Caracterización molecular de cepas de Escherichia coli del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 y de otros clones causantes de infecciones extraintestinales en seres humanos. Genes de virulencia y de resistencia

NTIAGO DE COMPOSTELA Facultad de Veterinaria e Rosalia Seferina Mamani Huarani LUGO, 2014 U NIVERSIDADE DE S ANTIAGO DE C OMPOSTELA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOXÍA E PARASITOLOXÍA FACULTADE DE VETERINARIA T ESIS D OCTORAL Caracterización Molecular de Cepas de Escherichia coli del Grupo Clonal O25b:H4-B2-ST131 y de otros Clones Causantes de Infecciones Extraintestinales en Seres Humanos. Genes de Virulencia y de Resistencia. AUTORIZACIÓN DE LOS DIRECTORES D. Jorge Blanco Álvarez Catedrático del Departamento de Microbioloxía e Parasitoloxía de la USC D. Miguel Blanco Álvarez Profesor Titular del Departamento de Microbioloxía e Parasitoloxía de la USC Como Directores de la Tesis Doctoral titulada “Caracterización molecular de cepas de Escherichia coli del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 y de otros clones causantes de infecciones extraintestinales en seres humanos. Genes de virulencia y de resistencia.” Presentada por Dñ. ROSALIA SEFERINA MAMANI HUARANI Alumna del Programa de Doctorado: Microbioloxía e Parasitoloxía Autorizan la presentación de la tesis indicada, considerando que reúne los requisitos exigidos en el artículo 34 del reglamento de los Estudios de Doctorado, y que como Directores de la misma no incurren en las causas de abstención establecidas en la ley 30/1992. Lugo, 27 de Noviembre de 2014 Fdo. Jorge Blanco Fdo. Miguel Blanco Jorge Blanco Álvarez, como Director del Laboratorio de Referencia de E. coli (LREC) del Departamento de Microbioloxía e Parasitoloxía de USC, informo: Que la presente Memoria experimental de la Tesis Doctoral titulada “Caracterización molecular de cepas de Escherichia coli del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 y de otros clones causantes de infecciones extraintestinales en seres humanos. Genes de virulencia y de resistencia”, elaborada por Dñ. ROSALIA SEFERINA MAMANI HUARANI, ha sido realizada bajo su dirección y la del profesor Miguel Blanco Álvarez en el LREC-USC de la Facultade de Veterinaria. Lugo, 27 de Noviembre de 2014. Fdo. Jorge Blanco Álvarez Catedrático de Microbiología Director del Laboratorio de Referencia de E.coli (LREC) Laboratorio Nacional de Referencia para la Detección de E.coli en Alimentos Departamento de Microbioloxía e Parasitoloxía Facultade de Veterinaria A toda mi familia, especialmente a mis padres Ernesto y Mercedes por apoyarme siempre AGRADECIMIENTOS Me siento muy afortunada por continuar mi aprendizaje en Microbiología y muy feliz por finalizar esta etapa y emprender nuevos objetivos. Quiero agradecer a todos los investigadores que han colaborado en los estudios realizados. Jorge Blanco Álvarez, director del laboratorio LREC, por haberme dado la oportunidad de realizar esta tesis, por acogerme en su laboratorio, por la dirección y coordinación del estudio, por su ayuda en la revisión crítica de esta memoria, por enseñarme a crecer profesionalmente, por todo su apoyo y paciencia durante todos estos años. Miguel Blanco, por la dirección y por toda su paciencia durante la revisión de la presente tesis, por la dirección en la detección de genes de virulencia y cepas BLEE por PCR. Azucena Mora, por la dirección de los estudios de tipado molecular por PFGE y MLST. Jesús Blanco, por la dirección en la realización del serotipado, por escucharme y por todo su apoyo. Cecilia López y Ghizlane Dahbi, por su ayuda en la realización de la parte experimental del presente estudio. Monserrat Lamela, por su amistad y compañía y por toda su ayuda en la preparación de medios de cultivo. A mis compañeros de laboratorio Verónica Gómez, Alexandra Herrera, Juan Marzoa y Susana Viso, por su compañía y amistad. María Pilar Alonso, Fernando García-Garrote, Amparo Coira, Julia Pita Carretero, Ángeles Espiño e Inés Trabado de la Unidad de Microbiología Clínica del Hospital Universitario Lucus Augusti (HULA) de Lugo por el aislamiento e identificación de las cepas de E. coli aisladas de pacientes con infecciones urinarias y bacteriemias y por la realización de los antibiogramas. Marie-Hélène Nicolas-Chanoine (Service de Microbiologie, Hôpital AP-HP Beaujon, Clichy, France; Faculté de Médecine D. Diderot, Université Paris 7, Paris, Francia) James R. Johnson y Brian Johnston (Veterans Affairs Medical Center and University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota, USA) A Veronika Tchesnokova y Mariya Billig (Department of Microbiology, University of Washington School of Medicine, Steattle, WA, U.S.) Juan José González-López, Alicia Coelho, María Nieves Larrosa, J. Natalia Quintero-Zarate, Guillermo Prats (Servei de Microbiología, Hospital Vall d’Hebron ; Departament de Genètica i Microbiología, Universitat Autònoma de Barcelona). Lorena López-Cerezo, Álvaro Pascual, Jesús Rodríguez-Baño (Unidad Clínica de Enfermedades Infecciosas y Microbiología, Hospital Universitario Virgen Macarena; Departamento de Microbiología y Departamento de Medicina, Facultad de Medicina, Universidad de Sevilla, Sevilla) Luis Martínez-Martínez, Jorge Calvo (Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Marqués de Valdecilla-IDIVAL, y Departamento de Biología Molecular, Universidad de Cantabria, Santander) Fernando Chaves, María Ángeles Orellana (Servicio de Microbiología, Hospital 12 de Octubre, Madrid) Fernando de la Cruz y Val Fernández (Instituto de Biomedicina y Biotecnología, Departamento de Biología Molecular, Universidad de Cantabria, Santander) Germán Bou, Ana Fernández (Servicio de Microbioloxía, Complexo Hospitalario Universitario, A Coruña) Begoña Fernández (Unidad de Microbioloxía, Complexo Hospitalario de Ourense) Andrés Agulla (Servicio de Microbioloxía, Complexo Hospitalario Arquitecto Marcide-Prof. Novoa Santos, Ferrol) Y al Grupo Español para Infecciones Nosocomiales (GEIH) formado por: C. Martínez Peinado (Villajoyosa, Alicante), J. F. Ordás (Cangas de Nancea, Asturias), E. Garduño (Badajoz), M. A. Domínguez (Barcelona), F. Navarro (Barcelona), G. Prats (Barcelona), F. Marco (Barcelona), E. Ojeda (Burgos), P. Marín (Cádiz), R.l Carranza (Alcazar de S. Juan, Ciudad Real), F. Rodríguez (Córdoba), C. García Tejero (Figueras, Gerona), F. Artiles (Gran Canaria), B. Palop (Granada), I. Cuesta (Jaén), M. Cartelle ( A Coruña), M. D. Rodríguez (Ferrol, A Coruña), I. Fernández (León), E. Ugalde (Logroño), R. Cantón (Madrid), E. Cercenado (Madrid), F. Chaves (Madrid), J. J. Picazo (Madrid), A. Delgado (Alcorcón, Madrid), C. Guerrero (Murcia), B. Fernández (Orense), A. Fleites (Oviedo), A. Oliver (Palma de Mallorca), J. J. García (Pamplona), M. García (Pontevedra), J. Elías (Salamanca), J. Calvo (Santander), M. Treviño (Santiago de Compostela), M. Ruiz (Sevilla), M. A. Díaz and J.R. Hernández-Bello (Sevilla), M. Lara (Tenerife), L. Torres (Teruel), E. García (Toledo), D. Navarro (Valencia), M. Gobernado (Valencia), A. Tenorio (Valladolid), I. Otero (Vigo), L. Michaus (Vitoria), J. Castillo (Zaragoza). Cruzando el Atlántico, en mí querido país Bolivia, quiero agradecer a: Volga Iñiguez, por todos sus consejos, apoyo y paciencia y sobre todo por enseñarme a ser mejor persona y profesional. Rolando Sánchez, por ser mi profesor, mi tutor, por sus consejos, su apoyo incondicional, por creer en mí, por enseñarme a luchar y alcanzar mis objetivos. Juan Pablo Torrico, por ser mi amigo, por ayudarme a encontrar mi camino, por hacer que encuentre mi gran pasión la MICROBIOLOGIA. A mis amigos Julia Barreta, Paola Romesin, Rosario Rivera, Rosenka Tejerina, Nataniel Mamani, Samantha Sánchez, Roció Pinto, Janeth Serrudo y Vicky Yujcra, por estar siempre conmigo en las buenas y en las malas, por todos los momentos que pasamos y que recordaremos siempre, en el lugar donde estemos. A mis amigos de España Irene, Luz, María Luz, Teresa, Pepe, Ana, Marina y Guillermo, por escucharme y apoyarme, por hacerme sentir como en casa. A mis amigos internacionales Lupe G., Asia, Amanda P., Carolina, David, Aida C., Santiago, Fabián R., Edgar, Carlos T. y Armando, por cuidarme, por escuchar mis tristezas y alegrías, por su compañía durante mi recorrido por Europa, por todo su apoyo y amistad. A la Agencia Española de Cooperación Internacional para el desarrollo (EACID) por concederme la beca doctoral. Finalmente, a Dios, al Apóstol Santiago y a la Virgen por cuidarme, por permitirme cumplir mis objetivos, a la vida por haberme dado tanto. Esta tesis ha sido financiada por: Este estudio ha sido financiado por el proyecto FIS PI09/01273 y la Red Española de Investigación en Patología Infecciosa (REIPI RD06/008/1018 y 1016) (Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigación Sanitaria, Ministerio de Economía y Competitividad, Gobierno de España), por los proyectos 09TAL007261PR y EM2014/001 y los programas de Consolidación y Estructuración de Unidades de Investigación Competitivas 2007/000044-0 y CN2012/303 de la Xunta de Galicia (Consellería de Economía e Industria y Consellería de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria, Fondo Europeo para el Desarrollo Regional), por el proyecto AGL2013-47852-R (Ministerio de Economía y Competitividad, Gobierno de España) y por el proyecto FEDERINNTERCONECTA-COLIVAC (CDTI, Ministerio de Economía y Competitividad, Gobierno de España; Consellería de Economía e Industria, Xunta de Galicia; The European Regional Development Fund, ERDF). Rosalía Mamani agradece a la Agencia Española de Cooperación Internacional (AECI) (Ministerio de Asuntos Exteriores y de Cooperación, Gobierno de España) por la beca recibida y a la USC por los contratos que le han permitido financiar su estancia en España y completar la parte experimental de la Tesis Doctoral. ÍNDICE DE CONTENIDOS RESUMEN……………………………………………………………………. I 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………... 1 1.1. Escherichia coli…………………………………………………………. 1 1.2. Patogénesis……………………………………………………………… 1 1.3. E. coli patógeno extraintestinal…………………………………............ 1 1.3.1. Factores de virulencia………………………………………………… 2 1.3.1.1. Adhesinas…………………………………………………………… 3 1.3.1.2. Toxinas……………………………………………………………… 11 1.3.1.3. Sideróforos……………………………………………………......... 19 1.3.1.4. Antígeno capsular K………………………………………………… 22 1.3.1.5. Antígeno somático O………………………………………………... 24 1.3.1.6. Colicinas…………………………………………………………….. 27 1.3.1.7. Proteínas de la membrana externa (Iss y TraT)……………….......... 28 1.3.1.8. Hemaglutinina sensible a la temperatura (Tsh)…...………………… 29 1.3.1.9. Proteína especifica uropatogénica (Usp)……..……………………... 30 1.3.1.10. Invasina IbeA……………………………………………………… 31 1.3.2. Islas de patogenicidad………………………………………………… 32 1.3.3. Tipado de las cepas…………………………………………………… 33 1.3.4. β-lactamasas de espectro extendido (BLEE)………………………..... 35 1.3.4.1. Distribución de las BLEE a nivel mundial………………………..... 37 1.3.4.2. Distribución de las BLEE en España…………………………......... 40 1.3.5. Grupo clonal ST131…………………………………………………... 41 1.3.5.1. Subclones del grupo clonal ST131………………………………..... 46 1.3.6. Grupo clonal O15:H1-D-ST393……………………………………… 47 1.3.7. Grupo clonal GCA-D-ST69……………………….............................. 49 1.3.8. Resistencia a antibióticos…………………………………………….. 51 1.3.9. Epidemiología de la bacteriemia……………………………………… 56 2. OBJETIVOS…………………………………………………………….......... 61 3. MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………...... 62 3.1. Cepas clínicas de E. coli…………………………………………........... 62 3.2. Cepas de referencia……………………………………………………... 64 3.3. Serotipado convencional y molecular………………………………….. 64 3.3.1. Serotipado convencional por aglutinación……………………........... 64 3.3.2. Tipado molecular de los antígenos H ………..………………………. 67 3.3.3. Tipado molecular de las variantes O25a y O25b por PCR…………… 67 3.4. Detección molecular de los grupos clonales ST131, O15-D-ST393 y GCA-D-ST69 y los subclones H22, H30-Rx, H30 no-Rx y H41............ 69 3.5. Determinación de los grupos filogenéticos por PCR…………………... 70 3.6. Detección y tipado de BLEE por PCR y secuenciación……………….. 70 3.7. Detección de genes de virulencia por PCR……………………………. 71 3.8. Protocolo de PCR……………………………………….……………… 71 3.9. Determinación de secuencias tipo por MLST…………………………. 73 II RESUMO Nos últimos anos, as cepas de Escherichia coli do grupo clonal ST131 propagáronse rapidamente a nivel mundial. Por esa razón, nós formulámonos estudar as características das cepas ST131 illadas nos diferentes hospitais españois e comparámolas coas cepas non-ST131. No estudo I, ao analizar 654 cepas de E. coli produtoras de β-lactamasas de espectro estendido (BLEE) illadas de pacientes entre 2005 e 2008 en 4 hospitais de Galicia, identificamos 5 grupos clonais produtores de CTX-M-14 (O1:HNM-D-ST59, O15:H1-DST393, O20:H34/HNM-D-ST354, O25b:H4-B2-ST131 e ONT:H21,42-B1-ST101). Cada grupo clonal mostrou un perfil de xenes de virulencia e de resistencias específico. No estudo II, ao caracterizar 94 cepas de E. coli produtoras de BLEE illadas de pacientes dun Hospital de Barcelona no ano 2008, o grupo clonal O25b:H4-B-ST131 foi o máis prevalente (32%), sendo o 63% das cepas ST131 produtoras de CTX-M-15 e o 27% de SHV-12. As 30 cepas ST131 exhibiron un significativo maior número de xenes de virulencia (media 9,6) que as 64 cepas non ST131 (media 5,8). O estudo III é o primeiro europeo no que se analizan conxuntamente os grupos clonais O25b:H4-B2-ST131, O15:H1-D-ST393 e GCA-D-ST69, e entre as 500 cepas de E. coli illadas en 5 hospitais de España no ano 2009 (7% BLEE), observamos que o máis prevalente foi o O25b:H4-B2-ST131 (12%). As cepas ST131 presentaron o maior número de xenes de virulencia (media 8,1; rango 4 a 13 xenes), comparado coas cepas ST393 (media 6,0; rango 3 a 7) e ST69 (media 5,4; rango 2 a 9). No estudo IV, analizamos 1.021 cepas de E. coli produtoras de BLEE que foron illadas en 44 hospitais españois. Un total de 195 cepas (19%) foron do grupo clonal O25b:H4-B2-ST131. Ao caracterizar 130 cepas ST131 representativas, o 74% delas foron produtoras de CTX-M15. Desenvolvemos un sistema para clasificar as cepas ST131 atendendo aos seus xenes de virulencia en virotipos e comprobamos que a maioría das cepas dun mesmo virotipo agrupábanse en clusters específicos xerados por PFGE-XbaI implicando unha base clonal. No estudo V, analizamos 3.260 cepas de E. coli bacteriémicas illadas no Hospital Universitario Lucus Augusti (HULA) de Lugo entre os anos 1989 e 2011. Entre estas cepas identificamos 9 filoserogrupos prevalentes (O1-D, O2-B2, O4-B2, O6-B2, O8-A, O9-A, O15-D, O18-B2 e O25-B2), sendo o O6-B2 o máis prevalente nos períodos 1989-1998 e 1999-2008 e o O25-B2 no período 2009-2011. Ao analizar as 157 cepas ST131 bacteriémicas illadas entre os anos 1993 e 2011 de pacientes do HULA observamos que os 3 subclons maioritarios (H30-Rx, H30 non-Rx e H22) son os mesmos que predominaban nos estudos realizados recentemente en EEUU e Canadá. Como novidade concluímos que as cepas dos virotipos A, B, C, E e F pertencen aos subclons H30-Rx e/ou H30 non-Rx, mentres que as cepas do virotipo D pertencen ao subclón H22. Como nos estudos realizados en EEUU e Canadá observamos que durante os primeiros anos (1993-1999) as cepas H22 eran as máis prevalentes, pero dende que emerxeron no 2001 as cepas H30 se foi incrementando continuamente a súa prevalencia sendo na actualidade as predominantes. De especial interese clínico é a asociación do subclón H30Rx coa produción de CTX-M-15. Ademais, os nosos resultados indican que as cepas do subclón H30-Rx posúen un maior número de xenes de virulencia que as cepas do subclón H30 non-Rx. Non obstante, ambos os dous subclons están a expandirse na actualidade, predominando o subclón H30-Rx entre as cepas produtoras de BLEE e o H30 non-Rx entre as cepas resistentes ás quinolonas fluoradas non produtoras de BLEE. Os nosos resultados tamén coinciden cos encontrados por outros autores no sentido que a nivel internacional predominan as cepas O25b:H4-B2-ST131 H30 do virotipo C. III SUMMARY In recent years, Escherichia coli strains of clonal group ST131 have rapidly spread worldwide. For that reason, the objectives of the present doctoral thesis were to analyze the characteristics of the ST131 E. coli strains isolated from different Spanish hospitals and to compare them with non-ST131 E. coli strains. In the first study (study I), 654 extendedspectrum β-lactamase (ESBL)-producing E. coli strains isolated from patients between 2005 and 2008 in 4 hospitals in Galicia were characterized with 5 CTX-M-14-producing clonal groups identified (O1:HNM-D-ST59, O15:H1-D-ST393, O20:H34/HNM-D-ST354, O25b:H4-B2-ST131 and ONT:H21,42-B1-ST101). Each clonal group showed a specific profile of virulence genes and resistance. In a second study (study II), 94 ESBL-producing E. coli strains isolated from patients in a hospital in Barcelona in 2008 showed that the O25b:H4-ST131-B clonal group was the most prevalent (32%), being 63% of the ST131 strains CTX-M-15 producers and 27% SHV-12. Furthermore, the 30 ST131 strains showed a significant larger number of virulence genes (mean 9.6) versus the 64 non-ST131 strains (mean 5.8). The study III was the first in Europe to analyze and compare together the three clonal groups O25b:H4-B2-ST131, O15:H1-D-ST393 and GCA-D-ST69. Among 500 E. coli strains isolated in 2009 in 5 Spanish hospitals (7% ESBL), the O25b:H4-B2-ST131 was the most prevalent (12%). Besides, ST131 strains showed the highest number of virulence genes (mean 8.1; range 4 to 13 genes) compared to ST393 (mean 6.0; range 3 to 7) or to ST69 strains (mean 5.4; range 2 9). In the study IV, 1,021 ESBL-producing E. coli strains were isolated in 44 Spanish hospitals. A total of 195 strains (19%) belonged to the clonal group O25b:H4-B2-ST131 and when a representative group of 130 ST131 strains were analyzed, 74% resulted positive for CTX-M-15. We developed a system to classify ST131 strains in virotypes based on the presence or absence of a group of distinctive virulence genes, showing that most strains of the same virotype grouped together in specific XbaI-PFGE clusters, suggesting a clonal basis for the virotypes. In the study V, 3,260 bacteremic E. coli strains isolated at the University Hospital Lucus Augusti (HULA) of Lugo between 1989 and 2011 were analyzed. Nine prevalent phylo-serogroups were identified (O1-D, O2-B2, O4-B2, O6B2, O8-A, O9-A, O15-D, O18-B2 and O25-B2). Phylo-serogroup O6-B2 was the most prevalent in the periods from 1989 to 1998 and 1999 to 2008, and the O25-B2 in the period 2009-2011. By analyzing the 157 ST131 bacteremic strains isolated from 1993 to 2011, we detected the 3 major subclones (H30-Rx, H30 non-Rx and H22) are the same that those reported as the most prevalent in recent studies from USA and Canada. What we concluded as new is that ST131 strains of virotypes A, B, C, E and F belong to the H30-Rx and/or H30 nonRx subclones, whereas strains of virotype D belong to H22 subclone. Like other studies from USA and Canada, we observed that the H22 strains were the most prevalent during the early years (1993-1999); however, H30 strains have been increasing since its emergence in 2001 being predominant at present. Of particular clinical interest is the association of the H30-Rx subclone with the production of CTX-M-15. Furthermore, our results indicate that the H30-Rx subclone carry more virulence genes than the H30 non-Rx. However, both subclones are spreading today, predominantly H30-Rx subclone among ESBL-producing strains and H30 non-Rx among non-ESBL strains resistant to fluoroquinolones. In agreement with other authors, our findings show that O25b: H4-B2-ST131 H30 strains of virotype C are globally predominant. IV Esta tesis está basada en resultados no publicados y en los estudios Emergence of clonal groups O1:HNM-D-ST59, O15:H1-D-ST393, O20:H34/HNM-D-ST354, O25b:H4-B2-ST131 and ONT:H21,42-B1-ST101 among CTX-M-14-producing Escherichia coli clinical isolates in Galicia, northwest Spain. Mora A, Blanco M, López C, Mamani R, Blanco JE, Alonso MP, García-Garrote F, Dahbi G, Herrera A, Fernández A, Fernández B, Agulla A, Bou G, Blanco J. Int J Antimicrob Agents. 2011 Jan;37(1):16-21. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2010.09.012. Epub 2010 Nov 13. Spread of Escherichia coli O25b:H4-B2-ST131 producing CTX-M-15 and SHV-12 with high virulence gene content in Barcelona (Spain). Coelho A, Mora A, Mamani R, López C, González-López JJ, Larrosa MN, Quintero-Zarate JN, Dahbi G, Herrera A, Blanco JE, Blanco M, Alonso MP, Prats G, Blanco J. J Antimicrob Chemother. 2011 Mar;66(3):517-26. doi: 10.1093/jac/dkq491. Epub 2010 Dec 21. National survey of Escherichia coli causing extraintestinal infections reveals the spread of drug-resistant clonal groups O25b:H4-B2-ST131, O15:H1-D-ST393 and CGA-D-ST69 with high virulence gene content in Spain. Blanco J, Mora A, Mamani R, López C, Blanco M, Dahbi G, Herrera A, Blanco JE, Alonso MP, García-Garrote F, Chaves F, Orellana MÁ, Martínez-Martínez L, Calvo J, Prats G, Larrosa MN, González-López JJ, López-Cerero L, Rodríguez-Baño J, Pascual A. J Antimicrob Chemother. 2011 Sep;66(9):2011-21. doi: 10.1093/jac/dkr235. Epub 2011 Jun 13. Four main virotypes among extended-spectrum-β-lactamase-producing isolates of Escherichia coli O25b:H4-B2-ST131: bacterial, epidemiological, and clinical characteristics. Blanco J, Mora A, Mamani R, López C, Blanco M, Dahbi G, Herrera A, Marzoa J, Fernández V, de la Cruz F, Martínez-Martínez L, Alonso MP, Nicolas-Chanoine MH, Johnson JR, Johnston B, LópezCerero L, Pascual A, Rodríguez-Baño J; Spanish Group for Nosocomial Infections (GEIH). J Clin Microbiol. 2013 Oct;51(10):3358-67. doi: 10.1128/JCM.01555-13. Epub 2013 Aug 7. Introducción 1 1. INTRODUCCION 1.1. Escherichia coli (E. coli) La E. coli fue descubierta en 1885 por Theodor Escherich (1857-1911). Es una de las especies bacterianas más estudiadas, no solamente por sus capacidades patógenas, sino también como sustrato y modelo de investigaciones metabólicas, genéticas, poblacionales y de diversa índole (Escherich, 1885; Humbert et al., 2000; Uzzau y Fasano, 2000). Forma parte de la familia Enterobacteriaceae. Estas bacterias son de rápido crecimiento y amplia distribución en el suelo, agua, animales y vegetales. En conjunto, la importancia de las enterobacterias en patología humana puede cuantificarse constatándose que constituyen aproximadamente el 50% de todos los aislamientos clínicamente significativos (Donnenberg y Whittam, 2001; Fasano, 2001). 1.2. Patogénesis La E. coli coloniza el tracto gastrointestinal y establece con el hospedador una relación estable de mutuo beneficio como integrante de la microbiota del hombre y de muchos animales. Su presencia en el agua y los alimentos es un indicador de contaminación fecal reciente (Humbert et al., 2000). No obstante, hay muchas cepas de E. coli patógenas que pueden causar infecciones entéricas (diarrea, disentería, colitis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico y enfermedad de los edemas) o extraintestinales (Domingue et al., 1985; Alonso et al., 1987; Blanco et al., 1996; Blanco et al., 1997; Donnenberg y Whittam, 2001; Fecteau et al., 2001; Arbeloa et al., 2009). 1.3. E. coli patógeno extraintestinal (ExPEC) La E. coli es uno de los microorganismos que con mayor frecuencia se asocia con infecciones extraintestinales, tanto en seres humanos como en los animales. Dentro de las infecciones que provoca están las infecciones del tracto urinario (ITU), bacteriemias o septicemias, meningitis, peritonitis, infecciones pulmonares y de heridas (Domingue et al., 1985; Blanco et al., 1991; Introducción 2 Blanco et al., 1996; Dalmau et al., 1996; Blanco et al., 1997; Abe et al., 2008; Houdouin et al., 2008; Manges et al., 2008; Mora et al., 2009). Es responsable del 20% al 30% de las bacteriemias de la comunidad y del 20% de las nosocomiales. Estas infecciones se originan en el tracto urinario y en la cavidad intrabdominal. Comúnmente se dan en individuos con enfermedad de base o con enfermedades crónicas de larga evolución. Su pronóstico suele ser mejor que la infección por otros microorganismos bacilos gramnegativos, con una tasa de mortalidad de entre el 4% y el 18%, que se asocia principalmente a leucopenia, inmunodepresión y la adquisición nosocomial. No obstante, en los últimos 10 años las cepas de E. coli bacteriémicas han desarrollado un incremento progresivo de resistencia a antibióticos, lo cual dificulta su tratamiento (Javaloyas, 2003; Oteo et al., 2006; Jones et al., 2008; Naseer et al., 2009). Se han desarrollado 2 teorías para explicar la relación entre las cepas fecales de E. coli y las causantes de ITU: la teoría de la prevalencia y la teoría de la especial patogenicidad. La primera sostiene que la cepa presente en mayor abundancia en la flora normal intestinal es la que usualmente causa las ITU, mientras que la segunda apoya la idea de que sólo determinadas cepas con factores de virulencia son capaces de producir las infecciones extraintestinales. Los resultados obtenidos en las décadas de los ochenta y noventa del siglo pasado confirman la validez de la teoría de la especial patogenicidad, ya que se comprobó que las cepas causantes de ITU presentaban una serie de factores de virulencia que les permite invadir, colonizar y dañar el tracto urinario, provocando infecciones urinarias bajas y altas (Korhonen et al., 1985; Orskov y Orskov, 1985; Blanco et al., 1991; Johnson, 1991; Blanco et al., 1996). 1.3.1. Factores de virulencia Entre los factores de virulencia de las cepas ExPEC (extraintestinal pathogenic Escherichia coli), se encuentran las adhesinas (fimbrias P y S), la producción de toxinas (Hly y CNF), ciertos factores somáticos O (O1, O2, O4, O6, O7, O18, O25 y O75) y capsulares (K1, K2, K3, K12 y K13), la resistencia a la actividad bactericida del suero y a la fagocitosis, la producción de colicina V y la expresión de sideróforos. Todos estos factores de virulencia contribuyen conjuntamente a potenciar su patogenicidad (Blanco et al., 1992a; Moulin-Schouleur et al., 2006; Bidet et al., 2007; Johnson et al., 2008; Olesen et al., 2009). Introducción 3 1.3.1.1. Adhesinas Las fimbrias son apéndices filamentosos formados por subunidades de proteínas que están anclados en la membrana externa de las bacterias gramnegativas. Las fimbrias pueden ser rígidas o flexibles. La función principal de las fimbrias es servir como soporte de las adhesinas, encargadas de reconocer a su receptor en la célula hospedadora (FIGURA 1). Las adhesinas son, por lo general, proteínas que tienen afinidad por los azúcares y su función es la adherencia. Las cepas ExPEC poseen genes que codifican para varias clases de adhesinas, como las fimbrias tipo 1, tipo P, S y Afa/Dr (Schilling et al., 2001; Smithson, 2008; Molina, 2014). FIGURA 1. Las adhesinas fimbriales son parte constitutiva de una fimbria y las moléculas encargadas de asegurar la adhesión de esa estructura a su receptor en la célula hospedadora (http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/patogenicidad.html). Las fimbrias tipo 1 (fimbrias sensibles a la manosa) están presentes en la inmensa mayoría (99%) de las cepas de E. coli. Estas fimbrias se unen a los residuos de α-D-manosa presentes en los receptores glicoproteicos. Al principio la única función identificada para la fimbria tipo 1 era que mediaba la adherencia a la célula hospedadora, pero en otros estudios se mostró que esta fimbria está implicada en la invasión de las células epiteliales de la vejiga (Martínez et al., 2000; Schilling et al., 2001). El receptor integrina α3β1 es expresado por muchos tipos de células hospedadoras, incluyendo las células epiteliales de la vejiga. A él se enlaza la adhesina FimH, localizada en la punta de la fimbria tipo 1, y media la internalización de la E. coli que posee esta fimbria. Las integrinas funcionan como moléculas de adhesión superficial o como receptores de adhesión. La manipulación de integrinas, y la posterior cascada de señalizaciones, Receptor Introducción 4 es un mecanismo común por el cual los patógenos consiguen entrar en las células hospedadoras (Lodish et al., 2005; Wiles et al., 2008). FIGURA 2. Invasión de la célula hospedadora por UPEC. La invasión bacteriana mediante FimH a la célula hospedadora requiere de la dinámica reorganización del citoesqueleto de actina del hospedador y un número de integrinas asociadas a factores de señalización y proteínas adaptadoras (α-actina y vinculina) que regulan el dinamismo de la actina que ha sido implicada en el proceso de invasión (Wiles et al., 2008). En la FIGURA 2, se muestra como la adhesina FimH se enlaza al receptor integrina α3β1 y posiblemente a otros receptores, los cuales se agrupan dentro de las balsas lipídicas. Las balsas lipídicas son microdominios de la membrana plasmática ricos en colesterol, esfingolípidos, proteínas receptoras de la superficie celular y proteínas señalizadoras. La unión al receptor desencadena una cascada de señalizaciones relacionadas con la fosforilación de la “kinasa adhesión focal” (FAK), la formación transitoria entre FAK y fosfoinositol-3-quinasa (PI-3K), la activación de Rac1 (GTPasa de la familia Rho) y la formación transitoria compleja entre el citoesqueleto y el andamio de proteínas α-actina y vinculina. La vinculina es una proteína del citoesqueleto que está asociada a la adhesión focal e involucrada en el anclaje de las moléculas de integrina al citoesqueleto de actina. La vinculina cumple la función de proteína adaptadora. Todos estos eventos estimulan la reorganización de la actina, provocando que la membrana plasmática de la célula hospedadora se cierre alrededor y envuelva a la bacteria enlazada para la subsecuente internalización. Una vez internalizada, UPEC (uropathogenic Escherichia coli) Introducción 5 puede ser transferida a compartimientos similares al endosoma tardío, que a menudo se localizan dentro de una malla de filamentos de actina. La bacteria enlazada a la actina permanece inactiva dentro de estos compartimentos que pueden servir como reservorio para infecciones recurrentes del tracto urinario. La liberación de UPEC dentro del citosol de la célula hospedadora estimula el rápido crecimiento de la bacteria y la formación de comunidades intracelulares similares a una biopelícula. Las biopelículas son comunidades de microorganismos que crecen embebidos en una matriz de exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o un tejido vivo. Permiten a los microorganismos sobrevivir en condiciones ambientales adversas incluyendo los que el sistema inmune y los antibióticos producen (Mulvey, 2002; Eto et al., 2007; Wiles et al., 2008). Para la expresión y el ensamblaje de la fimbria tipo 1 se requiere de 8 genes; fimB, fimE, fimA, fimC, fimD, fimF, fimG y fimH, que están presentes en el operón que codifica para la fimbria, como se muestra en la FIGURA 3 (Schilling et al., 2001; Smithson, 2008). FIGURA 3. Organización genética del operón de la fimbria tipo 1. El gen fimA codifica la subunidad mayor y los genes fimF, fimG y fimH codifican para las proteínas que forman el extremo de la fimbria (Schilling et al., 2001; Smithson, 2008). Las fimbrias tipo P (fimbria Pap resistente a la manosa) son uno de los principales factores de virulencia presentes en la mayor parte de las cepas aisladas de pacientes con pielonefritis y urosepsis (septicemias de origen urinario), en el 40% al 50% de las cepas causantes de cistitis aguda y en un 20% de las cepas causantes de bacteriuria asintomática. Esta fimbria se une a un glucoesfingolípido específico del grupo sanguíneo P, donde el receptor activo es el digalactósido α-D-Gal-﴾1-4﴿-β-D-Gal, que le permite a la bacteria fijarse y colonizar el epitelio urinario sin ser arrastrada por la orina (Lund et al., 1987; Blanco et al., 1990; Strömberg et al., Introducción 6 1990; Blanco et al., 1991; Blanco et al., 1992a; Blanco et al., 1996; Blanco et al., 1997; Manning et al., 2001; Smithson, 2008). La producción de la fimbria P es regulada por el operón cromosomal pap que contiene 11 genes (papIBAHCDJKEFG) (FIGURA 4). La estructura de la fimbria P está constituida por una subunidad mayor PapA, que en un proceso de polimerización da lugar a la fimbrillina, proteína estructural de las fimbrias P (Smithson, 2008; Hung et al., 2009). La adhesina de la fimbria P es codificada por el gen papG y se localiza en la punta de la fimbria para adherirse directamente a la célula hospedadora. Hasta el momento se conocen 4 clases de adhesinas de PapG (clase I, II, III y IV), que fueron caracterizadas en base a su capacidad de unión al receptor (Blanco et al., 1991; Manning et al., 2001). Por otra parte, para que se produzca la adhesión, la proteína G tiene que estar asociada con la proteína F. Esta proteína parece ser altamente repetitiva en todas las clases de fimbrias P, lo cual tiene importancia para la elaboración de vacunas contra la pielonefritis (Blanco et al., 1992a). FIGURA 4. Esquema del operón pap. El gen papA codifica para la subunidad mayor, mientras que los genes papK, papE, papF y papG codifican el complejo que forma el extremo de la fimbria (Hung et al., 2009). Las fimbrias S son morfológicamente idénticas a las fimbrias tipo 1 y fimbrias P, también participan en el proceso de adhesión bacteriana a las superficies epiteliales y están asociadas especialmente con cepas de E. coli causantes de septicemias y meningitis. Muchas cepas uropatogénicas y septicémicas humanas expresan conjuntamente las fimbrias P y S. Ambas fimbrias tienen un patrón similar de unión en el tracto urinario, pero en la orina humana existen inhibidores (principalmente la glucoproteína de Tamm-Horsfall) que impiden la adhesión mediada por las fimbrias S. Estas fimbrias se unen a receptores celulares compuestos por Introducción 7 glucoconjugados que contienen ácido siálico, interaccionando con proteínas de superficie con αsialil-β-D-(2-3) -D-galactosa (Blanco et al., 1991; Stins et al., 1994; Blanco et al., 1997). El operón sfa, que codifica para la fimbria S, consta de 9 genes (C, B, A, D, E, F, G, S y H) (FIGURA 5), de los cuales el gen sfaA codifica para una fimbrillina de 16 kDa, mientras que el gen sfaS codifica para la adhesina que ha sido localizada en la punta de la fimbria S. En el estudio realizado por Prasadarao et al. (1993) en células endoteliales de cerebro bovino se determinó que los glucolípidos sulfatados pueden servir como receptores para la fimbrillina, por lo que parece que al menos 2 sitios distintos de enlace en las células endoteliales del cerebro estarían relacionados en el enlace de la fimbria S: las sialo-glucoproteínas para la adhesina SfaS y los glucolípidos sulfatados para la proteína SfaA. Se especula con que la adherencia inicial de la bacteria a las células endoteliales ocurre vía receptores que contienen ácido siálico y está mediada por la adhesina SfaS. Este evento es seguido por una asociación de la bacteria a glucolípidos sulfatados expresados en la superficie celular, posiblemente para un contacto más íntimo del organismo para satisfacer los requerimientos nutricionales, lo cual puede permitir el cruce de la barrera hemato-encefálica (Moch et al., 1987; Blanco et al., 1992a; Prasadarao et al., 1993; Stins et al., 1994; Balsalobre et al., 2003). FIGURA 5. Esquema del operón sfa. La fimbria S está compuesta de una subunidad mayor codificada por el gen sfaA y 3 subunidades menores codificadas por los genes sfaG, sfaS y sfaH. La regulación del operón sfa está mediada por los genes sfaC y sfaB (Stins et al., 1994; Balsalobre et al., 2003). Dentro de las adhesinas resistentes a la manosa se encuentra la familia de adhesinas Afa/Dr. El receptor específico de enlace no ha sido determinado para todas estas adhesinas. La mayoria de las adhesinas Afa/Dr reconocen el factor DAF (decay-accelerating-factor) o CD55 como receptor, el cual está expresado sobre los eritrocitos y otros tejidos como el uroepitelio. DAF es una glicoproteína reguladora del complemento que está anclada a la membrana celular mediante el fosfatidilinositol (GPI). Como se observa en la TABLA 1, la familia de adhesinas Afa/Dr Introducción 14 citosol, donde los CNFs cumplen la función de desaminación de las proteínas GTPasas-Rho (Fabbri et al., 1999; Boquet, 2001; Knust et al., 2009; Knust y Schmidt, 2010). FIGURA 10. Internalización celular de CNF1. 1) Enlace al receptor laminina de CNF1 mediante el dominio amino-terminal. 2) El receptor media la endocitosis. 3) Acidificación del endosoma precoz. 4) Cambio conformacional de CNF1 debido al medio acido e inserción en la membrana vesicular mediante el dominio de translocación. 5) Fragmentación de la toxina por una serina proteasa y liberación del dominio catalítico. 6) Desaminación de la proteína Rho (Knust y Schmidt, 2010). La desaminación lleva a la activación constitutiva de las GTPasas-Rho. Las GTPasas de la familia Rho (Cdc42, Rac y RhoA) han sido identificadas como un blanco común de las toxinas bacterianas. Estas GTPasas son reguladoras de las vías de señalización que unen los estímulos extracelulares o intracelulares al ensamblaje y organización de la actina del citoesqueleto. También participan en las vías de señalización que activan cascadas de quinasas que regulan la expresión génica, la endo y exocitosis, la proliferación celular y la apoptosis (Boquet, 2001; Knust et al., 2009; Knust y Schmidt, 2010). Como se observa en la FIGURA 11, las proteínas Rho funcionan como interruptores moleculares en las diversas vías de señalización, activas en su forma unida a GTP e inactivas en la forma unida a GDP. La conversión del estado inactivo al activo está mediada por GEF (Guanine-nucleotide Exchange Factor, factor intercambiador de nucleótido de guanina), que Introducción 15 cataliza la liberación del nucleótido enlazado (GDP), y se da el cambio por GTP. Las proteínas Rho retornan al estado inactivo por medio de la actividad intrínseca de la misma GTPasa o por la hidrólisis de GTP, que es catalizada por GAP (GTPase Activating Protein, proteínas activadoras de GTPasas). Otro factor adicional regulador de la actividad de las GTPasas-Rho son los GDIs (GDP-dissociation Inhibitors, inhibidores de la disociación de nucleótidos de guanina), que secuestran las proteínas Rho unidas a GDP en el citoplasma o median el transporte de las GTPasas activadas a otras localizaciones celulares. Los CNFs catalizan la desaminación de la glutamina 63 de las GTPasas-Rho (o la glutamina 61 en Rac y Cdc42) generando ácido glutámico y como estas glutaminas son cruciales para la actividad intrínseca de las GTPasas y de GAP, el retorno al estado inactivo es bloqueado, lo cual provoca un continuo efecto de activación de las GTPasas (Boquet, 2001; Knust et al., 2009; Knust y Schmidt, 2010). FIGURA 11. Activación de la GTPasa-Rho por CNFs. Los CNFs desaminan la glutamina 63 de RhoA, generando acido glutámico. Esto lleva al bloqueo de la hidrólisis de GTP y la activación constitutiva de la proteína G (Knust y Schmidt, 2010). La activación constitutiva de RhoA lleva a la formación de fibras de estrés, las cuales son haces contráctiles de filamentos paralelos de actina y miosina. La activación de Rac lleva a la formación de lamelipodios (prolongaciones transitorias de la membrana celular), los cuales requieren una organización similar a una red de los filamentos de actina. La toxina también induce la formación de filopodios (proyecciones citoplasmáticas delgadas) debido a la activación de la vía dependiente de Cdc42 (Knust y Schmidt, 2010). Por otra parte, CNF1, mediante la activación de las proteínas GTPasas-Rho en los leucocitos polimorfonucleares, afecta drásticamente a la arquitectura del citoesqueleto, induciendo un incremento en el contenido de la actina F, lo cual provoca alteraciones en las características funcionales de los Introducción 16 polimorfonucleares, como la generación de superóxidos, pero significativamente decrece su función fagocítica (Hofman et al., 2000). El sustrato específico difiere entre los CNFs: CNF2 preferentemente modifica RhoA y Rac, mientras que CNF1 y CNF3 desaminan RhoA, Rac y Cdc42. CNF3 activa RhoA más fuerte que CNF1 (Sugai et al., 1999; Stoll et al., 2009). La toxina SAT fue descrita por Guyer et al. (2000). Identificaron una proteína autotransportadora de 107 kDa que era expresada más significativamente por cepas de E. coli asociadas con los síntomas clínicos de pielonefritis aguda que por cepas fecales (Maroncle et al., 2006). La proteína Sat, de acuerdo a sus características, pertenece a uno de los subgrupos de la familia de autotrasportadores SPATEs (serine protease autotransporters of Enterobacteriaceae). Estas proteínas utilizan el sistema de secreción de proteínas tipo V para dirigir su propia exportación (FIGURA 12). Una vez transportada a la superficie celular bacteriana, el dominio pasajero (proteína madura) puede permanecer adherido a la membrana externa o ser liberado por fragmentación proteolítica. Se ha demostrado que la proteína madura Sat tiene un efecto citopático en varias líneas celulares, que provoca daño glomerular y una fuerte respuesta de anticuerpos en ratones infectados transuretralmente con la cepa de E. coli CFT073 (Guyer et al., 2000; Guyer et al., 2002). FIGURA 12. Sistema de secreción de proteínas tipo V. La proteína a secretarse presenta 3 regiones: 1) Una secuencia señal localizada en el extremo amino-terminal, que permite atravesar la membrana interna. 2) Un dominio pasajero (proteína madura) en el cual el fenotipo de cada proteína está distribuida. 3) Un dominio autotransportador β en el extremo carboxi-terminal, que permite la secreción a través de la membrana externa formando una estructura de barril-β con 10 a 18 hebras antiparalelas, a través del cual se transporta el dominio pasajero. Una vez que la proteína se localiza en la superficie celular, es liberada por proteólisis (GonzálezPedrajo y Dreyfus, 2003). Introducción 17 El estudio realizado por Maroncle et al. (2006) muestra que el sitio activo de Sat (actividad serina proteasa) es necesario para la actividad citotóxica y proteasa, contracción del citoesqueleto y alteración del citoesqueleto de actina o de proteínas asociadas al citoesqueleto en cultivos de células de vejiga y riñón, pero no para el procesamiento o la liberación de la toxina desde la superficie bacteriana. Demostraron que la toxina Sat es internalizada y localizada específicamente en la fracción del citoesqueleto de las células epiteliales de la vejiga y riñón, donde Sat probablemente está asociada con la degradación de fodrina (proteína del citoesqueleto). Las proteínas fodrina/espectrina están relacionadas con la estabilización de la estructura de la membrana, manteniendo de esta manera la forma de la célula y enlazan los filamentos de actina con la membrana plasmática. Sat es capaz de degradar las cadenas α y β de espectrina y la α-fodrina. De esta forma altera el citoesqueleto, lo cual puede explicar el elongamiento, el erizamiento y desprendimiento de la membrana en células urinarias (Maroncle et al., 2006). Por otra parte, en cultivos de células epiteliales de vejiga y riñón, la incubación con Sat provoca dramáticas vacuolizaciones dentro del citoplasma, así como daños histológicos, particularmente en el glomérulo y túbulos proximales. Aunque Sat no es requerida para la colonización del tracto urinario, por su actividad citopática que daña el tejido del hospedador, puede incrementar la habilidad de E. coli para propagarse. Se podría especular que el daño específico del glomérulo y túbulo proximal pueden facilitar la entrada de cepas en el torrente sanguíneo (Guyer et al., 2002). El gen sat está localizado en la isla de patogenicidad PAI II de la cepa de E. coli CFT073 (Guyer et al., 2000; Phillips et al., 2000). La toxina CDT, fue descrita por primera vez por Johnson y Lior en 1987, como una toxina que es activa sobre las células HeLa, Hep-2, CHO y Vero, en las cuales causa un distintivo y progresivo alargamiento nuclear y citoplasmático, provocando posteriormente la muerte celular (Johnson y Lior, 1987; Johnson y Lior, 1988; Pickett y Whitehouse, 1999; Jinadasa et al., 2011). En cepas de E. coli asociadas con infecciones intestinales y extraintestinales, la producción de CDT ha sido relacionada con varios serotipos (Tóth et al., 2003; Pickett et al., 2004; Asakura et al., 2007; Dubois et al., 2010). Los genes de la toxina CDT han sido clonados y secuenciados por Scott y Kaper (1994), encontrando que la actividad de CDT es codificada por 3 genes relacionados y designados como cdtA, cdtB y cdtC, los cuales codifican para las correspondientes subunidades proteicas CdtA, CdtB y CdtC, con pesos moleculares aproximados de 23-30 kDa, 28-29 kDa y 19-21 kDa, Introducción 18 respectivamente. Se han encontrado al menos 5 variantes diferentes de CdtB (Cdt-I, II, III, IV y V) en cepas de E. coli asociadas con diferentes síndromes (Pickett y Whitehouse, 1999; Tóth et al., 2003; McSweeney y Dreyfus, 2004; Asakura et al., 2007). Las toxinas Cdt-I, Cdt-II y CdtIV han sido detectadas en cepas de E. coli que causan infecciones gastrointestinales y urinarias en humanos (Tóth et al., 2003; Picket et al., 2004; Asakura et al., 2007; Dubois et al., 2010), mientras Cdt-III fue detectada en cepas aisladas de humanos con diarrea y de animales con diarrea o septicemia (Pickett y Whitehouse, 1999; Tóth et al., 2003; Bielaszewska et al., 2004; Jinadasa et al., 2011). La Cdt-V fue detectada en cepas de E. coli O157 aisladas de humanos con diarrea o síndrome hemolítico urémico (Bielaszewska et al., 2004). Las Cdts I, II, IV y V son codificadas por genes cromosómicos (Asakura et al., 2007; Jinadasa et al., 2011), mientras que el operón que codifica para Cdt-III se localiza en un plásmido conjugativo llamado pVir (Jinadasa et al., 2011). Como se muestra en la FIGURA 13, la toxina CDT está compuesta por 3 subunidades, CdtA, CdtB y CdtC. A la subunidad CdtB se le atribuye la función de actividad catalítica, actividad de DNasa, debido a que el ADN cromosómico es el blanco de acción de la toxina. Las subunidades CdtA y CdtC son responsables del enlace y/o internalización de la toxina CDT (McSweeney y Dreyfus, 2004; McSweeney y Dreyfus, 2005; Jinadasa et al., 2011). Después del enlace al receptor, el cual está localizado dentro de las balsas lipídicas de la membrana celular, la subunidad CdtB es internalizada por endocitosis en una vesícula recubierta por clatrina (proteína que recubre las vesículas en el proceso de transporte entre membranas) y dirigida por transporte retrógrado hacia el retículo endoplasmático vía complejo Golgi. Posteriormente, mediante una secuencia señal de localización nuclear, llega al núcleo y rompe la doble cadena de ADN, lo cual inicia la cascada de eventos que lleva a la muerte celular (McSweeney y Dreyfus, 2004; Jinadasa et al., 2011). Introducción 19 FIGURA 13. Internalización y transporte intracelular de CDT en células de mamíferos. 1) Enlace de la toxina heterotrimérica al receptor localizado dentro de las balsas lipídicas de la membrana celular. 2) Endocitosis de la subunidad activa. 3) Transporte retrogrado vía complejo Golgi y retículo endoplasmatico. 4) La señal de localización nuclear media el transporte activo hacia el núcleo (Jinadasa et al., 2011). 1.3.1.3. Sideróforos El hierro es un compuesto esencial para la mayoría de los organismos vivos. En los vertebrados superiores el hierro se asimila desde la dieta y se transporta en la sangre unido a la transferrina (Pattus y Abdallah, 2000; Balado, 2009). La limitación de la disponibilidad de hierro afecta al crecimiento de prácticamente cualquier especie bacteriana. Es por ello que en el caso de las bacterias patógenas la adquisición de hierro es uno de los principales pasos en su desarrollo dentro del hospedador. Los sistemas de captación de hierro presentes en los microorganismos patógenos juegan un papel clave en el establecimiento de la infección, por lo que la capacidad de obtención de hierro es uno de sus principales factores de virulencia. Las cepas ExPEC, como las cepas de E. coli en general, poseen múltiples mecanismos de adquisición de hierro, que incluyen sideróforos y receptores de sideróforos (Raymond et al., 2003). Uno de los más utilizados es la secreción de sideróforos. La elevada afinidad de los 1 2 3 4 Introducción 20 sideróforos por el Fe+3 le permite competir no solo por el hierro libre sino también arrebatarlo de fuentes de reserva del hospedador tales como la ferritina (Balado, 2009). En las bacterias gramnegativas, el hierro biodisponible debe atravesar la membrana externa hasta el periplasma y de ahí ser internalizado al citoplasma a través de la membrana celular. Para ello, la célula posee receptores de membrana externa y un complejo Ton que le suministra la energía necesaria para el transporte del hierro al periplasma. El complejo Ton es una unidad funcional integrada por 3 proteínas (TonB, ExbB y ExbD) anclado en la membrana citoplasmática. El paso del hierro a través de la membrana citoplasmática se realiza a través de un mecanismo de tipo ATP binding cassette (ABC). El transportador de este tipo mejor caracterizado es el sistema fhuBCD de E. coli (Garrido, 2005). Las cepas UPEC producen hasta 4 diferentes sideróforos: enterobactina y salmoquelina (sideróforos catecolates), aerobactina y yersiniabactina (sideróforos de tipo hidroxamato). Para la adquisición de hierro mediante sideróforos se requiere de 5 pasos: 1) síntesis del sideróforo en el citoplasma, 2) exportación del sideróforo, 3) recepción del complejo sideróforo-hierro, 4) internalización y 5) liberación del hierro en el citoplasma (Garenaux et al., 2011). La aerobactina es un sideróforo producido por algunas cepas de E. coli. Como se observa en la FIGURA 14, el sistema para la biosíntesis de la aerobactina lo componen 5 genes: 4 (iucA, iucB, incC y iucD) están relacionados con la síntesis y el gen iutA codifica para el receptor de la membrana externa (de Lorenzo et al., 1986; de Lorenzo y Neilands, 1986; Garenaux et al., 2011). Hasta el momento se desconoce el mecanismo por el cual la aerobactina es exportada. Una vez en el medio extracelular el sideróforo se une al Fe+3. Luego, cuando el complejo hierrosideróforo se enlaza al receptor, TonB es reclutado para transferir energía al receptor e inducir un cambio conformacional que permite la internalización de hierro-sideróforo en el espacio periplasmático. Posteriormente la proteína transportadora FhuD transfiere el complejo hierrosideróforo desde el receptor IutA hasta el sistema de transporte de la membrana interna FhuBCD (FIGURA 15). Una vez en el citoplasma el Fe+3 debe ser liberado del complejo hierro-sideróforo. Los mecanismos básicos para liberar el metal consisten en la reducción del ión (Fe+3 a Fe+2) mediante reductasas o la hidrólisis del sideróforo (Neilands, 1995; Balado, 2009; Garenaux et al., 2011). Introducción 21 FIGURA 14. Grupo de genes que codifican para aerobactina y salmoquelina. Genes que codifican para la biosíntesis (flecha negra), exportación (flecha azul), recepción (flecha amarilla) y degradación (flecha gris) (Garenaux et al., 2011). FIGURA 15. Modelo de diferentes sistemas que contribuyen a la captación de hierro mediante sideróforos en E. coli. En el rectángulo amarillo se indican las proteínas relacionadas con la síntesis de cada uno de los 4 tipos de sideróforos. Los exportadores de membrana son indicados en azul oscuro. Los receptores de membrana externa son indicados en verde claro y están asociados con el complejo TonBExbDB requeridos para la transducción de energía y la subsecuente internalización de sideróforos dentro del espacio periplasmico. El transportador (ABC) es mostrado en la membrana interna. Los signos de interrogación indican los pasos donde aún no se han determinado los mecanismos (Garenaux et al., 2011). Introducción 22 En la mayoría de las cepas de E. coli, los genes responsables para la biosíntesis y transporte de aerobactina están localizados en el plásmido pColV-K30, pero excepcionalmente también pueden estar localizados en el cromosoma bacteriano (de Lorenzo et al., 1986; de Lorenzo y Neilands, 1986; Garenaux et al., 2011). Por otra parte, en el estudio realizado por García et al. (2011) en ratones, en un modelo de infección del tracto urinario, se muestra que la aerobactina es más importante en UPEC para colonizar el tracto urinario que la utilización de enterobactina o salmoquelina. En otro estudio, la aerobactina muestra ser más efectiva que la enterobactina en la entrega de hierro a E. coli a bajas concentraciones del sideróforo (Williams y Carbonetti et al., 1986). La salmoquelina es un sideróforo que está relacionado con la virulencia de cepas ExPEC. Los genes responsables para la biosíntesis y transporte de salmoquelina son generalmente codificados en los plásmidos ColV o ColBM, aunque también pueden ser codificados en PAIs (pathogenicity islands) en algunas cepas. Una región contiene los genes iroB, iroC, iroD e iroE, y la otra contiene el gen iroN que codifica para el receptor de salmoquelina (FIGURAS 14 y 15) (Sorsa et al., 2003; Garenaux et al., 2011). El gen iroN, descrito en 1999, codifica la síntesis de la proteína IroN, un receptor de sideróforo catecolate y significativamente más prevalente en cepas de E. coli aisladas del tracto urinario y sangre que en cepas aisladas de heces (Russo et al., 1999; Russo et al., 2002). El estudio realizado por Feldmann et al. (2007) muestra que IroN, como receptor del sideróforo salmoquelina, también contribuye a la invasión de las células uroepiteliales por cepas ExPEC. Finalmente, de acuerdo a las demostraciones previas del papel de IroN en la virulencia, su expresión en fluidos biológicos humanos y su prevalencia entre cepas ExPEC, se le considera como un candidato potencial para la elaboración de vacunas (Russo et al., 1999; Russo et al., 2003; Sorsa et al., 2003; Feldmann et al., 2007; Garenaux et al., 2011). 1.3.1.4. Antígeno capsular K Los polisacáridos capsulares son estructuras que se encuentran sobre la superficie celular de un amplio rango de especies bacterianas. Los polisacáridos capsulares a menudo constituyen la capa más externa de la célula, por lo cual pueden directamente mediar interacciones entre la bacteria y su entorno inmediato, y han sido implicados como un importante factor de virulencia de muchos patógenos. Entre las funciones de los polisacáridos capsulares se Introducción 23 encuentran la prevención a la desecación, la adherencia y la resistencia al sistema inmune no específico y específico. Están compuestos de unidades repetidas de monosacáridos unidos por enlaces glucosídicos. También pueden ser homo o heteropolimeros, y pueden ser sustituidos por moléculas orgánicas e inorgánicas. Como resultado los polisacáridos capsulares pueden ser increíblemente diversos no solo por las diferentes unidades de monosacáridos, sino también en como estas unidades están unidas. En el caso de la E. coli se han descrito casi 80 variedades del antígeno K de acuerdo a sus propiedades serológicas, de los cuales una pequeña fracción están asociados con infecciones invasivas (Roberts, 1996; Whitfield, 2006). Los antígenos K de E. coli se han dividido en 4 grupos (IA, IB, II y III) en base a sus propiedades biológicas, químicas y genéticas. Los grupos IA y IB se encuentran en aislados de E. coli que causan infecciones intestinales (EPEC, ETEC y EHEC) y las cápsulas de los grupos II y III se encuentran en cepas que causan infecciones extraintestinales. Las cápsulas del grupo II y III son termolábiles, tienen una carga de densidad alta, tienen menor peso molecular que las del grupo I y contienen ácido hexurónico, ácido N-acetilneuraminico (NeuNAc) o ácido 2-keto-3-deoximanno-octonico (KDO) como componentes ácidos (Roberts, 1996; Clarke et al., 1999; Whitfield, 2006). Los genes que codifican para la cápsula de los grupos II y III son denominados kps y han sido localizados cerca del gen serA (codifica la biosíntesis de serina) en el cromosoma de E. coli. El detallado análisis molecular del cluster de genes del antígeno K del grupo II revela que tienen una organización genética conservada que consta de 3 regiones funcionales como se observa en la FIGURA 16. El cluster de genes de las regiones 1 y 3 son conservados entre los diferentes antigenos K del grupo II y participan en un rango de actividades relacionadas con la exportación y ensamblaje de la cápsula en la superficie celular. La región central 2 es serotipo específica. La mutación en la región 2 anula la biosíntesis de polisacáridos, lo cual sugiere que esta región codifica enzimas para la síntesis de un antigeno K en particular (K1, K2, K4, K5, K12, K13, K92, K100). En el caso del antigeno K1, la región 2 codifica 3 enzimas que están relacionadas en la biosíntesis y activación de NeuNAc. La región 1 contiene 6 genes que son kpsFEDUCS; y la región 3 contiene los genes kpsM y kpsT (Roberts, 1996; Whitfield, 2006). Introducción 30 significativamente más baja que entre los aislados uropatogénicos, sugiriendo que Tsh está más asociada con cepas causantes de ITU que con E. coli comensales (Heimer et al., 2004). 1.3.1.9. Proteína específica uropatogénica (uropathogenic-specific protein, Usp) En el año 2000, Kurazono et al. (2000) identificaron una supuesta isla de patogenicidad (PAI) de 4.167 bp, de la cual una longitud de 1.038 bp codifica para una proteína de 346 aminoácidos que fue denominada como proteína específica uropatogénica debido a su predominio en cepas aisladas de ITU. A continuación de usp fueron identificados 3 fragmentos de lectura abierta (ORFs; orfU1, orfU2, orfU3). El análisis de secuenciación de las PAIs de 7 cepas representativas (6 UPEC y 1 de individuo sano) mostró que el gen usp presenta 2 variantes (uspI y uspII), con diferentes secuencias en la región 3`-terminal (Nakano et al., 2001; Parret y De Mot, 2002). Por otra parte, las PAIusp pueden ser clasificadas en 4 subtipos (Ia, Ib, IIa y IIb) de acuerdo a la secuencia de ADN de las variantes de uspI, uspII y los diferentes arreglos de orfU1, orfU2 y orfU3. El subtipo Ia fue asociado más significativamente con los aislados de prostatitis (Kanamaru et al., 2006a). Para determinar la virulencia de la proteína Usp en cepas UPEC, se realizaron experimentos en ratones en los que se observó que las cepas de E. coli que poseían el gen usp aumentaban su infectividad (Yamamoto et al., 2001). Posteriormente, Parret y De Mot (2002) demostraron que la proteína Usp puede actuar como una bacteriocina, debido a la gran homología de la región carboxi-terminal de Usp con la piocina tipo S producida por las cepas de Pseudomonas aeruginosa. Las piocinas pertenecen a un grupo grande y heterogéneo de proteínas conocidas como bacteriocinas. Moléculas antimicrobianas producidas por ciertas cepas virulentas, capaces de lisar otras cepas no virulentas de estos mismos gérmenes, lo que permitiría que la cepa de E. coli que posee la proteína Usp compita contra otras cepas de E. coli que ocupan el mismo nicho, lo cual aumentaría su infectividad en el tracto urinario. Introducción 31 1.3.1.10. Invasina IbeA (Invación del endotelio cerebral, invasión of brain endothelium) Las cepas ExPEC han sido asociadas con las infecciones de meningitis neonatal. Las cepas que causan meningitis poseen diferentes factores de virulencia que permiten que la bacteria atraviese la barrera hemato-encefálica y entre en el sistema nervioso central. El gen ibeA, que codifica para una proteína de 50 kDa, es uno de los factores de virulencia que contribuye en está invasión. Este gen ha sido encontrado en cepas de E. coli K1 aisladas de líquido céfaloraquídeo (Huang et al., 2000; Huang et al., 2001). Como se muestra en la FIGURA 18, el gen ibeA está localizado en una isla de patogenicidad denominada GimA, de 20,3 kb, que consta de 4 operones: ptnIPKC, cglDTEC, gcxKRCI e ibeRAT. El análisis secuencial sugiere que esta isla codifica para 10 enzimas, 3 transportadores, una proteína regulatoria y una invasina (IbeA). Muchas de estas proteínas codificadas por GimA participan en el transporte y metabolismo de fuentes de carbono, como la glucosa y el glicerol. Se ha demostrado que la glucosa es la fuente de carbono preferido por las cepas de E. coli K1, observándose que en el líquido céfalo-raquídeo la glucosa disminuye significativamente durante la meningitis (Huang et al., 2001; Zou et al., 2008). También se ha determinado que la vimentina es el receptor de IbeA que induce la señalización e invasión del endotelio cerebral. La vimentina es una de las proteínas fibrosas que forman los filamentos intermedios del citoesqueleto intracelular, en particular de células embrionarias, ciertas células endoteliales, así como de células sanguíneas (Chi et al., 2010). La producción de biopelículas ayuda a la bacteria a sobrevivir y aumenta su habilidad para causar la enfermedad. En un estudio realizado por Wang et al. (2011) se ha encontrado que ibeA era más prevalente en cepas que forman biopelículas. Por eso se cree que ibeA está relacionada con la formación de biopelículas, aunque la función exacta de la proteína IbeA aún no está clara. Introducción 32 FIGURA 18. Localización genética y estructura de los operones de la isla de patogenicidad GimA. Este locus está situado entre yjiD y yjiE, adyacente al operon fim y ausente en las cepas de E. coli K12 no patogénicas. Los 4 rectángulos indican los operones (GimA1, GimA2, GimA3 y GimA4) y las flechas indican la orientación de la transcripción (Huang et al., 2001). 1.3.2. Islas de patogenicidad Los genes de virulencia de E. coli pueden estar localizados en el cromosoma, plásmidos, transposones, bacteriófagos y/o islas de patogenicidad. Los genes para HlyA se han localizado en el cromosoma y en plásmidos. Lo mismo pasa con los genes del sideróforo aerobactina, que pueden ser cromosómicos ó encontrarse en un plásmido que suele codificar también para la producción de colicina V (Smith y Huggings, 1976; Vidotto et al., 1991). En ocasiones los genes de virulencia se encuentran agrupados formando islas (10 a 200 Kb) o islotes (1 a 10 Kb) de patogenicidad (PAIs). Dichos fragmentos pueden llevar también sistemas de secreción de proteínas de tipo III ó IV. Poseen un contenido G+C diferente al resto del cromosoma bacteriano, lo que sugiere que se han adquirido recientemente y de forma horizontal. Las PAIs están flanqueadas por secuencias repetitivas que se generan después de la integración del ADN foráneo por recombinación y se encuentran situadas cerca de genes que codifican para ARNt. Los genes de ARNt suelen actuar como secuencias diana para la integración del ADN foráneo en muchos organismos procariotas y en algunos eucariotas. Las PAIs llevan también genes que codifican para factores de movilización, tales como integrasas, transposasas, o partes de elementos de inserción (insertion sequences, IS). Introducción 33 Por ello a menudo representan regiones de ADN inestables. Las PAIs pueden proceder de antiguos profagos ó derivar incluso de plásmidos. Se han caracterizado varias islas de patogenicidad cromosómicas en E. coli causantes de infecciones extraintestinales que contienen los genes que codifican para la fimbria P (Pap), fimbrias Prs (P-related sequence), CNF1 y/ó Hly (Hacker et al., 1999; Bingen-Bidois et al., 2002). Ciertas cepas pueden contener múltiples islas de patogenicidad, cada una con factores de virulencia que pueden llegar a ser diferentes o iguales. De la misma manera, algunas cepas de E. coli causantes de infecciones extraintestinales también son portadoras de genes de resistencia a antibióticos, tales como las β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), en elementos móviles como los plásmidos (Branger et al., 2005; Cagnacci et al., 2008; Coque et al., 2008b; Jones et al., 2008; Leflon-Guibout et al., 2008; Johnson et al., 2009). 1.3.3. Tipado de las cepas En los laboratorios de microbiología clínica los microorganismos suelen identificarse a nivel de especie, porque este nivel de identificación, junto con los datos de sensibilidad a los antibióticos, resulta suficiente en la mayoría de los casos para orientar el tratamiento de la infección y establecer las medidas de profilaxis. Sin embargo, en algunas situaciones es importante subdividir una especie en grupos infraespecíficos porque cada grupo puede presentar características diferenciales muy importantes (Prats, 2007). Existen diversos métodos que permiten subdividir (tipar) una especie en grupos infraespecificos (tipos o variedades). Estos métodos pueden basarse en el estudio de características fenotípicas o genotípicas. Los caracteres más utilizados para el fenotipado han sido los bioquímicos (biotipo), los antigénicos (serotipo), la lisis por bacteriófagos (fagotipo) y el patrón de sensibilidad a los antibióticos (antibiotipo). Las características antigénicas desempeñan un papel importante en el tipado de E. coli. Para diferenciar las cepas patógenas de las cepas comensales, presentes en la flora microbiana normal, Kauffmann (1947) desarrolló un esquema de serotipificación que actualmente tiene 174 antígenos somáticos (O1 a O181), 53 flagelares (H1 a H56) y 72 capsulares (K1 a K103). El antígeno O es un polisacárido termoestable (estable tras calentar a 121ºC/2 h) que forma Introducción 34 parte del lipopolisacárido (LPS) presente en la membrana externa de la pared celular. El antígeno K es un polisacárido capsular que envuelve la pared celular y puede bloquear la reacción del antígeno O inhibiendo su aglutinación. Existen 2 grupos de antígenos K (I y II) que se corresponden con las variedades K(A) y K(L). Los antígenos K(L) se inactivan al ser expuestos a 100ºC/1 h, mientras que para la inactivación de los antígenos K(A) se requiere de una temperatura de 121ºC/2 h. Los antígenos H son proteínas termolábiles que se inactivan al ser calentados a 100ºC/30 min. La determinación de los antígenos O y H se realiza por técnicas de aglutinación, mientras que la identificación del antigeno K se realiza por contrainmunoelectroforesis. Debido a las reacciones cruzadas entre los antígenos O y H de las diferentes cepas de E. coli y los otros géneros de las enterobacterias, se recomienda utilizar antisueros absorbidos para evitar falsas reacciones de aglutinación (Guinée et al., 1972; Guinée et al., 1981; Orskov y Orskov, 1984; Murray et al., 1999; Rodríguez-Angeles, 2002). La introducción en los últimos años de las técnicas de genotipado, basadas en el estudio de las diferencias del genoma, ha facilitado el desarrollo de pruebas que utilizan los mismos o parecidos reactivos, que permiten identificar los diferentes clones o grupos clonales: perfil plasmídico, análisis del ADN cromosómico mediante enzimas de restricción (restriction fragment length polymorphism, RFPL y pulse field gel electrophoresis, PFGE), ribotipado (análisis de los genes de ADN que codifican para ARNr 16S y 23S), tipado mediante técnicas de PCR (arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR y Random-PCR) y secuenciación del ADN (Sussman, 1997; Hilali et al., 2000; Bidet et al., 2007; Gordon et al., 2008; Clermont et al., 2009). Desde el punto de vista filogenético, las cepas de E. coli se pueden englobar en 4 grupos: A, B1, B2 y D. Mientras que los grupos B2 y D predominan entre las cepas ExPEC, los grupos A y B1 son más frecuentes entre las cepas comensales intestinales (Clermont et al., 2000; Gordon et al., 2008; Johnson et al., 2008; Mora et al., 2009). El esquema de MLST (multilocus sequence typing) de Achtman (http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli) utiliza las secuencias de fragmentos internos amplificados por PCR de 583 a 932 pb de 7 genes altamente conservados (adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA, y recA) que definen el perfil alélico o secuencia tipo (ST) para cada cepa. Existe un segundo esquema que ha sido desarrollado por el Instituto Pasteur basándose en la Introducción 35 secuenciación de 8 genes altamente conservados (dinB, icdA, pabB, polB, putP, trpA, trpB y uidA) (www.pasteur.fr/mlst). El MLST se ha revelado como una herramienta de tipado filogenético poderosa, tanto para estudios de evolución como epidemiológicos. Con la PFGE se puede lograr una mayor resolución de las relaciones clonales entre cepas de la misma secuencia tipo de MLST. Se trata de una herramienta de subtipado con mayor poder de discriminación que el MLST y que se utiliza en varias redes internacionales de salud (p.e. PulseNet, FoodNet y VetNet) para estudios epidemilógicos locales en los que interesa detectar cepas implicadas en brotes. Recientemente se ha descrito otro método de genotipado de cepas de E. coli en base a la secuenciación del gen fimH que codifica para la adhesina FimH, localizada en la punta de la fimbria tipo 1. El tipado de la región fimH (fimHTR) lleva a un abanico sumamente diverso de alelos (Tartof et al., 2007; Weissman et al., 2012; Adams-Sapper et al., 2013; NicolasChanoine et al., 2014). Este método de tipado fue aplicado en las cepas del grupo clonal ST131, entre las cuales identificaron varios tipos de fimH, si bien los más prevalentes fueron fimH30, fimH22 y fimH41 (Johnson et al., 2013). El tipado de las cepas ST131 ha llevado a la identificación de multiples subclones con distintos perfiles de resistencia a antibióticos. El subclón H30-R está representado por las cepas que tienen el alelo fimH30 y son resistentes a la ciprofloxacina. Por otra parte, en los últimos años ha emergido un importante subclón llamado H30-Rx entre las cepas H30-R. Estas cepas fueron denominadas de esta manera por su extensiva resistencia antimicrobiana, además la gran mayoría de sus cepas son productoras de CTX-M-15 (Price et al., 2013; Banerjee et al., 2013c; Banerjee y Johnson, 2014). El tipado de las cepas tiene como objetivos fundamentales el distinguir las cepas patógenas de las inocuas y determinar si las cepas pertenecen al mismo clon o a grupos clonales relacionados epidemiológicamente. 1.3.4. β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) Las β-lactamasas son enzimas proteicas que catalizan la hidrólisis del anillo betalactámico separando el enlace amida, impidiendo al antibiótico inhibir la síntesis de la pared celular. Las β-lactamasas están codificadas en genes que pueden localizarse tanto en el cromosoma Introducción 36 bacteriano como en plásmidos. El grado de resistencia conferida por este tipo de enzimas depende fundamentalmente de la cantidad de enzima producida y está modulada por factores de permeabilidad. Su hiperproducción puede conferir resistencia a las combinaciones de amoxicilina-clavulánico e incluso piperacilina-tazobactam. En el caso de la enzima SHV-1 puede además conferir resistencia de bajo nivel a ceftazidima (cefalosporina de tercera generación) (Coira, 2008; Navarro, 2009). Las β-lactamasas de espectro extendido se definen como enzimas capaces de hidrolizar las cefalosporinas de amplio espectro (cefalosporinas de primera, segunda, tercera y cuarta generación) y los monobactámicos (aztreonam), pero no las cefamicinas (cefoxitina) o los carbapenemes (imipenem y meropenem). Se caracterizan por ser inhibidas por los inhibidores de β-lactamasas de clase A (ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam). Sus determinantes genéticos se encuentran generalmente en plásmidos y derivan por mutaciones puntuales de otras β-lactamasas con menor espectro como TEM-1, TEM-2 y SHV-1. Las primeras BLEE descritas fueron las BLEE de tipo SHV, localizadas en cepas de Klebsiella pneumoniae en Alemania el año 1983, seguidas del aislamiento de las BLEE de tipo TEM en 1984. Actualmente están distribuidas por todo el mundo y se reconocen más de 180 variantes de SHV y más de 200 variantes de TEM con espectro extendido (http://www.lahey.org/Studies/) (Barrera et al., 2005; Cantón et al., 2007; Coque et al., 2008a). En 1989, casi simultáneamente en Alemania y Argentina y después en Francia e Italia, fue descrita un nuevo tipo de BLEE. Estas enzimas fueron llamadas CTX-M porque poseen mayor poder hidrolítico frente a cefotaxima. Las BLEE de tipo CTX-M han sido detectadas en muchas especies de la familia Enterobacteriaceae y en los últimos años se están expandiendo de forma espectacular. En la actualidad se conocen al menos 130 variantes de β-lactamasas de tipo CTXM agrupadas en torno a 5 familias de enzimas diferentes según su secuencia de aminoácidos (CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 y CTX-M-25) (TABLA 3) (Bauernfeind et al., 1990; Pitout et al., 2005a; Cantón y Coque, 2006; Karisik et al., 2006; Cantón et al., 2007; Livermore et al., 2007; Cantón et al., 2008; Clermon et al., 2008; Coque et al., 2008a; Arpin et al., 2009; Literacka et al., 2009; Oteo et al., 2009; Lau et al., 2010). Cada uno de estos grupos están relacionados con β-lactamasas cromosómicas de diferentes especies del genero Kluyvera que podrían haberse movilizado a través de secuencias de inserción (ISCR1, ISEcp1) o por bacteriófagos (Oliver et al., 2005; Cantón y Coque, 2006; Cantón et al., 2007). Introducción 37 TABLA 3. Diferentes grupos y orígenes de enzimas BLEE tipo CTX-M. Grupos/Familias CTX-M-1 CTX-M-2 CTX-M-8 CTX-M-9 CTX-M-25 Año de aparición Enzima País 1989 CTX-M-1 Alemania 1986 FEC-1 Japón 1996 CTX-M8 Brasil 1994 CTX-M-9 España 2000 CTX-M-25 Canadá Enzimas CTX-M-1, 3, 10, 11, 12, 15, 22, 23, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 54 UOE-1 CTX-M-2, 4, 6, 7, 20, 31, 44 (TOHO-1), FEC-1 CTX-M-40 CTX-M-9, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 24, 27, 45 (TOHO-2), 46, 47, 48, 49, 50 CTX-M-26, 25, 39, 41 Origen Kluyvera ascorbata Kluyvera ascorbata Kluyvera georgiana Kluyvera georgiana No definido Fuente: Cantón y Coque, 2006. 1.3.4.1. Distribución de las BLEE a nivel mundial Los diferentes estudios de vigilancia realizados en Europa y otras áreas geográficas han mostrado un incremento de la prevalencia y dispersión de las cepas productoras de BLEE. Los últimos datos disponibles de EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System) (http://www.rivm.nl/earss/about/) reflejan el incremento de las cepas de E. coli invasivas, resistentes a las cefalosporinas de tercera generación, recuperadas de cultivos de sangre. Como se muestra en la TABLA 4, entre las cepas resistentes a cefalosporinas de tercera generación, una gran proporción fueron identificadas como productoras de BLEE por los laboratorios participantes en el estudio realizado en el año 2012. Dieciséis de 23 países informaron entre 85% y 100% de cepas BLEE (EARSS-NET, 2012). De la misma manera, el programa de vigilancia MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) en países europeos muestra un incremento de las cepas de E. coli productoras de BLEE desde el año 1997 (2,1%) hasta el 2004 (10,8%). Esta situación era diferente en los EE.UU., donde los aislados productores de BLEE eran menos prevalentes que en Europa (Goossens y Grabein, 2005; Cantón et al., 2008). No obstante, la situación cambió en los últimos años también en EE.UU. con la emergencia y expansión espectacular del clon Introducción 38 ST131 productor de CTX-M-15 (Banerjee y Johnson, 2014; Nicolas-Chanoine et al., 2014). Otro programa de vigilancia denominado SMART (Study for Moritoring Antimicrobial Resistance Trends), realizó en el 2004 un estudio a nivel mundial en el cual el 10% de las cepas de E. coli eran productoras de BLEE; cepas que fueron aisladas de infecciones intraabdominales (Rossi et al., 2006; Cantón et al., 2008). El estudio SMART realizado en el 2007, en el cual participaron varios países de la región Asia-Pacífico, muestra que el 42% de las cepas de E. coli eran BLEE positivas (Hawser et al., 2009). El estudio multicéntrico realizado en Canadá desde el año 2005 hasta el 2009 muestra un incremento de la incidencia de E. coli productora de BLEE desde 0,12 a 0,47 por cada 1.000 pacientes por día (Lowe et al., 2012). TABLA 4. Cepas de E. coli invasivas resistentes a cefalosporinas de tercera generación y porcentaje de cepas BLEE positivas, determinados por los laboratorios participantes de 23 países europeos en 2012. País Nº de Laboratorios Nº de cepas de E. coli resistentes a cefalosporinas de tercera generación % de cepas BLEE Austria 29 233 92,7 Bulgaria 14 69 94,2 Croacia 12 79 89,9 República Checa 40 322 81,4 Dinamarca 3 45 91,1 Estonia 6 24 83,3 Finlandia 17 196 91,8 Francia 52 915 70,5 Alemania 15 260 81,9 Hungría 5 27 100 Irlanda 30 198 82,3 Italia 3 63 95,2 Letonia 8 23 87,0 Lituania 10 22 100 Luxemburgo 5 38 92,1 Holanda 8 79 96,2 Polonia 33 134 85,8 Portugal 16 269 95,9 Rumania 6 31 100 Eslovaquia 14 213 68,1 Eslovenia 10 111 91,0 España 38 764 82,2 Suecia 17 241 97,1 Fuente: EARSS-NET, 2012. Introducción 39 En la actualidad la mayoría de las cepas BLEE expresan enzimas de tipo CTX-M y son más frecuentemente encontradas en cepas de E. coli que en el resto de las enterobacterias. La mayoría de estos aislados son ahora recuperados de pacientes de la comunidad y muchos de ellos con infecciones del tracto urinario (Cantón et al., 2007; Cantón et al., 2008; Coque et al., 2008b). Los trabajos multicéntricos realizados en diferentes laboratorios, utilizando diferentes sistemas de vigilancia en cada país, han contribuido a entender mejor la epidemiología de estas enzimas a nivel local, nacional e internacional. Se han identificado situaciones que difieren en distintas áreas geográficas y reflejan una dispersión local y específica de algunas enzimas. Las BLEE de tipo CTX-M constituyen las β-lactamasas más diseminadas en todo el mundo, como se observa en la FIGURA 19, considerándose endémicas en muchos países de Europa, Asia y América Latina. En Europa occidental inicialmente se describieron brotes en países como Grecia o Francia (Cantón et al., 2007; Cantón et al., 2008). Algunas de las enzimas CTX-M están ampliamente distribuidas en países específicos, como el grupo CTX-M-9 en España (Hernández et al., 2003; Rodríguez-Baño et al., 2004; Cantón et al., 2007; Diestra et al., 2008). Las cepas productoras de CTX-M-14 también son prevalentes en Canadá y Japón (Pitout et al., 2005a; Suzuki et al., 2009). El CTX-M-1 y el CTX-M-32 inialmente eran prevalentes en áreas del Mediterráneo pero hoy en día son prevalentes en casi todos los países Europeos (Livermore et al., 2007; Cantón et al., 2008; Fang et al., 2008). CTX-M-15 se encuentra en casi todo el mundo. La exitosa dispersión de CTX-M-15 ha sido asociada con clones específicos y la transferencia de plásmidos que contienen el gen blaCTXM-15 (Bonnet, 2004; Boyd et al., 2004; Woodford et al., 2004; Brigante et al., 2005; Hernández et al., 2005; Lartigue et al., 2005; Paterson y Bonomo, 2005; Romero et al., 2005; Ben-Ami et al., 2006; Cantón y Coque, 2006; Lavollay et al., 2006; Novais et al., 2006; Cantón et al., 2007; Cantón et al., 2008; Lau et al., 2008). A diferencia de América Latina y Asia, el grupo CTX-M-2 está representado desigualmente en Europa, con la aparición de diferentes variantes en distintas áreas, particularmente en Rusia y países del Este (Edelstein et al., 2003; Chmelnitsky et al., 2005; Cantón et al., 2008). En Europa, el grupo CTX-M-8 está representado solo en el Reino Unido por la variante CTXM-40. De la misma manera, el grupo CTX-M-25 también ha sido detectado en el Reino Unido, Introducción 46 1.3.5.1. Subclones del grupo clonal ST131 Los estudios recientes de epidemiología molecular y el estudio filogenético de todo el genoma de las cepas ST131 han contribuido a esclarecer la fina estructura clonal de ST131, que consta de múltiples subclones con distintos perfiles de resistencia, incluyendo los subclones H22, H30, H30-Rx y H41 (Banerjee et al., 2013c; Price et al., 2013; Banerjee et al., 2014; Banerjee y Johnson, 2014; Nicolas-Chanoine et al., 2014; Peirano y Pitout, 2014; Peirano et al., 2014a; Petty et al., 2014). Las primeras cepas aisladas del grupo clonal ST131 presentaban el alelo fimH22 y eran sensibles a la ciprofloxacina. La resistencia a la ciprofloxacina asociada con el alelo fimH30 parece que fue esencial en la expansión de las cepas ST131, ya que el subclón H30 emergió con mucha fuerza a partir del año 2000, expandiéndose rápidamente hasta convertirse en la actualidad en el más dominante a nivel mundial entre las cepas de E. coli extraintestinales. En los estudios de Price et al. (2013) y Petty et al. (2014), al secuenciar el genoma completo de las cepas ST131, entre las cepas fimH30 resistentes a la ciprofloxacina, se identificó un importante subclón denominado H30-Rx por su extensiva resistencia a los antibióticos. La gran mayoría de las cepas de este subclón eran productoras de CTX-M-15. Las recientes publicaciones revelan que el subclón H30-Rx es el que se está expandiendo rápidamente a nivel mundial entre las cepas productoras de BLEE (Banerjee et al., 2013c; Banerjee y Johnson, 2014; Peirano y Pitout, 2014; Peirano et al., 2014a). No obstante, la mayoría de los estudios se han realizado en EE.UU. y Canadá, y hay muy pocos datos sobre los subclones de ST131 en Europa. Concretamente Peirano y Pitout (2014) analizaron 4.698 cepas de E. coli bacteriémicas aisladas en Canadá entre los años 2000 y 2010. La prevalencia de cepas resistentes a las quinolonas fluoradas (R-QF) pasó del 6% (2000) al 26% (2010). De las 197 (4%) productoras de BLEE, 194 fueron R-QF. El 46% de las cepas R-QF eran del grupo clonal ST131. Un total de 299 (6%) cepas bacteriémicas pertenecían al subclón H30 y 97 (2%) eran del subclón H30-Rx. Entre las cepas R-QF se incrementó el porcentaje de cepas ST131 pasando de un 42% (2000-2007) a un 50% (2008-2010), y dicho incremento fue debido al subclón H30-Rx. Banerjee et al. (2013c), al analizar una colección de 71 cepas ST131, mostraron que las cepas H30-R y las cepas de subclón H30-Rx tienen distintos perfiles de virulencia que las cepas no- Introducción 47 H30. Curiosamente, varios genes de virulencia fueron específicos de un determinado subclón. Los genes iha, sat y iutA fueron prevalentes entre las cepas H30, pero los genes iroN, K1 y ibeA fueron más prevalentes entre las cepas no-H30. Recientemente también se han identificado cepas del grupo clonal ST131 pertenecientes al serotipo O16:H5 (Johnson et al. 2014) que pertenecen al subclón H41 y poseen un perfil de genes de virulencia similar al de las cepas del serotipo O25b:H4. Aunque la media de genes de virulencia de las cepas del serotipo O16:H5 ha resultado ser inferior al de las cepas O25b:H4, en los ensayos de virulencia in vivo realizados en un modelo de sepsis murino resultaron ser en algunos casos tan letales como las cepas O25b:H4 del subclón H30-Rx (Mora et al. 2014). Los estudios realizados por Matsumura et al. (2012b, 2013) en Japón, Kudinha et al. (2013) en Australia y Johnson et al. (2014) en EE.UU., Olesen et al. (2013) en Dinamarca y Dahbi et al. (2013) en España indican que las cepas ST131 del serotipo O16:H5 son mucho menos prevalentes que las del serotipo O25b:H4, que la resistencia a ciprofloxacina entre estas cepas no es tan frecuente y que las que son productoras de BLEE suelen ser positivas para CTX-M14. 1.3.6. Grupo clonal O15:H1-D-ST393 En Inglaterra, en el sudeste de Londres, una cepa de E. coli no común fue responsable de un brote comunitario entre octubre de 1986 y octubre de 1987. Muchos pacientes tenían infección del tracto urinario y algunos septicemia, 3 de estos pacientes murieron. Al principio la cepa fue reconocida debido a su inusual patrón antimicrobiano, el cual incluye resistencia a la ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfonamida, tetraciclina y trimetoprim. Posteriormente se comprobó que la cepa de E. coli que fue responsable de 29 casos de septicemia durante el brote pertenecía al serotipo O15:K52:H1, mientras que en los 17 años anteriores esta cepa había causado solo 16 de los 674 casos analizados (Phillips et al., 1988; George y Manges, 2010). Resultados similares fueron obtenidos por O´Neill et al. (1990) en Inglaterra en un estudio realizado durante los meses de noviembre y diciembre de 1986. Caracterizaron un total de 123 cepas de E. coli aisladas de sangre, observando un marcado incremento de la prevalencia del serogrupo O15. Durante este período, 25 cepas (20%) fueron de este serogrupo, de las cuales 20 cepas expresaban el mismo patrón de multirresistencia. Introducción 48 También estudiaron 195 cepas aisladas de orina, recolectadas entre enero y junio de 1987; 26 cepas pertenecieron al serogrupo O15 y, de ellas, 20 fueron multirresistentes. En un estudio realizado en Dinamarca, el O15:K52:H1 fue el segundo serotipo más común entre las cepas de E. coli aisladas de sangre en el hospital de Copenhague. Caracterizaron 377 cepas de E. coli que fueron recolectadas desde 1986 hasta 1990. Diecisiete cepas fueron O15:K52:H1 y todas mostraban el mismo perfil de factores de virulencia que las cepas del brote de Londres (Olesen et al., 1995; Prats et al., 2000). Hasta ese momento el grupo clonal O15:K52:H1 había sido descrito solo en Europa. Con el objetivo de detectar este grupo clonal fuera de Europa, se analizaron 75 cepas de E. coli del serogrupo O15 que fueron recolectadas en EE.UU., Canadá y otros países. Estas cepas fueron comparadas con 5 cepas del grupo clonal O15:K52:H1 de Barcelona, de acuerdo con el background genómico, los factores de virulencia y el perfil de resistencia antimicrobiana. El análisis de clusters de acuerdo al perfil de RAPD (random amplified polymorphic DNA) y ERIC2 PCR mostró 4 grandes clusters. El subcluster predominante contenía las 5 cepas españolas y 16 cepas no europeas que corresponderían al grupo clonal O15:K52:H1. Ciertos factores de virulencia fueron significativamente más prevalentes entre las 5 cepas españolas y las 16 cepas no europeas del grupo clonal O15:K52:H1 que entre las restantes 59 cepas del serogrupo O15. Los factores de virulencia asociados al serotipo O15:K52:H1 fueron el papG alelo II (fimbria P), iha (iron-regulate gene homologue adhesin), kpsMTII (cápsula grupo II), fyuA (receptor de yersiniabactina) y iutA (receptor de aerobactina). El perfil de resistencia antimicrobiano fue variable. Este estudio indica que el grupo clonal O15:K52:H1 está ampliamente distribuido a nivel mundial (Johnson et al., 2002a). Debido a la emergencia de grupos clonales multirresistentes, como el grupo clonal O15:K52:H1 de E. coli, y que este grupo clonal con el tiempo había comenzado a incrementar su virulencia y su resistencia a antibióticos, Olesen et al. (2009) analizaron una colección internacional de 100 cepas de E. coli O15:K52:H1 que fueron recolectadas entre 1975 y 2006. Del total de cepas, 57 fueron aisladas de sangre, 27 de orina, 5 de heces y 11 eran de origen desconocido. Las 100 cepas pertenecieron al grupo filogenético D. El MLST fue realizado a 12 cepas del estudio que presentaron la secuencia tipo ST393 y que llevaban los factores de virulencia papG alelo II, iha, fimH, fyuA, iutA y kpsM tipo II. El 55% de las cepas mostraba resistencia de 1 a 9 Introducción 49 antimicrobianos y el 16% exhibía multirresistencia. En este estudio demostraron que en las 3 primeras décadas desde su aparición el grupo clonal O15:K52:H1 había mantenido un perfil de virulencia bastante estable, a diferencia de su perfil de resistencia antimicrobiana que se había vuelto progresivamente más amplio (Olesen et al., 2009). En España, para clarificar la clínica y la correlación bacteriológica de las infecciones urinarias debidas a la E. coli O15:K52:H1, se realizó el análisis de 1.871 cepas de E. coli aisladas de orina en el hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona que fueron recolectadas durante un año (junio de 1994 a mayo de 1995). En total, 25 cepas de E. coli fueron del serotipo O15:K52:H1, las cuales fueron comparadas con 22 cepas O15:K52:H1 que fueron aisladas de otros lugares de España e Inglaterra y 23 cepas control (8 cepas de referencia colección ECOR y 15 cepas de serotipos O:K:H no patógenos). Se analizaron las características fenotípicas y genotípicas de todas ellas. Los resultados obtenidos demostraron que aunque las cepas O15:K52:H1 causan solo una pequeña fracción de todas las ITU, cuando éstas causan ITU adquiridas en la comunidad son mucho más agresivas que las otras cepas de E. coli. También encontraron que las cepas O15:K52:H1 de las diversas áreas geográficas fueron similares, pero diferentes de las cepas control de otros serotipos en lo que respecta al perfil de factores de virulencia (Dalmau et al., 1996; Prats et al., 2000). 1.3.7. Grupo clonal GCA-D-ST69 El incremento de la resistencia a antibióticos de primera generación, particularmente al cotrimoxazol, ha complicado el control de las infecciones del tracto urinario. Casi a finales de los años 90 en los EE.UU., otro grupo clonal de cepas ExPEC, designadas provisionalmente como grupo clonal A (GCA), se había demostrado que era responsable de entre el 33% y el 57% de los episodios de cistitis aguda no complicada y pielonefritis debidas a cepas de E. coli resistentes a cotrimoxazol (Johnson et al., 2002b; Burman et al., 2003; Manges et al., 2004). En el estudio realizado por Manges et al. (2001) se analizaron 255 cepas de E. coli aisladas en California: 55 cepas fueron resistentes a cotrimoxazol, de ellas, 28 exhibían el mismo patrón de 4 bandas de acuerdo a ERIC2 PCR y fueron identificadas como del grupo clonal A. A este grupo clonal también pertenecieron las 7 cepas que fueron aisladas en Minnesota y 11 cepas en Michigan. Muchas de las cepas del grupo clonal A pertenecían a los serotipos O11:HNT y O77:HNT, y presentaban similares patrones de factores de virulencia (papG II, iutA, kpsMTII y Introducción 50 traT), de susceptibilidad antimicrobiana y características electroforéticas. En otro estudio, entre mayo de 2001 y mayo de 2003 en el Hospital General de San Francisco se aislaron de sangre un total de 127 cepas de E. coli de las cuales 48 cepas (39%) fueron resistentes a cotrimoxazol. Diecinueve cepas (15%) de los serogrupos O11, O77, O17 y O73 fueron definidas como del GCA por ERIC2 PCR, (Manges et al., 2006). Hasta ese momento, el grupo clonal A había sido estudiado solo dentro de los EE.UU. En el año 2005 Johnson et al. (2005) realizaron un estudio más amplio en el que participaron 20 laboratorios de microbiología clínica (10 de EE.UU. y 10 de otros países), cada laboratorio proporcionó aproximadamente entre 24 y 100 cepas consecutivas de E. coli resistentes y sensibles a cotrimoxazol. De un total de 1.102 cepas analizadas, 68 cepas (6%) fueron del grupo clonal A y del grupo filogenético D. Las cepas del GCA estaban asociadas fuertemente con la resistencia a cotrimoxazol, y el 15% de estas cepas fueron aisladas en EE.UU. y solo el 5% de otros países. Estas cepas fueron de los serogrupos O11, O17 y O77. De acuerdo con este estudio, el GCA está heterogéneamente distribuido pero es más prevalente en los EE.UU. Afecta a diversas poblaciones y exhibe un contundente perfil de genes de virulencia (papGII, iha, iutA, kpsM II, traT y ompT) (Johnson et al., 2005). En otro estudio se analizaron 196 cepas de E. coli aisladas de sangre que fueron recolectadas entre enero de 2003 y mayo de 2005 en 4 hospitales de Copenhague, Dinamarca. Treinta cepas (15%) de los serogrupos O11, O15, O17, O44, O73, O77 y O86 pertenecieron al grupo clonal A. El GCA fue responsable del 17% de las bacteriemias adquiridas en la comunidad y del 5% de las adquiridas en hospital (Skjot-Rasmussen et al., 2013). Como el GCA tenía implicaciones considerables para la salud pública, Johnson et al. (2011) examinaron la tendencia de su distribución global, la asociación clínica y la prevalencia temporal durante los años 1998 a 2007. Caracterizaron 2.210 cepas ExPEC que fueron aisladas en 32 laboratorios de microbiología clínica de los 5 continentes. Cada centro proporcionó una media de 54 aislados (rango 24-320). Todos los centros, excepto 1, proporcionaron aproximadamente un número similar de cepas sensibles y resistentes a cotrimoxazol. En este estudio, 144 cepas fueron del GCA de acuerdo al tipado molecular, encontrándose claramente asociado con la resistencia a cotrimoxazol: el 10,1% de las cepas resistentes a cotrimoxazol perteneció al GCA frente a tan sólo el 2,8% de las cepas sensibles. La prevalencia del GCA por Introducción 51 centro osciló entre el 0% y el 34%. En 5 centros (2 de EE.UU. y 3 de otros países) la prevalencia del GCA fue superior al 20%. Por otra parte, no se encontró asociación del GCA con otras variables epidemiológicas (tipo de muestra, edad del paciente, condición del paciente interno/externo). La prevalencia del GCA se mantuvo estable a lo largo del período de estudio, sugiriendo que el GCA había emergido completamente a finales de los años 90 y hoy en día es una amenaza endémica de salud pública a nivel mundial (Johnson et al., 2011). Para determinar la prevalencia de los 3 grupos clonales mayoritariamente diseminados a nivel mundial se realizaron algunos estudios como el de Johnson et al. (2009) en el cual se analizaron 199 cepas de E. coli que fueron recolectadas en Canadá entre el 2002 y el 2004. De acuerdo al tipado molecular, las más prevalentes fueron las cepas de E. coli del grupo clonal ST131 (23,1%), 19 cepas (9,5%) correspondían al grupo clonal O15:K52:H1 y 9 cepas (4,5%) correspondían al GCA. Así, el 37,2% del total de las cepas analizadas pertenecían a alguno de estos 3 grupos clonales. En otro estudio, realizado en Australia, se analizaron 582 cepas de E. coli aisladas de humanos y 125 cepas aisladas de animales que fueron recolectadas entre octubre de 2007 y octubre de 2009. Del total de las cepas analizadas, 205 cepas (35%) aisladas de humanos y 9 cepas (7,2%) aisladas de animales fueron del grupo clonal ST131. En contraste, el GCA y el O15:K52:H1 no fueron tan comunes entre los aislados humanos: solo 8 cepas (1,4%) fueron del GCA y 33 cepas (5,7%) fueron del grupo clonal O15:K52:H1. Solo una cepa de los aislados de animales fue positiva para el O15:K52:H1 (Platell et al., 2010). 1.3.8. Resistencia a antibióticos Las cepas BLEE suponen un grave problema terapéutico porque además de ser resistentes a la gran mayoría de los β-lactámicos, también llevan frecuentemente resistencia cotransferida a quinolonas, aminoglucósidos, cloranfenicol, tetraciclinas y trimetoprimsulfametoxazol (Barrera et al., 2005; Hernández et al., 2005; Paterson y Bonomo, 2005; Schwaber et al., 2005; Baquero et al., 2006; Martínez-Martínez, 2007). Las causas de estas altas tasas de resistencia son múltiples, tanto desde el punto de vista bioquímico como genético. Los mecanismos implicados pueden ser consecuencia de mutaciones o de reorganizaciones cromosómicas (alteraciones de la permeabilidad, producción de enzimas de codificación cromosómica) o de la presencia de otros genes de resistencia incluidos en los plásmidos que codifican la BLEE, o Introducción 52 incluso en otros plásmidos que se encuentran en el mismo microorganismo (Martínez-Martínez, 2007). La aparición de cepas de E. coli bacteriémicas resistentes a antibióticos continua incrementándose a nivel europeo, tanto de las multirresistentes como de las resistentes a un solo antibiótico, tal como se observa en los informes anuales de EARSS (http://www.rivm.nl/earss/about/). En el informe anual de EARSS-2012 se presentaron los resultados de treinta países europeos. Del total de 70.857 cepas de E. coli aisladas de hemocultivos, el 11,8% fueron resistentes a las cefalosporinas de tercera generación y el rango de la proporción de los aislados resistentes osciló entre el 4,4% (Suecia) y el 38,1% (Bulgaria). Tres países mostraron porcentajes de resistencia menor al 5%, 11 países entre el 5% y 10%, otros 11 entre el 10% y 25% y 5 países mostraron los valores más altos arriba del 25% (FIGURA 22) (EARSS, 2012). En el informe anual de 2007, España, con 3.678 cepas de E. coli invasivas y una tasa de resistencia del 7%, figuraba en una posición menos alarmante, pero en el informe de 2012 la situación empeoró. España, con 5.672 cepas, presenta un porcentaje de 13,5% de resistencia a cefalosporinas de tercera generación (FIGURA 22) (EARSS, 2007; EARSS, 2012). De acuerdo al informe anual de EARSS-2012, la resistencia a las fluoroquinolonas se ha incrementado (FIGURA 23). Del total de 71.800 cepas de E. coli invasivas proporcionadas por los treinta países implicados en el estudio, el 22,3% de las cepas fueron resistentes a fluoroquinolonas. La proporción de las cepas resistentes en los diferentes países varía entre el 9,7% y el 42,0%. La mayoría de los países (18 de 30) detectaron porcentajes superiores al 20%, en 11 países osciló entre 10% y 20% y solo Islandia mostró un porcentaje inferior al 10%. Introducción 53 FIGURA 22. Porcentaje de cepas de E. coli invasivas resistentes a cefalosporinas de tercera generación (arriba) 2007, (abajo) 2012 (EARSS, 2007; 2012). FIGURA 23. Porcentaje de cepas de E. coli invasivas resistentes a fluoroquinolonas (EARSS, 2012). Introducción 54 En España, como se observa en la TABLA 5, desde el 2001 se ha incrementado la resistencia a fluoroquinolonas de las cepas de E. coli invasivas. En ese año, de un total de 1.652 cepas estudiadas el 17,3% fueron resistentes. Con el transcurso de los años, el porcentaje de resistencia fue aumentando y alcanzó el 33,9% en el año 2012 (EARSS, 2012). TABLA 5. Porcentaje de cepas de E. coli invasivas resistentes a fluoroquinolonas y a aminoglucósidos en España, 2001-2012. Año Susceptibilidad a fluoroquinolonas Susceptibilidad a aminoglucósidos Nº de cepas % de Resistencia Nº de cepas % de Resistencia 2001 1.652 17,3 1.656 6,8 2002 2.478 19,3 2.480 7,5 2003 2.639 21,0 2.649 7,3 2004 3.466 25,4 3.467 7,5 2005 2.993 28,2 2.996 9,9 2006 3.360 28,0 3.363 9,3 2007 3.659 30,4 3.678 10,1 2008 3.610 32,5 3.622 11,2 2009 3.810 31,5 3.820 13,0 2010 5.696 32,8 5.696 14,2 2011 5.597 34,5 5.603 14,8 2012 5.654 33,9 5.675 15,6 Fuente: EARSS, 2012. Los aminoglucósidos (gentamicina, tobramicina, amikacina, etc.) son otro grupo de antibióticos que ha incrementado su porcentaje de resistencia entre las cepas de E.coli. Los treinta países participantes informaron de los resultados de 68.567 cepas de E.coli invasivas, de las cuales el 10,3% fueron resistentes a aminoglucósidos. La proporción de cepas resistentes entre los diferentes países oscilaron entre el 3,6% y el 26,5%. Trece de los treinta países presentaron porcentajes de cepas resistentes superiores al 10% y dieciséis países se situaron entre el 5% y 10%. Ünicamente, Islandia mostró una prevalencia inferior al 5% (FIGURA 24) (EARSS, 2012). Introducción 55 FIGURA 24. Porcentaje de cepas de E. coli invasivas resistentes a aminoglucósidos (EARS-2012). En España el porcentaje de cepas de E. coli invasivas resistentes a aminoglucósidos se fue incrementando con el transcurso de los años, pasando del 6,8% en el año 2001 al 15,6% en el 2012 (TABLA 5) (EARSS, 2012). Para determinar la resistencia combinada a cefalosporinas de tercera generación, fluoroquinolonas y aminoglucósidos, se analizaron un total de 64.861 cepas de E. coli. De estas cepas, el 4,4% fueron resistentes a los 3 grupos de antibióticos. El porcentaje de cepas multirresistentes (resistencia a cefalosporinas de tercera generación, fluoroquinolonas y aminoglucósidos) fue superior al 10% en 7 países (Bulgaria, Chipre, Grecia, Italia, Rumania, Eslovaquia y Hungría), en 6 países osciló entre 5% y 10%, y en los restantes 17 países el porcentaje fue inferior al 5% (TABLA 6) (EARSS, 2012). Material y Métodos 62 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1.Cepas clínicas de E. coli En el ESTUDIO I caracterizamos 654 cepas de E. coli productoras de BLEE que fueron aisladas de pacientes internos y externos entre los años 2005 y 2008 en 4 hospitales de Galicia: Complexo Hospitalario Xeral-Calde de Lugo (actual Hospital Universitario Lucus Augusti) (325 cepas), Complexo Hospitalario Universitario A Coruña (150 cepas), Complexo Hospitalario de Ourense (100 cepas) y Complexo Hospitalario Arquitecto Marcide-Prof. Novoa Santos de Ferrol (79 cepas). Solo fue incluida una cepa por paciente y la mayoría fueron obtenidas de muestras de orina. Posteriormente las cepas fueron remitidas al LREC de la USC, donde se realizó la identificación del tipo de enzimas BLEE, serotipos, genes de virulencia, grupos filogenéticos, perfiles de PFGE y las secuencias tipo por MLST siguiendo el esquema de Achtman. En el ESTUDIO II analizamos 94 cepas de E. coli productoras de BLEE aisladas de pacientes internos y externos del Hospital Vall d´Hebron de Barcelona en el año 2008. Se incluyó una sola cepa por paciente. Las cepas se aislaron de orina (69), sangre (10), del aparato respiratorio (6), de la piel (5) y de otros orígenes (4). Después de su recolección, las cepas fueron remitidas al LREC de la USC, donde se realizó la caracterización feno-genotípica (serotipo, genes de virulencia, grupos filogenéticos, tipo de enzimas BLEE, PFGE y MLST). En el ESTUDIO III se analizaron un total de 500 cepas de E. coli causantes de infecciones extraintestinales, que fueron recolectadas durante el mes de febrero 2009 de pacientes internos y externos en 5 hospitales de diferentes regiones de España (Hospital Universitario Lucus Augusti de Lugo, Hospital Vall d´Hebron de Barcelona, Hospital Marqués de Valdecilla de Santander, Hospital 12 de Octubre de Madrid y Hospital Virgen de Macarena de Sevilla). En cada hospital se recogieron 100 cepas consecutivas de diferentes pacientes, responsables de infecciones extraintestinales. El 71% procedían de pacientes atendidos en ambulatorios (infecciones comunitarias y asociadas con cuidados sanitarios) y el 29% de pacientes hospitalizados (infecciones nosocomiales). El origen clínico era: 421 cepas de orina, 25 de sangre, 14 de herida quirúrgica, 5 de muestras del tracto respiratorio, 5 de bilis y 30 de otras muestras. Las 500 cepas fueron remitidas al LREC de la USC donde se realizó la detección de Material y Métodos 63 los grupos clonales ST131, ST393 y ST69 y se identificaron las cepas productoras de CTXM. Posteriormente, solo en las cepas de los 3 grupos clonales y en las productoras de CTX-M se realizó el serotipado y la caracterización genotípica (genes de virulencia, grupos filogenéticos, tipo de enzimas BLEE, PFGE, MLST). En el ESTUDIO IV caracterizamos 1.021 cepas de E. coli productoras de BLEE que fueron aisladas de pacientes internos y externos en Febrero y Marzo del año 2006 en 44 hospitales (proyecto GEIH-BLEE-2006) distribuidos por todas las comunidades autónomas de España. Las cepas fueron remitidas al LREC de la USC donde se realizó la identificación del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 mediante la triple PCR que fue desarrollada en el LREC-USC (Blanco et al., 2009). La triple PCR se basa en la detección de los genes afa FM955459, rfbO25b y blaCTX-M15. Tras identificar las cepas pertenecientes al grupo clonal O25b:H4-B2ST131, solo en estas cepas realizamos la caracterización genotípica (tipo de enzimas BLEE, genes de virulencia, grupo filogenético, PFGE, MLST) y el serotipado. También analizamos 52 cepas ST131 aisladas en 8 países de 3 continentes y que pertenecen a las colecciones de referencia de Nicolas-Chanoine et al. (2008) y Johnson et al. (2012b). Se trata de 50 cepas de origen humano y 2 aviares que incluyen representantes de los pulsotipos más prevalentes (800, 812, 905 y 968) y otros menos frecuentes (699, 788, 797, 806, 903, 904, 909, 910, 911, 913, 915, 916, 917, 919, 979, 981, 1160, 1201 y 1202) descritos por Johnson et al. (2012b) recientemente entre cepas ST131 aisladas especialmente en EE.UU. En el ESTUDIO V caracterizamos un total de 3.260 cepas de E. coli aisladas de hemocultivos de 3.008 pacientes internos y externos en la Unidad de Microbiología del Hospital Universitario Lucus Augusti de Lugo, desde el año 1989 hasta el 2011. Las cepas fueron identificadas como E. coli por pruebas bioquímicas y tras realizar el correspondiente antibiograma, se inocularon en medios de conservación, para luego ser remitidos al LREC de la USC, donde se realizó el serotipado, la detección de 3 grupos clonales (O25:H4-B2-ST131, GCA-D-ST69 y O15:H1-D-ST393) asociados con resistencia a antibióticos, la identificación de las cepas productoras de CTX-M y de los grupos filogenéticos. Posteriormente, en las cepas de los 3 grupos clonales y en las productoras de CTX-M, se identificaron los genes de virulencia, el tipo de BLEE producido y el tipado molecular por PFGE y MLST. Además se estableció el serogrupo O y el grupo filogenético de las 3.260 cepas y se estableció el perfil de genes de virulencia de un grupo representativo de cepas históricas y recientes. Material y Métodos 64 3.2. Cepas de referencia En todos los ensayos fenotípicos y genotípicos se emplearon cepas control positivas y negativas de la colección del LREC de la USC. 3.3. Serotipado convencional (fenotípico) y molecular (genotípico) La determinación de los antígeno O y H de las cepas fue realizada por aglutinación siguiendo la metodología originalmente descripta por Guinée et al. (1972, 1981) y modificada por Blanco et al. (1996). Además, se realizó el tipado molecular de las variantes O25a y O25b siguiendo el método descrito por Clermont et al. (2007, 2008) y el tipado molecular de algunos antígenos H. 3.3.1. Serotipado convencional por aglutinación Determinación del antígeno O Se emplearon los 173 antisueros O capaces de reaccionar específicamente con los antígenos O1 a O181 de E. coli. Dichos antisueros se obtuvieron en el LREC inmunizando a conejos y fueron absorbidos para eliminar las reacciones cruzadas causantes de falsos positivos. Los 173 antisueros O monovalentes se repartieron en 25 antisueros polivalentes formados por 6 ó 7 antisueros monovalentes. La dilución final de los antisueros individuales en el polivalente coincide con la dilución de ensayo (1/40 ó 1/80). A. Preparación de las suspensiones bacterianas  Cultivar las cepas en agar de triptona-soja (TSA) (Oxoid) (37°C/18h).  Suspender las bacterias en 2 ml de solución salina (0,85% ClNa, p/v) y ajustar la concentración bacteriana (1,8 x 109 bacterias/ml) por comparación con el tubo número 6 de la escala de Mc Farland.  Calentar la suspensión bacteriana a 100°C/1 hora para eliminar el antígeno K y desenmascarar el antígeno O. Material y Métodos 65  Una vez enfriado, añadir 2 ml de solución salina formalinizada (0,5%, v/v) conteniendo violeta de genciana (0,005%, p/v). Conservar las suspensiones bacterianas a 4°C durante un máximo de 2 semanas. B. Determinación presuntiva del serogrupo O (FIGURA 25A)  Enfrentar las suspensiones calentadas a 100°C/1 h con los 25 antisueros polivalentes a la dilución de ensayo. Para ello, añadir a 50 µl de cada antisuero, y 50 µl de la suspensión bacteriana calentada, formalinizada y teñida. Tapar la placa e incubar (37°C/18 h).  Si la cepa bacteriana da aglutinación con alguno de los antisueros polivalentes empleados, se realiza a continuación el mismo proceso con los antisueros O monovalentes incluidos en el polivalente correspondiente. Realizar la confirmación del serogrupo O con las cepas que hayan sido aglutinadas por 1 o más antisueros O monovalentes. Si la cepa es negativa con todos los antisueros se considera no tipable (ONT). C. Confirmación del serogrupo O (FIGURA 25B)  Colocar 50 µl de solución salina en todos los pocillos de cada fila, excepto en el nº1.  Añadir a los pocillos nº 1 y nº 2 de cada fila 50 µl de la dilución de ensayo del antisuero O correspondiente. Hacer diluciones seriadas (1/2) transfiriendo 50 µl de la mezcla del pocillo nº 2 al nº 3, mezclando y repitiendo la operación hasta llegar al pocillo nº 10. Utilizar los pocillos 11 y 12 como controles negativos, desechando los 50 µl que sobran después de mezclar en el pocillo nº 10.  Añadir 50 µl de la suspensión bacteriana calentada, formalinizada y teñida a los 12 pocillos de cada fila, empezando por el nº 12 y avanzando hasta el nº 1. Tapar las placas e incubar (37°C/18 h) y realizar la lectura de los resultados determinando los títulos. Material y Métodos 66 FIGURA 25. Serotipado de E. coli A: Determinación presuntiva del serogrupo O B: Titulación para la confirmación Determinación del antígeno H Se emplearon 53 antisueros (H1 a H56) que se obtuvieron en el LREC inmunizando a conejos. Estos antisueros fueron absorbidos para eliminar las reacciones cruzadas causantes de falsos positivos. Los 53 antisueros H monovalentes se repartieron en 10 antisueros polivalentes formados por 5 ó 6 antisueros monovalentes. La dilución final de los antisueros individuales en el polivalente coincide con la dilución de ensayo (1/200).  Dar a las cepas 3 pases consecutivos (37°C/48 h) en tubos en forma de "U" con medio para movilidad (medio semisólido MIL, Difco) con objeto de potenciar la expresión de los flagelos. Si la cepa es móvil continuar el proceso. En caso contrario, dar 3 nuevos pases y, si continúa siendo inmóvil, se considerará H-.  Sembrar en 7 ml de infusión de cerebro-corazón (Difco) e incubar (37°C/6-8 h/80 rpm). Añadir 7 ml de solución salina formalinizada sin violeta de genciana y dejar los tubos a Material y Métodos 67 temperatura ambiente una noche. La turbidez de los tubos tratados con solución salina formalinizada debe ser comparable a la del tubo nº 2 de la escala de Mc Farland.  En tubos de vidrio tipo Kahn, añadir 0,5 ml de la suspensión bacteriana formalinizada y 0,5 ml de antisuero polivalente H diluido a 1/200 e incubar (45°C/2 h/ en baño de agua). Realizar este proceso con cada uno de los antisueros H monovalentes incluidos en los antisueros polivalentes positivos. La aglutinación se traduce en la formación de una película en el fondo del tubo, con el sobrenadante transparente. En los cultivos negativos la falta de aglutinación supone que el sobrenadante continua turbio. Si hay aglutinación con alguno de los antisueros se establece el antígeno H. Si no hay aglutinación con ninguno de los antisueros, se considera que tiene un antígeno H no tipable (H? o HNT). 3.3.2. Tipado molecular de los antígenos H También se identificaron algunos antígenos H por PCR empleando los siguientes primers (TABLA 7). Esto resulta particularmente importante en las cepas que no expresan los flagelos al cultivarlas en el laboratorio y que pasarían a ser consideradas no móviles (Hó HNM). Amplificando el gen fliC con primers específicos podemos determinar el antígeno H que dichas cepas podrían teóricamente expresar durante la infección in vivo. 3.3.3. Tipado molecular de las variantes O25a y O25b por PCR La determinación de las variantes O25a y O25b se realizó por PCR empleando los primers descritos por Clermont et al. (2007, 2008) (TABLA 8). Material y Métodos 68 TABLA 7. Primers para la identificación de algunos antígenos H. Genes Primers Secuencia oligonucleótida 5`- 3` Tamaño (bp) Tº de hibridación Referencia fliC-H1 H1-F2 H1-R2 TATCCGGTCAGACCCAGTTC TTGCGGATGTATCACCGTTA 828 60ºC LREC-USC fliC-H2 H2-F H2-R AACGACGGCGAAACAATTAC AGAACGCAACGAGTCAACCT 828 58ºC LREC-USC fliC-H4 H4-F H4-R GCAGCGTATTCGTGAACTGA GCTGGATAATCTGCGCTTTC 713 66ºC Mora et al., 2011b fliC-H7 H7-F H7-R GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC 625 55ºC Gannon et al.,1997 fliC-H8 H8-F H8-R TAACAGCGCAAAAGACGATG CCGAGAGTTTTCGCATCAAT 393 58ºC Mora et al., 2012 fliC-H9 H9-F H9-R ACGAAATCAAATCCCGTCTG GCGGTATCGTTACCTGCATT 649 62ºC LREC-USC fliC-H10 H10-F H10-R AGCAAGTGGCAGTAGGTGCT GCTGGATAATCTGCGCTTTC 624 62ºC LREC-USC fliC-H11 H11-F H11-R ACTGTTAACGTAGATAGC TCAATTTCTGCAGAATATAC 248 52ºC Durso et al., 2005 fliC-H18 H18-F1 H18-R1 TTCTGACCTGGACTCCATCC CGTTAGCAAACGTTGAAGCA 827 60ºC LREC-USC fliC-H21 H21-F H21-R3 GGCGATTGCTAACCGTTTTA CGTAAGTGAACCATCCGCAG 549-556 58ºC Mora et al., 2012 fliC-H25 H25-F H25-R ATGAAATTGACCGCGTATCC TTGCGGGATAGATGTGATAGC 212 58ºC LREC-USC fliC-H28 H28-F H28-R ACGAAATCAAATCCCGTCTC GCCGATTGAAGAGACTCAGC 856 58ºC Mora et al., 2012 TABLA 8. Primers para la identificación de las variantes O25a y O25b. Primers Secuencia oligonucleótida 5´- 3´ Tamaño (bp) Tº de hibridación rfbO25a O25-AR O25-F GAGATCCAAAAACAGTTTGTG ATACCGACGACGCCGATCTG 313 54ºC rfbO25b rfb.1bis rfbO25b.r ATACCGACGACGCCGATCTG TGCTATTCATTATGCGCAGC 300 55ºC Material y Métodos 69 3.4. Detección molecular de los grupos clonales ST131, O15:H1-D-ST393 y GCA-D-ST69 y los subclones H22, H30-Rx, H30 no-Rx y H41. La identificación de los grupos clonales ST131, O15:H1-D-ST393 y GCA-D-ST69 se realizó mediante la técnica de PCR de acuerdo a lo descrito por Johnson et al. (2004a,b, 2009). Por su parte la identificación del subclón H30-Rx se estableció con una PCR de un SNP específico del gen ybbW desarrollada por Banerjee et al. (2013c) y el tipo de alelo fimH secuenciando dicho gen siguiendo el método de clonotipado desarrollado por Weissman et al. (2012) (TABLA 9). Finalmente el tipo de alelo fimH es el que permite identificar los clonotipos y los subclones dentro del grupo clonal ST131. TABLA 9. Primers para la identificación de los grupos clonales ST131, O15:H1-D-ST393 y GCA-DST69, y los subclones H22, H30-Rx, H30 no-Rx y H41. a Primers utilizados para PCR y secuenciación del gen fimH. bPrimers utilizados para identificar el subclón H30-Rx. Primers Secuencia oligonucleótida 5´- 3´ Tamaño (bp) Tº de hibridación ST131 SNPs-gen mdh mdh36-F mdh36-R GTTTAACGTTAACGCCGGT GGTAACACCAGAGTGACCA 275 58ºC ST131 SNPs-gen gyrB gyrb47-F gyrb47-R CGCGATAAGCGCGAC ACCGTCTTTTTCGGTGGAA 132 54ºC ST131 Subclón H30-Rx SNP-gen ybbW bAPfor63 bAPrev66 GGTTGCGGTCTGGGCA CAATATCCAGCACGTTCCAGGTG 194 64-66ºC ST131 Secuenciación fimHTR Alelos fimH afimH-w-F afimH-w-R CACTCAGGGAACCATTCAGGCA CTTATTGATAAACAAAAGTCAC 955 54ºC rfbO15 gndbis.f rfbO15r ATACCGACGACGCCGATCTG TGATAATGACCAACTCGACG 536 54ºC Grupo clonal O15 fumC O15f fumC O15r GCTGCTGGCGCTGCGCAAGCAA CCGGAAATCTCCTGT 153 54ºC GCA gyrB27f gyrB27r GGTGCGTTTCTGGCCA GACGCCGATACCATC 259 52ºC Confirmación del GCA fumC.CGA.f fumC.CGA.r GCTATCTGGCAGACT CGTGCATCGCCGTTGGAAAG 175 52ºC Material y Métodos 70 3.5. Determinación de los grupos filogenéticos por PCR La identificación de los grupos filogenéticos A, B1, B2 y D se realizó por PCR siguiendo el método descrito por Clermont et al. (2000) (TABLA 10 y 11). TABLA 10. Tipado de los grupos filogenéticos. Grupo filogenético Genes chuA yjaA tspE A - + ó - - B1 - + ó - + B2 + + + ó - D + - + ó - TABLA 11. Primers para la identificación de los grupos filogenéticos. Genes Primers Secuencia oligonucleótida 5´- 3´ Tamaño (bp) Tº de hibridación chuA ChuA.1 ChuA.2 GACGAACCAACGGTCAGGAT TGCCGCCAGTACCAAAGACA 279 62ºC yjaA YjaA.1 YjaA.2 TGAAGTGTCAGGAGACGCTG ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC 211 54ºC tspE TspE4.C2.1 TspE4.C2.2 GAGTAATGTCGGGGCATTCA CGCGCCAACAAAGTATTACG 152 54ºC 3.6. Detección y tipado de BLEE por PCR y secuenciación La detección de los genes bla que codifican para BLEE de tipo TEM, SHV y CTX-M se realizó por PCR siguiendo el protocolo descrito por Leflon-Guibout et al. (2004, 2008). Los amplificados de las cepas positivas posteriormente se secuenciaron para poder determinar el tipo concreto de enzima producido por la cepa. Las secuencias obtenidas fueron comparadas con los correspondientes genes disponibles en el GenBank usando Blast sequence software (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). La secuenciación se realizó en el Departamento de Genética Material y Métodos 71 de la Facultad de Veterinaria. Para ello se utilizó el método de Sanger, empleando el analizador genético ABI 3100 (Applied Bio-Systems) y un BigDye Terminador v3.1 cycle sequencing kit. Se secuenciaron las 2 hebras complementarias del fragmento de ADN amplificado en la reacción de PCR. En la TABLA 12, se listan los primers usados en las pruebas de PCR, sus secuencias nucleotídicas, y el tamaño en pares de bases. TABLA 12. Primers para el tipado de BLEE por PCR y secuenciación. Genes Primers Secuencia oligonucleótida 5´a 3´ Tamaño (bp) Tº de hibridación Referencia bla CTX-M CTX-C3 CTX-C4 ATGTGCAGCACCAGTAAAGTGATG ACCGCGATATCGTTGGTGGTGCC 542 58 ºC Mora et al., 2013 bla CTX-M Grupo 9 CTX-M-9, 14, 14b aCTX-M9-F aCTX-M9R GTGACAAAGAGAGTGCAACGG ATGATTCTCGCCGCTGAAGCC 856 56 ºC Simarro et al., 2000 bla CTX-M Grupo 1 CTX-M-1, 15, 32 CTX-M-F1 CTX-M-F2 ATAAAACCGGCAGCGGTG GAATTTTGACGATCGGGG 483 55 ºC Leflon-Guibout et al., 2004 CTX-M13-U CTX-M13-L GGTTAAAAAATCACTGCGTC TTGGTGACGATTTTAGCCGC 863 52 ºC Saladin et al., 2002 bCTX-15-F1 bCTX-15-R GAAGCTAATAAAAAACACACGTGG GTATGCGCAAGCGCAGGTGG 10441123 52 ºC Mora et al., 2013 bla SHV bSHV-1 bSHV-2 GGGTTATTCTTATTTGTCGC TTAGCGTTGCCAGTGCTC 930 48 ºC Rasheed et al., 1997 bla SHV SHV-F2 SHV-R2 TTGTCGCTTCTTTACTCGCC CCCGGCGATTTGCTGATTTCGC 879 58 ºC Mora et al., 2013 bla TEM aTEM-1-F aTEM-1-R ATGAGTATTCAACATTTCCG CTGACAGTTACCAATGCTTA 868 50 ºC Rasheed et al., 1997 a Primers utilizados para PCR y secuenciación. b Primers utilizados para secuenciación. 3.7. Detección de genes de virulencia por PCR Se investigaron los genes de virulencia empleando los primers que figuran en la TABLA 13. 3.8. Protocolo de PCR Preparación de las muestras: extracción del ADN Material y Métodos 78 a. Preincubación: termobloque a 37ºC, 15 minutos en 200 μl del buffer H 10X diluido en agua bidestilada. Pasado ese tiempo retiramos el buffer de preincubación y añadimos la enzima b. Incubación: termobloque a 37ºC, 180 minutos en 200 μl de la enzima XbaI (10U/μl por muestra) diluida en buffer H Electroforesis 13. Una vez terminada la digestión, montar los cortes de bloque sobre los dientes del peine para la electroforesis. Preparar el gel con 150 ml de agarosa SeakemGold al 1% en TBE 0,5X. La agarosa a 55ºC añadirla al molde en el que se ha colocado el peine. Condiciones de electroforesis en el CHEF Mapper para E. coli:  Auto Algorithm  30 kb-low MW 600 kb-high MW  Pulso inicial: 2.16s Pulso final: 54.17s Tiempo: 21.30h 3.11. Determinación de resistencia a antimicrobianos El estudio de la susceptibilidad de las cepas a los antimicrobianos se realizó en el laboratorio de Microbiología del Hospital donde se aislaron. Concretamente, en la Unidad de Microbiología del Hospital Universitario Lucus Augusti, se utilizó el Sistema MicroScan WalkAway® plus (Siemens) que determina la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos y la concetración minima inhibitoria (CMIs) según las normas descritas por el CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). En los otros hospitales se empleó este mismo sistema u otros similares. Se analizó la sensibilidad para Sulfa-trimetoprim, ácido nalidixico, ciprofloxacina, gentamicina, tobramicina, amikacina, fosfomicina, nitrofurantoina, amoxicilina/ácido clavulánico, piperacilina/tazobactam, cefepima, ceftazidima, aztreonam y cefotaxima. La producción de BLEE se definía si se observaba sinergia entre amoxicilina/ácido clavulánico y al menos uno de los siguientes antimicrobianos: cefotaxima, ceftazidima, aztreonam o cefepima. Material y Métodos 79 3.12. Análisis estadístico Las proporciones entre grupos fueron comparadas usando normalmente la prueba exacta de Fisher o Chi-cuadrado. P<0,05 implica diferencias estadísticamente significativas. Resultados 80 4. RESULTADOS 4.1. ESTUDIO I: Emergencia de los grupos clonales O1:HNM-D-ST59, O15:H1-DST393, O20:H34/HNM-D-ST354, O25b:H4-B2-ST131 y ONT:H21,42-B1-ST101 entre cepas de E. coli productoras de CTX-M-14 aisladas en Galicia (2005-2008). 4.1.1. Breve introducción y objetivos En un estudio previo (Blanco et al., 2009), realizado con cepas de E. coli productoras de enzimas BLEE aisladas de pacientes con infecciones extraintestinales del Complexo Hospitalario Xeral-Calde de Lugo, observamos que las enzimas más frecuentemente producidas eran CTX-M-14 y CTX-M-15, y que casi todas las cepas CTX-M-15 pertenecían al grupo clonal emergente O25b:H4-B2-ST131. En contraste, en dicho estudio, como en los estudios previos, se observó una altísima diversidad clonal entre las cepas productoras de CTX-M-14. En el presente estudio se caracterizó un mayor número de cepas BLEE procedentes de varios hospitales de Galicia con el objetivo de identificar y caracterizar grupos clonales emergentes entre cepas de E. coli CTX-M-14. 4.1.2. Aislados clínicos (cepas) Se caracterizaron un total de 654 cepas de E. coli productoras de BLEE aisladas de pacientes internos y externos entre 2005 y 2008 en 4 hospitales de Galicia: Complexo Hospitalario Xeral-Calde de Lugo (325 cepas), Complexo Hospitalario Universitario A Coruña (150 cepas), Complexo Hospitalario de Ourense (100 cepas) y Complexo Hospitalario Arquitecto Marcide-Prof. Novoa Santos de Ferrol (79 cepas). 4.1.3. Estudios realizados Se determinó el tipo de enzimas BLEE, serotipos, genes de virulencia, grupos filogenéticos, perfiles de PFGE, las secuencias tipo por MLST siguiendo el esquema de Achtman y las resistencias a antibióticos. Resultados 81 4.1.4. Análisis molecular de las enzimas BLEE e identificación de grupos clonales De las 654 cepas de E. coli productoras de BLEE, 334 (51%) fueron positivas para CTX-M14 y 119 (18%) para CTX-M-15, siendo estas 2 enzimas BLEE las más prevalentes. Hay que destacar que la cepa FV10827 presentó los genes blaCTX-M-14 y blaCTX-M-15. Entre las 119 cepas productoras de CTX-M-15, 103 (87%) pertenecieron al grupo clonal O25b:H4-B2-ST131, el cual también resultó positivo para otros tipos de BLEE (CTX-M-1, CTX-M-9, CTX-M-14 y CTX-M-32). En contraste con las cepas CTX-M-15, las cepas productoras de CTX-M-14 pertenecieron a un amplio número de serotipos. Pero al analizar las cepas que compartían los mismos serotipos y grupos filogenéticos pudimos identificar 32 cepas CTX-M-14 (25 de ITU), englobadas en 5 grupos clonales, que han sido caracterizadas con detalle en el presente estudio. Los 5 grupos clonales emergentes identificados fueron los siguientes: O1:HNM-D-ST59, O15:H1-D-ST393, O20:H34/HNM-D-ST354, O25b:H4-B2-ST131 y ONT:H21,42-B1ST101. La cepa FV10856 (ST1394) presentó un único nucleótido de diferencia en el gen purA con las 4 cepas del grupo clonal O15:H1-D-ST393 por lo que consideramos que las 5 cepas deben incluirse en el mismo grupo clonal. 4.1.5. Genes de Virulencia Las 32 cepas de E. coli CTX-M-14 pertenecientes a los 5 grupos clonales emergentes fueron analizadas por PCR para la presencia de genes que codifican para factores de virulencia de cepas ExPEC (TABLA 15). Como era de esperar, las cepas pertenecientes al mismo grupo clonal mostraron similares perfiles de genes de virulencia (FIGURA 26). Las 32 cepas de E. coli cumplen el criterio de estatus ExPEC, ya que presentan 2 o más de los 5 genes de virulencia (papEF, sfa/focDE, afa/draBC, iucD y kpsM II) de acuerdo a la Resultados 82 definición de Johnson et al. (2003). Las cepas pertenecientes a los grupos clonales ONT:H21,42-B1-ST101 y O1:HNM-D-ST59 acumulaban el mayor número de factores de virulencia (≥8). Las 2 cepas afa/draBC del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 eran afaE1. 4.1.6. Resistencia antimicrobiana Las 32 cepas de E. coli CTX-M-14 pertenecientes a los 5 grupos clonales emergentes se analizaron para la resistencia a carbapenemes, aminoglucósidos, fluoroquinolonas, trimetoprim-sulfametoxazol y fosfomicina. Las cepas del grupo clonal O1:HNM-D-ST59 fueron sensibles a estos antibióticos, mientras que la mayoría de las cepas de los restantes 4 grupos clonales fueron resistentes a la ciprofloxacina y al trimetoprim-sulfametoxazol. Las del grupo clonal O20:H34/HNM-DST354 también fueron resistentes a la gentamicina y algunos a la tobramicina. Las 32 cepas productoras de CTX-M-14 fueron sensibles a imipenem, amikacina y fosfomicina (FIGURA 26). 4.1.7. Tipado molecular por PFGE Como se observa en la FIGURA 26, el análisis de los perfiles de macrorestricción de las 32 cepas de E. coli CTX-M-14 pertenecientes a los 5 grupos clonales formaron 5 clusters (I a V) que se corresponden con los grupos clonales O15:H1-D-ST393/ST1394, ONT:H21,42-B1ST101, O1:HNM-D-ST59, O20:H34/HNM-D-ST354 y O25b:H4-B2-ST131, respectivamente. Las cepas (O15:H1, O1:HNM y O25b:H4) de los clusters I, III y V que fueron aisladas en diferentes años y hospitales mostraron una alta diversidad genética, mientras que las cepas (ONT:H21,42 y O20:H34/HNM) agrupadas en los clusters II y IV aisladas en el Hospital Lucus Augusti de Lugo en 2008 y 2007, respectivamente, presentaron como era de esperar, una más baja variabilidad genética. Resultados 83 Las cepas del grupo clonal O15:H1-D-ST393/ST1394 (cluster I con un 73,2% de similitud) mostraron un subcluster con un 87,6% de similitud formado por 4 cepas con idéntico patrón de genes de virulencia (fimH, fimAVMT78, papGII, sat, iucD y kpsMII-K5). Las cepas del grupo clonal ONT:H21,42-B1-ST101 (cluster II y 93,3% de similitud) resultaron ser las más homogéneas, presentando las 5 cepas el mismo patrón de genes de virulencia (fimH, papGIII, focG, iucD, iroN, iss, traT y tsh) y de resistencias (ciprofloxacina y trimetoprim-sulfametoxazol). Las cepas del grupo clonal O1:HNM-D-ST59 (cluster III y 76,5% de similitud) mostraron 3 subclusters con diferentes patrones de genes de virulencia. Un dato interesante es que las cepas del grupo clonal O20:H34-D-ST354 (cluster IV y 79,9% de similitud) formaron 2 subclusters con las cepas móviles (H34) e inmóviles (HNM), respectivamente. Las cepas del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 (cluster V y 64,7% de similitud) también formaron 2 subclusters con las cepas fimH y afa/draBC positivas respectivamente. 4.1.8. Comparación de cepas del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 productoras de diferentes tipos de enzimas CTX-M Por último, en este estudio hemos comparado las 5 cepas CTX-M-14 pertenecientes al grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 con otras 9 cepas del mismo grupo clonal productoras de otros tipos de enzimas CTX-M, comprobando que las cepas que producen el mismo tipo de enzima BLEE y poseen el mismo patrón de genes de virulencia se incluyen dentro del mismo cluster, y que las cepas productoras de CTX-M-14 pertenecen a diferentes clusters que las CTX-M-15 (FIGURA 27). Resultados 84 TABLA 15. Caracterización de los genes de virulencia en las 32 cepas de E. coli productoras de CTXM-14 pertenecientes a los 5 grupos clonales. Genes O1:HNM-DST59 n=10 O15:H1-DST393/ST1394 n=5 O20:H34/HNMD-ST354 n=7 O25b:H4-B2ST131 n=5 ONT:H21,42B1-ST101 n=5 Adhesinas fimH 10 5 7 3 5 fimAvMT78 7 5 0 0 0 papEF 9 5 0 0 5 papG 9 5 0 0 5 papG I 6 0 0 0 0 papG II 5 5 0 0 0 papG III 0 0 0 0 5 sfa/focDE 0 0 0 0 5 sfaS 0 0 0 0 0 focG 0 0 0 0 5 afa/draBC 0 0 0 2 0 bmaE 0 0 0 0 0 gafD 0 0 0 0 0 Toxinas cnf1 0 0 0 0 0 cdtB 0 0 0 0 0 sat 10 5 0 5 0 hlyA 0 0 0 0 0 Sideróforos iucD 10 5 6 5 5 iroN 0 0 0 0 5 Cápsula kpsM II 10 5 7 5 0 kpsM II-K2 0 0 0 0 0 kpsM II-K5 0 5 7 5 0 neuC-K1 10 0 0 0 0 kpsM III 0 0 0 0 0 Varios cvaC 0 0 0 0 0 iss 0 0 0 0 5 trat 9 0 0 4 5 ibeA 0 1 7 0 0 malX 10 0 0 5 0 usp 10 0 7 5 0 tsh 0 0 0 0 5 Resultados 85 FIGURA 26. Dendrograma del análisis de los perfiles de PFGE-XbaI de las 32 cepas de E. coli CTX-M-14 pertenecientes a los 5 grupos clonales. A la derecha de la imagen se indica la designación de la cepa, serotipo, grupo filogenético, secuencia tipo (ST), año, localidad del hospital, genes de virulencia y resistencia antimicrobiana. La cepa FV 10827 (O25b:H4) produce CTX-M-14 y CTX-M-15. CIP, ciprofloxacina; SXT, trimetoprim-sulfametoxazol; GEN, gentamicina; TOB, tobramicina. Resultados 86 FIGURA 27. Dendrograma del análisis de los perfiles de PFGE-XbaI de las 14 cepas del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131. Comparación entre las cepas productoras de CTX-M-14 y de otras enzimas CTX-M. A la derecha de la imagen se indica la designación de la cepa, el tipo de CTX-M, el patrón de genes de virulencia y la resistencia antimicrobiana. La cepa FV 10827 (O25b:H4) produce CTX-M-14 y CTX-M-15. CIP, ciprofloxacina; SXT, trimetoprim-sulfametoxazol; GEN, gentamicina; TOB, tobramicina. Resultados 87 4.2. ESTUDIO II: Detección de cepas del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 productoras de SHV-12 con un elevado contenido de genes de virulencia e identificación de los grupos clonales ST101, ST162, ST369, ST393 y ST410 entre cepas de E. coli productoras de BLEE (Barcelona, 2008). 4.2.1. Breve introducción y objetivos Después de investigar cepas de E. coli productoras de enzimas BLEE aisladas de pacientes con infecciones extraintestinales del Complexo Hospitalario Xeral-Calde de Lugo entre los años 2006 y 2008 (Blanco et al., 2009) y asociar el grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 con la emergencia de la enzima CTX-M-15, nos planteamos el presente estudio con el objetivo de evaluar la presencia del grupo clonal ST131 en un hospital de otra Comunidad Autónoma situada a una distancia (1020 Km) considerable, comparar las cepas aisladas en ambos hospitales y detectar la posible emergencia de nuevos grupos clonales productores de enzimas BLEE. 4.2.2. Aislados clínicos (cepas) Se caracterizaron un total de 94 cepas de E. coli productoras de BLEE aisladas de pacientes internos y externos del Hospital Vall d´Hebron de Barcelona en el año 2008. El 72% de las cepas procedían de pacientes con ITU y el resto de otras infecciones extraintestinales. 4.2.3. Estudios realizados Se determinó el tipo de enzimas BLEE, serotipos, genes de virulencia, grupos filogenéticos, perfiles de PFGE, las secuencias tipo por MLST siguiendo el esquema de Achtman y las resistencias a antibióticos. 4.2.4. Análisis molecular de las enzimas BLEE Las enzimas BLEE más frecuentemente producidas por las 94 cepas de E. coli investigadas fueron: CTX-M-14 (46%), CTX-M-15 (26%) y SHV-12 (18%). Entre un 1% y un 4% de las Resultados 94 FIGURA 28. Dendrograma de las 30 cepas de E. coli O25b:H4-B2-ST131 productoras de BLEE (Barcelona, 2008). Los clusters que presentan una similitud ≥85% son indicados en negrilla. A la derecha de la imagen se indica la designación de la cepa, tipo de enzima BLEE, los genes de virulencia y la resistencia antimicrobiana. NAL, ácido nalidixico; CIP, ciprofloxacina; SXT, trimetoprim-sulfametoxazol; GEN, gentamicina; TOB, tobramicina, AMK, amikacina. Resultados 95 FIGURA 29. Dendrograma de las 16 cepas de E. coli productoras de BLEE pertenecientes a los grupos clonales ST101, ST162, ST369, ST393 y ST410 (Barcelona, 2008). A la derecha de la imagen se indica la designación de la cepa, el serotipo, la secuencia tipo, el tipo de enzima BLEE, el grupo filogenético, los genes de virulencia y la resistencia antimicrobiana. NAL, ácido nalidixico; CIP, ciprofloxacina; SXT, trimetoprim-sulfametoxazol; TOB, tobramicina. Resultados 96 4.3. ESTUDIO III: Prevalencia y caracterización de los grupos clonales O25b:H4-B2ST131, O15:H1-D-ST393 y GCA-D-ST69 en infecciones extraintestinales en España. Relación con la resistencia antimicrobiana y el contenido de genes de virulencia (Estudio Nacional año 2009). 4.3.1 Breve introducción y objetivos Los grupos clonales O25b:H4-B2-ST131, O15:H1-D-ST393 y CGA-D-ST69 se han asociado en numerosos estudios con la resistencia a antibióticos, pero únicamente en un estudio realizado en Canadá entre los años 2004 y 2006 se habían analizado conjuntamente (Johnson et al., 2009). Por ello nos propusimos realizar el primer estudio en Europa en el que además de analizar la prevalencia de estos grupos clonales estudiásemos el potencial de virulencia de las cepas y su papel como responsables de las elevadas tasas de resistencia a antimicrobianos observadas en cepas de E. coli causantes de infecciones extraintestinales. 4.3.2. Aislados clínicos (cepas) Se analizaron un total de 500 cepas de E. coli causantes de infecciones extraintestinales que fueron recolectadas durante el mes de febrero 2009 de pacientes internos y externos en 5 hospitales de España (Hospital Universitario Lucus Augusti de Lugo, Hospital Vall d´Hebron de Barcelona, Hospital Marqués de Valdecilla de Santander, Hospital 12 de Octubre de Madrid y Hospital Virgen de Macarena de Sevilla). En cada hospital se recogieron 100 cepas consecutivas de diferentes pacientes. El 84% de las cepas procedían de pacientes con ITU y el resto de otras infecciones extraintestinales. 4.3.3. Estudios realizados Se realizó la detección de los 3 grupos clonales y la determinación del tipo de enzimas BLEE en las 500 cepas incluidas en el estudio. Posteriormente se establecieron los serotipos, genes de virulencia, grupos filogenéticos, perfiles de PFGE, las secuencias tipo por MLST siguiendo el esquema de Achtman y las resistencias a antibióticos de las cepas pertenecientes a los 3 grupos clonales y de las cepas productoras de enzimas BLEE. Resultados 97 4.3.4. Prevalencia de grupos clonales y de cepas productoras de BLEE De acuerdo con los estudios de tipado molecular realizados entre las 500 cepas de E.coli analizadas, 59 (12%) eran del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131, 16 (3%) del grupo clonal O15:H1-D-ST393 y 22 (4%) del GCA-D-ST69. Por lo tanto, los 3 grupos clonales representaron colectivamente el 19% del total de las cepas. La mayor prevalencia de los 3 grupos clonales (30%) se observó en el Hospital Vall d´Hebron de Barcelona y la menor en el Hospital Marqués de Valdecilla de Santander (13%) (TABLA 19). Los grupos clonales ST131 y ST69 se encontraron en los 5 hospitales y el ST393 en 4. El ST131 fue significativamente más prevalente que los otros 2 grupos en los 5 hospitales (P<0,001). Los 3 grupos clonales presentaron una prevalencia similar entre las cepas aisladas de pacientes ambulatorios y hospitalizados: ST131 (12% versus 12%), ST393 (3% versus 4%) y ST69 (4% versus 4%). Por otra parte, la prevalencia de las cepas de E. coli productoras de BLEE fue de 7% (35 de las 500 cepas). De las 59 cepas ST131, 6 cepas (10%) (55SA, 167LU, 6MA, 99SE, 85MA y 29BA) fueron positivas para CTX-M-15. De las 16 cepas ST393, solo 1 cepa (6%) fue positiva para CTX-M-14, y ninguna de las cepas ST69 fue productora de BLEE. 4.3.5. Resistencia antimicrobiana Como se observa en la TABLA 20, los 3 grupos clonales conjuntamente representaron el 37% de las cepas resistentes a trimetoprim-sulfametoxazol y ciprofloxacina, el 34% de las cepas resistentes a aminoglucósidos y el 30% de las cepas multirresistentes. Las cepas del grupo clonal GCA-D-ST69 supusieron el 12% de las resistentes a trimetoprimsulfametoxazol y sensibles a ciprofloxacina, mientras que las cepas de los grupos clonales O25b:H4-B2-ST131 y O15:H1-D-ST393 representaron el 23% y el 10%, respectivamente, de las resistentes a trimetoprim-sulfametoxazol y ciprofloxacina. Es de destacar que el grupo Resultados 98 clonal ST131 fue el más prevalente entre las cepas multirresistentes, suponiendo el 23% de las mismas. 4.3.6. Factores de virulencia Las cepas pertenecientes a los 3 grupos clonales (O25b:H4-B2-ST131, O15:H1-D-ST393 y GCA-D-ST69) y las 28 cepas productoras de BLEE de los otros grupos clonales fueron analizadas por PCR para la presencia de 30 genes que codifican para factores de virulencia típicos de cepas ExPEC (TABLA 21). Las cepas ST131 presentaron el mayor número de genes de virulencia (media 8,1; rango 4 a 13 genes), comparado con las cepas ST393 (media 6,0; rango 3 a 7), ST69 (media 5,4; rango 2 a 9) y las cepas productoras de BLEE de los otros grupos clonales (media 4,0; rango 1 a 7) (P<0,001). El mayor número de genes de virulencia se observó en las cepas ST131 que tienen el gen ibeA, que presentaron una media de 11,4 genes y un rango de 8 a 13 genes. De las 97 cepas pertenecientes a los 3 grupos clonales, 67 cepas (69%) cumplieron los criterios para cepas ExPEC. Los patrones de combinaciones de genes de virulencia fueron diferentes en cada uno de los grupos clonales. Entre las 59 cepas ST131 se identificaron 24 patrones (P1– P24) (FIGURA 30), 4 patrones entre las 16 cepas ST393 (P25 – P28) (FIGURA 31) y 16 patrones entre las 22 cepas ST69 (P29 – P44) (FIGURA 32). Aunque se encontraron diferentes combinaciones de genes de virulencia entre las cepas pertenecientes a un mismo grupo clonal, la mayoría de las cepas compartían muchos genes de virulencia. En contraste, entre las 28 cepas de E. coli productoras de BLEE pertenecientes a otros grupos clonales se encontraron numerosos y heterogéneos patrones de genes de virulencia (P45 – P62) (FIGURA 33). 4.3.7. Tipado molecular por PFGE En la FIGURA 30 se muestra el dendrograma obtenido tras realizar el análisis de los perfiles Resultados 99 de macrorrestricción con la enzima XbaI de las 59 cepas ST131 que presentaron una similitud del 58,5%. Las cepas se distribuyeron en 4 clusters (I – IV) con unas identidades del 67,6%, 71,5%, 72,6% y 75,0%, respectivamente. Las cepas de estos 4 grupos presentaban patrones de genes de virulencia y resistencia antimicrobiana característicos. La mayoría de las cepas ST131 se incluyeron en el cluster II. Casi todas las cepas de este cluster poseen el gen sat y carecen del gen ibeA. Es interesante destacar que las cepas ST131 con el gen de virulencia ibeA formaron 2 clusters (I y III), que se pueden diferenciar claramente por el distinto patrón de genes de virulencia. El cluster I incluye 8 cepas aisladas en los 5 hospitales participantes en este estudio, que presentaron idéntica combinación de genes de virulencia (cnf1, hlyA e iroN) y que son resistentes al trimetoprim-sulfametoxazol. Las cepas del cluster III presentaron un perfil de genes de virulencia bastante diferente incluyendo el gen cdtB que está ausente en las cepas del cluster I. En cualquier caso la diversidad genética observada entre las 59 cepas ST131 ha sido muy elevada, y se identifico un total de 11 clusters con una similitud ≥ 85%. La FIGURA 31 muestra el dendrograma de las 16 cepas O15:H1-D-ST393 que presentaron una similitud del 72,2% y un cluster con una similitud ≥ 85% que incluyó 13 cepas. Las cepas incluidas en este grupo clonal presentan también un homogéneo patrón de genes de virulencia, incluyendo los genes fimH, fimAvMT78, papGII, sat, iucD y kpsM II-K5. En la FIGURA 32, se observa el dendrograma de las 22 cepas GCA-D-ST69, las cuales muestran una similitud del 68,2%, con 4 clusters que muestran una similitud ≥ 85%. Se observó una gran diversidad tanto en los perfiles de PFGE como en los patrones de genes de virulencia. Como era de esperar la diversidad de los perfiles de PFGE y de los patrones de virulencia de las 28 cepas productoras de BLEE que no pertenecieron a ninguno de los 3 grupos clonales fue muy elevada, observándose una similitud de tan sólo el 48,2% y únicamente 2 clusters con una similitud ≥ 85% (FIGURA 33). Resultados 100 TABLA 19. Prevalencia de los 3 grupos clonales entre las 500 cepas de E. coli aisladas en 5 hospitales españoles. Hospital Ciudad Nº total de cepas Prevalencia de los grupos clonales O25b-B2-ST131 O15-D-ST393 GCA-D-ST69 Hospital Lucus Augusti Lugo 100 8 4 5 Hospital Vall d´Hebron Barcelona 100 16 5 9 Marqués de Valdecilla Santander 100 9 2 2 12 de Octubre Madrid 100 15 0 3 Virgen Macarena Sevilla 100 11 5 3 Total 500 59 (12%) 16 (3%) 22 (4%) TABLA 20. Distribución de los 3 grupos clonales por categorías de resistencia antimicrobiana. Fenotipos de resistencia Nº Total de cepas Prevalencia de los grupos clonales O25b-B2ST131 O15-DST393 GCA-DST69 Total Trimetoprim-sulfametoxazol 174 31 (18%) 10 (6%) 14 (8%) 55 (32%) Fluoroquinolonas 155 41 (26%) 14 (9) 4 (3%) 59 (38%) Trimetoprim-sulfametoxazol y fluoroquinolonas 93 21 (23%) 9 (10%) 4 (4%) 34 (37%) Aminoglucósidos 61 17 (28%) 0 4 (7%) 21 (34%) Amoxicilina/ácido clavulánico 39 6 (15%) 0 0 6 (15%) Cefalosporinas de espectro extendido 38 6 (16%) 1 (3%) 0 7 (19%) Ninguno de los indicados anteriormente 256 51 (20%) 14 (5%) 14 (5%) 79 (31%) Multirresistencia (a 3 o más clases de antimicrobianos) 61 14 (23%) 1 (2%) 3 (5%) 18 (30%) Fluoroquinolonas: resistencia a ciprofloxacina; aminoglucosidos: resistencia a gentamicina, tobramicina y/o amikacina; cefalosporinas de espectro extendido: resistencia a cefepima, ceftazidima y/o cefotaxima. Resultados 101 TABLA 21. Genes de virulencia de las 97 cepas de los 3 grupos clonales. Genes Grupos clonales Valor de Pa O25b-B2ST131 (n = 59) O15-DST393 (n =16) GCA-DST69 (n = 22) ST131 vs ST393 ST131 vs ST69 ST393 vs ST69 Adhesinas fimH 58 (98%) 16 (100%) 22 (100%) fimAvMT78 0 16 (100%) 0 <0,001 <0,001 papEF 15 (25%) 14 (88%) 12 (55%) <0,001 0,011 0,029 papG I 0 0 0 papG II 3 (5%) 14 (88%) 8 (36%) <0,001 0,005 <0,001 papG III 12 (20%) 0 0 0,043 0,016 papG IV 0 0 3 (14%) 0,018 sfa/focDE 0 0 0 afa/draBC 7 (12%) 0 1 (5%) afaFM955459 4 (7%) 0 0 bmaE 0 0 1 (5%) gafD 0 0 1 (5%) Toxinas cnf1 10 (17%) 0 0 0,033 cdtB 6 (10%) 0 0 sat 39 (66%) 15 (94%) 11 (50%) <0,001 0,004 hlyA 10 (17%) 0 0 0,033 Sideróforos iucD 52 (88%) 15 (94%) 19 (86%) iroN 22 (37%) 0 5 (23%) 0,002 Cápsula kpsM II 43 (73%) 16 (100%) 11 (50%) 0,013 0,034 0,001 kpsM II-K2 6 (10%) 0 1 (5%) kpsM II-K5 36 (61%) 16 (100%) 10 (45%) 0,001 <0,001 neuC-K1 1 (2%) 0 0 kpsM III 0 0 6 (27%) <0,001 0,027 Varios cvaC 14 (24%) 0 5 (23%) 0,024 iss 21 (36%) 0 5 (23%) 0,002 traT 51 (86%) 3 (19%) 19 (86%) <0,001 <0,001 ibeA 16 (27%) 0 0 0,013 0,003 malX (PAI) 58 (98%) 0 0 <0,001 <0,001 usp 59 (100%) 0 0 <0,001 <0,001 tsh 1 (2%) 0 2 (9%) Estatus ExPEC 38 (64%) 16 (100%) 13 (59%) 0,002 0,003 Cepas con ≥8 genes de virulencia 25 (42%) 0 1 (5%) <0,001 <0,001 aEl valor de P fue obtenido mediante la prueba exacta de Fisher. Únicamente se muestran si son estadísticamente significativos (P<0,05). Resultados 102 FIGURA 30. Dendrograma del análisis de los perfiles de PFGE-XbaI de las 59 cepas de E. coli O25b:H4-B2ST131 aisladas de infecciones extraintestinales (2009). Los clusters que presentan una similitud ≥85% son indicados en negrilla. A la derecha de la imagen se indica la designación de la cepa, el patrón de genes de virulencia, los genes de virulencia y la resistencia antimicrobiana. Las cepas 55SA, 167LU, 6MA, 99SE, 85MA y 29BA del grupo II eran productoras de CTX-M-15. CIP, ciprofloxacina; SXT, trimetoprim-sulfametoxazol; GEN, gentamicina; TOB, tobramicina. Resultados 103 FIGURA 31. Dendrograma del análisis de los perfiles de PFGE-XbaI de las 16 cepas de E. coli O15:H1-D-ST393 aisladas de infecciones extraintestinales (2009). Los clusters que presentan una similitud ≥85% son indicados en negrilla. A la derecha de la imagen se indica la designación de la cepa, el serotipo, el patrón de genes de virulencia, los genes de virulencia y la resistencia antimicrobiana. La cepa 114LU fue productora de CTX-M-14. CIP, ciprofloxacina; SXT, trimetoprimsulfametoxazol. Resultados 110 Como era de esperar los genes blaOXA-1 y aac(6´)-ib-cr se asociaron con la producción de la enzima CTX-M-15. Estos genes se detectaron en el 69% y el 100% de las cepas del virotipo A, respectivamente, en el 88% (ambos genes) del virotipo B y en el 51% (ambos genes) del virotipo C, pero en ninguna de las cepas del virotipo D (TABLA 25). Únicamente hemos detectado la secuencia IS26, insertada al final de la secuencia movilizadora ISEcp1 interrumpiendo la secuencia promotora del gen blaCTX-M-15, en las 29 cepas del virotipo A (P<0,001 con respecto a los virotipos B, C y D) (TABLA 25). 4.4.10. Relación entre los virotipos y los pulsotipos (PFGE) En base al dendrograma obtenido por PFGE, 116 de las 130 cepas O25b-ST131 fueron distribuidas en 4 grandes clusters específicos para cada virotipo, con un nivel de similitud del 72% (11 cepas del virotipo D), 76% (28 cepas del virotipo A), 77% (33 cepas del virotipo C) y 74% (39 cepas del virotipo B) (FIGURA 36 y FIGURA 1 suplementaria incluida únicamente en la versión electrónica). En las FIGURAS 37, 38, 39 y 40 figuran los pulsotipos de las cepas españolas de los virotipos A, B, C y D, respectivamente. Cuando se obtuvo el dendrograma con los pulsotipos de las 130 cepas españolas y de las 52 cepas internacionales también se formaron los 4 grandes clusters virotipo específicos (FIGURA 2 suplementaria incluida únicamente en la versión electrónica). Estos 4 clusters presentaron una similitud del 80% (47 cepas, 40 del virotipo B), 78% (60 cepas, 58 del virotipo C), 82% (37 cepas, 36 del virotipo A) y 67% (18 cepas, 16 del virotipo D) e incluyeron todos ellos cepas de varios países. Las 13 cepas internacionales pertenecientes a los 4 principales pulsotipos establecidos por Johnson et al. (2012b) presentaron los virotipos A (pulsotipo 812), B (pulsotipo 905), y C (pulsotipos 968, 800, 905 y 812). Ninguna de las cepas de estos 4 pulsotipos prevalentes entre las cepas ST131 de EE.UU. presentó el virotipo D. Resultados 111 4.4.11. Asociaciones clínicas y epidemiológicas En la TABLA 26 se han comparado los datos clínicos y epidemiológicos de las infecciones causadas por las cepas O25b-ST131 y por cepas no pertenecientes a dicho grupo clonal. Las infecciones causadas por O25b-ST131 se han asociado significativamente con una mayor edad de los pacientes, con pacientes ingresados en residencias de ancianos/cuidados especiales, con las infecciones extrahospitalarias asociadas con cuidados sanitarios, con bacteriuria asintomática y con bacteriemia. No obstante, después de ajustar los datos por el tipo de adquisición y la edad con un análisis logístico de regresión no se encontró una asociación significativa con la bacteriemia. En la TABLA 27 se comparan los datos demográficos, el tipo de adquisición y el tipo de infección en relación con los 4 virotipos de las cepas O25b-ST131. El virotipo B se asoció estadísticamente con los pacientes de mayor edad, con una menor proporción de infecciones asintomáticas (especialmente urinarias), pero con una mayor proporción de infecciones respiratorias. En contraste, el virotipo C se asoció significativamente con infecciones sintomáticas, mientras que el virotipo D se asoció con los pacientes más jóvenes y la adquisición comunitaria. Además, los virotipos A y B se asociaron con los pacientes de residencias (17/69, 25%) versus los virotipos C y D (4/61, 7%) (P=0,005). 4.4.12. Desarrollo de una PCR triple para el virotipado de las cepas O25b-ST131 Hemos diseñado una PCR múltiple basada en la detección de los genes sat, iroN e ibeA que puede ser combinada con la PCR múltiple (genes afa FM955459, rfbO25b y blaCTX-M-15) que ya se había desarrollado en el LREC-USC para la detección de las cepas pertenecientes al grupo clonal O25b-ST131 (TABLA 28 y FIGURA 34). Cuando la nueva PCR múltiple se aplicó a las 130 cepas O25b-ST131 españolas del presente estudio se obtuvo una especificidad y sensibilidad del 100%. Resultados 112 TABLA 22. Virotipos de las cepas O25b:H4-B2-ST131 (Estudio GEIH-BLEE-2006). Virotipo afa FM955459 iroN ibeA sat Nº cepas (n= 130) A + - - +/ - 29 (22%) B - + - +/- 40 (31%) C - - - + 41 (32%) D - +/- + +/- 17 (13%) Resultados 113 TABLA 23. Prevalencia del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 entre las cepas de E. coli productoras de BLEE obtenidas en 44 hospitales (Estudio GEIH-BLEE-2006). Código del centro Hospital Ciudad Nº de cepas O25b-ST131/ Total cepas BLEE Nº de cepas O25b-ST131 y virotipos (tipo de BLEE) entre las 130 cepas representativas 2 Marina Baixa Villajoyosa 4/18 (22%) 2 A (CTX-M-15), 2 B (CTX-M-15) 3 Severo Ochoa Cangas de Narcea 0/1 4 Infanta Cristina Badajoz 0/7 5 Bellvitge Barcelona 3/19 (16%) 3 D (SHV-12) 6 Sant Pau Barcelona 3/22 (14%) 1 A (CTX-M-15), 1 B (CTX-M-15), 1 C (CTX-M-3) 7 Vall d´Hebron Barcelona 4/21 (20%) 1 A (CTX-M-15), 3 B (CTX-M-15) 8 Cínico Barcelona 7/24 (29%) 2 B (CTX-M-15), 1 C (CTX-M-15), 3 D (CTX-M-9) 11 General Yagüe Burgos 0/9 12 Puerta del Mar Cádiz 0/27 13 La Mancha Centro Alcázar de San Juan 1/10 (10%) 1 D (CTX-M-14) 14 Reina Sofía Córdoba 1/14 (7%) 1 A (CTX-M-15) 15 Figueras Figueras 0/3 16 Doctor Negrín Gran Canaria 16/31 (52%) 1 A (CTX-M-15), 7 C (CTX-M-15), 2 D (SHV-12) 17 San Cecilio Granada 0/8 19 General Ciudad de Jaén Jaén 0/14 20 Juan Canalejo A Coruña 1/18 (6%) 1 C (CTX-M-14 y CTX-M-15) 21 Arquitecto Marcide Ferrol 1/13 (8%) 1 C (CTX-M-14 y CTX-M-15) 22 Complejo Asistencial de León León 0/3 23 Complejo Hospitalario San Millán y San Pedro Logroño 3/13 (23%) 1 A (CTX-M-15), 1 B (CTX-M-15), 1 D (CTX-M-9) 24 Ramón y Cajal Madrid 15/45 (33%) 4 A (CTX-M-15), 4 B (CTX-M-15), 1 C (CTX-M-14), 1 D (CTX-M-9) 25 Gregorio Marañón Madrid 20/52 (39%) 1 A (CTX-M-15), 5 B (CTX-M-15), 1 C (CTX-M-32) 26 12 de Octubre Madrid 17/35 (49%) 2 A (CTX-M-15), 5 B (CTX-M-15), 1 C (CTX-M-14), 1 NT (CTX-M-15) 27 Clínica San Carlos Madrid 21/70 (30%) 3 A (CTX-M-15), 5 B (CTX-M-15), 1 D (CTX-M-14), 1 NT (CTX-M-14) 28 De Alcorcón Alcorcón 30/60 (50%) 3 A (CTX-M-15), 5 B (CTX-M-15), 1 C (CTX-M-14), 1 D (CTX-M-14) 29 Morales Meseguer Murcia 4/37 (11%) 3 C (CTX-M-15) 30 Santa María Nai Ourense 2/22 (9%) 1 C (CTX-M-15), 1 C (CTX-M-9) 31 Central de Asturias Oviedo 2/26 (8%) 1 C (CTX-M-15), 1 C (CTX-M-14) 32 Son Dureta Palma de Mallorca 2/30 (7%) 1 D (CTX-M-14), 1 D (CTX-M-32) 34 De Navarra Pamplona 0/1 35 Provincial Pontevedra 1/18 (6%) 1 C (CTX-M-32) 36 Clínico Salamanca 0/14 37 Marqués de Valdecilla Santander 0/31 38 Clínico Universitario Santiago de Compostela 0/23 39 Virgen Roció Sevilla 5/70 (7%) 4 A (CTX-M-15), 1 C (CTX-M-15) 40 Virgen Macarena Sevilla 3/34 (9%) 3 B (CTX-M-15) 41 Virgen Candelaria Tenerife 5/15 (33%) 4 C (CTX-M-15), 1 NT (SHV-12) 42 Hospital de Alcañiz Teruel 0/4 43 Parapléjicos Toledo 6/17 (35%) 1 A (CTX-M-15), 4 B (CTX-M-15), 1 C (SHV-12) 44 Clínico Valencia 2/20 (10%) 2 C (CTX-M-32) 45 La Fe Valencia 8/53 (15%) 3 C (CTX-M-15), 1 C (CTX-M-14), 1 C (CTX-M103), 2 C (SHV-12), 1 D (CTX-M-14) 46 Clínico Valladolid 3/10 (30%) 3 A (CTX-M-15) 47 Xeral Cies Vigo 2/13 (15%) 1 C (CTX-M-14 y CTX-M-15), 1 D (CTX-M-14) 48 Txagorritxu Victoria 0/14 49 Lozano Blesa Zaragoza 3/32 (9%) 1 A (CTX-M-15), 2 C CTX-M-15) Las prevalencias más elevadas se indican en negrilla (30% a 52%). Resultados 114 TABLA 24. Comparación de la prevalencia de genes de virulencia entre las 130 cepas O25b:H4-B2ST131 en relación con el virotipo (Estudio GEIH-BLEE-2006). Genes Virotipos Nº Total de Cepas O25b-ST131 n=130 Valor de P A n=29 B n=40 C n=41 D n=17 Adhesinas fimH 29 (100%) 40 (100%) 40 (98%) 17 (100%) 129 (99%) ISL3-como en fimB 29 (100%) 40 (100%) 41 (100%) 0 110 (85%) <0,001 fimAvMT78 0 0 0 1 (6%) 1 (1%) F10papA 27 (93%) 31 (78%) 41 (100%) 0 100 (77%) <0,001 papA 0 0 0 12 (71%) 12 (9%) <0,001 papC 0 0 2 (5%) 9 (53%) 11 (8%) <0,001 papEF 0 0 0 12 (71%) 12 (9%) <0,001 papG I 0 0 0 0 0 papG II 0 0 0 0 0 papG III 0 0 0 12 (71%) 12 (9%) <0,001 sfa/focDE 0 0 0 0 0 sfaS 0 0 0 0 0 focG 0 0 0 0 0 afa/draBC 29 (100%) 0 1 (2%) 0 30 (23%) <0,001 afaFM955459 29 (100%) 0 0 0 29 (22%) <0,001 iha 27 (93%) 29 (73%) 41 (100%) 0 98 (75%) <0,001 bmaE 0 0 0 0 0 gafD 0 0 0 0 0 Toxinas cnf1 0 0 0 10 (59%) 10 (8%) <0,001 cdtB 0 0 0 5 (29%) 5 (4%) <0,001 sat 28 (97%) 30 (75%) 41 (100%) 0 99 (76%) <0,001 hlyA 0 0 0 10 (59%) 10 (8%) <0,001 Sideróforos iucD 27 (93%) 39 (98%) 41 (100%) 13 (76%) 121 (93%) iutA 28 (97%) 40 (100%) 41 (100%) 13 (76%) 122 (94%) iroN 0 40 (100%) 0 13 (76%) 53 (41%) <0,001 fyuA 29 (100%) 40 (100%) 41 (100%) 17 (100%) 130 (100%) chuA 29 (100%) 40 (100%) 41 (100%) 17 (100%) 130 (100%) Cápsula kpsM II 29 (100%) 31 (78%) 28 (68%) 17 (100%) 106 (82%) kpsM II-K2 29 (100%) 0 0 0 29 (22%) <0,001 kpsM II-K5 0 31 (78%) 28 (68%) 15 (88%) 75 (58%) <0,001 neuC-K1 0 0 0 2 (12%) 2 (2%) kpsM III 0 0 0 0 0 Varios cvaC 0 1 (3%) 0 9 (53%) 10 (1%) <0,001 iss 0 39 (98%) 0 16 (94%) 55 (42%) <0,001 traT 21 (72%) 21 (53%) 36 (88%) 16 (94%) 96 (74%) ibeA 0 0 0 17 (100%) 17 (13%) <0,001 malX (PAI) 29 (100%) 40 (100%) 41 (100%) 17 (100%) 130 (100%) usp 29 (100%) 40 (100%) 41 (100%) 17 (100%) 130 (100%) tsh 0 0 0 0 0 ompT 29 (100%) 40 (100%) 41 (100%) 17 (100%) 130 (100%) Estatus ExPEC 29 (100%) 31 (78%) 28 (68%) 17 (100%) 106 (82%) Rango de genes de virulencia 10-15 11-17 12-14 9-20 9-20 No aplicable Media de genes de virulencia 14,4 14,5 13,6 16,8 14,4 No aplicable En negrilla se señalan los resultados estadísticamente significativos (P<0,05). El valor de P fue obtenido mediante la prueba exacta de Fisher. Resultados 115 TABLA 25. Tipos de BLEE, genes asociados con plásmidos CTX-M-15 y resistencia antimicrobiana de las 130 cepas O25b:H4-B2-ST131 en relación a sus virotipos. Características Virotipos Total de cepas O25b-ST131 n=130 A n=29 B n=40 C n=41 D n=17 Enzimas BLEE CTX-M-3 0 0 1 (2%) 0 1 (0.8%) CTX-M-9 0 0 1 (2%) 5 (29%) 6 (5%) CTX-M14 0 0 8 (20%) 6 (35%) 15 (12%) CTX-M-15 29 (100%) 40 (100%) 26 (63%) 0 96 (74%) CTX-M-32 0 0 4 (10%) 1 (6%) 5 (4%) CTX-M-103 0 0 1 (2%) 0 1(0.8%) SHV-12 0 0 3 (7%) 5 (29%) 9 (7%) Genes asociados con CTX-M-15 bla OXA-1 20 (69%) 35 (88%) 21 (51%) 0 85 (65%) aac(6´)-Ib-cr 29 (100%) 35 (88%) 21 (51%) 0 85 (65%) IS26a 29 (100%) 0 0 0 30 (23%) Resistencia Antimicrobiana Ciprofloxacina 29 (100%) 40 (100%) 40 (98%) 5 (29%) 117 (90%) Gentamicina 0 27 (68%) 16 (39%) 1 (6%) 46(35%) Tobramicina 29 (100%) 33 (83%) 28 (68%) 3 (18%) 95 (73%) Trimetoprim/ sulfamethoxazol 29 (100%) 31 (78%) 20 (50%) 10 (59%) 92 (71%) Amoxicilina/ Ácido clavulánico 10 (34%) 6 (15%) 9 (22%) 0 26 (20%) Fosfomicina 5 (17%) 3 (8%) 2 (5%) 0 11 (9%) En negrilla se señalan los resultados estadísticamente significativos (P<0,05). El valor de P fue obtenido mediante la prueba exacta de Fisher. Resultados 116 TABLA 26. Comparación de los datos epidemiológicos y clínicos de pacientes con infección por cepas O25b:H4-B2-ST131 productoras de BLEE y pacientes con infección por cepas no-ST131. Variables Nº de cepas Valor de Pe ST131 vs no-ST131 ST131 (n=190)a no-ST131 (n=818)a Género masculino 70 (37%) 328 (40%) Media y rango de edad en años 75 (68-84) 69 (50-79) 0,01b Pacientes pediátricos (≤14 años) 4 (2%) 53 (6%) 0,01c Tipo de adquisición Nosocomial 66 (35%) 238 (29%) Asociada con cuidados sanitarios 47 (25%) 115 (14%) <0,001 Comunitaria 77 (41%) 465 (57%) <0,001 Residencia de ancianos 37 (19%) 39 (5%) <0,001 Lugar de infección 136 (72%) 651 (80%) 0,02 Tracto urinario d 102 (75%) 485 (75%) Tejidos blandosd 16 (12%) 71 (11%) Tracto digestivod 6 (4%) 37 (6%) Otros tiposd 20 (15%) 116 (18%) Bacteriemia (primaria o secundaria) d 22 (16%) 56 (9%) 0,01 Mortalidad cruda en 30 díasd 5 (4%) 12 (2%) aNo estaban disponibles los datos de 5 pacientes con infección por ST131 y 8 pacientes por No-ST131. El valor de P fue calculado por la prueba de Chi-cuadrado excepto cuando se indica otra prueba. bPrueba Mann-Whitney U. cPrueba exácta de Fisher. dSólamente se consideraron los pacientes con infección. e Los valores de P únicamente se muestran si son estadísticamente significativos (P<0,05). Resultados 117 TABLA 27. Asociación de los virotipos con los datos clínicos y epidemiológicos de las 130 cepas O25b:H4-B2-ST131 productoras de BLEE. Variables Nº de cepas Virotipo A (n=29) Virotipo B (n=40) Virotipo C (n=41) Virotipo D (n=17) Género masculino 10 (35%) 16 (40%) 22 (54%) 7 (41%) Edad ≤14 years 1 (3%) 0 1 (2%) 2 (12%) Media y rango de edad 77 (63-82) 75 (64-83)a 64 (56-79) 60 (34-78)b Nosocomial 9 (31%) 18 (45%) 18 (44%) 4 (24%) Relacionada con cuidados sanitarios 9 (31%) 9 (23%) 7 (17%) 1 (6%) Comunitaria 11 (38%) 13 (32%) 16 (39%) 12 (71%)c Residencia de ancianos 7 (24%) 10 (25%) 3 (7%) 1 (6%) Infección 22 (85%) 21 (57%)d 36 (92%)e 13 (77%) Tracto urinario 20 (69%) 13 (33%)f 25 (61%) 13 (77%) Tracto respiratorio 0 4 (10%)g 1 (2%) 0 Tracto digestivo 0 0 2 (5%) 0 Bacteriemia primaria 0 2 (5%) 3 (7%) 0 Otros tipos 2 (7%) 2 (5%) 5 (12%) 0 Bacteriemia (primaria o secundaria) 5 (17%) 8 (20%) 8 (15%) 0 Mortalidad cruda en 30 días 0 6 (15%) 4 (10%) 1 (6%) Infección relacionada con la mortalidad 0 3 (8%) 1 (2%) 0 aP=0,05 (Prueba de Mann-Whitney U); bP=0,03 (Prueba de Mann-Whitney U); cP=0,03 (Prueba de Fisher); dP=0,009; eP=0,01; fP=0,0001; gP=0,03 (Prueba de Fisher). Resultados 118 TABLA 28. Primers utilizados para la identificación del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 y virotipos. Genes Primers Secuencia de los oligonucleótidos (5´-3´) Tamaño (bp) Tº de hibridación Referencia afa FM955459a AFA-O25F AFA-O25R GAGTCACGGCAGTCGCGGCGG TTCACCGGCGACCAGCCATCTCC 207 55ºC Blanco et al., 2009 rfbO25ba rfb.1bis rfbO25b.r ATACCGACGACGCCGATCTG TGCTATTCATTATGCGCAGC 300 55ºC Clermont et al., 2008 bla CTX-M-15 a CTX-M-F1 CTX-M-F2 ATAAAACCGGCAGCGGTG GAATTTTGACGATCGGGG 483 55ºC Leflon-Guibout et al., 2004 iroNb IRON-F IRON-R AAGTCAAAGCAGGGGTTGCCCG GACGCCGACATTAAGACGCAG 667 60ºC Johnson et al., 2000a satb SAT-F SAT-R ACTGGCGGACTCATGCTGT AACCCTGTAAGAAGACTGAGC 387 60ºC Johnson et al., 2003 ibeAb IBEA 10F IBEA 10R AGGCAGGTGTGCGCCGCGTAC TGGTGCTCCGGCAAACCATGC 170 60ºC Johnson y Stell, 2000 aPCR múltiple para la identificación de cepas O25b-ST131 (Blanco et al., 2009). bPCR múltiple para el virotipado de cepas O25b-ST131 (Desarrollada en este estudio). FIGURA 34. PCRs multiples usadas para la identificación de las cepas del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 y el virotipado. Bandas 1 y 12: marcadores de diferentes pesos moleculares. Bandas 2, 4, 6, 8 y 10: Triple PCR para la identificación de las cepas O25b-ST131. Bandas 3, 5, 7, 9 y 11: Nueva triple PCR para el virotipado desarrollada en este estudio. Banda 2: Cepa control FV9863 (blaCTX-M-15+, rfbO25b+, afaFM955459+). Banda 3: Cepas control FV14025 y H1387: (iroN, sat, ibeA). Bandas 4 y 5: Cepa 24.18 del virotipo A (blaCTX-M-15+, rfbO25b+, afaFM955459+) (sat+). Bandas 6 y 7: Cepa 26.02 del virotipo B (blaCTX-M-15+, rfbO25b+) (iroN+, sat+). Bandas 8 y 9: Cepa 45.09 del virotipo C (blaCTX-M-15+, rfbO25b+) (sat+). Bandas 10 y 11: Cepa 8.23 del virotipo D (rfbO25b+) (iroN+, ibeA+). Resultados 119 FIGURA 35. Distribución de las cepas O25b-ST131 en España. Las cepas O25b-ST131 fueron ampliamente distribuidas en toda España, estas cepas fueron identificadas en 30 de 44 hospitales participantes. Los nombres de los hospitales vienen detallados en la TABLA 23. Resultados 126 4.5.3. Estudios realizados Se establecieron los grupos filogenéticos por PCR y el serogrupo O por serotipado de las 3.260 cepas bacteriémicas de E. coli incluidas en este estudio. Además, todas las cepas se analizaron por PCR para la identificación de los grupos clonales B2-ST131, O15:H1-DST393 y GCA-D-ST69 y para la presencia de los genes blaCTX-M. Con respecto a los 4 anteriores estudios, como novedad se incluye la identificación de todas las cepas del grupo clonal ST131 (O25b, O16, y de otros posibles serogrupos, incluidas las ONT) utilizando una PCR múltiple específica de SNPs de los genes gyrB y mdh desarrollada por Johnson et al. (2009). En los estudios previos las cepas fueron analizadas por una triple PCR desarrollada en el LREC-USC que permitía únicamente la identificación de cepas del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 (Blanco et al., 2009). Además, se secuenció el gen fimH de todas las cepas del grupo clonal ST131, lo que nos permitió identificar las cepas pertenecientes a los subclones H22, H30 y H41. También por primera vez se realiza la identificación de las cepas pertenecientes al subclón H30-Rx de ST131 empleando una PCR de un SNP específico del gen ybbW (Price et al., 2013). Por último, aunque solo en deteminadas cepas, se realizó la identificación de los genes de virulencia, la resistencia antimicrobiana, el tipado molecular por PFGE y las relaciones clonales por MLST siguiendo el esquema de Achtman. 4.5.4. Grupos filogenéticos El grupo filogenético B2 fue el más predominante (40%) entre las 3.260 cepas de E. coli causantes de bacteriemia, seguido por los grupos filogenéticos A (25%), D (23%) y B1 (13%) (TABLA 29). Al comparar la distribución de los 4 grupos filogenéticos entre los 2 períodos (1989-1999 y 2000-2011), observamos que la prevalencia del grupo filogenético A ha descendido en el segundo período, pasando del 28% al 23% (estadísticamente significativo P=0,008). En contraste, la prevalencia del grupo filogenético B1 ha aumentado Resultados 127 significativamente durante el segundo período, del 9% al 14% (P<0,001), mientras que la distribución de los grupos filogenéticos B2 (41% versus 40%) y D (22% versus 23%) se ha mantenido estable en ambos períodos. 4.5.5. Serogrupos O, filoserogrupos y estatus ExPEC Aunque las cepas bacteriémicas presentaron una gran diversidad de serogrupos O, ya que se identificaron un total de 138 serogrupos diferentes, el 66% de las cepas se englobaron en únicamente 18 serogrupos (O1, O2, O4, O6, O7, O8, O9, O11, O15, O17, O18, O22, O25, O75, O77, O83, O101 y O153) (TABLA 30). En la TABLA 30 también podemos observar que entre los 9 serogrupos más frecuentes, el O6 (9%) presentó la mayor prevalencia durante el período de los 23 años de estudio, seguido por el O2 (8%), O8 (7%), O25 (7%), O1 (7%), O15 (4%), O18 (4%), O9 (4%) y el O4 (4%). Durante el segundo período (2000-2011), el serogrupo O25 ha emergido con fuerza pasando de un 3% en el primer período (1989-1999) a un 8% en el segundo, desplazando a los serogrupos O1, O2, O4, O8, O15 y O18 que han descendido en los últimos años (TABLA 31). Destacar que en los últimos 7 años (2005-2011) el serogrupo O25 presentó la mayor prevalencia (9,6%), desplazando incluso al serogrupo O6 (7,9%). En la TABLA 32 se relacionan los 24 filoserogrupos más prevalentes. Observamos que el filoserogrupo O25-B2 pasa de un 2,4% en el primer período (1989-1999) a un 6,7% en el segundo (2000-2011) (P<0,001). También aumenta la prevalencia de las cepas O9-B1 (0% al 0,9%). En contraste, los filogrupos O18-B2 y O83-B2 descienden significativamente. Las diferencias observadas en el resto de los filoserogrupos no fueron estadísticamente significativas. En la TABLA 33 se analiza la distribución de los 24 filoserogrupos más prevalentes en 3 períodos observándose que las cepas O6:B2 fueron las más prevalentes en los 2 primeros períodos (1989-1998 y 1999-2008) mientras que las O25-B2 fueron las más prevalentes en el último período (2009-2011). En el último período también se observa un aumento significativo en la prevalencia de las cepas de los filogrupos O8-A, O9-B1 y O153-D. Resultados 128 Para determinar el estatus ExPEC, se analizaron un total de 1.810 cepas de E. coli bacteriémicas, de las cuales 1.166 cepas (64%) cumplieron el criterio de cepas ExPEC de acuerdo a la definición de Johnson et al. (2003). Entre las cepas de los 18 serogrupos más frecuentes, el 73% cumplieron el criterio de cepas ExPEC, mientras que entre las cepas de los serogrupos menos frecuentes únicamente el 39% fueron ExPEC (P<0,001) (TABLA 34). Como se observa en la TABLA 35, la gran mayoría de las cepas de los filoserogrupos O1-B2 (89%), O1-D (89%), O2-B2 (95%), O2-D (97%), O4-B2 (95%), O6-B2 (97%), O7-A (89%), O11-D (74%), O15-D (86%), O18-B2 (81%), O25-B2 (90%), O75-B2 (100%) y O83-B2 (79%) cumplen el estatus ExPEC. 4.5.6. Comparación entre los períodos extremos, 1989-1993 y 2010-2011 En las TABLAS 36 a 42 se comparan los resultados obtenidos en los 2 períodos extremos del estudio para detectar los cambios que se han producido en lo relativo a la prevalencia de grupos filogenéticos, clones O15-ST393, GCA-ST69 y ST131, filoserogrupos y genes de virulencia. Para ello se completó la caracterización de 213 cepas de E. coli históricas aisladas de hemocultivos que corresponden a los primeros 5 años (1989-1993) y de 614 cepas recientes que corresponden a los 2 últimos años (2010-2011). Al comparar las cepas aisladas en los primeros 5 años con las cepas de los 2 últimos años observamos que no existen diferencias significativas en relación a los grupos filogenéticos, el estatus ExPEC y los grupos clonales O15-ST393 y GCA-ST69. No obstante, sí que existen diferencias significativas en el grupo clonal ST131 que se incrementó del 0,5% al 8% (P< 0,001) (TABLA 36). Únicamente 3 filoserogrupos (O25-B2, O101-A y O153-D) aumentaron y 2 descendieron (O18-B2 y O77-D) significativamente entre los períodos 1989-1993 y 2010-2011 (TABLA 37). Las 827 cepas de E. coli bacteriémicas fueron analizadas por PCR para la presencia de 30 genes que codifican para factores de virulencia típicos de cepas ExPEC (TABLA 38). Los genes de virulencia más frecuentemente detectados en las cepas fueron fimH, papEF, iucD, Resultados 129 iroN, kpsMII, traT, malX y usp. Al comparar las primeras 213 cepas con las últimas 614 cepas aisladas, solo un gen de virulencia (fimAvMT78) fue significativamente asociado con las primeras cepas. Por el contrario, con las cepas aisladas durante los 2 últimos años, 7 fueron los genes (papG NT, afa/draBC, afa FM955459, cnf1, iucD, cvaC y traT) asociados de manera significativa. 4.5.6.1. Genes de virulencia y grupos filogenéticos La TABLA 38 muestra la distribución de los genes de virulencia entre las cepas de los grupos filogenéticos A, B1, B2 y D de los períodos 1989-1993 y 2010-2011. Al analizar las cepas del grupo filogenético A vemos que los genes fimAvMT78 (36% versus 17%) y neuC-K1 (9% versus 1%) se encontraron más frecuentemente entre las cepas del primer período, mientras que los genes papEF (19% versus 35%), papG-NT (9% versus 28%), iroN (28% versus 48%), cvaC (19% versus 41%), y traT (41% versus 60%) se asociaron estadísticamente con las cepas del segundo período. En las cepas del grupo filogenético B1 observamos que los genes iucD (19% versus 49%), iroN (24% versus 50%) y traT (43% versus 68%) se asociaron con significación estadística con las cepas aisladas más recientemente. Entre las cepas del grupo filogenético B2 el gen sfa/focDE (65% versus 53%) se encontró más frecuentemente en las cepas del primer período, mientras que los genes afa/draBC (1% versus 8%), cnf1 (38% versus 50%), sat (31% versus 44%), iucD (51% versus 62%) y traT (33% versus 56%) se observaron más frecuentemente entre las cepas aisladas en los 2 últimos años. Por su parte, al analizar las cepas del grupo filogenético D únicamente el gen iucD (59% versus 76%) se encontró asociado estadísticamente con las cepas aisladas más recientemente. Como era de esperar, entre los grupos filogenéticos se observaron diferencias notorias en relación a la media de los genes de virulencia. Así, las cepas del grupo B2 presentaron las medias más elevadas (9,5 y 10), seguido por el grupo D (medias 6,1 y 6,4), el grupo A Resultados 130 (medias 3,8 y 4,5) y el grupo B1 (medias 2,5 y 4,0). Las mayores medias en los 4 grupos filogenéticos se encontraron entre las cepas aisladas durante los 2 últimos años (2010-2011). No obstante, el nivel de cepas que cumplieron el estatus ExPEC fue similar en ambos períodos (58% versus 63%) y el porcentaje de cepas con 8 o más genes de virulencia fue el mismo en ambos períodos (37%). 4.5.6.2. Genes de virulencia y serogrupos O Las TABLA 39 y 40 muestran la distribución de los genes de virulencia entre las cepas de los 9 serogrupos más prevalentes (O1, O2, O4, O6, O8, O9, O15, O18 y O25) comparando los períodos 1989-1993 y 2010-2011. Entre las cepas del serogrupo O1 los genes de virulencia fimH, fimAvMT78, papEF, papGII, sat, iucD, neuC-K1, traT, malX y usp fueron los más frecuentes, superando en todos los casos su presencia en el 50% de las cepas. Además, más del 90% cumplieron el criterio de cepas ExPEC y más del 50% presentaron 8 o más genes de virulencia. Al comparar las cepas del serogrupo O1 de ambos períodos únicamente se apreciaron diferencias significativas con respecto a los genes papEF (67% versus 94%) y papGII (33% versus 77%) que fueron más frecuentes entre las cepas aisladas más recientemente (TABLA 39). En las cepas del serogrupo O2 fueron 8 los genes de virulencia que se encontraron en al menos el 50% de las cepas de este serogrupo: fimH, papEF, sfa/focDE, iucD, iroN, kpsMII, malX y usp. También más del 90% cumplieron el criterio de cepas ExPEC y más del 50% presentaron 8 o más genes de virulencia. Únicamente los genes cnf1 (19% versus 53%) y hlyA (19% versus 60%) mostraron diferencias estadísticas en los 2 períodos analizados. No obstante el número de cepas con al menos 8 genes de virulencia fue superior (33% versus 72%) entre las aisladas más recientemente (TABLA 39). En el serogrupo O4 al menos el 90% de sus cepas contenían los genes fimH, papEF, sfa/focDE, cnf1, hlyA, iroN, malX y usp. Además, más del 90% de sus cepas cumplieron el criterio de cepas ExPEC y el 100% contenían 8 o más genes de virulencia. Observamos diferencias significativas en los períodos analizados únicamente con los genes cnf1 (70% versus 100%) e iucD (40% versus 5%) (TABLA 39). Resultados 131 Las cepas del serogrupo O6 mostraron el mayor número de genes de virulencia, presentando al menos el 50% de sus cepas los siguientes 12 genes: fimH, papEF, papGII, sfa/focDE, cnf1, sat, hlyA, iucD, iroN, kpsMII-K5, malX y usp. Además, al menos el 90% cumplieron el criterio de cepas ExPEC y presentaron 8 o más genes de virulencia. Los genes papGII (29% versus 64%), cnf1 (65% versus 89%), sat (35% versus 64%), hlyA (70% versus 92%) y traT (18% versus 53%) se detectaron con frecuencias significativamente superiores entre las cepas aisladas en el período 2010-2011. Únicamente el gen papGIII fue más frecuente entre las cepas antiguas (TABLA 39). Las cepas de los serogrupos O8 y O9 fueron las que presentaron menos genes de virulencia, no presentando el estatus ExPEC la mayoría de ellas. No obstante, se ha observado que las aisladas en los 2 últimos años presentaron una media de genes de virulencia más elevada, pasando de 4,4 a 5,3 en las del serogrupo O8 y de 3,0 a 5,4 en las del serogrupo O9. Entre las cepas del serogrupo O9 se observó que los genes papEF (11% versus 51%), papG-NT (11% versus 49%), iroN (22% versus 63%) e iss (22% versus 63%) eran mucho más frecuentes entre las aisladas recientemente. En el caso de las cepas del serogrupo O8 el gen tsh (24% versus 2%) se observó más frecuentemente entre las cepas más antiguas y el gen cvaC (29% versus 63%) entre las más recientes (TABLA 40). Entre las cepas del serogrupo O15 los genes de virulencia fimH, fimAvMT78, papEF, papGII, sat, iucD y kpsM II-K5 fueron los más frecuentes, superando en todos los casos su presencia en el 50% de las cepas. Además, más del 75% cumplieron el criterio de cepas ExPEC, pero únicamente el 11% presentaron 8 o más genes de virulencia. Al comparar las cepas del serogrupo O15 de ambos períodos no se apreciaron diferencias significativas con respecto a ninguno de los genes de virulencia analizados (TABLA 40). Con respecto a las cepas del serogrupo O18, 10 genes de virulencia (fimH, papEF, sfa/focDE, sat, hlyA, iucD, iroN, kpsMII-K5, malX y usp) se encontraron con una prevalencia de al menos el 50%. Además, el 88% de sus cepas cumplieron el criterio de cepas ExPEC y presentaron 8 o más genes de virulencia. Las medias (9,7 y 10,6) de genes de virulencia entre las cepas O18 fueron muy elevadas y únicamente algo inferiores a las encontradas en las cepas del serogrupo O6 (10,0 y 11,0). Únicamente el gen traT (20% versus 62%) se observó más frecuentemente en las cepas O18 aisladas más recientemente (TABLA 40). Resultados 132 4.5.6.3. Genes de virulencia y filoserogrupos Las TABLA 41 y 42 muestran la distribución de los genes de virulencia entre las cepas de los 9 filoserogrupos más prevalentes (O1-D, O2-B2, O4-B2, O6-B2, O8-A, O9-A, O15-D, O18B2 y O25-B2) comparando los períodos 1989-1993 y 2010-2011. Entre las cepas del filoserogrupo O1-D los genes de virulencia fimH, fimAvMT78, papEF, sat, iucD, neuC-K1, traT, malX y usp fueron los más frecuentes, superando en todos los casos su presencia en el 50% de las cepas. Además, el 90% cumplieron el criterio de cepas ExPEC y el 73% presentaron 8 o más genes de virulencia. Al comparar las cepas del filoserogrupo O1-D de ambos períodos se apreciaron diferencias significativas con respecto a los genes papEF (64% versus 95%), papGII (9% versus 68%) y iucD (64% versus 95%), que fueron más frecuentes entre las cepas aisladas más recientemente (TABLA 41). En las cepas del filoserogrupo O2-B2, fueron 10 los genes de virulencia que se encontraron en al menos el 50% de las cepas de este filoserogrupo: fimH, papEF, sfa/focDE, cnf1, hlyA, iucD, iroN, neuC-K1, malX y usp. El 100% cumplieron el criterio de cepas ExPEC y el 75% presentaron 8 o más genes de virulencia. Únicamente los genes cnf1 (29% versus 68%) y hlyA (29% versus 71%) mostraron diferencias estadísticas en los 2 períodos analizados. No obstante el número de cepas con al menos 8 genes de virulencia fue superior (50% versus 85%) entre las aisladas más recientemente (TABLA 41). En el filoserogrupo O4-B2 al menos el 50% de sus cepas presentaban los siguientes 10 genes de virulencia: fimH, papEF, papGIII, sfa/focDE, cnf1, hlyA, iroN, kpsMII-K5, traT, malX y usp. Además, el 97% de sus cepas cumplieron el criterio de cepas ExPEC y el 100% contenían 8 o más genes de virulencia. Observamos diferencias significativas en los períodos analizados únicamente con los genes cnf1 (70% versus 100%) e iucD (40% versus 5%) (TABLA 41). Las cepas del filoserogrupo O6-B2 mostraron el mayor número de genes de virulencia, presentando al menos el 50% de sus cepas los siguientes 13 genes: fimH, papEF, papGII, sfa/focDE, cnf1, sat, hlyA, iucD, iroN, kpsMII-K5, malX y usp. Además, el 99% cumplieron el criterio de cepas ExPEC y el 93% presentaron 8 o más genes de virulencia. Los genes papGII Resultados 133 (31% versus 65%), cnf1 (69% versus 90%), sat (38% versus 65%), hlyA (75% versus 94%) y traT (19% versus 52%) se detectaron con frecuencias significativamente superiores entre las cepas aisladas en el período 2010-2011, mientras que lo contrario pasó con los genes papGIII (50% versus 19%) y sfa/focDE (100% versus 79%) (TABLA 41). Las cepas de los filoserogrupos O8-A y O9-A fueron las que presentaron menos genes de virulencia. No obstante, se ha observado que las cepas O9-A aisladas en los 2 últimos años presentaron una media de genes de virulencia más elevada, pasando de 3,0 a 5,6. Entre las cepas del filoserogrupo O9-A se observó que los genes papEF (11% versus 60%) y papG-NT (11% versus 56%) eran mucho más frecuentes entre las aisladas recientemente. En el caso de las cepas del filoserogrupo O8-A los genes sfa/focDE y tsh (22% versus 0%) se detectaron más frecuentemente entre las cepas más antiguas y el gen cvaC (44% versus 82%) entre las más recientes (TABLA 42). Entre las cepas del filoserogrupo O15-D los genes de virulencia fimH, fimAvMT78, papEF, papGII, sat, iucD y kpsM II-K5 fueron los más frecuentes superando en todos los casos su presencia en el 50% de las cepas. Además, el 83% cumplieron el criterio de cepas ExPEC, pero únicamente el 13% presentaron 8 o más genes de virulencia. Al comparar las cepas del filoserogrupo O15-D de ambos períodos no se apreciaron diferencias significativas con respecto a ninguno de los genes de virulencia analizados (TABLA 42). En las cepas del filoserogrupo O18-B2, 10 genes de virulencia (fimH, papEF, sfa/focDE, sat, hlyA, iucD, iroN, kpsMII-K5, malX y usp) presentaron una prevalencia de al menos el 50%. Además, el 90% de sus cepas cumplieron el criterio de cepas ExPEC y presentaron 8 o más genes de virulencia. Las medias (10,2 y 10,6) de genes de virulencia entre las cepas O18-B2 fueron muy elevadas. Únicamente el gen traT (21% versus 60%) se observó más frecuentemente en las cepas O18-B2 aisladas más recientemente (TABLA 42). 4.5.7. Grupos clonales (O15-ST393, GCA-ST69 y ST131) y genes de virulencia La detección de los grupos clonales O15-D-ST393, CGA-D-ST69 y B2-ST131 se realizó por PCR en las 3.260 cepas bacteriémicas. Un total de 92 (2,8%) fueron del grupo clonal O15ST393, 158 (4,8%) del grupo clonal A, 157 (4,8%) del grupo clonal ST131. De las 157 cepas Resultados 134 ST131, 150 pertenecieron al serotipo O25b:H4 y 7 al O16:H5. Los 3 grupos clonales representaron el 12,5% del total de las cepas bacteriémicas aisladas entre los años 1989 y 2011 (TABLA 43). El grupo clonal O15-ST393 apareció por primera vez en el año 1991 y presentó algunas variaciones en su distribución a lo largo de los años, especialmente en el primer período (1989-1999), en el cual se observaron algunos incrementos esporádicos, como en el año 1993 donde su prevalencia fue de 7%. No se observaron diferencias significativas en la prevalencia de las cepas del primer período (3,4%) con respecto al segundo (2,6%). En este grupo clonal se identificaron únicamente 4 cepas productoras de CTX-M-14, la primera de las cuales fue identificada el año 2003. En la distribución del grupo clonal A también se observaron algunos picos en los años 1999 a 2001 y 2006 a 2008. En el primer período (1989-1999), el grupo clonal A presentó una prevalencia de 2,9%, mientras que en el segundo (2000-2011) su prevalencia fue significativamente mayor (5,5%). Entre las cepas del grupo clonal A encontramos únicamente 2 cepas productoras de CTX-M-14 que se aislaron en los años 2008 y 2010. A partir del año 2005 se observó un incremento muy significativo de cepas O25b:H4-ST131. La prevalencia de estas cepas fue de 1% en el primer período del estudio (1989-1999) pasando al 5,9% en el segundo período (2000-2011). La primera cepa O25b:H4-ST131 se aisló en el año 1993, pero no fue hasta el año 2006 cuando se detectaron las primeras cepas productoras de CTX-M-15. Entre las cepas O25b:H4-ST131, 35 fueron productoras de CTXM-15, 1 de CTX-M-14, 2 de CTX-M-9 y 1 de SHV-12. La primera cepa O16:H5-ST131 se aisló 2005. En el año 2010 se aislaron 4 de las 7 cepas de este subclón coincidiendo con la detección de la primera cepa productora de CTX-M-14 (TABLA 43). Como se observa en la TABLA 43, 55 cepas (1,7%) fueron de la variante O25a. No se observaron diferencias significativas al comparar la prevalencia de los 2 períodos (2,2% versus 1,5%), pero se observa una tendencia a la baja. Las 2 cepas productoras de CTX-M-32 se identificaron en el año 2005. Resultados 135 Al analizar los genes de virulencia de las 92 cepas del grupo clonal O15-ST393, nos encontramos que más del 90% de ellas presentaron los siguientes 7 genes: fimH, fimAvMT78, papEF, papGII, sat, iucD y kpsMII-K5. Además, el 97% de las cepas respondieron al estatus ExPEC, pero únicamente el 3% presentaron 8 o más genes de virulencia (TABLA 44). Los genes de virulencia más comunes entre las cepas del grupo clonal A fueron: fimH, papEF, iucD, kpsMII-K5 y traT. Algo más de la mitad (56%) se clasificaron como ExPEC y únicamente el 2% presentaron 8 o más genes de virulencia (TABLA 44). Entre las 157 cepas del grupo clonal ST131, 7 genes de virulencia (fimH, sat, iucD, kpsMIIK5, traT, malX y usp) presentaron una prevalencia superior al 60%. El 85% presentaron el estatus ExPEC y el 42% presentaron 8 o más genes de virulencia (TABLA 44). Al analizar las diferencias significativas entre los grupos clonales O15-ST393 y ST131, 13 genes de virulencia (papGIII, afa/draBC, afa FM955459, cnf1, cdtB4, hlyA, iroN, kpsMII-K2, iss, traT, ibeA, malX y usp) fueron asociados con el ST131 y 6 genes (fimAvMT78, papEF, papGII, sat, iucD y kpsMII-K5) con el grupo clonal O15-ST393. De la misma manera, al analizar las diferencias significativas entre los grupos clonales A y ST131, 11 genes de virulencia se asociaron con el ST131 (papGIII, afa/draBC, afa FM955459, cnf1, cdtB4, sat, hlyA, iucD, kpsMII-K2, neuC-K1, ibeA, malX y usp) y 6 genes (fimAvMT78, papEF, papGII, papGIV, kpsMIII y traT) con el grupo clonal A. En relación a las diferencias significativas entre los grupos clonales O15 y GCA, 6 genes de virulencia fueron asociados con el O15-ST393 (fimAvMT78, papEF, papGII, sat, iucD y kpsMII-K5) y los genes papGIV, iroN, kpsMIII, iss y traT fueron asociados con el grupo clonal A (TABLA 44). 4.5.8. Virotipos de las cepas O25b:H4-ST131 En este estudio las cepas O25:H4-ST131 se clasificaron en 6 virotipos (arbitrariamente denominados como A, B, C, D, E y F) y en 5 subvirotipos (D1, D2, D3, D4 y D5) en base a la presencia o ausencia de 11 genes de virulencia (TABLA 45). Conclusiones 238 6. CONCLUSIONES 1. Aunque nuestros estudios confirman que las cepas de E. coli productoras de CTX-M-14 pertenecen a una amplia variedad de serotipos, hemos observado en Galicia la emergencia de 5 grupos clonales (O1:HNM-D-ST59, O15:H1-D-ST393, O25b:H4-B2-ST131, O20:H34/HNM-D-ST354 y ONT:H21,42-B1-ST101), que además de ser resistentes a numerosos antimicrobianos muestran un elevado potencial de virulencia. 2. Casi la mitad de las cepas BLEE del estudio realizado en Barcelona (2008) pertenecían a únicamente 6 grupos clonales (ST101, ST162, ST131, ST369, ST393, ST410). En E. coli esta clonalidad es muy notable, considerando la elevada diversidad genética de esta especie y el paradigma establecido para la emergencia de cepas BLEE en base a la transferencia de plásmidos R entre cepas no clonales. En contraste, entre las cepas del grupo clonal ST131 se observó una gran diversidad genética, identificándose por primera vez cepas SHV-12 con numerosos genes de virulencia. Esto era inesperado ya que las cepas fueron aisladas en un solo hospital y en un corto período de tiempo. Por lo tanto la capacidad de diversificación genética, junto con el numeroso arsenal de genes de virulencia y resistencia a antibióticos que presentan las cepas del grupo clonal O25b:H4B2-ST131, explicarían su exitosa diseminación. 3. En el primer estudio realizado en Europa sobre los grupos clonales O25b:H4-B2-ST131, O15:H1-D-ST393 y GCA-D-ST69, observamos que el primero es el más prevalente y que las cepas ST131 poseen un significativo mayor número de genes de virulencia. Además, el grupo clonal ST131 resultó ser también el más prevalente entre las cepas multirresistentes. Es evidente el componente clonal en la emergencia de resistencias entre las cepas ExPEC. No obstante, es necesario realizar futuros estudios ya que los 3 grupos clonales estudiados únicamente representaron la tercera parte de las cepas multirresistentes, por lo que seguramente otros grupos clonales podrían estar desempeñando un papel crítico en el aumento del nivel de resistencia a los antimicrobianos. 4. En los hospitales españoles al igual que pasa a nivel mundial está aumentando de forma significativa la prevalencia de cepas productoras de BLEE y muy especialmente de CTXM-15 debido fundamentalmente a la emergencia del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131. Conclusiones 239 Las cepas de este grupo clonal como en otros países se aíslan más frecuentemente de pacientes mayores e ingresados en residencias con cuidados especiales. Aunque las cepas de este grupo clonal tienen numerosos genes de virulencia no se asocian con un incremento de la mortalidad. 5. Las cepas del grupo clonal O25b:H4-B2-ST131 atendiendo a sus genes de virulencia se pueden clasificar en diversos virotipos que al tener una base clonal pueden representar diferentes subclones. El virotipo B se asocia con los pacientes de mayor edad y con una menor proporción de infecciones asintomáticas. En contraste el virotipo C se asocia significativamente con infecciones sintomáticas, mientras que el virotipo D se asocia con los pacientes más jóvenes y la adquisición comunitaria. Además, los virotipos A y B se asocian con los pacientes de residencias. La elevada cantidad de genes de virulencia de las cepas del virotipo D podría explicar su asociación con infecciones en pacientes más jóvenes y las comunitarias. Cabe destacar que el virotipo C es el más ampliamente distribuido a nivel mundial. 6. Al analizar las cepas ST131 bacteriémicas aisladas en el hospital HULA de Lugo observamos que los 3 subclones mayoritarios (H30-Rx, H30 no-Rx y H22) son los mismos que predominaban en los estudios realizados recientemente en EE.UU. y Canadá. Como novedad concluimos que las cepas de los virotipos A, B, C, E y F pertenecen a los subclones H30-Rx y/ó H30 no-Rx, mientras que las cepas del virotipo D pertenecen al subclón H22. Como en los estudios realizados en EE.UU. y Canadá observamos que durante los primeros años (1993-1999) las cepas H22 eran las más prevalentes, pero desde que emergieron en el 2001 las cepas H30 se fue incrementando continuamente su prevalencia siendo en la actualidad las predominantes. De especial interés clínico es la asociación del subclón H30-Rx con la producción de CTX-M-15. Además, nuestros resultados indican que las cepas del subclón H30-Rx poseen un mayor número de genes de virulencia que las cepas del subclón H30 no-Rx. No obstante, ambos subclones están expandiéndose en la actualidad, predominando el subclón H30-Rx entre las cepas productoras de BLEE y el H30 no-Rx entre las cepas resistentes a las quinolonas fluoradas no productoras de BLEE. Conclusiones 240 7. Aunque nuestros estudios confirman que el grupo filogenético B2 es el predominante entre las cepas bacteriémicas, es importante destacar que casi el 40% de las cepas bacteriémicas pertenecen a los grupos filogenéticos A o B1 y que entre las cepas de estos dos grupos filogenéticos son especialmente predominantes las resistentes a antimicrobianos. Por ello, creemos que los estudios futuros deberían centrar sus esfuerzos también en la caracterización detallada de las cepas de los grupos filogenéticos A y B1. 8. Aunque entre las cepas bacteriémicas identificamos numerosos serogrupos, muchas de las cepas se englobaron en únicamente 18 serogrupos (O1, O2, O4, O6, O7, O8, O9, O11, O15, O17, O18, O22, O25, O75, O77, O83, O101 y O153). Como era de esperar en entre las cepas de los serogrupos más frecuentes encontramos un porcentaje de cepas ExPEC muy superior al observado entre las cepas de los serogrupos menos frecuentes y entre las no tipables, de lo que se puede concluir que estos serogrupos son los más prevalentes porque se asocian con la presencia de genes de virulencia que contribuyen a la patogenicidad de las cepas. Especialmente elevados fueron los porcentajes de cepas ExPEC entre las cepas de los serogrupos O1, O2, O4, O6, O7, O15, O18, O25, O75 y O83. Estos serogrupos son los encontrados también a nivel mundial ampliamente diseminados. 9. Si analizamos los 8 filoserogrupos más prevalentes entre las cepas bacteriémicas representados por al menos un centenar de cepas observamos que la gran mayoría de las cepas de los filoserogrupos O1-D, O2-B2, O4-B2, O6-B2, O15-D, O18-B2 y O25-B2 resultaron ser ExPEC. La excepción fueron las cepas O8-A. Lo mismo sucede con el filoserogrupo O9-A que es el noveno más frecuentemente identificado. Por ello podemos concluir que incluso cepas con pocos genes de virulencia pueden causar sepsis frecuentemente, dándose la circunstancia que entre dichas cepas abundan las resistentes a los antimicrobianos. 10. En nuestro estudio es destacable que las cepas del filoserogrupo O6:B2 fueron las más prevalentes junto con las O25-B2 entre los hemocultivos de pacientes del HULA (Lugo). Destacar que la inmensa mayoría de las cepas del filoserogrupo O6:B2 son susceptibles a los antimicrobianos, por lo que el éxito de las cepas O6:B2 únicamente es atribuible a la combinación de genes de virulencia que presentan. Conclusiones 241 11. En el último período del estudio sobre cepas bacteriémicas es interesante el aumento significativo en la prevalencia de cepas de los filoserogrupos O8-A, O9-B1 y O153-D. Muchas de las cepas O9-B1 y O153-D, al igual que las O8-A, no presentaron los genes de virulencia necesarios para poder ser clasificadas dentro del estatus ExPEC. Es posible que las cepas de estos tres filoserogrupos posean otros genes que jueguen un papel esencial en su virulencia o que sea su elevado nivel de resistencias a los antimicrobianos el que justifique su aumento de prevalencia en los últimos años. Bibliografía 242 7. BIBLIOGRAFIA Abe C.M., Salvador F.A., et al. (2008). "Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strains may carry virulence properties of diarrhoeagenic E. coli." FEMS Immunol Med Microbiol 52: 397-406. Adams-Sapper S., Diep B.A., et al. (2013). "Clonal composition and community clustering of drugsusceptible and resistant Escherichia coli isolates from bloodstream infections." Antimicrob Agents Chemother 57: 490-497. Adrianzén D., Arbizu A., et al. (2013). 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