Papel de p53 en el metabolismo hepático

TESE DE DOUTORAMENTO PAPEL DE P53 EN EL METABOLISMO HEPÁTICO Begoña Porteiro Couto ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN ENDOCRINOLOXÍA SANTIAGO DE COMPOSTELA ANO 2018 DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS Papel de p53 en el metabolismo hepático D./Begoña Porteiro Couto Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Santiago de Compostela, Febrero de 2018 AUTORIZACIÓN DO DIRECTOR / TITOR DA TESE Papel de p53 en el metabolismo hepático D. Rubén Nogueiras Pozo D. Carlos Diéguez González INFORMA/N: Que a presente tese, correspóndese co traballo realizado por D/Dna. Begoña Porteiro Couto, baixo a miña dirección, e a utorizo a súa presentación , considerando que reúne os r equisitos esixidos no R egulamento de Estudos de Doutoramento da USC, e que como director desta non incorre nas causas de abstención establecidas na Lei 40/2015. En Santiago de Compostela, Febrero de 2018 Asdo. Rubén Nogueiras Pozo Asdo. Carlos Diéguez Resumo p53 xoga un papel importante en diferentes funcións biolóxicas como a proliferación celular, a lonxevidade, o estrés, e desordes asociados á obesidade como a esteatose e a esteatohepatite non alcohólica. O obxectivo desta tese é estudiar o papel de p53 no metabolismo lipídico hepático e dos posibles mecanismos que conducen ás alteracións metabólicas. Atopamos que a ausencia de p53 provoca unha disminución de peso corporal e masa graxa de forma independente da inxesta debido á activación da termoxénese no tecido adiposo pardo. Ademáis, vimos que p53 é fundamental para acción adipoxénica da ghrelina no tecido adiposo branco e no fígado. A disminución dos niveis de p53 de forma total ou específica no fígado, provocan un incremento da graxa hepática de forma independente da inxesta. Descubrimos que esta acción está mediada por TAp63 xa que a súa disminución hepática reduce a esteatose en ratos obesos e deficientes en p53. A sobreexpresión no fígado de TAp63 produce esteatose a través da activación de IKKβ e o estrés do retículo endoplasmático. Por último, atopamos niveis elevados de TAp63, IKKβ e XBP1 en fígado de doentes con esteatose e esteatohepatite. Plabras chave: esteatose, esteatohepatite, ghrelina, p53, p63, metabolismo lipídico. Resumen p53 juega un papel importante en diferentes funciones biológicas como la proliferación celular, la longevidad, el estrés y desórdenes asociados a la obesidad como la esteatosis y la esteatohepatitis no alcohólica. El objetivo de esta tesis es el estudio del papel de p53 en el metabolismo lipídico hepático y de los posibles mecanismos que conducen a las alteraciones metabólicas. Encontramos que la ausencia de p53 provoca una disminución de peso corporal y de masa grasa debido a la activación de la termogénesis en el tajido adiposo marrón. Además, observamos que p53 es fundamental para la acción adipogénica de la ghrelina en el tejido adiposo blanco y en el hígado. La disminución total o específica de los niveles de p53 en el hígado, provocan un incremento de la grasa hepática de forma independiente de la ingesta. Descubrimos que esta acción está mediada por TAp63 ya que su disminución hepática reduce la esteatosis en ratones obesos y deficientes en p53. La sobreexpresión de TAp63 produce esteatosis a través de la activación de IKK IKKβ y el estrés del retículo endoplasmático. Por último, encontramos niveles elevados de TAp63, IKKβ y XBP1 en el hígado de pacientes con esteatosis y esteatohepatitis. Plabras clave: esteatosis, esteatohepatitis, ghrelina, p53, p63, metabolismo lipídico. Abstract p53 plays an important role in different biological functions such as cell proliferation, longevity, stress and disorders associated with obesity such as steatosis and non-alcoholic steatohepatitis. The aim of this thesis is the study of the role of p53 in hepatic lipid metabolism and the possible mechanisms that lead to metabolic alterations. We found that the lack of p53 causes a decrease in body weight and fat mass due to the activation of thermogenesis in brown adipose tissue. In addition, we observed that p53 is crucial for the adipogenic action of ghrelin in white adipose tissue and in the liver. The total or specific decrease of p53 levels in the liver, cause an increase in liver fat independently of intake. We discovered that this action is mediated by TAp63 since its hepatic reduction attenuates steatosis in obese and p53-deficient mice. The overexpression of TAp63 induces steatosis through the activation of IKKβ and the stress of the endoplasmic reticulum. Finally, the expression of TAp63, IKKβ and XBP1 is increased in the liver of patients with steatosis and steatohepatitis. Key words: steatosis, steatohepatitis, ghrelin, p53, p63, lipid metabolism. ÍNDICE ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS Abreviaturas y Acrónimos 19 ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS AAV: virus adenoasociados (adeno-associated virus) ACADL: Long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase ACADM: medium-chain acyl-CoA dehydrogenase ACC: acetil CoA carboxilasa ad: adenovirus ADN: ácido desoxiribonucleico AgRP: péptido relacionado con agouti (agouti related protein) ALT: alanina aminotransferasa AMPc: adenosín monofosfato cíclico AMPK: proteína quinasa activada por AMP AP-1: proteína activadora 1 Apo: apolipoproteína ARNm: ácido ribonucleico mensajero AST: aspartato aminotransferasa ATF4: factor de transcripción activador 4. ATF6: factor de transcripción activante 6 (Activating Transcription Factor 6) ATGL: trilicéridos lipasa (adipose triglyceride lipase) ATP: adenosín trifosfato BAT: tejido adiposo pardo (brown adipose tissue) BW: peso corporal (body weight) C/EBP: (CCAAT/enhancer-binding protein) CAMKK: proteína quinasa quinasa dependiente de calcio/calmodulina (Calcium/calmodulindependent protein kinase kinase). CART: transcriptasa relacionada con la cocaína-amfetamina (Cocaineand amphetamineregulated transcript) CCK: colecitoquinina CCL2: (chemokine ligand 2) CHOP: proteína homóloga de C/EBP BEGOÑA PORTEIRO COUTO 20 ChREBP: proteína de unión en respuesta a carbohidratos (carbohydrate-responsive elelement-binding protein) CPT1: carnitina palmitoiltransferasa 1 CREB: (cAMP response element-binding) DAG: diacilglicerol DGAT2: (diacylglycerol O-acyltransferase) EE: gasto energético (energy expenditure) eIF2: (-subunit of the translation initiation factor eIF2) ERAD: componentes de degradación asociados al RE (ER-associated degradation) FAO: fatty acid oxidation FAS: ácido graso sintasa FATP: proteína transportadora de ácidos grasos (fatty acid transport protein) FBS: fetal bovine serum FGF21: factor de crecimiento de fibroblastos (fibroblast growth factor). FOXO1: Forkhead box O1 FQ: food quotient G6P: glucosa 6 fosfato GADD34 (growth arrest and DNA damage 34) GAPDH: gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa GCKR: regulaor de la glucoquinasa (glucokinase regulator) GFP: proteína verde fluorescente (Green fluorescent protein) GHSR: receptor del secretagogo de la hormona del crecimiento (growth hormone secretagogue receptor) GK: glucoquinasa GLP-1: péptido similar al glucagón 1 (glucagon-like peptide-1) GLUT: transportador de glucosa (glucose transporter) GRP78: proteína regulada por glucosa 78 (glucose-regulated protein 78/immunoglobulinheavy-chain-binding protein) GSK3: glucógeno sintasa quinasa 3 (glycogen synthase kinase 3) GTT: test de tolerancia a la glucosa (glucose test tolerance) Abreviaturas y Acrónimos 21 HCC: hepatocarcinoma HDL: lipoproteínas de alta densidad (High density lipoproteins) HFD: dieta alta en grasa (high fat diet) HMG-CoA: 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA reductasa HNE: 4-hydroxinoneal HNF: factor nuclear de hepatocitos (hepatocyte nuclear factor) HPRT: Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase HSL: hormona sensible a lipasa IGF-1: factor de crecimiento similar a la insulina (insulin-like growth factor) IKKβ: quinasa IB (I  B kinase) IL: interleuquina IMC: índice de masa corporal INSIG2: insulin induced gene 2 IR: resistencia a insulina (insulin resistance) IRE1: proteína requerida de inositol 1 α (Inositol Requiring enzyme 1 alpha) IRS: sustrato del receptor de la insulina (insulin receptor substrate) ITT: test de tolerancia a la insulina (insulin test tolerance) JAK-STAT: janus kinaseSignal transducer and activator of transcription JNK: quinasa C-Jun N-terminal (C-Jun N-terminal kinase) KO: knock out LA: actividad locomotora (locomotor activity) LDL: lipoproteína de baja densidad (low density lipoprotein) LKB1: liver kinase B1 LPL: lipoproteína lipasa LPS: lipopolisacárido LXR: factor hepático X (liver X receptor) MAPK: proteína quinasa activada por mitógeno (mitogen-activated protein kinase) MCD: dieta deficiente en metionina y colina (methionine and choline deficient diet) MCP1: proteína quimioatrayente de monocitos (monocyte chemoattractant protein-1) BEGOÑA PORTEIRO COUTO 22 MDA: malondialdehyde MGL: monoacilglicerol lipasa mTOR: (mammalian target of rapamicyn) mTORC: (mammalian target of rapamicyn complex ) MTTP: proteína microsomal de transferencia de lípidos (microsomal triglyceride transfer protein) NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NAFLD: enfermedad de hígado graso no alcohólico (non alcoholic fatty liver disease) NAS: NAFLD activity score NASH: esteatohepatitis no alcohólica (Nonalcoholic steatohepatitis) NEFFAs: ácidos grasos libres no esterificados (non-sterified free fatty acids) NFβ: factor nuclear kβ (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) NLRP3: NLR Family Pyrin Domain Containing 3 NOS2: óxido nítrico sintasa 2 (nitric oxide synthase 2) NPY: neuropéptido Y OMS: organización mundial de la salud p70S6: quinasa ribosomal S6 (ribosomal protein S6 kinase) PBS: tampón fosfato salino (phosphate buffer saline) PCR: reacción en cadena de la polimerasa (polimerase chain reaction) PDC: complejo piruvato deshidrogenasa PDK: piruvato deshidrogenasa quinasa PECK: fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (phosphoenolpyruvate carboxykinase) PERK: quinasa del factor de transcripción pancreático del retículo endoplásmico iniciador de la traducción eucariota (PKR-like ER kinase) PFK: fosfofructoquinasa 1 PGC1: proteína 1 alpha coactivadora del receptor activado por el proliferador de peroxisomas (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) PGM: fosfoglicerato mutasa PI3K: fosfoinositol 3 kinasa (phosphatidylinositide 3-kinases) PK: piruvato quinasa Abreviaturas y Acrónimos 23 PKA: proteína quinasa A PKC: proteína quinasa C PNPLA3: proteína 3 que contiene el dominio de la fosfolipasa tipo patatin (patatin-like phospholipase domain-containing protein 3) POMC: propiomelanocortina PP1: fosfatasa 1 PPAR: receptor del peroxisoma-proliferador activado alfa (peroxisome proliferatoractivated receptor alpha) PPARs: receptores del peroxisoma-proliferador activado (peroxisome proliferator-activated receptors) PUFAs: ácidos grasos poli-insaturados (polyunsaturated fatty acids) PYY: péptido YY QM: quilomicrones RE: retículo endoplasmático ROS: especies reactivas de oxígeno (reactive oxigen species) RQ: coeficiente respiratorio (respiratory quotient) RT: room temperature SCD-1: esteoril-CoA desaturasa SCO2: enzima citocromo c oxidasa 2ç SD: dieta estándar (standard diet) SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico. shRNA: short hairp ribonuclei acid siRNA: small interfering ribonucleotide SREBP: proteína de unión reguladora de esterol tipo 1-c (sterol regulatory element-binding protein 1c) T2DM: diabetes tipo 2 (type 2 diabetes mellitus) TG: triglicéridos TGFβ: factor de crecimiento transformante β (transforming grwoth factor β) TIGAR: (TP53 inducible glycolysis and apoptosis regulator) TLR: receptor tipo toll TM6SF2: superfamilia transmembrana 6(transmembrane 6 superfamily member 2) BEGOÑA PORTEIRO COUTO 24 TNFR2: receptor 2 del factor de necrosis turmoral (tumor necrosis factor receptor 2) TNFα: factor de necrosis tumoral α (tumor necrosis factor α) TRAIL: receptores de ligando inductores de apoptosis relacionados con el factor de necrosis tumoral (TNF-related apoptosis-inducing ligand) TSC2: proteína 2 de la esclerosis tuberosa TUDCA: ácido tauroso-deoxicólico (tauroursodeoxycholic acid) TZD: tiazolidinedionas UCP1: proteína desacoplante 1 (uncouplin protein 1) UPR: respuesta a proteínas desplegadas (unfolded protein response) VLDL: lipoproteína de muy baja densidad (very low density lipoprotein) WAT: tejido adiposo blanco (white adipose tissue) WT: wild type XBP1: proteína de unión X-box (X-box binding protein 1) ANGLICISMOS Ballooning: abalonmiento Browning: amarronamiento Downstream: más abajo Splicing: corte alternativo Knockout Upstream: más arriba El resto de las abreviaturas son de uso común o bien se detallan de un modo específico en el te INTRODUCCIÓN BEGOÑA PORTEIRO COUTO 32 durante el ayuno39,40. Existen al menos seis isoformas de sus receptores, la principal (Ob-Rb) altamente expresada en el hipotálamo donde la leptina ejerce su acción sobre neuronas que expresen su receptor mediante una ruta de señalización dependiente JAKSTAT (janus kinaseSignal transducer and activator of transcription)41 La principal función de la leptina está mediada a través de su receptor en el cerebro dando lugar a una disminución del apetito y a un aumento del gasto energético, que se explica principalmente por el incremento de la termogénesis. La leptina también ejerce funciones a nivel periférico a través de la expresión de sus receptores en distintos tejidos. Promueve la β-oxidación y la lipólisis e inhibe la síntesis de TG. En los ratones ob/ob, el tratamiento con leptina restaura la homeostasis de la glucosa y la sensibilidad a insulina. Estudios con animales y cultivos celulares muestran que la leptina modula la acción de la insulina y viceversa, existiento una interacción entre las dos vías de señalización42. Otros efectos endocrinos importantes de la leptina son, por ejemplo, la regulación de la función inmune, hematopoyesis, angiogénesis, desarrollo óseo y reproducción40.  Adiponectina: es un péptido de 244 aminoácidos altamente expresado por el WAT. Su secreción es estimulada por la insulina y otros factores que regulan sus niveles en la sangre. En individuos obesos, el incremento de masa grasa, da lugar a una disminución de la adiponectina circulante mientras que la pérdida de peso tiene como resultado concentraciones aumentadas en humanos y roedores38. En humanos, los niveles circulantes de adiponectina están inversamente relacionados con el IMC43 y la concentración de triglicéridos. Uno de los mecanismos que podrían explicar esta relación inversa es su actuación como factor antiinflamatorio; así, su producción es inhibida por factores proinflamatorios como TNF, IL6, el estrés y la hipoxia44. Posee dos receptores: AdipoR1 que se expresa principalmente en el músculo esquelético y AdipoR2, en el hígado45. Ambos receptores actúan a través de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) y PPAR36. En el hígado, aumenta la β-oxidación y disminuye la gluconeogénesis. Además, los niveles de AdipoR1 y AdipoR2 están disminuidos en NASH. En el músculo, la unión con el receptor da lugar a un incremento de la β-oxidación y de la captación de glucosa. Reduce los niveles plasmáticos de glucosa y triglicéridos.  Resistina: es un péptido de 12 KDa que se sintetiza principalmente en adipocitos aunque se han encontrado niveles bajos de ARNm en otros tejidos como el hipotálamo, glándula adrenal, bazo, músculo esquelético, páncreas y tracto gastrointestinal46. Aunque es principalmente una adipoquina, en humanos puede ser sintetizada por el músculo, células pancreáticas y macrófagos47. El patrón de secreción de la resistina es similar al observado en leptina. Los niveles circulantes incrementan tras las comidas y con el aumento de la masa grasa; se ve ampliamente afectada por el estado nutricional y metabólico ya que el ayuno da lugar a una disminución de los niveles de ARNm48. Estudios en ratones deficientes en resistina muestran bajos niveles de glucosa en sangre debido a una menor producción hepática; su tratamiento con resistina administrada de forma periférica no afecta al peso corporal ni a la ingesta49. Sin embargo, la administración central de resistina parece tener un efecto en la homeostasis metabólica por un lado inhibiendo la ingesta, y por otro lado induciendo la resistencia a insulina en el hígado. Estudios posteriores demostraron que la Introducción 33 administración central crónica de resistina reduce el peso corporal y activa la lipogénesis de novo en el hígado y en el WAT50,51. Señales procedentes del páncreas  Insulina: A pesar de los períodos de ayuno y alimentación, la concentración de glucosa en plasma permanece en un rango estable (4-7 mM) en individuos normales. Este control se debe al equilibrio que existe entre la absorción de glucosa a través del intestino, la producción hepática y la captación por parte de los tejidos periféricos en función de la demanda metabólica. La insulina incrementa la captación de glucosa en el músculo y en la grasa e inhibe su síntesis en el hígado. Promueve el almacenamiento de los sustratos mediante la lipogénesis en el músculo y la grasa, mientras que inhibe la gluconeogénesis en el hígado. Estimula la glucólisis y la síntesis de proteínas, el crecimiento y la diferenciación celular52. El receptor de la insulina es del tipo factor de crecimiento similar a la insulina (insulin-like growth factor, IGF-I) es una proteína tetramérica que consiste en dos subunidades  y dos subunidades β que poseen actividad tirosina quinasa. Con la unión de la insulina, se produce la autofosforilación de dichas tirosinas que actúan como sitios de unión para los siguientes componentes de la ruta de señalización. El receptor de la insulina posee 9 sustratos diferentes, de los cuales, cuatro son del tipo sustrato receptor de insulina (insulin-receptor substrate, IRS)53. Los sustratos poseen diferentes funciones según su distribución tisular. Principalmente hay dos vías de transducción de señales activadas por la insulina: 1) vía de la fosfatidilinositol 3 quinasa (PI3K) a través de la cual regula el metabolismo de glucosa y lípidos. 2)Vía de las MAPK que regula la síntesis de proteínas. La vía fosfatidilinositol 3 quinasa (phosphatidylinositide 3-kinase, PI3K) es la principal a través de la cual la isulina ejerce sus funciones en el metabolismo de la glucosa y lípidos. Esta vía transmite múltiples señales; la mejor caracterizada es lavía PI3K/Akt y PI3K/PKC (proteína quinasa C) 54,55. Existen otras quinasas como la quinasa C-Jun N-terminal (C-Jun N-terminal kinase, JNK), la quinasa IB (I  B kinase, IKKβ), PKC, mTORC (mammalian target of rapamicyn complex) y la proteína ribosomal quinasa (ribosomal protein S6 kinase, p70S6) que pueden fosforilar varios residuos de serinas en los sustratos para los receptores de insulina. En general, dichas fosforilaciones actúan como reguladores negativos, disminuyendo la respuesta en la señalización de la insulina56.  Glucagón: es una hormona secretada por las células alfa de los islotes de Langerhans pancreáticos derivado del gen pre-pro-glucagón, en respuesta a bajos niveles de glucosa plasmática 57. Esta hormona contrarresta la hipoglucemia y se opone a las acciones de la insulina mediante la activación de la síntesis y movilización de la glucosa hepática 58. Sin embargo, además de su implicación en el metabolismo de la glucosa, se ha descrito que el glucagón también está involucrado en la regulación del metabolismo lipídico y gasto energético. Numerosos estudios han descrito que el efecto del glucagón sobre el metabolismo lipídico se traduce en una reducción de la síntesis y secreción de componentes implicados en el almacenamiento energético (TG, BEGOÑA PORTEIRO COUTO 34 lipoproteínas de muy baja densidad (very low density lipoprotein, VLDL), colesterol)) y en una movilización lipídica 59,60. Se ha descrito que la administración periférica de glucagón reduce la ingesta pero este efecto es más acusado cuando la administración es central 61; la acción anorexigénica del glucagón implican la vía PKA/proteína quinasa quinasa dependiente de calcio calmodulina (calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase CAMKK/AMPK en el arcuato62. Señales del tracto gastrointestinal  Ghrelina: se descubrió como un ligando endógeno para el receptor secretagogo de la hormona de crecimiento (growth hormone secretagogue receptor, GHSR)63. Se trata de un péptido de 28 aminoácidos producido y secretado por las células parietales del estómago64. La expresión de ARNm de la ghrelina aumenta por la pérdida de peso, el ayuno y la hipoglucemia inducida por la insulina. Su administración periférica estimula la ingesta de alimentos y disminuye la utilización de la grasa. Por lo tanto, se ha propuesto a la ghrelina como una señal entérica involucrada en la homeostasis energética, siendo la única hormona peptídica que estimula el apetito en lugar de actuar como una señal de saciedad65. Además de su efecto hiperfágico, se ha demostrado que la ghrelina provoca un aumento de la masa grasa tras su administración central66,67 o periférica68. Para conocer los mecanismos moleculares que llevan a dicha adiposidad, estudios in vitro han demostrado que la ghrelina estimula la diferenciación de preadipocitos de rata69 y estimula la acumulación de lípidos así como la apoptosis inducida por TNF en adipocitos viscerales humanos70,71. Además de sus aciones directas sobre el WAT, la infusión crónica de ghrelina provoca esteatosis hepática, aumentando el número de gotas lipídicas y el contenido de TG debido a un mecanismo dependiente receptor GHSR1a72. De forma similar, la administración central crónica de ghrelina también favorece la acumulación de lípidos hepáticos y reduce su movilización67. Los efectos anabólicos de esta hormona, son parcialmente independientes de su efecto hiperfágico ya que se ha visto que en ratas obesas inducidas por dieta, aumenta la adiposidad y la expresión de enzimas lipogénicas sin efectos hiperfágicos debido a la resistencia de los efectos orexigénicos de la ghrelina en las neuronas ArRP/NPY73.  CCK (Colecitoquinia): péptido sintetizado en el yeyuno y duodeno en respuesta a la presencia de nutrientes. Tiene una vida media de entre 1-2 minutos, siendo su principal acción reducir el apetito activando aferencias del nervio vago. Tiene funciones locales como el retraso del vaciado gástrico, estimulación de la secreción de enzimas pancreáticas y contracción de la vesícula biliar 74.  GLP-1 (glucagon-like peptide-1): es una incretina derivada del procesamiento post-transcripcional del gen pre-pro-glucagón en las células L del intestino y en el sistema nervioso central 75. Las acciones de GLP-1 abarcan diversos tejidos, estimulando la secreción de insulina en el páncreas, retrasando el vaciado gástrico e incrementando la presión sanguínea en el corazón. En el cerebro, GLP-1 ejerce su acción metabólica entre otras zonas, en el hipotálamo, actuando como una hormona de saciedad y en el metabolismo de la glucosa. La activación de GLP-1 central inhibe la captaciónde glucosa en el músculo, favoreciendo la liberación de insulina76. Las Introducción 35 acciones centrales de GLP-1 también involucran al metabolismo lipídico en el WAT reduciendo el almacenamiento de TG independientemente de la ingesta 77. El BAT está también regulado por los efectos centrales de GLP-1, ya que incrementa el programa termogénico, favoreciendo la transformación de los adipocitos del WAT a un fenotipo de adipocito marrón (browning) 78,79.  PYY (péptido Y): este péptido se localiza a lo largo del intestino con una mayor concentración en el colón y en el recto. Aunque existe alguna controversia al respecto, la forma 1-36 es orexigénica mientras que PYY 3-36 ejerce un efecto anorexigénico. Sus efectos post-pandriales incluyen retraso del vaciado gástrico y reducción de la secreción gástrica. Se han detectado acciones sobre el metabolismo de la glucosa pero con un componente de dimorfismo sexual, que puede ser asociado a las diferencias de género sobre el eje hipotálamo-hipofisario 80. METABOLISMO HEPÁTICO METABOLISMO LIPÍDICO HEPÁTICO El hígado es un órgano metabólico clave que controla el metabolismo energético del cuerpo. Actúa como un centro para conectar metabólicamente a varios tejidos, incluidos el músculo esquelético y el tejido adiposo. Su metabolismo está estrechamente controlado. Se han identificado múltiples señales nutritivas, hormonales y neuronales para regular el metabolismo de la glucosa, lípidos y los aminoácidos. La disfunción de la señalización hepática y el metabolismo causa o predispone a la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) y/o diabetes tipo 281. Tras la digestión, la glucosa, los ácidos grasos y los aminoácidos se transportan al hígado. En estado posprandial, la glucosa se almacena en forma de glucógeno y/o se convierte en ácidos grasos o aminoácidos. El hígado es el principal órgano que puede convertir carbohidratos en ácidos grasos. Cuando existe un exceso de glucosa en los hepatocitos, los ácidos grasos libres se esterifican con glicerol-3-fosfato para generar TG que se almacenan en gotas lipídicas o bien se empaquetan y secretan a la circulación como partículas de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) hacia el WAT y otros tejidos extrahpepáticos (imagen 4). Los aminoácidos se metabolizan para proporcionar energía o se utilizan para sintetizar proteínas, glucosa y/u otras moléculas bioactivas. En ayuno o durante el ejercicio, los combustibles (glucosa y TG) se liberan desde el hígado a la circulación y se metabolizan en el músculo, tejido adiposo y otros BEGOÑA PORTEIRO COUTO 36 tejidos. El WAT produce y libera NEFFAs y glicerol a través de la lipólisis. El músculo descompone el glucógeno y las proteínas liberando lactato y alanina. Lactato, alanina y glicerol vuelven al hígado para ser utilizados como precursores para la síntesis de glucosa (gluconeogénesis). Los NEFFAs se oxidan en las mitocondrias hepáticas a través de la β-oxidación generando cuerpos cetónicos (cetogénesis) (imagen 4) los cuales proporcionan combustibles metabólicos para los tejidos extrahepáticos durante períodos de inanición o durante el ejercicio81. Grasa procedente de la dieta El hígado es altamente susceptible a alteraciones en el contenido de lípidos de la dieta. La esteatosis hepática se desarrolla en humanos y roedores en los primeros días de inicio de dieta alta en grasa. Esto no es de extrañar ya que el 75% del aporte sanguíneo que recibe el hígado procede de la vena porta hepática que transporta la sangre procedente del tracto gastrointestinal, páncreas, bazo y vesícula biliar al hígado. Aproximadamente entre un 15-20% del contenido de TG proceden de la grasa de la dieta82. Metabolismo lipídico extrahepático Comienza con la absorción intestinal de las grasas procedentes de la dieta. Para poder pasar del lumen intestinal al plasma, los lípidos son emulsionados e hidrolizados por los ácidos biliares dentro del lumen. Los lípidos hidrolizados son absorbidos por los enterocitos donde son empaquetados en partículas de lipoproteínas (quilomicrones nacientes). Se secretan al sistema linfático y entran en la circulación. Durante su viaje pierden dos apolipoproteínas, ApoA-I y ApoA-IV, que son sustituidas por ApoE y ApoC-II, importantes para su procesado. ApoC-II activa a la lipoproteína lipasa (LPL) que facilita la digestión de los quilomicrones a ácidos grasos y glicerol. Los ácidos grasos son captados parcialmente por los adipocitos mientras que los quilomicrones remanentes vuelven a la circulación. ApoE es reconocido por el receptor de lipoproteínas de baja densidad (low density lipoproteín, LDL) en el hepatocito lo que facilita su captación. Dentro del hepatocito los quilomicrones remanentes son eliminados por lisosomas liberando glicerol, ácidos grasos, colesterol, aminoácidos y residuos de fosfato que son metabolizados y reciclados en nuevas partículas, VLDL83. Imagen 4 : Metabolismo hepático de TG1. Con permiso de American ASSN for the advancement of science. Introducción 37 Lipogénesis La lipogénesis implica la síntesis de ácidos grasos de novo a partir de intermediarios metabólicos como el acetil-CoA o el malonil-CoA. Está altamente regulada por la glucosa y la insulina, que activan fatores de transcripción como la proteína de unión reguladora de esterol tipo 1-c (sterol regulatory element-binding protein 1c, SREBP1c) y la proteína de unión en respuesta a carbohidratos (carbohydrate-responsive elelement-binding protein, ChREBP) en el núcleo (imagen 4). La insulina activa SREBP1c a través de la vía de señalización AKT, factor hepático X (liver X receptor, LXR) y mTOR84. SREBP1c es la isoforma más expresada en el hígado; tiene funciones superpuestas con otra proteína de la misma familia, SREBP2 pero ésta, está implicada en la regulación del metabolismo del colesterol85. Los ratones transgénicos para SREBP1c, donde incrementa su expresión, poseen mayor actividad lipogénica86. La glucosa promueve la lipogénesis activando a ChREBP87 que al igual que SREBP1c, regula de forma positiva la expresión de múltiples genes involucrados en la síntesis de ácidos grasos como la acetil CoA carboxilasa (ACC), la ácido graso sintasa (FAS) y la esteoril CoA desaturasa (SCD1)87,88. ChREBP, además, incrementa genes involucrados en la glucólisis lo cual proporciona más sustratos para la síntesis de NEFFAs y TG87. Dependiendo del estado metabólico, los ácidos grasos son procesados hacia TG e inmediatamente almacenados o bien son rápidamente oxidados como fuente de energía durante un estado de ayuno (imagen 4). En individuos sanos, en ayuno, la tasa de lipogénesis de novo es de aproximadamente el 5% mientras que durante la comida incrementa hasta un 23%. Sin embargo, en pacientes con NAFLD que presentan hipertrigliceridemia e hiperinsulinemia, muestran un incremento de la lipogénesis de novo hasta un 26% tras un ayuno82,83. Captación Otra fuente de ácidos grasos en el hepatocito es el reclutamiento desde el torrente sanguíneo. Los ácidos grasos, no solo pasan al interior de la célula de forma pasiva sino también facilitada a través de proteínas transportadoras de ácidos grasos (fatty acid transport protein, FATP) como FATP2 y FATP5. Los ratones deficientes en el FATP5 poseen una disminución de la absorción hepática de NEFFAs y por tanto del almacenamiento de TG89. La translocasa de ácidos grasos CD36/FAT se expresa en macrófagos, adipocitos, miocitos, enterocitos y hepatocitos facilitando la captación y el tráfico intracelular de los ácidos grasos libres. En roedores con esteatosis hepática, la expresión de CD36/FAT se incrementa, aunque su papel en la enfermedad hepática en humanos no está muy claro. En pacientes con obesidad mórbida, los niveles de ARNm de CD36/FAT se correlacionaron positivamente con el contenido de grasa hepática y con la apoptosis en esteatohepatitis no alcohólica (Nonalcoholic steatohepatitis, NASH90,91. Oxidación Facilita la degradación de los ácidos grasos a acetyl-CoA para obtener energía por lo que su tasa será elevada en ayuno y baja en estado posprandial. La oxidación β mitocondrial no solo proporciona energía para los hepatocitos sino que también genera cuerpos cetónicos (β- BEGOÑA PORTEIRO COUTO 38 hidroxibutirato, acetoacetato y acetona) que se exportan a la circulación y proporcionan combustibles metabólicos para los tejidos extrahepáticos durante el ayuno81. Los ácidos grasos se activan mediante la acyl-CoA sintetasa en el citosol. Este proceso es indispensable para que puedan entrar en la mitocondria. Los de cadena media y corta pueden pasar directamente por difusión, mientras que los de cadena larga lo hacen a través de la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1). El malonil CoA, intermediario en la síntesis de novo de TG, es un inhibidor alostérico de CPT183. PPAR y la insulina están involucrados en la regulación de la oxidación92. PPAR regula de forma positiva las proteínas de transporte de ácidos grasos y enzimas relacionadas con el metabolismo de la ApoB93. En circunstancias normales, los ácidos grasos de cadena corta, media y larga sufren βoxidación en las mitocondrias, mientras que los ácidos grasos de cadena muy larga se oxidan en los peroxisomas. En situaciones de sobrecarga de ácidos grasos o en diabéticos, la - oxidación, tiene lugar en el retículo endoplasmático94. Secreción de lípidos Aunque los mecanismos de cómo las lipoproteínas se ensamblan y son secretadas no se conoce en detalle, hay tres componentes esenciales para el proceso: ApoB, la principal proteína responsable del ensamblaje y secreción de lípidos; una cantidad adecuada de lípidos y la enzima responsable de su transferencia hacia las lipoproteínas nacientes, la proteína microsomal de transferencia de lípidos (microsomal triglyceride transfer protein, MTTP). Por lo tanto, mutaciones en Apob o delecciones en Mttp, reducen la secreción hepática de las VLDL y provocan esteatosis95. En humanos, mutaciones en el exón 26 de Apob resulta en elevados niveles de colesterol, hígado graso y posible cirrosis y hepatocarcinoma96. La secreción de VLDL desde el hígado está a menudo incrementada en pacientes con esteatosis; la tasa de secreción de lípidos es lineal conforme a su incremento, hasta que se alcanza una meseta (umbral) en el que los niveles de lípidos hepáticos exeden el 10%. En esos casos, a pesar de la secreción, no se revierte la enfermedad de hígado graso no alcohólico (Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD82. Introducción 39 Macroautofagia Estudios recientes han relacionado la macroautofagia con la homeostasis lipídica en el hígado97. Mediante la ruta lisososmal, se reciclan los constituyentes celulares prescindibles en fuentes de energía durante un estado de ayuno98. Estudios recientes en animales sugieren que es un proceso clave en la lipólisis hepática y degradación de la gota lipídica. Durante la inanición, la macroautofagia conduce a la fusión de lisosomas y gotas lipídicas dentro de autofagosomas que son degradados; los ácidos grasos son por tanto liberados (imagen 5) y pueden ser catabolizados vía oxidación o a cuerpos cetónicos en caso de inanición. Además, el glicerol liberado en la degradación de los TG, se puede convertir en glucosa vía gluconeogénesis hepática. METABOLISMO HEPÁTICO DE LA GLUCOSA Captación, síntesis de glucógeno y gluconeogénesis El hígado desempeña un papel fundamental en el metabolismo de la glucosa ya que regula su concentración en sangre. La glucosa llega a los hepatocitos a través de los transportadores de glucosa, GLUT2. La deleción de este transportaor bloquea su entrada a la célula sin afectar a la síntesis de novo; esto sugiere que la glucosa puede utilizar otros mecanismos de entrada99. Tras su entrada, la glucosa se fosforila a glucosa-6-fosfato (G6P) mediante la enzima glucoquinasa (GK). Se sabe que las mutaciones en el gen de la GK están implicadas en el desarrollo de NAFLD91. Se regula transcripcionalmente por SREBP1c, por los factores nucleares de hepatocito (hepatocyte nuclear factor, HNF) HNF4, HNF6, FOXO1 (Forkhead box O1)83 (imagen 5). La G6P no puede ser pasar a través de los transporatdores por lo que es retenida en el interior del hepatocito. Tras la ingesta, la G6P actúa como precursor para la síntesis de glucógeno a través de la glucógeno sintasa100. La insulina activa a la fosfoprotein fosfatasa, la cuál cataliza la hidrólisis de los grupos fosfato de varios enzimas implicados en el metabolismo del glucógeno, incluyendo la glucógeno sintasa. Esta enzima solo está activa cuando no está fosforilada y este hecho es dependiente del PKA la cuál se activa alostericamente por la G6P y además está finamente regulada por la ratio glucagon/insulina. En ayuno, la concentración de insulina disminuye. El glucagón y las catecolaminas, secretadas por las céluas  del páncreas y la médula adrenal respectivamente, activan a PKA la cual activa a la glucógeno fosforilasa81. Durante períodos cortos de ayuno, el hígado produce glucosa principalmente a través de la glucógenolisis. Sin embargo, el glucógeno se agota rápidamente durante las 2-6 horas de ayuno y decrece progresivamente después de las 12-40 horas; luego entra en juego un segundo aporte de glucosa proveniente de la gluconeogénesis, capaz de mantener la homeostasis de la glucosa Imagen 5 : Función de la macroautofagia en el metabolismo lipídico hepático97. Con permiso de American Physiological Society. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 40 hasta las 60 horas de ayuno101. En la gluconeogénesis, el hepatocito es capaz de producir glucosa a partir de precursores como lactato, piruvato, glicerol y aminoácidos. La tasa de gluconeogénica se controla por la activación de las encimas fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PECK), fructosa-1,6-bifosfatasa y la G6P fosfatasa102. En ayuno, hormonas catabólicas, como el glucagón, dan lugar a una señalizacion mediada por AMP cíclico que desencadenan la interacción de CREB con sus coactivadores para dar lugar a la activación transcripcional de genes gluconeogenicos103. Además del elemento de respuesta a AMPc (cAMP response element-binding, CREB), FOXO1 junto con la proteína 1 alpha coactivadora del receptor activado por el proliferador de peroxisomas (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,PGC1) y otros factores tienen efectos trancripcionales sobre genes gluconeogenicos en ayuno gracias a la falta de señalizacion de la via de insulina y su principal diana AKT104. De forma contraria, después de la ingesta, la terminación de la gluconeogenesis hepática se alcanza por la inhibición transcripcional de gened gluconeogénicos por insulina. Concretamente, en estas condiciones, cuando los niveles de insulina son elevados se activa la señalizacion por AKT de forma que se impide la actuación de FOXO1 sobre la transcripción de genes gluconeogénicos105. Glucólisis Los hepatocitos poseen una gran flexibilidad a la hora de seleccionar combustibles para la obtención de enrgía (glucosa y/o ácidos grasos). Dicha selección está regulada por señales hormonales. Tras la ingesta, momento en que la glucosa es abundante, el hepatocito prefiere la vía glucolítica; la G6P se metaboliza para generar piruvato y otros intermediarios que se utilizan para la síntesis de lípidos y aminoácidos o bien se procesa en el ciclo de Krebs para obtener energía. En ayuno, estado en que la concentración de glucosa es baja, el hepatocito oxida ácidos grasos para obtener energía81. La glucólisis está regulada por cuatro enzimas principales: la GK, fosfofructoquinasa 1 (PFK), la piruvato kinasa (PK) y las piruvato deshidrogenasa quinasas (PDKs). Durante el ayuno, la expresión de estas enzimas se encuentra baja mientras que tras la ingesta incrementan su actividad glucolítica106. La glucosa puede activar factores de transcripción como ChREBP que induce la expresión de genes como la PK dando lugar a piruvato. ChREBP juega por tanto un papel crítico para el depósito del exceso de carbohidratos en forma de grasas puediendo contribuir al desequilibrio entre el consumo de nutrientes y su almacenaje favoreciendo la obesidad107 (imagen 6). Imagen 6 : Metabolismo hepático de la glucosa83. Licencia creative commons. Introducción 41 ENFERMEDADES HEPÁTICAS ASOCIADAS AL SÍNDROME METABÓLICO La enfermedad de hígado graso no alcohólico (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD) se define como la presencia de más de un 5% triglicéridos en los hepatocitos, en ausencia de otras patologías hepáticas como infecciones víricas crónicas como la hepatitis, el uso de medicamentes que inducen esteatosis y otras enfermedades como hepatitis autoinmune, hemocromatosis, enfermedad de Wilson o consumo de acohol108. La NAFLD está fuertemete asociada con las características del síndrome metabólico, que incluyen obesidad, resistencia a insulina (insulin resistance, IR) o T2DM y dislipidemia; por lo tanto, se considera la manifestación hepática de este síndrome. Se ha convertido en la causa más frecuente de disfunción hepática en muchos países desarrollados o en vías de desarrollo, en línea creciente con la prevalencia en aumento de la obesidad e IR. Se prevé además, que sea la causa principal para el transplante hepático en varios países en una década ya que la incidencia de daño hepático más severo (cirrosis) por hepatitis viral crónica disminuye, mientras que la de NAFLD aumenta91. La NAFLD se presenta como una enfermedad inflamatoria hepática crónica con un amplio espectro de estadíos, como podemos observar en la imagen 7, desde una simple esteatosis (acumulación intrahepática de TG) hacia NASH y hasta fases fnales de la enfermedad como la fibrosis, cirrosis y hepatocarcinoma celular. En paralelo a dicha acumulación de lípidos, pueden ocurrer otros eventos dañinos como lipotoxicidad, estrés oxidativo, inflamación, apoptosis, etc. que son los que provocan la progresión de NAFLD a NASH y hacia fibrosis, cirrosis y, en último caso, a hepatocarcinoma109. Imagen 7 : El espectro de la enfermedad del hígado graso no alcohólico1. Con permiso de American ASSN for the advancement of Science. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 48 mitocondrial. FXR también inhibe directamente la activación de las células estelares hepáticas y la fibrogénesis hepática así como la inflamación de la microbiota intestinal147.  LXR: es un factor de transcripción que juega un papel crítico en la homeostasis del colesterol y el metabolismo de los ácidos biliares. Aumentan la lipogénesis hepática ya que regula SREBP1c. Además, el promotor de ChREBP contiene sitios de unión a LXR incrementando así su actividad148.  PXR (pregnane X receptor): modula la homeostasis lipídica a través de SREBP1c y de carbohidratos, la inflamación y la fibrogénesis. Suprime la gluconeogénesis hepática compitiendo con el factor nuclear HNF4 por su lugar de unión a PGC1. PXR también actúa como co-represor de la transcripción de FOXO1, otro regulador positivo de la gluconeogénesis que está sobreexpresada en NASH. Además de sus efectos en la regulación metabólica, PXR tiene potentes actvidades antiinflamatorias y antifibróticas tanto in vivo como in vitro. Es capaz de suprimir la apoptosis vía factor nuclear kβ (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NFβ) y mejora la autofagia en los hepatocitos147,149.  PPARs receptores del peroxisoma-proliferador activado (peroxisome proliferator-activated receptors): Pertenecen a una superfamilia de receptores nucleares; se pueden clasificar en tres subtipos: PPPAR, PPAR (también llamado PPARβ) y PPAR147. - PPAR. Normalmente su expresión es baja en hígado, pero en modelos de resistencia a insulina e hígado graso, su expresión es elevada. La deleción parcial de PPAR en modelos de ratones resistentes a insulina (ob/ob) pudo atenuar el desarrollo de la esteatosis, independientemente de la presencia de hiperinsulinemia o hiperglicemia150. PPAR promueve la diferenciación de los adipocitos, la secreción de adiponectina y mejora la sensibilidad a insulina. Las tiazolidinedionas (TZDs), utilizadas en el tratamiento para la diabetes, son agonistas de PPAR que revierten NASH y una ligera fibrosis en pacientes con NASH, pero poseen efectos secundarios no deseados; por eso se trabaja en compuestos en los que se combinan PPAR y PPAR149. - PPAR: se expresa en el hígado y otros órganos metabólicamente activos como el músculo estriado, el riñón y el páncreas. Regula de forma positiva numerosos enzimas involucrados en la β-oxidación, transportadores de ácidos grasos a través de la membrana y la cetogénesis. La activación de PPAR mejora la eliminación de TG mediante la regulación positiva de LPL. Otra diana de PPAR es la catalasa, que mejora la detoxificación del peróxido de hidrógeno y protege al hepatocito frente al estrés oxidativo, que es crucial para el desarrollo del daño hepático en NASH. PPAR aumenta la transcripción de FGF21. Por último, PPAR tiene propiedades antiinflamatorias e inhibe la secreción de citoquinas como IL1, IL6 y TNF liberadas debido al incremento LPS (lipopolisacárido). - PPAR: su expresión es ubicua y se ha implicado en el metabolismo lipídico y la homeostasis energética en varios órganos, incluyendo el hígado. En las células no parenquimales, tiene propiedades anti-infalamatorias, ya que polariza a los macrófagos de un tipo de respuesta pro-inflamatorio M1 a un fenotipo M2 anti-inflamatorio149. Introducción 49 B. AMPK Es un sensor celular de estado energético de la célula y un regulador clave del metabolismo celular. Se activa durante la restricción calórica o demandas de energía elevadas, cuando se agotan las reservas de ATP. La activación de AMPK estimula la producción de ATP mediante la activación de rutas catabólicas, como la βoxidación y la inhibición de procesos que consumen ATP, como la lipogénesis. La metformina, tratamiento para la diabetes, activa la actividad hepática de AMPK. Las TZDs se conocen principalmente porque actúan activando PPAR, sin embargo, se ha visto que también activan AMPK85 (imagen 13). En modelos preclínicos de NASH, los activadores de AMPK mejoran la resistencia a insulina suprimiendo la gluconeogénesis. También mejora NASH inducido debido a la ingesta de una dieta alta en grasa a través de la regulación negativa de factores clave en la síntesis de colesterol y ácidos grasos, como SREBP y ACC. En los hepatocitos, la activación de AMPK puede también mejorar la biogénesis y actividad mitocondrial mediante la inhibición de mTORC1, previniendo así la acumulación hepática de lípidos debido al exceso de nutrientes. Además de sus efectos metabólicos, la activación de AMPK también tiene un efecto directo antiinflamatorio ya que induce la transición funcional de macrófagos que liberan citoquinas proinflamatorias, fenotipo M1 a fenotipo M2 o antiinflamatorias147,149. C. mTOR Es también un regulador del metabolismo y crecimiento celular que responde a estímulos nutricionales y hormonales; la desregulación de mTOR está implicada en muchas enfermedades como la diabetes, la obesidad y NASH. mTOR se asocia con varias proteínas para formar dos complejos de señalización con diferentes reguladores y sustratos diana: mTORC1 y mTORC2. mTORC1 se activa por aminoácidos y factores de crecimiento como la insulina e IGFs. Promueve el anabolismo celular mediante la síntesis de proteínas, lípidos y nucleótidos. Regula positivamente la lipogénesis a través de la inhibición de AKT y directamente a través de la activación transcripcional de SREBP1c. Además del metabolismo de ácidos grasos, mTORC1 activa la síntesis de colesterol y su captación mediante el control de SREPB2. Bloquea rutas catabólicas y procesos como la autofagia a nivel transcripcional y post-transcripcional regulando negativamente PPAR y la cetogénesis. En modelos animales, la inhibición de mTORC1 mejora NASH inducido por dieta alta en grasa147. Imagen 13 : Consecuencias hepáticas de la activación de AMPK85. Con permiso de American Society for Clinical Investigation. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 50 LIPOTOXICIDAD La progresión de la esteatosis a NASH podría determinarse no por la cantidad de TG en el hígado, sino más bien por la acumulación de intermediarios lipotóxicos procedentes de la síntesis de TG y/o la lipólisis. Los mediadores lipotóxicos clave en el daño hepático podrían también ser objeto de intervenciones farmacológicas. SREBP2 es el mediador de la acumulación del colesterol libre. Existen estudios del papel de la acumulación del colesterol libre y la patogénesis del NASH151. El mecanismo por el cual se interrumpe la regulación negativa de SREBP2 y los depósitos de colesterol en la patogénesis del NASH involucran a mTORC1 que media la transcripción del gen que codifica para SREBP2, SREBF2147. La ceramida es un esfingolípido que consiste en un ácido graso saturado o monoinsaturado de longitud variable unido a un grupo amino y una base ensfingosina. Existen evidencias clínicas y de laboratorio que indican que la acumulación intracelular de ceramidas favorece la patogénesis de NASH a través de una gran variedad de mecanismos que incluyen, la disfunción de la homeostasis del cálcio, lo cual conduce a estrés del retículo endoplasmático y, en última instancia, a la activación de la apoptosis mediada por dicho estrés. La acumulación de ceramidas puede provocar resistencia a insulina mediante la inhibición de Akt. También participa en la activación del inflamosoma y empeora la autofagia147. La enzima DGAT2 (diacylglycerol O-acyltransferase) cataliza el último paso en la síntesis de TG, la esterificación del DAG mediante ésteres de acil-CoA de cadena larga. Exsiten dos isoformas de la DGAT, DGAT1 y DGAT2. La DGAT2 se expresa principalmente en hígado y tejido adiposo. Su inhibición reduce la expresión de SREBP1c y mejora la expresión de genes relacionados con la oxidación de los ácidos grasos y rutas termogénicas. La sobreexpresión de DGAT2 está relacionada con una marcada esteatosis hepática, adiposidad y resistencia a insulina. La acumulación de DAG puede desencadenar inflamación a tarvés de NFβ mediada por la acción de la PKC (PKC) además de fibrosis hepática mediada por las células estelares147. ESTRÉS OXIDATIVO En un contexto de gran abundancia de ácidos grasos, la mitocondria está sobrepasada y los peroxisomas y la membrana del retículo endoplasmático comienzan a ser sitios de oxidación152. Se han observado defectos estructurales en las mitocondrias de pacientes con NAFLD, lo que puede ser indicativo de fallo en la fosforilación oxidativa. La disfunción de la respiración mitocondrial puede conducir directamente a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). La oxidación en el retículo endoplasmático está controlada por el sistema de citocromos p450, concretamente por CYP2E1 y los miembros de la familia CYP4A. CYP2E1 parece ser la principal fuente de H2O2 y de peroxidación lipídica (imagen 12). Además, presenta mayor actividad en individuos obesos, diabéticos o hiperlipidémicos130. El efecto acumulativo de la oxidación de ácidos grasos extramitocondrial incrementa el estrés oxidativo. Algunas consecuencias de la formación de estas especies es el agotamiento del ATP, daño en el ácido desoxiribonucleico (ADN) (afectando a la biogénesis mitocondrial), alteraciones en la estabilidad de las proteínas, destrucción de membranas vía peroxidación lipídica y liberación de citoquinas inflamatorias85. Introducción 51 La peroxidación lipídica hace referencia a la degradación oxidativa de los lípidos de las membranas celulares. Las especies reactivas de oxígeno son moléculas de vida media corta y con efectos locales. Cuando atacan a ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), resulta en la formación de productos aldheido, como el HNE (4-hydroxinoneal) y el MDA (malondialdehyde), que poseen una vida media más larga y tiene capacidad de difundir, amplificando los efectos del estrés oxidativo153 (imagen 12). Los aldehídos formados a través de la peroxidación de los ácidos grasos poliinsaturados (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) empeoran la homeostasis celular: la síntesis de nucleótidos y proteínas, agotan el glutatión (antioxidante natural), aumentan la producción de citoquinas proinflamatorias como el TNF, promueven la infiltración de células inflamatorias en el hígado y activan las células estelares que promueven la deposición de colágeno, la fibrosis y la perpetuación de la respuesta inflamatoria153. Además, la oxidación de los PUFA aumenta la proteólisis en el retículo endoplasmático de ApoB, atenuando así la secreción de VLDL en roedores154. INFLAMACIÓN Existen numerosas evidencias de la relación entre la obesidad y la inflamación. La obesidad se asocia con un grado de inflamación bajo y crónico en el tejido adiposo blanco a través de la activación del sistema inmune innato. Además, la inflamación asociada a la obesidad va unida a la resistencia a insulina en tejidos periféricos155. En el hígado, las células de Kupffer se activan en individuos obesos y segregan citoquinas que promueven la acumulación de macrófagos proinflamatorios, contribuyendo a la esteatosis hepática. Dichas citoquinas proinflamatorias activan quinasas con actividad seria/treonina como JNK e IKK156. Imagen 14 : Mecanismos de daño celular inducido por lípidos en NAFLD85. Con permiso de American Society for Clinical Investigation. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 52 Principales vías de señalización inflamatorias A. Factor nuclear β-IB quinasa TNF estimula la ruta de señalización del factor nuclear β (NF-β)-IB quinasa (IKK) para estimular la liberación de señales proinflamatorias a través del control transcripcional. En el citoplasma, NF-β, está secuestrado por el inhibidor IB para evitar su translocación al núcleo. La activación de IKK conduce a la fosforilación de IkB y a la liberación de NF-β, que ya puede llegar al núcleo y unirse a promotores de genes proinflamatorios para iniciar su transcripción. Las subunidades catalíticas son IKK e IKKβ que, junto con la subunidad reguladora NEMO, forman el complejo IKK157,158. B. Quinasa c-Jun N-terminal (JNK) La ruta de señalización c-Jun N-terminal quinasa (JNK) proteína activadora 1 (AP-1), promueve la liberación de señales proinflamatorias. La activación y fosforilación de JNK conlleva la fosforilación del extremo N-terminal en los homodímeros c-Jun para formar heterodimeros c-Jun-c-Fos que se unen a los promotores de genes proinflamatorios. La actividad de JNK aumenta en los tejidos sensibles a insulina (hígado, músculo y tejido adiposo) tanto en ratones alimentados con una dieta alta en grasa como en ratones deficientes en leptina (ob/ob)159. La señalización de JNK también puede ser activada por el estrés del retículo endoplasmático e inhibe directamente la señalización de la insulina a través de la fosforilación serina/treonina de su receptor, evitando así, la fosforilación de los sustratos IRS160. C. El inflamosoma Es un complejo proteico que comprende proteínas “andamio” (scaffold), proteínas adaptadoras y caspasas que participan en la maduración y secreción de citoquinas inflamatorias como IL1β e IL18161. Este tipo de inflamación tiene gran relevancia en algunas patologías como el NASH, ya que acentuan el daño inicial y lo agravan. El inflamosoma requiere dos señales para producir la inflamación. La primera señal de activación se debe a las citoquinas inflamatorias; éstas, activan la vía de señalización NF-β. NLRP3 (NLR Family Pyrin Domain Containing 3) es el inflamosoma más estudiado; forma un complejo con la pro-caspasa 1 la cual se activa y provoca el corte y activación de las procaspasas IL1β e IL18. La segunda señal de activación es proporcionada por moléculas exógenas, por ejemplo, producidas por agentes patógenos. Estos factores también incluyen al palmitato y las ceramidas, presentes en concentraciones elevadas en individuos obesos156,162. D. Activación de macrófagos en el hígado en el desarrollo de la lipotoxicidad hepática Existen dos tipos de macrófagos; los denominados macrófagos M1 o macrófagos activados clásicamente, juegan un papel fundamental en la inmunidad humoral y respuesta común a patógenos. Secretan grandes cantidades de citoquinas proinflamatorias como TNF e IL12. Macrófagos tipo M2, con respuesta antiinflamatoria. En animales alimentados con dieta alta en grasa y en individuos obesos, lo que ocurre es un incremento del número de macrófagos tipo M1 en relación a los M2. La activación de macrófagos en el tejido adiposo precede a la activación de las células de Kupffer. La infiltración en el hígado de macrófagos tipo M1 y el desarrollo por tanto de esteatohepatitis ocurre semanas después de la disfunción del tejido adiposo. El desequilibrio M1/M2 en favor de M1 y la liberación de citoquinas pro-infalamtorias Introducción 53 por las células Kupffer es un paso crítico para el desarrollo de NASH y posibles dianas para su tratamiento82,131. Los ácidos grasos pueden activar la ruta de señalización NF-β directamente o vía ER estrés y desregulación mitocondrial, induciendo la sobreexpresión de citoquinas proinflamatorias como IL6, TNF y su receptor. En pacientes con NASH, se han encontrado niveles circulantes elevadores de TNF y su receptor (tumor necrosis factor receptor 2, TNFR2). Curiosamente, en pacientes con NAFLD, los niveles séricos tanto de TNF como de su receptor no se encuentran elevados en comparación con individuos sanos. Sin embargo, sí se han encontrado diferencias en cuanto a su expresión hepática. Por lo tanto, los niveles séricos elevados de TNF se relacionan con un grado de fibrosis hepática. IL6 se encuentra elevado tanto en suero como en hígado de pacientes con NASH comparado con individuos normales pacientes131,163,164. E. Antagonistas de quemoquinas Son pequeñas proteínas secretadas que regulan la inflamación, la migración de leucocitos, la fibrosis y remodelado tisular y la angiogénesis. La familia de las quemoquinas incluye a 45 ligandos diferentes y 22 receptores que se diferencia por el tipo celular donde se expresan: leucocitos, hepatocitos, células estelares y adipocitos. Las céluals de Kupffer son la mayor fuente de quemoquinas mediadoras en el daño hepático y NASH. Se encontraron niveles elevados de CCL2 (chemokine ligand 2) en pacientes con NASH en comparación con pacientes con simple esteatosis. Este resultado indica que esta quemoquina podría ser un buen indicador de la transición de esteatosis a NASH165 155. MUERTE CELULAR Y NECROSIS La apoptosis y necrosis en los hepatocitos juega un papel crítico en la lesión hepática y el desarrollo de NASH110. La muerte de los hepatocitos ocurre en forma de apoptosis (muerte celular programada) o accidental (necrótica). La apoptosis se define morfológicamente en base al redondeo celular, la concentración citoplasmática, la condensación de la cromatina y la fragmentación nuclear. Para la adquisición de esta morfología se requiere la activación de las caspasas (proteasas que rompen a otras proteínas en sus residuos aspartato). La necrosis conduce a la inflamación celular, pérdida del núcleo y ruptura de la membrana celular; comunmente se asocia con una reacción celular inflamatoria166. Tanto la apoptosis como la necrosis pueden ocurrir como consecuencia del mismo evento desencadenante91. La apoptosis es una muerte celular altamente regulada y una característica morfológica y patogénica de NASH. Se ejecuta mediante dos vías diferentes: la vía extrínseca mediada por receptores de muerte celular en las membranas y la vía intrínseca activada por mecanismos de estrés celular y de membrana, estrés de retículo endoplasmático y mitocondrial91. Los receptores de muerte celular que pueden iniciar la vía extrínseca incluyen Fas, TNFR1 y receptores tipo TRAIL (receptores de ligando inductores de apoptosis relacionados con el factor de necrosis tumoral). Los ácidos grasos provocan la regulación positiva de receptores tipo Fas y TRAIL-R5; se ha encontrado que la expresión de estos receptores es más alta en pacientes con NASH que con BEGOÑA PORTEIRO COUTO 54 una simple esteatosis167. Tras la activación de vía TNF y JNK a través del receptor TNFR1, se forma un complejo que resulta en la activación de la caspasa 8 y muerte celular. Se ha encontrado que la expresión de TNF y su receptor R1,se encuentra elevado en pacientes con NASH y también con fibrosis166,168. La vía de apoptosis intínseca se caracteriza por la liberación de citocromo C u otros factores activadores de caspasas desde el espacio intermembrana de la mitocondria al citoplasma. En el citoplasma, se forma un complejo llamado apoptosoma que activa la caspasa 9. Alteraciones de la homeostasis del calcio, sobrecarga de proteínas o su mal plegamiento inducirá estrés del RE que, como explicaremos más adelante, puede desencadenar apoptosis. El exceso de ROS provocado por el estrés oxidativo puede causar daños en el ADN mitocondrial, proteínas y fosfolípidos e inducir apoptosis en los hepatocitos169. ESTRÉS DEL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO El lumen del RE proporciona un ambiente especializado para la maduración de las proteínas ya que es el lugar donde se encuentran las chaperonas para facilitar su adecuado plegamiento. Por otro lado, enzimas clave en la síntesis de colesterol, fosfolípidos y TG, y los componentes lipídicos de las lipoproteínas se encuentran integradas en las membranas del RE de los hepatocitos. Por todo esto, el RE se somete a un flujo continuo de vesículas que transportan proteínas secretadas o proteínas de membrana hacia su destino final. El RE también juega un papel importante en la detoxificación ya que las enzimas del complejo citocromo P450 están asociadas a su membrana. Cuando la célula está expuesta a compuestos tóxicos, el RE liso de los hepatocitos puede aumentar su superficie para la eliminación de dichos compuestos. Finalmente, el RE es un orgánulo clave para la homeostasis del calcio celular. Dentro del RE, los niveles elevados de calcio son esenciales ya que la actividad de muchas chaperonas son dependen de el para su funcionamiento170. Las alteraciones que se producen en el RE son provocadas por infinidad de estímulos tanto farmacológicos como fisiológicos o simplemente debidas a una elevada demanda de proteínas. Todas esas perturbaciones se conocen como estrés del retículo endoplasmático (endoplasmic reticulum stress, ER stress). Para combatir el estrés, la célua dispone de un sistema de transducción de señales que comunica al lumen del RE con el citoplasma y el núcleo en lo que se conoce como respuesta a proteinas desplegadas (unfolded protein response, UPR). El sistema UPR consta de tres rutas de señalización: la enzima dependiente de inositol, IRE1 (Inositol requiring enzyme 1 alpha), la quinasa del factor de transcripción pancreático del retículo endoplásmico iniciador de la traducción eucariota, PERK (PKR-like ER kinase) y el factor de transcripción activante 6, ATF6 (Activating Transcription Factor 6) (imagen 15). En las células no estresadas, los tres sensores se mantienen en un estado inactivo a través de su asociación con la proteína regulada por glucosa GRP78 (glucose-regulated protein 78/immunoglobulin-heavy-chain-binding protein). El RE es muy sensible a las alteraciones en la homeostasis celular como la deprivación de nutrientes o glucosa, infecciones viales, acumulación de lípidos, incremento de proteínas mal plegadas171, etc. Tras producirse el estrés, GRP78 se libera y secuestra a las proteínas mal plegadas, lo que permite la activación de la UPR. Esta activación inicia una cascada de respuestas que incluyen la atenuación de la traducción de proteínas y la regulación positiva de proteínas de empaquetamiento y degradación Introducción 55 a traves de los componentes de degradación asociados al RE (ER-associated degradation, ERAD) y así restablecer la homeostasis del RE172. IRE1, cuando se disocia de la chaperana GRP78, también conocida como BiP, dimeriza y se autofosforila, activándose su actividad endoribonucleasa. Gracias a esta actividad provoca la escisión del ARNm del factor de transcripción Xbp1 (X-box binding protein 1) (imagen 15). La actividad RNasa de IRE1 implica la degradación de otros ARNm como el de la insulina y el del propio Ire1.Además, la expresión del ARNm de Xbp1 aumenta a través de la acción de ATF6, proporcionando un sustrato adicional a IRE1. PERK, es una de las cuatro quinasas que pueden fosforilar a eIF2. La fosforilación de eIF2 (  -subunit of the translation initiation factor eIF2) por parte de PERK es fundamental para la superviviencia celular ya que limita la cantidad de proteínas mal plegadas y el consiguiente aumento de estrés oxidativo por su acumulación. Uno de los genes clave que se activa, es el factor de transcripción 4 (ATF4), el cual induce genes responsables de la respuesta antioxidante, el metabolismo de los aminoácidos y de la apoptosis, como la proteína homóloga de C/EBP (CHOP). CHOP fue identificado como un regulador negativo de otros miembros de la familia C/EBP. ATF4 induce la expresión de la síntesis de aminoácidos y genes de respuesta antioxidante. CHOP activa la exresión de GADD34 (growth arrest and DNA damage 34), que se asocia con la fosfatasa 1 (PP1) para desfosforilar eIF2α (imagen 15) en un bucle de retroalimentación negativa, reanudando así la traducción. ATF6, tras la disociación de BiP, ATF6 se traslada al Golgi donde unas proteasas cortan su extremo C-terminal. El fragmento de 50 KDa generado, se trasloca al núcleo para activar la transcripción uniéndose a elementos de respuesta ATF/cAMP (CRE) y a elementos de respuesta al ER estrés (ERSE) (imagen 15). ATF6 puede activar elementos de ERAD mediante dimerización con la forma escindida de XBP1 (XBP1s). Los ratones deficientes en Atf6 con ER estrés en el hígado desarrollan hepatoesteatosis y mueren172,173. UPR y desarrollo de la esteatosis hepática, NAFLD Los hepatocitos realizan innumerables funciones metabólicas como la síntesis de proteínas, la secreción de proteínas plasmáticas (albúmina, globulinas, fibrinógeno…), ensamblaje y secreción de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), biosíntesis de colesterol y metabolismo de xenobióticos; por lo tanto, poseen una gran extensión de retículo endoplasmático liso y rugoso. De acuerdo con esta función secretora, el hígado puede activar fisiológicamente la UPR. Por ejemplo, el ritmo de activación basal de IRE1 está relacionado con la regulación circadiana de la homeostasis lipídica 174. Los sensores de estrés del RE desempeñan un papel importante en el metabolismo de los lípidos hapáticos, en el desarrollo de la esteatosis y la resistencia a insulina hepática. Esto es debido a que en enfermedades crónicas como la obesidad y NAFLD, la habilidad para resolver el estrés del RE está comprometida. El vínculo entre el estrés del RE y la esteatosis se ha demostrado en modelos de ratones con la transducción de la señal PERK/eiF2, IRE1/XBP1 y ATF6 modificada genéticamente, en modelos de ratones con obesidad inducida por dieta, en ratones alimentados con dieta deficiente en colina (MCD) que muestran esteatosis sin obesidad BEGOÑA PORTEIRO COUTO 56 y en modelos genéticos como los ratones ob/ob. Más tarde, la activación de varios componentes de la UPR se confirmó en pacientes con NAFLD y NASH175. En los ratones ob/ob, la esteatosis provoca estrés del RE, lo cual conduce a la escisión proteolítica de los factores de transcripción SREBP1c y SREBP2, que controlan la lipogénesis y el metabolismo del colesterol respectivamente. La sobreexpresión hepática de adenovirus BiP en estos ratones, disminuye la activación de los SREBP, los niveles de TG hepáticos, colesterol y mejora la sensibilidad a insulina176. La vía PERK-eiF2-ATF4 regula la lipogénesis y la esteatosis hepática. Se ha encontrado que la señalizacion PERK dependiente contribuye a la diferenciación lipogénica en el epitelio mamario, y la eliminación de PERK inhibe la expresión de enzimas lipogénicas como FAS, ATP-citrato liasa, SCD1. Oyadomari et al. ha demostrado que a tarvés de la inhibción de GADD34, que desfosforila eiF2, da como resultado una disminución de la hepatoesteatosis en animales alimentados con una dieta alta en grasas177. La disminución de la fosforilación de eiF2 se correlaciona con una expresión disminuida del factor de transcripción PPAR y de sus reguladores upstream, C/EBP (CCAAT/enhancer-binding protein  ) y C/EBPβ (CCAAT/enhancer-binding protein β). Los ratones KO para ATF4, están protegidos contra la obesidad inducida por dieta, la hipertrigliceridemia y la esteatosis ya que la falta de ATF4 reduce la expresión de PPAR, SREBP1c, ACC y FAS. El mantenimiento prolongado estrés de RE se traduce en una elevada acción de CHOP lo que da lugar a la inhibición del factor de transcripción C/EBPα, activador de importantes reguladores del metabolismo lipídico; reduciéndose la oxidación lipídica, secreción de lipoproteínas y lipogénesis, participando por tanto en la generación de la esteatosis178. Por otro lado, la vía IRE1-XBP1 es necesaria para el mantenimiento de la homeostasis lipídica hepática en condicioens de estrés del retículo endoplasmático (imagen 15). Los ratones con una deleción específica en los hepatocitos de IRE1, desarrollan esteatosis severa después de un tratamiento inductor de estrés del RE. El desarrollo de la esteatosis se debe a la disminución de la expresión de los reguladores metabólicos C/EBP, C/EBPβ y PPAR. IRE1 se requiere para la secreción eficiente de apolipoproteínas tras la interrupción de la homeostasis del RE. Esta vía, desempeña un papel esencial en la regulación del ensamblaje y secreción de VLDL hepática, que se debe, al menos en parte, a la disminución de la actividad de la proteína MTT. En los hepatocitos, XBP1 regula la lipogénesis hepática mediante la unión directa a los promotores de genes lipogénicos como SCD1, DGAT2 y ACC2, activando su expresión. Por lo tanto, la síntesis de lípidos de novo se reduce en los hígados de ratones con una deleción en XBP1.La deleción condicional hepática de XBP1 reduce la lipogénesis de novo, los TG en suero así como colesterol y NEFFAs179. Poco se conoce acerca del mecanismo de acción de XBP1; estudios recientes muestran que la vía de señalización de la insulina aumenta la eficacia de la translocación al núcle de XBP1 debido a su unión a la subunidad p85 de PI3K a XPB1180. El estrés del RE hepático también afecta a la producción de las VLDL mediante la degradación de apoB100181 (imagen 15). Como hemos mencionado anteriormente, la regulación de la secreción de lipoproteínas desde el hígado es controvertida y hemos visto que la exposición prolongada a ácidos grasos afecta al estrés del RE. Un estudio ha propuesto que un estrés de RE moderado está en un principio asociado con un incremento en ApoB (puesto que la activación de la formación de ApoB por la elevada presencia de ácidos grasos es mayor que la inhibición mediada por el estrés del RE); mientras que un estrés de RE severo da lugar a Introducción 57 una reducción de la activación inducida por ácidos grasos por lo que se inhibe la secreción de las VLDL. Sin embargo, debido al estrés de RE y a la UPR, la secreción de TG no es proporcional al continuo acumulo de ácidos grasos. Debido a ello, el aumento de la UPR terminará por reducir la secreción de VLDL, y activando rutas inflamatorias, aumentando la lipotoxicidad y sustituyendo la esteatosis hepática por esteato-hepatitis 182. Por último, la vía ATF6 también juega un papel importante en la acumulacion de lípidos inducida por estrés (imagen 15). Un estudio detallado sobre la relación entre la actividad de ATF6 y la lipogénesis, ha revelado que ATF6 nuclear interactúa con la forma nuclear de SREBP2 inhibiendo su acción lipogénica en cultivos celulares175. El ratón deficiente para ATF6 desarrolla esteatosis cuando se somete a condiciones de estrés183. Imagen 15 :Papel del estrés del RE en el control del metabolismo hepático183. Con permiso de Elsevier. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 64 Finalmente, se ha encontrado que p53 también puede tener un papel en el transporte de los lípidos. A nivel hepático, se ha realizado un estudio de expresión génica en una línea celular de un hepatocarcinoma, HepG2, y se han encontrado incrementados genes que juegan un papel importante en el metabolismo de las lipoproteínas220. Entre esos genes se encuetran la PLTP (phospholipid transfer protein) y la apolipoproteína M que forma parte de las HDL. PLTP es una proteína que interviene en la trasferencia de lípidos entre LDL/VLDL a partículas HDL. El hecho de que p53 regule estos genes sugiere que desempeña un papel activo en el transporte de los lípidos. En el caso de PLTP, p53 induce dicho gene a través de la unión a elementos de respuesta (p53RE)208. FAMILIA P53: P63 Y SU PAPEL EN EL METABOLISMO HEPÁTICO p53 pertenece a una familia de factores de transcripción que incluye a p63 y p73, homólogos funcionales de p53 que poseen una elevada similitud en cuanto a secuencia y estructura (imagen 19). Tanto Tp63 como Tp73 son genes que se transcriben a partir de dos promotores diferentes, resultando en dos proteínas diferentes: una de ellas posee el dominio de transactivación (TA) completo (TAp63 y TAp73) y otra posee el extremo N-terminal truncado (Np63 y Np73) faltándoles parte de ese dominio, pero manteniendo alguna capacidad de transactivación. Además, un splicing alternativo del ARN en el extremo C-terminal, da lugar a tres isoformas distintas en cada una de las proteínas, α,  y  respectivamente. El tamaño de dicho extremo C-terminal afecta a la función. En el caso de p63, la isoforma transcripcionalmente más activa es curiosamente la más corta, TAp63 mientras que la isoformas más larga, TAp63 es la menos activa debido a acciones inhibitorias del propio extremo C-terminal225 (imagen 19). TAp63 y TAp73 pueden suplementar la función de p53 y activar genes dando lugar a arresto del ciclo celular o muerte celular; aunque pueden tener dianas de transactivación diferentes. Por el contrario, las formas Np63 y Np73, generalmente, tienen actividad antiapoptótica y actúan como dominantes negativos para inhibir la función de los miembros de la familia p53. Las isoformas N pueden activar genes diana específicos y actuar de forma independiente (imagen 20). A pesar de las similitudes y superposición en cuanto a actividad, como se puede ver en la imagen 19, p63 y p73 presentan funciones sorprendentemente diferentes y ámbas juegan un papel fundamental en el desarrollo226. Imagen 19 :Representación esquemática del gen de la familia p53 y la estructura de la proteína. Principales dominios proteicos: dominio de transactivación (TAD) en amarillo, dominio de unión al ADN (DBD) en rojo, dominio de oligomerización (OD) en verde, motivo alfa estéril (SAM) en azul. Los diferentes dominios Cterminales se pueden combinar con los diferentes Nterminales para generar un gran número de proteínas diferentes. Las regiones codificantes de ADN están en azul oscuro mientras que las UTR 5 'y 3' están en azul claro. P1 y P2 indican los diferentes promotores utilizados226. Con permiso de Elsevier. Introducción 65 Mientras que los ratones p53 KO son viables y no muestran ningún defecto de desarrollo importante, los ratones p73 y p63 KO muestran fenotipos muy marcados. p73 es esencial para el desarrollo neural adecuado; los ratones Tp73-/- muestran defectos en el desarrollo del SNC. Los ratones Tp63-/- tienen defectos en el desarrollo de tejidos epiteliales y extramidades. En humanos, mutaciones en p63 provocan displasias ectodérmcias. En cuanto al papel de p63 en cáncer, es controvertido. Algunos tumores muestran una sobreexpresión de p63, mientras que la progresión y metástasis de otros tumores se asocia a la pérdida de p63. Esto se debe a la presencia de las disntintas isoformas: TAp63 actúa como un supresor tumoral mientars que Np63 como un oncogen227. Las funciones de las isoformas de p63 en tejidos normales, se han debatido durante varios años. La controversia comenzó a aclararse con la generación de ratones KO específicos de cada isoforma. Los ratones deficientes para Np63 muestran una epidermis y epitelio estratificado poco desarrollado, lo que demuestra que esta isoforma es responsable del desarrollo del epitelio y mantenimiento de las células madre228. Np63, ha demostrado poseer un papel importante en el desarrollo de tumores promoviendo la supervivencia de las células epiteliales ya que es capaz de activar transcripcionalmente a FAS229. En cambio, los ratones deficientes en TAp63 mostraron un envejecimiento prematuro, desarrollaron tumores y alteraciones en el metabolismo de lípidos y glucosa230. En este estudio, los ratones desarrollaron múltiples fenotipos como un envejecimiento prematuro, resistencia a insulina, intolerancia a la glucosa e hígado graso. Se encontraron alteraciones en los niveles de ARNm de genes implicados en el metabolismo lipídico como FAS y CPT1, entre otros, lo cual indica defectos tanto en la síntesis como en la oxidación de los ácidos grasos. El mecanismo molecular que promueve estos efectos es directo a través de Sirt1, AMPK2 y LKB1. Aunque estos datos mostraron un papel importante de TAp63 en el control del metabolismo lipídico en ratones, hasta el momento, no se ha encontrado evidencias de estos trastornos metabólicos en pacientes. Además de Sirt1, AMPK y LKB1, se han identificado nuevas dianas de TAp63 implicadas en el metabolismo hepático de los lípidos. Se ha propuesto la vía TAp63-CCDC3 para regular la acumulación de lípidos hepáticos. CCDC3 (Coiled-Coil Domain Containing 3), como diana de TAp63, actúa como una molécula endocrina que puede aliviar los cambios patológicos asociados a la esteatosis en los hepatocitos a través de su efecto antilipogénico231. En busca de otras dianas de p63, enontramos que IKK es una diana downstream fundamental que participa en el desarrollo epidérmico. En humanos, su promotor, contiene lugares de unión que pueden ser reconocidos por las tres isoformas de TAp63, pero no de Imagen 20 :Funciones metabólicas de los genes diana específicos de las isoformas de p635. Con permiso de Elsevier. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 66 Np63232. Se ha demostrado que IKKβ puede inhibir a la isoforma TAp63233. IKK e IKKβ son dos subunidades catalíticas homólogas que forman un complejo quinasa junto con la subunidad reguladora IKK; este complejo activa a NFβ en respuesta a citoquinas inflamatorias como TNF. Se ha demostrado que NFβ se encuentra incrementado en modelos de roedores con obesidad inducida por dieta o bien genética (ratones ob/ob). Mediante el empleo de ratones que sobreexpresan IKKβ y NFβ de forma específica en el hígado (ratones LIKK), desarrollaron resistencia a insulina local y sistémica a través de la producción de IL6 e IL1β234. De esta forma se relaciona a la subunidad IKKβ con el desarrollo de la inflamación y resistencia a insulina. Otro estudio realizado por Karin et al. demostró que la inhibición de IKKβ específica en el hígado, mejora la sensibilidad a insulina y reduce la gluconeogénesis hepática en ratones ob/ob alimentados con dieta alta en grasa.235. P53 Y P63 EN EL DESARROLLO DE NAFLD Como hemos visto, NAFLD es la manifestación hepática del síndrome metabólico, una enfermedad crónica fuertemente asociada con enfermedades cada vez más incidentes como la obesidad y la T2DM. También hemos visto los principales mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de la esteatosis y la progresión a esteatohepatitis como la inflamación, el estrés oxidativo, estrés del retículo endoplasmático, la apoptosis y la resistencia a insulina. La alteración de p53 promueve los efectos de dichos eventos moleculares y la lesión hepática. Dada la importancia que p53 juega en la regulación del metabolismo lipídico, no es de extrañar que participe en el desarrollo de enfermedades sistemicas relaciondas con la homeostasis lipídica como la obesidad, diabetes y NAFLD. En modelos de ratones con obesidad inducida por dieta, los niveles elevados de lípidos dan lugar a un aumento del estrés oxidativo y por tanto a la activación de p53 que intentará mejorar el catabolismo lipídico; por otro lado también se producirá resistencia a insulina y diabetes236. Los adipocitos y hepatocitos de ratones obesos muestran niveles elevados de p53237 224. En la bibliografía, en relación al papel de p53 en el desarrollo de la esteatosis hepática encontramos grandes controversias. Por ejemplo, en el estudio de Derdak et al., la inhibición farmacológica de p53 disminuyó la acumulación de TG, el estrés oxidativo y la apoptosis a través de la ruta SIRT1/PGC1/PPAR y SIRT1/LKB1/AMPK238. Otro estudio realizado en ratones deficientes para la proteína p53 a los que se le induce esteatohepatitis con una dieta MCD, mostró que p53 regula la progresión de la esteatohepatitis mediante la vía de p66shc (una diana downstream de p53) controlando los niveles de ROS y la apoptosis. Además, experimentos in vitro, mostraron que la interrupción de la vía de señalización de p53 inhibe la actividad de p66shc y disminuye la acumulación de ROS en los hepatocitos.239 En estos modelos, la inhibición química o la deleción total de p53, mejora la enfermedad hepática. Un estudio posterior realizado por Liu et al., ha demostrado un papel de p53 totalmente opuesto en el metabolismo lipídico hepático. El ayuno provoca un estrés ribosomal que impide la síntesis de la enzima mdm2, p53 se activa, e induce la transactivación de la enzima malonilCoA descarboxilasa (MCD) que cataliza la degradación de malonil-CoA a acetil-CoA, favorecióndo la oxidación. Sin embargo, en ratones con la mutación mdm2 C305F, con una actividad de p53 disminuida, no pudieron activar a la enzima MCD, por lo tanto se acumula el malonil-CoA con una consecuente disminución de la tasa oxidativa y acumulación de ácidos Introducción 67 grasos en el hígado240. En esta línea, en ratones obesos, la pérdida de p53 resultó en un aumento sustancial de la acumulación de lípidos en el hígado y de masa corporal241. Estos resultados contradictorios sugieren que el resultado de la activación de p53 es específico de tejido y probablemente dependa del tipo de estrés. Otra posibilidad es que los niveles basales de p53 ayuden a mantener la homeostasis lipídica208 y protejan de la enfermedad metabólica, mientras que la desregulación de p53 o la activación crónica debido a estrés metabólico sostenido (como en el caso de la obesidad), contribuyen a la patogénesis de la enfermedad. Un estudio reciente mostró que los niveles de p53 en el hígado son altamente dinámicos y regulados por la disponibilidad de nutrientes. La deleción aguda y específica de p53 en hígado de ratones adultos dio lugar a defectos en el almacenaje de glucógeno y provocó el desarrollo de esteatosis. La privación de alimentos estabiliza los niveles de p53 hepáticos y la expresión de sus genes diana a través del sensor metabólico AMPK. Por otro lado, durante el ayuno, la pérdida hepática de p53 empeora la homeostasis de la glucosa y el catabolismo de los aminoácidos242. Recientemente se ha demostrado que la deficiencia de TAp63 provoca obesidad y síntomas de diabetes tipo 2 tanto en ratones ancianos como en ratones alimentados con dieta alta en grasa230. Por otro lado, la deficiencia de TAp73 da lugar a un aumento de la sensibilidad a insulina y protección contra la intolerancia a la glucosa en ratones alimentados con dieta alta en grasa, debido a un efecto positivo en la vía de señalización de la insulina243 Teniendo en cuenta estos estudios, queda clara de nuevo la complejidad del papel de la familia p53 durante el desarrollo del síndrome metabólico201. En general, todos estos factores de transcripción cooperan en la supervisión del metabolismo de glucosa y lípidos, funciones mitocondriales y producción de RO OBJETIVOS Objetivos 71 OBJETIVOS Para el desarrollo de esta tesis se propusieron los siguientes objetivos:  Estudiar el papel de p53 en la regulación del metabolismo lipídico hepático.  Estudiar el papel de p53 en las acciones periféricas de la ghrelina sobre el metabolismo lipídico en el tejido adiposo y en el hígado. MATERIAL Y MÉTODOS BEGOÑA PORTEIRO COUTO 80 La determinación del peso corporal se realizó con una balanza de precisión. Los animales se pesaron diariamente en el caso de tratamientos crónicos cortos (días). Es el caso de la administración de ghrelina intraperitoneal (7 días) o la administración de adenovirus (ad) en los que la duración del efecto es de 5 a 7 días. En este caso los ratones se estabularon individualmente y se hizo además un seguimiento de la ingesta. En el caso de los tratamientos de larga duración (meses) los animales se estabularon en grupos, teniendo en cuenta el comportamiento social de la especie. Se trata de experimentos en los que se administran virus adenoasociados y lentivirus cuyo efecto es permanente en el tiempo. En este caso se mide la ingesta por caja y se hace un promedio en función del número de ratones por caja. También se llevó a cabo un seguimiento de peso e ingesta semanal en los modelos en los que se induce obesidad mediante el uso de dietas altas en grasa. Utilizamos dos tipos de dietas altas en grasa que se diferencian entre sí por el porcentaje de grasa: dieta alta en grasa (HFD, High Fat Diet) con un 45% de grasa (Research Diets, D12451) y dieta alta en grasa con un 60% de contenido graso (Research Diets, D12492) (tabla 8). Para el mantenimiento general y cría, los ratones se alimentaron con un pienso sólido comercial que constituía la dieta estándar (SD, Standard Diet) (Harlan Laboratories, 2019). Composición SD % kcal HFD (45%) HFD (60%) Proteína 23 20 20 Carbohidrato 55 35 20 Grasa 22 45 60 Total 100 100 100 Kcal/g 3,3 4,73 5,24 FENOTIPADO METABÓLICO Para realizar el fenotipado metabólico de los ratones p53 KO y de los ratones tratados con ghrelina se mide la composición corporal de los ratones al inicio y al finalizar el tratamiento con un aparato de resonancia magnética nuclear para roedores (NMR, Echo Medical System) y el gasto energético, actividad locomotora y coeficiente respiratorio (RQ) utilizando un sistema de 12 cajas con medición de calorimetría indirecta (LAbMaster TSE Systems). Determinación de la composición corporal El análisis de la composición corporal se realizó a través de resonancia magnética nuclear (Whole Body Composition Analyzer; Echo MRI). Obtenemos datos de composición de masa grasa y masa magra. Las determinaciones se hacen al inicio y al final del experimento por lo que podemos analizar los cambios que provoca el tratamiento en el almacenamiento de los depósitos grasos. Fotografia termogénica Para medir la temperatura interscapular de los animales es necesario afeitar el pelo de esta zona previamente a la realización de la fotografía térmogénica (E60bx: Compact-InfraredTabla 8. Composición en %kcal de las dietas SD, HFD (45%) y HFD (60%) Material y Métodos 81 Thermal-Imaging-Camera; FLIR; West Malling, Kent, Reino Unido). Las imágenes fueron analizadas mediante el software específico de FLIR-Tools. Sistema de calorimetría indirecta La calorimetría indirecta nos permite reflejar el estado nutricional del ratón en estudio bajo diferentes condiciones genéticas, farmacológicas o utilizando distintos tipos de dieta. Además del tipo de sustrato que se utiliza para la obtención de energía, también obtenemos información acerca de la asimilación de los macronutrientes, la termogénesis, del ejercicio físico y la patogénesis de la obesidad y la diabetes. El sistema de calorimetría indirecta está formado por jaulas individuales que presentan sensores que registran la actividad locomotora (LA, Locomotor Activity), el gasto energético (EE, Energy expenditure), el cociente respiratorio (RQ, Respiratory Quotient) y la ingesta. Los animales se adaptaron al nuevo tipo de ambiente colocándolos en cajas de adaptación durante 48 horas previas a la medida. El sistema realiza medidas cada 30 minutos durante 48 horas de ingesta, consumo de O2 (vO2), producción de CO2 (vCO2) y actividad locomotora, entre otros.  Actividad locomotora (LA): se detecta utilizando haces de luz infrarroja que registra el movimiento del animal en sentido horizontal y vertical.  Gasto energético (EE): mediante el uso del sistema de calorimetría indirecto podemos estimar la cantidad de energía producida por el cuerpo mediante la medida del consumo de O2 y la producción de CO2. La cantidad de energía varía debido a la manipulación genética, tratamientos farmacológicos o simplemente cambios en la dieta. Esto se debe tener en cuenta a la hora de representar los datos del gasto energético ya que no podrán representarse como datos brutos, sino que debemos normalizarlos. El método más extendido para normalizar el gasto energético es dividir el vO2 entre el peso corporal total, que es como se representan en este estudio (Kcal/Kg/48h); sin embargo, la tasa metabólica no siempre es proporcional al peso corporal ya que, en los animales obesos, el aumento de tamaño se debe a un incremento en la masa grasa, tejido que posee una tasa metabólica muy baja. Teniendo en cuenta que no todos los tejidos tienen los mismos requerimientos metabólicos, podemos corregir el gasto energético de una forma más precisa teniendo en cuenta el cambio en la composición corporal (dividir el vO2 entre la masa libre de grasa ó lean mass) (Kcal/g lean mass/48h). Esta aproximación tampoco es la más correcta ya que, aunque la grasa es un tejido metabólicamente menos activo, ocupa más volumen en animales obesos por lo que puede hacer una aportación mayor al gasto energético oxidando el aporte de calorías extra; una parte del depósito graso corresponde a la grasa parda (tejido metabólicamente muy activo) y, por último, la grasa también puede actuar como órgano endocrino. Por todo ello, forma más apropiada de representar los datos de gasto energético, más que con una simple división por BW o lean mass, sería mediante una regresión lineal enfrentando los datos de EE frente a la masa libre de grasa y realizar un análisis de la covarianza (ANCOVA). Este análisis estadístico nos permite eliminar la heterogeneidad que existe sobre el gasto energético al ejercer sobre él influencia tantos factores (edad, hormonas, masa grasa, masa libre de grasa….)245-247  Tasa de respiración metabólica (RQ): Se calcula como la ratio entre el CO2 liberado y el O2 consumido. Esto nos permite detectar cuál es el principal combustible BEGOÑA PORTEIRO COUTO 82 utilizado en el organismo estudiado, ya que el valor del RQ es característico del sustrato energético que está siendo oxidado. En el caso de la glucosa en valor del RQ es 1 ya que por cada mol de O2 utilizado, se libera un mol de CO2. El valor de la RQ disminuye a 0,8 y 0,7 si se utilizan aminoácidos o grasa como fuente de energía248. Existen determinados estados metabólicos como la diabetes, hipo o hiper ventilación o una elevada presencia de glucosa en la urea que provocan variaciones en los valores de RQ lo cual nos puede llevar a una mala interpretación del tipo de sustrato que el individuo está utilizando como combustible249. En el caso de valorar el RQ cuando el animal de estudio es sometido a distintos tipos de dieta (alta en grasa, alta en glucosa…) debemos tener en cuenta el food quotient, que es un indicador de la proporción de calorías procedentes de cada macronutriente, y se calcula de la siguiente forma (0,835 × %proteína + 0,71 × % grasa + 1 × % carbohidrato). La relación entre el RQ y el FQ depende de la homeostasis energética del ratón. En los animales en los que existe un balance entre la ingesta y el gasto, el depósito de grasa es constante y por tanto los valores de RQ y FQ son iguales. Si el balance energético es positivo, es decir, cuando la ingesta supera al gasto, aumenta el valor de RQ ya que un aumento de la ingesta provoca un incremento en el almacenaje de grasa. Por el contrario, si el gasto energético es negativo el valor del RQ se situa por debajo del valor de FQ250. TEST DE TOLERANCIA A GLUCOSA E INSULINA Los test de tolerancia a glucosa (GTT, Glucose Test Tolerance) e insulina (ITT, Insulin Tolerance Test) permiten conocer la capacidad que tiene el metabolismo del ratón para tolerar la glucosa y el grado de resistencia a insulina respectivamente. Para ello, a primera hora de la mañana, ponemos a los ratones en ayuno y, tras 6 horas, realizamos las mediciones de glucosa basal, tomando una muestra de sangre a través de una pequeña incisión en la cola. Medimos la cantidad de glucosa en sangre (mg/dL) con una tira comercial (GLUCOCARD G Sensor) conectada a un glucómetro (GLUCOCARD G+ meter, A. MERANINI diagnostics). INYECCIÓN INTRAPERITONEAL (IP) Y SUSTANCIAS INYECTADAS Esta vía de administración de sustancias no requiere anestesia. Sujetamos al ratón por la espalda y cuando esté correctamente inmovilizado, lo inclinamos caudalmente e inclinando ligeramente la cabeza del ratón hacia abajo para minimizar el riesgo de pinchar alguna víscera. Trazamos una línea imaginaria que cruce su abdomen transversalmente a la altura de las rodillas. La aguja (BD Microlance, 25G 5/8” 0,5x16mm, BD Medical Surgicals Systems) (acoplada a una jeringa (1 ml BD slip-tip siringe, bulk, non-sterile, BD Medical Surgicals Systems)) deberá ser insertada a dicha altura, preferiblemente en el lado derecho del ratón. La aguja debe alcanzar una profundidad de medio centímetro, aproximadamente, y debe insertarse con un ángulo de 30 con respecto a la superficie del abdomen. Las sustancias que inyectamos de forma intraperitoneal a lo largo de la tesis fueron las siguientes: Material y Métodos 83 INYECCIÓN EN LA VENA DE LA COLA La inyección en la vena lateral del ratón (tail vein injection, TVI) es el método más común y eficiente de administrar vectores virales en el hígado251. Se han identificado al menos 12 serotipos diferentes de AAVs que vienen determiados por las distintas proteínas de la cápside. Cada uno de estos serotipos posee un tropismo diferente. Seleccionamos el AAV serotipo 8 por poseer una elevada afinidad por la infección en los hepatocitos. Dependiendo de la dosis, AAV8 puede infectar entre el 90 y 95% de los hepatocitos tras la inyección a través de la vena252. Esta vía de administración tampoco requiere anestesia, pero sí la utilización de un cepo para inmovilizar de forma correcta al ratón. Los cepos se adquirieron en la casa comercial BIOSEB, Francia (modelo: TV-150-STD). Antes de administrar las sustancias hay que dilatar la vena del ratón para facilitar su inyección. Para ello se pueden utilizar varios métodos como las lámparas de infrarrojo, calentar la cola en agua a menos de 43C o utilizar vasodilatadores. En nuestro caso utilizamos la luz infrarroja con exposiciones cortas (5 minutos aproximadamente). Inyectamos con agujas de 27G x 3/8” (0.40mm x 10mm) BD Plastipak syringe (1112678990) un volumen de 100l. Las sustancias se inyectan en las venas laterales que se localizan a ambos lados de la línea central de la cola. Estas venas son muy superficiales de manera que la inyección ha de hacerse paralela a la superficie. Para comprobar si estamos accediendo a la vena de forma correcta basta con comprobar si aparece sangre al aspirar, o bien, no apreciar ninguna resistencia al presionar el émbolo de la aguja al inyectar. Una vez inoculada la sustancia, se retira la aguja despacio y se presiona la zona hasta detener la hemorragia. A lo largo de esta tesis, hemos utilizado esta vía de administración para inyectar virus que modifican la expresión de determinados genes: Sustancia IP Casa comercial y número de referencia Dosis Vehículo Glucosa SIGMA; San Luis, Estados Unidos (158968) 2g/Kg Suero salino Insulina Actrapid, Novo Nordisk; Bagsværd, Dinamarca 0,75U/Kg Suero salino Ghrelina SIGMA; San Luis, Estados Unidos (G3902) 30g/día Suero salino C75 SIGMA; San Luis, Estados Unidos (C5490) 10mg/Kg Suero salino:DMSO (1:50) TUDCA Calbiochem; San Diego, Estados Unidos (580549) 250mg/Kg Suero salino Virus Casa comercial y número de referencia Dosis (UV/ml) Vehículo AAV8-Cre-GFP Signagen; Maryland, Estados Unidos (SL100835) 10^10 Suero salino AAV8-GFP Signagen; Maryland, Estados Unidos (SL100833) 10^10 Suero salino AAV8-TAp63 Signagen; Maryland, Estados Unidos (189SL100865) 10^10 Suero salino Lentivirus shp63 Dharmacon; Colorado, Estados Unidos (: SH01-040654-02-20) 10^7 Suero salino Turbo GFP shRNA control SIGMA; San Luis, Estados Unidos (SHC004) 10^7 Suero salino ad-p53 Signagen; Maryland, Estados Unidos (SL100777) 10^9 Suero salino Tabla 9. Lista de sustancias inyectadas vía intraperitoneal. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 84 SACRIFICIO, RECOGIDA DE TEJIDOS Y MUESTRAS Al final de los experimentos, los animales se sacrificaron por decapitación. Las muestras obtenidas por disección se almacenaban rápidamente a -80C hasta su posterior análisis molecular. Para análisis histológicos se introducía una pequeña muestra del tejido de interés en paraformaldehído 10% para su posterior inclusión en parafina. CULTIVOS CELULARES HEPG2, HUMAN CAUCASIAN HEPATOCYTE CARCINOMA Esta línea celular fue aislada de la biopsia de hígado de un hombre de 15 años con un carcinoma hepatocelular bien diferenciado. Se obtuvo de la ECACC (The European Collection fo Authenticated Cell Cultures) a través de Sigma-Aldrich. El medio utilizado para el cultivo de estas células fue Eagle´s Minimum Essential Medium, Eartle Balanced Salt Solution (ENEM), (EBSS) cuya referencia es M2279 de Sigma-Aldrich. Este medio se suplementó con un 10% v/v de suero bovino fetal (FBS, Fetal Bovine Serum) y con un 1% GPS (200Mm LGlutamina, 200 U/mL de penicilina y 10mg/mL de estreptomicina) de Sigma-Aldrich (G6784). Estas células se mantuvieron en condiciones de 5% de CO2 a 37C. Se pasaban cuando alcanzaban la subconfluencia (70-80%) y se diluían 1:4, lo que equivale a 5×10000 células/cm2 usando tripsina/EDTA al 0,25% de Fisher Scientific. THLE2, TRANSFORMED HUMAN LIVER EPITHELIAL-2 Se trata de una línea celular con morfología epitelial que procede de un cultivo primario de hepatocitos procedente del lóbulo izquierdo de un adulto en el que no se encontraron evidencias de tumor. Esta línea celular se inmortalizó mediante la infección de un virus que contiene fragmentos del antígeno SV40 T. El medio de cultivo empleado fue BEGM de la casa comercial Lonza; además es necesario suplementar este medio basal con unos aditivos (BPE (Bovine pituitary extract), insulina, hidrocortisona, ácido retinoico, transferrina, triyodotironina, epinefrina y hEGF (Human epitelial growth factor)), 70ng/mL de fosfoetanolamina (SigmaAldrich P0503), un 10% de suero bovino fetal (FBS, Fetal bovine serum) y un 1% de GPS (200Mm L-Glutamina, 200 U/mL de penicilina y 10mg/mL de estreptomicina) de SigmaAldrich (G6784). Estas células se mantuvieron en condiciones de 5% de CO2 a 37C. Se pasaban cuando alcanzaban la subconfluencia (70-80%) y se diluían 1:4, lo que equivale a 5×10000 células/cm2 usando tripsina/EDTA al 0,25%. Para sembrar estas células necesitamos hacer un tratamiento previo en las placas para conseguir una mejor adherencia. Se trata de aplicar un precoat formado por una mezcla de 0,01 mg/mL de fibronectina (Gibco, 33010-018), 0,03 mg/mL de collagen type I (Santa Cruz biotechnology sc-136157) y 0,01 mg/mL bovine serum albumin (Sigma-Aldrich A4503) disuelto en medio basal. ad-GFP Signagen; Maryland, Estados Unidos (SL100833) 10^9 Suero salino ad-GRP78 WT ViraQuest; Iowa, Estados Unidos (050312) 10^9 Suero salino ad-GFP ViraQuest; Iowa, Estados Unidos (101311) 10^9 Suero salino Tabla 10. Lista de virus inyectados por la vena de la cola del ratón. Material y Métodos 85 El mantenimiento, congelación/descongelación y contaje se hicieron según procedimientos estándar de cultivo celular. TRATAMIENTOS CELULARES Transfecciones transitorias Para el estudio del efecto metabólico de p63 en hepatocitos utilizamos dos tipos de aproximaciones: sobreexpresión con plásmidos e inhibición con un ARN interferente (siRNA, small interfering RNA). Plásmido/siRNA Casa comercial y número de referencia µg/pocillo pTAp63 27008, Addgene 2,5 Np63 26979, Addgene 2,5 pControl pcDNA 3.1 (+/-); Juan Zalvide 2,5 siTAp63 ON-TARGETplus C7-000112, Dharmacon 5µM siIKKβ ON-TARGETplus-SMARTpool L-003503-00-0005, Dharmacon 5µM siControl D-001810-10-05, Dharmacon 5µM En el caso de la sobreexpresión de p63, utilizamos Lipofectamina 2000 (LifeTechnologies, 11668-019) siguiendo las instrucciones de la casa comercial. Sembramos 1.5x105 células en placas de 6 pocillos y a las 24 horas se lipofectaron con los plásmidos correspondientes, un plásmido vacío como control y los plásmidos para las isoformas de p63 TAp63 y Np63. 24 horas después de la transfección se recogieron los extractos para el estudio de la expresión génica, proteica o bien para realizar inmunofluorescencias. En el caso de la inhibición de p63, adquirimos un único siRNA de la casa comercial Dharmacon cuya referencia se indica en la tabla 11. La secuencia de nucleótidos de la cadena “sense” es la siguiente: GAGGUUUUCCAGCAUAUCUUU. En el caso del silenciamiento de IKKβ, se adquirió un siRNA también de la casa comercial Dharmacon (tabla 11); en este caso se obtuvo una mezcla de 4 secuencias diferente: AUGAAUGCCUCUCGACUUA; GAAGAGGUGGUGAGCUUAA; GAGCUGUACAGGAGACUAA y CCGAUAAGCCUGCCACUCA. Para la transfección utilizamos DharmaFECT (Dharmacon, T-2001-03) siguiendo las instrucciones de la casa comercial. Se sembraron 1.5x105 células en placas de 6 pocillos y tras 24 horas en cultivo se transfectaron con los correspondientes ARNs de interferencia. Tras 8 horas, cambiamos el medio de cultivo y al cabo de otras 8 horas recogemos los extractos para el estudio de la expresión génica, proteica o bien para realizar inmunofluorescencias. Amplificación y purificación de plásmidos:  Cultivo bacteriano: Para la amplificación de estos plásmidos se transformaron bacterias de la cepa Escherichia coli (Subcloning effiency DH5α: Fφ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ Invitrogen). Para el crecimiento de las bacterias se utilizó el medio LB (LuriaTabla 11. Lista de plásmidos y siRNAs utilizados en las transfecciones transitorias. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 86 Broth) (triptona 1%, extracto de levadura 0,5%, cloruro sódico 1% en agua destilada). Para la selección de las bacterias transformantes, el medio se suplementó con antibiótico según la resistencia conferida por el plásmido (Ampicilina 100 μg/mL, Sigma-Aldrich). Las condiciones de crecimiento fueron 18h a 37C y 225 revoluciones por minuto (rpm). Para la preparación de placas con medio sólido se utilizó el medio LB suplementado con agar bacteriológico a una concentración de 1,5%. En estas placas, que se utilizaron para la selección de transformantes, también se añadió el antibiótico correspondiente, después de esterilizar el medio y previamente a su solidificación. Tanto el medio líquido como las placas se prepararon en condiciones de esterilidad.  Obtención del ADN plasmídico: la purificación de los plásmidos a partir del cultivo bacteriano en primer lugar se picaron colonias aisladas de las placas de LB, que se crecieron en un mini cultivo y luego se purificaron mediante la técnica denominada miniprep para comprobar en primer lugar su correcta secuencia. 1. Minipreps: Para la recuperación del DNA plasmídico a pequeña escala (minipreps) se utilizó el kit GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) siguiendo las instrucciones del fabricante. A partir del midi cultivo se obtuvo un cultivo a mayor escala o midi cultivo que posteriormente se purificó mediante la técnica de midiprep: 2. Midipreps: El midi cultivo se realiza en 150 mL de LB suplementado con el antibiótico correspondiente durante 18 h a 37C y 225 rpm. Para larecuperación del DNA plasmídico se utilizó el kit NucleoBond Xtra Midi EF (Macherey-Nagel) siguiendo las instrucciones del fabricante.  Cuantificación del ADN plasmídico: Para cuantificar la concentración de los ácidos nucleicos se utilizó un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific), midiendo la absorbancia a 260 nm. La relación D.O. 260 nm /D.O. 280 nm permite estimar el grado de pureza de las muestras, siendo 1,8 el valor óptimo. También se comprobó la integridad del DNA plasmídico mediante gel de agarosa. Tratamiento con ácido oleico: Con el fin de inducir la acumulación de triglicéridos, una vez sembradas las células para iniciar el experimento, las tratamos con una disolución de ácido oleico (Sigma-Aldrich, O1383) 1mM unido a BSA libre de ácidos grasos (Capricorn, BSA-FAF-1U) en una proporción molar 2:1. En el caso de los controles tan solo tratamos con BSA. Para asegurarnos de obtener una acumulación adecuada de lípidos, mantuvimos a las células con el tratamiento en un incubador a 37C con una concentración de CO2 del 5% durante 12 horas. Para comprobar que las células acumularon lípidos, realizamos una inmunofluorescencia con BODIPY (493/503) (Invitrogen, D3922), un fluoróforo que por su naturaleza no polar, fluorescencia y absorción de longitud de onda larga, se puede utilizar para la tinción de lípidos. Inumunofluorescencia con Bodipy: Se sembraron 1.5x104 células en placas de 24 pocillos en la que previamente hemos colocado cubreobjetos de 12mm de diámetro. Para la realización de la inmunofluorescencia realizamos el siguiente procolo: Material y Métodos 87  Aspiramos el medio de cultivo y lavamos 3 veces con PBS Ca+2/Mg+2.  Fijamos las células con paraformadehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT, Room Temperature). Al cabo de ese tiempo lavamos tres veces con PBS.  Incubamos durante 40 minutos las células con BODIPY 2mg/mL en un volumen final de 300µL de medio de cultivo basal. Lavamos 3 veces con PBS.  Para el montaje de los cubreobjetos utilizamos un medio acuoso con agentes para evitar la pérdida de fluorescencia, Fluoroshield Mounting Medium (Abcam, ab104135) con una dilución de DAPI (SigmaAldrich, D-9542) 1:1000. Obtención de imágenes mediante microscopía confocal: Las imágenes fueron obtenidas con un microscopio confocal (Confocal Microscopy Leica TCS SP5), con un objetivo APO 63X/1.32, utilizando como medio de transmisión aceite de inmersión (Immersol™ 518, Zeiss). Las imágenes se procesaron con el software LAS AR Lite (Leica). Las imágenes son combinaciones de secciones tomadas en el eje z con intervalos de 0,5µm. Por último, utilizamos el Adobe Photoshop para cortar y montar las imágenes finales. Estudio morfológico del del retículo endoplásmico 2 : Para estudiar el efecto de la sobreexpresión de p63, hicimos un estudio de la fragmentación del retículo endoplasmático en células HepG2. Tras la transfección con el plásmido, se realizó una doble inmunofluorescencia con un marcador rojo de retículo endoplasmático, ERTracker™(587/615) (Invitrogen, E34250) y un anticuerpo anti-FLAG TAp63 para identificar las células transfectadas con TAp63. ER-Tracker penetra en la célula y es altamente selectivo para el retículo endoplasmático (RE); consta de glibenclamida que se une a los receptores de sulfonilurea de canales K+ sensibles al ATP que son prominentes en el RE. Las imágenes se tomaron con microscopio confocal (explicado anteriormente). La cuantificación del número y áreas positivas para la tinción del retículo endoplasmático se realizó con el Image J 1.36 (National Institutes of Health, Bethesda, MD) del siguiente modo: se aplicó un umbral para los niveles de gris (40-225) de las imágenes proyectadas en z (mapa de píxeles que ofrece el programa); para cuantificar el número de áreas inmunoreactivas se eligió un tamaño superior a 5 pixel utilizando la función Analyze Particles de dicho software. ESTUDIO DEL METABOLISMO LIPÍDICO EN CÉLULAS THLE2 3 Estudio de la lipogenesis de novo: Tras sembrar las células THLE2 para el experimento, se incubaron toda la noche (Overnight) en Eagle´s Minimum Essential Medium (EMEM) suplementado con un 0,5% w/v BSA libre de ácidos grasos. Luego, se incubaron durante 4 horas con medio fresco suplementado con insulina 84nM y acetato 20µM con una cantidad de 20µCi/mL de acetato [H3] (Perkin Elmer)253. Tras la incubación, se hicieron dos lavados con PBS frío (pH 7,4) y se 2 Estudio realizado en colaboración con el Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología del Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba de la Dra. María del Mar Malagón. 3 Estudio realizado en colaboración con el grupo de investigación Liver and Lipids perteneciente al Departamento de Fisiología de la Universidad del País Vasco dirigido por la Dra. Patricia Aspichueta. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 88 recogieron las células. Se separan los lípidos tanto de las células como del medio y se separan mediante cromatografía de capa fina254. Los diferentes tipos de lípidos se visualizaron mediante exposicón al vapor de yodo, se seleccionaron las bandas correspondientes y se contabilizó la cantidad de marcaje radiactivo incorporado en los lípidos con un contador de centelleo. Los resultados se expresan en relación a la cantidad de proteína celular. Estudio del recambio y secreción de triglicéridos: Este estudio se realiza mediante un experimento denominado pulso-caza. Se incubaron las células durante 6 horas con EMEM bajo en glucosa y suplementado con un 0,5% (w/v) de BSA libre de ácidos grasos. Luego, se incubaron durante 4 horas con 0,4mM de oleico [H3] (5µCi/placa) y glicerol [C14] (0,55µCi/placa); esta incubación corresponde al pulso254. Tras esta incubación, lavamos durante 1 hora con DEMEM y las células se incubaron durante otras 4 horas; esta incubación corresponde a la caza. Se extrajeron los lípidos tanto de las células como del medio tras el pulso-caza y se separaron mediante cromatografía en capa fina. Se visualizaron mediante exposición a vapor de yodo y se seleccionaron las bandas correspondientes a los triglicéridos. Por último, se cuantificó la cantidad de radiactividad correspondiente al H3 y C14 con un contador por centelleo. Los resultados se presentan como porcentaje del total de triglicéridos marcados (TG-H3 y TG-C14) secretados al medio. Estudio de la oxidación de los ácidos grasos: La tasa de oxidación se determinó mediante la medición de la cantidad de CO214 (oxidación completa) y la cantidad de C14 unido a metabolitos ácido-solubles (ASM) (oxidación incompleta) liberados al medio. Para ello, se incubaron las céluas overnight en medio bajo en glucosa; luego, se incubaron durante 4 horas con palmitato 0,2mM con 0,5µCi/mL [114C] (Perkin Elmer). El medio se recogió en un tubo con un filtro Whatman empapado con 0,1M NaOH en la tapa. Luego se añaden 500µl de ácido perclórico 3M para liberar el CO2 capturado en el papel de filtro. El medio acidificado se centrifugó a 21000g durante 10 minutos para eliminar posibles partículas. La radiactividad del CO2 capturado por los filtros de papel y la radiactividad de los metabolitos ácido-solubles del medio, se midió mediante un contador de centelleo. MUESTRAS HUMANAS La población de estudio incluye a un grupo pacientes adultos y obesos, IMC ≥ 35Kg/m2 y en los que las biopsias hepáticas revelaron NAFLD. Los pacientes fueron sometidos a cirugía bariátrica en el Hospital Universitario de Salamanca. Como controles, incluimos a individuos con un IMC <35 Kg/m2 que se sometieron a colecistectomía laparoscópica para el tratamiento de cálculos biliares. Se excluyeron del estudio pacientes que hayan padecido enfermedades hepáticas relacionadas con el consumo de alcohol (> 30g/ día en hombres y > 20g/ día en mujeres), hepatitis C o B crónicas o si en laboratorio los datos histopatológicos revelan otras Material y Métodos 89 causas de enfermedad hepática distinta a NAFLD. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Salamanca y todos los pacientes presentaron un informe de consentimiento escrito para someterse a una biopsia hepática bajo supervisión durante la cirugía. Los datos recopilados incluyen información demográfica (edad, sexo y etnia), medidas antropométricas (IMC), historial sobre alcholismo y tabaquismo y otras condiciones médicas o fármacos utilizados. Antes de la cirugía, se tomaron muestras de sangre del paciente en ayuno para realizar un análisis completo: bilirrubina total, aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), colesterol total, HDL, LDL, TG, creatinina, glucosa y albúmina. TÉCNICAS ANALÍTICAS ANÁLISIS HISTOLÓGICO DEL TEJIDO HEPÁTICO Para entender la progresión de la enfermedad y el estado metabólico del animal, es crucial determinar el nivel de acumulación de lípidos en el hígado. Para ello realizamos tinciones histológicas que permiten visualizar la morfología y la distribución intracelular de las gotas lipídicas dentro de los tejidos. Una vez obtenidas las tinciones, se observaron y fotografiaron los cortes con un microscopio (Zeiss) utilizando los objetivos de 10, 20 y 40 aumentos.  Oil red O: se trata de un colorante tipo diazol soluble en grasa que tiñe lípidos neutrales y colesterol ésteres, pero no membranas biológicas. Para ello, se cortaron e un criostato secciones de hígado congelados (8 µm) y se colocaron en portaobjetos. Los portaobjetos se sumergieron en tinción Oil red O durante 10 minutos. Después se lavaron con H2O destilada y se contratiñeron con hematoxilina Meyers durante 3 minutos.  Hematoxilina/eosina: para esta tinción, el tejido fijado con la formalina se incluyó en parafina para ser seccionado en un micrótomo. Los cortes de parafina se trataron con xilol para eliminar los excesos de la misma. Después se pasaron los cortes por un proceso de rehidratación, consistente en alcoholes de concentración decreciente (100, 95 y 70C). Tras un lavado con H20 destilada, se sumergieron en hematoxilina (Bio Óptica) durante 10 minutos, se lavaron e inmediatamente se pasaron por un alcohol ácido. Tras el lavado, se sumergieron 30 segundos en eosina (Bio Óptica). Para deshidratar la muestra, se pasaron los cortes por los mismos alcoholes en graduación creciente y, antes de montar, se dejaron sumergidos 10 minutos en xilol. Los portaobjetos se montaron en medio de montaje acuoso. Esta técnica tiñe las estructuras celulares mostrando, de forma general, la estructura del tejido. La hematoxilina es de naturaleza catiónica (básica) por lo que tiñe de azul estructuras basófilas (ácidas) como los núcleos celulares. Por otro lado, la eosina es de naturaleza ácida, tiñendo de rosa estructuras de naturaleza básica, como el citoplasma. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 96 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN MEDIANTE WESTERN BLOT Extracción de proteína a partir de tejido y células De las muestras de tejido conservadas a -80C, se obtuvo una pequeña porción para su procesado. Durante todo el proceso las muestras se deben mantener en hielo para evitar la degradación de las proteínas. El tejido y el tampón de lisis se colocan junto con una bolita de acero en un tubo de polipropileno de 2 mL y se homogeniza en el Tissue lyser durante 4 minutos a 25 rpm. El tampón de lisis (tabla 19) facilita, junto con la homogenización mecánica, la rotura del tejido y los componentes celulares disolviéndose las proteínas del tejido en el mismo. Tampón de lisis Tris-HCl pH 7,5 50 mM EGTA 1 mM EDTA 1 mM Tritón X-100 1% vol/vol Ortovanadato Sódico 1 mM Fluoruro Sódico 50 mM Pirofosfato Sódico 5 mM Sacarosa 0,27 M Fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM Cocktail inhibidor proteasas (ROCHE) 1 pastilla/50 mL Tras la homogenización de las muestras, se centrifugan a 13200 rpm a 4C durante 20 minutos. A continuación, el sobrenadante (extracto proteico) se pasa a un nuevo tubo descartando el precipitado (núcleos y restos celulares) y la posible capa superior de grasa. En el caso de las muestras de tejido adiposo e hígado graso, se deben realizar varias centrifugaciones sobre el extracto inicial para descartar la grasa. Para la extracción de proteína a partir de un cultivo celular se realizó el siguiente protocolo: 1) Retirar el medio de cultivo de las células y lavar con PBS frío (4C). 2) Situar las placas de cultivo en hielo y añadir tampón de lisis. Despegar las células mediante el uso de un scraper o rascador (BD Falcon) y recoger en un tubo de polipropileno de 1,5 mL. 3) Mantener en hielo 10 minutos, agitando cada 5 minutos. 4) Centrifugar durante 10 minutos a 13000 rpm a 4C y llevar el sobrenadante a un nuevo tubo. Almacenar los extractos a -80C o llevar a análisis. Cuantificación de los extractos proteicos Para cuantificar la cantidad de proteína contenida en el extracto, realizamos un método colorimétrico con la solución Bradford (Bio-rad Protein Assay Kit). Este método se basa en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos y aromáticos por lo que la unión de este colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante de 465 a 595 nm. La forma roja de este compuesto se Tabla 19. Componentes del tampón de lisis disuelto en agua destilada. Material y Métodos 97 convierte en azul cuando se une con la proteína. Experimentalmente, realizamos una curva patrón de sero-albúmina bovina (BSA) con diluciones seriadas a partir de la máxima concentración (1 mg/mL). En el caso de las muestras, realizamos una dilución para poder realizar la cuantificación, 1:50 en el caso de hígado, 1:25 para la grasa e hipotálamo y en el caso de la proteína extraída a partir del cultivo celular de HepG2, 1:5 para la proteína extraída a partir del cultivo celular de THLE2. Todas las muestras se miden por duplicado junto con la recta patrón en un espectrofotómietro a 550 nm. Previamente, la mezcla de las muestras con el Bradford se incuba durante 5 minutos a 37C. Preparación de las muestras para la electroforesis SDS-PAGE Tras la cuantificación, debemos preparar las muestras junto con el tampón de carga (tampón de Laemmli, tabla 20). Este tampón permite dotar a todas las proteínas de carga negativa en proporción a su tamaño, gracias al dodecil-sulfato sódico (SDS) y además permite su desnaturalización gracias al β-mercaptoetanol, el cual elimina los puentes disulfuro. Todas las muestras deben tener la misma concentración final para que en el volumen de carga en la electroforesis (16 µl) haya 20 µg de proteína de hígado, 30 µg de proteína de grasa, 12 µg de proteína de hipotálamo y 5 µg de proteína en los extractos proteicos obtenidos a partir de cultivo celular. Tras añadir el tampón de carga y siempre previamente a realizar la electroforesis, las muestras se deben calentar a 95C durante 5 minutos para su completa desnaturalización. Electroforesis SDS-PAGE La electroforesis SDS-PAGE consiste en la separación de las proteínas por su peso molecular. Se incluyen las proteínas desnaturalizadas y con carga negativa en un gel de acrilamida-bisacrilamida (30% Acrilamida/ Bis 29:1, Bio-Rad). Al aplicar una corriente eléctrica, las proteínas migran a través del gel hacia el polo positivo, separándose en gradiente por su peso molecular de mayor a menor. La concentración de acrilamida-bisacrilamida determina el tamaño del poro de la malla formada por el gel y, por tanto, el grado de separación de las proteínas. El gel está formado por dos fracciones:  Gel concentrador: se localiza en la parte superior sobre el que se incluye el peine para formar los pocillos y poder introducir la muestra. Este gel tiene un porcentaje de acrilamida-bisacrilamida del 5% y permite homogenizar la entrada de las proteínas en el gel separador (tabla 21).  Gel separador: permite la separación de las proteínas por su peso molecular. El porcentaje de acrilamida-bisacrilamida varía en función del tamaño de las proteínas Tampón Laemmli Tris-HCl pH 6,7 250 mM Glicerol 50% vol/vol SDS 10% peso/vol β-Mercaptoetanol 5% vol/vol Azul de bromofenol 0,0005 % peso/vol Tabla 20. Componentes del tampón de Laemmli disuelto en agua destilada. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 98 que queramos estudiar. En nuestro caso, los porcentajes se encuentran entre el 8% y el 12% (tabla 22). Los geles se montan en una cubeta de electroforesis junto con el tampón de electroforesis (tabla 23) que permite la transmisión del voltaje. Se añaden las muestras y un marcador de peso molecular conocido (Bio-rad). Se conecta a una fuente de alimentación a un voltaje de entre 80-120 V. Transferencia semi-húmeda Una vez que las proteínas se separaron en el SDS-PAGE, las proteínas contenidas en el gel se transfieren a una membrana de polifluoruro de vinilideno (PVDF, Bio-Rad) permitiendo que las proteínas queden fijadas e inmovilizadas. El proceso de transferencia del gel a la membrana es también dependiente de voltaje. Se realiza en un soporte horizontal donde se ponen en contacto gel y membrana acotados por papel absorbente empapado en tampón de transferencia (tabla 24) que favorece la transmisión de la corriente durante el proceso. Se realiza a amperaje constante 0,8 mA/cm2 durante una hora y 40 minutos. Gel concentrador 5% H2O destilada 4,1 mL 30% Acrilamida/Bis 1 mL Tris-HCl 1 M pH 6.8 0,75 mL 10% SDS 0,06 mL 10% persulfato amónico 0,06 mL TEMED 0,006 mL Gel separador 8% 10% 12% H2O destilada 11,5 mL 9,9 mL 8,2 mL 30% Acrilamida/Bis 6,7 mL 8,3 mL 10 mL Tris-HCl 1 M pH 6.8 6,3 mL 6,3 mL 6,3 mL 10% SDS 0,25 mL 0,25 mL 0,25 mL 10% persulfato amónico 0,25 mL 0,25 mL 0,25 mL TEMED 0,015 mL 0,01 mL 0,01 mL Tampón de electroforesis Tris-HCl 200 mM Glicina 20 mM SDS 1% peso/vol Tampón de transferencia Tris-HCl 40 mM Glicina 40 mM SDS 0,36% peso/vol Metanol 20% vol/vol Tampón de lavado (TBS-T) Tris-HCl 20 mM NaCl 146 mM Tween-20 0,1% vol/vol Tabla 21. Composición del gel SDS PAGE concentrador. Tabla 22. Composición del gel SDS PAGE separador a porcentajes 8, 10 y 12. Tabla 23. Composición del tampón de electroforesis disuelto en agua destilada. Tabla 24. Composición del tampón de transferencia disuelto en agua destilada Tabla 25. Composición del tampón de lavado disuelto en agua destilada Material y Métodos 99 Inmunodetección  Bloqueo de la membrana: este proceso consiste in incubar la membrana durante una hora a temperatura ambiente en agitación con una solución de BSA o leche en polvo al 5% disuelto en tampón de lavado (TBS-T, tabla 23). Se trata de impedir la unión de proteínas a la membrana en lugares que hayan quedado libres tras la transferencia. De no realizarse este paso, el anticuerpo, podrá unirse a dichos lugares y dificultar así la detección del complejo antígeno-anticuerpo deseada dando lugar a inespecificidades y ruido de fondo. Con dichas soluciones proteicas, se rellenan los sitios libres y los anticuerpos específicos no se unirán a ellos ya que no encontrará la proteína que busca.  Anticuerpo primario: tras el bloqueo de la membrana se incuba con el anticuerpo específico contra la proteína de estudio (tabla 26). El anticuerpo se diluye según las instrucciones del fabricante (1:5000/1:1000) en TBS-T al 3% y se deja incubar en agitación una hora a temperatura ambiente o bien toda la noche a 4C. Tras la incubación, se retira el anticuerpo y se realizan 3 lavados de 5 minutos con TBS-T.  Anticuerpo secundario: para detectar la presencia de la proteína y amplificar la señal del anticuerpo primario, se incuba la membrana con un anticuerpo secundario asociado a peroxidasa que reconoce la parte constante del primario. Se diluye en una sulución de incubación a una concentración 1:5000. El tipo de secundario utilizado vendrá determinado por el tipo de huésped en el que se generó el anticuerpo primario.  Quimioluminiscencia: para detectar el anticuerpo secundario, se incuba la membrana con el sustrato de la peroxidasa y un potenciador de la quimioluminiscencia (Pierce® ECL western blot substrate, Thermo Scientific) incubándose 1 minuto en oscuridad. Inmediatamente después, para detectar la luz emitida resultante de la reacción del sustrato con la peroxidasa, se coloca la membrana en un casete de autorradiografía y se expone a una película fotográfica (Fujifilm). Tras el revelado a distintos tiempos utilizando líquidos de revelado y fijado en una sala oscura, se observa el resultado de la interacción de los anticuerpos con la proteína de la muestra.  Análisis de resultados: para analizar los datos, se digitalizan las imágenes de las placas fotográficas mediante un escáner de alta resolución. Para determinar la cantidad relativa de proteína de cada muestra, se utiliza el programa informático ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij; National Institutes of Health), que detecta la cantidad de píxeles de la imagen de la proteína en todas las muestras de una misma placa radiográfica. El área de medición debe ser igual para todas las muestras. Estos valores se relativizan respecto al control constitutivo (β-actina, GAPDH), que debe ser detectada por cada gel de electroforesis. El valor final es relativo respecto al grupo control de cada experimento. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 100 Proteína diana Nombre del anticuerpo Casa commercial/número de catálogo Monoclonal/ polyclonal Dilución Fatty acid synthase FAS (H-300) Santa Cruz Biotechnology; sc20140 Rabbit polyclonal 1:1000 Apolipoproteina B ApoB Abcam; ab2037 Rabbit polyclonal 1:5000 BAX BAX Cell Signaling; 2772 Rabbit polyclonal 1:1000 c-Jun N terminal kinases 1/3 JNK 1/3 (C17) Santa Cruz Biotechnology; sc-474 Rabbit polyclonal 1:1000 phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (81E11) phosphoSAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (81E11) Cell Signaling; 4668 Rabbit monoclonal 1:1000 Anti-IRE 1 IRE 1 Abcam; ab-37073 Rabbit polyclonal 1:1000 IRE 1 alpha phosphoespecific [ser 724] phospho-IRE 1-alpha [ser 724] Novus Biologicals; NB1002323 Rabbit polyclonal 1:1000 X-box binding protein-1 XBP1 Santa Cruz Biotechnology; sc7160 Rabbit polyclonal 1:1000 Phospho-PERK (Thr 981) phosphoPERK Santa Cruz Biotechnoloy; sc32577 Rabbit polyclonal 1:1000 Eucariotic initiation complex subunit alpha eiF2α (FL315) Santa Cruz Biotechnology; sc11386 Rabbit polyclonal 1:1000 phospho-eiF2α phosphoeiF2α (Ser 52) Santa Cruz Biotechnology; sc101670 Rabbit polyclonal 1:1000 Caspase-3 Caspase-3 (8G10) Cell Signaling; 9665 Rabbit monoclonal 1:1000 Cleaved caspase 3 Cleaved caspase-3 (Asp 175) (5A1E) Cell Signaling; 9664 Rabbit monoclonal 1:1000 Caspase 7 Caspase 7 Cell Signaling; 9492 Rabbit polyclonal 1:1000 Cleaved caspase 7 Cleaved caspase 7 (Asp 198) Cell Signaling; 9491 Rabbit polyclonal 1:1000 TAp63α p63 (TA) clone 6189 Biolegend; 618902 Rabbit polyclona. 1:1000 Np63α p63 (N) clone 6190) Biolegend; 619002 Rabbit polyclona. 1:1000 p63 (H-129) p63 Santa Cruz Biotechnology; sc11386 Rabbit polyclonal. 1:1000 Anti-p73 [EP436Y] P73 Abcam; ab-40658 Rabbit monoclonal 1:1000 Anti-SHC (phosphor S36) [6E10] p66shc Abcam; ab-54518 Mouse monoclonal 1:1000 p21 (C19) p21 Santa Cruz Biotechnology; sc-397 Rabbit polyclonal 1:1000 IB kinases α and  PhosphorIKKα/ (Ser180/Ser181)-R Santa Cruz Biotechnology; sc23470-R Rabbit polyclonal 1:1000 Anti IKK  (phosphor Y188) Phospho IKK  Abcam; ab194519 Rabbit polyclonal 1:1000 Material y Métodos 101 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos obtenidos tras los procedimientos experimentales in vivo e in vitro, se presentan como la media de los grupos ± la desviación típica. El tamaño muestral de las poblaciones de cada experimento se detalla en los pies de figura de los resultados. Para el análisis, se excluyeron muestras y/o animales cuyo valor se desviaba ± 2 veces la desviación estándar255, o cuando se observa un comportamiento inadecuado durante el procedimiento experimental. En todos los análisis, se considera una diferencia estadísticamente significativa a partir de la probabilidad p ≤ 0,05. Antes de realizar el análisis estadístico, se realiza un test de normalidad. Se utiliza el test Shapiro-Wilks para un conjunto de muestras de n ≤ 20 y ≥ 7, y el test Kolgomorov-Smirnof cuando el n ≤ 6256,257. Cuando las poblaciones analizadas muestran una distribución normal se realizan test estadísticos paramétricos y cuando no pasan el test de normalidad, se realizan test estadísticos no paramétricos. Test paramétricos Se realizan sobre aquellos experimentos cuyos grupos experimentales sigan una distribución Gaussiana (normal). A. Anova de una vía: determina si hay diferencia entre las medias de tres o más poblaciones que siguen una distribución normal y son independientes entre sí. Una vez realizado el test, en caso de aceptar la hipótesis alternativa que indica que sí hay diferencias entre las medias, es necesario realizar un test a posteriori para comprobar qué medias son las que causan significación. Existen varios test que se pueden realizar: uno de ello es el Tukey test que compara dos medias simples cada vez y ejecuta todas las posibles comparaciones; el Dunnett test se realiza cuando se comparan todas las medias con el grupo control, por lo que no es un procedimiento tan exhaustivo y por último, la corrección o test de Bonferroni que es el procedimiento más potente; se recomienda su uso cuando se realizan comparaciones entre más de tres grupos experimentales258. A lo largo de esta tesis realizamos test a posteriori de Bonferroni y Tukey. Anti-IKK  [EPR6043] IKK  Abcam; ab124957 Rabbit monoclonal 1:1000 Glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase (GAPDH) GAPDH (6C5) Merck Millipore; CB1001 Mouse monoclonal 1:5000 Transferrin (I-20) Transferrin Santa Cruz, CA, USA; sc-22597 Rabbit polyclonal 1:5000 Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP Anticuerpo sedundario DAKO; P0260 monoclonal 1:5000 Polyclonal Goat Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP Anticuerpo secundario DAKO; P0448 monoclonal 1:5000 GFP GFP Living Colors 632381 Rabbit monoclonal 1:10000 Tabla 26. Lista de anticuerpos utilizados para la inmunodetección por western blot. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 102 B. T-test: compara las medias de dos poblaciones desapareadas asumiendo que siguen una distribución normal. Es un test robusto, puesto que es capaz de comparar poblaciones con un n ≤ 5259,260. En un contraste de hipótesis bilateral (2 colas), se estudia la desigualdad entre las medias, siendo la región crítica del estadístico ambas regiones correspondientes a la cola inferior y superior de la distribución. En un contraste unilateral (1 cola) la desigualdad en la hipótesis señala una sola dirección. A lo largo de esta tesis se utilizó t-test de una y de dos colas. Cuando estudiamos variables de las cuales no conocemos su efecto o no existe una evidencia previa, realizamos t-test de dos colas; sin embargo, en el momento en el que trabajamos sobre una premisa ya evaluada, realizamos t-test de una cola. El uso de una cola ofrece un test estadístico más robusto ya que aumenta la sensibilidad para detectar efectos fisiológicos261. Test no paramétricos Se realian sobre aquellos experimentos cuyos grupos experimentales no siguen uan distribución Gaussiana (normal). A. Test Kruskal-Wallis: se utiliza para realizar comparaciones entre múltiples poblaciones que no siguen una distribución normal. Como test a posteriori se utiliza el test de Dunn para determinar entre qué poblaciones existe la significancia262,263. B. Test Mann-Whitney: compara dos poblaciones, de las cuales alguna no sigue una distribución normal264. Correlaciones entre variables En los estudios de humanos se analizaron las correlaciones entre los niveles de TAp63 y diferentes variables mediante el coeficiente de correlación de Pearson (si los datos siguen una distribución normal) o el coeficiente de correlación de Spearman (si los datos no siguen una distribución normal) (r). Para evaluar el grado de asociación entre ambas variables se realizó un test chi-cuadrado (χ2). Este test contrasta dos hipótesis, una hipótesis nula o hipótesis de independencia de las variables (H0) y una hipótesis alternativa o hipótesis de asociación de las variables (H1). A mayor valor del estadístico χ2, mayor es la diferencia entre los valores observados y teóricos, en consecuencia, mayor es el grado de asociación entre las variables (H1 verdadera). DISEÑO EXPERIMENTAL ADMINISTRACIÓN CRÓNICA PERIFÉRICA DE GHRELINA Con el fin de estudiar los efectos periféricos de la administración crónica de ghrelina, se inyectó de forma intraperitoneal ghrelina a ratones WT y KO para el gen p53. Material y Métodos 103 Los grupos experimentales fueron los siguientes:  Ratones p53 WT + vehículo (suero salino) intraperitoneal  Ratones p53 WT + ghrelina (30µg/día) intraperitoneal  Ratones p53 KO + vehículo (suero salino) intraperitoneal  Ratones p53 KO + ghrelina (30µg/día) intraperitoneal EFECTOS DE LA GHRELINA SOBRE EXPLANTES DE TEJIDO ADIPOSO Para comprobar si la ghrelina tiene un efecto directo sobre el tejido adiposo, realizamos un experimento con explantes de tejido adiposo gonadal. Este experimento fue realizado en colaboración con el departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología del Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba de la Dra. María del Mar Malagón. Se llevarón a cabo dos experimentos. En primer lugar, quisimos ver la activación de las proteínas AMPK y ERK: En una segunda aproximación, quisimos estudiar la expresión génica, para lo cual se incubaron durante más tiempo los adipocitos con la ghrelina; FENOTIPADO METABÓLICO DE RATONES P53 KO EN DIETA ESTÁNDAR Y ALTA EN GRASA Para estudiar si la ausencia de p53 en ratones tiene efectos en el metabolismo, realizamos un seguimiento de peso e ingesta, test de tolerancia a la glucosa y sensibilidad a insulina. Para su fenotipado metabólico, los ratones se metieron en un sistema de calorimetría indirecta (TSE) durante dos días. La medida de composición corporal se realizó al inicio del experimento y al finalizar, al salir del TSE. Realizamos el mismo estudio en ratones macho alimantados con dieta estándar y con dieta alta en grasa (HFD): Inyección grelina i.p Ratón 30 µg/día Dieta estándar Sacrificio 3 semanas Nacimiento Día 0 Día 7 Seguimiento peso/ingesta RMN RMN Genotipado y destete 5 semanas Grelina10-8 M Activación AMPK y ERK Extraer proteína 30 minutos 5mg tejido adiposo Centrífuga Medio cultivo adipocitos PBS + BSA 2% 1 hora 37C5 minutos Grelina10-8 M Extraer ARNm 30 minutos 5mg tejido adiposo Centrífuga Medio cultivo adipocitos PBS + BSA 2% 1 hora 37C12 y 24 horas BEGOÑA PORTEIRO COUTO 104 Los grupos experimentales fueron los siguientes:  Ratones machos p53 WT dieta estándar  Ratones machos p53 KO dieta estándar  Ratones machos p53 WT dieta (HFD 45% grasa)  Ratones machos p53 ko dieta (HFD45% grasa) También quisimos comprobar si la falta de p53 afectaba al metabolismo de las hembras: Grupos experimentales:  Ratones hembra p53 WT dieta estándar  Ratones hembra p53 KO dieta estándar  Ratones hembra p53 WT dieta (HFD 45% grasa)  Ratones hembra p53 ko dieta (HFD45% grasa). DISMINUCIÓN HEPÁTICA DE LOS NIVELES DE P53 Para estudiar de forma más específica los efectos de la falta de p53 exclusivamente en el hígado, utilizamos ratones flox para el gen p53. Administramos a través de la vena de la cola un virus adenoasociado que codifica para la recombinasa Cre (AAV8-Cre, Signagen) (1010 Sacrificio 3 semanas Nacimiento Semana 1 Semana 11 Seguimiento peso/ingesta RMN Genotipado y destete 5 semanas GTT ITT Semanas 12-13 Semana 14 Entrada TSE Salida TSE RMN Dieta estándar Dieta estándar Dieta alta en grasa 45% Sacrificio 3 semanas Nacimiento Semana 1 Semana 11 Seguimiento peso/ingesta RMN Genotipado y destete 5 semanas GTT ITT Semanas 12-13 Semana 14 Entrada TSE Salida TSE RMN Dieta estándar Dieta estándar Sacrificio 3 semanas Nacimiento Semana 1 Semana 11 Seguimiento peso/ingesta RMN Genotipado y destete 5 semanas GTT ITT Semanas 12-13 Semana 14 Dieta estándar RMN Dieta alta en grasa 45% Sacrificio 3 semanas Nacimiento Semana 1 Semana 11 Seguimiento peso/ingesta RMN Genotipado y destete 5 semanas GTT ITT Semanas 12-13 Semana 14 Dieta estándar RMN Material y Métodos 105 UV/mL) y su control AAV8-GFP. De esta manera, al aumentar la expresión de la recombinasa Cre, se reducirán los niveles de p53 en el hígado. La especificidad de la técnica se demuestra por una mayor infección en el hígado con respecto a otros órganos265-267 Se sabe que, por su naturaleza, su efecto es permanente en el tiempo (años) y tal y como hemos comprobado en esta tesis, los virus adenoasociados necesitan al menos dos semanas para infectar de manera significativa. Por lo tanto, en el siguiente experimento, esperamos un mes desde la inyección del virus para asegurar infección suficiente y además realizar pruebas de tolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina antes de sacrificar a los ratones. Este experimento se realiza en machos p53 flox de cría propia. Grupos experimentales:  Ratón p53 flox AAV8-GFP  Ratón p53 flox AAV8-Cre SOBREEXPRESIÓN DE P53 EN RATONES P53 KO OBESOS Para rescatar los niveles de p53 en ratones deficientes, inyectamos a través de la vena de la cola un vector adenoviral que sobreexprese dicha proteína en el hígado (109 UV/mL, Signagen). Debido a las características biológicas del adenovirus, la infección y la sobreexpresión del gen que porta es de acción inmediata y su efecto transitorio (7 días). Realizamos este experimento en ratones macho p53 WT y KO de cría propia. Grupos experimentales:  Ratón p53 WT + adGFP  Ratón p53 WT + adp53  Ratón p53 KO + adGFP  Ratón p53 KO + adp53 Dieta estándar Sacrificio 3 semanas Nacimiento Día 1 Seguimiento peso/ingesta Genotipado y destete 5 semanas GTT ITT Día 18 Día 30 Dieta estándar Administarción i.v. AAV8-Cre 1010 UV/mL Día 24 HFD (60% grasa) Sacrificio 3 semanas Nacimiento Genotipado y destete 3 semanas 8 semanas Dieta estándar Administarción i.v. adp53 109UV/mL Día 1 RESULTADOS Resultados 115 CARACTERIZACIÓN DEL ESPECTRO TUMORAL DE LOS RATONES p53 KO. Para estudiar la posible función de p53 en el metabolismo elegimos, en primer lugar, un ratón con una deficiencia global en este gen. Los ratones deficientes en p53 tienen menor esperanza de vida que los ratones WT. Se realizó un seguimiento de la superviviencia (Figua 1A) de estos ratones, así como de la aparición de tumores a lo largo de su vida (Tabla 27). Para realizar los experimentos seleccionamos ratones macho homocigotos deficientes para el gen p53 y ratones macho homocigotos WT como controles. Para ello, cuando las crías tuvieron 3 semanas de edad, realizamos su genotipado. Además, también se comprobó la ausencia de la expresión de p53 mediante una PCR en tiempo real comparando la expresión de dicho gen en el hígado entre los ratones p53 WT y p53 KO (Figura 1 B). FENOTIPADO METABÓLICO DE RATONES p53 KO ALIMENTADOS CON DIETA ESTÁNDAR Y DIETA ALTA EN GRASA Tras el destete, los ratones se mantuvieron en dieta estándar hasta las 6 semanas de edad. Se hizo una medida de composición corporal mediante resonancia magnética y posteriormente se alimentaron con dieta estándar y con HFD 45% durante 11 semanas. Durante este tiempo se Tipo de tumor p53 WT (6 meses) p53 KO ( 6 meses) Linfoma tímico 0/20 15/44 Linfoma multicéntrico 0/20 4/44 Linfoma esplénico 0/20 6/4 Tabla 27. Aparición de tumores en los ratones Porcentaje de supervivencia 0 20 40 60 80 100 120 010 20 30 40 50 Edad (semanas) p53 KO p53 WT 0 20 40 60 80 100 120 140 ND Niveles de ARNm de p53 hepático (% control) p53 WT p53 KO AB Figura 1. (A) Efectos de la mutación en el gen p53 en la supervivencia. (B) niveles hepáticos de ARNm de p53 en ratones p53 WT y p53 KO. Se utilizó HPRT se utilizó para normalizar los valores de ARNm. ND (no detectado) BEGOÑA PORTEIRO COUTO 116 hizo un seguimiento semanal del peso. Al finalizar, se realizó de nuevo una medida de composición corporal y se hicieron test de tolerancia a glucosa e insulina. Durante las once semanas de seguimiento de peso y composición corporal, se pudo observar que los ratones p53 KO ganaron menos peso (Figura 2A) y menos masa grasa (Figura 2C) que los controles WT. Por el contrario, en los ratones alimentados con dieta estándar, la falta de p53 no afectó a la ganancia de peso ni de masa grasa. Los test de tolerancia a glucosa e insulina mostraron que tan solo en los ratones alimentados con HFD la ausencia de p53 produjo una mejora en la resistencia a insulina (Figura E, F). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 * Peso corporal (g) semanas * * * * 0 5 10 15 20 25 12345678910 11 Ganancia de peso semanal (g) ** ** 0 2 4 6 8 10 12 Ganancia de masa grasa (g) 0 5 10 15 20 25 Ganancia de masa magra (g) AB C D Macho p53WT STD Macho p53KO STD Macho p53WT HFD Macho p53KO HFD 0 100 200 300 400 500 015 30 60 120 Glucosa (mg/dL) Tiempo (min) 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 AUC 0 20 40 60 80 100 120 015 30 60 120 Glucosa (% a la basal) Tiempo (min) 0 2000 4000 6000 8000 10000 * AUC E F * * Figura 2. Fenotipo metabólico de los ratones macho p53 KO: efecto de la ausencia de p53 en peso corporal de los ratones después de libre acceso a deita estándar y dieta alta en grasa durante 11 semanas (A, B), en ganancia de masa grasa (C) y ganancia de masa magra (D). Test de tolerancia a la glucosa y área bajo la curva (AUC) y test de tolerancia a la insulina y área bajo la curva (E). Los valores indican la media ± el error estándar de p53 WT SD (n=9), p53 KO SD (n=5), p53 WT HFD (n=8) y p53 KO HFD (n=11).Test t-student comparando deita estándar y dieta alta en grasa como experimentos por separado *p<0,05; **p<0,01. Resultados 117 Repetimos el mismo procedimiento en hembras, pero los resultados encontrados en machos debido a la ausencia de p53 en la ganancia de peso y de masa grasa, no se encontraron en las hembras ya que no se observaron diferencias en peso bajo ninguna de las dos dietas, pero sí una tendencia en la acumulación de masa grasa en las hembra p53 KO alimentadas con HFD. En los test de tolerancia a glucosa e insulina no se encontró ninguna diferencia significativa entre hembras p53 KO y sus controles ni en dieta estándar ni en dieta alta en grasa. Hembra p53WT STD Hembra p53WT HFD Hembra p53KO STD Hembra p53KO HFD 0 5 10 15 20 25 30 Peso corporal (g) 0 1 2 3 4 5 6 7 Ganancia de masa grasa (g) 0 5 10 15 20 Ganancia de masa magra (g) 0 100 200 300 400 500 015 30 60 120 Glucosa (mg/dL) Tiempo (min) 0 20 40 60 80 100 120 015 30 60 90 120 Glucosa (% a la basal) Tiempo (min) Ganancia de peso semanal (g) semanas 0 2 4 6 8 10 12 12345678910 11 AUC 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 0 5000 10000 15000 20000 25000 AUC AB CD E F Figura 3. Fenotipo metabólico de los ratones hembra p53 KO. (A, B) Peso corporal de los ratones después de libre acceso a dieta estándar y dieta alta en grasa durate 11 semanas. (C) Ganancia de masa grasa y (D) ganancia de masa magra. (E) Test de tolerancia a la glucosa y área bajo la curva (AUC) y (F) test de tolerancia a la insulina y área bajo la curva. Los valores indican la media ± el error estándar de p53 WT SD (n=8), p53 KO SD (n=7), p53 WT HFD (n=9) y p53 KO HFD (n=9).Test t-student comparando deita estándar y dieta alta en grasa como experimentos por separado. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 118 Volviendo a los ratones macho, quisimos indagar acerca de la causa de la pérdida de peso de los ratones p53 KO cuando se alimentaron con dieta alta en grasa. Para ello se realizó un fenotipado metabólico más amplio introduciendo a los ratones, tras las once semanas en dieta, en jaulas metabólicas durante 48 horas. Los resultados que obtuvimos en cuanto a ganancia de peso no se pueden explicar debido a un aumento de ingesta ya que no encontramos difrencias en la misma durante la monitorización (Figura 4E). Sin embargo, sí se observó un incremento del gasto energético de los ratones p53 KO tanto durante la fase de luz como durante la fase oscura (Figura 4A). A pesar de este incremento en el gasto energético, la actividad locomotora no se vio incrementada lo que nos indica que son otros mecanismos, y no la actividad física, los que provocan ese incremento del gasto energético. La tasa de respiración tampoco se vio afectada por la ausencia de p53, por lo que este gen, no modula la partición nutricional. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 p53 WT p53 KO Gasto energético (Kcal/Kg/48h) ** ** p53WT p53 KO Masa magra (g) 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 19 20 21 22 23 Gasto energético (Kcal/Kg/48h) 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 p53 WT p53 KO Actividad locomotora total (cortes en los haces/48h) AB C 0,79 0,8 0,81 0,82 0,83 0,84 0,85 0,86 0,87 0,88 Luz Oscuridad Total RQ VCO2/VO2 D Macho p53WT HFD Macho p53KO HFD 0 1 2 3 4 5 6 p53 WT p53 KO Ingesta 48h (g) E Figura 4. Fenotipo metabólico de los ratones macho p53 KO. Efectos de la ausencia de p53 en el gasto energético total (A) y respecto a la masa magra (B); en la actividad locomotora (C), sobre la tasa de respiración (RQ, Respiratory quotient) (D) y sobre la ingesta (E). Los valores indican la media ± el error estándar de p53 WT HFD (n=14) y p53 KO HFD (n=11). Test t-student, *P<0,05 con respecto al control p53 WT. Resultados 119 LA AUSENCIA DE P53 ACTIVA LA TERMOGÉNESIS EN EL TEJIDO ADIPOSO MARRÓN (BAT, BROWN ADIPOSE TISSUE). Nos propusimos investigar el mecanismo por el cual el gasto energético se encuentra elevado en los ratones p53 KO alimentados con dieta alta en grasa. Para ello, se analizó en detalle el estado del BAT que juega un papel crucial en la termogénesis. En primer lugar, se encontró que los ratones deficientes para p53 tienen una mayor temperatura en el BAT que los WT alimentados con HFD (figura 5A). Se analizaron secciones histológicas de dicho tejido teñidas con eosina/hematoxilina y se observó que las gotas lipídicas tienen un menor tamaño en los ratones p53 KO (Figura 5B). Esto nos sugirió que el BAT está más activo en estos ratones. De acuerdo con esto, se encontraron niveles elevados de forma significativa de la proteína UCP1 mediante western blot (Figura 5C). Por otro lado, se analizaron varios genes relacionados con la termogénesis y se observó un incremento significativo en UCP3 y PRDM16 en el BAT de los ratones p53 KO en comparación con los WT. De forma consistente con la activación del BAT, el receptor adrenérgico 2 tiene una expresión mucho más elevada en los ratones p53 KO (Figura 5D). LA AUSENCIA DE P53 ACTIVA LA LIPOGÉNESIS Y LA OXIDACIÓN EN EL TEJIDO ADIPOSO BLANCO (WAT, WHITE ADIPOSE TISSUE). La menor cantidad de masa grasa en los ratones deficientes en p53 alimentados HFD nos condujo a investigar qué ruta metabólica media el metabolismo de los adipocitos en WAT. Se observó un incremento significativo en los genes SREBP1, INSIG-2 y receptor 1 adrenérgico en los ratones p53 KO (Figura 6A). Además, se encontró una disminución significativa en la expresión de la proteína fosforilada AMPK y, acorde a ello, niveles elevados de ACCα y FAS en el WAT de ratones p53 KO (Figura 6B). Como marcador de oxidación, se estudiaron los niveles de CPT1 observando un incremento en los ratones p53 KO (Figura 6B). Figura 5. Metabolismo del BAT en ratones p53 KO. Efectos de la ausencia de p53 en la temperatura interescapular (imagen térmica representativa) (A), histología del BAT (B), niveles de expresión prteica de UCP1 (C) y niveles de ARNm de genes termogénicos (D). Los valores indican la media ± el error estándar de p53 WT HFD (n=7-8) y p53 KO HFD (n=7-8). El HPRT se utilizó para normalizar los valores de ARNm. Test t-student, *P<0,05; **p<0,01 con respecto al control p53 WT. Imgagen termográfica 100m100m Eosina/Hematoxilina Niveles de proteína de BAT (% control) 0 50 100 150 200 250 UCP1 ** Macho p53WT HFD Macho p53KO HFD -actina p53 WT UCP1 p53 KO 0 50 100 150 200 UCP3 PRDM16 PGC1αFGF21 BMP7 Recept b1 adren. Recept b3 adren. Niveles de ARNm de BAT (% control) 0 50 100 150 200 250 Recept b2 adren. * ** A CD B p53 WT p53 KO p53 WT p53 KO BEGOÑA PORTEIRO COUTO 120 ACCIONES DE LA GHRELINA EN METABOLISMO DE RATONES p53 KO LA FALTA DE P53 BLOQUEA LA GANANCIA DE PESO Y DE MASA GRASA PROVOCADA POR LA ADMINISTRACIÓN PERIFÉRICA CRÓNICA DE GHRELINA. Una vez estudiadas las rutas metabólicas en el WAT de los ratones p53 KO, quisimos investigar si la ghrelina, hormona conocida por su acción adipogénica, tiene algún papel relacionado con la acción de p53 en dicho tejido. Para comprobar la importancia de la acción periférica de la ghrelina en el peso corporal y en la adiposidad, se diseñó un experimento en el que se inyectó ghrelina (30g/día) vía intraperitoneal y de forma crónica durante una semana a ratones p53 WT y p53 KO. Este tratamiento provocó un aumento de la media del peso corporal en ratones p53 WT (Figura 7A), aunque con el análisis estadístico ANOVA de dos vías no se obtuvo una interacción significativa entre la acción de la ghrelina y p53 (P = 0,25, F = 1,31, df = 1). Este aumento en la media del peso corporal se acompañó de un aumento en la media del porcentaje de masa grasa (Figura 7C), aunque de nuevo, tras el análisis estadístico con el ANOVA de dos vías no se encontró interacción entre la ghrelina y p53 (P = 0,7, F = 3,38, df = 1). Si analizamos los Figura 6. Metabolismo del WAT de los ratones p53 KO. Efectos de la ausencia de p53 en la expresión de genes (A) y proteína (B) relacionadas con el metabolismo lipídico. Los valores indican la media ± el error estándar de p53 WT HFD (n=7-8) y p53 KO HFD (n=7-8). El HPRT se utilizó para normalizar los valores de ARNm. Test t-student, *P<0,05 con respecto al control p53 WT. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 SREBP1 FAS INSIG 2 ATGL HSL MGLL Recept b1 adren. Recept b2 adren. Recept b3 adren. PGC1αUCP1 CIDEA Niveles de ARNm de WAT (% control) * * * * A Macho p53WT HFD Macho p53KO HFD Niveles de proteína de WAT (% control) * *** B -actina p53 WT pAMPK AMPK1 AMPK2 ACC FAS CPT1 p53 KO 0 50 100 150 200 250 PAMPK AMPKα1 AMPKα2 ACCαFAS CPT1 pAMPK Resultados 121 datos con un test estadístico (t-student) comparando solo las medias de los ratones p53 WT, sí obtenemos diferencias significativas con el tratamiento con ghrelina. En los ratones p53 KO, la acción de la ghrelina no tiene efecto ni en peso corporal (Figura 7A) ni en el porcentaje de masa grasa (Figura 7C). No se observaron cambios en el porcentaje de masa no grasa en los ratones p53 WT ni en los ratones p53 KO (Figura 7D) así como tampoco cambios en la ingesta acumulada tras el tratamiento con la ghrelina (Figura 7B). Es importante destacar que el peso corporal, la ingesta y la composición corporal fue similar entre los grupos p53 WT y p53 KO antes de iniciar el tratamiento con ghrelina (Tabla 28). p53WT p53KO Peso corporal (g) 22.11±1.18 20.59±0.98 Ingesta (g) 3.68±0.2 3.87±0.27 Masa grasa (%) 8.5±0.34 9.67±0.47 Masa magra (%) 85.16±1.4 85.11±0.77 El tratamiento crónico con ghrelina se asocia con un balance energético positivo, pero no encontramos ningún efecto en parámetros séricos como la glucosa, insulina, triglicéridos, colesterol, ácidos grasos libres y corticosterona (Tabla 29). Figura 7. Efectos de la administración crónica intraperitoneal de ghrelina (30g/día) sobre el peso corporal (A), ingesta (B) y sobre la composición corporal en masa grasa (C) y magra (D). Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 10 animales por grupo. Test ANOVA de dos vías seguido de un post test Bonferroni; *P<0,05 frente al control. 0 50 100 150 200 Ganancia de peso corporal (%) p53 WT vehículo ip p53 WT grelina ip (30g/día) p53 KO vehículo ip p53 KO grelina ip (30g/día) 0 5 10 15 20 25 30 35 Ingesta acumulada (%) 0 20 40 60 80 100 120 140 Masa grasa (%) 0 20 40 60 80 100 120 Masa magra (%) AB CD Tabla 28. Peso corporal, ingesta y composición corporal (masa grasa y masa magra) de ratones p53 WT y p53 KO antes de iniciar el tratamiento con ghrelina. Los datos se presentan como la media y  el error estándar de un n de 23 y 19 ratones por grupo. Test ANOVA de dos vías seguido de un post test Bonferroni; *P<0,05 frente al control. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 128 Centrándonos en el metabolismo lipídico, se observó un aumento en la expresión de proteínas implicadas en la síntesis de novo con los niveles elevados de FAS. También analizamos marcadores de oxidación: CPT1, ACADM, ACADL y FATP2 que permanecen sin cambios tras la reducción de los niveles de p53.De acuerdo con este daño hepático también hallamos incrementos significativos en los marcadores de respuesta al estrés del retículo endoplasmático (pIRE/IRE, XBP1s, pPERK y peIF2α/eiF2α) y en la apoptosis (cleaved caspasa 3 y 7) (Figura 14). Niveles de proteína hepática (% control) 0 20 40 60 80 100 120 140 p53 * p53flox-AAV8-GFP SD p53flox-AAV8-CRE SD Oil Red O p53flox-AAV8-GFP Eosina hematoxilina 100 m p53flox-AAV8-CRE 100 m 100 m100 m GAPDH AAV8 CRE p53 flox AAV8 GFP p53 mgTG/g hígado 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 ** 0 5 10 15 20 25 AST (IU/mL) * 0 1 2 3 4 5 6 ALT (IU/mL) 0 20 40 60 80 TG en suero (mg/dL) AB C Figura 13. Efectos de la disminución de p53 en la esteatosis hepática. . Niveles de la expresión de p53 en el hígado de ratones p53 flox inyectados con el AAV8-Cre y AAV8-GFP en la vena de la cola (n = 7 por grupo) (A). Cortes histológicos de hígado con la tinción eosina/hematoxilina y Oil Red O (B). Niveles de triglicéridos en hígado y medidas de transaminasas y triglicéridos en suero (C) (n = 8 AAV8-GFP y n = 11 AAV8). Se utilizó GAPDH para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar.Test t-student, *p<0,05 y **p<0,01 frente al control p53 flox AAV-GFP. Figura 14. Efectos de la disminución de p53 en la esteatosis hepática. (A) Cuantificación de la expresión de las proteínas FAS, pJNK/JNK, pIRE/IRE, XBP1s, pPERK, peIF2α/eif2α, Cleaved caspasa 3, Cleaved caspasa 7 y APOB (n = 7 por grupo). (B) Cuantificación de la expresión de los genes CPT1, ACADM, ACADL y FATP2 (n = 8 por grupo). Se utilizó GAPDH y transferrina para normalizar los niveles de proteína y HPRT para normalizar los valores de ARNm. Los valores indican la media ± el error estándar. Test t-student, *p<0,05 y**p<0,01 frente al control p53 flox AAV-GFP. Niveles hepáticos de ARNm (% control) 0 20 40 60 80 100 120 140 CPT1 ACADM ACADL FATP2 0,06 ** * * ** ** 0 50 100 150 200 250 300 FAS pJNK/JNK pIRE/IRE XBP1s pPERK peIF2α/eIF2αCleaved Caspase 3 Cleaved Caspase 7 * Niveles de proteína hepática (% control) 0 20 40 60 80 100 120 140 ApoB100 ApoB48 Ap53flox-AAV8-GFP SD p53flox-AAV8-CRE SD GAPDH FAS pJNK JNK GFP CRE p53 flox GAPDH pIRE1 IRE1 XBP1s GFP CRE p53 flox eIF2α pPERK GAPDH peIF2α GFP CRE p53 flox GAPDH Cleaved caspase 3 Cleaved caspase 7 GFP CRE p53 flox ApoB100 ApoB48 Transferrina GFP CRE p53 flox Bp53flox-AAV8-GFP SD p53flox-AAV8-CRE SD Resultados 129 Quisimos comprobar si además de la esteatosis hepática, la disminución de p53 de forma específica en el hígado producía cambios el metabolismo de la glucosa. Para ello se realizó un test de tolerancia a la glucosa y a la insulina y, como se puede observar en la figura 15 no se observaron cambios. LA SOBREEXPRESIÓN DE P53 MEJORA LA ESTEATOSIS Y LA ESTEATOHEPATITIS EN RATONES P53 KO Y EN RATONES ALIMENTADOS CON DIETA ALTA EN GRASA. Hasta ahora comprobamos que tanto la deficiencia parcial como global de p53 en el hígado provoca esteatosis y esteatohepatitis independientemente del tipo de dieta. El siguiente experimento consistió en comprobar si la recuperación de la expresión de p53 es suficiente para mejorar el estado hepático de los ratones p53 KO alimentados con dieta alta en grasa. Para ello, se inyectó a través de la vena de la cola un adenovirus que codifica para p53 y su control GFP. Una semana después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se comprobó la especificidad de la infección en el hígado. Para ello se realizó un western blot para comprobar la expresión de GFP en distintos tejidos (Figura 16A). Además, los niveles de p53 en el hígado aumentaron tras la inyección del adenovirus como se puede comprobar en la figura 16B. 0 10000 20000 30000 AUC 0 2000 4000 6000 AUC Glucosa (mg/dL) Tiempo (min) 0 50 100 150 200 250 300 015 30 60 90 120 0 20 40 60 80 100 120 015 30 60 90 120 Glucosa (% a la basal) Tiempo (min) A B Figura 15. Efectos de la disminución de p53 en el metabolismo de la glucosa. (A) Test de tolerancia a la glucosa y área bajo la curva. (B) Test de tolerancia a la insulina y área bajo la curva (n = 8 AAV8-GFP y n = 11 AAV8).Los valores indican la media ± el error estándar. Test t-student, *p<0,05 frente al control p53 flox AAVGFP. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 130 Despúes de una semana de infección con el adenovirus de p53, tanto los ratones p53 KO como los p53 WT mostraron una menor cantidad de gotas lipídicas, menor cantidad de triglicéridos y una tendencia no significativa a una menor concentración de AST en suero. (Figura 16C, D). Esta mejora del contenido hepático de grasa vino acompañada de la inhibición las proteínas FAS, pJNK/JNK, de marcadores de estrés de retículo endoplasmático y de apoptosis (Cleaved caspasa 3) (Figura 17A,B). 0 20 40 60 80 100 120 Nivele de la proteína GFP (% control) ND ND LIVER BAT LIVER BAT 200bp 600bp p53WT adGFP p53WT adp53+p53KO adGFP p53KO adp53+ Oil Red O adGFP p53WT HFD adp53+p53WT HFD adGFP p53KO HFD adp53+p53KO HFD Eosina Hematoxilina 100 m100 m100 m100 m 200 m200 m200 m200 m 0 5 10 15 20 * ** (mg TG/g hígado) AST (IU/ml) 0 5 10 15 20 0,09 p53WT p53KO GFP GAPDH Hígado BATBAT Hígado AB CD TG en suero (mg/dL) 0 20 40 60 80 100 120 140 *adGFP p53WT HFD adp53+p53WT HFD adGFP p53KO HFD adp53+p53KO HFD Figura 16. La recuperación de los niveles de p53 en el hígado de los ratones p53 KO en HFD mejora la esteatosis y la esteatohepatitis. (A) Comprobación de los niveles de GFP en distintos tejidos (n = 4 por grupo). (B) Expresión de p53 en el hígado de ratones p53 WT y p53 KO tras una semana de infección del adenovirus (n = 4 por grupo). (C) Tinción eosina-hematoxilina y Oil Red O de cortes histológicos de hígado (n= 3 por grupo). (D) Niveles de triglicéridos en hígado y suero y de AST en suero (n = 6 GFP y n = 5 adp53+ en los p53 WT y n = 5 GFP y n = 4 adp53+). Los valores indican la media ± el error estándar. Test t-student, *p<0,05 y **p<0,01 con respecto a p53 WT GFP y p53 KO GFP respectivamente. Resultados 131 p53 regula la expresión de p63 en el hígado. Una vez que estudiamos los efectos que tiene la falta de p53 en el metabolismo de lipídico hepático, intentamos averiguar qué mecanismos regulan estos efectos. Existen varias dianas downstream de p53 relacionados con la regulación del metabolismo lipídico en el hígado como Bax, p66 shc y p21239,276. Tras comprobar su expresión en ratones p53 KO no se encontró ningún cambio significativo (figura 18A). Por tanto, se estudiaron otros miembros de la familia p53 que median la apoptosis dependiente de p53277; de nuevo, mediante el estudio de la expresión proteica, no se encontraron cambios en los niveles de p73 en el hígado de ratones p53 KO, pero sí un incremento significativo en los niveles de p63. Esto nos llevó a estudiar en nuestros modelos la expresión de p63 (Figura 18B-D). Niveles hepáticos de ARNm (% control) 0 20 40 60 80 100 120 140 CPT1 ACADM ACADL FATP2 *** * * 0 20 40 60 80 100 120 140 FAS pJNK/JNK pIRE/IRE XBP1s pPERK peIF2α/eIF2αCleaved Caspase 3 Cleaved Caspase 7 Niveles de proteína hepática (% control) 300 350 0 50 100 150 ApoB100 ApoB48 ** * * ** ** *** *** *** 160 280 ApoB100 adp53+ p53 WT adGFP adp53+ p53 KO adGFP ApoB48 Transferrina peIF2α GAPDH Cleaved caspase 3 Cleaved caspase 7 adp53+ p53 WT adGFP adp53+ p53 KO adGFP pPERK XBP1s pIRE1 GAPDH eIF2α adp53+ p53 WT adGFP adp53+ p53 KO adGFP GAPDH FAS JNK pJNK IRE1 adp53+ p53 WT adGFP adp53+ p53 KO adGFP A B adGFP p53WT HFD adp53+p53WT HFD adGFP p53KO HFD adp53+p53KO HFD Figura 17. La recuperación de los niveles de p53 en el hígado de los ratones p53 KO en HFD mejora la esteatosis y la esteatohepatitis. (A) Cuantificación de la expresión de genes de oxidación en el hígado (CPT1, (n = 6 GFP y n = 5 adp53+ en los p53 WT y n = 5 GFP y n = 4 adp53+). (B) Cuantificación de la expresión de las proteínas FAS, pJNK/JNK, pIRE/IRE, XBP1s, pPERK, peIF2α/eif2α, Cleaved caspasa 3, Cleaved caspasa 7 y APOB (n = 6 GFP y n = 5 adp53+ en los p53 WT y n = 5 GFP y n = 4 adp53+). Se utilizó GAPDH y transferrina para normalizar los niveles de proteína y HPRT para normalizar los valores de ARNm.Los valores indican la media ± el error estándar. Test t-student, *p<0,05 y **p<0,01 con respecto a p53 WT GFP y p53 KO GFP respectivamente. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 132 p63 pertenece a una familia de factores de transcripción, como p53 y p73; se sinteteiza a partir de dos promotores distintos dando lugar a dos proteínas: TAp63 que contiene un dominio de transactivación completo y Np63 con el extremo N-terminal truncado, es decir, le falta parte de ese dominio de transactivación pero mantiene la capacidad para actuar como factor de transcripcion201. Como hemos explicado anteriormente, en ambas proteínas, un splicing Macho p53WT SD Macho p53KO SD A Niveles de proteína hepática (% control) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 p73 bax p66shc p21 p73 p53 KO p53 SD p53 WT Bax p66-Shc GAPDH p21 adGFP p53WT HFD adp53+p53WT HFD adGFP p53KO HFD adp53+p53KO HFD F * * Niveles de proteína hepática (% control) 0 50 100 150 200 DNp63apha DNp63beta DNp63gamma Np63alpha Np63beta Np63gamma 0 50 100 150 200 TAp63 alpha TAp63beta TAp63gamma Niveles de proteína hepática (% control) * Bp53 WT SD p53 KO SD 0 50 100 150 200 250 Niveles de p63 hepático (% control) * p63 p53 KO p53 WT GAPDH 0 50 100 150 Niveles de p63 hepático (% control) * p53 flox GFP CRE p63 GAPDH Dp53flox-AAV8-GFP p53flox-AAV8-CRE C 0 50 100 150 Niveles de p63 hepático (% control) ** p53 KO adp53+ p53 WT adGFP adp53+ adGFP p63 GAPDH adGFP p53WT HFD adp53+p53WT HFD adGFP p53KO HFD adp53+p53KO HFD E p53 WT SD p53 KO SD TAp63alpha p53 KO p53 WT GAPDH TAp63beta TAp63gamma Np63alpha GAPDH p53 KO p53 WT Np63beta Np63gamma * 0 50 100 150 DNp63 alpha DNp63beta DNp63gamma Np63alpha Np63beta Np63gamma Niveles de proteína hepática (% control) p53 WT SD p53 KO SD 0 50 100 150 TAp63alpha TAp63beta TAp63gamma * ** * Niveles de proteína hepática (% control) TAp63alpha TAp63beta TAp63gamma GAPDH adp53+ p53 WT adGFP adp53+ p53 KO adGFP Ndp63alpha Np63beta Np63gamma GAPDH adp53+ p53 WT adGFP adp53+ p53 KO adGFP Figura 18. p53 regula la expresión de p63 en el hígado. (A) Cuantificación de la expresión de dianas por debajo de p53 (p73, bax, p66shc y p21) en ratones p53 KO SD (n = 7 por grupo). (B) Cuantificación de la expresión de p63 en el hígado de ratones p53 KO SD (n = 7 por grupo). (C) Niveles de expresión de p63 en ratones p53 WT y KO HFD con inyección de adenovirus p53 dominante positivo y GFP (n = 6 GFP y n = 5 adp53+ en los p53 WT y n = 5 GFP y n = 4 adp53+). (D) Cuantificación de la expresión de p63 en ratones p53 flox-Cre y p53 flox-GFP (n = 7 por grupo). (E) Cuantificación de la expresión de las isoformas de TAp63 y Np63 en p53 KO SD (n = 7 por grupo). (F) Cuantificación de las distintas isoformas de TAp63 y Np63 en p53 KO HFD. Se utilizó GAPDH para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar. Test tstudent, *p<0,05 y **p<0,01 con respecto al control. Resultados 133 alternativo en el extremo C-terminal, da lugar a distintas isoformas. Quisimos estudiar en nuestros modelos animales la expresion de dichas isoformas cuantificando los niveles de proteína en el hígado de los ratones p53 KO en dieta estándar. Los resultados nos indicaron que la isoforma TAp63α aumentó de forma significativa, reproduciendo así, los resultados encontrados midiendo p63 total; mientras que la expresión de TAp63β y TAp63 disminuyó. Las isoformas de la proteína Np63 no presentan cambios (Figura 18E). Luego, se midió la expresión de estas proteínas en nuestro modelo de ratones p53 KO y p53 WT en HFD donde se recuperó la expresión de p53 mediante un adenovirus que sobreexpres p53 y su control GFP. Se encontró que TAp63α disminuye significativamente en los ratones en los que se recuperó la expresión de p53, tanto en los ratones WT como en los KO (Figura 14F). TAp63 disminuye en los ratones WT donde se sobreexpresó p53, pero no en los ratones p53 KO; TAp63 no presentó ningun cambio. Los niveles de las isoformas Np63α y Np63 no cambian, pero los niveles de Np63 aumentan en los ratones p53 WT inyectados con el adenovirus p53 dominante positivo; no vimos este efecto en los ratones p53 KO (Figura 18F). En resumen, todos estos resultados indican que TAp63 es la única isoforma que se regula de una manera homogénea en el hígado, incrementando sus niveles cuando no hay p53 mientras que disminuye cuando sobre-expresamos p53. LOS NIVELES HEPÁTICOS DE TAP63 AUMENTAN CON DIETA ALTA EN GRASA. Se sabe que las dietas altas en grasa provocan esteatosis hepática e incrementan el estrés del RE por lo que diseñamos un experimento en el que alimentamos a ratones de la cepa C57BL6 con dieta estándar y HFD (60% de grasa) durante 2 y cuatro semanas. Tras finalizar este tiempo, medimos los niveles de las isoformas de TAp63 y Np63 en el hígado. Se observó el incremento de peso corporal (Figura 19A) y la disminución en la ingesta (Figura 19B) esperados. En cuanto a p63, encontramos que TAp63α es la única isoforma que aumenta de forma consistente tanto a 2 como a 4 semanas de dieta alta en grasa; por otro lado, TAp63 disminuye y TAp63 solo aumenta tras 4 semanas de dieta (Figura 19C). Cuando estudiamos las isoformas de Np63, los resultados no fueron consistentes ya que detectamos niveles elevados de Np63α y Np63 solo a 2 semanas de dieta; mientras a 4 semanas de dieta, las tres isoformas dismimuyen (Figura 19C). Además, se observó que el aumento de los niveles de TAp63α precede a los cambios en la respuesta al estrés del RE y a la lipogénesis ya que dichos marcadores permanecen sin cambios a las 2 semanas de dieta y FAS se encontraba disminuido de forma significativa (Figura 19D). BEGOÑA PORTEIRO COUTO 134 LA INHIBICIÓN DE P63 MEJORA LA ESTEATOSIS HEPÁTICA PROVOCADA POR LA INACTIVACIÓN DE P53. Dados los efectos que provoca en la expresión de p63 la manipulación de p53, nos propusimos realizar un experimento para investigar si la inhibición hepática de p63 puede revertir el daño creado por la falta de p53. Para ello utilizamos ratones p53 flox a los que se le inyectó el virus adenoasociado Cre junto con un lentivirus que codifica un RNA horquilla (shRNA) contra el ARNm de p63 y su control GFP. La administración de los virus se realizó a través de la vena de la cola para que ambos virus infecten de forma específica el hígado. La eficiencia de la infección con el lentivirus se confirmó mediante una disminución significativa de los niveles de la proteína p63 (Figura 20A). Un mes después de la infección con el shRNA para p63, los ratones mostraron una menor cantidad de gotas lipídicas en los hepatocitos comparados con sus controles, ratones p53flox-Cre y lentivirus para GFP (Figura 20B). También se halló una disminución de los niveles hepáticos de triglicéridos y de transaminasas *** 0 20 40 60 80 100 120 FAS pIRE XBP1s pPERK Niveles de proteían hepática (% control) C57 SD 2 semanas C57 HFD (60%) 2 semanas C57 SD 4 semanas C57 HFD (60%) 4 semanas C A 0 2 4 6 8 10 0 3 6 10 15 18 26 30 Peso corporal acumulado (g) Días *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** 0 20 40 60 80 100 120 0 3 6 10 15 18 26 30 Ingesta acumulada (g) Días ***** B Niveles de proteían hepática (% control) 0 100 200 300 400 TAp63 alpha TAp63beta TAp63gamma **** * ** 0 50 100 150 200 DNp63 alpha DNp63beta DNp63gamma ** * * * ** Np63alpha Np63beta Np63gamma D C57 SD 2 semanas C57 HFD (60%) 2 semanas Niveles de proteían hepática (% control) TAp63α TAp63 GAPDH TAp63 SD 2 semanas HFD 2 semanas SD 4 semanas HFD 4 semanas Np63α Np63 GAPDH Np63 SD 2 semanas HFD 2 semanas SD 4 semanas HFD 4 semanas FAS pIRE XBP1s pPERK GAPDH SD 2 semanas HFD 2 semanas Figura 19. TAp63 aumenta en dieta alta en grasa. (A) Cambios en el peso corporal (n = 10 por grupo). (B) Cambios en la ingesta (n = 10 por grupo). (C) Cuantificación de la expresión de las isoformas de TAp63 y Np63 tras 2 y 4 semanas en dieta alta en grasa (n = 6 por grupo). (D) Cuantificación de la expresión de FAS, pIRE,XBP1s y pPERK en el hígado de ratones alimentados con dieta estándar y alta en grasa durante 2 semanas (n = 7 por grupo).Se utilizó GAPDH para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar. Test t-student, *p<0,05; **p<0,01 y ***p<0,001 con respecto al control. Resultados 135 en suero; sin cambios en los niveles de triglicéridos en suero (Figura 20C). La disminución de la esteatosis hepática en los ratones que expresan niveles bajos tanto de p53 como de p63 es consistente con una disminución de la expresión de proteínas como FAS, pJNK y marcadores de estrés de RE como pPERK y XBP1s (Figura 20D). En este caso no encontramos diferencias en la proteína ApoB (Figura 16D) ni tampoco cambios en los genes marcadores de oxidación, CPT1, ACADM, ACADL y FATP2 (Figura 20E). LA INHIBICIÓN DE P63 MEJORA LA ESTEATOSIS HEPÁTICA PROVOCADA POR UNA DIETA ALTA EN GRASA. El siguiente experimento que nos propusimos fue comprobar la eficiencia del silenciamiento de p63 en ratones obesos. Un mes después de la inyección a través de la vena de la cola del lentivirus que codifica un shRNA para p63 y su respectivo contro, GFP, se encontró una mejora del estado hepático. Comprobamos de nuevo la eficiencia del silenciamiento mediante western blot (Figura 21A). Se observaron menos gotas lipídicas en los cortes histológicos (Figura 21B), menor contenido hepático de TG y de transaminasas en suero sin mg TG/g hígado 0 1 2 3 4 * A CRE shp63 CRE GFP p63 GAPDH Niveles de proteína hepática p63 (% control) 0 50 100 150 * B Oil Red O p53flox-AAV8-CRE+GFP p53flox-AAV8-CRE+shp63 Hematoxylina eosina 100 m100 m 100 m100 m C 0 5 10 15 20 25 AST (IU/mL) * 0 1 2 3 4 5 ALT (IU/mL) * TG suero (mg/dL) 0 20 40 60 80 100 p53flox-AAV8 CRE-GFP p53flox-AAV8 CRE-shRNAp63 E Niveles de ARNm hepático (% control) 0 50 100 150 CPT1 ACADM ACADL FATP2 GAPDH FAS JNK pJNK p53 flox CRE shp63 CRE GFP IRE1 pPERK GAPDH XBP1s eIF2α pIRE1 p53 flox CRE shp63 CRE GFP GAPDH peIF2α Cleaved caspase 3 p53 flox CRE shp63 CRE GFP Transferrina ApoB100 ApoB48 p53 flox CRE shp63 CRE GFP D Niveles de proteína hepática (% control) 0 20 40 60 80 100 120 FAS pJNK/JNK pIRE/IRE XBP1s pPERK peIf2α/eIF2αCleaved Caspase 3 ** * ** ** ** 0 50 100 150 200 ApoB100 ApoB48 Figura 20. Efectos de la inhibición hepática simultánea de p63 y p53 en dieta estándar (A) Cuantificación de los niveles de p63 total tras un mes de la inyección de lentivirus (n = 7 por grupo). (B) Tinción eosina hematoxilina y Oil Red O en cortes histológicos de hígado de ratones (n = 3 por grupo). (C) Contenido hepático de triglicéridos y niveles en suero de transaminasas y triglicéridos (n = 8 por grupo). (D) Cuantificación de la expresión de FAS, pJNK/JNK, pIRE/IRE,XBP1s, pPERK, peIF2α/eiF2α, cleaved caspasa 3 y ApoB (n = 5 por grupo). (E) Niveles de expresión de los genes CPT1, ACADM, ACADL y FATP2. Se utilizó GAPDH para normalizar los niveles de proteína y HPRT para normalizar los niveles de ARNm. Los valores indican la media ± el error estándar. Test t-student, *p<0,05 y **p<0,01 con respecto al control p53 flox-Cre con lentivirus GFP. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 136 cambios en niveles de TG circulantes (Figura 21C). De acuerdo con esta mejora del estado hepático, se observó una menor expresión de las proteínas FAS, pJNK/JNK, XBP1s, pPERK, peIF2α/eiF2α. En este experimento ApoB100 se redujo de forma significativa tras el silenciamiento de p63; no fue así con ApoB48 (Figura 21D). Tampoco se encontraron cambios en los niveles de los genes de oxidación CPT1, ACADM, ACADL y FATP2 (Figura 21E). LA SOBREEXPRESIÓN DE TAP63 PROVOCA ESTEATOSIS. La inhibición farmacológica del estrés del retículo endoplasmático revierte la esteatosis provocada por la sobrexpresión de TAp63α. Para conseguir la sobreexpresión de la isoforma TAp63α en el hígado, se inyectó a través de la vena de la cola un virus adenoasociado para p63 (AAV8-TAp63α) y su control GFP (AAV8-GFP).Tres semanas después de la infección con el virus, se inició el tratamiento para reducir el estrés de RE con una chaperona química, TUDCA278, inyectándolo de forma intraperitoneal durante una semana. Los niveles hepáticos de la proteína TAp63α incrementaron HFD-Lentiv shRNA p63 Oil Red O HFD-Lentiv turbo GFP Hematoxylina eosina 100 m100 m 100 m100 m 0 50 100 150 Niveles de proteína hepática p63 (% control) * Lentiv shRNA p63 Lentiv GFP p63 GAPDH A B C 0 5 10 15 20 mg TG/g hígado * 0 5 10 15 AST (IU/mL) * 0 2 4 6 8 ALT (IU/mL) * TG suero (mg/dL) 0 20 40 60 80 100 HFD-Lentiv GFP HFD-Lentiv shRNA p63 D J 0 50 100 150 200 FAS pJNK/JNK pIRE/IRE XBP1s pPERK peIF2α/eIF2αCleaved caspase 3 Niveles de proteína hepática (% control) *0,05 ** * * * 0 20 40 60 80 100 120 APOB 100 APOB 48 GFP GAPDH FAS pJNK JNK shp63 GAPDH pIRE1 IRE1 XBP1s pPERK peIF2α GAPDH eIF2α Cleaved caspase 3 GFP shp63 GFP shp63 ApoB100 Transferrina ApoB48 GFP shp63 0 50 100 150 CPT1 ACADM ACADL FATP2 Niveles de ARNm hepático (% control) Figura 21. Efectos de la inhibición hepática simultánea de p63 en ratones obesos. (A) Cuantificación de los niveles de p63 total tras un mes de la inyección de lentivirus (n = 7 por grupo). (B) Tinción eosina hematoxilina y Oil Red O en cortes histológicos de hígado de ratones (n = 3 por grupo). (C) Contenido hepático de triglicéridos y niveles en suero de transaminasas y triglicéridos (n = 11 GFP y 13 shRNA p63). (D) Cuantificación de la expresión de FAS, pJNK/JNK, pIRE/IRE,XBP1s, pPERK, peIF2α/eiF2α, cleaved caspasa 3 y ApoB (n = 7 por grupo). (E) Niveles de expresión de los genes CPT1, ACADM, ACADL y FATP2. Se utilizó GAPDH para normalizar los niveles de proteína y HPRT para normalizar los niveles de ARNm. Los valores indican la media ± el error estándar. Test t-student, *p<0,05 con respecto al control lentivirus GFP. Resultados 137 significativamente tras un mes de infección con el virus (Figura 22A). Los ratones, alimentados con dieta estándar, mostraron una mayor cantidad de gotas lipídicas en los hepatocitos debido a la sobreexpresión de p63 (Figura 22B), niveles elevados de TG hepáticos y un incremento de AST en suero (Figura 22C). Asociamos este mayor contenido en grasa en el hígado con una estimulación del estrés de RE debido a que se incrementó la expresión de diversos marcadores de respuesta a dicho estrés como XBP1s y peIF2α/eiF2α (Figura 22D). Todos estes efectos se pudieron revertir tras el tratamiento con TUDCA (Figura 22B-D). En cuanto a la oxidación de lípidos, la sobreexpresión de TAp63α redujo los niveles de CPT1 y ACADM, pero el tratamiento con TUDCA no fue capaz de modificar este perfil (Figura 22E). La inhibición genética del estrés del retículo endoplasmático revierte la esteatosis provocada por la sobrexpresión de TAp63α. Decidimos realizar una segunda aproximación para intentar revertir el estrés de RE generado por la sobreexpresón de TAp63α. De nuevo se utilizó un AAV inyectado a través de la cola para aumentar la expesión de p63 en hígado. A las tres semanas de infección, se B C mg TG/g hígado 0 1 2 3 4 *** AAV8-GFP Vehículo AAV8-TAp63αVehículo AAV8-TAp63αTUDCA AAV8-GFP TUDCA Niveles de proteína hepática (%control) 0 50 100 150 200 250 pJNK/JNK XBP1s pPERK peIF2α/eIF2αCleaved Caspase 3 Cleaved Caspase 7 * ** **** D E GAPDH TAp63α AAV8 GFP AAV8 TAp63 ** 0 50 100 150 Niveles proteína TAp63αen hígado (% control) A AAV8 TAp63α+ Vehículo Oil Red O AAV8 GFP + Vehículo 100 m Hematoxylina eosina AAV8 GFP + TUDCA 100 m100 m100 m 100 m100 m100 m AAV8 TAp63α+ TUDCA 100 m 0 5 10 15 AST (IU/mL) ** GFP Vehículo TAp63α Vehículo TAp63α TUDCA GAPDH JNK pJNK Niveles de ARNm hepático (% control) 0 20 40 60 80 100 120 140 CPT1 ACADM ACADL FATP2 *** ** * * * 0 50 100 150 200 250 ApoB 100 ApoB 48 TG suero (mg/dL) 0 50 100 150 200 * GAPDH XBP1s eIF2α pPERK GFP Vehículo TAp63α Vehículo TAp63α TUDCA Cleaved caspase 3 GAPDH peIF2α Cleaved caspase 7 GFP Vehículo TAp63α Vehículo TAp63α TUDCA ApoB48 ApoB100 Transferrina GFP Vehículo TAp63α Vehículo TAp63α TUDCA Figura 22. Efectos de la sobreexpresión hepática simultánea de TAp63 en ratones obesos. . (A) Cuantificación de los niveles de TAp63α tras un mes de la inyección del virus (n = 7 por grupo). (B) Tinción eosina hematoxilina y Oil Red O en cortes histológicos de hígado de ratones (n = 4 por grupo). (C) Contenido hepático de triglicéridos y niveles en suero de transaminasas y triglicéridos (n = 9 GFP y 10 TAp63α). (D) Cuantificación de la expresión de FAS, pJNK/JNK, pIRE/IRE,XBP1s, pPERK, peIF2α/eiF2α, cleaved caspasa 3 y ApoB (n = 7 por grupo). (E) Niveles de expresión de los genes CPT1, ACADM, ACADL y FATP2 (n = 8 por grupo). Se utilizó GAPDH y transferrina para normalizar los niveles de proteína y HPRT para normalizar los niveles de ARNm. Los valores indican la media ± el error estándar. Test t-student, *p<0,05 y **p<0,01 con respecto al control AAV-GFP. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 144 Estudio de los niveles de TAp63, IKK y XBP1s en muestras humanas Analizamos muestras de biopsias hepáticas procedentes de pacientes con NAFLD (IMC  35Kg/m2) procedentes de dos cohortes diferentes; una utilizada para el estudio de la expresión de ARNm 4 ; las características de estos pacientes se encuentran resumidas en la tabla 30. Una segunda cohorte para el estudio inmunohistoquímico 5 de la expresión de TAp63α; las características de estos pacientes se encuentran resumidas en la tabla 31. Nuestros resultados muestras que existe una correlación positiva entre p63 y el IMC (Figura 29A), entre el NAS score y el índice de masa corporal (Figura 29B) y una clara tendencia entre p63 y el NAS score (Figura 29C). Además, encontramos una elevada expresión de p63, IKK y XBP1s en pacientes con NAFLD comparándolos con individuos con un IMC  35Kg/m2. El análisis inmunohistoquímico de la expresión de TAp63α corroboró los resultados, ya que se encuentran niveles más elevada en pacientes con NAFLD y NASH en comparación con pacientes control (IMC  35Kg/m2). 4 Las muestras pertenecientes a esta cohorte fueron cedidas por la Doctora Guadalupe Sabio; Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Las muestras fueron obtenidas en el Hospital Universitario Marqués de Valdecilla de Santander. 5 Las muestras pertenecientes a esta cohorte fueron cedidas por la Doctora María Luz Martínez Chantar; CIC bioGUNE, Centro de Investigación Biométida en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd). Las muestras fueron obtenidas en el Hospital Universitario de Salamanca por el Dr. Miguel Marcos. D TAp63α-No NAFLD TAp63α-NAFLD TAp63α-NASH 50m50m50m E 0 5 10 15 20 25 30 050 100 Niveles hepáticos de ARNm de p63 (% control) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 050 100 NAS score Índice de masa corporal (kg/m2) Índice de masa corporal (kg/m2) A B 0 5 10 15 20 25 30 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Niveles hepáticos de ARNm de p63 (% control) C NAS score r = 0.42 p = 0.003 r = 0.33 p = 0.02 r = 0.25 p = 0.06 Niveles hepáticos humanos de ARNm(% control) 0 50 100 150 200 250 300 350 p63 IKKb XBP1s 0,05 **** No-NAFLD (n = 18) NAFLD (n = 48) IKK Figura 29. Datos clínicos y expresión de p63. Correlación entre (A) niveles de p63 e índice de masa corporal, (B) índice de masa corporal y NAS score y (C) niveles de p63 y NAS score. Las correlaciones entre los niveles de p63 y las diferentes variables de estudio se analizaron mediante el coeficiente de correlación de Pearson (si los datos siguen una distribución normal) o el coeficiente de correlación de Spearman (si los datos no siguen una distribución normal) (r). (D) Niveles hepáticos de ARNm de TAp63, IKKβ y XBP1s en pacientes sin NAFLD (n = 18) y con NAFLD (n = 48). Se utilizó HRPT para normalizar los niveles deARNm. Los valores indican la media ± el error estándar. Test t-student, *p<0,05; **p<0,01 y ***p<0,001 con respecto al control. (E) Fotos representativas de la inmunohistoquímica de TAp63 en cortes histológicos de pacientes sin NAFLD (n=11), NAFLD (n=23) y con NASH (n=19) pacientes. Resultados 145 Además, realizamos un estudio matemático para comprobar el grado de asociación entre p63 y los componentes del llamado NAFLD activity score (NAS) que abarcan el grado de esteatosis, la inflamación lobular y el ballooning. Encontramos que existe una fuerte y significativa asociación entre las muestras TAp63α positivas (considerando positivo al menos 5 núcleos de hepatocitos marcados con TAp63α) con el grado de esteatosis y el NAS score (Tabla 28). Chi Cuadrado P Odds Ratio (95% IC) NAS 5.7651 0.0163 1.5367 (1.0527; 2.2433) Esteatosis 4.8200 0.0281 1.9128 (1.0473; 3.4935) Inflamación 2.3527 0.1251 2.1669 (0.7719; 6.0831) Balooning 1.3474 0.2457 1.5406 (0.7430; 3.1943) Fibrosis 0.9782 0.3226 1.5602 (0.6424; 3.7893) Variable Obese patients with NAFLD (n = 35) Controls (n =11) P Age (years) 43.7 (11.4) 50.4 (17.5) 0.140 Female:male ratio 29:9 7:4 0.451 Hypertension (n) 15 (39.5) 2 (18.2) 0.287 Diabetes mellitus (n) 8 (21.1) 0 (0) 0.172 BMI (kg/m2) 49.2 (6.9) 27.2 (4.24) < 0.001* Fasting blood sugar (mg/dL) 104.2 (34.4) 93.67 (14.3) 0.376 AST (IU/L) 24.8 (13.4) 21.0 (3.8) 0.137 ALT (IU/L) 30.8 (17.6) 28.4 (12.6) 0.703 Bilirubin (mg/dL) 0.43 (0.2) 0.49 (0.27) 0.383 Total cholesterol (mg/dL) 199.1 (33.6) 207.0 (37.3) 0.563 Triglycerides (mg/dL) 129.9 (50.0) 97.6 (38.3) 0.096 LDL-cholesterol (mg/dL) 118.7 (35.6) 124.8 (36.0) 0.668 HDL-cholesterol (mg/dL) 49.0 (13.2) 62.7 (18.5) 0.020* NAS score 4.9 (1.5) 0 < 0.001* Steatosis 2.1 (0.9) 0 < 0.001* Lobular inflammation 1.6 (0.8) 0 < 0.001* Hepatocyte ballooning 1.4 (0.6) 0 < 0.001* Tabla 30. Relación logística entre TAp63 y los parámetros que contribuyen al NAS score. Tabla 31. Datos obtenidos de los pacientes de la cohorte procedente del Hospital de Salamanca para el estudio del a expresión de p63 en el ARNm. Las variables se representan como la media y desviación estándar y se comparan las medias mediante test T de Student o con un test 2. BEGOÑA PORTEIRO COUTO 146 NÚMERO DE PACIENTES N= 39 GÉNERO (FEMENIMO/MASCULINO) 21/18 EDAD (AÑOS) 45  11 NAS SCORE 1-3 (N) 22 MEDIA 2.4  1.0 NAS SCORE  4 17 MEDIA 4.5  1.0 Tabla 30. Datos obtenidos de los pacientes de la cohorte procedente del Hospital de Santander para el estudio inmunohistoquímico de p63. La puntuacón histológica se realizó de acuerdo a los criterios del NASH Clinical Research Network (NASH CRN) DISCUSIÓN Discusión 149 DISCUSIÓN Uno de los objetivos principales de esta tesis es el estudio de p53 en el metabolismo. Una característica esencial de las células tumorales es el cambio metabólico que sufren debido a las elevadas demandas energéticas debido al aumento de la proliferación celular. Por lo tanto, p53 desempeñará un papel importante en el desplazamiento metabólico de las células cancerosas, lo que sugiere una función fundamental en la regulación del metabolismo celular. De ahí que en los últimos años, se hayan acumulado una gran cantidad de datos acerca de p53 y su papel fundamental en el metabolismo, pero, como hemos mencionado a lo largo de la tesis, los resultados son controvertidos237-240,274,279-281. Comenzamos realizando el fenotipado metabólico de los ratones p53 KO con el fin de estudiar cuáles de los principales tejidos metabólicos se encontraban afectados por su deficiencia. Muchos estudios demostraron que p53 ejerce un papel importante en la homeostasis energética195. Nuestros datos muestran que los ratones deficientes para p53 de forma global alimentados con dieta alta en grasa ganan menos peso y masa grasa antes de que desarrollen cualquier síntoma de presencia tumoral. Estas características se pueden explicar por el mayor gasto energético y el aumento de la actividad termogénica del BAT, consistente con obsesrvaciones anteriores282. Existen estudios que demuestran que los ratones deficientes ganan más peso en comparación con los controles WT con niveles más bajos de la proteína UCP1 en BAT283. Sin embargo, otro estudio mostró que estos ratones eran resistentes a obesidad inducida por dieta y tenían niveles de UCP1 más elevados tanto en WAT como en BAT282. Nuestros resultados están de acuerdo con este último estudio. Todos estos cambios son independientes de la ingesta de alimentos, de la tasa respiratoria o de la actividad locomotora. Nuestros hallazgos sugieren que el fenotipo de estos ratones es consecuencia de la energía disipada para generar calor en el BAT. Se ha descrito que p53 se activa en los principales tejidos metabólicos, como el WAT o el hígado, en condiciones de obesidad inducida por dieta o genética224,237 y que la falta de p53 en el WAT produce alteraciones en la sensibilidad a insulina236,284. Un estudio realizado por Yahagi et al. demuestra que p53 se encuentra activado en los adipocitos de ratones ob/ob, dando lugar a una regulación negativa de genes lipogénicos224. Existe, por tanto, un mecanismo de prevención de ganacia de adiposidad en animales ya obesos que conlleva una retroalimentación negativa entre p53 y la lipogénesis en el WAT. Esto encaja con nuestros resultados mostrando que la falta de p53 en ratones obesos da lugar a un incremento de enzimas lipogénicos y de oxidación en WAT. Estos resultados junto con el hecho de que estos ratones ganen menos grasa que sus controles, nos lleva a estudiar qué otros mecanismos puden estar involucrados en la acción lipogénica de p53. Dada la relación entre adiposidad y p53, nos pareció importante estudiar el papel de p53 en señales endocrinas implicadas en el desarrollo de adiposidad. Existen numerosos estudios donde se observa que la manipulación genética y farmacológica de la ghrelina afecta al peso y composición corporal. La administración central de la ghrelina incrementa la adiposidad y ganancia de peso66-68. De forma consistente con esto, otros estudios basados en manipulaciones genéticas en ratones, indican que la falta de ghrelina285 o su receptor286 hacen que acumulen BEGOÑA PORTEIRO COUTO 150 menos grasa que sus controles cuando son alimentados con dieta alta en grasa. Aunque la acción adipogénica de esta hormona peptídica es indudable, las rutas metabólicas por las que favorece la deposición lipídica siguen siendo, en parte, desconocidas. Los datos obtenidos a lo largo de esta tesis demuestran que p53 es crucial en la acción adipogénica de la ghrelina. Estos resultados parecen indicar que, la falta de p53 impide el almacenaje de los lípidos en el tejido adiposo y en el hígado. La mayor parte de los efectos de la ghrelina se producen a través del receptor GHS-R1a (growth hormone secretagogue receptor, GHSR)64, ampliamente expresado en el sistema nervioso central y tejidos periféricos287,288. Aunque este receptor controla tanto los efectos adipogénicos como orexigénicos de la hormona, los mecanismos a través de los cuales ejerce su función son totalmente diferentes. Prueba de ello son los ratones con obesidad inducida por dieta, donde el efecto hiperfágico de la ghrelina desaparece73,289 conservando el efecto adipogénico289. Bajo nuestras condiciones experimentales, donde la ghrelina inyectada de forma crónica incrementa el peso corporal y la adiposidad en ratones p53 WT, no se producen alteraciones en la ingesta. A nivel hipotalámico, la activación del receptor de la ghrelina (GHS-R1) en el hipotálamo provoca respuestas celulares que activan a SIRT1269,290, la cual deacetila p53; estos cambios provocan la fosforilación de AMPK y aumento de la síntesis de novo de ácidos grasos, con una activación simultánea de la oxidación de los ácidos grasos291. Debido a dichas modificaciones moleculares, se producen cambios en UCP2 y especies reactivas de oxígeno292, incremento de la expresión de los factores Bsx293, FoxO1 y pCREB24. La activación de estos factores de transcripción conduce en ultima instancia a la activación de la transcripción de los neuropéptidos orexigénicos NPY y AgRP294. En nuestros ratones, la inyección de ghrelina periférica provocó en el hipotálamo la disminución de los niveles de la proteía lipogénica FAS, diana que se encuentra más abajo en la ruta de señalización de p53 y AMPK291,295 . A nivel periférico, los estudios que abordan los mecanismos moleculares por los cuales la ghrelina controla el metabolismo de los adipocitos, son escasos. Existen estudios in vitro donde se ha observado un incremento de la expresión del gen PPAR2 tras la estimulación con ghrelina en un cultivo primario de adipocitos diferenciados mientras que en preadipocitos, la ghrelina estimula la actividad de glycerol-3-fosfato69. Estudios in vivo demostraron que la ghrelina es capaz de promover la deposición de lípidos en el WAT y en el hígado mediante el incremento de la expresión de enzimas clave relacionads con el metabolismo de los ácidos grasos: SCD1, ACC y FAS. Sin embargo, los mecanismos moleculares que ocurren después de la activación del GHS-R1, pero antes del cambio en las enzimas involucradas en el metabolismo lipídico permanecen aun sin esclarecerse. En recientes estudios sobre el papel de la ghrelina en la regulación del metabolismo perfiérico, se ha demostrado que sus isoformas ghrelin acilado y UAG inhiben la lipólisis de los depósitos grasos tanto subcutáneo como visceral296. Es importante resaltar que los ratones WT y deficientes en p53 alimentados con dieta estándar no mostraron diferencias en peso corporal, ingesta o composición corporal. Sin embargo, tienen niveles elevados de enzimas implicadas en el metabolismo lipídico en el tejido adiposo (SREBP1 y LPL) y en el hígado (ACC y FAS) asi como elevados niveles de TG hepáticos. Discusión 151 Curiosamente, encontramos que en los ratones deficientes en p53, la ghrelina no es capaz de estimular los genes responsables de dos funciones diferentes en el WAT: por un lado, genes involucrados en la captación y deposición (SREBP1c, FAS y LPL) y, por otro lado, aquellos que promueven la diferenciacción (PPAR y CEBP). A pesar de que el aumento de la ganancia de peso y de masa grasa en los ratones WT tratados con ghrelina no es estadísticamente significativo tras realizar un ANOVA de dos vías; es probable que con una mayor duración del tratamiento sí llegase a serlo. En este contexto, nuestros hallazgos indican entonces, que los cambios bioquímicos encontrados en el WAT y en el hígado se producen antes que los cambios de peso corporal y ganacia de masa grasa. Otra cuestión importante a abordar fue si estas acciones de la ghrelina en tejidos periféricos estaban mediados a través de acciones de p53 en el cerebro. Nuestros hallazgos apoyan la hipotesis de que estas acciones podrían estar moduladas por p53 a nivel central ya que los resultados in vitro realizados en explantes de tejido adiposo incubados durante un periodo de tiempo largo con ghrelina, no mostraron ninguna alteración en la expresión de genes lipogénicos. A pesar de las numerosas evidencias previas del papel de p53 en el control de la adipogénesis284,297. En resumen, con estos experimentos, demostramos que p53 es esencial para la acción crónica de la ghrelina en el WAT y en el hígado (Figura 30) ya que regula la acción adipogénica y lipogénica de genes que, en último caso, llevan a un incremento de peso corporal. Figura 30. Representación esquemática de la acción adipogénica de la ghrelina en ratones p53 WT y KO. Ratones KO p53 Tratamiento Ghrelina ip Ratones WT p53 BEGOÑA PORTEIRO COUTO 152 Como hemos mencionado a lo largo de la tesis, existe una gran cantidad de estudios sobre el papel de p53 en el metabolismo hepático. Dada la ambiguedad de la literatura actual y que p53 se expresa en todas las células y tejidos metabólicamente activos, realizamos estudios de ganancia y pérdida de su función, específicamente en el hígado para evitar posibles contribuciones/compensaciones de p53 por parte de otros tejidos. Encontramos niveles elevados de grasa hepática en ratones deficientes para p53 a pesar del hecho de que ganan menos peso que los ratones control alimentados con dieta alta en grasa. Teóricamente este hecho podría explicarse en base a que las grasas no almacenadas en el WAT van al hígado y/o por un efecto dpenediente de p53 hepática. Nuestros datos de cambios similares tras silenciamiento global de p53 y su sileciamniento especifico a nivel hepático apoyan la segunda hipótesis sin que ello descarte un papel de p53 extrahepático (e.g a nivel central) en la regulación del WAT. Los mecanismos moleculares que llevan a dicha acumulación hepática de lípidos incluyen la activación del estrés de RE y rutas metabólicas que favorecen el depósito lipídico. De forma más específica, nuestros datos demostraron una elevada lipogénesis de novo hepática, con niveles elevados de la enzima FAS en el hígado de ratones totalmente deficientes para p53 o bien en ratones donde se ha silenciado previamente la expresión de p53. Con respecto estrés del RE, característica del hígado de ratones obesos298, encontramos sobre-expresados varios marcadores característicos de la UPR en el hígado de ratones deficientes en p53 de forma global y específica. Comprobamos el papel específico de p53 en la atenuación de la esteatosis y estrés del RE inducido por dieta alta en grasa, recuperando los niveles de p53 en hígado de ratones KO. En la misma dirección que nuestros resultados, estudios anteriores también demostraron que la reducción global de p53 provoca hepatoesteatosis bajo condiciones de ayuno240, pero no se han identificado los mecanismos específicos que participan en este hecho. Teniendo todo esto en cuenta, los resultados sugieren que p53 ejerce una profunda influencia en el metabolismo hepático, ya que su pérdida lleva a marcados daños en el hígado. Además, estos efectos hepáticos son claramente independientes del estado nutricional ya que los ratones se alimentaron ad libitum. Ambos experimentos sugieren que la falta de p53 empeora la homeostasis lipídica en el hígado. Por eso, decidimos evaluar más a fondo la implicación de la vía de señalización más allá de p53, para descubrir posibles dianas farmacológicas. Los niveles hepáticos de dianas posteriores a p53, como bax o p66shc, relacionadas con el metabolismo lipídico239,276 no se encuentran alterados en nuestros experimentos. Sin embargo, los niveles hepáticos de p63 se encuentran aumentados en los modelos en los que la ausencia de p53 es total o parcial; y lo que es más importante, la disminución hepática de p63 atenua el estrés de RE y la deposición de lípidos asociados a la falta de p53. Esta interacción entre p63 y p53 es fuerte y puede complementar/antagonizar cada una de las demás funciones a nivel celular226. El silenciamiento hepático de p63 fue también suficiente para mejorar la esteatosis, y el estrés del RE. De acuerdo con estos resultados procedentes de experimentos de pérdida de función, la sobreexpresión de p63 en el hígado incrementa los niveles de expresión de marcadores de estrés de RE, estimula la deposición de lípidos e induce esteatosis, confirmando que p63 es el mediador de los efectos asociados a la pérdida de la función de p53. Discusión 153 Distintos estudios demostraron interacciones opuestas entre p53 y p63 dependiendo del tejido y estado celular. Por ejemplo, la apoptosis dependiente de p53 en respuesta a daños en el ADN requiere p63 y p73 en el desarrollo del cerebro de ratón y fibroblastos embrionarios299. Sin embargo, en modelos murinos p63 (y p73) no contribuyen a la acción supresora tumoral de p53 en el desarrollo del linfoma300. Estudios más recientes han demostrado que p63 puede mostrar una actividad supresora de tumores similar o totalmente indpendiente de p53301. Otro aspecto importante de nuestro estudio fue descifrar qué isoforma de p63 es la responsable de los cambios en el metabolismo hepático de lípidos. Nuestros estudios indican que TAp63 es la única isoforma inversamente regulada por p53 y positivamente regulada por dieta alta en grasa, mientras que otras isoformas de TAp63 y Np63 no parecen estar reguladas por p53 o HFD. En la misma línea, nuestros estudios in vitro también sugieren que TAp63 pero no Np63 es la responsable del incremento de lípidos en THLE2. En general, nuestros datos indican que TAp63 es la isoforma que controla el metabolismo lipídico en el hígado. En este sentido, ratones con una deficiencia global de TAp63, son obesos, desarrollan esteatosis hepática y resistencia a insulina230,302. Sin embargo, los ratones heterocigotos para p63 muestran una perdida de peso303 y la razón por la cual esto ocurre no ha sido investigada. La discordancia entre nuestros resultados, que indican que TAp63 provoca esteatosis hepática, y los estudios anteriores en ratones a los que les falta TAp63, sugieren que el resultado de la desregulación de TA63 es tejido-específica y que la falta global de TAp63 enmascara el papel de TAp63 en el hígado. Para profundizar aún más en el papel de p53/p63 en el metabolismo hepático, estudiamos las rutas moleculares que controlan las acciones hepáticas de p63. La sobreexpresión de p63 induce el estrés de RE mientras que su inhibición lo reduce. La importancia del estrés de RE como mediador de la función hepática de p63 se demostró por el hecho de que la inhibición farmacológica (TUDCA) o genética (adenovirus que codifican para GRP78) del estrés de RE reduce (bloquea) la acción esteatótica de TAp63. El estrés del RE involucra a IKKβ como diana transcripcional ya que el silenciamiento de IKKβ fue suficiente para bloquear el efecto de acumulación lipídica y expresión genética inducida por TAp63 en hepatocitos. Aunque esta asociación ya se había demostrado anteriormente304, estudios previos mostraron diferentes resultados en relación a la asociación entre p63 e IKK. Por ejemplo, en un estudio donde investigan el desarrollo epidérmico, observaron que p63 actua previamente a IKK, sin estudiar los efectos en IKKβ232. Hasta donde sabemos, ningún estudio ha examinado la posibilidad de que otros mienbros de la familia IKK puedan ser modulados por p63. El hecho de que nuestros resultados indiquen que TAp63 incrementa los niveles de IKKβ fosforilado no es sorprendente, si tenemos en cuenta que IKK forma parte de un complejo de quinasas con IKKβ e IKK, lo que sugiere que cualquiera de esas quinasas podría estar modulada por p63. Por otro lado IKKβ, pero no IKK, inhibe a TAp63225, una observación inesperada ya que IKKβ también puede fosforilar y estabilizar TAp63 233. Dada la complejidad de la biología de p63, la bibliografía disponible y nuestros resultados, especulamos con la hipótesis de que IKK y p63 pueden influenciarse recíprocamente dependiendo del estado de la célula. En esta línea, ya se ha descrito una regulación similar en el caso de p53 y AMPK305. En cualquier caso, este es el primer estudio que indica que la sobreexpresión de TAp63 conduce a la fosforilación de IKKβ para provocar una alteración en la función del estrés de RE que resulta en una activación de la UPR. Así, la fosforilación de IKKβ incrementa los niveles