mi(tesis,(siguiendo(el(procedimiento(adecuado(al(Reglamento,(y(declaro(que:( 1) La(tesis(abarca(los(resultados(de(la(elaboración(de(mi(trabajo.( 2) En(su(caso,(en(la(tesis(se(hace(referencia(a(las(colaboraciones(que(tuvo(este( trabajo.( 3) (La(tesis(es(la(versión(definitiva(presentada(para(su(defensa(y(coincide(con(la( versión(enviada(en(formato(electrónico.( 4) Confirmo(que(la(tesis(no(incurre(en(ningún(tipo(de(plagio(de(otros(autores(ni( de(trabajos(presentados(por(mí(para(la(obtención(de(otros(títulos.( ! En Santiago de Compostela 12 de Mayo de 2020 Fdo. ........... ! ! 3! AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS Infectómica y Vacunómica aplicada al estudio del Rotavirus Prof. Dr. D. ANTONIO SALAS ELLACURIAGA Prof. Dr. D. FEDERICO MARTINÓN TORRES INFORMA/N: Que la presente tesis, corresponde con el trabajo realizado por D. JOSE GÓMEZ RIAL, bajo mi dirección, y a utorizo su presentación , considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de ésta no incurre en las causas de abstención establecidas en Ley 40/2015. En Santiago de Compostela 12 de Mayo de 2020 Fdo. ........... Prof. Dr. Antonio Salas Fdo. ........... Prof. Dr. Federico Martinón-Torres ! ! 4! A la memoria de mis padres A mi mujer Carolina y mis hijos Manuel y Merce ! ! 5! Agradecimientos Ha sido un largo camino hasta llegar a la consecución de este objetivo. Son muchas las personas a las que le debo mi más sincero agradecimiento y sin las cuales esta empresa no hubiese podido llegar a su fin. En primer lugar, mi más profundo agradecimiento a mis directores de Tesis, los profesores Federico Martinón Torres y Antonio Salas Ellacuriaga, Fede y Toño, mis maestros, mis amigos, mis mentores. Sin ellos habría dejado ya hace mucho tiempo este mundo de la investigación. Solo su constante motivación y entusiasmo diario me ha permitido llegar al final del camino. Nunca en la vida he conocido a personas tan brillantes y a la vez tan generosas. Grandes maestros en lo profesional y en la vida, a los que no me cansaré nunca de agradecer que me hayan incorporado a su mundo de este modo. Gracias por compartir tanto conmigo. A todas las personas que forman y han formado el grupo de investigación en vacunas, infecciones y pediatría (GENVIP) Todos y cada uno de ellos han dejado una impronta en este trabajo de algún u otro modo. Una gran familia dispuesta a colaborar en cualquier trabajo que se le solicitase, sin pedir nada a cambio. Han sido y serán mis compañeros de viaje en este ingrato, pero a la vez fascinante mundo de la ciencia y la investigación. En especial debo agradecer a mi compañera María José Currás Tuala, toda su labor y apoyo prestado para la realización de gran parte del trabajo experimental de esta tesis. ! ! 6! A mis compañeros del Servicio de Inmunología del Hospital Clínico de Santiago, mi lugar de trabajo, por haberme aguantado todo este tiempo y haberme apoyado hasta el final en la consecución de este trabajo. A mis padres, Pepe y Merche, donde quiera que estén, personas humildes y trabajadoras que renunciaron a tanto para que sus hijos pudiesen conseguir los éxitos personales y profesionales actuales. Llevaré siempre conmigo una losa al no poder haber conseguido este pequeño logro antes que el caprichoso destino me los arrebatase de forma tan prematura. Aquí la tienes papá, la tesis. A mis hijos Manuel y Merce, el futuro es vuestro, aprovechad lo que os dejo y aprended de mis errores. Papá ha terminado la tesis, al fin. A mi mujer Carolina, el sentido de mi vida, la razón de mi día a día, mi más profunda motivación, mi más feroz crítica y a la vez mi más ferviente admiradora. Ella ha sufrido más que nadie, todas las horas que le he robado para dedicar a la consecución de este trabajo. Mi compañera de viaje, participe de mis éxitos y mis fracasos, siempre a mi lado. Gracias Caro. ! ! 7! Declaración de conflictos de interés Declaro no tener ningún conflicto de interés en relación con la tesis doctoral. La presente tesis no ha generado ninguna patente. Este trabajo ha sido financiado íntegramente por el proyecto de investigación en salud PI13/02382 financiado por el Instituto de Salud Carlos III al Prof Dr Federico Martinón Torres entre los años 2014-2016 Durante el transcurso de la tesis he recibido pagos de la empresa Merck Sharp & Dohme, GlaxoSmithkline y Pfizer en concepto de asesorías científicas, no relacionadas con el contenido de la tesis. ! ! 8! 1 Tabla de contenido 1!INTRODUCCIÓN+.......................................................................................................................................+11! 1.1!ROTAVIRUS:!CARACTERÍSTICAS!Y!DESCRIPCIÓN4..................................................................................411! 1.2!CARACTERIZACIÓN!DE!LA!ENFERMEDAD!POR!ROTAVIRUS4.............................................................413! 1.2.1!Fisiopatogenia....................................................................................................................................................13! 1.2.2!Anclaje.del.rotavirus.a.la.membrana.celular:.susceptibilidad.genética.a.la.infección......17! 1.3!EPIDEMIOLOGÍA!Y!CARGA!DE!LA!ENFERMEDAD4....................................................................................419! 1.3.1!Carga.de.la.enfermedad.por.Rotavirus.en.Europa.y.en.España...................................................21! 1.4!VACUNAS!FRENTE!AL!ROTAVIRUS4................................................................................................................424! 1.4.1!Primeras.estrategias.......................................................................................................................................24! 1.4.2!Vacunas.actuales.frente.a.Rotavirus........................................................................................................25! 1.4.3!Nuevos.candidatos.vacunales......................................................................................................................27! 1.5!LA!RESPUESTA!INMUNE!FRENTE!AL!ROTAVIRUS4..................................................................................429! 1.5.1!Respuesta.inmune.innata.en.humanos.tras.la.infección.por.rotavirus.....................................29! 1.5.2!Papel.de.las.citocinas.en.la.defensa.frente.al.rotavirus...................................................................31! 1.5.3!Acción.de.las.células.inmunes.innatas.en.la.infección......................................................................32! 1.5.4!Respuesta.inmune.humoral.tras.la.infección.por.rotavirus...........................................................34! 1.5.5!Respuesta.inmune.celular.............................................................................................................................35! 1.5.6!Respuesta.inmune.tras.la.vacunación.....................................................................................................36! 1.6!CORRELATOS!DE!PROTECCIÓN!PARA!LAS!VACUNAS!FRENTE!A!ROTAVIRUS4...........................438! 1.6.1!RV-sIgA.como.correlato.de.protección....................................................................................................39! 1.6.2!Nuevos.correlatos.de.protección.alternativos......................................................................................42! 1.6.3!Anticuerpos.secretores.frente.a.rotavirus.(RV-SIg)...........................................................................42! 1.6.4!Células.B.memoria.y.células.plasmáticas.específicas.de.rotavirus.............................................43! 1.6.5!Células.T.específicas.frente.a.rotavirus...................................................................................................43! 1.7!ORGANIZACIÓN!DE!LA!RESPUESTA!INMUNE!EN!LA!MUCOSA!INTESTINAL4...............................445! 1.7.1!El.sistema.inmune.de.la.mucosa.(MALT)...............................................................................................46! 1.7.2!Los.diferentes.sistemas.MALT.y.la.comunicación.entre.ellos........................................................47! 1.8!ROTAVIRUS!COMO!ENFERMEDAD!SISTÉMICA:!“ROTAVOLUTION”4.................................................451! 2!JUSTIFICACIÓN+DE+LA+TESIS+................................................................................................................+54! 3!OBJETIVOS+.................................................................................................................................................+56! 4!MATERIAL+Y+MÉTODOS+.........................................................................................................................+57! 4.1!SUJETOS!DEL!ESTUDIO4................................................................................................................................................457! 4.1.1!Criterios.de.inclusión.y.exclusión.en.el.estudio....................................................................................57! 4.2!MUESTRAS!RECOGIDAS!PARA!EL!ESTUDIO4...............................................................................................................459! 4.3!VACUNA!EMPLEADA!DURANTE!EL!ESTUDIO4............................................................................................................460! 4.4!ANTÍGENOS!DE!ROTAVIRUS!EMPLEADOS!ENSAYO!ESTIMULACIÓN!IN!VITRO4......................................................460! 4.5!PROCEDIMIENTOS!REALIZADOS!DURANTE!EL!ESTUDIO4.........................................................................................461! 4.5.1!Extracción.de.ARN.y.preparación.de.la.muestra................................................................................61! 4.5.2!Análisis.transcriptómico.mediante.ARN-Seq........................................................................................61! 4.5.3!Determinación.de.RV-IgA.en.muestras.de.suero.y.saliva.mediante.ELISA.directo..............65! 4.5.4!Determinación.por.multiplexado.de.citocinas.en.suero.y.saliva.mediante.xMAPLuminex â ...............................................................................................................................................................................66! 4.5.5!Evaluación.de.la.respuesta.inmune.celular.mediante.ensayo.de.estimulación.en.sangre. completa.(WBS,.whole.blood.stimulation.assay)..................................................................................................68! 4.5.6!Criopreservación.de.sangre.completa.....................................................................................................69! 4.5.7!Análisis.de.expresión.de.marcadores.de.activación.en.superficie.celular.mediante. citometría.de.flujo..............................................................................................................................................................69! 4.5.8!Inmunoblotting.sobre.electroforesis.bidimensional.de.proteínas.de.rotavirus....................70! 4.6!ANÁLISIS!ESTADÍSTICO4...............................................................................................................................................474! 5!RESULTADOS+............................................................................................................................................+75! 5.1!ESTUDIO!DE!LA!RESPUESTA!HUMORAL!EN!LA!MUCOSA!ORAL!EN!RESPUESTA!A!LA!INFECCIÓN!NATURAL!Y!EN! LA!VACUNACIÓN:!COMPARACIÓN!CON!LA!RESPUESTA!SISTÉMICA4....................................................................................475! 5.1.1!Análisis.de.RV-IgA.en.muestras.de.suero/saliva.en.la.cohorte.de.pacientes.infectados....75! ! ! 9! 5.1.2!Análisis.de.RV-IgA.en.muestras.de.suero/saliva.en.la.cohorte.de.pacientes.vacunados...77! 5.1.3!Análisis.de.la.influencia.de.la.lactancia.sobre.la.inmunogenicidad.de.la.vacunación.y.el. GMFR.83! 5.1.4!Comparación.entre.las.cohortes.de.individuos.vacunados.e.infectados...................................85! 5.1.5!Correlación.entre.las.muestras.de.saliva.y.suero.en.ambas.cohortes........................................87! 5.2!ESTUDIO!DE!LA!RESPUESTA!DE!CITOCINAS!EN!MUCOSA!ORAL!ENTRE!EL!PACIENTE!VACUNADO!E!INFECTADO:! COMPARACIÓN!CON!LA!RESPUESTA!SISTÉMICA4...................................................................................................................489! 5.2.1!Perfil+de+citocinas+en+suero+y+saliva+en+la+cohorte+de+pacientes+infectados................89! 5.2.2!Perfil.de.citocinas.en.suero.y.saliva.en.la.cohorte.de.pacientes.vacunados............................92! 5.2.3!Análisis.comparativo.entre.el.perfil.de.citocinas.de.la.cohorte.de.pacientes.infectados.y. vacunados...............................................................................................................................................................................95! 5.2.4!Correlación.entre.los.valores.de.citocinas.obtenidos.y.el.curso.clínico.de.los.pacientes. infectados...............................................................................................................................................................................98! 5.3!ANÁLISIS!DE!LA!RESPUESTA!INMUNE!CELULAR!A!DIFERENTES!ANTÍGENOS!DE!ROTAVIRUS!EN!AMBAS! COHORTES4.............................................................................................................................................................................4104! 5.3.1!Respuesta.inmune.celular.a.antígenos.de.rotavirus.en.la.cohorte.de.pacientes.infectados .104! 5.3.2!Respuesta.inmune.celular.a.antígenos.de.rotavirus.en.la.cohorte.de.pacientes. vacunados............................................................................................................................................................................106! 5.3.3!Comparación.de.la.respuesta.inmune.celular.obtenida.entre.la.cohorte.de.pacientes. infectados.y.vacunados..................................................................................................................................................112! 5.3.4!Correlación.de.la.respuesta.inmune.celular.con.el.curso.clínico.en.la.cohorte.de. pacientes.infectados........................................................................................................................................................114! 5.3.5!Correlación.entre.la.inmunidad.celular.y.la.inmunidad.humoral.en.la.cohorte.de. pacientes.vacunados.......................................................................................................................................................116! 5.4!ESTUDIO!COMPARATIVO!DE!LOS!PERFILES!MOLECULARES!DE!INMUNIZACIÓN!HUMORAL!EN!EL!SUERO!TRAS! LA!INFECCIÓN!NATURAL!Y!TRAS!LA!VACUNACIÓN4...........................................................................................................4118! 5.5!ANÁLISIS!DEL!TRANSCRIPTOMA!EN!EL!PACIENTE!INFECTADO!Y!VACUNADO4...................................................4121! 5.5.1!Análisis.del.transcriptoma.en.el.paciente.infectado.vs.grupo.control...................................121! 5.5.2!Análisis.del.transcriptoma.en.el.paciente.vacunado.vs.grupo.control...................................135! 5.6!CARACTERIZACIÓN!DE!LA!RESPUESTA!INMUNE!CELULAR!TRAS!LA!INFECCIÓN!Y!TRAS!LA!VACUNACIÓN!DE! ROTAVIRUS4............................................................................................................................................................................4136! 5.6.1!Caracterización.de.la.respuesta.celular.durante.la.fase.aguda.de.la.infección.por. rotavirus...............................................................................................................................................................................136! 5.6.2!Caracterización.de.la.respuesta.celular.tras.la.vacunación.frente.al.rotavirus................138! 6!DISCUSIÓN+..............................................................................................................................................+140! 6.1!ESTUDIO!DE!LA!RESPUESTA!HUMORAL!EN!LA!MUCOSA!ORAL!EN!RESPUESTA!A!LA!INFECCIÓN!NATURAL!Y!A!LA! VACUNACIÓN4.........................................................................................................................................................................4140! 6.1.1!Rotavirus-IgA.salivar.como.correlato.de.protección.alternativo.............................................141! 6.1.2!Interferencia.de.la.lactancia.materna.en.el.cálculo.de.la.conversión....................................142! 6.1.3!Diferencias.en.los.niveles.de.anticuerpos.alcanzados.mediante.la.infección.natural.y.la. vacunación..........................................................................................................................................................................144! 6.1.4!Correlación.entre.los.compartimentos.sérico.y.mucosa.oral.....................................................145! 6.2!RESPUESTA!DE!CITOCINAS!EN!SUERO!Y!EN!MUCOSA!ORAL!TRAS!LA!INFECCIÓN!NATURAL!DE!ROTAVIRUS!Y! TRAS!LA!VACUNACIÓN4.........................................................................................................................................................4146! 6.2.1!Respuesta+inmune+mediada+por+citocinas+en+respuesta+a+la+infección+por+ rotavirus+en+mucosa+oral.........................................................................................................................................146! 6.2.2!Respuesta.inmune.mediada.por.citocinas.en.respuesta.a.la.vacunación.............................153! 6.2.3!Comparación.entre.la.respuesta.de.citocinas.en.la.infección.natural.y.tras.la.vacunación .154! 6.2.4!Comparación.entre.la.respuesta.de.citocinas.en.suero.y.saliva................................................155! 6.3!ANÁLISIS!DE!LA!RESPUESTA!INMUNE!CELULAR!A!DIFERENTES!ANTÍGENOS!DE!ROTAVIRUS!EN!AMBAS! COHORTES4.............................................................................................................................................................................4156! 6.3.1!Respuesta.inmune.celular.en.el.paciente.infectado........................................................................156! 6.3.2!Respuesta.inmune.celular.en.el.paciente.vacunado.......................................................................157! 6.3.3!Cambios.en.el.perfil.de.citocinas.tras.la.vacunación......................................................................158! 6.3.4!Comparación.de.la.respuesta.entre.ambas.cohortes.....................................................................159! Introducción ! 16! Figura 2: Modelo de diarrea inducida por rotavirus (De Robert F. Raming J Virol, 2004 Vol 78 Nº 19) A. La célula epitelial es infectada por el virus presente en el lumen intestinal, se produce la decapsidación viral y la formación del viroplasma (Vi) y la liberación del virus y las proteínas virales. La enterotoxina NSP4 (triángulo rojo) podría ser liberada a través de una vía secretora no habitual. La liberación de NSP4 en el interior de la célula produce liberación del Ca++ desde sus compartimentos internos, principalmente el retículo endoplasmático, aumentando la concentración de Ca++ intracelular. También la enterotoxina NSP4 liberada durante la infección interacciona con las uniones estrechas intercelulares, permitiendo la salida de agua y electrolitos entre las células (flecha verde) NSP4 se une a su receptor específico en la célula y activa una cascada de señalización a través de la PLC e IP3 que resulta en la liberación de Ca++ y aumento de su concentración intracelular. Este incremento produce la desorganización del citoesqueleto de las microvellosidades y finalmente secreción de iones como el Clhacia el exterior. B. Se muestra la arquitectura normal del intestino delgado con el sistema nervioso entérico y el sistema ganglionar en los diferentes niveles de la submucosa. C. Se muestra el arco reflejo en el que el sistema nervioso entérico (SNE) puede recibir señales del epitelio de las microvellosidades y activar el epitelio de las células de la cripta. La imagen 1 muestra las vellosidades teñidas para una proteína del sistema nervioso entérico que revela la gran inervación presente (tinción amarilla) La imagen 2 muestra que los enterocitos de las vellosidades infectados pueden estimular el SNE a través de la liberación basolateral de NSP4. Introducción ! 17! 1.2.2 Anclaje del rotavirus a la membrana celular: susceptibilidad genética a la infección ! El rotavirus preferentemente infecta los enterocitos villosos terminalmente diferenciados de la parte superior del intestino delgado (20). El primer paso en el proceso de infección es la digestión de la partícula viral mediada por proteasas similares a tripsina localizadas en el lumen intestinal del huésped (21, 22). Durante este paso de activación se produce la ruptura de la proteína de cápside viral VP4 en dos fragmentos principales, VP8* por el extremo N-terminal y VP5* en el lado C-terminal (23, 24). Este procesamiento proteolítico es esencial para la infectividad del virus y permite un anclaje estable al epitelio de la mucosa intestinal (25). Estudios recientes han identificado el ligando sobre la mucosa intestinal reconocido por esta molécula VP8* del rotavirus; se trata de oligosacáridos pertenecientes a los antígenos de grupo sanguíneo tisular (HBGA, histo-blood group antigens) (26-28). Estos carbohidratos HBGA similares a los antígenos Lewis y ABO se encuentran genéticamente determinados y están presentes en las células epiteliales intestinales, en las secreciones mucosas y en la superficie de los hematíes. Son, además, factor de anclaje para otros patógenos gastrointestinales como son Helicobacter pilory ó Norovirus (29) Estos HBGA comparten un residuo común de a-1,2-Fucosa unido, añadido por el enzima a-1,2-fucosiltransferasa. Este enzima es codificado por el gen FUT2 y determina un fenotipo “secretor” para estos antígenos HBGA. Los individuos Introducción ! 18! mutantes para FUT2 son considerados “no-secretores” por carecer de esta actividad enzimática y por tanto ausentes de antígenos a-1,2-fucosilados en los tejidos de la mucosa. Estos individuos muestran una resistencia natural a la infección sintomática por rotavirus, demostrando ser un determinante de susceptibilidad importante al rotavirus (30). Sin embargo, la entrada del rotavirus en la célula es un proceso complejo que implican varios pasos de anclaje a diferentes receptores. La proteína viral VP8* media la interacción específica con glicanos celulares, pero se requieren otros receptores (componentes endosomales, integrinas, proteínas de choque térmico) para que el proceso de infección se complete con éxito (31-33). Introducción ! 19! 1.3 EPIDEMIOLOGÍA Y CARGA DE LA ENFERMEDAD La infección por rotavirus es la causa de entre el 40-50% de las diarreas graves agudas en niños en todo el mundo (34, 35). A la edad de 5 años, el 95% de los niños habrán contraído la enfermedad y se muestran especialmente vulnerables los niños de entre 6 meses y dos años, aunque la infección por rotavirus puede afectar a cualquier edad del individuo (36, 37). Los rotavirus son altamente contagiosos entre los niños. Es frecuente encontrar casos de infecciones repetidas con diferentes cepas virales, y muchos niños sufren varios episodios de infección por rotavirus en el primer año de vida. La primera infección tiende a ser la más severa y con las sucesivas infecciones el individuo adquiere inmunidad frente al virus (38). Se reportan anualmente 114 millones de casos de infección por rotavirus en niños menores de 5 años en el mundo, de los cuales 24 millones de casos requieren visita al centro de salud y 2,3 millones de casos requieren de hospitalización (35). En el año 2013, la infección por rotavirus se asoció con aproximadamente 200.000 muertes en niños menores de 5 años en todo el mundo (39). Aunque la prevalencia de la infección por rotavirus es mundialmente similar (30-50%), >90% de la mortalidad se asocia a países en vías de desarrollo, debido fundamentalmente al limitado acceso a los servicios básicos de salud, falta de las terapias de hidratación necesarias y una mayor prevalencia de otras condiciones como la desnutrición (40). Introducción ! 20! La infección por rotavirus se produce a edades más tempranas en los países en vías de desarrollo que en los países desarrollados, con tasas de hospitalización a los 8 meses de vida del 43% en África y 27% en Europa (40). Además, la estacionalidad se correlaciona con el nivel de vida de los países, con mayor numero de enfermedad estacional en países desarrollados que en países en vías de desarrollo (41). Figura 3: Mortalidad asociada a Rotavirus en niños menores de 5 años en el año 2013 La OMS estima que durante el año 2013, 215.000 niños menores de 5 años fallecieron a causa de una infección por rotavirus. Imagen obtenida de: http://www.who.int/immunization/monitoring_surveillance/burden/estimates/rotavirus/rotavirus_deaths_map_b.jpg?ua=1 Introducción ! 21! 1.3.1 Carga de la enfermedad por Rotavirus en Europa y en España Las muertes por diarrea asociada a rotavirus ocurren con menos frecuencia en las regiones industrializadas como Europa. A pesar del bajo número de muertes anuales, la carga de la enfermedad por rotavirus es considerable, con más de 87.000 hospitalizaciones y casi 700.000 consultas en centros de salud en niños menores de 5 años en los países industrializados. En los países europeos la infección por rotavirus también produce muertes, con 231 niños anualmente (42). Los rotavirus son la causa única más común de gastroenteritis en niños menores de 5 años de edad en Europa, donde es tres veces más probable la hospitalización que en gastroenteritis por otros causas (43) En Europa, las infecciones nosocomiales adquiridas por rotavirus afectan aproximadamente al mismo número de niños que las infecciones adquiridas en comunidad (44), alcanzando la cifra de hasta el 40% de las diarreas nosocomiales adquiridas en Polonia, Austria y Francia (42, 45, 46). Estudios desarrollados en Francia e Italia demuestran que más del 15% de los niños muestran sintomatología de la enfermedad tras el alta hospitalaria (47, 48). Los costes asociados a la infección nosocomial son considerables y forman parte de los principales costes hospitalarios asociados a la enfermedad por rotavirus en la región europea (45). En España, la carga de la enfermedad se considera elevada en relación con el resto de los países europeos (Tabla 1) con hasta 7 muertos al año, más de 7000 hospitalizaciones y más de 60.000 visitas a los centros de salud (42). Se estima Introducción ! 22! que el 31,6% de las admisiones hospitalarias por gastroenteritis son debidas al rotavirus con una tasa de hospitalización de 480 casos por cada 100.000 niños menor de 5 años y un coste hospitalario medio anual de 123.262 euros (49). Introducción ! 23! Tabla 1: Incidencia anual de la enfermedad por rotavirus en niños menores de 5 años en Europa Figura 4: Carga de la enfermedad por rotavirus en Europa y el Mundo La pirámide muestra el riesgo de sufrir la enfermedad por rotavirus de un niño antes de alcanzar los 5 añosen la Unión Europea y su comparación con el resto del mundo (Datos obtenidos de Parashar UD et al Emerg Infect Dis 2003 9(5) Introducción ! 24! 1.4 VACUNAS FRENTE AL ROTAVIRUS Desde el principio, el objetivo de la vacunación frente al rotavirus ha sido replicar el grado de protección frente a la enfermedad que sigue a la infección natural. Por tanto, los programas de vacunación se centraban en prevenir la enfermedad grave y/o moderada pero no necesariamente la enfermedad leve asociada con rotavirus. 1.4.1 Primeras estrategias ! Las primeras investigaciones para desarrollar una vacuna frente a rotavirus segura y eficaz comenzó durante los años 70 cuando se demostró que infecciones previas con cepas de rotavirus animales generaban protección frente a infecciones experimentales con rotavirus humanos (50). De este modo, se desarrollaron tres vacunas frente a rotavirus no humanas, dos de ellas con cepas de rotavirus bovinas RIT4237 con una cepa G6P6 (51) y WC3 con G6P7 (52), y una cepa de rotavirus de simio Rhesus RRV con G3P3 (53). Todas estas vacunas demostraron una eficacia variable durante los ensayos clínicos, pero obtuvieron resultados particularmente decepcionantes en los países en vías de desarrollo (54, 55). En el año 2001, China introdujo una vacuna frente a rotavirus para inmunización de niños basada en una cepa atenuada de cordero G10P12 desarrollada y producida por el Instituto Lanzhou, aunque la eficacia y los resultados del ensayo clínico no son conocidos. A la vista de los malos resultados obtenidos a partir de vacunas monovalentes basadas en cepas animales atenuadas, los esfuerzos se centraron en desarrollar cepas humanas atenuadas o cepas de rotavirus reasortantes animales- Introducción ! 25! humanas. La primera vacuna oral multivalente reasortante desarrollada fue RotaShield™ (RRV-TV), una vacuna tetravalente que contenía una mezcla de cuatro cepas virales G1 a G4 con genes reasortantes humanos-rhesus (56). RRV-TV demostró alta eficacia frente a las formas graves-moderadas de la enfermedad (80-100%) en los ensayos clínicos desarrollados en EEUU, Finlandia y Venezuela (57-59), y fue licenciada en agosto de 1998 para su uso rutinario en EEUU (60). Sin embargo, tras la inclusión de esta vacuna en el calendario de inmunización se reportaron varios casos de invaginación intestinal asociada a la vacuna (61) con mayor riesgo a los 3-10 días de la primera de las tres dosis (62). El riesgo de este efecto adverso de la vacuna se estimó en 1/10.000 niños vacunados (63) y hecho por el cual Rotashield™ fue retirado del mercado americano 14 meses tras su introducción y se detuvieron todos los ensayos que se estaban realizando en los demás países. 1.4.2 Vacunas actuales frente a Rotavirus ! ! Actualmente existen cuatro vacunas frente a rotavirus licenciadas por la OMS: Rotarix™ (GlaxoSmithKline, 2009), RotaTeq™ (Merck & Co, 2008) Rotavac™ (Bharat Biotech, 2018) y ROTASIIL™ (Serum Institute of India, 2018). Sin embargo, las dos ultimas en licenciarse Rotavac™ y Rotasiil™ actualmente solo se usan en India (ambas vacunas) y Palestina (Rotavac™). Adicionalmente, existen otras dos vacunas disponibles en el mercado privado nacional de Introducción ! 32! activación a través de la proteína viral NSP1 (103). En este sentido, la cepa de rotavirus humana Wa es muy eficiente bloqueando la translocación nuclear del NFKB (95) y limitando de este modo la inducción de varios tipos de IFN (91). 1.5.3 Acción de las células inmunes innatas en la infección ! Las células dendríticas han demostrado su importancia para resolver la infección por rotavirus y la protección frente a la re-infección en modelos murinos (104, 105). Tras la activación y maduración de las células dendríticas, éstas migran a las placas de Peyer intestinales y muestras signos de activación e inducción de citocinas (106). La activación de las células dendríticas se realiza tras detección del ARN viral por el receptor endosomal TLR7 que induce la expresión de IFN-a/b (107) Sin embargo aun no se ha determinado que subtipo de células dendríticas son importantes en controlar la replicación del rotavirus durante la infección in vivo. Además de estas células dendríticas, otras células fagocíticas, los macrófagos juegan un papel importante en el aclaramiento de la infección, aunque su papel exacto no ha sido aún esclarecido (108). Introducción ! 33! Figura 5: Detección de la infección por rotavirus e inducción de la respuesta inmune innata en las células epiteliales intestinales. Tras la entrada del RV en la célula, los sensores MDA5 y RIG-I detectan ARN viral y a través de proteínas mitocondriales de señalización antiviral (MAVS) inducen la activación de los factores de respuesta a IFN (IRF3/7) y la expresión de IFN-a/b. La infección por rotavirus también activa el factor de transcripción NFKB. Todos estos factores de transcripción se trasladan al núcleo donde induce la expresión de IFN y otras citocinas como IL-8. Se ha descrito también una vía alternativa de detección del rotavirus a través de TLR3 y su adaptador TRIF que conduce a la activación de IRF3/7 e inducción de IFN. Los efectos protectores del IFN están mediados por activación de la vía STAT1/2 y activación de los genes estimulados por IFN (ISG) e inhibición de la replicación del rotavirus a través de un mecanismo desconocido. La liberación de citocinas produce el reclutamiento de otras células inmunitarias al lugar de la infección. La proteína de rotavirus NSP1 puede interferir con la respuesta del IFN, degradando los factores IRF3/7. También algunos rotavirus inhiben la activación del factor NFKB a través de la degradación mediada por NSP1 de factores asociados a NFKB La infección por rotavirus previene la acumulación nuclear de las moléculas activadas STAT1/2 a través de un componente viral no identificado. Introducción ! 34! 1.5.4 Respuesta inmune humoral tras la infección por rotavirus ! En uno de los trabajos más importantes realizados hasta la fecha, Velázquez (37) en un seguimiento realizado durante 2 años a 200 niños sanos, estudió la respuesta inmune asociada a la infección por rotavirus. Según este trabajo, la primera infección por rotavirus típicamente resultaba en una GEA, sin embargo, la protección desarrollada frente a infecciones posteriores de rotavirus, el riesgo de desarrollar enfermedad descendía progresivamente, de forma que tras dos infecciones no se observaba enfermedad moderada o grave. La infecciones sintomáticas o asintomáticas conferían grados similares de protección (37, 109), resaltando la importancia de la infección asintomática por rotavirus en la protección frente al rotavirus (110). La inmunidad tras infección neonatal no confería protección pero en algunos casos evitaba el desarrollo de enfermedad grave (111). La primera evidencia de que la protección frente al rotavirus era específica de serotipo y se relacionaba con los niveles de anticuerpos neutralizantes homotípicos del virus provinieron de los estudios de Chiba et al (112). Otros estudios posteriores sugirieron que la inmunidad humoral frente al rotavirus se correlacionaba con protección (113, 114). Tras la primera infección por rotavirus en niños se encontraban respuestas de anticuerpos neutralizantes homotípicas y heterotípicas, lo que sugería la presencia de epítopos neutralizantes crossreactivos (78, 115). Aquellos niños con respuestas heterotípicas tendían a ser de mayor edad y tenían anticuerpos frente a rotavirus pre-existentes (112). Introducción ! 35! Posteriormente se investigó en muestras de heces la presencia de anticuerpos IgA específicos frente a rotavirus y se demostró que a niveles altos correlacionaba muy bien con protección (116, 117). Los anticuerpos IgA séricos específicos frente a rotavirus también mostraban actividad neutralizante y reaccionaban con epítopos que inducían protección heterotípica (118). Los anticuerpos maternos adquiridos transplacentariamente podían conferir cierto nivel de protección frente al rotavirus en los primeros meses de vida (119) La lactancia materna proporciona protección pasiva a través de mecanismos más allá de los anticuerpos (120, 121). Sin embargo, a pesar de la importancia de las respuesta inmunes especificas frente a rotavirus, la protección tras la infección natural no necesariamente se correlaciona con la presencia de anticuerpos neutralizantes serotipo-específicos (122) Las proteínas de rotavirus VP2 y VP6 aunque no generan anticuerpos neutralizantes portan epítopos inmunodominantes y se han encontrado anticuerpos dirigidos frente a estos antígenos en muestras de sueros de individuos convalecientes (123), así como anticuerpos frente a NSP2 y NSP4 (124-126) El significado clínico de estos anticuerpos específicos noneutralizantes es desconocido. 1.5.5 Respuesta inmune celular ! La infección natural por rotavirus no es gran inductora de la secreción de citocinas ni de células CD8+ específicas frente al virus (127) aunque estas células pueden detectarse en circulación in la mayoría de los adultos (128) Del Introducción ! 36! mismo modo se detectan células CD4+ específicas frente a rotavirus circulantes en muestras de sangre de niños en la fase de convalecencia (129) Las células dendríticas han demostrado tener capacidad de secretar citocinas Th1 tras la infección por rotavirus (106) aunque son menos eficientes en la presentación de antígenos en individuos jóvenes que en adultos (127). El papel de las respuestas inmunes mediadas por células en la protección frente a la infección por rotavirus en humanos está aun por clarificar (78). 1.5.6 Respuesta inmune tras la vacunación ! La inmunidad heteróloga desarrollada en terneros tras la vacunación con cepas de rotavirus bovinas frente a cepas humanas constituyó la base para el uso de cepas bovinas como los primeros candidatos vacunales humanos frente a rotavirus (130, 131) Aunque esta cepa de virus bovina no compartía epítopos neutralizantes con las cepas humanas conocidas, inducía una potente respuesta protectora heterotípica (132) Posteriormente se demostró que no solo los niveles de anticuerpos neutralizantes frente a rotavirus representaban el correlato de protección y se desarrollaron otros conceptos diferentes de vacunación basándose en vacunas reasortantes multivalentes que contenían moléculas de VP4 y VP7 representativas de las cepas humanas circulantes (base para las vacunas RotaShield™ y RotaTeq™) (65, 131). En contraste, la vacuna monovalente de serotipo G1P8 único (Rotarix™) se desarrolló en base a la generación de la respuesta inmune heterotípica producida en el curso de sucesivas infecciones naturales (37). Introducción ! 37! Ambas estrategias de vacunas frente a rotavirus han demostrado excelentes tasas de protección, particularmente frente a enfermedad grave que requiere hospitalización (69, 133) y han demostrado desarrollar inmunidad homotípica y heterotípica (78) La protección que generan ambas vacunas correlaciona la mayoría de las veces pero no siempre con los niveles de anticuerpos IgG o IgA específicos frente a rotavirus, pero no así con los niveles de anticuerpos neutralizantes específicos (134) Así, los anticuerpos neutralizantes específicos para la proteína VP7 (serotipo G) generados por la vacuna pentavalente RotaTeq™ son demasiado bajos para el elevado nivel de protección que generan. Además, individuos con deficiencia selectiva IgA se encuentran protegidos de la enfermedad grave a través de una respuesta compensatoria IgG especifica que es mayor que la que se genera en individuos IgA competentes. En el suero de individuos vacunados se encuentran anticuerpos IgA neutralizantes específicos de rotavirus que reconocen epítopos específicos de VP4 y VP7 y que han demostrado producir una amplia inmunidad heterotipica (118) Del mismo modo, se ha propuesto como posible correlato de protección de la vacunación niveles de células plasmáticas o células B especificas frente a rotavirus que portan receptores de migración intestinales (135). Con relación a la inmunidad celular proporcionada por las vacunas de rotavirus hay muy poca información disponible. Se conoce que los individuos vacunados muestran células dendríticas circulantes capaces de estimular células T específicas frente a rotavirus y producir citocinas Th1 (9) Asimismo, niños Introducción ! 38! afectados con inmunodeficiencia severa combinada pueden desarrollar GEA tras la vacunación con rotavirus (136) 1.6 CORRELATOS DE PROTECCIÓN PARA LAS VACUNAS FRENTE A ROTAVIRUS Aunque las vacunas actuales frente a rotavirus han demostrado ser altamente efectivas en la prevención de la enfermedad grave por diferentes tipos de rotavirus, el mecanismo de protección generado no está del todo claro (79) Tras la vacunación se ha observado en todo el mundo la generación de inmunidad homotípica y heterotípica, pero el nivel hasta el que esta protección heterotípica puede alcanzar comienza aun a ser explorado, especialmente en los países en vías de desarrollo (78) La vigilancia epidemiológica que se lleva a cabo en los países con programas de vacunación revelarán el grado en que esta protección heterotípica afecta a la diversidad de las cepas de rotavirus y si las variaciones en esta diversidad es atribuible a la fluctuación natural o representan especies nuevas de rotavirus que consiguen escapar a la presión de los programas de vacunación (137) Hay una necesidad urgente en determinar los mecanismos y correlatos de protección de las respuestas inmunes especificas frente al rotavirus en humanos que puedan ser adquiridas a través de la infección natural o tras la vacunación. Sobre todo, porque se ha demostrado que la efectividad de las vacunas depende, al menos en parte del estatus socioeconómico de los países (138-140) Introducción ! 39! 1.6.1 RV-sIgA como correlato de protección Hasta la fecha se han propuesto varios mecanismos de protección generados tras la vacunación que se resumen en la Figura 6. En la gran mayoría de los ensayos clínicos realizados hasta la fecha se ha empleado la inducción de IgA séricas específicas de rotavirus (RV-sIgA) como marcador de respuesta vacunal (141-144) y a mayores se han reportado los títulos de anticuerpos neutralizantes serotipo-específicos en algunos ensayos clínicos (revisado en (81) De este modo, la respuesta a la vacuna se expresa en tasas de seroconversión o como el porcentaje de niños con aumento de título de anticuerpos en al menos tres veces sus niveles basales. La revisión sistemática del valor de los anticuerpos RV-sIgA como correlato de eficacia de la vacuna demostró que tanto el nivel de protección como el mantenimiento de esta tras la vacunación era menor en aquellos individuos con menor tasa de seroconversión y que las tasas de mortalidad infantil en <5 años mostraba una correlación inversa con los títulos de IgA (138) En un estudio reciente se ha demostrado la correlación entre el nivel de anticuerpos unidos al fragmento secretor (tanto IgA como IgM) y el nivel de protección frente a la enfermedad, mostrando así una vínculo entre inmunidad mucosa y enfermedad (145) Introducción ! 40! Sin embargo, la medición de los títulos de RV-sIgA no proporciona ninguna información acerca de las proteínas de rotavirus diana de la protección heterotípica. Se han sugerido epítopos crossreactivos de VP4 y VP7 no neutralizantes o antígenos incluidos en la proteína VP6 como posibles candidatos (79) Anticuerpos específicos frente a VP6 se han demostrado a altos niveles tras la infección natural y la vacunación (146, 147) Está claro que anticuerpos frente a VP6 son los anticuerpos más comunes producidos por las Figura 6: Mecanismos propuestos de inmunidad mediada por anticuerpos frente al rotavirus. (1) Células plasmáticas presentes en la mucosa intestinal incluyen poblaciones (2) secretoras de IgA e IgG monomérica que pueden ser detectadas en circulación en gran proporción (3) secretoras de IgA diméricas (unidas por la cadena J) que de igual modo pueden ser detectadas en sangre. (4) IgA dimérica (y también IgM pentamérica) interactúan con el receptor de poli-inmunoglobulina (pIgR) en la superficie basolateral del enterocito y por transcitosis a la superficie apical (5) La IgA dimérica es liberada al lumen intestinal por proteólisis unida al componente secretor. Su función en el lumen intestinal es unirse al rotavirus y producir la exclusión de la mucosa intestinal y prevenir la infección. (6) Copro-IgA puede ser detectada en las heces y se correlaciona ocn los niveles en el duodeno proporcionando un marcador de inmunidad en el lugar de la infección (7) IgA secretora también puede ser detectada en suero a través de un mecanismo de retro-transcitosis a través de la mucosa intestinal y puede representar un reflejo de la inmunidad intestinal (8) Durante la transcitosis, anticuerpos frente a VP6 también pueden unirse al rotavirus una vez la proteína VP6 es expuesta durante la replicación viral, lo que resulta en expulsión viral (9) Anticuerpos frente a VP6 también inhiben la transcripción viral Introducción ! 41! células B especificas frente a rotavirus, dada la gran inmunogenicidad de esta proteína (104, 148) Estos anticuerpos han demostrado en modelos animales capacidad de actuar intracelularmente, bloqueando el paso del virus a través de la mucosa y expulsando al virus de la mucosa intestinal (149) Además también han demostrado capacidad para inhibir la transcripción viral lo que explicaría también su efecto antiviral (150-152) Sin embargo estos anticuerpos han demostrado no ser protectores en cerdos a pesar de ser producidos localmente en la mucosa intestinal. Por tanto, está pendiente de determinar en humanos su papel funcional en la inmunidad heterotípica (153) De igual modo, anticuerpos frente a la enterotoxina viral NSP4 han mostrado conferir protección en modelos murinos pero no así en cerdos (154) Finalmente, anticuerpos que bloquean la interacción entre el virus y su receptor en la mucosa intestinal (HBGA, histoblood group antigens) evitando el anclaje inicial han demostrado conferir protección frente a la infección por norovirus y por tanto debería ser explorado su papel como correlato de protección frente a la infección por rotavirus (155) Introducción ! 48! De todos ellos los sistemas más complejos y mejor organizados son los tres primeros BALT, GALT y NALT que actúan a su vez de principales sitios inductores (172-174) Destaca el sistema de la mucosa asociado al sistema gastrointestinal (GALT) por su organización y complejidad y por constar de tejido linfoide organizado similar a un ganglio linfático y denominado Placas de Peyer, Figura 7: Esquema de funcionamiento de la respuesta inmune en el sistema inmune mucoso con los sitios inductores y efectores. Los antígenos administrados a través de los sitios inductores (Mucosa intestinal, Tejido Linfoide Bronquial y Tejido Linfoide Nasal) activan las células inmunitarias en los ganglios linfáticos regionales (p. ej. Placas de Peyer en mucosa intestinal) donde se generan células inmunes efectoras que viajan a través de la sangre periférica y la red linfática ganglionar hacia el resto de las mucosas del organismo, que actúan como sitios efectores, proporcionando la defensa global frente al antígeno. GALT: Gut-associated lymphoid tissue; BALT: Bronchial-associated lymphoid tissue; NALT: Nasal-associated lymphoid tissue Introducción ! 49! que actúan como sitios inductores principales (172) Desde estos sitios inductores donde se inicia la respuesta inmunitaria se transportaran las células efectoras (células B-IgA, células T CD4+) hacia los sitios efectores del resto de los tejidos mucosos. Podemos hablar por tanto de un sistema perfectamente organizado de tráfico celular entre los lugares donde se inicia la respuesta inmune (sitios inductores) hacia los lugares donde se produce la respuesta efectora (sitios efectores) (174) (Figura 8) Introducción ! 50! Figura 8: Diagrama esquemático del funcionamiento del sistema inmune de la mucosa organizado en sitios inductores y efectores. Se muestra el tráfico celular a partir de los sitios de inductores principales GALT, NALT y BALT hacia los sitios efectores que comprenden los demás sistemas de la mucosa. Adaptado a partir de Otczyk C & Cripps AW Human Vaccines 2010 6(12) Introducción ! 51! 1.8 ROTAVIRUS COMO ENFERMEDAD SISTÉMICA: “ROTAVOLUTION” Durante muchos años la patología del rotavirus se consideraba una enfermedad limitada solo al tracto gastrointestinal y carente de interés para la gran mayoría de la comunidad científica. Sin embargo, evidencias recientes sobre las implicaciones sistémicas de la infección por rotavirus han hecho reconsiderar el interés por esta patología (175). Actualmente está claro que rotavirus va más allá de una simple infección gastrointestinal. El término clásico de gastroenteritis aguda (GEA) por rotavirus está siendo reemplazado por el den “enfermedad por rotavirus” lo que refleja las implicaciones sistémicas de la infección (176). Estamos, por tanto, antes una auténtica revolución (“rotavolution”) de la percepción clínica tradicional de la infección por rotavirus, ayudado por el recientemente demostrado impacto de las vacunas más allá de la patología gastrointestinal (177) y el hecho de que la diarrea no es necesaria para el diagnostico de la infección por rotavirus dado que un importante porcentaje de pacientes con rotaviremia no presentan clínica intestinal (178). El espectro clínico de la infección por rotavirus es actualizado cada año, con una creciente evidencia que apunta hacia una conexión entre la infección por rotavirus y el desarrollo de ciertas enfermedades autoinmunitarias en individuos genéticamente predispuestos (177) Esta recopilación de manifestaciones extra intestinales nos lleva a proponer un modelo “iceberg” para la enfermedad por rotavirus, donde la parte visible serían las manifestaciones clínicas típicamente Introducción ! 52! asociadas con la patología intestinal (vómitos, diarrea y deshidratación) mientras que la parte oculta comprendería todas las manifestaciones extra intestinales relacionadas como las convulsiones o el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias, pasando por la infección asintomática sin presencia de diarrea (177) (Figura 9) Figura 9: Modelo de iceberg para la infección por rotavirus. Diarrea, vómitos y deshidratación son solo la parte más visible y reconocible de la enfermedad por rotavirus, pero en la gran mayoría de las veces se produce una diseminación viral que puede desencadenar en una serie de manifestaciones extra intestinales ocultas como son las convulsiones o el desarrollo de patología autoinmunitaria en individuos genéticamente susceptibles. Imagen obtenida de Gómez-Rial J et al Infect and Drug Resist 2019 Introducción ! 53! La implementación de las vacunas frente a rotavirus durante la ultima década ha producido además de un descenso significativo de la patología intestinal moderada o grave (179), también ha impactado sobre las manifestaciones extra intestinales asociadas a rotavirus en una forma que estamos empezando aún a comprender. Tras el trabajo inicial de Payne demostrando una reducción de las hospitalizaciones por convulsiones tras la incorporación de la vacunación frente al rotavirus en USA (180) continuaron otros grupos mostrando resultados en la misma línea (181-186). No solo se ha demostrado impacto de las vacunas sobre el desarrollo de convulsiones; en los últimos años diversos estudios han encontrado un efecto protector de la vacuna en el desarrollo de patología autoinmunitaria como la enfermedad celíaca (187, 188) y diabetes mellitus tipo 1 (189, 190) demostrando unos efectos bien heterólogos o bien directos hasta ahora desconocidos y que darán mucho que hablar durante los próximos años. Justificación ! 54! 2 JUSTIFICACIÓN DE LA TESIS Actualmente, los mecanismos de protección frente al rotavirus bien sean de forma natural o a través de la vacunación, son solo parcialmente conocidos y no se encuentran claramente definidos. Sabemos que la exposición repetida al virus, ya sea de forma natural o a través de dosis sucesivas de vacuna, genera protección. Sin embargo, los mecanismos implicados son prácticamente desconocidos, o extrapolados de otras patologías, y no se dispone de biomarcadores específicos contrastados, ni de protección clínica, ni de inmunidad natural o inducida por vacunación, que sean reproducibles y útiles. No existe actualmente una correlación entre el nivel de protección y los títulos de anticuerpos neutralizantes serotipo-específicos generados tras la vacunación. La tasa de seroconversión, sobre todo en países en vías de desarrollo, no se corresponde con el nivel de protección, por lo que es necesario la búsqueda de correlatos de protección alternativos a los actuales. En esta búsqueda se debería considerar el compartimento de la mucosa y el componente celular de la respuesta inmunitaria, pobremente estudiado en la protección frente al virus. Por otro lado, hoy sabemos que nuestra respuesta inmune es el resultado de la activación coordinada de cientos-miles de genes que pueden ser detectados con gran precisión y de modo indiferente en el genoma mediante perfiles de expresión de ARN mensajero mediante análisis transcriptómicos. Se reconoce Justificación ! 55! que los genes que están regulados de forma diferencial en estas respuestas especificas funcionan dentro de redes altamente reproducibles que pueden ser detectadas dentro de un conjunto de datos de expresión mediante el uso de algoritmos apropiados. Mediante esta estrategia se permite entender mejor la interacción entre los antígenos, tanto naturales como vacunales, y nuestro sistema inmunitario, y permite identificar nuevos biomarcadores diferenciales de respuesta inmune o protección clínica que permitan guiar el desarrollo de nuevas vacunas frente a rotavirus. El reconocimiento de los mecanismos de acción concretos del sistema inmunitario frente a la infección y la vacunación nos permitirá aumentar la capacidad de hacer mejores racionales en el espectro de vacunas actuales y futuras, no solo en fases preclínicas y clínicas, sino durante su implementación poblacional, permitiendo incluso plantearse la vacunación individualizada en función de los marcadores de protección natural o vacunal identificados, con los consiguientes ahorros tanto en el proceso de desarrollo vacunal como en su aplicación poblacional a gran escala. Por ello, la finalidad del presente trabajo de tesis es profundizar desde una perspectiva “-ómica” en el estudio de la infección natural y la vacunación por rotavirus. Para ello hemos realizaremos un abordaje transversal de evaluación de la respuesta inmune desencadenada mediante la infección natural o mediante la vacunación frente al rotavirus, basado en la inmunogenómica y la vacunómica. Objetivos ! 56! 3 OBJETIVOS El presente trabajo de tesis persigue los siguientes objetivos: 1. Caracterizar la respuesta inmune natural y artificial frente al rotavirus 2. Búsqueda de correlatos de protección en las vacunas frente a rotavirus 3. Caracterización de la huella transcriptómica de la enfermedad natural y de la vacunación frente a rotavirus 4. Identificación de biomarcadores predictivos de gravedad en la infección por rotavirus Material y Métodos ! 57! 4 MATERIAL Y MÉTODOS En el desarrollo del presente trabajo de investigación se han empleado los siguientes materiales y métodos: 4.1 Sujetos del estudio Para la realización de este trabajo de investigación se reclutaron un total de 148 sujetos de los cuales 27 pertenecían a la cohorte de paciente infectado y 121 pertenecían a la cohorte de paciente vacunado. Los diferentes experimentos se han realizado sobre el total o subgrupos de pacientes pertenecientes a ambas cohortes. Dependiendo del experimento llevado a cabo, se utilizaron distintas muestras biológicas de los pacientes y en tiempos de muestreo diferentes (ver detalles en el siguiente apartado). El reclutamiento tuvo lugar durante el período 2013-2015. 4.1.1 Criterios de inclusión y exclusión en el estudio ! Se aplicaron diferentes criterios de inclusión/exclusión en función de la cohorte: a) Sujetos cohorte vacunados Los sujetos de esta cohorte fueron reclutados en la unidad de ensayos clínicos del Servicio de Pediatría del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela. Se consideró elegible para el presente estudio cualquier niño sano que acudía para recibir la vacuna pentavalente del rotavirus siguiendo las indicaciones de la ficha técnica de la vacuna. Durante el período de duración del estudio solo la vacuna pentavalente frente a rotavirus (Rotateqâ) estaba autorizada por las autoridades sanitarias. Material y Métodos ! 64! de la longitud del gen) y por millón de lecturas (dependiente del tamaño de la librería). La información de los genes representada por los perfiles transcriptómicos obtenidos en el presente estudio ha sido obtenido empelando Gene Ontology (GO) (196, 197). El análisis de enriquecimiento fue llevado a cabo empleando la Enciclopedia Kyoto de genes y genomas (KEGG) (198). Los patrones de expresión fueron codificados empleado un método de clasificación de genes basado en distribución hipergeométrica (199) 4.5.2.4 Análisis de componentes principales ! Se hizo un análisis de componentes principales (PCA) s para mejorar la visualización de los patrones de transcriptoma global de los datos de ARN-seq en casos y controles. El PCA permite la inspección de patrones diferenciales de expresión entre muestras e identificación de posibles outliers, así como facilitar las decisiones con relación al análisis basado en clusters de muestras. El PCA se realizó empleando la librería adegenet (200) del software estadístico R (http://www.rproject.org) 4.5.2.5 Inferencia de redes ! La inferencia de redes reguladoras empleándose hizo empleando el software GeneMANIA (v 3.2.1; http://www.genemania.org) Este software usa un gran conjunto de datos funcionales de interacciones Material y Métodos ! 65! para encontrar genes que están relacionados con un conjunto de genes de entrada (201) 4.5.3 Determinación de RV-IgA en muestras de suero y saliva mediante ELISA directo El método para determinación de anticuerpos anti-IgA específicos frente a rotavirus empleado se adaptó del previamente descrito por Friedman (202). El antígeno salvaje de rotavirus (106 PFU) se capturó en placas de poliestireno afinidad intermedia Greiner Bio-one Microlone (Fisher Scientific) incubando toda la noche a 4ºC en tampón de captura NaHCO3 pH 9,5. Tras lavado de exceso de antígeno de rotavirus con tampón de lavado fosfato salino-albumina sérica bovina (PBS-BSA) 1% se bloquean los pocillos con PBS-BSA 5% durante 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras de suero y saliva se incuban en los pocillos a una dilución 1:25 y 1:10 respectivamente en PBS-Tween20 0.1%-BSA 1% durante 24 horas a 4ºC. Tras los lavados, se incuban los pocillos durante 1 hora con anticuerpo monoclonal específicos frente a IgA Goat Anti-Human IgAHRP (abcam ab97215, Cambridge, UK) diluido 1/100 en PBS-Tween20 0.1%-BSA 1% seguido de revelado con solución 3,3',5,5'- Tetramethylbenzidine (TMB) (Sigma-Aldrich CL07) y deteniendo la reacción a los 30 minutos con solución Stop (Sigma-Aldrich S5814) La lectura en el espectrofotómetro se realizó a una longitud de onda de 450nm Material y Métodos ! 66! 4.5.4 Determinación por multiplexado de citocinas en suero y saliva mediante xMAPLuminexâ El ensayo para detección de citocinas se realizó mediante el kit Human Map Miliplex HCYTOMAG-60K (Merck Millipore, Billerica, MA). El panel de citocinas estaba constituido por Interferon-alpha2 (IFN-a2), interleucina-8 (IL-8), interleucina-1beta (IL-1b), interleucina-10 (IL-10), interleucina-15 (IL-15), interleucina-12 subunidad p70 (IL-12p70), factor de necrosis tumoral-alpha (TNF-a), interferón-gamma (IFN-g) e interleucina6 (IL-6) Los ensayos se llevaron a cabo en la plataforma Luminexâ 200. Tras reconstituir las microesferas siguiendo las indicaciones del kit se prepara el coctel de microesferas, así como los estándar y controles correspondientes. Se incuban 25 µl de suero o saliva (netos, sin diluir) junto con 25 µl de solución tampón y 25 µl del coctel de microesferas. Se incuba durante toda la noche a 4ºC y tras los consiguientes lavados se añaden 25 µl de Anticuerpo de detección incluido en el kit y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se añaden 25 µl de solución de Ficoeritrina-Estreptavidina y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras el lavado final se añaden 150 µl de líquido de sistema Labscan y se realiza la lectura en el equipo Luminexâ200. Para el análisis de los datos obtenidos se emplea el software de análisis xPONENTâ del equipo que transforma los valores de intensidad media de fluorescencia (MFI) en unidades de concentración empleando el Material y Métodos ! 67! análisis de regresión logística de 5 parámetros que recomienda el fabricante. Finalmente se aplica el factor de dilución empleado para el cálculo del valor final. Para la detección del interferón-lambda (IFN-l) y la interleucina-22 (IL-22) se empleó un kit ELISA Duoset (R&D Systems, Minneapolis, MN) consistente en anticuerpos de captura y detección específicos, así como las proteínas estándar recombinantes correspondientes. En primer lugar, se transfieren 100 µl del correspondiente anticuerpo de captura a una placa de ELISA Greiner Bio-one Microlone (Fisher Scientific) de afinidad intermedia. Se incuba toda la noche a temperatura ambiente y al día siguiente se aspiran los pocillos y se lava tres veces con el tampón de lavado que incluye el kit. Tras este proceso, se bloquea la placa con 300 µl de tampón de bloqueo incluido en el kit durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas ya están listas para ser incubadas con las muestras de suero y saliva (netos, sin diluir) y los correspondientes estándar durante 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras se incuban con 100 µl del anticuerpo biotinilado de detección durante 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, se añaden 100 µl de StrepatavidinaPeroxidasa durante 30 minutos a temperatura ambiente evitando la luz directa sobre la placa. Tras el tiempo de incubación se lava la placa y se añaden 100 µl de la solución sustrato incluida en el kit durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detiene añadiendo 50 µl de solución Stop a cada pocillo y se agita la placa para una correcta homogenización de la solución. La lectura de la absorbancia se realiza en Material y Métodos ! 68! un espectrofotómetro a 450 nm, con corrección a 540 nm para eliminar interferencias. Los valores de densidad óptica (DO) obtenidos son extrapolados mediante análisis logístico de 4 parámetros a partir de la curva de concentración estándar realizada para obtener, tras aplicar el factor de corrección empleado, el valor final de concentración de cada muestra. 4.5.5 Evaluación de la respuesta inmune celular mediante ensayo de estimulación en sangre completa (WBS, whole blood stimulation assay) El método empleado es adaptado del protocolo descrito por Thurm & Halsey (203) descrito a continuación: 1 ml de sangre completa heparinizada se diluyó 1:5 en RPMI1640 (Gibco, Grand Island, NY) y se distribuyó en cuatro tubos polipropileno de 15 ml (Fisher Scientific, Grand Island, NY) y fueron estimulados durante 24 horas (a 37ºC en atmosfera 5% CO2) con 10µg/ml de Fitohemaglutinina (PHA, a partir de Phaseolus vulgaris, Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 5µl solución rotavirus salvaje (10x106 PFU/ml de cepa Wa-1 cultivada en células MA104) y 5µl solución rotavirus vacunal (RotaTeqâ, conteniendo reasortantes de rotavirus humano-bovinos producidos en células Vero, ~10x106 PFU) y 5µl RPMI como control de estimulación basal. La sangre fue estimulada siempre dentro de las 4 horas tras la extracción. Tras el período de incubación las muestras fueron centrifugadas a 2000g durante 10 minutos y los sobrenadantes almacenados a -80ºC. La fracción celular restante se Material y Métodos ! 69! sometió a criopreservación para posteriores estudios de citometría de flujo. Posteriormente, los sobrenadantes fueron analizados para determinación múltiple de citocinas mediante procedimiento descrito en el punto 5.4 con el kit Human Map Miliplex HCYTOMAG-60K (Merck Millipore, Billerica, MA) a una dilución de la muestra 1:10 en plataforma Luminexâ200. 4.5.6 Criopreservación de sangre completa ! La fracción celular resultante tras los ensayos de estimulación en sangre completa se sometió a criopreservación para posteriores estudios de citometría de flujo mediante método descrito por Paredes et al (204) La fracción celular (500 µl) se transfiere lentamente a crioviales de 1,8 ml conteniendo 500µl de medio de congelación (90% Suero Ternera Fetal + 10% DMSO (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) en frío. La solución resultante se mezcla mediante inversión y se colocan en recipiente Corning de congelación CoolCell (Fisher Scientific, Grand Island, NY) a -80ºC Previo a los estudios de citometría de flujo, los crioviales serán descongelados por inmersión en baño maría a 37ºC hasta su completa descongelación. 4.5.7 Análisis de expresión de marcadores de activación en superficie celular mediante citometría de flujo Material y Métodos ! 70! La sangre completa descongelada se reparte (100µl) en tubos de poliestireno 12x75mm y se incuba con los siguientes Anticuerpos Monoclonales de Becton Dickinson (Bergen, JE): CD45 PerCP-Cy5.5 (clon 2D1), CD69 FITC (clon L78), CD3 APC (clon SK7), CD4 PE (clon SK3), CD8 PE (clon SK1), CD16 PE (clon B73.1), CD56 APC (clon NCAM16) empleando las siguientes combinaciones: CD69-FITC+CD4PE+CD3-APC+CD45-PerCP (células T CD4+); CD69-FITC+CD8PE+CD3-APC+CD45-PerCP (células T CD8+); CD69-FITC+CD16PE+CD56-APC+CD45-PerCP (células Natural Killer). Se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. Tras la incubación se añaden 2 ml de Solución de Lisis 1x (Becton Dickinson, Bergen JE) y se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos. Al finalizar el periodo de incubación se centrifugan los tubos a 350g durante 5 minutos y se descarta el sobrenadante. Se realiza un lavado con 3 ml de PBS, y se vuelve a centrifugar a 350g durante 5 minutos. Tras el lavado se resuspende el pellet celular en 500 µl de PBS y se analizaron en citómetro de flujo BD FACSCalibur empleando el programa CellQuest para adquisición y análisis de fluorescencia. Se analizó sobre la población de células que expresaban el marcador CD45, la proporción de células TCD4+, células T-CD8+ y células Natural Killer CD16+CD56+ que expresaban el marcador de activación CD69. 4.5.8 Inmunoblotting sobre electroforesis bidimensional de proteínas de rotavirus ! 4.5.8.1 Preparación del extracto proteico de rotavirus ! Material y Métodos ! 71! Se centrifugó 1 ml de suspensión de rotavirus salvaje (10x106 PFU/ml) a 5000 g durante 5 minutos y resuspender el pellet en mismo volumen de tampón de lavado 2-D (Bio-Rad, Múnich GE) calentado a 37ºC. Se repitió este proceso tres veces para eliminar proteasas extracelulares. Posteriormente se añadieron 150 µl de tampón de solubilización SDS a 95ºC al pellet y se sometió a un vortex. Tras la homogenización se realizó sonicación de la muestra 10 veces durante 1 segundo a 60W y 20kHz y se incubó la solución a 95ºC durante 5 minutos. Al finalizar el periodo de incubación se enfrió la muestra a 20ºC y se diluyó con 500 µl de tampón de muestra 2-D (Bio-Rad, Múnich GE) Se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos tras lo cual se centrifugó la muestra a 14000g durante 30 minutos a 20ºC y se recogió el sobrenadante proteico. Se ajustó la concentración de proteínas virales a aproximadamente 5 µg/µl 4.5.8.2 Purificación de la muestra ! Se empeló el kit ReadyPrepâ2-D Cleanup Kit de BioRad para eliminar posibles contaminantes en la muestra. Se transfirieron 100 µl de la solución proteica en un tubo microcentrífuga 1,5 ml y se añadieron 300 µl del agente precipitante 1. Tras la homogenización de la solución, se incubó en hielo durante 15 minutos. Posteriormente se añadieron 300 µl del agente precipitante 2 a la mezcla y se homogenizó vigorosamente. Se centrifugó el tubo a 12000g durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante usando una pipeta. Se añadieron 40 µl de reactivo de lavado 1 al pellet y se centrifugó el tubo a 12000g durante Material y Métodos ! 72! 5 minutos. Se descartó el sobrenadante y se añadieron 25 µl de agua ultrapura ReadyPrep (BioRad Múnich GE) al pellet proteico. Se añadieron 1 ml de reactivo de lavado 2 enfriado a -20ºC y 5 µl de aditivo de lavado. El tubo se sometió a un vortex durante 1 minuto para homogenizar la solución y posteriormente se incubó a -20ºC durante 30 minutos. Tras el periodo de incubación se centrifugó el tubo a 12000g durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante. Se dejó secar el pellet proteico al aire durante 5 minutos, tras lo cual se resuspendió el pellet en tampón de rehidratación 2-D 4.5.8.3 Isoelectroenfoque (IEF) ! Se empleó el sistema PROTEAN i12â de BioRad para realización de la primera separación proteica mediante isoelectroenfoque (IEF) siguiendo las instrucciones del proveedor. Se introdujo un volumen equivalente a 100 µgr de proteínas de rotavirus resuspendidos en tampón de rehidratación 2-D en el gradiente de pH inmovilizado (IPG ReadyStrips, 7 cm, pH 3-10, BioRad) en el sistema de IEF. Durante la rehidratación activa a 50 V, 20ºC durante 16 horas, la corriente se limitó a 70 µA. Se ajustó el protocolo de gradiente de IEF según instrucciones del proveedor (1: mantener a 150V durante 1 hora; 2: mantener a 300V durante 1 hora; 3: subida a 1000 V en 1 hora; 4: subir a 3000 V en 2 horas; 5: mantener a 3000 V durante 2 horas) a una temperatura de 20ºC Material y Métodos ! 73! 4.5.8.4 Electroforesis en gel ! Tras el IEF, las proteínas se redujeron directamente en tampón de muestra, conteniendo 50mM DTT. Para la separación de las proteínas en la segunda dimensión, las tiras de IPG se colocaron en la parte superior del gel de poliacrilamida (4%-12%, 1.0 mm) empleando 4 µl de Estándar de Proteínas (Dual Color Protein Standard III, Serva) como marcador de peso molecular. La electroforesis se desarrolló en tampón XT-MES (BioRad, Múnich GE) a 180V. 4.5.8.5 Inmunoblotting ! El gel resultante se equilibró en tampón XT-MES durante 10 minutos, tras lo cual las proteínas fueron transferidas a una membrana de PVDF (Millipore, Darmstadt, GE) en tampón de transferencia en un sistema XCell II Blot (Thermo Fisher Scientific) a 30V durante 15 minutos. Tras la transferencia, la membrana de PVDF se bloqueó durante 30 minutos en tampón de bloqueo EveryBlot (BioRad, Múnich GE) tras lo cual se incubó durante 24 horas con pool de suero pacientes diluido 1:500 en tampón de bloqueo. Tras el periodo de incubación, la membrana de PVDF fue lavada cinco veces durante 5 minutos en PBS-Tween20 0,1%. El anticuerpo secundario usado fue el IRDye 800 CW Goat antihuman IgA (LI-COR) La membrana fue digitalizada empleando un escáner Odyssey de infrarrojo cercano (LI-COR) a 800 nm longitud de onda. Resultados ! 80! El porcentaje de individuos que mostraron seroconversión con GMFR ³ 1 para muestra de saliva fue 77,58% (45/58) para el grupo de Fórmula, 61,53% (24/39) para el grupo de Materna y 50,00% (12/24) para el grupo de Materna/Fórmula. En las muestras de suero el porcentaje de individuos que mostraron seroconversión con GMFR ³ 3 fue 89,65% (52/58) para el grupo de Fórmula, 87,17% (34/39) para el grupo de Materna y 91,66% (22/24) para el grupo de Materna/Fórmula. Datos representados en el siguiente gráfico: Estos datos muestran que la lactancia materna no afecta a la tasa de seroconversión medida en el suero, pero si afecta a la tasa de seroconversión medida en saliva, debido a la propia interferencia de los Ac anti RV-IgA presentes en la leche materna y que son detectados en la muestra de saliva del niño. Esta interferencia se presenta en todas las muestras de saliva obtenidas durante la lactancia materna (Pre-dosis1/Post-Dosis 3 en el grupo Materna y Pre-Dosis 1 Gráfica 3: Representación de las diferencias en los valores de seroconversión en saliva (GMFR ³ 1) y suero (GMFR ³ 3) según el tipo de lactancia GMFR: Geometric Mean Fold Rise Formula Materna Materna/Formula 0 20 40 60 80 100 % Seroconversión GMFR ≥ 1 Seroconversión (saliva) según lactancia Formula Materna Materna/Formula 0 20 40 60 80 100 % Seroconversión GMFR ≥ 3 Seroconversión (suero) según lactancia 77,58% (45/58) 61,53% (24/39) 50,00% (12/24) 89,65% (52/58) 87,17% (34/39) 91,66% (22/24) Resultados ! 81! en el grupo Materna/Fórmula) no permitiendo realizar un cálculo correcto de la tasa de seroconversión en estos grupos. En cuanto a los valores de GMT obtenidos en los diferentes grupos de lactancia, se representan en la siguiente Gráfica 4: pre-dosis1 post-dosis3 pre-dosis1 post-dosis3 0 100 200 300 GMT RV-IgA Vacunados (Formula) Saliva Suero GMFR.=.1,65 GMFR.=.8,00 pre-dosis1 post-dosis3 pre-dosis1 post-dosis3 0 100 200 300 GMT RV-IgA Vacunados (Materna) Saliva Suero GMFR.=.1,27 GMFR.=.10,51 pre-dosis1 post-dosis3 pre-dosis1 post-dosis3 0 100 200 300 GMT RV-IgA Vacunados (Materna/Formula) Saliva Suero GMFR.=.0,88 GMFR.=.8,79 Gráfica 4: Representación de los valores de GMT (IC 95%) para RV-IgA obtenidos en muestra de saliva y suero en la cohorte de pacientes vacunados según el tipo de lactancia, antes de la primera dosis (pre-dosis 1) y 40 días tras la toma de la 3ª dosis (post-dosis 3), junto con los valores de GMFR para cada muestra GMT: Geometric Mean Titer; IC: Intervalo de confianza; GMFR: Geometric Mean Fold Rise Resultados ! 82! De igual modo que antes, aquellos valores de GMT obtenidos en las muestras Pre-Dosis 1/Post-Dosis 3 del grupo Materna y Pre-Dosis 1 en el grupo Materna/Fórmula, muestran interferencia por presencia de Ac anti RV-IgA procedente de la leche materna, lo que no permite en estos grupos hacer una estimación real de los valores GMT obtenidos a través de la vacunación. Resultados ! 83! Formula Materna Materna/Formula 0 100 200 300 GMT RV-IgA Post-Dosis3 (Saliva) Saliva Formula Materna Materna/Formula 0 100 200 300 GMT RV-IgA Post-Dosis3 (Suero) Suero Gráfica 5: Análisis comparativo de los valores de GMT (IC 95%) para RV-IgA obtenidos en muestra de saliva y suero entre los diferentes grupos de lactancia: Fórmula, Materna y Materna/Fórmula GMT: Geometric Mean Titer; IC: Intervalo de confianza 5.1.3 Análisis de la influencia de la lactancia sobre la inmunogenicidad de la vacunación y el GMFR Para estudiar si el tipo de lactancia tiene algún efecto significativo sobre la inmunogenicidad de la vacuna, realizamos un análisis comparativo entre los GMT para RV-IgA alcanzados tras 40 días de toma de la última dosis de vacuna (Post-Dosis 3) (Gráfica 5) La prueba estadística empleada (Kruskal-Wallis) no muestra diferencias significativas en los valores de GMT RV-IgA alcanzados en los diferentes grupos de lactancia y en ambas muestras. Kruskal-Wallis P valor 0.6320 Kruskal-Wallis P valor 0.3241 Resultados ! 84! Asimismo, también realizamos un análisis comparativo del GMFR en las muestras de saliva y suero entre los diferentes grupos de lactancia (Gráfica 6) El análisis estadístico mediante la prueba de Kruskal-Wallis no mostró diferencias significativas en los valores de GMFR entre los diferentes grupos de lactancia en ambas muestras. Formula Materna Materna/Formula 0 10 20 30 40 GMFR GMFR (Saliva) Formula Materna Materna/Formula 0 10 20 30 40 GMFR GMFR (Suero) Gráfica 6: Análisis comparativo de los valores de GMFR obtenidos en muestra de saliva y suero entre los diferentes grupos de lactancia: Fórmula, Materna y Materna/Fórmula GMFR: Geometric Mean Fold Rise Kruskal-Wallis P valor 0.0633 Kruskal-Wallis P valor 0.2372 Resultados ! 85! 5.1.4 Comparación entre las cohortes de individuos vacunados e infectados En el siguiente gráfico se representan los valores de GMT y GMFR para los Ac frente a RV-IgA obtenidos a través de la infección natural y a través de la vacunación: pre-dosis1 post-dosis3 pre-dosis1 post-dosis3 0 100 200 300 GMT RV-IgA Cohorte Vacunados Saliva Suero GMFR.=.1,34 GMFR.=..8,15 Fase Aguda Convalecencia Fase Aguda Convalecencia 0 100 200 300 GMT RV-IgA Cohorte Infectados Saliva Suero GMFR.=.1,76 GMFR.=.4,02 Gráfica 7: Análisis comparativo entre los valores de GMT (IC 95%) y GMFR para Ac anti RV-IgA obtenido en la cohorte de infección natural y en la cohorte de vacunación GMT: Geometric Mean Titer; IC: Intervalo de confianza; GMFR: Geometric Mean Fold Rise Resultados ! 86! Se realizó la prueba estadística de Mann-Whitney entre los valores correspondientes para cada grupo para conocer si existen diferencias significativas entre ambas cohortes: Los resultados no muestran diferencias significativas entre los valores GMT iniciales y finales en muestras de saliva entre ambas cohortes. Por el contrario, si se observan diferencias estadísticamente significativas en los valores séricos de GMT iniciales (Pre-Dosis 1 y Fase Aguda) (P=0.0064) y por extensión de los valores de GMFR (P=0.0332), entre ambas cohortes Muy probablemente esta diferencia se deba a la diferencia de edad entre ambos grupos (ver Tabla 4). Sin embargo, no se observan diferencias en el valor de GMT final en el suero (Post-Dosis 3 y Convalecencia) alcanzado por ambas cohortes. Parámetro Saliva Suero Vacunados (n=121) Infectados (n=10) MannWhitney Vacunados (n=121) Infectados (n=10) MannWhitney GMT Pre-1/F-Aguda GMT Post-3/Conval GMFR 23,25 (20,33–26,60) 31,28 (27,19–35,99) 1,34 (1,14–1,58) 33,46(12,63 – 88,62) 58,90(21,19 – 163,8) 1,76(0,73 – 4,21) ns ns ns 12,71(11,24 – 14,38) 103,7(89,53 – 120,2) 8,15(6,97 – 9,54) 27,05(14,07 – 52,04) 109,0(61,83 – 192,3) 4,02(2,16 – 7,48) 0.0064 ns 0.0332 N = numero de sujetos de la cohorte GMT = Geometric Mean Titer GMFR = Geometric Mean Fold Rise ns = diferencias no significativas Tabla 4: Análisis de las diferencias de inmunogenicidad en suero y saliva entre la cohorte de individuos vacunados e infectados Resultados ! 87! Hay que tener en cuenta en el análisis de los resultados la limitación que supone el bajo número de pacientes reclutados en la cohorte infectados. 5.1.5 Correlación entre las muestras de saliva y suero en ambas cohortes Se realizó una correlación de Spearman entre los valores GMT RV-IgA obtenidos entre ambas muestras de suero/saliva para cada cohorte. Se representan en la siguiente tabla los valores p de correlación obtenidos para cada pareja de muestras: COHORTE VACUNADOS Saliva Pre-Dosis 1 Saliva Post-Dosis 3 Suero Pre-Dosis 1 Suero Post-Dosis 3 Saliva Pre-Dosis 1 0.003 0.837 0.619 Saliva Post-Dosis 3 0.003 0.135 0.191 Suero Pre-Dosis 1 0.837 0.135 0.002 Suero Post-Dosis 3 0.619 0.191 0.002 COHORTE INFECTADOS Saliva FAguda Saliva Conval Suero F-Aguda Suero Conval Saliva F-Aguda 0.088 0.912 0.810 Saliva Conval 0.0088 0.313 0.843 Suero F-Aguda 0.912 0.313 0.097 Suero Conval 0.810 0.843 0.097 Tabla 5: Correlación de Spearman entre muestras de suero/saliva en ambas cohortes 050 100 150 200 250 0 100 200 300 400 500 Post-Dosis 3 RV-IgA (Saliva) Post-Dosis 3 RV-IgA (Suero) no significativo 0200 400 600 0 100 200 300 Conval RV-IgA (Saliva) Conval RV-IgA (Suero) no significativo Gráfico 8: Asociación mediante correlación de Spearman entre los valores de GMT RV-IgA en Suero y Saliva en la cohorte de pacientes vacunados (Post-Dosis 3) y en la cohorte de pacientes infectados (Convalecencia) Cohorte Vacunados Cohorte Infectados Resultados ! 88! Como se puede observar en ambas tablas y en el gráfico de asociación, no se observa correlación significativa alguna entre las muestras de suero y saliva en ambas cohortes, lo que indica compartimentos diferentes. Resultados ! 89! 5.2 Estudio de la respuesta de citocinas en mucosa oral entre el paciente vacunado e infectado: comparación con la respuesta sistémica 5.2.1 Perfil de citocinas en suero y saliva en la cohorte de pacientes infectados Mediante análisis multiparamétrico se analizó el perfil de 12 citocinas en suero y saliva del paciente reclutado en fase aguda y tras su recuperación en la convalecencia. En la tabla siguiente se presentan los datos de concentración (pg/ml) de citocinas obtenidos: Parámetro Saliva (N = 27) Suero (N = 20) Fase Aguda (n=27) Convalecencia (n=23) Wilcoxon test Fase Aguda (n=20) Convalecencia (n=12) Wilcoxon test EGF 843,8 (317,8-1346) 338,4 (191,1-532) 0.0214 9,17 (5,87-32,32) 1,27 (0,06-5,33) 0.0078 IFN α2 30,09 (11,93-69,59) 71,80 (18,46-221,5) 0.0192 6,21 (1,23-14,46) 0,0 (0,0-9,67) ns IL-8 387 (165,9-1510) 249,6 (121,7-418,4) 0.0319 19,34 (10,85-35,32) 8,49 (3,66-14,80) 0.0391 IL-1β 3,97 (1,94-19,82) 3,02 (1,78-4,59) 0.0319 5,79 (3,18-17,06) 0,01 (0,0-0,35) 0.0156 IL-15 2,68 (1,27-5,53) 2,27 (0,99-3,72) ns 2,37 (1,31-5,31) 0,95 (0,72-2,04) ns IL-10 3,80 (0,61-15,15) 10,70 (3,30-15,40) ns 70,0 (22,40-204,7) 14,62 (12,02-60,86) 0.0156 IL12 7,82 (3,01-17,76) 7,55 (2,85-20,66) ns 1,15 (0,31-5,21) 0,53 (0,17-5,94) 0.0469 IL 6 1,98 (1,10-3,84) 1,12 (0,55-2,49) 0.0351 2,32 (1,41-4,49) 0,94 (0,25-3,85) ns TNF-α 2,61 (1,17-9,14) 2,89 (0,89-4,19) ns 14,89 (7,95-20,37) 13,87 (11,57-27,78) 0.0313 IFN-γ 4,43 (1,88-7,24) 4,38 (2,69-8,03) ns 5,78 (3,18-17,06) 1,27 (0,06-5,33) 0.007 IL-22 51,71 (4,53-186,6) 12,36 (2,71-17,53) 0.0161 119,8 (55,66-197,8) 31,90 (18,29-84,26) ns IFNl n.d. n.d. - n.d. n.d. - N = numero de sujetos de la cohorte n = numero de sujetos con muestra analizada n.d.= no detectable EGF=Epidermal Growth Factor; IL=Interleucina; IFN=Interferon; TNF=Tumor Necrosis Factor Tabla 6: Concentración de citocinas en saliva y suero en la cohorte de pacientes infectados (Fase Aguda y Convalecencia). Los datos representan la Mediana de las concentraciones (pg/ml) y el rango intercuartil 25%-75% El nivel de significancia calculado según el test de Wilcoxon (significativo < 0.005) Resultados ! 96! En el Gráfico 13 se representan comparativamente los valores de citocinas obtenidos en la muestra de suero en ambas cohortes estudiadas: Gráfico 13: Análisis comparativo de niveles de citocinas en muestra de SUERO entre la cohorte Infectados vs Vacunado. Los datos representan la Mediana de las concentraciones (pg/ml) y el rango intercuartil 25%-75% (+ = Media) SUERO EGF IFN-alpha IFN-gamma IL-1beta IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNF-alpha IL-22 0 100 200 300 pg/ml Infectados+(Fase+Aguda) EGF IFN-alpha IFN-gamma IL-1beta IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNF-alpha IL-22 0 100 200 300 pg/ml Infectados+(Convalecencia) EGF IFN-alpha IFN-gamma IL-1beta IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNF-alpha IL-22 0 100 200 300 pg/ml Vacunados)(Pre-Dosis)1) EGF IFN-alpha IFN-gamma IL-1beta IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNF-alpha IL-22 0 100 200 300 pg/ml Vacunados)(Post-Dosis)3) Resultados ! 97! En el Gráfico 14 se representan comparativamente los valores de citocinas obtenidos en la muestra de saliva en ambas cohortes estudiadas: EGF IFN-alpha IFN-gamma IL-1beta IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNF-alpha IL-22 0 500 1000 1500 2000 pg/ml Infectados+(Fase+Aguda) EGF IFN-alpha IFN-gamma IL-1beta IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNF-alpha IL-22 0 500 1000 1500 2000 pg/ml Infectados+(Convalecencia) EGF IFN-alpha IFN-gamma IL-1beta IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNF-alpha IL-22 0 500 1000 1500 2000 pg/ml Vacunados)(Pre-Dosis)1) EGF IFN-alpha IFN-gamma IL-1beta IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNF-alpha IL-22 0 500 1000 1500 2000 pg/ml Vacunados)(Post-Dosis)3) SALIVA Gráfico 14: Análisis comparativo de niveles de citocinas en muestra de SALIVA entre la cohorte Infectados vs Vacunado. Los datos representan la Mediana de las concentraciones (pg/ml) y el rango intercuartil 25%-75% (+ = Media) Resultados ! 98! 5.2.4 Correlación entre los valores de citocinas obtenidos y el curso clínico de los pacientes infectados ! Con el objeto de buscar algún biomarcador en suero y/o saliva asociado al curso clínico de la enfermedad, se analizó la correlación entre los diferentes valores de citocinas obtenidos y diferentes parámetros clínicos recogidos en la cohorte infectados (n=27) en fase aguda de la enfermedad (Tabla 9) 5.2.4.1 Correlación con los valores obtenidos en muestra de saliva En la Tabla 10 siguiente se representan los valores p obtenidos mediante el test de Spearman para cada asociación de citocinas en SALIVA con los parámetros clínicos obtenidos en fase aguda de la enfermedad: SALIVA EGF IFN-⍺ IFN-𝜸 IL-1β IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNF-⍺ IL-22 Edad (Meses) 0,184 0,962 0,207 0,329 0,814 0,533 0,242 0,932 0,397 0,555 0,966 Estancia hospitalaria (días) 0,022 0,437 0,830 0,109 0,582 0,633 0,690 0,658 0,867 0,205 0,193 Duración Diarrea (días) 0,891 0,226 0,031 0,718 0,206 0,553 0,249 0,711 0,034 0,928 0,870 Nº deposiciones/día 0,273 0,199 0,783 0,149 0,690 0,605 0,585 0,472 0,511 0,644 0,513 Duración vómitos 0,634 0,220 0,128 0,614 0,225 0,859 0,114 0,559 0,343 0,618 0,224 Nº máx. vomitos/día 0,790 0,155 0,313 0,856 0,319 0,473 0,454 0,759 0,192 0,507 0,938 Temperatura 0,503 0,773 0,066 0,513 0,993 0,172 0,099 0,946 0,314 0,058 0,238 Nivel de Deshidratación 0,216 0,762 0,003 0,712 0,023 0,949 0,010 0,039 0,014 0,594 0,225 Score Vesikari 0,642 0,655 0,039 0,670 0,026 0,665 0,031 0,121 0,031 0,374 0,655 Parámetros Clínicos Fase Aguda Score Vesikari 11,07 (3,485) Días de Estancia Hospitalaria 5,750 (3,026) Temperatura (ºC) 38,70 (0,622) Número de episodios de vómitos/día 3,179 (4,738) Duración de los vómitos (días) 2,037 (1,931) Número de deposiciones/día 4,929 (5,018) Duración de la diarrea (días) 4,571 (2,168) Nivel de deshidratación 1,607 (1,100) Tabla 9: Características clínicas de los pacientes en Fase aguda expresados como Media (SD) Tabla 10: Niveles de significación según el test de Spearman para la asociación de los niveles de citocinas obtenidos en fase aguda en SALIVA con los parámetros clínicos de los pacientes infectados. Se muestra en negrita aquellos valores p significativos (P<0.005) Resultados ! 99! Encontramos valores de citocinas en saliva con asociaciones significativas con parámetros clínicos: EGF con Estancia Hospitalaria (r2=-0.63), IFN-g, IL-6, IL-10 e IL-12 con el Score de Gravedad de Vesikari (r2=-0.39, r2=-0.42, r2=-0.41 y r2=- 0.41 respectivamente) En el Gráfico 15 se muestran aquellos valores que muestran una asociación clínica significativa (P<0.05) mediante test de Spearman: Gráfico 15: Asociación entre los valores de EGF, IFNg , IL-6, IL-12 e IL-10 en SALIVA (Fase Aguda) con los parámetros clínicos de Estancia Hospitalaria (días) y Score de gravedad de Vesikari. 0 5 10 15 0 200 400 600 800 1000 1200 Estancia hospitalaria (nº días) EGF$saliva$pg/ml r 2 = - 0.63 p = 0.022 0 5 10 15 20 0 10 20 30 Score Vesikari IFN-γ%%saliva%pg/ml r 2 = - 0.398 p = 0.039 0 5 10 15 20 0 50 100 150 Score Vesikari IL-6%saliva%pg/ml r 2 = - 0.427 p = 0.026 0 5 10 15 20 0 10 20 30 Score Vesikari IL-10&saliva&pg/ml r 2 = - 0.415 p = 0.031 0 5 10 15 20 0 10 20 30 40 50 Score Vesikari IL-12&saliva&pg/ml r2 = - 0.416 p = 0.031 Resultados ! 100! 5.2.4.2 Correlación con los valores obtenidos en muestra de suero En la Tabla 11 siguiente se representan los valores p obtenidos mediante la prueba de Spearman para cada asociación de citocinas en suero con los parámetros clínicos obtenidos en fase aguda de la enfermedad: SUERO EGF IFN-⍺ IFN-𝜸 IL-1β IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNF-⍺ IL-22 Edad 0,747 0,071 0,235 0,052 0,479 0,571 0,784 0,543 0,493 0,245 0,023 Estancia hospitalaria (días) 0,133 0,380 0,042 0,299 0,181 0,091 0,059 0,178 0,445 0,707 0,656 Duración Diarrea (días) 0,938 0,716 0,405 0,867 0,025 0,756 0,064 0,816 0,758 0,969 0,226 Nº deposiciones/día 0,525 0,000 0,007 0,009 0,492 0,424 0,313 0,054 0,023 0,992 0,557 Duración vómitos 0,818 0,791 0,947 0,189 0,194 0,529 0,889 0,953 0,677 0,382 0,027 Nº máx. vomitos/día 0,280 0,038 0,026 0,039 0,895 0,100 0,517 0,084 0,017 0,302 0,285 Temperatura 0,612 0,880 0,823 0,832 0,533 0,989 0,342 0,530 0,610 0,875 0,272 Nivel de Deshidratación 0,875 0,382 0,494 0,768 0,194 0,984 0,635 0,973 0,850 0,375 0,189 Score Vesikari 0,270 0,005 0,007 0,009 0,827 0,294 0,389 0,109 0,005 0,577 0,090 Encontramos valores de citocinas en suero con asociaciones significativas con parámetros clínicos, destacando por su alto valor de significancia: IFN-a, IFN-g, IL-1b e IL-12 y su asociación con el Score de gravedad de Vesikari (r2=0.606, r2=0.582, r2=0.571 y r2=0.598 respectivamente) Tabla 11: Niveles de significación según el test de Spearman para la asociación de los niveles de citocinas obtenidos en fase aguda en SUERO con los parámetros clínicos de los pacientes infectados. Se muestra en negrita aquellos valores p significativos (P<0.005) Resultados ! 101! En el Gráfico 16 se destacan estos valores que muestran una asociación clínica significativa (P<0.05) mediante la prueba de Spearman: 5.2.4.3 Correlación de los valores de citocinas con la edad de los pacientes Para descartar que las asociaciones encontradas no sean debido a la edad del paciente, se analizó mediante la prueba de Spearman si existía alguna asociación entre los valores de citocinas y la edad del paciente. En las tablas anteriores se analizó la asociación entre la edad en meses de los pacientes y lo valores de citocinas encontrados tanto en suero y saliva. Como se puede observar por los valores de significación calculados, tan solo la IL-22 en suero muestra una asociación con la edad de los pacientes (r2=+0.519 Gráfico 16: Asociación entre los valores de IFN-a, IFNg , IL-1 b e IL-12 en SUERO (Fase Aguda) con el Score de gravedad de Vesikari. 0 5 10 15 20 0 10 20 Score Vesikari IFN-α&&suero&pg/ml r 2 = + 0.606 p = 0.005 0 5 10 15 20 0 10 20 30 40 Score Vesikari IFN-γ%%suero%pg/ml r 2 = + 0.582 p = 0.007 0 5 10 15 20 0 5 10 Score Vesikari IL-1β%%suero%pg/ml r2 = + 0.571 p = 0.009 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 Score Vesikari IL-12&suero&pg/ml r 2 = + 0.598 p = 0.005 Resultados ! 102! P=0.023) Con esta citocina no se encontró ninguna asociación clínica significativa. En el Gráfico 17 se muestra la asociación de las citocinas EGF (saliva), IFN-a, IFN-g, IL-1b e IL-12 (suero) con la edad de los pacientes: 0500 1000 0 10 20 30 40 EGF saliva pg/ml Edad (meses) ns 0 5 10 15 20 0 10 20 30 40 IFN-α%suero%pg/ml Edad (meses) ns 010 20 30 40 0 10 20 30 40 IFN-γ%suero%pg/ml Edad (meses) ns 012345 0 10 20 30 40 IL-1β suero pg/ml Edad (meses) ns 0 5 10 0 10 20 30 40 IL-12 suero pg/ml Edad (meses) ns Gráfico 17: Asociación entre los valores de citocinas EGF (saliva), IFNa , IFNg , IL-1 b e IL-12 (suero) con la edad de los pacientes de la cohorte infectados Resultados ! 103! 5.2.4.4 Correlación entre la respuesta mediada por citocinas en suero y saliva Se analizó (Tablas 12 y 13) si existía alguna correlación entre los valores de citocinas obtenidos en suero y saliva para cada una de las cohortes mediante el calculo del coeficiente de correlación de Spearman. No se encontró ninguna asociación significativa. SALIVA/SUERO EGF IFN-⍺ IFN-𝜸 IL-1β IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNF-⍺ IL-22 EGF 0.906 0.476 0,718 0,909 0,814 0,442 0,322 0,151 0,228 0,473 0,616 IFN-⍺ 0,291 0,635 0,801 0,855 0,711 0,868 0,404 0,757 0,807 0,829 0,034 IFN-𝜸 0,745 0,264 0,523 0,596 0,267 0,333 0,482 0,974 0,878 0,075 0,284 IL-1β 0,436 0,376 0,936 0,676 0,670 0,361 0,681 0,168 0,533 0,391 0,587 IL-6 0,828 0,056 0,797 0,742 0,923 0,673 0,986 0,127 0,167 0,844 0,425 IL-8 0,676 0,360 0,530 0,491 0,468 0,204 0,668 0,057 0,110 0,190 0,887 IL-10 0,683 0,344 0,380 0,729 0,963 0,428 0,342 0,843 0,658 0,454 0,909 IL-15 0,596 0,109 0,751 0,797 0,571 0,424 0,509 0,549 0,858 0,094 0,478 IL-12 0,713 0,081 0,819 0,898 0,634 0,655 0,418 0,490 0,586 0,132 0,521 TNF-⍺ 0,472 0,386 0,586 0,983 0,909 0,909 0,753 0,151 0,580 0,960 0,604 IL-22 0,523 0,571 0,901 0,951 0,857 0,549 0,220 0,392 0,057 0,078 0,182 SALIVA/SUERO EGF IFN-⍺ IFN-𝜸 IL-1β IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNF-⍺ IL-22 EGF 0,304 0,779 0,271 0,779 0,364 0,383 0,105 0,294 0,779 0,271 0,019 IFN-⍺ 0,185 0,219 0,346 0,219 0,142 0,964 0,929 0,224 0,219 0,346 0,543 IFN-𝜸 0,565 0,287 0,045 0,287 0,951 0,059 0,119 0,064 0,287 0,045 0,143 IL-1β 0,394 0,442 0,836 0,442 0,971 0,262 0,346 0,880 0,442 0,836 0,227 IL-6 0,128 0,086 0,586 0,086 0,709 0,217 0,041 0,361 0,086 0,586 0,258 IL-8 0,905 0,415 0,719 0,415 0,242 0,763 0,243 0,685 0,415 0,719 0,158 IL-10 0,234 0,589 0,113 0,589 0,806 0,353 0,864 0,116 0,589 0,113 0,538 IL-15 0,128 0,443 0,276 0,567 0,876 0,123 0,345 0,234 0,098 0,258 0,178 IL-12 0,627 0,376 0,552 0,376 0,878 0,845 0,131 0,755 0,376 0,552 0,212 TNF-⍺ 0,941 0,064 0,133 0,056 0,886 0,057 0,131 0,064 0,133 0,123 0,451 IL-22 0,128 0,086 0,089 0,341 0,132 0,051 0,361 0,579 0,258 0,125 0,098 Tabla 12: Niveles de significación según el test de Spearman para la asociación entre los valores de citocinas en suero y saliva en la cohorte de pacientes INFECTADOS. Tabla 13: Niveles de significación según el test de Spearman para la asociación entre los valores de citocinas en suero y saliva en la cohorte de pacientes VACUNADOS. Resultados ! 104! 5.3 Análisis de la respuesta inmune celular a diferentes antígenos de rotavirus en ambas cohortes Empleamos el método de estimulación en sangre completa (WBS, whole blood stimulation assay) para evaluar la respuesta inmune celular diferencialmente en la cohorte de pacientes vacunados e infectados. La respuesta celular fue evaluada en respuesta a dos antígenos de rotavirus: cepa de rotavirus humano salvaje (Wa-1) y cepa de rotavirus vacunal (cepa RIX4414, obtenida a partir de vacuna monovalente) 5.3.1 Respuesta inmune celular a antígenos de rotavirus en la cohorte de pacientes infectados La respuesta inmune celular medida a través del perfil de citocinas liberados fue evaluada en la cohorte de pacientes infectados, durante la Fase Aguda de la infección, al no haber conseguido muestra de sangre en el período de convalecencia. Los valores obtenidos tras la estimulación se resumen en la Tabla 14: Parámetro Fase Aguda (n=16) Basal wildRV vacRV PHA IFNa 2,98 (1,65 – 6,82) 11,40 (7,32-38,76) 16,03 (7,29-37,07) 44,74 (31,04-62,57) IFNg 1,67 (0,88-3,11) 1,80 (1,04-8,62) 3,14 (1,19-85,44) 144,9 (129-239,7) IL-1 b 8,05 (1,86-13,67) 8,81 (1,91-36.13) 77,91 (9,00-1139) 948 (139-1575) IL-6 18,05 (11,59-65,39) 137,8 (14,03-982,7) 1480 (149,9-2456) 1803 (549-3465) IL-8 167 (124-317,3) 2021 (487,2-2720) 2779 (1562-2978) 4545 (2617-7458) IL-10 2,98 (1,65-6,82) 23,82 (4,21-64,83) 36,52 (6,01-582,4) 92,50 (36,25-341,3) IL-15 0,82 (0,33-1,22) 1,16 (0,0-2,33) 0,35 (0,0-1,21) 12,87 (11,00-23,00) IL-12 0,0 (0,0-0,68) 0,0 (0,0-0,1) 0,70 (0,0-3,35) 135 (58,0-317,3) TNFa 2,98 (1,65-6,82) 26,30 (4,48-145,9) 50,63 (9,54-289,0) 167,5 (136,0-348) wildRV = cepa rotavirus humana salvaje (Wa-1) vacRV = cepa rotavirus vacuna RIX4414 PHA = control positivo (Fitohemaglutinina) Basal = control negativo (Medio de cultivo) Tabla 14: Valores (pg/ml) de citocinas obtenidos tras la estimulación de sangre completa obtenida en Fase Aguda de pacientes de la cohorte infectados. Se representan los datos como Mediana (Rango intercuartílico) Resultados ! 105! El Gráfico 18 muestra la representación de los valores donde se observa una potente respuesta inmune celular durante la fase aguda de la infección, con producción de IFN-a, IFN-g, IL-1b, IL-6, IL-8, IL-10 IL-15 y TNF-a en respuesta a antígenos del rotavirus. En la representación gráfica de los valores se observan, además, las diferencias entre los dos antígenos de rotavirus empleados. Como Gráfico 18: Producción de citocinas (pg/ml) evaluadas mediante análisis multiplex en respuesta a antígeno salvaje de rotavirus (RVwild) y antígeno vacunal rotavirus (RVvac) en sangre completa de paciente infectado en Fase Aguda. Se representa el control negativo para determinar los niveles basales y el control positivo con PHA. Se representa la mediana de los valores y el rango intercuartílico. El test de Wilcoxon realizado muestra las diferencias entre los dos antígenos de rotavirus empleados. ns = no significativo PHA = Fitohemaglutinina Basal RVwild RVvac PHA 0 20 40 60 80 100 IFN-α&&pg/ml ns Basal RVwild RVvac PHA 0 100 200 300 400 IFN-γ%%pg/ml ns Basal RVwild RVvac PHA 0 500 1000 1500 2000 2500 IL-1β pg/ml ns Basal RVwild RVvac PHA 0 2000 4000 6000 IL-6 pg/ml p=0.0067 Basal RVwild RVvac PHA 0 2000 4000 6000 8000 10000 IL-8 pg/ml p=0.0067 Basal RVwild RVvac PHA 0 500 1000 IL-10 pg/ml ns Basal RVwild RVvac PHA 0 10 20 30 IL-15 pg/ml ns Basal RVwild RVvac PHA 0 200 400 600 IL-12 pg/ml p=0.0293 Basal RVwild RVvac PHA 0 100 200 300 400 500 TNF-α pg/ml ns Resultados ! 112! En el caso de la cohorte de pacientes vacunados, se observan diferencias mínimamente significativas en la producción de citocinas en respuesta a los dos antígenos de rotavirus al nivel de IFN-a e IL-1b, pero tan solo en la muestra obtenida tras la vacunación (Post-Dosis 3) En este caso, a diferencia de la cohorte de pacientes infectados, se obtienen valores ligeramente superiores de citocinas en la estimulación con el antígeno salvaje de rotavirus. 5.3.3 Comparación de la respuesta inmune celular obtenida entre la cohorte de pacientes infectados y vacunados En el Gráfico 24 se muestra el estudio comparativo en la respuesta de citocinas entre ambas cohortes, comparando los valores de citocinas obtenidos en Fase Aguda (Cohorte Infectados) y tomando la muestra Pre-Dosis 1 (Cohorte Vacunados) como muestra control. Resultados ! 113! Fase Aguda Pre-Dosis 1 Fase Aguda Pre-Dosis 1 0 100 200 300 400 500 IFN-α&&pg/ml wildRV vacRV p=0.0021 p=0.0010 Fase Aguda Pre-Dosis 1 Fase Aguda Pre-Dosis 1 0 50 100 IFN-γ%%pg/ml wildRV vacRV ns ns Fase Aguda Pre-Dosis 1 Fase Aguda Pre-Dosis 1 0 500 1000 1500 IL-1β pg/ml wildRV vacRV p=0.0003 ns Fase Aguda Pre-Dosis 1 Fase Aguda Pre-Dosis 1 0 1000 2000 3000 IL-6 pg/ml wildRV vacRV p=0.0323 ns Fase Aguda Pre-Dosis 1 Fase Aguda Pre-Dosis 1 0 1000 2000 3000 4000 IL-8 pg/ml wildRV vacRV p=0.0025 ns Fase Aguda Pre-Dosis 1 Fase Aguda Pre-Dosis 1 0 200 400 600 IL-10 pg/ml wildRV vacRV ns ns Fase Aguda Pre-Dosis 1 Fase Aguda Pre-Dosis 1 0 1 2 3 4 IL-15 pg/ml wildRV vacRV ns ns Fase Aguda Pre-Dosis 1 Fase Aguda Pre-Dosis 1 0 2 4 6 8 10 IL-12 pg/ml wildRV vacRV ns ns Fase Aguda Pre-Dosis 1 Fase Aguda Pre-Dosis 1 0 200 400 600 TNF-α%%%pg/ml wildRV vacRV p=0.0420 ns Gráfico 24: Comparación en los valores de citocinas (pg/ml) obtenidos entre la cohorte de pacientes infectados (Fase Aguda) y la muestra Pre-Dosis 1 (Vacunados) tomada como muestra control, en respuesta a antígeno de rotavirus salvaje (wildRV) y vacunal (vacRV) Se representa la mediana de los valores y el rango intercuartílico. El test de Wilcoxon realizado muestra las diferencias en la respuesta entre ambas cohortes. Resultados ! 114! Como se puede observar en la imagen, varias citocinas presentan diferencias en su producción entre ambas muestras: IFN-a (con ambos antígenos de rotavirus), IL-1b, IL-6, IL-8 y TNF-a (solo en respuesta al antígeno salvaje de rotavirus) En todos los casos, el nivel de estas citocinas es inferior en la muestra tomada en fase aguda de la infección con respecto a la muestra control. 5.3.4 Correlación de la respuesta inmune celular con el curso clínico en la cohorte de pacientes infectados Se estudió la correlación existente entre la respuesta inmune celular durante la fase aguda de la infección y el curso clínico de los pacientes infectados mediante el análisis de Pearson. En la Tabla 16 siguiente se presentan los valores de significancia del valor de cada citocina con la estancia hospitalaria y el Score de Gravedad de Vesikari: Correlación Pearson valores p IFNa IFNg IL-1 b IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNFa Estancia Hospitalaria 0.874 0.848 0.050 0.102 0.340 0.028 0.562 0.435 0.119 Score Vesikari 0.156 0.417 0.002 0.019 0.013 0.227 0.934 0.116 0.207 Edad 0,116 0,745 0,123 0,223 0,113 0,353 0,823 0,441 0,652 Correlación Pearson valor coeficiente IFNa IFNg IL-1 b IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNFa Estancia Hospitalaria -0.043 +0.052 +0.497 +0.424 +0.255 +0.549 +0.172 +0.210 +0.481 Score Vesikari -0.372 +0.218 -0.704 -0.578 -0.606 -0.320 -0.008 +0.592 -0.333 Edad -0.422 -0.158 -0.540 -0.283 -0.425 -0.548 -0.063 +0.461 -0.126 Tabla 16: Asociaciones mediante correlación de Pearson entre los valores de citocinas y el Score de Gravedad de Vesikari. Se representa el valor p obtenido (parte superior) y el valor del coeficiente (parte inferior) Resultados ! 115! Encontramos por lo tanto una asociación positiva de los valores de IL-10 con la Estancia Hospitalaria (P=0.028, r2=+0.549) lo que indica que, a mayor producción de esta citocina en respuesta al rotavirus, mayor será el tiempo de recuperación y de estancia hospitalaria. Por otro lado, hay varias citocinas que se asocian con el Score de gravedad de Vesikari: IL-1 b (P=0.002, r2=-0.704), IL-6 (P=0.019, r2=-0.578) e IL-8 (P=0.013, r2=-0.606) muestran una asociación negativa con el valor del score de gravedad. Esto indica que a mayor capacidad de producción de las citocinas IL-1b, IL-6 e IL-8 por parte del paciente infectado en respuesta al rotavirus, menor puntuación alcanza en la escala de gravedad. Para descartar que estas asociaciones no estuviesen relacionadas con la edad del paciente se correlacionaron los valores de citocinas con la edad, no obteniéndose en ningún caso asociación significativa alguna entre la edad del paciente y la capacidad de producción de citocinas en respuesta a los antígenos de rotavirus. Resultados ! 116! 5.3.5 Correlación entre la inmunidad celular y la inmunidad humoral en la cohorte de pacientes vacunados Para analizar si existía alguna asociación entre el título de IgA específicos frente a rotavirus y la respuesta inmune celular del paciente, seleccionamos aquellos pacientes de la cohorte vacunados de los que tuviésemos datos de inmunidad humoral e inmunidad celular. En un subgrupo de 26 pacientes vacunados establecimos una correlación entre los valores de citocinas producidos en respuesta al antígeno salvaje de rotavirus tras la vacunación (Post-Dosis 3) y el título de anticuerpos IgA frente a rotavirus en suero alcanzado tras la vacunación. En la Tabla 17 se muestran los valores de significación para las diferentes asociaciones entre los niveles de citocinas y el título de anticuerpos: Como se puede observar, encontramos una asociación positiva entre la producción de IL-15 y TNFa con los valores alcanzados de anticuerpos IgA en suero frente a rotavirus, en la cohorte de pacientes vacunados, datos representados en el Gráfico 25. En la cohorte infectados no se pudo realizar el Correlación Pearson valores p IFNa IFNg IL-1 b IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNFa RV-IgA post-dosis 3 (Suero) 0,2165 0,3932 0,2450 0,2943 0,3892 0,3921 0,0310 0,2850 0,0023 Correlación Pearson valor coeficiente IFNa IFNg IL-1 b IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-12 TNFa RV-IgA post-dosis 3 (Suero) 0,2458 0,1712 0,2364 0,2095 -0,1762 0,1752 0,4237 0,2178 0,5713 Tabla 17: Asociaciones mediante correlación de Pearson entre los valores de citocinas y el título de Anticuerpos RV-IgA en susero obtenidos en Post-Dosis 3. Se representa el valor p obtenido (parte superior) y el valor del coeficiente (parte inferior) Resultados ! 117! estudio de asociación al no haber podido completar datos de un mínimo razonable de pacientes. 012345 0 1 2 3 4 IL-15 RV-IgA GMT (suero) p=0.031 r2=+0.423 0100 200 300 0 1 2 3 4 TNF-α (pg/ml) RV-IgA GMT (suero) p=0.002 r 2 =+0.571 Gráfico 25: Asociación entre los niveles de IL-15 y TNFa producidos tras la vacunación y el título de Anticuerpos frente a rotavirus alcanzado tras la vacunación en la cohorte de pacientes vacunados, mediante el análisis de correlación de Pearson. Resultados ! 118! 5.4 Estudio comparativo de los perfiles moleculares de inmunización humoral en el suero tras la infección natural y tras la vacunación Se realizó el estudio comparativo de los perfiles moleculares de inmunización humoral generados tras la infección natural y tras la vacunación, con el objetivo de analizar diferencias. Para ello se realizó un pool representativo de muestras de suero de cada cohorte (infectados vs vacunados) y se enfrentó a un lisado de proteínas de rotavirus (cepa Wa-1) separadas mediante electroforesis bidimensional y transferidas a una membrana de PVDF (Inmunoblotting) En el Gráfico 26 se muestran los diferentes perfiles de inmunización obtenidos: Resultados ! 119! VP1 125kDa, pI:8.1 NSP1 (58kDa, pI:8.64) VP6 (44kDa,pI:5.82) NSP2 (36kDa, pI:9.07) NSP3 (34kDa, pI:5.19) VP7 (37kDa, pI:4.43) NSP5 (21kDa,pI:6.37) 15 25 35 55 70 100 130 WM Sueros pacientes infectados con Rotavirus pH 10 -------------------------------------------------------------------------- 3 VP8/VP5 (86kDa, pI: 5.1) Peso Molecular (kDa) 70 55 35 25 15 100 130 10 WM VP1 125kDa, pI:8.1 VP7 (37kDa, pI:4) NSP3 (34kDa, pI:5.19) NSP5 (21 kDa, pI: 6.37) NSP1 (58kDa, pI:8.64) VP6 (44kDa, pI:5.82) VP3 (98kDa, pI:8.3) VP2 (24.8 kDa, pI: 6.9) VP8/VP5 (86kDa, pI: 5.1) Sueros de pacientes vacunados RotaTeq™ pH 10 ------------------------------------------------------------------------------ 3 Peso Molecular (kDa) Gráfico 26: Perfiles moleculares de inmunización en suero obtenidos en pool de muestras de A) pacientes infectados en fase de convalecencia y B) pacientes vacunados tras la toma de la tercera dosis (Post-Dosis 3) A B Resultados ! 120! En la Tabla 18 se relacionan las proteínas virales reconocidas en ambas cohortes de pacientes: Proteínas Rotavirus Pool Infectados Pool Vacunados Función/Localización VP1 + + ARN polimerasa / Core VP2 - + Unión a ARN / Core VP3 - + ARN Transferasa / Core VP4 (VP5+VP8) + + Anclaje / Superficie VP6 + + Estructural / Cápside interna VP7 + + Anclaje / Superficie NSP1 + + Unión a ARN / No estructural NSP2 + - Unión a ARN / No estructural NSP3 + + Unión a ARN / No estructural NSP4 - - Enterotoxina / No estructural NSP5 + + Unión a ARN / No estructural Tabla 18: Reconocimiento diferencial de los Anticuerpos IgA anti-RV en pool de pacientes de la cohorte infectados y vacunados. Resultados ! 121! 5.5 Análisis del transcriptoma en el paciente infectado y vacunado Mediante secuenciación de ARN (ARN-seq) se procedió a cuantificar la expresión directa de todos los genes presentes en la sangre de los pacientes infectados y vacunados. 5.5.1 Análisis del transcriptoma en el paciente infectado vs grupo control 5.5.1.1 Características clínicas de pacientes infectados y grupo control Todos los niños reclutados para este sub-estudio (rango de edad 1,9-14,4 meses, ratio masculino/femenino = 8,3) tenían el calendario de inmunización de rutina al día y ninguno había recibido la vacuna de rotavirus o había sufrido infecciones de rotavirus previas en el momento de la toma de muestras. Los pacientes empleados para grupo control pertenecían a la cohorte de paciente vacunados en el momento previo a la vacunación (Pre-dosis 1). En el grupo de pacientes infectados, el tiempo medio entre el ingreso hospitalario y la toma de muestras fue de tres días. Todos los pacientes infectados mostraron una recuperación completa después de una estancia media hospitalaria de 4 días (desviación estándar = 2,3 días) Resultados ! 128! Los datos analizados indican una clara activación de los factores de transcripción E2F en las muestras de pacientes infectados: E2F1 (D=2,2), E2F2 (D=2,3) y E2F8 (D=5). Usando diferentes fuentes biológicas y metodología de redes se identificó que estos factores de transcripción regulan varios aspectos del ciclo celular a través de la modulación de la expresión de diferentes complejos de reconocimiento de origen (ORCs) y controlando el ciclo mitótico, como se puede observar en el Gráfico 31: Gráfico 31: Análisis de redes de los factores de transcripción E2F indicando el complejo escenario de interacciones relacionadas con el ciclo celular. El color rojo indica la situación de genes activados. Resultados ! 129! Por otro lado, los datos indican que dos categorías de genes relacionados con respuesta inmune como son los genes de respuesta a Malaria y las interacciones Citocina-Receptor de Citocina, se encuentran claramente inhibida en los pacientes con respecto al grupo control. De los genes de ambas categorías, relacionados con respuesta inmune, destaca el gen para la proteína 27 inducible por IFNa (IFI27) que muestra el valor de incremento mayor de todos los genes diferencialmente expresados en el grupo de pacientes con respecto al grupo control (D=23,8, valor P=0.0014). Otro gen con activación moderada en el grupo de pacientes fue el gen para interleucina12 (IL-12) (D=3,5, valor P=0.013). Entre los genes con mayor inhibición encontrados en nuestros datos destacan el gen para la hemoglobina g 1 (HBG1) (D= -77, valor P=0.0016), el gen para la proteína de unión a Selenio 1 (SELENBP1) (D= -41, valor P=0.001) y el gen para el grupo sanguíneo Diego (SLC4A1) (D= -27, valor P=0.001). De entre la serie de genes encontrados con inhibición en su expresión, destacan además tres de los cuatro genes para glicoforina detectados mediante secuenciación del ARN: los genes para las glicoforinas A (GYPA) (D= -7,5, valor P=0.0037), glicoforina B (GYPB) (D= -20, valor P=0.0025) y glicoforina C (GYPC) (D= -2,3, valor P=0.0014) Resultados ! 130! El análisis de las redes de interacción de los diferentes genes para la glicoforina (Gráfico 32) muestra relación con otros genes relacionados con el metabolismo del hematíe como son: proteína estabilizadora hemoglobina-a (AHSP), anhidrasa carbónica 1 (CA1), anhidrasa carbónica 4 (CA4), proteína transportadora aniónica Banda-3 (SLC4A1) y el enzima mitocondrial delta aminolevulinato sintasa 2 (ALAS2), todos ellos con expresión inhibida durante la infección por rotavirus. Gráfico 32: Análisis de redes de los genes para la glicoforina GYPA/B/C y sus interacciones con otros genes relacionados con el hematíe. El color rojo y verde indica respectivamente la situación de genes activados e inhibidos. Resultados ! 131! La expresión de los genes en el grupo de pacientes infectados mostraba además una alta correlación (Pearson r = 0.8) como se muestra en el Gráfico 33, lo que es compatible con una regulación directa de estos genes sobre el ciclo celular. Gráfico 33: Mapa de calor que muestra los patrones de correlación entre genes diferencialmente expresados en los pacientes infectados. La función de densidad (línea verde) en la leyenda de la imagen (arriba izquierda) indicaba la cantidad de genes que muestra el correspondiente valor de correlación. Resultados ! 132! 5.5.1.4 Análisis transcriptómico de los genes de respuesta inmunitaria frente al rotavirus ! Centrando el análisis transcriptómico en los genes relacionados directamente con la respuesta inmunitaria, obtenemos un total de 75 genes diferencialmente inhibidos/activados que nos dan una idea de como es la respuesta inmune generada durante la infección por rotavirus. En la Tabla 20 se relacionan los genes que se encuentran diferencialmente inhibidos y activados, así como su función conocida. Resultados ! 133! Ensembl_ID Nombre Gen Cromosoma D P-valor ajustado Función del Gen ENSG00000123838 C4BPA chr1 -11.428 0.00585665 Inhibe la acción del complemento ENSG00000162722 TRIM58 chr1 -9.562 0.00142852 Regulación negativa expresión TLR2 ENSG00000169245 CXCL10 chr4 -5.704 0.01307760 Quimioatrayente células T, NK, dendríticas ENSG00000091181 IL5RA chr3 -3.930 0.00142852 Receptor para IL-5 ENSG00000090920 FCGBP chr19 -3.331 0.00142852 Proteína de unión a Fc IgG ENSG00000105366 SIGLEC8 chr19 -3.252 0.00142852 Receptor inhibidor membrana eosinófilos ENSG00000158488 CD1E chr1 -2.763 0.01055640 Presentación de antígenos lipídicos a células T ENSG00000179639 FCER1A chr1 -2.624 0.00142852 Receptor alta afinidad Fc IgE ENSG00000163735 CXCL5 chr4 -2.619 0.00689309 Quimiotaxis y activación de neutrófilos ENSG00000232629 HLA-DQB2 chr6 -2.465 0.03197730 Presentación antigénica ENSG00000237541 HLA-DQA2 chr6 -2.089 0.00142852 Presentación antigénica ENSG00000196083 IL1RAP chr3 -2.022 0.00142852 Proteína accesoria del receptor IL-1 ENSG00000172183 ISG20 chr15 2.034 0.00142852 Actividad antiviral frente a virus ARN ENSG00000137441 FGFBP2 chr4 2.044 0.00142852 Proteína con actividad citotóxica ENSG00000176083 ZNF683 chr1 2.045 0.00689309 Diferenciación células NK ENSG00000163464 CXCR1 chr2 2.058 0.00142852 Receptor para IL-8, activación neutrófilos ENSG00000198933 TBKBP1 chr17 2.060 0.01554680 Supervivencia células NK ENSG00000008516 MMP25 chr16 2.089 0.00142852 Metaloproteinasa secretada por células NK ENSG00000137265 IRF4 chr6 2.164 0.00142852 Factor regulador del interferon ENSG00000196549 MME chr3 2.170 0.00142852 CD10, enzima metaloproteinasa ENSG00000004468 CD38 chr4 2.173 0.00142852 Marcador de activación celular en linfocitos ENSG00000119632 IFI27L2 chr14 2.196 0.00142852 Actividad pro-apoptótica ENSG00000105374 NKG7 chr19 2.205 0.00142852 Enzima proteolítica liberada por células NK ENSG00000181036 FCRL6 chr1 2.251 0.00373316 Marcador diferenciación linfocitos citotoxicos ENSG00000077984 CST7 chr20 2.329 0.00142852 Regulación células NK y células T ENSG00000115523 GNLY chr2 2.339 0.00142852 Enzima citotóxica de células NK y CD8 ENSG00000160791 CCR5 chr3 2.340 0.00142852 Receptor quimiocinas células T ENSG00000137757 CASP5 chr11 2.348 0.03572250 Caspasa con actividad inflamatoria ENSG00000124256 ZBP1 chr20 2.371 0.00263678 Sensor de ARN viral de inmunidad innata ENSG00000105501 SIGLEC5 chr19 2.459 0.00263678 Molécula adhesión células fagocíticas ENSG00000057657 PRDM1 chr6 2.469 0.00142852 Represor IFN-b, proliferación cel plasmáticas ENSG00000142089 IFITM3 chr11 2.487 0.03388020 Efector antiviral sistema inmune innato ENSG00000100453 GZMB chr14 2.513 0.00142852 Granzima B expresado por células citotóxicas ENSG00000026751 SLAMF7 chr1 2.517 0.00142852 Regulación células NK, marcador cel plasmat ENSG00000161570 CCL5 chr17 2.533 0.00142852 RANTES, quimiotaxis leucocitos ENSG00000205020 CCL4L1 chr17 2.662 0.03637160 Citocina inflamatoria ENSG00000111537 IFNG chr12 2.754 0.02401320 Interferon-g, activación fagocitosis ENSG00000183508 FAM46C chr1 2.797 0.00142852 Proteína de respuesta a IFN-I ENSG00000160932 LY6E chr8 2.971 0.00142852 Proteína antiviral ENSG00000163568 AIM2 chr1 2.995 0.00263678 Proteína del inflamasoma ENSG00000100290 BIK chr22 3.272 0.00142852 Proteína antiviral ENSG00000112299 VNN1 chr6 3.293 0.00142852 Enzima panteteinasa secretada por células NK ENSG00000188389 PDCD1 chr2 3.319 0.00142852 Proteína de muerte celular ENSG00000100450 GZMH chr14 3.401 0.00142852 Granzima H secretada por células citotóxicas ENSG00000173585 CCR9 chr3 3.410 0.00142852 Receptor quimiocina linfocitos ENSG00000168811 IL12A chr3 3.479 0.01307760 Subunidad a IL-12 ENSG00000173372 C1QA chr1 3.499 0.00142852 Subunidad A componente c1q ENSG00000165948 IFI27L1 chr14 3.674 0.00142852 Respuesta a interferón, pro-apoptótica ENSG00000137965 IFI44 chr1 4.140 0.00142852 Proteína de respuesta a interferón ENSG00000123095 BHLHE41 chr12 4.249 0.00142852 Desarrollo de células B-1ª ENSG00000137959 IFI44L chr1 4.278 0.01467030 Respuesta a interferón, antiviral ENSG00000123689 G0S2 chr1 4.417 0.00142852 Activación y diferenciación células T CD8+ ENSG00000173369 C1QB chr1 4.532 0.00142852 Subunidad B componente c1q Tabla 20: Expresión diferencial de genes relacionados con respuesta inmunitaria en pacientes vs control mostrando la función de los genes Resultados ! 134! ENSG00000134285 FKBP11 chr12 4.821 0.01382790 Diferenciación células plasmáticas ENSG00000182985 CADM1 chr11 5.439 0.00142852 Adhesión celular que media citotoxicidad NK ENSG00000240505 TNFRSF13B chr17 5.476 0.00142852 TACI, activación células B ENSG00000117650 NEK2 chr1 5.595 0.00142852 Diferenciación células B ENSG00000105974 CAV1 chr7 5.673 0.00142852 Caveolinas, inmunidad innata ENSG00000100985 MMP9 chr20 5.712 0.00142852 Metaloproteinasa secretada por células NK ENSG00000109956 B3GAT1 chr11 5.742 0.00142852 CD57, marcador células NK ENSG00000089685 BIRC5 chr17 6.181 0.00142852 Desarrollo y activación células NK ENSG00000165409 TSHR chr14 6.695 0.03088750 Receptor TSH, activación células inmunes ENSG00000189233 NUGGC chr8 6.812 0.00142852 Formación centro germinal células B ENSG00000089692 LAG3 chr12 7.067 0.00142852 Activación células T, B y NK ENSG00000254709 IGLL5 chr22 7.269 0.00142852 Cadena ligera lambda inmunoglobulinas ENSG00000048462 TNFRSF17 chr16 7.364 0.00142852 Activación células B ENSG00000011590 ZBTB32 chr19 7.390 0.00142852 Proliferación células NK ENSG00000125726 CD70 chr19 7.468 0.00373316 Marcador activación células T ENSG00000170476 MZB1 chr5 9.009 0.00142852 Chaperona síntesis inmunoglobulinas ENSG00000145850 TIMD4 chr5 9.230 0.00142852 Desarrollo respuestas Th2 ENSG00000204936 CD177 chr19 9.922 0.00142852 Activación y proliferación neutrófilos ENSG00000115884 SDC1 chr2 10.731 0.00142852 Sindecano, proliferación de células inmunes ENSG00000132465 IGJ chr4 11.324 0.00142852 Cadena J, unión inmunoglobulinas ENSG00000165949 IFI27 chr14 23.755 0.00142852 Respuesta a interferón, pro-apoptótica Resultados ! 135! 5.5.2 Análisis del transcriptoma en el paciente vacunado vs grupo control En el análisis del transcriptoma realizado sobre las muestras obtenidas tras la pauta completa de vacunación comprado con el grupo control previo a la vacunación no obtuvimos ninguna expresión diferencial significativa, lo cual era de esperar pues se corresponde con momentos de reposo inmunológico con lo cual la huella de expresión génica no difiere de la del grupo control. Resultados ! 136! 5.6 Caracterización de la respuesta inmune celular tras la infección y tras la vacunación de rotavirus Tras el ensayo de WBS se analizaron las células totales resultantes tras la estimulación con el antígeno de rotavirus salvaje (RVwild) mediante citometría de flujo para el estudio del marcador de activación CD69 en diferentes subpoblaciones celulares: T-CD4+, T-CD8+ y célula Natural Killer (NK) CD16+CD56+ 5.6.1 Caracterización de la respuesta celular durante la fase aguda de la infección por rotavirus Se estudiaron los cambios en las poblaciones linfocitarias y el análisis de la expresión del marcador de activación linfocitaria CD69+ tras el ensayo de estimulación con antígeno salvaje de rotavirus mediante WBS en los 16 pacientes reclutados durante la fase aguda de la infección por rotavirus. Los datos obtenidos se representan en la Tabla 21 y el Gráfico 34: FASE AGUDA n=16 Células T-CD4 Células T-CD8 Células NK %CD4+ %CD4+CD69+ %CD8+ %CD8+CD69+ %CD16+CD56+ %CD16+CD56+ CD69+ Basal 42,1 (37,9-46,4) 14,8 (13,8-17.0) 19,9 (18,7-23,2) 5,2 (2,6-6,6) 6,9 (4,8-10,3) 0,6 (0,3-1,1) RVwild 42,0 (39,4-46,8) 17,7 (15,6-19,3) 20,4 (19,5-26,6) 11,3 (8,1-13,1) 8,0 (5,6-10,2) 1,3 (0,9-1,7) PHA 48,8 (47,5-51,3) 21,8 (20,4-25,3) 25,6 (23,4-27,0) 10,4 (9,3-11,3) 8,3 (6,7-10,1) 1,2 (1,0-1,5) Tabla 21: Valores relativos de las diferentes poblaciones linfocitarias y la expresión de marcador de activación CD69 en pacientes infectados en fase aguda. Valores expresados en porcentajes de linfocitos totales: mediana (rango intercuartílico) Resultados ! 137! Basal RVwild PHA 0 20 40 60 %CD4+ ns Basal RVwild PHA 0 10 20 30 %CD4+CD69+ p = 0.002 Basal RVwild PHA 0 10 20 30 40 %CD8+ p = 0.013 Basal RVwild PHA 0 5 10 15 20 %CD8+CD69+ p < 0.0001 Basal RVwild PHA 0 5 10 15 %CD16+CD56+ ns Basal RVwild PHA 0 1 2 3 4 %CD16+CD56+CD69+ p < 0.0001 Gráfico 34: Distribución de las diferentes poblaciones linfocitarias (células T-CD4+, células T-CD8+ y células NK CD16+CD56+) y expresión del marcador de activación CD69 tras el ensayo WBS de estimulación con antígeno salvaje de rotavirus (RVwild) en pacientes infectados en fase aguda. Se muestran las comparaciones realizadas mediante test de Wilcoxon (ns: no significativo) PHA: Fitohemaglutinina (control positivo) Discusión ! 144! 6.1.3 Diferencias en los niveles de anticuerpos alcanzados mediante la infección natural y la vacunación Los resultados del estudio no muestran diferencias significativas en los valores de GMT en suero y saliva finales alcanzados tras la infección natural y tras la vacunación (Tabla 4) Si bien los valores de seroconversión muestran diferencias significativas, estas son debidas a las diferencias en los valores basales de anticuerpos entre ambas cohortes. La razón de estas diferencias radicaría en las diferentes edades entre ambas cohortes y/o en la posibilidad de infecciones subclínicas previas en la cohorte infectados. Si bien el análisis de estos resultados presenta como limitación el bajo numero de pacientes analizados en la cohorte infectados, podemos concluir que tanto a nivel de mucosa oral como a nivel sistémico no se aprecian diferencias significativas en la respuesta de anticuerpos RV-IgA entre ambas cohortes. Recientemente, un trabajo publicado en Finlandia concluía que la respuesta de Anticuerpos frente a la proteína de cápside de rotavirus VP6 era similar tras la infección natural y tras la vacunación con RotaTeqâ (220) Este hallazgo está en línea con nuestros resultados basados en anticuerpos IgA totales frente a rotavirus, en suero y saliva. Discusión ! 145! 6.1.4 Correlación entre los compartimentos sérico y mucosa oral Los estudios de asociación realizados entre los valores obtenidos de RV-IgA en ambos compartimentos (sistémico y saliva) indican que no existe correlación alguna entre las respuestas humorales en suero y saliva (Gráfico 8) Estaríamos hablando, por tanto, de respuestas independientes y no relacionadas, generadas a partir del mismo estímulo. Si bien, estudios previos indicaban una asociación entre los valores de IgA intestinal y los valores séricos (208, 221), nuestros resultados muestran que esa asociación no es extrapolable a la mucosa oral. Sin embargo, en el caso de vacunas sistémicas si se ha demostrado una correlación positiva entre los valores obtenidos en suero y en saliva, como es el caso de la vacuna polisacárida conjugada frente a meningococo (222) Parece, por tanto, que la vía de administración condiciona la asociación entre las respuestas de ambos compartimentos. Ya se discutió previamente la conveniencia del uso del RV-IgA salivar como correlato de protección alternativo al sérico. El hecho de que no haya correlación entre ambos compartimentos apoya el uso de la saliva como un posible correlato alternativo, si bien los bajos valores de conversión encontrados y las limitaciones e interferencias presentes en saliva, lo desaconsejan desde nuestro punto de vista. Discusión ! 146! 6.2 Respuesta de citocinas en suero y en mucosa oral tras la infección natural de rotavirus y tras la vacunación El patrón de citocinas liberado durante la respuesta inmunitaria o persistente tras la infección nos muestra una visión importante del proceso inmune que se ha desarrollado (223) Esta respuesta se produce normalmente a las pocas horas de la infección o del contacto con el patógeno y la persistencia en el tiempo dependerá del tiempo de resolución del proceso y de la intensidad de la reacción (224) Por lo tanto, según las muestras tomadas en nuestro estudio debemos interpretar tres momentos bien diferenciados: basal (previo al contacto con el patógeno) que correspondería a la muestra Pre-Dosis 1 de la cohorte vacunados; fase aguda (fase aguda de la infección) y recuperación tras la infección/vacunación, que correspondería a las muestras de convalecencia (cohorte infectados) y Post-Dosis 3 (cohorte vacunados). 6.2.1 Respuesta inmune mediada por citocinas en respuesta a la infección por rotavirus en mucosa oral 6.2.1.1 Respuesta proinflamatoria del epitelio mucosa oral Los datos obtenidos muestran por primera vez en la literatura, que la infección natural por rotavirus produce en fase aguda una respuesta mediada por citocinas en la mucosa oral. Las células del epitelio oral reconocen la invasión del patógeno a través de sus receptores innatos específicos y son estimuladas a producir citocinas. Esta respuesta de Discusión ! 147! citocinas por parte de células de epitelio oral se había demostrado previamente durante infecciones o inflamaciones locales (225), pero es la primera vez que se demuestra durante una infección intestinal como el rotavirus, para la cual no hay evidencia de que infecte la cavidad bucal. Se observan diferencias significativas en los niveles de varias citocinas en los pacientes durante la fase aguda de la infección (Tabla 6), lo que sugiere una respuesta sistémica a la infección por rotavirus, que incluye la mucosa oral. Los datos muestran también que se trata de una respuesta coordinada asociada a un incremento de citocinas proinflamatorias, lo que indica una transferencia de la respuesta inflamatoria que se produce a nivel intestinal hacia la saliva en una forma perfectamente orquestada. Los pacientes en fase aguda de la infección muestran niveles incrementados de varias citocinas asociadas a respuesta inmune innata, particularmente IL-22 pero también IL-6, IL-8 e IL-1b (Gráfico 9) Todas ellas son citocinas proinflamatorias que actúan atrayendo diversas células inmunitarias como polimorfonucleares hacia el lugar de la infección. La mayoría de estas citocinas son producidas por el epitelio en respuesta a la entrada del patógeno (226, 227) Por tanto, aunque no hay evidencia hasta la fecha de entrada de partículas de rotavirus en el interior de la mucosa oral, nuestros datos sugieren que la mucosa oral produce una respuesta inmune a través de la liberación de mediadores proinflamatorios, presumiblemente a través de la comunicación inmunitaria entre la mucosa intestinal y la mucosa oral, mostrando una respuesta Discusión ! 148! inmune global en toda la mucosa del huésped en respuesta a la infección por rotavirus. Otras citocinas de origen adaptativo como el IFN-g, producida principalmente por los linfocitos T, no se ha encontrado diferencialmente expresado en los pacientes, lo que indicaría que el sistema inmune adaptativo no participaría al menos en la respuesta inmune en la mucosa oral. El IFN-l, relacionada con la defensa epitelial frente a patógenos virales tampoco no fue detectada en nuestro estudio. 6.2.1.2 Participación de la IL-22 en la respuesta inmune en la mucosa oral La citocina que más notablemente se mostró incrementada con respecto a sus valores basales fue la IL-22, citocina no asociada a síntesis epitelial. Esta citocina es principalmente sintetizada por células linfoides innatas tipo 3 (ILC-3), células dendríticas y células NK (228) No hay evidencia de síntesis de IL-22 por las células epiteliales, por tanto su presencia en la mucosa oral está asociada a una respuesta inmune de células linfoides innatas, sugiriendo la presencia de células linfoides activadas en la mucosa oral en respuesta a la infección intestinal. La diana principal para esta citocina son las células epiteliales donde actúa como potente mediador del proceso inflamatorio frente a los patógenos invasores (229) En modelos experimentales de ratón, la administración de IL-22 en células epiteliales intestinales produjo la eliminación de la infección por rotavirus actuando como agente antiviral de amplio espectro (230) También se ha Discusión ! 149! relacionada con funciones protectoras en el epitelio a través de su acción regeneradora en el epitelio dañado tras la infección (229, 231, 232) Por tanto, nuestros resultados muestran que no solo se produce una respuesta por parte de las células epiteliales en respuesta a la infección intestinal por rotavirus, sino que también se detecta implicación de las células linfoides innatas en esta respuesta. 6.2.1.3 Alteración en la producción del IFNa 2 en la mucosa Un dato bastante significativo encontrado en nuestro estudio de citocinas en saliva de pacientes infectados es que los valores de IFN-a2 se encontraron significativamente descendidos durante la fase aguda de la infección en comparación con la fase de convalencencia y con los valores basales de esta citocina. Varios estudios indican que la expresión constitutiva de interferón tipo I en las superficies mucosas juega un importante papel en el control de la proliferación y función del epitelio, regulando la renovación epitelial (233-235) Los rotavirus han desarrollado una amplia variedad de mecanismos dirigidos a evadir la respuesta antiviral del interferón tipo I del huésped con el objetivo de alcanzar un nivel de replicación optimo en el epitelio del huésped (236) por ejemplo evitando la detección de componentes virales o inhibiendo la función de los factores de transcripción que inician la respuesta del interferón (237) Sin embargo, es poco probable que los valores descendidos de IFN-a2 observados en la mucosa oral en fase aguda de la infección por rotavirus sean debidos a una inhibición específica promovida por el rotavirus, dado Discusión ! 150! que no hay evidencia de entrada del rotavirus en el epitelio oral. Parece mas probable que el daño producido en la mucosa intestinal conlleve una interferencia en la homeostasis normal de producción del interferón a lo largo de todo el sistema de mucosas. 6.2.1.4 Asociación de los valores de EGF con estancia hospitalaria Otro parámetro encontrado elevado en las muestras de saliva recogidas en fase aguda en los pacientes infectados es el factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Gráfico 9) Esta proteína, está vinculada a la regeneración del epitelio tras una lesión mucosa, estimulando la cicatrización de heridas y la reparación del tejido (238) Estudios previos en modelos animales de cerdos neonatales infectados con rotavirus apuntan hacia un papel beneficioso contar con niveles fisiológicos altos de EGF en estimular la recuperación del epitelio intestinal tras la infección (239) Por otro lado, la aplicación de EGF en la mucosa puede promover la proliferación intestinal y mejorar la recuperación tras una lesión intestinal, y podría ser un tratamiento efectivo en el síndrome de isquemiareperfusión en modelos animales (240) Otros autores, basándose en estudios animales, proponían la hipótesis de suplementación con EGF tras una lesión intestinal como potencial tratamiento que mejoraba el pronóstico de los pacientes (241) lo que abría la puerta a un novedoso posible tratamiento de recuperación tras la infección por rotavirus. Según nuestros resultados, los valores de EGF se encuentran aumentados durante la infección natural con rotavirus. Esta Discusión ! 151! sobreexpresión de los valores de EGF en los pacientes infectados podría sugerir una respuesta de recuperación por parte del huésped al daño inducido en la mucosa intestinal por la infección del rotavirus. La perdida de la homeostasis normal de la mucosa induciría la síntesis de EGF a lo largo de toda la mucosa con el objetivo de recuperar la integridad de esta tras la infección. Además, nuestros resultados muestran una asociación de los valores de EGF con la duración de la estancia hospitalaria (Gráfico 15) Cuanto mayor eran los niveles de EGF en las muestras de fase aguda de pacientes infectados, más corta era la estancia hospitalaria. Se podría argumentar que mayores niveles de EGF reflejarían una respuesta más poderosa de recuperación de la homeostasis en la mucosa, facilitando la recuperación y resultando en una menor estancia hospitalaria. Esta asociación, de confirmarse prospectivamente, permitiría realizar predicciones sobre estancia hospitalaria y recuperación de la integridad de la mucosa a través de un biomarcador no-invasivo como es la saliva. Sin embargo, debemos señalar como una limitación importante de nuestro estudio el limitado numero de individuos analizados. 6.2.1.5 Asociación entre otras citocinas encontradas en saliva y gravedad de la enfermedad Además del EGF, otras citocinas encontradas en saliva durante la fase aguda de la enfermedad mostraban asociación con parámetros clínicos de gravedad determinados por el score clínico de gravedad de Vesikari Discusión ! 152! (Tabla 10) Las citocinas que mostraban asociación significativa fueron IFN-g, IL-6, IL-10 e IL-12. Sin embargo, de todas ellas solamente la IL-6 mostró diferencias ligeramente significativas entre los valores en fase aguda y los valores de convalecencia, por ello la interpretación de esta asociación clínica debe ser hecha con precaución. 6.2.1.6 Perfil de citocinas en suero de pacientes infectados se asocia con gravedad de la enfermedad Los valores de citocinas obtenidos en el suero de los pacientes infectados y tras el periodo de convalecencia muestran varias citocinas con valores significativamente alterados durante la fase aguda de la infección (Tabla 6) Así, nos encontramos elevaciones significativas en EGF, IL-8, IL-1b, IL10, IL-12, TNF-a e IFN-g Los cambios más significativos se producen en EGF y en IFN-g. El aumento sérico de la molécula de EGF vendría a confirmar lo mismo que observamos en saliva y estaría en línea con la misma argumentación que el aumento en la mucosa, esto es, intento de recuperación de la mucosa dañada tras la infección. Por otro lado, IFN-g es una citocina liberada por una gran variedad de células inmunitarias entre las que destacan la célula T CD4+ y la célula NK, y constituye un potente activador de la respuesta inmune innata frente a virus a través de la activación de los macrófagos y sus capacidades fagocíticas (242) Otras citocinas significativamente elevadas corresponden a un perfil proinflamatorio, como son IL-8, IL-1b y TNF-a, producidas por múltiples estirpes celulares y que activan el estado de inflamación sistémica en el Discusión ! 153! huésped. Estos resultados vienen a confirmar el carácter sistémico de la infección por rotavirus, no limitándose la inflamación al compartimento intestinal sino que se traduce en la elevación de marcadores inflamatorios sistémicos específicos, como otros autores habían descrito anteriormente (243) Sin embargo, nuestros resultados muestran por primera vez en la literatura una asociación entre los valores séricos de algunas citocinas y varios parámetros clínicos de gravedad recogidos en el score de Vesikari (Tabla 11) que no muestran dependencia con la edad del paciente. De este modo, podemos establecer un perfil de citocinas séricas (IFN-a, IFNg, IL-1b e IL-12) que muestran una asociación positiva con el score de gravedad de Vesikari (Gráfico 16) Hasta la fecha, la estratificación de gravedad en la infección por rotavirus se realiza en base a escalas exclusivamente clínicas que no incorporan ningún parámetro de laboratorio (244) Sería interesante evaluar de acuerdo a estos resultados si la incorporación de este perfil de citocinas séricas a las actuales escalas de clasificación de la gravedad podrían aportar algo. 6.2.2 Respuesta inmune mediada por citocinas en respuesta a la vacunación El análisis de citocinas tras la vacunación frente a rotavirus muestra como no se producen cambios significativos en sus valores en suero y saliva (Tabla 7) Estos resultados indican que la vacunación no produciría inflamación sistémica, al menos que perdure un mes después de la ultima dosis de vacuna.