Interceptación de señales de comunicación bacteriana tipo "N"-Acilhomoserín Lactonas (AHLs) en bacterias aisladas del medio marino

Interceptación de señales de comunicación bacteriana tipo N-acilhomoserín lactonas (AHLs) en bacterias aisladas del medio marino Memoria para optar al Grado de Doctor en Biología que presenta Manuel Romero Bernárdez Santiago de Compostela, Mayo de 2010 Fdo: Manuel Romero Bernárdez Ana María Otero Casal, Profesora Titular del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Biología, de la Universidad de Santiago de Compostela. HACE CONSTAR: Que la memoria titulada “Interceptación de señales de comunicación bacteriana tipo Nacilhomoserín lactonas (AHLs) en bacterias aisladas del medio marino”, que presenta D. Manuel Romero Bernárdez para optar al Grado de Doctor en Biología, fue realizada bajo su dirección en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela, y autoriza su presentación. Y para que así conste, firma la presente en Santiago de Compostela, Mayo 2010 Fdo: Dra. Ana Maria Otero Casal A mis padres y a mi hermana El trabajo contenido en la presente memoria ha sido parcialmente financiado por el proyecto titulado “Interceptación de Quorum: Una nueva aproximación al tratamiento de las infecciones bacterianas en acuicultura”, 2006-2009, de la Dirección Xeral de I+D, Xunta de Galicia. Manuel Romero Bernárdez ha sido becario predoctoral del programa de Formación de Profesorado Universitario (FPU), en el período 2005-2009 y becario de investigación de la Diputación de A Coruña, en el período 2009-2010. Se agradece al Instituto Español de Oceanografía, Centro Oceanográfico de Vigo, el uso de infraestructura necesaria para la recogida de muestras de agua de mar oceánica. ix AGRADECIMIENTOS En estos momentos si echo la vista atrás se me ocurren un montón de personas que me han ayudado en todos estos años tanto a nivel profesional como personal por eso me gustaría dar las gracias: A mi directora Ana María Otero Casal, por haberme dado la oportunidad de iniciar con ella el estudio de la comunicación bacteriana que tanto nos apasiona. Agradecerle por haberme guiado y orientado todo este tiempo de manera tan constructiva poniéndome los pies en la tierra algunas veces y animándome en otras en las que no estaba tan convencido. Su modo de ver la investigación y su rigor científico han sido y serán un ejemplo a seguir para mí. A Jaime Fábregas Casal, por abrirme las puertas de su laboratorio en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia donde inicié mi investigación. Además de darme una visión más amplia de la ciencia y las posibles aplicaciones de los resultados de mi investigación. A Miguel Cámara y Alicia Muro Pastor por acogerme en mis dos estancias en sus laboratorios de Nottingham y Sevilla donde he pasado momentos muy especiales y felices en un ambiente estupendo para trabajar. A Ana Belén por sus aportaciones e importantes consejos como experta en bioinformática, a pesar de la época complicada en la que fueron solicitados por su avanzado embarazo. A mis padres Mª Carmen y Alfredo, a mi hermana Paula y a mi abuela Genoveva, por ser las personas más importantes y cercanas que me han apoyado siempre, sin ellos nada de esto sería posible (aunque yo no contara demasiado…). También gracias a toda mi familia por estar tan unidos y siempre ahí. xvii Abreviaturas AHL N-acilhomoserín lactona AI Autoinductor AIP Péptido autoinductor AM Agar marino CCE Extracto celular crudo CDP Dipéptido cíclico CFB Citofaga-Flavobacterium-Bacteroides CM Caldo marino DSF Factor señal difusible FAS Agua de mar filtrada y autoclavada FAS CAS Medio FAS suplementado con casaminoácidos FAS POL Medio FAS suplementado con polisacáridos FISH Hibridación de fluorescencia in situ FMM Medio Flexibacter maritimum GBL -butirolactona GOS “Global ocean sampling”: colección de metagenomas marinos de océano HSL Homoserín lactona LB Medio Luria-Bertani MRM Monitorización de múltiples reacciones Ntm Hidrolasas N-terminales PAME Metil-éster del ácido 3-hidroxipalmítico PON Paroxonasa PQS Señal quinolona de Pseudomonas PTE Dominio fosfotriesterasa QQ Quorum quenching QS Quorum sensing QSIS Biosensor de QQ “quorum sensing inhibitor selector” SAM S-adenosilmetionina TLC Cromatografía en capa fina TSA-I Agar de triptona y soja con 1% de NaCl UFC Unidades formadoras de colonias INTRODUCCIÓN Introducción 3 1. Comunicación bacteriana dependiente de densidad celular o quorum sensing 1.1 Definición de quorum sensing Las bacterias han sido consideradas durante años, salvo raras excepciones como las Mixobacterias, como organismos no diferenciados y no cooperativos, descartándose cualquier posibilidad de que existiesen mecanismos de comunicación intercelular en organismos unicelulares. Sin embargo, se sabe que las bacterias han desarrollado sofisticados mecanismos que les permiten detectar y responder a las condiciones ambientales, que incluyen estímulos clásicos como los cambios de temperatura, la disponibilidad de nutrientes, presión, oxígeno y pH. Sólo recientemente se ha descubierto que las bacterias también producen y responden a señales extracelulares producidas por otras bacterias. Estos mecanismos de comunicación intercelular permiten a las bacterias desarrollar comportamientos cooperativos. La detección de quorum o “quorum sensing” (QS) (Fuqua et al., 1994) describe la capacidad de un microorganismo para percibir y responder a la densidad poblacional mediante la regulación de la expresión genética, siendo así capaz de desarrollar un comportamiento social coordinado. Este proceso desdibuja la línea entre procariotas y eucariotas, ya que permite a las bacterias comportarse como un organismo multicelular. Las bacterias comunican su presencia a las demás usando pequeñas moléculas de señalización química denominadas autoinductores (AIs) o feromonas. Específicamente, liberan, detectan y responden a la acumulación en el medio de esas moléculas (Figura 1). La detección de AIs permite a la bacteria distinguir entre una alta o baja densidad de población. A medida que crece la población bacteriana se incrementa el nivel extracelular de la molécula señal, hasta que se alcanza una concentración umbral que equivale a un censo mínimo o quórum que desencadena una variación de la expresión génica en respuesta a cambios en el número de células. Este proceso, que permite a la población bacteriana coordinar la expresión génica de toda la comunidad, fue descrito por primera vez en la bacteria marina simbionte bioluminiscente Vibrio fischeri (Nealson, 1977; Nealson y Hastings, 1979). Esta bacteria sólo emite luz en cultivo cuando se alcanza una densidad celular mínima o quórum. Las células de V. fischeri detectan la densidad celular mediante la producción de una pequeña molécula de la familia de las N-acilhomoserín lactonas (AHLs), que Introducción 4 difunde libremente a través de la membrana y se acumula en el medio de cultivo. Una vez alcanzada la concentración umbral de autoinductor comienza la generación de luz. En la naturaleza esta concentración umbral sólo se puede alcanzar en el ambiente cerrado del órgano luminoso del huésped simbionte. De esta forma V. fischeri evita el gasto energético de la emisión de luz a menos que la concentración de bacterias sea la suficiente como para reportar un beneficio al huésped. En su momento este fenómeno se consideró anómalo y, en general, no se creía posible que las bacterias utilizasen sistemas de comunicación intercelular, sólo desarrollados por eucariotas. Casi 10 años más tarde se descubrió que un mecanismo similar, mediado por distintas moléculas señal estaba implicado en la regulación genética de procesos tan diversos como la producción de antibióticos, la liberación de factores de virulencia, la transferencia conjugacional de plásmidos, lo que inició una serie innumerable de descubrimientos que nos han brindado una nueva visión del mundo microbiano. Hoy en día sabemos que los sistemas de QS intervienen además en el control de muchas otras funciones fisiológicas bacterianas, entre las que se encuentra el crecimiento en “enjambre” o “anillos” (“swarming”), formación de endosporas, maduración de biopelículas, etc. (Swift et al., 2001, Williams et al., 2007) (Tabla 1). Se han propuesto explicaciones alternativas que cuestionan que los procesos de QS constituyan un sistema de comunicación bacteriano, como la hipótesis de “difusión sensing/eficiency sensing” (Redfield, 2002; Boyer y Wisniewski-Dyé, 2009). Estas hipótesis explican la producción de moléculas de QS como un medio que las bacterias poseen para percibir el grado de difusión y mezcla de metabolitos en el medio que las rodea, lo que les permitiría determinar los beneficios de secretar moléculas que implican mayor gasto energético. De este modo evitarían un despilfarro de recursos, por ejemplo, produciendo y liberando enzimas extracelulares como proteasas; factores de virulencia o formación de biopelículas, si el medio que las rodea las diluyera inmediatamente. Aunque el término QS fue acuñado en un principio para describir los fenómenos de respuesta a densidad celular mediados por AHLs en bacterias Gram-negativas, este término se ha extendido a sistemas que utilizan moléculas señal distintas a las AHLs. Se han descubierto un gran número de moléculas distintas que se agrupan en varias familias. Introducción 5 Figura 1. Modelo de la detección de quorum (“quorum sensing”, QS). Con bajas densidades celulares (1) la concentración del autoinductor (pentágonos) en el medio es muy baja, no activando los sistemas dependientes de quórum. Cuando se alcanza una elevada densidad celular (2), la concentración de autoinductor alcanza el nivel umbral de detección, iniciándose la expresión de genes cuyos productos (círculos) pueden actuar en el interior o en el exterior de la bacteria (B). En un modelo alternativo, la detección de quórum resulta en la represión de la expresión génica. O SC YSTCDFIM OCH 3 HO HO O B O HO OH O N O H H O A B C Figura 2. Principales tipos de señales de quorum en bacterias. (A) Las bacterias Gram-negativas usan moléculas de la familia de las N-acilhomoserín lactonas (AHLs), que difieren en la cadena lateral. Se muestra la N-oxohexanoil-L-homoserín lactona (OC6-HSL) de Vibrio fischeri. (B) Las bacterias Grampositivas utilizan péptidos cortos, que en algunos casos presentan modificaciones. Se muestra uno de los autoinductores de Staphylococcus aureus, que presenta un puente tiolactona entre el aminoácido terminal y una cisteína interna. (C) El diéster furanosil borato o AI-2 es utilizado tanto por Gram-positivas como por Gram-negativas. 1.2 Señales de quorum sensing Existen tres tipos principales de señales de QS (Figura 2): 1. Las bacterias Gram-negativas producen generalmente AHLs basadas en un anillo lactona (HSL) al que se une, mediante enlace amida, un ácido graso que Introducción 6 constituye la cadena lateral. Poseen una elevada diversidad conformacional, difiriendo en la longitud de cadena lateral, que normalmente contiene entre 4 y 18 carbonos, saturada o insaturada y con o sin sustituciones oxoo hidroxien el tercer carbono (Whitehead et al., 2001). Las AHLs se identificaron por primera vez en bacterias bioluminiscentes marinas, donde tienen un papel fundamental en el control de la emisión de luz en simbiontes, como V. fischeri (Figura 3), que constituye el paradigma de los circuitos de control genético por QS en Gram-negativas. Cada sistema detector puede ser activado solamente por su AI correspondiente, aunque algunos presentan un pequeño grado de inespecificidad. Se ha especulado con que las AHLs fueran producidas exclusivamente por un número relativamente bajo de especies pertenecientes a α-, - y γ-Proteobacterias (Whitehead et al., 2001; Fuqua y Greenberg, 2002; Williams et al., 2007), pero recientemente ha sido descrita la presencia de estas señales en otros phyla como en la cianobacteria colonial Gloeothece (Sharif et al., 2008) y en miembros de Citofaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), también conocidos como Bacteroidetes (Huang et al., 2008; Romero et al., 2010, Anexo 2.2), lo que refuerza la importancia del papel de los sistemas de QS en las poblaciones naturales. 2. En bacterias Gram-positivas la coordinación intercelular se realiza mediante la acción de moléculas señal de naturaleza peptídica. Se trata de péptidos de bajo peso molecular, que sufren modificaciones post-traduccionales y son conocidos como péptidos autoinductores (AIPs). Su tamaño varía entre 5 y 34 residuos aminoacídicos y generalmente poseen una arquitectura compleja no usual (Figura 2). Se conocen tres familias diferentes de AIPs: (i) los oligopéptidos lantibióticos, como la Nisina de lactococos, caracterizados por la presencia de tioéteres macrocíclicos y aminoácidos deshidrogenados (Quadri, 2002); (ii) péptidos de tiolactona, como el AIP-1 de estafilococos (Chan et al., 2004) y (iii) los péptidos de triptófano isoprenilado, en los que ComX y sus variantes de Bacillus subtilis y otros Bacillus son los únicos miembros conocidos (Okada et al., 2005). Estas señales se exportan activamente al medio y la feromona peptídica secretada es reconocida por el dominio sensor de una proteína sensora de membrana, componente de un par típico de transductores de señal de dos componentes. Estos sistemas reguladores de dos componentes, que consisten en una proteína sensora de membrana y una proteína reguladora de respuesta utilizan la fosforilación como medio para transmitir la señal que culmina en la activación de una Introducción 7 proteína que modula la transcripción de los genes diana, controlando procesos como la secreción de factores de virulencia, esporulación y competencia (Kleerebezem et al., 1997; Lazazzera et al., 1997). Figura 3. Bacteria bioluminiscente marina V. fischeri, paradigma de control de expresión genética por quorum mediado por AHL. 3. Un tercer tipo de autoinductor denominado AI-2, cuya estructura es un diéster furanosil borato (Figura 2), combina ambos tipos de comunicación. Este autoinductor se identificó por primera vez en otro vibrio marino bioluminiscente, V. harveyi. Mientras que las AHLs y los autoinductores peptídicos son altamente específicos y se utilizan para la comunicación intercelular dentro de la misma especie, AI-2 se encuentran tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas, lo que indica que podría actuar como lenguaje químico interespecífico más universal, ya que en muchos casos ambos tipos de sistemas de detección conviven (Miller y Bassler, 2001; Federle y Bassler, 2003). En la actualidad se conocen dos tipos de señal AI-2 identificadas en V. harveyi y Salmonella typhimurium. En el primero el AI-2 es un (2S,4S)-2-metil-2,3,3,4tetrahidroxitetrahidrofurano-borato (Chen et al., 2002), mientras que en S. typhimurium se trata de un (2R,4S)-2-metil-2,3,3,4-tetrahidroxitetrahidrofurano (Miller et al., 2004). La proteína sintetizadora del AI-2 es LuxS (Xavier y Bassler, 2003) y la búsqueda en Introducción 14 Debido a la especificidad de estos sistemas es aconsejable la utilización simultánea de varias de estas cepas biosensoras para detectar un amplio rango de tamaños de AHL. También es recomendable el uso de cromatografía en capa fina (TLC) para separar y evitar problemas por interferencia con sustancias inhibidoras que puedan encontrarse en el medio de cultivo y que interfieran con el biosensor. Además, la aplicación de cromatografía-líquida combinada con espectrometría de masas (HPLCMS) permite la confirmación e identificación de las señales. 2.3 Quorum sensing y biopelículas De entre los procesos controlados por QS, uno de los de mayor impacto económico y clínico es la formación de biopelículas. Existen numerosas evidencias epidemiológicas que relacionan las biopelículas con distintos procesos infecciosos en humanos (Wilson, 2001; Costerton et al., 1999). Los mecanismos por los que la biopelícula produce los síntomas de la enfermedad todavía no están completamente establecidos, pero se ha sugerido que las bacterias de la biopelícula pueden producir endotoxinas, se pueden liberar grupos de bacterias al torrente sanguíneo, las células de la biopelícula se vuelven resistentes a la acción fagocitaria de las células del sistema inmune y por otro lado, constituyen un nicho para la aparición de bacterias resistentes a los tratamientos antibióticos (Donlan y Costerton, 2002). Las biopelículas producen una gran cantidad de polisacáridos extracelulares, responsables de su apariencia viscosa, y se caracterizan por una gran resistencia a agentes antibióticos. Esta resistencia puede deberse a que la matriz extracelular en la que se encuentran embebidas las bacterias proporciona una barrera frente a la penetración de biocidas. Otra posibilidad es que la mayoría de las células de la biopelícula crecen muy lentamente, en un estado de privación de nutrientes, por lo que no son susceptibles al efecto de los agentes antimicrobianos. Un tercer aspecto podría estar relacionado con que las células en la biopelícula adoptasen un fenotipo distinto, por ejemplo, mediante la expresión de bombas secretoras de fármacos (Donlan y Costerton, 2002). Además de su importancia clínica, es común la contaminación biológica de superficies por biopelículas, pudiendo desarrollarse sobre superficies hidrófobas, hidrófilas, bióticas o abióticas, lo que conduce a la degradación del material, liberación Introducción 15 de productos de contaminación, bloqueo mecánico e impedancia de la transferencia de calor en procesos acuáticos. Las biopelículas son también la primera causa de la contaminación biológica de sistemas de distribución de agua potable, y otras conducciones, siendo especialmente importante el control de biopelículas en los sistemas antiincendios. El establecimiento de bacterias adheridas a los alimentos o a las superficies en contacto con los alimentos conlleva serios problemas higiénicos e incluso casos de toxiinfecciones alimentarias, así como numerosas pérdidas económicas por los productos que se llegan a desechar (Carpentier y Cerf, 1993). En acuicultura tiene especial relevancia la formación de biopelículas en estructuras sumergidas tales como jaulas, redes y contenedores; o equipamiento tales como cañerías, bombas, filtros y tanques colectores, y para especies de cultivo, como mejillones, vieiras, ostras, etc. Esta colonización que sirve de base para el crecimiento de organismos superiores se conoce como biofouling (Railkin, 2004) y afecta a todos los sectores de la acuicultura europea resultando en sustanciales pérdidas económicas. Figura 6. 1) Diagrama de maduración de una biopelícula de Pseudomonas aeruginosa. Las células bacterianas se fijan a la superficie donde proliferan formando microcolonias. Las microcolonias de alta densidad desarrollan biopelículas maduras mediante un mecanismo dependiente de señal Noxododecanoil-L-homoserín lactona (OC12-HSL). 2) Reducción en el desarrollo de biopelícula por un mutante de P. aeruginosa incapaz de producir AHL (derecha) respecto a cepa salvaje (izquierda). Tomado de Parsek y Greenberg (2000). AHL + AHL - AHL + AHL - 1 2 Introducción 16 Con frecuencia el QS y la formación de biopelículas están estrechamente relacionados (Nadell et al., 2008). Así, muchas especies, incluido el patógeno P. aeruginosa, activan la producción de polisacáridos extracelulares únicamente cuando la población alcanza una alta densidad (Davies et al., 1998; Sakuragi y Kolter, 2007) (Figura 6). Este mecanismo evita el coste de producción de exopolisacárido en fase planctónica (Xavier y Foster, 2007). Se han cuantificado altas concentraciones de AHLs en biopelículas: Charlton et al. (2000) encontraron 4,5 veces más cantidad de señal Noxododecanoil-L-homoserín lactona (OC12-HSL) de P. aeruginosa en biopelículas de la bacteria que en medio líquido. En otro estudio, Huang et al. (2007) describen la presencia de muy altas concentraciones de N-dodecanoil-L-homoserín lactona (C12HSL) (3,36 mM) en una biopelícula, indicando que las AHLs se acumulan dentro de estas estructuras y podrían ser más estables dentro de las biopelículas. Al controlar la formación de biopelículas y otros factores de virulencia, la interceptación de los procesos de QS se ha convertido en una estrategia biotecnológica cuya exploración presenta un elevado interés. 3. Interceptación de quorum sensing: quorum quenching 3.1 Estrategias de quorum quenching Aunque la síntesis de quimioterápicos artificiales y el descubrimiento y mejora de los antibióticos han supuesto en el siglo pasado una auténtica revolución médica en el tratamiento de enfermedades infecciosas, el desarrollo de resistencia a antibióticos por parte de algunas bacterias patógenas es un grave problema mundial, que obliga a la industria farmacéutica a desarrollar nuevas generaciones de antibióticos más potentes, y que puede originar cepas multirresistentes en las que el tratamiento es más largo y con frecuencia ineficaz. Debido a que la comunicación bacteriana juega un papel crítico en la regulación de numerosas funciones fisiológicas microbianas, incluyendo las relacionadas con la patogenicidad en plantas y animales, existe un enorme interés en el diseño e implementación de estrategias de inactivación de los sistemas de QS, también denominadas “quorum quenching” (QQ, Zhang, 2003), que puedan funcionar como Introducción 17 nuevas fórmulas de lucha antimicrobiana (Dong y Zhang 2005; Dong et al., 2007). Mientras que los agentes antimicrobianos tradicionales resultan en la muerte celular del patógeno, la utilización de sistemas que interfieran con la comunicación bacteriana adopta una estrategia menos agresiva y que no estaba disponible hasta el momento: atenuar la virulencia del patógeno de modo que no sea capaz de adaptarse al ambiente del huésped y pueda ser eliminado por las defensas innatas de éste. La identificación de sistemas que inactiven el sistema de QS sería importante en el caso de patógenos oportunistas como P. aeruginosa, cuyo éxito depende de la organización de un “ataque” coordinado que supere las defensas del huésped (Finch et al., 1998; de Kievit e Iglewski, 2000; Zhang, 2003; Hentzer y Givskov, 2003). Aunque la inactivación de otros sistemas de QS es igualmente interesante, hasta el momento los sistemas de QQ mejor conocidos se refieren a la inactivación de las señales tipo AHL en Gram-negativas. Existen varios tipos de estrategias de QQ posibles, que incluyen a) la inhibición de la generación de señal AHL, b) el bloqueo de la diseminación de la señal y c) antagonizar la recepción de la AHL. a) Aunque la inhibición de LuxI y por tanto el bloqueo de la generación del AI, sería el método más eficaz de interceptación de la comunicación bacteriana, existen en la actualidad escasos estudios que hayan explorado esta posibilidad. Así, se han construido mutantes en lasI (homólogo de luxI) en P. aeruginosa que resultaron casi totalmente deficientes en cuanto a producción de factores de virulencia (Shih y Huang, 2002). También se ha observado que varios análogos de SAM como la Sadenosilhomocisteína, S-adenosilcisteína o sinefungin son potentes inhibidores de la síntesis de AHL en P. aeruginosa (Parsek et al., 1999). Aunque el SAM es intermediario en otras muchas rutas metabólicas de procariotas y eucariotas, debido a que la reacción de síntesis de AHL mediada por LuxI parece ser única, existe la esperanza de que estos análogos de SAM podrían ser utilizados de forma específica como inhibidores de QS mediado por AHLs, sin afectar a las enzimas eucariotas que usan SAM como sustrato. También se ha descrito un efecto inhibitorio sobre la síntesis de AHLs por antibióticos del grupo de los macrólidos cuando se suministraron en concentraciones no letales (Tateda et al., 2001; Pechere, 2001). Aunque el efecto de estos antibióticos se ha identificado como inhibidor de la síntesis proteica a nivel del ribosoma, todavía no está claro el mecanismo de inhibición de estos compuestos sobre Introducción 18 la producción de señales AHL (Pechere, 2001). Debido a que en la actualidad están descritas las estructuras cristalográficas de varias proteínas tipo LuxI, éstas podrían ser utilizadas como guía para el diseño de inhibidores sintéticos (Pappas et al., 2004). b) La comunicación bacteriana puede ser bloqueada por una disminución de la concentración de AHL activa en el medio. Así, las AHLs se degradan de modo espontáneo por hidrólisis alcalina a pHs elevados (Yates et al., 2002), aunque esta disminución de la concentración de AHL puede también deberse a mecanismos enzimáticos. Algunas bacterias han sido descritas como capaces de degradar señales AHL (Dong y Zhang 2005), por lo que las bacterias responsables podrían ser utilizadas en el bloqueo de comunicación bacteriana y sus enzimas tienen gran interés para su uso en aplicaciones biotecnológicas. Debido a que el término QQ se utilizó por primera vez para describir este mecanismo, algunos autores restringen su uso a esta aplicación. c) El bloqueo del la transducción de la señal de QS se puede lograr por la presencia de un antagonista de la AHL capaz de competir o interferir con la unión de la señal a su receptor LuxR. Los antagonistas competitivos serían lo suficientemente similares, estructuralmente, a las AHLs para permitir su unión al receptor pero no activarían la transducción de señal posterior, mientras que los antagonistas no competitivos mostrarían baja o ninguna similitud estructural con las AHLs, ya que se unirían a sitios distintos del receptor LuxR. Se ha observado que los antagonistas pueden acelerar la degradación de LuxR por la célula cuando se unen a esta (Manefield y Turner, 2002). En la actualidad existe bastante conocimiento sobre la relación estructura-función de las señales AHL, lo que permitirá realizar una búsqueda efectiva de potentes antagonistas de QS. Así, en el caso de la cadena acil de las AHLs, se ha visto que una reducción o aumento del tamaño de la cadena de la señal de Erwinia carotovora en únicamente una unidad metil reducía la actividad de la señal en un 90% y 50% respectivamente (Chhabra et al., 1993). Una de las primeras estrategias de antagonismo de las señales de QS tipo AHL descritas es la utilización de AHLs homólogas que bloquean el receptor. Debido a la elevada especificidad de muchos generadores de respuesta dependientes de AHL, la presencia de AHLs con cadena larga (más de 10 carbonos) puede resultar en el bloqueo de la respuesta, por lo que han sido propuestas como antagonistas de la señal mediada por AHLs en algunos patógenos. Sin embargo, el potencial de la utilización de Introducción 19 moléculas de AHLs de cadena larga como agentes antimicrobianos, funcionando como antagonistas en procesos de infección, es limitado ya que algunas AHLs poseen potentes efectos moduladores sobre el sistema inmune. Así, se ha descrito que la OC12HSL de P. aeruginosa puede alterar la respuesta inmune del huésped haciéndola menos efectiva (Rice et al., 1999) y además su presencia activa la producción de interleucina-8, através de la transcripción del factor nuclear NF-κB en las células epiteliales del sistema respiratorio (Zimmermann et al., 2006), activando la respuesta inflamatoria y por lo tanto actuando como un factor de virulencia por si mismo (Pesci e Iglewski, 1999; Smith e Iglewski, 2003). También se han descrito efectos apoptóticos sobre líneas celulares de la señal OC12-HSL (Tateda et al., 2003; Horikawa et al., 2006; Shiner et al., 2006). Debido a estas observaciones la utilización de AHLs como agentes antimicrobianos está fuertemente limitada. 3.2 Degradación enzimática de AHLs: Acilasas y lactonasas Tal y como era de esperar, en la naturaleza se han desarrollado por parte de eucariotas sistemas de lucha para impedir la invasión o colonización bacteriana mediante la interceptación de los procesos mediados por QS y también las propias poblaciones bacterianas han desarrollado estrategias de competencia para luchar con otras bacterias mediante la inactivación de sus sistemas de QS (Tabla 2). Una de estas estrategias incluye la degradación enzimática de las señales AHL. La estructura química de las AHLs implica que su degradación enzimática podría ocurrir mediante cuatro reacciones diferentes (Figura 7A). Dos de ellas implicarían la rotura del anillo HSL y estarían mediadas por enzimas tipo lactonasa o descarboxilasa. Las otras dos separarían el ácido graso del anillo HSL mediante la acción de una acilasa (amidasa) o una deaminasa (Dong y Zhang, 2005). Únicamente dos de las cuatro tipos de enzimas mencionadas han sido identificadas hasta la fecha: lactonasas y acilasas. Se ha descrito la inactivación enzimática de las moléculas señal en numerosas bacterias (Dong y Zhang 2005), como las especies del género Bacillus, que son capaces de degradar las AHLs mediante la acción de un gen específico, aiiA (AutoInducer Inactivator), que codifica una enzima lactonasa que inactiva la AHL al hidrolizar el anillo HSL (Figura 7B). De esta forma las lactonasas interceptan las señales Introducción 20 inactivándolas y resultando en una posible ventaja a la hora de colonizar nuevos ambientes (Park et al., 2008). Se ha probado que plantas modificadas genéticamente con el gen de la lactonasa de Bacillus presentan una mayor resistencia al ataque de patógenos cuya virulencia depende de la utilización de AHLs como señal, como E. carotovora (Dong et al., 2001; Zhang, 2003) (Tabla 2). También se ha descrito la presencia de una lactonasa en Arthrobacter sp. codificada por el gen ahlD (Park et al., 2003). Debido a que las AHLs son utilizadas exclusivamente por Gram-negativas, no es extraño que estas bacterias Gram-positivas hayan desarrollado un sistema para inactivar estas señales. Sin embargo, este tipo de enzimas también han sido identificadas en Agrobacterium tumefaciens, que utilizaría las lactonasas BlcC (anteriormente AttM) y AiiB (Zhang et al., 2002; Carlier et al., 2003) para inactivar su propio sistema de QS (Zhang, 2003) aunque BlcC parece estar involucrada en el metabolismo de GBLs (Carlier et al., 2004; Khan y Farrand, 2008), o en Klebsiella pneumoniae que produce la lactonasa AhlK (Park et al., 2003). El segundo tipo de enzimas inactivadoras de QS se encontró en otra bacteria Gram-negativa aislada del suelo, Variovorax paradoxus. Esta bacteria puede utilizar las AHLs como única fuente de energía y nitrógeno (Leadbetter y Greenberg, 2000). En este caso se trata de una acilasa que rompe el enlace amida entre la HSL y el ácido graso (Figura 7B), que es utilizado como fuente de energía, aunque el gen responsable todavía no ha sido clonado. Una enzima similar, denominado AiiD, que libera la cadena lateral del HSL, ha sido clonada de otra Proteobacteria formadora de biopelículas, Ralstonia sp. (Lin et al., 2003; Taga y Bassler, 2003). P. aeruginosa PAOI también produce dos acilasas: PvdQ y QuiP con las que podría regular su sistema de QS (Sio et al., 2006; Huang et al., 2006). Las acilasas AhlM de Streptomyces sp. (Park et al., 2005), AiiC de Anabaena sp. PCC7120 (Romero et al., 2008), AaC de Shewanella sp. (Morohoshi et al., 2008b) y Comamonas sp. (gen no identificado) (Uroz et al., 2003) completan la lista de enzimas de tipo acilasa que se conocen hasta la actualidad (Tabla 2). En Acinetobacter sp., Bosea sp., Ochrobactrum sp., Sphingomonas sp., Delftia acidovorans, Marinobacterium sp. y Glaciecola sp. también ha sido descrita actividad QQ de tipo enzimático pero el tipo de actividad acilasa o lactonasa no ha sido descrito hasta la actualidad (Kang et al., 2004; D’Angelo-Picard et al., 2005; Jafra et al., 2006; Tait et al., 2009) (Tabla 2). Introducción 21 Especie Actividad QQ Gen Autores Grupo Agrobacterium tumefaciens Lactonasa Lactonasa blcC aiiB Zhang et al., 2002 Carlier et al., 2003 Bosea sp. (n.d.) (n.d.) D’Angelo-Picard et al., 2005 Ochrobactrum sp. (n.d.) (n.d.) Jafra et al., 2006 Sphingomonas sp. (n.d.) (n.d.) D’Angelo-Picard et al., 2005 Sphingopyxis sp. (n.d.) (n.d.) D’Angelo-Picard et al., 2005 -Proteobacteria Variovorax paradoxus Acilasa (n.d.) Leadbetter y Greenberg, 2000 Ralstonia sp. Acilasa aiiD Lin et al., 2003 Comamonas sp. Acilasa (n.d.) Uroz et al., 2003 Delftia acidovorans (n.d.) (n.d.) Jafra et al., 2006 -Proteobacteria Pseudomonas aeruginosa Acilasa Acilasa pvdQ quiP Huang et al., 2003; 2006 Klebsiella pneumoniae Lactonasa ahlK Park et al., 2003 Shewanella sp. Acilasa Lactonasa aaC (n.d.) Morohoshi et al., 2008b Tait et al., 2009 Acinetobacter sp. (n.d.) (n.d.) Kang et al., 2004 Marinobacterium sp. (n.d.) (n.d.) Tait et al., 2009 Glaciecola sp. (n.d.) (n.d.) Tait et al., 2009 -Proteobacteria Bacillus sp. Lactonasa aiiA Dong et al., 2000; 2002 Bacillus megaterium Oxidasa P450B M-3 Chowdhary et al., 2007 Halobacillus salinus Antagonistas (fenetilamidas) (n.d.) Teasdale et al., 2009 Firmicutes Rhodococcus erythropolis Lactonasa/Acilasa/Oxid orreductasa qsdA Uroz et al., 2005; 2008; Park et al., 2006 Streptomyces sp. Acilasa ahlM Park et al., 2005 Arthrobacter sp. Lactonasa ahlD Park et al., 2003 Actinobacteria Anabaena PCC7120 Acilasa aiiC Romero et al., 2008 Cianobacteria Riñón Acilasa (n.d.) Xu et al., 2003 Epitelio respiratorio (n.d.) PON2 Stoltz et al., 2007 Mamífero Luffariella variabilis Antagonistas (Manoalidos) (n.d.) Skindersoe et al., 2008 Esponja Flustra foliacea Antagonistas (Alcaloides) (n.d.) Peters et al., 2003 Briozoo Scorzonera sandrasica Antagonistas (n.d.) (n.d.) Bosgelmez-Tinaz et al., 2007 Medicago truncatula Antagonistas (n.d.) (n.d.) Gao et al., 2003 Pisum sativum Antagonistas (n.d.) (n.d.) Teplitski et al., 2000 Lotus corniculatus (n.d.) (n.d.) Delalande et al., 2005 Plantas Laminaria digitata Haloperoxidasa (n.d.) Borchardt et al., 2001 Ahnfeltiopsis flabelliformis Antagonistas (floridósido, betonicina y ácido isetiónico) (n.d.) Kim et al., 2007 Delisea pulchra Antagonistas (furanonas) (n.d.) Givskov et al., 1996 Algas Penicillium spp. Antagonistas (ácido penicílico y patulín) (n.d.) Rasmussen et al., 2005 Hongo Tabla 2. Listado de bacterias y organismos eucariotas en los que se ha descrito actividad QQ sobre señales del tipo AHL tanto enzimática (sombreado en gris) como mediante antagonistas. No determinado (n.d.). Introducción 22 Figura 7. A) Cuatro posibles modos de degradación enzimática de AHLs. Los números en rojo indican la posición de corte de las enzimas: 1) Lactonasa; 2) Descarboxilasa; 3) Deaminasa y 4) Acilasa. B) Modo de acción de los dos tipos principales de enzimas de QQ conocidos. Las lactonasas hidrolizan el anillo HSL de la AHL mientras que las acilasas rompen el enlace amida entre el anillo HSL y el ácido graso. De modo interesante, las especies bacterianas en las que se ha descubierto actividad enzimática degradadora de señales de tipo AHL pertenecen a cuatro phyla diferentes del reino Bacteria (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/): Actinobacteria (Arthrobacter sp.), Firmicutes (Bacillus), Proteobacteria (A. tumefaciens, K. pneumoniae, P. aeruginosa, Ralsonia sp. y V. paradoxus) y Cianobacteria (Anabaena sp.). Esta amplia distribución sugiere que los genes codificadores de enzimas degradadoras podrían estar conservados en muchos organismos procariotas. La diversidad taxonómica de estas especies bacterianas se refleja también en las secuencias de los genes de las enzimas degradadoras que producen. Así las acilasas de Ralstonia sp. y P. aeruginosa presentan baja homología, con aproximadamente un 39% de identidad a nivel peptídico (Huang et al., 2003; Lin et al., 2003). Del mismo modo, en las lactonasas también se observa una importante variación en las secuencias aminoacídicas. Las lactonasas se pueden agrupar en dos grupos, uno representado por la lactonasa AiiA que contiene las secuencias de las especies de Bacillus, que comparten un 90% de identidad en sus secuencias peptídicas (Dong et al., 2002; Lee et al., 2002; Ulrich, 2004). El otro es el grupo de BlcC que incluye las lactonasas de A. tumefaciens, Klebsiella pneumoniae y Arthrobacter sp., y que comparten entre un 30 y un 58% de identidad. Sorprendentemente las lactonasas de ambos clúster comparten menos del A B O N HO O R n OH N HO O R nOH O H 2 N O OR nOH + AcilasasLactonasas O N HO O R n O N HO O R n OH N HO O R nOH OH N HO O R nOH O H 2 N O OR nOH + O H 2 N O O H 2 N O OR nOH O R nOH + AcilasasLactonasas O N HO O R n O N HO O R n 1 2 34 Introducción 23 25% de homología, como en el caso de AiiA y BlcC (Zhang et al., 2002), aunque todas presentan un dominio altamente conservado: HXDH~H~D, se trata del dominio de unión a Zn característico de las metalo--lactamasas, que se ha comprobado esencial para la actividad AHL-lactonasa (Dong et al., 2002; Wang et al., 2004). Recientemente se ha descubierto en Rhodococcus erythropolis la lactonasa QsdA (Uroz et al., 2008), que no presenta homología con la familia de metalo--lactamasas a la que pertenecen las anteriores, sino que presenta el dominio fosfotriesterasa (PTE) de unión a Zn. Además de actividades enzimáticas tipo lactonasa y acilasa se han descrito dos actividades oxidasa-reductasa en bacterias capaces de modificar la cadena acil de las AHLs. Aunque estas actividades no suponen la degradación de la señal, las modificaciones en el ácido graso de la AHL podrían afectar la especificidad y por tanto el reconocimiento de la molécula por el receptor. La primera actividad oxidasareductasa fue descrita en Rhodococcus erythropolis W2. Esta bacteria reduce la AHLs oxo-sustituidas en el tercer carbono a sus formas hidroxi, siendo inactiva frente a las AHLs no sustituidas o con sustituciones hidroxi- (Uroz et al., 2005). La segunda actividad fue descrita en Bacillus megaterium y es la monooxigenasa P450, anteriormente descubierta como oxidadora de ácidos grasos y aminoácidos unidos a ácido graso. Esta enzima oxida AHLs de cadena larga en las posiciones -1, -2 y -3, siendo más activa sobre AHLs oxosustituidas (Chowdhary et al., 2007). Además de bacterias, se ha encontrado que plantas como Lotus corniculatus (Delalande et al., 2005) y las células de mamíferos también pueden interferir con las señales AHL (Chun et al., 2004). Aunque Chun et al. (2004) no identificaron las enzimas responsables de la inactivación de las AHL por células de epitelio respiratorio humano, observaron que aquéllas se encontraban asociadas a las células. En estudios posteriores se identificaron como los candidatos más probables a las proteínas citoplásmicas de la familia de las paraxonasas (PONs): PON1, PON2 y PON3 (Draganov et al., 2005; Khersonsky y Tawfik, 2005). Estas enzimas están involucradas en mecanismos de detoxificación de muchos organofosfatos y actúan como lactonasas. De las tres PONs descritas, la más activa frente a AHL parece ser PON2 debido a que se ha observado que lisados de células de epitelio respiratorio de ratones mutantes en esta enzima no degradaban OC12-HSL, y su sobreexpresión aumentó la actividad Introducción 30 búsqueda de homólogos de luxI y luxR en las secuencias de metagenomas marinos disponibles dio como resultado un número muy bajo de candidatos, estando estos metagenomas principalmente representados por genomas de bacterias planctónicas debido a la desviación generada por el sistema de filtración de agua de mar usado (Case et al., 2008). Por el contrario, se había obtenido un porcentaje alto de cepas productoras de AHLs en muestras procedentes de biopelículas de la zona intermareal (Huang et al., 2008; Tait et al., 2009), esponjas (Mohamed et al., 2008) y, aunque con menor frecuencia, también en nieve marina y aislados microalgales (Gram et al., 2002). Existen otras evidencias que demuestran que el QS mediado por AHL es frecuente en el medio marino, detectándose actividad AHL en cerca de un 60% de las αProteobacteria aisladas de diferentes muestras marinas, incluyendo especies planctónicas y bacterias asociadas a algas (Wagner-Dobler et al., 2005). Las señales AHL parecen también tener un papel importante en las interacciones entre eucariotas y procariotas en el hábitat marino, como demuestra la necesidad de presencia de AHLs para la selección de superficies con biopelículas bacterianas para la fijación permanente de zoosporas del alga verde Ulva (Tait et al., 2005; 2009), para la liberación de esporas del alga roja Acrochaetium sp. (Weinberger et al., 2007) y para el asentamiento inicial de larvas en el poliqueto Hydroides elegans (Huang et al., 2007). Además, la producción de AHLs es habitual en bacterias patógenas de peces incluyendo: Aeromonas salmonicida, A hydrophila, Yersinia ruckeri, Vibrio salmonicida, V. vulnificus, V. harveyi, V. anguillarum o Edwardsiella tarda (Freeman y Bassler, 1999; Swift et al., 1999; Croxatto et al., 2002; Buch et al., 2003; Kim et al., 2003; Bruhn et al., 2005; Morohoshi et al., 2004) (Tabla 3). Debido a que estas señales controlan la expresión de importantes factores de virulencia en estos patógenos, la posibilidad del uso de procesos de interceptación de QS se ha propuesto como alternativa a la utilización de antibióticos para el control de infecciones en acuicultura (Defoirdt et al., 2004) y la viabilidad de esta aproximación ya ha sido demostrada en diferentes trabajos (Rasch et al. 2004; Tinh et al., 2008). La información disponible acerca de la existencia de procesos de QQ en el medio marino es todavía escasa, aunque algunas evidencias indirectas indican que estos fenómenos podrían ser frecuentes. Así, se sabe que las AHLs se degradan más rápidamente en agua de mar natural que en agua de mar artificial y estas observaciones Introducción 31 se han relacionado con la presencia actividad QQ debida a enzimas en el agua (Hmelo y Van Mooy, 2009). Otra evidencia es que cuando se añaden AHLs a los medios de cultivo se incrementa la eficiencia de cultivo de poblaciones bacterianas marinas (Bruns et al., 2002). Tabla 3. Listado de bacterias patógenas marinas en las que se ha descrito la producción de señales de quorum y las funciones controladas por QS. Mientras que existe un número considerable de estudios que describen la presencia de actividad QQ en muestras de suelo, incluyendo búsquedas de genes homólogos a los codificadores de enzimas de QQ en metagenomas de suelo (Williamson et al., 2005; Riaz et al., 2008; Schipper et al., 2009), que han permitido el aislamiento de varias cepas bacterianas capaces de degradar AHLs y el establecimiento de la prevalencia de los procesos de QQ en estas muestras (Leadbetter y Greenberg, 2000; Park et al., 2003; Uroz et al., 2003; Wang y Leadbetter, 2005), no hay estudios sobre actividad QQ de AHLs en bacterias marinas que nos permitan evaluar la importancia ecológica de estos procesos en el medio marino, ni el desarrollo de aplicaciones biotecnológicas específicas basadas en cepas marinas con actividad QQ. Sólo recientemente Tinh et al. (2007) han aplicado con éxito cultivos de enriquecimiento para demostrar la capacidad de consorcios bacterianos procedentes de intestino de camarón de acuicultura para degradar AHLs, aunque la muestra no sea estrictamente de origen marino ni las bacterias identificadas ni el tipo de actividad Especie Señal Genes Factores regulados Autores Vibrio harveyi OHC4-HSL y AI-2 luxLM/luxN Producción de sideróforos, toxinas, sistema de secreción III, luminiscencia Bassler et al., 1993 Vibrio anguillarum OC10-HSL, C6HSL y OC6-HSL vanI/vanR vanM/vanN Metaloproteasa, pigmento, biopelícula Milton et al., 1997; 2001 Vibrio vulnificus C4-HSL y AI-2 ? Proteasa, hemolisina Valiente et al., 2009 Vibrio salmonicida C6-HSL y OC6HSL ? Desconocidos Bruhn et al., 2005 Aeromonas hydrophila C4 y C6-HSL ahyI/ahyR Proteasas y metaloproteasas Swift et al., 1997 Aeromonas salmonicida C4 y C6-HSL asaI/asaR Exoproteasa, biopelícula Swift et al., 1997 Edwardsiella tarda C6 y C7-HSL edwI/edwR Desconocidos Morohoshi et al., 2004 Yersinia ruckeri C8-HSL y OC8HSL ? Desconocidos Bruhn et al., 2005 Introducción 32 enzimática sobre AHLs caracterizada. También recientemente Halobacillus salinus ha sido descrito como productor de metabolitos secundarios antagonistas de AHLs (Teasdale et al., 2009) y una Shewanella sp. aislada de biopelícula marina como degradadora de AHLs (Tait et al., 2009). Es por lo tanto necesario la realización de un estudio que nos permita evaluar el potencial del medio marino como fuente de aislados con actividad QQ. OBJETIVOS/OBJECTIVES Objetivos/Objectives 35 Los principales objetivos de este trabajo fueron: 1) Estudiar la existencia y estimar la frecuencia de bacterias cultivables capaces de interferir con sistemas de quorum sensing mediados por AHLs en diferentes hábitats marinos: a) Comunidades bacterianas densas de origen costero expuestas a una elevada carga orgánica: el sedimento de un tanque de cultivo de peces, una biopelícula de tanque reservorio de agua de mar filtrada y el alga Fucus vesiculosus. b) Muestras agua de mar de estuario y de alta mar a 0 y 10 metros de profundidad. 2) Caracterización de los aislados obtenidos con alta actividad QQ contra AHLs para evaluar su potencial uso biotecnológico. The main objectives of this work were: 1) The study of the presence and estimation of the frequency of cultivable bacteria capable of interfering with AHL quorum sensing systems in different marine environments: a) Bacterial communities obtained from sites with high organic load: the sediment from a fish culture tank, a biofilm from a filtered seawater reservoir tank and the marine algae Fucus vesiculosus. b) Marine water samples from estuary and ocean at 0 and 10 meter depth. 2) Characterization of the obtained isolates with high QQ activity against AHLs in order to evaluate its biotechnological potential. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y Métodos 39 1. Quorum quenching en el medio marino 1.1 Metodología de cuantificación de bacterias cultivables y aislamiento Para la detección de bacterias marinas con actividad QQ sobre AHLs se procedió al aislamiento, con material esterilizado, de cepas procedentes de muestras de diferentes medios marinos. Las muestras fueron seleccionadas en función de su carga orgánica y bacteriana: - Una muestra de sedimento de tanque de cultivo de peces con circuito cerrado de agua de mar en la Universidad de Santiago (Junio 2007). - En Illa de Arousa (N 42º.33’.45” W 8º.53’.08”) se obtuvo una muestra procedente de biopelícula sumergida de pared de un tanque exterior de cemento (25.000 L), que sirve como reservorio de agua de mar filtrada para una estación de acuicultura y en el que el agua era renovada de forma constante (Junio 2007). - En el mismo lugar se tomo una muestra de alga Fucus vesiculosus de rocas de la zona intermareal. Un gramo del alga escurrida se troceó y resuspendió en 10 mL de agua de mar esterilizada (Junio 2007). - También en Illa de Arousa se tomó una muestra de agua de mar de estuario (Enero 2010). - En alta mar, entre las rías de Vigo y Pontevedra (N 42º.17’.07” W 8º.53’.27”) se tomaron muestras de agua a 0 y 10 metros de profundidad (Enero 2010). Los medios sólidos empleados para el aislamiento incluyeron medios con alta concentración de nutrientes como: agar de triptona y soja con 1% NaCl (TSA-I) y agar marino (AM, Difco), adecuados para bacterias eutróficas, y también medios con baja concentración de nutrientes como: agar marino en dilución 1/100 (AM 1/100), agua de mar filtrada y autoclavada (FAS, Schut et al., 1993) suplementada con 1 g/L de casaminoácidos (FAS CAS) y medio FAS suplementado con 0,5 g/L de los polímeros agarosa, quitina y almidón (FAS POL) (Bruns et al., 2002). Se prepararon 3 diluciones en órdenes de 10 (1/10, 1/100 y 1/1000) en agua de mar esterilizada para cada una de las muestras y se sembraron en placas con los medios de cultivo citados. Las placas fueron incubadas a 15 y 22ºC durante 15 días. Para la estima de la densidad bacteriana se seleccionaron las placas que contenían entre 30-300 colonias. Se aislaron un total de Materiales y Métodos 46 evaporaron bajo flujo de nitrógeno. El extracto seco obtenido se resuspendió en 200 μL de acetonitrilo y se procedió a la cuantificación de las AHLs por HPLC-MS. De la misma forma se extrajeron muestras control con 500 μL de CM y CM + AHL 50 μM. Para detectar actividad enzimática degradadora de AHLs tipo lactonasa en T. discolor 20J se llevaron a cabo dos tipos de ensayos. Duplicados de los sobrenadantes anteriormente descritos de C4 y C12-HSL se acidificaron hasta pH 2 con HCl 1M y se incubaron 24 horas más en las mismas condiciones para la posterior extracción de AHLs y cuantificación por HPLC-MS. También se realizó un bioensayo en medio sólido con C. violaceum CV026 para la señal C6-HSL 20 M y con C. violaceum VIR07 para C10 y C12-HSL 20 M, con y sin acidificación hasta pH 2. En este caso tras la degradación de las señales por cultivos de T. discolor 20J se realizaron extracciones orgánicas de los sobrenadantes y sobrenadantes acidificados de los cultivos y los extractos secos se resuspendieron en agua para posterior ensayo en pocillo con los biosensores de C. violaceum correspondientes 4.2 Cinética de degradación de AHLs Se incubaron a 22ºC y 200 rpm 60 mL de CM inoculados con T. discolor 20J. Tras 24 horas, el cultivo fue dividido y centrifugado (10.000 rpm, 5 min), y el pellet se lavó dos veces con 10 mL de PBS pH 6,5. En las dos suspensiones celulares así obtenidas se añadió C4 ó C12-HSL a una concentración final de 30 μM. Las mezclas de reacción se incubaron a 22ºC y 200 rpm durante 24 horas, tomándose muestras de 500 μL a diferentes tiempos desde el tiempo 0 h. Estas muestras se extrajeron, y las concentraciones de C4 ó C12-HSL restantes en cada muestra se determinaron por HPLC-MS con la metodología descrita. 4.3 Localización de la actividad degradadora de AHLs Para determinar la localización de la actividad degradadora de AHLs, se obtuvieron el sobrenadante y extracto celular crudo (CCE) de cultivos de 24 horas de Tenacibaculum discolor 20J en 15 mL de CM. Los cultivos se centrifugaron durante 5 minutos a 10.000 rpm para separar la biomasa del medio de cultivo. El sobrenadante se Materiales y Métodos 47 filtró a través de un filtro de 0,22 μm y se almacenó a 4ºC, previo uso. El pellet se lavó con 15 mL de PBS pH 6,5, se resuspendió en otros 5 mL del mismo tampón, se sonicó mediante pulsos de 30 seg, durante 5 minutos en hielo y se centrifugó a 12.000 rpm durante 30 min a 4ºC. El CCE así obtenido se filtró a través de un filtro de 0,22 μm y se almacenó a 4ºC (Uroz et al., 2005). Con el sobrenadante y el CCE de T. discolor 20J se realizaron dos ensayos: - Un ensayo en medio sólido con C. violaceum CV026 y VIR07 como se describió anteriormente. Se incubaron 500 μL de sobrenadante y de CCE durante 24 horas con C6 ó C10-HSL 20 μM a 22ºC y 200 rpm. Los controles se incubaron de la misma forma, con 500 μL de CM o PBS + AHL 20 μM. - Cuantificación por HPLC-MS de extractos obtenidos de 500 μL de sobrenadante y de CCE incubados 24 horas con C4 ó C12-HSL 50 μM a 22ºC y 200 rpm con o sin acidificación hasta pH 2 con HCl 1M (24 horas más a 22ºC y 200 rpm). Las concentraciones de las AHLs tras este ensayo fueron cuantificadas por HPLC-MS como se describió anteriormente. Los resultados se compararon con la degradación del cultivo completo (bacteria viva) incubado en las mismas condiciones y con controles de CM fresco con C4 ó C12-HSL 50 μM. 4.4 PCR para lactonasas y acilasas Para determinar si los genes responsables de actividad QQ sobre AHLs en T. discolor 20J codificaban lactonasas o acilasas se realizaron PCRs con cebadores degenerados diseñados para las secuencias más conservadas de estas enzimas. Las secuencias de cebadores para lactonasas fueron: 5’-GAGGATCCCA YCTICAYKYNGAYCA y 5’-ATGAATTCGGIGTRTGNCCNGGNGT (Park et al., 2003). Para acilasas: 5’- GSIAAYCCNCAYTTYCCNTGG y 5’- TCIGCNGCDATIGTRTTNACCCANGG (Park et al., 2005). Las reacciones de PCR se realizaron en las condiciones: 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 45 seg, hibridación a 50 ó 55ºC durante 45 seg, extensión a 72ºC durante 45 seg. Precedidos de 5 minutos de desnaturalización a 95ºC y seguidos de 10 min de extensión a 72ºC. Materiales y Métodos 48 4.5 Clonación de genes de quorum quenching de Tenacibaculum discolor 20J Se llevó a cabo un intento de clonación de los genes de QQ responsables de las actividades degradadoras de AHLs presentes en T. discolor 20J. Mediante la construcción de una librería genética en plásmido y su expresión en una cepa de Pseudomonas aeruginosa PAOI en la que sólo los clones capaces de eliminar la actividad AHL pueden sobrevivir. Para ello se realizó una extracción de ADN de T. discolor 20J con Genomic DNA purification kit (Promega). El ADN genómico (20 g) se incubó a 37ºC durante 10 min en diluciones seriadas con la enzima de restricción Sau3A1 (Promega), obteniéndose una digestión parcial de ADN. El resultado de la digestión de ADN se cromatografió en gel de agarosa (1%), de donde se extrajeron bandas correspondientes a fragmentos de ADN de tamaño entre 2 y 4 kb con Geneclean III kit (Qbiogene). Los fragmentos de ADN se ligaron luego en el plásmido pME6000 (portador de un gen de resistencia a tetraciclina) (Maurhofer et al., 1998), digerido con BamHI y defosforilado con fosfatasa alcalina (Promega) para evitar su recircularización. Se transformó P. aeruginosa PAOI portadora del plásmido pMH655 (con gen de resistencia a gentamicina) (Rasmussen et al., 2005) con la librería genética así obtenida. La transformación se realizó de la siguiente forma: 1,5 mL de un cultivo de 12 h de P. aeruginosa PAOI pMH655 a 42ºC en 5 mL de LB + gentamicina 20 μg/mL, se centrifugó 5 min a 10.000 rpm. El pellet obtenido se lavó dos veces con un 1 mL de MOPS 1 mM / Glicerol 10% a pH 7,2 (4ºC) y se resuspendió con el volumen de enrase del pellet. La suspensión celular así obtenida se electroporó con 2 μL de librería. El plásmido pMH655 presenta una fusión del promotor de lasB y el gen sacB codificador de la levanosacarasa de Bacillus subtilis (Steinmetz et al., 1983). Se trata de un biosensor de QQ denominado “quorum sensing inhibitor selector” (QSIS) (Rasmussen et al., 2005), el gen lasB codifica la elastasa B de P. aeruginosa, gen involucrado en su patogenicidad cuya expresión esta controlada por QS basado en AHL de esta bacteria. La levanosacarasa SacB secretada por Bacillus subtilis cataliza una hidroxilación de la sacarosa propiciando la formación del polímero bactericida levano (Gay et al., 1983). Como resultado, en presencia de AHLs y sacarosa se producirá la expresión de sacB y la producción de levano, provocando la muerte de la bacteria. Sólo aquellos clones portadores de un gen de QQ prodrán sobrevivir. Materiales y Métodos 49 El medio utilizado para la detección de clones con actividad QQ se preparó de la siguiente forma: LB sólido (15% de agar), sacarosa 60 mg/mL, citrato sódico 40 mM, OC12-HSL 200 nM, C4-HSL 200 nM, Gentamicina 80 g/mL y Tetraciclina 125 g/mL. Las placas selectivas se inocularon con 100 L de suspensión bacteriana transformada y se incubaron a 37ºC. Tras 24 horas se observó crecimiento. El número de clones analizados por cada transformación se determinó mediante placas control sin sacarosa donde se contaron el número de colonias obtenidas. Para conocer el número mínimo de clones que se debían analizar para asegurar, con un 99% de probabilidad, que se ha analizado el gen o genes responsables de la actividad QQ en T. discolor 20J se utilizó la fórmula: N = ln(1 - P)/ln(1 - f). Donde P es la probabilidad asignada (0,99), f es la proporción del genoma representada en un único clon y N es el número de recombinantes a analizar para obtener P. Se consideró que la bacteria analizada tendría aproximadamente 7000 genes, con lo que el valor de f = 1/7000 y para P = 0,99 implicó el análisis de 32000 recombinantes. Para comprobar la validez de la metodología utilizada se realizó una transformación del mismo biosensor QSIS P. aeruginosa PAOI pMH655 con el plásmido pME6000 portador del gen aiiA codificador de lactonasa de Bacillus sp. El biosensor de QQ P. aeruginosa PAOI pMH655 fue proporcionado por el Prof. Michael Givskov del Department of International Health, Immunology and Microbiology de la Universidad de Copenhague (Dinamarca). 4.6 Análisis de patogenicidad de Tenacibaculum discolor 20J Con el objetivo de determinar si la cepa 20J de T. discolor aislada en este trabajo podría tener aplicaciones biotecnológicas para acuicultura se comprobó si ésta era patógena de peces. Para ello se realizó una infección experimental de juveniles de rodaballo (25 gramos de peso medio) mantenidos en un flujo constante de agua de mar a 15ºC con niveles de oxígeno superiores a 8 mg/L y 32 ‰ de salinidad. Para los ensayos de patogenicidad los peces fueron aclimatados a las condiciones anteriores durante 5 días y luego fueron infectados mediante inoculación intraperitoneal de 100 L de una suspensión bacteriana de T. discolor 20J en solución salina (109 células por mililitro). Materiales y Métodos 50 Se estableció un grupo control inoculado con 100 L de solución salina. Se examinó la mortalidad durante 21 días. 4.7 Degradación de AHLs en el género Tenacibaculum Para comprobar si la actividad degradadora de AHLs detectada en T. discolor 20J era común en el género Tenacibaculum, se realizaron también ensayos con los biosensores C. violaceum CV026 (McClean et al., 1997) y VIR07 (Morohoshi et al., 2008a) para diferentes especies (Tabla 4). Veinte microlitros de soluciones stock de C6 ó C10-HSL se añadieron a cultivos de 24 horas de las diferentes especies del género Tenacibaculum en CM, con una concentración final de 10 M, e incubadas 24 horas a 22ºC. Además, en la cepa tipo T. maritimum NCIMB 2154T se añadió la misma cantidad de AHLs al sobrenadante filtrado (0,22 μm) de un cultivo de 24 horas en CM. La degradación de AHL se determinó por la producción de violaceína en ensayo en placas de LB con pocillos, como ha sido descrito anteriormente. Tabla 4. Cepas de distintas especies del género Tenacibaculum ensayadas para degradación de AHLs. Para evaluar el tipo de actividad degradadora de AHLs presente en T. maritimum NCIMB 2154T se establecieron dos matraces con 15 mL de CM suplementado con C10Cepas Aislamiento Origen T. discolor 20J Sedimento de tanque de cultivo Este trabajo T. discolor DSM 18842 Solea senegalensis , España Dra. Ysabel Santos T. discolor LC073.2.2 Solea senegalensis , España Dra. Ysabel Santos T. discolor R016.8.1 Psetta maxima, España Dra. Ysabel Santos T. gallaicum R006.0.1 Psetta maxima, España Dra. Ysabel Santos T. gallaicum A37.1 Agua de tanque de cultivo, España Dra. Ysabel Santos T. litoreum JCM13039 Sedimento de zona intermareal, Corea Japanese Collection Riken BCR (Hirosawa, Japón) T. maritimum NCBI 2154T Pargus major, Japón The National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria Ltd. (Aberdeen, UK) T. soleae LL0412.1.7 Solea senegalensis , España Dra. Ysabel Santos T. soleae 567/06.1 Dicentrarchus labrax, España Dra. Ysabel Santos Materiales y Métodos 51 HSL en concentración 10 M. Uno de los matraces fue inoculado con 1 mL de un cultivo de 48 horas de T. maritimum NCIMB 2154T e incubado a 22ºC en agitación suave (110 rpm), mientras que el otro se mantuvo en las mismas condiciones como control. Tras 24 horas, 500 μL de sobrenadante normal y acidificado (pH 2) se extrageron tres veces con el mismo volumen de acetato de etilo, se evaporaron y resuspendieron en 200 μL de acetonitrilo para análisis por HPLC-MS. Se extrajeron también 500 μL de CM + C10-HSL y la concentración de C10-HSL obtenida se utilizó para calcular el porcentaje de degradación. 5. Señales de quorum sensing en Tenacibaculum 5.1 Cepas utilizadas y condiciones de cultivo Además de las bacterias del género Tenacibaculum de las que ya se disponía en el laboratorio y que habían sido utilizadas para comprobar la actividad QQ en el género (Tabla 4), para la detección de AHLs se analizaron también 8 nuevas cepas patógenas de Tenacibaculum maritimum: NCIMB 2153 y 2158, obtenidas de The National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria Ltd. (Aberdeen, UK) y 6 cepas aisladas en el departamento de Microbiología de la Universidad de Santiago procedentes de peces enfermos de estaciones de acuicultura de España y Portugal. Estas cepas pertenecen al los principales serotipos y líneas clonales de esta bacteria (Avendaño-Herrera et al., 2004; 2006) y fueron confirmadas como T. maritimum por análisis PCR (Toyama et al., 1996) (Tabla 5). Para el análisis de producción de AHLs las cepas se cultivaron rutinariamente a 22ºC en medio Flexibacter maritimum (FMM) sólido y caldo (Pazos et al., 1996) o en AM/CM, con agitación suave a 110 rpm en caso de medio líquido. También se analizó la producción de AHLs en Flavobacterium psychrophilum PT4.1, que se creció rutinariamente en agar “Anacker and Ordal” en las mismas condiciones (Toranzo y Barja, 1993). Se utilizaron tres biosensores basados en lux de E. coli JM109 (Swift et al., 1997; Winson et al., 1998) para la detección de AHLs en sobrenadantes y extractos de las diferentes especies del género Tenacibaculum. Las tres cepas biosensoras permiten la detección de todo el rango de tamaños de AHL debido a que presentan receptores con Materiales y Métodos 52 distinta especificidad para las señales AHL. E. coli JM109 pSB401, con el gen codificador del receptor de AHL luxR (V. fischeri), se utilizó para detección de AHLs de tamaño intermedio; E. coli JM109 pSB536, con ahyR de Aeromonas hydrophila, para AHLs cortas y E. coli JM109 pSB1075, con lasR de Pseudomonas aeruginosa, para AHLs de cadena larga. Los tres biosensores se cultivaron a 37ºC en LB suplementado con el antibiótico adecuado (Swift et al., 1997; Winson et al., 1998). Cepas Aislamiento Serotipo(*) NCIMB 2154T Pargus major, Japón O1/O2 (O2) NCIMB 2158 Solea solea, UK O2 NCIMB 2153 Acanthopagrus schlegeli, Japón O1/O2 (O1) ACR104.1 Scophthalmus maximus, España O2 PC424.1 Scophthalmus maximus, España O2 PC503.1 Solea senegalensis, España O1 PC538.1 Sparus aurata, España O1 LgH35-O3 Solea senegalensis, España O3 ACC6.1 Scophthalmus maximus, Portugal O3 Tabla 5. Cepas de Tenacibaculum maritimum utilizadas para la detección de señales AHL. (*) Serotipos según el esquema de tipado de Avendaño-Herrera et al. 2006. 5.2 Toma de muestras y extracción de AHLs Se tomaron muestras de 40 mL de sobrenadantes de cultivos de las diferentes cepas de Tenacibaculum en FMM a 24 y 48 horas después de su inoculación. Se filtraron (0,22 m) y reservaron 10 mL a -20ºC y el resto se acidificaron a pH 2 con HCl 1M y se incubaron 24 horas a 25ºC a 200 rpm. Posteriormente se realizó una doble extracción orgánica de AHLs con el mismo volumen de diclorometano y se evaporó en rotavapor a 40ºC hasta obtener el extracto seco que se resuspendió en 1 mL de acetonitrilo. Los extractos así obtenidos se mantuvieron a -20ºC para posteriores análisis. Para estudiar el efecto del medio de cultivo en la producción de AHL, se seleccionó la cepa tipo de T. maritimum (NCIMB 2154T). Se cultivó la bacteria en Materiales y Métodos 53 FMM o CM y se tomaron muestras de 40 mL a diferentes tiempos tras inoculación: 12, 24, 48 y 75 horas. Las AHLs se extrajeron como se explicó anteriormente para posterior análisis con biosensores en luminómetro y HPLC-MS. Con el objetivo de reproducir la metodología utilizada por otros autores que no pudieron detectar la presencia de AHLs en el patógeno perteneciente al grupo de los Bacteroidetes Flavobacterium psychrophilum, también se realizaron extracciones de AHLs de medio sólido FMM y AM de T. maritimum NCIMB 2154T y Flavobacterium psychrophilum PT4.1 cultivado en Anacker y Ordal agar. Para ello se transfirieron cortes de agar con colonias a tubos de cristal donde se homogeneizaron con disruptor con 3 mL de acetato de etilo (tres veces). Se separó el solvente por centrifugación a 3.000 rpm y se evaporó bajo flujo de nitrógeno. Se reconstituyó el extracto seco obtenido con 1 mL de acetonitrilo para su posterior análisis (Bruhn et al., 2005). Para determinar si se producían cambios en el modo de crecimiento en biopelícula de T. maritimum NCIMB 2154T se añadió la señal C4-HSL en concentraciones: 1; 2,5; 5 y 10 g/mL a cultivos de la bacteria en 15 mL de FMM o CM. La tinción de biopelícula se realizó con 500 L de solución cristal violeta-oxalato (Panreac). 5.3 Detección e identificación de AHLs 5.3.1 Cromatografía en capa fina (TLC) Dos microlitros de cada extracto orgánico de sobrenadantes de cultivo se cargaron sobre placas de TLC de gel de sílica C18 de fase reversa. Las muestras se cromatografiaron con metanol/agua (60/40% v/v) como fase móvil (Shaw et al., 1997). También se cargaron 2 L de AHL sintética procedentes de stock con 10 g/mL (50 μM) de concentración como controles. Las AHLs utilizadas fueron C4-HSL para E. coli JM109 pSB536, C8-HSL para E. coli JM109 pSB401 y C12-HSL para E. coli JM109 pSB1075. Las placas de TLC se secaron a temperatura ambiente y cubrieron con 3 mL de LB blando (8% de agar) inoculado con 30 L de un cultivo de 12 horas de cada biosensor. Tras la solidificación del LB blando, las placas se incubaron a 37ºC y cada Materiales y Métodos 54 hora se colocaron placas de radiografía sobre las TLCs para la detección de emisión de luz por los biosensores. 5.3.2 Luminómetro Los tres biosensores de E. coli JM109 también se utilizaron para la detección de AHLs en sobrenadantes “crudos” (no sometidos a extracción) y en extractos orgánicos en acetonitrilo. Los ensayos se llevaron a cabo en líquido en placas microtiter negras Fluoro Nunc F96 MicroWellTM. Para sobrenadantes crudos, se mezclaron 100 μL con 150 μL de una dilución 1/100 en LB de un cultivo de 12 horas de los biosensores. Se establecieron tres pocillos por muestra y como controles positivos se añadieron AHLs sintéticas en concentración final 1 μg/mL (5 μM) ajustando el volumen a 100 μL con LB. Como controles negativos se establecieron pocillos con 100 μL de medio de cultivo fresco (FMM o CM). En el caso de extractos de sobrenadantes, se evaporaron 100 μL de cada extracto directamente en las placas microtiter. Los extractos secos se resuspendieron luego en 150 μL de una dilución 1/100 en LB de un cultivo de 12 horas de biosensor. Del mismo modo se establecieron controles positivos y negativos evaporando 100 μL de AHLs sintéticas o acetonitrilo. Las placas microtiter se incubaron a 37ºC durante 4 horas y se midió la producción de luz en luminómetro Ultra Evolution Xfluor4beta E 4.51e (Tecan Trading AG, Suiza). Los valores de bioluminiscencia se normalizaron con los valores obtenidos para los controles negativos. 5.3.3 HPLC-MS Los extractos de sobrenadantes que activaron los biosensores de AHL fueron analizados posteriormente por HPLC-MS para identificación de sus AHLs. Los análisis por HPLC-MS se llevaron a cabo en dos laboratorios, en Nottingham (Reino Unido) y en Santiago de Compostela, usando diferentes equipos con condiciones similares. En Nottingham el equipo HPLC utilizado fue un Shimadzu series 10AD VP equipado con bombas binarias, un desgasificador de vacío y un autosampler SIL-HTc (Shimadzu, MD, EEUU). La columna usada fue una Phenomenex Gemini C18, 150 x 2 mm (5 m Materiales y Métodos 55 de tamaño de partícula) a 45ºC. La fase móvil se estableció con 0,1% de acido fórmico en agua (A) y 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo (B). La tasa de flujo empleada fue de 0,45 mL/min. Las condiciones de elución fueron: 1 min con 0% de B, gradiente lineal hasta 50% de B en 0,5 min, gradiente lineal desde 50% hasta 90% de B durante 4 min, luego hasta 99% de B durante 2 min y vuelta a condiciones iniciales en 0,2 min. La columna se reequilibró durante 4 min. Se inyectaron alícuotas de 10 L de cada muestra en la columna. Los análisis mediante MS se llevaron a cabo con un 4000 QTRAP hybrid triplecuadrupolo de trampa de iones lineal (Applied Biosystem, CA, EEUU) equipado con una fuente TurboIon utilizada en electrospray de ion positivo y en modo de monitorización de múltiples reacciones (MRM). Se utilizaron como estándares las AHLs con o sin sustituciones oxoo hidroxiy de tamaños de cadena lateral entre 4 y 14 carbonos: C4-HSL, N-oxobutanoil-L-homoserín lactona (OC4-HSL), Nhidroxibutanoil-L-homoserín lactona (OHC4-HSL), C6-HSL, OC6-HSL, Nhidroxihexanoil-L-homoserín lactona (OHC6-HSL), N-heptanoil-L-homoserín lactona (C7-HSL), C8-HSL, OC8-HSL, N-hidroxioctanoil-L-homoserín lactona (OHC8-HSL), C10-HSL, N-oxodecanoil-L-homoserín lactona (OC10-HSL), N-hidroxidecanoil-Lhomoserín lactona (OHC10-HSL), C12-HSL, OC12-HSL, N-hidroxidodecanoil-Lhomoserín lactona (OHC12-HSL), N-tridecanoil-L-homoserín lactona (C13-HSL), Noxotridecanoil-L-homoserín lactona (OC13-HSL), N-hidroxitridecanoil-L-homoserín lactona (OHC13-HSL), C14-HSL, N-oxotetradecanoil-L-homoserín lactona (OC14HSL) y N-hidroxitetradecanoil-L-homoserín lactona (OHC14-HSL). Las AHLs en las muestras fueron identificadas por comparación de tiempos de elución y espectros de picos obtenidos para las estándar. En Santiago de Compostela el equipo y condiciones utilizadas fueron las mismas que las descritas previamente (sección 1.3 de materiales y métodos). 5.4 Detección de AHLs in vivo Se realizaron infecciones experimentales de juveniles de rodaballo (25 gramos de peso medio) mantenidos en un flujo constante de agua de mar a 15ºC con niveles de oxígeno superiores a 8 mg/L y 32 ‰ de salinidad. Para los ensayos de patogenicidad los peces fueron aclimatados a las condiciones anteriores durante 5 días y luego fueron Resultados y Discusión 62 cepas, la cepa 20J, con actividad enzimática QQ sobre las AHLs presentes en el medio de cultivo. 0 20 40 60 80 100 C+ 5 6 7 20J 89 90 91 92 100 101 102 103 104 105 106 107 112 113 114 115 124 125 Aislado 10 3 x RLU Figura 11. Diagrama de barras obtenido por cuantificación de bioluminiscencia de E. coli JM109 pSB1075, en el ensayo de degradación de C12-HSL (50 µM) en medio líquido para la detección de cepas marinas con actividad QQ. Las cepas 5, 20J, 100 y 124 parecen degradar o antagonizar la acción de C12HSL tras 24 horas ya que inhiben la producción de luz del biosensor, pero las cepas 100 y 124 resultaron falsos positivos en el ensayo sólido con C. violaceum CV026. Los valores de luminiscencia son la media de tres pocillos de placa microtiter. Control (C+): C12-HSL 50 µM en CM. RLU: unidades relativas de luz. La elevada cantidad de cepas negativas para degradación de AHLs en el análisis con HPLC-MS de las seleccionadas en el bioensayo en medio líquido, motivó el desarrollo de un nuevo ensayo en medio sólido con C. violaceum CV026 para confirmar la posible producción de antagonistas. Este nuevo ensayo nos permitió diferenciar de manera directa las cepas con inhibición de crecimiento sobre biosensor de las cepas con actividad QQ real. Así, en todas las cepas positivas con doble actividad obtenidas en el ensayo en medio líquido que no pudieron ser confirmadas por HPLC-MS se observó la producción de un halo de inhibición de crecimiento de C. violaceum CV026. Probablemente esta inhibición de crecimiento fue la responsable de la no detección de Resultados y Discusión 63 bioluminiscencia con los biosensores basados en lux. La mayoría de estas cepas procedían de la muestra de F. vesiculosus y presentaban un crecimiento en swarming característico (Figura 12). En el ensayo con C. violaceum CV026 en medio sólido se identificaron 24 cepas con actividad QQ, lo que representó un 14,5% de las cepas aisladas (Tabla 6). Se confirmaron de este modo 10 cepas con QQ de las identificadas con E. coli JM109, siendo 7 activas frente a C4-HSL en el ensayo líquido, y se detectaron 10 nuevas cepas capaces de degradar C6-HSL. Figura 12. Imagen del crecimiento en swarming e inhibición de crecimiento de varios aislados marinos en ensayo de detección de QQ en medio sólido con C. violaceum CV026. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los medios utilizados para el aislamiento de cepas con actividad QQ (Tabla 6, test Chi cuadrado, p>0,05). Aproximadamente el 50% de las cepas activas se aislaron a 22ºC y por tanto el efecto de la temperatura sobre el aislamiento de bacterias con actividad QQ tampoco fue significativo (test exacto de Fisher, p>0,05). Por el contrario se observaron importantes diferencias sobre el aislamiento de cepas con actividad QQ dependiendo de la muestra utilizada (Tabla 6, test Chi cuadrado, p<0,05). Mientras que las cepas aisladas de los tanques presentaban un porcentaje de actividad QQ entre el 6 y 9% (Tabla 6), casi un 40% de las cepas aisladas de la muestra de F. vesiculosus fueron activas frente a C6HSL (Tabla 6). Las 24 cepas capaces, aparentemente, de bloquear la actividad C6-HSL se analizaron también para interceptación de C10-HSL con el mismo ensayo en medio sólido usando el biosensor C. violaceum VIR07. De éstas, solamente 15 fueron capaces Resultados y Discusión 64 de interceptar completamente en 24 horas la actividad C6 y C10-HSL (Figura 13) y por tanto estas cepas fueron seleccionadas para caracterización de su actividad QQ e identificación. De estos aislados, 7 procedieron de muestra de F. vesiculosus, 7 de sedimento de tanque y 1 de biopelícula de tanque de agua de mar (Tabla 7). Paralelamente se realizó un ensayo con C. violaceum CV026 para detectar la producción de AHLs por los aislados que nos permitiese estimar la prevalencia de bacterias productoras de AHLs en las muestras y permitir detectar posibles interferencias en ensayos de QQ. Sin embargo no se detectó producción de AHLs en este ensayo con ninguno de los aislados marinos ensayados debido a la relativa alta concentración de AHLs necesaria para ser detectados por los biosensores de C. violaceum. Figura 13. Foto de un ensayo en medio sólido para la detección de actividades QQ en cepas marinas con los biosensores de AHLs C. violaceum CV026 (A) y C. violaceum VIR07 (B). Las cepas marinas capaces de degradar o antagonizar la acción de C6 y C10-HSL (10 µM) tras 24 horas impiden la formación del halo de violaceína en los biosensores. El pocillo central se corresponde con el control de AHL (10 µM). También se establecieron controles negativos para QQ con la bacteria Vibrio anguillarum. Además, en estas cepas se comprobó la capacidad de degradación de la AHL sustituida OC12-HSL utilizando un ensayo en placa con el biosensor E. coli JM109 pSB1075 (Figura 14). Diez de las 15 cepas fueron capaces de suprimir completamente la AHL sustituida detectable por el biosensor (Tabla 7), indicando que estos aislados pueden inactivar un amplio rango de AHLs. A B 168 168 20J 20J 176 176 Control C6-HSL Control C10-HSL Vibrio anguillarum Vibrio anguillarum Resultados y Discusión 65 Figura 14. Foto de un ensayo en medio sólido para la detección de actividad QQ sobre OC12-HSL en cepas marinas con el biosensor E. coli JM109 pSB1075. Las cepas marinas capaces de degradar o antagonizar la AHL tras 24 horas impiden la producción de luz por el biosensor. El pocillo central se corresponde con el control de AHL (10 M), los pocillos a la izquierda se corresponden con aislados negativos para degradación de OC12-HSL (Cepas 30 y 33). 1.1.3 Confirmación de la actividad degradadora de AHLs por HPLC-MS Las 15 cepas capaces de interceptar C6 y C10-HSL en ensayo en placa con medio sólido fueron capaces de reducir significativamente la concentración de C4 y C12-HSL cuantificada por HPLC-MS (Figura 15). El pH final de los cultivos tras 24 horas de ensayo de degradación estuvo, en todos los casos, por debajo de 7,0 y por tanto se pudo descartar una apertura espontánea del anillo HSL de las señales debido a pHs básicos. Este resultado indicó la presencia de actividad enzimática degradadora de AHLs en todas las cepas. El aspecto del halo de violaceína en C. violaceum permitía ya adelantar la presencia de actividad QQ de tipo enzimático ya que, con la concentración de AHLs utilizada, la degradación enzimática de señales se mostraría como ausencia o reducción del diámetro del halo violeta alrededor de los pocillos, mientras que un antagonista de AHLs generalmente se muestra como un halo mas claro de violaceína rodeado por un segundo halo de violaceína más intenso, como ocurre con la difusión de furanonas de D. pulchra (Figura 9). Resultados y Discusión 66 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 CM C12 2 5 168 172 173 176 177 20J 24 30 33 50 97-1 97-2 61 Cepa % AHL C12 C12 acidificado Fucus Sedimento Biopelícula 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 CM C4 2 5 168 172 173 176 177 20J 24 30 33 50 97-1 97-2 61 Cepa % AHL C4 C4 acidificado Biopelícula Fucus Sedimento Figura 15. Análisis HPLC-MS de degradación de C4 y C12-HSL (50 µM) tras 24 horas por las 15 cepas QQ positivas seleccionadas. Se acidificó a pH 2 para recuperar el anillo lactona (barras verdes) Resultados y Discusión 67 Origen Cepa Bacteria cultivada más cercana 16S % ID Gram TSA-I OC12 Posible secuencia 2 Hyphomonas sp. DG895 99 - - +++ Acilasa y lactonasa 5 Stappia sp. 98 - - + lactonasa 168 Alteromonas sp. BCw156 99 - - +++ acilasa 172 Oceanobacillus sp. YIM DH3 99 + + - acilasa 173 Rhodococcus erythropolis PR4 100 + + +++ lactonasa 176 Stappia sp. 98 - - +++ lactonasa Fucus vesiculosus 177 Phaeobacter sp. NH52F 96 - - +++ 20J Tenacibaculum discolor DSM 18842 99 - - +++ 24 Bacillus circulans cepa X3 98 + + +++ lactonasa(1) 30 Oceanobacillus sp. YIM DH3 99 + + - acilasa 33 Halomonas taeanensis BH539 99 - - - 50 Rhodococcus erythropolis MM30 99 + + +++ lactonasa 97-1 Stappia sp. 98 - - +++ lactonasa Sedimento 97-2 Oceanobacillus sp. YIM DH3 99 + + - acilasa Biopelícula 61 Roseovarius aestuarii SMK-122 99 - - +++ Tabla 7. Identificación de las 15 cepas con actividad QQ de amplio espectro en base a las secuencias de sus genes de ARNr 16S. También se muestra la tinción de Gram según método tradicional de las cepas, la capacidad de crecimiento en medio sin sales marinas (TSA-I) y la capacidad de degradar AHL sustituida (OC12-HSL), así como la presencia y tipo de posibles secuencias de enzimas degradadoras de AHL en los genomas secuenciados. (1) Basado en la presencia común de lactonasas en los genomas disponibles del género Bacillus. La mayoría de las cepas degradaron completamente C4 y C12-HSL a pesar de que los bioensayos con las que se seleccionaron originalmente fueron con las señales C6 y C10-HSL. La recuperación de AHL debido a la acidificación del medio de cultivo a Resultados y Discusión 68 pH 2, que permite la recircularización del anillo HSL causada por actividades lactonasa, fue más frecuente para C4-HSL. Únicamente en las cepas 2, 24, 168 y 177, que degradaron casi completamente las AHLs corta y larga, la acidificación no recuperó la concentración de las señales indicando que la actividad enzimática presente en estos aislados no se debe a una lactonasa. Varias cepas como 20J presentaron un perfil de degradación diferente para AHL corta y larga indicando la posible presencia de más de un tipo de actividad enzimática, mientras que otras como las cepas 5, 30, 33, 97-1, 97-2, 172 y 176 parecen tener lactonasas con amplio espectro de degradación de AHLs, debido a que la concentración de ambas AHLs se recupera parcialmente tras la acidificación del medio de cultivo (Figura 15). 1.1.4 Identificación de aislados Se obtuvieron las secuencias del gen de ARN ribosómico 16S (Anexo 1) de las 15 cepas seleccionadas y, para su identificación taxonómica, se realizó una búsqueda comparativa mediante BLAST en las secuencias disponibles de ARNr 16S del GenBank. La bacteria más próxima a cada aislado se muestra en la Tabla 7. De los 15 aislados, dos pertenecen a γ-Proteobacteria (33 y 168), seis a α-Proteobacteria (5, 97-1, 176, 2, 61 y 177), cuatro a Firmicutes (24, 30, 97-2 y 172), dos a Actinobacteria (50 y 173) y una a Bacteroidetes (20J). De las 15 cepas marinas aisladas únicamente tres: la cepa 24 (identificada como Bacillus circulans al 98% con el identidad) y las cepas 50 y 173 (Rhodococcus erythropolis con un 99 y 100% de identidad respectivamente), pertenecen a géneros en los que aislados del medio terrestre habían sido descritos como capaces de degradar AHLs (Dong et al., 2002; Uroz et al., 2003). Aunque B. circulans ha sido aislado estas muestras (Das et al., 2008) la presencia de especies de Bacillus no es común en muestras del medio marino (Ivanova et al., 1999). Debido a que el aislado 24 procede de un sedimento de tanque de un circuito cerrado de agua de mar para cultivo de peces en unas instalaciones lejanas al mar (Santiago de Compostela), es posible que su origen sea terrestre. Resultados y Discusión 69 ‐Proteobacteria ‐Proteobacteria Firmicutes Actinobacteria Bacteroidetes Cepas aisladas en este trabajo Cepas con N-acilhomoserín lactona acilasas Cepas con actividad quorum quenching no caracterizada Cepas con lactonasas ‐Proteobacteria Cianobacteria Shigella sp. 5 219944573 Klebsiella pneumoniae 342 206575712 Shewanella sp. MIB015 161408102 Pseudoalteromonas atlantica T6c 109896322 Alteromonas sp. BCw156 229892555 168 Gamma proteobacterium HTCC5015 254449402 Endosymbiont of Lucinoma sp. 209869711 Gamma proteobacterium NOR5-3 218703224 Chromohalobacter salexigens DSM 30439402 Halomonas taeanensis BH539 50236441 33 Azotobacter vinelandii DJ 226942170 Pseudomonas aeruginosa PAO1 110645304 Pseudomonas putida KT2440 26986745 Pseudomonas syringae B728a 66043271 Pseudomonas fluorescens Pf0-1 255961261 Acinetobacter sp. C1010 34484363 Ralstonia solanacearum GMI1000 17544719 Ralstonia pickettii 12D 241661625 Comamonas sp. D1 33329791 Variovorax paradoxus VAI-C 11385580 Sphingopyxis witflariensis W-50 253680762 61 Roseovarius aestuarii 182892404 177 Phaeobacter sp. NH52F 209981527 Rhodobacter aestuarii 161513025 2 Hyphomonas sp. DG895 32441397 97-1 5 176 Rhodobacteraceae bacterium MEBiC05066 1828924041 Bosea thiooxidans KB13-VS 6273428 Bradyrhizobium sp. BTAi1 CP000494 Agrobacterium tumefaciens str. C58 1591184118 Rhodococcus erythropolis MM30 190351101 173 50 Arthrobacter sp. IBN110 31558965 Streptomyces sp. M664 49781330 Anabaena sp. PCC 7120 39010 Bacillus thuringiensis 49476684 Bacillus sp. A24 225921123 24 Bacillus circulans X3 190364844 Oceanobacillus caeni 115551759 30 Oceanobacillus sp. YIM DH3 86279611 172 97-2 Flavobacterium aquatile 87116142 20J Tenacibaculum discolor 151416868 100 100 95 100 100 99 94 78 67 100 100 96 82 100 100 100 100 100 100 100 99 84 100 100 100 74 100 91 98 100 99 100 96 99 84 57 98 95 90 74 0.02 ‐Proteobacteria ‐Proteobacteria Firmicutes Actinobacteria Bacteroidetes Cepas aisladas en este trabajo Cepas con N-acilhomoserín lactona acilasas Cepas con actividad quorum quenching no caracterizada Cepas con lactonasas ‐Proteobacteria Cianobacteria Shigella sp. 5 219944573 Klebsiella pneumoniae 342 206575712 Shewanella sp. MIB015 161408102 Pseudoalteromonas atlantica T6c 109896322 Alteromonas sp. BCw156 229892555 168 Gamma proteobacterium HTCC5015 254449402 Endosymbiont of Lucinoma sp. 209869711 Gamma proteobacterium NOR5-3 218703224 Chromohalobacter salexigens DSM 30439402 Halomonas taeanensis BH539 50236441 33 Azotobacter vinelandii DJ 226942170 Pseudomonas aeruginosa PAO1 110645304 Pseudomonas putida KT2440 26986745 Pseudomonas syringae B728a 66043271 Pseudomonas fluorescens Pf0-1 255961261 Acinetobacter sp. C1010 34484363 Ralstonia solanacearum GMI1000 17544719 Ralstonia pickettii 12D 241661625 Comamonas sp. D1 33329791 Variovorax paradoxus VAI-C 11385580 Sphingopyxis witflariensis W-50 253680762 61 Roseovarius aestuarii 182892404 177 Phaeobacter sp. NH52F 209981527 Rhodobacter aestuarii 161513025 2 Hyphomonas sp. DG895 32441397 97-1 5 176 Rhodobacteraceae bacterium MEBiC05066 1828924041 Bosea thiooxidans KB13-VS 6273428 Bradyrhizobium sp. BTAi1 CP000494 Agrobacterium tumefaciens str. C58 1591184118 Rhodococcus erythropolis MM30 190351101 173 50 Arthrobacter sp. IBN110 31558965 Streptomyces sp. M664 49781330 Anabaena sp. PCC 7120 39010 Bacillus thuringiensis 49476684 Bacillus sp. A24 225921123 24 Bacillus circulans X3 190364844 Oceanobacillus caeni 115551759 30 Oceanobacillus sp. YIM DH3 86279611 172 97-2 Flavobacterium aquatile 87116142 20J Tenacibaculum discolor 151416868 100 100 95 100 100 99 94 78 67 100 100 96 82 100 100 100 100 100 100 100 99 84 100 100 100 74 100 91 98 100 99 100 96 99 84 57 98 95 90 74 0.02 Figura 16. Árbol filogenético construido por el método del vecino más próximo (“neighbour-joining”) mostrando las relaciones taxonómicas basadas en secuencias de genes de ARNr 16S de los 15 aislados seleccionados en este trabajo (en rojo) y especies anteriormente descritas con actividad quorum quenching. El código que sigue a cada taxón se corresponde con el número de acceso a su respectiva secuencia del 16S. Se muestran los porcentajes mayores del 50% de homología en el análisis neighbourjoining. Barra de escala: 0,02 sustituciones por posición nucleotídica. Resultados y Discusión 70 Dos aislados, obtenidos de diferente muestra, la cepa 50 de sedimento y la cepa 173 de F. vesiculosus, fueron identificados como R. erythropolis (Tabla 7), indicando que esta especie es un representante común entre las bacterias marinas con actividad QQ. El género Rhodococcus está ampliamente distribuido en hábitats acuáticos y terrestres y varias especies son conocidas por su alta capacidad degradadora de compuestos orgánicos complejos (Goodfellow y Maldonado, 2006). Varias especies de este género degradan AHLs, pero hasta la fecha todas son procedentes de muestras de origen terrestre (Uroz et al., 2008). Todos los aislados con actividad QQ no descrita previamente pertenecen a géneros típicos de ambientes marinos aunque muchos fueron capaces de crecer en TSAI (NaCl 1%) (Tabla 7). La α-Proteobacteria Stappia sp. (cepas 5, 176 y 97-1), un género que incluye varias especies marinas clasificadas anteriormente como pertenecientes al género Agrobacterium, y el Firmicute Oceanobacillus sp. (cepas 172, 30 y 97-2), un género que incluye muchas especies marinas alcalófilas facultativas, parecen ser abundantes y ubicuos, ya que representantes de ambos géneros pudieron ser aislados varias veces de muestras de muy diferente origen (F. vesiculosus y sedimento de tanque). De entre las cepas aisladas de muestra de F. vesiculosus, Hyphomonas sp. (cepa 2) pertenece al grupo de los prostecados, bacterias típicamente epibiontes de algas (Poindexter, 2006), mientras que Alteromonas sp. (cepa 168) es un género de γProteobacterias marinas que son aisladas con frecuencia de varios ambientes marinos, incluyendo algas (Gauthier y Breittmayer, 1992). Ambas especies fueron incapaces de crecer en TSA-I indicando que se trata de cepas con origen estrictamente marino (Tabla 7). Finalmente, la cepa 177 (Cepa objeto de patente, Anexo 2.4) representa una nueva especie de α-Proteobacteria que está relacionada (ID 96%) con Phaeobacter sp., un género de bacterias marinas próximo al grupo de las Roseobacterias (Martens et al., 2006; Figura 16), aunque las secuencias más próximas filogenéticamente a este aislado se corresponden con bacterias no cultivables (Jones et al., 2007). En cuanto a los aislados procedentes de sedimento de tanque de peces, la cepa 20J presentó un 99% de identidad en su secuencia del gen de ARNr 16S con el patógeno de peces Tenacibaculum discolor. El género Tenacibaculum pertenece al grupo Bacteroidetes, Resultados y Discusión 71 que constituye uno de los grupos dominantes de bacterias heterótrofas en los ambientes acuáticos e incluye varias especies causantes de la tenacibaculosis/flexibacteriosis o “gliding bacterial disease” en peces. Sorprendentemente, la cepa 20J fue aislada en TSA-I, una característica que la excluiría de la especie Tenacibaculum discolor (Piñeiro-Vidal et al., 2008). La cepa 33 se identificó como miembro del género Halomonas (ID 99%), un grupo de γ-Proteobacterias generalmente marinas que incluye varias cepas halofílicas moderadas. La única cepa con actividad QQ aislada de biopelícula de tanque de agua de mar (cepa 61) fue identificada como Roseovarius aestuarii (ID 99%). El género Roseovarius comprende α-Proteobacterias estrictamente marinas (Labrenz et al., 1999). Esta especie pertenece al linaje de Roseobacterias que, se estima, comprende del 20 al 30% de las secuencias de genes ARNr 16S de la zona fótica de los hábitats marinos (Wagner-Dobler y Biebl, 2006). Las relaciones entre las secuencias de ARNr 16S de los 15 aislados y las de otras cepas con actividad QQ descritas con anterioridad (Carlier et al., 2003; Kang et al., 2004; Uroz et al., 2007) se muestran en el dendrograma de la Figura 16. Aunque Delftia sp. A317 y Ochrobactrum sp. A44 presentan actividad QQ (Jafra et al., 2006), no fueron incluidas en el análisis debido al escaso tamaño de la secuencia de ARNr 16S disponible en las bases de datos. 1.1.5 Genes de quorum quenching en colecciones de metagenomas marinos Aunque la presencia de lactonasas ya ha sido descrita en colecciones de metagenomas de muestras de suelo procedentes de una planicie del río Tanana en EEUU y de una tierra de pastos en Francia (Williamson et al., 2005; Riaz et al., 2008; Schipper et al., 2009), no se han realizado búsquedas de genes QQ en otros hábitats. Para determinar si este tipo de enzimas (lactonasas y acilasas) son tan comunes en el medio marino como la actividad QQ encontrada en bacterias marinas cultivables aisladas en este estudio, se analizaron las secuencias de colecciones de metagenomas marinos para detectar homólogos de las secuencias de lactonasas y acilasas conocidas. Resultados y Discusión 78 m, lo que se ha denominado “distancia de llamada”. Por tanto, la difusión molecular a largas distancias, como la esperada en comunidades bacterianas marinas de vida libre, llevaría mucho tiempo y supondría mucho gasto energético. En el caso de que las actividades QQ estuvieran generalmente asociadas a materia particulada y por tanto a superficies en el medio marino, sería de esperar una mayor frecuencia de secuencias de genes QQ en las colecciones metagenómicas procedentes de biomasa de esqueletos de ballenas (75 Mpb, Tringe et al., 2005), que no presentan desviaciones por filtración. Aunque no se encontraron posibles secuencias de genes QQ cuando se aplicaron las condiciones más restrictivas, la frecuencia de secuencias de QQ obtenidas en los esqueletos de ballena fueron significativamente mayores que la obtenida para colecciones GOS cuando se aplicó el criterio menos estricto, lo que apoyaría la asociación entre la materia particulada y los procesos de QS y QQ. De todas formas, cualquier comparación entre los resultados de búsqueda en las colecciones metagenómicas GOS y de esqueleto de ballena debe tomarse con precaución debido a la diferencia de tamaños de secuencia disponible en cada una de ellas. Otra hipótesis que explicaría la discrepancia en la relevancia de los sistemas de QS y QQ en las bacterias marinas cultivables y las bases de datos de metagenomas marinos es el número limitado de secuencias de las que disponemos para enzimas productoras y degradadoras de AHLs. La mayoría de las sintetasas de AHL que han sido identificadas son homólogos de LuxI pertenecientes a α-, βy γ-Proteobacteria (Williams et al., 2007). La amplia variedad taxonómica de Proteobacterias marinas productoras de AHLs junto con el reciente descubrimiento de producción de AHLs por aislados marinos de Bacteroidetes (Huang et al., 2008; Romero et al., 2010, Anexo 2.2), podría estar indicando la existencia de una mayor diversidad molecular de sintetasas y receptores de AHLs cuya presencia no sería revelada por el uso de las secuencias de luxI y luxR en las colecciones de metagenomas. El mismo problema sería aplicable a las secuencias de QQ. Así, recientemente se ha clonado una nueva clase de lactonasa de R. erythropolis (Uroz et al., 2008), que no presenta homología con la familia de lactonasas bien caracterizadas que comparten un dominio de unión a Zn (HXDH~H~D) y están representadas por AiiA de Bacillus sp. (Dong et al., 2000). También se han identificado dos nuevas lactonasas en un estudio de metagenoma de suelo (Schipper et al., 2009) y el Resultados y Discusión 79 presente trabajo ha permitido la identificación de bacterias con actividad QQ pertenecientes a 8 nuevos géneros en los que esta actividad no había sido descrita con anterioridad, incluyendo una nueva especie de α-Proteobacteria (cepa 177) y un miembro de Bacteroidetes (cepa 20J), lo que seguramente ampliará el número de secuencias disponibles para estas enzimas. La baja homología de las secuencias de enzimas de QQ hace necesario reducir los porcentajes de similitud en las búsquedas en colecciones de metagenomas y genomas, lo que resulta en un importante incremento en la cantidad de secuencias con posible actividad acilasa o lactonasa (Figura 18) disminuyéndo la discrepancia de resultados obtenidos con la actividad de las bacterias cultivables. Otro resultado significativo derivado del análisis de metagenomas marinos es la clara divergencia encontrada entre la distribución espacial de lactonasas y acilasas (Figura 17). Las lactonasas presentan homología con la familia de -lactamasas pero parecen ser enzimas altamente específicas sin o con baja actividad sobre otras moléculas (Dong et al., 2007). La única excepción la representa la lactonasa BlcC de Agrobacterium tumefaciens, cuyo gen forma parte del operón blcABC, que presenta actividad sobre -butirolactona (GBL) y de hecho le confiere a la bacteria capacidad de crecimiento con GBL como única fuente de carbono (Carlier et al., 2004; Khan y Farrand, 2008). Por otro lado, las acilasas presentan homología con acilasas de cefalosporinas, hidrolasas N-terminales (Ntm) (Dong et al., 2007) y en algunos casos son capaces de catalizar la hidrólisis de Penicilina G como la acilasa AhlM de Streptomyces sp. (Park et al., 2005). Debido a estas diferencias de especificidad entre los dos tipos procariotas de enzimas degradadoras de AHLs descritos hasta la actualidad, se puede hipotetizar con que la mayor abundancia de las acilasas, degradadoras de AHLs en las muestras de metagenomas costeros, es el reflejo de un ambiente más rico y complejo en el que las acilasas podría actuar como bloqueadores de QS mediado por AHLs, así como con otras funciones como defensa contra la producción de antibióticos por competidores. A parte del mayor porcentaje de aislados con actividad QQ, la diversidad taxonómica de bacterias degradadoras de AHL obtenidas en este trabajo es mucho mayor que la encontrada en muestras de suelo y asociadas a plantas. Se aislaron miembros de 10 géneros diferentes pertenecientes a α-, γ-Proteobacteria, Resultados y Discusión 80 Actinobacteria, Firmicutes y Bacteroidetes (Figura 16) incluida la identificación de una nueva especie relacionada con Phaeobacter (cepa 177). Casi todos los aislados marinos activos pertenecen a géneros comúnmente o exclusivamente marinos, excluyendo un posible origen terrestre de las cepas, a pesar del carácter costero de las muestras. Únicamente tres de los aislados pertenecen a géneros (Bacillus y Rhodococcus) en los que habían sido descrito previamente representantes terrestres con actividad QQ (Dong et al., 2002; Uroz et al., 2003). En contraste con nuestros resultados, en la búsqueda de QQ realizada en 800 cepas procedentes de suelo todos los aislados activos caracterizados pertenecieron al género Bacillus (Dong et al., 2002). En otro estudio con diferentes cepas de Bacillus sp. y α-Proteobacterias procedentes de muestra de rizosfera de tabaco, únicamente se obtuvieron cepas degradadoras para especies de Bacillus (D’Angelo-Picard et al., 2005), indicando una menor variedad de los representantes con actividad QQ entre las bacterias de suelo, o al menos entre aquellas cultivables. Aunque los resultados de los bioensayos excluían a priori la posibilidad de que las cepas seleccionadas produjeran AHLs o antagonistas que pudieran bloquear los receptores para AHL del biosensor, la actividad enzimática de las 15 cepas seleccionadas se confirmó mediante metodología HPLC-MS (Figura 15). Los resultados de HPLC-MS demostraron que los 15 aislados seleccionados degradaron activamente tanto C4-HSL como C12-HSL. La acidificación de los medios de cultivo tras el ensayo de degradación permitió la identificación de posibles actividades lactonasa en las cepas, ya que el anillo lactona puede ser recircularizado a pHs bajos (Yates et al., 2002). La actividad lactonasa parece estar muy extendida en el género Bacillus (Dong et al., 2002), sin embargo la acidificación de los medios tras degradación de AHLs en nuestro aislado de B. circulans no recuperó la actividad C12-HSL y sólo un poco de C4HSL (Figura 15) indicando un tipo de actividad enzimática diferente de la lactonasa descrita hasta ahora para este género. Será necesario confirmar si una posible actividad oxidasa sobre AHLs como la descrita para B. megaterium (Chowdhary et al., 2007; Cirou et al., 2009) es la responsable de la capacidad QQ de B. circulans cepa 24. R. erythropolis W2 es una cepa particular pues se ha demostrado que es capaz de inactivar un amplio rango de AHLs usando tres mecanismos enzimáticos diferentes: una lactonasa, una acilasa y una oxidorreductasa que reduce las oxo-AHLs a sus equivalentes hidroxilados (Park et al., 2006; Uroz et al., 2008). Esta combinación única Resultados y Discusión 81 no pudo ser encontrada en otras cepas terrestres de R. erythropolis, en los que únicamente se ha descubierto actividad lactonasa sobre las AHLs (Uroz et al., 2008). Esta importante diversidad en cuanto actividad enzimática en el nivel infraespecie ya había sido descrita para cepas de R. erythropolis procedentes de regiones geográficas muy alejadas (Brandão et al., 2003). Aunque es necesario realizar estudios más detallados de las actividades enzimáticas presentes en nuestros aislados marinos de R. erythropolis, los análisis por HPLC-MS de degradación de la señal C12-HSL demuestran que el pico de concentración de AHL no se recupera tras acidificación del medio de cultivo y por tanto una actividad enzimática diferente de la de lactonolisis debería estar presente en ambos aislados. Por el contrario, la señal C4-HSL pudo recuperarse parcialmente tras el tratamiento de acidificación (Figura 15), y por tanto se propone la presencia de un complejo sistema enzimático para la degradación activa de AHLs en nuestros aislados marinos, similar al descrito para R. erythropolis W2 (Uroz et al., 2008). Este sistema merecerá mayor caracterización pues los dos aislados marinos de R. erythropolis obtenidos en este trabajo también inactivan la AHL oxosustituida OC12-HSL (Tabla 7). Uno de los aislados procedentes de sedimento de tanque de cultivo de peces, la cepa 33 identificada como Halomonas sp. (99%) y el único aislado activo obtenido de la biopelícula de tanque de agua de mar, identificado como Roseovarious aestuarii (99%) pertenecen a géneros que habían sido descritos como productores de señales AHL previamente (Llamas et al., 2005, Wagner-Dobler et al., 2005). R. aestuarii pertenece al linaje marino de las roseobacterias, que ha sido propuesto como el más numeroso de entre las bacterias productoras de AHL en el hábitat marino, al menos dentro de los grupos bacterianos cultivables (Cicirelli et al., 2008). La producción de AHLs también ha sido descrita para ciertas cepas productoras de polisacáridos del género Halomonas (Llamas et al., 2005), característica que podría estar relacionada con su capacidad para promover o inhibir el asentamiento larval en organismos marinos como poliquetos y briozoos (Holmstrom y Kjelleberg, 2000). Por tanto, la presencia de un amplio espectro de actividad degradadora de señales AHL en estas especies podría representar un mecanismo de automodulación de los niveles de señal, como ya ha sido descrito para Agrobacterium tumefaciens (Zhang et al., 2002), o también como sistema de interferencia con las señales de posibles competidores (Park et al., 2008). Las posibles Resultados y Discusión 82 diferencias en cuanto a producción de señales AHL y su degradación en estos géneros, podría constituir una buena herramienta experimental para el estudio de la importancia de las AHLs en la formación de biopelículas y procesos de biofouling en el medio marino (Dobretsov et al., 2009). La búsqueda de genes de QQ en los genomas bacterianos secuenciados disponibles en las bases de datos y con la metodología menos restrictiva (30/70%), reveló la presencia de secuencias homólogas en varias de las especies con actividad QQ identificadas en este trabajo (Tabla 7; Figura 18). En algunos casos, como en las cepas de Stappia sp., que presentaron una clara actividad lactonasa, la secuencia obtenida de los genomas del género secuenciados coincidió con los resultados preliminares del análisis por HPLC-MS. Por el contrario, en el caso de Oceanobacillus spp., los análisis por HPLC-MS indicaron la presencia de actividad tipo lactonasa, mientras que en el genoma sólo se detectó una secuencia homóloga a acilasas conocidas. La clonación de las enzimas responsables de la actividad QQ en estos nuevos aislados extenderá muy probablemente nuestro conocimiento sobre la variabilidad y modos de acción de estas enzimas y permitirá una interpretación ecológica más completa de los procesos de QQ derivada de búsquedas más precisas en metagenomas. Además, una caracterización profunda de estos aislados y de sus actividades podría conducir al desarrollo de herramientas biotecnológicas para el tratamiento y prevención de infecciones en las que intervienen procesos de QS mediados por AHLs, especialmente en el campo de la acuicultura (Defoirdt et al., 2007). El alto porcentaje de cepas con actividad QQ aisladas en el presente trabajo parece indicar que el QQ es una estrategia comúnmente adoptada por las bacterias marinas cultivables con el fin de obtener ventajas competitivas, al menos en medios marinos costeros ricos en nutrientes. Esta actividad es especialmente importante para las bacterias aisladas de muestra de F. vesiculosus, indicando la existencia de fuertes interacciones bacterianas en la superficie de las algas. La llamativa diferencia encontrada para los porcentajes de cepas con QQ entre las bacterias cultivables y la baja frecuencia de genes de QQ en las secuencias de metagenomas marinos merece estudios en más profundidad para determinar si existen verdaderas diferencias entre la prevalencia de estas actividades en los hábitats marinos costeros y oceánicos o, por el Resultados y Discusión 83 contrario, se derivan de las metodologías empleadas en la obtención de las secuencias de metagenomas. Resultados y Discusión 85 Resultados y Discusión 87 Capítulo 2. Quorum quenching en agua de mar de estuario y mar abierto 2.1 Resultados 2.1.1 Aislamiento bacteriano Con el objetivo de determinar si las discrepancias encontradas entre el aislamiento de cepas con actividad QQ en comunidades microbianas densas de origen marino y la frecuencia de genes de QQ en metagenomas marinos (Capítulo 1) reflejaban diferencias reales entre ambos hábitats, se repitió la búsqueda de aislados con capacidad de interferir con comunicación mediada por AHLs en muestras marinas no asociadas a superficies y con menor carga orgánica consistentes en agua de estuario obtenida en la misma localización que las muestras de Fucus vesiculosus y biopelícula de tanque reservorio de agua de mar (Ría de Arousa, Capítulo 1) y mar abierto a 0 y 10 metros de profundidad. En estas nuevas muestras el número de UFCs obtenido fue entre dos y tres órdenes de magnitud inferior a las obtenidas para muestras de comunidades microbianas marinas densas (Figuras 10 y 19). La muestra con mayor población bacteriana fue la de estuario, alcanzando 4x104 UFCs/mL, un orden de magnitud superior a las muestras de alta mar (Figura 19). En aguas de alta mar la cantidad de UFCs obtenida fue similar para ambas profundidades, y no se encontraron diferencias entre los distintos medios y temperaturas utilizados, alcanzándose valores máximos con medios de cultivo más oligotrofos como AM 1/100 (Figura 19), mientras que en agua de estuario existió más variabilidad entre medios de cultivo, al igual que ocurría en las muestras de comunidades microbianas densas de origen marino (Figuras 10 y 19). El medio más efectivo para aislamiento de bacterias cultivables en agua de estuario fue el AM (Figura 19). Se seleccionaron un total de 132 aislados en base a morfología y coloración de las colonias para la muestra de agua de mar de estuario y 166 para cada una de las muestras de alta mar (Tabla 9). Resultados y Discusión 94 2.1.4 Identificación de aislados Se seleccionaron las 4 cepas (138E, 131, 139 y 160) con actividad degradadora confirmada para C4, C6, C10 y C12 para su identificación taxonómica. Para ello se obtuvieron las secuencias del gen de ARN ribosómico 16S (Anexo 1) de las cepas y se realizó una búsqueda comparativa mediante BLAST en las secuencias disponibles de ARNr 16S del GenBank. La bacteria más próxima a cada aislado se muestra en la Tabla 10. Los aislados 131 y 160 pertenecieron a la misma especie: Salinicola salarius (Halomonas salaria) (Kim et al., 2007) con un porcentaje de similitud del 98,4% y 99,9% respectivamente con la secuencia del gen ARNr 16S. La actividad QQ sobre AHLs parece estar conservada en especies del grupo de las Halomonas, pues S. salarius, que había sido clasificada hasta hace poco como Halomonas salaria (De la Haba et al., 2010), es muy próxima a uno de los aislados con actividad QQ de muestra de sedimento de tanque del capítulo anterior que también se identificó como otra especie de este género (Cepa 33, Halomonas taeanensis 99%). Tanto en el caso de los dos aislados de Halomonas de alta mar como el obtenido a partir de sedimento de tanque del capítulo anterior, el análisis por HPLC-MS del producto de degradación después de acidificación revela la presencia de actividad lactonasa (Figuras 15 y 23), lo que confirma la robustez de la metodología empleada. Origen Cepa Bacteria cultivada más cercana 16S % ID Medio aislamiento Estuario 138E Olleya marilimosa 99,9 FAS POL 131 Salinicola salarius (Halomonas salaria) 98,4 AM 139 Maribacter ulvicola 94,7 AM Alta mar (10 m) 160 Salinicola salarius (Halomonas salaria) 99,9 AM 1/100 Tabla 10. Identificación de las 4 cepas con actividad QQ en base a sus secuencias de los genes de ARNr 16S. Se muestra el origen y el medio de aislamiento de cada cepa. Resultados y Discusión 95 A pesar de que los porcentajes de identidad de secuencias de genes de ARNr 16S no fueron iguales, el aislamiento de dos cepas de S. salarius a partir de la misma muestra indicaría la posibilidad de que alguno de los 82 aislados positivos de muestras de alta mar fuesen el resultado de múltiples aislamientos de la misma cepa. En espera de un estudio en profundidad para la caracterización taxonómica del resto de las especies de origen oceánico con actividad, la observación morfológica de las colonias permite agruparlas en varias tipologias que indican que efectivamente, algunas de las cepas podrían haber sido aisladas más de una vez. Las cepas 138E y 139 aisladas de agua de mar de estuario y agua de alta mar de 10 m de profundidad pertenecen al phylum Bacteroidetes. En el caso del aislado 138E la especie más próxima es Olleya marilimosa (99,9%). Esta especie fue aislada de materia particulada de Océano Antártico (Nichols et al., 2005). El género Olleya incluye dos especies Olleya marilimosa y Olleya aquimaris, aislada de agua de puerto en Corea (Lee et al., 2010). La cepa 139 representaría una nueva especie ya que presenta un porcentaje de identidad del 94,7% con Maribacter ulvicola. Las especies más próximas a las cuatro bacterias seleccionadas son de origen estrictamente marino, por lo que se puede descartar una contaminación en la toma de muestras. Ninguna especie de los 3 géneros aislados en este estudio había sido descrita previamente como degradadora de AHLs o con capacidad inhibitoria de QS mediado por AHLs. 2.2 Discusión En el trabajo descrito en este capítulo se realizó una búsqueda de cepas marinas con actividad QQ en muestras de agua de mar de estuario y alta mar a 0 y 10 metros de profundidad, con el objetivo de comparar los resultados con las muestras obtenidas en comunidades bacterianas densas costeras. Como se esperaba, en estas muestras se obtuvo una menor densidad de bacterias cultivables que en las comunidades bacterianas densas utilizadas con anterioridad para los medios seleccionados, aunque el número de UFCs fue considerablemente mayor (un orden de magnitud) en aguas de estuario que en aguas oceánicas, probablemente debido a su mayor carga orgánica (Figura 19). Como ya sucediera con muestras del capítulo anterior, la alta actividad interceptora de comunicación por señales AHL encontrada en estos aislados marinos Resultados y Discusión 96 manifiesta que el QQ es un proceso común entre bacterias en este medio. El porcentaje medio de cepas aisladas capaces de bloquear la actividad AHL obtenido en muestras de agua de mar fue de un 18,3% (Tabla 9), muy similar al de muestras de comunidades microbianas densas (14,4%; Tabla 6) y mucho mayor que los porcentajes obtenidos en otros estudios para muestras de suelo y plantas. Esta actividad es especialmente significativa entre las bacterias planctónicas obtenidas de agua de mar oceánica, alcanzando al menos un 20% de actividad, independientemente de la profundidad de la muestra (Tabla 9). Debido a que en la metodología de búsqueda de actividad QQ se evitó el uso de cultivos de enriquecimiento, se ha podido obtener un aislado bacteriano con posible actividad antagonista de AHLs (cepa 147) (Figuras 21 y 22). Aunque los resultados obtenidos todavía son preliminares, su confirmación supondría que la cepa 147 sería el segundo aislado bacteriano marino descrito con actividad inhibitoria de QS mediado por AHL, puesto que recientemente se ha descrito un aislado marino de Halobacillus salinus como productor de dos fenetilamidas con estructura similar a la de las AHLs y con capacidad de antagonizar la unión de las señales con sus receptores (Teasdale et al., 2009). La cepa 147 presentaría antagonismo sobre AHLs cortas pues se obtuvo degradación completa de C12-HSL medida por HPLC-MS (Figura 20). La actividad antagonista específica sobre ciertos tipos de AHL ya ha sido descrita debido a la diversidad estructural de las señales (Ni et al., 2009), de este modo están descritas moléculas capaces de antagonizar la recepción de AHLs cortas pero con escasa actividad sobre AHLs de cadena lateral larga y viceversa (Smith et al., 2003). Aunque debido a que la degradación de AHLs largas por la cepa 147 impide la detección de actividad antagonista sobre éstas. Al igual que para las muestras de comunidades bacterianas costeras no se encontraron diferencias significativas entre el número de cepas con actividad QQ obtenido dependiendo del medio de cultivo o temperatura utilizados para su aislamiento, pero sí en cuanto al origen de la muestra, con un porcentaje mucho mayor en muestras de alta mar, 27,7 y 21,7% para 0 y 10 metros respectivamente, frente a sólo un 2,3% en agua de estuario, porcentaje que aproxima a esta muestra al de las muestras de suelo. Como sucediera en las muestras de comunidades bacterianas costeras, el porcentaje de aislados con actividad QQ parece incrementarse significativamente en muestras marinas con menor número de UFCs, como la superficie del alga F. vesiculosus y muestras de Resultados y Discusión 97 alta mar (0 y 10 metros). Parece existir una correlación negativa entre el número de UFCs y actividad QQ, ya que las muestras con mayor actividad son aquellas que presentan menor número de bacterias cultivables. La muestra de F. vesiculosus y las de alta mar pueden presentar similitud en cuanto a la disponibilidad de fuentes de carbono complejas que impliquen una mayor competencia por recursos. Un resultado significativo derivado del análisis por HPLC-MS es la elevada actividad degradadora sobre C12-HSL registrada por los 85 aislados seleccionados a partir de bioensayo con C. violaceum (Figura 20), mientras que únicamente 4 fueron capaces de degradar completamente la señal corta C4-HSL (Figura 21). Este resultado contrasta con el hecho de que se ha observado una menor tasa de degradación de AHLs largas respecto cortas en agua de mar filtrada, que ha sido atribuida a la existencia de enzimas de QQ (Hmelo y Van Mooy, 2009). Además, cuanto mayor sea la cadena lateral de las AHLs más estable es la molécula, de este modo las AHLs más largas son más estables a pHs alcalinos (Yates et al., 2002). Por tanto nuestras observaciones indicarían que las bacterias marinas podrían utilizar preferentemente señales AHLs de cadena lateral larga como moléculas con mayor fuente de carbono. A pesar de que los ensayos de degradación se realizaron en medio rico en nutrientes (CM) la degradación de AHLs parece expresarse constitutivamente en estos aislados, independientemente de la disponibilidad de otras fuentes de carbono. El principal objetivo del trabajo descrito en este capítulo fue determinar si las discrepancias encontradas entre el aislamiento de cepas con actividad QQ en muestras de comunidades microbianas densas de origen costero y la frecuencia de genes de QQ en metagenomas marinos se debía a diferencias en la significación ecológica de este proceso en distintos ambientes marinos o se derivaba de problemas metodológicos. Las muestras de agua de mar analizadas en este capítulo fueron similares a las utilizadas para la construcción de librerías metagenómicas, aunque se evitó el filtrado que se aplica en algunas de las muestras de metagenomas (0,1-0,8 μm) (Rusch et al., 2007), y por lo tanto se esperaba una menor actividad QQ en sus aislados que en los aislados de superficies costeras, por el bajo número de secuencias homólogas a acilasas y lactonasas halladas en metagenomas. Sin embargo, de nuevo la actividad registrada fue similar o incluso mayor que la obtenida para muestras de comunidades bacterianas densas, especialmente en las muestras de agua de mar abierto. Resultados y Discusión 98 Es por tanto más factible la segunda hipótesis enunciada en el capítulo anterior, que explicaría la discrepancia en la relevancia de los sistemas de QS y QQ en las bacterias marinas cultivables y las bases de datos de metagenomas marinos en base al número limitado de secuencias para enzimas productoras y degradadoras de AHLs disponibles. La mayoría de las sintetasas de AHL que han sido identificadas son homólogos de LuxI pertenecientes a α-, βy γ-Proteobacteria (Williams et al., 2007). La amplia variedad taxonómica de Proteobacterias marinas productoras de AHLs junto con el reciente descubrimiento de producción de AHLs por aislados marinos de Bacteroidetes (Huang et al., 2008; Romero et al., 2010, Anexo 2.2), apoyaría la existencia de una mayor diversidad de sintetasas y receptores de AHLs cuya presencia no sería revelada por el uso de las secuencias de luxI y luxR en las colecciones de metagenomas. El mismo problema se aplica para las secuencias de QQ, puesto que de los 4 puntos posibles de corte de la estructura de las AHL (Figura 7A, Dong y Zhang, 2005), únicamente se han descrito enzimas con actividad sobre dos de ellos, por lo que no se puede descartar que además de existir secuencias marinas con baja homología para las acilasas y lactonasas conocidas, existan otros tipos de enzimas todavía no descritos con estos tipos de actividad. Además existen diferentes familias de enzimas con un mismo tipo de actividad. Así, recientemente se ha clonado de R. erythropolis una nueva clase de lactonasa (Uroz et al., 2008), que no presenta homología con la familia de lactonasas bien caracterizadas que comparten un dominio de unión a Zn (HXDH~H~D) y están representadas por AiiA de Bacillus sp. (Dong et al., 2000). También han sido identificadas dos nuevas lactonasas en un estudio de metagenoma de suelo (Schipper et al., 2009). La baja homología existente entre las secuencias de las enzimas de QQ hace necesario disminuir los parámetros de restricción en las búsquedas para la obtención de secuencias en los genomas bacterianos secuenciados (Figura 18). La aplicación de estos mismos parámetros en la búsqueda en colecciones de metagenomas resulta en un importante incremento en la cantidad de secuencias con posible actividad acilasa o lactonasa disminuyéndose la discrepancia de resultados obtenidos con la actividad de las bacterias cultivables. El presente trabajo ha permitido la identificación de un total de 19 bacterias con actividad QQ pertenecientes a 10 nuevos géneros en los que esta actividad no había sido descrita con anterioridad, incluyendo una nueva especie de α-Proteobacteria (cepa 177) y Bacteroidetes (cepa Resultados y Discusión 99 139), lo que seguramente permitirá la identificación de nuevas secuencias de enzimas degradadores de AHLs. Otra explicación que todavía no puede ser totalmente descartada, debido a la utilización de muestras de agua de mar no filtradas en este capítulo, es que la metodología utilizada para la construcción de librerías metagenómicas excluye la materia particulada a la que se asocian numerosas bacterias. La asociación de los procesos de QS y QQ a comunidades bacterianas asociadas a materia particulada (Gram et al., 2002; Cicirelli et al., 2008; Hmelo y Van Mooy, 2009; Tait et al., 2009), excluida de los metagenomas, explicaría también la baja frecuencia de genes de QS y QQ observada en éstos. Un dato que apoya esta hipótesis es que la cepa 138E, con elevada actividad QQ sobre AHLs, obtenida en este trabajo se corresponda con Olleya marilimosa, Bacteroidete aislado originalmente de materia particulada del océano Antártico (Nichols et al., 2005). El océano es un ecosistema extremo debido a la baja concentración de nutrientes, ya que elementos como nitrógeno, fósforo y hierro están frecuentemente a concentraciones muy bajas o casi indetectables, lo que ocurre en el 70% de los océanos (Michaels et al., 1994). Estas condiciones limitan en gran medida la abundancia de bacterias en aguas oceánicas. La abundancia bacteriana en el océano es un tema controvertido debido a las discrepancias obtenidas dependiendo de las técnicas utilizadas. Mediante técnicas moleculares generalmente esta densidad se sitúa en 105 bacterias/mL en la superficie de los océanos (0-300m) (Ducklow, 2000), mientras que mediante cultivo con medios microbiológicos estándar únicamente el 0,1% de éstas son cultivables (Ferguson et al., 1984), lo que limita en gran medida las conclusiones ecológicas que se pueden obtener a partir de las bacterias cultivables obtenidas de muestras oceánicas. A pesar de esto, la utilización de técnicas de filogenia molecular, basadas en la similitud en las secuencias de genes como el del ARNr 16S (Pace et al., 1986; Woese, 1987) aplicadas a los análisis metagenómicos que secuencian de manera aleatoria porciones de los genomas presentes en la muestras y de este modo muestran la habilidades funcionales de los microorganismos de un determinado hábitat (Venter el al., 2004), han permitido estimar las abundancias relativas de las diferentes divisiones y phyla de los microorganismos en el océano. El phylum dominante de bacterias en muestras de océano, tanto en muestras cultivables como en los análisis metagenómicos, Resultados y Discusión 100 son las Proteobacterias (sobretodo - y -Proteobacterias) constituyendo aproximadamente el 60% de las secuencias de RNA 16S en colecciones de los metagenomas (Giovanonni y Stingl, 2005; Rusch et al., 2007). Otro grupo importante del bacterioplancton marino lo constituye el phylum Bacteroidetes que, de acuerdo con los análisis de hibridación de fluorescencia in situ (FISH), constituiría la mitad de las células del bacterioplancton potencialmente hibridadas en una muestra marina (Cottrell y Kirchman, 2000). Estos resultados contrastan con la baja frecuencia de clones pertenecientes a Bacteroidetes detectados en librerías de RNA 16S de muestras de océano. Se ha hipotetizado con que estas discrepancias se podrían deber a una desviación aparente contra este grupo por los cebadores utilizados habitualmente en la construcción de estas librerías (Weaver et al., 2003), sin embargo la relativa baja frecuencia de este phylum en estudios de colecciones metagenómicas realizados hasta la fecha sugiere que los análisis FISH no son completamente representativos (5-13% de miembros de Bacteroidetes; Giovanonni y Stingl, 2005; Rusch et al., 2007). Aunque los resultados de estudios con bacterias marinas cultivables deben tomarse con cautela y el bajo número de representantes con actividad QQ limita la generalización de estos resultados, la diversidad de bacterias obtenidas en este estudio no refleja los porcentajes de prevalencia de los distintos grupos derivados de las técnicas moleculares, ya que la mitad de los aislados seleccionados con actividad QQ de amplio espectro pertenecieron al phylum Bacteroidetes (Cepa 138E: Olleya marilimosa y Cepa 139: nueva especie próxima a Maribacter ulvicola) mientras que la prevalencia de este grupo en muestras oceánicas según librerías de secuencias de ARNr 16S es mucho menor. Se piensa que este grupo constituye uno de principales degradadores de materia orgánica del bacterioplancton (Riemann et al., 2000), por tanto es posible que entre la amplia variedad de estrategias degradadoras en este grupo, se incluya la utilización de señales AHL como fuente de energía adicional. Con la excepción del alto porcentaje de QQ obtenido para la muestra de F. vesiculosus, los resultados obtenidos en este trabajo parecen indicar que los fenómenos de QQ son más abundantes en aguas oceánicas. En espera del estudio taxonómico de las 82 cepas obtenidas de agua oceánica, los Bacteroidetes parecen ser el grupo predominante entre los aislados de aguas oceánicas con esta actividad y por tanto parece Resultados y Discusión 101 existir una menor diversidad taxonómica entre los aislados con actividad QQ de amplio espectro en el mar abierto respecto a muestras de superficies costeras. Resultados y Discusión 103 Capítulo 3. Caracterización de Tenacibaculum discolor 20J, una cepa marina con elevada actividad degradadora de AHLs 3.1 Resultados 3.1.1 Especificidad de la actividad quorum quenching De las cepas con actividad QQ identificadas en las muestras marinas, se seleccionó para un primer estudio de caracterización de la actividad la cepa Tenacibaculum discolor 20J, por ser un aislado con alta actividad degradadora sobre las cinco AHLs testadas inicialmente (C4, C6, C10, C12 y OC12-HSL), por su rápido crecimiento y por ser cultivable en medios marinos y terrestres. Por estas características esta cepa ha sido objeto de patente y actualmente se encuentra en fase de aprobación internacional (Anexo 2.3). Para esta cepa se determinó, mediante HPLC-MS en cultivos de mayor volumen (20 mL), el tipo de actividad QQ que presentaba y su capacidad de degradar todo el rango de AHLs de distinta longitud de cadena lateral de las que disponíamos en el laboratorio. Esta técnica analítica permite comprobar de forma inequívoca la degradación de las AHLs. Las señales ensayadas fueron: C4, C6, C8, C10, C12 y C14-HSL en concentración 50 M. Para C4 y C12-HSL se acidificaron los sobrenadantes para la detección de posible actividad lactonasa (Yates et al., 2002). Tras 24 horas T. discolor 20J eliminó totalmente todas las AHLs no sustituidas probadas demostrando por tanto poseer actividad degradadora altamente inespecífica (Figura 24). Como sucediera en cultivos de 1 mL (Figura 15), cuando se acidifican a pH 2 los sobrenadantes de cultivos de mayor volumen de T. discolor 20J se recupera aproximadamente la mitad de la concentración de la señal corta (Figura 24). Este resultado indica la posible presencia de una lactonasa responsable de, al menos, la mitad de la actividad degradadora sobre C4-HSL. En el caso de C12-HSL, no se pudo recuperar la molécula señal tras acidificación, por tanto la actividad enzimática de T. discolor 20J sobre AHLs largas no puede ser explicada por la presencia de una lactonasa, debiendo ser analizado mediante la técnica de dansilación si se trata de una acilasa (Uroz et al., 2005). Estos datos indican por tanto que el aislado 20J presenta Resultados y Discusión 110 mayores (40 kb) y que será expresada en E. coli DH5, para la que se ha puesto ya a punto la metodología para la detección de clones con actividad QQ. 3.1.6 Análisis de patogenicidad de Tenacibaculum discolor 20J Con el objetivo de determinar si la cepa 20J de T. discolor aislada en este trabajo podría tener aplicaciones biotecnológicas directas en el campo de la acuicultura se comprobó si era patógena para peces. Para ello se realizó una infección experimental de juveniles de rodaballo, mediante inoculación intraperitoneal de 100 L de suspensión bacteriana de T. discolor 20J en solución salina (109 células por mililitro). A pesar de la elevada concentración bacteriana utilizada para la inoculación de los peces no se registró mortalidad de los juveniles al cabo de 21 días por lo que se descarta la posibilidad de que esta cepa sea patógena para rodaballo en las condiciones ensayadas. Es necesario sin embargo comprobar la patogenicidad de esta cepa en otras especies y en condiciones de estrés, antes de pasar a comprobar la viabilidad de su utilización como probiótico en co-inoculaciones con patógenos. 3.1.7 Actividad quorum quenching en el género Tenacibaculum Adicionalmente se probaron otras cepas de distintas especies del género Tenacibaculum (Tabla 4) para determinar si presentaban actividad degradadora de AHLs. Se utilizaron los biosensores de C. violaceum CV026 para detectar actividad QQ sobre C6-HSL y C. violaceum VIR07 para C10-HSL. Se observó degradación completa de ambas señales tras 24 horas cuando se añadieron a cultivos de todas las especies de Tenacibaculum ensayadas, con la excepción de T. maritimum NCIMB 2154T, que no eliminó la señal corta (Figura 29A) (Anexo 2.2). Corroborando resultados anteriores que apoyaban la hipótesis de que la lactonasa responsable de degradación de AHLs cortas se encontraba en sobrenadantes, mientras que la enzima que actúa sobre largas se encuentraría unida a biomasa, la actividad QQ de T. maritimum sobre AHLs largas estaría asociada a la biomasa, debido a que no se observó una reducción significativa de actividad C10-HSL cuando la señal se añadió a sobrenadantes filtrados de la bacteria (Figura 29B). Resultados y Discusión 111 T. maritimum T. maritimum T. maritimum T. maritimum T. mari ti m um Sobrenadante Sobrenadante CM + C6-HSL CM + C6-HSL CM + C10-HSL CM + C10-HSL CM T. discolor 20J T. discolor DSM18842 T. maritimum T. l itoreum T. di sc olo r DSM18842 T. discolor 20J T. l itoreum C10-HSL C6-HSL A B CM Figura 29. Fotografías de ensayos de QQ en placa con los biosensores C. violaceum CV026 (izquierda) y VIR07 (derecha). A) Ensayo de degradación de C6 y C10-HSL por cultivos de 24 horas de T. maritimum NCIMB 2154T, T. discolor DSM 18842, T. discolor 20J y T. litoreum JCM13039. Como controles se añadieron 2 μg/mL (10 µM) de C6 ó C10-HSL en CM o directamente a pocillo. B) Ensayo de QQ en T. maritimum NCIMB 2154T y sobrenadante de un cultivo de 24 de T. maritimum NCIMB 2154T. Como controles se añadieron 2 μg/mL (10 µM) de C6 ó C10-HSL en CM o CM sin AHL. La realización del ensayo para determinar el tipo de actividad degradadora presente en T. maritimum NCIMB 2154T mediante análisis en HPLC-MS confirmó que la bacteria degradaba el 90% de la señal C10-HSL tras 24 horas de exposición, pero no Resultados y Discusión 112 se recuperó la señal tras acidificación del medio de cultivo, lo que descartaría una actividad tipo lactonasa en esta cepa (Figura 30). Figura 30. Cuantificación por HPLC-MS de C10-HSL tras 24 horas en FMM y FMM inoculado con T. maritimum NCIMB 2154T, en extractos de sobrenadantes de cultivo sin acidificación (barras verdes) o acidificados a pH 2 (barras rojas). Los datos están expresados como porcentaje de la concentración inicial de AHL (2 μg/mL=10 µM). 3.1.8 Detección e identificación de AHLs en el género Tenacibaculum y efecto de adición de C4-HSL en Tenacibaculum maritimum NCIMB 2154T Durante los ensayos de detección de QQ con las distintas cepas de especies pertenecientes al género Tenacibaculum se observaron halos tenues de activación de violaceína con el biosensor C. violaceum CV026 para sobrenadantes de T. maritimum NCIMB 2154T. Estos resultados podrían indicar la producción de AHLs por estos miembros de un género perteneciente al grupo Bacteroidetes, que constituye uno de los grupos dominantes de bacterias heterotróficas en los ambientes acuáticos. Esta observación significaba la primera descripción de la producción de AHLs por una noproteobacteria, ya que hasta ese momento las AHLs sólo habían sido identificadas en , 0 20 40 60 80 100 FM M T. maritimum % C10-HSL Resultados y Discusión 113  y -Proteobacterias. Además, en este caso, se trataba de una bacteria patógena del grupo Bacteroidetes. Con el objetivo de confirmar estos resultados preliminares obtenidos con C. violaceum CV026, se utilizaron también los tres biosensores de E. coli JM109 con mayor sensibilidad para la detección de amplio rango de tamaños de AHL. Para ello se analizaron sobrenadantes crudos (no extraídos orgánicamente) obteniéndose activación de E. coli JM109 pSB536 en luminómetro lo que indicaría la presencia de señales AHL de cadena corta en los sobrenadantes del cultivo (no se muestran los datos). Debido a que la activación de biosensores podría deberse a compuestos diferentes de señales tipo AHL presentes en los medios de cultivo de Tenacibaculum, se extrajeron orgánicamente muestras de mayor volumen (40 mL) de sobrenadantes de cultivo tomadas a 24 y 48 horas tras inoculación. De nuevo estos extractos se analizaron mediante luminómetro y TLC con las tres cepas biosensoras de E. coli JM109. Tabla 11. Activación de biosensor de AHLs cortas E. coli JM109 pSB536 por extractos orgánicos de sobrenadantes de cultivo de diferentes cepas del género Tenacibaculum recogidos después de 24 y 48 horas de cultivo. CEPA 24h 48h T. discolor 20J + ++ T. discolor DSM 18842 + ++ T. discolor LC073.2.2 + ++ T. discolor R016.8.1 + ++ T. gallaicum R006.0.1 + ++ T. gallaicum A37.1 + ++ T. litoreum JCM13039 + ++ T. maritimum NCBI 2154T + ++ T. maritimum NCIMB 2153 ++ + T. maritimum NCIMB 2158 ++ + T. maritimum ACC6.1 + ++ T. maritimum ACR104.1 +++ + T. maritimum LGH35-03 - +++ T. maritimum PC424.1 + ++ T. maritimum PC503.1 ++ +++ T. maritimum PC538.1 ++ + T. soleae LL0412.1.7 + ++ T. soleae 567/06.1 + ++ Resultados y Discusión 114 En ambos ensayos se confirmó activación con E. coli JM109 pSB536 tanto para las muestras de 24 como 48 horas para todas la cepas del género Tenacibaculum probadas, aunque con diferencias en el tiempo máximo de activación (Tabla 11). Figura 31. Detección de actividad AHL en extractos de medio de cultivo de 24 y 48 horas de T. maritimum NCIMB 2154T en ensayo con TLC. Las TLC fueron cubiertas con E. coli JM109 pSB536 y la luz emitida por el biosensor fue registrada mediante velado de placas de radiografía. Además, debido a que el ensayo con TLC permite una identificación parcial de la señal presente en los extractos por comparación de migración con la de AHLs sintéticas, se identificó el compuesto activador como una probable C4-HSL (Figura 31). Los análisis por HPLC-MS identificaron de manera inequívoca la presencia de C4-HSL en los extractos por comparación de los espectros de masas con los de la AHL sintética (Figuras 32 y 33). Estos análisis se realizaron en dos laboratorios con dos equipos diferentes y condiciones cromatográficas ligeramente distintas para ratificar la bondad de la identificación, debido a que se trataba de la primera descripción de Bacteroidetes patógenos como productores de señales AHL. C+ C4 HSL 48h 24h Resultados y Discusión 115 Figura 32. Cromatogramas de iones obtenidos a partir de transición 172.1 > 102.1 (C4-HSL) de MRM (Multiple Reaction Monitoring) de extractos de medio de cultivo de 48 horas de T. maritimum NCIMB 2154T en FMM, C4-HSL sintética y medio de cultivo FMM. T. maritimum NCIMB 2154T C4-HSL sintética FMM Resultados y Discusión 116 Intensity, cps m/z, amu Intensity, cps m/z, amu C4-HSL Sintética C4-HSL T. maritimum 2154 T Figura 33. Identificación de C4-HSL. Picos del espectro de masas obtenido para C4-HSL sintética y el correspondiente para extractos de medio de cultivo de T. maritimum NCIMB 2154T. Para estudiar el efecto del medio de cultivo en la producción de C4-HSL, se seleccionó la cepa T. maritimum NCIMB 2154T. Se cultivó la bacteria en FMM o CM y se tomaron muestras a diferentes tiempos tras inoculación para estudiar la producción de señal a lo largo de la curva de crecimiento mediante luminómetro con el biosensor E. coli JM109 pSB536. En ambos medios se detectó actividad C4-HSL, siendo las curvas de producción de la AHL bastante diferentes. Aunque el máximo de producción de señal detectado en ambos medios se situó a las 48 horas tras inóculo, éste fue más acusado en medio FMM, debido a que en el CM la producción de AHL ya fue elevada en muestras tempranas (Figura 34). También se obtuvo una curva de producción de C4HSL muy similar a partir de los mismos extractos de medio FMM en HPLC-MS (Figura 34) confirmando la validez de la metodología de cuantificación de señal mediante biosensor basado en lux. Resultados y Discusión 117 0 100 200 300 400 500 600 12 24 48 75 Millares T (h) RLU 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 ng/mL Figura 34. Curvas de producción de C4-HSL por T. maritimum NCIMB 2154T obtenidas a partir de extractos de cultivos en medio FMM o CM. Las cuantificaciones se realizaron en luminómetro con el biosensor E. coli JM109 pSB536 (unidades relativas de luz, RLU) o por HPLC-MS (ng/mL). C4-HSL en FMM (--; -●-), C4-HSL en CM (-□-). Se hipotetizó que la presencia de un pico de producción de C4-HSL a las 48 horas de cultivo de T. maritimum NCIMB 2154T podría estar relacionado con las características de crecimiento de esta especie. Inicialmente Tenacibaculum maritimum crece en hilos y agregados formando biopelícula en las paredes y fondo de los matraces y tras 48 horas de cultivo pasa de manera abrupta al medio creciendo de manera densa (Figura 35), una característica de maduración de biopelículas que ha sido correlacionada con procesos de QS. Sin embargo esta característica no fue observada para ninguna de las restantes especies del género Tenacibaculum estudiadas a pesar de producir también C4-HSL. Para determinar de modo sencillo si existía algún control por QS de la formación de biopelícula en esta bacteria se añadió C4-HSL en concentración: 1, 2,5, 5 ó 10 g/mL a matraces de FMM o CM inoculado con T. maritimum NCIMB 2154T. De modo interesante, todas las concentraciones de C4-HSL empleadas redujeron de manera significativa la formación de biopelícula, observable tras tinción con cristal violeta, en comparación con el control (Figura 36). Resultados y Discusión 118 Figura 35. Biopelícula de un cultivo de 24 horas de T. maritimum NCIMB 2154T en FMM incubado a 22ºC y 110 rpm. Figura 36. Fotografía mostrando biopelículas de T. maritimum NCIMB 2154T teñidas con cristal violeta adheridas a matraces. En las imágenes se observa la menor producción de biopelícula en medio FMM a 22ºC y 110 rpm con adición externa de 10 g/mL C4-HSL (derecha) con respecto a controles sin adición de C4-HSL (izquierda). CONTROL + C4-HSL Resultados y Discusión 119 Debido que con anterioridad otros autores trataron sin éxito de detectar la presencia de AHLs en medios de cultivo de otros Bacteroidetes, extrayendo a partir de medio sólido de diferentes cepas de Flavobacterium psychrophilum (Bruhn et al., 2005), se utilizó la misma metodología para intentar detectar C4-HSL en FMM sólido y AM de T. maritimum NCIMB 2154T y Flavobacterium psychrophilum PT4.1 cultivado en Anacker y Ordal agar. Los extractos obtenidos se analizaron por luminómetro con los biosensores de E coli JM109, observándose activación para E. coli JM109 pSB536 en extractos de T. maritimum NCIMB 2154T, mientras que los extractos de Flavobacterium psychrophilum PT4.1 activaron el biosensor de señales largas E. coli JM109 pSB1075 (No se muestran los datos). Rodaballo Muestra C4-HSL (nmol/Kg) Recuperación de bacteria Sangre 0,00 - Bazo 0,00 - Riñón 0,00 - No infectado (n=10) Hígado 0,00 - Sangre 0,46 + Bazo 1,12 + Riñón 0,49 + Asintomático (n=8) Hígado 0,37 + Sangre 0,00 + Bazo 0,29 + Riñón 0,04 + Moribundo (n=18) Hígado 0,09 + Sangre 0,00 - Bazo 1,84 + Riñón 0,09 + Muerto (n=8) Hígado 1,40 + Tabla 12. Concentraciones de C4-HSL presentes en tejidos de peces infectados con T. discolor DSM 18842 y recuperación de la bacteria. Resultados obtenidos en colaboración con el laboratorio de la Prof. Ysabel Santos. Resultados y Discusión 126 patogénesis en la tenacibaculosis. Los niveles de producción de AHL observados en los peces también se encuentran dentro de los rangos normales de producción descritos para otros patógenos (Buch et al., 2003). El sistema de QS en T. maritimum también podría controlar el modo de crecimiento en esta especie ya que la adicción externa de C4-HSL inhibió la formación de biopelícula característica de esta especie (Figuras 35 y 36). Un comportamiento similar ya había sido observado en el patógeno de humanos V. cholerae. Este enteropatógeno comienza la producción de biopelícula inmediatamente tras la adhesión y fijación a una superficie y únicamente bloquea la producción de exopolisacárido cuando se alcanza una alta densidad que implica el umbral de QS de la bacteria. La síntesis de exopolisacárido está controlada por el gen vps, cuya expresión puede ser regulada por el homólogo de LuxR en V. cholerae, HapR, que lo reprime (Heithoff y Mahan, 2004). Se habían publicado con anterioridad algunos resultados contradictorios a cerca de la producción de AHLs en el género Flavobacterium, también perteneciente al grupo Bacteroidetes. Mientras que había sido detectada actividad tipo AHL en un aislado planctónico de Flavobacterium sp., usando el biosensor E. coli MT102 con el plásmido pJBA132 basado en lux y portador de luxR de V. fischeri como sensor de AHLs, la presencia de AHLs no pudo ser demostrada por metodología GC-MS (Wagner-Döbler et al., 2005). Tampoco se detectó producción de AHLs en F. psychrophilum utilizando los biosensores C. violaceum CV026 y Agrobacterium tumefaciens NT1 (Bruhn et al., 2005). En el presente trabajo se detectó AHL cuando se analizaron extractos de F. psychrophilum con el biosensor de AHLs largas E. coli JM109 pSB1075. Las diferencias en las observaciones están, probablemente, relacionadas con la metodología de ensayo y los biosensores utilizados. En nuestra experiencia, los resultados basados en evaluación directa de medios de cultivo de bacterias marinas, frecuentemente CM, deben de ser interpretados con precaución ya que la composición de este medio de cultivo podría inhibir el crecimiento o emisión de bioluminiscencia de estos biosensores, que son fundamentalmente de origen terrestre. Además, como ha sido demostrado en este trabajo, existe influencia de los medios de cultivo sobre el perfil de producción de las AHLs (Figura 32). Otros factores también influyen en la detección de las AHLs, como el pH de los cultivos o la temperatura y podrían explicar que las AHLs no hayan sido detectadas por otros autores en este grupo (Yates et al., 2002). Por otro Resultados y Discusión 127 lado, debido a la capacidad de diferentes compuestos de activar los biosensores de AHLs (Holden et al., 1999), los resultados positivos deben ser confirmados por métodos analíticos. Aunque los procesos fisiológicos bajo control de QS en Tenacibaculum deben ser investigados en mayor profundidad, la producción de C4-HSL en este género junto con la reciente detección de AHLs en aislados de biopelícula marina pertenecientes a Bacteroidetes (Huang et al., 2008), extiende el paradigma de sistemas de QS mediado por AHLs más allá de Proteobacterias. Debido a que los procesos controlados por señales de tipo AHL habían sido descritos únicamente en un número limitado de géneros de α-, βy γ-Proteobacterias, muchos de ellos patógenos (Williams et al., 2007), la significación ecológica de los sistemas de QS había sido cuestionada como un factor clave de regulación de la expresión génica dentro de las poblaciones bacterianas en la naturaleza (Manefield y Turner, 2002). El hecho de que géneros fuera de Proteobacteria produzcan las mismas moléculas señal, y que existan mecanismos de degradación en bacterias Gram-positivas, Gram-negativas, Cianobacterias (Dong y Zhang, 2005; Romero et al., 2008), Bacteroidetes (Romero et al., 2010) y células de mamífero (Chun et al., 2004); refuerza la importancia ecológica de los procesos de QS mediados por AHL. La existencia de AHLs fuera de Proteobacterias no es un resultado sorprendente ya que un estudio filogenético de los genes luxI y luxR sugirió que los mecanismos de QS se establecieron muy pronto en la evolución bacteriana, aunque la transferencia horizontal pudo haber jugado un papel importante en la distribución de estos genes (Lerat y Moran, 2004). Por tanto la clonación de los genes responsables de la síntesis y detección de C4-HSL en el género Tenacibaculum aportará sin duda nueva información para entender la historia evolutiva del QS. Por primera vez ha sido demostrada simultáneamente en miembros del grupo Bacteroidetes, la producción de AHL y presencia de actividad QQ, incluidos representantes patógenos. Debido a la importancia ecológica de este clúster, especialmente en el ambiente marino, el descubrimiento de procesos de QS mediados por AHL en sus miembros permitirá avanzar en la comprensión de las interacciones microbianas en estos complejos ecosistemas. Además, los fenómenos de comunicación bacteriana deberán ser considerados en otros hábitats en los que los Bacteroidetes Resultados y Discusión 128 también juegan un papel importante, como la flora intestinal o la placa dental. En el caso de las cepas patógenas, el descubrimiento de estos procesos abre una nueva vía para el tratamiento de estas enfermedades. CONCLUSIONES/CONCLUSIONS Conclusiones/Conclusions 131 1) El quorum quenching (QQ) podría ser una actividad de elevada prevalencia en el medio marino entre las bacterias cultivables, como demuestra la elevada frecuencia de aislados con capacidad de degradación enzimática de señales de quorum sensing (QS) tipo AHL, obtenidos tanto de comunidades bacterianas costeras como de muestras de agua de mar. De un total de 630 bacterias aisladas, 109 presentaban actividad enzimática degradadora al menos sobre una de las AHLs probadas, lo que representa un 17,3% del total de los aislados analizados, porcentaje casi un orden de magnitud más elevado que el descrito para aislados de suelo. 2) Sólo ha sido posible identificar un aislado capaz de antagonizar la actividad AHL sin degradarla, aunque esta actividad debe ser todavía caracterizada. Sin embargo, la elevada concentración de AHL utilizada en los bioensayos para la detección de actividad QQ no permite concluir que la producción de inhibidores de procesos de QS mediados por AHLs sea un proceso poco común en el medio marino. 3) El medio de cultivo y la temperatura no afectan al número de bacterias aisladas con actividad QQ, mientras que el origen de la muestra afecta fuertemente a la actividad, siendo mayor en el alga Fucus vesiculosus (39,4% de especies activas) y en muestras de alta mar a 0 y 10 metros de profundidad (27,7 y 21,7% respectivamente). Parece existir una correlación negativa entre el número de UFCs/mL y el porcentaje de cepas con actividad QQ en las muestras analizadas. 4) Se han identificado 19 aislados capaces de degradar un amplio espectro de AHLs, 15 de ellos de comunidades bacterianas densas y 4 de agua de mar, en su mayoría pertenecientes a géneros estrictamente marinos. Además de ser más frecuentes, los aislados con actividad QQ de amplio espectro presentaron una mayor variabilidad taxonómica entre los aislados de comunidades bacterianas costeras, perteneciendo a 10 géneros encuadrados en los phyla α-; γ-Proteobacteria (6, incluyendo una nueva especie próxima a Phaeobacter); Actinobacteria (1); Firmicutes (2) y Bacteroidetes (1). Los aislados de agua de mar pertenecieron a -Proteobacteria (1) y Bacteroidetes (2), incluyendo una nueva especie próxima a Maribacter. Conclusiones/Conclusions 132 5) Existe una fuerte discrepancia entre el número de aislados con actividad QQ en aguas marinas y la frecuencia de las secuencias homólogas a enzimas de QQ conocidos en metagenomas del medio marino. Esta discrepancia puede ser atribuida a la baja homología existente entre secuencias de enzimas de QQ, a la existencia de actividades enzimáticas todavía no descritas y/o a la metodología utilizada para la construcción de librerías metagenómicas, que excluiría las bacterias asociadas a materia particulada. 6) La caracterización de la actividad QQ del aislado 20J, obtenido de la muestra de sedimento de tanque de cultivo de peces e identificado como Tenacibaculum discolor (99% ID), revela que esta cepa presenta dos tipos de actividad de tipo enzimático, siendo una de ellas una lactonasa que se excreta al medio de cultivo. La enzima lactonasa es más activa sobre AHLs de cadena corta. Esta actividad QQ de amplio espectro sobre AHLs está conservada en las especies del género Tenacibaculum, con la excepción de T. maritimum NCIMB 2154T que únicamente degrada AHLs largas. 7) Miembros del género Tenacibaculum, pertenecientes al phylum Bacteroidetes, producen C4-HSL. Esta AHL podría controlar el modo de crecimiento en biopelícula de T. maritimum NCIMB 2154T y puede ser detectada in vivo en el patógeno T. discolor DSM 18842. Conclusiones/Conclusions 133 1) Quorum quenching (QQ) could be a common activity among cultivable marine bacteria, as demonstrated by the high frequency of AHL-signals degradation activity found among coastal and open ocean marine bacteria isolates. Out of 630 bacterial isolates, 109 were confirmed as being able to enzymatically degrade at least one of the AHLs tested, which represents a 17.3% of the analysed isolates. This percentage is almost an order of magnitude higher than that reported for soil bacteria isolates. 2) Only one of the selected isolates was able to antagonize the AHL activity without enzymatic degradation, although this activity is still to be characterized. Nevertheless, the high concentration of AHL used in the bioassays for the detection of QQ activity does not allow to categorically conclude that the production of inhibitors of AHL mediated QS processes is not a common process in the marine environment. 3) The culture media and temperature had no effect on the number of QQ active bacteria. On the contrary, a strong effect of the origin of the sample was found, being higher for Fucus vesiculosus surface sample (39.4%) and in open ocean samples of 0 and 10 meters depth (27.7 and 21.7% respectively). A negative correlation among number of CFUs and percentage of QQ strains seems to be present in the analysed samples. 4) 19 new marine isolates capable of degrading a wide-spectrum of AHLs were identified from dense marine communities (15) and sea-water (4), almost all of them belonging to strictly marine genera. Besides being more frequent, wide-spectrum QQ isolates from coastal bacterial communities presented a higher taxonomic diversity, belonging to 10 genera located within the phyla α-; γ-Proteobacteria (6, including a new species close to Phaeobacter); Actinobacteria (1); Firmicutes (2) and Bacteroidetes (1). Sea-water isolates belonged to the -Proteobacteria (1) and Bacteroidetes (2), including a new species related with Maribacter. 5) A strong discrepancy was observed in the number of marine isolates with QQ activity and the frequency of sequences homologous to known QQ enzymes found in marine metagenomic collections. This discrepancy could be explained on the basis of the low Conclusiones/Conclusions 134 homology among QQ enzymes sequences, the existence of unknown enzymatic activities and/or the methodology used for the construction of metagenomic libraries, which excludes bacteria associated to marine particulated-matter. 6) The characterization of the QQ activity in the strain 20J, isolated from the sediment of a fish tank and identified Tenacibaculum discolor (99% ID), revealed that this strain has two different enzymatic activities, one of them being a lactonase which is secreted into the media. The lactonase enzyme is more active against short chain AHLs. The wide QQ activity against AHLs is conserved among species of the genus Tenacibaculum, except for T. maritimum NCIMB 2154T that only degrades long chain AHLs. 7) Members of the genus Tenacibaculum, belonging to the phylum Bacteroidetes, produce C4-HSL. This AHL could be involved in controlling the mode of growth of T. maritimum NCIMB 2154T biofilm and could also be detected in vivo in the pathogenic strain T. discolor DSM 18842. RESUMEN/SUMMARY Anexos/Annexes 239 RESEARCH LETTER Acylhomoserine lactone production and degradation by the ¢sh pathogen Tenacibaculum maritimum , a member ofthe Cytophaga^Flavobacterium^Bacteroides (CFB) group Manuel Romero 1 , Rub´ en Avenda ˜ no-Herrera 1 , Beatriz Magari ˜ nos 1 , Miguel C ´ amara 2 & Ana Otero 1 1 Departamento de Microbiolog´ ıa, Facultad de Biolog´ ıa-CIBUS, Universidad de Santiago de Compostela, Santiago, Spain; and 2 School of Molecular Medical Sciences, Centre for Biomolecular Sciences, University Park, University of Nottingham, Nottingham, UK Correspondence: Ana Otero, Departamento de Microbiolog´ ıa, Facultad de Biolog´ ıa-CIBUS, Universidad de Santiago de Compostela, 15782 Santiago, Spain. Tel.: 134 98 156 3100, ext. 16967; fax: 134 98 159 2210; e-mail: [email protected] Present address:Rub´ en Avenda ˜ no-Herrera, Departamento de ciencias biol ´ ogicas, Facultad de ciencias biol ´ ogicas, Universidad de Andr´ es Bello, Santiago, Chile. Received 29 September 2009; revised 9 December 2009; accepted 15 December 2009. Final version published online February 2010. DOI:10.1111/j.1574-6968.2009.01889.x Editor: Craig Shoemaker Keywords quorum sensing; quorum quenching; acylhomoserine lactone; Cytophaga–Flavobacterium–Bacteroides . Abstract Tenacibaculum maritimum (formerly Flexibacter maritimus) is a filamentous, biofilm-forming member of the Cytophaga–Flavobacterium–Bacteroides group (or Bacteroidetes), which causes the widely distributed marine fish disease tenacibaculosis. A search for N-acylhomoserine lactones (AHLs) quorum-sensing (QS) signals in the culture media of nine representative strains of this species using different biosensor strains revealed the presence of short-type AHL activity in all of them. N-butyrylL-homoserine lactone (C4-HSL) was identified in T. maritimum NCIMB2154 T by LC-MS. A degradation activity for long-acyl AHLs (C10-HSL) was subsequently demonstrated in T. maritimum NCIMB2154 T . The acidification of the culture medium after degradation did not allow the recovery of C10-HSL, which indicates a possible acylase-type degradation activity. Even though the physiological processes under the control of AHL-mediated QS in T. maritimum need to be further characterized, this discovery extends the paradigm of AHLmediated QS signalling beyond the Proteobacteria and reinforces its ecological significance. Introduction Many bacterial species coordinate responses to environmental changes using complex cell–cell communication mechanisms in a cell-density-dependent manner. This phenomenon is known as quorum sensing (QS) and relies on the accumulation of signal molecules in the surrounding environment to threshold concentrations at which target structural genes are activated (Williams et al., 2007). Several communication systems exist that use different signal molecules, also known as autoinducers (Waters & Bassler, 2005; Williams et al., 2007). In Gram-negative bacteria, the most intensively studied QS systems rely on the use of Nacylhomoserine lactones (AHLs), a family of signal molecules differing in the length and substituents of the acyl chain. The use of these molecules as QS signals has been well established, and their role in the control of important physiological processes such as bioluminescence, biofilm formation, plasmid conjugation, production of exoenzymes and virulence factors, swarming, etc., has been shown in a number of Proteobacteria, including several important animal and plant pathogens (Williams et al., 2007). The production of AHLs has so far been limited to a few genera within the Proteobacteria (Williams et al., 2007), which has raised questions with regard to the ecological significance of these molecules (Manefield & Turner, 2002). Outside Proteobacteria, the production of AHLs has been recently demonstrated for the colonial cyanobacterium Gloeothece PCC6909 and for several strains of Bacterioidetes isolated from marine biofilms, although the physiological processes under the control of the QS system were not completely elucidated (Sharif et al., 2008; Huang et al., 2009). AHL-like FEMS Microbiol Lett 304 (2010) 131–139 c2010 Federation of European Microbiological Societies Published by Blackwell Publishing Ltd. All rights reserved MICROBIOLOGY LETTERS Anexos/Annexes 240 activity was also found in the haloalkalophilic archaeon Natronococcus occultus (Paggi et al., 2003), but the biochemical nature of the signal has not been confirmed. Short-chain AHL-type activity was also found in Flavobacterium sp., a member of the Cytophaga–Flavobacterium–Bacteroides (CFB) cluster, but the presence of AHL could not be confirmed by GC-MS (Wagner-D¨ obler et al., 2005). QS seems to be of special significance in the marine environment. AHL signal molecules are produced by more than half of the marine Alphaproteobacteria isolated from various marine habitats (Wagner-D¨ obler et al., 2005). Moreover, the production of AHLs is common among marine and fish pathogenic Proteobacteria (Bruhn et al., 2005; Wagner-D¨ obler et al., 2005), controlling the expression of key virulence factors (Defoirdt et al., 2005). Because of the prevalence of QS systems among these pathogens, the inhibition of these processes has been proposed as an alternative to the use of antibiotics in aquaculture (Defoirdt et al., 2004). The inhibition of AHL-mediated QS processes was first described in the marine alga Delisea pulchra (Givskov et al., 1996) and has now been described in several eukaryotes and bacteria of terrestrial origin (reviewed by Dong & Zhang, 2005). The isolation and characterization of marine bacterial strains capable of inhibiting QS, a process known as quorum quenching (QQ), either enzymatically or through the production of inhibitors or antagonists may help to develop new biotechnological tools. Several results indicate the viability of this approach for the treatment of infections in aquaculture (Rasch et al., 2004). The marine bacteria Tenacibaculum maritimum (formerly Flexibacter maritimus) (Suzuki et al., 2001) is a filamentous member of the CFB group causing the fish ‘gliding bacterial disease’ or tenacibaculosis/flexibacteriosis (Avenda˜ no-Herrera et al., 2004). Tenacibaculum maritimum belongs to the CFB cluster, which is also known as Bacteroidetes (Ludwig & Klenk, 2001), and constitutes one of the dominant heterotrophic bacterial groups in aquatic habitats. The fact that T. maritimum shifts abruptly from a biofilm to a planktonic mode of growth, a characteristic that could be related to a QS-controlled process (Rice et al., 2005; Wagner-D¨ obler et al., 2005), led us to investigate the possible production and degradation of AHLs by this fish pathogen. Materials and methods Strains and culture conditions The T. maritimum strains NCIMB2154 T , NCIMB2153 and NCIMB2158 were obtained from The National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria Ltd (Aberdeen, UK). In addition, six strains isolated in our laboratory from fish farm disease outbreaks from Spain and Portugal were used. These strains belong to the main serotypes and clonal lineages described within this pathogen (Table 1) (Avenda˜ no-Herrera et al., 2004, 2006), and were confirmed as T. maritimum by PCR-based analysis (Toyama et al., 1996). The strains were routinely cultured at 20 1ConF. maritimus medium (FMM) agar or broth (Pazos et al., 1996) and on marine broth (MB, Difco) for some of the experiments. Liquid cultures were inoculated with a 10% volume of a 24-h liquid culture and maintained in a shaker at 100 r.p.m. Cultures were double-checked for purity on Marine Agar (Difco) and FMM before and after each experiment. Three lux-based Escherichia coli JM109 AHL biosensor strains that respond to AHLs with different side chain lengths were used for the detection of AHL production (Swift et al., 1997; Winson et al., 1998). The biosensor strains were grown at 37 1C in Luria–Bertani (LB) broth or agar supplemented with the adequate antibiotics. Table 1. AHL activity in acidified culture media extracted with dichloromethane (1 : 1 v/v) of nine different isolates of Tenacibaculum maritimum as detected by TLC using the lux-based reporter strain Escherichia coli JM109 pSB536 (specific for short-length AHLs) Bacterial isolate Host species Origin Serotype  AHL activity (sensor Escherichia coli pSB536) 24 h 48 h NCIMB2154 T Pagrus major Japan O1/O2 (O2) 111 NCIMB2158 Solea solea UK O2 11 1 ACR104.1 Scophthalmus maximus Spain O2 111 1 PC424.1 Scophthalmus maximus Spain O2 111 NCIMB2153 Acanthopagrus schlegeli Japan O1/O2 (O1) 11 1 PC503.1 Solea senegalensis Spain O1 11 111 PC538.1 Sparus aurata Spain O1 11 1 LgH35-O3 Solea senegalensis Spain O3 111 ACC6.1 Scophthalmus maximus Portugal O3 111 Samples were extracted 24 and 48 h after inoculation. Activity was evaluated in comparison with the intensity of the spots obtained for the type strain Tenacibaculum maritimum NCIMB2154 T (Fig. 1).  Serotypes follow the typing schema of Avenda ˜ no-Herrera et al. (2006). FEMS Microbiol Lett 304 (2010) 131–139 c2010 Federation of European Microbiological Societies Published by Blackwell Publishing Ltd. All rights reserved 132 M. Romero et al. Anexos/Annexes 241 Additionally, the AHL biosensor strains Chromobacterium violaceum CV026 (McClean et al., 1997) and C. violaceum VIR07 (Morohoshi et al., 2008) were used for the AHLdegradation assays in solid plates as explained below (McClean et al., 1997). These strains were routinely cultured on LB medium supplemented with kanamycin (50 mgmL 1 ) at 30 1C. Sampling and AHL extraction Samples (100 mL) from cultures of nine different strains of T. maritimum grown in liquid FMM were obtained 24 and 48 h after inoculation, acidified to pH 2 with HCl 1 M in a shaker at 200 r.p.m. for 12 h at 20 1C, to ensure the absence of any AHL lactonolysis products, and extracted with dichloromethane as described previously (Yates et al., 2002). Dried extracts were reconstituted in 1 mL ethyl acetate and stored at 20 1C until further analysis. Thin-layer chromatography (TLC) detection assays of extracted samples Two microlitres of the ethyl acetate extracts obtained from the spent culture media were run on reversed-phase hydrocarbon-impregnated C18 silica gel plates using methanol : water 60 : 40 v/v as the mobile phase (Shaw et al., 1997). Two microlitres of synthetic AHLs (Sigma, stock concentration 50 mgmL 1 ) were run as controls: N-octanoylL -homoserine lactone (C8-HSL) for E. coli JM109 pSB401, N-butyrylL - homoserine lactone (C4-HSL) for E. coli JM109 pSB536 and N-dodecanoylL -homoserine lactone (C12-HSL) for E. coli JM109 pSB1075 (Winson et al., 1998). Plates were dried and overlaid with 3 mL of semi-solid LB medium (8% agar) inoculated with 30 mL of an overnight culture of the corresponding sensor strain. Plates were incubated at 37 1C and every hour, radiographic plates were laid over them to detect the emission of bioluminescence. LC-MS AHL identification LC-MS analyses were carried out simultaneously in the laboratories in Nottingham and Santiago using different equipment and slightly different conditions to confirm the presence of AHLs unequivocally. In Nottingham, a Shimadzu series 10AD VP equipped with binary pumps, a vacuum degasser and an SIL-HTc autosampler and column oven (Shimadzu, River Drive, MD) was used as the LC system. As column a Phenomenex Gemini C18, 150 2mm (5mm particle size), at 45 1C was used. The mobile phase was built by 0.1% formic acid in water (A) and 0.1% formic acid in acetonitrile (B). The flow rate was 0.45 mL min 1 . The elution conditions were as follows: 1 min 0% B, linear gradient to 50% B for 0.5 min and then a linear gradient from 50% to 90% B over 4 min, then 2.5 min 99% B over 2 min, then ramped back to the starting conditions in 0.2 min. The column was re-equilibrated for a total of 4 min. Samples were redissolved in 50 mL acetonitrile before use and a 10-mL volume was injected onto the column (Ortori et al., 2007). Parallel analyses were carried out using an HPLC 1100 series (Agilent, Santa Clara, CA) equipped with a C8 precolumn (2.1 12.5 mm, 5 mm particle size) and a ZORBAX Eclipse XDB-C18 2.1 150 mm (5 mm particle size) column. Temperature and mobile phases were the same as above, but the flow rate was set at 0.22 mL min 1 . In this equipment, the elution conditions were as follows: 0 min 35% B, linear gradient to 60% B in 10 min and then a linear gradient from 60% to 95% B over 5 min, then 5 min 95% B and then in 1 min, ramped back to the starting conditions in 9 min. The column was reequilibrated for a total of 5 min. A 2-mL volume was injected onto the column. The MS experiments shown were conducted in Santiago on an API 4000 triple-quadrupole mass spectrometer (Applied Biosystems, Foster City, CA) equipped with a TurboIon source using positive ion electrospray, multiple reaction monitoring (MRM) mode. The MRM signals were used to generate relative quantification information and to trigger subsequent quality product ion spectra (product ion PI, MS2). The conditions for the generation of the MRMtriggered spectra were as follows: DP ramped from 35 to 57, CE 14-28, CXP 8. Analyses were confirmed on a 4000 QTRAP hybrid triple-quadrupole linear ion trap mass spectrometer (Applied Biosystems) equipped with a TurboIon source used in positive ion electrospray, MRM mode. In this case, the conditions for the generation of the MRMtriggered spectra were as follows: DP ramped from 25 to 50, CE 15-45, CXP 12. AHL with or without a 3-oxo or a 3-hydroxy substitution andwithanacylsidechainlengthof4(C4-HSL,3-oxo-C4HSL and 3-hydroxy-C4-HSL), 6 (C6-HSL, 3-oxo-C6-HSL and 3-176 hydroxy-C6HSL), 7 (C7-HSL), 8 (C8-HSL, 3-oxo-C8HSL and 3-hydroxy-C8-HSL), 10 (C10-HSL, 3-oxo-C10-HSL and 3-hydroxy-C10-HSL), 12 (C12-HSL, 3-oxo-C12-HSL and 3-hydroxy-C12-HSL), 13 (C13-HSL, 3-oxo-C13-HSL and 3hydroxy-C13-HSL) or 14 (C14-HSL, 3-oxo-C14-HSL and 3hydroxy-C14-HSL) were used as standards. Acyl-HSLs were identified and confirmed by comparing both the elution time and the spectra from any peaks obtained with those of the standards. AHL-degradation activity assay Chromobacterium violaceum-based solid plate assays (McClean et al., 1997) were carried out to detect AHL degradation activity in T. maritimum NCIMB2154 T .Two different sensor strains were used to detect AHL degradation. Chromobacterium violaceum CV026 (McClean et al., FEMS Microbiol Lett 304 (2010) 131–139 c2010 Federation of European Microbiological Societies Published by Blackwell Publishing Ltd. All rights reserved 133Quorum sensing in Tenacibaculum maritimum Anexos/Annexes 242 1997) was used to measure the degradation of C6-HSL and C. violaceum VIR07 was used to measure the degradation of C10-HSL (Morohoshi et al., 2008). Twenty microlitres of stock solutions of C6-HSL or C10-HSL were added to 500 mL of an overnight culture of T. maritimum NCIMB2154 T in MB (final concentration 2 mgmL 1 ) and incubated for 24 h at 20 1C. The same amount of AHL was added to 500 mL of spent culture medium obtained from a 24-h-old culture by filtration through 0.22 mm. The amount of remaining AHL in the culture media of T. maritimum was evaluated in LB plates overlaid with 5 mL of semi-solid LB agar seeded with 500 mL of overnight cultures of C. violaceum CV026 for C6-HSL or C. violaceum VIR07 for C10HSL. Fifty microlitres of culture supernatants were loaded in wells and adjusted to 100 mL with distilled water. Sterile MB and MB plus C4 or C10-SHLs were set as controls. The same experiment was carried out in FMM broth (data not shown). Plates were incubated for 12–24 h and the production of violacein was examined. To evaluate the possible type of AHL degradation activity, two flasks with 15 mL of FMM were supplemented with C10-HSL to a final concentration of 2 mgmL 1 . One of them was inoculated with 1 mL of a 48-h culture of T. maritimum NCIMB2154 T and the other was maintained as control. Flasks were incubated in a shaker at 22 1C under soft agitation (110 r.p.m.). After 24 h, 500 mL of normal and acidified culture media were extracted three times with ethyl acetate, dehumidified onto MgSO 4 , evaporated under nitrogen flux and resuspended in acetonitrile for LC-MS analysis as described above. Before inoculation, 500 mLof FMM1C10-HSL were also extracted and the value of C10HSL obtained was used to calculate the percentage of degradation. Results and discussion The presence of AHLs was investigated in ethyl-acetate extracts of acidified culture media of the type strain T. maritimum NCIMB2154 T obtained at 24 and 48 h using the three E. coli JM109 lux-based biosensor strains carrying pSB536, pSB401 or pSB1075 to detect a wide range of AHLs differing in the length of their acyl chain. TLC analysis revealed the presence of short-chain AHLs using the E. coli JM109 pSB536 biosensor (Fig. 1). A search for AHL-type QS signals in extracts obtained from the culture media of another eight representative isolates of T. maritimum using the same technique revealed the presence of short-chain AHL activity in all of them, although differences were recorded in relation to their peak in activity (Table 1). LC-MS analysis confirmed the presence of N-butyrylL -homoserine lactone (C4-HSL) in the culture media of T. maritimum NCIMB2154 T grown in both FMM (Fig. 2) and MB (data not shown). This AHL was unequivocally identified by comparison of its mass spectra with those of pure standards (Fig. 3). As this is the first description of the production of AHLs by a pathogenic member of the CFB cluster, the analyses were carried out simultaneously in both laboratories using different chromatographic conditions. The results confirmed unequivocally the presence of the C4-HSL. So far, no physiological role other than as QS signals has been assigned to AHLs, except as a chelator, for tetramic acid (a derivative of 3-oxo-C12) or antibiotic activity for both 3-oxo-C12-HSL and tetramic acid (Kaufmann et al., 2005; Schertzer et al., 2009). In addition, a role as biosurfactant has been attributed to long-chain AHLs (Daniels et al., 2006). Therefore, even though the physiological features under the control of these molecules in T. maritimum remain to be investigated, the production of C4-HSL by T. maritimum strains extends the paradigm of AHL-mediated QS beyond the Proteobacteria. As the physiological processes under the control of AHL-mediated QS have so far been described for a limited number of genera of the Alpha-, Betaand Gammaproteobacteria, many of them human or plant pathogens (Williams et al., 2007), the ecological significance of AHL-mediated QS has been questioned as a key switch controlling gene expression within bacterial populations in nature (Manefield & Turner, 2002). The fact C+ C4 HSL 48h 24h Fig. 1. Detection of AHL activity in the culture media of Tenacibaculum maritimum NCIMB2154 T with the TLC assay. TLCs of ethyl acetate extracts of acidified culture media obtained after 24 and 48 h were covered with the lux-based sensor strains, followed by exposure to X-ray films. Positive results were obtained with the sensor strain Escherichia coli JM109 pSB536, specific for the detection of short-length AHLs. Control (C1): C4-HSL. FEMS Microbiol Lett 304 (2010) 131–139 c 2010 Federation of European Microbiological Societies Published by Blackwell Publishing Ltd. All rights reserved 134 M. Romero et al. Anexos/Annexes 243 that genera outside the Proteobacteria produce the same signal molecules, and that AHL-degrading activity has been found in Gram-positive, Gram-negative and Cyanobacteria (Dong & Zhang, 2005; Romero et al., 2008) and in mammalian cells (Chun et al., 2004), reinforces the ecological significance of AHL-mediated QS processes. The presence of AHL-mediated QS beyond the Proteobacteria is not surprising, as a phylogenetic study based on the LuxI/LuxR genes suggested that QS mechanisms were established very early in the evolution of bacteria, although horizontal transfer may have also played an important role in the distribution of QS genes, at least within this group (Lerat & Moran, 2004). The cloning of genes responsible for the synthesis and detection of AHLs in T. maritimum will undoubtedly provide new insights into the evolutionary history of QS. The production of AHLs was demonstrated for all isolates of T. maritimum analysed (Table 1), therefore being a conserved trait within this species, which is not the case in some other marine pathogens such as Aeromonas salmonicida (Bruhn et al., 2005). Some contradictory results have been published previously regarding the production of AHLs by the genus Flavobacterium belonging to the Bacteroidetes group. While AHL-like activity was detected in a planktonic isolate of Flavobacterium sp. using E. coli MT102 carrying the biosensor plasmid pJBA132 based on the luxR gene from Vibrio fischeri, the presence of AHLs could not be demonstrated by GC-MS (Wagner-D¨ obler et al., 2005). Furthermore, no AHL activity was found in different pathogenic strains of Flavobacterium psychrophilum using the sensor strains C. violaceum CV026 and Agrobacterium tumefaciens NT1 (Bruhn et al., 2005). The differences in the Intensity, cps Intensity, cpsIntensity, cps 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0 2.6e5 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0 4.09 0.11 12345678 87654321 0.99 1.12 1.28 1.80 3.60 1.47 1.54 2.24 2.40 1234 3.53 3.82 4.29 4.37 4.65 5 5.38 678 Time, min Time, min Time, min T. maritimum 2154 48h Sample Blank FMM C4-HSL Standard 3.54 4.67 5.28 3.22 3.23 1.66 1.02 3.28 2.61 Fig. 2. Extraction ion chromatograms of the MRM transition 172.1 4102.1 (C4 HSL) of extracts of acidified culture media of Tenacibaculum maritimum NCIMB2154 T (48-h sample), C4-HSL standard and FMM broth. FEMS Microbiol Lett 304 (2010) 131–139 c2010 Federation of European Microbiological Societies Published by Blackwell Publishing Ltd. All rights reserved 135Quorum sensing in Tenacibaculum maritimum Anexos/Annexes 244 AHL activity described probably depend on the assay conditions and the sensor strain utilized. In our experience, data based on the direct evaluation of culture media of marine bacteria, usually MB, should be interpreted with caution, as the media composition could result in inhibition of growth or bioluminescence production by the sensor strain (unpublished data). On the other hand, due to the ability of different compounds to activate the AHL biosensors (Holden et al., 1999), the results should be viewed with caution unless the presence of AHLs can be confirmed by analytical chemical methods. On the basis of our results and as the detection of the QS activity is strongly dependent on the biosensor strain used and on the culture conditions, it is possible that AHL-based QS systems are more widespread than described so far (Wagner-D¨ obler et al., 2005). An in vivo degradation assay was carried out using two biosensor strains of C. violaceum.Chromobacterium violaceum CV026 was used to detect degradation of short AHLs (C6-HSL), and C. violaceum VIR07 was used to detect degradation of long AHLs (C10-HSL). Complete degradation of C10-HSL was observed after 24 h, but no changes in C6-HSL activity were observed (Fig. 4a). The activity should 1.30e6 1.20e6 1.10e6 1.00e6 9.00e5 8.00e5 7.00e5 6.00e5 5.00e5 4.00e5 3.00e5 2.00e5 1.00e5 43.1 74.1 90.0 102.1 108.1 113.0 110.2 126.0 131.0 134.9 144.1149.0 154.1 172.1 50 60 70 80 90 110 120 130 140 170 m/z, amu C4-HSL standard 1.10e6 1.00e6 8.00e5 9.00e5 7.00e5 1.00e5 6.00e5 5.00e5 4.00e5 3.00e5 2.00e5 57.2 71.0 60.2 84.9 89.9 100.2 102.1 112.1 126.0 130.9 131.8 130.1 142.2 144.1 148.9 154.1 155.1 172.1 40 50 60 70 80 90 100 120 140 150 160 170 C4-HSL T. maritimum 2154 24 h m/z, (amu) Intensity, cpsIntensity, cps 180 130 150 160 180100 40 56.4 71.0 85.0 84.1 103.0 43.1 74.0 70.2 95.0 113.1 116.1 110 (a) (b) Fig. 3. Product ion spectrum of synthetic C4-HSL (a) and the corresponding peak (b) in the chromatograms of extracts of spent culture medium of Tenacibaculum maritimum NCIMB2154 T . 0 20 40 60 80 100 FMM % C10-HSL (a) (b) T. maritimum Supernatant + C10-HSL MB MB +C6-HSL T. maritimum + C6-HSL T. maritimum + C10-HSL Surpernatant + C6-HSL MB +C10-HSL MB Fig. 4. Agar plate assay for the detection of AHL degradation activity in Tenacibaculum maritimum NCIMB2154 T . (a) Complete degradation of C10-HSL (right) and no degradation of C6-HSL (left) was found after 24 h of exposure. The degradation of C10-HSL was monitored using Chromobacterium violaceum VIR07 (right), and the degradation of C6-HSL was monitored using the biosensor strain C. violaceum CV026 (left). As negative controls, AHL incubated in culture media were used (central wells). (b) HPLC quantitation of C10-HSL after 24 h in FMM and FMM inoculated with T. maritimum NCIMB2154 T . Spent culture media (open bars) and acidified spent culture media (grey bars) were extracted. Data are expressed as the percentage of the initial C10-HSL concentration (2 mgmL 1 ). FEMS Microbiol Lett 304 (2010) 131–139 c 2010 Federation of European Microbiological Societies Published by Blackwell Publishing Ltd. All rights reserved 136 M. Romero et al. Anexos/Annexes 245 be cell bound, as no significant degradation was obtained when the C10-HSL was added to cell-free spent culture medium (Fig. 2a). HPLC analysis of the degradation of C10HSL revealed that 90% of the AHL was degraded after 24 h of exposition to T. maritimum cultures, and no recovery of the AHL could be achieved by medium acidification, which may discard a lactonase-type degrading enzyme (Fig. 4b). Further analyses are required to confirm an acylase-type activity. The presence of AHL degradation enzymes has been described in Gram-negative bacteria, possibly as a mechanism to outcompete Gram-positive neighbours (Roche et al., 2004). In Gram negatives, these enzymes can be used for the self-modulation of the level of the signals as already found in A. tumefaciens (Zhang et al., 2002). In the case of the bacteroidete T. maritimum, the presence of a QQ enzyme for long AHLs may represent an exclusion mechanism to interfere with the QS systems of competitors (Dong & Zhang, 2005). Evidence is beginning to accumulate indicating that QS and QS inhibition processes, including enzymatic degradation of the signal or QQ, are important in the marine environment. Besides the well-characterized phenomenon of the production of furanones by the red alga D. pulchra to avoid surface colonization by Gram-negative biofilm formers (Givskov et al., 1996), QS systems mediated by AHLs have been found in many species of marine pathogenic bacteria (Bruhn et al., 2005). AHLs also seem to play an important role in the eukaryotic–prokaryotic interactions in the marine environment, as demonstrated by the importance of the production of AHLs by marine biofilms for the surface selection and permanent attachment of zoospores of the green alga Ulva (Tait et al., 2005), for spore release of the red alga Acrochaetium sp. (Weinberger et al., 2007), and for some initial larval settlement behaviours in the polychaete Hydroides elegans (Huang et al., 2007). As most of the isolates involved in algal morphogenesis belong to the CFB group (Hanzawa et al., 1998; Matsuo et al., 2003), the discovery of the production and degradation of AHLs by members of this group provides the possibility of new interactions between bacteria and eukaryotes in the marine environment. For the first time, the production of AHL-type QS signals and QQ activity has been demonstrated simultaneously in a pathogenic member of the CFB group. Because of the ecological significance of the Cytophaga–Flavobacterium cluster, especially in the marine environment, the discovery of AHL-mediated QS processes among their members will advance our understanding of the microbial interactions in complex ecosystems. Moreover, cell-to-cell communication phenomena should be reconsidered in other habitats in which the Bacteroidetes play an important role, such as intestinal flora or dental plaque. As QS controls the expression of important virulence factors in many pathogenic bacteria, the disruption of QS mechanisms in T. maritimum and other fish pathogenic bacteria may represent a new strategy for the treatment of infections in aquaculture. Acknowledgements This work was financed by a grant from Conseller´ ıa de Innovaci´ on e Industria, Xunta de Galicia, Spain (PGIDIT06PXIB200045PR). M.R. is supported by an FPU fellowship from the Spanish Ministry of Science and Education. We would like to thank Noemi Ladra (University of Santiago) and Catherine Ortori (University of Nottingham) for LC-MS analysis. The sensor Chromobacterium violaceum VIR07 was kindly provided by Prof. T. Morohoshi. References Avenda˜ no-Herrera R, Magari˜ nos B, L´ opez-Romalde S, Romalde JL & Toranzo AE (2004) Phenotyphic characterization and description of two major O-serotypes in Tenacibaculum maritimum strains from marine fishes. Dis Aquat Organ 58: 1–8. Avenda˜ no-Herrera R, Toranzo AE & Magari˜ nos B (2006) Tenacibaculosis infection in marine fish caused by Tenacibaculum maritimum: a review. Dis Aquat Organ 71: 255–266. Bruhn JB, Dalsgaard I, Nielsen KF, Buchholtz C, Larsen JL & Gram L (2005) Quorum sensing signal molecules (acylated homoserine lactones) in Gram-negative fish pathogenic bacteria. Dis Aquat Organ 65: 43–52. Chun CK, Ozer EA, Welsh MJ, Zabner J & Greenberg EP (2004) Inactivation of a Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal by human airway epithelia. 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All rights reserved 139Quorum sensing in Tenacibaculum maritimum Anexos/Annexes 254 Anexos/Annexes 255 Anexos/Annexes 256 Anexos/Annexes 257 Anexos/Annexes 258 Anexos/Annexes 259 Anexos/Annexes 260 Anexos/Annexes 261 Anexos/Annexes 262 Anexos/Annexes 263 Anexos/Annexes 270 Anexos/Annexes 271 Anexos/Annexes 272 Anexos/Annexes 273 Anexos/Annexes 274 Anexos/Annexes 275 Anexos/Annexes 276 Anexos/Annexes 277 Anexos/Annexes 278 Anexos/Annexes 279 Anexos/Annexes 286 Anexos/Annexes 287 Anexos/Annexes 288 Anexos/Annexes 289 Anexos/Annexes 290 Anexos/Annexes 291 Anexos/Annexes 292 Anexos/Annexes 293 Anexos/Annexes 294 Anexos/Annexes 295 2.4 Solicitud de patente nacional P201030892 Anexos/Annexes 302  Uso de una nueva Į-Proteobacteria para Quorum Quenching La presente invención se encuentra dentro de la biología, la biología molecular, y la acuicultura, y específicamente se refiere a una nueva Į-Proteobacteria capaz de degradar N-acil-homoserín lactonas (AHLs) para el control de  enfermedades infecciosas bacterianas, y para evitar la formación de biofilms. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR Numerosas especies bacterianas usan un mecanismo de regulación genética  coordinada para responder a cambios en el entorno. Este mecanismo conocido como “quorum sensing” (QS) consiste en la producción y liberación de moléculas señal al medio donde se acumulan controlando la expresión de múltiples genes (Fuqua et al., 1994. J Bacteriol 176: 269-275). Mediante la comunicación por QS las poblaciones bacterianas pueden coordinarse para  ejecutar importantes funciones biológicas, muchas de ellas implicadas en la virulencia de importantes patógenos, como: movilidad, “swarming”, agregación, luminiscencia, biosíntesis de antibióticos, factores de virulencia, simbiosis, formación y diferenciación de biofilms, transferencia de plásmidos por conjugación,… (Williams et al., 2007. Phil Trans R Soc B 362: 1119-1134).  Las señales de QS más estudiadas y conocidas son las N-acil-homoserin lactonas (AHLs) empleadas por numerosas bacterias Gram-negativas (Williams et al., 2007. Phil Trans R Soc B 362: 1119-1134). Las AHLs, también conocidas como autoinducers (AIs), son una familia de moléculas señales usadas en el  sistema de QS de muchas bacterias, principalmente Gram negativas, que se basan en un anillo lactona con una cadena lateral acilo de tamaño variable entre 4 y 14 carbonos, con o sin saturación y con o sin sustituciones Oxoo Hidroxien el tercer carbono (Whitehead et al., 2001. FEMS Microbiol Rev 25: 365-404). Como las poblaciones de especies bacterianas coordinadas por QS  obtienen importantes ventajas competitivas en sus múltiples interacciones con otros procariotas y eucariotas, sus competidores han desarrollado mecanismos Anexos/Annexes 303  para interferir con su comunicación por sistemas QS, a estos mecanismos se les conoce como “quorum quenching” (QQ). Existen dos tipos principales de mecanismos de QQ: un primer tipo se basa en la producción de moléculas inhibidoras/antogonistas que mimetizan las AHLs bloqueando o desestabilizando el receptor, como las furanonas producidas por el alga marina  Delisea pulchra (Givskov et al., 1996. J Bacteriol 178: 6618-6622). Otra estrategia para bloquear los sistemas de QS mediados por AHLs es la degradación enzimática de las moléculas señal. Hasta el momento, se han descrito dos tipos principales de enzimas que llevan a cabo esta degradación: las lactonasas que hidrolizan el anillo lactona y las acilasas que rompen el  enlace entre el anillo lactona y la cadena lateral (Dong et al., 2007, Phil Trans R Soc B 362: 1201-1211). La actividad acilasa ha sido descrita en Pseudomonas aeruginosa PAO1, Ralstonia sp., Streptomyces sp., Rhodococcus erythropolis, Anabaena sp. PCC 7120, Shewanella sp. y Variovorax paradoxus (Leadbetter and Greenberg, 2000, J Bacteriol 182: 6921-6926; Lin et al., 2003, Mol  Microbiol 47: 849-860; Park et al., 2005, Appl Environ Microbiol 71: 2632-2641; Uroz et al., 2005, Microbiol 151: 3313-3322; Huang et al., 2006, Appl Environ Microbiol 72: 1190-1197; Sio et al., 2006, Infect Immun 74: 1673-1682; Romero et al., 2008, FEMS Microbiol Lett 280: 73-80), mientras que la actividad lactonasa ha sido identificada en distintas cepas de los géneros Bacillus,  Arthrobacter sp. y Rhodococcus, pero también está presente en algunos Gram negativos como Klebsiella y Agrobacterium (Dong and Zhang, 2005. J Microbiol 43: 101-109; Dong et al., 2007, Phil Trans R Soc B 362: 1201-1211). Aunque la síntesis de quimioterápicos artificiales y el descubrimiento y mejora  de los antibióticos han supuesto en el siglo pasado una auténtica revolución médica en el tratamiento de enfermedades infecciosas, el desarrollo de resistencia a antibióticos por parte de algunas bacterias patógenas es un grave problema mundial, que obliga a la industria farmacéutica a desarrollar nuevas generaciones de antibióticos más potentes, y que puede originar cepas  multirresistentes en las que el tratamiento es más largo y con frecuencia ineficaz, llegando incluso a la muerte del paciente. La presión selectiva que se Anexos/Annexes 304  ejerce en el ambiente microbiano, el estado inmunitario del hospedero, los microambientes bacterianos y factores propios de las bacterias involucradas, tienen un papel importante en el desarrollo de la resistencia. Es por lo tanto un objetivo prioritario para la industria farmacéutica el desarrollo de nuevas estrategias para el tratamiento de las infecciones bacterianas.  Puesto que muchas bacterias usan el sistema de señales de QS para sincronizar la expresión genética y coordinar su actividad biológica dentro de una población, controlando la virulencia y la formación de biofilms entre otras funciones biológicas, una vía para evitar el aumento de mecanismos de  resistencia de las bacterias patógenas (que en muchas ocasiones dificultan el adecuado tratamiento clínico, llegando incluso a la muerte del paciente) sería controlar estos sistemas de señales QS mediante QQ. La posibilidad de utilización de la inhibición del quorum sensing para el tratamiento de enfermedades bacterianas ha sido revisada con anterioridad (Stephenson et  al., 2004. Curr Med Chem 11:765-773; Hentzer et al., 2003. BioDrugs 17:241250; Hentzer et al., 2003. J Clin Invest 112:1300-1307; Lyon et al., 2003. Chem Biol 10:1007-1021). Debido a que gran cantidad de patógenos humanos (p. e.: Pseudomonas putida, Serratia spp.,…), de plantas (p. e.: Agrobacterium spp., Erwinia carotovora,…) y patógenos marinos (p. e.: Aeromonas salmonicida,  Vibrio anguillarum,…) (Williams et al., 2007. Phil Trans R Soc B 362: 11191134; Bruhn et al., 2005. Dis Aquat Org 65: 43-52) emplean AHLs para el control de la producción de factores de virulencia, la interferencia con estos sistemas de comunicación constituye una interesante y prometedora vía para el control de enfermedades infecciosas bacterianas (Dong & Zhang. 2005. J  Microbiol 43: 101-109; Dong et al., 2007. Phil Trans R Soc B 362: 1201-1211). Una de las actividades bacterianas de mayor importancia clínica y ecológica en la que intervienen los procesos de “quorum sensing” es la formación de biofilms, que requiere la producción, por parte de los microorganismos, de  estas moléculas señal difusibles (Nadell et al., 2008. PLoS Biol 6(1): e14. doi:10.1371/journal.pbio.0060014). Anexos/Annexes 305  Los biofilms son películas biológicas que se desarrollan y persisten en las superficies, y que suelen ser estables y difíciles de eliminar debido a la naturaleza protectora de la matriz de polisacárido en la que están embebidos los microorganismos. Pueden definirse como una población bacteriana encerrada dentro de una matriz de polisacárido que se adhiere a las  superficies. Se encuentran generalmente en las superficies de los equipamientos industriales que procesan o transportan líquidos, o en las superficies adyacentes a tales equipamientos. A menudo se encuentran en la superficie de los implantes médicos o en los dispositivos insertados en el organismo. También se pueden formar en áreas del cuerpo que están  expuestas al aire; en particular en heridas y en la pleura. Uno de los biofilms biológicos que presenta mayor complejidad y de mayor relevancia clínica es la placa dental. Los medicamentos convencionales, como por ejemplo, los antibióticos, son  poco eficaces en infecciones que cursan a través de la formación de biofilms, debido a las barreras de difusión o al estado metabólico de los microorganismos en el biofilm. Por tanto, mecanismos de interferencia del QS, es decir el QQ, solos o en  combinación con antibióticos, constituyen una estrategia interesante en la inhibición de la formación de biofilms así como en el tratamiento de enfermedades infecciosas por patógenos multirresistentes, como Pseudomonas aeruginosa, en la que está descrito el control de QS sobre mecanismos de virulencia (Venturi, 2006. FEMS Microbiol Rev 30: 274-291) y  otros patógenos de humanos, animales y plantas. Pseudomonas aeruginosa es una de las bacterias más infectivas y problemáticas, al formar biofilms difícilmente tratables con antibióticos convencionales. En pacientes con fibrosis quística coloniza los pulmones causando infecciones que son difíciles de tratar y a menudo, finalmente fatales. También es especialmente interesante para  pacientes con heridas crónicas o con quemaduras. Anexos/Annexes 306  Por tanto, este mecanismo puede ser interesante para el tratamiento de muchas enfermedades bacterianas, y existe bastante literatura sobre este tema (March & Bentley, 2004. Current Opinion in Biotechnology 15:495–502; Stephenson et al., 2004. Curr Med Chem 11:765-773; Hentzer et al., 2003. BioDrugs 17:241-250; Hentzer et al., 2003. J Clin Invest 112:1300-1307; Lyon  et al., 2003. Chem Biol 10:1007-1021). Por ejemplo, se ha visto que puede ser útil en el tratamiento de enfermedades, tanto en los animales como en las plantas, provocadas por los géneros Staphylococcus, Pseudomonas, Borrelia, Salmonella, Burkholderia, Ceratocystis, Serratia, Chromobacterium, Pectobacterium, Erwinia, Agrobacterium, o por otras enterobacterias (además  de Pseudomonas). Además, el interés de las estrategias de QQ para el tratamiento de enfermedades infecciosas es que, al no afectar directamente a la supervivencia del patógeno sino a la expresión de los factores de virulencia, no ejercen  presión selectiva evitando la aparición de resistencias. Por esta razón, este tipo de estrategia ha sido denominada “antiinfectivos” o “antipatogénicos” en contraste con los “antibióticos” o “antibacterianos” cuyo objetivo es la muerte celular.  A pesar de que los procesos de QS y de QQ se descubrieron en organismos marinos (Nealson et al., 1970.  J Bacteriol 104: 313-322; Givskov et al., 1996. J Bacteriol 178: 6618-6622) se ha prestado poca atención a su significado ecológico en el ambiente marino. La producción de AHLs es común entre las bacterias patógenas de peces marinos, incluyendo Aeromonas salmonicida,  Yersinia ruckeri, Vibrio salmonicida, Aeromonas hydrophila, Vibrio vulnificus, Vibrio harveyi, o Vibrio anguillarum (Freeman & Bassler, 1999. Mol Microbiol 31: 665-677; Croxatto et al., 2002. J Bacteriol 184: 1617-1629; Buch et al., 2003. Syst Appl Microbiol 26: 338-349; Kim et al., 2003. Mol Microbiol 48: 16471664; Bruhn et al., 2005. Dis Aquat Org 65: 43-52). Por ello, la posibilidad de  emplear los inhibidores de QS para controlar la infección se ha propuesto como una alternativa al uso de antibióticos en acuicultura  (Defoirdt et al., 2004. Anexos/Annexes 307  Aquaculture 240: 69-88), y la viabilidad de la utilización de esta estrategia ha sido ya demostrada (Rasch et al., 2004.System Appl Microbiol 27: 350-359; Tinh et al., 2008. FEMS Microbiol Ecol 62: 45-  53). DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN  La presente invención se refiere a una cepa de una nueva especie de ĮProteobacteria afín al género Phaeobacter, que es capaz de degradar las NAcil-homoserin lactonas (AHLs), las cuales no pueden ser recuperadas significativamente por acidificación, indicando una actividad enzimática  diferente a la lactonasa. Por tanto, el empleo de esta bacteria es útil para controlar las infecciones bacterianas, sin ejercer presión selectiva sobre las poblaciones de las bacterias patógenas y evitando así la aparición de resistencias. También permite la inhibición de otros procesos de colonización bacteriana en los que están implicadas las señales de “quorum sensing” o QS  tipo AHL, como la formación de biofilms. Por tanto, un aspecto de la invención se refiere a una cepa de células bacterianas de Į-Proteobacteria depositada el 21 de mayo de 2010 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de depósito CECT  7733, de ahora en adelante “cepa de la invención” o “cepa 177”. Dicha cepa pertenece al filo de las Į-Proteobacteria afín al género Phaeobacter. Esta cepa de la invención crece, preferiblemente, en caldo o agar marino, más preferiblemente a una temperatura de 22ºC y aun más preferiblemente durante 24 horas. La secuencia de polinucleótidos de la región ribosómica 16S de dicha  cepa de la invención se recoge parcialmente en la SEQ ID NO: 1.  Cualquier bacteria regula su expresión génica en respuesta a diferentes señales medioambientales, una propiedad esencial para competir con otros organismos. En el caso particular de bacterias patógenas, la regulación génica  es crucial para permitir la supervivencia de la bacteria en el particular ambiente que le ofrece su hospedador. Los genes de virulencia bacterianos están sujetos Anexos/Annexes 308  a complejos mecanismos de regulación para asegurar la expresión del gen apropiado en el momento apropiado. Las AHLs son las señales de QS más estudiadas y conocidas, y como se ha dicho son empleadas por multitud de bacterias patógenas humanas, de plantas y marinas para el control de la producción de factores de virulencia.  Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de una célula bacteriana cuya región 16S del ARNr presenta una identidad de al menos un 96% con la secuencia polinucleotídica recogida en la SEQ ID NO: 1, respecto a la longitud completa de la SEQ ID NO: 1, de ahora en adelante “célula  bacteriana de la invención”, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para degradar N-Acil homoserin lactonas y provocar quorum quenching. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la región 16S del ARNr de la célula bacteriana de la invención presenta una identidad de al menos un 97%, más  preferiblemente de un 98%, y aún más preferiblemente, de un 99% con la secuencia polinucleotídica recogida en la SEQ ID NO: 1, respecto a la longitud completa de la SEQ ID NO: 1. En una realización particular de este aspecto de la invención, la región 16S del ARNr de la célula bacteriana de la invención presenta la secuencia polinucleotídica recogida en la SEQ ID NO: 1, más  preferiblemente, la célula bacteriana de la invención es la cepa de la invención. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa de la invención, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para provocar quorum quenching.  En la presente invención se entiende por “quorum quenching” o “QQ” el mecanismo mediante el cual se interfiere la comunicación microbiana, preferiblemente de bacterias patógenas, mediada por señales basadas en un sistema quorum sensing o QS. Este mecanismo QQ afecta negativamente a,  por ejemplo, aunque sin limitarnos, la expresión de factores de virulencia de la población microbiana sin provocar la muerte celular. Anexos/Annexes 309  Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula bacteriana de la invención, preferiblemente, de la cepa de la invención, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, los cuales son capaces de degradar N-Acil homoserin lactonas y, por tanto, de interferir con el sistema de señales de QS de bacterias, para la elaboración de  un medicamento. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula bacteriana de la invención, preferiblemente, de la cepa de la invención, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas bacterianas.  La producción de AHLs es común entre las bacterias patógenas de peces marinos, incluyendo, pero sin limitarse, a Aeromonas salmonicida, Yersinia ruckeri, Vibrio salmonicida, Aeromonas hydrophila, Vibrio vulnificus, Vibrio harveyi, o Vibrio anguillarum, (Freeman & Bassler, 1999. Mol Microbiol 31: 665- 677 ; Croxatto et al., 2002. J Bacteriol 184: 1617-1629; Buch et al., 2003. Syst Appl Microbiol 26: 338-349; Kim et al., 2003. Mol Microbiol 48: 1647-1664; Bruhn et al., 2005. Dis Aquat Org 65: 43-52). Por ello, la posibilidad de emplear los inhibidores de QS para controlar la infección se ha propuesto como una alternativa al uso de antibióticos en acuicultura  (Defoirdt et al., 2004.  Aquaculture 240: 69-88), y su viabilidad ya ha sido demostrada (Rasch et al., 2004.System Appl Microbiol 27: 350-359; Tinh et al., 2008. FEMS Microbiol Ecol 62: 45-  53). Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la  enfermedad infecciosa bacteriana la padece un animal acuático. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, las enfermedades infecciosas bacterianas son provocadas por bacterias productoras de AHLs. En esta memoria se entiende por “animal acuático” cualquier animal que viva en el agua, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, peces, moluscos o  crustáceos. Anexos/Annexes 310  Los “biofilms” o “biopelículas”, tal y como se definen en esta memoria, son comunidades de microorganismos que crecen embebidos en una matriz de exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o un tejido vivo. Es una comunidad de bacterias (de una única especie o varias), que se adhiere a una superficie sólida. La inhibición de las AHLs permite inhibir la formación de  biopelículas formadas por procesos controlados por QS. Los biofilms producen una gran cantidad de polisacáridos extracelulares, responsables de la apariencia viscosa, y se caracterizan por una gran resistencia a agentes antibióticos. Esta resistencia puede deberse a que la  matriz extracelular en la que se encuentran embebidas las bacterias proporciona una barrera frente a la penetración de biocidas. Otra posibilidad es que la mayoría de las células del biofilm crecen muy lentamente, en un estado de privación de comida, por lo que no son susceptibles al efecto de los agentes antimicrobianos. Un tercer aspecto podría ser que las células en el biofilm  adoptasen un fenotipo distinto, por ejemplo, mediante la expresión de bombas efluentes de fármacos. La contaminación biológica de superficies es común, pudiendo desarrollarse el biofilm sobre superficies hidrófobas, hidrófilas, bióticas o abióticas, y conduce a  la degradación del material, productos de contaminación, bloqueo mecánico e impedancia de la transferencia de calor en procesos acuáticos. Los biofilms son también la primera causa de la contaminación biológica de sistemas de distribución de agua potable, y otras conducciones, siendo especialmente importante el control de biofilms en los sistemas antiincendios. El  establecimiento de bacterias adheridas a los alimentos o a las superficies en contacto con los alimentos, conlleva serios problemas higiénicos e incluso casos de toxiinfecciones alimentarias, así como numerosas pérdidas económicas por los productos que se llegan a desechar (Carpentier & Cerf, 1993. J App Bacter. 75:499-511).  En acuicultura tiene especial relevancia la formación de biofilm en estructuras Anexos/Annexes 311  sumergidas tales como jaulas, redes o contenedores; o equipamientos tales como cañerías, bombas, filtros y tanques colectores, y para especies de cultivo, como mejillones, vieiras, ostras, etc. Se conoce como biofouling y afecta a todos los sectores de la acuicultura europea, siendo un problema creciente debido a la aplicación de la Directiva de Productos Biocidas EC 98/8/EC,  resultando en sustanciales pérdidas económicas. Tiene además, repercusiones ecológicas importantes porque los organismos acuáticos que se afianzan a los cascos de los barcos como consecuencia del biofouling acompañan a estos navíos a donde quiera que vayan. Esto ha significado un problema ecológico mundial, ya que los barcos están trasladando especies invasoras hacia los  lagos, los ríos y los océanos que no son su hábitat original. Así, la fabricación de pinturas anti-incrustaciones con células bacterianas de la invención, preferiblemente, con la cepa de la invención, el extracto celular crudo o el sobrenadante de sus cultivos, reduciría el biofouling en los cascos  pintados con ella, sin tener elementos químicos tóxicos para la vida marina. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula bacteriana de la invención, preferiblemente, de la cepa de la invención, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones,  para inhibir la formación de biofilms. Existen numerosas evidencias epidemiológicas que relacionan los biofilms con distintos procesos infecciosos en humanos, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, los recogidos en la tabla 1 (Wilson, 2001. Sci Prog 84: 235-254;  Costerton et al., 1999. Science, 284: 1318-1322). Los mecanismos por los que el biofilm produce los síntomas de la enfermedad todavía no están completamente establecidos, pero se ha sugerido que las bacterias del biofilm pueden producir endotoxinas, se pueden liberar grupos de bacterias al torrente sanguíneo, se vuelven resistentes a la acción fagocitaria de las células del  sistema inmune y por otro lado, constituyen un nicho para la aparición de bacterias resistentes a los tratamientos antibióticos. Este último aspecto puede Anexos/Annexes 318  funcionamiento normal y supervivencia del huésped, por lo que se califica al microorganismo como patógeno. Por “categoría taxonómica” se entiende el nivel de jerarquía utilizado para la clasificación de los organismos.  El término “polinucleótido", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan aquí de manera intercambiable y se refieren exclusivamente a la estructura  primaria de la molécula. El término “homología”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la semejanza entre dos estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más concretamente, a la semejanza entre los nucleótidos de dos o más  polinucleótidos. El término “identidad”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos idénticos entre dos polinucleótidos homólogos que se comparan.  El término “fenotipo”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la suma total de las propiedades estructurales y funcionales observables de un organismo; producto de la interacción entre el genotipo y el medio ambiente.  El medio de cultivo empleado para el crecimiento de las células bacterianas de la invención, y preferiblemente de la cepa de la invención, puede ser cualquier medio conocido en el estado del arte. Preferiblemente el medio contiene los componentes que comprenden el medioambiente de donde se coge la muestra. Por ejemplo, el medio de cultivo de bacterias marinas comprende  preferiblemente sales marinas. El soporte sólido para crecer colonias aisladas individuales puede ser agar, agar noble, Gel-Rite o cualquier otro medio sólido Anexos/Annexes 319  conocido en el estado del arte. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas  y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.  DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1. Foto del ensayo en medio sólido para detectar cepas marinas QQ con los biosensores para AHL C. violaceum CV026 (A) y C. violaceum VIR07 (B). Las cepas de QQ positivas (177, 168 y 20J) degradaron ambas  AHLs (10 μM) tras 24 horas, eliminando la producción de violaceína comparada con el control (pocillo central). Se empleó una cepa de Vibrio anguillarum como control negativo. Fig. 2. Foto de un ensayo en medio sólido para la detección de actividad  QQ sobre OC12-HSL con el bisensor E. coli JM109 pSB1075. Las cepas capaces de degradar la AHL tras 24 horas impiden la producción de luz por el biosensor. El pocillo central se corresponde con el control de AHL (10 ȝM), los pocillos a la izquierda se corresponden con aislados negativos para degradación de OC12-HSL.  Fig. 3. Análisis por HPLC-MS de degradación de C4-HSL y C12-HSL en el medio de cultivo de los 15 aislados QQ positivos tras 24 horas. La concentración inicial de AHL era de 50 μM. Los sobrenadantes fueron acidificados hasta pH 2 para permitir la recuperación del anillo de lactona. CM:  caldo marino. Anexos/Annexes 320  Fig. 4. Árbol Neighbour-joining mostrando las relaciones entre los aislados bacterianos de los ejemplos de la invención (rombos oscuros) y las especies con lactonasas (círculos blancos) y acilasas (círculos oscuros) conocidas y cepas con actividad QQ conocida de las que no se ha caracterizado la actividad enzimática (rombos blancos) basada en el  gen de 16S ADNr. El número tras cada nombre taxonómico es el número de acceso para la secuencia génica correspondiente. Se muestran los valores de Bootstrap por encima del 50% del análisis neighbour-joining. Barra: 0,02 sustituciones por posición de nucleótido.  EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad de la cepa de la invención para degradar N-Acil homoserin lactonas. Estos ejemplos  se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.  Metodología de aislamiento de las cepas bacterianas marinas Para la detección de bacterias marinas con actividad quorum quenching (QQ) de señales tipo AHL se procedió al aislamiento de colonias procedentes de muestras de diferentes medios marinos.  Se tomaron tres tipos de muestras con material estéril: -Muestra de sedimento de un tanque-reservorio de agua de mar de un circuito cerrado para el cultivo de peces de la Universidad de Santiago de Compostela. -Muestra de biopelícula de un tanque de cemento para el cultivo marino  de peces en circuito abierto del instituto IGAFA (Isla de Arosa). -Muestra de alga Fucus vesiculosus obtenida de un sustrato rocoso Anexos/Annexes 321  intermareal en la Illa de Arousa. 1 g del alga fue troceado y diluido en 10 ml de agua de mar esterilizada. Los medios sólidos empleados para el aislamiento fueron: Agar Triptona soja (TSA) 1% NaCl, Agar marino (MA, Difco), Agar marino en dilución 1/100, medio  FAS suplementado con 1 g/l de casaminoácidos (FAS CAS) (Schut et al., 1993, Appl Environ Microbiol 7: 2150-2160) y medio FAS suplementado con 0,5 g/l de los polímeros agarosa, quitina y almidón (FAS POL) (Bruns et al., 2002, Appl Environ Microbiol 68: 3978-3987). Se prepararon 3 diluciones (1/10, 1/100 y 1/1000) en agua de mar esterilizada para cada una de las muestras y se  sembraron en placas con los medios de cultivo nombrados. Las placas se incubaron a 15 y 22ºC durante 15 días. Se aislaron un total de 166 colonias en función de su diferente morfología y coloración para el análisis de actividad QQ. Puesto que las 166 cepas obtenidas presentaban crecimiento en MA a 22ºC, se seleccionaron estas condiciones de cultivo como método de cultivo estándar  y para su mantenimiento en el laboratorio. Detección de actividad QQ Las cepas aisladas fueron ensayadas para su actividad QQ utilizando un  ensayo en medio sólido basado en dos biosensores derivados de la especie Chromobacterium violaceum en los que la producción del exopigmento violaceína es dependiente de la presencia de AHLs en el medio de cultivo. La cepa C. violaceum CV026 se utilizó inicialmente para la detección de la degradación de N-hexanoil-L-homoserín lactona (C6-HSL, McClean et al.,  1997, Microbiol 143: 3703-3711). Con posterioridad se confirmó la capacidad de degradación de C10-HSL utilizando la cepa C. violaceum VIR07 (Morohoshi et al., 2008b, FEMS Microbiol Lett 279: 124-130). Las cepas marinas aisladas se inocularon en tubos con 1 ml de caldo marino (CM) a 22ºC y 200 rpm. Tras 24 horas se centrifugaron 500 μl de los cultivos a 2000 x g, durante 5 min y se  resuspendieron en 500 μl de CM al que se añadió C6-HSL ó C10-HSL 2 μM, incubándose durante otras 24 horas. Para la evaluación de la degradación de Anexos/Annexes 322  las AHLs, se colocaron 50μl de los sobrenadantes de estos cultivos en pocillos realizados con un sacabocados en placas de LB cubiertas con LB blando inoculado con 500μl de un cultivo de 12 horas de C. violaceum CV026 ó C. violaceum VIR07, añadiéndose 50 μl de agua destilada estéril para completar el volumen del pocillo. Tras 24 horas de incubación a 25ºC se observó la  producción de violaceína (Figura 1). Además se analizó la capacidad de interferir con la actividad de la OC12-HSL de las cepas seleccionadas utilizando la cepa sensora de E. coli JM109 pSB1075 (Winson MK, Swift S, Fisha L, Throup JP, Jørgensen F, Chhabra SR,  et al. 1998. FEMS Microbiol Lett 163:185-192). Se añadió OC12-HSL a 1 ml de cultivo de 12 horas de las cepas en Caldo Marino a una concentración final de 2 μg/ml y se incubaron durante 24 horas a 22ºC. La actividad AHL en el medio de cultivo se evaluó en placas de LB cubiertas con 5 ml de LB semi-sólido inoculado con 50 μl de un cultivo de 12 horas de la cepa sensora E. coli JM109  pSB1075 mantenida a 37ºC y 200 rpm. Se pipetearon 50 μl de cultivo en pocillos realizados en el agar de estas placas, utilizándose CM estéril y CM más OC12-HSL como controles. Las placas se inocularon durante 3 horas a 37ºC, observándose la producción de luz derivada de la actividad AHL (Figura 2).  Confirmación de la degradación de AHL por HPLC-MS Con las 15 cepas que mostraron inhibición de QS contra las AHLs C6 y C10, se llevaron a cabo análisis mediante HPLC-MS para determinar inequívocamente  su capacidad para degradar AHLs (Figura 3). A cultivos de 24h de 1 ml de las cepas correspondientes, se añadieron las AHLs C4-HSL y C12-HSL con una concentración final de 50 μM, y se incubaron estos cultivos durante 24 h más a 22 o C y a 200 rpm. Tras la centrifugación de los cultivos (2000g, 5 min), se dividió el sobrenadante en dos partes iguales. Un volumen de 500 μl se  acidificó con HCl hasta un pH de 2 y se incubó durante 24 h a 25 o C para facilitar la recuperación de la actividad AHL derivada de la hidrólisis del anillo Anexos/Annexes 323  de lactona por la acción de las lactonasas. Los sobrenadantes de los cultivos se extrajeron 3 veces con un volumen igual de etilacetato, se evaporaron bajo flujo de nitrógeno y se resuspendieron en 200 μl de acetonitrilo para análisis por HPLC-MS y cuantificación. Las muestras de caldo marino suplementadas con la misma cantidad de C4 o C12-HSL fueron procesadas y extraídas de la  misma forma y usadas como controles. Los análisis se llevaron a cabo con un equipo de HPLC 1100 series (Agilent USA) con precolumna CB (2,1x12,5 mm, 5 ȝm de tamaño de partícula) y columna ZORBAX Eclipse XDB-C18 2,1 x 150 mm (tamaño de partícula 5 ȝm) a 45 o C. La fase móvil estaba compuesta por 0,1% de ácido fórmico en agua (A) y 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo (B).  La velocidad de flujo fue de 0,22 ml/min. Las condiciones de elución fueron las siguientes: 0 min 35%B, gradiente lineal a 60%B en 10 min, gradiente lineal desde 60% a 95% B durante 5 min, 5 min 95% B y finalmente vuelta a las condiciones iniciales en 9 min.  La columna fue reequilibrada durante 5 min. El volumen de inyección fue de 2 ȝl. Los experimentos de MS mostrados fueron llevados a cabo en un espectrómetro de masas API 4000 triple-quadrupole (Applied Biosystem, CA, USA) equipado con una fuente de Turbolon empleando un electrospray iónico positivo, con modo de monitorización de reacción múltiple (MRM). La señales  MRM se emplearon para generar información cuantitativa relativa mediante comparación con una curva de calibrado construida para abundancia iónica molecular, empleando el estándar sintético de AHL apropiado (Milton et al., 2001, J Bacteriol 183: 3537-3547).  Identificación bacteriana basada en la subunidad 16S y análisis filogenéticos La identificación de las cepas se llevó a cabo mediante amplificación y secuenciación parcial del gen correspondiente a la subunidad 16S del ARNr. El  ADN genómico de los distintos aislados fue extraído (Puregene Tissue Core Kit B) y el gen de la subunidad 16S del ARNr fue amplificado empleando los Anexos/Annexes 324  cebadores ANT1 (forward) (5`AGAGTTTGATCATGGCTCAG) y S (reverse) (5`GGTTACCTTGTTACGACTT) (Martinez-Murcia and Rodriguez-Valera, 1994, FEMS Microbiol Lett 124: 265-269). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones estándar: 35 ciclos (desnaturalización a 94ºC durante 15 s, hibridación a 50ºC durante 30 s, extensión a 72ºC durante 2 min)  precedidos por 2 min de desnaturalización a 94ºC y seguidos por 7 min de extensión a 72ºC. Los productos de PCR fueron parcialmente secuenciados, revisados y corregidos mediante el programa BioEdit Sequence Alignment Editor (v. 7.0.9.0 http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Un total de quince secuencias de la subunidad 16S del ARNr fueron identificadas y  comparadas con secuencias de la subunidad 16S del ARNr disponibles en el GenBank usando NCBI BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res 25: 3389-3402) y el Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu/html/). Las secuencias de ARNr 16S fueron alineadas usando MUSCLE (Edgar, 2004, Nucleic Acids Res 321792-321797) con las secuencias más cercanas  filogenéticamente encontradas en las bases de datos tras identificación por BLAST, y con aquellos aislados con actividad acilasa o lactonasa previamente identificados o con actividad QQ ya conocida. Para eliminar espacios y posiciones alineadas de modo inequívoco, se empleó Gblocks (Castresana, 2000, Mol Biol Evol 17: 540-552), dando lugar a 649 posiciones disponibles  para construir el árbol filogenético. Los análisis filogenéticos se llevaron a cabo después usando el paquete informático de filogénesis MEGA4 (Zmasek and Eddy, 2001, Bioinformatics 17: 821-828; Kumar et al., 2004, Brief Bioinform 5: 150-163) empleando los parámetros por defecto (Figura 4).  RESULTADOS Crecimiento y aislamiento bacteriano Se obtuvieron resultados muy distintos en el número de unidades formadoras  de colonias (CFU) dependiendo del medio de cultivo y de la temperatura de crecimiento empleada para cada muestra. La muestra con una población de Anexos/Annexes 325  bacterias mayor fue la obtenida del sedimento del tanque de cultivo, llegando a 3x10 6 CFUs ml -1 . El mayor valor de CFU obtenido para la muestra de biopelícula era un orden de magnitud más bajo que en el sedimento, mientras que el número de bacterias viables aisladas de F. vesiculosus era el más bajo, llegando tan sólo a 30.000 CFUs ml -1 en el mejor de los casos. La temperatura  de crecimiento y, lo que es más importante, el medio de cultivo empleado para su aislamiento, también tuvieron una gran influencia sobre el número de bacterias viables aisladas. Temperaturas más altas (22 o C) permitieron el crecimiento de un mayor número de colonias en casi todos los casos. El medio de Agar Marino Diluido (MA 1/100) y el medio de FAS-CAS resultaron ser los  más efectivos para la recuperación de CFUs en las muestras de sedimento y de biopelícula, mientras que en la muestra de F. vesiculosus el medio de Agar Marino y el de FAS-POL fueron igual de efectivos a altas temperaturas, resultando en números de CFUs 3 veces mayores que los otros medios de cultivo.  Un total de 166 aislados fueron obtenidos de las muestras de ambientes marinos seleccionados para la búsqueda de actividad QQ, 85 cepas de la muestra de sedimento del tanque de cultivo, 48 de la biopelícula y 33 de F. vesiculosus (Tabla 2).  A pesar del mayor número de CFU/ml obtenidas con el medio de cultivo oligotrófico en las primeras dos muestras, alrededor de la mitad de aislados empleados para la búsqueda de actividad QQ se obtuvieron de medios más ricos como TSA 1% NaCl y MA, debido a la mayor variabilidad que se observó  de las colonias. En el caso de la muestra de sedimento, más del 70% de los aislados provenían de estos medios ricos, mientras que en la muestra de biopelícula la mayoría de cepas habían sido aisladas en medio FAS (Tabla 2). El número de cepas aisladas a las dos temperaturas distintas que se emplearon en el estudio fue muy similar: 91 cepas se aislaron de placas  mantenidas a 22 o C y 75 de placas mantenidas a 15 o C. Anexos/Annexes 326  Detección de la inhibición de la actividad quorum sensing mediante bioensayos El ensayo en medo sólido en placa empleando la cepa biosensora C. violaceum CV026 permitió la detección de la inhibición de la actividad C6-HSL  de forma robusta (Figura 1). Este ensayo permitió diferenciar las cepas con actividad de inhibición del crecimiento de aquéllas con una actividad QQ real. El ensayo en medio sólido con C. violaceum CV026 permitió la identificación de 24 cepas con actividad QQ, lo cual representa un 14,5% de las cepas aisladas (Tabla 2).  Nº de cepas aisladas Cepas QQ Sedimento del tanque de peces TSA-1% NaCl 30 2 MA 31 4 MA 1/100 9 1 FAS-CAS 7 0 FAS-POL 8 1 Total 85 8 Biofilm del tanque de agua TSA-1% NaCl 9 0 MA 5 0 MA 1/100 7 0 FAS-CAS 17 2 FAS-POL 10 1 Total 48 3 Fucus vesiculosus TSA-1% NaCl 9 3 MA 9 2 Anexos/Annexes 327  MA 1/100 5 3 FAS-CAS 7 3 FAS-POL 3 2 Total 33 13 Todas las muestras TSA-1%NaCl 48 5 MA 45 6 MA 1/100 21 4 FAS-CAS 31 5 FAS-POL 21 4 Total 166 24 Tabla 2. Resumen de las cepas bacterianas aisladas de distintos ambientes y medios de cultivo, mostrando el número y porcentaje de cepas con actividad de inhibición QS contra C6-HSL obtenido empleando el ensayo en placa de C. violaceum CV026. MA: agar marino; MA 1/100: agar marino diluido 1/100 con  agua de mar; FAS-CAS: agua de mar filtrada y autoclavada suplementada con casaminoácidos; FAS-POL: agua de mar filtrada y autoclavada suplementada con polímeros. No se observó un efecto significativo del medio de cultivo empleado para el  aislamiento sobre el porcentaje de cepas con actividad QQ (Tabla 2, test Chi cuadrado, p>0,05). El 50% de las cepas activas fueron activadas a 22 o C y por tanto el efecto de la temperatura de aislamiento no fue significativo (test de Fisher exacto, p>0,05). Por el contrario, sí se observó un efecto importante del origen de la muestra sobre el porcentaje de cepas con actividad QQ  encontradas (Tabla 2, test Chi cuadrado, p<0,05). Mientras que las cepas aisladas de los tanques presentaron un porcentaje de actividad QQ de entre el 6 y el 9% (Tabla 2), casi el 40% de las cepas aisladas de la muestra de F. vesiculosus resultaron activas contra C6-HSL (Tabla 2). Las 24 cepas que eran aparentemente capaces de interceptar la actividad de C6-HSL se analizaron  más a fondo, estudiando su capacidad de interceptar C10-HSL mediante el mismo ensayo en medio sólido pero empleando la cepa biosensora C. Anexos/Annexes 334  REIVINDICACIONES 1. Cepa de células bacterianas de Į-Proteobacteria depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número de depósito CECT 7733.  2. Uso de la cepa según la reivindicación 1, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para provocar quorum quenching. 3. Uso de la cepa según la reivindicación 1, del extracto celular crudo o del  sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para la elaboración de un medicamento. 4. Uso de la cepa según la reivindicación 1, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para la  elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas bacterianas. 5. Uso de la cepa según la reivindicación 4 donde la enfermedad infecciosa bacteriana la padece un animal acuático.  6. Uso de la cepa según la reivindicación 1, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, para inhibir la formación de biofilms.  7. Uso de la cepa, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en combinación con antibióticos u otros agentes antibacterianos.  8. Uso de la cepa, del extracto celular crudo o del sobrenadante de sus cultivos, o cualquiera de sus combinaciones, según cualquiera de las Anexos/Annexes 335  reivindicaciones 4 a 7, donde la formación de biofilms y las enfermedades infecciosas bacterianas son provocadas por bacterias productoras de AHLs. 9. Composición que comprende un elemento seleccionado de la lista que comprende:  a. la cepa según la reivindicación 1, b. el extracto celular crudo de un cultivo bacteriano de la cepa según la reivindicación 1, c. el sobrenadante del cultivo bacteriano de (b),  o cualquiera de sus combinaciones. 10. Uso de la composición según la reivindicación 9 como agente antipatogénico.  11. Uso de la composición según la reivindicación 9 para la elaboración de un medicamento. 12. Uso de la composición según la reivindicación 9 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas  bacterianas. 13. Uso de la composición según la reivindicación 12 donde la enfermedad infecciosa bacteriana la padece un animal acuático.  14. Uso de la composición según la reivindicación 9 para inhibir la formación de biofilms. 15. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 en combinación con antibióticos u otros agentes antibacterianos.  Anexos/Annexes 336  16. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 donde la formación de biofilms y las enfermedades infecciosas bacterianas son provocadas por bacterias productoras de AHLs.  Anexos/Annexes 337    FIG. 1 FIG. 2 9LEULR DQJXLOODUXP 9LEULR DQJXLOODUXP &RQWURO &+6/ &RQWURO &+6/ --    $ % Anexos/Annexes 338  0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 CM C12 2 5 168 172 173 176 177 20 24 30 33 50 97-1 97-2 61 Cepa % AHL C12 C12 acidificado Fucus vesiculosus Sedimento Biopelícula 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 CM C4 2 5 168 172 173 176 177 20 24 30 33 50 97-1 97-2 61 Cepa % AHL C4 C4 acidificado Biopelícula Fucus vesiculosus Sedimento  FIG. 3 Anexos/Annexes 339  γ γ γ γ-proteobacteria α α α α-proteobacteria Firmicutes Actinobacteria Bact eriodet es β ββ β-proteobacteria Cyanobacteria Shigella sp. 5 219944573 Klebsiella pneumoniae 342 206575712 Shewanella sp. MIB015 161408102 Pseudoalteromonas atlantica T6c 109896322 Alteromonas sp. BCw156 229892555 168 Gamma proteobacterium HTCC5015 254449402 Endosymbiont of Lucinoma sp. 209869711 Gamma proteobacterium NOR5-3 218703224 Chromohalobacter salexigens DSM 30439402 Halomonas taeanensis BH539 50236441 33 Azotobacter vinelandii DJ 226942170 Pseudomonas aeruginosa PAO1 110645304 Pseudomonas putida KT2440 26986745 Pseudomonas syringae B728a 66043271 Pseudomonas fluorescens Pf0-1 255961261 Acinetobacter sp. C1010 34484363 Ralstonia solanacearum GMI1000 17544719 Ralstonia pickettii 12D 241661625 Comamonas sp. D1 33329791 Variovorax paradoxus VAI-C 11385580 Sphingopyxis witflariensis W-50 253680762 61 Roseovarius aestuarii 182892404 177 Phaeobacter sp. NH52F 209981527 Rhodobacter aestuarii 161513025 2 Hyphomonas sp. DG895 32441397 97-1 5 176 Rhodobacteraceae bacterium MEBiC05066 1828924041 Bosea thiooxidans KB13-VS 6273428 Bradyrhizobium sp. BTAi1 CP000494 Agrobacterium tumefaciens str. C58 1591184118 Rhodococcus erythropolis MM30 190351101 173 50 Arthrobacter sp. IBN110 31558965 Streptomyces sp. M664 49781330 Anabaena sp. PCC 7120 39010 Bacillus thuringiensis 49476684 Bacillus sp. A24 225921123 24 Bacillus circulans X3 190364844 Oceanobacillus caeni 115551759 30 Oceanobacillus sp. YIM DH3 86279611 172 97-2 Flavobacterium aquatile 87116142 20J Tenacibaculum discolor 151416868 100 100 95 100 100 99 94 78 67 100 100 96 82 100 100 100 100 100 100 100 99 84 100 100 100 74 100 91 98 100 99 100 96 99 84 57 98 95 90 74 0.02 γ γ γ γ-proteobacteria α α α α-proteobacteria Firmicutes Actinobacteria Bact eriodet es β ββ β-proteobacteria Cyanobacteria Shigella sp. 5 219944573 Klebsiella pneumoniae 342 206575712 Shewanella sp. MIB015 161408102 Pseudoalteromonas atlantica T6c 109896322 Alteromonas sp. BCw156 229892555 168 Gamma proteobacterium HTCC5015 254449402 Endosymbiont of Lucinoma sp. 209869711 Gamma proteobacterium NOR5-3 218703224 Chromohalobacter salexigens DSM 30439402 Halomonas taeanensis BH539 50236441 33 Azotobacter vinelandii DJ 226942170 Pseudomonas aeruginosa PAO1 110645304 Pseudomonas putida KT2440 26986745 Pseudomonas syringae B728a 66043271 Pseudomonas fluorescens Pf0-1 255961261 Acinetobacter sp. C1010 34484363 Ralstonia solanacearum GMI1000 17544719 Ralstonia pickettii 12D 241661625 Comamonas sp. D1 33329791 Variovorax paradoxus VAI-C 11385580 Sphingopyxis witflariensis W-50 253680762 61 Roseovarius aestuarii 182892404 177 Phaeobacter sp. NH52F 209981527 Rhodobacter aestuarii 161513025 2 Hyphomonas sp. DG895 32441397 97-1 5 176 Rhodobacteraceae bacterium MEBiC05066 1828924041 Bosea thiooxidans KB13-VS 6273428 Bradyrhizobium sp. BTAi1 CP000494 Agrobacterium tumefaciens str. C58 1591184118 Rhodococcus erythropolis MM30 190351101 173 50 Arthrobacter sp. IBN110 31558965 Streptomyces sp. M664 49781330 Anabaena sp. PCC 7120 39010 Bacillus thuringiensis 49476684 Bacillus sp. A24 225921123 24 Bacillus circulans X3 190364844 Oceanobacillus caeni 115551759 30 Oceanobacillus sp. YIM DH3 86279611 172 97-2 Flavobacterium aquatile 87116142 20J Tenacibaculum discolor 151416868 100 100 95 100 100 99 94 78 67 100 100 96 82 100 100 100 100 100 100 100 99 84 100 100 100 74 100 91 98 100 99 100 96 99 84 57 98 95 90 74 0.02  FIG. 4   Anexos/Annexes 340  RESUMEN Uso de una nueva Į-Proteobacteria para Quorum Quenching La presente invención se refiere a una cepa de una nueva especie de Į- Proteobacteria afín al género Phaeobacter, que es capaz de degradar las NAcil-homoserin lactonas (AHLs), las cuales no pueden ser recuperadas significativamente por acidificación, indicando una actividad enzimática diferente a la lactonasa. Por tanto, el empleo de esta bacteria es útil para controlar las infecciones bacterianas, sin ejercer presión selectiva sobre las  poblaciones de las bacterias patógenas y evitando así la aparición de resistencias. También permite la inhibición de otros procesos de colonización bacteriana en los que están implicadas las señales de “quorum sensing” o QS tipo AHL, como la formación de biofilms. Anexos/Annexes 341 8QWLWOHGB67 /,67$'2'(6(&8(1&,$6 !8QLYHUVLGDGHGH6DQWLDJRGH&RPSRVWHOD  !8VRGHXQDQXHYDDOID3URWHREDFWHULDSDUD4XRUXP4XHQFKLQJ ! ! !3DWHQW,QYHUVLRQ ! ! !'1$ !&HSDEDFWHULDQDFRQQ~PHURGHGHSyVLWR&(&7 ! FDFDWJFDDJWFJDJFJFWWFDFWWFJJWJDJJDJFJJFJJDFJJJWWDJWDDFJFJWJJ JDDFDWDFFFWWWWFWDDJJDDWDJFFDFWJJDDDFJJWJDJWDDWDFFWWDWDFJFFFW WFJJJJJDDDJDWWWDWFJJDJDDJJDWWJJFFFJFJWWDJDWWDJDWDJWWJJWJJJJW DDWJJFFWDFFDDJWFWDFJDWFWDWDJFWJJWWWWDJDJJDWJDWFDJFDDFDFWJJJD FWJDJDFDFJJFFFDJDFWFFWDFJJJDJJFDJFDJWJJJJDDWFWWDJDFDDWJJJFJF DDJFFWJDWFWDJFJDWJFFJFJWJDJWJDWJDDJJFFWWDJJJWFJWDDDJFWFWWWFJ FFDDJJDWJDWDDWJDFDJWDFWWJJWDDDJDDJWFFFJJFWDDFWFFJWWFFDJFDJFF JFJJWDDWDFJJDJJJJDFWDJFJWWJWWFJJDDWWDFWJJJFJWDDDJFJFDFJWDJJF JJDWFDJDDDJWDWJJJJWJDDDWFFFDJJJFWFDDFFFWJJDDFWJFFWFDWDDDFWFF WJJWFWWJDJWWFJDJDJDJJWJDJWJJDDWWFFJDJWJWDJDJJWJDDDWWFJWDJDWD WWFJJDJJDDFDFFDJWJJFJDDJJFJJFWFDFWJJFWFJDWDFWJDFJFWJDJJWJFJD DDJWJWJJJJDJFDDDFDJJDWWDJDWDFFFWJJWDJWFFDFDFFJWDDDFJDWJDDWJF FDJWFJWFJJDWDJFDWJFWDWWFJJWJDFDFDFFWDDFJJDWWDDJFDWWFFJFFWJJJ JDJWDFJJWFJFDDJDWWDDDDFWFDDDJJDDWWJDFJJJJJFFFJFDFDDJFJJWJJDJ FDWJWJJWWWDDWWFJDDJFDDFJFJFDJDDFFWWDFFDDFFFWWJDFDWFFWJWJFWDF DWFFDJDJDWJJDWJJWWFFFWWFJJJJDFJFDJWJDWFDJJWJFWJFDWJJFWJWFJWF DJFWFJWJWF 3iJLQD Anexos/Annexes 343 Anexo 3. Otras publicaciones relacionadas 3.1 Quorum quenching activity in Anabaena sp. PCC 7120: identification of AiiC, a novel AHL-acylase. FEMS Lett. 280: 73-80. Anexos/Annexes 350 diazotrophic cultures and disappear abruptly when the early stationary phase is achieved (M. Romero et al., unpublished results), indicating that the level of the signals could be modulated through the presence of degradation mechanisms. This fact encouraged a search for enzymes able to degrade the AHLs in Anabaena sp. PCC 7120. The degradation activity found, demonstrated to be acylase-type by the dansylation assay, can be at least partially attributed to the aiiC acylase gene cloned in this paper. Even though the presence of additional acylases in Anabaena sp. PCC 7120 cannot be completely excluded, the similarity between the specificity of AHL degradation of the cyanobacterial CCE and the cloned enzyme (Table 1) seems to indicate that AiiC is the only enzyme responsible for the degradation of AHLs in Anabaena sp. PCC 7120. The 2544 bp all3924 gene, here named aiiC, encodes an 847 amino acid protein. As reported for the homologous quorum signal utilization and inactivation protein QuiP in P. aeruginosa PAO1, the presence of a signal sequence and a putative transmembrane domain located in the N-terminal region (residues 20–40) suggests that AiiC has a periplasmic localization. Acylase activity has been localized primarily in the cell debris after lysis in Ralstonia sp. (Lin et al., 2003), while in Streptomyces sp. it has been found in the culture media (Park et al., 2005). The predicted secondary structure of AiiC and the absence of acylase activity in the cell-free culture supernatants suggest that in the case of Anabaena sp. PCC 7120, the enzyme is cell-bound. Genomic searches with acylase sequences revealed the presence of genes homologous to the Pseudomonas acylases in the genomes of the filamentous cyanobacterium N. punctiforme and in the unicellular G. violaceus and Synechocystis sp., indicating that this activity could be widespread among the Cyanobacteria. The phylogenetic analysis shows that AiiC and most of the other cyanobacterial putative acylases are closely related to P. aeruginosa PAO1 QuiP (Fig. 4). Only the potential homologous acylase of the unicellular nondiazotrophic cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 is located in a different branch, closer to the PvdQ acylase of P. aeruginosa. Out of these two clusters is the R. erythropolis acylase QsdA, which shows no homology with the others. The QuiP cluster proteins share in average 30% identities between them, while the PvdQ cluster shares a more variable 23–40% identity in their peptide sequences. Despite their relatively low overall sequence homologies, conserved homologous domains of 11–12 residues can be observed in both the QuiP cluster (GYXHAQDRLWQM) and in the PvdQ cluster (GLLLXNPHXPN). The identity between the two AHL-acylases clusters is only 18%, without any noticeable conserved motif in their sequences. Despite showing a higher similarity to the P. aeruginosa PAO1 acylases, those are only able to degrade long-chain specifically AHLs (Huang et al., 2006; Sio et al., 2006), while AiiC can also degrade short-chain AHLs, (Table 1), as it has been described for QsdA of AiiD R. erythropolis and Ralstonia sp. or the activity found in Variovorax paradoxus (Leadbetter & Greenberg, 2000; Lin et al., 2003; Uroz et al., 2005). Because the lowest acylase activity in the biomass of diazotrophic cultures is observed at the early stationary phase, correlating with the highest AHL concentration in the biomass (M. Romero et al., unpublished results), the possibility that this enzyme could be directly involved in the 140 000 120 000 100 000 80 000 60 000 40 000 20 000 0 C12-HSL 100 μg mL CCE DH5αCCE DH5α aiiC RLU Fig. 3. C12-HSL degradation activity of CCE of Escherichia coli DH5a transformed with pME6032 carrying (CCE DH5aaiiC) or not (CCE DH5a) the aiiC gene before (hatched bars) and after acidification to pH 2.0 (solid bars). Luminescence values of negative controls (nontreated biosensor or biosensor plus solvent) were subtracted in order to normalize the results. E. coli cultures were carried out at 28 1C and degradation assays were carried out at 30 1C. NPR0954 Nostoc punctiforme PCC 7310 2 10 PAM QsdA Rhodococcus erythropolis AiiD Ralstonia sp. AiiC Anabaena sp. PCC 7120 GLR1988 Gloeobacter violaceus PCC 7421 SLR0378 Synechocystis sp. PCC 6803 AhIM Streptomyces sp. PvdQ Pseudomonas aeruginosa PA01 QuiP Pseudomonas aeruginosa PA01 Fig. 4. Tree showing the phylogenetic relationship between the AiiC acylase of Anabaena sp. PCC 7120 and homologous sequences from known or putative acylases present in diverse bacteria and Cyanobacteria. PAM, percent accepted mutation. FEMS Microbiol Lett 280 (2008) 73–80 c 2008 Federation of European Microbiological Societies Published by Blackwell Publishing Ltd. All rights reserved 78 M. Romero et al. Anexos/Annexes 351 intracellular inactivation of the signals should be investigated. The use of the QQ enzymes for the self-modulation of the level of the signals has already been found in Agrobacterium tumefaciens, for which the lactonase activity of AttM seems to be crucial for the inhibition of conjugation of the Ti plasmid (Zhang et al., 2002). The hypothesis of a possible role of AiiC in the regulation of the AHLs intracellular level is further supported by the fact that the AHL acylase activity could be found only in the biomass. The continuous periplasm of filamentous Cyanobacteria is thought to be a channel for the transfer of signals and nutrients, which is essential for the multicellular nature of these organisms (Mariscal et al., 2007). The transfer of the signals through the continuous periplasm would be consistent with the finding of AHLs in the biomass of Anabaena sp. PCC 7120 and a possible periplasmic location of the acylase. Although the possible physiological role of AHLs in Anabaena sp. PCC 7120 is not yet completely defined, the presence of AHLs only in the biomass of diazotrophic cultures and a strong effect of the addition of exogenous AHLs on the nitrogenase activity indicate a possible role of AHLs in the control of heterocyst differentiation or any other process related to nitrogen fixation (M. Romero et al., unpublished results). Another fact supporting the hypothesis of a role of AHLs and AHL-acylase in the complex network of genes controlling nitrogen fixation in Anabaena sp. PCC 7120 is the presence of a putative binding site for NtcA at position 48 in the aiiC promoter. NtcA is the global transcription regulator belonging to the cyclic AMP receptor protein family, which controls a number of genes involved in nitrogen and carbon metabolism and is responsible for the initiation of heterocyst differentiation (Herrero et al., 2004). On the other hand, and even though the hypothesis that AiiC could play a self-regulatory function cannot be completely excluded, the presence of acylase activity in diazotrophic cultures, in which no AHLs could be detected, suggests a more general physiological role of AiiC. The unicellular nondiazotrophic cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 also possesses a putative acylase and this may indicate an alternative physiological role for this enzyme. Because the presence of AHLs has been demonstrated in the natural microbial communities in which the Cyanobacteria are present or even dominate, such as microbial mats or cyanobacterial blooms (Bachofen & Schenk, 1998; Braun & Bachofen, 2004), AiiC could also be involved in the interference of signalling in these complex bacterial systems. Despite their ecological significance, the importance of QS systems have been questioned due to the relatively low number of Proteobacteria species in which the real physiological functions controlled by the AHL-mediated QS system has been identified (Manefield & Turner 2002). The increasing number of bacteria presenting AHL-degrading mechanisms reinforces the view on the ecological significance of these signals. In the case of Cyanobacteria, the presence of AHL signals only in the biomass suggests a different usage of these molecules that may rather act as intracellular signals. Even though some results indicate that AiiC could be involved in the self-regulation of the AHL levels in the diazotrophic filaments, the cyanobacterium could also use the enzyme as a defence barrier in order to avoid the interference of external signals with its own signalling system. The presence of AHL-acylase sequences in diverse Cyanobacteria would support the latter hypothesis. Further studies are required in order to elucidate the possible physiological role of AiiC in Anabaena sp. PCC 7120. Acknowledgements This work was financed by a grant from Conseller´ ıa de Innovaci´ on e Industria, Xunta de Galicia PGIDIT06PXIB200045PR. Manuel Romero is supported by a FPU fellowship from the Spanish Ministry of Science and Education. The authors would like to thank Alex Truman for his support on the HPLC analysis. The authors are grateful to Alicia Muro Pastor for critically reviewing the manuscript. 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PCC7120 (Submitted in FEMS Microbiology Letters). 355 For Peer Review KWWSPFPDQXVFULSWFHQWUDOFRPIHPV 4XRUXPVHQVLQJ1DF\OKRPRVHULQHODFWRQHVLJQDOVDIIHFW VXUYLYDODQGQLWURJHQIL[DWLRQLQWKHF\DQREDFWHULXP $QDEDHQDVS3&& -RXUQDO )(060LFURELRORJ\/HWWHUV 0DQXVFULSW,' 'UDIW 0DQXVFULSW7\SH 5HVHDUFK/HWWHU 'DWH6XEPLWWHGE\WKH $XWKRU QD &RPSOHWH/LVWRI$XWKRUV 5RPHUR0DQXHO8QLYHUVLGDGGH6DQWLDJR'HSDUWDPHQWRGH 0LFURELRORJLD 0XUR3DVWRU$OLFLD&6,&,QVWLWXWR%LRTXLPLFD9HJHWDO\ )RWRVLQWHVLV 2WHUR$QD8QLYHUVLGDGGH6DQWLDJR6SDLQ'HSDUWDPHQWRGH 0LFURELRORJLD .H\ZRUGV&\DQREDFWHULD$QDEDHQDTXRUXPVHQVLQJ$+/WHWUDPLFDFLG QLWURJHQIL[DWLRQ ScholarOne Support 1-434/817-2040 ext 167 FEMS Microbiology Letters Anexos/Annexes 356 For Peer Review 1 Quorum sensing N-acylhomoserine lactone signals affect 1 survival and nitrogen fixation in the cyanobacterium 2 Anabaena sp. PCC7120 3 4 Manuel Romero(1), Alicia M. Muro-Pastor(2) and Ana Otero(1) 5 6 (1) Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Biología-CIBUS, 7 Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela, Spain. 8 (2) Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Consejo Superior de Investigaciones 9 Científicas and Universidad de Sevilla. Sevilla, Spain. 10 11 Corresponding author: Ana Otero, Dep. de Microbiología y Parasitología, Fac. de 12 Biología-CIBUS, Univ. de Santiago de Compostela, 15782 Santiago, Spain. Tel. +34 13 981563100 ext 16913, Fax: +34 981 528006. E-mail: [email protected] 14 15 Keywords 16 Cyanobacteria, Anabaena, quorum sensing, AHL, tetramic acid, nitrogen fixation. 17 18 19 20 21 22 23 Page 1 of 24 ScholarOne Support 1-434/817-2040 ext 167 FEMS Microbiology Letters 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 357 For Peer Review 2 Abstract 24 Bacteria secrete small signal molecules into the environment that act inducing self and 25 neighbours gene expression. This phenomenon, termed Quorum Sensing (QS), allows 26 cooperative behaviours that increase the fitness of the group. The best studied signal 27 molecules are the N-acylhomoserine lactones (AHLs), secreted by a growing number of 28 bacterial species including important pathogen species like Pseudomonas aeruginosa. 29 These molecules have recently been proposed to have more than signalling properties, 30 functioning as iron chelants or antibiotics. In this work we analyze the effects of 31 different AHLs varying in length and substitutions on the growth and nitrogen 32 metabolism of the cyanobacterium Anabaena sp. PCC7120. N-(3-oxodecanoyl)-L-33 homoserine lactone (OC10-HSL) was lethal for this diazotrophic cyanobacterium. All 34 other AHLs tested did not produce cell lyses but dramatically inhibited nitrogen 35 fixation. The strong inhibition of nitrogen fixation seems to take place at post-36 transcriptional level, since no effect on heterocyst differentiation or in the expression of 37 nitrogenase was observed. The significance of these results is discussed in relation to 38 nitrogen metabolism and non-signal properties of AHLs. 39 40 41 42 43 44 45 46 47 Page 2 of 24 ScholarOne Support 1-434/817-2040 ext 167 FEMS Microbiology Letters 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Anexos/Annexes 358 For Peer Review 3 Introduction 48 The term “quorum sensing” (QS) (Fuqua et al., 1994), describes a phenomenon of 49 bacterial communication that confers these organisms the ability to perceive and 50 respond to the community density through coordinated regulation of gene expression, 51 thus being able to adopt an advantageous social behaviour. Bacteria communicate their 52 presence to others by secreting small chemical signals called autoinducers, allowing the 53 individuals to distinguish between high or low population densities. 54 By means of QS, bacterial populations can coordinate important biological functions 55 including motility, swarming, aggregation, plasmid conjugal transfer, luminescence, 56 antibiotic biosynthesis, virulence, symbiosis or biofilm maintenance and differentiation 57 (Williams et al., 2007). While several chemically distinct families of QS signal 58 molecules have now been described, the most studied QS signalling system involves N-59 acylhomoserine lactones (AHLs) employed by diverse Gram-negative bacteria. AHLs 60 differ in the acyl side chain, which usually contains between 4 and 18 carbons in length, 61 with or without saturation or C3 hydroxyor oxosubstitutions (Whitehead et al., 62 2001). AHLs have been initially described as being exclusively produced by a relatively 63 small number of Į and Ȗ-proteobacteria (Williams et al., 2007), but recently the 64 production of these signals has also been reported for the colonial cyanobacterium 65 Gloeothece (Sharif et al., 2008) and different marine Bacteroidetes (Huang et al., 2008; 66 Romero et al., 2010) which might point to a significant role of QS systems in natural 67 populations/environment. 68 Besides its function as quorum signals, some AHLs have been proposed to have other 69 possible biological functions such as iron quelants and antibiotics (Kaufmann et al., 70 2005; Schertzer et al., 2009). In Pseudomonas aeruginosa a naturally occurring 71 Page 3 of 24 ScholarOne Support 1-434/817-2040 ext 167 FEMS Microbiology Letters 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 359 For Peer Review 4 degradation product of its N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (OC12-HSL) 72 AHL signal, the tetramic acid 3-(1hydroxydecylidene)-5-(2-hydroxyethyl)pyrrolidine-73 2,4-dione, exhibits iron-binding ability. This AHL derivative is able to bind iron in a 3:1 74 complex with an affinity comparable to that exhibited by standard chelators and 75 siderophores (Schertzer et al., 2009). Also, antibiotic properties of the tetramic acid 76 derivative of OC12-HSL have been described, through the disruption of membrane 77 potential and proton gradient of bacteria, thus eliminating the proton motive force and 78 leading to bacterial death (Lowery et al., 2009). 79 The existence of QS blockage systems adopted by competitors to destroy or inhibit the 80 functions of AHLs also indicates the ecological importance of these molecules. The 81 different mechanisms of interference with QS communication systems have been 82 generally termed as “quorum quenching” (QQ) (Dong et al., 2001). An example of QQ 83 is the enzymatic inactivation of AHLs, with two groups of AHL-degrading enzymes 84 identified so far. The lactonases hydrolyse the homoserine lactone (HSL) ring of the 85 AHL molecule to produce acyl homoserines (Dong et al., 2007), whereas the acylases 86 cleave the AHL amide bond generating the corresponding fatty acid and HSL ring 87 (Dong et al., 2007). Enzymatic QQ activity has been described in Gram-positive and 88 negative bacteria and more recently in the cyanobacterium Anabaena sp. PCC7120 89 (Romero et al., 2008). 90 Anabaena sp. PCC7120 is a filamentous cyanobacterium able to simultaneously 91 perform photosynthesis and dinitrogen fixation under aerobic conditions. In the 92 presence of a source of combined nitrogen, filaments grow as undifferentiated chains of 93 vegetative cells. In contrast, when Anabaena sp. PCC7120 is deprived of combined 94 nitrogen, approximately 10% of the cells differentiate into morphologically distinct 95 Page 4 of 24 ScholarOne Support 1-434/817-2040 ext 167 FEMS Microbiology Letters 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Anexos/Annexes 366 For Peer Review 11 synergic effect of both compounds on the disruption of membrane potential, since high 240 levels of HN 4+ have been described to have such effect in cyanobacteria (Drath et al., 241 2008), but if that was the case, a similar effect would be expected for OC12-HSL 242 (Schertzer et al., 2009). Therefore, the fact that OC10-HSL signal is lethal only in the 243 presence of combined nitrogen in liquid media should be the result of a specific 244 inhibitory effect at some point of the assimilation of combined nitrogen. This effect 245 should be highly specific and different from the antibiotic effect described so far for 246 tetramic acids, since no cytotoxic effect could be observed when Anabaena sp. 247 PCC7120 was cultivated in liquid BG11 0 C+NH 4+ supplemented with OC12-HSL or its 248 tetramic acid derivative. The half maximal effective concentration (EC50) is between 8 249 and 55 PM for the OC12-HSL-derived tetramic acid and between 22.1 and 100 PM for 250 OC12-HSL itself depending on the bacterial strain (Kaufmann et al., 2005). These 251 ranges match the lethal concentration observed for OC10-HSL in BG11 0 C+NH 4+ 252 cultures of Anabaena sp. PCC7120, but this activity was mainly described for Gram-253 positive bacteria, in which there is no outer membrane providing a permeability barrier 254 like in Gram-negative bacteria. Moreover, Lowery et al. (2009) reported data on the 255 anti-bacterial activities of OC12-tetramic acid and C14-tetramic acid, with the latter 256 being much more potent, likely due to the increased hydrophobicity of the longer acyl 257 chain, allowing better membrane partitioning or cell penetration. Thus, if the cytotoxic 258 effect observed in Anabaena sp. PCC7120 was caused by an OC10-tetramic acid 259 derivative, a stronger effect would be expected with the longer OC12-tetramic acid, 260 which in turn is not inactive in this case. All these evidences point to the mode of action 261 of OC10-HSL in Anabaena PCC7120 being different from that observed for Gram-262 positive bacteria. 263 Page 11 of 24 ScholarOne Support 1-434/817-2040 ext 167 FEMS Microbiology Letters 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 367 For Peer Review 12 The observation that antibiotics cannot easily reach the lethal concentrations in natural 264 environments has led to questioning whether these molecules could act, in subinhibitory 265 concentrations, as signal molecules (Davies, 2006; Linares et al., 2006). Low 266 concentrations of several antibiotics can alter expression patterns of bacteria without 267 any effect on growth rate (Davies et al., 2006), which resembles the mode of action of 268 QS signals. Thus one possibility is that the AHL signals have antibiotic effects when 269 added at higher concentrations than those found in natural environments. In fact, the 270 concentrations reported in the literature for AHLs in the culture media of the model 271 microorganism Vibrio fischeri usually range between 0.4 and 400 nM (Kaplan & 272 Greenberg, 1985; Schaefer et al., 2002; Burton et al., 2005), significantly lower than the 273 concentrations exhibiting cytotoxic activity. 274 275 Possible effects of AHLs on heterocyst differentiation was also tested with Anabaena 276 sp. PCC7120 strain CSEL4a (Olmedo-Verd et al., 2006). This strain expresses gfp gene 277 under the control of ntcA promoter, that is the master regulator of nitrogen assimilation, 278 controlling also the early phases of heterocyst differentiation (Herrero et al., 2004). 279 Cells grown in the presence of BG11 0 C+NH 4+ were transferred to BG11 0 C + AHL 100 280 PM. No changes in the activity of the ntcA promoter could be observed in the presence 281 of AHLs by means of changes in GFP fluorescence, indicating that the AHLs were not 282 affecting the process of heterocyst differentiation (data not shown). 283 284 Nitrogenase activity 285 The effect of the signals on the nitrogenase activity was evaluated in BG11 0 C+NH 4+ 286 cultures transferred to BG11 0 C for the induction of heterocyst formation and nitrogen 287 Page 12 of 24 ScholarOne Support 1-434/817-2040 ext 167 FEMS Microbiology Letters 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Anexos/Annexes 368 For Peer Review 13 fixation in the presence of the AHLs. Nitrogenase measurements were carried out 20 288 hours after the nitrogen step-down treatment in order to allow the formation of mature 289 heterocysts. A strong inhibition of the nitrogenase activity was recorded for all AHLs 290 tested. The lower ethylene production in AHL-treated cultures was evident after 15 291 minutes from acetylene addition. The inhibition was specially marked in cultures treated 292 with OC10 and OC12-HSL, in which none or residual nitrogenase activity could be 293 detected (Figure 2). This result is consistent with the inhibition of growth observed in 294 the cyanobacterium with these two AHLs in solid BG11 0 C media. 295 In order to evaluate whether the nitrogenase activity inhibition was due to defects in 296 heterocyst wall formation, thus preventing the formation of O 2 impermeable layers and 297 a microoxygenic environment inside the heterocysts, nitrogenase activity was also 298 measured under anaerobic atmosphere. Air inside the flasks was substituted by Argon 299 and DCMU was added to the cultures to inhibit PSII-dependent O 2 production. Higher 300 nitrogenase activity was observed in anaerobic conditions when compared to aerobic 301 ones, but the effect of AHL addition was still observed (Figure 2). This result indicates 302 that the lower nitrogenase activity observed in the presence of AHLs was not due to 303 alterations of the heterocyst envelope and confirm that they have no effect on heterocyst 304 differentiation as observed in AHL supplemented cultures described before. As in 305 aerobic conditions, OC10 and OC12-HSL were the signals with the strongest inhibitory 306 effect on nitrogenase activity (Figure 2). 20 hours after the addition of acetylene still no 307 recovery of normal levels of nitrogenase activity of the cultures was observed either in 308 aerobic or anaerobic conditions (data not shown). 309 310 Page 13 of 24 ScholarOne Support 1-434/817-2040 ext 167 FEMS Microbiology Letters 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 369 For Peer Review 14 To determine whether the inhibitory effect of the AHLs on nitrogen fixation took place 311 only in developing heterocysts, nitrogenase activity was also measured in diazotrophic 312 cultures in which C10-HSL (100 PM) was added 24 h after nitrogen step-down, when 313 mature heterocysts are already present. The amount of ethylene produced in early 314 samples was similar in cultures with or without C10-HSL but, interestingly, a 315 progressive lower ethylene production was observed in C10-HSL treated culture, 316 resulting in a 30 % decrease of nitrogenase activity (data not shown). The lower AHL 317 inhibitory effect in mature heterocysts, could be related to the impermeability of the 318 mature heterocysts wall. The inhibiton of the nitrogenase activity in acclimated cultures 319 would be then related to the entrance of the AHLs in the new generations of heterocysts. 320 Nonetheless it cannot be excluded that AHLs enter through vegetative walls and spread 321 along the filaments by the periplasmic space, acting at molecular level only in newly 322 formed heterocysts. It has been described that Anabaena sp. PCC7120 cells are 323 surrounded by the plasmatic membrane and a peptidoglican layer but the outer 324 membrane of the wall does not enter the septum between cells, implying the existence 325 of a continuous periplasmic space (Flores et al., 2006; Mariscal et al., 2007). In that case 326 the results observed would suggest a non reversible inhibition of nitrogenase in very 327 early stages either at the level of gene expression or on its enzymatic activity. 328 329 Expression of nitrogen fixation genes 330 Because all tested AHLs showed some inhibitory activity on nitrogen fixation only in 331 newly formed heterocysts, in order to study possible effects at the level of expression of 332 nitrogen metabolism genes, northern blots were carried out do detect changes in 333 expression of the dinitrogenase reductase subunit gen (nifH) and ferredoxin (fdxH, 334 Page 14 of 24 ScholarOne Support 1-434/817-2040 ext 167 FEMS Microbiology Letters 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Anexos/Annexes 370 For Peer Review 15 encoding for dinitrogenase reductase electron donor [Razquin et al., 1995]). Expression 335 of both genes is heterocyst specific and their products are involved in nitrogen fixation. 336 No significant differences in the expression of both genes could be detected at 20 and 337 24 h after nitrogen step-down (no expression of nifH and fdxH was detected at 0, 3 and 338 6 h) in total RNA extracted from C10-HSL treated cultures when compared to control 339 samples (Figure 3). This result indicates that AHL inhibition could be affecting either 340 the expression of other genes related to nitrogen fixation or act on nitrogenase-related 341 genes at a post-transcriptional level. 342 343 The AHL signal produced by the colony and biofilm forming unicellular 344 cyanobacterium Gloeothece PCC6909 induces an increase in the expression of 345 aminoacid synthetases (Sharif et al., 2008), particularly the glutamate synthase. 346 Glutamate, together with glutamine, plays a central role in ammonium assimilation that 347 can be directly incorporated into these molecules either after nitrate or atmospheric 348 nitrogen assimilation, acting as nitrogen carrying biomolecules. Moreover it has been 349 observed that the exogenous addition of the AHL signal to Gloeothece PCC6909 350 cultures increases the expression of ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase 351 (RuBisCo) (Sharif et al., 2008). Evidences exist that Gloeothece secretes aminoacids 352 when the nitrogen fixation rate exceeds the growth capability of the cyanobacterium 353 (Flynn & Gallon, 1990). It is therefore possible that Gloeothece regulates its nitrogen 354 and carbon balance depending on the population density (Sharif et al., 2008). Perhaps 355 the effects observed when exogenous AHLs are added to Anabaena sp. PCC7120 are 356 related to a C/N imbalance. When enough concentration of AHL is introduced in liquid 357 cultures, it could unbalance the available levels of nitrogen and carbon in the cells, 358 Page 15 of 24 ScholarOne Support 1-434/817-2040 ext 167 FEMS Microbiology Letters 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 371 For Peer Review 16 which would explain the lethal effect of OC10-HSL in non diazotrophic medium and 359 the total nitrogenase activity inhibition in the absence of combined nitrogen. 360 The presence of acylase activity against AHLs described in the biomass of Anabaena 361 sp. PCC7120 (Romero et al., 2008) could be related to the negative effects of AHLs in 362 this cyanobacterium. This AHL-degradation mechanism would protect the filaments, at 363 normal environmental concentrations, from exogenous signals with potential cytotoxic 364 and inhibitory activities on the cyanobacterium. 365 366 In conclusion, N-acylhomoserine lactones do not seem to affect the process of 367 heterocyst differentiation because no changes were observed in the frequency, pattern of 368 differentiation, permeability of the heterocyst cell wall, or expression of regulatory 369 genes whose products are involved in differentiation (ntcA). The strong inhibition of 370 nitrogenase activity observed could be related to nitrogen fixation blockage at a post-371 transcriptional level, mainly on new forming heterocysts, or/and to an C/N unbalance 372 affecting energetic equilibrium of the cells. A possible new activity of AHL signals was 373 found for OC10-HSL, differing from those already described for Oxosubstituted and 374 AHL tetramic acid derivatives. 375 376 Acknowledgements 377 This work was financed by a grant from Consellería de Innovación e Industria, Xunta de 378 Galicia PGIDIT06PXIB200045PR. Manuel Romero was supported by a FPU 379 fellowship from the Spanish Ministry of Science and Education and a predoctoral 380 fellowship from Diputación de A Coruña. We would like to thank Professor Kim D. 381 Janda and Dr. Gunnar F. Kaufmann for kindly providing us with OC12-Tetramic acid. 382 Page 16 of 24 ScholarOne Support 1-434/817-2040 ext 167 FEMS Microbiology Letters 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Anexos/Annexes 372 For Peer Review 17 383 References 384 Bachofen R & Schenk A (1998) Quorum sensing autoinducers - do they play a role in 385 natural microbial habitats. Microbiol Res 153: 61-63. 386 Burton EO, Read HW, Pellitteri MC & Hickey WJ (2005) Identification of acyl-387 homoserine lactone signal molecules produced by Nitrosomonas europaea strain 388 Schmidt. Appl Environ Microbiol 71: 4906-4909. 389 Davies J (2006) Are antibiotics naturally antibiotics? J Ind Microbiol Biotechnol 33: 390 496-499. 391 Davies J, Spiegelman GB & Yim G (2006) The world of subinhibitory antibiotic 392 concentrations. 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