Estudio clínico y molecular de cinco familias con resistencia a la acción de las hormonas tiroideas

1 Estudio clínico y molecular de cinco familias con resistencia a la acción de las hormonas tiroideas. Joaquin Lado Abeal 1,2, Ramón Albero Gamboa3, David Araujo Vilar1,4, Olga Barca Mayo1, Ignacio Bernabeú Moron4, María Teresa Calvo5, Isabel Castro Piedras1,2, Jesús Martin Calamata6, Fernando Palos Paz1, Roberto Peinó4, Diego Peteiro1,3, Berta Victoria1. 1UETeM. Departamento de Medicina. Facultad de Medicina. Universidad de Santiago de Compostela. 2División de Endocrinología. Departamento de Medicina. Texas Tech University Health Sciences Center-School of Medicine. Lubbock, Texas. USA. 3Servicio de Endocrinología y Nutrición, Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza. 4Servicio de Endocrinología y Nutrición. Complejo Hospitalario de Santiago de Compostela. 5 6Servicio de Pediatría. Hospital O. Polanco. Teruel. 2 Resumen Fundamento y objetivo El síndrome de resistencia a la acción de las hormonas tiroideas (SRHT), causado mayoritariamente por mutaciones en el gen receptor beta de las hormonas tiroideas, THRB, se caracteriza por la elevación en los niveles séricos de hormonas tiroideas (HT) con niveles elevados o normales de TSH. Se estudian cinco familias españolas con fenotipo de SRHT. Material y Métodos Secuenciación de THRB. Estudio del efecto de las mutaciones sobre la respuesta a T3 y de su efecto dominante negativo, mediante transfección celular y ensayos de movilidad electroforética (EMSA). Obtención de cultivos de fibroblastos de pacientes con y sin mutaciones en THRB para investigar la respuesta a T3 de los genes regulator of calcineurin 2 (=ZAKI4) y Kruppel-like factor 9 (=BTEB) que son regulados positivamente por las HT. Resultados En tres casos se detectaron mutaciones en THRB: R243Q, R320C y R429Q, todas causando una disminución en la respuesta a T3. R243Q y R320C presentaron un potente efecto dominante negativo. La respuesta a T3 de ZAKI4 y BTEB fue diferente entre los sujetos sin mutación en THRB; uno se comportó de forma similar al portador de R230C y en el otro la expresión de los dos genes fue superior a la observada en controles normales. Conclusiones 3 En tres de las cinco familias estudiadas se detectaron mutaciones en THRB, responsables del cuadro clínico, dando lugar una menor respuesta a T3 y ejerciendo un efecto dominante negativo. Los dos casos de SRHT sin mutacion en THRB obedecen a causas distintas, todavía desconocidas. Palabras Clave: Síndrome de resistencia a la acción de las hormonas tiroideas, receptor beta de las hormonas tiroideas, gen THRB, mutación. 4 Introducción El síndrome de resistencia a la acción de las hormonas tiroideas (SRHT) se caracteriza por una disminución en la sensibilidad tisular a la acción de las hormona tiroideas (HT) (1,2). Los pacientes con SRHT presentan una elevación en los niveles séricos de tiroxina (T4) y/o triyodotironina (T3), y niveles séricos de hormona estimulante del tiroides (TSH) inapropiadamente normales o elevados. Las manifestaciones clínicas son variables, pudiendo coexistir en un mismo sujeto datos de hipotiroidismo e hipertiroidismo, reflejo de que la resistencia es variable entre los diferentes tejidos (1-3). La incidencia de SRHT se estima en 1 de 40000 nacidos vivos (4). La mayoría obedece a mutaciones autosómicas dominantes en el gen receptor beta de las hormonas tiroideas, THRB (1,4), aunque en el 15% las causas se desconocen (1,4). En los últimos 10 años se han identificado dos entidades de sensibilidad disminuida a la acción de las HT: una relacionada con mutaciones en el transportador de HT conocido como transportador 8 de monocarboxilatos (MCT8) (5,6), y otra causada por mutaciones en el gen selenocysteine insertion sequence-binding protein2 (SECISBP2 o SBP2) (7). La mutaciones en el receptor beta (TRb) responsables de SRHT, afectan a la parte del receptor en donde se une la T3, y se asocian a una menor afinidad del receptor por la hormona (8,9); con menor frecuencia, causan una interacción defectuosa con co-factores implicados en la acción de las HT (10). Para ejercer su efecto, los TRs se unen entre ellos (homodímeros) o con otros receptores nucleares (hetorodímeros), principalmente con los receptores X del acido retinoico (RXRs); estos dímeros se unen a secuencias específicas del ADN conocidas como elementos de respuesta a las hormonas tiroideas (TRE). En la ausencia de T3, los dímeros de TR se asocian a co-represores silenciando la transcripción 5 de genes positivamente regulados por la T3. La unión TR-T3 da lugar a la disociación de los co-represores y al reclutamiento de co-activadores al dímero, estimulando la transcripción genica (10). Los TRbs mutados interfieren con las funciones fisiológicas del TRb wildtype, fenómeno que se conoce como efecto dominante negativo (11), y que implica la ocupación de los TREs por el TRb mutado con una o varias de las siguientes propiedades: (a) disminución en la afinidad o incapacidad total para unirse a la T3, (b) mayor afinidad por co-represores (12-14), (d) disminución en la capacidad para reclutar co-activadores (15). La ocupación de los TREs implica que los TRb mutados conservan su capacidad de unión al ADN y la capacidad de dimerizar como homoo heterodímeros (4); hasta la fecha no se han descrito pacientes con SRHT portadores de mutaciones que afecten al lugar de unión al ADN (4). En el presente trabajo se estudian cinco casos con fenotipo clínico y bioquímico sugestivo de SRHT. En tres sujetos se encontraron mutaciones y en dos no se detectaron mutaciones en la región codificante de THRB. Se presentan evidencias in vitro de las consecuencias funcionales de los TRb mutados; en concreto, se estudiaron: 1) la capacidad de respuesta de los mutantes a T3 y 2) el efecto dominante negativo de los mutantes sobre el TRb wildtype, investigado de dos formas: incubando un gen reportero (gen que se activa por acción del TRb en presencia de T3) con el TRb wildtype y concentraciones crecientes de los TRb mutados y cuantificando mediante un ensayo de movilidad electroforética (EMSA), la disociación de una secuencia específica de ADN del TRb wiltype y TRb mutados en presencia de dosis crecientes de T3. Por último, utilizando cultivos de fibroblastos procedentes de los pacientes se estudiaron los cambios 6 de expresión de los genes regulator of calcineurin 2 (RACN2, ZAKI4) y Kruppel-like factor 9 (KLF9, BTEB), regulados positivamene por T3 en sujetos normales (16). Material y Métodos. Sujetos. Caso 1. El propositus, un varón de 28 años, fué remitido al Hospital Universitario Miguel Servet para estudio de bocio. El paciente no refería síntomas sugestivos de hipertiroidismo. Su talla era de 181 cm y su peso de 92,5 kg; presentaba un bocio nodular, grado 2, sin otros hallazgos físicos de interés. La TSH sérica era 2,57 µU/ml (normal 0,41-4,94 µU/ml), T4 libre (FT4) 2,4 ng/dl (normal 0,85-1,69 ng/dL) y T3 libre (FT3) 6,88 pg/ml (normal 2,53-4,29 pg/ml). Los valores de TSH séricos en respuesta a TRH (100 µg en bolus) fueron: 0 min. 2,88 µU/ml, 30 min. 18,56 µU/ml, 60 min. 12,11 µU/ml. El árbol genealógico se representa en la figura 1. La madre del propositus, el hijo varón del propositus y dos hermanos de éste (un varón y una mujer) presentaban fenotipo bioquímico sugestivo de resistencia a la acción de las hormonas tiroideas. Caso 2. El caso índice, una paciente de 58 años, fué remitida al Complejo Hospitalario Universitario de Santiago (CHUS) por hipertiroidismo (TSH 5,09 µU/ml, FT4 2,49 ng/dl y FT3 5,81 pg/ml). Como antecedente personal presentaba infertilidad de causa desconocida. El árbol genealógico se resume en la figura 1. La paciente refería ser “muy nerviosa de siempre”, “tener poca memoria para el estudio”, “no recordar bien las cosas”, e hiperactividad en la infancia. No refería palpitaciones, temblores ni sudoración. Su talla era 159 cm y su peso 70 kg. No presentaba bocio y el resto de la exploración física fue normal. La ecografía y gammagrafía tiroideas no mostraron anomalías. 7 Caso 3. El caso index, una paciente de 34 años, fue remitida al CHUS para estudio de niveles séricos elevados de hormonas tiroideas. La paciente presentaba desde la infancia ansiedad, hiperactividad, palpitaciones, incapacidad para concentrarse y desinterés por lo estudios, abandonando la escuela a los 16 años. Sus ciclos menstruales eran normales y tuvo un embarazo y parto normales. En la figura 1 se representa el arbol genealógico. Su talla era 160 cm y su peso 70 kg. Presentaba bocio difuso, pequeño, siendo el resto de la exploración física normal. La TSH sérica era 3,58 µU/ml, FT4 2,01 ng/dl y FT3 5,54 pg/ml. La ecografía y gammagrafía tiroideas no mostraron anomalías. Caso 4. El caso index, una mujer de 51 años, fue remitida por su psiquiatra al CHUS para estudio de hipertiroidismo. Padecía trastorno bipolar tratado con litio. La paciente refería palpitaciones que controlaba con atenolol. Su talla era 163 cms y su peso 66 kg; presentaba un bocio pequeño, difuso y sin nódulos. Su TSH sérica era 4,45 µU/ml, FT4 1,89 ng/dl y FT3 5,23 pg/ml Los anticuerpos antiperoxidasa y antitiroglobulina fueron negativos. Una gammagrafía tiroidea mostró una captación aumentada. Un test de TRH (100 µg en bolus) mostró los siguientes valores de TSH: 0 min. 4,33 mUI/L, 30 min. 5,49 mUI/L y 60 min. 5,40 mUI/L. La RNM de hipófisis no mostró anomalías detectándose a nivel de la protuberancia del tronco encefálico una masa de 1 cm con características de lipoma. Una densitometria ósea fue normal. Case 5. El propositus, un niño de 6 años de origen eucatoriano, fue remitido al Hospital General de Teruel tras detectarse una elevación en los niveles séricos hormonas tiroideas. La historia previa del niño y su familia carecía de interés. Su talla era 107,8 cm (percentil 3 para niños españoles, 10-25 para ecuatorianos) y su peso 20,5 kg (percentil 20-50 para niños españoles, 50 para ecuatorianos) (17). El examen físico fue normal; la 8 edad ósea concordaba con su edad cronológica. La TSH sérica era 2,51 mIU/L, FT4, 2,2 ng/dL y FT3, 6,3 pg/mL. Los anticuerpos antiperoxidasa y antitiroglobulina fueron negativos. La ecografía tiroidea y RNM hipotálamo-hipofisarias no mostraron anomalías. El test de TRH (100 µg en bolus) mostró los siguientes valores de TSH sérica: 0 min, 3,27 mUI/L, 30 min, 22,27 mUI/L y a 60 min, 17,29 mUI/L. Análisis Genético. El presencia de mutaciones en el gen THRB se realizó sobre ADN procedente de células sanguíneas (RealPure Extracción Genómico, Durviz SL, España). En los casos 4 y 5 se utilizaron también muestras de cDNA procedentes de fibroblastos de los pacientes. Los exones 3 a 10 del gen THRB se amplificaron mediante PCR (condiciones y secuencia de oligonucleótidos disponibles a petición), y los productos purificados se secuenciaron en un ABI PRISM 3100 utilizando dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystem, Madrid). Estudios funcionales in vitro. Construcción de los plásmidos. Los vectores de expresión con los mutantes THRB R243Q y R320C se generaron mediante mutagénesis dirigida (Quickchange II Site Direct Mutagnesis kit, Stratagene, Alemania) sobre un vector THRB wildtype clonado en pcDNA1 (cedido por S Refetoff, University of Chicago Medical Center, Illinois, USA) (la secuencia de nucleótidos de mutagenesis y condiciones de PCR están disponibles a petición). El vector de expresión con el mutante R429Q se generó sobre el vector pcDNA1-THRB wildtype, sustituyendo un fragmento de 301 bp de éste por un fragmento similar procedente del paciente y que 9 contiene la mutación, como se describió previamente (18). La correcta clonación de los plásmidos se comprobó mediante secuenciación directa de todo el inserto. Transfección de plásmidos. Se emplearon células HepG2 (ECACC, UK) cultivadas en un medio compuesto de DMEM (SIGMA, España), suero fetal bovino (FCS) (10%) y gentamicina (50 µg/ml), a una temperatura de 37C, humedad del 100% y CO2 al 10%. Las células se en placas de cultivos de 12 pocillos hasta alcanzar una confluencia del 70%, retiróndose entonces el medio, lavóndose las células con buffer fosfato salino (PBS) y, por último, añadiendo 1 ml de la solución de transfección compuesta de DMEM, FCS (10%) libre de hormona tiroidea, lipofectamina (Invitrogen, España), los vectores de expresión THRB y el vector reportero Palx3-Luc (cedido por el Prof S Refetoff, University of Chicago Medical Center) que expresa el gen de la luciferasa (Luc) bajo control de un promotor que tiene tres copias de un TRE palindrómico (AGGTCATGACCT) (18). La concentración de los vectores de expresión THRB fue 5 ng por pocillo y del gen reportero 1 µg por pocillo. La cantidad total de ADN transfectado se ajustó a 1.5 µg por pocillo con un plásmido pcDNA1 vacio. Transcurridas 24 horas, las células se lavaron con PBS y se incubaron en un medio compuesto de DMEM, FCS (10%) libre de hormona tiroidea y gentamicina (50 µg/ml) durante 24 horas, añadiendo a continuación T3 a la dosis de 10-9M, 10-8M y 107M, incubando las células durante otras 24 horas. Finalizada la incubación, las células se lisaron y se procedió a medir la actividad luciferasa mediante el Luciferase Assay System (Promega, Madrid) en un luminómetro (Junior LB 9509, Berthold, Alemania). Las transfecciones se realizaron en triplicados y cada experimento se realizó al menos en 2 ocasiones. 16 embargo, el cuadro de SRTH no se debe a haploinsuficiencia ya que individuos con delección de uno de los alelos TRb wildtype no presentan SRTH (4), sino que obecede a que el TRb mutante interfiere con la función del receptor wildtype, fenómeno conocido como dominante negativo (4). La mutación R243Q (caso 1) afecta al residuo Arginina243, situado en una zona rica en dinucleótidos CpG en la parte bisagra del receptor (22), y provoca el cambio de Arginina por Glutamina. Los estudios de transfección mostraron que el mutante 243Q ejerce un importante efecto dominante negativo sobre el TRb wildtype y, mediante EMSA, se demostró que incluso con dosis muy elevadas de T3, 243Q permanece unido DR4. Esto implica que 243Q no tiene alteradas sus capacidades de unión al ADN, de heterodimerización y de unión a co-represores (22,23). A pesar del notable cuadro clínico de SRHT de los pacientes portadores de esta mutación, estudios in vitro han demostrado que este mutante no tiene una disminución importante en la capacidad de unión a la T3 (13,22); sin embargo, la unión de T3 a 243Q disminuye notablemente una vez que el mutante de une al ADN, perdiendo además la capacidad de disociarse del co-represor NCoR (12,22). Estudios de cristalografía han demostrado que la mutación R243Q aumenta la flexibilidad y movilidad de la región del receptor en donde se encuentra, desestabilizando la parte de unión a la hormona y alterando la liberación de co-represores una vez unida la hormona (24). La mutación R320C (caso 2) afecta al residuo Arginina320 situado en una zona rica en dinucleótidos CpG que forma parte de la región de unión a la T3 (4). La mutación provoca el cambio de Arginina por Cisteina y ha sido ampliamente descrita (25,26). Al igual que en el caso anterior, 320C ejerce un importante efecto dominante negativo sobre 17 el TRb wildtype, y su disociación de DR4 requiere dosis muy elevadas de T3. Estudios previos han demostrado que mutaciones naturales en la Arginina320 presentan una disminución superior al 50% en la capacidad de unión a la T3, factor responsable del SRHT (27) La mutación R429Q (caso 3) afecta al residuo Arginina429 situado en una región rica en dinucleotidos CpG en el dominio de unión a la T3 (4). Esta mutación origina el cambio de Arginina por Glutamina. En caso índice presentó manifestaciones clínicas sugestivas de hipertiroidismo, y los experimentos in vitro mostraron que el receptor mutado responde de forma similar al TRb wildtype en cuanto al estímulo de la actividad luciferasa del gene reportero PAL3-luc, requiriendo dosis menores de T3 que los otros dos mutantes estudiados de T3 para disociarse del elemento DR4. 429Q requiere una concentración 4 veces superior al wildtype para ejercer el efecto dominante negativo sobre un reportero Pal3-Luc, que es regulado positivamente por T3. El comportamiento clínico y los resultados de los estudios in vitro concuerdan con estudios previos, en donde se sugiere que este mutante causa resistencia central a la acción de las hormonas tiroideas (28). De hecho, 429Q tiene un mayor efecto sobre la transactivación de genes regulados por las hormonas tiroideas en sentido negativo que sobre genes regulados en sentido positivo (4). La subunidad alfa de TSH y el TRH están regulados negativamente por la T3, por lo que los sujetos portadores de 429Q debieran de presentar una alteración en la acción de las hormonas tiroideas a nivel hipotálamo hipofisario (29); en este sentido, estudios in vitro han mostrado que 429Q bajo la acción de la T3, ejerce una menor inhibición sobre la regulación de TRH y TSH alfa que el TRb wildtype (30), lo que 18 explicaría la elevación de la TSH y, al no existir resistencia periférica a la T3, los síntomas de hipertirodismo de la paciente. En los sujetos de los casos 4 y 5 no se encontraron mutaciones en la región codificante del gen THRB en muestras de ADN procedentes de linfocitos. Asi mismo, tampoco se encontraron evidencias de anomalías en el splicing del gen en las amplificaciones de cDNA procedente de fibroblastos de los pacientes. La prevalencia de casos de SRHT sin mutaciones en el gen THRB es del 15% habiéndose descartado la existencia de mosaicismos y de mutaciones en diferentes co-activadores, co-represores, co-reguladores y transportadores (4). Aunque nuestro estudio no reveló la causa de la resistencia a la acción de las hormonas tiroideas en estos dos sujetos, los estudios in vitro sugieren que los mecanismos son diferentes para cada uno de estos sujetos. Los cambios en la expresión de ZAKI4 y BETB tras la administración de T3 en los fibroblastos del caso 4, son similares a los observados en el sujeto con la mutación R320C; esto sugiere que la resistencia en este caso está relacionada con un defecto en la acción del TRb; una posibilidad es que este defecto se debe a una alteración en los co-represores o coactivadores o en otros receptores nucleares que dimerizan con TR. Los cambios en la expresión de ZAKI4 y BETB en los fibroblastos del sujeto 5 fueron diferentes, presentando un aumento en la expresión incluso superior a la observada en fibroblastos de los sujetos control. Esta observación indica que los fibroblastos de este sujeto son capaces de transportar T3 y no son resistentes a la acción de la T3. La elevación de T4 y T3 sugiere además que no existe un defecto en la conversión de T4 en T3, y que la acción de las desyodinasas 1 y 2 esta conservada. Aunque en base a todos estos datos se podría hipotetizar que el sujeto presenta una resistencia central a la acción de las hormonas 19 tiroideas, la RNM de hipófisis fue normal y los hallazgos de la anamnesis y exploración física no evidenciaron datos de hipertiroidismo, esperables en un cuadro de resistencia central. Dado que ZAKI4 y BETB son genes regulados por TRb (16), existe pues la posibilidad es que el sujeto sea portador de una mutacion en TRa; sin embargo, hasta la fecha no se han descrito sujetos con mutaciones naturales en TRa y se desconoce por ello que fenotipo clínico-bioquímico pudieran presentar. 20 Agradecimientos Al profesor Samuel Refetoff de la Universidad de Chicago por la cesión de los plálsmidos Palx3-Luc y pcDNA1-THRB. Este trabajo fue financiado por Fondo de Investigaciones Sanitarias FIS (proyecto PI030401 a JL-A), Ministerio de Educación (proyecto SAF2006-02542 a JL-A), Xunta de Galicia (poyectos PGIDIT04PXIC20801PN y PGIDIT06PXIB 208360PR a JL-A). 21 References. 1. Refetoff S, Weiss RE, Usala SJ. The syndromes of resistance to thyroid hormone. Endocr Rev.1993;14:348-99. 2. Beck-Peccoz P, Chatterjee VK. The variable clinical phenotype in thyroid hormone resistance syndrome. Thyroid. 1994;4:225-32. 3. Brucker-Davis F, Skarulis MC, Grace MB, Benichou J, Hauser P, Wiggs E et al. Genetic and clinical features of 42 kindreds with resistance to thyroid hormone. The National Institutes of Health Prospective Study. Ann Intern Med. 1995;123:572-83. 4. Refetoff S, Dumitrescu AM. Syndromes of reduced sensitivity to thyroid hormone: genetic defects in hormone receptors, cell transporters and deiodination. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 2007;21:277-305. 5. 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