Caracterización molecular y potencial zoonótico de aislados de Cryptosporidium en rumiantes domésticos y su relación con la edad

 TESIS DE DOCTORADO CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y POTENCIAL ZOONÓTICO DE AISLADOS DE CRYPTOSPORIDIUM EN RUMIANTES DOMÉSTICOS Y SU RELACIÓN CON LA EDAD Esther Navarro González ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN MEDICINA Y SANIDAD VETERINARIA LUGO 2017   DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS Caracterización molecular y potencial zoonótico de aislados de Cryptosporidium en rumiantes domésticos y su relación con la edad D./Dña. Esther Navarro González Presentomitesis,siguiendoelprocedimientoadecuadoalReglamento,ydeclaroque: 1) Latesisabarcalosresultadosdelaelaboracióndemitrabajo. 2) Ensucaso,enlatesissehacereferenciaalascolaboracionesquetuvoestetrabajo. 3) Latesiseslaversióndefinitivapresentadaparasudefensaycoincideconlaversiónenviadaen formatoelectrónico. 4) Confirmoquelatesisnoincurreenningúntipodeplagiodeotrosautoresnidetrabajos presentadospormíparalaobtencióndeotrostítulos.  En Lugo, 1 de diciembre de 2017 Fdo. Esther Navarro González   AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS Caracterización molecular y potencial zoonótico de aislados de Cryptosporidium en rumiantes domésticos y su relación con la edad D. Pablo Díaz Fernández Dña. Patrocinio Morrondo Pelayo D. Pablo Díez Baños INFORMA/N: Que la presente tesis, corresponde con el trabajo realizado por Dña. Esther Navarro González, bajo nuestra dirección, y a utorizamos su presentación , considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como directores de ésta no incurre en las causas de abstención establecidas en Ley 40/2015. En Lugo, 1 de diciembre de 2017 Fdo. Pablo Díaz Fdo. Patrocinio Morrondo Fdo. Pablo Díez  FINANCIACIÓN: Este trabajo se ha realizado gracias a la concesión de los siguientes proyectos de investigación: Consejo Nacional de Becas de China (CSC). Convocatoria de Becas del Gobierno Chino 2016-2107. “Programa de Estancia de Investigación (Senior Scholar Program)”. Convenio Bilateral del Ministerio de Educación de España con el Ministerio de Educación de la República Popular China (01/03/2017- 31/07/2017). Diarreas neonatales en rumiantes: nuevas estrategias basadas en avances moleculares y en el análisis integrado de enteropatógenos frecuentes y emergentes” (AGL2016-76034-P). Ministerio de Economía y Competitividad. Investigador responsable: Mª Patrocinio Morrondo Pelayo. Consolidación e Estruturación. Redes GI-1702 RUMIGAL. Rede de estudo multidisciplinar dos ruminantes en Galicia. Consellería de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria (2017- 2019). Investigador responsable: Pablo Díez Baños. Ayuda para Consolidación y Estructuración de Unidades de Investigación Competitivas del Sistema Universitario de Galicia. Grupos de Referencia Competitiva (GR2015/003). Consellería de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria (2015-2018). Investigador responsable: Pablo Díez Baños. PUBLICACIONES: Parte de los resultados obtenidos en el desarrollo de esta Tesis han dado lugar a las siguientes publicaciones: A.- Artículos de investigación: DÍAZ, P.; SOILÁN, M.; NAVARRO, E.; PÉREZ, A.; CABANELAS, E.; PRIETO, A.; DÍAZ, J.M.; LÓPEZ, C.; PANADERO, R.; FERNÁNDEZ, G.; MORRONDO, P.; DÍEZ-BAÑOS P. (2014). Criptosporidiosis en rumiantes. Revista Técnica Ganadera: Ganadería, 94: 44-48. DÍAZ, P.; QUÍLEZ, J.; PRIETO, A.; NAVARRO, E.; PÉREZ-CREO, A.; FERNÁNDEZ, G.; PANADERO, R.; LÓPEZ, C.M.; DÍEZBAÑOS, P.; MORRONDO P. (2015). Cryptosporidium species and subtype analysis in diarrhoeic pre-weaned lambs and goat kids from north-western Spain. Parasitology Research, 114 (11): 4099-4105. CABANELAS, E., DÍAZ, P., NAVARRO, E., PÉREZ-CREO, A., PRIETO, A., DÍAZ-CAO, J. M., PANADERO, R., LÓPEZ, C., FERNÁNDEZ, G., DIEZ-BAÑOS, P., MORRONDO, P. (2015). Diarreas de etiología parasitaria en terneros. Producción Animal, 289: 40-45. DÍAZ, P.; GÓMEZ-COUSO, H.; NAVARRO, E.; PÉREZ-CREO, A.; REMESAR, S.; PRIETO, A.; LÓPEZ, C.M.; PANADERO, R.; ARES-MAZAS, E.; MORRONDO P.; DÍEZ-BAÑOS, P. (2017). Detección de Giardia y Cryptosporidium en corzos abatidos en Galicia. Boletín de la Asociación del Corzo Español, 15: 135- 140. B. Artículos de divulgación: GARCÍA MENIÑO, I.; DÍAZ, P.; GÓMEZ, V.; NAVARRO, E.; PÉREZ, A.; CABANELAS, E.; PRIETO, A.; DÍAZ, J.M.; SOILÁN, M.; LÓPEZ, C.; PANADERO, R.; FERNÁNDEZ, G.; MORRONDO, P.; DÍEZ-BAÑOS, P.; MORA, A. (2014). Diarreas neonatais en xatos: situación en Galicia. Revista de la Asociación de Frisona Gallega (AFRIGA), 113: 86-92. CABANELAS, E., DÍAZ, P., PÉREZ-CREO, A., NAVARRO, E., PRIETO, A., DÍAZ-CAO, J. M., LÓPEZ, C., PANADERO, R., FERNÁNDEZ, G., MORRONDO, P., DIEZ-BAÑOS, P. (2016). Estratexias de control das principais parasitoses do gando vacún. Revista de la Asociación de Frisona Gallega (AFRIGA), 123: 2- 7. C. Contribuciones a congresos: MORRONDO PELAYO, P.; NAVARRO, E.; DÍAZ, P.; PRIETO, A.; PÉREZ, A.; LÓPEZ, C.M.; FERNÁNDEZ, G.; DÍEZ-BAÑOS. P. (2014). Identification of species of Cryptosporidium in postweaned calves and adult cattle from NW Spain. Joint ISP BAVP EVPC Conference. Dublin, Ireland. 12-13 June 2014. DÍAZ, P.; NAVARRO, E.; PRIETO, A.; PÉREZ, A.; PANADERO, R.; LÓPEZ, C.M.; FERNÁNDEZ, G.; DÍEZ-BAÑOS, P.; MORRONDO P. (2015). Infections by Cryptosporidium spp. in post-weaned and adult small ruminants. XXII International Congress of Mediterranean Federation for Health and Production of Ruminants. Sassari, Italy. 17-20 June 2015. y por hacerme sentir que, si amaba algo, sería capaz de lograrlo con perseverancia y esfuerzo. A André, a mi alma compañera, a esa persona que tiene un doctorado en quererme y en apoyarme en las decisiones que tomo. Sabes que sin tu ayuda todo esto nunca hubiese sido posible. Gracias por ser el gran hombre que camina a mi lado. Índice 1 ANTECEDENTES DEL TEMA........................................................................ 3 1.1. BIOLOGÍA DE Cryptosporidium .............................................................. 3 1.1.1. Taxonomía ...................................................................................... 3 1.1.2. Ciclo biológico ................................................................................ 7 1.1.3. Fuentes de contagio y formas de transmisión .................................. 10 1.2. EPIDEMIOLOGÍA Y PATOGENIA DE Cryptosporidium EN RUMIANTES DOMÉSTICOS ........................................................................................ 13 1.3. DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR Cryptosporidium ........................ 18 1.3.1. Técnicas microscópicas ................................................................. 18 1.3.2. Técnicas inmunológicas ................................................................. 24 1.3.3. Técnicas moleculares ..................................................................... 27 1.3.3.1. Análisis genotípico........................................................... 28 1.3.3.2. Análisis subtípico ............................................................. 30 1.4. INFECCIONES POR Cryptosporidium EN RUMIANTES DOMÉSTICOS ........ 32 1.4.1. En ganado vacuno ......................................................................... 32 1.4.1.1. Especies descritas. ........................................................... 34 1.4.1.2. Relación entre la edad de los animales y las especies identificadas ................................................................... 39 1.4.1.3. Subtipos de C. parvum en ganado vacuno ......................... 46 1.4.2. En ganado ovino ............................................................................ 54 1.4.2.1. Especies descritas ............................................................ 55 1.4.2.2. Relación entre la edad de los animales y las especies identificadas ................................................................... 61 1.4.3. En ganado caprino ......................................................................... 64 1.4.3.1. Especies descritas ............................................................ 65 1.4.3.2. Relación entre la edad de los animales y las especies identificadas ................................................................... 68 1.4.4. Subtipos de C. parvum y C. ubiquitum en pequeños rumiantes ....... 70 1.5. REPERCUSIONES ZOONÓSICAS EN HUMANOS ......................................... 74 2 OBJETIVOS .................................................................................................... 81 3 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................ 85 3.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA ZONA Y DE LOS ANIMALES ......... 87 3.2. OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS ........................................... 90 3.2.1. Concentración de ooquistes de Cryptosporidium y extracción de ADN ............................................................................................ 91 3.2.2. Análisis genotípico ........................................................................ 92 3.2.3. Análisis subtípico .......................................................................... 93 3.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ......................................................................... 96 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................... 97 4.1. EN GANADO VACUNO............................................................................. 99 4.1.1. Prevalencia de infección ................................................................ 99 4.1.2. Análisis genotípico: especies de Cryptosporidium ........................ 105 4.1.3. Relación entre las especies de Cryptosporidium y la edad de los animales .................................................................................... 116 4.1.4. Análisis subtípico ........................................................................ 122 4.2. En ganado ovino y caprino ................................................................ 126 4.2.1. Prevalencia de infección .............................................................. 126 4.2.2. Análisis genotípico: especies de Cryptosporidium ........................ 132 4.2.3. Especies de Cryptosporidium al considerar la edad de los animales .................................................................................... 142 4.2.4. Análisis subtípico ........................................................................ 147 5 CONCLUSIONS/CONCLUSIONES ............................................................ 161 6 SUMMARY/RESUMEN ............................................................................... 169 7 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................... 181 Antecedentes del tema 3 1. Antecedentes del tema Cryptosporidium spp. es una causa frecuente de procesos diarreicos en personas y animales de todo el mundo y, especialmente, en individuos jóvenes o inmunocomprometidos, para los cuales todavía no se dispone de un tratamiento farmacológico eficaz (Bouzid et al., 2013). Además, este protozoo parásito también puede afectar a individuos aparentemente sanos (Bouzid et al., 2013; García Meniño, 2013; Valderrey, 2017). 1.1. BIOLOGÍA DE Cryptosporidium 1.1.1. Taxonomía Una de las áreas de investigación más confusas y que más cambios ha experimentado en los últimos años es la caracterización taxonómica de las especies de Cryptosporidium. Desde el punto de vista clásico, Cryptosporidium spp. se sitúa dentro del Phylum Apicomplexa, que también incluye a otros patógenos de importancia médica y veterinaria, como Eimeria o Isospora. El género Cryptosporidium se incluye en la Clase Sporozoasida, Subclase Coccidiasina, Orden Eucoccidiorida, Suborden Eimeriorina, Familia Cryptosporidiidae, que únicamente contiene este género (Sréter y Varga, 2000). Todas las especies conocidas de Cryptosporidium son monoxenas y poseen características propias que las diferencian de otros coccidios: (i) ooquistes sin esporocistos y con cuatro esporozoítos; (ii) formación de ooquistes de pared fina que permiten la autoinfección y (iii) presencia de una vacuola parasitófora en la célula hospedadora de localización intracelular, pero extracitoplasmática (Ward y Wang, 2001). Sin embargo, y debido a las similitudes microscópicas, moleculares, genómicas y bioquímicas existentes entre Cryptosporidium y las gregarinas, algunos investigadores sugirieron que las especies de este protozoo podrían representar un “eslabón 4 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ perdido” entre estas últimas, que son más primitivas, y los coccidios. En este sentido, Cavalier-Smith (2014), tras revisar detenidamente la taxonomía de las gregarinas, concluyó que algunas eugregarinas y todas las neogregarinas están estrechamente relacionadas con Cryptosporidium, incluyéndolas en una nueva subclase, la Orthogregarinia; además, propuso incluir el género Cryptosporidium dentro de la subclase Cryptogregaria, que agrupa a parásitos epicelulares de vertebrados que poseen un orgánulo alimentador similar al de las gregarinas, pero que carece de apicoplasto. Recientemente, Ryan et al. (2016b) confirmaron definitivamente que Cryptosporidium es una gregarina. El género Cryptosporidium incluye a varias especies que infectan a numerosos vertebrados, incluyendo mamíferos, aves, peces y reptiles. La criptosporidiosis humana es una infección relativamente común, con tasas de seroprevalencia que oscilan entre el 20-35% en Reino Unido (Millar et al., 2002) y EE.UU. (Chappell y Okhuysen, 2002). La criptosporidiosis se consideró una enfermedad antropozoonótica durante algún tiempo, que implicaba principalmente a humanos y rumiantes, con C. parvum y C. hominis como los únicos responsables de la infección. A pesar de que estas especies causan el 90% de los casos (Cacciò, 2005), también se han descrito infecciones por C. felis, C. muris, C. meleagridis, C. canis, C. suis, C. andersoni, C. ubiquitum, C. cuniculus o el genotipo mono de Cryptosporidium (Xiao, 2010). C. meleagridis se considera un parásito emergente y se ha descrito tanto en individuos inmunocompetentes como inmunosuprimidos (Cacciò, 2005; Chalmers et al., 2009b). Debido a que la intensidad de las manifestaciones clínicas, la patogenicidad, el grado de excreción de ooquistes, la implicación en brotes hídricos y la incidencia varía entre las distintas especies del protozoo (Xiao y Feng, 2008), es importante una correcta identificación de estas especies para conocer el riesgo que implica para la salud pública, así como la dinámica de transmisión de las especies de Cryptosporidium presentes en animales (que pueden actuar como reservorio) y en el medio ambiente. De modo similar a otros protozoos, la clasificación de las especies de Cryptosporidium resulta complicada ya que sus ooquistes son Antecedentes del tema 5 indistinguibles desde el punto de vista morfológico (Plutzer y Karanis, 2009; Xiao, 2010; Chalmers y Katzer, 2013). Con objeto de mejorar la identificación específica se han desarrollado varias técnicas de biología molecular, y sus resultados se han complementado con la información obtenida mediante estudios morfológicos, histopatológicos y/o de transmisión cruzada –que permiten conocer la especificidad de hospedador. El empleo conjunto de estos métodos, han permitido avanzar y estandarizar la taxonomía de este género, contribuyendo a la validación de diversas especies (Cama, 2006; Xiao, 2010). Sin embargo, todavía existen numerosos genotipos que no se han podido establecer como especies pues, a pesar de diferir de otras por su morfología y composición genética, no se dispone de los datos precisos sobre sus características biológicas (Xiao et al., 2002a). En este sentido, se ha sugerido que el número de genotipos puede triplicar el número de especies. En la Tabla 1.1., se indican las 32 especies consideradas válidas hasta la fecha, habiéndose reconocido aproximadamente unos 70 genotipos (Xiao, 2010). Esta taxonomía, en ocasiones basada en aspectos no bien conocidos, ha supuesto uno de los mayores obstáculos para comprender adecuadamente la epidemiología de las infecciones por Cryptosporidium en personas y animales (Cacciò, 2005; Sulaiman et al., 2000). Por ello, el mayor conocimiento de sus relaciones filogenéticas ha permitido avanzar en cuestiones importantes como son el potencial zoonótico de cada especie, su distribución y transmisión entre los animales domésticos, silvestres y el hombre. Además, su inclusión dentro de las gregarinas permitió demostrar su capacidad de desarrollo extracelular y, con ello, su importancia como patógeno ambiental (Jex et al., 2008b; Beck et al., 2009; Thompson y Ash, 2016). A pesar de todos los avances efectuados, todavía se necesitan nuevos estudios que permitan dar mayor solidez a la taxonomía de Cryptosporidium, lo que sin duda implicará una mejor comprensión de su estructura poblacional y de su papel en la Salud Pública (Tibayrenc y Ayala, 2014; Šlapeta, 2009). 6 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Tabla 1.1. Especies de Cryptosporidium aceptadas actualmente como válidas y su hospedador tipo Especies Hospedador/es principal/es Referencia C. andersoni Bovino Lindsay et al., 2000 C. avium Pájaros Holobová et al., 2016 C. baileyi Gallina Current et al., 1986 C. bovis Bovino Fayer et al., 2005 C. canis Perro Fayer et al., 2001 C. cuniculus Conejo, Humano Robinson et al., 2010 C. erinacei Erizos Kvác et al., 2014 C. fayeri Canguro rojo, otros marsupiales Ryan et al., 2008 C. felis Gatos Iseki et al., 1979 C. fragile Anfibios Jirku et al., 2008 C. galli Aves Ryan et al., 2003 C. hominis hombre Morgan-Ryan et al., 2002 C. huwi Poecilia reticulata Ryan et al., 2015 C. macropodum Canguro gigante y gris Power y Ryan, 2008 C. meleagridis Pavo, hombre Slavin, 1955 C. molnari Dorada, Lubina Alvarez-Pellitero y Sitja- Bobadilla, 2002 C. muris Ratón Tyzzer, 1907 C. parvum Mamíferos Tyzzer, 1912 C. proliferans Rata topo de África Oriental Kvác et al., 2016 C. ryanae Bovino Fayer et al., 2008 C. rubeyi Marmotas Li et al., 2015 C. saurophilum Lagarto Koudela y Moudri, 1998 C. scophthalmi Peces Alvarez-Pellitero et al., 2004 C. scrofarum Cerdo Kvác et al., 2013 C. serpentis Serpientes Levine, 1980 C. suis Cerdo Ryan et al., 2004 C. tyzzeri Ratón Ren et al., 2012 C. ubiquitum Mamíferos Fayer et al., 2010 C. viatorum Hombre Elwin et al., 2012b C. varanii Varanus prasinus Pavlasek et al., 1995 C. wrairi Cobaya, conejo de indias Vetterling et al., 1971 C. xiaoi Ovino Fayer y Santín, 2009 Antecedentes del tema 7 1.1.2. Ciclo biológico El ciclo biológico de Cryptosporidium spp., así como los diferentes estadios de desarrollo, es semejante al de otros coccidios pertenecientes al suborden Eimeriorina. Es de tipo monoxeno, y todas las fases de multiplicación, tanto sexuales como asexuales, tienen lugar en el mismo hospedador (Smith y Rose, 1998). El ciclo se inicia con la eliminación de ooquistes esporulados con las heces o secreciones respiratorias del hospedador infectado; éste es el único estadio que se puede encontrar en la fase exógena (Fig. 1.1). Los ooquistes presentan una fuerte pared que permite mantener la viabilidad de los 4 esporozoítos internos en condiciones adversas, constituyendo la fuente para nuevas infecciones. Un hospedador receptivo se infecta fundamentalmente mediante la ingestión de ooquistes presentes en el agua, alimentos o en fómites, aunque también se han descrito infecciones por inhalación de los mismos. A continuación, comienza la fase endógena donde, tras la exposición a enzimas pancreáticas y/o sales biliares del intestino delgado, se liberan los 4 esporozoítos. En condiciones experimentales se ha comprobado que los ooquistes pueden enquistarse en soluciones acuosas templadas como las que se pueden encontrar en la conjuntiva del ojo, tracto respiratorio, nódulos linfáticos, testículos, ovarios y vagina (Fayer et al., 1990; Fleta et al., 1995).Tras la liberación de los cuatro esporozoítos, se produce la adhesión de éstos a la superficie de las células epiteliales del tracto gastrointestinal, aunque algunas especies pueden hallarse en el tracto respiratorio. Esta adhesión de los esporozoítos a la superficie permite que penetren, invadiendo la célula hospedadora y formando dentro de ella una vacuola parasitófora, pero que será extracitoplasmática. Se produce así una diferenciación de los esporozoítos en trofozoítos uninucleados, en un proceso conocido como merogonia o esquizogonia, que se caracteriza por varias divisiones nucleares asexuales que lo convierten en un meronte tipo I inmaduro (célula con 6 u 8 merozoítos). Este, después de madurar, da lugar a ocho merozoítos de primera generación (Current, 1999; Sréter y Varga, 2000; Smith et al., 2007; Fayer, 2008; Xiao, 2010). Cada uno de estos merozoítos, después de su liberación al lumen intestinal, invade otra célula epitelial y en ella puede seguir dos caminos: (i) 14 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Además de Cryptosporidium spp., en las diarreas neonatales de los rumiantes intervienen otros agentes infecciosos tanto víricos (rotavirus, coronavirus, torovirus, norovirus, nebovirus, etc.) como bacterianos (Escherichia coli, Salmonella spp., Clostridium spp., Campylobacter spp., etc.) puesto que son procesos complejos debido a su etiología multifactorial (de la Fuente et al., 1998; de Graaf et al., 1999; Olson et al., 2004); no obstante, actualmente este parásito se considera una de las principales causas de diarrea neonatal en terneros, corderos y cabritos (de Graaf et al., 1999; Lundborg et al., 2005; Díaz et al., 2014; García-Meniño et al., 2015). La principal acción patógena de la mayoría de las especies del género Cryptosporidium es consecuencia de su multiplicación activa en las células epiteliales del final del yeyuno y del íleon, que provoca una rápida y numerosa destrucción de las mismas, lo que se traduce en atrofia, fusión y reducción de la longitud de las vellosidades intestinales, quedando la superficie de absorción muy disminuida (Fayer, 2008). En respuesta a la pérdida de enterocitos, en las criptas intestinales se generan nuevas células, pero con escasa capacidad enzimática y de absorción. Estos cambios provocan una deficiencia en el proceso de absorción y digestión de nutrientes que finaliza con la aparición de diarrea, que varía desde moderada hasta aguda y que conlleva deshidratación (Anderson, 1981; Fayer y Ungar, 1986; Díaz et al., 2014; Certad et al., 2017). Entre los signos que también se asocian a la infección por el protozoo se incluyen anorexia, dolor abdominal, apatía, depresión y pérdida de peso (Casey, 1991; De Graaf et al., 1999; Lefay et al., 2001), aunque también se han descrito casos de infección asintomática (Anderson, 1989; Ongerth y Stibbs, 1989; McCluskey et al., 1995). Los casos más graves se caracterizan por una pérdida excesiva de líquidos y electrolitos que produce una acidosis metabólica, que puede resultar fatal en algunas circunstancias (De Graaf et al., 1999). La enfermedad dura aproximadamente entre 3 y 12 días y se caracteriza por la eliminación de numerosos ooquistes (Casemore et al., 1997). La criptosporidiosis produce notables pérdidas económicas en las explotaciones. Además de las pérdidas directas, relacionadas con la mortalidad de los animales, se producen otras pérdidas indirectas Antecedentes del tema 15 como retraso en el crecimiento y debilidad de los animales que superan la enfermedad, a las que hay que añadir el coste de los tratamientos y atención veterinaria (Díaz et al., 2014; García-Meniño et al., 2015). Todos los microorganismos asociados con la aparición de diarrea en rumiantes neonatos se pueden encontrar también en animales sanos. Que el animal muestre sintomatología clínica depende de diferentes circunstancias (Figura 1.3.), como la presencia de factores intrínsecos del animal muy relacionados con su estado inmunitario (edad, el estado nutricional, etc.) y otros factores ligados a las condiciones medioambientales y de manejo de las explotaciones (Morin et al., 1976; Moon et al., 1978; Acres et al., 1979; Radostits y Acres, 1983; Waltner-Toews et al., 1986a-d). Figura 1.3. Principales factores que influyen en las diarreas neonatales en rumiantes neonatos La contaminación del medio constituye uno de los factores más importantes que incrementan la frecuencia de infección en los rumiantes (Díaz et al., 2014). En este sentido es necesario tener en cuenta que los animales infectados eliminan un elevado número de ooquistes con las heces, y que éstos son muy resistentes a factores ambientales (Díaz et al., 2014). Así, los terneros infectados pueden llegar a eliminar hasta 10 millones de ooquistes por gramo de heces 16 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ durante la fase aguda de la enfermedad, constituyendo la principal fuente de contagio en las explotaciones ganaderas, circunstancia que unida a la baja dosis infectante (10-100 ooquistes), facilita la difusión y perpetuación de la enfermedad (Vergara y Quílez, 2004; Díaz et al., 2014). La extrema resistencia de los ooquistes a las condiciones adversas del ambiente es otro factor de gran interés en la epidemiología. Los ooquistes son capaces de mantenerse infectantes en el ambiente durante 2-6 meses a 4ºC, y hasta tres meses a temperaturas de 25-30ºC, seis meses a 20º C o siete meses a 15ºC (Anderson, 1985; Fayer et al., 1998); sin embargo, son muy sensibles a desecación, a la congelación (-18ºC durante 24 horas) y a altas temperaturas, como 70ºC (5 segundos) (Fujino et al., 2002; Vergara y Quílez, 2004; García-Sánchez et al., 2014). Además, los ooquistes resisten bien la desinfección química y no se inactivan con la mayoría de los desinfectantes de uso doméstico e industrial, como cloro, yodóforos al 4 %, cloruro de benzalconio al 10 % o cresoles al 5 % (Xiao et al., 2004). Por el contrario, se ha comprobado que la formalina al 10%, así como los compuestos a base de peróxido o hidróxido de amonio al 5%, empleados durante 18-24 horas, eliminan o reducen de manera notable la capacidad infectante de los ooquistes (Quílez et al., 2005; Fayer et al., 2008; Díaz et al., 2014; García- Sánchez et al., 2014). Recientemente se ha observado que el tratamiento de agua con ozono o con luz ultravioleta puede inactivar los ooquistes del parásito, aunque no se permite su uso a gran escala (Fontán-Sainz, 2011; Gómez-Couso et al., 2012). Por todo ello, se ha comprobado que la presencia de Cryptosporidium spp. está directamente relacionada con una higiene deficiente de las instalaciones y con un manejo incorrecto de los animales. En este sentido, varios estudios han señalado que los suelos fáciles de limpiar (cemento o emparrillado), el uso diario de desinfectantes adecuados en las instalaciones, el mantenimiento de la zona de paridera convenientemente limpio y el empleo de cubículos individuales para los recién nacidos, suponen un menor riesgo de criptosporidiosis (Castro-Hermida et al., 2002a; Vergara y Quílez, 2004; Díaz et al., 2010c; García-Meniño et al., 2014). El tamaño del rebaño también condiciona mucho la presentación de la infección, Antecedentes del tema 17 existiendo mayor frecuencia en los más grandes, probablemente por la mayor densidad de animales, mayor carga de patógenos y menor posibilidad de realizar vaciado sanitario, aunque dependiendo del manejo, esta situación puede empeorar en granjas pequeñas (Díaz et al., 2014). Además, un elevado número de nacimientos en un corto periodo de tiempo favorece el hacinamiento y un aumento de la presión de infección (Vergara y Quílez, 2004; Díaz et al., 2014; García-Meniño et al., 2014). Por otra parte, todos aquellos factores que reduzcan la resistencia del animal a la infección favorecerán la aparición de criptosporidiosis. Los animales recién nacidos son los más receptivos a la infección por Cryptosporidium spp., posiblemente debido a que su sistema inmunitario es todavía inmaduro (Ortega-Mora y Wright, 1994; Santín et al., 2004; Maddox-Hyttel et al., 2006; Roy et al., 2006; Starkey et al., 2006). Se ha comprobado que los anticuerpos calostrales, aunque no protegen completamente frente a la infección en rumiantes neonatos, reducen la gravedad de los signos clínicos e incrementan la resistencia de los animales a otros patógenos entéricos (Fayer et al., 2008). Así, se ha observado mayor morbilidad y cuadros más graves cuando la toma de calostro es insuficiente, incorrecta o de mala calidad; esta situación es muy frecuente en terneros procedentes de novillas de primer parto, pues suelen producir menor cantidad de calostro y de baja calidad, por lo que sus terneros tendrán más posibilidades de adquirir la infección y presentar la consiguiente diarrea (Kelly y Coutts, 2000; Díaz et al., 2014; García-Meniño et al., 2014; Arsenopoulos et al., 2017; Costa et al., 2017; Gelsinger y Heinrichs, 2017; Novo et al., 2017). Además, todas aquellas condiciones y situaciones estresantes, como son una alimentación inadecuada, el hacinamiento o el mantenimiento de los animales en instalaciones poco ventiladas y húmedas, también aumentan notablemente el riesgo de padecer la enfermedad (Díaz et al., 2014). Por último, en la aparición de la diarrea hay factores que están relacionados con los enteropatógenos. Así, es importante señalar que algunas cepas de estos microorganismos poseen una mayor virulencia y causan procesos más graves. Además, las infecciones múltiples son 18 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ muy frecuentes y están asociadas, generalmente, a procesos más graves (García-Meniño et al., 2014, 2015). 1.3. DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR Cryptosporidium Se han descrito una gran variedad de métodos para la detección de Cryptosporidium spp., entre los que se incluyen técnicas microscópicas, inmunológicas y moleculares. Las técnicas microscópicas se utilizan para identificar al parásito tanto en tejidos como en heces, y destacan por su bajo coste, aunque se debe elegir cuidadosamente el método de tinción y visualización (Checkley et al., 2015). Las técnicas inmunológicas y moleculares son complejas y suponen un mayor coste, aunque ofrecen mejores valores de sensibilidad y especificidad (Siddons et al., 1992; Morgan et al., 1998). Sin embargo, el diagnóstico de Cryptosporidium spp. continúa presentando numerosos desafíos. El uso de diferentes métodos de diagnóstico y la aplicación de determinadas técnicas de tipificación pueden dificultar y/o imposibilitar las comparaciones directas entre ensayos clínicos, veterinarios y medioambientales, o entre distintas regiones y países (Chalmers y Katzer, 2013). 1.3.1. Técnicas microscópicas Hasta principios de la década de los 80, el diagnóstico etiológico de la criptosporidiosis se basaba en el estudio de cortes histológicos de muestras de tejido intestinal, que se obtenían mediante biopsia o necropsia, con objeto de localizar los estadios endógenos del parásito en el borde apical de los enterocitos. En la actualidad, la microscopía óptica y/o electrónica son útiles en el estudio de los aspectos histopatológicos y cambios de la estructura celular asociados a la infección; sin embargo, no se emplean en el diagnóstico rutinario de la enfermedad debido a su carácter invasivo, al coste humano y material, y a su escasa sensibilidad. En cualquier caso, las muestras tisulares que se examinen deben fijarse, tan pronto como sea posible, para evitar la autolisis de las células epiteliales. Al examinar microscópicamente cortes de intestino teñidos con hematoxilina/eosina, las fases evolutivas del parásito Antecedentes del tema 19 aparecen como pequeños cuerpos basófilos esféricos (de 2 a 5 μm) en el borde apical de la mucosa (Lamps, 2009), aunque por su tamaño pueden pasar inadvertidas. Sin embargo, para observar las características ultraestructurales y su localización dentro de la vacuola parasitófora es necesario recurrir al microscopio electrónico (O’Donoghue, 1995). La detección de Cryptosporidium spp. en los laboratorios de patología clínica se basa principalmente en la identificación microscópica de ooquistes mediante tinciones y/o anticuerpos fluorescentes (Chalmers y Katzer, 2013). La microscopía presenta una serie de ventajas e inconvenientes a tener en cuenta. Entre sus ventajas cabe destacar el bajo coste de los reactivos y su sencillez, mientras que entre sus inconvenientes se encuentra los bajos valores de especificidad y sensibilidad de la mayoría de estos métodos (Casemore, 1991), así como la necesidad de emplear mano de obra cualificada para identificar correctamente el parásito y no confundirlo con los artefactos que aparecen en las muestras de heces (Kettelhunt et al., 2003). Además, otra importante limitación en el diagnóstico de este parásito es que, al existir especies cuyos ooquistes son morfológicamente idénticos, como C. parvum y C. hominis, nunca se puede alcanzar la identificación específica. Se han descrito un gran número de técnicas para la identificación de ooquistes de este protozoo en las heces, con valores de sensibilidad muy diversos, entre las que se encuentran la tinción con carbolfucsina o tinción negativa de Heine (Heine, 1982), la tinción de Ziehl-Neelsen modificada (Henriksen y Pohlenz et al., 1981), la tinción de Kinyoun (Ma y Soave, 1983), con safranina-azul de metileno (Baxby et al., 1984), con verde malaquita (Elliot et al., 1999), la inmunofluorescencia directa (Bialek et al., 2002), la tinción de hematoxilinaeosina y la tinción con auramina. Las técnicas más comúnmente utilizadas son: - Tinción de Heine: descrita por Heine en el año 1982, se basa en el uso de fucsina básica fenicada, que tiñe los detritus fecales, destacando los ooquistes refringentes no coloreados (Figura 1.4.). Entre sus ventajas destacan su rapidez, sencillez y bajo coste, por 20 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ lo que se considera un buen método para realizar un cribado inicial (Villacorta, 1989; García-Meniño, 2013); además, tiene una buena concordancia con otras técnicas más sensibles. García- Meniño (2013) verificó que, en heces procedentes de terneros con diarrea, los resultados obtenidos con la técnica de Heine mostraban una buena concordancia con los observados con la tinción de auramina (κ= 0,707) y ELISA directo (κ= 0,705). Por el contrario, en muestras de animales sin diarrea, la concordancia era moderada. Figura 1.4. Tinción de Heine Entre los inconvenientes de esta técnica cabe destacar que las preparaciones teñidas con esta tinción no son permanentes y deben examinarse durante los primeros 15 minutos tras su realización, ya que posteriormente los ooquistes son más difíciles de identificar (Potters y Van Esbroeck, 2010). Además, los ooquistes, por su tamaño y forma, pueden confundirse con levaduras u otros artefactos presentes en la materia fecal; en este sentido, y debido a las escasas diferencias morfológicas de los Antecedentes del tema 21 ooquistes de Cryptosporidium spp. (Fall et al., 2003; Checkley et al., 2015), se necesitan técnicas de tinción diferencial, como las usadas para teñir organismos ácido-alcohol resistentes, debido a que la pared de los ooquistes del parásito resiste la decoloración con alcohol-ácido. Existen otras técnicas similares que pueden emplearse en la detección de ooquistes de Cryptosporidium spp., como la tinción negativa con verde malaquita, en la cual éstos se observan como estructuras brillantes, envueltas por un fondo verde (Elliot et al., 1999). - Tinción Ziehl-Neelsen: es una tinción permanente que permite detectar ooquistes del protozoo, que se observan de un color rojo brillante sobre un fondo verde-azulado (Figura 1.5.). Figura 1.5. Tinción Ziehl-Neelsen Este método fue modificado posteriormente permitiendo realizarlo en frío, convirtiéndose en el más utilizado para la tinción de ooquistes en muestras de heces (Casemore, 1991), por lo que se consideró como el “gold-standard”. Esta técnica presenta una serie de inconvenientes a tener en cuenta, (i) su largo 22 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ tiempo de ejecución, unos 30-45 minutos (Mtambo et al., 1992; Chartier et al., 2002); (ii) la aparición de falsos positivos, ya que algunas levaduras y restos fecales pueden adquirir una coloración rojo pálido, pudiendo dar lugar a confusión. La diferenciación de los ooquistes de Cryptosporidium spp. con respecto a otros objetos esféricos de tamaño similar puede conllevar cierta dificultad para una persona poco entrenada, sobre todo en muestras que presentan un reducido número de ooquistes (Smith, 2008); (iii) aparición de falsos negativos, debido a que cuando se sobrepasa el tiempo óptimo de decoloración, los ooquistes pueden aparecer poco teñidos. Por este motivo, algunos autores recomiendan utilizar tinciones que incorporen safranina, tales como la técnica de Köster modificada (safranina y potasa/verde malaquita) o la de Baxby (safranina/azul de metileno) que tiñe los ooquistes de un rosa anaranjado (Villacorta, 1989). - Tinción de Kinyoun: se utiliza para organismos ácido-alcohol resistentes, por lo que mediante esta técnica se consigue una excelente visualización de los estadios evolutivos de Cryptosporidium en heces y/o tejidos. Los ooquistes presentan una coloración rosácea y roja, que destaca sobre un fondo verde (Ma y Soave, 1983; Latimer et al., 1988). La tinción de Kinyoun es muy similar a la de Ziehl-Neelsen, diferenciándose en que: (i) el ácido usado para decolorar es más débil; (ii) no se decolora con alcohol. Aunque ambas tinciones tienen la misma sensibilidad, especificidad y contraste, la de Kinyoun requiere menos tiempo y su ejecución es más sencilla (Velazco, 1995). - Visualización microscópica en contraste de fase: esta técnica de centrifugación-flotación en solución de sacarosa de Sheather se utiliza para la detección de ooquistes de Cryptosporidium spp. a partir de muestras fecales por presentar un bajo coste (Current, 1990). Las muestras deben examinarse rápidamente, ya que si los ooquistes se exponen a soluciones de alta densidad durante un tiempo prolongado pueden distorsionarse o romperse, obteniendo resultados erróneos. Para la visualización de los ooquistes, puede utilizarse un microscopio óptico de campo claro o de contraste de Antecedentes del tema 23 fase (Xiao y Feng, 2008). Con contraste de fase, los ooquistes se visualizan como cuerpos brillantes conteniendo gránulos negros; en el microscopio de campo claro, aparecen translúcidos, muchas veces como estructuras levemente rosáceas, conteniendo gránulos en su interior. La diferenciación con respecto a levaduras es fácil, debido a que no van a presentar esa coloración rosácea típica de Cryptosporidium spp. ni se observan gránulos interiores (Current, 1999; Sréter y Varga, 2000). - Tinción con auramina: con esta técnica se aumenta la sensibilidad, debido a la captación de un fluorocromo por parte de los ooquistes de Cryptosporidium spp.; para ello se utiliza una solución fenólica de auramina, que tiñe tanto la pared externa del ooquiste como las estructuras internas (Figura 1.6). Figura 1.6. Ooquistes de Cryptosporidium spp. teñidos con auramina Existen varias variantes, usando además de la auramina, rodamina (García et al., 1987), fucsina básica fenicada (Casemore et al., 1985a), naranja de acridina (García et al., 1983), mepracina (Ungureanu y Dontu, 1992) o permanganato potásico (Fleck y Moody, 1988). Es una técnica relativamente fácil, rápida y barata, 30 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ 1.3.3.2. Análisis subtípico El empleo de loci altamente polimórficos, que permiten obtener una mayor discriminación, ha resultado de especial interés en el estudio de la variación intraespecífica de algunas especies de Cryptosporidium, fundamentalmente C. parvum y C. hominis, conduciendo a un notable progreso del conocimiento de la epidemiología del protozoo. Entre estos genes cabe destacar el que codifica para la glicoproteína de 60 kDa (GP60, antiguamente denominado gp40), así como varias regiones microsatélite y minisatélite y espaciadores internos transcritos (ITS-2) del ARNr (Gasser et al., 2003; Xiao 2010; Xiao et al., 2001b). Actualmente, la mayoría de los estudios de subtipado se basan en el estudio de la secuencia del gen de la GP60, ya que es el marcador individual más polimórfico identificado hasta el momento en el genoma de Cryptosporidium spp. (Robinson y Chalmers, 2012). Sin embargo, los cebadores descritos hasta el momento sólo permiten amplificar determinadas especies, como C. hominis, C. parvum, C. meleagridis, C. fayeri, C. cuniculus, C. wrairi, C. tyzzeri, C. ubiquitum o C. erinacei (Xiao, 2010; Soilán, 2014). El análisis del gen de la GP60 permite clasificar los diferentes subtipos de C. parvum y C. hominis dentro de familias alélicas; esto es debido que este gen posee una secuencia microsatélite que codifica para la serina constituida por un número variable de repeticiones en tándem de los trinucleótidos TCA/TCG/TCT en el extremo 5´, así como diferencias en las regiones no repetitivas del gen (Xiao, 2010). Así, en la actualidad se han identificado 14 familias alélicas de C. parvum en humanos y animales (IIa-IIo), que se basan en los polimorfismos de un sólo nucleótido (SNPs) y en la secuencia microsatélite. Algunos subtipos, especialmente el IIc, sólo se han detectado en humanos. Por el contrario, otros como el IId, y en particular el IIa, se han señalado como los más comunes en los animales; la mayoría de los subtipos pertenecientes a las familias IIa y IId se han identificado también en humanos, por lo que presentan potencial zoonótico (Xiao, 2010; Wang et al., 2014). Además, cada familia de subtipos GP60 está asociada con ciertas características biológicas del parásito, lo que permite relacionarlas con las presentaciones clínicas (Soilán, 2014). Antecedentes del tema 31 Aquellos estudios de subtipado que requieren una mayor poder discriminatorio se basan en el estudio de regiones con mayor variabilidad como microsatélites y/o minisatélites, que permiten identificar aislados individuales o líneas clonales (Cacciò et al., 2005). Los microsatélites (MS) y minisatélites (MN) se pueden hallar en el genoma de todos los seres eucariotas y son secuencias de ADN que consisten en la repetición en tándem de 1-5 o 10-100 pares de bases, respectivamente. Estos MS y MN presentan polimorfismos de tamaño (variaciones en el número de repeticiones en tándem - VNTR), que son consecuencia de errores que suceden durante la replicación del ADN, lo que se traduce en la ganancia o pérdida de unidades de repetición (Feng et al., 2000; Alves et al., 2003; Mallon et al., 2003a, b; Tanriverdi y Widmer, 2006; Tanriverdi et al., 2006). En consecuencia, los alelos para los loci MS y MN suelen presentar polimorfismos de tamaño. Además, los MS y MN también pueden presentar SNPs, además de las variaciones en el número de repeticiones en tándem (Sulaiman et al., 2001; Peng et al., 2003; Gatei et al., 2006, 2007). Los estudios basados en el análisis conjunto de varios locus (análisis multilocus) se utilizan cada vez con más frecuencia en el tipado de aislados de Cryptosporidium spp. de animales y humanos, permitiendo determinar su estructura poblacional. Estos análisis se pueden basar en la variación de longitud de las secuencias microsatélite y minisatélite, lo que se conoce como tipificación multilocus (MLT) (Feng et al., 2000;Tanriverdi et al., 2006; Alves et al., 2003; Mallon et al., 2003a, b; Tanriverdi y Widmer, 2006; Ngouanesavanh et al., 2006; Díaz et al., 2012), o en la variación de la heterogeneidad genética de la secuencia, que se denomina tipificación multilocus de secuencias (MLST), que además permite detectar los SNPs (Glaberman et al., 2001; Sulaiman et al., 2001; Gatei et al., 2007). En definitiva, los test de diagnóstico tienen cada cual sus limitaciones tanto en coste, importancia clínica y valoración o evaluación de coinfecciones con otros patógenos. Por este motivo, es necesario desarrollar nuevas estrategias para mejorar la interpretación de los resultados en las infecciones mixtas, la relevancia del subtipado 32 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ de especies y la vigilancia de los estudios, y así mejorar la detección e interpretación de los resultados (Ryan et al., 2016). 1.4. INFECCIONES POR Cryptosporidium spp. EN RUMIANTES DOMÉSTICOS Cryptosporidium spp. es un parásito muy común en los rumiantes en todo el mundo, pero las tasas de prevalencia observadas varían ampliamente de unas especies de rumiantes a otras, de las condiciones de manejo y de otra serie de factores, entre los que destacan la edad del hospedador, su estado inmunitario, así como de la especie/genotipo del parásito y su virulencia, que viene determinada genéticamente. 1.4.1. En ganado vacuno El primer estudio sobre criptosporidiosis bovina se publicó en 1971, cuando se identificó este protozoo en una novilla de 8 meses con diarrea crónica (Panciera et al., 1971). En un principio Cryptosporidium spp. se consideró un agente oportunista; su papel como enteropatógeno primario en las diarreas neonatales del vacuno se descubrió cuando Tzipori et al. (1980) atribuyeron por primera vez un brote de diarrea neonatal a la infección exclusiva por este protozoo. Posteriormente, y mediante infecciones experimentales, se demostró que Cryptosporidium spp. es capaz de causar diarrea clínica en terneros (Tzipori et al., 1983; Heine et al., 1984). Desde entonces se ha descrito su intervención en procesos gastroentéricos en los bovinos de la mayoría de los países del mundo (Fayer y Xiao, 2007). Debido a que el ganado vacuno es la especie animal donde la criptosporidiosis tiene una mayor importancia (Santín et al., 2008), en estos animales se han llevado a cabo numerosos estudios transversales que demuestran que este protozoo es muy prevalente en bóvidos, independientemente de su aptitud (lechera o cárnica); así, se han señalado valores de prevalencia individual muy variables que oscilan entre el 0% y el 100%, aunque la mayoría muestran porcentajes del 3- 75% (Santín et al., 2008; Feng y Xiao, 2011; Imre y Dărăbuş, 2011). Estas diferencias tan evidentes son el resultado del empleo de varias Antecedentes del tema 33 técnicas de diagnóstico con diferente sensibilidad (Santín et al., 2008), aunque también se ha comprobado que otros factores, como el sistema de manejo, la época del año, las condiciones ambientales, la edad de los animales, la densidad de ejemplares en la granja, la limpieza de las instalaciones o el diseño del estudio, influyen en el porcentaje de animales infectados en un rebaño (Garber et al., 1994; Atwill et al., 1999; Mohammed et al., 1999; Castro-Hermida et al., 2002a; Maddox-Hyttel et al., 2006; Trotz-Williams et al., 2007; Navarro-i- Martínez et al., 2011; Carmena et al., 2012; Abeywardena et al., 2013a). Sin embargo, cabe destacar que los estudios donde se analiza una única muestra por animal suelen subestimar la prevalencia real, pues la eliminación es, en muchos casos, intermitente (Robertson et al., 2014). En este sentido, los resultados de varios estudios longitudinales realizados en rebaños positivos a Cryptosporidium spp., muestran que todos los terneros eliminan ooquistes en algún momento durante sus primeros meses de vida (O’Handley et al., 1999; Castro- Hermida et al., 2002b; Santín et al., 2008). En ganado vacuno explotado en España fueron Juste et al. (1987) los que describieron el primer caso de criptosporidiosis. En nuestro país, las investigaciones realizadas hasta el momento muestran que este protozoo está implicado frecuentemente en la aparición de brotes de diarrea neonatal en granjas de bovino (Tabla 1.2), con prevalencias que varían entre el 35,7% y el 76%. Tabla 1.2. Prevalencias de infección por Cryptosporidium spp. en terneros lactantes con diarrea neonatal en España Zona Prevalencia Autores Galicia 52,5% Castro-Hermida et al., 2002a 49% Díaz et al., 2010a 76% García-Meniño, 2013 70% García-Meniño et al., 2014 Norte de España 57,8% Quílez et al., 2008a Castilla-León 35,7% Martín-Gómez et al., 1995a Centro de España 52,3% De la Fuente et al., 1998 Aragón 64,7% Quílez et al., 1996a Además, los estudios que analizan la presencia de Cryptosporidium spp. en bovinos asintomáticos en España señalan porcentajes de infección del 22,7- 44% en terneros (Castro-Hermida et 34 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ al., 2002a; García-Meniño et al., 2013) y del 8,4%-14,2% en adultos (Castro-Hermida et al., 2006b, 2007; Cardona et al., 2015). 1.4.1.1. Especies descritas Numerosos estudios demuestran que el ganado vacuno puede estar afectado por un elevado número de especies y genotipos de Cryptosporidium, aunque C. andersoni, C. bovis, C. parvum y C. ryanae son las más frecuentes y con una distribución geográfica más amplia (Tabla 1.3). No obstante, también se ha identificado la presencia, tanto de forma natural como experimental, de otras especies y/o genotipos en los bovinos (Tabla 1.3.), aunque la información obtenida hasta el momento sugiere que estas infecciones son esporádicas y de escasa importancia clínica (Bornay- Llinares et al., 1999; Smith et al., 2005; Geurden et al., 2006; Fayer et al., 2006; Langkjaer et al., 2007; Feng et al., 2007; Khan et al., 2010; Xiao, 2010). De hecho, se necesitan nuevos estudios que permitan determinar si estas especies afectan verdaderamente al ganado vacuno o si únicamente son transeúntes intestinales (Robertson et al., 2014). De todas las especies que afectan al ganado bovino, C. parvum parece ser la especie más cosmopolita, debido a que se ha identificado en un mayor número de países (Xiao, 2010; Ryan et al., 2014;). Los ooquistes de C. parvum son indistinguibles morfológicamente de los de otras especies de Cryptosporidium, por lo que es necesario recurrir a técnicas de biología molecular para identificar las diversas especies; por ello, los primeros estudios moleculares utilizaron los términos C. parvum genotipo bovino, genotipo II y genotipo B para distinguir esta especie de C. hominis. C. parvum presenta un amplio rango de hospedadores vertebrados, principalmente mamíferos, entre los que se encuentran los rumiantes domésticos y las personas, por lo que tiene un indudable interés zoonótico (Casemore et al., 1997; Sischo et al., 2000; Castro-Hermida et al., 2002b; Joachim et al., 2003; Xiao y Ryan, 2008; Fayer, 2010; Díaz et al., 2014). De hecho se considera, junto a C. hominis, una de las especies más comunes en brotes de criptosporidiosis humana, tanto en personas inmunodeprimidas como Antecedentes del tema 35 inmunocompetentes (Vergara y Quílez, 2004; Xiao y Feng, 2008; Chalmers y Katzer, 2013; Šlapeta, 2013). Tabla 1.3. Especies y genotipos de Cryptosporidium identificados en ganado vacuno Especies Distribución Referencias C.parvum Mundial Al Mawly et al.,2015; Cul et al., 2014; Helmy et al., 2013; Meireles et al., 2011; Smith et al., 2010; Santín y Trout, 2008 C.bovis Mundial Abeywardena et al., 2013; Budu-Amoako et al., 2012a, b; Follet et al., 2011; Maikai et al., 2011; Wang et al., 2011b; Silverlas et al., 2010b, 2009b; Fayer et al., 2006 C. ryanae Mundial Mahfouz et al, 2014; Budu-Amoako et al., 2012a, b; Meireles et al., 2011; Wang et al., 2011b; Santín et al., 2008; Halim et al., 2008; Plutzer y Karanis, 2007 C. andersoni Mundial Mahfouz et al, 2014; Castro-Hermida et al., 2011; Wang et al., 2011b; Ralston et al., 2010; Santín y Trout, 2008 C. suis Bélgica, EE. UU, Dinamarca, Sri Lanka, Zambia, Madagascar Bodager et al., 2015; Abeywardena et al., 2014; Fayer et al., 2006; Geurden et al., 2006; Xiao y Cama.,2006; Enemark et al., 2003 C. hominis Escocia, China, Corea, Kenia, India, Nueva Zelanda, Malawi Abeywardena et al., 2012; Chen y Huang, 2012; Kangéthe et al., 2012; Roy et al., 2010; Banda et al., 2009; Feng et al., 2007b; Park et al., 2006; Smith et al., 2005 C. scrofarum Dinamarca Langkjær et al., 2007 C. serpentis Irán, China Chen y Huang, 2012; Azami et al., 2007 C. felis Polonia, España Cardona et al., 2015; Bornay-Llinares et al., 1999 C. canis EE. UU Fayer et al., 2001 C. meleagridis China, Portugal Zhang et al., 2013; Mendoca et al., 2007 C. wrairi Irán Azami et al., 2007; Chrisp et al., 1992 C. baileyi Irán Azami et al., 2007 C. ubiquitum Francia, Italia, Suecia, China Björkman et al., 2015; Ma et al., 2014; Di Piazza et al., 2013; Follet et al., 2011 C. tyzzeri China Chen y Huang, 2012 C. suis-like Dinamarca, India, China, Taiwán, Bélgica, Australia, Reino Unido Ma et al., 2015; Abeywardena et al., 2013 a, b; Robinson et al., 2011; Khan et al., 2010; Geurden et al, 2007; Langkjær et al., 2007; Watanabe et al, 2005 C. parvum-like Nueva Zelanda, Kenia, EE. UU, Canadá Shrestha et al., 2014; Kang'ethe et al., 2012; Lu et al., 2008; Zhang et al., 2007; Starkey et al., 2006; Yang et al., 2004; Heitman et al., 2002 C. xiaoi Jordania, Irlanda, China, Taiwán Hijjawi et al., 2016; Mirhashemi et al., 2016; Ma et al., 2014; Watanabe et al., 2005 36 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Además, C. parvum se considera la especie más patógena en rumiantes domésticos, pues es la principal responsable de la aparición de importantes brotes de diarrea neonatal (Santín et al., 2004; Fayer et al., 2006; Santín y Trout, 2008; Amer et al., 2013, Díaz et al., 2014). Por ello, es la especie predominante en aquellos estudios de casos clínicos (Quílez et al., 2008a; Díaz et al., 2010a; Imre et al., 2011), aunque también se ha identificado como la especie más frecuente o incluso la única presente en vacuno con o sin diarrea (Learmonth et al., 2003; Santín et al., 2004; Castro-Hermida et al., 2006a,b, 2007, 2011; Trotz-Williams et al., 2006; Fayer et al., 2007; Karanis, 2007; Brook et al, 2009; Duranti et al., 2009; Amer et al., 2010; Maurya et al., 2013; Smith et al, 2014; Wells et al., 2015;dos Santos Toledo et al., 2017). Los ooquistes de C. bovis (Xiao et al., 2002b; Santín et al., 2004; Fayer et al, 2005) son morfológicamente indistinguibles de los de C. parvum; por ello, Fayer et al. (2005) renombró esta especie tras caracterizarla molecularmente para los genes de la SSU rRNA, la Hsp70 y la actina. C. bovis tiene un rango de hospedadores limitado, siendo una especie bien adaptada al ganado vacuno y menos patógena que C. parvum, ya que su infección suele cursar de forma asintomática (Feng et al., 2007a; Silverlås et al., 2010 a, b); sin embargo, se han hallado casos de animales diarreicos que eliminaban ooquistes de esta especie (Lee et al., 2016). C. bovis es una especie cosmopolita, pues se ha identificado en ganado vacuno de todo el mundo (Xiao et al., 2002b, 2006, 2007, Geurden et al., 2006, Langkjær et al., 2007, Coklin et al., 2007, Feng et al., 2007a; Siwila et al., 2007, Thomaz et al., 2007, Thompson et al., 2007, Feltus et al., 2008). Además, diversas investigaciones han resaltado la importancia de esta especie en el ganado bovino, al reconocerla como la especie predominante en países como Australia (Abeywardena et al., 2013a), China (Zhang et al., 2015), Dinamarca (Langkjaer et al., 2007), Francia (Rieux et al., 2013), India (Feng et al., 2007a; Khan et al., 2010), Japón (Murakoshi et al., 2012), Nigeria (Maikai et al., 2011; Ayinmode et al., 2010), República Checa (Ondrácková et al., 2009), Suecia (Silverlås et al., 2010b) y EE.UU. (Santín et al., 2004, 2008; Fayer et al., 2006, 2007). Por el contrario, los casos de infecciones por C. bovis en seres Antecedentes del tema 37 humanos son esporádicos y se han detectado en países como Australia (Ng et al., 2012), Egipto (Helmy et al., 2013) o la India (Khan et al., 2010). C. ryanae se nombró en un principio como genotipo “deer-like” debido a que su secuencia 18S rRNA era muy similar a un genotipo hallado en ciervos, a pesar de que nunca se detectó en estos hospedadores (Xiao et al., 2002a). Basándose en estudios genéticos, así como en la morfología y en su forma de transmisión, se le consideró una nueva especie (Fayer et al., 2008). Según Santín et al. (2008) y Silverlås et al. (2010 a, b), el hospedador primario de C. ryanae es el ganado bovino, aunque también se ha hallado en yaks (Ma et al., 2014; Mi et al., 2014; Qi et al., 2015 a; Li et al., 2016), corzos (García-Presedo et al., 2013), ciervos de cola blanca (Santín y Fayer, 2015), zorros (Sturdee et al., 1999; Zhou et al., 2004; Hammes et al., 2007; Nagano et al., 2007; Beck et al., 2011a; Ravaszová et al., 2012), cebúes y búfalos (Abeywardena et al., 2012; Feng et al., 2012; Amer et al., 2013; Bhat et al., 2013; Inpankaew et al., 2014; Aquino et al., 2015; Ma et al., 2015; Ibrahim et al., 2016; Swain, 2016; Hingole et al., 2017). Actualmente se considera poco prevalente en ganado vacuno; de hecho, solo en un estudio se ha identificado como la especie predominante (Nguyen et al., 2012). Sin embargo, presenta una amplia distribución geográfica, pues se ha identificado en los cinco continentes (Santín et al, 2004, 2008; Fayer et al., 2006; Plutzer y Karanis, 2007; Halim et al., 2008; Follet et al., 2011; Meireles et al., 2011; Wang et al., 2011b; Budu- Amoako et al., 2012a, b; Abeywardena et al., 2013a; Mahfouz et al, 2014). Los bovinos infectados con esta especie no presentan, por lo general, signos clínicos compatibles con criptosporidiosis (Fayer, 2010); además, no es zoonótica, por lo que carece de interés en salud pública (Šlapeta, 2013). En los rumiantes, C. andersoni se describió originalmente como C. muris genotipo A o C. muris genotipo bovino basándose en el tamaño de su ooquistes, ya que morfológicamente son similares a los de esta especie (Šlapeta, 2013). Posteriormente, mediante técnicas moleculares se comprobó que presenta una secuencia única del gen SSU rRNA (Morgan et al., 2000). A diferencia de C. muris, esta 38 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ especie posee un estrecho rango de hospedadores, fundamentalmente bovinos, aunque también se ha identificado en otros rumiantes como ovejas, cabras y camellos (Guyot et al., 2001; Enemark et al., 2002; Koyama et al, 2005; Matsubayashi et al., 2005; Fayer et al., 2006; Kvac et al., 2006; Leoni et al., 2006; Robinson et al., 2006; Morse et al., 2007; Waldron et al., 2011; Wang et al., 2011b; Agholi et al., 2013; Liu et al., 2014; Jiang et al., 2014). En el ganado vacuno, esta especie muestra una distribución mundial, aunque es especialmente frecuente en China, donde numerosos estudios la han identificado como la especie predominante (Liu et al., 2009; Wang et al., 2011b; Zhao et al., 2013, 2014; Ma et al., 2015; Qi et al. et al., 2015b); también fue la especie más frecuentemente identificada en otros países como Canadá (Dixon et al., 2011) y la India (Paul et al., 2009). Muestra una localización abomasal, y generalmente su presencia no está asociada a la aparición de signos clínicos (Kváč y V ítovec, 2003), aunque se han señalado algunos casos de animales infectados con esta especie que presentaban diarrea (Kváč et al., 2011). Además, esta especie no se considera zoonótica (Santín et al., 2004; Šlapeta, 2013), aunque se ha identificado esporádicamente en personas en Francia (Guyot et al., 2001), la India (Hussain et al., 2017), Malawi (Morse et al., 2007) y el Reino Unido (Leoni et al., 2006). A pesar de que las cuatro especies de Cryptosporidium más frecuentes en el ganado vacuno presentan una distribución mundial, los resultados moleculares obtenidos hasta el momento sugieren que su importancia varía al considerar la zona geográfica, existiendo notables diferencias regionales (Wang et al., 2011b). Así, en Europa, C. parvum es la especie más frecuente en los bovinos (Díaz et al., 2010a; Smith et al., 2010; Göhring et al., 2014), mientras que C. bovis es la especie predominante en países como China, Australia, India y EE. UU, así como en algunos países europeos (Santín et al., 2004, 2008; Khan et al., 2010; Silverlas et al., 2010b; Wang et al., 2011b; Abeywardena et al., 2013; Rieux et al., 2013; Zhang et al., 2015). Por otro lado, C. ryanae a pesar de su amplia distribución geográfica, sólo se ha encontrado como la especie predominante en un estudio realizado en Vietnam (Nguyen et al., 2012). Asimismo, C. andersoni es especialmente frecuente en algunos países de Asia y América, Antecedentes del tema 39 como China, Brasil y Canadá (Zhou et al., 2007; Liu et al., 2009; Sevá et al., 2010; Dixon et al., 2011; Silva et al., 2014). 1.4.1.2. Relación entre la edad de los animales y las especies identificadas Respecto a la posible relación entre la edad de los animales y los porcentajes de infección por Cryptosporidium spp., la mayoría de los estudios coinciden en que la prevalencia está inversamente relacionada con la edad, de modo que los animales más jóvenes presentan los porcentajes de infección más elevados (Santín et al., 2004; Santín y Trout, 2008; Keshavarz et al., 2009; Khan et al., 2010; Maikai et al., 2011; Muhid et al., 2011; Robertson et al., 2014). Así, en ganado vacuno de EE.UU., Santín et al. (2008), observaron que el 45,8% de los animales de 1-8 semanas de edad eran positivos, mientras que únicamente el 18,5% de los de 3-12 meses de edad y el 2,2% de los 12-24 meses de edad eliminaban ooquistes del protozoo. En la India, Khan et al. (2010) apreciaron una prevalencia significativamente superior en terneros neonatos (20%) que en adultos (4,4%). En el mismo sentido, Gong et al. (2017) en China, apreciaron los porcentajes de infección más elevados en terneros neonatos (19,5%) mientras que los más reducidos se hallaron en los adultos (4,9%), siendo estas diferencias significativas. En Galicia, Castro- Hermida et al. (2006a) observaron un patrón similar, pues la prevalencia fue significativamente más elevada en los menores de un mes (58,5%), descendiendo hasta el 7,9% en los animales adultos. Todos estos datos confirman que los terneros neonatos son los más receptivos a la infección por Cryptosporidium spp., y por ello los animales de 1 a 3 semanas de edad muestran los porcentajes de infección más elevados (Ortega-Mora y Wright, 1994; Quílez et al., 1996a; De la Fuente et al., 1999; Causapé et al., 2002; Castro- Hermida et al., 2002b, 2006a; Santín et al., 2004; Maddox-Hyttel et al., 2006; Roy et al., 2006; Starkey et al., 2006; Soilán, 2014). De hecho, los terneros que adquieren la infección poco después de nacer suelen mostrar los primeros signos clínicos entre los 3 y 5 días de edad, siendo especialmente frecuentes entre los 8 y los 12 días (Castro-Hermida et al., 2002b; Soilán, 2014). La receptividad 46 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ 1.4.1.3. Subtipos de C. parvum en ganado vacuno Actualmente, las técnicas moleculares dirigidas al gen de la glicoproteína de 60 kDa (GP60) han incrementado notablemente la capacidad de identificar y diferenciar los genotipos y subtipos zoonóticos de Cryptosporidium (Strong et al., 2000; Jex y Gasser, 2010; Rieux et al., 2013a). Estas técnicas pueden emplearse para investigar la distribución de las variantes de determinadas especies de Cryptosporidium en animales y en humanos en diferentes regiones geográficas (Robertson et al., 2014). Debido a que C. parvum es la especie zoonótica identificada con mayor frecuencia en el ganado vacuno, los análisis subgenotípicos se han centrado en el estudio de esta especie. En base a los datos proporcionados por estas técnicas, se han identificado más de 80 subtipos diferentes de C. parvum pertenecientes a cuatro familias alélicas (IIa, IId, IIj y IIl) (Tabla 1.4.). De todas ellas, la familia alélica IIa de C. parvum parece ser la más frecuente y ampliamente distribuida en el ganado vacuno (Jex y Gasser, 2010), con más de 60 subtipos diferentes (Tabla 1.4.); sin embargo, es interesante destacar que en el ganado vacuno de China se ha observado que esta familia alélica no es la más común (Wang et al., 2014). Aunque para identificar el subtipo GP60 se emplea fundamentalmente la secuenciación, este método sólo permite detectar el alelo más frecuente en la muestra, impidiendo la evaluación de cualquier diversidad alélica y, consecuentemente, la presencia de infecciones mixtas (Grinberg et al., 2013; Quinones-Mateu et al., 2014); sin embargo, diversos autores sí han señalado la presencia de varios subtipos en una misma granja, y empleando otra metodología, también los han hallado en un mismo animal (Thompson et al., 2007; Xiao et al., 2007; Quílez et al., 2008a). Muchos de los subtipos pertenecientes a la familia IIa detectados en el ganado vacuno tienen potencial zoonótico, pudiendo afectar también a los seres humanos; de hecho, en varios estudios se han aislado los mismos subtipos de C. parvum en muestras de bovinos y personas procedentes de la misma región (Alves et al., 2006a; Geurden et al., 2007; Ng et al., 2008; Wielinga et al., 2008; Xiao y Fayer, 2008; Budu-Amoako et al., 2012b; Rahmouni et al., 2014; Taylan-Ozkan et al., 2016). Antecedentes del tema 47 Tabla 1.4. Subtipos de C. parvum identificados en muestras de ganado bovino Subtipo Lugar Referencia IIaA10G1R1 Eslovenia Kaupke et al., 2015 IIaA11G2R1 España Soilán, 2014 IIaA13R1 Eslovenia Soba y Logar, 2008 IIaA13G1R1 España, Suecia, Díaz et al., 2010a; Silverlas et al., 2013; Soilán, 2014 IIaA13G1R2 Suecia Silverlas et al., 2013 IIaA13G2R1 Argelia, Bélgica, Canadá, España, Holanda, Turquía Trotz-Williams et al., 2006; Geurden et al., 2007; Wielinga et al., 2008; Soilán, 2014; Taylan-Ozkan et al., 2016; Benhouda et al., 2017 IIaA14R1 Suecia Silverlas et al., 2013 IIaA14G2R1 Alemania, Bélgica, Brasil, China Geurden et al., 2007; Broglia et al., 2008; Mi et al., 2013; Heckler et al., 2015 IIaA14G1R1 China, Polonia Mi et al., 2013; Kaupke et al., 2015 IIaA14G1R1b Egipto, Suecia, Amer et al., 2013; Silverlas et al., 2013 IIaA14G1R1r1b Egipto Amer et al., 2013 IIaA14G2R2 Brasil do Couto et al., 2014 IIaA15G2R1 Mundial Trotz-Williams et al., 2006; O’Brien et al., 2008; Quílez et al., 2008a; Wielinga et al., 2008; Díaz et al., 2010a, 2012; Budu-Amoako et al., 2012a; Mi et al., 2013; Silva et al., 2013; Rahmouni et al., 2014; Smith et al., 2014; Soilán, 2014; Aita et al., 2015; Ichikawa-Seki et al., 2015; Ramo et al., 2015; Danisova et al., 2016; Murakoshi et al., 2016; Matsura et al., 2017 IIaA15G2R2 EE. UU, Inglaterra y Gales, República Checa Xiao et al., 2007; Kvac et al., 2011; Smith et al., 2014 IIaA15G1R1 Brasil, China, Egipto Amer et al., 2013; Helmy et al., 2013; Silva et al., 2013; Mahfouz et al., 2014; Feng et al., 2017 IIaA15G4R1 Chile Mercado et al., 2015 IIaA16G1R1 Mundial Trotz-Williams et al., 2006; Misic y Abe, 2007; Plutzer y Karanis, 2007; Broglia et al., 2008; Soba y Logar, 2008 Wielinga et al., 2008; Ondrácková et al., 2009; Silverlås, et al., 2010b, 2013; Imre et al., 2011, 2013; Kvác et al., 2011; Insulander et al., 2013; del Coco et al., 2014; Lassen et al., 2014; Soilán, 2014; Björkman et al., 2015; Vieira et al., 2015 IIaA16G1R1b Belgrado, Polonia, Suecia, Serbia y Montenegro Misic y Abe, 2007; Silverlas et al., 2013; Kaupke et al., 2015 IIaA16G2R1 Bélgica, Canadá, China, España, Portugal Alves et al., 2006a; Trotz-Williams et al., 2006; Geurden et al.,2007; Quílez et al., 2008a; Budu- Amoako et al., 2012a; Mi et al., 2013; Soilán, 2014 48 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Tabla 1.4. (continuación) Subtipo Lugar Referencia IIaA16G3R1 Australia, Canadá, China, Corea, EE. UU, España, Inglaterra, Irlanda del Norte, Irán, Nueva Zelanda, Polonia Trotz-Williams et al., 2006; Xiao et al., 2007; Quílez et al., 2008a; Nolan et al., 2009; Díaz et al., 2010a, 2012; Xiao, 2010; Nazemalhosseini- Mojarad et al., 2011; Budu- Amoako et al., 2012a; Mi et al., 2013; Shrestha et al., 2014; Soilán, 2014; Kaupke et al., 2015; Lee et al., 2016 IIaA16G3R2 Brasil do Couto et al., 2014 IIaA16G4R1 Chile Mercado et al., 2015 IIaA16R1 Eslovenia Soba y Logar, 2008 IIaA16G1 Túnez Rahmouni et al., 2014 IIaA16GR1 Argentina, Jordania, Rumania, Suecia, Silverlas et al., 2010b, 2013; Imre et al.,2013; Insulander et al., 2013; del Coco et al., 2014; Kinross et al., 2015; Hijjawi et al., 2016 IIaA17G1R1 Argentina, Holanda, Inglaterra y Gales, Polonia, Suecia, Wielinga et al., 2008; Tomazic et al., 2013; Silverlas et al., 2013; Smith et al., 2014; Kaupke et al., 2015 IIaA17G1R1c Suecia Silverlas et al., 2013 IIaA17R1 Suecia Silverlas et al., 2013 IIaA17G1R2 Inglaterra y Gales Smith et al., 2014 IIaA17G2R1 Alemania, Australia, Brasil, Canadá, EE. UU, Eslovaquia, España, Inglaterra, Irlanda del Norte, Italia, Malasia, Polonia Trotz-Williams et al., 2006; Thompson et al., 2007; Xiao et al., 2007; Broglia et al., 2008; Quílez et al., 2008a; Duranti et al.,2009; Nolan et al., 2009; Muhid et al., 2011; Smith et al., 2014; Kaupke et al., 2015; Danisova et al., 2016; dos Santos Toledo et al., 2017 IIaA17G4R1 Chile Mercado et al., 2015 IIaA18G1R1 Argentina, Belgrado, Brasil, Francia, Holanda, Hungría, Inglaterra, Republica Checa, Serbia y Montenegro, Suecia Feltus et al., 2006; Misic y Abe, 2007; Plutzer y Karanis, 2007; Wielinga et al., 2008; Brook et al., 2009; Silverlas et al., 2010b, 2013; Kvac et al., 2011; del Coco et al., 2012, 2014; Tomazic et al., 2013; do Couto et al., 2014; Rieux et al.,2014 IIaA18G2R1 Alemania, Francia, Eslovaquia, Hungría, Suecia, Plutzer y Karanis, 2007; Broglia et al., 2008; Silverlas et al.,2013; Rieux et al., 2014; Danisova et al., 2016 IIaA18G2R1a Australia Nolan et al., 2009 IIaA18G2R1b Australia Nolan et al., 2009 IIaA18G1R1c Polonia, Suecia Silverlas et al., 2013; Kaupke et al., 2015 IIaA18G1R1d Suecia Silverlas et al., 2013 IIaA18G2R2 Brasil do Couto et al., 2014 IIaA18G3R1 Australia, Canadá, Corea, España, Gales, Inglaterra, Irlanda del Norte Trotz-Williams et al., 2006; Thompson et al., 2007, 2008; O’Brien et al., 2008; Quílez et al., 2008a; Ng et al., 2012; Abeywardena et al., 2013; Soilán, 2014; Lee et al., 2016; Zahedi et al., 2016a IIaA18G4R1 Australia Nolan et al., 2009 IIa18A3R1 Malasia Muhid et al., 2011 Antecedentes del tema 49 Tabla 1.4. (continuación) Subtipo Lugar Referencia IIaA19G1R1 Argentina, Irlanda del Norte, Polonia Thompson et al., 2007; Xiao et al., 2007; Wielinga et al.,2008; Ng et al., 2012; del Coco et al., 2014; do Couto et al., 2014; Kaupke et al., 2015 IIaA19G2R1 Australia, Brasil, Francia, Holanda, Inglaterra, Jordania, Norte América, Xiao et al., 2007; Wielinga et al., 2008; Brook et al., 2009; Ng et al., 2012; Rieux et al., 2013a; do Couto et al., 2014; Hijjawi et al., 2016 IIaA19G2R2 Brasil do Couto et al., 2014 IIaA19G3R1 España Quílez et al., 2008a IIaA19G3R1a Australia Nolan et al., 2009; IIaA19G3R1b Australia Nolan et al., 2009 IIaA19G4R1 Nueva Zelanda Shrestha et al., 2014 IIaA20G1R1 Argentina, Belgrado, Serbia y Montenegro, Suecia Misic y Abe, 2007; Silverlas et al., 2013; Tomazic et al., 2013; del Coco et al., 2014 IIaA20G2R1 Australia, Brasil Nolan et al., 2009; do Couto et al., 2014 IIaA20G2R2 Brasil do Couto et al., 2014 IIaA20G3R1 Australia, Inglaterra Nolan et al., 2009; Smith et al., 2014 IIaA20G4R1 Australia Nolan et al., 2009 IIaA21G0R1 Alemania Broglia et al., 2008 IIaA21G1R1 Argentina, Suecia Del Coco et al., 2012, 2014; Tomazic et al., 2013; Silverlas et al., 2013 IIaA21G1R1b Suecia Silverlas et al., 2013 IIaA21G3R1 Australia Nolan et al., 2009 IIaA22G1R1 Alemania, Argentina, República Checa, Suecia Broglia et al., 2008; Kvac et al., 2011; Tomazic et al., 2013; Silverlas et al., 2013; del Coco et al., 2014 IIaA23G1R1 Argentina del Coco et al., 2012, 2014; Tomazic et al., 2013 IIaA23G3R1 Australia Nolan et al., 2009; IIdA14G1 China Qi et al., 2015; IIdA15G1 China, España, Holanda, Irán, Malasia, Turquía Quílez et al., 2008a; Wielinga et al., 2008; Lv et al., 2009; Nazemalhosseini-Mojarad et al., 2011; Muhid et al., 2011; Arslan y Ekinci, 2012; Zhang et al., 2015; Li et al., 2016 IIdA16G1 Holanda, Túnez Wielinga et al. 2008; Rahmouni et al., 2014 IIdA17G1 China, España, Portugal, Quílez et al., 2008a; Silverlas et al., 2013a; Li et al., 2016 IIdA17G1d Suecia Silverlas et al., 2013 IIdA18G1 China, Holanda, Turquía, Sudán Wielinga et al., 2008; Qi et al., 2015; Taylan- Ozkan et al., 2016; Taha et al., 2017 IIdA18G1b Belgrado, Serbia y Montenegro Misic y Abe, 2007 IIdA19G1 China, Hungría Suecia, Sudán Plutzer y Karanis, 2007; Wang et al., 2011a, b, 2013; Silverlas et al., 2013; Zhao et al., 2014; Li et al., 2016; Feng et al., 2017; Taha et al., 2017 50 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Tabla 1.4. (continuación) Subtipo Lugar Referencia IIdA20G1 Egipto Amer et al., 2010,2013; Helmy et al., 2013; Mahfouz et al., 2014; Ibrahim et al., 2016; Feng et al., 2017 IIdA20G1b Egipto, Turquía Amer et al., 2013; Taylan-Ozkan et al., 2016 IIdA20G1e Suecia Silverlas et al., 2013 IIdA21G1a Rumania Vieira et al., 2015 IIdA22G1 Alemania, Bélgica, Rumania, Suecia, Geurden et al., 2007; Broglia et al., 2008; Silverlas et al., 2013; Vieira et al., 2015 IIdA22G1b Polonia Kaupke et al., 2015 IIdA22G1c Suecia Silverlas et al., 2013 IIdA23G1 España, Polonia, Suecia Quílez et al., 2008a; Silverlas et al., 2013a; Kaupke et al., 2015 IIdA24G1c Suecia Silverlas et al., 2013a; Kaupke et al., 2015 IIdA25G1 Rumania Vieira et al., 2015; IIdA26G1b Suecia Silverlas et al., 2013a IIdA27G1 Rumania, Suecia, Björkman et al., 2015; Vieira et al., 2015 IIjA16R2 Belgrado, Serbia y Montenegro Misic y Abe, 2007 IIjA17R2 Belgrado, Serbia y Montenegro Misic y Abe, 2007 IIlA16R2 Eslovenia, Serbia y Montenegro Misic y Abe, 2007; Soba y Logar, 2008 IIlA17R2 Serbia y Montenegro Misic y Abe, 2007 IIlA18R2 Eslovenia Soba y Logar, 2008 IIlA19R3 Polonia Kaupke et al., 2015 IIlA24R2 Lituania Wielinga et al., 2008 El subtipo IIaA15G2R1 de C. parvum se considera el más prevalente en terneros de todos los continentes, especialmente en naciones industrializadas (Trotz-Williams et al., 2006; O'Brien et al., 2008; Quílez et al., 2008a; Santín et al., 2008; Díaz et al., 2010a, 2012; Silva et al., 2013; Rahmouni et al., 2014; Smith et al., 2014; Soilán, 2014; Zhang et al., 2015; Ibrahim et al., 2016; Ramo et al., 2016; Matsura et al., 2017); debido a que también es uno de los más frecuentes en los seres humanos, se considera el principal responsable de la criptosporidiosis zoonótica (Feltus et al., 2006; Thompson et al., 2007; Wielinga et al., 2008; Xiao y Ryan, 2008; Díaz et al., 2010a; Xiao, 2010; Silva et al., 2013). Sin embargo, este subtipo no se ha identificado como el predominante en todos los países, pues en diversas regiones del Reino Unido (Inglaterra, Irlanda del Norte), así como en Australia y Nueva Zelanda, el IIaA18G3R1 fue el más común (Thompson et al., 2008; Ng et al., 2012; Abeywardena et al., Antecedentes del tema 51 2013b; Al Mawly et al., 2015; Zahedi et al., 2016a). Estudios recientes revelan que en Nueva Zelanda predomina el subtipo IIaA19G4R1 (Al Mawly et al., 2015; Shrestha et al., 2014). Por el contrario, en ganado vacuno de Argentina no se ha detectado el subtipo IIaA15G2R1, siendo especialmente frecuentes el IIaA20G1R1, el IIaA21G1R1 y el IIaA22G1R1 (Del Coco et al., 2012, 2014). Otro subtipo muy común en bovinos es el IIaA16G1R1, siendo frecuente en el continente europeo, especialmente en los países del centro de Europa (Tabla 1.4), aunque también se ha identificado en algunos países americanos como Argentina (del Coco et al., 2014), Brasil (dos Santos Toledo et al., 2017), EE.UU. (Xiao et al., 2007) y Canadá (Trotz-Williams et al., 2006), así como en Australia (Nolan et al., 2009) e Irán (Nazemalhosseini-Mojarad et al., 2011), La familia Ild es la segunda más importante en ganado vacuno, tanto por su amplia distribución (se ha detectado en bovinos de todos los continentes, excepto en América) y frecuencia, como por su variabilidad genética, ya que hasta el momento se han identificado al menos 20 subtipos diferentes (Tabla 1.4). Además, la IId se incluye entre las familias zoonóticas de C. parvum más importantes, siendo junto a la IIa, las principales responsables de la criptosporidiosis zoonótica (Quílez et al., 2008b; Amer et al., 2010; Cui et al., 2014; Björkman et al., 2015; Vieira et al., 2015; Ibrahim et al., 2016). Así, los subtipos predominantes de esta familia subtípica son el IIdA15G1 y el IIdA18G1, que también se han detectado en personas en Asia (India, Irán, Jordania, Kuwait y Malasia), Europa (Holanda, Reino Unido) y Oceanía (Australia) (Tabla 1.4). De igual modo, se han identificado subtipos de la familia IIl en terneros de Eslovenia, Lituania, Polonia y Serbia y Montenegro, aunque restringidos a un pequeño número de aislados (Misic y Abe, 2007; Soba y Logar, 2008; Wielinga et al., 2008; Kaupke et al., 2015). La familia IIj únicamente se ha identificado en Belgrado, Serbia y Montenegro (Misic y Abe, 2007). Sin embargo, la familia IIc es antroponótica, y hasta ahora solo se ha encontrado en seres humanos, estando ausente en el ganado vacuno (Alves et al., 2003, 2006; Xiao et al., 2004b; Xiao y Ryan, 2004; Thompson et al., 2007; Ryan et al., 2014). También es interesante destacar que la mayoría de los subtipos 52 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ GP60 descritos en el ganado vacuno sólo presentan una copia de la secuencia ACATCA (R1), aunque ocasionalmente se han identificado algunos subtipos con dos copias de esta secuencia (R2) en Suecia y el Reino Unido (Inglaterra y Gales), así como en Norteamérica y Brasil (Feltus et al., 2006; Trotz-Williams et al., 2006; Xiao et al., 2007; Silverlas et al., 2013; do Couto et al., 2014; Smith et al., 2014). En el ganado bovino en España, se han identificado principalmente 2 familias alélicas, la IIa y la IId; la heterogeneidad de los aislados de C. parvum para este locus en España se puede considerar moderada pues se han detectado aproximadamente unos 10 subtipos, siendo los más frecuentes el IIaA15G1R1, IIaA16G3R1 y IIaA13G1R1 (Quílez et al., 2008a; Soilán, 2014). En otras áreas geográficas, como Argentina, Bélgica, EE.UU. o Rumanía, se identificaron entre 5 y 7 subtipos en el ganado bovino (Xiao et al., 2007; Geurden et al., 2008; Imre et al., 2013; Del Coco et al., 2014), mientras que en otros estudios realizados en Europa, se describieron un mayor número de subtipos GP60, alcanzando los 18 (Thompson et al., 2007; Wielinga et al., 2008). Los resultados obtenidos en España hasta el momento revelan que los terneros menores de 1 mes con diarrea deben considerarse un importante reservorio zoonótico (Quílez et al. 2008a; Soilán, 2014). Así, Quílez et al. (2008a) realizaron un estudio sobre la caracterización subgenotípica (GP60) de aislados de Cryptosporidium spp. procedentes de terneros menores de 21 días del norte de España, observando la presencia de dos familias alélicas (IIa y IId), siendo el subtipo más frecuente el IIaA15G2R1 (75,7%) y, en menor proporción, se identificaron IIaA16G3R1 (10,0%), IIaA16G2R1 (2,8%), IIaA17G2R1 (2,8%), IIaA18G3R1 (5,7%), IIaA19G3R1 (1,4%) y IIdA23G1 (1,4%). En este mismo sentido, Díaz et al. (2010a) en un estudio realizado en terneros diarreicos de hasta 21 días de edad en granjas de Galicia, observan solo la presencia de la familia alélica IIa, con el subtipo IIaA15G2R1 como el más común y ampliamente distribuido en terneros, identificándose en 26 aislados (96,3%), distribuidos a lo largo de 15 explotaciones; además identificaron en el resto de terneros el nuevo subtipo IIaA13G1R1. Posteriormente, Díaz et al. (2012) en terneros de la misma edad y de la misma zona geográfica comprobaron que predominaba el subtipo Antecedentes del tema 53 IIaA15G2R1 (78,3%) y en menor proporción el subtipo IIaA13G1R1 (18,9%). Asimismo, Soilán (2014) en esta misma zona geográfica muestra la existencia de 8 subtipos diferentes pertenecientes a la familia alélica IIa. Al analizar la presencia de más de un subtipo GP60 en las explotaciones donde se identificaron varios aislados de C. parvum, detectaron que en la mayoría de las granjas aparecía un único alelo. Sin embargo, en 5 rebaños se observaron dos subtipos diferentes. En todos estos casos estuvo presente el subtipo IIaA15G2R1 (76%), junto con el IIaA16G3R1 (13%), y en menor proporción el subtipo IIaA18G3R1 (2,5%), IIaA13G1R1 y IIaA16G2R1 (1,9%), IIaA11G2R1 y IIaA13G2R1 (1,2%) y IIaA16G1R1 (0,6%). Algunos de los subtipos que se han encontrado en el ganado en Galicia (IIaA13G1R1, IIaA15G2R1, IIaA16G3R1 y IIaA18G3R1), habían sido previamente detectados en humanos de la misma zona, lo que indica que tienen potencial zoonótico (Navarro-i- Martínez et al., 2003, 2010; Vergara y Quílez, 2004; Quílez et al., 2008b; Soilán, 2014; Abal-Fabeiro et al., 2015). El subtipo IIaA15G2R1 está considerado como uno de los principales subtipos responsables de la criptosporidiosis en humanos (Glaberman et al., 2002; Chalmers et al., 2005; Sulaiman et al., 2005; Alves et al., 2006). Por el contrario, los subtipos IIaA16G3R1 y IIaA13G1R1 poseen potencial zoonótico y se han detectado previamente en humanos en casos esporádicos y en un número reducido de aislados (Jex et al., 2008; Soba y Logar, 2008; Zintl et al., 2009, 2011; Ng et al., 2011; De Chierico et al., 2011; Waldron et al., 2011; Iqbal et al., 2012; del Coco et al., 2014; Koehler et al., 2014; Lassen et al., 2014; Lobo et al., 2014; Valenzuela et al., 2014). Quílez et al. (2008a) y Soilán (2014) observaron que el subtipo IIaA18G3R1 presentaba una escasa importancia en el ganado vacuno de España, aunque era el más prevalente en ganado vacuno en Irlanda, Australia, Nueva Zelanda, aumentando el porcentaje de infección en humanos de estos países (Thompson et al., 2007; Jex et al., 2008; Zintl et al., 2009, 2011; Waldron et al., 2011; Ng et al., 2012; Abeywardena et al., 2013. Shrestha et al., 2014). 54 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ 1.4.2. En ganado ovino La criptosporidiosis se describió por primera vez en estos rumiantes en Australia, concretamente, en corderos de entre 1 y 3 semanas de edad que presentaban diarrea (Barker y Carbonell, 1974). No obstante, el papel de Cryptosporidium spp. como agente etiológico primario que ocasiona diarrea en los ovinos se confirmó a principios de los años 80, tras la realización de infecciones experimentales con este protozoo en ausencia de otros enteropatógenos (Angus et al., 1982a; Snodgrass et al., 1984); desde entonces, su importancia como causante de diarreas neonatales en corderos se ha incrementado de forma progresiva. Así, en la actualidad se asocia con una alta morbilidad y baja mortalidad, aunque dependiendo de las condiciones ambientales y de la presencia de otros patógenos intestinales, estos procesos pueden ser fatales (Angus, 1990; Matos-Fernández et al., 1994; Muñoz- Fernández et al., 1996). Según Robertson (2009) la prevalencia individual de Cryptosporidium spp. en ganado ovino, a nivel mundial, se aproxima al 30%, aunque varía de forma considerable entre los diferentes estudios realizados, oscilando entre el 5 y el 70%; esta variación depende de varios factores, entre los que destacan el manejo de los animales, la técnica de diagnóstico empleada, el número de muestras recogidas por animal, la edad de los animales o la presencia de sintomatología clínica. La mayoría de los estudios recientes señalan prevalencias inferiores al 15% en animales sanos (Majewska et al., 2000; Sturdee et al., 2003; Pritchard et al., 2007; Geurden et al., 2008; Wang et al., 2010; Ye et al., 2013; Koinari et al., 2014; Tzanidakis et al., 2014), aunque también se han señalado prevalencias del 15% al 40% (Ryan et al., 2005; Pritchard et al., 2008; Paoletti et al., 2009; Sari et al., 2009; Yang et al., 2009). Los estudios longitudinales muestran que el porcentaje de ovejas que, durante su vida, se infectan con Cryptosporidium spp. es muy elevado; así, en dos granjas de ovino de Australia, y recogiendo 5 muestras por animal, Sweeny et al. (2011) apreciaron una prevalencia individual que osciló entre el 71,4% y el 81,3%; estos autores, además, comprobaron que varios animales eran positivos en todos los muestreos, lo que puede reflejar Antecedentes del tema 55 constantes reinfecciones o la imposibilidad de eliminar de forma natural las infecciones por Cryptosporidium spp. En España, el primer brote de criptosporidiosis en corderos con diarrea fue descrito por Rojo et al. (1985). Posteriormente, diversos autores han puesto de manifiesto la importancia de las infecciones por Cryptosporidium spp. en granjas de ovino con brotes de diarrea neonatal (Tabla 1.5). Tabla 1.5. Prevalencia de infección por Cryptosporidium spp. en ovinos con diarrea neonatal en España Zona Prevalencia Autores Aragón 90,0% Clavel et al. (1989) Aragón 79,4% Causapé et al. (2002) León 70,8% Martín-Gómez et al. (1995b) Castilla-León 44,8% Muñoz et al. (1996) Castilla-León 40,2% Pilar-Izquierdo et al. (1993) Galicia 31,6% Díaz et al. (2015) Galicia 30,7% Díaz et al. (2010a) Este parásito es también frecuente en aquellos rebaños ovinos sin problemas de diarreas en corderos, pues se hallaron prevalencias de infección individuales que oscilaron entre el 14,7% y el 28,0% (Clavel et al., 1989; Matos-Fernández et al., 1993; Martín-Gómez et al., 1995b; Causapé et al., 2002); Además, Cryptosporidium spp está ampliamente distribuido en las granjas ovinas, pues el porcentaje de rebaños con al menos un animal positivo oscila entre el 46,7% y el 73% (Pilar-Izquierdo et al., 1993; Martín-Gómez et al., 1995b). 1.4.2.1. Especies descritas En ganado ovino se han publicado numerosas investigaciones sobre las infecciones por Cryptosporidium spp., aunque únicamente un reducido porcentaje de ellos incluyen datos moleculares que, por lo general, están limitados a un escaso número de aislados del protozoo. Aún así, el número de especies y genotipos encontrado en ovejas, aunque inferior al hallado en ganado vacuno, es considerable e incluye C. andersoni, C. bovis, C. fayeri, C. hominis, C. meleagridis, C. 62 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Hermida et al. (2011) apreciaron una prevalencia significativamente más elevada en corderos neonatos (37,1%) que en ovejas adultas (5,2%). En rebaños de ovejas de EE.UU., Santín et al. (2007) observaron que la prevalencia en los corderos era del 77,4%, siendo ésta muy superior (25,0%) a la hallada en sus madres. En el mismo sentido, Sweeny et al. (2011) señalaron que el porcentaje de infección en los corderos (24,7%-40,7%) era significativamente más elevado que en las hembras gestantes (7,3%). Wang et al. (2009), en ganado ovino de China, comprobaron que el porcentaje de animales que eliminaban ooquistes del protozoo era significativamente superior en los corderos lactantes (10,8%) y en los destetados (4,3%) que en las hembras adultas (2,1-2,5%). Así mismo, en rebaños de ovejas de China, Ye et al. (2013) apreciaron mayores prevalencias en corderos de 3-15 semanas (22,2%) que en sus madres (6,1%) y, además, observaron que el porcentaje de ovejas que eliminaban ooquistes del protozoo en el momento del parto (7,8%) era superior al de las hembras una semana después de parir (1,7%), lo que confirma el incremento de la excreción de ooquistes durante el periparto. En el ganado ovino, el estudio de la posible relación entre la edad y la presencia de determinadas especies de Cryptosporidium conlleva grandes dificultades debido a las limitaciones de los estudios disponibles hasta el momento. Así, la mayoría de las investigaciones sobre Cryptosporidium spp. en ovejas se centran animales sin destetar, donde C. parvum es la principal especie identificada tanto en brotes de diarrea neonatal (Mueller-Doblies et al., 2008; Quílez et al., 2008b; Robertson, 2009; Díaz et al., 2010a, 2015; Cacciò et al., 2013; Imre et al., 2013) como en corderos sanos (Pritchard et al., 2007; Mueller- Doblies et al., 2008; Paoletti et al., 2009; Yang et al., 2009). Las infecciones con criptosporidios en los ovinos de mayor edad (corderos destetados y adultos) suelen ser asintomáticas (Santín et al., 2007), por lo que cabría suponer que estos animales estarían infectados por especies más específicas de hospedador y menos patógenas, como C. ubiquitum o C. xiaoi. Sin embargo, la información disponible sobre las infecciones por Cryptosporidium spp. en estos animales es todavía insuficiente debido al limitado número de aislados identificados. No obstante, esta información sería de gran interés, pues permitiría Antecedentes del tema 63 conocer los grupos de edad con un mayor riesgo zoonótico o que podrían actuar como fuente de infección para los corderos neonatos. Los resultados de algunos estudios epidemiológicos moleculares longitudinales sugieren que, al igual que sucede en el ganado bovino, es probable que exista una relación entre la edad de las ovejas y las especies de Cryptosporidium que presentan. En China, Wang et al. (2010) analizaron muestras fecales de 1.701 ovejas de diferentes edades, observando que C. ubiquitum era la especie más frecuente en todos los grupos de edad, identificándose en el 90,2% de los animales positivos. C. xiaoi y C. andersoni sólo se detectaron en corderos y en hembras adultas, respectivamente, pero en mucha menor proporción. Por el contrario, en otro estudio más reciente realizado en el mismo país, Ye et al. (2013) apreciaron que C. xiaoi era la especie predominante tanto en las madres (10/13) como en corderos (21/36), especialmente en aquellos de 3-4 semanas de edad (15/16). C. ubiquitum también se encontró en ambos grupos de edad en menor proporción, aunque fue la especie más frecuente en los corderos de 15-16 semanas (14/20). C. parvum únicamente se identificó en un cordero menor de un mes (1/36). Todos estos resultados sugieren que las madres pueden transmitir C. xiaoi a los corderos en el periparto (Ye et al., 2013). En este sentido, un estudio longitudinal realizado en ovino de aptitud cárnica en Australia (Sweeny et al., 2011) también mostró que C. xiaoi era la especie más frecuente en los corderos desde las 2 semanas de vida hasta los 9 meses de edad (315/387), así como la única identificada en los animales adultos (14/14). C. ubiquitum sólo se detectó en corderos, siendo más frecuente en los menores de 2 meses. Además, la presencia de C. parvum fue similar en todos los grupos de corderos, formando parte en numerosas ocasiones de infecciones mixtas con C. xiaoi, aunque esta última especie no se identificó en ovinos adultos (Sweeny et al., 2011). Por el contrario, los resultados de otros estudios no han permitido apreciar diferencias entre los diferentes grupos de edad. Así, en EE.UU., Santín et al. (2007) hallaron que C. ubiquitum era la especie predominante tanto en los corderos (22 C. ubiquitum, 3 C. xiaoi y 1 C. parvum) como en los animales adultos (6 C. ubiquitum, 1 C. xiaoi y 1 C. parvum). Además, en 377 ovejas de granjas gallegas, Castro-Hermida et al. (2011) sólo 64 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ identificaron C. parvum tanto en 18 corderos neonatos como en 9 ovejas adultas; en este sentido, Smith et al. (2010) observaron que, en rebaños ovinos del Reino Unido, C. parvum era también la especie predominante en todos los grupos de edad, hallando C. bovis (posiblemente C. xiaoi) sólo en un pequeño porcentaje de corderos lactantes. Estas notables discrepancias entre los estudios podrían ser un reflejo de las importantes diferencias geográficas en la distribución de las diversas especies de Cryptosporidium en el ganado ovino, lo que haría necesario estudiar la posible presencia de asociaciones en cada una de las zonas descritas anteriormente (Europa, Australia y América-Asia). 1.4.3. En ganado caprino La infección por Cryptosporidium spp. en cabras se describió por primera vez en Australia en un cabrito de 2 semanas de edad con diarrea (Mason et al., 1981). Desde entonces, este protozoo se ha identificado en brotes de diarrea neonatal en granjas de ganado caprino de todo el mundo (Polack et al., 1983; Nagy et al., 1984; Matos-Fernández et al., 1993; Santín, 2013), considerándose actualmente como el enteropatógeno más común en cabritos con diarrea (Muñoz-Fernández et al., 1996). Los porcentajes de parasitación por Cryptosporidium spp. en ganado caprino son muy variables, estimándose que, de media, aproximadamente el 15% de las cabras están infectadas (Robertson, 2009), aunque este porcentaje oscila entre el 3,5% y el 72,5% (Wang et al., 2014; Romero-Salas et al., 2016; Kaupke et al., 2017). Estas variaciones en la prevalencia se deben a las diferencias geográficas y estacionales y a las características intrínsecas y extrínsecas de la población estudiada (Geurden et al., 2008; Mahfouz et al., 2014). En España son escasos los estudios realizados sobre el porcentaje de infección por Cryptosporidium spp. en cabras, aunque demuestran que es un parásito muy prevalente en cabritos con diarrea (Tabla 1.7.). Por el contrario, en ganado caprino sano, las prevalencias son mucho más bajas, oscilando entre el 11,0%-19,1% de los animales y el 30,0%-35,5% de las granjas (Matos-Fernández et al., 1993; Martín- Antecedentes del tema 65 Gómez et al., 1995b; Muñoz et al., 1996; Castro-Hermida et al., 2007; Sanz-Ceballos et al., 2009). Tabla 1.7. Prevalencia de infección individual por Cryptosporidium spp. en ganado caprino en España Zona Prevalencia Autores Aragón 55,7% Quílez et al. (2001) Castilla-León 41,7% Muñoz et al. (1996) Galicia 62,7% Díaz et al. (2015) 1.4.3.1. Especies descritas Los estudios sobre la caracterización molecular de especies y/o genotipos de Cryptosporidium realizados en cabras son todavía escasos respecto a los realizados en ganado vacuno y ovino. Como se refleja en la Tabla 1.8., se han identificado 5 especies y dos genotipos del protozoo y, al igual que en el ganado ovino, las especies de Cryptosporidium más prevalentes en las cabras son C. parvum, C. ubiquitum y C. xiaoi (Rieux et al., 2013b; Koinari et al., 2014; Mi et al., 2014; Tzanidakis et al., 2014; Wang et al., 2014; Díaz et al., 2015; Taylan-Ozkan et al., 2016); con menor frecuencia se han hallado C. hominis y C. andersoni. Además, cabe señalar la importancia que C. parvum, C. hominis y C. ubiquitum tienen en Salud Pública, debido a que estas especies poseen potencial zoonótico y se han hallado en reservas y suministros de agua (Robertson, 2009; Ryan et al., 2014). En el ganado caprino, establecer posibles diferencias geográficas en la distribución de especies y genotipos de Cryptosporidium conlleva notables complicaciones debido al escaso número de animales analizados, procedentes, en muchas ocasiones, de unas pocas granjas localizadas en zonas muy concretas (Wang et al., 2014). De todos modos, si se excluyen los estudios de casos clínicos y una investigación realizada en Malasia que incluye, aproximadamente, la mitad de los aislados identificados como C. parvum en cabras (Mat Yusof et al., 2017), C. xiaoi parece ser la especie del protozoo predominante en el ganado caprino en todos los continentes. C. parvum es la especie con una distribución geográfica más amplia en el ganado caprino, ya que se ha detectado en un mayor número de países, aunque todavía no se ha detectado en el continente 66 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ americano (Tabla 1.8). Además, es la especie que se ha identificado en un mayor número de muestras procedentes de cabras, aunque su prevalencia no es siempre la más elevada en los rebaños (Tzanidakis et al., 2014; Kaupke et al., 2017). Como en el resto de rumiantes domésticos, es la principal especie asociada a la aparición de cuadros diarreicos, especialmente en los cabritos neonatos (Chalmers et al., 2002; Quílez et al., 2008b; Díaz et al., 2015), aunque su impacto sobre la salud de los animales parece ser menos importante que en otros rumiantes domésticos, como en los bóvidos (Kaupke et al., 2017). Así mismo, las numerosas descripciones de casos clínicos en animales neonatos han contribuido a que el número de aislados de esta especie sea especialmente elevado. C. xiaoi está ampliamente distribuida en ganado caprino de los 5 continentes (Tabla 1.8.), siendo la especie que predomina en cabras en Australia (Al-Habsi et al., 2017), China (Mi et al., 2014; Peng et al., 2016), Francia (Rieux et al., 2013), Grecia (Tzanidakis et al., 2014), Jordania (Hijjawi et al., 2016) o Polonia (Kaupke et al., 2017). Se cree que es una especie poco patógena para el ganado caprino, puesto que se ha identificado fundamentalmente en animales sanos (Rieux et al., 2013; Mahfouz et al., 2014), aunque también se ha hallado en un reducido número de muestras procedentes de cabritos con diarrea (Díaz et al. 2010b, 2015). C. ubiquitum es la tercera especie más frecuentemente hallada en cabras, aunque el número de aislados identificados es muy inferior a la de las dos especies anteriormente citadas; sin embargo, es la especie predominante en algunos estudios realizados en China (Wang et al., 2014) y Francia (Paraud et al., 2014). Hasta el momento, esta especie sólo se ha identificado en animales asintomáticos, lo que refleja su escasa patogenicidad para el ganado caprino. No obstante, se considera una especie emergente con implicaciones en Salud Pública debido a su potencial zoonótico. Las cabras también pueden presentar infecciones por otras especies del protozoo con un rango de hospedadores restringido, como C. hominis y C. andersoni, así como por algunos genotipos. Antecedentes del tema 67 Tabla 1.8. Especies y genotipos de Cryptosporidium identificados en ganado caprino País C. parvum C. ubiquitum C. xiaoi Otros Referencia Europa 143 21 62 1 C. hominis Bélgica 11 Geurden et al. (2008) España* 17* Quílez et al. (2008b) España* 2* Díaz et al. (2010b) España* 61* 5* Díaz et al. (2015) Francia 7 Ngouanesavanh et al. (2006) Francia 1 18 Rieux et al. (2013b) Francia 16 Paraud et al. (2014) Grecia 2 5 7 Tzanidakis et al. (2014) ND, I, CZE* 15 Cacciò et al. (2000) Italia 21* Drumo et al. (2012) Noruega 4 1 Lange et al. (2014) Polonia 1 29 Kaupke et al. (2017) R. Unido* 2* Chalmers et al. (2002) R. Unido 1 C. hominis Giles et al. (2009) R. Checa 1 Hajušek et al. (2004) América 4 EE.UU. 4 Fayer et al. (2010) África 1 5 Egipto ¿? Shoukry et al. (2009) Tanzania 5 Parsons et al. (2015) Zambia 1 Goma et al. (2007) Asia 274 36 149 16 C. andersoni 3 C. hominis 1 nuevo gt Bangladesh 3 Siddiki et al. (2015) China 1 1 nuevo gt Karanis et al. (2007) China 24 4 16 C. andersoni Wang et al. (2014) China 14 10 45 Mi et al. (2015) China 8 2 94 Peng et al. (2016) Corea Sur 3 C. hominis Park et al. (2006) Filipinas 30 Domingo et al. (2012) India 4 Maurya et al. (2013) Jordania 2 Hijjawi et al. (2016) Malasia 207 Mat Yusof et al. (2017) Omán* 1 Johnson et al. (1999) Sri Lanka 1 Noordeen et al. (2002) Turquía* 9* Taylan-Ozkan et al. (2016) Oceanía 6 8 18 6 C. hominis 1 gt rata II Australia 4 8 17 Al-Habsi et al. (2017) PN Guinea 2 1 6 C. hominis 1 gt rata II Koinari et al. (2014) TOTAL 424 65 238 16 C andersoni 10 C. hominis 1 gt rata II 1 nuevo gt * identificados a partir de muestras de cabritos con diarrea 68 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Estas infecciones se consideran esporádicas, ya que el número de aislados identificado es muy pequeño y solo se han hallado en determinadas granjas. 1.4.3.2. Relación entre la edad de los animales y las especies identificadas Al estudiar la variación de la prevalencia por Cryptosporidium spp. al considerar la edad de los animales, la mayoría de los estudios coinciden con los resultados obtenidos en otras especies animales, señalando que el porcentaje de infección disminuye con la edad. Así, Mi et al. (2014), en rebaños de ganado caprino de China, observaron que los valores más elevados correspondieron a los corderos lactantes (20%) y destetados (15%), mientras que los porcentajes fueron significativamente más reducidos en cabras de un año (7,5%) y adultas (6,3%). En el mismo sentido, y tras analizar un número considerable de muestras fecales (n= 1.265) de cabras en China, Wang et al. (2014) apreciaron los porcentajes de infección más elevados en los cabritos destetados (4,6%) y en los lactantes (2,1%), mientras que los más reducidos se hallaron en los adultos (1,9%), siendo estas diferencias significativas. Otros autores como Noordeen et al. (2001) o Peng et al. (2016) también comprobaron que los animales jóvenes son los más sensibles a la infección por este parásito, aunque se ha observado que cuando los animales no presentan un cuadro clínico, los porcentajes de infección son más elevados en los cabritos de entre 3 y 9 semanas (44,4%) que en los menores de 21 días (26,2%) (Kaupke et al., 2017). Según de Graaf et al. (1999), las infecciones naturales por Cryptosporidium spp. en cabras afectan sobre todo a los neonatos, pudiendo causar cambios patológicos en el intestino que ocasionan una diarrea acuosa autolimitante, pérdida de peso y elevada mortalidad. Sin embargo, aunque un elevado porcentaje de cabras adultas (incluso más del 25%) pueden eliminar ooquistes del protozoo de forma crónica (Noordeen et al., 2001), las criptosporidiosis clínicas son infrecuentes a partir del mes de vida (Delafosse et al., 2006; O′Handley y Olson 2006; Santín, 2013), manifestándose sobre todo con retraso en el crecimiento, reducción de la ganancia media diaria y pérdida de peso (Karanis et al., 2007; Sweeny et al., 2011; Jacobson et Antecedentes del tema 69 al., 2016); por ello, lo más frecuente es que estos animales permanezcan como portadores asintomáticos, debido al desarrollo en mayor o menor grado de una inmunidad protectora asociada a la edad, a una mejor condición física de los animales adultos o a una variación en la infectividad y virulencia de las cepas que afectan a estas cabras (Karanis et al., 2007; Wang et al., 2014; Kaupke et al., 2017). Sin embargo, se ha señalado que durante el periparto el porcentaje de hembras que eliminan ooquistes del protozoo se incrementa de forma considerable, pudiendo ser similar al de los corderos más jóvenes (Wang et al., 2014). Aunque en ganado vacuno se ha demostrado la existencia de una relación entre la edad y la presencia de determinadas especies de Cryptosporidium, resulta difícil llegar a una conclusión en el ganado caprino debido al reducido número de aislados identificados en estos animales, y a que muy pocas investigaciones incluyen una caracterización molecular de aislados procedentes de diferentes grupos de edad. De hecho, sólo tres estudios realizados en China (Mi et al., 2014; Wang et al., 2014; Peng et al., 2016) presentan datos completos. Así, Mi et al. (2014) observaron que C. xiaoi, y C. parvum se observaban en los grupos de animales menores de dos años, mientras que C. ubiquitum se halló en todos los grupos de edad, a excepción de los cabritos lactantes. El porcentaje de aislados positivos a C. xiaoi y C. parvum fue mayor en los cabritos destetados (48,9% y 80%, respectivamente); por el contrario, el número de aislados identificados como C. parvum fue similar en los tres grupos de edad. Los resultados obtenidos posteriormente por Peng et al. (2016) son muy similares a los del estudio anterior, aunque la estratificación de edades resultó un poco diferente; así, C. xiaoi fue también la especie más frecuentemente identificada en todos los grupos de edad; C. parvum también se encontró en las cabras de todas las edades, pero en baja proporción. Por el contrario, C. ubiquitum solo se identificó de forma esporádica en una muestra procedente de un cordero lactante y en otra de un animal adulto. En el mismo sentido, Rieux et al. (2013b) apreciaron que la mayoría (18/19) de los cabritos sin destetar estudiados eliminaban ooquistes de C. xiaoi. Estos resultados sugieren 70 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ una posible transmisión de C. xiaoi en el periparto, similar a lo observado en ganado ovino (Ye et al., 2013). En contraste con los estudios anteriores, Wang et al. (2014) observaron que C. ubiquitum era la especie predominante en todos los grupos de edad, a excepción del grupo de los corderos destetados, donde C. andersoni fue la especie identificada con mayor frecuencia; esta última especie se halló en una única granja, aunque se detectó en 4 grupos de edad. Sin embargo, la importancia de C. xiaoi fue menor, identificándose solo en cabritos y en hembras gestantes. 1.4.4. Subtipos de C. parvum y C. ubiquitum en pequeños rumiantes El gen GP60 es, actualmente, el marcador genético empleado con mayor frecuencia para el subtipado de aislados pertenecientes a diferentes especies de Cryptosporidium, incluyendo algunas de gran importancia en humanos, como C. parvum y C. hominis, y otras de menor relevancia (C. meleagridis, C. cuniculus, etc.). Respecto a los subtipos GP60 de C. parvum, aunque se han publicado numerosos trabajos relativos tanto a los seres humanos como al ganado vacuno, en pequeños rumiantes éstos son escasos; así, tanto en ganado ovino como en caprino únicamente se han identificado subtipos de las familias alélicas IIa y IId que tienen potencial zoonótico (Tablas 1.9 y 1.10). Además de los subtipos recogidos en estas Tablas, en pequeños rumiantes también se han detectado el IIdA4G2T14 y IIdA4G3T13, aunque no se han incluido debido a que no se indica ni el número de aislados de cada uno de ellos ni la especie donde se hallaron (Tzanidakis et al., 2014). En ovinos, al contrario de lo observado en caprino, el número de subtipos de C. parvum pertenecientes a la familia IId es muy superior a la de subtipos IIa, aunque esto puede deberse al menor número de aislados identificados en estos últimos. Ambas familias poseen potencial zoonósico, aunque los datos obtenidos hasta el momento sugieren que los subtipos pertenecientes a la familia IIa son los más comunes en las infecciones por C. parvum en personas (Xiao, 2010). Antecedentes del tema 71 Tabla 1.9. Subtipos de C. parvum identificados en muestras de ganado ovino Subtipo Nº aislados Lugar Referencia IIaA13G1R1 1 España Díaz et al., 2015 IIaA14G2R1 1 España Díaz et al., 2015 IIaA15G2R1 42 Bélgica, Brasil, China, España, Italia, Papúa N. Guinea, Reino Unido Geurden et al., 2008; Quílez et al., 2008b; Díaz et al., 2010a, 2015; Smith et al., 2010; Cacciò et al., 2013; Ye et al., 2013; Koinari et al., 2014; Paz e Silva, 2014; Yang et al., 2014; Wells et al., 2015 IIaA16G1R1 2 Jordania, Rumanía Imre et al., 2013; Hijjawi et al., 2016 IIaA16G3R1 15 España Díaz et al., 2010a, 2015 IIaA17G1R1 12 Polonia, Reino Unido, Rumanía Smith et al., 2010; Imre et al., 2013; Kaupke et al., 2017 IIaA17G2R1 1 Reino Unido Smith et al., 2010 IIaA18G2R1 1 Reino Unido Wells et al., 2015 IIaA18G3R1 1 España Quílez et al., 2008b IIaA19G1R1 3 Reino Unido Connelly et al., 2013; Utsi et al., 2016 IIaA19G2R1 7 Jordania, Reino Unido Wells et al., 2015; Hijjawi et al., 2016 IIaA19G4R1 1 Papúa N. Guinea Koinari et al., 2014 IIaA20G2R1 3 Italia Cacciò et al., 2013 TOTAL IIa 90 IIdA14G1 2 España Quílez et al., 2008b IIdA15G1 3 España Quílez et al., 2008b IIdA17G1 70 España Quílez et al., 2008b IIdA18G1 42 Australia, China, España Quílez et al., 2008b; Yang et al., 2014, 2015 IIdA19G1 43 China y España Quílez et al., 2008b; Yang et al., 2014 IIdA20G1 1 Rumanía Imre et al., 2013 IIdA21G1 1 España Quílez et al., 2008b IIdA22G1 2 España Quílez et al., 2008b IIdA22G2R1 1 Rumanía Imre et al., 2013 IIdA24G1 3 España y Rumanía Quílez et al., 2008b; Imre et al., 2013 TOTAL IId 168 Si bien es cierto que, en pequeños rumiantes, un amplio número de estudios únicamente han detectado subtipos pertenecientes a la familia IIa (Geurden et al., 2008; Díaz et al., 2010a; Smith et al., 2010; Cacciò et al., 2013; Connelly et al., 2013; Ye et al., 2013; Koinari et al., 2014; Lange et al., 2014; Paz e Silva, 2014; Yang et al., 2014; Hijjawi et al., 2016; Utsi et al., 2016; Al-Habsi et al., 2017), cabe destacar que el número de aislados identificados en cada una de estas investigaciones fue, generalmente, reducido. La diversidad genética de C. parvum observada en estos pequeños rumiantes es menor a la detectada en ganado vacuno, y refleja el escaso número de aislados identificados. Por el mismo motivo, el número de subtipos detectados en el ovinos es mayor que en caprinos (Tablas 1.9 y 1.10); no obstante, si se considera el total de aislados identificados hasta el 78 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Las infecciones humanas causadas por C. felis se han detectado en muchos lugares, mostrando una mayor frecuencia en los países en desarrollo que en las naciones industrializadas (Raccurt, 2007; Lucio- Forster et al., 2010). Diversos estudios llevados a cabo en Europa identificaron un número variable de casos producidos por C. felis (Morgan et al., 2000; Pedraza-Díaz et al., 2001; Leoni et al., 2006; ANOFEL, 2010; Elwin et al., 2012a; Insulander et al, 2013). Asimismo, se encontraron muestras positivas para esta especie en humanos de África y del Norte y Sur de América (Pieniazek et al., 1999; Morgan et al., 2000; Pedraza-Díaz et al., 2001). Cryptosporidium canis infecta a perros domésticos (Canis familiaris) de todo el mundo. Aún se conoce muy poco sobre esta especie y la enfermedad que causa en estos animales domésticos. Esta especie también se ha detectado (Trout et al., 2006) en coyotes (Canis latrans), en zorros rojos (Vulpes vulpes) (Nolan et al., 2013) y ocasionalmente en humanos. En los últimos años, C. ubiquitum, anteriormente conocido como "genotipo cervino o genotipo 3", emerge como otra importante especie zoonótica que infecta a humanos (Fayer et al., 2010). Se ha encontrado en personas de todo el mundo, principalmente en naciones industrializadas (Chalmers y Katzer, 2013). De hecho, en el Reino Unido, se han atribuido más casos humanos de criptosporidiosis a C. ubiquitum que a C. canis (Elwin et al., 2012a). El reciente reconocimiento de C. ubiquitum como un patógeno zoonótico emergente tiene una elevada importancia en la salud pública debido a su amplia distribución geográfica y al amplio rango de hospedadores que tiene (Fayer et al., 2010; Li et al., 2014). Esta especie se ha detectado en corderos en Galicia (Soilán, 2014; Díaz et al., 2015), en rumiantes silvestres, en roedores, en carnívoros (mapaches) en lémures y en humanos (Feng et al., 2007; Ziegler et al., 2007; Da Silva et al., 2003; Elwin y Chalmers, 2008; Fayer et al., 2010). También se ha hallado en fuentes de agua potable, aguas pluviales y aguas residuales en varias ubicaciones geográficas (Zhou et al., 2003; Jiang et al., 2005; Yang et al., 2008; Jellison et al., 2009; Nichols et al., 2010; Van Dyke et al., 2012). Antecedentes del tema 79 En España esta enfermedad es de declaración obligatoria desde el año 2009, pero las pruebas de rutina no se llevan a cabo y en muchos casos puede pasar inadvertida (Martín-Ampudia et al., 2012). No obstante, la identidad de las especies y genotipos de Cryptosporidium que infectan a las personas en nuestro país no está bien definida y se encuentran disponibles pocos datos sobre la diversidad intraespecífica de este protozoo. La mayoría de los estudios se realizaron en poblaciones en riesgo con sintomatología o donde ya se sospechaba de la existencia de la infección. Se publicaron estudios en población adulta y en niños (tanto inmunocompetentes como inmunodeprimidos), sobre todo VIH-positivos en diversas regiones como Galicia (Abal-Fabeiro et al., 2015), Cádiz (García et al., 1989; Díaz et al., 1990), Madrid (Alonso-Sanz et al., 1995; del Águila et al., 1997), Salamanca (García-Rodríguez et al., 1990; Rodríguez-Hernández et al., 1996), Zaragoza (Moles et al., 1998; Ramo et al., 2015), Islas Canarias (Abreu-Acosta et al., 2007) o Barcelona (Segura et al., 2015). A través de estudios moleculares se demuestra que en España circulan 4 especies de Cryptosporidium (C. parvum, C. hominis, C. meleagridis y C. felis) importantes en la epidemiología de la criptosporidiosis humana (Quílez et al., 2008b; Navarro-i- Martínez et al., 2003, 2010). De hecho, los casos de criptosporidiosis humana ocasionados por C. hominis son más prevalentes que los de C. parvum (Llorente et al., 2007; Navarro-i-Martínez et al., 2012). En este sentido, en los niños de áreas urbanas predominaban las infecciones por C. hominis, mientras que, en los de áreas rurales eran más prevalentes las infecciones por C. parvum. Esto coincide con lo señalado por diversos autores (Llorente et al., 2007; Essid et al., 2008; Zintl et al., 2009; Xiao, 2010; Navarro-i-Martinez et al., 2012) quienes indicaron que sobre la distribución geográfica de C. parvum y de C. hominis influye el hábitat en el que viven las personas. No obstante, cabe señalar que, aunque C. hominis y C. parvum son responsables de la mayoría de las infecciones, también hay que prestar atención a las criptosporidiosis ocasionadas por C. meleagridis, C. felis y C. ubiquitum, ya que también se han descrito casos esporádicos (Llorente et al., 2007; Martín-Ampudia et al., 2012), especialmente en niños (Llorente et al., 2007; Cardona et al., 2011). 80 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Otros estudios sugieren la existencia de poblaciones de C. parvum específicas de humanos (Cacciò, 2005); este genotipo se caracterizó bien y se detecta en numerosos brotes de criptosporidiosis teniendo como fuente principal de transmisión el agua de bebida o destinada a usos recreativos (MacKenzie et al., 1994; Peng et al., 1997; Ong et al., 1999; Sulaiman et al., 1998; Xiao et al., 2001; Glaberman et al., 2002; Ward et al., 2002; Ryan et al., 2005; Baldursson y Karanis, 2011). Además, hay que tener en cuenta, que Cryptosporidium puede ser resistente a los diferentes métodos para el tratamiento de aguas, por lo que la criptosporidiosis representa el principal problema de salud pública de los servicios de suministro de agua potable en los países desarrollados (Fayer et al., 2000; Chalmers y Katzer, 2013). También se ha detectado la presencia de Cryptosporidium spp. en verduras frescas (Monge et al., 1996), en sidra de manzana (Millard et al., 1994; Driedger et al., 2001; Blackburn et al., 2006) o en bivalvos (Freire-Santos et al., 2000). Puntualmente, se han descrito casos de infección respiratoria por inhalación o aspiración (Shirley et al., 2012). Objetivos 83 2. Objetivos Basándonos en los antecedentes expuestos, nos planteamos los siguientes objetivos: 1º.- Determinar la prevalencia de infección por Cryptosporidium spp. en rumiantes domésticos sin diarrea, en Galicia. 2º.- Identificar las especies y genotipos presentes en ganado vacuno, ovino y caprino de esta región española. 3º.- Conocer las asociaciones de las especies/genotipos de Cryptosporidium más frecuentes en las granjas de rumiantes domésticos en Galicia. 4º.- Determinar la frecuencia de las especies/genotipos de Cryptosporidium en relación con la edad de los animales. 5º.- Analizar si los animales sin diarrea pueden originar brotes de diarrea neonatal en las explotaciones de rumiantes domésticos. 6º.- Investigar si las especies/genotipos de Cryptosporidium halladas en los rumiantes objeto de estudio, son potencialmente zoonóticas. Materiales y métodos 87 3. Materiales y métodos En este apartado se describen las características generales de la zona y de los animales objeto de este estudio, así como las técnicas moleculares empleadas para detectar la presencia de Cryptosporidium spp. y para genotipar y/o subtipar los aislados del protozoo. 3.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA ZONA Y DE LOS ANIMALES Galicia es una región esencialmente ganadera situada en el noroeste de España (43°47’-41°49’ N; 6°42-9°18’ W). El ganado vacuno de aptitud lechera y cárnica son los principales activos del sector ganadero en Galicia, siendo Lugo y A Coruña las provincias con un mayor censo de bovinos, con 451.970 y 335.654 cabezas de ganado, respectivamente (MAGRAMA, 2015). En los últimos años, debido fundamentalmente al cierre de las explotaciones de pequeño tamaño, en esta Comunidad Autónoma se ha reducido significativamente el número de granjas (de 49.355 en el 2008 a 39.479 en 2014), aunque ha aumentado el número de vacas por rebaño (Instituto Galego de Estatística, 2017), conduciendo a un mayor grado de intensificación (mayor producción) y tecnificación (uso de maquinaria más moderna, mejores instalaciones) de las granjas, especialmente de ganado vacuno lechero. Sin embargo, el aumento de animales estabulados, si las medidas higiénico-sanitarias no son las adecuadas, conlleva un incremento del riesgo de contagio con algunos patógenos, como los protozoos intestinales (Cryptosporidium spp., Eimeria spp., Giardia spp., etc.). Este riesgo es menor en las explotaciones de carne, pues la mayoría de las explotaciones gallegas de vacuno de carne se caracterizan por ser pequeñas empresas familiares, que sirven de complemento a su economía, y por ello la mayoría se manejan en régimen semi-extensivo. El tiempo de pastoreo depende de las condiciones meteorológicas; así, por ejemplo, en primavera y otoño, las vacas permanecen todo el día en los pastos, 94 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Gyeonggi, Corea del Sur) aplicando un voltaje de 110V durante 70 minutos. A continuación, se visualizaron en un analizador de imagen. Las especies y/o genotipos de Cryptosporidium se identificaron comparando los patrones de restricción obtenidos con los recogidos en varios trabajos (Feng et al., 2007; Xiao y Ryan, 2008), y que se resumen en la Tabla 3.4. Un número representativo de los aislados cuyo patrón de restricción no coincidió con el de C. parvum se secuenciaron con objeto de confirmar los resultados de la RFLP. Tabla 3.4. Patrones de restricción para las especies de Cryptosporidium más frecuentes en rumiantes domésticos al considerar la enzima usada SspI VspI MboII C. andersoni 448, 397 730, 115 769, 76 C. bovis 432, 267, 103, 34 617, 115, 104 412, 185, 162, 76 C. parvum 450, 267, 108, 12, 11 629, 115, 104 771, 76 C. ryanae 432, 267, 103, 34 616, 115, 104 574, 185, 76 C. ubiquitum 454, 384, 11 461, 169, 115, 104 - C. xiaoi 413, 267, 103, 34, 19 617, 115, 104 - 3.2.3. Análisis subtípico Los aislados identificados como C. parvum y C. ubiquitum en la RFLP, se subtiparon mediante el análisis de la secuencia de un fragmento (800-850 y 950 pb, respectivamente) del gen que codifica para la glicoproteína de 60 kDa (GP60), empleando PCRs anidadas descritas previamente por Alves et al. (2003) y Li et al. (2014), respectivamente. En el caso de la PCR anidada para subtipar C. parvum, en ambas reacciones se empleó 1 μl de ADN (ADN patrón para la primera reacción y producto de la primera PCR para la segunda reacción), que se añadió a una mezcla compuesta por tampón de PCR 1x, MgCl2 3 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador (Tabla 3.5) y 5 U de Taq polimerasa, en un volumen total de 50 μl. Las muestras se sometieron a 40 ciclos de 45’’ a 95°C, 45’’a 52°C y un minuto a 72°C; también se incluyó un paso de desnaturalización inicial (3 minutos a 95°C) y otro de extensión final (10 minutos a 72°C). Materiales y métodos 95 Tabla 3.5. Cebadores usados en la amplificación de los genes que codifican para la GP60 Cebador Secuencia (5´-3´) C. parvum GP601F (AL 3531) ATA GTC TCC GCT GTA TTC GP601R (AL 3535) GGA AGG AAC GAT GTA TCT GP602F (AL 3532) TCC GCT GTA TTC TCA GCC GP602F (AL 3534) GCA GAG GAA CCA GCA TC C. ubiquitum Ubi-18S-F1 TTTACCCACACATCTGTAGCGTCG Ubi-18S-R1 ACGGACGGAATGATGTATCTGA Ubi-18S-F2 ATAGGTGATAATTAGTCAGTCTTTAAT Ubi-18S-R2 TCCAAAAGCGGCTGAGTCAGCATC Para amplificar un fragmento del gen gp60 de C. ubiquitum se empleó 1 μl de ADN patrón para la primera reacción y 2 μl del producto de la primera PCR para la segunda. Ambas reacciones se realizaron en un volumen total de 50 μl, conteniendo 3 mM de MgCl2, tampón de PCR 1x, 200 µM de cada dNTP, 0,25 µM de los cebadores Ubi-18S-F1 y Ubi-18S-R1 o 0,5 µM de los Ubi-18S-F2 and Ubi-18S- R2 (Tabla 3.5) y 1,25 unidades de Taq polimerasa. En la primera PCR también se incluyeron 400 ng/μl de seroalbúmina bovina (Sigma, S. Luis, Montana, EE.UU.). El protocolo consistió en una desnaturalización inicial a 94°C durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos de 45‘’ a 94°C, 45’’ a 58° C (primera PCR) o a 55°C (segunda PCR), 1’ a 72°C y una extensión final de 7’ a 72°C. En ambos casos, los productos de PCR obtenidos se visualizaron en un analizador de imagen tras someterlos a una electroforesis, empleando el mismo protocolo que en la PCR del SSU rRNA. Para identificar los subtipos presentes, se determinó la secuencia de nucleótidos utilizando el procedimiento citado anteriormente, y las secuencias consenso se compararon con las depositadas en el GenBank. En C. parvum, el fragmento amplificado del gen de la GP60 posee en el extremo 5’ una región integrada por repeticiones de los trinucleótidos TCA/TCG/TCT que codifican para la serina. Teniendo en cuenta esta característica, los subtipos se nombraron considerando el número de repeticiones de TCA y TCG en la región repetitiva y de las mutaciones presentes en la zona sin repeticiones, así como del número de copias de la secuencia ACATCA localizadas al final de la zona repetitiva en aquellos subtipos pertenecientes a la familia IIa (Sulaiman et al., 2005). 96 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ 3.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Los datos obtenidos en este estudio se procesaron con ayuda de la hoja de cálculo Microsoft Excel 2007 y su análisis estadístico se realizó mediante el paquete estadístico IBM SPSS Statistics para Windows, versión 20.0. (IBM Corporation, Chicago (IL), EE.UU.). Para comprobar la posible influencia de diferentes parámetros (edad, provincia, especie animal, especie de Cryptosporidium, …) sobre el porcentaje de infección individual se empleó el test Chi-cuadrado. Se consideró que las diferencias eran significativas cuando el p-valor fue menor de 0,05. Resultados y discusión 99 4. Resultados y discusión En este apartado se analiza la prevalencia de infección por Cryptosporidium spp. en tres especies de rumiantes domésticos a nivel individual, de explotación y al considerar la edad de los animales. Además, se han determinado las especies de este parásito y su prevalencia en los diferentes grupos de edad y se han establecido cuales son los subtipos más frecuentes en el ganado vacuno y en el ovino y el caprino. 4.1. EN GANADO VACUNO 4.1.1. Prevalencia de infección Como ya se señaló en el correspondiente apartado de Materiales y Métodos, en primer lugar los ooquistes de Cryptosporidium spp. presentes en las muestras de heces se concentraron, empleando este concentrado para realizar la extracción del ADN parasitario. Posteriormente, y mediante una PCR anidada, se amplificó un fragmento de aproximadamente 850 pares de bases (pb) del gen que codifica para la subunidad 18S del ARNr de este parásito (Figura 4.1.). Así, se detectó la presencia de ADN de Cryptosporidium spp. en 91 muestras de las 555 analizadas, lo que supone una prevalencia de infección individual del 16,4%. Al considerar la localización de las explotaciones, el porcentaje de animales positivos fue significativamente (χ2= 4,409; p= 0,036) superior en Pontevedra (25,4%) que en Lugo (15,2%); en la provincia de Ourense no se detectaron animales positivos. Se debe señalar que en el presente estudio sólo se pudo disponer de una muestra por animal; teniendo en cuenta que las infecciones asintomáticas por este protozoo se caracterizan por una eliminación intermitente de ooquistes, el análisis de una única muestra puede dar lugar a falsos negativos, por lo que nuestros resultados podrían estar 100 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ subestimando la prevalencia real de Cryptosporidium spp. en el ganado vacuno sin diarrea (O’Handley et al., 1999; Fayer et al., 1998; Castro-Hermida et al., 2002, 2006; Robertson et al., 2014; Cardona et al., 2015). Algunas investigaciones sugieren que casi la totalidad de los animales se infectan con el protozoo durante el primer mes de vida; en este sentido, Villacorta et al. (1991) hallaron una prevalencia de infección del 93% en terneros neonatos cuando, al realizar un seguimiento individual durante un mes, se analizaron dos muestras semanales. Figura 4.1. Muestras positivas (calles 1-16) mediante PCR del gen que codifica para la subunidad ribosómica 18S del ARNr (fragmento de aproximadamente 850 pb) El porcentaje de infección individual detectado en el presente estudio resultó, por lo general, ligeramente más elevado que los señalados previamente en ganado vacuno de Galicia por Castro Hermida et al. (2006, 2007, 2009, 2011), con valores que oscilaron entre el 6,4% y el 14,2%. En otras regiones de España se hallaron prevalencias similares a las obtenidas en nuestro estudio, como en Aragón (19,7%; Quílez et al., 1996a); por el contrario, en un estudio realizado en Álava, Cardona et al. (2011), solo hallaron un 3% de bovinos positivos. Al comparar nuestros resultados con los obtenidos Resultados y discusión 101 en ganado bovino de otros países, como Bélgica, Brasil, Canadá, Egipto, la India, Noruega o Reino Unido, se hallaron porcentajes similares o ligeramente inferiores (Geurden et al., 2007; Langkjaer et al. 2007; Khan et al., 2010; Dixon et al., 2011; Amer et al., 2013; Silva et al., 2013; Smith et al., 2014). Sin embargo, en algunos países asiáticos y en EE.UU. se observaron valores más elevados que oscilaron entre el 20% y el 40% (Santín et al., 2004; Nguyen et al., 2007; Muhid et al., 2011; Murakoshi et al., 2012), lo que puede deberse a la influencia de ciertos factores como el tamaño y manejo del rebaño, número de granjas y animales muestreados, condiciones higiénicas de las instalaciones, edad de los animales y año o temporada en la que se realizó el muestreo (Sturdee et al., 2003; Hamnes et al., 2006; Imre y Dărăbuş, 2011; Feng y Xiao, 2011). Con respecto a la prevalencia por explotación, el 41,6% (62/149) de las granjas poseían al menos un animal positivo a Cryptosporidium spp. Con respecto a su localización, 48 de estas granjas estaban ubicadas en la provincia de Lugo y 14 en Pontevedra; no se hallaron explotaciones positivas en Ourense. El porcentaje de rebaños positivos fue superior en Lugo (43,2%) que en Pontevedra (37,8%), aunque estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (χ2= 0,186; p= 0,66). Nuestros resultados son similares a los hallados previamente por Valderrey (2017) en explotaciones gallegas donde se estudiaron terneros sin destetar que no presentaban signos de diarrea neonatal (38,5%). Asimismo, al estudiar la presencia del protozoo en bovinos mayores de 3 años, Castro-Hermida et al. (2007) observaron que un 48,3% de los rebaños poseían al menos un animal positivo a Cryptosporidium spp. Por el contrario, en otros estudios realizados también en Galicia, pero en granjas en las que había animales con diarrea neonatal, Díaz et al. (2010) y Soilán (2014) señalaron prevalencias de infección del 60-63%. No obstante, en todos los casos, los resultados de estos estudios ponen en evidencia que Cryptosporidium es un parásito con una amplia distribución en las granjas de ganado vacuno en Galicia. Varios estudios han demostrado que la presencia de este protozoo en las granjas está asociada a condiciones higiénicas deficientes y a un manejo incorrecto de los animales (de Graaf et al., 1999; Castro-Hermida et al., 2002; Díaz et 102 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ al., 2010c); en Galicia son todavía muy comunes las explotaciones de pequeño tamaño y manejo tradicional, menos profesionalizadas, donde la higiene y las instalaciones suelen ser peores y que favorecen la contaminación del medio con ooquistes y, por ello, la transmisión del parásito (Castro-Hermida et al., 2002), lo que explicaría los porcentajes tan elevados hallados en rebaños bovinos de esta Comunidad. Por el contrario, en otros países donde la producción de vacuno está más profesionalizada se ha apreciado la existencia de una relación positiva entre el tamaño de la explotación y el riesgo de infección, debida principalmente a la elevada densidad de animales (Garber et al., 1994; Quigley et al., 1994). Al analizar la influencia de la edad de los animales sobre la prevalencia de Cryptosporidium spp., se observó la existencia de una relación inversa; así, los terneros menores de 2 meses mostraron un porcentaje de infección significativamente (χ2= 22.004; p< 0,001) más elevado (28,6%) que los de más edad (Figura 4.2.). Las diferencias observadas entre los diferentes grupos de animales de más de dos meses de edad no fueron estadísticamente significativas en ningún caso (p> 0,05). Figura 4.2. Porcentaje de infección por Cryptosporidium spp. en ganado vacuno de Galicia al considerar la edad de los animales Resultados y discusión 103 Estos resultados coinciden con los obtenidos en la mayoría de investigaciones, en las que las prevalencias más elevadas se observaban en los animales más jóvenes, más receptivos, que suelen infectarse poco tiempo después de nacer (Castro-Hermida et al., 2006a; Santín et al., 2008; Khan et al., 2010; Muhid et al., 2011; dos Santos Toledo et al., 2017; Gong et al., 2017). La prevalencia observada en los terneros lactantes sin diarrea, un 28,6%, coincidió con la de otros estudios previos realizados en la misma área de estudio, donde se señalaron porcentajes del 22,7-27% (Castro- Hermida et al., 2002; Valderrey, 2017). Por el contrario, García Meniño (2013) halló que un 44% de los terneros sin diarrea en Galicia eliminaban ooquistes del protozoo. Sin embargo, todos estos resultados resultaron mucho más reducidos que los señalados en terneros con diarrea neonatal. Así, en Galicia, Díaz et al. (2010) y Soilán (2014) observaron que el 49,2% y el 53,4% de los animales estudiados, respectivamente, eran positivos mediante técnicas microscópicas; estos resultados coinciden con los señalados en terneros menores de 45 días explotados en Aragón (53,8%; Quílez et al., 1996), así como en el Centro (50%; De la Fuente et al., 1998) y en el Norte (57,8% Quílez et al., 2008) de España. En Galicia, García- Meniño (2013) encontró una prevalencia de infección mucho más elevada (76%), aunque estos resultados pueden deberse al reducido número de muestras analizadas. Todos estos datos confirman que Cryptosporidium spp. es un parásito muy prevalente tanto en terneros sanos como con diarrea, aunque las prevalencias de infección son siempre superiores en animales que presentan sintomatología clínica (García-Meniño et al., 2015). Los terneros de entre 2-12 meses y las novillas presentaron unas prevalencias de 17,8% y 13,5 %, respectivamente, que fueron significativamente más reducidas que las de los terneros lactantes (χ2=3,4077; p= 0,049 y χ2=8,796; p= 0,003, respectivamente). La mayoría de los estudios realizados en bovinos muestran porcentajes de infección por el protozoo que oscilan entre el 10 y el 20% en terneros destetados; así, Quílez et al (1996a) observaron que los animales de 1,5-4 meses de edad mostraban una prevalencia del 14%, mientras que sólo el 7,7% de los de 4-24 meses eran positivos. Del mismo modo, en 110 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ 10 20 30 40 50 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 GAGTAAGGAA CAACCTCCAA TCTCTAGTTG GCATAGTTTA TGGTTAAGAC C. spp HQ822146 -----..... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 60 70 80 90 100 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 TACGACGGTA TCTGATCGTC TTCGATCCCC TAACTTTCGT TCTTGATTAA C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 110 120 130 140 150 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 TGAAAACATC CTTGGCAAAT GCTTTCGCAC TAGTTTGTCT TTAACAAATC C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 160 170 180 190 200 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 TAAGAATTTC ACCTCTGACT GTTAAATACA AATGCCCCCA ACTGTCCCTA C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 210 220 230 240 250 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 TTAATCATTA TTTTTATCTT AGAACCAATA AAAAAGATAA AAATCTTTTA C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 260 270 280 290 300 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 TATTATTCCA TGCTGGAGTA TTCAAGGCAT ATGCCTGCTT TAAGCACTCT C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 310 320 330 340 350 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 AATTTTCTCA AAGTAAAATT TCATATACTA ATAATAA-TA TAGTAATATG C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......-.. .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... ....A..T.. .......... 360 370 380 390 400 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 AATTATGTTA ATATTATATA AATATTAAAA ATATTATATA TAAATTATTA C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 410 420 430 440 450 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 ACAGAAATCC AACTACGAGC TTTTTAACTG CAACAACTTT AATATACGCT C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... Figura 4.5. Alineamiento de secuencias de ADN de los productos de PCR del gen SSU rRNA, incluyendo un aislado representativo de C. suis-like identificado en ganado vacuno de Galicia y Cryptosporidium spp. (HQ822146) y C. suis (JQ936502). Los puntos indican nucleótidos idénticos a los del aislado B14/87 y los guiones señalan delecciones. Las mutaciones de nucleótidos con respecto a dicho aislado se indican en rojo. Resultados y discusión 111 460 470 480 490 500 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 ATTGGAGCTG GAATTACCGC GGCTGCTGGC ACCAGACTTG CCCTCCAATT C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 510 520 530 540 550 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 GATACTTGTA AAGGGGTTTA TACTTAACTC ATTCCAATTA CAAAACTAAA C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 560 570 580 590 600 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 AAAGTCCTGT ATTGTTATTT CTTGTCACTA CCTCCCTGTA TTAGGATTGG C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 610 620 630 640 650 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 GTAATTTGCG CGCCTGCTGC CTTCCTTAGA TGTGGTAGCC GTTTCTCAGG C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 660 670 680 690 700 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 CTCCCTCTCC GGAATCGAAC CCTAATTCCC CGTTACCCGT CATTGCCACG C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 710 720 730 740 750 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 GTAGGCCAAT ACCCTACCGT CTAAAGCTGA TAGGTCAGAA ACTTGAATGA C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 760 770 780 790 800 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. suis-like B14/87 TATGTCACAT TAAAAATGTG ATCCGTAAAG TTATTATGAA TCACCAAATT C. spp HQ822146 .......... .......... .......... .......... .......... C. suis JQ936502 .......... .......... .......... .......... .......... 810 820 ....|....| ....|....| .... C. suis-like B14/87 ATATTGGTTC TTTATCTAAT AAAT C. spp HQ822146 .........- ---------- ---- C. suis JQ936502 .......... .......... .... Figura 4.5. (Continuación) La mayoría de los aislados identificados como C. bovis fueron idénticos a la secuencia de referencia MF074602, obtenida en ganado vacuno de China (Cai et al., 2017). El resto mostraron una delección de una timina en la posición 718 (Figura 4.6.), mostrando una homología del 100% con el aislado KC618608 detectado por Rzezutza y Kaupke (2013) en bovinos de Polonia. 112 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ 10 20 30 40 50 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 TTACGGATCA CATTATGTGA CATATCATTC AAGTTTCTGA CCTATCAGCT C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... 60 70 80 90 100 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 TTAGACGGTA GGGTATTGGC CTACCGTGGC TATGACGGGT AACGGGGAAT C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... 110 120 130 140 150 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 TAGGGTTCGA TTCCGGAGAG GGAGCCTGAG AAACGGCTAC CACATCTAAG C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... 160 170 180 190 200 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 GAAGGCAGCA GGCGCGCAAA TTACCCAATC CTAATACAGG GAGGTAGTGA C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... 210 220 230 240 250 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 CAAGAAATAA CAATACAGAA CCTTACGGTT TTGTAATTGG AATGAGTTAA C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... 260 270 280 290 300 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 GTATAAACCC CTTAACAAGT ATCAATTGGA GGGCAAGTCT GGTGCCAGCA C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... 310 320 330 340 350 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 GCCGCGGTAA TTCCAGCTCC AATAGCGTAT ATTAAAGTTG TTGCAGTTAA C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... 360 370 380 390 400 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 AAAGCTCGTA GTTAATCTTC TGTTAATTTT TATATATAAT ATCACGATAT C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... 410 420 430 440 450 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 TTATATAATA TTAACATAAT TCATATTACT TTTTAGTATA TGAAACTTTA C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... Figura 4.6. Alineamiento de secuencias de ADN de los productos de PCR del gen SSU rRNA de aislados representativos de C. bovis y C. xiaoi identificados en ganado vacuno de Galicia. Los puntos indican nucleótidos idénticos a los del aislado B05/23 y los guiones señalan delecciones. Las mutaciones de nucleótidos con respecto a dicho aislado se indican en rojo. Resultados y discusión 113 460 470 480 490 500 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 CTTTGAGAAA ATTAGAGTGC TTAAAGCAGG CTATTGCCTT GAATACTCCA C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... 510 520 530 540 550 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 GCATGGAATA ATATTAAGGA TTTTTATTCT TCTTATTGGT TCTAGAATAA C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... 560 570 580 590 600 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 AAATGATGAT TAATAGGGAC AGTTGGGGGC ATTTGTATTT AACAGTCAGA C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......A.. .......... .......... .......... 610 620 630 640 650 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 GGTGAAATTC TTAGATTTGT TAAAGACAAA CTACTGCGAA AGCATTTGCC C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... 660 670 680 690 700 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| C. bovis_B05/23 AAGGATGTTT TCATTAATCA AGAACGAAAG TTAGGGGATC GAAGACGATC C. bovis B08/15 .......... .......... .......... .......... .......... C. xiaoi B14/110 .......... .......... .......... .......... .......... 710 720 730 740 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| . C. bovis_B05/23 AGATACCGTC GTAGTCTTAA CCATAAACTA TGCCAACTAG A C. bovis B08/15 .......... .......-.. .......... .......... . C. xiaoi B14/110 .......... ...------- ---------- ---------- - Figura 4.6. (Continuación) Por último, un único aislado (B14/110) mostró una transición (G x A en la posición 568; Figura 4.6.), resultando idéntico a varios aislados identificados como C. xiaoi, entre ellos el KY055405 (Kaupke et al., 2017). También coincidió al 100% con otras secuencias de C. bovis, pero curiosamente todas ellas procedían de pequeños rumiantes domésticos. C. bovis y C. xiaoi presentan una secuencia muy similar para el 18S; de hecho, hay estudios donde, al emplear únicamente este gen para el análisis genotípico, denominan a los aislados C. bovis/C. xiaoi (Mirhashemi et al., 2016). Por ello, en este caso, sería también interesante caracterizar este aislado para los genes de la actina y la Hsp70, donde las diferencias son más acusadas (Díaz et al., 2010b). Sin embargo este análisis no se pudo realizar porque todo el ADN de esta muestra se había utilizado anteriormente. 114 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Todos estos resultados nos indican que el ganado vacuno gallego está infectado por las cuatro especies principales de Cryptosporidium (C. parvum, C. bovis, C. ryanae y C. andersoni) que afectan a los bovinos, puesto que, a nivel mundial, son las especies predominantes en el ganado vacuno (Peng et al., 2003; Santín et al.et al., 2004; Langkjaer et al., 2006; Feng et al., 2007; Fayer et al., 2007; Xiao, 2010; Chalmers y Katzer, 2013). La mayor prevalencia observada para C. parvum en el presente estudio coincide con numerosas investigaciones realizadas en ganado vacuno de Europa, que la consideran la especie más frecuente en estos animales, afectando principalmente a los más jóvenes, aunque varios autores han confirmado que puede afectar a bovinos de todas las edades (Díaz et al., 2010a; Smith et al., 2010; Göhring et al., 2014). C. bovis fue muy prevalente en el ganado bovino gallego y, de hecho, estudios realizados en China, Australia, India y EE.UU., así como en varios países europeos, la han señalado como la especie predominante (Santín et al., 2004, 2008; Khan et al., 2010; Silverlas et al., 2010b; Wang et al., 2011b; Abeywardena et al., 2013b; Rieux et al., 2013; Zhang et al., 2015). Por el contrario, el porcentaje de animales positivos a C. andersoni fue muy reducido, aunque en algunos países de Asia y América, como China, Brasil y Canadá, es la especie predominante (Zhou et al., 2007; Liu et al., 2009; Sevá et al., 2010; Dixon et al., 2011; Paz e Silva et al., 2014). En el ganado vacuno también se han identificado, aunque de forma esporádica, otras especies como C. felis, C. hominis o C. suis, así como algunos genotipos, incluido el suis-like (Bornay-Llinares et al., 1999; Smith et al., 2005; Fayer et al., 2006; Langayan et al., 2006). Es interesante destacar que, en nuestro estudio, se han hallado un número considerable de aislados identificados como genotipo suislike que, aunque se ha encontrado en varias muestras procedentes de bovinos, en general se considera un hallazgo ocasional, limitado a un número escaso de aislados (Fayer et al., 2006; Feng et al., 2007 a; Khan et al., 2010; Xiao, 2010; Šlapeta, 2013); de hecho, su prevalencia fue muy superior a la de C. andersoni, una de las especies más frecuentes en animales adultos (Santín et al., 2004; Santín y Trout, 2008; Fayer et al., 2010a; Wang et al., 2011; Šlapeta, 2013; Resultados y discusión 115 Smith et al., 2014). Aunque C. suis se considera una especie específica del ganado porcino, se ha identificado en muestras de ganado vacuno de aptitud cárnica y lechera, así como en personas (Xiao et al., 2002 a; Fayer et al., 2006; Geurden et al., 2006; Leoni et al., 2006; Wang et al., 2013b). El genotipo suis-like también se ha hallado en ganado porcino (Langkjaer et al., 2007), así como en otros hospedadores, como roedores (Ng-Hublin et al., 2013), pero la mayoría de los aislados identificados proceden de bovinos (Khan et al., 2010; Ma et al., 2015; Tao et al., 2017). Este genotipo es muy similar a C. suis en el gen 18S, pero en otros locus, como la actina y el hsp70, las diferencias son significativas (Robinson et al., 2011). Por ello, es posible que el ganado porcino no sea el hospedador tipo; de hecho, se ha identificado en ganado vacuno de Australia, Dinamarca, la India y Reino Unido que no habían tenido contacto con el ganado porcino (Langkjaer et al., 2007; Khan et al., 2010; Robinson et al., 2011; Abeywardena et al., 2013a, b). Aunque en el pasado la cría de varias especies animales, compartiendo instalaciones, era algo muy común en Galicia, lo que favorecería la aparición de especies del protozoo en hospedadores poco adecuados, en la actualidad esto no es frecuente, pudiendo encontrarse únicamente en algunas granjas tradicionales, de pequeño tamaño. De hecho, las granjas positivas al genotipo suis-like eran explotaciones profesionales, donde los bovinos no compartían instalaciones con otras especies animales. Nuestros resultados son también importantes desde el punto de vista de Salud Pública, ya que C. parvum, que es la especie más frecuentemente identificada en el presente estudio, es la más importante para el ser humano desde el punto de vista zoonótico; de hecho, esta especie se ha considerado, junto a C. hominis, responsable de la mayoría de los brotes de criptosporidiosis humana (Xiao y Feng, 2008; Xiao, 2010). Aunque se desconoce su patogenicidad, el genotipo suis-like también se ha detectado de forma esporádica en muestras fecales procedentes de personas en Canadá y el Reino Unido (Ong et al., 2002; Robinson et al., 2011). Así mismo, C. andersoni se ha identificado esporádicamente en personas en Francia, India Malawi y el Reino Unido (Guyot et al., 2001; Leoni et al., 2006; Morse et al., 2007; Hussain et al., 2017), a pesar de que no se considera una especie 116 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ importante desde el punto de vista zoonótico (Santín et al., 2004; Šlapeta, 2013). En la mayoría de las granjas sólo se halló un único animal positivo a Cryptosporidium spp. (Tabla 4.1.). En quince explotaciones se detectaron varios animales que eliminaban ooquistes del parásito; en estos casos se analizó la posible presencia de diferentes especies del protozoo. En la mayoría de estas granjas sólo se identificó una única especie del protozoo en todos los bovinos positivos, predominando C. parvum (Tabla 4.1.). En el 40% de los rebaños con más de un animal positivo se identificaron 2 especies, siendo especialmente frecuente la presencia C. parvum y C. bovis (Tabla 4.1.). Por último, sólo en dos granjas (13,3%; 2/15) se hallaron 3 especies diferentes; en una se halló la combinación C. parvum+ C. bovis+ C. ryanae, mientras que en la otra se observó C. ryanae+ C. bovis+ C. andersoni (Tabla 4.1.). Tabla 4.1. Infecciones mixtas por Cryptosporidium spp. en explotaciones de ganado vacuno en Galicia Especies identificadas Porcentaje Granjas con 1 animal positivo 47/62 (75,8%) Granjas con al menos 2 animales positivos 15/62 (24,2%) 1 especie 7/15 (46,7%) C. parvum 6/7 (85,7%) C. bovis 1/7 (14,3%) 2 especies 6/15 (40,0%) C. bovis + C. parvum 3/6 (50,0%) C. bovis + C. ryanae 2/6 (33,3%) C. bovis + C. suis-like gt 1/6 (16,7%) 3 especies 2/15 (13,3%) C. bovis + C. ryanae + C. parvum 1/2 (50%) C. bovis + C. ryanae + C. andersoni 1/2 (50%) 4.1.3. Relación entre las especies de Cryptosporidium y la edad de los animales Para analizar la posible relación sobre la asociación de determinados grupos de edad con diferentes especies de Cryptosporidium, como se señaló en el correspondiente apartado de Resultados y discusión 117 Materiales y Métodos, se consideraron 4 grupos de edad: G1: terneros lactantes menores de 2 meses, G2: terneros destetados de entre 2-12 meses, G3: novillas entre 12-24 meses y G4: adultos mayores de 24 meses. En los terneros más jóvenes se hallaron tres especies: C. parvum, C. bovis y C. ryanae (Figura 4.7.), siendo la primera la especie dominante en este grupo de edad. En los animales de mayor edad predominan otras especies, siendo C. bovis la más frecuentemente identificada en todos los grupos de bovinos de más de dos meses (Fig. 4.7.). Figura 4.7. Porcentaje de identificación de Cryptosporidium spp. en ganado vacuno de Galicia al considerar la edad de los animales A medida que aumentó la edad de los animales, se encontró una mayor variedad de especies y genotipos del parásito; así, en los terneros de 2-12 meses se identificaron dos especies (C. bovis y C. ryanae) y un genotipo (C. genotipo suis-like), en las novillas se hallaron las anteriores y C. parvum, y finalmente, en los bovinos adultos se encontraron todas las especies y genotipos identificados en este estudio (Figura 4.7.). Es interesante señalar que la presencia de C. andersoni estuvo restringida a este último grupo. 118 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Cuando se analizó la variación de los valores de prevalencia de cada una de las especies de Cryptosporidium identificadas, se observó que el porcentaje de infección por C. parvum fue del 20,3% en los terneros de menos de 2 meses, disminuyendo a un 2,4% en los animales mayores de 24 meses; cabe destacar que esta especie no se halló en terneros de 2-12 meses. C. bovis y C. ryanae se identificaron en todos los rangos de edad, experimentando una variación en la prevalencia muy similar; así, en los terneros lactantes los porcentajes de infección (7,5% y 0,8%, respectivamente) fueron inferiores a los hallados en los terneros de 2-12 meses, donde se observaron los valores más elevados (8,9% y 5,6%, respectivamente). A partir de esa edad, la prevalencia disminuyó progresivamente (C. bovis= 7,1% y C. ryanae= 0,8% en las novillas), alcanzando los valores más reducidos en los bovinos de mayor edad (3,4% y 0,5%, respectivamente). La prevalencia de Cryptosporidium genotipo suis-like fue del 2,2% en los terneros de 2-12 meses, del 3,2% en los animales de 12-24 meses de edad y del 0,5% en los mayores de 24 meses. C. andersoni únicamente se identificó en el 1% de los animales mayores de 24 meses, estando ausente en el resto de grupos de edad. Los datos obtenidos en este estudio muestran que ciertas especies de Cryptosporidium presentan una asociación con determinados grupos de edad, siendo más similares al “patrón clásico” establecido en números estudios previos (Feng et al., 2007; Santín y Trout, 2008; Xiao, 2010), aunque con algunas diferencias significativas. Así, nuestros resultados coinciden con el “patrón clásico” en que los terneros menores de 2 meses son los más sensibles a la infección por C. parvum, que es la especie predominante en este grupo de edad, aunque también se han descrito infecciones por C. bovis, C. ryanae y C. andersoni con una menor prevalencia, siendo especialmente frecuentes en animales sin diarrea (Wang et al., 2011; Smith et al., 2014; Robertson et al., 2014). Asimismo, los datos obtenidos en los bovinos de más edad también coinciden, en general, con este “patrón clásico”, que señala que estos animales están parasitados por especies más adaptadas al ganado vacuno y menos patógenas que C. parvum, que puede aparecer con una menor prevalencia que en los terneros lactantes (Santín et al., 2008); el “patrón clásico” también señala a C. Resultados y discusión 119 bovis y C. ryanae como las especies predominantes en bovinos de 2- 12 meses, mientras que C. andersoni es la más común en ganado bovino adulto mayor de 1 año. En los animales sin destetar la especie dominante fue C. parvum, lo que concuerda con los resultados obtenidos previamente en terneros neonatos sin diarrea en Galicia (Castro-Hermida et al., 2002; García Meniño, 2013). Valderrey (2017) observó que un importante porcentaje de terneros lactantes sanos era positivo a Cryptosporidium spp., siendo C. parvum la especie más prevalente hasta la 4ª semana de vida. Además, esta especie también es la más frecuente en terneros con diarrea en España, especialmente durante las dos primeras semanas de vida, donde su prevalencia es más elevada (Castro- Hermida et al., 2002b; Quílez et al., 2008a; Díaz et al., 2010a; Soilán, 2014). Un análisis conjunto de todos estos resultados indica que los terneros lactantes asintomáticos, especialmente aquellos con edades comprendidas entre las 3 y 4 semanas de vida, poseen una gran importancia epidemiológica, pues actúan frecuentemente como reservorios de C. parvum, contaminando el medio con ooquistes y, por tanto, constituyendo una fuente de infección para otros terneros neonatos, más receptivos a la infección con esta especie y a presentar criptosporidiosis clínica (Huetink et al., 2001; Castro-Hermida et al., 2002; Fayer et al., 2006; Thompson et al., 2007; Xiao, 2010; Silverlas et al. 2009b, 2010b). La aparición de los procesos diarreicos en los rebaños estaría relacionado con unas condiciones higiénicas deficientes en las explotaciones, y facilitados por el manejo tradicional de los animales (Díaz et al., 2014). Además, C. parvum es importante desde el punto de vista de la Salud Pública, ya que esta especie junto con C. hominis, son responsables de la mayoría de los brotes de criptosporidiosis en humanos a través de productos alimenticios, el agua o el contacto directo con ellos (Santín et al., 2004; Thompson et al., 2007; Fayer, 2008; Xiao, 2010; Chalmers y Katzer, 2013). Por lo tanto, sí se tienen en cuenta los porcentajes de infección observados en este estudio, los terneros menores de 2 meses en Galicia poseen una gran importancia como portadores y diseminadores de especies del parásito con potencial zoonótico, por lo que las personas que tengan un contacto directo con estos animales deben tomar precauciones para 126 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ terneros menores de tres semanas con diarrea en Galicia, siendo el subtipo IIaA15G2R1 el más común y ampliamente distribuido en terneros, identificándose en 26 aislados (96,3%). Asimismo, Soilán (2014), en terneros con diarrea procedentes de esta misma zona geográfica, señaló la predominancia de los subtipos IIaA15G2R1 (76%) y IIaA16G3R1 (13%). La variabilidad genética de C. parvum observada en el presente estudio fue muy reducida, pues solo se identificaron 2 subtipos, similar a los 3 detectados por Díaz et al., (2010a) en terneros lactantes de Galicia. En el norte de España, Quílez et al. (2008a) hallaron un mayor número de subtipos en terneros (6), mientras que Soilán (2014) identificó 8, aunque esta mayor variabilidad puede obedecer a un mayor número de aislados identificados. Los subtipos IIaA15G2R1 y IIaA16G3R1 encontrados en el ganado vacuno en Galicia habían sido previamente detectados en humanos, lo que indica que tienen potencial zoonótico (Navarro-i- Martínez et al., 2003, 2010; Vergara y Quílez, 2004; Quílez et al., 2008b; Soilán, 2014; Abal-Fabeiro et al., 2015). El subtipo IIaA15G2R1 está considerado como uno de los principales subtipos responsables de criptosporidiosis humana (Glaberman et al., 2002; Chalmers et al., 2005; Sulaiman et al., 2005; Alves et al., 2006). Por el contrario, el subtipo IIaA16G3R1, que también posee potencial zoonótico, se ha detectado esporádicamente en casos humanos (Trotz- Willians et al., 2006; Zintl et al., 2009; Nazemalhosseini-Mojarad et al., 2011). 4.2. En ganado ovino y caprino 4.2.1. Prevalencia de infección Al analizar la prevalencia individual, se observó que el 5,9% de los pequeños rumiantes eran positivos a Cryptosporidium spp. Además, se apreció que los porcentajes de infección fueron similares en las ovejas (5,9%; 19/324) y en las cabras (6,0%; 14/234), por lo que no se constataron diferencias significativas entre ambas especies animales (χ2= 0,003; p= 0,953). Sin embargo, el porcentaje de Resultados y discusión 127 infección hallado en el ganado bovino fue significativamente superior al hallado tanto en el ovino (χ2= 22,389; p< 0,001) como en el caprino (χ2= 16,717; p< 0,001). En ambas especies de pequeños rumiantes se comprobó que la prevalencia individual era superior en los animales procedentes de explotaciones de Lugo (7,2% ov.; 7,6% cap.) que en los de A Coruña (3,9% ov.; 5,7% cap.); ninguna de las cabras explotadas en la provincia de Ourense resultaron positivas. Con Chicuadrado se constató que estas diferencias no eran significativas (p> 0,05). La similitud observada en la prevalencia de Cryptosporidium spp. en ovejas y cabras de Galicia contrasta con los de una revisión publicada por Robertson (2009), quien señaló un mayor porcentaje de infección en el ganado ovino (≈30%) que en el caprino (≈15%). Estos resultados concuerdan con los observados en ovejas (5,1-5,4%) y cabras (7,7%) adultas de Galicia (Castro-Hermida et al., 2007, 2011), así como con la mayoría de los estudios realizados en pequeños rumiantes sanos, donde el porcentaje de animales positivos no suele superar el 8% (Majewska et al., 2000; Ryan et al., 2005; Wang et al., 2010; Koinari et al., 2014; Wang et al., 2014; Mi et al., 2015; Kaupke et al., 2017). No obstante, se debe tener en cuenta que, en nuestro estudio, solo se recogió y procesó una única muestra fecal por animal, por lo que el porcentaje de infección observado podría estar subestimado, ya que se ha demostrado que la mayoría de los pequeños rumiantes adultos, y que no presentan diarrea, son portadores asintomáticos que eliminan un reducido número de ooquistes de forma intermitente (Karanis et al., 2007; Santín et al., 2007); además, el muestreo no se realizó durante la época de paridera, donde el incremento de la excreción de ooquistes en las hembras podría facilitar la detección de los animales positivos (Paraud et al., 2014; Wang et al., 2014). Sin embargo, también se debe señalar que, las muestras sólo se procesaron mediante técnicas moleculares que, según varios autores, son las que presentan los mejores valores de rendimiento diagnóstico, siendo más sensibles que las técnicas microscópicas (Ryan et al., 2005; Santín et al., 2007; Wang et al., 2014). 128 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Por el contrario, la prevalencia de infección hallada en nuestro estudio resultó inferior a la observada (40%) en pequeños rumiantes por otros autores (Majewska et al., 2000; Ryan et al., 2005; Pritchard et al., 2008; Paoletti et al., 2009; Sari et al., 2009; Yang et al., 2009). En este sentido, las variaciones detectadas entre los resultados obtenidos en los diferentes estudios pueden deberse a diferencias geográficas y estacionales, así como a la presencia de varios factores intrínsecos y extrínsecos de la población estudiada, entre los que destacan el manejo de los animales, la técnica de diagnóstico empleada, el número de muestras recogidas por animal, la edad de los animales o la presencia de sintomatología clínica (Geurden et al., 2008; Mahfouz et al., 2014). La prevalencia por explotaciones fue prácticamente idéntica en las granjas de ovejas (47,4%; 9/19) y en las de cabras (50,0%; 8/16), por lo que las diferencias no fueron significativas (χ2= 0,024; p= 0,877). Al considerar la localización de los rebaños de ovino se observó que el 33,3% (3/9) de los localizados en A Coruña y el 70% (7/10) de los de Lugo fueron positivos; de igual modo, se apreció que el 80,0% (4/5) las granjas de ganado caprino de A Coruña y el 44,4% (4/9) de las de Lugo mostraron al menos un animal positivo. Sin embargo, en ningún caso estas diferencias fueron significativas (p> 0,05). Estos resultados demuestran que, aunque el porcentaje de pequeños rumiantes destetados y adultos que eliminan ooquistes de Cryptosporidium spp. es bajo, sin embargo, este parásito está ampliamente distribuido en los rebaños de ovino y de caprino de Galicia, coincidiendo con los resultados señalados previamente en la misma zona de estudio por Castro-Hermida et al. (2007), quienes observaron que en el 34,2% de las explotaciones de ovejas y en el 30,0% de las de cabras había por lo menos un animal que eliminaba ooquistes de este protozoo. Así mismo, en explotaciones gallegas de pequeños rumiantes en los que había animales con diarrea neonatal, Díaz et al. (2015) observaron que el 54,1% de las granjas de ovino y el 65,2% de las de caprino había animales positivos. Los resultados obtenidos en el presente estudio son de gran interés debido a que, aunque en las explotaciones no se habían observado brotes de diarrea neonatal en el último año, la distribución Resultados y discusión 129 de Cryptosporidium spp. en las granjas gallegas de pequeños rumiantes es amplia; además, la existencia de portadores asintomáticos unido a la presencia de factores de riesgo (mala higiene, épocas de paridera, instalaciones, manejo inadecuado, hacinamiento, etc.), muy frecuentes en las granjas de pequeños rumiantes de Galicia, pueden favorecer la aparición de brotes de diarrea neonatal ocasionados por este parásito y ocasionar importantes pérdidas económicas (de Graaf et al., 1999; Soilán, 2014). Al considerar la edad de los animales se observó que la prevalencia individual por Cryptosporidium spp. fue muy similar en los corderos destetados y en las ovejas adultas, mientras que, en ganado caprino, el porcentaje de adultos que eliminaron ooquistes del parásito fue ligeramente superior al de los cabritos destetados (Figura 4.9); no obstante, estas diferencias no fueron significativas en ninguna de las dos especies (p> 0,05). Figura 4.9. Porcentaje de infección por Cryptosporidium spp. en pequeños rumiantes al considerar la edad de los animales Estos resultados contrastan con los obtenidos en varias investigaciones que señalan que la prevalencia de infección por Cryptosporidium spp. presenta una relación inversa con la edad de los 130 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ animales, de modo que los animales de más edad muestran los porcentajes de infección más reducidos, aunque en algunos casos estas diferencias no fueron significativas (Majewska et al., 2000; Noordeen et al., 2001; Wang et al., 2009, 2014; Castro-Hermida et al., 2011; Ye et al., 2013; Mi et al., 2014; Peng et al., 2016). La menor prevalencia de infección en los animales de mayor edad podría estar relacionada con una mejor condición corporal de estos o con su mayor respuesta inmunitaria, ya que las reinfecciones repetidas con el protozoo favorecen el desarrollo de una respuesta inmunitaria protectora frente al parásito (Wang et al., 2014). Debido a que los trabajos sobre las infecciones por Cryptosporidium spp. en pequeños rumiantes son escasos y emplean metodologías muy diferentes, las discrepancias observadas entre nuestros datos y los de otras investigaciones pueden obedecer a diferentes factores relacionados con el diseño del estudio que afecten a la exactitud de los resultados, entre los que destacan:  a) el número de animales muestreados; cuando los casos son reducidos impiden estimar la prevalencia con una precisión aceptable (Majewska et al., 2000; Nordeeen et al., 2001). Por ejemplo, Castro-Hermida et al. (2011), en Galicia, analizaron muestras de 136 ovinos, así como de otras especies animales, si bien el objetivo del trabajo no consistió en estimar la prevalencia en diferentes grupos de edad.  b) el número de grupos de edad estudiados no coincide exactamente con el de otros trabajos, aunque, en general, en la mayoría los animales se clasifican según su edad en lactantes, destetados y adultos: No obstante, hay autores que, dentro de los animales de mayor edad, separan los de 12 a 24 meses y los de más de 24 meses (Mi et al., 2014) y dentro de los adultos se separan las hembras durante el periparto (Wang et al., 2014). Otros autores, como Peng et al. (2016) consideran grupos de 0- 2 meses, 3-6 meses, 7-12 meses y más de 12 meses; sin embargo, esta división puede derivar en la aparición de grupos con un número muy reducido de animales, lo que, como se comentó anteriormente, puede conllevar una menor precisión Resultados y discusión 131 en los resultados obtenidos. En este sentido, Mi et al. (2014) analizaron muestras de 604 animales, pero únicamente 16 tenían más de 12 meses de edad.  c) también deben considerarse el número de granjas muestreadas, pues si recogen muestras en un pequeño número de ellas, la presencia de una explotación con una elevada prevalencia intra-rebaño puede alterar de forma significativa los resultados obtenidos, sobre todo si en cada granja el número de animales estudiados por grupo de edad no es similar. Así, en las investigaciones más completas realizadas hasta el momento en las que se analiza la influencia de la edad sobre la prevalencia de Cryptosporidium spp., el número de granjas es muy reducido e inferior a 7 (Ye et al., 2013; Wang et al., 2010, 2014), y no suelen superar las 18 (Mi et al., 2014; Peng et al., 2016). Por ejemplo, en el estudio realizado por Wang et al. (2014) se analizaron 1.265 cabras de 7 explotaciones en China, y el número de muestras por rebaño osciló entre 24 y 790.  d) el método de identificación de Cryptosporidium spp. también es de gran interés, pues el empleo de técnicas con reducidos valores de rendimiento diagnóstico puede alterar de forma significativa los resultados. En este sentido, debido a que los adultos eliminan, por lo general, un menor número de ooquistes por gramo de heces que los jóvenes (Karanis et al., 2007), los estudios que utilizan métodos microscópicos y, por tanto, menos sensibles que los moleculares (Ryan et al., 2005; Santín et al., 2007; Wang et al., 2014), subestiman la prevalencia de infección en los animales de mayor edad ya que detectan un menor número de animales positivos y, consecuentemente, el número de falsos negativos se incrementará con la edad de los animales. 132 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ 4.2.2. Análisis genotípico: especies de Cryptosporidium Debido a que la mayoría de las investigaciones realizadas en granjas de ovino y caprino son estudios de brotes de diarrea neonatal, se ha comprobado que C. parvum es la principal especie de Cryptosporidium implicada en estos brotes (Mueller-Doblies et al., 2008; Quílez et al., 2008b; Pritchard et al., 2008; Díaz et al., 2010, 2015; Imre et al., 2013). En corderos y cabritos destetados y en animales adultos que no muestran sintomatología clínica, los estudios sobre las especies de Cryptosporidium son limitados, ya que en la mayoría no se realiza la caracterización molecular de los aislados, por lo que no se identifican las especies y genotipos, ni su potencial zoonótico, al tiempo que es escasa la información sobre algunos factores epidemiológicos importantes, como la edad de los animales y la consistencia de las heces (Robertson, 2009). El análisis del patrón de bandas obtenido, tras la digestión de las muestras positivas a la PCR de la 18S con las endonucleasas SspI, VspI y MboII, permitió identificar 3 especies de Cryptosporidium (C. parvum, C. ubiquitum y C. xiaoi) tanto en los rebaños de ovino como en los de caprino; estas especies ya se habían identificado previamente en corderos y cabritos lactantes con diarrea de la misma área de estudio (Díaz et al., 2010, 2015). Al considerar ambas especies de pequeños rumiantes en conjunto, y como se aprecia en la Figura 4.10., C. parvum fue la especie más frecuentemente identificada (16/33), seguida por C. xiaoi (8/33) y C. ubiquitum (6/33). Tres muestras (9,1%), dos procedentes de ovejas y una de cabra, fueron positivas a PCR, pero las bandas fueron muy débiles, de manera que el producto obtenido no fue suficiente para realizar un análisis RFLP. Para confirmar los resultados obtenidos en la PCR-RFLP, tanto para las cabras como para las ovejas, se secuenció un número representativo de aislados de cada una de las especies de Cryptosporidium cuyo patrón de restricción fue diferente al de C. parvum y se compararon con las incluidas en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information); así, se observaron tres secuencias diferentes (Figura 4.11.). Resultados y discusión 133 Figura 4.10. Porcentaje de identificación de cada una de las especies de Cryptosporidium identificadas en pequeños rumiantes de granjas gallegas Todos los aislados identificados como C. ubiquitum, procedentes tanto de ovino como de caprino, fueron idénticos a la del genotipo 1 (EF362479), detectado por Santín et al. (2007) en ovinos de Maryland (EE.UU.), y hallado previamente en corderos con diarrea en Galicia (Soilán, 2014; Díaz et al., 2015). En el caso de C. xiaoi, se identificaron dos secuencias diferentes (Figura 4.11.); cabe destacar que, los aislados procedentes de ganado caprino mostraron una homología del 100% con la secuencia de referencia KY055376, obtenida en ovejas de Polonia (Kaupke et al., 2017), mientras que las de ovino fueron idénticas a la KY055407, obtenidas en caprino por los mismos autores. Entre ambas secuencias sólo se hallaron dos mutaciones: una transición de un nucleótido (C por T) en la posición 399 y una transversión (T por A) en la posición 406 (Figura 4.11.). Estos resultados coinciden con la mayoría de los escasos estudios moleculares realizados previamente en ganado ovino y caprino, y permiten confirmar que C. parvum, C. ubiquitum y C. xiaoi son las especies de Cryptosporidium predominantes en los pequeños rumiantes a nivel mundial (Chalmers et al., 2002; Ryan et al., 2005; Santín et al., 2007; Mueller-Doblies et al., 2008; Yang et al., 2009; Rieux et al., 2013; Tzanidakis et al., 2014; Wang et al., 2010, 2014; 134 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Mi et al., 2015). De hecho, el resto de especies del protozoo identificadas en estos animales son hallazgos ocasionales y, a excepción de C. hominis en ganado ovino, no superan la veintena de aislados. 10 20 30 40 50 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 ATAACTTTAC GGATCACATT ---ATGTGAC ATATCATTCA AGTTTCTGAC 18S_L17/29 .......... .......... ---....... .......... .......... 18S_L12/14 .......... .......... TAT....... .......... .......... 60 70 80 90 100 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 CTATCAGCTT TAGACGGTAG GGTATTGGCC TACCGTGGCT ATGACGGGTA 18S_L17/29 .......... .......... .......... .......... .......... 18S_L12/14 .......... .......... .......... .........A .......... 110 120 130 140 150 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 ACGGGGAATT AGGGTTCGAT TCCGGAGAGG GAGCCTGAGA AACGGCTACC 18S_L17/29 .......... .......... .......... .......... .......... 18S_L12/14 .......... .......... .......... .......... .......... 160 170 180 190 200 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 ACATCTAAGG AAGGCAGCAG GCGCGCAAAT TACCCAATCC TAATACAGGG 18S_L17/29 .......... .......... .......... .......... .......... 18S_L12/14 .......... .......... .......... .......... .......... 210 220 230 240 250 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 AGGTAGTGAC AAGAAATAAC AATACAGAAC CTTA--CGGT TTTGTAATTG 18S_L17/29 .......... .......... .......... ....--.... .......... 18S_L12/14 .......... .......... .......G.. T...AATA.. .......... 260 270 280 290 300 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 GAATGAGTTA AGTATAAACC CCTTAACAAG TATCAATTGG AGGGCAAGTC 18S_L17/29 .......... .......... .......... .......... .......... 18S_L12/14 .......... .......... ....T..... .......... .......... 310 320 330 340 350 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 TGGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATTCCAGCTC CAATAGCGTA TATTAAAGTT 18S_L17/29 .......... .......... .......... .......... .......... 18S_L12/14 .......... .......... .......... .......... .......... Figura 4.11. Alineamiento de secuencias de ADN de los productos de PCR del gen SSU rRNA de diversos aislados representativos de C. ubiquitum (L12/14, genotipo 1) y C. xiaoi (L11/21, C. xiaoi origen ovino; L17/29, C. xiaoi origen caprino) identificados en pequeños rumiantes. Los puntos indican nucleótidos idénticos a los del aislado L291 y los guiones señalan delecciones. Las mutaciones de nucleótidos con respecto a dicho aislado se indican en rojo. Resultados y discusión 135 360 370 380 390 400 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 GTTGCAGTTA AAAAGCTCGT AGTTAATCTT CTGTTAATTTTTATATATA 18S_L17/29 .......... .......... .......... .........- ........C. 18S_L12/14 .......... .......... ....GGAT.. ........AA .......... 410 420 430 440 450 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 ATATCTCG-- -ATATTTATA TAATATTAAC ATAATTCATA TTACT----- 18S_L17/29 .....A..-- -......... .......... .......... .....----- 18S_L12/14 ....T.TATT A......... ..G....... .......... .....ATATT 460 470 480 490 500 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 TTTTAGTATA TGAAACTTTA CTTTGAGAAA ATTAGAGTGC TTAAAGCAGG 18S_L17/29 .......... .......... .......... .......... .......... 18S_L12/14 ..A....... .....T.... .......... .......... .......... 510 520 530 540 550 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 CTATTGCCTT GAATACTCCA GCATGGAATA ATATTAAGGA TTTTTATTCT 18S_L17/29 .......... .......... .......... .......... .......... 18S_L12/14 .AT.A..... .......... .......... ....A..A.. .......CT. 560 570 580 590 600 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 TCTTATTGGT TCTAGAATAA AAATGATGAT TAATAGGAAC AGTTGGGGGC 18S_L17/29 .......... .......... .......... .......... .......... 18S_L12/14 .T........ ....AG.... ....A..... .......G.. .......... 610 620 630 640 650 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 ATTTGTATTT AACAGTCAGA GGTGAAATTC TTAGATTTGT TAAAGACAAA 18S_L17/29 .......... .......... .......... .......... .......... 18S_L12/14 .......... .......... .......... .......... .......... 660 670 680 690 700 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 18S_L11/21 CTACTGCGAA AGCATTTGCC AAGGATGTTT TCATTAATCA AGAACGAAAG 18S_L17/29 .......... .......... .......... .......... .......... 18S_L12/14 ...G...... .......... .......... .......... .......... 710 720 730 740 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|. 18S_L11/21 TTAGGGGATC GAAGACGATC AGATACCGTC GTAGTCTTAA CCATAA 18S_L17/29 .......... .......... .......... .......... ...... 18S_L12/14 .......... .......... .......... .......-.. ...... Figura 4.11. (Continuación) Estos resultados son también importantes desde el punto de vista de la Salud Pública, ya que dos (C. parvum y C. ubiquitum) de las tres especies identificadas en ambos rumiantes domésticos poseen potencial zoonótico, especialmente C. parvum, que junto con C. hominis es la especie más frecuentemente implicada en brotes de criptosporidiosis humana (Xiao, 2010). C. ubiquitum se ha identificado en un número suficiente de personas, tanto 238 ESTHER NAVARRO GONZÁLEZ Quílez, J.; Ares-Mazas, E.; Sánchez-Acedo, C.; del Cacho, E.; Clavel, A.; Causape, A. C., 1996c. Comparison of oocyst shedding and the serum immune response to Cryptosporidium parvum in cattle and pigs. Parasitology Research, 82 (6): 529–534. Quílez, J.; Vergara-Castiblanco, C.; Sánchez-Acedo. C.; del Cacho, E.; Lopez-Bernad, F., 2001. Prevalencia de Cryptosporidium parvum en ganado caprino en la provincia de Zaragoza. Estudio preliminar. Acta Parasitológica Portuguesa, 8: 167. 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