Diagnóstico molecular de la sepsis

TESIS DOCTORAL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA SEPSIS Manuela Hernández Blanco DEPARTAMENTO MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA FACULTA DE MEDICINA SANTIAG0 DE COMPOSTELA 2016 TESIS DOCTORAL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA SEPSIS Fdo. Manuela Hernández Blanco DEPARTAMENTO MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA FACULTAD DE MEDICINA SANTIAG0 DE COMPOSTELA 2016 AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS D. Benito Jose Regueiro García (Director) Catedrático del Departamento de Microbiología y Parasitología Clínica D. Julián Álvarez Escudero (Codirector) Catedrático del Departamento de Cirugía Dña. Alicia Estévez Tranzo (Tutora) Catedrática del Departamento de Microbiología y Parasitología Clínica Como Directores y Tutora de la Tesis de Doctorado titulada: «DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA SEPSIS» Presentada por Dña. Manuela Hernández Blanco Alumno del Programa de Doctorado. Avances en Microbiología y Parasitología Clínica. Autoriza a presentación da tese indicada, considerando que reúne os requisitos esixidos no artigo 34 do regulamento de Estudos de Doutoramento, e que como Director da mesma non incurre nas causas de abstención establecidas na lei 30/1992. Fdo. D. Benito Jose Regueiro García Fdo. D. Julián Álvarez Escudero Fdo. Dña. Alicia Estévez Toranzo Agradecimientos Este trabajo está dedicado nuestro compañero Dr. Eduardo Varela al que deseo dar las gracias por el valioso trabajo realizado. Su sabiduría creó escuela de la que todos nos hemos beneficiado y su grandeza como persona nos dio una lección de vida. Espero que desde donde quiera que esté se sienta orgulloso de los resultados. Es un privilegio contar con profesionales en los que el trabajo diario se convierte en un aprendizaje continuo. Mi más sincero agradecimiento a las personas que me han brindado su ayuda, mención especial a: Dr. Benito Regueiro director del proyecto por tener la deferencia de aceptarme bajo su dirección. Dr. Julián Álvarez Escudero codirector de la tesis por su valiosa gestión en la coordinación con las unidades de críticos. Dr. Ángel Fernández responsable de facilitar los datos de Cirugía Cardiaca. Dra. Alicia Estévez Tranzo por su disponibilidad para ejercer como tutora. D. Antonio Gómez Tato por la realización del programa estadístico. D.Arturo Soto Fernández por la revisión del texto. A todos mis compañeros de Microbiología y equipo de investigación de del CHUS A mi familia y amigos porque sufren como nadie las consecuencias de mis actos, con un enorme abrazo para mi hijo Manuel por el tiempo le ha restado la realización de este trabajo. A nuestro entrañable Edu ÍNDICE 1.-INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 21 1.1 Historia de la sepsis ...................................................................................................... 23 1.2 Definiciones relacionadas con sepsis .Concepto .......................................................... 24 1.2.1 Definiciones ...................................................................................................... 25 1.2.2 Criterios diagnósticos........................................................................................ 26 1.3 EPIDEMIOLOGÍA ....................................................................................................... 28 1.3.1 Incidencia y mortalidad..................................................................................... 28 1.3.2 Factores de riesgo ............................................................................................. 29 1.3.2.1 Factores poblacionales ..................................................................................... 30 1.3.2.2 Factores ambientales ........................................................................................ 31 1.3.2.3 Factores socioeconómicos ............................................................................... 31 1.3.3 Evolución cronológica de los microorganismos y lugar de la infección. ......... 32 1.4 FISIOPATOLOGÍA ..................................................................................................... 34 1.4.1 Respuesta de huésped ....................................................................................... 34 1.4.2 Patogénesis de la sepsis .................................................................................... 36 1.5 MANIFESTACIONES CLÍNICAS .............................................................................. 39 1.5.1 Manifestaciones clínicas de sepsis incipiente ................................................... 40 1.5.2 Manifestaciones clínicas de disfunción de organica aguda. ............................. 40 1.6 DIAGNÓSTICO ........................................................................................................... 41 1.6.1 Historia clínica .................................................................................................. 42 1.6.2 Exploración física ............................................................................................. 42 1.6.3 Diagnóstico de laboratorio ................................................................................ 43 1.6.3.1 Hematología ..................................................................................................... 44 1.6.3.2 Bioquímica ....................................................................................................... 44 1.6.4 Diagnóstico microbiológico .............................................................................. 44 1.6.4.1 Elección de pruebas dignósticas según sospecha clínica ................................. 45 1.6.4.2 Hemocultivo .................................................................................................... 45 1.6.4.3 Pruebas serológias ........................................................................................... 46 1.6.4.4 Diagnóstico molecular de la sepsis. ................................................................. 47 1.6.5 Diagnóstico por imagen .................................................................................... 48 1.6.6 Diagnóstico diferencial ..................................................................................... 48 1.7 TRATAMIENTO .......................................................................................................... 48 1.7.1 Abordaje terapéutico de la sepsis ...................................................................... 48 1.7.2 Administración de fluidos ................................................................................. 49 1.7.3 Vasopresores ..................................................................................................... 49 1.7.4 Tratamiento de la infección ............................................................................... 50 1.7.5 Otras medidas terapéuticas ................................................................................ 50 1.7.5.1 Corticoides ...................................................................................................... 50 1.7.5.2 Control de glucemia ........................................................................................ 51 1.7.5.3 Asistencia respiratoria mecánica (ARM) protectora ....................................... 51 1.7.5.4 Nuevas estrategias ........................................................................................... 51 2.-OBJETIVOS ....................................................................................................................... 53 2.1 Objetivo principal .......................................................................................................... 55 2.2 Objetivos específicos..................................................................................................... 55 3-MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 57 3.1 Criterios clínicos de selección de pacientes y periodo de estudio................................. 59 3.1.1 Primer grupo: Grupo observacional. ................................................................. 59 3.1.2 Segundo grupo: Grupo intervencionista. ........................................................... 60 3.1.3 Tercer grupo control para valoración del nuevo método de extracción automatizado. .................................................................................................... 60 3.1.4 Cuarto grupo pacientes seleccionados estudio endocarditis. ............................. 60 3.2 Muestras y técnicas microbilógicas convencionales de diagnóstico ............................. 61 3.2.1 Hemocultivos ..................................................................................................... 61 3.2.2 Estudios de microbiología convencional ........................................................... 61 3.2.3 Procesamiento e identificación de los microorganismos por métodos fenotípicos: ........................................................................................................ 61 3.2.4 Diagnóstico molecular: Multiplex SeptiFast® .................................................. 61 3.2.5 Extración de ADN ............................................................................................. 62 3.2.5.1 Protocolo extracción del ADN bacteriano por el método SeptiFast Prep Kit: .................................................................................................................. 63 3.2.5.2 Diseño de método automatizado: Extracción del ADN bacteriano por el método MagNA Pure Compact . ..................................................................... 63 3.2.6 PCR en tiempo real ............................................................................................ 64 3.2.6.1 Amplificación por PCR y detección a tiempo real en el sistema LightCycler® 2.0: ........................................................................................... 66 3.3 Comparación del sistema Septifast Prep Kit y el sistema MagnaPure Compact en la preparación de ADN: ............................................................................................ 70 3.3.1 Primer control: recuperación de ADN genómico E.coli ................................... 71 3.3.2 Segundo control: recuperación de ADN genómico de cepas referencia ATTC ................................................................................................................ 71 3.3.2.1 Recuperación de ADN en bacterias completas en buffer TE pH 8 .................. 72 3.3.2.2 Ensayo de SeptiFast para comprobar la capacidad de detectar el ADN de las 20 cepas de referencia en sangre con EDTA de donante sano. .................. 73 3.3.3 Calculo control interno ..................................................................................... 74 3.4 Estudio de interferencia del ADN genómico con la extracción de ADN bacteriano mediante MagNA Pure Compact ................................................................ 74 3.4.1 Mezcla de ADN estándar E.coli con ADN placenta ......................................... 74 3.4.2 Mezcla de ADN estándar E.coli en sangre total con recuento periférico de leucocitos normal. ........................................................................................ 75 3.4.3 Evaluación clínica de los dos métodos de extracción de ADN ........................ 76 3.5 Análisis estadístico: ...................................................................................................... 78 3.6 Determinación del polimorfismo C-159-T en el promotor del gen del receptor CD14 ............................................................................................................................. 78 3.6.1 Amplificación a partir de ADN genómico y análisis de restricción ................. 79 3.6.2 PCR en tiempo real y melting peaks para determinación el SNP ..................... 80 3.7 Diagnóstico de endocarditis infecciosa a partir de tejido valvular ............................... 81 3.7.1 Extracción de ADN de vegetaciones de válvulas cardíacas con el sistema automático MagNA Pure Compact ...................................................... 82 4.-RESULTADOS ................................................................................................................... 83 4.1 Análisis comparativo del rendimiento de SeptiFast (ROCHE) con los procesos de diagnóstico habitual utilizados en el laboratorio de microbiología. ........................ 85 4.1.1 Comparacion del SeptiFast con el Hemocultivo .............................................. 85 4.1.2 Comparación de los resultados de SeptiFast con los obtenidos por el conjunto de procesamientos microbiológicos convencionales ......................... 89 4.2 Modificación de la técnica de extracción de ácidos nucleicos de sangre periférica para PCR LightCycler - SeptiFast ................................................................ 90 4.2.1 Rendimiento de las dos técnicas para recuperación de ADN control ............... 91 4.3 Estudio de Interferencia del ADN genómico en la extracción de ADN bacteriano con MagNA Pure Compact ......................................................................... 95 4.3.1 Mezcla de ADN de placenta con ADN de E. coli............................................. 95 4.3.2 Interferencia de sangre total (10.710 leucocitos/μl) con ADN de E coli. ......... 96 4.3.3 Evaluación clínica de los dos métodos extracción ............................................ 97 4.4 Beneficio terapéutico del diagnóstico molecular ........................................................ 102 4.5 Rendimiento económico de SeptiFast en pacientes con sepsis. Estimación de costes. Consumo de recursos ....................................................................................... 113 4.6 Polimorfismo C-159-T del promotor de CD14 ........................................................... 115 4.7 Diagnóstico de infección polimicrobiana mediante la PCR LightCyclerSeptiFast...................................................................................................................... 118 4.8 Diagnóstico de Aspergilosis invasiva mediante PCR LightCycler SeptiFast............. 120 4.9 Diagnóstico de endocarditis infecciosa mediante PCR LightCycler SeptiFast en muestras de tejido valvular .......................................................................................... 123 6.-DISCUSIÓN ...................................................................................................................... 125 6.1 Modificación de la técnica de extracción de ADN ..................................................... 130 6.2 Beneficio terapéutico con el diagnóstico molecular ................................................... 135 6.3 Rendimiento económico de SeptiFast en pacientes con sepsis. Estimación de costes. Consumo de recursos ....................................................................................... 138 6.4 Posible influencia del polimorfismo C-159-T en el promotor de CD14 en nuestro medio sobre la mortalidad .............................................................................. 139 6.5 Diagnóstico de la infección polimicrobiana ................................................................ 140 6.6 Diagnóstico molecular de Aspergilosis invasiva ........................................................ 142 6.7 Diagnóstico molecular de Endocarditis infecciosa ..................................................... 143 6.8 Aplicaciones específicas en las que la PCR pudiera aportar un mejor apoyo en el diagnóstico de la sepsis. .......................................................................................... 145 7. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 147 7.1 CONCLUSIONES ESPECÍFICAS ............................................................................. 149 7.2 CONCLUSION GENERAL. RESUMEN FINAL ..................................................... 151 8.- BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................. 153 1.-INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 23 Las infecciones graves en los pacientes de las unidades de cuidados intensivos (UCI) se asocian a una elevada morbilidad y mortalidad, sobre todo cuando su diagnóstico y tratamiento se retrasan más allá de las primeras 6 horas después del ingreso en la UCI 1. Esta rápida evolución de algunos cuadros clínicos obliga al laboratorio a mantener un contacto inmediato con estas unidades, avanzando cualquier hipótesis diagnóstica antes de que se pueda emitir un informe definitivo. Las limitaciones de algunos métodos tradicionales, que requieren de la viabilidad y del desarrollo de los microorganismos, siguen condicionando el inicio de terapias empíricas para mejorar el pronóstico de estos cuadros, que no admiten una respuesta microbiológica dilatada. Las modernas técnicas de biología molecular, utilizadas ampliamente con éxito durante los últimos años, constituyen una poderosa herramienta para acelerar los diagnósticos microbiológicos, pero su aplicación resulta muy difícil de adaptar a cuadros de etiología tan compleja como la sepsis. La elaboración de un método molecular para el diagnóstico de bacteriemia como causa de un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, que comprenda un espectro lo más amplio posible o que ayude a descartarla en pocas horas, era uno de los retos pendientes hasta las recientes fechas en que se comenzó a introducir SeptiFast (ROCHE) en un reducido número de laboratorios, entre los que se encuentra el nuestro, donde hemos podido evaluar su aportación al diagnóstico precoz de la sepsis. 1.1 Historia de la sepsis Las enfermedades infecciosas han sido la mayor amenaza contra la salud a lo largo de la historia de la humanidad, y aún hoy en día representan la causa de más impacto en la patología del hombre moderno. Los microorganismos responsables de ellas poseen una enorme capacidad de adaptación a los cambios medioambientales como resultado de millones de años de evolución, y muchos de ellos conviven con nosotros desarrollándose en los tejidos que están en contacto con el “medio externo”. La infección tiene lugar cuando alguno de estos microorganismos o sus constituyentes superan el aislamiento interior, desencadenando una respuesta inmune que intentará eliminar la invasión, reparar el daño local causado, y evitar su progresión al resto del organismo.2 INTRODUCCIÓN 24 Desde los más antiguos tratados sobre Medicina, tenemos constancia del temor que suscitaba en nuestros antepasados la posible extensión generalizada de una infección, y de algunas de las medidas o precauciones que se tomaban para evitar este riesgo de tan extrema gravedad. Así en el “papiro Ebers”, compuesto en escritura hierática egipcia hacia el año 1550 a.C., se advierte del peligro de hinchazones malolientes con mucho pus y aire en su interior, que si se inciden quirúrgicamente pueden extender su mal a todos los miembros del cuerpo, de modo que luego se asemejan al que fue afectado primero. El concepto de sepsis data de los tiempos de Hipócrates. Los antiguos griegos la consideraban una descomposición biológica que ocurría dentro del cuerpo causada por unos “principios internos” capaces de provocar una peligrosa autointoxicación, resultante en una putrefacción maloliente. 3 De aquí procede el significado etimológico del término sepsis: sēpσήπω (gr. ‘pudrir’) más el sufijo -sis σήψις (pudrir-se) Sepsis es pues, sinónimo de putrefacción. El concepto de “generación espontánea” perduró durante siglos, hasta que Louis Pasteur realizó su elegante experimento en 1859 demostrando que el proceso de putrefacción no tiene lugar sin la participación de organismos vivos 4 y poco después, en la década de 1870, Robert Koch describió los agentes etiológicos de enfermedades como el ántrax, la tuberculosis o el cólera 5 además de formular sus conocidos postulados sobre las enfermedades infecciosas. 4 En nuestros tiempos, la definición de algunos conceptos clínicos relacionados con las enfermedades infecciosas todavía es objeto de debate, y aunque poseemos eficientes fármacos antimicrobianos, el manejo de la sepsis continúa siendo uno de los retos más importantes de la medicina intensiva, y probablemente ninguna otra entidad, requiere de habilidades médicas tan complejas como las necesarias para el satisfactorio tratamiento del shock séptico. 6 1.2 Definiciones relacionadas con sepsis. Concepto Dada la ambigüedad presentada por múltiples definiciones a lo largo de muchos años, en las conferencias de consenso del American College of Chest Physicians / Society of Critical Care Medicine (ACCM/SCCM) en 1991 con la intención de unificar criterios, se INTRODUCCIÓN 25 proponen nuevas definiciones sobre la sepsis y los procesos relacionados.7 Estas sociedades por comité de expertos de ámbito internacional elaboran guías de actuación que integran dos partes: Definiciones, criterios diagnósticos y recomendaciones en el abordaje terapéutico de la sepsis. Las guías se revisan de forma periódica y el objetivo es que orientar al clínico sobre el manejo de la sepsis.8-10 Sumándose a esta iniciativa, las diversas sociedades medicas han elaborado protocolos de actuación de carácter nacional, adaptaciones de las guías internacionales y que pretenden difundir y facilitar el manejo de la sepsis en nuestros hospitales.11.12 No obstante, a pesar de los esfuerzos, hoy día estas definiciones continúan siendo inespecíficas y precisan de criterios diagnósticos para delimitarse y aunque no han sufrido muchas modificaciones, se han adaptado e incorporado algunos conceptos que sientan las bases de las actuaciones clínicas. 1.2.1 Definiciones Infección: Presencia de microorganismos en un sitio normalmente estéril que por lo general se acompaña de una respuesta inflamatoria del huésped. Bacteriemia: Se define como la presencia de bacterias viables en la sangre, confirmada mediante hemocultivos positivos. Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SRIS): Concepto incorporado en la conferencia celebrada 1992 para definir la respuesta del organismo frente a una amplia variedad de procesos, infecciosos o no, que actúan como una agresión inespecífica (infección sistémica, quemaduras, isquemia, politraumatismo, shock hemorrágico, pancreatitis, cirugía mayor, lesión autoinmune…) y que en realidad representa las manifestaciones clínicas de la respuesta inflamatoria generalizada ante dicha injuria. 8 Sepsis: Se define como la presencia posible o documentada de una infección junto con las manifestaciones sistémicas de infección. Sepsis grave: Sepsis sumada a disfunción orgánica inducida por sepsis o hipoperfusión tisular. Hipoperfusión tisular inducida por sepsis: Hipotensión inducida por infección lactato elevado u oliguria. INTRODUCCIÓN 32 el Reino Unido (27,1%) y Brasil (27,3%), refleja una escasez de camas de UCI ya que sólo los pacientes más enfermos pueden ser admitidos. Hay 8,6 camas de UCI por 100.000 habitantes en el Reino Unido en comparación con el 38,4 y el 30,5 por 100 000 en Francia y en los Estados Unidos, en donde la frecuencia UCI media de la sepsis es de 12,4% y 12,6%.46 El nivel socioeconómico influye de manera importante sobre la mortalidad, una educación avanzada, empleos bien remunerados y vivir en barrios con baja pobreza, tienen una mayor esperanza de vida y las comorbilidades más bajas.47-49 Las causas no son claras a nivel individual, puede que influyan factores inmunológicos.50 La relación es directa en el caso de otros condicionantes, las personas nivel sociocultural alto, tienen acceso a un sistema sanitario con mejores condiciones, el vivir en zonas más desarrolladas, implica que los accesos a los hospitales estén conectados por autovías y helipuertos que acorta el tiempo de traslado al hospital. Son zonas dotadas de unidades medicalizadas con posibilidades de administrar tratamiento inicial, canalizar vías y administrar fluidos. Los hospitales son de referencia, con unidades de triaje en el servicio de Urgencias, que permiten una selección rápida. Una vez ingresados, cuentan con mayor nº de camas en unidades de críticos dotados de pruebas específicas y con profesionales de todas las especialidades de guardia las 24 horas que permiten efectuar una intervención inmediata de manera multidisciplinar, circunstancias clave, en el diagnóstico y tratamiento de la sepsis. 1.3.3 Evolución cronológica de los microorganismos y lugar de la infección. Los microorganismos evolucionan a lo largo de los años de forma paralela a la raza humana o es posible, que la evolución de la raza humana condicione la evolución de los patógenos. El desarrollo de la medicina, ha dado lugar a que se realicen mayor número de intervenciones quirúrgicas de alto riesgo antes impensables, la colocación de dispositivos va en aumento y el empleo de antibióticos de amplio espectro ha supuesto la aparición de microorganismos multiresistentes por presión antibiótica. Una adecuada evaluación clínica del paciente con bacteriemia, debe plantear una serie de cuestiones clave que nos permitan anticipar su orientación diagnóstica.51 Estas averiguaciones junto con el conocimiento de la epidemiología local, permitirán establecer un juicio clínico, incluida la etiología más probable e iniciar el tratamiento de forma más adecuada. INTRODUCCIÓN 33 La localización y el tipo de microorganismo es variable, dependiendo si se trata de una infección comunitaria, asociada a cuidados sociosanitarios ó nosocomial. Se considera infección comunitaria, la que se detectada dentro de las primeras 48 horas de hospitalización, no mediando durante ese periodo ninguna actividad asistencial que pueda haberla inducido. Las infecciones asociadas a cuidados sanitarios son las secundarias a procedimientos diagnósticos o terapéuticos realizados de forma ambulatoria, las de pacientes ambulatorios portadores de sondas o catéteres intravenosos, las de pacientes en hemodiálisis crónica y en diálisis peritoneal y las bacteriemias de pacientes ingresados en residencias de ancianos y en centros de larga estancia. Las infecciones nosocomiales, son la adquiridas en el hospital, excluyendo aquellas que se detectan en las primeras 48 horas, cuando ninguna acción sobre el paciente, haya podido inducirla después del ingreso. 52-53 Alrededor de un tercio de los pacientes ingresados en centros de tercer nivel, presentan en el momento de su ingreso o desarrollan durante su estancia en el hospital un SRIS, y dicha prevalencia supera el 50%, en aquellos que requieren atención en unidades de cuidados intensivos (UCI), de estos pacientes críticos, aproximadamente, un 25% sufrirá un episodio de sepsis. Hasta hace poco la localización más frecuente era la infección urinaria en la actualidad, se considera la más frecuente la infección respiratoria, principalmente la neumonía, que presenta mayor mortalidad.54 Prevalencia Europea de Infección en Cuidados Intensivos estudio EPIC (II) informó más organismos gram-negativas (62,2% vs. 46,8%). Los patrones de microorganismos infecciosos, son similares a los de estudios previos. Los microorganismos predominantes son S.aureus (20,5%), Pseudomonas (19,9%), Enterobacteriaceae (principalmente E.coli, 16,0%), y hongos (19%). Acinetobacter estaba involucrado en 9% de todas las infecciones, con una variación significativa de las tasas de infección, en las diferentes regiones (3,7% en América del Norte vs. 19,2% en Asia). Lancet Infect Dis. 2013 Mar; 13 (3): 260-268. INTRODUCCIÓN 34 Estos datos, se correlacionan con el estudio de prevalencia de infección nosocomial en España EPINE. En la infección comunitaria, un 36.56% son enterobacterias, el 8.69% de BGN no fermentadores, frente a un 28.19% de cocos Gram positivos, 3.64% levaduras, 3.04% de anaerobios y 11.79% víricas. En la infección nosocomial, las enterobacterias prácticamente es el mismo porcentaje, suponen un 35.5%, con aumento significativo de los BGN no fermentadores que suponen un 15.07%, los cocos Gram positivos el 35.15%, las levaduras en un 8.19%, disminuye el porcentaje de enfermedades virales al 0.42%. En la infección nosocomial los patógenos más frecuentes es Escherichia coli en un 15.17% seguido de Pseudomona auruginosa que supone el 11.18%. 55-56 En la epidemiologia de la sepsis intervienen múltiples factores: poblacionales, medioambientales, socioeconómicos y culturales. La localización y los microorganismos tambien es variable, esta situación, implica establecer un marcaje estrecho a los microorganismos, ya que el conocimiento exhaustivo de la epidemiología de forma global en todas sus facetas: periódica, estacional, regional, local, intrahospitalaria y en las diferentes unidades médicas y por supuesto prestando especial atención a las posibles epidemias y brotes nosocomiales que puedan surgir, es de vital importancia porque condiciona sobremanera el tratamiento empírico. 1.4 FISIOPATOLOGÍA Hoy día la causa principal de la sepsis continua siendo desconocida. La mayor parte de los experimentos se han realizado en ratones y aún nos encontramos en fase de descripción fenomenológica.57-58 El fracaso de ensayos clínicos de alto perfil ha llevado a los investigadores a afirmar que se los estudios de sepsis necesitan una nueva dirección.59 1.4.1 Respuesta de huésped Recientes investigaciones y la evidencia de que algunos pacientes sobreviven a la fase hiperinflamatoria de la sepsis y desarrollaron un estado antiinflamatorio retardado y prolongado, definido inicialmente como CARS, a desechado la teoría que la sepsis estaba producida por una tormenta de citocinas.60 Después de un considerable debate, se acordó por consenso que la sepsis puede evolucionar en dos fases: la primera es la hiperinflamación INTRODUCCIÓN 35 (tormenta de citoquinas) y el segundo ser hipo-inflamación (parálisis inmune).61La intensidad de la fase inicial hiperinflamatoria, es más habitual en pacientes jóvenes con el sistema inmune intacto, y depende de múltiples factores subyacentes: estado físico y comorbilidades del paciente, factores de virulencia de los patógenos, la carga de patógenos y factores genéticos. Las nuevas terapias y protocolos de tratamiento, han dado lugar a una enfermedad más prolongada, con un cambio hacia la fase de inmunosupresión, la sepsis es cada vez más una enfermedad de personas mayores, en los países a avanzados, suponen el 60% de los pacientes con una tasa mortalidad del 75%. La disfunción inmune, conduce a una mayor susceptibilidad a las infecciones bacterianas secundarias (neumonía asociada a ventilación mecánica [NAV] 62 infecciones con organismos normalmente no virulentas u oportunistas, reactivación latente de virus herpes (citomegalovirus [CMV]) ,63-64 un mayor riesgo de MODS y pérdida de respuesta retardada tipo hipersensibilidad a antígenos de recuerdo común. La investigación realizada por muchos grupos, ha demostrado que hipo-inflamación se debe a una variedad de defectos inmunes incluyendo una respuesta inmune adaptativa disfuncional. 65 Una tercera respuesta inmunológica teórica a la sepsis, se caracteriza por un ciclo entre hiperinflamatoria y estados hipoinflamatoria. Según esta teoría, los pacientes que desarrollan sepsis, tienen una respuesta hiperinflamatoria inicial seguida de un estado hipoinflamatorio y con el desarrollo de una nueva infección secundaria, los pacientes tienen una respuesta hiperinflamatoria repetición y pueden o bien recuperar o volver a entrar en la fase hipoinflamación. Los pacientes pueden morir en cualquier estado. Hay menos evidencia de esta teoría pero parece ser que cuanto más se prolongue la sepsis, existe un mayor riesgo de desarrollar una profunda inmunosupresión.66 Las primeras muertes durante la fase de respuesta proinflamatoria principalmente se deben a eventos de tormenta mediada por citoquinas, mientras que las muertes posteriores durante la fase anti-inflamatoria se deben a la falta de control de los patógenos. Normalmente en la sepsis temprana, predomina la respuesta proinflamatoria, cuando la sepsis avanza predomina la respuesta anti-inflamatoria y es durante esta fase cuando se producen infecciones secundarias y la reactivación viral. 65 INTRODUCCIÓN 36 1.4.2 Patogénesis de la sepsis La patogénesis de la sepsis es pues, el resultado de un complejo entramado de eventos cuyo desencadenante inicial, es la exposición al sistema inmunitario de diversos componentes bacterianos, que al ser reconocidos, inducen una respuesta inflamatoria descontrolada. Receptores activados del sistema inmune innato receptores de reconocimiento de patrones, (PRRS), que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) y patrones moleculares asociados a daños (apaga), incluyendo proteínas intracelulares asociada a tejido lesionado (alarmins), conducen a una respuesta imune exagerada. Este se caracteriza por una compleja interacción de citocinas, quimiocinas, complemento y factores de coagulación, así como células reguladoras inflamatorias e inmunes. 67-69 Además, los mecanismos neuronales pueden inhibir la inflamación. En el llamado reflejo neuroinflammatorio, la entrada sensorial se retransmite a través del nervio vago aferente hacia el tronco cerebral, posteriormente el nervio vago eferente, en el plexo celiaco, activa el nervio esplénico que libera en el bazo norepinefrina y en un subconjunto de células T CD4 + acetilcolina. La liberación de acetilcolina se dirige a los receptores colinérgicos α7 sobre los macrófagos, que origina a la supresión de la liberación de citoquinas proinflamatorias.70-72 El endotelio es el blanco principal de los eventos inducidos en la sepsis y la cantidad de daño de sus células explica la patología del choque séptico. La manifestación hemodinámica más grave de la sepsis es el choque hiperdinámico, caracterizado por un INTRODUCCIÓN 37 incremento del gasto cardíaco y una pérdida de la resistencia vascular periférica, acompañados, de una mala distribución del flujo sanguíneo en la microcirculación, en consecuencia a un deterioro de la oxigenación. La hipoperfusión, es un hallazgo común, aun en presencia de gasto cardíaco normal o aumentado, y está estrechamente relacionada con la disfunción de múltiples órganos y sistemas que caracteriza a la sepsis grave. La coagulación intravascular diseminada (CID), es frecuente en los pacientes sépticos, y se caracteriza por un depósito de fibrina y microtrombos que ocluyen la microcirculación, y están asociadas con el empeoramiento del cuadro clínico. Hay un creciente reconocimiento, de que el evento fisiopatológico importante en la sepsis, es la progresión del estado hiperinflamatoria inicial a un estado de inmunosupresión, en el que el huésped, es incapaz de erradicar los patógenos invasores y son particularmente propensos a desarrollar infecciones. Se caracteriza, por un incremento del gasto cardíaco y una pérdida de la resistencia vascular periférica, acompañados, de una mala distribución del flujo sanguíneo en la microcirculación, en consecuencia, un deterioro de la oxigenación. Durante varios años, la activación de la coagulación ha sido considerada únicamente como un mecanismo de daño tisular, un concepto que llevó a efectuar varios ensayos clínicos con agentes anticoagulantes para la sepsis. Recientemente, este paradigma ha sido cuestionado por el fracaso de los ensayos clínicos, y mayor crecimiento evidencia, que el concepto de que la activación de la coagulación es beneficioso para la eliminación de patógenos. 73 El retiro de mercado de la proteína C activada, recombinante (rhAPC), un anticoagulante natural que se utiliza en el tratamiento de la sepsis, representa el último capítulo de una historia caracterizada por fallos en serie de ensayos clínicos a gran escala, diseñados para poner a prueba la hipótesis generalmente aceptada de que la activación de la coagulación y trombosis microvascular fueron los principales determinantes de daño tisular en la sepsis.74 La coagulación y la inmunidad innata han evolucionado paralelamente durante 450 millones de años.75 La sepsis, una de las causas más importantes del mundo de muerte, es probablemente la condición en la que este vínculo evolutivo es más evidente. Durante la sepsis, la respuesta del huésped a un patógeno se asocia invariablemente con la activación de la coagulación. El reconocimiento de los patógenos invasores por la inmunidad innata INTRODUCCIÓN 38 desencadena mecanismos que contribuyen a la remoción de patógenos tales como la activación endotelial y el reclutamiento de células inmunes a los sitios de infección. Activación de la coagulación es parte de esta respuesta estereotipada. Durante la sepsis, el aumento de la expresión del factor tisular, la baja regulación de las vías de anticoagulantes naturales, y el resultado hipo fibrinólisis en una mayor generación de trombina y la formación de coágulos. Las consecuencias positivas de activación de la coagulación incluyen la liberación de péptidos antimicrobianos de la proteólisis de varias proteínas de la cascada de coagulación, y la limitación de patógenos difundida por la fibrina medida hemostática de contención. Sin embargo, la activación de la coagulación desregulada también podría contribuir a la trombosis microvascular y la hipoxia, lo que contribuye al daño tisular en la sepsis. La identificación precisa del momento en que la activación de la coagulación convierte de beneficioso un proceso perjudicial, permitiría aproximaciones terapéuticas más racionales para la sepsis.75-77 INTRODUCCIÓN 39 1.5 MANIFESTACIONES CLÍNICAS Las manifestaciones clínicas de sepsis son muy variables dependiendo del sitio inicial de la infección, el organismo causante, el patrón de la disfunción orgánica aguda, el estado de salud subyacente del paciente y el intervalo antes de la inicio del tratamiento. Los signos de infección y disfunción de órganos pueden ser sutiles, y por lo tanto las más recientes directrices de consenso internacional proporcionan una larga lista de señales de advertencia de la sepsis incipiente.78-88 INTRODUCCIÓN 40 1.5.1 Manifestaciones clínicas de sepsis incipiente La clínica de la sepsis de inicio puede ser larvada e insidiosa, es frecuente que se pase por alto la verdadera dimensión de cuadro clínico. Ciertos síntomas nos pueden poner bajo la sospecha de que el paciente esté iniciando o ya esté instaurado un cuadro séptico: La fiebre es una de los síntomas más comunes, pero puede estar ausente si el paciente está a tratamiento con antiinflamatorios, antitérmicos, es de edad avanzada, inmunodeprimido o tiene insuficincia renal. Con menos frecuencia, presenta hipotermia, que suele ser un signo de mal pronostico.89-92 La hiperventilación es frecuente y suele aparecer en las fases tempranas de la sepsis cuando aún no han aparecido otras manifestaciones clínicas, por lo que puede confundirse son cuadro de ansiedad. La hipotensión, sobre todo si estás asociada a un lactato elevado, debe alertarnos que nos encontramos ante un Shock séptico.93 Pueden presentar confusión y alteración del nivel de conciencia que se produce con mayor frecuencia en ancianos y enfermos neurológicos.94 En ocasiones, la morfología de las lesiones cutáneas sugiere la etiología de la infección desencadenante de la sepsis. Las petequias y la púrpura son frecuentes en los pacientes con sepsis.95-97bPueden presentar otra sintomatología que va depender de las manifestaciones locales del cuadro infeccioso de inicio. 1.5.2 Manifestaciones clínicas de disfunción de orgánica aguda La disfunción de órganos incluye comúnmente hipotensión, síndrome de distrés respiratorio agudo, alteración del estado mental, lesión renal aguda, íleo, disfunción hepática, coagulación intravascular diseminada, disfunción adrenal y síndrome del enfermo eutiroideo. El efecto acumulativo de la disfunción de órganos, es el predictor más fuerte de la mortalidad. Para los pacientes que sobreviven más allá de la sepsis temprana, la inmunosupresión aumenta el riesgo de infecciones secundarias. El compromiso pulmonar clásicamente se manifiesta como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), que se define como la hipoxemia con infiltrados bilaterales de origen no cardiaco. El diagnóstico diferencial con neumonía nosocomial es muy difícil. 99-102 A nivel cardiovascular, cursa principalmente como hipotensión o un nivel de lactato sérico elevado. Después de la expansión de volumen adecuada, la hipotensión persiste con frecuencia, requiriendo el uso de vasopresores y puede ocurrir disfunción miocárdica.103-114 INTRODUCCIÓN 41 La disfunción del sistema nervioso central se manifiesta típicamente como obnubilación o delirio u otros signos de encefalopatía no focal.115-122 La polineuropatía del paciente crítico y miopatía también son comunes, especialmente en pacientes con una estancia prolongada en la UCI. 123-127 Con frecuencia este proceso impide la retirada de la ventilación mecánica, en parte debido a la afección del nervio frénico.128 Los pacientes que sobreviven a este proceso pueden tardar meses en recuperarse completamente de la debilidad muscular.129 Las alteraciones renales consisten en oliguria con aumento de creatinina, pero también puede consistir en poliuria que puede deberse a la propia disfunción renal o a la hiperglucemia. La función renal puede complicarse por toxicidad medicamentosa. 130-132 A nivel digestivo son comunes síntomas inespecíficos, como nauseas vómitos que pueden confundir con un cuadro de gastroenteritis, tambien pueden presentar úlceras gástricas de estrés o íleo paralítico. El shock séptico puede acompañarse de graves complicaciones, como la necrosis hepatocelular aguda o la isquemia intestinal aguda.133-136 La CID o coagulopatía de consumo es muy frecuente en los casos de sepsis grave y clínicamente se manifiesta con la aparición de necrosis tisulares y disfunción orgánica generalizada, como consecuencia del desarrollo de trombosis diseminadas y con la tendencia al sangrado, como consecuencia del consumo exagerado de factores de la coagulación. 137-140 1.6 DIAGNÓSTICO El diagnóstico se establece mediante los criterios intrínsecos en definiciones, no obstante es variable e inespecífica, la enfermedad puede presentarse de una forma explosiva ó con sintomatología manifiesta que nos alertan sobre la gravedad del paciente, ó con sintomatología solapada que puede confundirnos con un proceso banal. No todos los pacientes con sepsis presentan criterios diagnósticos de SIRS. La base fundamental de diagnóstico que pone a prueba la pericia del profesional es una historia clínica y exploración física meticulosas apoyadas en las pruebas de laboratorio, el diagnóstico microbiológico y las técnicas de imagen.141-144 INTRODUCCIÓN 48 1.6.5 Diagnóstico por imagen Otros procedimientos de imagen, como los estudios electrofisiológicos, RX abdominal, ecografía abdominal o la ecocardiografía, la tomografía computarizada, la resonancia magnética, etc., son de gran utilidad para localizar la infección inicial desencadenante de la sepsis y para evaluar sus complicaciones.182-186 1.6.6 Diagnóstico diferencial El diagnóstico diferencial de la sepsis y especialmente de sus complicaciones, es muy amplio, e incluye, entre otras, a todas las demás enfermedades capaces de causar el SRIS. En cuanto al diagnóstico diferencial del shock séptico, es importante tener en cuenta que la mayor parte de cuadros de shock más comunes, como el cardiogénico o el hipovolémico, se caracterizan por el aumento de las resistencias vasculares periféricas. Sin embargo, existen algunos tipos de shock, en general poco frecuentes con una fisiopatología similar a la del shock séptico que incluye la disminución de las resistencias vasculares periféricas; se trata del shock anafiláctico y del shock relacionado con el beriberi, la cirrosis hepática, la sobredosis de narcóticos o el Síndrome de fuga capilar sistémica conocida como enfermedad de Clarkson. 187-195 1.7 TRATAMIENTO 1.7.1 Abordaje terapéutico de la sepsis En un importante esfuerzo por comprender y tratar adecuadamente la sepsis grave y el shock séptico, en el año 2002 surgió la Surviving Sepsis Campaign (SSC). Se trata de una iniciativa internacional sostenida por varias Sociedades Científicas de cuidados críticos del mundo, que tiene por objetivo disminuir la mortalidad de esta patología por medio de la elaboración e implementación de guías de práctica clínica.196 La última revisión publicada recientemente, modifican los paquetes de medidas ("bundles") recomendados hasta ahora. El "antiguo" conjunto de medidas de tratamiento se elimina, y las medidas de resucitación, se desdoblan en dos grupos, aumentando el énfasis en el reconocimiento y tratamiento INTRODUCCIÓN 49 precoces de la sepsis. Los dos nuevos paquetes de medidas se deben cumplir en las 3 y en las 6 primeras horas. Las guías recomiendan emplear el cumplimiento de los paquetes de medidas como indicadores de calidad.197 Los principios de la gestión paquete inicial, son proporcionar reanimación cardiorrespiratoria y mitigar las amenazas inmediatas de infección no controlada. La resucitación requiere el uso de fluidos y vasopresores por vía intravenosa con la terapia de oxígeno y ventilación mecánica proporcionada según sea necesario. 1.7.2 Administración de fluidos La administración temprana de líquidos por vía intravenosa, es el enfoque principal de los primeros minutos de la terapia de la sepsis grave. Ha habido un largo debate sobre la elección y adecuado volumen de líquido por vía intravenosa, las directrices actuales recomiendan cristaloides como la elección con un fluido inicial mínimo de 30 ml / kg, de los cuales una parte podría ser la albúmina. 10.78.198-202 1.7.3 Vasopresores La norepinefrina se recomienda como la primera opción para el uso de vasopresores en pacientes con shock séptico. 10,203-205 La dopamina se había utilizado ampliamente como un agente de primera línea pero en comparación con la norepinefrina, se asocia con una mayor tasa de arritmia. No se recomienda la dopamina en dosis bajas para la protección renal. Si se INTRODUCCIÓN 50 necesita una segunda dosis de vasopresores, se puede utilizar epinefrina o vasopresina.205 La vasopresina se puede agregar a la noradrenalina, pero no se recomienda como un único agente. 206 Por último, los agentes inotrópicos como dobutamina, se pueden utilizar si hay evidencia de disfunción miocárdica o hipoperfusión en curso a pesar de la reanimación con líquidos y la iniciación de vasopresores. 78.207-208 1.7.4 Tratamiento infección La administración de tratamiento antimicrobiano empírico eficaz de forma inmediata es de vital importancia, cada hora de retraso o de tratamiento inadecuado, aumenta de forma directa la mortalidad.209-211 Las unidades de críticos deberán ponerse en contacto con el servicio de microbiología, el análisis en conjunto del proceso infeccioso, permite canalizar las pruebas diagnosticas, para una mayor rentabilidad y adecuar la terapia empírica de una forma eficaz. Normalmente de inicio, se pautan antibióticos de amplio espectro hasta la identificación del agente etiológico responsable. El microbiólogo debe comunicar de forma inmediata al clínico el resultado del aislamiento, a la vez que se realizan los estudios de sensibilidad. La evaluación clínica diaria y adecuar el tratamiento una vez que dispongamos del antibiograma es necesaria para desescalar, mantener antibióticos de amplio espectro de forma continuada, aumenta la resistencia antibiótica, favorece otras infecciones por microorganismos resistentes, en consecuencia la mortalidad y el gasto hospitalario.211-214 1.7.5 Otras medidas terapéuticas El conjunto de recomendaciones completas se especifican en las guías 2013, en líneas generales, algunas consideraciones importantes son: 1.7.5.1 Corticoides Las directrices actuales, recomiendan iniciar corticosteroides por vía intravenosa a dosis bajas en los pacientes con Shock refractario, choque, que han permanecido hemodinámicamente inestables, incluso después de la reanimación con líquidos adecuada y el uso de vasopresores.10.215-216 INTRODUCCIÓN 51 1.7.5.2 Control de glucemia El control de la glucemia en los pacientes sépticos, no ha estado exento de controversia, mientras que se aconsejaba la terapia intensiva con insulina, un estudio posterior, demostró, que la terapia intensiva con insulina no disminuye la mortalidad.217 En la actualidad, las directrices recomiendan administrar insulina cuando dos mediciones consecutivas sean superiores a 180 mg/dl el objetivo, es mantener la glucemia en el rango 180mg/dl -110mg/dl. El control de la glucemia debe realizarse de inicio cada 2 horas y una vez se estabilice la glucemia, cada 4 horas. Recientes estudios abogan por la terapia de ciclo cerrado automatizado, basado en las mediciones de glucosa subcutánea continua, es un enfoque seguro y eficaz para el control de la glucosa en adultos críticamente enfermos. 218-219 1.7.5.3 Asistencia respiratoria mecánica (ARM) protectora En los pacientes con ARM se utiliza un volumen corriente de 6 ml/kg de peso y una presión meseta igual o menor de 30 cm H20; este tipo de ventilación protectora disminuye la mortalidad en pacientes con sepsis y lesión pulmonar aguda o SDRA. 10 .220-222 Otra medidas como administración de hemoderivados o medidas de soporte, se incluyen en las recomendaciones del 2013. En general, se deberán realizar el conjunto de medidas necesarias encaminadas al control del proceso infeccioso, como intervenciones quirúrgicas y drenaje de abscesos. En definitiva, la gestión de los pacientes críticos, deben incluir una discusión multidisciplinar de las medidas a tomar en cada caso particular. 1.7.5.4 Nuevas estrategias A pesar de los esfuerzos por desarrollar nuevos fármacos, la mayoría de ellos han fracasado. Recientemente, el uso de células mesenquimales que reparan la lesión y reducen la inflamación,223-224 terapias basadas en la purificación de la sangre 225 y aunque con resultados contradictorios la utilización de perfusión continua de polimixina B para contrarrestar los efectos perjudiciales de las bacterias en el endotelio,226-227 la modulación de la inmunidad innata con el uso de inmunoglobulina infusa (IgM enriquecido inmunoglobulinas)228y las terapias antioxidantes como la melatonina, 229parece ser prometedoras. Otros estudios perfilan la aspirina como un tratamiento potencial en la sepsis.230 INTRODUCCIÓN 52 Hasta la fecha, se han realizado más de 100 ECA (fases IIII) que buscan en las terapias que puedan modular la inflamación, con resultados contradictorios. Con más de 200 objetivos potenciales, es preocupante que no existen terapias definitivas para mejorar el resultado en pacientes sépticos. Serán necesarias más investigaciones para el desarrollo de nuevas terapias en la sepsis.231 2.-OBJETIVOS OBJETIVOS 55 2.1 Objetivo principal Hemos querido evaluar la aportación del método de diagnóstico molecular SeptiFast (ROCHE), en el diagnóstico precoz de la sepsis, con el propósito analizar el rendimiento clínico de la técnica manual, previo, al diseño de un método de extracción automatizado, basado en nanopartículas magnéticas que sustituya al manual, buscando acortar el intervalo de repuesta diagnostica que permita adecuar la terapia empírica de forma precoz, en consecuencia, la repercusión directa, suponga un descenso importante de la mortalidad, la estancia hospitalaria y los costes sanitarios. 2.2 Objetivos específicos 1º.- Comparar el rendimiento de SeptiFast (ROCHE) con el hemocultivo y otras técnicas de diagnóstico convencional utilizadas en el laboratorio de microbiología para la detección de microorganismos infecciosos en pacientes con sospecha de sepsis. 2º.- Modificar la técnica de extracción de ADN en la preparación de la muestra para PCR. Aplicación del sistema automático MagNA PureCompact - Nucleid Acid Isolation Kit I (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) comparando su eficacia con el equipo SeptiFast Prep Kit, recomendado por el fabricante. 3º.- Análisis de la funcionalidad de método automatizado MagNA PureCompact para conseguir identificar las dianas de Master list Septifast. 5º.- Estudio de la interferencia del ADN genómico en el proceso de extracción automático. 5º.- Evaluación clínica del método de extracción de ácidos nucleídos automatizado. 6º.- Beneficio terapéutico del diagnóstico molecular. 7ª Rendimiento económico de SeptiFast en pacientes con sepsis. Estimación de costes. Consumo de recursos. OBJETIVOS 56 8ºEstudio del polimorfismo del promotor del receptor del LPS, CD14, a partir del ADN obtenido de las muestras procesadas mediante SeptiFast y su posible implicación en la evolución clínica de la sepsis. Influencia en nuestros grupos de pacientes. 9º.- Análisis de el rendimiento de SeptiFast para la detección de infecciones polimicrobianas. 10ºDiagnóstico de Aspergilosis invasiva a partir de muestras de sangre periférica mediante SeptiFast. 11ºAplicación de la técnica SeptiFast en el diagnóstico de las endocarditis bacterianas. Estudio comparativo de las muestras procedentes de Cirugía Cardiaca (hemocultivo, cultivo válvulas cardiacas, tejido periprotésico, liquido pericardio, etc.) procesadas por cultivo/SeptiFast. 12º.- Directrices futuras en las que el método de extracción automatizado aplicado a la PCR pudiera aportar un mejor apoyo en el diagnóstico de la sepsis. 3-MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 64 Como evaluación de esta técnica automática para su aplicación a SeptiFast, se realizaron diferentes experimentos que se describen más adelante, con ADN estándar de E. coli (Sigma-Aldrich (USA) producto nº D4889) cepas bacterianas del listado de SeptiFast y muestras clínicas de pacientes con criterios de sepsis. El protocolo de extracción seleccionado para el ADN estándar en solución, a diferencia del especificado antes (“DNA-Bacteria”) fue el de “Lisis externa”, puesto que este ADN utilizado como control no precisa de lisis para su liberación. En este caso se parte igualmente de 400μl (solución de ADN control en buffer TE pH 8) pero la elución final se concentra en un volumen de 100μl. Por el mismo motivo, al no ser necesario romper la pared bacteriana, se prescindió de la etapa previa de lisis mecánica en MagNA Lyser. Como quiera que esta modificación metodológica ha podido condicionar los resultados a la hora de comparar el ADN recuperado a partir de las distintas fuentes, hemos repetido la prueba con el ADN estándar siguiendo el mismo protocolo que en la lisis bacteriana, para objetivar en qué medida los distintos procesos que ofrece el sistema automático pueden influir en el rendimiento final de la extracción. 3.2.6 PCR en tiempo real El sistema LightCycler® SeptiFast Test (Roche molecular Systems) es un método de PCR a tiempo real que detecta patógenos a partir de sangre total. El sistema detecta los microorganismos que provocan el 90% de las infecciones sanguíneas. Teniendo en cuenta que en la etiología de la bacteriemia en los pacientes de UCI, según el estudio según el estudio ENVIN 2015 los microorganismos más frecuentes están las bacterias gran negativas destacan microorganismos multirresistentes tales como E.coli (14.32%) Pseudomonas aureginosa (12.93%), Klebsiella pneumoniae (9.35%) (Acinetobacter baumannii (2.66%), Enterobacter cloacae (4.09%), cocos gram positivos, como los S.epidermidis (8.55%), Staphylococcus aureus (4.09%) Enteroccocus faecalis (7.01%); Enteroccocus faecium (3.29%) y la tasa de candidemias se sitúa entre 33%-55%, por lo que podemos afirmar que el sistema incorpora los principales patógenos productores de bacteriemia en estas unidades.236-237 Algunos de los microorganismos que detecta son los que con frecuencia se tratan de forma inadecuada con los tratamientos empíricos, tales como: Enterococcus spp., Candida spp y otros son microorganismos de difícil tratamiento como: Acinetobacter, MATERIALES Y MÉTODOS 65 Stenotrophomonas, Pseudomonas… por lo que la identificación temprana favorecerá la instauración rápida de una terapia adecuada. En la Tabla 1 se muestran todos los microorganismos que amplifica el sistema. Al tratarse de un sistema de amplificación que parte de sangre total y no de cultivo positivo, esta prueba detecta tanto bacterias/hongos viables como no viables, además puede detectar hasta 25 posibles patógenos en una sola muestra. Tabla 1. Lista de microorganismos detectados por el sistema SeptiFast La diana de amplificación del sistema son los “espaciadores de transcripción internos” (ITS). Se trata de regiones multicopia no codificantes altamente conservadas en el ADN ribosómico. Las ITS se encuentran entre las secuencias de ADN ribosómico 16s y 23s de todas las bacterias gran positivas y gram negativas y entre las secuencias de ADNr 18s y 5.8s de todos los hongos. Esta zona ofrece una mayor sensibilidad analítica que los genes de copia única ya que existen varios operones en los genomas bacterianos y de hongos. Además, las regiones ITS contienen más regiones específicas que el RNA ribosómico, por lo que resultan más adecuadas para la diferenciación de los microorganismos. En cada experimento se amplifica de forma simultánea la muestra problema junto con un control negativo (CN) y tres controles positivos (RC) para gram positivos, gram negativos y hongos. Además se amplifica un control interno (CI) añadido en el proceso de extracción, para garantizar la extracción eficiente de la muestra. El CI consta de moléculas sintéticas de ADN de doble cadena con sitios de unión de cebadores idénticos a los de las secuencias objetivo pero con regiones de unión de sondas únicas que permiten diferenciar la amplificación del CI del amplificado real. MATERIALES Y MÉTODOS 66 Antes de llevar a cabo la amplificación de la región diana, para reducir el riesgo de contaminación con amplicones, se pone en contacto el extracto de ADN con el enzima uracilN-glicosilasa, que reconoce y cataliza la destrucción de las cadenas de ADN que contienen desoxiuridina, pero no del ADN que contiene desoxitimidina. 3.2.6.1 Amplificación por PCR y detección a tiempo real en el sistema LightCycler® 2.0: La amplificación y detección a tiempo real se realiza en el instrumento LightCycler®: Un sistema automatizado que puede controlar el desarrollo de la amplificación del ácido nucleico diana mediante la medida de la fluorescencia producida en cada ciclo de amplificación. El instrumento realiza la amplificación generando un gradiente de temperaturas mediante corrientes de aire. Al igual que en otros sistemas de PCR a tiempo real, la amplificación y detección del producto final tiene lugar en un sistema cerrado, eliminando la posibilidad de contaminación. 238-239 El eluído final obtenido por ambos sistemas de extracción es sometido a tres reacciones paralelas de PCR diferentes utilizando el kit LightCycler® SeptiFast Mgrade (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) Tres alícuotas de 50 μl de la muestra preparada de ADN se añaden a las mezclas maestro correspondientes de cada PCR y se cargan en los capilares del sistema LightCycler, de 100 μl de capacidad. El ADN objetivo se amplifica en las tres reacciones paralelas utilizando el arranque en caliente de Taq polimerasa. Se amplifican las regiones ITS de gram positivos, gramnegativos y hongos, a partir de la unión de cebadores universales o específicos. Las condiciones de amplificación del experimento son las siguientes: MATERIALES Y MÉTODOS 67 Durante la fase de annealing del proceso de amplificación se produce la hibridación de las sondas específicas que emiten fluorescencia que será detectada por el sistema y se lee en uno de los cuatro canales de detección existentes. La sonda incorporada en la mezcla de reacción permite la detección a tiempo real y la diferenciación de cada uno de los microorganismos que detecta el sistema. Figura 1. LightCycler ® 2.0 El tipo de sondas utilizadas es el de las denominadas sondas FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) que consisten en sistemas compuestos por pares de oligonucleótidos marcados con sendas moléculas fluorescentes. Cuando dichas sondas se unen a sus secuencias complementarias (adyacentes en el ADN diana) los fluorógenos emiten una señal de fluorescencia en respuesta a la excitación por luz ultravioleta. Esta emisión MATERIALES Y MÉTODOS 68 puede ser registrada por el fotómetro del LightCycler, y es proporcional al número de moléculas del ADN diana amplificado en cada momento, sobre cuya secuencia hibridan las sondas FRET. Los marcajes fluorescentes se sitúan en el extremo 3´ de una de las sondas y en el extremo 5´ de la otra. La hibridación correcta de las sondas sobre sus respectivas secuencias sitúa a los dos fluorocromos próximos entre sí, de manera que la excitación de uno de ellos, el donador, transfiere su energía al aceptor, que a su vez, emite la fluorescencia que detecta el lector del equipo 239 Esta interacción molecular se fundamenta en el fenómeno físico conocido como transmisión de energía de resonancia de Förster, y depende de ciertas condiciones favorecedoras como la proximidad (1-10 nm) la orientación y la sobreposición de los espectros de emisión y de absorción de los fluorógenos. Figura 3. Sondas FRE Una vez finalizada la amplificación se genera un análisis de las curvas de disociación entre la sonda y el DNA objetivo. Este análisis se basa en la aplicación de un gradiente de temperaturas creciente para monitorizar la cinética de disociación de los fragmentos amplificados con la sonda específica, de esta forma podremos calcular la Tm (Tm= temperatura a la que el 50% del ADN está desnaturalizado). Cada fragmento amplificado tiene una Tm característica, que depende sobre todo, de la longitud y composición de sus bases 238 Por lo tanto, las sondas permitirán diferenciar las cepas por su Tm propia detectada en cada canal. En la Figura 4 se pueden observar la distribución de Tm que corresponden con cada uno de los microorganismos detectados por el sistema y los canales de detección de los mismos y los controles internos. MATERIALES Y MÉTODOS 69 MATERIALES Y MÉTODOS 70 El análisis de las Tm de las muestras y controles se realiza mediante un software de identificación especial (Software de identificación de SeptiFast: SIS) que genera un informe con los resultados. Las concentraciones bajas de SCN y Streptococcus spp. que reflejan el rango de contaminación de flujo de trabajo o de la extracción de la muestra, no se muestran como resultado. Esto supone una ventaja importante con respecto al hemocultivo, ya que permite diferenciar bacteriemias verdaderas de pseudobacteriemias o bacteriemias falsas.240 Para establecer el punto de corte a partir del cual los SCN y Strep spp. No son informados por el sistema, contamos con la posibilidad de cuantificar el ADN diana presente en la muestra. En PCR a tiempo real se define como Cp“crossing point” o Ct “threshold cycle” al ciclo en el que se empieza a detectar un incremento de fluorescencia significativo, con respecto a la señal de base. Con concentraciones previamente conocidas que nos permitan establecer una curva patrón, podemos inferir, según el valor de Cp de la muestra, la concentración inicial de ADN presente en la misma. Partiendo de esto, se han realizado estudios 241con los que se establecieron los puntos de corte que distinguen las posibles contaminaciones por bacterias gram-positivas a partir de su cuantificación en la muestra de sangre periférica. 3.3 Comparación del sistema Septifast Prep Kit y el sistema MagnaPure Compact en la preparación de ADN Ambos sistemas de extracción se evaluaron utilizando dos clases de ADN como control, en primer lugar ADN genómico de E. coli en forma de ADN estándar y el segundo control consistió en recuperación de ADN genómico de cepas de referencia ATTC. Posteriormente para la evaluación clínica del método automatizado, se analizaron en paralelo 106 muestras de sangre pertenecientes a 72 pacientes ingresados en la UCI del CHUS, que presentaban un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica con sospecha de sepsis. MATERIALES Y MÉTODOS 71 3.3.1 Primer control recuperación de ADN genómico E.coli Como primer control probamos la recuperación de ADN genómico de E. coli en forma de ADN estándar para nuestros test (E. coli es una de las dianas incluidas en la lista de bacterias que reconoce SeptiFast). Este ADN, suministrado por Sigma-Aldrich (USA) (producto nº D4889) es obtenido por purificación mediante ultracentrifugación por equilibrio de densidad de flotación en gradiente de cloruro de cesio y posee un tamaño aproximado a 16 Kb. Dicho ADN disuelto en buffer TE pH 8 y en alícuotas de diluciones seriadas, se procesó con las técnicas recomendadas por los fabricantes (descritas anteriormente) mediante el Septifast Prep Kit y el MagNA Pure Compact (MPC) siguiendo con este último dos protocolos diferentes: El protocolo para Lisis externa y el protocolo para Bacterial DNA (comentados en los métodos de extracción de ADN). Para el ADN estándar se prescindió de la lisis mecánica previa por agitación en MagNA Lyser, que en cambio si se realizó en el procesamiento de los otros tipos de muestras, las cuales, a diferencia del ADN estándar, se probaron exclusivamente con el protocolo de Bacterial DNA en el MPC. 3.3.2 Segundo control: recuperación de ADN genómico de cepas referencia ATTC El segundo control consistió en una mezcla de 20 cepas de referencia ATCC (American type culture Collection) en diferentes concentraciones que para validar la eficacia de la extracción y comprobar la calidad del ADN obtenido se realizaron dos experimentos diferentes: 1. Determinación del ADN recuperado de la mezcla de cepas ATCC preparada en buffer TE pH 8 por medición de fluorescencia con el sistema Qubit y el equipo Quant-iT® (Invitrogen, USA) capaz de cuantificar ADN entre 50 pg/μl y 200 ng/μl sin interferencia de contaminantes comunes como nucleótidos libres, disolventes, detergentes, o proteínas. 2. Ensayo de SeptiFast para comprobar su capacidad de detectar el ADN de E. coli y de las 20 cepas de referencia incluidas en la mezcla preparada en sangre total procedente de donantes sanos, después de la extracción por ambos métodos. MATERIALES Y MÉTODOS 72 Las cepas ATCC caracterizadas por su gran estabilidad genética se corresponden con las dianas que puede identificar Master list Septifast si bien es verdad que la técnica identifica 25 microorganismos nosotros solo utilizamos 20 ATCC dado que algunas por su proximidad genética (K.Pneumoniae/K oxytoca) se amplifican en el mismo canal y los picos de melting correspondientes están muy próximos en ocasiones prácticamente se superponen solo diferenciados por dos picos dentro de la misma curva con intervalos de TM mínimos por lo que no consideramos necesario incluir todas las cepas. Lista de cepas ATCC utilizadas: Acinetobacter baumannii (ATCC 19686) Enterobacter cloacae (ATCC 13847) Serratia marcescens (ATCC 14756) Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 51331) E. coli (ATCC 25922) Klebsiella pneumoniae (ATCC 70063) Proteus mirabilis (ATCC 12453) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) Staphylococcus aureus (ATCC 25923) Staph. epidermidis (ATCC 12228) Streptococcus pneumoniae (ATCC 49619) Str. agalactiae (ATCC 13813) Enterococcus faecalis (ATCC 29212) Ent. faecium (ATCC 35667) Candida albicans (ATCC90028) C. tropicalis (ATCC 750) C. parapsilosis (ATCC 22019) C. glabrata (ATCC 1526) C. krusei (ATCC 6258) Aspergillus fumigatus (ATCC 36607). 3.3.2.1 Recuperación de ADN en bacterias completas en buffer TE pH 8 El genoma de E. coli posee 4,6 x 106 pares de bases con un peso molecular aproximado de 2,5 x 109 Da, o lo que es lo mismo 4,1514 x 10-9 μg. En una suspensión bacteriana 0,5 McFarland con 108 bacterias/ml se alcanzaría una concentración de ADN genómico de E. coli próxima a los 0,4 μg/ml (suponiendo que la suspensión estuviese compuesta por una distribución homogénea de bacterias aisladas). En un intento de medir la eficacia de MPC para extraer ADN procedente de bacterias completas, preparamos múltiples diluciones en buffer TE pH 8 a partir de una suspensión bacteriana concentrada, obtenida de la mezcla de varias colonias de E. coli (ATCC 25922) desarrolladas en agar-sangre después de 24 h de incubación a 37ºC. La dilución con valor 0,5 McFarland medida en un nefelómetro se usó como referencia para estimar la concentración bacteriana de las demás suspensiones bacterianas. Para confirmar la aproximación en UFC/ml de la suspensión de referencia, esta se midió también por citometría. (Fig. 5) MATERIALES Y MÉTODOS 73 Las suspensiones bacterianas en TE pH 8 se sometieron a agitación mecánica en MagNA Lyser y posteriormente se procesaron para extracción de ADN en MPC siguiendo el protocolo DNA Bacterial de igual manera que para las muestras de ADN estándar y las muestras clínicas. La concentración de ADN en los 200 μl de la solución resultante al final del proceso de extracción se midió con el equipo Quant-iT® para establecer una relación con la cantidad estimada en las suspensiones bacterianas de origen, según los cálculos descritos anteriormente. 3.3.2.2 Ensayo de SeptiFast para comprobar la capacidad de detectar el ADN de las 20 cepas de referencia en sangre con EDTA de donante sano. Una vez comprobada la extracción de DNA de bacterias completas en buffer TE pH 8 y establecido el cálculo aproximado de la diluciones se procede a comprobar la capacidad del sistema para diferenciar los 20 patógenos incluidos en el test tras la extracción por ambos métodos, se determinó mediante el uso de cepas de referencia ATCC (American type culture Collection), que se caracterizan por su gran estabilidad genética. Se realizaron diluciones seriadas a partir de una dilución matriz que contiene 108 UFC/ml de cada microorganismo (turbidez 0.5 McFarland), inoculados en sangre de donantes sanos, obteniéndose así diluciones con las siguientes concentraciones: 25.105 UFC/ml, 5.103 UFC/ml, 50 UFC/ml, 5 UFC/ml, 2.5 UFC/ml y 0.5 UFC/ml. que se procesaron por ambos métodos MagNa Pure Compact. SFM y SeptiFast Mgrade Extrac. Manual. MATERIALES Y MÉTODOS 80 homocigotos TT o una sola banda de 497 bp, del producto sin digerir, para los homocigotos CC 246 3.6.2 PCR en tiempo real y melting peaks para determinación el SNP El SNP se pudo detectar también mediante el análisis de las curvas de melting de los productos de amplificación resultantes de la PCR a tiempo real. Para ello se utilizaron los siguientes primers y sondas FRET de hibridación, 245 capaces de reconocer la secuencia variable del promotor (Tib Molbiol. Berlin, Germany). Primers: sense 5’-GGTGCCAACAGATGAGGTTCAC-3’ antisense 5’-CTTCGGCTGCCTCTGACAGTT-3’ Sondas: LC-640 – 5’-TTCCTgTTACggCCCCCCT -3’– PH 5’-ggAgACACAgAACCCTAgATgCCCTgcA-3’ – FL La reacción, se realizó en capilares de 20 μl del LightCycler 2.0 con 5,3 μl de H2O; 0,5 μl de primers (10 μM) 1 μl y sondas (3 μM) y 3 μl de Fast Start DNA-Plus Master HybProbe (Cat Nº 03 515 575 001 – Roche Applied Science – Roche Diagnostics GmbH. Mannheim, Germany) a los que se añadieron 3,7 μl de ADN de las muestras de los pacientes. La programación de la PCR consistió en 9 min de preincubación a 95ºC, seguidos de 45 ciclos de 2 seg a 95ºC, 10 seg a 55 ºC y 11 seg a 72ºC, con adquisición de fluorescencia en modo single durante la fase de hibridación a 55ºC. Al final de los ciclos de amplificación se realiza una melting curve con 5 seg de desnaturalización a 95ºC y 10 seg de hibridación a 45ºC; seguidos de un aumento de temperatura a razón de 0,2 ºC/seg hasta los 85ºC con adquisición de fluorescencia en modo continuo. El software 4.0 del LightCycler calcula los melting peaks que nos permiten diferenciar la secuencia amplificada. MATERIALES Y MÉTODOS 81 3.7 Diagnóstico de endocarditis infecciosa a partir de tejido valvular En un considerable número de casos con sospecha clínica de endocarditis infecciosa (EI) que oscila entre el 2,5% y el 31%, la etiología microbiológica no puede ser confirmada por el hemocultivo. El crecimiento del microorganismo causante a menudo no es posible debido a la antibioterapia previa, a la recogida inadecuada o inoportuna de las muestras, o a la presencia de gérmenes exigentes y de crecimiento lento. Sin embargo, en los últimos años, el desarrollo de las técnicas de diagnóstico molecular ha permitido elaborar alternativas más capaces de alcanzar este diagnóstico etiológico. El ADN bacteriano es detectable mediante PCR y persiste de forma estable en el tejido valvular durante largos periodos de tiempo, sin que se haya podido determinar con certeza si la amplificación de estas secuencias de ADN es predictiva de un proceso infeccioso activo, aún cuando las bacterias no sean viables por cultivo. Las técnicas propuestas consisten principalmente en PCR de amplio espectro dirigidas a regiones del genoma bacteriano codificadoras del rRNA 16S, seguidas de la secuenciación de los productos de amplificación, las cuales ofrecen mayor sensibilidad y especificidad que los cultivos convencionales. 247-248 A pesar del buen rendimiento de estos procedimientos, su complejidad, su excesiva laboriosidad y la necesidad de personal técnico altamente especializado, dificultan su introducción como técnica de rutina en muchos laboratorios de Microbiología Clínica. En nuestro laboratorio hemos ensayado una alternativa que podría ser útil para la mayoría de los diagnósticos de endocarditis infecciosa, fácil de asimilar como método de rutina y que reduce el tiempo de diagnóstico a tan sólo 4 h. Se trata de la aplicación de la técnica LightCycler SeptiFast® como diagnóstico molecular de las endocarditis con cultivo negativo, a partir del tejido valvular. Entre agosto de 2007 y septiembre de 2009 se estudiaron 15 pacientes (11 varones y 4 mujeres) con EI activa sometidos a cirugía valvular. La media de edad fue de 70,2 años (intervalo 57 – 82) Todos presentaban EI definida según los criterios de Duke modificados 247 localizada sobre válvula nativa izda. (6 casos) prótesis valvular (8 casos) y válvula tricúspide (1 caso). MATERIALES Y MÉTODOS 82 Antes de ser remitidos para cirugía se habían extraído hemocultivos en distintos servicios hospitalarios, que resultaron positivos en 13 casos y negativos en 2. Todos los pacientes habían recibido tratamiento antiinfeccioso entre 24 h y 82 días antes, sin completar una pauta correcta. Durante la evaluación preoperatoria, realizada entre 1 y 24 días después del hemocultivo, se extrajo sangre para estudio mediante SeptiFast, y en la intervención quirúrgica, se introdujo una muestra de tejido valvular con vegetaciones o sólo vegetaciones, en el caso de prótesis, en un recipiente estéril libre de ADN y sin aditivos para la PCR. Un fragmento del tejido fue remitido para cultivo convencional en agar sangre, agar proteosa (CO2 5%) agar Sabouraud, agar Schaedler (anaerobiosis) y caldo tioglicolato. La identificación de los microorganismos aislados se llevó a cabo mediante el sistema Vitek 2 (bioMerieux, Nancy l’Etoile, Francia). 3.7.1 Extracción de ADN de vegetaciones de válvulas cardíacas con el sistema automático MagNA Pure Compact En condiciones estériles 20mg de una vegetación valvular se homogenizan en 750 μl de Tissue-Lysis buffer (ROCHE 1 796 828 High Pure PCR Template Prep kit) mediante lisis mecánica con bolas de cerámica y vidrio en el agitador MagNALyser® (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Germany) a 7000 rpm 70 seg. Tras sedimentación durante 10 min. Se recogen 400l μl del sobrenadante y se dispensan en un tubo para muestras, colocado en su correspondiente posición de la gradilla del MagNA Pure Compact. Una vez preparados los reactivos según las indicaciones del fabricante, e inmediatamente antes de comenzar el protocolo de extracción, añadimos a la muestra 4 μl l del Control Interno de SeptiFast®. Finalmente seleccionamos el programa para extracción de ADN bacteriano con la opción de 400 μl de volumen de muestra y 200 μl de volumen de elución. El instrumento realiza una extracción automática de ADN en 30 min. Mediante cromatografía de adsorción en partículas magnéticas y en condiciones de esterilidad, sin requerir más que una mínima manipulación de la muestra. 4.-RESULTADOS RESULTADOS 85 4.1 Análisis comparativo del rendimiento de SeptiFast (ROCHE) con los procesos de diagnóstico habitual utilizados en el laboratorio de microbiología 4.1.1 Comparación del SeptiFast con Hemocultivo. La identificación de microorganismos obtenida mediante la PCR SeptiFast en sangre periférica se comparó con el resultado del hemocultivo en las mismas muestras y con la revisión de los procedimientos convencionales de diagnóstico microbiológico a partir de otras muestras de estos mismos pacientes. El cálculo de sensibilidad, especificidad, valores predictivos y concordancia se realizó, en principio, sobre los dos primeros grupos de pacientes incluidos en el estudio, cuyas características poblacionales, diagnósticos de inicio y lugares de origen de la sepsis (cuando podía ser conocido) eran similares. No se hallaron diferencias estadísticamente significativas en relación a la edad, sexo o índices de riesgo entre los dos grupos de pacientes. (Tabla 1) Tabla 1. Datos clínicos y demográficos de los dos grupos de pacientes. Control LCS p N=54 N=48 Edad M 65.3 ± 14.7 64.4 ± 12.9 ns Sexo Masculino 45 35 Femenino 9 13 Diagnóstico inicial Abdomen agudo 11 9 Cirugía 2 2 Cirugía abdominal programada 4 Neumonía 1 7 Pancreatitis 9 5 Lesión en SNC 4 20 Politraumatismo / craneal 20 2 Trauma 3 1 Cirugía cardíaca 1 Diagnóstico de condición de sepsis Peritonitis 11 9 Neumonía 32 28 Meningitis 1 Endocarditis 2 2 Mediastinitis 2 2 Heridas / Infec. tejidos blandos 6 6 Infec. Urinaria 1 Indices de riesgo APACHE II 17.5 ± 6.3 16.8 ± 5.1 ns SOFA 8.8 ± 5.0 8.1 ± 4.1 ns RESULTADOS 86 Para dichos cálculos, en primer lugar, se tomaron como referencia los resultados obtenidos por el hemocultivo, si bien hemos de tener en cuenta sus limitaciones en cuanto a sensibilidad para establecer el diagnóstico etiológico de la sepsis. 249 La evaluación de ambos grupos se efectuó separadamente y en conjunto, estableciendo además dos modos de cálculo en cada caso: Por un lado comparando cada una de las determinaciones de SeptiFast con la correspondiente toma del hemocultivo y por otro analizando el seguimiento de cada paciente, como un caso, a lo largo de su estancia en la UCI y observando la eficacia de las dos técnicas para demostrar la presencia de microorganismos en algún momento de la evolución del cuadro. El software de SeptiFast realiza un análisis semi-cuantitativo para las PCR de grampositivos en los canales de lectura donde se identifican los SCN y los Streptococcus spp. con objeto de reconocer las posibles contaminaciones producidas por estas bacterias. Cuando se amplifica ADN de alguna de estas especies, el informe de resultados del sistema de identificación de SeptiFast (SIS) no refleja su presencia a no ser que el punto de corte de la curva de amplificación se encuentre por debajo de 35 ciclos, interpretando que la amplificación es causa de una falsa bacteriemia cuando se supera este umbral. De igual modo, hemos considerado que los hemocultivos con estos aislamientos son reflejo de contaminaciones, salvo aquellos en los que se obtuviese el crecimiento de la misma cepa en distintas tomas de muestra. En las tablas 2, 3 y 4 podemos ver los resultados de la comparación de SeptiFast con Hemocultivo atendiendo a cada una de las determinaciones realizadas en paralelo para los dos grupos de pacientes por separado (tablas 2 y 3) y para los dos grupos en conjunto (tabla 4) después de haber descartado los casos sospechosos de falsa bacteriemia. Tabla 2. SeptiFast / Hemocultivo Grupo 1º SeptiFast / Hemocultivo Grupo 1º Intervalos de confianza inferior superior Sensibilidad 42,1 20 66 Especificidad 84,12 78 88 Valor Predictivo Positivo 17,77 8 32 Valor Predictivo Negativo 94,68 90 97 Prevalencia 7.53 Ratio Prob. Test Positivo 2.65 1,44 4.85 Ratio Prob. Test Negativo 0.688 0,467 1,01 Kappa 0.161 RESULTADOS 87 Tabla 3. SeptiFast / Hemocultivo Grupo 2º SeptiFast / Hemocultivo Grupo 2º intervalos de confianza inferior superior Sensibilidad 45,45 16 76 Especificidad 84,05 73 91 Valor Predictivo Positivo 31,25 11 58 Valor Predictivo Negativo 90,62 80 96 Prevalencia 13,75 Ratio Prob. Test Positivo 2,85 1,22 6,63 Ratio Prob. Test Negativo 0,648 0,374 1,12 Kappa 0,247 Los resultados son similares en ambos grupos y por lo tanto en la tabla 4, que recoge los valores obtenidos por los dos grupos en conjunto, no se aprecian variaciones significativas. Tabla 4. SeptiFast / Hemocultivo Los 2 Grupos SeptiFast / Hemocultivo Los 2 Grupos Intervalos de confianza Inferior Superior Sensibilidad 43,33 25 62 Especificidad 84,1 79 88 Valor Predictivo Positivo 21,31 11 33 Valor Predictivo Negativo 93,72 90 96 Prevalencia 9,03 Ratio Prob. Test Positivo 2,72 1,67 4,42 Ratio Prob. Test Negativo 0,67 0,49 0,92 Kappa 0,187 En cuanto al cálculo de resultados para el estudio del seguimiento de cada paciente como un caso, si que se observan algunas diferencias en la sensibilidad y especificidad obtenidas en ambos grupos al confrontar SeptiFast con Hemocultivo, como se aprecia en las siguientes tablas. RESULTADOS 88 Tabla 5 SeptiFast / Hemocultivo Grupo 1º (seguimiento casos) Intervalos de confíanza inferior Superior Sensibilidad 72,22 46 90 Especificidad 72,22 54 85 Valor Predictivo Positivo 56,52 34 76 Valor Predictivo Negativo 83,87 66 94 Prevalencia 33,33 Ratio Prob. Test Positivo 2,59 1,42 4,73 Ratio Prob. Test Negativo 0,384 0,177 1,83 Kappa 0,415 SeptiF SeptiFast / Hemocultivo Grupo 2º (seguimiento casos) SeptiFast / Hemocultivo Grupo 2º (seguimiento casos) Tabla 6 SeptiFast / Hemocultivo Grupo 2º (seguimiento casos) Intervalos de confianza inferior superior Sensibilidad 38,46 13 68 Especificidad 79,16 57 92 Valor Predictivo Positivo 50 18 81 Valor Predictivo Negativo 70,37 49 86 Prevalencia 35,13 Ratio Prob. Test Positivo 1,84 0,65 5,22 Ratio Prob. Test Negativo 0,777 0,482 1,25 Kappa 0,186 Tabla 7. SeptiFast / Hemocultivo Los 2 Grupos (seguimiento casos) SeptiFast / Hemocultivo Los 2 Grupos (seguimiento casos) Intervalos de confianza Inferior Superior Sensibilidad 58,06 39 75 Especificidad 75 62 85 Valor Predictivo Positivo 54,54 36 71 Valor Predictivo Negativo 77,58 64 87 Prevalencia 34,06 Ratio Prob. Test Positivo 2,32 1,36 3,94 Ratio Prob. Test Negativo 0,559 0,36 0,86 Kappa 0,325 RESULTADOS 89 La sensibilidad de SeptiFast es mayor en el primer grupo, probablemente como consecuencia de un seguimiento más prolongado y con mayor número de determinaciones. 4.1.2 Comparación de los resultados de SeptiFast con los obtenidos por el conjunto de procesamientos microbiológicos convencionales Si comparamos los resultados de SeptiFast con los obtenidos por el conjunto de los procesamientos microbiológicos realizados a las distintas muestras de cada paciente además de los hemocultivos, también podemos encontrar una diferencia favorable al primer grupo, que puede ser debida a la mayor continuidad del estudio en estos pacientes. Tabla 8. SeptiFast / Hemocultivo + Micro. Grupo 1º (seguimiento casos) SeptiFast / Hemocultivo + Micro. Grupo 1º (seguimiento casos) Intervalos de confianza Inferior Superior Sensibilidad 52,77 35 69 Especificidad 94,44 72 99 Valor Predictivo Positivo 95 75 99 Valor Predictivo Negativo 50 32 67 Prevalencia 66,66 Ratio Prob. Test Positivo 9,49 1,37 65,42 Ratio Prob. Test Negativo 0,5 0,347 0,71 Kappa 0,444 Existe una discrepancia en el caso nº 24 en el que se amplificó S. maltophilia en una de las PCR y sin embargo no fue aislada en cultivo, pero en los hemocultivos de este paciente si crecieron SCN en las dos tomas recogidas en sendas ocasiones y en una toma más de dos correspondientes a otro hemocultivo. Al revisar las determinaciones de SeptiFast de este caso, hemos advertido la amplificación de ADN de SCN en concordancia con los hemocultivos positivos, aunque por debajo del punto de corte establecido para que el SIS informara de su detección. Si interpretásemos como contaminación la presencia de SCN en los hemocultivos de este paciente, siguiendo el criterio de SeptiFast, la tabla anterior sería válida, pero si consideramos también como posible contaminante a la S. maltophilia (dada su concurrencia con la amplificación en baja carga de SCN y que con relativa frecuencia este microorganismo se presenta como tal) entonces la tabla quedaría como sigue, alcanzando una especificidad y un valor predictivo positivo de 100%. RESULTADOS 96 sometidas todas las mezclas a extracción en MagNA Pure Compact (protocolo Bacterial DNA) se midió la concentración de ADN recuperado y se amplificó mediante SeptiFast la secuencia diana de E. coli para calcular la cuantificación absoluta. En la tabla 22 se pueden ver las medidas de la concentración de ADN y los puntos de corte (C.P.) de la amplificación. Tabla 22 ADN Placenta humana ADN Extrac MagNA Pure Cuantificación absoluta (C.P.) 190 g/ml 78,80 g/ml --- 95 g/ml 48,50 g/ml 32,14 47,25 g/ml 30,47 g/ml 22,19 23,75 g/ml 17,60 g/ml 18,34 11,875 g/ml 9,11 g/ml 18,36 En la muestra de concentración más alta no se amplificó el ADN de E. coli. En las otras muestras la carga detectada de E. coli fue mayor (menor punto de corte) a medida que disminuía la concentración total de ADN, salvo en las dos últimas muestras, en las que se invierte esta tendencia. 4.3.2 Interferencia de sangre total (10.710 leucocitos/μl) con ADN de E coli Una muestra de sangre sin bacteriemia con 10.710 leucocitos/μl se sometió a lisis mecánica en MagNA Lyser, de manera análoga a la preparación de muestras clínicas para SeptiFast y posteriormente se realizaron 3 diluciones 1:2 consecutivas en buffer TE. Sobre el lisado de la muestra original y las diluciones se añadieron 0,02 μg de ADN de E. coli como en el experimento anterior. El ADN obtenido por la extracción con MagNA Pure Compact de todas las diluciones se midió y se amplificó con SeptiFast para determinar la cantidad recuperada de ADN de E. coli y/o la posible interferencia del ADN genómico sanguíneo en la PCR. Tabla 23 Sangre (10.710 leucos/l) ADN Extrac MagNA Pure Cuantificación absoluta (C.P.) 400 l tras MagNA Lyser 40,8 g/ml 16,89 Dil 1:2 con TEB 15,7 g/ml 17,26 Dil 1:4 con TEB 8,07 g/ml 17,24 Dil 1:8 conTEB 4,12 g/ml 19 RESULTADOS 97 En contraste con la solución de ADN humano de placenta, en este caso no sólo no hubo inhibición de la PCR para E. coli en la muestra con mayor ADN genómico, sino que además se aprecia un aparente efecto paradójico que parece indicar una mayor recuperación de ADN de E. coli (C.P. más bajo en la PCR) cuanto menor es la dilución de la muestra de partida. Si observamos la medida de concentración en las diluciones obtenidas con el MagNA Pure podemos advertir un acusado descenso en la proporción del ADN recuperado de la primera dilución con respecto al obtenido de la muestra de sangre total sin diluir (la concentración del ADN extraído de esta primera dilución representa el 38,5% de la obtenida con sangre total) descenso de mayor magnitud que el encontrado con las otras diluciones, incluyendo las del ADN de placenta, en las que el rendimiento de la extracción nunca es inferior al 51,7% del ADN obtenido en las diluciones previas, salvo de la solución original, de la que se obtiene el 41,5% seguramente por la proximidad al límite de saturación de la técnica. Dicho de otro modo, la sangre total sin diluir parece ofrecer un medio óptimo para la extracción automática del MPC. 4.3.3 Evaluación clínica de los dos métodos extracción Se procesaron alternativamente con las dos técnicas 106 muestras de sangre periférica pertenecientes a 72 pacientes de las UCI del Hospital Clínico Universitario de Santiago y del Hospital de CONXO, a los cuales se recogió simultáneamente una muestra para hemocultivo en sendos frascos BactAlert (bioMerieux) con medio para cultivo aeróbico y anaerobio. Los datos resultantes de estos tres procedimientos se pueden ver en la tabla 14. RESULTADOS 98 Tabla 14 La concordancia entre ambos métodos de extracción se analizó en primer lugar por comparación de los resultados obtenidos con la PCR SeptiFast entre ellos, usando como referencia de infección verdadera el de la extracción manual. Posteriormente se compararon los valores de SeptiFast de cada uno de los procedimientos de extracción con los resultados del hemocultivo, utilizando el valor de este como criterio de infección verdadera. (Tabla 15) RESULTADOS 99 Tabla 15 A: Comparación de las identificaciones obtenidas con SeptiFast usando ambos métodos de extracción y con hemocultivo más sistema Vitek II B: Concordancia según test Kappa, que corrige la proporción de concordancia debida al azar. C: Relación de los volúmenes de muestra utilizados en los diferentes experimentos. Lo mismo que con los grupos de pacientes anteriores, al elaborar las tablas de contingencia para comparar los resultados de la PCR con los cultivos, hemos considerado los aislamientos de SCN como no representativos de enfermedad, puesto que el SeptiFast informa las contaminaciones como resultados negativos. Veamos esta evaluación en primer lugar mediante el seguimiento de los casos. En la Tabla 16 se ve la comparación de la PCR con la suma de hemocultivo y Microbiología convencional. RESULTADOS 100 Tabla 16. SeptiFast / Hemocultivo + Micro. CONXO (seguimiento casos) SeptiFast / Hemocultivo + Micro. CONXO (seguimiento casos) Intervalos de confianza Inferior superior Sensibilidad 47,22 38 55 Especificidad 87,5 82 91 Valor Predictivo Positivo 68 57 76 Valor Predictivo Negativo 74,66 69 79 Prevalencia 36 Ratio Prob. Test Positivo 3,77 2,61 5,45 Ratio Prob. Test Negativo 0,603 0,513 0,7 Kappa 0,372 Como quiera que el seguimiento de estos casos fue mucho más reducido que en los dos primeros grupos de pacientes, la sensibilidad de la técnica se ve disminuida, pero sin embargo se alcanza mayor especificidad que en el segundo de los grupos anteriores. En cambio la correlación entre los resultados de PCR y hemocultivo mejora sustancialmente, como podemos observar en la Tabla 17. Tabla 17. SeptiFast / Hemocultivo. CONXO (seguimiento casos) SeptiFast / Hemocultivo. CONXO (seguimiento casos) Intervalos de confianza Inferior Superior Sensibilidad 73,77 60 84 Especificidad 84,93 80 88 Valor Predictivo Positivo 47,36 37 57 Valor Predictivo Negativo 94,63 91 96 Prevalencia 15,52 Ratio Prob. Test Positivo 4,89 3,64 6,58 Ratio Prob. Test Negativo 0,308 0,202 0,47 Kappa 0,478 Con la pretensión de evaluar la capacidad de SeptiFast para detectar bacteriemia (aunque sea falsa bacteriemia) hemos querido revisar aquellos casos en los que se ha amplificado ADN de SCN en baja carga y que fueron informados como negativos por el SIS. De esta manera podemos contrastar su detección con los correspondientes hemocultivos en los que se obtuvo crecimiento de estos contaminantes. Si consideramos “positivos” los casos en los que se han encontrado estos microorganismos, veremos un considerable incremento en la sensibilidad de SeptiFast para revelar la presencia de bacteriemia. RESULTADOS 101 Tabla 18. SeptiFast / Hemocultivo. CONXO (seguimiento casos) con SCN como (+) independiente de C.P. y de nº de tomas de aislamiento en hemocultivo. SeptiFast / Hemocultivo. CONXO (seguimiento casos) con SCN como (+) independiente de C.P. y de nº de tomas de aislamiento en hemocultivo. Intervalos de confianza Inferior Superior Sensibilidad 78,49 68 86 Especificidad 80,33 75 84 Valor Predictivo Positivo 55,3 46 63 Valor Predictivo Negativo 92,33 88 95 Prevalencia 23,66 Ratio Prob. Test Positivo 3,99 3,1 5,13 Ratio Prob. Test Negativo 0,267 0,18 0,39 Kappa 0,513 La mayor sensibilidad de SeptiFast que se observa en este grupo de pacientes, utilizando MagNA Pure Compact para extraer el ADN, se evidencia mejor en la comparación con el hemocultivo determinación por determinación. En la Tabla 19 vemos estos datos considerando como negativos los aislamientos de SCN en la toma de hemocultivo cuyas muestras correspondientes para PCR presentan amplificaciones con C.P. > 20 (siguiendo el criterio de SeptiFast). Tabla 19. SeptiFast / Hemocultivo CONXO (determinación) SCN C.P.>20 = Neg. SeptiFast / Hemocultivo CONXO (determinación) SCN C.P.>20 = Neg. Intervalos de confianza Inferior Superior Sensibilidad 83,87 72 91 Especificidad 88,53 85 90 Valor Predictivo Positivo 43,33 34 52 Valor Predictivo Negativo 98,13 96 99 Prevalencia 9,46 Ratio Prob. Test Positivo 7,31 5,7 9,38 Ratio Prob. Test Negativo 0,182 0,103 0,32 Kappa 0,51 En la Tabla 20 podemos ver los resultados si consideramos como positivos los aislamientos de SCN y por lo tanto también damos valor positivo a cualquier amplificación de estas bacterias en la PCR. RESULTADOS 102 Tabla 20. SeptiFast / Hemocultivo. CONXO (determinación) SCN = (+) SeptiFast / Hemocultivo. CONXO (determinación) SCN = (+) Intervalos de confianza Inferior Superior Sensibilidad 67,82 58 76 Especificidad 79,44 75 82 Valor Predictivo Positivo 41,26 34 48 Valor Predictivo Negativo 92,06 89 94 Prevalencia 17,55 Ratio Prob. Test Positivo 3,29 2,67 4,06 Ratio Prob. Test Negativo 0,404 0,309 0,52 Kappa 0,377 En un intento de unificar los criterios de las dos tablas anteriores, hemos querido contar con las amplificaciones de baja carga de SCN que reflejan la presencia bacteriana en hemocultivo, pero dado que con una sola determinación de hemocultivo (la realizada en paralelo con la toma de SF) no es posible reconocer las falsas bacteriemias causadas por estos microorganismos, hemos decidido disminuir el posible sesgo excluyendo como positivos los aislamientos en los que la correspondiente PCR no detectó ADN de SCN así como las amplificaciones con C.P. > 20 en cuyo hemocultivo no se obtuvo crecimiento. Tabla 21. SeptiFast / Hemocultivo CONXO (determinación) (+) si SF SCN (+) C.P.>20 con Hm (+) y Neg si SCN (+) en Hm ≠ SF SeptiFast / Hemocultivo CONXO (determinación) (+)si SF SCN(+)C.P.>20 con Hm(+) y Neg si SCN(+) en Hm ≠ SF Intervalos de confianza Inferior Superior Sensibilidad 88,63 80 94 Especificidad 88 85 90 Valor Predictivo Positivo 53,42 44 61 Valor Predictivo Negativo 98,03 96 99 Prevalencia 13,43 Ratio Prob. Test Positivo 7,39 5,84 9,35 Ratio Prob. Test Negativo 0,129 0,071 0,23 Kappa 0,599 4.4 Beneficio terapéutico del diagnóstico molecular Para comprobar el beneficio terapéutico que pudiera aportar el diagnóstico precoz de la PCR en tempo real a los pacientes con sepsis, hemos repasado los tratamientos RESULTADOS 103 antimicrobianos que recibieron los pacientes de los dos primeros grupos de nuestro estudio. En esta revisión hemos encontramos 15 casos de tratamiento inadecuado, se podría haber evitado o modificado en un plazo más breve siguiendo el diagnóstico temprano proporcionado por SeptiFast. El paciente nº 1 había ingresado por Urgencias con una sobreinfección respiratoria como complicación de su enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Durante su estancia en la UCI se colonizó por Enterobacter cloacae en el tracto respiratorio y padeció infección de orina por el mismo microorganismo. Al día siguiente se pudo amplificar su ADN en sangre, pero no se aisló de las muestras de hemocultivo hasta tres días después, y el informe correspondiente se emitió todavía dos días más tarde. El tratamiento empírico consistía en monoterapia con Levofloxacino, para una cepa que era resistente a quinolonas y se modificó por Cefepime cuando se comunicó la presencia de Enterobacter cloacae en el hemocultivo. Recibió tratamiento inadecuado durante 4 días desde que SeptiFast detectó la bacteriemia. Paciente DIC.2005 ENE.2006 Días 23 24 25 26 27 28 29 30 31 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hospital REA SF/HC SF SF HC AB Levofloxacino Cefepime SF Klebs. SF Klebs / Ent SF Klebs / Ent Hc Ent. cloacae (Q-R) Exitus En el paciente nº6 se amplificó E. coli mediante SeptiFast en la misma toma de sangre en la que posteriormente se aisló del hemocultivo una cepa de E. coli productora de ESBL, pero este crecimiento se obtuvo dos días más tarde, durante los cuales el tratamiento recibido era Linezolid (16 días antes se había retirado la cobertura con Meropenem que se reinició coincidiendo con la positividad del hemocultivo). RESULTADOS 104 Paciente Nº6 DIC.2005 ENE.2006 Días 28 29 30 31 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Hospital REA SF HC HC AB Linezolid Meropenen SF E.coli E.coli ESBL Hc E.coli ESBL En este mismo enfermo se encontró un mes más adelante otro resultado positivo de SeptiFast para SCN y Candida albicans en la misma muestra. La C. albicans se había encontrado previamente colonizando las vías respiratorias, sin embargo en el cultivo cuantitativo del aspirado bronquial correspondiente al día siguiente de la PCR positiva se vio un recuento de C. albicans > 100.000 UFC/ml. En las dos tomas de otro hemocultivo recogido el día siguiente al del SeptiFast que amplificó ADN de SCN y C. albicans, se consiguió de nuevo el crecimiento del SCN (tras el obligado retraso de la incubación) El tratamiento fue modificado añadiendo Vancomicina 4 días después del resultado de la PCR, aunque se decidió no tratar la levadura, que no se volvió a detectar en sangre mediante cultivo, ni en ninguna de las 5 siguientes determinaciones de SeptiFast que se solicitaron. Pac.6 FEB.2006 Días 28 29 30 31 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hos REA ASP SF HC AB Ciprofloxacino Pipera/Tazob. Vanco SCN / Cand. alb. (Vanco 4 días después) SCN Asp.bron C. albicans RESULTADOS 105 El paciente nº 15 podría haberse beneficiado del diagnóstico de sepsis por Pseudomonas aeruginosa, detectada por PCR dos días antes que por el hemocultivo, cuando se inició tratamiento con Meropenem. En el nº 17 la PCR adelantó 20 días sobre los cultivos (absceso, herida quirúrgica y posteriormente hemocultivo) el hallazgo de Enterococcus faecalis y permaneció 18 días sin cobertura antibiótica adecuada. Paciente 17 ENE.2006 FEB.2006 # # # # # # # # # # # # # # # # # # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 # # # # # # # # # # # Hospital REA Cirugía SeptiFast HC/Cex C H Imipenen Cefepime Levofloxacino Vancomicina Tobramicina Fluconazol Clindamicina SeptiFast (+) Ent.faecalis E.faecalis E.faecalis E.faecalis Ent.faecalis Cult/Hemcult. E. faecalis E. faecalis En el caso nº 20 se amplificó Kleb. pneumoniae / oxytoca en la muestra del mismo día que la del hemocultivo que permitió su aislamiento (lo mismo que ocurrió con el E. coli en el nº 6) pero el crecimiento de la colonia a partir del hemocultivo se obtuvo dos días más tarde, por lo tanto se podría haber anticipado el tratamiento con Meropenem en 2 días. RESULTADOS 112 Paciente 59 Mayo.2006 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 Hospital REA Septifast Cloxacilina Linezolid Cefepime Ps.aerug Staph.aureus / Pse. Ps.aerug. Pse.aerug. S.aureus Pse. aerug. El paciente nº 60 ingresa por traumatismo toraco-abdominal y desarrolla empiema por St. aureus, que es tratado con drenaje quirúrgico y Linezolid. Una semana después se consigue amplificar ADN de St. aureus en SeptiFast mientras que los hemocultivos son negativos y en el líquido del drenaje se continúa aislando St. aureus Meticilín-sensible. 10 días más tarde se cambia el tratamiento a Cloxacilina. En el nº 77 se aísla St. aureus en hemocultivo y en exudado de herida quirúrgica tras cirugía urgente por infección. A pesar del tratamiento de limpieza y drenaje de la herida más antibioterapia con Linezolid, una semana más tarde se amplifica en SeptiFast ADN del St. aureus (Meticilín-sensible) aún bajo la cobertura con Linezolid, sin que se hubiera obtenido su crecimiento en sangre. RESULTADOS 113 Pac. nº 77 Junio 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 REA Linezolid Meropenem Fluconazol Cloxa Teico Caspofung. S.aureus S.aureus Cand.alb. _____Cloxa. 14 días después___________ St. aur. St. aureus (M-S) Ex. her. estern. Can. alb. S.aureus (drenaje) 4.5 Rendimiento económico de SeptiFast en pacientes con sepsis. Estimación de costes. Consumo de recursos La evaluación de los costes se basó en los recursos utilizados para los tratamientos y en el cálculo del gasto por unidad 256 según la propia perspectiva económica del Hospital. Para calcular una conversión de coste por paciente, en estos 2 primeros grupos del estudio, se recogió información de las historias clínicas y de las bases de datos del hospital sobre la permanencia en la UCI, la estancia hospitalaria tras el diagnóstico de shock séptico y los antibióticos usados. El costo de las unidades de recursos fue proporcionado por el departamento de contabilidad del Hospital. Para estimar el valor de los antibióticos, se recopilaron los datos del tratamiento administrado a cada paciente y la duración en días, deduciendo el gasto medio por antibiótico del coste de estancia en la UCI. Para el cálculo económico del test LigtCycler - SeptiFast hemos tenido en cuenta el precio de un set de reactivos para el análisis de 7 pacientes, 966 € (equivalente a 138 € por muestra) y el coste del personal necesario para realizar el test, que asciende a 42,5 €; incluyendo una hora de un técnico de laboratorio (25,8 €); 15 min. de un facultativo (12,2 €); 5 min. de enfermería (2,5 €) y 6 min. de personal administrativo (2,0 €) y finalmente añadimos 2,5 € de costes estructurales, con lo que se alcanza un valor total de 183 € por cada RESULTADOS 114 muestra de un paciente. No obstante, el procesamiento de las muestras no siempre puede efectuarse acumulando las 7 muestras que resultan en el óptimo aprovechamiento de cada set de reactivos. Cuando se hace un test con menor número de muestras, el gasto que exigen los múltiples controles de amplificación y de contaminación necesarios, condicionan un incremento en el coste de reactivos por paciente. Como los costes en este sentido representan una distribución no normal, hemos utilizado un agrupamiento de 1000 muestras para estimar la probabilidad de generar un incremento en el gasto provocado por la modificación de las condiciones en el uso de la técnica 257De esta manera hemos asumido un procesamiento medio de 3,5 muestras por ensayo, lo que implica un aumento de coste por muestra hasta alcanzar los 321 €. En la tabla 10 se recogen los valores del coste de los componentes por paciente. Tabla 10 Componente Unidad de medida Coste por unidad Estancia Hospital Día 273 € Estancia UCI Día 1.058 € LCSeptiFast Paciente 183 € LCSeptiFast Paciente 321 € (*) (3,5 muestras/ensayo) UCI: Unidad de Cuidados Intensivos La tasa de mortalidad después de 28 días fue 26% en el grupo control y 27% en el grupo intervencionista. Esta diferencia entre ambos grupos no es estadísticamente significativa, pero sin embargo existe un factor diferencial entre ambos grupos a este respecto que podría haber influido sobre las tasas de mortalidad encontradas, y es la distinta proporción en el genotipo que presentan los dos grupos para el promotor del receptor CD14, del que hablaremos más adelante. En cambio sí que hemos encontrado una diferencia significativa en la duración de la estancia en UCI (p<0,05) que fue de 31,0 ± 19,4 días en el grupo control y 22,9 ± 29,9 días en el segundo grupo. También resulta significativa, aunque menos marcadamente, la diferencia de la estancia media en el Hospital, que fue de 21,3 ± 23,4 días en el grupo control, frente a 18,3 ± 21,4 días en el segundo grupo. RESULTADOS 115 El gasto en antibióticos, así mismo, revela otra diferencia importante entre ambos grupos, con un valor medio de 2.812 € en el grupo intervencionista y 3.576 € en el grupo control. La suma de estas diferencias aporta un coste total por paciente considerablemente mayor para el grupo control (49.429 €) que para el grupo intervencionista (37.334 €) lo que supone 12.096 € más por paciente. (Tabla 11) Tabla 11 Grupo control Grupo LCS intervencionista p Mortalidad 28 días 13 (26%) 14 (27%) ns Mortalidad 6 meses 20 (37%) 20 (41,6%) ns Estancia en UCI 31,0 ± 19,4 22,9 ± 29,9 P<0,05 Estancia en Hospital 21,3 ± 23,4 18,3 ± 21,4 P<0,05 Estancia en UCI 24,1 ± 21,9 18,3 ± 11,4 P<0,05 (sobrevivientes) Nº antibióticos/paciente 5,1 ± 3,1 4,2 ± 2,2 P<0,05 Coste trat Antib/paciente 3576 € 2812 € P<0,05 Coste estancia en UCI 32798 € 24246 € P<0,05 Coste estancia Hospital 5824 € 4988 € P<0,05 Coste Total 42198 € 32228 € P<0,05 UCI: Unidad de Cuidados Intensivos 4.6 Polimorfismo C-159-T del promotor de CD14 El receptor de LPS juega un papel primordial en la génesis de la respuesta inflamatoria, y su diferente expresión tanto en la superficie de las células del sistema inmunitario como en su forma soluble en el plasma, puede estar relacionada con el pronóstico y la evolución de los pacientes críticos 242-244 que por lo general poseen una historia clínica compleja cúmulo de diversos procesos patológicos concurrentes en un mismo individuo. En los últimos años se ha debatido sobre la influencia de este polimorfismo en la evolución de múltiples patologías y se han efectuado estudios con resultados más o menos concluyentes sobre su posible implicación como factor capaz de modificar el pronóstico de RESULTADOS 116 algunas de ellas. Como quiera que nuestros pacientes representan un grupo sometido necesariamente a un fuerte estímulo de la respuesta inmune y a su correspondiente modulación durante nuestro estudio, hemos querido investigar la presencia de los distintos genotipos del polimorfismo C-159-T en el promotor de este receptor y su posible relación con la presentación de la sepsis, su evolución y su mortalidad. Para la determinación de este polimorfismo hemos empleado dos metodologías diferentes: Análisis de restricción con Ava II para obtener un corte en la secuencia GGTCC que reconoce a los alelos CD14 / 159 - T (Fig. 1) y PCR a tiempo real marcada con sondas FRET de hibridación sobre la secuencia del polimorfismo, capaz de distinguir los tres genotipos posibles mediante los picos de melting resultantes de la región del promotor en que se hallan. (Fig. 2) Fig. 1 Las calles 2 y 6 (desde abajo) corresponden a muestras de homocigotos CC, la calle 4 a un homocigoto TT y las restantes a heterocigotos CT. RESULTADOS 117 Fig.2: El pico de melting para los homocigotos TT es de 56,5 ºC (línea roja) y para los homocigotos CC es de 65,5 ºC (línea azul) Los heterocigotos presentan doble curva de melting (línea verde) Las proporciones totales encontradas de los distintos genotipos fueron 26,73% para la forma CC; 17,82% para TT y 55,45% para los heterocigotos CT, pero esta proporción no se mantuvo homogéneamente en ambos grupos de pacientes. En el grupo primero, control observacional, el porcentaje de los homocigotos CC fue considerablemente superior (36,5%) al del segundo grupo, intervencionista (16,66%) mientras que en este se encontró una mayor proporción de heterocigotos (66,66%) que en el primer grupo (46%) y el número de homocigotos TT fue similar en ambos grupos (18,86% y 16,66% respectivamente). (Tabla 12) La mortalidad hallada en nuestro medio para las distintas poblaciones del polimorfismo muestra algunas diferencias que quizás deberíamos de considerar: Fallecieron el 29,6% de los homocigotos CC y el 32,1% de los heterocigotos, mientras que para los TT la mortalidad alcanzó el 44,44%. Resulta interesante la observación de que la proporción de casos de SeptiFast positivos presenta una tendencia casi inversa, es decir, mayor para los homocigotos CC (51,58%) que para los TT (33,33%) y los heterocigotos (30,36%) que se evidencia de modo similar si calculamos la proporción de los polimorfismos en los casos positivos: 36,8% CC; 44,7% CT y 18,4% TT. RESULTADOS 118 Esta diferencia en la mortalidad de nuestros pacientes con los distinto polimorfismos C-159-T pudiera ser un factor a tener en cuenta a la hora de valorar la similitud en las cifras de mortalidad de nuestros grupos en estudio, ya que la distribución de dichos polimorfismos no resultó homogénea en ambos grupos. La mayor de las diferencias estriba en la proporción de homocigotos CC entre ambos grupos, algo más del doble en el primero (36,5 % del primer grupo frente a 16,66% en el segundo) mientras que la proporción de homocigotos TT es similar en ambos (18,86 % frente a 16,66 %) El genotipo CC es el que ha presentado mayor supervivencia en nuestro medio, por lo tanto se podría esperar que en nuestro segundo grupo se hubiera registrado una menor mortalidad si la proporción de estos homocigotos fuese superior. Tabla 12 CC CT TT Total 26,73% 55,45% 17,82% Mortalidad 29,6% 32,1% 44,44% SeptiFast (+) 51,58% 30,36% 33,33% CC CT TT Grupo 1ª 36,5% 46% 18,86% Grupo 2º 16,66% 66,66% 16.66% SeptiFast (+) CC CT TT porcentaje 36,8% 44,7% 18,4% 4.7 Diagnóstico de infección polimicrobiana mediante la PCR LightCycler SeptiFast En la revisión de un total de 500 pacientes de las tres series estudiadas en los servicios de UCI del Complejo Hospitalario a los que se aplicó SeptiFast, hemos encontrado 41 determinaciones por PCR de 40 pacientes, en las que se han podido detectar infecciones de más de un microorganismo en la misma muestra (en uno de los pacientes esto ocurrió en dos ocasiones, con identificación de gérmenes diferentes entre ellas) mientras que solamente hemos visto 12 hemocultivos de 11 pacientes en los que se recuperó el crecimiento de más de un microorganismo a la vez (igualmente hemos encontrado un caso en el que se aislaron dos microorganismos en distintos hemocultivos, a su vez con diferentes resultados entre sí) Obviamente hemos excluido de este recuento a los SCN considerados como contaminantes RESULTADOS 119 por ambas técnicas, y otras bacterias de crecimiento frecuente en hemocultivo sin significación clínica, como Corynebacterium spp. o Bacillus spp. En 7 casos el SeptiFast pudo detectar 3 microorganismos en la misma muestra y en 3 ocasiones se amplificaron hasta 4 microorganismos (E.faecium, E. faecalis, Kleb. pneumoniae y SCN en una de ellas y E.faecalis, E.coli, SCN y C. albicans en las otras dos) En 9 de estas 10 infecciones múltiples se detectó ADN de SCN. La combinación más frecuentemente encontrada con doble detección en SeptiFast fue Kleb. pneumoniae y Enterobacter cloacae que ocurrió en 10 ocasiones, seguida por 3 casos con detección de Kleb. pneumoniae y E.coli, y dos casos con Ent. cloacae y Aspergillus fumigatus. Los microorganismos más veces involucrados en estas infecciones múltiples fueron Klebsiella pneumoniae, que apareció en 15 ocasiones, seguida de Enterobacter cloacae, 13 veces presente, y de E.coli en 10 de los casos en lo que se refiere a los gram-negativos. Entre los gram-positivos, los que se encontraron con más frecuencia como copartícipes de la infección fueron SCN en 13 ocasiones y E.faecalis por 8 veces. De los 12 hemocultivos con crecimiento polimicrobiano, sólo en uno de ellos se aislaron 3 bacterias (E. faecalis, E. cloacae y Stenotrophomonas maltophilia) en un paciente en el que SeptiFast detectó solamente ADN de E. faecalis y E. cloacae pero en muestras diferentes. En otras dos ocasiones de doble aislamiento por hemocultivo (SCN más Kleb. pneumoniae y E. faecalis más SCN) se confirmó la presencia de ambas bacterias en sangre mediante la PCR, y en un caso de aislamiento de S. epidermidis más Fusobacterium necrophorum, el SeptiFast solo pudo detectar el SCN dado que el anaerobio no se encuentra incluido en la lista de su espectro. RESULTADOS 120 Tabla 24 SeptiFast Coinfección 4 x Microorganismos 2 x SCN E.faecalis E. coli C. albicans 1 x SCN E.faecalis E.faecium K.pneumoniae 3 x Microorganismos 1 x SCN E.faecalis E.faecium 1 x SCN E.faecalis E.cloacae 1 x SCN E.cloacae K.pneumoniae 1 x SCN E.cloacae C.parapsilosis 1 x SCN E. coli A.fumigatus 1 x SCN Ps.aeruginosa S.maltophilia 1 x Ps.aeruginosa C. albicans A.fumigatus 2 x Microorganismos 10 x K.pneumoniae E.cloacae 3 x K.pneumoniae E. coli 2 x E.cloacae A.fumigatus 2 x Microorganismos 1 x SCN/ E.faecalis E.coli/S.maltoph S.aureus/S.malt E.faecalis/P.aerug SCN/ E.faecium E.coli/E.faecalis C.albic/E.aerog SCN/A.baumanii E.coli/S.aureus C.albic/A.fumigat SCN/A.fumigatus S.aureus/Ps.aerug Str.pneum/E.faecium E.coli/A.bauman. S.aureus/S.marces Str.pneum/Str.spp. 4.8 Diagnóstico de Aspergilosis invasiva mediante PCR LightCycler SeptiFast La aspergilosis invasiva (AI) es una complicación grave en pacientes críticos, con elevada mortalidad, que requiere un tratamiento precoz ante la sospecha de su diagnóstico. Sólo una veintena de las más de 150 especies del género Aspergillus causan patología humana, y entre ellas Aspergillus fumigatus (AF) es la que más frecuentemente se aísla en nuestro entorno, representando el agente causal de la mayoría de las infecciones invasivas. El Aspergillus es un hongo filamentoso ubicuo que causa generalmente enfermedad asociada al aparato respiratorio, denominada aspergilosis pulmonar, como consecuencia de su vía de transmisión principal, por inhalación de esporas diseminadas en el aire. Pero para que esta infección pueda desarrollarse, es necesario que exista un importante compromiso de los mecanismos de defensa del huésped, pues el ser humano posee una notable capacidad para eliminar el Aspergillus por acción de macrófagos alveolares y neutrófilos. RESULTADOS 121 El frecuente aislamiento de AF en pacientes sin AI y la escasa sensibilidad de su cultivo en sangre, incluso en la infección diseminada, dificultan el verdadero diagnóstico de esta enfermedad, que debe basarse, como el de cualquier enfermedad infecciosa grave, en la sospecha clínica inicial y en la posterior confirmación microbiológica. Por otra parte, al ser una enfermedad de sintomatología variable y poco específica, la sospecha clínica debe ser siempre confirmada por técnicas de imagen suficientemente sensibles como TAC o RMN. 258 Las últimas definiciones de enfermedad fúngica invasiva publicadas por el European Organization for Research and Treatment of Cancer / Invasive Fungal Infections Cooperative Group (EORTC) contemplan tres niveles de probabilidad diagnóstica: AI probada, probable y posible. 259 ASPERGILOSIS INVASIVA PROBADA Requiere la demostración de la invasión fúngica en el tejido infectado: • Examen microscópico o estudio histopatológico de muestra obtenida por biopsia o aspiración, donde se observen las hifas invadiendo el tejido. • Cultivo de muestra estéril junto con síntomas clínicos o hallazgos radiológicos consistentes con proceso infeccioso. Se excluyen muestras de orina, senos paranasales o lavado broncoalveolar. ASPERGILOSIS INVASIVA PROBABLE Se precisa un factor de riesgo del huésped, junto con un criterio clínico o radiológico y otro microbiológico. Entre estos últimos se incluyen el aislamiento del hongo en cultivo de esputo, lavado o aspirado broncoalveolar, aspirado sinusal… Detección de antígeno de galactomanano en suero, lavado broncoalveolar o LCR. Detección de β-D-glucano en suero. Debido al bajo rendimiento del hemocultivo para obtener el crecimiento de AF, la amplificación de su ADN mediante una PCR multiplex como SeptiFast que puede detectarlo en sangre, se convierte en una alternativa con un valor análogo al cultivo de una muestra estéril para contribuir al diagnóstico de AI probada. Aunque se han descrito diversas técnicas moleculares con este propósito, hasta la fecha no se han desarrollado métodos estandarizados DISCUSIÓN 128 real, mediante sondas específicas cuyos “melting points” se analizan semi-automáticamente por el software del sistema. Para evitar señales inespecíficas debidas a microorganismos ambientales contaminantes y aumentar la sensibilidad del análisis, se utilizan reactivos de PCR de alta calidad, siguiendo las sugerencias discutidas recientemente en la literatura científica. 269-271 A estas medidas encaminadas a disminuir interferencias analíticas, se ha de añadir la aplicación automática de los puntos de corte determinados por el software para SCN y Streptococcus spp. que permiten excluir los informes positivos de aquellos casos en los que la presencia de dichas bacterias no tiene relevancia clínica. Sólo el 10–30% de los SCN aislados en un hemocultivo son verdaderos patógenos, la diferenciación entre patógenos verdaderos y contaminantes reduce el consumo de antibióticos innecesarios y la aparición de resistencias. Lee y col. demostraron, en un estudio realizado en el 2007, que cerca del 40% de pacientes con pseudobacteriemia o bacteriemia falsa habían sido tratados innecesariamente con antibióticos sistémicos, sin este tratamiento supusiese un beneficio terapéutico para el paciente y sí un aumento importante en el coste de su estancia hospitalaria y un mayor riesgo en la posibilidad de desarrollo de resistencias. Este trabajo muestra la necesidad de desarrollar métodos que permitan la diferenciación clara entre psuedobacteriemia y bacteriemia verdadera, entre los que se encuentra el SeptiFast. 272 Lehman y col., en un estudio realizado en el 2008, analizaron 574 muestras de sangre de voluntarios sanos y 102 pacientes de UCI para establecer el punto de corte, en forma de CP, que permitiese discriminar entre cantidades bajas de bacterias responsables del proceso infeccioso y bajas concentraciones de ADN resultantes de contaminación por la flora de la piel durante el proceso de la extracción de la muestra. No obstante, es necesario realizar estudios posteriores con otros grupos de pacientes para conocer si este punto de corte es válido en todos los casos o debe modificarse en función de la patología de base del paciente.241 Las regiones diana seleccionadas por SeptiFast, las ITS bacterianas 16S–23S y fúngicas 18S–5,8S, están presentes en múltiples operones en los genomas de bacterias y hongos 273 lo que proporciona un aumento en la sensibilidad del método. Además, estas regiones, facilitan una mayor precisión en la identificación de los microorganismos, ya que DISCUSIÓN 129 son más específicas de especie que la región conservada del rDNA.274 Las mediciones de los picos de melting determinadas para los microorganismos representativos de la lista del espectro de SeptiFast en los cuatro canales del LC 2.0 varió solamente entre 0,19 y 0,54 ºC en el estudio de Lehmann et al. 275 de manera que se evita la ambigüedad en las identificaciones, mejorando la interpretación con respecto a otros métodos basados en PCR publicados. El límite de detección que se ha calculado para SeptiFast en experimentos con sangre anticoagulada con EDTA a la que se añadieron distintas concentraciones de bacterias y hongos oscila entre 3 y 30 UFC/ml según los diferentes microorganismos (Kleb. pneumoniae, C.glabrata, Streptococcus spp. y SCN se detectan en un rango de 0% a 80% si se encuentran a la concentración de 3 UFC/ml 275 Frente a estos valores, los estudios de hemocultivos cuantitativos revelan que la mayoría de episodios de bacteriemia clínicamente significativa en adultos se caracterizan por un número bajo de bacterias circulantes, número que sin embargo es mucho mayor en niños, en los que generalmente esta cuantificación presenta una relación inversamente proporcional a su edad. Werner et al. 276 informan que un 54% de los hemocultivos de adultos con endocarditis por Staphylococcus spp. O Streptococcus spp. contienen entre 1 y 30 UFC/ml; y Kreger et al. 277 documenta un 73% de pacientes con bacteriemia por bacilos Gram-negativos con hemocultivos que poseen < 10 UFC/ml. Según estos estudios, la sensibilidad de 3–30 UFC/ml limitaría la capacidad de SeptiFast para el diagnóstico de pacientes con bacteriemias paucibacilares comparada con una sensibilidad teórica de 1 UFC/ml en una botella de hemocultivo convencional inoculada con 10 ml de sangre. Por lo tanto SeptiFast no puede sustituir al hemocultivo por su menor sensibilidad, especialmente antes de iniciar la terapia antimicrobiana. Además hoy por hoy, es necesario obtener el aislamiento del microorganismo infeccioso para realizar las pruebas de sensibilidad a los agentes antimicrobianos, que SeptiFast no puede efectuar. No obstante, en ocasiones en las que la viabilidad bacteriana estuviese comprometida, SeptiFast si que podría contribuir a un diagnóstico que el hemocultivo es incapaz de proporcionar. Tal es el caso de pacientes sometidos a tratamiento antibiótico en los que la PCR puede detectar bacterias no viables. Von-Lilienfeld-Toal et al. 278 encuentran que la PCR positiva en pacientes sin tratamiento, con frecuencia persiste positiva durante uno o dos días más y durante el tratamiento se detectan “restos” bacterianos en la PCR cuando el hemocultivo es negativo (lo que concuerda con nuestras observaciones) sugiriendo que la cuantificación de la carga de DISCUSIÓN 130 ADN microbiano podría ser de interés en el contexto del curso clínico de la enfermedad. Igualmente apuntan que, independientemente del tipo de infección de que se trate, la detección de motivos CpG bacterianos podría ser clínicamente relevante por sí misma, dado que poseen un importante efecto proinflamatorio 279 En este sentido, han observado que pacientes con PCR positiva, presentan elevados niveles séricos de procalcitonina. Por otro lado, la PCR podría ampliar las posibilidades de diagnóstico del hemocultivo, detectando la presencia de ADN intracelular278 de bacterias fagocitadas por los neutrófilos sanguíneos y en el diagnóstico de infecciones fúngicas invasivas. En el mismo estudio 189, realizado en pacientes neutropénicos, se elude a la baja población de neutrófilos como posible causa de la baja concentración de ADN microbiano en estos pacientes, y concluyen que si bien el hemocultivo resulta indispensable para no perder sensibilidad, en situaciones como la fiebre persistente durante tratamiento antibiótico o en infecciones fúngicas invasivas, el rendimiento de la PCR se impone al del hemocultivo. La necesidad de iniciar una terapia empírica de amplio espectro inmediatamente tras la sospecha clínica de sepsis, con frecuencia dificulta la posibilidad de aislar microorganismos viables en sangre y obliga al clínico a tomar decisiones críticas sin confirmación microbiológica. Aunque la detección de ADN microbiano en sangre difiere de los métodos clásicos basados en la viabilidad y pudiera tener significados añadidos, ambas metodologías son válidas para definir la infección y útiles en la práctica para monitorizar pacientes sépticos. La diferencia en los tiempos de diagnóstico, representa la primera de las ventajas de SeptiFast, no tan obvia con otros métodos moleculares como ya hemos comentado, y resulta especialmente crítica para los pacientes sépticos. 6.1 Modificación de la técnica de extracción de ADN El diagnóstico molecular involucra 3 pasos consecutivos: extracción de ácidos nucleicos, amplificación (PCR) y detección y análisis de las dianas moleculares. El procedimiento recomendado por el fabricante para SeptiFast propone una técnica de extracción manual que proporciona la suficiente sensibilidad, empleando materiales y reactivos que garantizan la ausencia de contaminación externa, pero consume la mitad del tiempo total necesario para la obtención de los resultados, y además exige la realización de DISCUSIÓN 131 múltiples pasos en los que han de manipularse muestras y reactivos con las precauciones propias de estas técnicas moleculares. Con el objeto de disminuir los inconvenientes de este prolongado proceso, que limita la facultad de informar al clínico antes de que se instaure un tratamiento empírico, hemos modificado la técnica de extracción sustituyéndola por un método automático de los múltiples que en los últimos años se han desarrollado para usar en conjunción con las técnicas de PCR. Estas tecnologías reducen el tiempo y los errores humanos en el trabajo, aumentando la precisión y reproducibilidad de resultados para un amplio número de muestras.280 El método automático además, permite evitar posibles interferencias entre diferentes laboratorios debidas a la manipulación, por lo que podría contribuir a una mejor estandarización de la técnica. Hasta el momento, se han elaborado algunos trabajos sobre la automatización de este proceso de extracción 281-282 seleccionando para ello distintos sistemas. En nuestro caso, hemos decidido escoger MagNA Pure Compact (MPC) para nuestro propósito, en primer lugar porque es uno de los métodos comerciales con nanopartículas magnéticas más rápido 283 que utiliza sólo 34 min., con una diferencia de 15 min. dependiendo del número de muestras procesadas; y en segundo lugar porque su capacidad máxima por ensayo de 8 muestras se correlaciona perfectamente con la de SeptiFast. Esta alternativa supone una importante reducción en el tiempo total de la prueba, de las 6,54 ± 0,27 h siguiendo la extracción manual, a 3,58 h con la automática (42 min. corresponden al paso previo de lisis mecánica más la extracción automática, que se siguen de 139 min. para la detección por PCR). Nuestra evaluación se ha centrado fundamentalmente en tres aspectos: En primer lugar, comprobar el rendimiento de la extracción por ambos métodos; en segundo lugar, la funcionalidad del método para conseguir identificar todas las dianas de la master list de SeptiFast, y finalmente, en definir el protocolo más adecuado, que mejor se ajuste al diagnóstico con SeptiFast. Utilizando ADN de E. coli como estándar disuelto en TE buffer PH8 hemos encontrado un rendimiento similar entre ambos métodos (24,14% y 27% MPC según los protocolos utilizados vs. 28,54% para la técnica manual) La cantidad total de ADN obtenida con la técnica manual es mayor que la conseguida con MPC, sin embargo se recupera diluida en un mayor volumen final (300 μl vs 200μl) y dado que la presencia de ADN de leucocitos DISCUSIÓN 132 en las muestras de sangre de los pacientes con frecuencia se acerca al valor de saturación, pensamos que esta diferencia no sería significativa para su aplicación clínica, tal como hemos podido comprobar posteriormente. Para determinar la funcionalidad de la extracción automática, hemos validado la correcta identificación de las diferentes especies incluidas en la master list de SeptiFast comparando los picos de melting y los peaks heights obtenidos tras la amplificación del ADN recuperado con ambos métodos de extracción. La prueba demostró que MPC es una alternativa válida, que reduce considerablemente el tiempo de trabajo y el tiempo total de detección e identificación con el sistema molecular. La extracción de ADN estándar de E. coli se llevó a cabo, en un primer momento, siguiendo un protocolo de MPC para lisis externa, puesto que se trataba de ADN en solución, pero como la aplicación clínica principal de SeptiFast se ha previsto para sangre periférica, hemos probado la extracción de este ADN estándar siguiendo el protocolo de MPC designado como Bacterial DNA para muestras de sangre, con buffer de lisis, a partir de 400 μl. Nuestras observaciones indican que este último consigue un aumento en el rendimiento de la recuperación de ADN por el efecto caotrópico del buffer. Así mismo hemos querido probar la influencia que pudiera tener la agitación mecánica en MagNA Lyser a la que se someten las muestras clínicas, sobre el ADN de E. coli en solución, pero en este caso no hemos encontrado diferencia en la cantidad final de ADN recuperado a partir de las muestras del ADN fragmentado o no fragmentado mecánicamente. Finalmente era preciso conocer la cantidad necesaria de C.I. que debíamos de añadir a cada muestra. Hemos probado 3, 4 y 5 μl. sobre los 400μl. de muestra total (4 μl representan la misma proporción 1:100 que los 10μl.que se incluyen sobre 1ml de sangre en la técnica manual) Los tres volúmenes permiten detectar el C.I. al final de la PCR sin competir con las otras dianas de amplificación, así que hemos optado por usar 4μl en orden de mantener la proporción de la técnica original. En definitiva, nuestra propuesta para la extracción automática de ácidos nucleicos que permite reducir la manipulación (y por tanto los posibles errores y contaminaciones derivados de ella) y el tiempo total de SeptiFast sin pérdida de sensibilidad en el test, consiste en el protocolo Bacterial DNA con 400 μl.de volumen de sangre periférica previamente agitada en DISCUSIÓN 133 MagNA Lyser, sobre el que añadimos 4μl. de C.I. inmediatamente antes de iniciar el proceso en MPC. El volumen de elución final obtenido es de 200μl. suficiente para las tres reacciones de PCR de SeptiFast, puesto que cada una de ellas precisa 50 μl. de muestra, y permite reservar los 50 μl sobrantes para efectuar el test que detecta la presencia de mecA en caso de que se haya obtenido amplificación de ADN de Staphylococcus spp. En el estudio clínico prospectivo con 72 pacientes, se procesaron 106 muestras en paralelo mediante las dos técnicas de extracción junto con el correspondiente hemocultivo para cada caso (en frasco aerobio y anaerobio) Puesto que una definición objetiva de enfermedad en pacientes con bacteriemia resulta difícil 4 para evaluar la técnica modificada con MPC escogimos como criterio de infección en el compartimiento sanguíneo el resultado de la PCR con extracción manual o el del hemocultivo. Según el primer criterio, la sensibilidad de SeptiFast con MPC fue sólo de 51,85%. Esta discrepancia entre los dos procedimientos de extracción podría ser debida al diferente volumen de sangre utilizado, que pudiera condicionar distinta eficacia en los procesos enzimáticos durante el paso de lisis. A mayores, la presencia de ADN genómico u otros elementos en distintas proporciones podrían afectar a la adsorción inespecífica del ADN microbiano detectado por SeptiFast 284 Cuando comparamos SeptiFast mediante extracción convencional con el resultado del hemocultivo simultáneo, obtenemos una sensibilidad similar (56%). Otras causas como el efecto de tratamiento antibiótico previo o el aislamiento de microorganismos viables no incluidos en el espectro de SeptiFast también podrían contribuir a explicar estas discrepancias. Pero sorprendentemente, al comparar el hemocultivo positivo simultáneo con SeptiFast tras la extracción automática, encontramos una sensibilidad de 92% con un coeficiente Kappa que indica una concordancia casi perfecta en la identificación (Vitek II) de los microorganismos aislados en hemocultivo y la obtenida con SeptiFast tras MPC. 285 ¿Cómo explicar estos resultados más favorables a MPC para detectar bacteriemia en muestras clínicas? Tal vez alguna característica del ADN bacteriano, como su alta proporción de motivos CpG, pueda facilitar una adsorción selectiva de este ADN en la superficie de las nanopartículas magnéticas. El MPC realiza distintos pasos de mezcla entre las partículas en suspensión y la muestra con el buffer, manteniendo todos estos componentes en agitación mediante múltiples pipeteos. Se crea pues, una exposición dinámica que promueve la interacción nanopartícula-ADN sacando el máximo aprovechamiento de la superficie de DISCUSIÓN 134 adsorción de las partículas en suspensión. Esta interacción dinámica pudiera tener mayor relevancia para secuencias más pequeñas dispersas en la muestra, especialmente si estas presentasen más afinidad, ya que aumenta la probabilidad de contacto en las condiciones adecuadas con la superficie de adsorción, y minimiza la interferencia que pudiera derivarse del exceso de ADN genómico leucocitario. En cambio la interacción del ADN con la superficie de adsorción en las columnas de la técnica manual, se fundamenta en un proceso estático de filtración que no garantiza de igual manera la exposición del ADN bacteriano disperso a la superficie de cromatografía de adsorción. Los métodos automáticos no son los más adecuados para mantener la integridad del ADN de gran tamaño, pero si resultan muy útiles cuando lo que se busca es recuperar secuencias pequeñas, reduciendo el tiempo del proceso y la manipulación. También es posible que la presencia en el medio de los componentes de la pared bacteriana derivados de los pasos de lisis facilite el efecto caotrópico de los búferes, incrementando el secuestro de moléculas de agua y promoviendo así una mayor interacción por fuerzas de Van der Waals de carácter atractivo entre la superficie de las nanopartículas y el ADN (En nuestros experimentos hemos podido comprobar que MPC recupera mayor proporción de ADN de E. coli a partir de la lisis de bacterias completas que a partir de ADN de E. coli estándar purificado en solución). También hemos observado que la sangre total o algunos de sus componentes, salvando la posible interferencia del exceso de ADN leucocitario, parecen facilitar la recuperación o la amplificación del ADN estándar de E.col..286 En nuestro estudio las seis discrepancias encontradas entre SeptiFast con extracción automática y el hemocultivo incluyen el crecimiento de una bacteria que no se encuentra en el espectro de SeptiFast (Bacteroides fragilis), otro caso con crecimiento de Streptococcus bovis en una muestra con identificación de S.aureus en SeptiFast, diferencia que podría explicarse por los distintos criterios de identificación; fenotípicos en Vitek II frente a genotípicos en SeptiFast. Otras dos bacterias aisladas en cultivo pero negativas por PCR (S. aureus y E. faecalis) y otras dos detectadas por SeptiFast con extracción automática cuyos hemocultivos fueron negativos (E. coli y S. pneumoniae) pertenecen a muestras de pacientes que habían recibido terapia antibiótica previa a su inclusión en el estudio. DISCUSIÓN 135 6.2 Beneficio terapéutico con el diagnóstico molecular . Aunque algunos de los tratamientos utilizados en la sepsis severa y el shock séptico como los corticoides, drotrecogín α o el control de glucosa… son objeto de debate; otras medidas, como la estabilización hemodinámica o el uso de antibióticos, se consideran indispensables 287 y, de acuerdo con las recomendaciones de las guías de procedimientos, deben de administrarse en las primeras fases del proceso infeccioso. Como casi siempre es necesario recurrir a tratamientos empíricos, conviene anticipar las oportunas tomas de muestra para cultivo microbiológico, previas al inicio de la terapia, con objeto de establecer el correspondiente diagnóstico etiológico. Los resultados de nuestro estudio comparativo entre los dos primeros grupos de pacientes (observacional e intervencionista) reflejan una mortalidad similar para ambos a los 28 días y a los 6 meses. Varios autores han destacado la relevancia del uso precoz del tratamiento antibiótico adecuado en pacientes sépticos 288-290. y el incremento de mortalidad en los pacientes que no son tratados adecuadamente. La identificación del microorganismo causante en pocas horas debería de servir para garantizar la eficacia del tratamiento antimicrobiano, y por tanto aumentar la supervivencia. Sin embargo no hemos encontrado esta reducción esperada en la mortalidad, que podría explicarse por la influencia de diversos factores. En primer lugar por el tamaño de nuestras muestras. En segundo lugar porque cuando se sospecha una sepsis severa o un shock séptico en la UCI, se inicia un tratamiento empírico de amplio espectro que posibilita la cobertura del germen causante aún cuando sea desconocido, pero en muchos casos es necesario recurrir al uso de “demasiados” antibióticos. Finalmente, porque la alta mortalidad de muchos de estos pacientes viene determinada no sólo por su proceso infeccioso, sino por su enfermedad de base por sí misma. Es frecuente que estos enfermos hayan sido sometidos a intervenciones quirúrgicas de alto riesgo, como cirugía cardiovascular o abdominal y a otras múltiples intervenciones que comportan intrínsecamente un alto riesgo de mortalidad que no puede modificarse solamente con el tratamiento antibiótico adecuado. Si bien nuestros dos grupos de estudio eran aparentemente homogéneos, es posible que la existencia de múltiples factores (muchos aún desconocidos y otros cuya influencia es difícil de definir) condicionasen alguna diferencia entre ellos, por ejemplo a nivel de la modulación de la respuesta inmune, que también podría contribuir a modificar la mortalidad de alguno de los grupos. En este sentido, la diferencia que hemos observado a DISCUSIÓN 136 posteriori, que ambos grupos presentan en el polimorfismo C-159-T del promotor del receptor del LPS, CD14, podría haber jugado un papel importante para nuestros resultados. No obstante la revisión del tratamiento empírico que recibieron los pacientes de los primeros grupos durante su evolución, nos ha permitido encontrar 15 casos de tratamiento no adecuado que podría haber sido modificado en un plazo más breve siguiendo el diagnóstico de SeptiFast dirigido sólo por los resultados de la microbiología convencional. Las discrepancias ocasionales entre PCR multiplex a tiempo real y los resultados de hemocultivo simultáneo se han documentado anteriormente, 288-290 ocurren fundamentalmente en 5 ocasiones: 1) En pacientes tratados con antibióticos previamente. 2) Infecciones por microorganismos que no figuran en la lista de amplificación. 3) Cuando existe una infección mixta. 4) Identificación según criterios fenotípicos, fundamentalmente bioquímicos frente a genotípicos. 5) Error de interpretación de los melting peaks por parte del software para especies cuyos productos de amplificación poseen temperaturas de melting similares. Todas estas discrepancias pueden explicar las diferencias en casos individuales, pero ocurren raramente en la aplicación rutinaria al diagnóstico de los métodos moleculares. En cualquier caso, la combinación de los test moleculares con los datos de la historia clínica junto con los resultados de los cultivos convencionales, facilitarán un diagnóstico más preciso, además de precoz, y permitirán realizar un seguimiento más completo en estos pacientes. Es importante destacar que en este estudio comparativo del primer grupo control de pacientes con un segundo grupo intervencionista para la evaluación del impacto clínico y de SeptiFast, la metodología de extracción de ácidos nucleicos empleada fue la técnica manual original, mediante el SeptiFast Prep Kit, en las muestras de ambos grupos. Nuestra propuesta de automatización de la técnica de extracción de ADN obtiene mayor sensibilidad en su aplicación clínica y además acorta el proceso total en 3 h. La información más precisa y temprana que se hubiese podido aportar al segundo grupo mediante la aplicación de la técnica modificada, presumiblemente habría proporcionado aún mejores resultados a nuestro estudio. Otra cuestión a considerar, es la necesidad de dar indicaciones clínicas precisas sobre cuándo utilizar la prueba. 291-293 Es evidente que no todos los pacientes se benefician por igual de la utilización de enfoques de diagnóstico molecular. 294 La utilidad de la prueba depende del estado clínico del paciente debido a que la muestra de sangre debe reflejar adecuadamente el compartimento que se va a analizar, a modo de ejemplo resulta ineficaz solicitar SeptiFast en DISCUSIÓN 137 pacientes sépticos con cuadros meníngeos extrahospitalarios en los que los agentes infecciosos con mayor frecuencia implicados son: Neiseria meningitidis, Haemophilus influencae, Streptococcus neumoniae o Listeria monocytogenes y que a excepción Streptococcus neumoniae no se encuentran dentro de la lista de identificación de la técnica. Esta misma situación ocurre cuando en patologías habitualmente con alta prevalencia de anaerobios u otro tipo de microorganismos no incluidos en SeptiFast. Es preciso tener en cuenta que en bacteriemias transitorias, biopelículas, y patologías bacterianas con niveles bajos pueden afectar la capacidad de la prueba de detección (endocarditis o pacientes neutropénicos). 295 Recientemente nos hemos encontrado con una inhibición del control de los Gram negativos y que en algunos trabajos han solucionado disminuyendo la cantidad de control ,296 desde nuestro punto de vista el control esta inestable y pudiera deberse a un defecto del lote, actualmente está en estudio, de cualquier manera no afecta a la identificación de hongos que en algún caso clínico con aspergilosis invasiva ha resultado de gran utilidad. A pesar de algunas limitaciones que requieren juicio profesional, el uso de técnicas de diagnóstico molecular representa una mejora global en términos de proporcionar apoyo bien fundamentado de decisiones clínicas de tratamiento. Es imprescindible una estrecha colaboración clinico–microbíologo en la toma de decisiones conjuntas de forma individualizada en beneficio del paciente. En conclusión, nuestro estudio ha demostrado que SeptiFast con Magna extracción compacta pura reduce el flujo de trabajo de 6. 54 hrs. a 3.56 hrs. cuando se compara con SeptiFast con la extracción manual convencional. La principal ventaja de SeptiFast MPC es acortar el intervalo de respuesta diagnostica, la identificación temprana del agente etiológico es de extrema importancia en los pacientes sépticos permite adecuar la terapia empírica de forma precoz en consecuencia, desciende de la mortalidad, se reducen las posibles complicaciones del paciente séptico, disminuye la estancia hospitalaria y los costes sanitarios. En nuestra experiencia, el uso combinado de las pruebas moleculares rápidas y microbiología convencional representa una ventaja para el paciente séptico y mejora la toma de decisiones clínicas para lograr un tratamiento adecuado. DISCUSIÓN 144 Se ha descrito una menor sensibilidad de SeptiFast en sangre frente a estafilococos coagulasa negativos (CoNS) respecto al hemocultivo310 puede deberse a una baja concentración de ADN bacteriano en sangre secundaria a la liberación enlentecida de ADN desde las vegetaciones a la circulación o a la inactivación del ADN(12.) diagnóstico de sepsis y ha prefijado un punto de corte de sensibilidad relativamente alto para el ADN de los CoNS y estreptococos, de modo que las concentraciones bajas no se consideran positivas. La programación del software pretende filtrar los casos de bacteriemia transitoria contaminante en relación con técnicas invasiva, catéteres intravenosos, sonda propias de las unidades de críticos. 295 En nuestra experiencia, consideramos que los portadores de prótesis valvulares, donde los CoNS son el principal agente etiológico de la EI postoperatoria precoz, cada caso debe ser valorado conjuntamente entre el clínico y el microbiólogo para discriminar entre contaminante o patógeno. En este sentido, nuestros pacientes 5, 10 y 11 presentaban endocarditis precoz sobre prótesis y SeptiFast en sangre detectó ADN de CoNS, pero el software de identificación lo interpretó como posible contaminación, mientras que los hemocultivos y SeptiFast del tejido valvular resultaron positivos. La sensibilidad de SeptiFast en las vegetaciones fue del 100%, mientras que para el cultivo del tejido valvular fue del 33,3%, similar a lo observado con otras técnicas moleculares (2-4). En nuestra serie, pudimos comprobar, al igual que otros autores 311 que la sensibilidad de la PCR no se afecta por el tiempo de tratamiento anti infeccioso administrado antes de la cirugía. Este hecho puede ser debido a que el aclaramiento del ADN procedente de bacterias viables o no viables presentes en la vegetación es lento, y puede persistir ADN bacteriano hasta varios años después de completar el tratamiento antinfeccioso. 311 Por último la mayor ventaja del SeptiFast en tejido valvular es que permite obtener el resultado en unas 3h30m-4h. despues de la cirugía frente a 4-5 días en el caso de que el cultivo sea positivo o 15 días que precisa ser incubado en el caso de que este sea negativo. Esta circunstancia permite tomar decisiones terapéuticas a las pocas horas de la intervención, resulta especialmente llamativo en caso de endocarditis fúngicas donde el crecimiento es mucho más lento, SeptiFast anticipa el diagnóstico a nivel de especie en 5 días en caso de los hongos levaduriformes y unos 7 días en caso de el Apergillus fumigatus, lo que hemos podido comprobar en el seguimiento diario de nuestro hospital una vez instaurada la técnica de rutina, DISCUSIÓN 145 eso sí, el cultivo hoy por hoy es el unico método que nos permite realizar estudios de sensibilidad y como ya se indicó. SeptiFast está diseñado para identificar un grupo amplio de especies bacterianas y fúngicas, pero no detecta otros posibles patógenos de la EI, como el grupo HACEK, Gemella, Coxiella y Bartonella que precisarían de otras técnicas diagnosticas por consiguiente, un SeptiFast negativo no descarta EI. 6.8 Aplicaciones específicas en las que la PCR pudiera aportar un mejor apoyo en el diagnóstico de la sepsis La velocidad es de vital importancia en el diagnóstico de la sepsis, actualmente se considera una carrera a muerte entre los patógenos y el sistema inmune del huésped.312 En los pacientes en estado crítico, el diagnóstico de infección en el torrente sanguíneo, supone un gran desafío, Las técnicas convencionales de diagnóstico son lentas y la demora en el tratamiento supone un aumento de la mortalidad de forma lineal cuando la terapia empírica adecuada no es administrada en las primeras horas. Los métodos moleculares proporcionan una identificación más rápida que facilita la toma de decisiones clínicas y terapéuticas. 313 Los pacientes ingresados con un alto riesgo de infección como críticos, trasplantados que habitualmente se encuentran con antibioterapia previa, pueden desarrollar infecciones nosocomiales por microorganismos multiresistentes, la terapia a la que se encuentran sometidos normalmente interfiere con el crecimiento de los mismos, SeptiFast detecta ADN circulante puede identificar el microorganismo, aunque este no sea viable en cultivo. El intervalo diagnóstico se acorta especialmente en caso de sobreinfección fúngica, en nuestro hospital ha supuesto un adelanto en el diagnóstico de 5-7 días frente a las técnicas de diagnóstico convencional. Puede resultar de útil en el diagnóstico de la infección nosocomial. Se ha aplicado la técnica en pacientes con cobertura antibiótica que tras la realización de maniobras invasivas, presentan fiebre persistente con datos clínicos de infección, que no responde al tratamiento antibiótico y en los que todas las técnicas de diagnóstico microbiológico convencional fueron negativas. Se realizo en muestras de (LCR en intervenciones de Neurocirugía, LCR (derivaciones), en líquido amniótico despues de realización de procedimientos quirúrgicos en tratamientos de fertilidad, líquido de diálisis peritoneal, L.pericárdico y L.pleural). DISCUSIÓN 146 Al igual que en otros estudios,313-314 se ha empleado en el diagnóstico de infección como complemento del hemocultivo, actualmente se está investigando en situaciones de difícil diagnóstico como e en muestra quirúrgicas del material periprotesico.315 En Traumatología es de vital importancia distinguir entre aflojamiento o infección de la prótesis, normalmente, a los pacientes se le ha administrado antibioterapia previa a la intervención de recambio de prótesis, lo que dificulta el crecimiento de los microorganismos en los medios convencionales. Los microorganismos más frecuentemente implicados en la infección de prótesis se encuentran dentro de las bacterias analizadas por SeptiFast, puede resultar de interés en estas patologías. Otras situaciones en las que pudiera ser útil son en el rastreo de pacientes con posibles bacteriemias por microorganismos causantes de brotes nosocomiales, donde habitualmente se requiere tratamiento específico y aislamiento para el control de la infección. Las directrices futuras en el diagnóstico de la sepsis pasan por el diseño de paneles con múltiples microorganismos que contengan genes de resistencia316 y biomarcadores de diagnóstico precoz, así como un software que permita al microbiólogo dirigir el diagnóstico a según la sospecha clínica y por supuesto el gran caballo de batalla a un coste asequible. Sin embargo, incluso el nuevo enfoque tecnológico más prometedor, no se traduce en mejoras notables en el manejo del paciente si no se implementa como parte de los algoritmos más grandes que deben basarse en la estrecha interacción entre el clínico y el microbiólogo.314 7. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 149 7.1 CONCLUSIONES ESPECÍFICAS 1º-El SeptiFast (ROCHE) no sustituye a los métodos de diagnóstico habituales, es menos sensible, identifica 25 los microorganismos y se precisa cultivo para realizar estudios de sensibilidad. No obstante al detectar ADN, diagnóstica bacteriemias con patógenos no viables en cultivo lo que la convierte en una técnica complementaria del hemocultivo. 2º-El desarrollo de un método automatizado basado a en nanopartículas magnéticas es una revolución metodológica, resulta menos laborioso, reduce considerablemente las contaminaciones, el tiempo de trabajo y el tiempo de detección e identificación del sistema molecular. 3º-.La obtención de ADN final de las cepas control por ambos métodos es óptima. En el sistema automatizado recupera menor volumen final pero más concentrado. 4º-. El método automatizado MagNA PureCompact obtuvo mayor sensibilidad que SeptiFast Prep Kit. al compararlo con el hemocultivo, sensibilidad del 92%, posiblemente promueve una mayor interacción por fuerzas de Van der Waals de carácter atractivo entre la superficie de las nanopartículas y el ADN. 5º-.En la mayoría de muestras clínicas el ADN genómico no interfiere con la extracción automatiza pero si contienen un exceso de carga genómica, puede saturarse la polimerasa y no detectarse el ADN, en estos casos, deben realizarse diluciones seriadas a 1:2 para su recuperación. 6ºSeptiFast MagNA PureCompact resulta especialmente útil en pacientes críticos y en bacteriemias con cultivos negativos. La principal ventaja es la rapidez en el diagnóstico muy superior a las técnicas convencionales, permite adecuar la terapia empírica en las primeras horas de la sepsis incluso sospechar el diagnóstico del cuadro clínico. 7º-.La antibioterapia adecuada precoz supuso un considerable descenso en la estancia media hospitalaria tanto en UCI como en especialidades y una reducción considerable en el consumo de antibióticos .En datos globales un ahorro sanitario de 12.096 € por paciente. CONCLUSIONES 150 8º-.Los factores genéticos juegan un papel importante en la sepsis. La variante TT del polimorfismo CD4 se asocia con mayor mortalidad. Se podría emplear como marcador pronostico. 9º-. SeptiFast es más sensible que el hemocultivo en las confecciones sobre todo si están implicados microorganismos de lento crecimiento como hongos, pero presenta limitaciones en las bacteriemias mixtas con anaerobios, ya que no se incluyen en el panel. 10º-. En las infecciones fúngicas la utilidad de SeptiFast es máxima, en el diagnóstico de la aspergilosis invasiva, detecta sin dificultad A.fumigatus que no crece de forma habitual en hemocultivos. En la candidiasis invasiva se anticipa al cultivo los entre 5-7 días e identifica a nivel de especie, lo que permite adecuar el antifúngico específico en las micosis más frecuentes. No obstante no detecta otras especies fúngicas por lo que no excluye el cultivo. 11º-.La sensibilidad en el tejido valvular es del 100% para los microorganismos incluidos en el panel, permite pautar tratamiento adecuado a las pocas horas de la intervención pero no detecta otros posibles patógenos de la EI, como el grupo HACEK, Gemella, Coxiella y Bartonella, por consiguiente, un SeptiFast negativo no descarta EI. 12ºLas investigaciones de futuro en la sepsis, pasan por el diseño equipos de diagnóstico rápido que integren software que permitan redirigir el flujo de trabajo según la sospecha clínica hacia determinaciones de PCR o plataformas de secuenciación masiva que sean capaces de identificar, microorganismos patógenos, principales genes de resistencia, genes de pronóstico y biomarcadores de diagnóstico rápido lo que nos permitiría, aplicar la terapia empírica basada en la evidencia de forma precoz. CONCLUSIONES 151 7.2 CONCLUSION GENERAL .RESUMEN FINAL La sepsis en una enfermedad emergente tiempo dependiente. El desarrollo de un método de diagnóstico molecular automatizado basado el nanoparticulas magnéticas que acorta el intervalo diagnóstico es una herramienta muy útil en las unidades de críticos, permite adecuar la terapia empírica en las primeras horas, reduce la mortalidad de forma lineal, el tiempo de estancia hospitalaria, el consumo antibióticos y los costes sanitarios. No obstante ninguna herramienta es tan potente la habilidad clínica de expertos en el diagnóstico de la infección. El microbiólogo debe formar parte de un equipo multidisciplinar junto con las unidades de críticos, la valoración conjunta de los casos clínicos de forma individualizada, permite gestionar los recursos disponibles emitir las resultados con prontitud y aconsejar la antibioterapia adecuada, a fin de cuentas, la sepsis es una carrera a muerte contra los microorganismos por conseguir el trofeo más preciado. La vida. 8.- BIBLIOGRAFÍA