Evaluación de recubrimientos comestibles proteicos aplicados al salmón del Atlántico (Salmo salar) congelado: estudio de diferentes formulaciones y tratamientos tecnológicos

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELAUNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Facultad d Facultad dFacultad d Facultad de Ciencias e Cienciase Ciencias e Ciencias DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA ÁREA DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Laura Rodríguez Turienzo TESIS DOCTORAL TESIS DOCTORALTESIS DOCTORAL TESIS DOCTORAL Lugo, 2011 Evaluación de recubrimientos comestibles proteicos aplicados al salmón del Atlántico (Salmo salar) congelado: estudio de diferentes formulaciones y tratamientos tecnológicos UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE CIENCIAS CAMPUS DE LUGO DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA ÁREA DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS D. Ángel Cobos García y Dña. Olga Díaz Rubio, Profesores Titulares del Área de Tecnología de los Alimentos del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela. CERTIFICAN: Que la Tesis Doctoral titulada “EVALUACIÓN DE RECUBRIMIENTOS COMESTIBLES PROTEICOS APLICADOS AL SALMÓN DEL ATLÁNTICO (Salmo salar) CONGELADO: ESTUDIO DE DIFERENTES FORMULACIONES Y TRATAMIENTOS TECNOLÓGICOS”, presentada por Dña. Laura Rodríguez Turienzo, ha sido realizada bajo su dirección conjunta en la Facultad de Ciencias de Lugo y cumple todos los requisitos exigidos por la normativa vigente. Por consiguiente, autorizamos su presentación ante el tribunal correspondiente. Y para que así constefirman la presente en Lugo, a 19 de septiembre de 2011. Fdo.: Ángel Cobos García Fdo.: Olga Díaz Rubio La doctoranda, Laura Rodríguez Turienzo AGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS Quisiera que estas líneas sirvieran para expresar mi más profundo y sincero agradecimiento a todas aquellas personas que de manera directa o indirecta, han colaborado en la realización del presente trabajo, en especial al Dr. Ángel Cobos y a la Dr. Olga Díaz, cotutores de esta tesis, por brindarme la oportunidad de continuar mi formación académica en su grupo y permitirme ser la tercera pata del banco durante esta etapa. Al Dr. Carlos Pereira por su colaboración desinteresada. A Bea, mucho más que una compañera de facultad y laboratorio, una amiga para toda la vida. También a Loreto, amiga de importación e increíble persona. A mis compañeros de la tercera planta; tanto a los que ya no están: Alberto, Jose, Diana, Inma (gracias por tu ayuda), Carlos (Charlie), Perejón, Belén, Noelia y Arelí, como a los que siguen ahí: Cris, Juán, Santi, Sonia y Lucas. También de manera especial a Ángeles y Javi, compañeros y amigos con los que he compartido este camino y que me han enseñado y ayudado tanto. Por último, a Jorge y a Dani por su amistad, apoyo incondicional y por ayudarme a crecer cada día y sacar lo mejor de mí. A los pilares de esta facultad, los PAS, que con su trabajo y simpatía mantienen esta entidad en funcionamiento. Especialmente a Quique por sus interminables charlas, a Manolo por ayudarme con todos los papeleos, a Felipe, Carmen y Jose Antonio por abrirme tantas puertas, a Jose por hacer las horas de trabajo más llevaderas, y a Marga, Emiliano, Conchi, Alfonso, Manuel y Juan Carlos, gracias por vuestro cariño y amistad. También quisiera incluir aquí a Ramón, nuestro Papá Noel particular. A mis compañer@s, profesor@s y amig@s de Biología, Tecnología de los Alimentos, del Máster de Seguridad e Innovación Alimentaria y de la Escuela de Idiomas, que han compartido conmigo esta larga y dura etapa, y que espero que continúen en mi vida durante mucho más tiempo. A mis amig@s de toda la vida, pues sin ell@s la vida no sería del mismo color. En especial a Marián, aunque no existen suficientes palabras de agradecimiento, gracias por tu apoyo, comprensión, ánimos e infinita paciencia. También a Jose, una de las mejores personas que he conocido, a pesar de sus inclinaciones futbolísticas. Muy en especial a mis padres y hermano por su cariño, apoyo y paciencia, ingredientes sin los cuales nada de esto habría sido posible. A Maribel y todo su equipo por su inestimable ayuda. vi A la Xunta de Galicia por la financiación de los proyectos de Investigación PGIDIT06TAL00801CT y 07TAL009262PR (Plan Galego de Investigación, Desenvolvemento e Innovación Tecnolóxica). El primero también cofinanciado por ANFACO-CECOPESCA, a quien así mismo agradezco su colaboración en el desarrollo de parte del análisis sensorial. Por último quisiera agradecer a todas aquellas mujeres que con su talento y tesón han abierto el camino para que las universitarias y doctorandas de hoy en día tengamos las mismas oportunidades que nuestros compañeros. A tod@s ell@s, muchas gracias, pues me voy con mucho más de lo que vine. "Para investigar la verdad es preciso dudar, en cuanto sea posible, de todas las cosas" René Descartes René DescartesRené Descartes René Descartes "Lo escuché y lo olvidé; lo vi y lo entendí; lo hice y lo aprendí" Confu ConfuConfu Confucio ciocio cio “Dos caminos se bifurcaban en un bosque, y yo, yo tome el menos transitado, y eso marcó toda la diferencia” Robert Frost Robert FrostRobert Frost Robert Frost. "La ciencia es una sola luz, e iluminar con ella cualquier parte, es iluminar el mundo entero." Isaac Asimov Isaac AsimovIsaac Asimov Isaac Asimov A mis padres, Summary vi The interest in using animal or vegetal proteins as materials for coating production arises from: their ability to create a cohesive polymeric matrix with a high variety of molecular interactions, their antioxidant properties and their availability. Besides, the development of new applications for protein products (some of them even by-products of the food processing industry), is another driving force behind this interest. The effectiveness of several technological treatments (ultrasonication or transglutaminase addition) in improving functional properties of biopolymers has been described. These treatments promote structural modifications and/or crosslinking of polymeric matrices such as proteins. Accordingly, the application of these techniques during coating preparation could improve the edible coating properties and could even substitute the heat treatment conventionally used in edible packaging obtaining. Edible coatings made of different types of biodegradable polymers such as proteins, polysaccharides or lipid-based materials, have been shown effective to prolong shelf life and to maintain quality attributes during frozen or refrigerated storage of fish. However, there are not studies published about edible coating applied on Atlantic salmon. Moreover, despite of the existence of several works on edible coatings applied on frozen fish, there is an important lack of knowledge about important factors involved in coating elaboration and use. Parameters such as the application moment, the use of diverse types of plasticizers in different concentrations, or the application of technological treatments, which can improve the characteristics and functionality of coatings, have not been investigated yet. Therefore, the development of edible protein-based coatings for frozen Atlantic salmon is very interesting for several reasons: firstly, they could constitute an environmental-friendly alternative to plastic packaging. Secondly, they could contribute to extend salmon shelf life maintaining the quality attributes of this fish of Summary vii widespread consumption, high nutritional properties and commercial value. Finally, these coatings could add economic value to some protein by-products. The two main objectives of this Ph.D. thesis were: - The evaluation of different edible protein-based coatings effects on several quality parameters of frozen Atlantic salmon fillets. - The evaluation of the effects of different technological treatments [enzimatic (transglutaminase) and physical (ultrasonication or heat] applied during coating elaboration on several quality parameters of frozen Atlantic salmon fillets. In order to achieve the main objectives, the following secondary objectives were proposed: - The evaluation of the effect of coatings based on different proteins: whey proteins, ovalbumin and soy proteins. - The study of the influence of different types (glycerol or sorbitol) and concentrations (different protein /plasticizer ratios) of plasticizer. - The determination of the effect of the coating application moment (before or after salmon freezing). - The evaluation of the differences between the application of thermal or ultrasound treatment on coatings, with or without transglutaminase addition in both cases. - The study of the effect of the ultrasound treatment duration on coating elaboration. The methodology developed in order to achieve these objectives was divided in two parts, each of them linked to a main objective. With respect to the raw materials, the protein sources and products selected for this thesis, based on its Summary viii antioxidant activity, technological interest and availability, were: whey proteins [whey protein concentrate (WPC) and isolate (WPI)], soy [soy protein concentrate (SOY)] and egg [purified ovalbumin (OVO)]. Besides, eviscerated and ice-preserved Norwegian farmed Atlantic salmon (Salmo salar) specimens were purchased at a local market. Part I: effects of protein coatings subjected to different formulations and application moments on frozen Atlantic salmon quality parameters Coatings were prepared from aqueous solutions of different types of proteins (WPC, OVO and SOY), using two types of plasticizers (glycerol or sorbitol) in different protein/plasticizer ratios, adjusting the pH and applying a thermal treatment according to the protein used. Moreover, coatings were applied in two different moments (before or after freezing) by immersion. Two different samples were used as controls: fillets without coating and glazed fillets (using distilled water). The latter were only compared with the samples coated after freezing. The fillets were stored at -20 ºC for four months. After frozen storage and thawing, some fish samples of each fillet were cooked (90 ºC/5 minutes) and others were stored at chilled temperatures (5 ºC/24 hours). The main parameters determined were: yields (yield, thaw yield, drip losses in thawing, drip losses after chilled storage, and cooking losses), physicochemical characteristics (pH, dry matter, lipid and ash content), colour, and lipid oxidation indexes [conjugated dienes, hydroperoxides and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) values]. These parameters were measured on raw fish fillets, after frozen storage (before or after thawing) and some of them on chilled or cooked samples. Summary ix Part II: effects of whey protein coatings subjected to different treatments on frozen Atlantic salmon quality parameters This part contained two studies. The first one evaluated the effect on frozen Atlantic salmon quality parameters of treated coatings with: a thermal (HEAT) or an ultrasound treatment (US), both with or without transglutaminase addition (TG). The treatment conditions were: HEAT (80 ºC /30 min, using a thermostatic water bath); US (30 min, using an ultrasonic bath at a frequency of 35 kHz) and TG (adding 10 units of enzyme/g protein). Samples without coating were used as control. In the second study, the effects of ultrasound-treated whey protein coatings on frozen Atlantic salmon quality parameters were evaluated. The experiment was performed using the ultrasonic bath at a frequency of 35 kHz and three ultrasonication times (1, 15 and 60 min). In this case, samples without coating and coated with untreated proteins were used as controls. In both studies, coatings were prepared from aqueous solutions of whey protein concentrate (WPC) and isolate (WPI). The elaboration parameters such as protein concentration, type of plasticizer, protein/plasticizer ratio and pH were the same for all the coating preparations. All protein solutions were applied to fish pieces before freezing by immersion. Fillets were kept under frozen storage for four months at -10 ºC. After frozen storage and thawing, some fish samples of each fillet were cooked or chilled as in part I. The determinations were also the same as those used in part I, with the exception of conjugated dienes. Finally, sensory analyses were carried out on coating salmon fillets using the most suitable formulations and treatments from both experimental parts (I and II). This time, uncoated and/or glazed fish fillets were used as controls. Summary x The most outstanding results of this Ph.D. thesis were: Regarding each type of protein selected using different formulations and application moments (Part I): All protein coatings (WPC, OVO, SOY) increased yield of salmon fillets comparing with uncoated ones. The application of whey protein concentrate (WPC) coatings after freezing increased the thaw yield, decreased the drip losses and modified, to a lesser extent, the colour parameters of frozen and thawed fillets, in comparison with application before freezing. Moreover, coating the fish after freezing made the cooked fish fillets redder and yellower than non-coated and water glazed fillets. Whey coatings delayed lipid oxidation of salmon fillets, and this effect was more pronounced when glycerol was used in coating formulation. WPC+glycerol 1:1 coating was the best for the protection of frozen Atlantic salmon especially when it was applied before freezing. The sensory properties of salmon fillets were not modified by the use of this coating. Ovalbumin-based coatings applied before freezing increased thaw yield, reduced water losses during frozen storage, decreased drip losses in thawing and modified, to a lesser extent, the colour of thawed fillets, in comparison with coatings applied after freezing. The ovalbumin coatings also delayed lipid oxidation of salmon fillets, particularly when glycerol was used in coating formulation and when they were applied before freezing. The formulation OVO+glycerol 2:1 applied before freezing was the best coating for the protection of frozen Atlantic salmon. Soy protein-based coatings plasticized with sorbitol increased yield, thaw yield and reduced water losses during frozen storage and drip losses in thawing, comparing to glycerol added coatings. However, soy coatings with glycerol delayed lipid oxidation and modified, to a lesser extent, colour parameters of thawed pieces. Summary xi The most protective coating was SOY+glycerol 1:1 when it was applied after freezing. The quality parameters were not affected significantly by the moment of application of soy protein coatings. Regarding the different treatments studied (Part II): In relation to the first study, all treated whey coatings (HEAT, HEAT+TG, US and US+TG) increased the yield of salmon fillets comparing with uncoated ones. Specifically, HEAT-treated whey coatings with or without TG addition obtained higher yield values than US or US+TG. Besides, thaw yields also increased when HEAT whey coatings with or without TG addition were applied. In relation to drip losses after chilled storage and cooking losses, no significant differences between HEAT and US-treated coatings were observed. Furthermore, all treated whey coatings (HEAT or US, with or without TG) also decreased lipid oxidation of salmon fillets comparing with uncoated ones. TBARS values were lower in US-treated coatings (without TG) than in HEAT-treated (without TG) ones, although the difference was only significant when WPC was used. In general, the addition of transglutaminase did not affect the yields of the fillets protected by US or HEAT-treated coatings. The enzymatic treatment only decreased yield and drip losses in thawing of US-treated WPI coatings. With regard to lipid oxidation, the TG addition lowered TBARS values only to HEAT-treated WPC coatings. Comparing the use of WPC or WPI with the different treatments studied, the employ of the former obtained lower modifications in colour parameters, lower cooking losses and reduced lipid oxidation levels (SRATB). In relation to the second study, parameters such as the yield, the thaw yield, the drip losses in thawing, the drip losses after chilled storage and the cooking losses of Summary xii fish samples were not influenced by the ultrasound treatment of coatings, compared to fish samples with untreated whey protein coatings. Furthermore, the US treatments tested did not modify the colour of frozen and thawed fillets but increased luminosity (L*) and whiteness of cooked samples in comparison with untreated whey protein coated samples. In addition, US-treated coating significantly delayed the lipid oxidation of salmon pieces in comparison with uncoated samples and those coated with untreated proteins. The duration of the ultrasound treatment affected some protective characteristics of coatings. Decreases in yield, drip losses in thawing and drip losses after chilled storage were observed in samples from WPC or WPI proteins ultrasonicated 60 min compared with those ultrasonicated 15 min. The use of solutions treated with ultrasounds for 15 and 60 minutes decreased the lipid oxidation of fish fillets more than the shortest US treatment (1 min). In fact, a trend was reported, the longer is the US treatment, the lower oxidation values were determined. Although most quality parameters studied were not influenced by the use of WPC or WPI with the different US times, the use of the former showed less impact on colour parameters of frozen and thaw fillets and reduced lipid oxidation (hydroperoxides), comparing with the latter. Finally, the sensory properties of salmon fillets were not negatively affected by the application of US-treated whey coatings. According with the results obtained, the main conclusions of this Ph.D. thesis are the following: Summary xiii With regard to the effects of different protein coating formulations and application moments on frozen Atlantic salmon quality parameters 1. The applications of whey protein concentrate, purified ovalbumin and soy protein concentrate as edible coatings increases the yield of the fillets and protects them from lipid oxidation during four months of frozen storage. All the protein coatings provide better protection against oxidation than glazing. 2. The effect of the moment at which the coating is applied (before or after freezing) is different depending on the type of protein. The best results are obtained with the application of whey protein concentrate coatings after freezing and with the application of ovalbumin before freezing. The quality parameters are not affected by the moment of application in soy protein coatings. 3. The protein+glycerol coatings are more suitable for the protection of frozen Atlantic salmon in relation to lipid oxidation than the sorbitol ones. No clear effects of the concentration of plasticizer (sorbitol or glycerol) in most quality parameters are found. 4. Whey protein concentrate+glycerol 1:1 coating is one of the best for frozen Atlantic salmon lipid protection. The sensory properties of salmon fillets are not modified negatively by the use of this coating. Summary xiv With regard to the effects of whey protein coatings subjected to different treatments on frozen Atlantic salmon quality parameters 1. All treated whey coatings studied (heat, heat+transglutaminase, ultrasound and ultrasound+transglutaminase) increase the yield and decrease the lipid oxidation of salmon fillets comparing with uncoated ones. Both ultrasound and heat+transglutaminase treatments are the most protective ones from an oxidative point of view. Particularly, heat+transglutaminase coatings also obtain higher yields and thaw yields, as well as lower drip losses in thawing, comparing with ultrasound-treated coatings. 2. The ultrasound-treated coatings, significantly delays the lipid oxidation of salmon fillets in comparison with uncoated samples, those coated with untreated proteins and those coated with heat-treated whey concentrate proteins. The duration of the ultrasound treatment affects some protective characteristics of coatings. The use of ultrasound solutions for 15 and 60 minutes decreases the lipid oxidation of fish fillets more than the shortest ultrasound treatment (1 minute). 3. The addition of transglutaminase reduces the lipid oxidation in heat-treated whey protein concentrate coated fish. However, no significant effects on lipid oxidation are observed when the enzyme is added to heat-treated whey protein isolate coatings or ultrasound-treated whey coatings. In general, the yields of the samples protected by ultrasound or heat-treated coatings are not influenced by the addition of transglutaminase. 4. The sensory properties of salmon fillets are not negatively affected by the use of ultrasonicated whey coatings. Capítulo 1 1 Capítulo 1 Introducción I. Películas y recubrimientos comestibles 1.1. Definición Cuando un envase, ya sea una película, una lámina, una capa fina o un recubrimiento, es parte integral de un alimento y se ingiere conjuntamente con él, entonces puede calificarse como “envase comestible” (Debeaufort et al., 1998). De manera general, las películas y recubrimientos comestibles pueden definirse como cualquier tipo de material utilizado para recubrir alimentos con el fin de prolongar su vida útil y que puede ser ingerido con ellos. En general su grosor es inferior a 0,3 mm (Pavlath & Orts, 2009). Frecuentemente los términos película y recubrimiento se utilizan indistintamente para indicar que la superficie de un alimento se encuentra recubierta por una capa relativamente fina de un material con una cierta composición. Sin embargo, las películas (también denominadas films) son estructuras independientes que han sido previamente elaboradas y posteriormente aplicadas al alimento, mientras que los recubrimientos (o envueltas) son finas capas de material formadas directamente sobre la superficie de un producto alimentario con la intención de protegerlo o mejorarlo de alguna manera (Krotcha, 2002). Las películas y recubrimientos comestibles pueden ser considerados productos alimentarios, ingredientes, aditivos o sustancias en contacto con los Capítulo 1 8 1.5. Composición Las películas y recubrimientos comestibles se componen principalmente de una base polimérica, que proporcionan una matriz macromolecular con alta resistencia cohesiva. A esta base se le pueden adicionar diversos aditivos como: plastificantes, añadidos generalmente para mejorar sus propiedades elásticas, surfactantes o emulsionantes, para facilitar la formación del polímero, antioxidantes o compuestos antimicrobianos, que mejoran la efectividad del recubrimiento o película, o incluso saborizantes o pigmentos. Por otro lado, se debe tener en cuenta que todos los materiales utilizados en la formulación de recubrimientos comestibles deben estar autorizados por la legislación vigente. En la Unión Europea estos materiales se regulan por la directiva 95/2/CE de 20 de febrero de 1995 relativa a aditivos alimentarios distintos de los edulcorantes. La última revisión legislativa es la Directiva 06/52/CE de 5 de julio de 2006. 1.5.1 Base polimérica Los envases comestibles pueden agruparse en tres tipos en función de la base polimérica utilizada: hidrocoloides, lípidos y mezclas o sistemas multi componentes. Los hidrocoloides incluyen polisacáridos (derivados de celulosa, alginatos, pectinas y almidones entre otros) y proteínas (del lactosuero, de soja, ovoalbúmina, etc.). Los lípidos incluyen ceras, acilgliceroles y ácidos grasos y las mezclas contienen componentes lipídicos e hidrocoloidales. El tipo de componente utilizado determinará las propiedades de cada película o recubrimiento (Krochta, 2002). Capítulo 1 9 1.5.1.1 Hidrocoloides Se denominan comúnmente hidrocoloides a los biopolímeros de elevado peso molecular y que se dispersan en agua. Los polisacáridos y las proteínas son polímeros que forman redes moleculares cohesionadas por una alta interacción entre sus moléculas (puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, London, Debye, de cristalización o de valencia primaria) (Sothornvit & Krochta, 2005). Su cohesión molecular les confiere buenas propiedades mecánicas, pudiendo ejercer de matriz estructural del recubrimiento (Guilbert, 1986), y buenas propiedades de barrera frente a los gases (O 2 y CO 2 ) (Kester & Fennema, 1986; Park et al., 1993; Nísperos-Carriedo, 1994). Sin embargo, la polaridad de estos polímeros hace que sean afines al agua y que ésta se integre fácilmente en su estructura estableciendo puentes de hidrógeno con las moléculas de polímero, reemplazando las uniones entre las moléculas del propio polímero. De esta manera, el polímero pierde cohesión y aumenta la permeabilidad tanto al agua como a los gases (McHugh & Krochta, 1994a). A. Polisacáridos Los carbohidratos son ampliamente utilizados en la industria alimentaria como estabilizantes, espesantes y gelificantes. Además, debido a su capacidad de polimerización, pueden utilizarse también en la elaboración de envases comestibles (Guilbert & Biquet, 1995). En general, los carbohidratos producen películas con buenas propiedades mecánicas y son barreras eficientes contra compuestos de baja polaridad. Sin embargo, su naturaleza hidrofílica hace que presenten una baja resistencia a la pérdida de agua (Parra et al., 2004). Su selectividad en cuanto a la permeabilidad al oxígeno y al dióxido de carbono condiciona la creación de atmósferas modificadas en el Capítulo 1 10 interior del alimento, lo que se traduce en un aumento de la vida útil del producto. La formación de películas de polisacáridos implica frecuentemente la formación de un gel y/o la evaporación del solvente. Los hidratos de carbono, incluyendo almidón, derivados de la celulosa, pululano, quitosano, alginato, pectina, carragenatos, goma gelán, entre otros, han sido estudiados como materiales formadores de películas comestibles (García et al., 1998, 2000; Yang & Paulson, 2000; Diab et al., 2001; Lazaridou & Biliaderis, 2001; Lee et al., 2004; Parra et al., 2004; Tomás et al., 2004; Tapia-Blácido et al., 2005). Estos compuestos tienen las características de ser polímeros de cadena larga, solubles en agua y de producir un fuerte aumento en la viscosidad al dispersarse en ella. B. Proteínas Las proteínas poseen una estructura única basada en 20 monómeros (aminoácidos), lo que les confiere un amplio abanico de propiedades funcionales, especialmente un elevado potencial de unión a nivel intermolecular (Bourtoom, 2009). Las películas de base proteica pueden formar uniones en diversas posiciones y con diferentes grupos, lo que supone un elevado potencial de formación de enlaces e interacciones y, por tanto, los tipos de uniones al utilizar proteínas serían mucho más variados que en el caso de los carbohidratos. En general, las películas a base de proteína son barreras excelentes al oxígeno, dióxido de carbono y a algunos aromas (Gennadios et al., 1993c). Sin embargo, sus propiedades mecánicas no son tan buenas. Las películas Capítulo 1 11 proteicas poseen mayor resistencia al vapor de agua que el resto de los hidrocoloides. A pesar de que son susceptibles a variaciones de pH, pueden proporcionar un valor nutricional añadido al producto, son buenas formadoras de films y se adhieren a superficies hidrofílicas (Baldwin et al., 1995). Las fuentes más comunes de proteínas son la leche y derivados (caseína y proteínas del lactosuero), el maíz (zeína), la soja (proteínas de soja), el huevo (ovoalbúmina), trigo (gluten) y tejidos animales (colágeno) (Baldwin et al., 1995). Un valor añadido en la utilización de proteínas en la elaboración de películas y recubrimientos para alimentos es su capacidad para actuar como antioxidantes naturales. Diversos estudios han descrito la actividad antioxidante de proteínas de origen animal y vegetal como las proteínas de la leche (Cervato et al., 1999; Tong et al., 2000), la zeína del maíz (Wang et al., 1991) o la gliadina del trigo (Iwami et al., 1987). También se ha estudiado la actividad antioxidante de péptidos generados a partir de la hidrólisis de diversas proteínas entre las que se encuentran: las proteínas de la clara de huevo (Tsuge et al., 1991), las proteínas de la yema de huevo sin lecitina (Park et al., 2001), la proteína de soja (Chen et al., 1995), la elastina soluble (Hattori et al., 1998), la caseína de la leche (Suetsuna et al., 2000) y las proteínas del lactosuero (Peña-Ramos & Xiong, 2001, 2003). Finalmente, al igual que en proteínas y péptidos, se ha estudiado la actividad antioxidante de los aminoácidos individualmente. Para que un aminoácido actúe como antioxidante y evite la oxidación lipídica, debe ser oxidado preferentemente frente a los ácidos grasos poliinsaturados (Elías et al., 2005). Cada aminoácido presenta una estabilidad oxidativa diferente (Stadtman, 1993), por lo que la Capítulo 1 12 capacidad de los residuos aminoacídicos de interaccionar con radicales libres o productos de la oxidación lipídica determinará la capacidad antioxidante general de la proteína (Viljanen et al., 2005). Sharp et al. (2004) estudiaron la reactividad de diferentes aminoácidos frente a la oxidación con radicales hidroxilo, observando el siguiente orden de mayor a menor capacidad de oxidación: cisteína > triptófano, tirosina > metionina > fenilalanina > histidina > isoleucina > leucina > prolina. Sin embargo, para otros autores la participación de la metionina en el sistema antioxidante no está clara (Elías et al., 2005). Así pues, proteínas con elevadas cantidades de aminoácidos altamente oxidables, como la cisteína, el triptófano y la tirosina, presentan la capacidad de inhibir las reacciones de oxidación lipídica. 1) Proteínas del lactosuero Estas proteínas se obtienen a partir del lactosuero, el cual es definido como “la sustancia líquida obtenida por separación del coágulo de leche en la elaboración de queso” (Foegeding & Luck, 2002). La utilización y/o tratamiento del lactosuero ha sido una de las grandes preocupaciones de la industria láctea debido a que, por un lado, posee componentes valiosos que no deberian ser desperdiciados, y por otro representa un importante contaminante medioambiental (El-Salam et al., 2010). El lactosuero contiene principalmente lactosa, proteínas, minerales, vitaminas y grasa. La composición y tipo de lactosuero varía considerablemente dependiendo del tipo de leche, tipo de queso elaborado y el proceso tecnológico empleado. La lactosa es el principal componente nutritivo (4,5%), seguida de las proteínas (0,8%), y los lípidos (0,5%). Si en la coagulación de la leche se utilizan enzimas, el lactosuero se denomina dulce, y si se reemplaza la enzima por ácidos orgánicos se denomina Capítulo 1 13 ácido. A pesar de que las proteínas no constituyen la fracción más abundante del lactosuero, es la más interesante en los terrenos económico y nutricional (Linden & Lorient, 1996). Comercialmente se encuentran disponibles diversos productos derivados del lactosuero de queserías como los concentrados de proteína de lactosuero (CPS) y los aislados de proteína de lactosuero (APS). Los concentrados son elaborados generalmente mediante ultrafiltración y contienen desde un 35% hasta un 80% de proteína, mientras los aislados contienen aproximadamente un 90% de proteína (Foegeding & Luck, 2002). La composición de los concentrados y aislados también difiere en los niveles de otros constituyentes. Así pues, aparte de un mayor contenido proteico, los APS presentan menores contenidos de grasa, lactosa y minerales que los CPS (Banerjee & Chen, 1995; Morr & Ha, 1993). Estas diferencias en la composición pueden influenciar en gran medida las propiedades barrera y mecánicas de las películas elaboradas a base de proteínas de lactosuero (Hong & Krochta, 2006). La grasa aumenta la hidrofobicidad de los films y mejora sus propiedades barrera frente a la humedad (Banerjee & Chen, 1995), mientras que la lactosa actúa como plastificante (Hong & Krochta, 2006). Las proteínas del lactosuero están formadas por diferentes fracciones: βlactoglobulina, α-lactoalbumina, seroalbúmina bovina y algunas inmunoglobulinas, entre otras. La βFigura 1.1. Representación tridimensional de la βlactoglobulina (Brownlow et al., 1997). Capítulo 1 14 lactoglobulina (Figura 1.1) es el componente proteico mayoritario (50-60%) del lactosuero (Sothornvit & Krochta, 2001). Se conocen 11 variantes genéticas siendo las variantes A y B las predominantes en la leche bovina (Regalado et al., 2006). La estructura primaria consiste en 162 residuos aminoacídicos con un peso molecular de 18.300 Da. La estructura secundaria y terciaria muestran un elevado grado de organización con un 43-50% de láminas β, 10-15% de hélices α y un 15-20% de giros β (Regalado et al., 2006). El monómero de β-lactoglobulina contiene un grupo tiol libre, inaccesible en el interior de la estructura, y dos enlaces disulfuro. Bajo condiciones fisiológicas se encuentra predominantemente en forma dimérica. La α-lactoalbúmina es la segunda proteína más abundante del lactosuero (20%). Es una proteína globular, al igual que la β-lactoglobulina, que contiene 123 residuos aminoacídicos y cuatro enlaces disulfuro. Presenta un bajo grado de organización con 30% de hélices α, un 9% de láminas β y un 61% sin organizar (Alexandrescu et al., 1993), lo que le confiere gran flexibilidad. Sin embargo, la fijación de calcio y los enlaces disulfuro mantienen su estructura globular, estabilizándola frente a la desnaturalización (Kinsella & Whitehead, 1989). Su estructura tridimensional puede dividirse en dos lóbulos: uno acídico, rico en láminas β, que contiene el dominio de unión al calcio y un lóbulo básico rico en hélices α. La seroalbúmina bovina (BSA) representa alrededor del 7% de la proteína del lactosuero. Esta proteína presenta catorce enlaces disulfuro y un enlace tiol libre, lo que la convierte en una proteína altamente estructurada (Morr & Ha, 1993). Como ya se ha comentado, las proteínas del lactosuero en estado nativo son globulares, por lo que la mayoría de los grupos sulfhidrilo se encuentran “ocultos” en el interior de las moléculas. Por este motivo, la formación de Capítulo 1 15 películas y recubrimientos a partir de estas proteínas suele implicar la desnaturalización de las mismas mediante diversos procedimientos que implican la modificación física, química o enzimática de las mismas, siendo el tratamiento térmico el mecanismo más utilizado. Estos procedimientos de desnaturalización proteica se analizarán con más detalle en un apartado posterior. Las proteínas del lactosuero son muy sensibles a las altas temperaturas y, en menor grado, al pH ácido (situación contraria a lo que sucede con las caseínas), debido a que su mecanismo de estabilización es por hidratación y no por carga eléctrica. Así pues, el calentamiento provoca una desnaturalización de las proteínas del lactosuero, particularmente de la βlactoglobulina. Este proceso de desnaturalización incluye el reordenamiento de la estructura terciaria de manera que el grupo tiol libre de la cisteína 121, que en el estado nativo se encontraba oculto en el interior de la molécula proteica, se vuelve ahora accesible. Este grupo tiol “activado” puede reaccionar con los enlaces disulfuro, también presentes en la β-lactoglobulina o en otras proteínas del lactosuero como la α-lactoalbúmina, o puede reaccionar con otros grupos tiol, formando nuevos enlaces disulfuro (Floris et al., 2008). Además de los grupos tiol, otros grupos hidrofóbicos también quedan al descubierto tras la desnaturalización (Shimada & Cheftel, 1998), por lo que también se promoverá la formación de interacciones hidrofóbicas además de los enlaces disulfuro durante la formación de las películas y envueltas (McHugh & Krochta, 1994b). En relación a su capacidad antioxidante, aunque el mecanismo por el cual las proteínas del lactosuero inhiben la oxidación lipídica no está claro, parece que la actividad antioxidante de ciertos aminoácidos presentes en estas proteínas juega un papel crucial (Elías et al., 2005). Los posibles mecanismos Capítulo 1 16 incluyen por un lado, la quelación de metales de transición (catalizadores de la oxidación) por la lactoferrina y la seroalbúmina, y por otro, la neutralización de radicales libres por aminoácidos como la cisteína, el triptófano o la tirosina (Tong et al., 2000). Procesos como la desnaturalización proteica o la hidrólisis parcial podrían hacer más accesibles los residuos aminoacídicos con poder antioxidante, lo que en un principio mejoraría su capacidad de neutralizar radicales libres, aunque también podría afectar a la capacidad de ciertas proteínas de quelar metales (Elías et al., 2005). Tanto la α-lactoalbúmina como la β-lactoglobulina (β-Lg) actúan como antioxidantes, aunque esta última resulta ligeramente menos efectiva a la hora de inhibir la oxidación lipídica en comparación con otros componentes proteicos del suero como la α-lactoalbúmina (αLa) (Allen & Wrieden, 1982). El efecto antioxidante de la β-Lg se atribuye a la presencia de un grupo sulfhidrilo libre (cisteína-121) parcialmente “oculto” en el núcleo proteico. Se cree que la cisteína actúa como antioxidante al ceder el hidrógeno de su grupo tiol (Taylor & Richardson, 1980). A pesar de la relativa accesibilidad de este grupo en la β-Lg, juega un papel fundamental a la hora de neutralizar radicales libres. Sin embargo, la cisteína no es el único residuo aminoacídico de las proteínas responsable del efecto antioxidante. Levine et al. (1996) propusieron que la metionina supone también un importante mecanismo de defensa de las proteínas frente a la oxidación. Por su parte Hernández-Ledesma et al. (2005) estudiaron la actividad antioxidante de diversos péptidos y aminoácidos obtenidos de la hidrólisis de la β-Lg y la α-La. En este estudio el triptófano presentó el mayor poder antioxidante seguido de la metionina y cisteína. También varios péptidos presentaron elevadas actividades antioxidantes, destacando el péptido con secuencia: Triptófano-Tirosina-Serina-Leucina- Capítulo 1 17 Alanina-Alanina-Serina-Asparragina-Isoleucina, el cual presentó una actividad incluso superior a la del hidroxianisol butirato, un antioxidante sintético utilizado en alimentación. Se cree que el triptófano funciona como antioxidante al actuar como donador del hidrógeno de su grupo indólico, neutralizando así a los radicales libres (Hernández-Ledesma et al., 2005). El interés por las proteínas de lactosuero nace de su habilidad para formar películas transparentes, con excelentes propiedades de barrera al oxígeno, aromas y aceites, a bajas humedades relativas (McHugh & Krochta, 1994b; Maté & Krochta, 1996; Osés et al., 2009). Se ha observado que al utilizar proteína completamente desnaturalizada, la permeabilidad al vapor de agua se reduce significativamente; esto se debe a que la desnaturalización con calor permite la formación de enlaces disulfuro intermoleculares, lo que disminuye los coeficientes de difusividad y solubilidad (McHugh & Krochta, 1994b). Las películas obtenidas son, en casi todos los casos, insolubles en agua, transparentes, de aroma y sabor suave, flexibles, blandas, biodegradables y con excelentes propiedades mecánicas (Cuq et al., 1998; Khaoula et al., 2004). Los recubrimientos a base de proteínas de lactosuero se han utilizado con éxito para reducir la rancidez de cacahuetes tostados a bajas humedades relativas (Maté & Krochta, 1996). También mejoran la consistencia y las pérdidas de peso en el pollo congelado (Alcántara & Krochta, 1996). En el salmón real (Oncorhynchus tschawytscha), envueltas de suero con antioxidante retrasan la oxidación lipídica y reducen los valores de productos primarios de oxidación (peróxidos) durante el almacenamiento en congelación (Stuchell & Krochta, 1995). También en salmón rosado (Oncorhynchus Capítulo 1 24 darán lugar a enlaces disulfuro covalentes intra e intermoleculares a través de la oxidación y las reacciones de intercambio disulfuro-sulfhidrilo (Mine, 1992; Gennadios et al., 1996a). Estas interacciones desembocarán en la formación de redes tridimensionales. Además de los enlaces S-S, los enlaces de hidrógeno formados, así como, las interacciones hidrofóbicas y electroestáticas, serán importantes a la hora de determinar las propiedades físicas de este tipo de películas. Las películas de ovoalbúmina presentan propiedades semejantes a las elaboradas con otro tipo de proteínas, aunque difieren en el color siendo más transparentes que las elaboradas con proteínas de trigo, soja o maíz (Gennadios et al., 1996a). Las propiedades mecánicas y de barrera de estas películas pueden modificarse variando el tipo y cantidad de plastificante añadido. Por un lado, al aumentar la cantidad de plastificante se incrementa la elongación y disminuye la fuerza tensil. Por otro lado, a igual contenido de plastificante (50%), los films de ovoalbúmina con sorbitol presentan menor permeabilidad al vapor de agua, mientras que los plastificados con glicerol muestran una menor fuerza tensil y elongación en comparación con los de sorbitol (Gennadios et al., 1996a). Diversos recubrimientos elaborados con proteínas de la clara de huevo son capaces de retrasar la pérdida de humedad de pasas en mezclas de cereales de desayuno (Bolin, 1976), y reducir la pérdida de humedad en huevos, a la vez que aumentan la resistencia de la cáscara (Wong et al., 1996). Así mismo, envueltas preparadas con proteínas de clara de huevo, proteínas lácteas y almidón, han reducido la pérdida de jugos tras el cocinado de productos Capítulo 1 25 cárnicos (Reutimann et al., 1996) y minimizado la transferencia de humedad entre componentes de una pizza (Berberat & Wissgott, 1993). 1.5.1.2 Lípidos y resinas La naturaleza hidrofóbica de los compuestos lipídicos explica las excelentes propiedades como barrera frente a la humedad de las películas y recubrimientos de grasas y derivados. Sin embargo, su falta de estabilidad e integridad estructural hace que presenten malas propiedades mecánicas, formando recubrimientos quebradizos (Gontard et al., 1995). En consecuencia, los lípidos deben asociarse con otras sustancias formadoras de polímeros, como proteínas o derivados de la celulosa (Debeaufort et al., 1993). La permeabilidad al vapor de agua disminuye cuando la concentración de fase hidrofóbica aumenta en la composición de la envuelta (Bourtoom, 2008). Por regla general, se observa el siguiente orden de eficacia en sentido decreciente como barrera frente a la humedad: ceras > grasas sólidas > lecitina, acetilglicéridos > aceites líquidos (Guilbert & Biquet, 1995). Los lípidos más utilizados en la formulación de recubrimientos comestibles son ceras (cera de abeja, candelilla, carnauba y parafina), ácidos grasos y diversos aceites vegetales (de cacahuete, maíz y soja), siendo los más efectivos la parafina y la cera de abeja (Bourtoom, 2008). Como ya se ha comentado con anterioridad, la aplicación de lípidos como recubrimientos comestibles se ha practicado desde hace siglos. En la actualidad, los lípidos, solos o en emulsión con otros compuestos, se utilizan como recubrimientos comestibles para carnes, pescado, frutas, vegetales, semillas, caramelos, alimentos frescos, curados, congelados o procesados Capítulo 1 26 (Rhim & Shellhammer, 2005). Posiblemente su aplicación más importante sea en frutas y vegetales, en cuyo caso los recubrimientos lipídicos previenen la pérdida de peso (debido a que evitan la pérdida de agua), ralentizan la respiración aeróbica, evitan la abrasión durante el transporte y mejoran su apariencia aportando brillo a su superficie. Al mismo tiempo, si el recubrimiento es muy grueso, su efecto sobre la transmisión de oxígeno y de dióxido de carbono puede dar lugar a procesos fisiológicos no deseados como la respiración anaeróbica, lo que producirá una disminución en la calidad del producto. En el caso de productos hortícolas con bajos procesos respiratorios, como las raíces, esta problemática es mínima y pueden emplearse recubrimientos de mayor grosor (Pavlath & Orts, 2009). 1.5.1.3 Mezclas o sistemas multicomponentes El objetivo de emplear mezclas de biopolímeros para la elaboración de películas comestibles y recubrimientos biodegradables es contrarrestar las deficiencias propias de cada componente, y así poder mejorar las propiedades y características del material resultante (Tharanathan, 2003). Estos recubrimientos compuestos se formulan generalmente a partir de una matriz estructural hidrocoloidal, que aporta la consistencia estructural y la barrera a los gases, y una cantidad de componente lipídico que aporta la resistencia al vapor de agua (Guilbert, 1986). Otras combinaciones también son posibles, como proteínas y polisacáridos o polímeros sintéticos y naturales, entre otros (Bourtoom, 2008). Los recubrimientos compuestos pueden ser: recubrimientos emulsionados, cuando el lípido está emulsionado en la matriz del hidrocoloide Capítulo 1 27 o recubrimientos bicapa, en los que el lípido está separado de la matriz, cada uno formando una capa (Pérez-Gago & Krochta, 2005) (Figura 1.4). Figura 1.4. Representación de las posibles estructuras de los recubrimientos compuestos o mezclas. A) recubrimiento bicapa, B) recubrimiento emulsionado. A pesar de que en un principio las películas bicapa suponen una barrera más eficaz frente al vapor de agua (Kamper & Fennema, 1984; Guilbert & Biquet, 1995), su preparación requiere de varios pasos: dos aplicaciones y dos etapas de secado; siendo ésta la razón por la cual la industria alimentaria se inclina por el uso de formulaciones emulsificadas. En este caso el recubrimiento se aplica directamente sobre el alimento y sólo se requiere una etapa de secado. Cabe también señalar que tanto la técnica de elaboración de la formulación como la técnica de aplicación afectan a la estructura y propiedades finales de recubrimiento. Kamper & Fennema (1984) fueron los primeros en utilizar emulsiones de metilcelulosa y ácidos grasos para mejorar las propiedades de barrera al vapor de agua de las películas de celulosa. A partir de entonces, numerosos autores han estudiado el desarrollo de películas multicomponentes basándose en el trabajo de estos autores. Algunos ejemplos de películas Capítulo 1 28 multicomponentes estudiadas en la que se utilizaron matrices proteicas son: películas de aislado proteico de lactosuero y lípidos (McHugh & Krochta, 1994a), caseínas y lípidos (Avena-Bustillos, 1993), gelatina y almidón soluble (Arvanitoyannis et al., 1997), aislado proteico de soja y alginato o ácido poliláctico (Rhim et al., 1999b, 2007). 1.5.2 Plastificantes Además del componente de naturaleza polimérica y de alto peso molecular (matriz), otro componente importante de los envases comestibles son los plastificantes. Un plastificante puede definirse como una sustancia estable, de baja volatilidad y elevado punto de ebullición, la cual, cuando se adiciona a un material polimérico, modifica las propiedades físicas y/o mecánicas del mismo. Este tipo de sustancias modifica la organización tridimensional, disminuye las fuerzas de atracción intermoleculares e incrementa la movilidad de las cadenas (Banker, 1966; McHugh & Krochta, 1994b). Así mismo, los plastificantes deben ser compatibles con el polímero, permanentes en el sistema y eficientes a la hora de conseguir las propiedades deseadas en la envuelta (Sothornvit & Krochta, 2005). La mayoría de las películas y envueltas elaboradas con proteínas son quebradizas cuando no se les añade un plastificante (Gennadios et al., 1994). Así pues, la incorporación de plastificantes tiene como objetivo mejorar la flexibilidad y consistencia de las envueltas, haciéndolas menos quebradizas para evitar su rotura durante la manipulación y el almacenamiento (Torres, 1994; Sothornvit & Krochta, 2000). La rigidez de los recubrimientos se debe a Capítulo 1 29 las fuerzas de cohesión que estabilizan la matriz polimérica de polisacárido o proteína. Los plastificantes debilitan estas fuerzas de cohesión al introducirse entre las cadenas poliméricas, incrementando la movilidad de las mismas y mejorando la flexibilidad y elasticidad de la matriz polimérica (Banker, 1966). Se cree que los grupos polares (-OH), a lo largo de las cadenas del plastificante, desarrollan puentes de hidrógeno entre el polímero y el plastificante, reemplazando así las interacciones polímero-polímero (Gennadios et al., 1993a). El tamaño molecular, la configuración y el número total de los grupos hidroxilo funcionales del plastificante, así como su compatibilidad con el polímero, pueden afectar las interacciones entre el plastificante y el polímero (Yang & Paulson, 2000), modificando su capacidad para interferir en las uniones entre las cadenas proteicas y su capacidad para atraer agua. Por otro lado, la reducción de la cohesión del polímero se traduce en un incremento de la permeabilidad al vapor de agua, gases y a compuestos aromáticos, por parte de la envuelta (Krochta, 2002). Así pues y de manera general, como resultado de los cambios en la organización molecular, la adición de plastificantes modifica las propiedades funcionales de las envueltas, incrementando la extensibilidad, distensibilidad y flexibilidad y disminuyendo la cohesión, elasticidad, resistencia mecánica y rigidez (Lieberman & Gilbert, 1973, McHugh & Krochta, 1994b, Park et al., 1994). También cabe mencionar que su adición resulta en un descenso de la temperatura de transición vítrea (Tg: temperatura por debajo de la cual un polímero se vuelve rígido y quebradizo) de los materiales amorfos a menudo necesario para elaborar envueltas mediante el método de termoformación (Cuq et al., 1998; Diab et al., 2001; Lazaridou & Biliaderis, 2002). En películas a base de gelatina y almidón, Arvanitoyannis et al. (1997) señalan que la Capítulo 1 30 disminución de la Tg con la presencia de plastificantes se debe a que el agua y los polioles establecen puentes de hidrógeno con el almidón, lo que lleva a disminuir las interacciones intra e intermoleculares entre las cadenas del polisacárido y, por ende, las energías de interacción. Los plastificantes más utilizados en la elaboración de envueltas comestibles, aparte del agua, que puede ser considerada como el plastificante natural, son: los polioles; como el glicerol (Figura 1.5), el polietilenglicol, el propilenglicol, etc. y los mono, di y oligosacáridos, como el sorbitol, (Figura 1.6) la sacarosa y la glucosa (Cuq et al., 1998). Todos ellos son de naturaleza hidrofílica y reducen significativamente la propiedad de barrera al vapor de agua del recubrimiento. Para preservar esta propiedad pueden utilizarse otros plastificantes de naturaleza hidrofóbica, como los ácidos grasos y los aceites que, sin embargo, aumentan la permeabilidad al oxígeno del recubrimiento. Por tanto, en función de las características requeridas del recubrimiento, se pueden utilizar un tipo u otro de plastificante o una combinación de ambos (Sothornvit & Krochta, 2005). Figura 1.5. Representación de la estructura del glicerol. Figura 1.6. Representación de la estructura del sorbit ol. Capítulo 1 31 La selección de un plastificante requiere la consideración de tres criterios básicos, aparte del coste (Sothornvit & Krochta, 2005): a) La compatibilidad: depende de la polaridad, forma y tamaño del plastificante. Las mejores compatibilidades se observan cuando el plastificante y el polímero tienen una estructura química similar. b) La eficiencia: generalmente, los buenos plastificantes proporcionan una elevada plastificación a bajas concentraciones y presentan una elevada difusión e interacción con el polímero. c) La permanencia: depende del tamaño de la molécula y del coeficiente de difusión en el polímero. En la elaboración de películas independientes basadas en proteínas (no así en recubrimientos), el efecto del tipo y proporción del plastificante empleado ha sido ampliamente estudiado, tanto con proteínas de lactosuero (McHugh & Krochta, 1994b; Sothorvit & Krochta, 2000, 2001; Dangaran & Krochta, 2007; Osés et al., 2008), como con proteínas de soja (Zang et al., 2001; Kim et al., 2003; Kokoszka et al., 2010), o con ovoalbúmina (Gennadios et al., 1996a). En relación a la cantidad de plastificante adicionado, se ha observado que, al incrementar la concentración de plastificante, se produce un descenso en la fuerza tensil y un aumento de los valores de elongación en películas de aislado proteico de lactosuero plastificadas con sorbitol y glicerol (McHugh & Krochta, 1994b), películas de albúmina de huevo plastificadas con glicerol, sorbitol o polietilenglicol (Gennadios et al., 1996a), películas elaboradas con aislado proteico de soja con glicerol, sorbitol o ambos (Kim et al., 2003), y en Capítulo 1 32 films preparados con gelatina y almidón soluble con adición de polioles (Arvanitoyannis et al., 1997). Paralelamente, el incremento de la concentración de plastificante (glicerol o sorbitol) en películas de aislado proteico de lactosuero disminuye sus propiedades barrera al oxígeno (Osés et al., 2008). Mediante el desarrollo de modelos matemáticos, se ha concluido que plastificantes como el glicerol o el sorbitol presentan una dependencia exponencial negativa entre la concentración de plastificante tanto con el módulo elástico y la fuerza tensil como con la permeabilidad al oxígeno, y una dependencia lineal entre la cantidad de plastificante y la elongación de las películas (Sothorvit & Krochta, 2000, 2001). Respecto al tipo de plastificante utilizado, el idóneo debería mejorar la flexibilidad de las películas o recubrimientos ejerciendo el menor impacto posible sobre la permeabilidad al oxígeno. Sothornvit & Krochta (2000) establecieron ratios de eficiencia de los plastificantes entre las propiedades mecánicas y la permeabilidad al oxígeno. Para estos autores, la sacarosa, el sorbitol y el glicerol presentarían los ratios más favorables en ese orden. Películas elaboradas a partir de β-lactoglobulina (principal proteína del lactosuero) en las que se utilizó sorbitol como plastificante presentan una menor permeabilidad al oxígeno y un mayor módulo elástico y fuerza tensil, comparadas con aquellas preparadas con glicerol a igual cantidad de plastificante añadido (Sothorvit & Krochta, 2000, 2001). También los films de ovoalbúmina con glicerol muestran una menor fuerza tensil y elongación en comparación con los de sorbitol, mientras que los plastificados con sorbitol presentan menor permeabilidad al vapor de agua, a igual contenido de plastificante (Gennadios et al., 1996a). También la utilización de sorbitol da lugar a films con menores permeabilidades al vapor de agua en comparación Capítulo 1 33 con el glicerol en películas de proteína de lactosuero (McHugh & Krochta, 1994b) y en películas con aislado proteico de soja plastificadas con glicerol, sorbitol o una mezcla de ambas (Kim et al., 2003). El sorbitol también presenta una menor permeabilidad al oxígeno que el glicerol en películas elaboradas con aislado proteico de lactosuero (McHugh & Krochta, 1994b; Osés et al., 2008) y caseínas (Chick & Ustunol, 1998). Así pues, el sorbitol parece ser un plastificante más efectivo que el glicerol a la hora de mejorar las propiedades mecánicas y de barrera frente al vapor de agua y al oxígeno en las películas elaboradas con proteínas. Sin embargo, la cristalización del sorbitol con el tiempo endurece las películas volviéndolas menos flexibles, lo que puede limitar su aplicación (Osés et al., 2008). 1.6. Elaboración de películas y/o recubrimientos comestibles 1.6.1 Mecanismos de formación En la formulación de películas y recubrimientos se necesita al menos un componente capaz de formar una matriz estructural de suficiente cohesividad, al establecer numerosas interacciones moleculares bajo la acción de un tratamiento químico o físico (Debeaufort et al., 1998). Los biopolímeros proteicos pueden definirse como redes macromoleculares Figura 1.7. Fuerzas estabilizadoras de redes proteicas (adaptada de Verbeek & Van den Berg 2010). Capítulo 1 40 Las transglutaminasas (TG) son una familia de proteínas presentes en la mayoría de los tejidos y fluidos extracelulares de los vertebrados, e involucradas en numerosos procesos biológicos. Se han encontrado en mamíferos, pescados, plantas y microorganismos (Kuraishi et al., 2001). Las TG son proteínas-γ-glutaminiltransferasas (EC 2.3.2.13) (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992) que catalizan la reacción de transferencia de grupos acil entre el grupo γcarboxiamida de un péptido ligado a un residuo de glutamina (donador de acilos) y una gran variedad de aminas primarias (aceptor de acilos), incluyendo el grupo amino de la lisina (Figura 1.8a). Figura 1.8. Reacciones generales catalizadas por transglutaminasa: a) reacción de transferencia de grupos acil; b) reacción “cross-linking”; c) desamidación. Cuando el grupo ε-amino de la lisina es el sustrato, las cadenas de péptidos quedan unidas a través de enlaces covalentes ε-(γ-glutaminil) lisina (G-L) (Figura 1.8b). En ausencia de sustratos con grupos amino, las TG catalizan la hidrólisis del grupo γ-carboxiamida del grupo glutaminil (Figura Capítulo 1 41 1.8c) dando lugar a una desaminación (Motoki & Seguro, 1998). La formación de los entrecruzamientos no reduce el valor nutricional del alimento, debido a que el residuo de lisina permanece disponible para la digestión (Bourtoom, 2009). Originariamente, las TG se extraían del hígado de cobaya o del plasma bovino, por lo que su obtención era limitada y muy costosa, entorpeciendo así su producción a gran escala y su comercialización (Zhu et al., 1995). En 1989 se aisló la enzima a partir del microorganismo Streptoverticillium mobaraense, actualmente denominado Streptomyces mobaraense. Esta enzima, capaz de establecer enlaces covalentes con las proteínas, se denominó transglutaminasa microbiana, disponiéndose así una fuente de enzima con un coste reducido. Desde entonces, ha sido comercializada como preparado enzimático para la industria alimentaria por Ajinomoto Corporation. Hasta el momento éste es el único producto de estas características disponible comercialmente. La TG microbiana (Figura 1.9) se caracteriza por catalizar la formación de enlaces ε-(γglutaminil) lisina en la mayoría de las proteínas que contengan glutamina y lisina, como las caseínas, globulinas de soja, gluten, proteínas de huevo, miosina y fibrina, entre otras, pero debe tenerse en cuenta que la cantidad de enlaces cruzados formados dependerá de la estructura Figura 1.9. Representación de la TG microbiana (Kashiwagi, 2002). Capítulo 1 42 macromolecular de cada sustrato (Dickinson, 1997). Dado que los residuos de glutamina residen en regiones flexibles de la cadena polimérica o en regiones con giros β o inversos, las caseínas se convierten en excelentes sustratos (Nio et al., 1986; Sakamoto et al., 1994). Sin embargo, las proteínas globulares como la β-lactoglobulina, αlactoalbúmina y la seroalbúmina bovina son pobres sustratos debido a su estructura compacta, la cual limita el acceso a los residuos de lisina y glutamina por parte de la enzima (Motoki & Nio, 1983; Mahmoud & Savello, 1992; Dickinson & Yamamoto, 1996; Matsumura et al., 1996). Así pues la susceptibilidad de esas proteínas puede mejorarse mediante del desdoblamiento o desnaturalización parcial de las mismas mediante la utilización de diversas técnicas (Lim et al., 1998). La TG microbiana es estable en un amplio rango de pH, entre 4 y 9, aunque su óptimo se localiza entre 6-7. Su punto isoeléctrico es 8,9 y, pese a que su temperatura óptima de actividad se encuentra entre 45-50 ºC a pH 6, mantiene su actividad a temperaturas entre 0 y 50 ºC (Ajinomoto, 2009). A temperaturas de congelación posee aún cierta actividad, pero su inactivación es irreversible a temperaturas de más de 80 ºC (Ando et al., 1989; Menéndez et al., 2006). A diferencia de la transglutaminasa endógena, la TG microbiana es totalmente independiente del calcio (Motoki et al., 1990). Esta característica es muy importante a la hora de modificar la propiedades funcionales de las proteínas debido a que muchas de las proteínas presentes en los alimentos, como son las caseínas, globulinas de soja y miosina, son susceptibles a la presencia de Ca 2+ , facilitando éste su precipitación, mientras que otros cationes Capítulo 1 43 como K + , Na + , Mg 2+ y Ba 2+ no afectan a su actividad enzimática (Tsai et al., 1996; Matsumura et al., 2000). Por otra parte, la TG microbiana puede establecer enlaces cruzados con un mayor número de proteínas que cualquier otra TG obtenida de mamíferos (De Jong et al., 2001). La TG microbiana se ha utilizado en la elaboración de películas para polimerizar proteínas de lactosuero (Mahmoud & Savello, 1992, 1993; Truong et al., 2004), caseínas (Motoki et al., 1987), proteínas de soja (Tang et al., 2005, 2006), proteínas de clara de huevo (Lim et al., 1998), gelatina (Lim et al., 1999) y gluten de trigo (Larré et al., 2000). También se ha estudiado su efecto en mezclas de proteínas de lactosuero y proteína de soja (fracción 11S) (Yildirim et al., 1996; Yildirim & Hettiarachchy, 1997, 1998), de pectina y harina de soja (Di Pierro et al., 2005), y de gelatina y caseínas (Chambi & Grosso, 2006) o proteínas de lactosuero y zeína (Oh et al., 2004). En general, el entrecruzamiento producido por la TG microbiana incrementa la fuerza tensil, mejora la tracción de las películas y disminuye la solubilidad de las proteínas constitutivas del film, indicando la potencial aplicación de esta enzima para la mejora de las propiedades de las películas proteicas (Gennadios et al., 2004). Mahmoud & Savello (1993) investigaron la elaboración de películas utilizando TG microbiana como catalizador enzimático del entrecruzamiento, a partir de proteínas de lactosuero (α-lactoalbúmina, β-lactoglobulina y una mezcla equimolar de ambas). Según estos autores, el entrecruzamiento covalente de las proteínas de lactosuero debido a la acción de esta enzima puede utilizarse para la elaboración de películas o recubrimientos. Sin embargo, para la utilización de la enzima es preciso tener en cuenta el pH y la Capítulo 1 44 naturaleza enzimática de la superficie del alimento a recubrir, puesto que la formación y propiedades de las envueltas se ven afectadas por ambos factores. Truong et al. (2004) encontraron que las proteínas de lactosuero (obtenidas de un aislado proteico) entrecruzadas con TG microbiana presentaban una mayor viscosidad y distintas características de gelificación comparadas con las proteínas control. Tang et al. (2005) estudiaron el efecto de la TG microbiana sobre las propiedades y la microestructura de películas elaboradas con aislado proteico de soja y distintos plastificantes (glicerol, sorbitol y una mezcla equimolar de ambos). La adición de la enzima incrementaba la fuerza tensil y la hidrofobicidad superficial, disminuyendo a su vez la elongación y transparencia. No obstante, la permeabilidad al vapor de agua no se vería afectada de manera significativa por el tratamiento enzimático. Por otro lado, las películas tratadas presentaron superficies de mayor rugosidad, siendo más homogéneas y compactas en comparación con los controles. Yildirim et al. (1996, 1997) obtuvieron heteropolímeros de aislado proteico de lactosuero y glicinina (11S) con mejores propiedades funcionales (mayor capacidad espumante y mayor estabilidad al calor) gracias al entrecruzamiento mediante TG microbiana. Además, sugirieron la aplicación de este tipo de polímeros en alimentos que requieren un fuerte tratamiento térmico como sopas, salsas, entre otros. Yildirim & Hettiarachchy (1998) utilizaron TG microbiana para el entrecruzamiento en la elaboración de películas de proteínas de lactosuero, obteniendo films con mayor fuerza tensil que los control y con una mejor Capítulo 1 45 integridad mecánica. También estos autores expusieron que la efectividad del entrecruzamiento enzimático dependería de de las condiciones de acidez y actividad proteolítica existentes en la superficie del alimento a recubrir, como ya comentaron Mahmoud & Savello (1993). Larre et al. (2000) demostraron la eficacia de la TG microbiana para introducir enlaces covalentes en películas elaboradas a partir de almidón parcialmente desaminado. El establecimiento de esos enlaces covalentes induciría la formación de biopolímeros de elevado peso molecular, responsables de la mayor insolubilidad de los films tratados y la reducción de su hidrofobicidad superficial. Finalmente, Oh et al. (2004) utilizaron la TG microbiana para incorporar hidrolizados de zeína en la preparación de películas con proteínas de lactosuero o caseínas. Estos films presentaron una mayor elongación pero menor fuerza tensil, sin observarse modificaciones significativas en su permeabilidad al vapor de agua. Así pues, este entrecruzamiento con las moléculas de zeína mejoraría la flexibilidad de las películas de proteínas lácteas. Hasta el momento, no se tiene constancia de la realización de estudios de las propiedades de recubrimientos proteicos modificados mediante la adición de TG aplicados sobre alimentos. Capítulo 1 46 C. Ultrasonicación Los ultrasonidos pueden definirse como ondas acústicas inaudibles para el ser humano, con una frecuencia superior a 16 kHz (Benedito et al., 1995). La Figura 1.10 muestra el espectro de las ondas sonoras. Figura 1.10. Representación del espectro vibracional de las ondas sonoras. Generalmente, los ultrasonidos se clasifican en dos grupos según la cantidad de energía generada, la cual viene caracterizada por la potencia (W), intensidad (W/cm 2 ) o la densidad energética (W/m 3 ) (Dolatowski et al., 2007): a) Ultrasonidos de baja energía (alta frecuencia): Las aplicaciones de ultrasonidos de baja energía (baja potencia, baja intensidad) implican el uso de frecuencias por encima de 100 kHz a intensidades por debajo de 1 W/cm 2 (Mason & Luche, 1996; Villamiel & De Jong, 2000). Los ultrasonidos de baja intensidad utilizan un nivel de potencia tan bajo que las ondas ultrasónicas no causan alteraciones químicas ni físicas Capítulo 1 47 en las propiedades del material a través del cual pasa la onda, por lo que se denominan no-destructivas. La aplicación más extendida de los ultrasonidos de baja intensidad en la industria alimentaria es como técnica analítica para obtener información sobre las propiedades fisicoquímicas de los alimentos, informando sobre su composición, estructura y estado físico (McClements, 1995; Fellows, 2000; Mulet et al., 2002; Jayasooriya et al., 2004; Knorr et al., 2004). También se utilizan con éxito para controlar diversos procesos en la industria alimentaria como por ejemplo controlar el flujo de fluidos. Otras aplicaciones incluyen la estimulación de la actividad celular, la limpieza superficial de alimentos, el control de la actividad de enzimas, ayuda en procesos de extracción, cristalización, emulsificación, filtración, secado, procesos de congelación o de ablandamiento de la carne (Mason & Luche, 1996; Behrend & Schubert, 2001). b) Ultrasonidos de alta energía (baja frecuencia): Las aplicaciones de ultrasonidos de alta energía utilizan intensidades superiores a 1 W/cm 2 y frecuencias del rango entre 18 y 100 kHz (McClements, 1995; Povey & Mason, 1998; Villamiel & De Jong, 2000). Este tipo de ultrasonidos es capaz de alterar las propiedades del material a través del cual se transmiten debido al fenómeno de cavitación. La cavitación consiste en la formación, crecimiento e implosión de burbujas en un medio líquido (Suslick, 1990). Cuando los ultrasonidos se transmiten en un medio líquido, generan ondas de compresión y descompresión de manera cíclica. Durante la fase de descompresión, la presión negativa puede ser lo suficientemente intensa para vencer las fuerzas de atracción moleculares y provocar la formación de burbujas. El crecimiento de las mismas depende de Capítulo 1 48 la intensidad del tratamiento. A bajas intensidades, las burbujas formadas aumentan progresivamente de tamaño en los sucesivos ciclos de compresión y descompresión hasta alcanzar un tamaño crítico (tamaño de resonancia) a partir del cual experimentan un rápido crecimiento seguido de su implosión. Sin embargo, a elevadas intensidades ultrasónicas, las burbujas implosionan prácticamente de forma instantánea tras su formación. Según consideraciones teóricas se estima que en la implosión llegan a alcanzarse temperaturas próximas a los 5.000 ºC y presiones de 1.000 atmósferas (Flint & Suslick, 1991). La intensidad de la cavitación depende de las características del ultrasonido empleado (ej. frecuencia, intensidad), de las propiedades del producto sobre el que se aplica (ej. viscosidad, tensión superficial) y de las condiciones ambientales (ej. temperatura, presión) (Dolatowski et al., 2007). Durante la cavitación, las moléculas de agua pueden romperse generando radicales libres altamente reactivos (H 2 O  H• + •OH). Estos radicales hidroxilo generados sonoquímicamente pueden reaccionar fácilmente con compuestos susceptibles a la oxidación presentes en el alimento (Riesz & Kondo, 1992). Dependiendo del procesado y de la matriz alimentaria, los efectos de la cavitación acústica pueden ser, o bien beneficiosos, o bien perjudiciales. La actividad de los antioxidantes en los alimentos y sistemas biológicos es dependiente del grado de hidroxilación. La formación de radicales es considerada una desventaja a la hora de preservar la actividad biológica de compuestos como los fenoles (Wan et al., 2005). Sin embargo, los radicales pueden mejorar la actividad antioxidante de otros componentes como flavonoides, al incrementar el grado de hidroxilación (Ashokkumar et al., 2008). Finalmente, cabe destacar que para aquellas aplicaciones en las que la formación de radicales hidroxilo afecta negativamente la integridad del Capítulo 1 49 alimento, es preferible la utilización de ultrasonidos de baja frecuencia. Esto se debe a que, como se ha señalado recientemente, los ultrasonidos de alta frecuencia generan una mayor cantidad de radicales (Soria & Villamiel, 2010). Su utilización en la industria alimentaria se ha sugerido para aplicaciones tan diferentes como la preparación de emulsiones, el control y modificación de procesos de cristalización de grasas y azúcares, el ablandamiento de la carne, la desgasificación de alimentos líquidos, la promoción de reacciones de oxidación, la mejora de procesos de filtración o deshidratación de alimentos, la inactivación o extracción de microorganismos y enzimas, para la inducción de reacciones de oxidación, o pueden ser utilizados para homogeneizar, debido a su capacidad para reducir el tamaño de partícula (Roberts, 1993; McClements, 1995; Benedito et al., 1996; Knorr et al., 2004; Zheng & Sun, 2006). El efecto de los ultrasonidos de alta intensidad sobre las propiedades funcionales de las proteínas ha sido poco estudiado. En general, las propiedades funcionales de las proteínas (ej. propiedades organolépticas, interfaciales, enzimáticas o reológicas, entre otras), que son de gran interés para la industria farmacéutica, alimentaria y cosmética, están influenciadas por la estructura molecular proteica, la cual determina las interacciones intra e intermoleculares (McClements, 1995). La ultrasonicación provoca cambios estructurales en las proteínas, a través de diversos efectos mecánicos, térmicos y/o químicos, que dan lugar a modificaciones de las propiedades funcionales de las mismas (Gülseren et al., 2007). Claramente, el grado de cambio estructural en las proteínas a Capítulo 1 56 envuelta más uniforme o de un espesor muy fino, el procedimiento recomendado es la pulverización (Donhowe & Fennema, 1994; Grant & Burns, 1994; Cutter & Sumner, 2002). Debido a la alta presión aplicada en este método (0,41-0,55 MPa), se requiere un menor gasto de solución formadora de película para obtener recubrimientos uniformes (Tharanathan, 2003). Con relación a la aplicación indirecta, se requiere la elaboración previa de películas independientes con el grosor y textura deseadas. Además, éstas deben ser firmes y poseer la flexibilidad suficiente para poder envolver adecuadamente el alimento (Donhowe & Fennema, 1994; Cutter & Sumner, 2002). Debe señalarse que las películas formadas independientemente pueden presentar características diferentes respecto a las envueltas creadas directamente sobre la superficie de los alimentos (Pavlath & Orts, 2009). A nivel industrial, las películas preformadas pueden fabricarse según las técnicas empleadas comúnmente para ciertos materiales y para las películas no comestibles, tales como la extrusión, el moldeado o el laminado (Guilbert & Biquet, 1995). Cuando un polímero se aplica sobre una superficie o matriz, en nuestro caso a un alimento, existen dos fuerzas que operan, una se genera entre las moléculas del polímero formadoras de la película (cohesión) y la otra, entre la película y el sustrato (adhesión). El grado de cohesión afecta a propiedades de la película o recubrimiento, tales como: la densidad, compactación, porosidad, permeabilidad, flexibilidad y fragilidad de la película. De esta forma, una cohesión estructural elevada se traduce en una reducción de la flexibilidad, de la porosidad y de la permeabilidad a los gases y a los solutos (Guilbert & Capítulo 1 57 Biquet, 1995). La cohesión depende de la estructura química del biopolímero, del proceso de elaboración, parámetros empleados (temperatura, presión, tipo de solvente y dilución, técnica de aplicación, procedimiento de eliminación del solvente, etc.), presencia de plastificantes, agentes ligantes y del espesor final de la película. La adhesión del recubrimiento sobre la superficie del alimento depende principalmente de la afinidad entre ambos, la cual viene determinada por su naturaleza y no por el método de aplicación. El uso de sustancias, como los tensoactivos en su formulación, puede permitir la adhesión del recubrimiento a la superficie de un producto por el que presentaba una baja o nula afinidad (Debeaufort et al., 1998). Capítulo 1 58 II. El salmón congelado: alteraciones durante su almacenamiento 1.7. Generalidades del salmón del Atlántico La demanda de pescado ha aumentado de manera continua desde principios de la década de los noventa debido al incremento en el consumo per cápita a nivel mundial. Este incremento se debe a sus efectos beneficiosos sobre la salud (FAO, 2010). La producción global de captura de pescado y acuicultura alcanzó cerca de 142 millones de toneladas de pescado en el 2008, dando un consumo per cápita anual de 17,1 kg de peso vivo de pescado (FAO, 2010). Según esta organización, la actual demanda de pescado será duplicada en unos 20 años debido a la necesidad de proporcionar dietas más saludables (con mayor contenido de grasas insaturadas y menos saturadas). El salmón es uno de productos pesqueros comercializados más importantes en términos de valor y en el año 2008 representaba el 12,1% del valor total de los productos pesqueros comercializados internacionalmente, sólo por detrás del camarón que supuso un 15,4% ( FAO, 2010). En España el consumo de pescado en el hogar en 2010 se situó en 706 millones de Kg, con un consumo per cápita de 15,36 Kg/persona de los cuales 0,73 Kg/persona corresponderían al salmón (MARM, 2011). La mayor parte del salmón consumido en nuestros mercados procede de las importaciones de Capítulo 1 59 Noruega y en menor medida de Escocia, siendo prácticamente la totalidad del salmón consumido en España salmón atlántico. Desde el punto de vista nutricional, las especies marinas poseen un elevado contenido de nutrientes importantes para la dieta humana como proteínas de elevado valor nutricional y buena digestibilidad, vitaminas liposolubles (A y D), minerales (I, F, Ca, Cu, Zn, Fe, Se, etc.) y ácidos grasos poliinsaturados omega-3 (Simopoulos, 1997). El 90% de los ácidos grasos poliinsaturados que componen los lípidos en el pescado está constituido por ácido eicosapentaenoico (EPA) y el ácido docosahexaenoico (DHA) (Ackman & Ratnayake, 1992). El nivel de ácidos grasos en el pescado depende de la especie, de la distribución de grasa en el pescado y la temporada del año (Flick et al., 1992; Harris & Tall, 1999). El término omega-3, desde el punto de vista químico, significa que el primer enlace doble en el carbono de la cadena principal ocurre en el tercer enlace carbono-carbono contando desde el extremo opuesto al grupo acídico. La nomenclatura omega (“ω”) es utilizada por los nutricionistas para referirse a los ácidos grasos poliinsaturados que tienen entre 18 y 22 átomos de carbono. La composición química de los lípidos del pescado difiere de otras grasas y aceites naturales en lo siguiente: 1) poseen una mayor variedad de compuestos grasos, 2) poseen mayores cantidades de ácidos grasos con cadenas que exceden los 18 carbonos, 3) contienen una mayor porción de ácidos grasos altamente insaturados, 4) sus ácidos grasos poliinsaturados poseen el doble enlace principalmente en la posición ω3 antes que en la ω6 (Harris & Tall, 1999). Capítulo 1 60 Sin embargo, desde un punto de vista tecnológico, la oxidación de estos ácidos grasos poliinsaturados supone una pérdida de calidad en el pescado. Los compuestos de oxidación lipídica, resultantes del enranciamiento enzimático y no enzimático, promueven la aparición de aromas desagradables y la pérdida de nutrientes esenciales (Harris & Tall, 1999; Kolakowska, 2003). Los pescados pueden clasificarse en función de su contenido graso: - Pescados magros o blancos: con un contenido en grasa inferior al 2%, aportan entre 50-80 kcal/100gr (bacalao, rape, lenguado). - Pescados semigrasos: el contenido graso se sitúa entre 2-7%, y el valor energético es de 80-160 kcal/100gr (trucha, gallineta). - Pescados grasos o azules: superan el 5% de grasa pudiendo llegar hasta un 28%, y el valor calórico está entre 160-200 kcal/100gr (caballa, sardina, chicharro). A este grupo también pertenecería el salmón del Atlántico. El salmón común o del Atlántico (Salmo salar) (Figura 1.12) pertenece a la familia Salmonidae, del orden Salmoniformes. Esta familia comprende varios géneros: Salmo (salmón del Atlántico, trucha), Oncorhynchus (salmones del Pacífico: rosa, sockeye, coho, chum, cherry y chinook), Hucho (salmón del Danubio), Salvelinus (trucha alpina) y Brachyumystax. A pesar de pertenecer a la misma familia, los salmones del Pacífico presentan mucho menor contenido lipídico que los del Atlántico. Esta familia se encuentra entre los pescados más apreciados, debido al delicado sabor de su carne rosada, y se les captura tanto en los ríos (donde constituye el objeto de una apasionante modalidad de pesca deportiva) como en el mar. También se crían Capítulo 1 61 artificialmente en jaulas. Los salmones son anádromos, ya que el desove, eclosión de los huevos y su primera alimentación se realizan en agua dulce; pero aproximadamente al año de edad son capaces de vivir en agua salada, regresando más adelante al agua dulce para el desove (Pike et al., 1990). Figura 1.12. Salmón del atlántico (Salmo salar). Uno de los aspectos más destacables de la carne de salmón es su perfil lipídico, el cual se caracteriza por su elevado contenido en ácidos grasos de alto grado de insaturación, particularmente el ácido 5,8,11,14,17eicosapentaenoico (ω3 20:5) (EPA) y el ácido 4,7,10,13,16,19docosahexaenoico (ω3 22:6) (DHA), ambos omega-3. Además, es el único de los pescados grasos disponibles para nuestro consumo que aporta más DHA que EPA (Valenzuela, 2005). El salmón se caracteriza por tener un sabor característico, el cual se cree que está asociado a sus componentes lipídicos, mientras que el aroma a salmón está asociado a compuestos del tipo alquil-furanoides (Durnford & Shahidi, 1998). El tradicional color rosado de su carne, frecuentemente considerado un parámetro de calidad y de aceptación por parte del consumidor, se debe, además de a las hemoproteínas, a su alto contenido en pigmentos carotenoides (Figura 1.13), siendo la astaxantina el mayoritario y encontrándose también Capítulo 1 62 cantaxantina, β-caroteno, luteína, tunaxantina y zeaxantina en pequeñas cantidades (Andersen et al., 1990; Sheehan et al., 1998). Figura 1.13. Representación de la estructura química de algunos carotenoides presentes en la carne de salmón. En la naturaleza, los carotenoides son sintetizados por algas y bacterias, llegando a los peces a través de la cadena alimentaria (Torrissen et al., 1989). Los peces de vida silvestre disponen de múltiples fuentes de carotenoides: crustáceos, algas y peces de inferior tamaño, entre otros, los cuales actúan como organismos acumuladores. Sin embargo, para los salmónidos criados en cautividad, es necesario suplementar su dieta con carotenoides (Schiedt & Liaaen-Jensen, 1995). Normalmente se utiliza una combinación de astaxantina y cantaxantina en las dietas, puesto que así se obtiene una mejor pigmentación Capítulo 1 63 que cuando se usan por separado. A pesar de que la cantaxantina proporciona una buena pigmentación, el uso de astaxantina aporta una coloración de mayor intensidad a similares concentraciones (Storebakken & No, 1992). Además, la astaxantina se deposita en el músculo con mayor eficacia, debido probablemente a una mejor absorción en el tracto digestivo (Torrisen et al., 1989). Estudios preliminares propusieron que los carotenoides estaban unidos a la actomiosina en el músculo del salmón, sin embargo posteriormente se identificó a la α-actinina como la principal proteína de unión con la astaxantina (Ojagh et al., 2010). Así pues, el grado de desnaturalización proteica en el músculo de salmón es importante no solo por su efecto en las propiedades texturales, sino también por su relación con el desarrollo de importantes cambios de color (Ojagh et al., 2010). 1.8. Conservación del pescado en congelación y alteraciones durante su almacenamiento El pescado fresco es un alimento con un elevado contenido de agua biológicamente activa, un pH próximo a la neutralidad y un gran número de sistemas enzimáticos, todos estos factores hacen que se deteriore muy rápidamente. Las mayores causas de alteración son el crecimiento microbiano, la actividad enzimática y las reacciones químicas que se originan por interacciones entre nutrientes o con otros componentes (Navarro, 1991). El método más utilizado para conservar los productos pesqueros, desde su captura hasta la llegada al consumidor, es la aplicación del frío. En función de la temperatura empleada se puede clasificar al pescado en refrigerado, congelado y ultracongelado (Fennema, 1993). El objetivo principal de la Capítulo 1 64 congelación del pescado es impedir el crecimiento de microorganismos, retardar los fenómenos de degradación interna del pescado y conseguir que después de descongelado no se aprecien modificaciones respecto a las características que tenía en estado fresco. Sin embargo, numerosas experiencias demuestran que la oxidación e hidrólisis lipídicas se siguen produciendo durante el almacenamiento en estado congelado. La congelación y el almacenamiento del pescado en congelación es uno de los métodos más utilizados para mantener las propiedades sensoriales y nutritivas del pescado (Erickson, 1997). Esto se debe a que es un excelente método de conservación, ya que inhibe la actividad de microorganismos patógenos y alterantes (efecto bacteriostático), a la vez que ralentiza las reacciones bioquímicas y enzimáticas que se producen en el pescado fresco (Flick, et al., 1992; Fennema, 1993). Estos efectos se deben al descenso de la temperatura y a la reducción de la actividad de agua debido a la congelación de la misma y a la consecuente concentración de las sustancias en el agua restante. Así pues, a temperaturas inferiores a -18 ºC el crecimiento microbiano se inhibe (aunque los microorganismos siguen vivos) y las reacciones bioquímicas se ralentizan, pero como se ha comentado anteriormente, siguen produciéndose a lo largo del almacenamiento. Aunque la congelación es un buen medio de conservar el pescado, ha de tenerse en cuenta que no mejora la calidad del producto, la cual dependerá de la calidad que presenta la materia prima antes de la congelación y de otros factores que intervienen durante la congelación, el almacenamiento y la distribución (FAO, 1977). Capítulo 1 65 Las principales alteraciones que dan lugar a la pérdida de calidad en el pescado durante su almacenamiento en congelación y posterior descongelación son: la alteración lipídica (por hidrólisis y oxidación); cambios en la textura (debidos a la desnaturalización proteica y que desembocan en el endurecimiento de la carne, en un descenso de la capacidad de retención de agua y en mayores pérdidas por goteo); cambios en el color (decoloración por degradación de pigmentos, por desnaturalización proteica o por deshidratación) y desecación superficial (quemadura por congelación). Así mismo, parámetros como la velocidad de congelación, la temperatura y duración del almacenamiento, y el procedimiento de descongelación, son factores que afectan a la calidad final del producto (Einen et al., 2002). Los efectos de la alteración lipídica son importantes en las especies grasas, observándose que éstas tienen un tiempo de vida útil inferior a las magras, llegándose a demostrar en la práctica que la formación de productos de oxidación es el factor limitante del tiempo de vida útil de las especies de pescado de elevado contenido graso almacenadas en congelación (Fennema, 1993). Por tanto, debido al elevado contenido graso del salmón, y más concretamente por su elevado contenido en ácidos grasos poliinsaturados, la alteración predominante durante el almacenamiento en congelación sería la rancidez debida a la oxidación lipídica. 1.8.1 Alteración de la textura El músculo de pescado congelado que ha sido almacenado pierde algunas propiedades funcionales, tales como capacidad de emulsificación, capacidad de enlazamiento con los lípidos, capacidad de retención de agua y capacidad de formar gel. La principal causa de estos cambios está establecida Capítulo 1 72 2. PROPAGACIÓN: En esta segunda etapa el radical alquilo libre formado (R•) se combina con el oxígeno para formar un radical peroxi (ROO•). Este radical, a su vez, puede sustraer un átomo de hidrógeno de otro carbono alílico de otro ácido graso insaturado para formar un hidroperóxido (ROOH) y un nuevo radical libre. 3. TERMINACIÓN: La terminación ocurre cuando dos radicales libres (R•) reaccionan entre sí generando productos no reactivos y más estables, como por ejemplo las cetonas. Otra vía de terminación de la autooxidación es aquella en que cualquier clase de radical libre alquílico (R•) reaccione con un radical libre peroxi (ROO•) dando lugar a una especie relativamente estable, no-iniciadora y no-propagadora. De forma similar dos radicales libres alquílicos ROO• pueden unirse también (De Man, 1999), como se muestra en las siguientes reacciones: Capítulo 1 73 Los productos primarios de la autooxidación son los hidroperóxidos. Éstos se caracterizan por ser compuestos inestables que se descomponen en los productos secundarios de la oxidación: compuestos carbonílicos, hidrocarburos, furanos substituidos, alcoholes, aldehídos (malondialdehído, nonanal, octanal, pentanal y hexanal), entre otros (Lewis-McCrea & Lall 2007). Estos compuestos son los responsables de la rancidez organoléptica en los alimentos (Pike, 2003) y representan una pérdida significativa de calidad, debido al descenso del contenido en ácidos grasos poliinsaturados (Aidos et al., 2003b). Los métodos de determinación de la oxidación lípídica se dividen en aquéllos que miden los productos primarios y aquéllos que miden los productos secundarios (Melton 1983; Gray et al., 1996). Entre los productos primarios de la oxidación que se miden se encuentran los hidroperóxidos y los dienos conjugados. Los peróxidos se descomponen fácilmente en productos secundarios, por lo que es mejor evaluar también los productos secundarios como los aldehídos, con métodos como el de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (SRATB). Capítulo 1 74 Existen varios factores que modulan la autooxidación y el grado de rancidez oxidativa, tanto intrínsecos, propios del tejido, o extrínsecos, provenientes del ambiente y condiciones que rodean al alimento. Uno de los más importantes es la temperatura de almacenamiento. La velocidad de las reacciones de oxidación aumenta con incremento de temperatura. Por el contrario, al bajar la temperatura al alimento se reducen las reacciones de oxidación de lípidos mediante la inmovilización de agentes catalíticos y el retardo de los cambios de post-sacrificio (Hultin, 1994). También la naturaleza del ácido graso y su grado de instauración afectan a la oxidación de lípidos en el pescado. Cuanto mayor sea el grado de instauración del ácido graso, mayor será la probabilidad de que se produzca la autooxidación (Harris & Tall, 1999). Finalmente, la presencia de metales de transición (como el hierro o el cobre), ya sean de la composición del pescado, provenientes del agua o equipos de proceso, pueden acelerar las reacciones de oxidación, al funcionar como activadores primarios de uno de los sustratos de la oxidación de lípidos en el pescado, el oxígeno molecular. Capítulo 1 75 III. Aplicaciones de las envueltas comestibles en pescados y otros productos de origen marino congelados Los factores más importantes que determinan la vida útil de los productos de origen marino incluyen la autolisis, causada por enzimas autolíticas, la actividad metabólica de los microorganismos y la oxidación. El deterioro autolítico depende de parámetros como el pH, la disponibilidad de oxígeno y las condiciones fisiológicas del pescado antes de su captura. El contenido en grasa de los animales marinos puede variar desde un 1% (ej.: bacalao, abadejo) hasta un 30% (ej.: arenque, caballa). Los productos con un alto contenido graso presentan una mayor tendencia a enranciarse, debido a su alto contenido en ácidos grasos poliinsaturados, lo que provoca la aparición de la rancidez en las características organolépticas del producto. Por tanto, disminuyendo el contacto entre el producto y el oxígeno se puede reducir el grado de deterioro autolítico, a la vez que se inhibe el crecimiento de microorganismos aerobios, como bacterias relacionadas con los procesos de putrefacción (Huss et al., 1995) y se controlan los procesos de enranciamiento. Las reacciones de deterioro que tienen lugar durante el almacenamiento de los alimentos congelados son principalmente de naturaleza química, incluyendo la degradación de vitaminas y pigmentos, la oxidación lipídica y la desestabilización de proteínas (Petersen et al., 1999). En consecuencia, los requerimientos de los materiales de envasado para productos congelados incluyen propiedades de barrera a la luz y al oxígeno para proteger frente a la oxidación. Por otro lado, la pérdida de humedad puede provocar la aparición de quemaduras de congelación (por sublimación), empeora la apariencia visual Capítulo 1 76 del producto y puede llevar a pérdidas de peso del producto inaceptables (Petersen et al., 1999). Por este motivo, se requiere una elevada barrera al vapor de agua por parte de los envases para reducir la pérdida de humedad y con ello la aparición de quemaduras por congelación (Robertson, 1993; Christophersen et al., 1992; Bak et al., 1999). Por lo tanto los requerimientos críticos para los envases de pescado congelado estarían relacionados con tres propiedades: barrera de humedad, barrera para el oxígeno y protección mecánica (Haugaard et al., 2001). Dentro de los problemas involucrados en la pérdida de calidad del pescado se encuentran la pérdida de humedad, la oxidación de lípidos, la desnaturalización de proteínas y, consecuentemente, la reducción de la capacidad de retención de agua, y el deterioro de textura, aroma, sabor y color. De acuerdo con Gennadios et al. (1997), la aplicación de recubrimientos comestibles al pescado y productos pesqueros podría ser de gran ayuda en la mejora de la calidad de los mismos por las siguientes razones: A. Las envueltas comestibles con buenas propiedades barrera podrían ayudar a solucionar el problema de la pérdida de humedad que se produce durante el almacenamiento del pescado, fresco o congelado. Esta pérdida provoca cambios en la textura, flavor y color, a la vez que reduce el peso del producto para la venta. B. Los envases comestibles pueden retener los jugos, previniendo los exudados y mejorando la presentación de los productos, eliminando a su vez la necesidad de utilizar sustancias absorbentes en, por ejemplo, las bandejas con filetes. Capítulo 1 77 C. Envueltas con baja permeabilidad al oxígeno podrían reducir la oxidación lipídica causante del enranciamiento y la alteración del color debida a la oxidación de los pigmentos. D. La aplicación de envueltas calentadas podrían reducir la carga microbiana e inactivar parcialmente las enzimas proteolíticas presentes en la superficie del alimento. E. Podrían limitar las pérdidas de compuestos volátiles o evitar la captación de aromas indeseables. F. Podrían utilizarse envueltas comestibles activas, que transportasen sustancias beneficiosas como antioxidantes o antimicrobianos, que mejorasen la calidad y vida útil de los productos. G. Finalmente, también podrían mejorar el valor nutricional de los alimentos al reducir la cantidad de aceite que absorbe el producto durante la fritura. Por otro lado, hay que tener en cuenta las posibles desventajas de los envases proteicos para ese tipo de productos. Por una parte, las proteínas de la envuelta pueden ser susceptibles a las enzimas proteolíticas presentes en los alimentos. Además en términos de aceptación por parte del consumidor y requisitos de etiquetado, deben tenerse en cuenta posibles reacciones adversas frente a algunas proteínas con potencial alergénico como las proteínas de leche, huevo, cacahuete y soja, entre otras (Gennadios et al., 1997). Los recubrimientos y películas comestibles elaborados a partir de polisacáridos (quitosano, goma xantán), lípidos (monoglicéridos acetilados) y proteínas (gelatina, proteínas de lactosuero, soja, albúmina, gluten) se han Capítulo 1 78 aplicado con éxito para prolongar la vida útil y mantener la calidad de diversos productos de la pesca y acuicultura refrigerados y congelados (Tabla 1.1). Tabla 1.1. Aplicaciones recientes de envueltas comestibles a diversos productos de la pesca y la acuicultura refrigerados y congelados. Conservación Producto Base polimérica Otros Referencia Refrigeración Camarón Quitosano Simpson et al., 1997 Tilapia Gelatina Ác. benzoico Ou et al., 2001 Arenque/Bacalao Quitosano Jeon et al., 2002 Gelatina Quitosano Salmón atlántico Quitosano Souza et al., 2010 Trucha arcoiris Quitosano Aceite de canela Ojagh et al., 2010 Monoglicéridos acetilados Caseinatos Caseína-monoglicéridos acetilados Proteínas de lactosuero Quitosano Ovoalbúmina Conc. proteico de soja Harina de pescado Proteínas de lactosuero Proteínas de soja Proteínas de fletán del Pacífico Salmón rosado Quitosano Sathivel et al., 2007 Salmón rosado Hidrolizado proteico de la piel de abadejo Sathivel et al., 2008 Carpa plateada Quitosano Fan et al., 2009 Gluten Goma xantán Harinas de trigo y maíz Refrig. y Cong. Bacalao largo Quitosano Vitamina E Duan et al., 2010 Sardinas ahumadas Orégano / romero Gómez-Estaca et al., 2007 Congelación Salmón plateado Hirasa, 1991 Salmón real Stuchell & Krotcha, 1995 Salmón rosado Sathivel, 2005 Salmón rosado Ambardekar, 2007 Trucha arcoiris Kilincceker et al., 2009 Capítulo 1 79 Lípidos: Glicéridos y glicéridos acetilados Se ha estudiado el recubrimiento de filetes de salmón plateado mediante inmersión en disoluciones de monoglicéridos acetilados (Myvacet, marca comercial de un preparado a partir de grasa vegetal hidrogenada), obteniéndose menores pérdidas de humedad e inferiores valores de peróxidos en comparación con los filetes control no recubiertos, durante el almacenamiento en congelación a -10 ºC (Hirasa, 1991). Tras 10 semanas en congelación, el contenido en humedad relativa de las muestras envueltas sólo disminuyó hasta un 97%, mientras que en las muestras control descendió hasta un 83,4%. Sin embargo, el tratamiento con los monoglicéridos acetilados no es tan efectivo como el envasado a vacío en bolsas plásticas a la hora de reducir la pérdida de humedad y retardar la oxidación lipídica. También se estudió la eficacia de recubrimientos compuestos elaborados con Myvacet, caseinato cálcico e hidroxipropilmetilcelulosa en el salmón congelado (Hirasa, 1991). Las muestras recubiertas presentaron contenidos de humedad ligeramente superiores a las no recubiertas, pero valores similares de hidroperóxidos. Las envueltas con caseinato sódico fueron más flexibles, pero a su vez más permeables al oxígeno y al vapor de agua que las envueltas elaboradas con Myvacet exclusivamente. Stuchell & Krotcha (1995) estudiaron los efectos de envueltas preparadas con monoglicéridos acetilados exclusivamente o con aislado de proteína de lactosuero, sobre la pérdida de humedad y la oxidación lipídica, en filetes de salmón real almacenadas a -23 ºC. Tanto aplicados solos como con Capítulo 1 80 aislado de lactosuero, redujeron la tasa de pérdida de humedad a un 42-65%, durante las 3 primeras semanas de almacenamiento en congelación. Además, el inicio de la oxidación lipídica fue retrasado en el tiempo y los valores de peróxido encontrados fueron menores. Polisacáridos: Almidón y derivados del almidón En los años 60, se comercializaron envueltas comestibles elaboradas con almidones hidroxipropilados bajo la marca comercial Ediflex (Anon., 1967). Estos envases se idearon para su uso en carne congelada, aves y pescado. Se caracterizaban por ser flexibles, transparentes, impermeables al oxígeno y solubles en agua. Presumiblemente, estas películas protegerían los productos durante el almacenamiento en congelación y se disolverían durante el descongelado y cocinado. Sin embargo no se han encontrado estudios científicos que demuestren la eficacia de los almidones hidroxipropilados como protectores de los alimentos congelados (Gennadios et al., 1997). Alginatos Durante los años 50 se comercializó en Noruega un proceso en el que pescados grasos congelados como la caballa o el arenque eran protegidos de la rancidez oxidativa mediante la aplicación de recubrimientos de alginatos gelificados con cationes calcio (Glicksman, 1969). Earle & Snyder (1966) también desarrollaron un método para proteger productos de origen marino de la deshidratación y la oxidación lipídica durante el almacenamiento en congelación, utilizando dispersiones acuosas de Capítulo 1 81 alginato sódico y almidón o dextrinas, e incorporando también aceite vegetal a la mezcla para mejorar los resultados. Productos como las gambas o la caballa tratados con este método mantuvieron su textura, color y flavor originales durante 3 meses almacenados en congelación. También se han aplicado envueltas elaboradas con alginatos comerciales (Flavor-Tex) sobre el salmón plateado y el pargo colorado congelados a -18 ºC (Ijichi, 1978), obteniéndose una menor oxidación lipídica y menores pérdidas por goteo en comparación con los controles no envueltos. En términos de pérdida de humedad, no se encontraron diferencias significativas entre las piezas envueltas y las glaseadas con agua. Carragenatos Se ha estudiado el empleo de carragenatos para prolongar la vida útil de pescados grasos durante su almacenamiento en congelación (Stoloff et al., 1948). Filetes de caballa se recubrieron por inmersión en soluciones acuosas de carragenato, que evitaron cambios sensoriales importantes durante 5 meses a -18 ºC, mientras que los controles sin envuelta fueron inaceptables para el consumo tras sólo 3 meses. También se realizaron pruebas adicionando ajo o ácido ascórbico a las envueltas de carragenato, retrasando el deterioro hasta el séptimo u octavo mes de almacenamiento en congelación. Dextrano Envueltas de dextrano aplicadas en forma de disoluciones acuosas o dispersiones se han utilizado para recubrir gambas sin pelar (Toulmin, 1956a), Capítulo 3 89 Capítulo 3 Material y métodos × Materiales 3.1. Aparatos de laboratorio La destilación del agua, necesaria para realizar las extracciones y para las disoluciones acuosas, se realizó en un aparato “Millipore” modelo Rios 5. Las pesadas de precisión se realizaron en una balanza analítica de “A & D Instruments” modelo HR-120. Para las pesadas ordinarias se empleó una balanza electrónica “Heraeus” modelo ADP 360. La carne obtenida de los salmones se trituró en una picadora “Moulinex”. La homogenización de las muestras y su mezcla con disolventes para diversas determinaciones se efectuaron en un aparato Polytron mod. 15/30 PT, dotado de un vástago modelo PTA 20 TS (Kinematica Ag Littan-Luzern). El pH de las muestras de carne fue medido con un medidor de pH “Crison” mod. GLP-21 y un electrodo de penetración “Hanna instruments”. El envasado a vacío de las piezas de salmón para la determinación de pérdidas por goteo y cocinado se realizó en una envasadora “Stephan Alval” mod. 190. El cocinado de las muestras para una parte del análisis sensorial se realizó con un microondas doméstico Moulinex FM2530Q (850 W). Capítulo 3 90 El hielo empleado para el baño hielo-agua necesario para el enfriamiento de las muestras en diversas determinaciones lo proporcionó la máquina de hielo “Servamatic”. La lectura de las absorbancias en las determinaciones de hidroperóxidos y del índice SRATB se obtuvieron en un espectrofotómetro “Zuzi” mod. UV4210. En la determinación del extracto seco se empleó una estufa “Indelab”. Para la determinación de cenizas se empleó un horno mufla “Heraeus” electronic. Para determinar los parámetros físicos de color se empleó un espectrocolorímetro marca “X-Rite”, modelo SP60. La centrifugación, necesaria para la extracción de la grasa de las diversas muestras y para la determinación de hidroperóxidos, se realizó en una centrífuga refrigerada “Hettich”, modelo Universal 16R equipada con un rotor angular modelo TT1616. Las muestras se conservaron en frigoríficos “Lynx” y arcones de congelación “Superser” y “Lynx”, a una temperatura de -20 ºC, y “Liebherr" a -10 ºC. Los tratamientos con ultrasonidos de las disoluciones de ciertos recubrimientos se realizaron en un baño de ultrasonidos digital de la marca Bandelin, modelo Sonorex Digital DK512 P (frecuencia de 35 kHz) con una potencia de ultrasonidos de 820 W. Capítulo 3 91 Se ha utilizado también material general de laboratorio: desecadores, baños termostatizados, agitadores, pinzas, tijeras, etc. 3.2. Reactivos, disolventes y gases Todos los productos químicos utilizados en este trabajo fueron de calidad analítica, suministrados por Panreac, Fluka y Sigma. El nitrógeno utilizado para evaporar el disolvente orgánico fue suministrado por Air Liquide. 3.3. Material biológico 3.3.1 Salmón del Atlántico Los salmones del Atlántico (especie Salmo salar) utilizados en los experimentos procedían de una granja de cría en cautividad de Noruega y fueron adquiridos en el mercado local. 3.3.2 Productos proteicos Para la elaboración de los recubrimientos comestibles, se utilizaron productos comerciales en polvo de tres tipos de proteínas (proteínas de lactosuero, de soja y ovoalbúmina): 1. Concentrado de proteínas del lactosuero (CPS): El producto empleado fue “Protarmor 800”, de Armor Protéines (Francia), un concentrado de proteínas del lactosuero con un contenido proteico del 80% y una composición proteica donde la β-lactoglobulina es la mayoritaria (Tabla 3.1 y Tabla 3.2). Capítulo 3 92 Tabla 3.1. Composición química de “Protarmor 800” Composición Humedad (%) 4,0 Proteína (%) 80,0 Grasa (%) 3,5 Cenizas (%) 3,5 Lactosa (%) 9,0 pH (disolución 10% p/v) 6,5 Tabla 3.2. Composición proteica de “Protarmor 800” Proteínas % β-lactoglobulina 63 α-lactoalbúmina 11 Inmunoglobulina G 4 BSA 3 Glucomacropéptido 3 Lactoferrina 1 Otras 15 Capítulo 3 93 2. Aislado de proteínas del lactosuero (APS): El producto empleado fue “Isolate whey 90”, de Armor Protéines (Francia), que tenía un contenido proteico mínimo del 90% (Tabla 3.3). Tabla 3.3. Composición química de “Protarmor Isolate whey 90” Composición Humedad (%) 4,5-5,5 Proteína (%) 91,0 Grasa (%) 0,5 Cenizas (%) <3 Lactosa (%) 2,0 pH (dis.10% p/v) 6-6,5 3. Concentrado de proteínas de soja (SOJA): El producto empleado fue “Procon 2100 IP” de The Solae Company (EEUU), un concentrado con un 68% de proteína de soja (Tabla 3.4). Tabla 3.4. Composición química de “Procon 2100 IP” Composición % Humedad (máx.) 7,5 Proteína (mín.) 68,0 Grasa (máx.) 1,5 Cenizas (máx.) 7,5 Capítulo 3 94 4. Proteínas de huevo (OVO): El producto empleado fue un preparado comercial de ovoalbúmina purificada con el 80% de proteína de Eurovo (Italia) (Tabla 3.5). Tabla 3.5. Composición química de “Eurovo ovoalbúmina purificada” Composición % Humedad (máx.) 8,0 Proteína (mín.) 80,0 Grasa (máx.) 1,2 Carbohidratos <0,1 3.3.3 Transglutaminasa Finalmente, para la modificación enzimática de ciertas envueltas se utilizó la enzima transglutaminasa de origen microbiano del producto comercial ACTIVA TM WM (Ajinomoto Co.), conteniendo 1% de enzima y 99% de maltodextrina (estabilizante), la cual se obtuvo de Impex Química S.A. (Barcelona). Según el fabricante la actividad enzimática de ACTIVA WM es de 100 U/g (U: cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de substrato por minuto). Capítulo 3 95 × Metodología 3.4. Preparación de los filetes de salmón: Los salmones (Salmo salar) se adquirieron ya eviscerados y descabezados, siendo conservados en hielo hasta su posterior utilización. Una vez en el laboratorio, a los especímenes se les retiró manualmente la piel, y con ayuda de un bisturí, se cortó cada ejemplar en dos lomos siguiendo el eje céfalo-caudal, retirándoseles también la espina central y la aleta caudal. Posteriormente se filetearon en piezas de unos 180-200 g quedando así preparados para su posterior utilización. 3.5. Preparación de las envueltas: 3.5.1 Preparación de las envueltas con distinta base proteica En base a la bibliografía consultada y a pruebas preliminares se procedió a la selección de ciertas variables (concentración de proteína en la disolución, tipo de plastificante y proporción del mismo, tratamiento térmico de desnaturalización empleado, pH y realización o no de filtración) para la preparación de las formulaciones de los recubrimientos. Las envueltas que se aplicaron sobre el pescado congelado se prepararon a partir de disoluciones acuosas de los distintos tipos de proteínas, con dos proporciones de dos plastificantes (glicerol y sorbitol) o sin su adición, ajustando el pH en función del tipo de proteína y con diferentes tratamientos térmicos según el caso (Tabla 3.6). En ningún caso fue necesario Capítulo 3 96 realizar la filtración de las soluciones. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Tabla 3.6. Parámetros en la elaboración de las envueltas TIPO PROTEÍNA %PROT pH PLASTIFICANTE (PROT/PLAST) TRATAMIENTO SIN - 1:1 SORBITOL 2:1 1:1 CPS 8% SIN AJUSTE GLICEROL 2:1 TÉ RMICO (80 ºC/30min) SIN - 1:1 SORBITOL 2:1 1:1 OVO 7,2% 10,5 GLICEROL 2:1 TÉRMICO (45 ºC/20min) SIN - 1:1 SORBITOL 2:1 1:1 SOJA 3,1% 10 GLICEROL 2:1 TÉ RMICO (70 ºC/20min) De manera general el protocolo seguido en la elaboración de estas envueltas se representa en la Figura 3.1. Capítulo 3 97 AGITACIÓN ADICIÓN PLASTIFICANTE AGITACIÓN DISOLUCIÓN PROTEÍNA 20 ºC/30 min Sorbitol (1:1,2:1) Glicerol (1:1,2:1) 20 ºC/30 min CPS: 8% OVO: 7,2% SOJA: 3,1% TRATAM. TÉRMICO CPS: 80 ºC/30min OVO: 45 ºC/20min SOJA: 70 ºC/20min CPS: sin ajuste OVO: 10,5 SOJA: 10 AJUSTE DE pH ENFRIAMIENTO Baño agua-hielo AGITACIÓN ADICIÓN PLASTIFICANTE AGITACIÓN DISOLUCIÓN PROTEÍNA 20 ºC/30 min Sorbitol (1:1,2:1) Glicerol (1:1,2:1) 20 ºC/30 min CPS: 8% OVO: 7,2% SOJA: 3,1% TRATAM. TÉRMICO CPS: 80 ºC/30min OVO: 45 ºC/20min SOJA: 70 ºC/20min CPS: sin ajuste OVO: 10,5 SOJA: 10 AJUSTE DE pH ENFRIAMIENTO Baño agua-hielo Figura 3.1. Representación del protocolo de elaboración de las envueltas para el estudio del empleo de recubrimientos de distinta base proteica. 1. Envueltas con proteína de lactosuero (CPS): Se prepararon soluciones acuosas con una concentración del 8% de proteína (p/p). Una vez disuelta la proteína mediante agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente (20 ºC), se adicionó el plastificante correspondiente en la proporción prevista, procediéndose a continuación a su agitación durante otros 30 minutos. En el caso de las soluciones sin plastificante, éstas se agitaron durante un tiempo total de una hora. El pH de las soluciones era de 6,1-6,2. Posteriormente, todas las disoluciones, se sometieron a un tratamiento térmico de 80 ºC durante 30 minutos, seguido de un enfriamiento en un baño agua-hielo, para detener el efecto del tratamiento térmico. Capítulo 3 104 Una vez preparados los filetes de salmón, la aplicación de las envueltas se llevó a cabo en todos los casos por el método de inmersión, realizándose ésta antes o después de la congelación, según el caso: a) Aplicación de los recubrimientos antes de la congelación: las piezas de salmón en fresco se sumergieron durante 60 segundos en la disolución, tras lo cual se dejaron escurrir brevemente (15 segundos) y se introdujeron en bolsas plásticas de congelación (zip-lock), procediéndose a continuación a su congelación a -20 ºC, en el caso de los estudios de las envueltas con distinta base proteica, o a -10 ºC, en los estudios del efecto de distintos tratamientos (térmico, ultrasonicación y enzimático). b) Aplicación de los recubrimientos tras la congelación: las piezas de salmón fresco se introdujeron en bolsas plásticas de congelación y se dejaron en un congelador a -20 ºC durante 48 horas. Una vez transcurrido ese tiempo, los filetes, ya perfectamente congelados, se sumergieron durante 30 segundos en la disolución, tras lo cual se dejaron escurrir brevemente (15 segundos) y se introdujeron en bolsas plásticas de congelación, procediéndose a continuación a su almacenamiento a -20 ºC. El menor tiempo de inmersión aquí aplicado responde al intento de evitar una descongelación superficial de los filetes, la cual se producía si se aplicaba durante más tiempo. Como muestras de referencia o control en todos los estudios, se utilizaron piezas de salmón a las que no se les aplicó ningún tipo de envuelta, denominándose sin envuelta. En el caso de la aplicación de las envueltas tras el congelado en el estudio de las envueltas con distinta base proteica, también se incluyeron Capítulo 3 105 muestras glaseadas para su comparación. El glaseado se aplicó también mediante la inmersión de los filetes de salmón congelados en agua destilada refrigerada a 5 ºC siguiendo el mismo protocolo empleado en la aplicación de las envueltas proteicas tras la congelación. Una vez aplicadas las envueltas, las piezas de salmón introducidas en las bolsas de polietileno de congelación se almacenaron en congeladores durante 4 meses, mantenidos a una temperatura de –20 ºC, en el caso del estudio de las distintas bases proteicas (CPS, OVO, SOJA) y de -10 ºC en el caso del estudio de los distintos tratamientos (calentamiento, adición de transglutaminasa o ultrasonicación) en proteínas de lactosuero (CPS y APS). La conservación a una mayor temperatura en este último caso tendría como objetivo estudiar el comportamiento de las envueltas sobre el salmón en condiciones que promoviesen una mayor oxidación lipídica. Una vez completado el periodo de almacenamiento, las muestras se sacaron del congelador, dejándose en una cámara frigorífica a 5 ºC durante 22 horas para su total descongelación. Una porción de cada filete descongelado (de unos 30 g) se sometió a un proceso de cocinado (90 ºC/5 minutos) y otra porción (de otros 30 g) se reservó para el almacenamiento en refrigeración (5 ºC/24 horas). Las determinaciones realizadas a lo largo del proceso y representadas en la Figura 3.4 fueron las siguientes: Capítulo 3 106 En el salmón fresco: × Determinación del peso inicial de los filetes en fresco × Determinación del color y pH inicial × Determinación del contenido de extracto seco, cenizas y lípidos del salmón inicial × Determinación de los índices de oxidación lipídica del salmón inicial En el salmón congelado al inicio del almacenamiento en congelación: × Determinación del peso inicial de los filetes congelados En el salmón congelado al término del almacenamiento en congelación: × Determinación del peso final de los filetes congelados × Determinación del color de los filetes congelados tras el almacenamiento En el salmón descongelado: × Determinación del peso de los filetes descongelados × Determinación del color y pH de los filetes descongelados tras el almacenamiento × Determinación del contenido de extracto seco, cenizas y lípidos tras el almacenamiento 11 22 33 44 Capítulo 3 107 × Determinación de los índices de oxidación lipídica tras el almacenamiento En el salmón descongelado cocinado: × Determinación del peso tras el cocinado × Determinación del contenido de extracto seco × Determinación del color de los filetes cocinados En el salmón descongelado almacenado en refrigeración: × Determinación del peso tras el almacenamiento en refrigeración 3.7. Determinaciones fisicoquímicas 3.7.1 Rendimiento • Objetivo: Determinar los rendimientos (ganancias de peso) de las piezas congeladas tras la aplicación de la envuelta y posterior congelación. • Método: Las piezas de salmón se pesaron en fresco y tras 24 horas de congelación ya con la envuelta. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado. El rendimiento se expresa como el porcentaje que supone el peso de la pieza una vez envuelta respecto al peso inicial de la pieza (Sathivel, 2005). Peso filete envuelto congelado inicial Rendimiento (%) = x100 Peso en fresco sin envuelta 55 66 Capítulo 3 108 3.7.2 Rendimiento tras descongelar • Objetivo: Determinar los rendimientos de las piezas una vez descongeladas. • Método: Las piezas de salmón se pesaron en fresco y tras su descongelación, al cabo de cuatro meses de almacenamiento en congelación. Las piezas congeladas se sacaron del congelador y se mantuvieron en refrigeración (5 ºC) durante 22 horas. Transcurrido este tiempo, se sacaron de las bolsas de polietileno y se dejaron en una rejilla durante 2 minutos para eliminar el agua superficial. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado. El rendimiento al descongelar se expresa como el porcentaje que supone el peso de la pieza descongelada respecto al peso inicial de la pieza (Sathivel, 2005). Peso filete envuelto descongelado Rendimiento tras descongelar (%) = x100 Peso en fresco sin envuelta 3.7.3 Pérdidas por goteo al descongelar • Objetivo: Determinar las pérdidas por goteo de las piezas al descongelarse. • Método : Las piezas de salmón se pesaron congeladas tras el almacenamiento durante cuatro meses y tras su descongelación, siguiendo el procedimiento descrito en el apartado anterior. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado. El cálculo se realiza mediante la expresión descrita por Sathivel (2005), que expresa estas pérdidas como el porcentaje que supone la diferencia de peso entre la pieza congelada tras el almacenamiento y tras descongelarla, respecto al peso congelado. Capítulo 3 109 Pérdidas por goteo (Peso filete envuelto cong. - Peso filete envuelto descong.) al descongelar (%) = x100 Peso filete envuelto congelado 3.7.4 Pérdidas por goteo tras almacenamiento en refrigeración • Objetivo: Determinar las pérdidas de líquido por goteo tras el almacenamiento en refrigeración. • Método: Para realizar esta prueba, se aplicó la técnica recomendada por Honikel & Hamm (1994). Se tomaron muestras de los filetes descongelados de unos 30 g aproximadamente, de forma cúbica, estos trozos se atravesaron con un hilo y se introdujeron en una bolsa de polietileno, posteriormente cerrada herméticamente dejando parte del hilo fuera de ésta. Seguidamente, utilizando el hilo como sujeción, se suspenden las bolsas en el interior de una cámara frigorífica a 2ºC, donde se dejaron durante 24 horas. Una vez transcurrido el tiempo, se pesaron, secándolas previamente con un papel de filtro pero sin ejercer presión sobre la muestra, para eliminar el agua superficial adherida. Las pérdidas por goteo se obtienen por diferencia de pesos antes y después del periodo de refrigeración. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado. Los resultados se expresan como el porcentaje de peso perdido respecto al peso inicial de la muestra. Pérdidas por goteo (Peso inicial - Peso tras refrigeración) tras almacenamiento (%) = x100 Peso inicial Capítulo 3 110 3.7.5 Pérdidas por cocinado • Objetivo: Determinar las pérdidas de líquido por goteo tras el cocinado. • Método: Para esta determinación se siguió el procedimiento descrito por Sathivel (2005). Se pesaron muestras de aproximadamente 30 g de filete de salmón descongelado (de forma cúbica) en una balanza de precisión. Una vez pesadas las muestra, se introdujeron en una bolsa de polietileno, posteriormente cerrada a vacío y se sumergieron en un baño con agua a 90 ºC durante 5 minutos. Transcurrido ese tiempo, se enfriaron en un baño de agua-hielo y posteriormente se dejaron atemperar a temperatura ambiente. Finalmente las muestras se pesaron, secándolas previamente con un papel de filtro, pero sin ejercer presión sobre la muestra. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado. El resultado de esta técnica se expresa como el porcentaje que supone el peso perdido en el cocinado respecto del peso inicial de la muestra. (Peso inicial - Peso tras cocinado) Pérdidas por cocinado (%) = x100 Peso inicial 3.7.6 pH • Objetivo: Determinar el pH interno del pescado en fresco y tras la descongelación posterior al almacenamiento en congelación. • Método: El pH se midió introduciendo el electrodo de penetración en las muestras de salmón, efectuándose la determinación en tres puntos distintos de cada una de ellas. Capítulo 3 111 3.7.7 Extracto seco • Objetivo: Determinar el contenido en extracto seco en el salmón fresco y en los filetes una vez descongelados tras el periodo de almacenamiento en congelación y tras su posterior cocinado. • Método: Se realizó por desecación en estufa a 110 ºC hasta peso constante (AOAC, 1995). La experiencia se realizó por triplicado, siendo el resultado final la media aritmética de los tres valores. Se tomó aproximadamente 1 g de muestra (carne previamente picada) en cada cápsula de porcelana tarada, previamente secada en estufa y enfriada en un desecador hasta temperatura ambiente. Las cápsulas se introdujeron en la estufa a 110 ºC hasta peso constante. A continuación se enfriaron en un desecador hasta temperatura ambiente y se pesaron. El valor del extracto seco se expresó en % (g/100 g de carne). 3.7.8 Cenizas • Objetivo: Determinar el contenido de la fracción mineral (cenizas) en las muestras del pescado en fresco y tras la descongelación posterior al almacenamiento en congelación. • Método: Se realizó por pesada tras la incineración de la muestra a 550 ºC en un horno mufla (AOAC, 1995). Se tomaron las cápsulas y muestras utilizadas para la determinación del extracto seco, por lo que la experiencia se realizó por triplicado, siendo el resultado final la media aritmética de los tres valores. El contenido de cenizas se expresó en % (g/100 g de carne). Capítulo 3 112 3.7.9 Contenido lipídico • Objetivo: Cuantificar el contenido lipídico de la carne de las distintas muestras del pescado en fresco y tras la descongelación posterior al almacenamiento en congelación. • Método: Se determinó por el método de Hanson & Olley (1963) usando butilhidroxitolueno (BHT) como antioxidante. Los lípidos se cuantificaron gravimétricamente. Para ello, en un tubo de vidrio de centrífuga se homogeneizó una cantidad conocida de muestra (aproximadamente 20 g) con una mezcla de disolventes compuesta por 20 ml de cloroformo y 20 ml de metanol y se añadió una punta de espátula del antioxidante. Tras la homogeneización, se le añadió a la mezcla otros 20 ml de cloroformo y se volvió a homogeneizar durante unos 30 segundos. Por último, se adicionó 20 ml de agua destilada y se homogeneizó de nuevo durante otros 30 segundos. La mezcla final se centrifugó a 15 ºC (3600 rpm durante 10 minutos), obteniéndose una clara separación trifásica con la capa de metanol-agua arriba, el tejido en el centro y la fase clorofórmica (donde están disueltos los lípidos) en el fondo. La capa superior se retiró por succión con una pipeta Pasteur, el tejido fue apartado cuidadosamente y de la capa inferior se recogieron 20 ml de cloroformo que se filtraron a través de lana de vidrio lavada impregnada con cloroformo/metanol (2/1) (v/v) y con sulfato sódico anhidro. El extracto lipídico se obtuvo evaporando los disolventes mediante corriente de nitrógeno en un baño a una temperatura de 40 ºC, manteniéndose posteriormente a vacío y en oscuridad en un desecador hasta pesada constante de la muestra. Para la determinación del contenido en grasa se Capítulo 3 113 tuvo en cuenta que el volumen de disolventes recuperados (20 ml) sólo rinde la mitad de la grasa presente en la muestra. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado. El resultado se expresó en % (g/100 g de carne). 3.7.10 Extracto seco magro • Objetivo: Determinar el contenido en extracto seco magro, para evitar interferencias del contenido graso en el extracto seco. • Método: Una vez se hubieron determinado tanto el contenido de extracto seco como el contenido lipídico, el contenido de extracto seco magro se calculó mediante la diferencia entre ambos valores. 3.7.11 Parámetros de color • Objetivo: Determinar el color superficial del pescado en cuatro momentos distintos: en fresco, congelado, tras descongelar y tras su cocinado. • Método: La medida instrumental del color se realizó por triplicado sobre las piezas de salmón. La Comisión Internacional de la Iluminación (Commission International de l`EclairageCIE) ha definido uno de los sistemas más importante y más usados en la actualidad para la descripción del color, basado en el uso de observadores y fuentes de iluminación estándar (Giese, 1995), el denominado espacio CIE L*a*b* (CIE, 1976). La ventaja de utilizar este espacio de color estriba en su similitud con la trivarianza visual humana (los conos del ojo humano son sensibles al rojo, verde o azul). El sistema obtiene los valores triestímulo CIE en relación con el espectro visible, definiendo tres colores primarios: rojo (X), verde (Y) y azul (Z). A partir de ellos se calculan matemáticamente las Capítulo 3 120 una temperatura próxima a 0 ºC, o en una cámara de congelación a -20 ºC, según el caso, hasta el momento del análisis. Las pruebas sensoriales se realizaron sobre filetes de salmón congelados, descongelados y cocinados (cocidos, fritos y a la plancha). El cocinado de las muestras se llevó a cabo siguiendo la metodología recomendada por el Codex Alimentarius (1999) (CAC/GL 31-1999). Para el cocinado de las muestras se utilizó agua hirviendo para la cocción, y aceite de girasol para la fritura y la plancha, sin añadir sal o ningún otro ingrediente a las muestras. Los procesos de cocinado se realizaron de manera que se alcanzase una temperatura final interna de las muestras de 68 ºC durante aproximadamente 5 minutos. Las pruebas de evaluación sensorial utilizadas fueron elegidas por el propio panel sensorial, seleccionando dos pruebas de discriminación (una prueba triangular y otra de comparación por parejas), una prueba de aceptación mediante la utilización de una escala específica y empleando una muestra de referencia, y una prueba de aceptación utilizando una escala hedónica. Para la realización de estas pruebas se siguieron las normas descritas por AENOR (2010): UNE-ISO 4121-2006: Análisis sensorial. Metodología. Evaluación de los productos alimentarios por métodos que utilizan escalas; UNE-ISO 87006:1992. Análisis sensorial. Metodología. Prueba triangular; UNE-ISO 87005:1992. Análisis sensorial. Metodología. Prueba de comparación por parejas. Capítulo 3 121  Prueba triangular: Condiciones generales de la prueba: la prueba triangular permite determinar si existen diferencias significativas entre las muestras presentadas para un atributo en particular. El procedimiento seguido se basó en la norma UNE 87-006-92 (AENOR, 2010). Las muestras se sometieron a un proceso de fritura y se presentaron al panel las muestras con el recubrimiento mencionado y muestras sin envuelta. Los atributos sometidos a evaluación fueron los siguientes: • Aspecto general: donde se evaluaron la consistencia y el color de los filetes. • Examen directo: donde fueron evaluados el olor, la textura y el sabor de los filetes. Desarrollo de la prueba: el panel estaba formado por siete catadores entrenados en evaluación sensorial de productos de la pesca y acuicultura; a cada catador se le presentó de modo simultáneo un juego de muestras (formado por tres muestras previamente codificadas con un número de tres cifras elegido al azar y de acuerdo con una de las combinaciones siguientes: ABB, AAB, ABA, BAA, BBA, BAB) (Figura 3.5). Cada catador procedió entonces a la evaluación de las muestras identificando, mediante la comparación de las muestras, aquella muestra desemparejada para el atributo dado. De acuerdo a los objetivos buscados, se empleó la técnica de “juicio forzado”, donde la opción “no existen diferencias” no se permitió. Capítulo 3 122 Una vez que cada catador realizó la prueba, la dirección del equipo evaluador procesó los resultados obtenidos para la aplicación del consiguiente tratamiento de datos. Figura 3.5. Ejemplos de juegos de muestras presentados a los catadores en la prueba triangular.  Prueba de Comparación por parejas: Condiciones generales de la prueba: este tipo de prueba permite determinar si existen diferencias significativas entre las muestras presentadas para un atributo en particular. El procedimiento seguido se basó en la norma UNE 87-005-92 (AENOR, 2010). Se consideró que la situación se ajustaba al Modelo Bilateral (Norma UNE 87-005-92) (AENOR, 2010), es decir, que las diferencias entre las muestras pueden manifestarse en cualquiera de las dos direcciones, sin que podamos presuponer si una de las muestras presenta un atributo de forma más pronunciada que la otra. Las muestras con envuelta y las glaseadas utilizadas en la prueba se sometieron a un proceso de cocción. Capítulo 3 123 Los atributos sometidos a análisis fueron: aspecto general, color, olor, sabor y textura. Las preguntas formuladas para cada uno de los atributos fueron: - ¿Cuál de estas dos muestras presenta un aspecto general más agradable/característico? - ¿Cuál de estas dos muestras presenta un color más agradable/característico? - ¿Cuál de estas dos muestras presenta un olor más agradable/característico? - ¿Cuál de estas dos muestras presenta un sabor más agradable/característico? - ¿Cuál de estas dos muestras presenta una textura más agradable/característica)? Desarrollo de la prueba: en un panel formado por siete catadores entrenados en evaluación sensorial de productos de la pesca y acuicultura, a cada catador se le presentaron las muestras de manera simultánea con el fin de que seleccionase, mediante la comparación entre ellas, la muestra que presentase el atributo más pronunciado, permitiendo la opción “no existen diferencias”. Una vez realizada la prueba, la dirección del equipo evaluador procesó los resultados obtenidos para la posterior aplicación del tratamiento de datos.  Prueba de aceptación mediante la utilización de una escala específica y empleando una muestra de referencia: Capítulo 3 124 Condiciones generales de la prueba: de acuerdo con los objetivos buscados, se decidió realizar un análisis organoléptico mediante la utilización de una escala específica y una muestra de referencia (muestra sin envuelta). La escala empleada fue de 0 a 3, donde 0 el valor de menor intensidad/aceptabilidad y 3 representa el valor de mayor intensidad/aceptabilidad, a través de la cual fueron puntuados cada uno de los atributos que a continuación se indican: • Aspecto general: donde se evaluaron el aspecto general de la muestra, el color y la consistencia (este último sólo en muestras descongeladas y cocinadas ―cocidas y fritas―, no en congeladas). • Examen directo: donde fueron evaluados el olor de la muestra (en muestras congeladas y descongeladas) y la textura y sabor de los filetes (en muestras cocinadas). Desarrollo de la prueba: En un panel formado por ocho catadores entrenados en evaluación sensorial de productos de la pesca y acuicultura, a cada catador se le presentó de modo simultáneo un juego de muestras formado por una pieza de la muestra recubierta y una pieza de la muestra referencia (Figura 3.6), con el objetivo de que el catador puntuase en una ficha de cata, cada uno de los atributos, bajo su propio criterio. Una vez realizada la prueba, la dirección del equipo evaluador procesó los resultados obtenidos para la posterior aplicación del tratamiento de datos. Capítulo 3 125 A B C D Figura 3.6. Ejemplos de juegos de muestras presentados a los catadores en la prueba de aceptación empleando una muestra de referencia (A: congelado, B: descongelado, C: cocido, D: frito).  Prueba de Aceptación mediante la utilización de una escala hedónica: Condiciones generales de la prueba: Se decidió realizar un análisis organoléptico del producto en tres formas de presentación distintas: descongelado, cocido y a la plancha. Para ello se evaluaron distintos atributos en cada una de estas presentaciones a través de una escala hedónica de Capítulo 3 126 intensidad de 5 puntos, puntuando cada uno de los atributos de 1 a 5, de acuerdo con la escala indicada a continuación: 1 2 3 4 5 Muy desagradable Desagradable Ni agradable, ni desagradable Agradable Muy agradable • Aspecto general producto descongelado: en este caso, los atributos evaluados fueron los siguientes: - Examen visual: aspecto general, color de los filetes y grado de liberación de agua. - Examen directo: olor y textura del producto. • Producto cocido: en este caso, los atributos evaluados fueron los siguientes: - Examen visual: aspecto general y color de los filetes. - Examen directo: olor, sabor y textura del producto. • Producto a la plancha: en este caso, los atributos evaluados fueron los siguientes: - Examen visual: aspecto general y color de los filetes. - Examen directo: olor, sabor y textura del producto. Desarrollo de la prueba: en un panel formado por nueve catadores entrenados en evaluación sensorial de productos de la pesca y acuicultura, a cada catador se le presentó de modo simultáneo un juego de cada una de las Capítulo 3 127 presentaciones (Figura 3.7) de la muestra con el fin que la persona consultada puntuase en una ficha de cata bajo su propio criterio cada atributo. Una vez que cada catador realizó la prueba, la dirección del equipo evaluador procesó los resultados obtenidos para la aplicación del consiguiente tratamiento de datos. A B C Figura 3.7. Ejemplos de juegos de muestras presentados a los catadores en la prueba de aceptación (A: descongelada, B: cocida y C: a la plancha). 3.8.2. Análisis sensorial de muestras de salmón recubiertas con CPS o APS+glicerol sometidas a tratamiento de ultrasonicación La evaluación sensorial de las muestras de salmón atlántico con recubrimientos sometidos a distintos tratamientos de ultrasonicación se llevó a cabo utilizando una prueba afectiva cuantitativa, tal y como describen Meilgaard et al. (1999), incluida dentro de las pruebas de aceptación por consumidores. Capítulo 3 128 Los tratamientos por ultrasonidos se seleccionaron considerando los recubrimientos elaborados a partir de disoluciones de concentrado de proteínas (CPS) y de aislado de proteínas de suero (APS) (+glicerol en proporción proteína:plastificante 2:1) que proporcionaron la mejor protección al producto, principalmente en lo que ser refiere a la oxidación lipídica y otros parámetros de calidad (APS sonicado 15 minutos y CPS sonicado 60 minutos). También se evaluaron muestras sin envuelta y muestras glaseadas, que actuaron como controles. El panel de consumidores estuvo integrado por un total de 23 jueces no entrenados, consumidores habituales de este producto, con edades comprendidas entre los 20 y los 50 años, de los que 16 eran hombres y 7 mujeres, reclutados entre el personal y los estudiantes de la Facultad de Ciencias de Lugo. Las sesiones de evaluación sensorial se realizaron en grupos de 2-3 personas con un tiempo medio de unos 15 minutos por catador. Las muestras de salmón, de aproximadamente 30 g de peso, se cocinaron en un horno microondas doméstico a potencia máxima (850 W) durante 30 segundos, siendo inmediatamente presentadas por separado a cada uno de los jueces y en orden aleatorio previamente determinado. Las muestras se codificaron utilizando códigos de tres dígitos elegidos al azar con ayuda de una tabla de números aleatorios (Meilgaard et al., 1999). Durante la realización de la prueba, los catadores dispusieron de agua y pan sin sal para eliminar el sabor dejado por la muestra anterior. Antes de realizar la prueba se les explicó detalladamente las experiencias que iban a realizar. Durante las mismas, se entregaron las hojas de respuesta a cada juez, en las que se explicaban las instrucciones para realizar los análisis y expresar sus resultados. Capítulo 3 129 La prueba consistió en una prueba de aceptación, en la que se utilizó una escala hedónica bipolar de nueve puntos (1= no me gusta nada; 9= me gusta muchísimo) y en la que a cada juez se le pidió que evaluase el color y el olor del producto sin probarlo, y después el sabor y la textura, además de solicitarle que diera una puntuación global de la muestra. Con esta prueba se pretendía obtener datos que pudieran relacionarse con los obtenidos en la evaluación analítica de parámetros como los rendimientos, el color o los índices de oxidación, de manera que se pudiera establecer si las diferencias observadas analíticamente también se reflejaban a nivel de consumidor. 3.9. Análisis estadístico Los resultados experimentales obtenidos se analizaron mediante un análisis de varianza de una vía (one-way ANOVA), con tres replicas y con un nivel de significancia del 5%. Este análisis permite comprobar si existen diferencias entre promedios de tres o más tratamientos y para ello calcula el valor de F. El valor de F sólo indica si existen diferencias entre los grupos, pero no nos dice entre cuales. Cuando el análisis de la varianza determinó la existencia de diferencias significativas entre los grupos, se utilizó el test post hoc DMS o LSD (diferencias menos significativas) a nivel de p<0,05 para determinar qué lotes eran significativamente diferentes. La comparación de medias entre las muestras recubiertas antes y después de la congelación, entre el uso de glicerol y sorbitol y la comparación de medias entre las muestras con CPS y APS, se realizó mediante un t-test para muestras independientes, con unos niveles de significancia del 5, 1 y 0,1%. Los resultados de estos t-test asumen que las varianzas de las dos muestras a comparar son iguales, por lo Capítulo 7 232 Muestras Congeladas Concentrado proteico de suero Sin envuelta 58,79 ± 4,90b 16,25 ± 1,91b 13,22 ± 1,31a 53,77 ± 5,33a Calentadas 54,89 ± 1,59ab 14,03 ± 2,45ab 11,62 ± 2,63a 51,30 ± 2,82a Calentadas+TG 53,72 ± 1,97a 15,25 ± 1,18ab 12,64 ± 1,28a 49,65 ± 2,46a Ultrasonicadas 54,98 ± 1,44ab 13,32 ± 0,51a 10,86 ± 0,56a 51,80 ± 1,35a Ultrasonicadas+TG 54,09 ± 1,65ab 14,34 ± 0,98ab 11,71 ± 0,80a 50,49 ± 1,99a Aislado proteico de suero Sin envuelta 58,79 ± 4,90b 16,25 ± 1,91b 13,22 ± 1,31b 53,77 ± 5,33a Calentadas 56,91 ± 0,91ab 12,01 ± 0,51a 9,83 ± 0,32a 54,20 ± 0,69a Calentadas+TG 55,66 ± 0,66ab 12,64 ± 1,48a 10,48 ± 1,42a 52,69 ± 1,13a Ultrasonicadas 54,26 ± 2,07a 12,07 ± 0,51a 10,03 ± 0,53a 51,64 ± 2,05a Ultrasonicadas+TG 55,85 ± 0,99ab 12,65 ± 0,29a 10,73 ± 0,57a 52,84 ± 1,12a A ns *** ** * Descongeladas Concentrado proteico de suero Sin envuelta 42,44 ± 2,51a 17,30 ± 1,89b 18,76 ± 4,28b 36,97 ± 4,05a Calentadas 46,52 ± 0,69c 12,73 ± 0,63a 10,61 ± 1,06a 44,01 ± 0,93b Calentadas+TG 45,82 ± 0,46bc 12,09 ± 0,35a 10,22 ± 0,30a 43,56 ± 0,44b Ultrasonicadas 44,46 ± 1,02ac 12,76 ± 0,23a 12,65 ± 0,36a 41,62 ± 1,09b Ultrasonicadas+TG 43,92 ± 0,59ab 12,85 ± 0,44a 12,16 ± 0,63a 41,19 ± 0,51b Aislado proteico de suero Sin envuelta 42,44 ± 2,51a 17,30 ± 1,89c 18,76 ± 4,28b 36,97 ± 4,05a Calentadas 51,51 ± 0,12b 12,41 ± 0,60b 12,80 ± 0,87a 48,33 ± 0,47b Calentadas+TG 50,60 ± 0,62b 12,42 ± 0,26b 12,79 ± 0,39a 47,48 ± 0,43b Ultrasonicadas 49,95 ± 1,04b 14,21 ± 0,65a 14,64 ± 0,73a 45,95 ± 1,33b Ultrasonicadas+TG 50,13 ± 0,43b 12,85 ± 0,47ab 13,34 ± 0,49a 46,80 ± 0,63b A *** ns *** *** Cocinadas Concentrado proteico de suero Sin envuelta 69,63 ± 1,19a 15,02 ± 0,69a 17,36 ± 1,85a 61,92 ± 1,99a Calentadas 73,84 ± 1,13b 13,40 ± 1,23bc 14,90 ± 1,12ab 67,04 ± 1,89c Calentadas+TG 74,07 ± 1,19b 12,84 ± 0,85b 14,63 ± 1,42b 67,57 ± 1,91c Ultrasonicadas 71,13 ± 1,95a 14,44 ± 0,85ac 17,11 ± 1,16a 63,45 ± 2,05ab Ultrasonicadas+TG 73,49 ± 0,46b 13,15 ± 0,32bc 15,60 ± 1,06ab 66,54 ± 0,92bc Aislado proteico de suero Sin envuelta 69,63 ± 1,19a 15,02 ± 0,69b 17,36 ± 1,85b 61,92 ± 1,99a Calentadas 74,07 ± 1,33b 10,92 ± 0,74a 14,31 ± 0,17ba 68,43 ± 1,25b Calentadas+TG 74,86 ± 0,72b 10,82 ± 1,09a 14,19 ± 0,47a 69,16 ± 0,95b Ultrasonicadas 75,95 ± 0,27b 10,25 ± 0,79a 13,40 ± 0,51a 70,62 ± 0,56b Ultrasonicadas+TG 74,39 ± 1,78b 11,12 ± 0,24a 13,24 ± 0,11a 69,10 ± 1,60b A ** *** *** *** A: empleo de concentrado proteico de suero vs aislado; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; ns: no significativo (p≥0,05) a,b,c,d: medias con diferentes letras en cada columna son significativamente diferentes (p<0,05) Tratamientos: calentamiento (80 ºC/30 min.); ultrasonicación (50%/30 min.); adición de transglutaminasa (TG: 10 unidades/g proteína) Tabla 7.4. Parámetros de color de los filetes recubiertos con CPS o APS sometidos a diversos tratamientos antes de su congelación, tras 4 meses de almacenamiento a -10 ºC. Valores de las muestras congeladas, descongeladas y cocinadas (media ± desviación estándar). L* a* b* Blancura Capítulo 7 233 destacar que no se observa influencia clara del tratamiento (calentamiento o ultrasonidos) ni de la adición de TG en el color de las muestras congeladas. A diferencia de los pescados con envuelta de los capítulos anteriores (4, 5 y 6), los pescados descongelados procedentes de muestras con envueltas calentadas o sonicadas presentan unos parámetros de color parecidos al del pescado fresco (Tabla 7.1), sobre todo las envueltas con CPS sonicadas. Tanto en los filetes con CPS como en los de APS, las muestras descongeladas sin envuelta presentaron valores de L* y blancura menores y de a* y b* significativamente superiores que los descritos para los filetes con envuelta, cualesquiera que fuera su tratamiento. Este resultado coincide con lo observado en el Capítulo 4 para la formulación CPS+glicerol 2:1 en muestras recubiertas antes de la congelación. De manera similar que en el congelado, no se observa influencia significativa del tratamiento (calentamiento o ultrasonidos) ni de la adición de TG en el color de las muestras descongeladas, tanto con CPS como con APS, aunque hay una tendencia a que las muestras con envueltas ultrasonicadas tengan valores de L* y blancura inferiores y a* y b* mayores que las muestras con recubrimientos calentados. En los filetes cocinados, no se observa influencia destacable del tratamiento (calentamiento o ultrasonidos) ni de la adición de TG en el color de las muestras cocinadas recubiertas con APS. En los filetes con recubrimientos CPS, sólo es destacable un menor valor de L* y de blancura y mayor de b* en las muestras ultrasonicadas sin TG en relación al resto de muestras tratadas, no habiendo influencia clara en el resto de parámetros de color ni del tipo de tratamiento ni de la adición de TG. En relación a las Capítulo 7 234 muestras cocinadas procedentes de muestras sin envuelta, tanto el calentamiento como la ultrasonicación de los recubrimientos proteicos origina un mayor valor de L* y blancura y menor de a* y b* en los pescados cocinados. El tipo de producto proteico empleado (CPS o APS) en la elaboración de la envuelta afecta al color de los filetes. Los filetes congelados correspondientes a las muestras con CPS presentaron valores significativamente superiores de a* (p<0,001) y b* (p<0,01) que las APS, por lo que la variación de color en los filetes congelados en relación al color del pescado congelado sin recubrimiento es menor cuando empleamos CPS en la preparación de las envueltas. Tras la descongelación de los filetes, aquellos con APS presentaron mayores valores de L*, blancura y b* (p<0,001) en relación con los de CPS. Así pues, también en los descongelados, los filetes con CPS presentan una menor variación del color con respecto al pescado descongelado sin envuelta. Finalmente, tras el cocinado los filetes con CPS presentan valores significativamente menores de L* (p<0,01) y blancura (p<0,001) y mayores de a* y b* (p<0,001). 7.5. Índices de oxidación. Los valores medios (± desviación estándar) correspondientes a los indicadores de oxidación obtenidos por el valor del índice valor de peróxidos y el valor de las sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (SRATB) se muestran en la Tabla 7.5. También se indican los niveles de significación para los distintos parámetros, al comparar estadísticamente los datos obtenidos, Capítulo 7 235 Concentrado proteico de suero Sin envuelta 3,75 ± 0,82a 18,63 ± 1,29b 2,91 ± 0,72b 14,40 ± 0,91c Calentadas 2,85 ± 0,31a 14,85 ± 0,86ab 1,78 ± 0,27a 9,24 ± 0,62b Calentadas+TG 2,82 ± 0,69a 13,03 ± 2,95a 1,65 ± 0,26a 7,62 ± 1,12a Ultrasonicadas 2,89 ± 0,57a 13,95 ± 2,75a 1,58 ± 0,06a 7,64 ± 0,26a Ultrasonicadas+TG 3,13 ± 0,53a 15,38 ± 2,79ab 1,58 ± 0,07a 7,75 ± 0,66a Aislado proteico de suero Sin envuelta 3,75 ± 0,82a 18,63 ± 1,29a 2,91 ± 0,72b 14,40 ± 0,91b Calentadas 3,18 ± 0,24a 15,26 ± 1,73a 1,96 ± 0,03a 9,39 ± 0,52a Calentadas+TG 3,52 ± 0,86a 15,05 ± 3,79a 2,00 ± 0,38a 8,57 ± 1,75a Ultrasonicadas 3,25 ± 0,53a 15,38 ± 2,09a 1,76 ± 0,14a 8,36 ± 0,42a Ultrasonicadas+TG 3,24 ± 0,54a 15,83 ± 2,67a 1,88 ± 0,25a 9,17 ± 1,25a A ns ns ** * a,b,c,d: medias con diferentes letras en cada columna son significativamente diferentes (p<0,05) SRATB: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (2): meq de cumene/kg carne; (3): meq de cumene/kg lípidos (4): mg de malondialdehído/kg carne; (5): mg de malondialdehído/kg lípidos Tratamientos: calentamiento (80 ºC/30 min.); ultrasonicación (50%/30 min.); adición de transglutaminasa (TG: 10 unidades/g proteína) (3) (4) (5) Tabla 7.5. Indicadores de la oxidación lipídica (media ± desviación estándar) de los filetes de pescado recubiertos con CPS o APS sometidos diversos tratamientos, tras 4 meses de almacenamiento en congelación a -10 ºC. A: empleo de concentrado proteico de suero vs aislado; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; ns: no significativo (p≥0,05) Muestras Valor de peróxidos Valor de SRATB (2) Capítulo 7 236 contrastando además la utilización de concentrado o aislado proteico de lactosuero. Los peróxidos vienen expresados en miliequivalentes de cumene por kg de carne o de lípidos y los compuestos secundarios (SRATB) en mg de malondialdehído por kg de carne o de lípidos. Los valores medios de peróxidos en las muestras con CPS (Tabla 7.5) fluctuaron entre 2,82 y 3,13 meq de cumene por kg de carne, no encontrándose diferencias significativas (p≥0,05) entre las distintas muestras. Al expresar los datos respecto al contenido en grasa los valores oscilaron entre 13,03 y 15,38 meq de cumene por kg de lípidos, siendo las muestras con las envueltas calentadas+TG y las ultrasonicadas las que presentaron menores contenidos (p<0,05) respecto al resto de muestas. Por su parte, los filetes con APS (Tabla 7.5) presentaron valores entre 3,18 y 3,52 meq de cumene por kg de carne y entre 15,05 y 15,83 meq de cumene por kg de lípidos, tampoco observándose diferencias significativas entre las muestras con envuelta. Comparando los filetes con recubrimientos con los filetes sin envuelta, los valores de peróxidos de estos últimos (3,75 meq de cumene por kg de carne y 18,63 meq de cumene por kg de lípidos, respectivamente) fueron superiores a los de los salmones con cobertura. En el caso de las envueltas con CPS, los filetes sin envuelta presentaron diferencias significativas con algunos de los que tenían recubrimiento cuando se expresaron en meq de cumene por kg de lípidos. Sin embargo al utilizar APS, aunque los filetes sin envuelta obtuvieron un mayor contenido de peróxidos, no hubo diferencias significativas. Stuchell & Krochta (1995) tampoco obtuvieron reducciones significativas en los niveles de peróxidos en el salmón envuelto al utilizar una solución calentada de aislado de proteínas de lactosuero sin más añadidos, tras 77 días de congelación, en comparación con sus muestras control sin envuelta. Capítulo 7 237 Los valores de peróxidos aquí obtenidos son superiores a los descritos para las envueltas de CPS en el Capítulo 4 (apartado 4.5), lo cual se puede deber a la mayor temperatura de conservación empleada (-10 ºC). Esto implicaría el desarrollo de una mayor rancidez al ralentizar menos la autooxidación lipídica. En relación a los productos de oxidación secundarios, los resultados indican que los filetes recubiertos con CPS o APS, para cualquiera de los tratamientos testados, presentan una menor oxidación que las muestras sin recubrimiento. Los contenidos medios de SRATB en las muestras con CPS (Tabla 7.5) oscilaron entre 1,58 y 1,78 mg de malondialdehído por kg de carne, siendo el valor significativamente mayor en los filetes sin envuelta (2,91 mg) en comparación con los filetes envueltos, cualesquiera que fuera su tratamiento. La misma tendencia se observó al expresar los datos de oxidación en relación con el contenido graso, obteniéndose contenidos de entre 7,62 y 9,24 mg de malondialdehído por kg de lípidos en las muestras envueltas. De nuevo, los valores de SRATB son superiores (p<0,05) en las muestras sin envuelta (14,40 mg) en comparación con los recubiertos con CPS. En las muestras con APS, los valores de SRATB (Tabla 7.5) se encontraron en un rango entre 1,76 y 2,00 mg de malondialdehído por kg de carne. De nuevo, las muestras sin envuelta presentaron un contenido (2,91 mg) significativamente mayor en comparación con los filetes envueltos, independientemente del tipo de tratamiento utilizado. Como en el caso anterior, la tendencia se repite al expresar los resultados en función del Capítulo 7 238 contenido graso, obteniendo valores entre 8,36 y 9,39 mg de malondialdehído por kg de lípidos en las muestras recubiertas. De nuevo, las cantidades son significativamente mayores en las muestras sin envuelta (14,40 mg). En vista de los resultados anteriormente descritos, al aplicar recubrimientos elaborados con CPS y APS con los dos tipos de tratamiento (calentamiento o ultrasonidos), tuvo lugar una reducción en la oxidación lipídica durante el almacenamiento en congelación, en comparación con las muestras sin recubrimiento. No hay estudios sobre mejoras en la oxidación de los alimentos por acción de ultrasonidos en recubrimientos proteicos. El único estudio que hay es sobre películas y relacionado con sus propiedades mecánicas. Así, Banerjee et al. (1996) obtuvieron películas con mejores propiedades mecánicas al ultrasonicar las disoluciones proteicas, al mejorar este tratamiento las interacciones moleculares de la red proteica de las películas. En relación a las diferencias entre ambos tratamientos, se puede observar que no hay diferencias en la reducción del valor de peróxidos entre el calentamiento y los ultrasonidos aplicados (80 ºC 30 minutos y 50% de potencia 30 minutos, respectivamente). Sin embargo, en los valores de SRATB, la reducción es mayor cuando se aplicó ultrasonidos que con el tratamiento térmico en las muestras sin tranglutaminasa, observándose diferencias significativas en las envueltas de CPS cuando se expresaron mg de malondialdehído por kg de lípidos entre las muestras calentadas y las sonicadas. Capítulo 7 239 En relación al efecto de la adición de transglutaminasa tras el calentamiento y la ultrasonicación, sólo se redujeron los valores de SRATB en las envueltas sometidas a tratamiento térmico, observándose diferencias significativas en el recubrimiento con CPS. Otros estudios, pero en películas independientes de base proteica, señalaron, que al añadir transglutaminasa, se incrementa la fuerza tensil, se mejora la tracción de las películas y disminuye la solubilidad (Gennadios et al., 2004). Concretamente Mahmoud & Savello (1992, 1993) y Truong et al. (2004) describieron variaciones en las propiedades de películas de proteínas de lactosuero, debidas fundamentalmente al entrecruzamiento covalente resultante de la acción de la transglutaminasa. Es posible que la acción de la enzima modifique la estructura del recubrimiento, haciéndolo más impermeable al oxígeno que cuando no se emplea. También es posible que induzca cambios en la estructura proteica, de forma que se expongan más grupos antioxidantes de los aminoácidos que reducen la alteración de los lípidos. En las muestras con envueltas tratadas con ultrasonidos, la transglutaminasa no tiene un efecto favorable en la reducción de la autooxidación, siendo incluso los valores algo superiores, aunque no significativamente, respecto a las que se recubrieron con recubrimientos sometidos únicamente a la acción de los ultrasonidos. Esta diferencia en el comportamiento entre las muestras con envueltas tratadas térmicamente y las sometidas a ultrasonidos se podría deber a las diferentes modificaciones estructurales de las proteínas que provocan estos tratamientos y que han sido observadas por otros autores (Gülseren et al., 2007). Los cambios inducidos por los ultrasonidos no parecen ser los adecuados para permitir una acción Capítulo 7 240 detectable de la transglutaminasa en las muestras de pescado analizadas, tal con sí sucede cuando se aplica calor en la preparación de las envueltas. Comparando los valores de peróxidos y SRATB entre CPS y APS, se observaron mayores valores de SRATB obtenidos en las muestras con APS en comparación con las CPS con diferencias significativas (p<0,01 y p<0,05), cuando se expresan los valores por kg de carne y de grasa respectivamente. Posiblemente estas diferencia se deban a las distintas composiciones de ambos productos, que pueden influenciar en gran medida las propiedades barrera de las películas elaboradas a base de proteínas de lactosuero (Hong & Krochta, 2006). En nuestro caso puede que esto suceda en las envueltas, dando lugar a diferentes resultados a la hora de desnaturalizar y formar nuevas uniones en la matriz del polímero con la aplicación de los distintos tratamientos. La lactosa presente en el CPS actúa como plastificante pudiendo influenciar en gran medida las propiedades barrera y mecánicas de las películas elaboradas a base de proteínas de lactosuero (Hong & Krochta, 2006) y en el caso de los recubrimientos deje pasar menos oxígeno. Además es posible que la mayor cantidad de lactosa en los CPS favorezca la reacción de Maillard con las altas temperaturas provocadas por los fenómenos de cavitación durante la sonicación, incrementándose la formación de sustancias antioxidantes como han señalado Hiller & Lorenzen (2010) en dispersiones calentadas de proteínas de suero. Capítulo 8 241 Capítulo 8 Efecto de la ultrasonicación sobre recubrimientos elaborados con concentrado y aislado proteicos de lactosuero (CPS y APS) aplicados a filetes de salmón del Atlántico congelados 8.1. Características del salmón empleado como materia prima Los valores medios (± desviación estándar) correspondientes a los distintos parámetros químicos y físico-químicos de la carne de salmón utilizada como materia prima en este estudio, se muestran en la Tabla 8.1. Se incluye la composición química, los valores de pH y color CIELab y los índices de oxidación lipídica. Composición Extracto seco (g/100 g carne) 37,93 ± 1,70 Lípidos (g/100 g carne) 17,07 ± 1,33 Cenizas (g/100 g carne) 1,15 ± 0,17 pH 6,12 ± 0,03 Color L* 45,37 ± 1,65 a* 19,49 ± 1,26 b* 18,10 ± 1,51 Blancura 41,95 ± 1,71 Índices de oxidación lipídica Dienos conjugados (mMol hidroperóxidos/kg lípidos) 34,27 ± 12,09 Peróxidos (meq cumene/kg carne) 1,84 ± 0,81 Peróxidos (meq cumene/kg lípidos) 10,67 ± 4,24 Valor SRATB (mg MDA/kg carne) 0,29 ± 0,13 Valor SRATB (mg MDA/kg lípidos) 1,73 ± 0,67 SRATB: Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico MDA: malondialdehído Tabla 8.1. Caracterización fisicoquímica del salmón utilizado como materia prima (media ± desviación estándar). Capítulo 8 248 Concentrado proteico de suero Sin envuelta 38,47 ± 0,07a 19,15 ± 0,31a 19,32 ± 0,29a 1,10 ± 0,03a 41,27 ± 1,91a Sin tratar 36,99 ± 1,49a 17,56 ± 1,70a 19,44 ± 1,25a 1,07 ± 0,07a 38,20 ± 0,69a Sonicada 1 min 38,42 ± 1,64a 18,05 ± 0,36a 20,37 ± 1,58ab 1,09 ± 0,04a 39,10 ± 1,03a Sonicada 15 min 38,86 ± 0,85a 16,67 ± 1,13a 22,19 ± 1,31b 1,12 ± 0,04a 38,64 ± 2,19a Sonicada 60 min 37,59 ± 1,07a 18,31 ± 2,79a 19,28 ± 2,06a 1,14 ± 0,04a 39,60 ± 2,98a Aislado proteico de suero Sin envuelta 38,47 ± 0,07a 19,15 ± 0,31ab 19,32 ± 0,29a 1,10 ± 0,03a 41,27 ± 1,91a Sin tratar 39,89 ± 0,70ab 21,79 ± 0,45c 18,09 ± 0,30a 1,04 ± 0,06a 40,01 ± 0,72a Sonicada 1 min 39,31 ± 1,67ab 18,07 ± 1,39a 21,24 ± 2,14a 1,05 ± 0,07a 39,98 ± 0,72a Sonicada 15 min 40,44 ± 0,93b 20,78 ± 0,36bc 19,66 ± 0,67a 1,04 ± 0,04a 41,05 ± 0,89a Sonicada 60 min 39,19 ± 0,99ab 18,56 ± 2,36ab 20,63 ± 3,24a 1,05 ± 0,03a 40,52 ± 0,47a A ** ** ns ** * a,b,c,d: medias con diferentes letras en cada columna son significativamente diferentes (p<0,05) Extracto seco tras cocinado A: empleo de concentrado proteico de suero vs aislado; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; ns: no significativo (p≥0,05) Muestras Extracto seco Contenido lipídico Extracto seco magro Cenizas Descongeladas Cocinadas Tabla 8.3 Extracto seco, extracto seco magro, contenido en lípidos y cenizas y extracto seco tras cocinado (g/100 g pescado; media ± desviación estándar) de los filetes de salmón tras 4 meses de almacenamiento en congelación con recubrimientos de CPS o APS ultrasonicados a distintos tiempos (1, 15 y 60 minutos) Capítulo 8 249 El contenido medio en extracto seco magro de las muestras osciló entre 18,09 y 22,19%. Sólo los filetes recubiertos con CPS ultrasonicado durante 15 minutos presentan valores significativamente superiores a la mayoría de los filetes recubiertos con CPS tratado o sin tratar. Sin embargo, en las muestras envueltas con APS no se observan diferencias significativas entre los distintos tratamientos aplicados. Aunque, en general, sí se observa que las muestras envueltas presentan unos valores de extracto seco magro superior a las no recubiertas lo que puede indicar que una pequeña parte de envuelta queda en el pescado descongelado. En vista de los resultados, también se puede señalar que las envueltas proteicas sonicadas no parecen proteger contra la pérdida de humedad. Finalmente, no se observan diferencias al comparar el empleo de CPS con el de APS respecto al extracto seco magro (p≥0,05). En relación al contenido mineral, los filetes con CPS presentaron contenidos en cenizas similares entre sí y con los sin envuelta (p≥0,05), con valores medios que variaron entre 1,07 y 1,14%, lo que significa que estas envueltas no modifican el contenido mineral de los filetes de salmón durante su almacenamiento en congelación ni tras su descongelación. Tampoco se observaron diferencias significativas entre las muestras sin envuelta y las recubiertas con APS sonicadas o no. Sin embargo, los filetes recubiertos con APS mostraron contenidos de cenizas inferiores a los descritos para las muestras con CPS (p<0,01). Fenómeno posiblemente causado, como se señaló en el capítulo anterior, por el mayor contenido mineral del CPS en comparación con el APS observado en nuestro estudio (ver Capítulo 3: material y métodos) y en otros trabajos (Banerjee & Chen, 1995; Morr & Ha, 1993). Capítulo 8 250 En relación a los contenidos en extracto seco de las muestras tras el cocinado, ni los filetes con CPS, ni con APS presentaron diferencias significativas. Sin embargo, los valores fueron inferiores, aunque no significativamente, en las muestras que fueron envueltas, lo cual podría indicar una cierta protección de los recubrimientos frente a pérdidas de humedad durante el cocinado, tal y como se señaló en el capítulo anterior. Pero esta protección es independiente del sonicado o del tiempo de sonicación, ya que los resultados son similares en las muestras con recubrimiento sin tratar. Finalmente, se observaron diferencias significativas (p<0,05) entre el empleo de CPS o APS en las envueltas, siendo mayor el extracto seco tras cocinado en las muestras donde se empleó APS. 8.4. Parámetros de color. Los valores medios (± desviación estándar) correspondientes las coordenadas de color CIELab y blancura (whiteness) de los filetes de salmón tras 4 meses de almacenamiento en congelación, una vez descongelados y tras su cocinado se muestran en la Tabla 8.4. En ésta también se indican los niveles de significación para los distintos parámetros, al comparar estadísticamente los datos obtenidos, contrastando además la utilización de concentrado o aislado proteico de lactosuero. Los filetes congelados tras el almacenamiento con o sin envuelta presentan un descenso de las coordenadas a* y b* y un aumento de la luminosidad (L*) en comparación con el fresco (Tabla 8.1), fenómeno ya descrito y explicado en capítulos anteriores. La aplicación de las envueltas Capítulo 8 251 Muestras Congeladas Concentrado proteico de suero Sin envuelta 50,82 ± 4,00a 14,56 ± 0,50c 13,77 ± 1,15c 46,85 ± 3,32a Sin tratar 49,70 ± 0,94a 11,29 ± 0,74ab 9,45 ± 0,72a 47,59 ± 1,15a Sonicadas 1 min 49,62 ± 0,79a 11,77 ± 0,55b 9,59 ± 0,57ab 47,38 ± 0,95a Sonicadas 15 min 52,01 ± 2,56a 11,49 ± 0,51ab 10,82 ± 0,76b 49,47 ± 2,26a Sonicadas 60 min 51,55 ± 1,05a 10,70 ± 0,37a 8,62 ± 0,12a 49,64 ± 0,94a Aislado proteico de suero Sin envuelta 50,82 ± 4,00a 14,56 ± 0,50b 13,77 ± 1,15b 46,85 ± 3,32a Sin tratar 51,21 ± 2,61a 10,23 ± 0,72a 8,24 ± 0,66a 49,47 ± 2,72ab Sonicadas 1 min 50,14 ± 0,62a 10,19 ± 0,57a 7,95 ± 0,25a 48,49 ± 0,63ab Sonicadas 15 min 52,74 ± 0,38a 8,83 ± 1,13a 7,27 ± 0,92a 51,36 ± 0,10b Sonicadas 60 min 51,87 ± 0,57a 10,07 ± 1,65a 8,40 ± 1,99a 50,08 ± 0,69ab A ns *** *** ns Descongeladas Concentrado proteico de suero Sin envuelta 45,93 ± 0,80a 17,46 ± 0,68b 19,51 ± 1,12b 39,92 ± 1,09a Sin tratar 49,85 ± 0,28b 16,28 ± 0,42a 15,06 ± 1,10a 45,16 ± 0,68b Sonicadas 1 min 48,59 ± 0,96b 16,54 ± 0,43ab 15,03 ± 0,23a 43,94 ± 0,97b Sonicadas 15 min 48,77 ± 0,82b 16,10 ± 0,77a 16,30 ± 0,96a 43,88 ± 1,07b Sonicadas 60 min 48,58 ± 0,43b 16,80 ± 0,37ab 15,44 ± 0,20a 43,75 ± 0,56b Aislado proteico de suero Sin envuelta 45,93 ± 0,80a 17,46 ± 0,68c 19,51 ± 1,12b 39,92 ± 1,09a Sin tratar 46,83 ± 0,79ab 15,82 ± 0,19b 14,68 ± 0,34a 42,62 ± 0,85b Sonicadas 1 min 47,46 ± 0,82bc 14,76 ± 0,52a 14,29 ± 0,86a 43,59 ± 1,12b Sonicadas 15 min 48,13 ± 0,55c 15,12 ± 0,47ab 14,70 ± 0,37a 44,01 ± 0,68b Sonicadas 60 min 47,34 ± 0,25bc 15,62 ± 0,73ab 15,04 ± 0,63a 43,04 ± 0,45b A *** *** * * Cocinadas Concentrado proteico de suero Sin envuelta 70,07 ± 0,50a 17,04 ± 1,84c 18,71 ± 0,70b 60,78 ± 1,13a Sin tratar 71,44 ± 0,41b 16,39 ± 1,35bc 16,73 ± 0,74a 63,06 ± 1,16b Sonicadas 1 min 72,15 ± 0,38b 15,55 ± 0,52ac 16,60 ± 0,67a 64,04 ± 0,80bc Sonicadas 15 min 73,56 ± 0,23c 13,88 ± 0,91a 15,24 ± 0,78a 66,47 ± 0,78d Sonicadas 60 min 73,49 ± 1,33c 14,63 ± 0,97ab 15,61 ± 1,20a 65,93 ± 1,95cd Aislado proteico de suero Sin envuelta 70,07 ± 0,50a 17,04 ± 1,84b 18,71 ± 0,70c 60,78 ± 1,13a Sin tratar 70,48 ± 2,81a 13,26 ± 1,49a 16,27 ± 1,05b 63,72 ± 2,30b Sonicadas 1 min 73,64 ± 1,22b 12,71 ± 0,81a 14,40 ± 0,81a 67,37 ± 1,05c Sonicadas 15 min 73,46 ± 1,14b 12,38 ± 0,30a 14,90 ± 0,65ab 67,14 ± 1,02c Sonicadas 60 min 72,75 ± 0,86ab 13,56 ± 0,91a 13,88 ± 0,98a 66,53 ± 0,94c A ns *** * ns A: empleo de concentrado proteico de suero vs aislado; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; ns: no significativo (p≥0,05) a,b,c,d: medias con diferentes letras en cada columna son significativamente diferentes (p<0,05) Tabla 8.4. Parámetros de color de los filetes con recubrimientos de CPS o APS ultrasonicados a distintos tiempos (1, 15 y 60 minutos), tras 4 meses de almacenamiento a -10 ºC. Valores de las muestras congeladas, descongeladas y cocinadas (media ± desviación estándar). L* a* b* Blancura Capítulo 8 252 provoca un descenso en las coordenadas a* y b* en comparación con los filetes congelados sin envuelta, tanto en las muestras con CPS como en las APS (p<0,05). La aplicación de envueltas ultrasonicadas o no, provoca una variación del color de los filetes, causada probablemente por la propia coloración blanquecina de las envueltas independientemente del tiempo de ultrasonicación aplicado. Así pues, ni la aplicación de ultrasonidos ni, por ello, el tiempo de sonicación influye de una manera clara en el color de los filetes congelados. Los filetes de salmón descongelados tras el periodo de almacenamiento en congelación, tanto con CPS como con APS, presentan mayores valores de luminosidad (L*) y blancura, y menores valores de las coordenadas a* y b* en comparación con los valores del pescado fresco (Tabla 8.1). Como ya se ha comentado a lo largo del presente estudio, esto podría deberse a la degradación de pigmentos carotenoides debido a su oxidación durante la congelación y descongelación, a la pérdida de pigmentos en el exudado de descongelación o a la desnaturalización proteica producida durante el almacenamiento, la cual afectaría a su textura y a las propiedades ópticas de los filetes (Andersen & Steinsholt, 1992; Refsgaard et al., 1998b; Sheehan et al., 1998; Einen et al., 2002). De nuevo, la aplicación de envueltas proteicas causa un aumento de L* y blancura y un descenso de a* y b* de los filetes descongelados como se observó en el capítulo anterior (Capítulo 7) en muestras con envueltas CPS o APS sonicadas. En general, el tratamiento de ultrasonidos para la elaboración de los recubrimientos no influye en el color de los filetes descongelados en relación a las muestras con envueltas sin tratar, es decir sin ultrasonicar. Capítulo 8 253 Los filetes cocinados, con envueltas de CPS y APS, presentaron valores de luminosidad y blancura significativamente mayores que los descongelados. Las muestras cocinadas procedentes de filetes envueltos mostraron un mayor valor de L* y blancura y menor de a* y b* que las muestras cocinadas sin envuelta. El empleo de la sonicación, a diferencia de lo que se observó en pescados congelados y descongelados, sí influyó de una manera significativa en las coordenadas de color. Así, en la coordenada L*, las muestras de pescados con envueltas sonicadas presentaron un mayor valor que las de envueltas sin tratar (con diferencias significativas con las tratadas 15 y 60 minutos en el caso de CPS y con las tratadas 1 y 15 minutos en APS). Las muestras sonicadas de CPS presentaron un menor valor de a* que las sin envuelta con diferencias significativas con la de 15 minutos de tratamiento. En la coordenada b* fueron las muestras APS (las tratadas 1 y 60 minutos) las que mostraron diferencias significativas con los filetes sin tratar, presentando las muestras sonicadas menores valores. Finalmente en la blancura, las muestras CPS y APS sonicadas tuvieron mayores valores que las recubiertas sin tratar (con diferencias significativas con las tratadas 15 y 60 minutos en el caso de CPS y con todas las tratadas en APS). Todos estos cambios de color podrían relacionarse con cambios estructurales producidos por los ultrasonidos en las proteínas del lactosuero. El tipo de producto proteico empleado (CPS o APS) en la elaboración de la envuelta afecta al color de los filetes. Los filetes congelados correspondientes a las muestras con CPS presentaron valores significativamente superiores de a* y b* (p<0,001) que las APS, lo cual también se describió en el Capítulo 7 (apartado 7.4). Tras la descongelación de los filetes, las muestras con APS presentaron valores significativamente Capítulo 8 254 inferiores en todos los parámetros estudiados, especialmente en L* y a* (p<0,001) en relación con los de CPS. Este resultado contrasta con lo observado en el capítulo anterior. Finalmente, tras el cocinado los filetes con CPS presentan valores significativamente mayores de a* (p<0,001) y b* (p<0,05) que los de APS. Estas diferencias entre CPS y APS también se observaron en los pescados cocinados del capítulo anterior. Por lo tanto, al utilizar CPS en la elaboración de las envueltas se obtendrían menores modificaciones en la coloración de los filetes del salmón. 8.5. Índices de oxidación. Los contenidos medios (± desviación estándar) correspondientes a los indicadores de oxidación obtenidos por el valor de peróxidos y el valor de las sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (SRATB) se muestran en la Tabla 8.5. En ésta también se indican los niveles de significación para los distintos parámetros al comparar estadísticamente los datos obtenidos, contrastando además la utilización de concentrado o aislado proteico de lactosuero. Los peróxidos vienen expresados en miliequivalentes de cumene por kg de carne o de lípidos y los compuestos secundarios (SRATB) en mg de malondialdehído por kg de carne o de lípidos. Los valores medios de peróxidos en las muestras con CPS (Tabla 8.5) fluctuaron entre 1,24 y 1,61 meq de cumene por kg de carne y entre 6,72 y 9,10 meq de cumene por kg de lípidos, encontrándose en ambos casos diferencias significativas entre las muestras sin envuelta (3,15 meq) y las recubiertas. Sin embargo, no se observaron diferencias (p≥0,05) entre los distintos tiempos de ultrasonicación aplicados a las envueltas. Capítulo 8 255 Concentrado proteico de suero Sin envuelta 3,15 ± 0,34b 16,46 ± 2,04b 1,99 ± 0,13c 10,39 ± 0,84c Sin tratar 1,61 ± 0,28a 9,10 ± 0,75a 1,62 ± 0,08b 9,29 ± 0,67bc Sonicada 1 min 1,28 ± 0,08a 7,08 ± 0,51a 1,57 ± 0,07b 8,72 ± 0,51ab Sonicada 15 min 1,24 ± 0,27a 7,40 ± 1,08a 1,31 ± 0,05a 7,91 ± 0,79a Sonicada 60 min 1,26 ± 0,45a 6,72 ± 1,59a 1,25 ± 0,25a 6,80 ± 0,87a Aislado proteico de suero Sin envuelta 3,15 ± 0,34b 16,46 ± 2,04b 1,99 ± 0,13c 10,39 ± 0,84c Sin tratar 2,82 ± 0,36ab 17,77 ± 0,78b 1,90 ± 0,08c 8,72 ± 0,24b Sonicada 1 min 2,75 ± 0,38a 13,57 ± 1,42a 1,38 ± 0,02ab 7,66 ± 0,50ab Sonicada 15 min 2,79 ± 0,57ab 12,95 ± 2,05a 1,49 ± 0,04b 7,16 ± 0,33a Sonicada 60 min 2,64 ± 0,40a 13,51 ± 1,12a 1,31 ± 0,02a 7,14 ± 0,91a A *** *** ns ns a,b,c,d: medias con diferentes letras en cada columna son significativamente diferentes (p<0,05) SRATB: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (2): meq de cumene/kg carne; (3): meq de cumene/kg lípidos (4): mg de malondialdehído/kg carne; (5): mg de malondialdehído/kg lípidos A: empleo de concentrado proteico de suero vs aislado; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; ns: no significativo (p≥0,05) Muestras (2) (3) (4) (5) Valor de peróxidos Valor de SRATB Tabla 8.5. Indicadores de la oxidación lipídica (media ± desviación estándar) de los filetes de pescado recubiertos con CPS o APS sometidos diversos tratamientos, tras 4 meses de almacenamiento en congelación a -10 ºC. Capítulo 8 256 Por otro lado, los valores de peróxidos los filetes con APS (Tabla 8.5) oscilaron entre 2,64 y 2,82 meq de cumene por kg de carne, siendo las muestras con las envueltas ultrasonicadas 1 y 60 minutos las que presentaron los menores valores (p<0,05). Sin embargo, al expresar los resultados en meq de cumene por kg de lípidos (entre 12,95 y 17,77), se encontraron valores significativamente menores en los filetes con envueltas ultrasonicadas en comparación con los filetes sin envuelta y los recubiertos sin ultrasonicar. Así pues, tanto en las muestras con CPS como con APS, los filetes con los valores más próximos a los filetes sin envuelta fueron los recubiertos sin tratar. A la vista de estos resultados, la utilización de envueltas de CPS o APS ultrasonicadas a distintos tiempos reduce la formación de peróxidos en el salmón almacenado en congelación. Esto coincide con los resultados del Capítulo 7 (apartado 7.5), en los que la aplicación de envueltas ultrasonicadas 30 minutos también disminuyó la formación de peróxidos durante el almacenamiento en congelación en condiciones iguales a las aquí descritas (4 meses/-10 ºC). En relación a los productos de oxidación secundarios, los resultados indican que los filetes recubiertos con CPS o APS para cualquiera de los tiempos de ultrasonicación testados presentan una menor oxidación que las muestras sin recubrimiento, observándose los menores valores en las muestras recubiertas con envueltas ultrasonicadas 15 y 60 minutos. Los valores medios de SRATB en las muestras con CPS (Tabla 8.5) oscilaron entre 1,25 y 1,62 mg de malondialdehído por kg de carne, siendo el valor significativamente mayor en los filetes sin envuelta (1,99 mg) en comparación con los filetes envueltos. Además, las muestras con envueltas Capítulo 8 257 ultrasonicadas durante 15 y 60 minutos dieron lugar a valores de SRATB significativamente inferiores al resto. La misma tendencia se observó al expresar los datos de oxidación en relación con el contenido graso, obteniéndose valores de entre 6,80 y 9,29 mg de malondialdehído por kg de lípidos en las muestras recubiertas. De nuevo, los contenidos de SRATB son superiores (p<0,05) en las muestras sin envuelta (10,39 mg) en comparación con los recubiertos con CPS ultrasonicados o no. En relación a los distintos tiempos de ultrasonicación empleados, las muestras ultrasonicadas durante 15 y 60 minutos obtuvieron los menores valores de SRATB. En las muestras con APS, los contenidos de SRATB (Tabla 8.5) se encontraron en un rango entre 1,31 y 1,90 mg de malondialdehído por kg de carne. Las muestras sin envuelta presentaron los valores mayores (1,99 mg) en comparación con los filetes con envueltas tratadas por sonicación (p<0,05), independientemente del tiempo de tratamiento utilizado. Como en el caso anterior, la tendencia se repite al expresar los resultados en función del contenido graso, obteniendo valores entre 7,14 y 8,72 mg de malondialdehído por kg de lípidos. De nuevo, los contenidos son mayores en las muestras sin envuelta (10,39 mg), con diferencias significativas en relación al resto. Al igual que con las de CPS, en las envueltas con APS, los tratamientos de ultrasonicación de 15 y 60 minutos obtuvieron los menores valores de SRATB expresados sobre materia grasa en comparación al resto. A la vista de los resultados anteriormente descritos, la utilización de proteínas séricas sin tratar como recubrimiento disminuye la oxidación lipídica, lo cual puede deberse a las propiedades antioxidantes de estas proteínas (Tong et al., 2000). En los resultados se puede ver que las muestras Capítulo 9 264 Así pues ninguna de las pruebas sensoriales discriminantes realizadas (comparación por parejas y prueba triangular) mostraron la existencia de diferencias significativas entre las muestras recubiertas con CPS+glicerol 1:1 y las no envuelta o glaseadas. 9.1.3. Prueba de aceptación mediante la utilización de una escala específica empleando una muestra de referencia Las puntuaciones medias (± desviación estándar) obtenidas durante el transcurso de la prueba sensorial con escala específica por parte del panel de cata se muestran en la Tabla 9.3. Aspecto general 2,4 ± 0,5 2,3 ± 0,5 2,6 ± 0,5 2,9 ± 0,3 Color 2,7 ± 0,5 2,4 ± 0,4 2,6 ± 0,5 3,0 ± 0,0 Olor 2,7 ±0,5 2,7 ±0,5 2,6 ±0,5 2,6 ±0,5 Consistencia 2,6 ±0,5 2,7 ±0,5 2,5 ±0,5 Sabor 2,3 ±0,6 2,2 ±0,7 Textura 2,5 ±0,6 2,4 ±0,7 Tabla 9.3. Puntuaciones obtenidas (media ± desviación estándar) para los distintos parámetros sensoriales estudiados (aspecto general, color, olor, consistencia, sabor y textura) tras la prueba de aceptación con escala específica realizada para muestras de salmón recubiertas con CPS+glicerol 1:1 descongeladas y cocinadas (cocidas y fritas). CongeladoAtributo evaluado Descongelado Cocinado Cocido Frito De los resultados obtenidos en el examen sensorial del producto congelado cabe destacar los siguientes aspectos:  Tras la evaluación de la muestra el panel de catadores ha definido el aspecto general como “agradable y específico del producto”, no detectando además desviaciones con respecto a la muestra de referencia. Capítulo 9 265  El color de la muestra ha sido definido como “muy agradable y específico del producto”, no detectando desviaciones significativas con respecto a la muestra de referencia.  Finalmente, el olor ha sido definido “muy agradable y específico del producto”, no detectando desviaciones significativas con respecto a la muestra de referencia. De los resultados obtenidos en el examen sensorial del producto descongelado, cabe destacar los siguientes aspectos:  Tras la evaluación de la muestra el panel de catadores ha definido el aspecto general como “ligeramente agradable y específico del producto” destacando, parte del panel, la presencia en algunas piezas de restos de cubierta en la superficie.  El color de la muestra ha sido definido como “ligeramente agradable y específico del producto”, detectándose piezas con un tono más blanquecino y opaco que la muestra de referencia.  Finalmente, el olor ha sido definido como “muy agradable y específico del producto”, no detectando desviaciones significativas con respecto a la muestra de referencia.  La consistencia ha sido definida como “firme y elástica”, no detectando diferencias significativas con respecto a la muestra de referencia. De los resultados obtenidos en el examen sensorial del producto descongelado y sometido a un proceso de cocción (producto cocido), destacan los siguientes aspectos: Capítulo 9 266  Aunque, tras la evaluación de la muestra, el panel de catadores ha definido el aspecto general como “agradable y específico del producto” cabe destacar que parte del mismo señala la presencia en algunas piezas de restos de cubierta en la superficie.  Aunque el color de la muestra, tras su evaluación sensorial, ha sido definido como “agradable y específico del producto”, parte del panel de catadores ha detectado piezas con un tono más blanquecino y opaco que la muestra de referencia.  El olor, tras la evaluación directa de la muestra, ha sido definido como “muy agradable y específico del producto”, no detectando desviaciones significativas con respecto a la muestra de referencia.  La consistencia ha sido definida como “firme y elástica”, no encontrando diferencias significativas con respecto a la muestra de referencia.  El sabor, tras la evaluación directa de la muestra, ha sido definido “ligeramente agradable y específico del producto”. El 50% del panel ha destacado la presencia de sabores impropios del producto (no definidos) y un regusto ligeramente astringente en la muestra evaluada con respecto a la muestra de referencia.  Tras la evaluación directa de la textura, el panel de catadores la ha definido como “ligeramente agradable y específica del producto”, señalándola como ligeramente más seca que la muestra de referencia. De los resultados obtenidos en el examen sensorial del producto sometido a un proceso de fritura (producto frito), destacan los siguientes aspectos: Capítulo 9 267  Aunque, tras la evaluación de la muestra, el panel de catadores ha definido el aspecto general como “agradable y específico del producto” no detectando diferencias significativas con respecto a la muestra de referencia.  El color de la muestra, tras su evaluación sensorial, ha sido definido como “agradable y específico del producto”, no detectando diferencias significativas con respecto a la muestra de referencia.  El olor, tras la evaluación directa de la muestra, ha sido definido como “muy agradable y específico del producto”, no detectando desviaciones significativas con respecto a la muestra de referencia.  La consistencia ha sido definida como “ligeramente firme y elástica”.  El sabor, tras la evaluación directa de la muestra, ha sido definido “ligeramente agradable y específico del producto”. El 62,5% del panel ha destacado la presencia de sabores impropios del producto (no definidos) y un regusto ligeramente astringente en la muestra evaluada con respecto a la muestra de referencia.  Tras la evaluación directa de la textura, el panel de catadores la ha definido como “ligeramente agradable y específica del producto”, definiendo la muestra ligeramente más seca que la muestra de referencia. A la vista de estos resultados podría concluirse que el salmón congelado no presenta desviaciones apreciables en el aspecto, color y olor, en base a la evaluación sensorial directa de las muestras con recubrimientos de CPS+glicerol 1:1, con respecto a las muestras de referencia (sin envuelta). En relación al salmón descongelado, tanto la consistencia como el olor de las muestras recubiertas, no presentan diferencias apreciables respecto a las Capítulo 9 268 muestras de referencia. Sin embargo, en referencia al aspecto y el color de las muestras con envuelta, la evaluación sensorial indicó la presencia de restos del recubrimiento en su superficie, aunque su presencia no tuvo un efecto negativo a la hora de la valoración de estos parámetros. Esta misma tendencia se observó en el salmón cocido, donde el aspecto general, el color, el olor, la consistencia, el sabor y la textura no presentan desviaciones apreciables respecto a la muestra de referencia, aunque de nuevo se indica la presencia de restos de las envueltas en la superficie de las muestras. Finalmente el salmón frito tampoco presentó desviaciones apreciables respecto a la muestra de referencia en todos los parámetros testados (aspecto general, color, olor, consistencia, sabor y textura). Sin embargo, es preciso mencionar que tanto en el salmón cocido como en el frito, una parte de los catadores detectaron la presencia de sabores impropios del producto (no definidos) y un regusto ligeramente astringente en la muestra evaluada, señalándola también como ligeramente más seca, con respecto a la muestra de referencia. Como se ha comentado anteriormente, la presencia de restos de las envueltas en la superficie de las muestras descongeladas ya fue señalada en el Capítulo 4. Así mismo, la presencia de sabores impropios del producto y el regusto ligeramente astringente señalado por parte del panel sensorial en las muestras cocinadas (cocidas o fritas) podría explicarse por la presencia de estos restos de envuelta proteica, los cuales al ser sometidos a un proceso de cocinado vinculado a la aplicación de elevadas temperaturas podrían desarrollar ciertos olores y sabores por acción del calor sobre las proteínas. Capítulo 9 269 9.1.4. Prueba de Aceptación Las puntuaciones medias (± desviación estándar) obtenidas durante el transcurso de la prueba de aceptación por parte del panel de cata se muestran en la Tabla 9.4. Aspecto general 4,4 ± 0,4 4,4 ± 0,4 4,5 ± 0,4 Color 4,5 ± 0,4 4,3 ± 0,7 4,4 ± 0,4 Olor 3,6 ± 0,8 4,6 ± 0,4 4,4 ± 0,5 Textura 3,6 ± 0,5 4,3 ± 0,2 4,4 ± 0,3 Sabor 4,2 ± 0,6 4,1 ± 0,6 Grado de liberación de agua 3,8 ± 0,2 Tabla 9.4. Puntuaciones obtenidas (media ± desviación estándar) para los distintos parámetros sensoriales estudiados (aspecto general, color, olor, textura, sabor y grado de liberación de agua) tras la prueba de aceptación realizada para muestras de salmón recubiertas con CPS+glicerol 1:1 descongeladas y cocinadas (cocidas y a la plancha). Atributo evaluado Descongelado Cocinado Cocido A la plancha De los resultados obtenidos en el examen sensorial del producto descongelado, destacan los siguientes aspectos:  Tras la evaluación visual de la muestra el panel de catadores ha definido el aspecto general como “agradable” y el color como “muy agradable”. Además, algunos catadores han observado cierta liberación de agua que ha sido definida como “ligera”.  Tras la evaluación directa de la muestra, el panel de catadores ha definido el olor y la textura de la carne como “agradable”.  Así mismo, aunque tras la realización del análisis sensorial de la muestra el panel de catadores ha definido el producto de forma general Capítulo 9 270 como “agradable”, es preciso mencionar que algunos catadores han observado la presencia de restos de película en la superficie del producto, los cuales han sido definidos como “ni agradables ni desagradables”, así como una ligera pérdida de elasticidad de la carne (grado de recuperación tras someterla a la aplicación de ligera presión). De los resultados obtenidos en el examen sensorial del producto cocido, destacan los siguientes aspectos:  Tras la evaluación visual de la muestra el panel de catadores ha definido el aspecto general y el color de las piezas como “agradable”.  Tras la evaluación directa de la muestra, el panel de catadores ha definido el olor como “muy agradable” y el sabor y la textura como “agradable”.  Aunque tras la realización del análisis sensorial de la muestra el panel de catadores ha definido el sabor como “agradable”, destaca que algunos catadores lo han valorado como “poco intenso”.  Finalmente, el panel de catadores ha definido el producto de forma general como “agradable”. Sin embargo, es preciso destacar que algunos catadores han observado la presencia de restos de cubierta en la superficie del producto, los cuales han sido definidos como “ni agradables ni desagradables”. De los resultados obtenidos en el examen sensorial del producto “a la plancha”, se destacan los siguientes aspectos: Capítulo 9 271  Tras la evaluación visual de la muestra el panel de catadores ha definido el aspecto general como “muy agradable” y el color como “agradable”.  Tras la evaluación directa de la muestra, el panel de catadores ha definido el olor, el sabor y la textura como “agradable”.  Si bien el panel de catadores ha definido el sabor como “agradable”, cabe destacar que algunos catadores lo han valorado como “ligeramente específico del producto”.  Para concluir, el panel de catadores ha definido el producto de forma general como “agradable”, aunque cabe mencionar que algunos catadores han observado la presencia de restos de cubierta en la superficie del producto, los cuales han sido definidos como “ni agradables ni desagradables”. Teniendo en cuenta estos resultados, el salmón congelado recubierto (CPS+glicerol 1:1) podría definirse como agradable en base a sus características sensoriales, siendo su color la característica más valorada como muy agradable, a pesar de que ciertos catadores observaron la presencia de restos del recubrimiento proteico en su superficie; por tanto, su presencia no tuvo un efecto negativo a la hora de la valoración de este parámetro. De manera similar, el salmón cocinado podría considerarse agradable, siendo su olor la característica más apreciada por los catadores, definida como muy agradable. De nuevo, la detección de restos del recubrimiento proteico en su superficie por parte del panel no afectaría su valoración, siendo considerada como ni agradable ni desagradable. En el caso del salmón a la “plancha” la consideración global sería también de agradable, presentando su aspecto general la mejor valoración como muy agradable. Como en los casos Capítulo 9 272 anteriores la presencia de restos de envuelta proteica no afectaría negativamente a su valoración. Para finalizar, cabe destacar que a pesar de las diferencias observadas a nivel analítico entre las muestras sin envuelta, las glaseadas y las recubiertas con CPS+glicerol 1:1 en el Capítulo 4, éstas no parecen ser suficientemente marcadas para ser percibidas en un análisis sensorial. Posiblemente la naturaleza de la propia materia prima, el salmón atlántico, el cual posee unas fuertes características sensoriales, dificulten la percepción de variaciones en las mismas. También el nivel de autooxidación lipídica que mostraron las muestras sin recubrimiento no fue lo suficientemente elevado como para ser detectado sensorialmente. Es posible que con períodos más largos de conservación en congelación o empleando temperaturas de conservación más elevadas se podrían haber apreciado más diferencias. En cualquier caso, se puede decir que el recubrimiento no afectó negativamente a las características sensoriales del producto. Capítulo 9 273 9.2. Análisis sensorial de muestras de salmón recubiertas con CPS o APS+glicerol sometidas a tratamiento de ultrasonicación Las muestras de salmón atlántico recubiertas con envueltas elaboradas con APS o CPS (+glicerol 2:1 ambas) sometidas a distintos tratamientos de ultrasonicación (15 y 60 minutos, respectivamente), se estudiaron mediante una prueba de aceptación de consumidores con el fin de examinar sensorialmente el producto recubierto y determinar la posible relación entre los resultados del análisis sensorial y los obtenidos en la evaluación analítica de parámetros como los rendimientos, el color o los índices de oxidación, de manera que se pudiera establecer si las diferencias observadas analíticamente también se reflejaban a nivel de consumidor. Los resultados obtenidos mediante cada prueba del análisis sensorial, realizado por un panel de consumidores no entrenados, se describen a continuación. Las puntuaciones medias (± desviación estándar) obtenidas durante el transcurso de la prueba de aceptación por parte del panel de consumidores se muestran en la Tabla 9.5 y representadas en la Figura 9.1. Atributos color 5,26 ± 1,81 5,26 ± 1,68 5,35 ± 1,80 5,48 ± 1,44 olor 5,22 ± 1,76 5,48 ± 1,47 5,39 ± 1,67 5,43 ± 1,31 sabor 5,65 ± 2,01 5,96 ± 1,46 6,04 ± 1,94 5,52 ± 1,95 textura 6,13 ± 1,58 6,61 ± 1,27 5,91 ± 1,53 6,17 ± 1,47 global 5,57 ± 1,80 6,13 ± 1,55 5,91 ± 1,62 5,78 ± 1,57 Sin envuelta Glaseado APS 15' CPS 60' Tabla 9.5. Puntuaciones obtenidas (media ± desviación estándar) para el global y los distintos parámetros sensoriales estudiados (color, olor, sabor y textura) tras la prueba de aceptación con consumidores realizada para muestras descongeladas de salmón recubiertas con APS+glicerol 2:1 sonicado 15 minutos, con CPS+glicerol 2:1 sonicado 60 minutos, glaseadas y sin envuelta. Capítulo 11 280 Alcántara, C.R. Krochta, J.M. 1996. Mechanical properties of whey protein-isolatecoated freeze-dried chicken white meat dice. En: Book of Abstracts, 1996 IFT Annual Meeting, New Orleans, LA. Chicago, IL: Institute of Food Technologists. p. 179. Alcántara, C.R., Rumsey, T.R., Krochta, J.M. 1998. Drying rate effect on the properties of whey protein films. Journal of Food Processing Engineering. 21: 387405. Alexandrescu, A.T., Evans, P.A., Pitkeathly, M., Baum, J., Dobson, C.M. 1993. Structure and dynamics of the acid-denatured molten globule state of α-Lactalbumin: A Two-Dimensional NMR Study. 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