Marcadores de bienestar relacionados con el hambre crónica en terneros lactantes

Jesús Sánchez Fuentes. Marcadores de bienestar relacionados con el hambre crónica en terneros lactantes. Facultad de Veterinaria Grado en Veterinaria Año 2024 Modalidad del Trabajo: Experimental Trabajo de Fin de Grado 2 LICENCIA Excepto donde se haga constar explícitamente, esta obra pertenece a Jesús Sánchez Fuentes y está bajo una licencia de “Creative Commons Reconocimiento 4.0 Internacional”. 3 Resumen. Este trabajo tuvo como objetivo comparar las concentraciones de leptina y ghrelina de terneros neonatos que han sido separados de sus madres de dos maneras diferentes. Para ello, se muestrearon 8 ganaderías divididas en dos grupos. Cuatro de ellas realizaban un manejo de separación madre-cría de manera temprana (antes de las 24 horas) y las otras cuatro realizaban un manejo de separación madre-cría de manera tardía (después de 24 horas). En cada grupo de explotaciones se recogieron muestras sanguíneas de 28 terneros, realizando un total de tres muestreos. La toma de muestras se realizó antes de la separación (en el caso del sistema de separación tardía), a los dos y a los siete días tras el primer muestreo. En el sistema de separación temprana se recogieron las muestras de sangre siguiendo un diseño equivalente en días postparto al grupo de separación tardía. Las muestras se analizaron mediante tests ELISA comerciales específicos para leptina y ghrelina bovina, siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Los resultados obtenidos indican un aumento estadísticamente significativo de las concentraciones de leptina y ghrelina en aquellos terneros que fueron manejados mediante el sistema de separación temprana, con respecto a aquellos que se encontraban bajo el sistema de separación tardía. Por otro lado, en ambos sistemas de manejo las concentraciones de leptina y ghrelina se mantuvieron estables a lo largo de los tres muestreos. La menor frecuencia de alimentación y el consumo de una menor cantidad de alimento en los terneros separados inmediatamente de sus madres, en comparación con los que son separados de manera tardía, se correspondería con el aumento de las concentraciones de ghrelina. Asimismo, las mayores concentraciones de leptina en terneros separados de manera temprana de su madre podrían estar provocadas por el mayor estrés durante la separación temprana, que generaría una elevación del cortisol, repercutiendo en mayores concentraciones de leptina. Por tanto, los valores de leptina y ghrelina observados en este estudio parecen ser indicadores de un problema de bienestar relacionado con el hambre prolongada en aquellos terneros lactantes separados de sus madres de manera temprana. Palabras clave: leptina, ghrelina, separación temprana, separación tardía, terneros neonatos y bienestar animal. 4 Resumo. Este traballo tivo como obxectivo comparar as concentracións de leptina e grelina de tenreiros neonatos que foron separados das súas nais de dúas maneiras diferentes. Para iso, mostrexáronse 8 gandarías divididas en dous grupos. Catro delas realizaban un manexo de separación nai-cría de maneira temperá (antes das 24 horas) e as outras catro realizaban un manexo de separación nai-cría de maneira tardía (despois de 24 horas). En cada grupo de explotacións recolléronse mostras sanguíneas de 28 tenreiros, realizando un total de tres mostrexos. A toma de mostras realizouse antes da separación (no caso do sistema de separación tardía), aos dous e aos sete días tras o primeiro mostreo. No sistema de separación temperá recolléronse as mostras de sangue seguindo un deseño equivalente en días postparto ao grupo de separación tardía. As mostras analizáronse mediante tests ELISA comerciais específicos para leptina e grelina bovina, seguindo as instrucións dos fabricantes. Os resultados obtidos indican un aumento estatisticamente significativo das concentracións de leptina e grelina naqueles tenreiros que foron manexados mediante o sistema de separación temperá, con respecto a aqueles que se atopaban baixo o sistema de separación tardía. Por outra banda, en ambos sistemas de manexo as concentracións de leptina e grelina mantivéronse estables ao longo dos tres mostrexos. A menor frecuencia de alimentación e o consumo dunha menor cantidade de alimento nos tenreiros separados inmediatamente das súas nais, en comparación cos que son separados de maneira tardía, corresponderíase co aumento das concentracións de grelina. Así mesmo, as maiores concentracións de leptina en tenreiros separados de maneira temperá da súa nai poderían estar provocadas polo maior estrés durante a separación temperá, que xeraría unha elevación do cortisol, repercutindo en maiores concentracións de leptina. Polo tanto, os valores de leptina e grelina observados neste estudo parecen ser indicadores dun problema de benestar relacionado coa fame prolongada naqueles becerros lactantes separados das súas nais de maneira temperá. Palabras chave: leptina, ghrelina, separación temperá, separación tardía, tenreiros neonatos e benestar animal. 5 Abstract. The aim of this study was to compare the leptin and ghrelin concentrations of neonatal calves that have been separated from their mothers in two different ways. For this purpose, 8 herds divided into two groups were sampled. Four of them performed early mother-calf separation management (before 24 hours) and the other four performed late mother-calf separation management (after 24 hours). In each group of farms, blood samples were collected from 28 calves, for a total of three samples. Sampling was done before separation (in the case of the late separation system), at two and seven days after the first sampling. In the early separation system, blood samples were collected following a design equivalent in days postpartum to the late separation group. Samples were analysed by commercial ELISA tests specific for bovine leptin and ghrelin, following the manufacturers' instructions. The results obtained indicate a statistically significant increase in leptin and ghrelin concentrations in calves managed under the early separation system, compared to those managed under the late separation system. On the other hand, in both management systems, leptin and ghrelin concentrations remained stable throughout the three samples. The lower feeding frequency and lower feed intake in calves separated immediately from their mothers, compared to calves separated late, would correspond to increased ghrelin concentrations. Likewise, the higher leptin concentrations in calves separated early from their mothers could be caused by the higher stress during early separation, which would generate an elevation of cortisol, resulting in higher leptin concentrations. Therefore, the leptin and ghrelin values observed in this study seem to be indicative of a welfare problem related to prolonged starvation in early separated nursing calves. Key words: leptin, ghrelin, early separation, late clearance, neonatal calves and animal welfare. 6 Índice 1. Introducción. 8 1.1. Caracterización del sector bovino de leche en Galicia. 8 1.2. Sistema de separación madre-cría en las granjas de bovino lechero. 9 1.2.1. Tipos de sistemas. 9 1.2.2. Efectos del sistema de separación madre-cría sobre la salud del ternero. 10 1.2.2.1. Diarreas y patógenos entéricos. 10 1.2.2.2. Problemas respiratorios. 12 1.2.2.3. Inmunidad. 12 1.2.2.4. Mortalidad. 13 1.2.3. Efectos del sistema de separación madre-cría sobre la salud de la madre. 14 1.2.4. Efectos del sistema de separación madre-cría sobre el comportamiento y el bienestar. 14 1.2.5. Efectos del sistema de separación madre-cría sobre la producción. 16 1.2.5.1. Crecimiento de los terneros. 16 1.2.5.2. Rendimiento lechero. 16 1.3. Sistema de alimentación en terneros lactantes. 17 1.4. Indicadores de hambre en ganado bovino. 18 1.4.1. Leptina. 19 1.4.2. Ghrelina. 20 2. Objetivo. 22 3. Material y métodos. 23 3.1. Área de estudio y animales muestreados. 23 3.2. Análisis serológicos. 24 3.3. Análisis estadísticos. 24 4. Resultados. 25 5. Discusión. 29 6. Conclusiones. 32 7. Bibliografía. 33 7 Abreviaturas  Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación: MAPA  Agencia Europea de Seguridad Alimentaria: EFSA  Inmunoglobulinas: Ig  Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis: MAP  Real Decreto: RD  Milimol: mmol  Litro: L  Kilogramo: Kg  Sistema Nervioso Central: SNC  Kilo Dalton: KD  Hormona de crecimiento: GH  Revoluciones por minuto: rpm  Enzimoinmunoanálisis de adsorción: ELISA  Nanogramos: ng  Mililitro: ml  Valor de significación: p 8 1. Introducción. 1.1. Caracterización del sector bovino de leche en Galicia. El sector bovino de leche es el principal agente económico del mundo rural de Galicia. Según las últimas estadísticas, en esta región hay censadas más de 330.000 hembras mayores de 24 meses de la especie bovina dedicadas a la producción láctea (40% del total del país), y más de 110.000 novillas de entre 8 y 24 meses (41% del total del país), siendo un 96% de raza Frisona (Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación [MAPA], 2020, 2023). Figura 1: Proporción del censo medio de vacas mayores de 24 meses en cada comunidad autónoma desde 2018 a 2022 (MAPA, 2023). Con respecto al número de animales por explotación, todavía encontramos casi 4.800 explotaciones por debajo de los 65 animales y sólo unas 120 explotaciones con más de 300 animales (MAPA, 2020). Por otro lado, la media de vacas por ganadería, en Galicia hay 50 vacas mayores de 24 meses por explotación, un dato inferior a la media del país (69 vacas/explotación), con un rendimiento lechero de 9.986 kg/vaca, ligeramente superior al de la media española (9.179 kg/vaca) (MAPA, 2023). 9 1.2. Sistema de separación madre-cría en las granjas de bovino lechero. 1.2.1. Tipos de sistemas. El sistema convencional de manejo de los terneros de aptitud láctea, consiste en la separación del ternero y su madre en el momento del nacimiento (separación temprana). En este sistema, el alimento se les administra a los animales de manera artificial, ya sea de forma manual por parte del ganadero, depositando los lacto remplazantes en cubos con tetinas o en biberones, o mediante un dispositivo automático, en el que se regula el número de tomas y la cantidad de leche consumida por cada ternero. Con este sistema se puede controlar mejor tanto la calidad como la cantidad de alimento que reciben los terneros, además de poder aprovechar la totalidad de la leche producida por la madre para su venta, y evitar el establecimiento del vínculo materno-filial, que posteriormente es más difícil de romper (Whalin et al., 2021). El alojamiento de los terneros en el sistema convencional puede ser individual o por grupos. Este tipo de sistema tiene consecuencias negativas relacionadas con el bienestar, por la incapacidad de realizar conductas exploratorias, disminución del reflejo de succión, trastornos respiratorios y gastrointestinales, estrés, disminución de las conductas de juego (especialmente en los alojamientos individuales) y aumento del hambre prolongada (EFSA, 2023). Por otro lado, el otro sistema de separación madre-cría consiste en mantener al ternero con su madre durante al menos 24 horas (separación tardía), permitiéndole alimentarse directamente de la madre con la frecuencia y duración que lo harían en un entorno natural, y pudiendo establecer un mayor vínculo madre-cría. En este sistema, recomendado por la EFSA en su último informe (EFSA, 2023), el ternero establece un fuerte vínculo con su madre durante la primera semana de vida. Este vínculo irá disminuyendo durante las siguientes semanas para establecer nuevas relaciones con terneros de similar edad. Además, el mayor tiempo de lamido contribuye a secar al ternero, estimula el apetito materno y potencia el efecto de los opioides secretados en post-parto por la madre, mitigando el dolor (EFSA, 2023). En condiciones naturales los terneros suelen mamar entre 4 y 9 veces al día (Fröberg & Lidfors, 2009; Johnsen et al., 2016). Conforme va pasando el tiempo, el número de veces que el ternero mama va disminuyendo, a la vez que aumenta el tiempo de succión. Cuando se produce una separación temprana de la madre y el ternero, el manejo debería asemejarse lo máximo posible a las condiciones naturales para no alterar la expresión de su comportamiento. 16 A continuación, en la Tabla 2 se expone, a modo de resumen, los efectos de estos dos métodos de manejo sobre el comportamiento y bienestar. Tabla 2: Efectos sobre el comportamiento y bienestar de los diferentes sistemas de manejo separación madre-cría. Separación temprana Separación tardía Neofobia alimentaria Aumento Disminución Succión no nutritiva Aumento Disminución Actividad y contacto con los humanos. Menor actividad y mejor contacto con los humanos. Mayor actividad y peor contacto con los humanos. Vocalizaciones agudas y blanco visible de los ojos. Aumento de las vocalizaciones y del blanco visible de los ojos. Disminución de las vocalizaciones y del blanco visible de los ojos. Estrés Aumento. Disminución 1.2.5. Efectos del sistema de separación madre-cría sobre la producción.  Crecimiento de los terneros. Con respecto al crecimiento, los terneros en el sistema de separación tardía crecen más durante la lactancia por la mayor ingesta de leche, pero, tienen un índice de crecimiento menor que los terneros de separación temprana en las semanas posteriores al destete. Esto es debido a que los terneros del sistema de separación temprana están más acostumbrados al consumo de alimentos sólidos que los terneros del sistema de separación tardía, en el cual solo han ingerido la leche materna y, por lo tanto, necesitan un tiempo de adaptación a la alimentación sólida (Margerison et al., 2002; Fröberg et al., 2011).  Rendimiento lechero. La producción láctea de las vacas en los distintos sistemas de destete no varía de manera significativa. Los estudios realizados hasta la fecha no encuentran un efecto negativo del contacto vaca-ternero en la producción de leche a largo plazo, ya que sólo se podría considerar una menor producción de leche, si la diferencia entre las vacas que están junto a sus crías y las que están separadas, excede la leche consumida por parte del ternero. Además, hay que considerar los costes adicionales que supone la compra de sustitutos lácteos para la lactancia artificial (Meagher et al., 2019). 17 1.3. Sistemas de alimentación en terneros lactantes. En la alimentación de los terneros, se han observado múltiples diferencias en la presentación, cantidad y formulación. En este punto abordaremos los distintos métodos de alimentación, así como la legislación que lo regula. En primero lugar, los sustitutos lácteos pueden suministrarse a los terneros en distintas presentaciones, siendo las principales en cubos o en tetinas. Sobre estos dos tipos de presentaciones, Jensen & Budde (2006) realizaron un estudio en el que comprobaron que en la alimentación a través de tetinas se reduce la incidencia de succiones no nutritivas, ya que los terneros tardan más en ingerir la leche en comparación con los terneros alimentados mediante cubos. Del mismo modo, los terneros alimentados mediante cubos lamen con más frecuencia los accesorios de las instalaciones o a otros terneros, aumentando el aseo social, en comparación con los alimentados mediante tetinas. Con respecto a la competencia, ésta fue mayor en los lugares donde se alojaba a los terneros en grupo, en comparación con los terneros alojados individualmente o por parejas, generando una mayor tasa de ingestión en los grupos numerosos (Babu et al., 2004). Esto se determinó por la frecuencia de cambio de tetina o de cubo, que se veía más acentuada cuando la alimentación estaba restringida, por lo que se sugiere que cuando se utilice una alimentación restrictiva, esta también sea selectiva, para que todos los terneros tengan acceso a la misma cantidad de alimento (Jensen & Budde, 2006). En cuanto a la cantidad de alimento aportada, Khan et al. (2011) y Palczynski et al. (2020) indican que, al nacer, el ternero debe recibir una cantidad de leche equivalente al 20% de su peso, divido al menos en dos tomas diarias. Esta recomendación ha ido aumentando en los últimos años, pero por ahora, todavía hay diferencias significativas en cuanto a la cantidad de alimento consumido y a la ganancia de peso antes del destete, con respecto a los terneros alimentados ad libitum (Jasper & Weary, 2002). Una alternativa para equiparar esa diferencia en la cantidad de leche ingerida entre un sistema y otro sería aumentar el tiempo que pasa el ternero con su madre. Asheim et al. (2016) compararon estos dos sistemas y concluyeron que una lactancia prolongada del ternero junto con la madre podría ser rentable para las explotaciones, además de aumentar la ganancia de peso de los terneros y mejorar el bienestar y la salud tanto de las vacas como de las crías. 18 Con respecto a la alimentación de los terneros, la legislación vigente es la Directiva del Consejo 2008/119/CE, del 18 de diciembre de 2008 a nivel europeo, y el Real Decreto 1047/1994, del 20 de mayo a nivel nacional. Esta legislación lo que indica es que todos los terneros deberán recibir una alimentación adecuada a sus necesidades, incluyendo una cantidad suficiente de hierro y una cantidad mínima de fibra dividida en al menos dos tomas diarias, a partir de las dos semanas de edad (MAPA, 1994; Consejo de la Unión Europea, 2009). Las deficiencias de hierro en la ración están relacionadas con una menor concentración de hemoglobina. La concentración mínima de hemoglobina que indica la legislación actual para los terneros es de 4.5 mmol/L, muy por debajo del rango fisiológico (5.64–7.11 mmol/L). Esto es así, porque, concentraciones de hemoglobina por debajo de las marcadas por la legislación están asociadas a una inmunidad deficiente, mayor prevalencia de diarreas, enfermedades respiratorias y menores ganancias de peso (EFSA, 2023). En cuanto a la cantidad de fibra aportada en la ración, la EFSA recomienda incluir 1kg/día de materia seca para completar el tiempo de rumia adecuado, que se estima en el 30% del tiempo diario (EFSA, 2023). Por último, en el RD 1047/1994 se especifica que no se deberá atar a los terneros, excepto aquellos que se encuentren alojados en grupo, y solamente durante el momento de la lactancia o la toma del lacto remplazante, siempre y cuando este periodo no sea superior a una hora. Estas ataduras estarán diseñadas para evitar todo tipo de heridas y estrangulaciones (MAPA., 1994). 1.4. Indicadores de hambre en ganado bovino. La regulación de la alimentación en mamíferos está basada en la interacción entre varios indicadores. Esto incluyen marcadores de saciedad que pueden ser a corto y largo plazo, y marcadores de hambre. Los marcadores de saciedad a corto plazo informan al sistema nervioso central (SNC) sobre la cantidad ingerida en la última comida; el rumen y el intestino delgado poseen receptores que responden a la presencia de alimento. Esta información llega al SNC que inhibirá la ingesta. También hay receptores que responde a la distensión, por lo que los alimentos más fibrosos, que generan más distensión, llevan a mayor saciedad. Los marcadores de saciedad a largo plazo informan al SNC sobre la cantidad de tejido adiposo en el cuerpo del animal. Así, los adipocitos producen leptina, tanto más cuanto mayor tamaño es el tamaño de estos. La ghrelina, por el contrario, es producida fundamentalmente por células epiteliales del tracto digestivo, tras el ayuno, actuando como marcador de hambre (Engel & Jerlhag, 2014). 19 1.4.1. Leptina. En 1994 se encontró una hormona secretada por el tejido adiposo denominada leptina (Clavijo et al., 2018). La leptina es una hormona de 146 aminoácidos, formada a partir de un precursor de 167 aminoácidos cuyo peso molecular es de 16 KD (San Miguel et al., 2006, Figura 2). Los receptores de esta hormona se encuentran distribuidos por todo el organismo. Los que tienen mayor longitud (OB-Rb) están en mayor proporción en el hipotálamo y se encargan de transmitir la información al SNC, mientras que los de menor longitud (OB-Ra, OB-Rc, OB-Rd, OB-Re y OB-Rf) los encontramos en el riñón, pulmón o cerebro, y son los encargados del transporte de la leptina (San Miguel et al., 2006). La principal función de la leptina es la de indicador de adiposidad e indicador de saciedad puesto que principalmente está secretada por el tejido adiposo blanco. Aunque también otros órganos son capaces de secretar una pequeña proporción de esta hormona, como la placenta, la mucosa gástrica, el músculo esquelético o el tejido mamario (Ahima & Flier, 2000, Cammisotto et al., 2005). Por este motivo, la cantidad de leptina que encontramos en el organismo es directamente proporcional a la cantidad de tejido adiposo del cuerpo, la cual es mayor en los depósitos subcutáneos que en los viscerales. Otra función secundaria de la leptina es la de regular los mecanismos neuroendocrinos responsables de la partición de la energía, por lo que cuando la cantidad de leptina disminuye, por la disminución de las reservas grasas, se promueve la conservación de energía para las actividades vitales, prescindiendo de otras como la reproducción (Block et al., 2003). 20 Por otro lado, la leptina producida por las células de la mucosa gástrica, junto al jugo gástrico hacen que disminuya la secreción de pepsina y de ácido gástrico (Brzozowski et al., 1999), incrementa los niveles del transportador de oligopéptidos Pep-T1 e inhibe el transporte de glucosa a nivel del intestino delgado (Ducroc et al., 2005), además de inhibir el apetito y el metabolismo a nivel hipotalámico (Hakansson et al., 1998). 1.4.2. Ghrelina. La ghrelina fue descubierta en 1999 al purificarla del estómago de una rata. En el caso de los rumiantes se trata de un péptido de 27 aminoácidos con un éster n-octanoilo en la región Nterminal lo que le permite estimular la secreción de somatotropina (ThidarMyint et al., 2008, Magdaleno, 2013, Figura 3). La ghrelina se divide en dos isoformas: la ghrelina des-acil, relacionada con la disminución de la ingesta de alimentos, la movilización de las reservas grasas, el balance energético negativo y el vaciamiento gástrico, y la ghrelina acilada, destacando en la secreción de la hormona de crecimiento (GH) (ThidarMyint et al., 2006). La ghrelina se produce principalmente en las células endocrinas inmunorreactivas X/A localizadas en la capa mucosa del abomaso, estás células están asociadas con los capilares sanguíneos que permiten la distribución de la ghrelina (Anderson et al., 2005). Las principales funciones de la ghrelina se basan en aumentar la cantidad de alimento ingerido, incrementando la motilidad gástrica, la secreción de ácido gástrico y teniendo un papel importante en el aumento de las reservas de ácidos grasos (Miura et al., 2004). Además, se descubrió el papel de la ghrelina en el intercambio de información entre el estómago y la glándula pituitaria, participando en la secreción de GH (Dieguez & Casanueva, 2000). 21 La ghrelina ha sido detectada en una importante región del control del apetito como es el núcleo arcuato hipotalámico. Estas neuronas que contienen ghrelina envían fibras eferentes a las neuronas que contienen el neuropéptido Y, estimulando la liberación de este péptido orexigénico, y extendiéndose por el núcleo paraventricular, el área lateral hipotalámica y el tronco encefálico, que son las áreas donde se regula la ingesta de comida y las funciones gastrointestinales (Inui, 1999; Hosoda et al., 2006) El efecto de la ghrelina a nivel endocrino se demostró mediante un experimento en el que inyectaban ghrelina de forma intravenosa en ratas (Date et al., 2000). Este experimento concluyó que tras la administración de ghrelina la liberación de cortisol, prolactina, la hormona adrenocorticótropa y la hormona de crecimiento protagonizaron un ascenso significativo, observándose también efectos anabólicos como el aumento del apetito y de la adiposidad. La regulación de la ghrelina depende del balance energético, incrementándose los niveles plasmáticos cuando hay una privación de alimentos y disminuyendo tras la comida, pero no está claro los factores que intervienen específicamente en la secreción o inhibición de la ghrelina (Hosoda et al., 2006). Uno de los elementos que se pensaban que activaría la secreción de ghrelina era la distensión gástrica, pero cuando el estómago se dilata por la ingestión de agua, los niveles de ghrelina no aumentan (Hosoda et al., 2006), por lo que el aumento o disminución de los niveles de ghrelina no estarían regulados por la distensión del estómago si no por el valor nutritivo del alimento ingerido. Desde el descubrimiento de las hormonas ghrelina y leptina se han realizado múltiples trabajos sobre su funcionalidad y utilidad de estas hormonas tanto en ratas como en humanos, pero en terneros la información de la que disponemos no es tan extensa. Por ello, en este estudio investigamos el comportamiento de las hormonas leptina (señal de saciedad) y ghrelina (señal de hambre) en terneros neonatos de aptitud láctea en dos sistemas de separación madre-cría con un acceso a la alimentación en los primeros días de vida diferente: restringida en terneros de separación temprana, y a demanda en terneros de separación tardía. Esto puede afectar a sus necesidades alimenticias, y por tanto a su desarrollo y bienestar. 22 2. Objetivo. El objetivo de este trabajo consiste en determinar y comparar las concentraciones plasmáticas de leptina y ghrelina en terneros Holstein neonatos a lo largo de tres muestreos, en dos sistemas de manejo de separación madre-cría diferentes: separación temprana (separando a la madre y al ternero inmediatamente tras el parto) y separación tardía (manteniendo a la vaca y al ternero al menos 24 horas post-part 23 3. Material y métodos. 3.1. Área de estudio y animales muestreados. Este trabajo fue realizado en la comunidad autónoma de Galicia (España), comunidad que cuenta con el 55% de las explotaciones de producción lechera de todo el país. Esto se traduce en 7.200 explotaciones activas aproximadamente (MAPA, 2020), aportando el 40% de la producción láctea y casi 5.200 toneladas anuales (MAPA, 2023). El estudio se llevó a cabo en 8 ganaderías de raza Holstein integradas en Control lechero oficial. Cuatro de las ganaderías realizaban un sistema de separación temprana y las otras cuatro ganaderías realizaban un sistema de separación tardía. En cada uno de los distintos grupos de ganaderías se analizaron 28 terneros, en los cuales se realizaron tres tomas de muestras de sangre (Figura 4). En el grupo de explotaciones con separación tardía, la primera toma de muestras se recogió antes de realizarse la separación, la segunda toma de muestras fue dos días después de la separación y la tercera toma de muestras se realizó a los 7 días de la separación. En el grupo de explotaciones con el sistema de separación temprana, se tomaron muestras de sangre de los terneros con un diseño de días tras el nacimiento equivalente al grupo de explotaciones con separación tardía. En este grupo, en todos los muestreos los terneros ya se encontraban separados de sus madres. Figura 4. Diseño del experimento. 24 La sangre fue recogida mediante venopunción de la vena yugular en tubos Vacutainer sin anticoagulante. Después se mantuvieron a temperatura ambiente durante dos horas y se centrifugaron durante 3 minutos a 4.000 rpm. Una vez obtenido el suero, éste se congeló hasta la realización de los análisis de laboratorio. 3.2. Análisis serológicos. Las muestras de suero fueron analizadas mediante test ELISA comerciales siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para determinar la concentración de leptina se utilizó el Bovine Lep(Leptin) ELISA Kit de la casa comercial FineTest. El kit de detección de leptina se basa en el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas tipo sándwich, mediante un anticuerpo anti-Leptina y un anticuerpo anti-Leptina biotinilado que se utiliza como el anticuerpo de detección. El test utilizado para analizar la concentración de ghrelina fue el Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit For Ghrelin (GHRL) de la casa comercial Cloud-Clone Corp. El kit de detección de ghrelina consiste en el empleo de la técnica de inmunoensayo competitivo de inhibición enzimática, entre la ghrelina biotinilada y la ghrelina no biotinilada con el anticuerpo específico para la ghrelina. Una vez obtenidos los valores de densidad óptica (a 450nm), se calculó la concentración de leptina y ghrelina, a partir de estos valores, empleando un modelo logístico de 4 parámetros. 3.3. Análisis estadístico. Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando SPSS 15.0. Para evaluar la evolución de las concentraciones de leptina y ghrelina a lo largo de los tres muestreos en los dos tipos de granjas se utilizó el test de Friedman. En cambio, para comparar las concentraciones obtenidas de leptina y ghrelina entre los dos tipos de granjas, durante cada uno de los tres muestreos, se utilizó el test U de Mann-Whitney. Previamente a cada comparación entre grupos se realizó la prueba de homogeneidad de varianzas. 25 4. Resultados. Las muestras analizadas en los dos grupos de explotaciones durante los tres muestreos revelan que las concentraciones de leptina y ghrelina en el sistema de separación temprana son significativamente superiores a la encontradas en el sistema de separación tardía (Tablas 3 y 4). Por otro lado, las concentraciones de leptina y ghrelina no variaron significativamente a lo largo de los tres muestreos, manteniéndose en valores semejantes a lo largo del tiempo (Gráficas 1 y 2). La Gráfica 1 muestra la concentración de leptina, representada en una gráfica de medias, en los dos grupos de estudio a lo largo de los 3 muestreos. En ella se observa la diferencia de concentraciones, y como son mayores en el sistema de manejo de separación temprana. Gráfica 1: Concentración media de leptina durante los tres muestreos en las dos tipologías de granjas. En la Tabla 3 se presentan los datos de la concentración de leptina, medida en ng/ml, en los tres muestreos. Asimismo, se muestran la media, la desviación típica, y el intervalo de confianza (95%). Además, se muestran los resultados obtenidos de U de Mann-Whitney y los valores de significación, obtenidos al comparar las concentraciones de ghrelina y leptina entre las dos tipologías de granjas, para cada uno de los tres muestreos. En ellos podemos comprobar que, las diferencias significativas de las concentraciones obtenidas se encuentran por debajo del 0,05. 32 6. Conclusiones. Las conclusiones obtenidas al terminar este estudio serían las siguientes:  En las ganaderías de producción láctea, la separación temprana de terneros neonatos de sus madres genera concentraciones significativamente más altas de leptina y ghrelina en comparación con la separación tardía.  La diferencia de concentraciones podría atribuirse a factores como diferencias en el cortisol basal y la frecuencia de alimentación. Los terneros alimentados artificialmente tendrían periodos más largos de ayuno (menor frecuencia de tomas) en comparación con los terneros amamantados por sus madres, que tendrían una alimentación más frecuente y consumirían más leche. Por otro lado, los terneros de separación temprana tendrían niveles más elevados de cortisol por el estrés generado al separarse de sus madres y por la interacción con un nuevo ambiente. 33 7. Bibliografía. 1. Ahima, R. S., & Flier, J. S. (2000). Leptin. Annual review of physiology, 62(1), 413-437. 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