Variabilidad molecular de marcadores genéticos de inflamación en el riesgo a desarrollar cáncer de próstata (PCa). Estudio genético-epidemiológico

TESIS DE DOCTORADO VARIABILIDAD MOLECULAR DE MARCADORES GENÉTICOS DE INFLAMACIÓN EN EL RIESGO A DESARROLLAR CÁNCER DE PRÓSTATA (PCA). ESTUDIO GENÉTICO-EPIDEMIOLÓGICO. Nerea Aguín Losada ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIODIVERSIDAD Y CONSERVACIÓN DEL MEDIO NATURAL SANTIAGO DE COMPOSTELA 2019 DECLARACIÓN DE LA AUTORA DE LA TESIS Variabilidad molecular de marcadores genéticos de inflamación en el riesgo a desarrollar cáncer de próstata (PCa). Estudio genético-epidemiológico. Dña. Nerea Aguín Losada Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Santiago de Compostela, a 9 de octubre de 2019 Fdo. Nerea Aguín Losada AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR Y TUTOR DE LA TESIS Variabilidad molecular de marcadores genéticos de inflamación en el riesgo a desarrollar cáncer de próstata (PCa). Estudio genético-epidemiológico. D. Javier Rodríguez Luis D. José Luis Blázquez Caeiro INFORMAN: Que la presente tesis, corresponde con el trabajo realizado por D/Dña. Nerea Aguín Losada, bajo nuestra supervisión, y a utorizamos su presentación, considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que no incurre en las causas de abstención establecidas en Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, a 9 de octubre de 2019 Director: Javier Rodríguez Luis Tutor: José Luis Blázquez Caeiro CONFLICTO DE INTERÉS Variabilidad molecular de marcadores genéticos de inflamación en el riesgo a desarrollar cáncer de próstata (PCa). Estudio genético-epidemiológico. Dña. Nerea Aguín Losada Declara que no existe ningún conflicto de interés en relación a esta Tesis Doctoral. En Santiago de Compostela, a 9 de octubre de 2019. Fdo. Nerea Aguín Losada Las muestras biológicas de origen humano utilizadas en esta tesis doctoral, así como los datos que componen la base de datos analizada, son anónimas, sin datos de carácter personal, por lo que no es necesaria la evaluación del comité ético. i ÍNDICE. RESUMEN…………………………………………………………………………………… v RESUMO………………………………………………………… .…..…………….………. v ABSTRACT………………………………………………..…………..………….…………. vi ABREVIATURAS Y SIGLAS…………………………………………………………….. vii 1. INTRODUCCIÓN 1.1. La próstata: consideraciones generales………………………………………………………… 1 1.1.1. ESTRUCTURA ANATÓMICA Y DESCRIPCIÓN HISTOLÓGICA……………………………….. 1 1.1.2. SIGNIFICADO FUNCIONAL DE LA PRÓSTATA…………………………….………………... 4 1.1.3. ALTERACIONES PATOLÓGICAS DE LA PRÓSTATA………………………………………… 5 1.2. El proceso inflamatorio………………………………………………………………………… 8 1.2.1. INFLAMACIÓN Y CÁNCER………………………………………………………………... 10 1.2.2. INFLAMACIÓN Y CÁNCER DE PRÓSTATA………………………………………………… 11 1.2.3. INFLAMACIÓN, DAÑO CELULAR Y REPARACIÓN……………………………………….... 12 1.3. El cáncer de próstata (PCa)…………………………………………………………………… 14 1.3.1. CARCINOGÉNESIS………………………………………………………………………... 14 1.3.2. CARCINOGÉNESIS PROSTÁTICA………………………………………………………….. 16 1.3.3. ESTRATEGIAS DE DIAGNÓSTICO DE PCA………………………………………………... 17 1.3.4. CLASIFICACIÓN DEL CÁNCER DE PRÓSTATA…………………………………………….. 19 1.3.5. EPIDEMIOLOGÍA DEL CÁNCER DE PRÓSTATA………………………..…………………... 21 1.3.6. FACTORES DE RIESGO…………………………………………………………………… 25 1.3.6.1. Edad………………………………………………………………………………... 25 1.3.6.2. Origen geográfico y grupos poblacionales………………………………………… 25 1.3.6.3. Dieta……………………………………………………………………………….. 26 1.3.6.4. Índice de masa corporal (IMC)……………………………………………………. 27 1.3.6.5. Tabaquismo………………………………………………………………………... 27 1.3.6.6. Estrés oxidativo……………………………………………………………………. 28 1.3.6.7. Vasectomía………………………………………………………………………… 28 1.3.6.8. Exposiciones ambientales………………………………………………………….. 28 1.3.6.9. Historia familiar……………………………………………………………………. 28 1.3.6.10. Hormonas y quimioprevención………………………………………………….... 29 1.3.6.11. Infección e inflamación de la próstata……………………………………………. 29 1.3.6.12. Variación genética.…………………………………..…………………………… 30 1.4. Marcadores genético moleculares…………………………………………………………….. 30 1.4.1. CITOQUINAS……………………………………………………………………………... 31 1.4.1.1. Familia Interleuquina 1…………………………………………………………….. 33 1.4.1.1.1. Interleuquina 1…………………………………………..……………………. 35 A. Interleuquina 1 alfa (IL-1α)………………………………………………………. 38 B. Interleuquina 1 beta (IL-1β)………………………………………………………. 42 1.4.1.1.2. Interleuquina 18 (IL-18)……………………………………………………… 47 1.4.1.2. Interleuquina 6 (IL-6)……………………………………………………………… 51 1.4.1.3. Interleuquina 10 (IL-10)…………………………………………………………… 58 ii 1.4.1.4. Interleuquina 17A (IL-17A)………………………………………………………... 63 1.4.1.5. MIF………………………………………………………………………………… 70 1.4.1.6. TNF alfa (TNF-α)………………………………………………………………….. 76 1.4.2. PROTEÍNAS DE REPARACIÓN DE ADN……………………………………………………. 82 1.4.2.1. XRCC1……………………………………………………………………………... 82 1.4.2.2. ERCC4……………………………………………………………………………... 86 1.5. Objetivos……………………………………………………………………………………… 90 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Muestra de estudio…………………………………………………………………………….. 93 2.1.1. PERIODO Y ÁREA DE ESTUDIO……………………………………………………………. 94 2.1.2. CRITERIOS DE INCLUSIÓN………………………………………………………………... 94 2.1.3. CRITERIOS BIOÉTICOS……………………………………………………………………. 95 2.2. Recogida de las muestras……………………………………………………………………… 95 2.2.1. MUESTRA BIOLÓGICA……………………………………………………………………. 95 2.2.2. CUESTIONARIOS…………………………………………………………………………. 95 2.3. Selección de marcadores genético moleculares………………………………………………. 96 2.4. Extracción de ADN y genotipado…………………………………………………………….. 97 2.4.1. EXTRACCIÓN DE ADN…………………………………………………………………... 97 2.4.1.1. Protocolo para extracción de ADN a partir de sangre total mediante FenolCloroformo-Isoamílico……………………………………………………………………... 98 2.4.1.2. Protocolo kit JetQuick para la purificación de ADN a partir de sangre venosa total………………………………………………………………………………………..... 99 2.4.1.3. Protocolo kit MasterPure para la purificación de ADN a partir de sangre venosa total………………………………………………………………………………………... 100 2.4.2. AMPLIFICACIÓN Y GENOTIPADO………………………………………………………... 101 2.5. Análisis estadístico………………………………………………………………………….. 108 2.5.1. ANÁLISIS DEL POLIMORFISMO EN LAS MUESTRAS DE CASOS Y CONTROLES…………... 108 2.5.1.1. Cálculo de frecuencias……………………………………………………………. 108 2.5.1.2. Análisis del equilibrio Hardy-Weinberg………………………………………….. 109 2.5.1.3. Índice de heterocigosidad esperado………………………………………………. 110 2.5.1.4. Estadístico ts………………………………………………………………………. 111 2.5.2. ANÁLISIS DE PSA………………………………………………………………………. 111 2.5.3. CÁLCULO DE RIESGO…………………………………………………………………… 112 2.5.3.1. Odds Ratio……………………………………………………………………….... 113 2.5.3.2. Cálculo de la significación estadística……………………………………………. 113 2.5.3.2.1. Intervalos de Confianza (95%)…………………………………………….... 114 2.5.3.2.2. Test χ2………………………………………………………………………... 114 2.5.3.3. Ajuste de los Odds Ratio…………………………………………………………. 115 2.5.4. MODELOS GENÉTICOS………………………………………………………………….. 115 2.5.4.1. Modelo dominante-recesivo…………………………………………………… 115 2.5.4.2. Modelo sobredominante………………………………………………………. 116 2.5.4.3. Modelo codominante………………………………………………………….. 116 2.5.4.4. Modelo alélico……………………………………………………………….... 116 2.5.5. ESTRATIFICACIÓN POR VARIABLES…………………………………………………….. 117 2.5.5.1. Variables analizadas…………………………………………………………….... 117 iii 2.5.5.1.1. Edad…………………………………………………………………………. 117 2.5.5.1.2. Índice de Masa Corporal (IMC)……………………………………………... 117 2.5.5.1.3. Tabaquismo………………………………………………………………….. 118 2.5.5.2. Análisis de estratificación……………………………………………………….... 119 2.5.6. ANÁLISIS DE MARCADORES COMBINADOS…………………..…………………………. 120 3. RESULTADOS 3.1. Análisis de PSA…………………………………………………………………………….... 123 3.1.1. ANÁLISIS PSA/IL-1α…………………………………………………………………….. 124 3.1.2. ANÁLISIS PSA/IL-1β…………………………………………………………………….. 126 3.1.3. ANÁLISIS PSA/IL-18…………………………………………………………………….. 127 3.1.4. ANÁLISIS PSA/IL-6………………………………………………………………............ 128 3.1.5. ANÁLISIS PSA/IL-10…………………………………………………………………….. 129 3.1.6. ANÁLISIS PSA/IL-17A…………………………………………………………………… 131 3.1.7. ANÁLISIS PSA/MIF………………………………………………………………............ 132 3.1.8. ANÁLISIS PSA/TNF-α……………………………………………………………............. 134 3.2. Análisis de asociación marcadores/PCa……………………………………………………… 135 3.2.1. INTERLEUQUINA 1α – rs3783553………………………………………………………. 135 3.2.2. INTERLEUQUINA 1β – rs16944…………………………………………………………. 138 3.2.3. INTERLEUQUINA 18 – rs187238………………………………….…………………….. 141 3.2.4. INTERLEUQUINA 6 – rs1800795………………………………………………………... 144 3.2.5. INTERLEUQUINA 10 – rs1800896………………………………………………………. 148 3.2.6. INTERLEUQUINA 17A – rs2275913…………………………………………………….. 152 3.2.7. MIF - rs2070767………………………………………………………………………... 155 3.2.8. TNF-α – rs1799964……………………………………………………………………. 159 3.2.9. XRCC1 – rs25487…………………………………………………………………….... 163 3.2.10. ERCC4 – rs744154……………………………….…………………………………… 166 3.2.11. ANÁLISIS DE RIESGO DE COMBINACIONES GENOTÍPICAS DE MARCADORES INFLAMATORIOS………………………..................................................................................... 171 4. DISCUSIÓN 4.1. Análisis de PSA…………………………………………………………………………….... 175 4.2. Análisis de asociación marcadores/PCa……………………………………………………… 177 4.2.1. INTERLEUQUINA 1α – rs3783553………………………………………………………. 177 4.2.2. INTERLEUQUINA 1β – rs16944…………………………………………………………. 180 4.2.3. INTERLEUQUINA 18 – rs187238………………………………………………………… 182 4.2.4. INTERLEUQUINA 6 – rs1800795………………………………………………………… 185 4.2.5. INTERLEUQUINA 10 – rs1800896………………………………………………………. 188 4.2.6. INTERLEUQUINA 17A – rs2275913…………………………………………………….. 191 4.2.7. MIF - rs2070767……………………………………………………………………….. 194 4.2.8. TNF-α – rs1799964…………………………………………………………………….. 196 4.2.9. XRCC1 – rs25487…………………………………………………………………….... 198 4.2.10. ERCC4 – rs744154…………………………………………………………………… 201 4.2.11. COMBINACIONES GENOTÍPICAS DE LOS MARCADORES INFLAMATORIOS…………….. 202 4.3. Discusión general……………………………………………………………………………. 204 iv 5. CONCLUSIONES……………………………………………………………………… 211 6. REFERENCIAS………………………………………………………………………... 217 7. ANEXOS 7.1. Anexo 1……………………………………………………………………………………… xvii 7.2. Anexo 2……………………………………………………………………………………. xxxix ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………... xliii ÍNDICE DE TABLAS…………………………………………………………………… xlvii v RESUMEN. El cáncer de próstata (PCa) es el más diagnosticado en España y, al igual que otros tipos de cáncer, su aparición está asociada a múltiples factores, entre los que destaca la inflamación y sus efectos sobre la integridad del ADN. Los procesos inflamatorios son muy complejos y su desarrollo depende de la actividad de una gran cantidad de genes. Por lo tanto, el riesgo de sufrir PCa se va a ver afectado por factores genéticos. Además, existen otro tipo de factores no genéticos entre los que se incluyen edad, tabaquismo e índice de masa corporal (IMC). En este trabajo se ha analizado, en una muestra de casos y controles de la población gallega, la posible asociación entre 10 marcadores genético moleculares localizados en genes implicados en rutas inflamatorias y también en mecanismos de reparación de ADN con el desarrollo de PCa. Además, se llevó a cabo un análisis estratificado en función de la edad, el IMC y el consumo tabáquico, con el que se buscaba poner de manifiesto la existencia de un efecto diferencial del genotipo sobre el desarrollo del PCa en grupos concretos de la población. Los resultados del análisis de la muestra a nivel global no permiten detectar, excepto en un caso, una asociación significativa entre el riesgo de desarrollar PCa y los polimorfismos genéticos individuales. Sin embargo, el estudio desvela que, en ciertos grupos de la muestra determinados por las variables de edad, tabaquismo e IMC, los genotipos de muchos de los marcadores genético moleculares analizados tienen un efecto significativo sobre la aparición de la enfermedad, aumentando o reduciendo el riesgo a desarrollarla. Asimismo, se realizó un análisis de marcadores genéticos pareados que permitió desvelar efectos de riesgo y protección, para ciertos polimorfismos genéticos, que no fueron detectados en el análisis general ni, incluso, en el estratificado. Palabras clave: cáncer de próstata, marcador genético molecular, polimorfismo, inflamación, estudio caso-control, Galicia. RESUMO. O cancro de próstata (PCa) é o máis diagnosticado en España e, do mesmo xeito que outros tipos de tumores, a súa aparición está asociada a múltiples factores, entre os que destaca a inflamación e os seus efectos sobre a integridade do ADN. Os procesos inflamatorios son moi complexos e o seu desenvolvemento depende da actividade dunha gran cantidade de xenes. Polo tanto, o risco de sufrir cancro de próstata vaise a ver afectado por factores xenéticos. Ademais, existen outro tipo de factores non xenéticos entre os que se inclúen idade, tabaquismo e índice de masa corporal (IMC). Neste traballo analizouse, nunha mostra de casos e controis da poboación galega, a posible asociación entre 10 marcadores xenético moleculares, localizados en xenes implicados en rutas inflamatorias e tamén en mecanismos de reparación de ADN, co desenvolvemento de cancro de próstata. Ademais, levouse a cabo unha análise estratificada en función da idade, o índice de masa corporal e o tabaquismo, co que se buscaba pór de manifesto a existencia dun efecto diferencial do xenotipo sobre o desenvolvemento do PCa en grupos concretos da poboación. Os resultados da análise da mostra a nivel global non permiten detectar, agás nun caso, unha asociación significativa entre o risco de desenvolver cancro de próstata e os polimorfismos xenéticos vi individuais. Con todo, o estudo desvela que, en certos grupos da mostra determinados polas variables de idade, tabaquismo e IMC, os xenotipos de moitos dos marcadores xenéticos moleculares analizados teñen un efecto significativo sobre a aparición da enfermidade, aumentando ou reducindo o risco a desenvolvela. Así mesmo, realizouse unha análise de marcadores xenéticos pareados que permitiu desvelar efectos de risco e protección, para certos polimorfismos xenéticos, que non foron detectados na análise xeral nin, incluso, na estratificada. Palabras chave: cancro de próstata, marcador xenético molecular, polimorfismo, inflamación, estudo caso-control, Galicia. ABSTRACT. Prostate cancer (PCa) is the most diagnosed malignant tumour in Spain and, like others types of cancer, its development is associated with multiple factors, among which stands out the inflammation and its effects on the integrity of DNA. Inflammatory pathways are very complex and its development depends on the activity of a large number of genes. Therefore, the risk of developing PCa it is affected for genetic factors. Furthermore, there are other kind of non-genetic factors including age, smoking and body mass index (BMI). In this thesis work the possible association between 10 molecular genetic markers and the risk of developing PCa has been analysed, in a case-control study of a sample of Galician population. These polymorphisms are located in genes which are related with inflammatory pathways and DNA reparation mechanisms. Additionally, a stratified analysis based on age, smoking and BMI was carried out. The aim of that analysis was to reveal the existence of a differential effect of the genotype on the development of PCa in specific groups of the population. The results of the global analysis of the sample do not allow us to detect, except in one case, a significant association between the risk of developing PCa and individual genetic polymorphisms. However, this study unveils that, in some groups of the sample determined by age, smoking and BMI, the genotypes of many of the molecular genetic markers analysed have a significant effect on the occurrence of the pathology, increasing or reducing the risk to develop it. Likewise, an analysis of paired genetic markers was carried out, which revealed risk and protection effects for certain genetic polymorphisms. These significant association had not been previously detected in the general or in the stratified analysis. Key words: prostate cancer, molecular genetic marker, polymorphism, inflammation, case-control study, Galicia. vii ABREVIATURAS Y SIGLAS. ºC: Grados centígrados. 3’UTR: 3’ untranslated region; Región 3’ no traducida. 5’UTR: 5’ untranslated region: Región 5’ no traducida. α (en análisis estadístico): Nivel de significación estadística. µl: Microlitro. Ac: Anticuerpo. Act1: An NF-κB-activating protein. ADNc (cDNA): ADN complementario. ADT: Terapia de deprivación androgénica. AFS: Estroma fibromuscular anterior de la próstata. Ag: Antígeno. AGF: Atipia glandular focal. AINEs: Antiinflamatorios no esteroideos. AJCC: American Joint Committee on Cancer. AK: Actinic Keratosis. AKT (PKB): Protein Kinase B. ANG: Angiogenina. AP-1: Activator protein 1. APRIL: A proliferation-inducing ligand. APUD: Amine precursor uptake and decarboxylation. ARNm: ARN mensajero. ASF: Alternative splicing factor 1. ASK 1: Signal regulating kinase. ATF: Activating Transcription Factor. BAD: Bcl-2 antagonist of cell death. BATF: Basic Leucine zipper Transcription Factor, ATF-like. BAX: Bcl-2-like protein 4. viii BCC: Basal cell carcinoma. BCL: B-cell lymphoma. BER: Base scission repair. bFGF: Basic Fibroblast Growth Factor. BP: Binding protein. BRCA1, 2: Breast cancer 1, 2. C/EBP: CCAAT-enhancer-binding protein. C-BAD: Dominio de Activación C/EBP-β. C-FLIP: Celullar FLICE Inhibitory Protein. cAMP: Cyclic adenosine monophosphate. CARD: N-terminal caspase recruitment domain. Casp-1: Caspasa 1. CCL: CC Chemokine Ligand. CCR7: CC Chemokine Receptor type 7. CD4+: Cluster of cuadruple differentiation. CD40L: CD40 ligand. CeGen: Centro Nacional de Genotipado. Células Th1: Células o linfocitos T colaboradores tipo 1. cIAP-1: Cellular inhibitor of apoptosis protein-1. CLC: Cardiotrophin Like Cytokine. CNTF: Ciliary Neurotrophic Factor. CNV: Copy Number Variation. COX-2: Ciclooxigenasa tipo 2. CRPB: Cellular Retinol Binding Protein. CSF2: Colony Stimulating Factor 2. CT-1: Cardiotrophin-1. CTC: Células tumorales circulantes. CTL: Cytotoxic T Lymphocyte = cytotoxic T cell = CD8+ T-cell CXCL1, 2, 6… : chemokine (C-X-C motif) ligand 1, 2, 6... CXCR3, 4… : CXC chemokine receptor 3, 4, etc. CZ: Zona central de la próstata. ix DAMP: Danger Associated Molecular Patterns. DC: Células dendríticas. DDT: D-dopacromo-tautomerasa. Del: Deleción. DHT: Dihidrotestosterona. dNMP: Desoxinucleótido monofosfato. dNTP: Desoxirribonucleótido trifosfato. DSB: Double Strand Break. EGF: Epidermal Growth Factor. Epo: Erithropoietin. ERK: Extracellular signal-regulated kinases. f: Frecuencia absoluta. fr: Frecuencia relativa. FADD: Fas-associated death domain. FasL: Fas ligand. FcγR: Fc gamma Receptor. FNIII: Fibronectin type III. FOXP3: Forkhead box P3. g: Fuerza g (9,81 m/s2) G-CSF: Granulocyte colony-stimulating factor. g.l.: Grados de libertad. GM-CSF: Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. GP: Glucoprotein. GSTP1: Glutathione S-transferase P. h: Índice de heterocigosidad esperada. 𝒉 : Índice de heterocigosidad esperada insesgada. H4TF-1: Histone 4 Transcription Factor 1. HBOC: Síndrome de cáncer hereditario de mama y ovario. HBP: Hiperplasia Benigna de Próstata. HIF-1: Hipoxia inducible factor 1. HLA: Human Leukocyte Antigen. 1. INTRODUCCIÓN. 1 1.1. La próstata: Consideraciones generales. 1.1.1. ESTRUCTURA ANATÓMICA Y DESCRIPCIÓN HISTOLÓGICA. La próstata es la glándula sexual accesoria más grande del sistema genital masculino. Forma parte de los órganos genitales internos pese a que por su posición y relaciones está asociada a los órganos urinarios (Fig. 1). Está situada por debajo de la vejiga urinaria, detrás de la sínfisis del pubis, delante del recto, por encima de la membrana perineal y del espacio perineal profundo. Rodea al origen de la uretra masculina y está atravesada por los conductos eyaculadores. Mide alrededor de 3,5 cm en su base y aproximadamente 2,5 cm, tanto en su dimensión vertical como anteroposterior, y su peso normal es de unos 18 gramos. Es un órgano rudimentario durante la infancia que se desarrolla en la pubertad, manteniéndose firme y elástica hasta los 50 años, a partir de los cuales sufre una involución fibrosa, pudiendo ser el foco de neoformaciones tanto benignas como malignas, entre las que se encuentra el cáncer de próstata (PCa) (Álvarez, 2005; Latarjet, Liard, & Pró, 2004; Ross & Pawlina, 2013). Figura 1. Sistema genital y urinario masculino. Fuente Instituto Nacional del Cáncer (“Más que salud,” 2018; Winslow, 2005). La próstata está envuelta por una cápsula fibrosa que emite prolongaciones hacia el interior del órgano. Su base o cara superior tiene una forma aproximadamente triangular, con la porción más ancha hacia atrás. La porción de la uretra prostática se encuentra más cerca del vértice anterior que del posterior. La base de la próstata está dividida, mediante una cresta transversal formada por lobulillos supero-mediales, en una región anterior correspondiente al cuello de la vejiga urinaria y una región posterior o hilio que aloja la formación de los conductos eyaculadores y los elementos vasculares. El hilio de la próstata está limitado por una banda de tejido glandular, correspondiente a los lobulillos ínfero-posteriores. El vértice de la próstata se sitúa en la parte inferior, por donde emerge la uretra (Álvarez, 2005; Latarjet et al., 2004). 2 La próstata está compuesta en un 70% de elementos glandulares, que ocupan aproximadamente las dos terceras partes del tejido contenido dentro de la cápsula prostática. El 30% restante es el denominado estroma fibromuscular, consistente en colágeno y músculo liso. Los elementos glandulares están formados por 30-50 glándulas túbulo-alveolares dispuestas en tres capas concéntricas: una capa mucosa interna, una capa submucosa intermedia y una capa periférica que contiene las glándulas prostáticas principales. Las glándulas de la capa mucosa secretan directamente hacia la uretra; las glándulas de las otras dos capas poseen conductos que desembocan en los senos prostáticos ubicados a cada lado de la cresta uretral en la pared posterior de la uretra (Álvarez, 2005; Latarjet et al., 2004; Ross & Pawlina, 2013). La próstata es un órgano difícil de sistematizar, por lo que a lo largo de los años se ha ido clasificando de diferentes formas en función de diversos enfoques: morfológico, anatómico, histológico, funcional, clínico, etc. Tradicionalmente, se describieron cinco lóbulos prostáticos. El lóbulo anterior situado delante de la uretra, es fibromuscular y prácticamente carece de tejido glandular. Se corresponde con el istmo o comisura de la próstata. El lóbulo posterior está ubicado detrás de la uretra y por debajo de los conductos eyaculadores. Es un lóbulo más largo que se va estrechando hacia la parte inferior. Los lóbulos laterales derecho e izquierdo, situados a ambos lados de la uretra, constituyen la mayor parte de la próstata. Las dos caras inferolaterales, oblicuas hacia abajo y medialmente en sentido vertical y de medial a lateral en sentido anteroposterior, están relacionadas con la fascia pelviana y con el músculo elevador del ano. Ambos lóbulos laterales están divididos por una ligera depresión denominada escotadura prostática. El lóbulo medio se halla entre la uretra y los conductos eyaculadores y tiene estrecha relación con el cuello de la vejiga (Álvarez, 2005). La Terminología Anatómica Internacional sistematiza las porciones de la próstata basándose en la aplicación de técnicas macroscópicas de disección (Tisell & Salander, 1984), combinándolas con los distintos tipos histológicos. El parénquima prostático se divide, mediante un plano sagital, en dos lóbulos prostáticos, derecho e izquierdo, compuestos por lobulillos glandulares y por el istmo de la próstata. Cada lóbulo prostático se subdivide en cuatro lobulillos de tejido glandular (Álvarez, 2005): - Lobulillo inferoposterior, ubicado periféricamente, forma la cara posterior y se extiende hasta el vértice de la próstata. - Lobulillo inferolateral, de posición periférica y que constituye la mayor parte de la cara inferolateral de la próstata. - Lobulillo superomedial, de situación central, por detrás de la uretra y rodeando el conducto eyaculador; se encuentra en la mitad superior de la próstata. - Lobulillo anteromedial, ubicado centralmente, lateral y un poco anterior con respecto a la uretra. - Los lobulillos inferoposteriores e inferolaterales (periféricos), unidos por delante por el istmo, forman un cono hueco, en cuyo interior se ubican los lobulillos superomediales y anteromediales (centrales). Por otra parte, el estudio ecográfico y su correlación con la histología, la aparición de patologías, así como su origen embriológico han permitido la descripción de cuatro zonas prostáticas glandulares denominadas Zonas de McNeal (Fig. 2), así como el estroma fibromuscular anterior (Álvarez, 2005; Ross & Pawlina, 2013). 3 1. Zona de transición (TZ): rodea la uretra prostática, constituye el 5% del tejido glandular prostático y contiene las glándulas mucosas. Es en esta zona en la que se produce hiperplasia (aumento anormal del tamaño de un órgano) y formación de masas nodulares de células epiteliales con la edad. Por su posición dichos nódulos pueden comprimir la uretra causando dificultad miccional. 2. Zona central (CZ): esta área rodea los conductos eyaculadores conforme atraviesan la próstata, contiene alrededor del 25% del tejido glandular y es resistente tanto a los carcinomas como a la inflamación. Las células de esta zona poseen características morfológicas distintivas, con citoplasma apenas basófilo y núcleos más grandes desplazados a diferentes alturas en las células contiguas. Esta zona se origina embriológicamente en la inclusión de células del conducto mesonéfrico de la próstata en desarrollo. 3. Zona periférica (PZ): constituye el 70% del tejido glandular de la próstata, rodea la zona central y ocupa la parte posterior y las porciones laterales de la glándula. La mayor parte de los carcinomas prostáticos se originan en esta zona. Es la más susceptible a la inflamación y palpable en el tacto rectal. 4. Zona periuretral (PuZ): contiene glándulas mucosas y submucosas. En las etapas avanzadas de la hiperplasia esta zona puede sufrir una proliferación patológica, sobre todo de los componentes del estroma. 5. Estroma fibromuscular anterior (AFS): El estroma fibromuscular anterior está compuesto por tejido conjuntivo denso no modelado con una gran cantidad de fibras musculares lisas, y se encuentra en la superficie anterior de la próstata, por delante de la uretra. Rodea y envuelve la región del ápex y de la base prostática. Carece de glándulas y no sufre ningún proceso patológico. Figura 2. Zonas de McNeal. SV (Vesícula Seminal), B (Vejiga), U (Uretra), CZ (Zona Central), TZ (Zona de Transición), AFS (Estroma fibromuscular anterior), PZ (Zona Periférica), PuZ (Zona Periuretral). Fuente Association, 2003; B. Kim & Kim, 2013. 4 En cuanto a la organización celular de la próstata hay cuatro tipos celulares principales que forman la región glandular de la misma (Álvarez, 2005): - Células epiteliales: Están bien diferenciadas y contienen abundantes gránulos secretores ricos en PSA (antígeno prostático específico) y fosfatasa ácida, entre otros componentes. Se unen lateralmente con otras células mediante moléculas de adhesión celular y se fijan a la membrana basal a través de integrinas. Tienen el núcleo en la base y microvellosidades en el borde apical, rico en gránulos y enzimas para la secreción de productos que se drenan a través de los ductos que se conectan con la uretra. - Células basales y células madre: Son más pequeñas y están en menor cantidad que las células epiteliales. Su forma es redondeada, con grandes núcleos y prácticamente sin productos de secreción. Las células basales en la membrana basal pueden identificarse mediante anticuerpos monoclonales (anticitoqueratinas). Se cree que dan origen a las células epiteliales secretoras, de modo que funcionan como células madre. - Células neuroendocrinas: Están entre las células epiteliales de los ductos y acinos del tejido, dispersas entre el epitelio secretor. Pertenecen al grupo de células APUD (Amine Precursor Uptake and Decarboxylation) y su función en la próstata es regular la actividad secretora y el crecimiento celular mediante la secreción de aminas (serotonina) y péptidos hormonales. - Acinos: Se localizan en las regiones central y periférica de la próstata. Poseen un rico plexo de nervios autónomos y fibras nerviosas. Producen un péptido intestinal vasoactivo. El estroma mielostático está formado por tejido conectivo, con fibras musculares que se entrelazan con el tejido glandular, permitiendo la secreción de los productos prostáticos (semen). Al igual que sucede con otros órganos semejantes, la próstata está cubierta de tejido conectivo denominado cápsula prostática. 1.1.2. SIGNIFICADO FUNCIONAL DE LA PRÓSTATA. La función principal de la próstata consiste en secretar el líquido seminal, que optimiza las condiciones para la fertilización del semen y que constituye la mayor parte del volumen del eyaculado. Es un líquido ligeramente alcalino, con efecto tamponador, que aumenta la motilidad y supervivencia de los espermatozoides. La próstata produce secreciones que protegen al tracto urinario inferior y al sistema reproductor de las lesiones causadas por agentes patógenos en la uretra. Además, junto con las glándulas de Cowper, es el origen de los factores de licuefacción del semen (Álvarez, 2005; Latarjet et al., 2004; Ross & Pawlina, 2013). Es uno de los principales órganos diana para la testosterona, ya que es en la próstata donde esta hormona masculina se transforma en dihidrotestosterona (DHT), una hormona más activa. Ambas hormonas son dos de los principales esteroides sexuales del hombre (andrógenos) junto con la androstenediona. Los andrógenos, incluida la testosterona, se producen esencialmente en los testículos, concretamente en las células de Leydig, desde donde la testosterona difunde por la membrana y actúa sin canales específicos sobre el receptor androgénico a través de su metabolito activo, la dihidrotestosterona. Participan en varios procesos biológicos, entre los que se encuentran el desarrollo normal del pene, escroto, testículos, glándulas sexuales accesorias y la aparición de las características sexuales secundarias en la pubertad. El eje hipotálamohipófisis-gónadas regula la síntesis y secreción de los andrógenos que pueden alcanzar los 5 órganos diana en forma libre o unidos a la SHBG. Los efectos biológicos de ambos andrógenos son mediados a través del receptor de andrógenos (RA), al que se unen en el citoplasma para alcanzar el núcleo celular y allí encajar en secuencias específicas de ADN de los órganos diana (Durán et al., 2011; Uribe-Arcila, 2005). Gracias al mecanismo de acción del receptor androgénico en la próstata, es posible regular la expresión de varios genes, produciéndose la síntesis de proteínas implicadas en la estimulación del desarrollo y el mantenimiento funcional y estructural de este órgano. Por lo tanto, las funciones de la próstata están reguladas por la interacción entre los receptores androgénicos y los andrógenos que viajan por el torrente sanguíneo (Durán et al., 2011; UribeArcila, 2005). Las células epiteliales de los ductos y el acino de la próstata producen el antígeno prostático específico (PSA, prostate specific antigen), proteína de 30 kDa perteneciente a la familia de las kalicreínas, utilizada como marcador bioquímico para la detección precoz y el control de pacientes con cáncer de próstata. El PSA es secretado al lumen prostático, donde se adhiere a las semenogelina I y II en el coágulo seminal, mediando en la fluidez del semen. La finalidad del PSA es licuar el semen eyaculado y así permitir la movilización de los espermatozoides (Balk, Ko, & Bubley, 2003; National Cancer Institute, 2019a; Ormachea-Salcedo, SánchezEnríquez, Callisaya-Huahuamullo, & Salcedo-Ortiz, 2011). 1.1.3. ALTERACIONES PATOLÓGICAS DE LA PRÓSTATA. La próstata es un órgano heterogéneo en el que se desarrollan múltiples patologías, siendo las más frecuentes la prostatitis, la hiperplasia benigna de próstata (HBP) y el cáncer de próstata (PCa). El término prostatitis define los procesos de naturaleza inflamatoria o infecciosa que afectan a la glándula prostática (Fig. 3). Se consideran, al igual que en el caso de la hiperplasia benigna de próstata, procesos benignos. Es una patología muy común en los hombres, que en el caso de la prostatitis aguda suele relacionarse con infecciones bacterianas y puede producirse en hombres de cualquier edad. La sintomatología de este tipo de prostatitis consiste en infección urinaria, inflamación prostática y bacteriemia (presencia de bacterias en el torrente sanguíneo). El tratamiento es generalmente exitoso y se basa en la administración precoz de antibióticos, AINES y abundantes líquidos. En cuanto a la prostatitis crónica se caracteriza por ser una infección prostática repetida a lo largo del tiempo. Sus síntomas son semejantes a los de la prostatitis aguda pero no tan severos, llegando a ser asintomática en algunos casos. El tratamiento es complicado ya que no siempre se encuentra el origen bacteriano concreto de la infección. Sin embargo, las prostatitis más comunes son las no bacterianas, frecuentemente crónicas, que también afectan a varones de cualquier edad. Su etiología, así como los síntomas no son tan claros como en los casos anteriores (Rodríguez-López, Baluja-Conde, & BermúdezVelásquez, 2007). 6 Figura 3. Efecto de la prostatitis (Pedrosa, 2019). La Hiperplasia Benigna de Próstata (HBP) se define como el crecimiento no maligno en el tamaño de la próstata debido a un aumento excesivo de glándulas y estroma. Se produce en los hombres a medida que aumenta la edad, debido al aumento relativo de los estrógenos con respecto a la testosterona, siendo una de las enfermedades más frecuentes en hombres adultos de avanzada edad. La primera fase de desarrollo conlleva un aumento en el número de nódulos, primero estromales y después glandulares. Posteriormente se produce crecimiento extremo de dichos nódulos, que a su vez implica un incremento de la resistencia uretral, que compensatoriamente lleva a un incremento progresivo de la presión del músculo detrusor (músculo liso que forma parte de la pared de la vejiga urinaria). Esto a su vez produce cambios a nivel celular en dicho músculo, caracterizados por el aumento de tamaño de los espacios intercelulares, patrones de hipertrofia muscular y el aumento de los depósitos de fibrina intercelular. La consecuencia habitual es una disminución de la calidad de la contracción muscular del detrusor. A medida que crece la próstata ésta puede ir comprimiendo progresivamente la uretra hasta provocar, entre otros efectos, dificultad en la micción. Otras consecuencias de la HBP son las retenciones de orina en la vejiga, el reflujo de la orina hacia los riñones y la necesidad frecuente de miccionar. El sistema urinario puede llegar a bloquearse completamente. Todos estos síntomas podrían confundirse en origen con el cáncer de próstata y, para evitar dicha confusión, se establece un diagnóstico diferencial consistente en la cuantificación de PSA, ecografía prostática y tacto rectal y, por último, biopsia (De Marzo et al., 2007; Rodríguez-López et al., 2007). La inflamación crónica causa alteraciones, como metilación del ADN, que pueden conducir al cáncer de próstata. Existen dos estados considerados premalignos desarrollados a partir de daño celular acumulativo y secuencial producido por los mismos factores que desembocan en el carcinoma prostático. Estos dos estados son la Atrofia Proliferativa Inflamatoria (PIA) y la Neoplasia Intraepitelial Prostática (PIN) (Fig. 4). Si los factores nocivos se perpetúan en el tiempo y se agregan otros nuevos el resultado es el desarrollo de un carcinoma prostático histológicamente constituido (Uribe-Arcila, 2005). La Atrofia Proliferativa Inflamatoria (PIA) agrupa la mayoría de lesiones atróficas que implican un incremento de la fracción de células epiteliales que proliferan en lesiones atróficas puntuales. Estas lesiones no se relacionan con el descenso de andrógenos y se presentan como focos aislados de glándulas atróficas rodeadas por glándulas de apariencia normal en la zona epitelial. Estas zonas atróficas aparecen debido a fallos en la diferenciación de células epiteliales a columnares secretoras, especialmente en la periferia. Así, el epitelio no forma proyecciones papilares abundantes y las células luminales tienen escaso citoplasma y núcleo 7 central pequeño, redondeado a ovoide con nucléolo no evidente o levemente agrandado. Sin embargo, la membrana basal y la línea de células basales se mantienen íntegras. Muchas de las células proliferativas en la PIA se encuentran en el compartimento luminal, lo que produce cambios en la fidelidad topográfica de la proliferación, tal y como ocurre en la PIN. Las lesiones con infiltración de inflamación tanto crónica como aguda se asocian con la atrofia epitelial puntual (Benedetti-Padrón & Reyes, 2014; De Marzo et al., 2007; Uribe-Arcila, 2005). Pacientes con HBP presentan epitelio aparentemente atrófico que podría ser considerado PIA. En estudios morfológicos se han observado transiciones entre epitelio atrófico y carcinoma, además de frecuentes transiciones entre áreas de PIA y atrofia proliferativa con alto grado de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) (Fig. 4) (Benedetti-Padrón & Reyes, 2014; De Marzo et al., 2007). Figura 4. Evolución de las patologías prostáticas. Fuente Benedetti-Padrón & Reyes, 2014. La Neoplasia Intraepitelial Prostática (PIN) es una lesión caracterizada por células con rasgos neoplásicos (atipia nuclear, desorganización de la arquitectura celular sin afectar a la membrana basal) y se considera la precursora más probable para la mayoría de los adenocarcinomas de próstata. Se localiza en los ductos y acinos del epitelio glandular prostático, que presentan cambios citológicos anticipatorios del cáncer. Se da, al igual que el cáncer, predominantemente en la zona periférica de la próstata. Presenta una membrana basal y una línea de células basales adelgazada pero íntegra. Sin embargo, hasta un 2% de los focos de PIN pueden mostrar alteración de la capa de células basales y disrupción de la membrana basal, siendo ambos cambios histológicos previos al cáncer. Además, la PIN tiene otras características que la asemejan al adenocarcinoma, ya que es multifocal, presenta aumento de alteraciones nucleares, se dan variaciones en el contenido del ADN y se incrementa la inestabilidad genética. Esta patología puede ser de bajo o alto grado, siendo la segunda la que se relaciona de forma más inmediata con el desarrollo de cáncer de próstata. La PIN precede al adenocarcinoma en unos 5 años y aumenta unas 15 veces el riesgo para el paciente de padecer en el futuro cáncer de próstata. El diagnóstico de PIN de alto grado implica entre un 30-50% de probabilidad de padecer cáncer de próstata (De Marzo et al., 2007; Uribe-Arcila, 2005). 14 1.3. El Cáncer de Próstata (PCa). 1.3.1. CARCINOGÉNESIS. El cáncer es un término genérico utilizado para agrupar las enfermedades en las que las células se dividen anormalmente, sin control y evitan la muerte celular. Cuando las células normales envejecen o se dañan, mueren y células nuevas las reemplazan. Sin embargo, en el cáncer este proceso se descontrola y a medida que las células se hacen más anormales, las células viejas o dañadas sobreviven en vez de morir y células nuevas se forman sin ser necesarias. Estas células adicionales pueden dividirse sin interrupción y formar masas denominadas tumores, que pueden ser benignos o malignos. Los tumores malignos son los denominados como cáncer y sus células pueden extenderse a los tejidos cercanos, además de difundirse a otras partes del cuerpo a través de los sistemas sanguíneo y linfático. Pueden empezar en casi cualquier zona del cuerpo, recibiendo nombres específicos, de modo que el carcinoma es un cáncer que empieza en el epitelio, el adenocarcinoma empieza específicamente en el epitelio glandular, el sarcoma empieza en hueso, cartílago, músculo u otros tejidos conectivos o de apoyo, la leucemia empieza en tejidos productores de sangre, etc. (GarcíaFoncillas, 2003; National Cancer Institute, 2019a). El cáncer se considera como una enfermedad multifactorial debida a la interacción de genes y factores ambientales, de tal modo que variaciones genéticas en dichos genes pueden tener un papel patológico o protector en la aparición del cáncer. En el desarrollo de los tumores pueden estar implicados genes de distinta naturaleza, por ejemplo, reguladores del ciclo celular, del desgaste telomérico o de la senescencia celular (DeVita, Hellman, & Rosenberg, 2005; Guttmacher & Collins, 2002; Uribe-Arcila, 2005). Hay una serie de características que definen al cáncer (Sanz-Ortiz, 2006): - Es una enfermedad genética estructural o funcional, para cuyo desarrollo son necesarias varias lesiones genéticas que pueden darse en tres tipos de genes: supresores, reparadores y proto-oncogenes. - Tiene un origen clonal. - Produce alteración en la proliferación y diferenciación celular que conduce a un crecimiento autónomo incontrolado. - Posee capacidad de invasión local, así como distante (metástasis). - El resultado final es la autodestrucción (muerte del huésped). - Su frecuencia es heterogénea en función del tejido, siendo más frecuente en tejidos epiteliales de recambio rápido. Hay tres tipos principales de genes implicados en el desarrollo del cáncer: los protooncogenes, cuya alteración se vincula con el desarrollo del cáncer mediante una mutación de ganancia de función que genera potencial oncogénico; los genes supresores de tumores cuyas mutaciones implican pérdida de función y los genes encargados de mantener la estabilidad genómica. Los genes supresores de tumores, también llamados anti-oncogenes, oncogenes 15 recesivos o genes de susceptibilidad al cáncer tienen como función inhibir la proliferación de células cancerosas. Las mutaciones que dan lugar a oncogenes tienden a ser dominantes mientras que las mutaciones en genes supresores de tumores son normalmente recesivas. Esto ha llevado a desarrollar el modelo de dos eventos (two-hit) de la carcinogénesis, propuesta por Knudson en 1993 (Fig. 8). El escenario que plantea este modelo es el siguiente: los individuos normales al nacer portan dos alelos salvajes en los loci supresores de tumores. Con el tiempo aparecen mutaciones espontaneas en esos loci que producen un alelo no funcional. Se espera que la mutación sea recesiva respecto al alelo salvaje que todavía está presente, con lo que no habría consecuencias fenotípicas. Más adelante, eventos adicionales pueden llevar a la pérdida del alelo salvaje, fenómeno que recibe el nombre de pérdida de heterocigosidad (loss of heterozygosity, LOH). La pérdida de la heterocigosidad proporciona una contribución tangible al fenotipo maligno. Sin embargo, dado que las mutaciones espontáneas en un locus específico y la pérdida de un segundo alelo específico son eventos raros, la malignidad no suele desarrollarse hasta pasado un largo periodo de latencia. Por otra parte, algunos individuos nacen con una mutación inicial, con lo que solamente sería necesaria la segunda mutación para que se dé el fenotipo cancerígeno. De esta manera, al producirse la pérdida de un alelo el peso del funcionamiento normal recaería sobre el otro alelo que, al tener la primera mutación hereditaria, no podría llevar a cabo de forma adecuada la función del gen (DeVita et al., 2005; GarcíaFoncillas, 2003). Figura 8. Hipótesis de Knudson para genes supresores de tumores. Basada en “ResearchGate | Find and share research,” n.d. Los genes supresores y los reparadores de ADN se agrupan, según algunos autores, en una misma categoría llamada “genes supresores de tumores”, que a su vez se divide en los gatekeepers, que englobaría los genes supresores de tumores tradicionales, inhibidores de la proliferación celular y promotores de la apoptosis; y los caretakers, genes que al mutar promueven el crecimiento del tumor de forma indirecta, causando inestabilidad genética y aumentando la tasa de mutación en otros genes. Estas nuevas categorías de agrupación se diferencian según el número de mutaciones necesarias para el desarrollo de un tumor, de modo que, tras la mutación heredada de un gatekeeper sólo se necesita una segunda mutación somática para que el tumor se inicie. En cambio, tras la mutación heredada de un caretaker es necesario que se produzcan varias mutaciones somáticas sucesivas (García-Foncillas, 2003). 16 Para que se desarrolle el cáncer deben activarse proto-oncogenes y/o inactivarse los genes supresores de tumores. Estos eventos producen inestabilidad genética que a su vez propiciarán el desarrollo de un ambiente beneficioso para el desarrollo del tumor, en el que se suceden las mutaciones que dan lugar a un grupo de células con tendencia a la necrosis, al pleomorfismo y pleiotropismo. Además, las células tumorales tienen tendencia a la metilación de ADN que implica un daño genómico asociado. Por lo tanto, los tumores generalmente se caracterizan por activación o inactivación de genes específicos que acumulan inestabilidad y variabilidad genética, proliferación celular rápida con tendencia a la inmortalización, capacidad de angiogénesis y capacidad de metástasis (Uribe-Arcila, 2005). 1.3.2. CARCINOGÉNESIS PROSTÁTICA. Entre el 90 y el 95% de los cánceres de próstata tienen origen epitelial glandular (adenocarcinomas), concretamente acinares, es decir, con origen en las células epiteliales glandulares de los acinos o los alveolos. Sin embargo, también se producen otros tipos de adenocarcinoma como son el ductal y el mucinoso, y en menor medida el carcinoma endometrioide, carcinoma neuroendocrino, carcinoma con células en anillo de sello, etc. (Alberts et al., 2016). De acuerdo a las variaciones histológicas, el desarrollo del cáncer de próstata podría dividirse en cinco fases, de las que posteriormente se extraerá el estadiaje de Gleason. En principio el tumor está formado por glándulas redondeadas, pequeñas, uniformes, con bordes bien definidos y estrechamente unidas entre sí (Fig. 9). A continuación, las glándulas se hacen más alargadas, su borde pierde definición y su relación es menos estrecha, con crecimiento del estroma. Posteriormente el tumor empieza a diferenciarse respecto a su forma y su tamaño. Las glándulas se oscurecen y aparecen células que proliferan rompiendo la membrana basal e infiltrando a los tejidos adyacentes. Con el tiempo las glándulas dejan de ser únicas y aisladas para formar grupos neoplásicos que invaden el tejido circundante. En esta fase las glándulas son grandes, irregulares y cribiformes. Finalmente, el tumor muestra epitelios cribiformes y papilares, sin diferenciación glandular y está compuesto por láminas, cordones, células aisladas o nidos tumorales sólidos con necrosis central. Este último grado describe un tumor poco diferenciado y anaplásico, es decir, el tumor prostático con peor pronóstico a partir de su descripción histológica. El desarrollo del tumor no se produce de forma homogénea, de modo que en un mismo caso se encontrará en el tejido prostático una mezcla de varios estadios de desarrollo y diferenciación (Gleason, 1992; Gleason et al., 2017; Humphrey, 2004). Figura 9. Cambios celulares en la progresión del PCa. Fuente Clinical Trials Arena, n.d. 17 Además de las variaciones a nivel tisular, también se producen cambios en la forma de las células. Núcleos poco redondeados, volumen nuclear variable, más de un nucléolo o elevada cantidad de heterocromatina se asocian con un tumor altamente desarrollado (Alberts et al., 2016). Durante la transformación maligna en la próstata, se da una vía aberrante de producción de los mismos factores de crecimiento que la próstata desarrolla en condiciones normales, predominantemente autocrinos y siempre favorables al desarrollo tumoral. Los mecanismos paracrinos del receptor androgénico son reemplazados por un mecanismo autocrino emergente, de modo que las células son cada vez menos dependientes de los factores celulares estromales. Las señales aberrantes provocan mutaciones de los factores de crecimiento, lo que a su vez produce pérdida de función, eliminación de señales inhibitorias del cáncer o activación de señales protumorigénicas. Todo ello está relacionado con el estado de malignidad del tumor, así como su agresividad fenotípica, es decir, producen cambios en la arquitectura del tejido y de su función (Uribe-Arcila, 2005). El PCa presenta una conducta evolutiva variable, con un tiempo de doblaje estimado de 24 ± 0,6 años en tumores localizados y de 1,8 ± 0,2 años en tumores diseminados. En pacientes con metástasis la supervivencia media estimada es de 30 meses. Cuando el PCa pasa de localizado a diseminado el pronóstico del paciente varía, ya que la invasión ganglionar es un factor de mal pronóstico, reduciendo la supervivencia del individuo. Sin embargo, no todas las invasiones ganglionares implican un mismo nivel de mortalidad, habiendo otros factores a considerar. En PCa en progresión, el aumento tumoral se da por reducción de muerte celular más que por un incremento de la división celular. 1.3.3. ESTRATEGIAS DE DIAGNÓSTICO DE PCA. Al igual que sucede en la mayoría de patologías, un diagnóstico temprano de cáncer de próstata mejora la eficacia de los tratamientos que puedan utilizarse y las posibilidades de curación del paciente. Sin embargo, el cáncer de próstata en sus estadios iniciales no muestra síntomas, por lo que la detección precoz generalmente se lleva a cabo mediante análisis rutinarios de la concentración de PSA en sangre y su progresión, así como mediante tacto rectal. En ambos casos son pruebas diagnósticas relativamente poco invasivas y que permiten la identificación del problema antes de manifestarse un cuadro sintomático evidente. En principio la presencia de síntomas se da en una fase avanzada del PCa, y éstos incluyen disuria (expulsión de orina dificultosa, dolorosa e incompleta), tenesmo vesical (deseo imperioso de orinar), polaquiuria (aumento de la frecuencia miccional), disuria y nicturia (aumento de la frecuencia miccional), retención de orina, pérdida de fuerza del chorro de la orina, goteo y hematuria terminal (sangre en la orina). En caso de que se llegue a dar metástasis, los síntomas iniciales más frecuentes son dolor lumbar, en la pelvis, los hombros o en diversas áreas óseas (DeVita et al., 2005; EEUU, 2019). El PSA está presente en diferentes formas, la mayoría en forma de PSA complejo (PSAc) unido a diferentes moléculas proteicas, y un pequeño porcentaje en estado libre, denominado PSAl y localizado en la sangre. Esta última forma generalmente es inactiva y es la que se cuantifica en la prueba del PSA. En dicha prueba se mide la concentración de PSA en sangre (ng/ml), es decir, su concentración sérica, y es el análisis más sensible utilizada para diagnosticar precozmente el cáncer de próstata cuando aún es asintomático. La transcripción del gen del PSA está regulada positivamente por el receptor androgénico. Su sobreexpresión en 18 pacientes con PCa refleja la elevada actividad transcripcional que se produce en la mayoría de cánceres prostáticos. La pérdida de la arquitectura glandular normal de la próstata en el PCa parece permitir al PSA incrementar su acceso directo a la circulación periférica. La prueba del PSA presenta considerables ventajas, dado que no es invasiva, sus efectos secundarios son nulos y su realización es rápida y de bajo coste. Sin embargo, también tiene ciertos puntos en contra, empezando por su baja sensibilidad, ya que en ciertos casos se dan resultados de PSA bajo en presencia de la enfermedad (falsos negativos). Además, también pueden darse falsos positivos, ya que este marcador no es indicativo únicamente del desarrollo tumoral en la próstata, sino también de prostatitis, hiperplasia, etc. (Balk et al., 2003; EEUU, 2019; Ormachea-Salcedo et al., 2011) Por lo tanto, la relativamente baja sensibilidad y especificidad de la prueba de PSA en sangre se debe a que, pese a que en próstatas sanas los valores de PSA aumentan únicamente debido a la eyaculación y la estimulación de la próstata, también pueden darse diferencias individuales en el nivel basal de PSA, así como un incremento asociado a la edad y no necesariamente vinculado a una patología. Por otra parte, en próstatas afectadas por ciertas enfermedades (prostatitis, HBP o PCa) suelen encontrarse valores de PSA en sangre considerablemente elevados, aunque esto no sucede en el total de los casos y dicho aumento puede deberse a ciertas cirugías mientras que un falso negativo pueda deberse a fármacos que reducen la concentración de PSA libre. Así, no es sencillo asociar un nivel de PSA a una de estas patologías concretas. Tampoco es indicativo del tipo de PCa, de modo que una prueba de PSA positiva puede llevar a realizar pruebas más invasivas que serían innecesarias en casos de cáncer de próstata de crecimiento lento. Por ello se la considera una prueba con poca especificidad, indicativa de un problema prostático, pero no necesariamente de un cáncer de próstata que deba ser tratado (Balk et al., 2003; Ormachea-Salcedo et al., 2011; Pita-Fernández & Pértegas-Díaz, 2003). No existe una concentración específica considerada normal de PSA en sangre, pero generalmente una concentración por debajo de 4 ng/ml se considera evidencia de una próstata sana, mientras que valores por encima de éste se consideran indicativos de una patología. La probabilidad de riesgo de cáncer de próstata se multiplica a partir de valores de PSA en sangre por encima de 10 ng/ml y a partir de ahí lo hará progresivamente (National Cancer Institute, 2019a; Ormachea-Salcedo et al., 2011; Pita-Fernández & Pértegas-Díaz, 2003). Por todo lo anterior, también se realizan otro tipo de pruebas como la del porcentaje del PSA libre, que indica la cantidad del PSA que circula libre comparado con el que está unido a proteínas. Dicha prueba permitiría, en principio, diferenciar entre HBP y PCa, ya que la relación entre ambos tipos de antígeno varía entre una enfermedad y otra. Además, en la actualidad se tienen en cuenta otras medidas como la velocidad de PSA, es decir, el ritmo al que varía la concentración de PSA en un hombre con el paso del tiempo. Esta medida se expresa en ng/ml por año y un rápido incremento sugiere la presencia de cáncer de próstata. Sin embargo, actualmente esta medida es más utilizada en el pronóstico que en el diagnóstico, ya que hay cierta controversia en su interpretación. Por último, una elevada densidad de PSA indicaría una alta probabilidad de tener PCa, pero esta prueba suele utilizarse en casos concretos como en el caso de próstatas de gran tamaño pero no cancerosas (American Cancer Society, 2019; Centers for Desease Control and Prevention, 2019; National Cancer Institute, 2019a). 19 El tacto rectal o examen digital del recto es una prueba llevada a cabo de forma rutinaria en varones a partir de 50 años. Mediante el palpado de la glándula prostática a través del recto se buscan nódulos, áreas de consistencia blanda o dura y otras anomalías. Esta prueba tiene ciertas limitaciones, entre las que se incluye la falta de detección en caso de que el tumor prostático se encuentre en el área de la próstata opuesta al tacto (National Cancer Institute, 2019a). En los casos en los que el tacto rectal es positivo y el PSA es elevado se realiza una ecografía prostática transrectal y la biopsia transrectal de próstata, llevándose así a cabo el llamado mapeo prostático. La biopsia es una prueba en la que se recoge tejido prostático que se analizará para comprobar si es tejido tumoral y, en caso afirmativo, su grado histológico de desarrollo. En la actualidad se lleva a cabo guiada por ultrasonido, mejorando su eficiencia y reduciendo sus complicaciones. Sin embargo, la biopsia no siempre da el resultado correcto, produciéndose casos de falsos negativos y la necesidad de repetición. Además, es una prueba que puede causar complicaciones como hematuria, hemospermia o sangrado rectal. Las distintas categorías posibles en el diagnóstico mediante biopsia son (Castellanos-Hernández, Velázquez-Macías, Cruz García-Villa, Navarro-Vargas, & Figueroa-Zarza, 2013; CastilloJimenez, Bendaña-Lainez, & Sabillón-Vallecillo, 2005): 1. NPM (negativo por malignidad): Tejido sin evidencia de neoplasia. Incluye hiperplasia glandular o estroma prostático, atrofia y prostatitis. 2. AGF (atipia glandular focal): La histología revela un foco muy pequeño y/o glándulas citológicamente atípicas, pero que no llega a reunir criterios para clasificarla dentro de los parámetros de neoplasia. 3. PIN (neoplasia intraepitelial prostática): Glándulas con neoplasia intraluminal que aún no muestran evidencia de invasión estromal. 4. Carcinoma prostático (PCa): Presencia histológica de neoplasia intraepitelial prostática. 1.3.4. CLASIFICACIÓN DEL CÁNCER DE PRÓSTATA. Incluso dentro del mismo tipo histológico de cáncer se dan, frecuentemente, subtipos diferenciables molecularmente. Estas diferencias suelen reflejar células de diferente origen y/o distinta lesión genética inicial. La clasificación temprana del tipo de cáncer es vital para la elección de tratamiento, así como para la orientación de pronóstico de la enfermedad. Clínicamente el PCa es una patología heterogénea, ya que hay pacientes cuyo tumor no varía con el paso de los años sin necesidad de tratamiento mientras que en otros casos la enfermedad progresa muy rápidamente. La clasificación histológica tradicional del PCa se lleva a cabo mediante la puntuación de Gleason (Gleason score) con una relativa utilidad predictiva (DeVita et al., 2005). Para calcular la puntuación de Gleason se calcula el grado de indiferenciación de los tejidos afectados por el tumor, seleccionando los dos grados mayoritarios. El primero sería el prevalente o primario, con valores entre 1 y 5, y el segundo sería el siguiente en prevalencia, con valores posibles entre 1 y 5. La suma de ambos dígitos da como resultado el grado de Gleason, de forma que un valor total de 7 resultado de 4+3 será peor que uno de 3+4. Los valores posibles oscilan entre 2 (tumores muy bien diferenciados) y 10 (muy poca diferenciación) (Gleason et al., 2017; Humphrey, 2004). Otro método de clasificación del grado de cáncer de próstata es la clasificación TNM (Tumor-Node-Metastasis), sistema establecido por la AJCC (American Joint Committee on Cancer) cuyos criterios son (American Joint Committee on Cancer, 2019; Jameson et al., 2005): 20 ➢ Tumor. ❖ Tx: No se puede evaluar el tumor primario. ❖ T0: No hay evidencias de tumor primario. ❖ T1: Tumor no evidente clínicamente i. T1a ii. T1b iii. T1c ❖ T2: Tumor confinado en la próstata i. T2a ii. T2b iii. T2c ❖ T3: Tumor que se extiende más allá de la cápsula prostática (T3a, T3b). ❖ T4: Tumor fijo o que invade estructuras adyacentes distintas de las vesículas seminales. ➢ Node (ganglios linfáticos regionales). ❖ Nx: No se pueden evaluar los ganglios linfáticos regionales. ❖ N0: No se demuestran metástasis ganglionares regionales. ❖ N1: Metástasis en ganglios linfáticos regionales. ➢ Metástasis (a distancia). ❖ Mx: No se pueden evaluar metástasis a distancia. ❖ M0: No hay metástasis a distancia. ❖ M1: Metástasis a distancia ❖ M1a: Ganglios linfáticos no regionales. ❖ M1b: Huesos. ❖ M1c: Otras localizaciones. Dependiendo del origen genético de la mutación también se puede clasificar el PCa en esporádico y hereditario. El cáncer esporádico, causado principalmente por factores ambientales, es mayoritario respecto al cáncer hereditario. En el cáncer de tipo esporádico las mutaciones genéticas vinculadas al cáncer se encuentran en las células del propio tumor, es decir, en aquellas células que han sufrido el proceso de transformación tumoral (GarcíaFoncillas, 2003). Pese a que la mayoría de los cánceres son de origen esporádico, entre el 5% y el 10% presentan un claro componente hereditario, es decir, se producen mutaciones en las células germinales que favorecen el desarrollo tumoral y que van a ser transmitidas de generación en generación. Dichas mutaciones, por tanto, están presentes en todas las células del organismo, incluido el tejido prostático. El cáncer hereditario suele implicar predisposición al desarrollo de tumores concretos, con mutaciones vinculadas al desarrollo tumoral presentes en todas las células del cuerpo. La susceptibilidad se manifiesta en distintos individuos de un grupo familiar a través de las generaciones según un patrón compatible con una segregación mendeliana. El cáncer hereditario suele aparecer a una edad más temprana que el esporádico, y el riesgo de desarrollarlo aumenta paralelamente con el grado de parentesco y el número de familiares que ya han padecido la enfermedad. Para que el PCa se considere hereditario debe cumplirse al 21 menos una de estas características: tres o más parientes en primer grado con cáncer de próstata; cáncer de próstata en tres generaciones de la misma rama de la familia; dos o más parientes cercanos, como un padre, un hermano, un hijo, un abuelo, un tío o un sobrino, de la misma rama de la familia a quienes se les haya diagnosticado cáncer de próstata antes de los 55 años. No hay que olvidar que la incidencia elevada de casos de cáncer en una familia no implica necesariamente una base genética, sino que pueden existir factores ambientales comunes a los miembros de dicha familia. Hay ciertos casos en los que, pese a afectar a varios miembros de una misma familia, no se conoce una base genética clara vinculada al cáncer. En estos casos parece haber una predisposición genética al desarrollo del tumor debida a un agente externo común. El cáncer de próstata familiar representa alrededor del 20% de los casos de PCa y se produce debido a una combinación de genes compartidos y factores ambientales o de estilos de vida compartidos (American Society of Clinical Oncology, 2019; de Oncología Médica, 2019; Ferrís-i-Tortajada, García-i-Castell, Berbel-Tornero, & Ortega-García, 2011; García-Foncillas, 2003). 1.3.5. EPIDEMIOLOGÍA DEL CÁNCER DE PRÓSTATA. La tasa de incidencia indica el número de hombres diagnosticados con cáncer cada año. Puede indicarse como un número absoluto o como el número de casos nuevos por cada 100.000 personas por año. En España, la información sobre la incidencia procede de los registros poblacionales consolidados que cumplen los indicadores de calidad fijados por la IARC (Agencia Internacional de Investigación y Cáncer), mientras que, la información sobre la incidencia de los registros mundiales se publica periódicamente en las monografías “Cancer Incidence in Five Continents” (World Health Organization, 2019a). Además, la IARC publica periódicamente estimaciones para países y grandes regiones geográficas incluidas en la base de datos GLOBOCAN (“ISCIII - Instituto de Salud Carlos III,” 2019; World Health Organization, 2019a, 2019b). En las últimas décadas el número de diagnósticos de cáncer se ha incrementado de forma constante en España debido al aumento poblacional, a las técnicas de detección precoz y a la mayor esperanza de vida (de Oncología Médica, 2017). Según los registros más recientes, en España la mayor incidencia por cáncer en hombres se da en el País Vasco y Gerona, con tasas superiores a los 500 casos por 100.000 personas-año, mientras que la menor incidencia se ha registrado en Granada, con 402 casos por 100.000 personas-año (López-Abente, Núñez, PérezGómez, Aragonés, & Pollán, 2015). En 2015 en España se diagnosticaron 247.771 nuevos casos de cáncer, de los cuales 148.827 eran varones. En ambos sexos los tipos de cáncer más frecuentemente diagnosticados en el 2015 fueron colorrectal (41.441 casos), próstata (33.370 casos), pulmón (28.347 casos), mama (27.747 casos) y vejiga (21.093 casos). Sin embargo, en varones el tumor más frecuentemente diagnosticado en España en el año 2015 fue el cáncer de próstata, seguido de colorrectal, pulmón, vejiga y estómago (de Oncología Médica, 2017). El cáncer de próstata es más común en varones de edad avanzada, con una historia familiar de PCa y en aquellos con ascendencia afroamericana (de Oncología Médica, 2019). Es el cáncer más frecuente en hombres a partir de los 60 años, mientras que entre 40-59 años el más frecuente es el cáncer de pulmón y en hombres más jóvenes el más frecuente es el de testículo. La incidencia de PCa presenta una distribución heterogénea en todo el mundo, tal y como se muestra en la gráfica de la figura 10. En España las zonas de mayor incidencia, como Girona y 22 País Vasco, presentan valores 1,67 veces superiores a las zonas de menor incidencia, como Granada. En el año 2012, se dio en España una tasa de incidencia de PCa ajustada a la población estándar europea ligeramente inferior a la media europea, con 103,4 frente a 110,8 casos por cada 100.000 habitantes/varones (“Asociación Española Contra el Cáncer: AECC,” 2019; López-Abente et al., 2015). Figura 10. Incidencia de PCa a nivel mundial. Fuente “IARC – International Agency for Research on Cancer,” n.d. La prevalencia es el número o proporción de la población con una enfermedad determinada durante un periodo de tiempo. Suele considerarse el número de pacientes diagnosticados que continúan vivos después de 3 o 5 años desde el diagnóstico. Así, la prevalencia está determinada por la supervivencia, de modo que los tumores con supervivencia menor tienen menor prevalencia, aunque se diagnostiquen más frecuentemente. En el año 2012 el tumor con mayor prevalencia en España fue el PCa, tanto en población general como únicamente en varones (de Oncología Médica, 2017). Según los datos recogidos por la IARC, en el 2012 la prevalencia a 5 años en España para el PCa era de 527,3 siendo Moldavia el país con menor prevalencia de Europa (96,9) para este tumor, seguida de Albania (99,7), mientras que el país de mayor prevalencia fue Suecia (1137,1) seguido de Noruega (1065,2). Otros países con elevada prevalencia de PCa fuera del continente europeo son Australia (872,9), Canadá (796,6), Estados Unidos (793,1), Israel (516,9) y Japón (424,4), tal y como se observa en la figura 11 (World Health Organization, 2019c). 23 Figura 11. Prevalencia de casos de PCa a 5 años en varones en 2012 a nivel mundial. Fuente “Global Cancer Observatory,” n.d.; “IARC – International Agency for Research on Cancer,” n.d. Se define como mortalidad el número de fallecimientos ocurridos en un periodo concreto de tiempo en una población determinada. Se expresa como el número de fallecimientos por año o por 100.000 personas por año. De acuerdo a los datos de la OMS, en el año 2012 se contabilizaron aproximadamente 8,2 millones de muertes relacionadas con tumores. El mayor número de fallecimientos se asocian con el cáncer de pulmón (1,59 millones de muertes), el cáncer de hígado (745.000 fallecimientos), el cáncer gástrico (723.000 fallecimientos), el colorrectal (694.000 muertes), el de mama (521.000 muertes) y el de esófago (400.000 muertes) (de Oncología Médica, 2017). En 2011 más de 70.000 hombres murieron por PCa en la Unión Europea, lo cual equivale al 1,5% del total de muertes por cualquier causa. Dependiendo de la región de Europa, la mortalidad por cáncer de próstata varía en una proporción de 1 a 3, ya que se observa un contraste entre regiones mediterráneas, con mortalidad por debajo del promedio, y el resto de países, donde hay importantes focos con mortalidad elevada. Se observa un patrón de la distribución de la mortalidad por PCa que refleja tasas generalmente altas en las regiones del noroeste europeo y tasas mucho más bajas en las regiones del sudeste (Books, 2015; de Oncología Médica, 2019). Los tumores son considerados, en la actualidad, como la causa de muerte más frecuente entre los varones en España, responsables de 65.014 fallecimientos en 2014. De acuerdo con los datos de la Red Española de Registros de Cáncer (“REDECAN - Red Española de Registros de Cáncer,” 2019), en el año 2015, una de cada tres muertes en varones y una de cada cinco en mujeres en España, se debieron a tumores malignos. De acuerdo con los datos del INE, la principal causa de muerte en los hospitales españoles fueron los tumores, pese a que entre los años 2003 y 2012, la mortalidad por tumores se redujo un 1,32% al año. Los datos de mortalidad, a pesar de la reducción en la incidencia, refleja las mejoras en la supervivencia de pacientes gracias a la implementación de medidas preventivas, las campañas de diagnóstico precoz y los avances terapéuticos. La supervivencia de los pacientes con cáncer en España es 30 1.3.6.12. Variación genética. El cáncer de próstata es una enfermedad genética ocasionada por acumulaciones de mutaciones cromosómicas, por lo que los factores genéticos relacionados con su desarrollo son el núcleo de múltiples estudios. Hay ciertas mutaciones genéticas heredadas que parecen aumentar el riesgo de cáncer de próstata, aunque se asocian únicamente a un pequeño porcentaje de casos. Un ejemplo de estas mutaciones hereditarias se da en los genes BRCA1, BRCA2, HPC1, HPCX o CAPB. Un caso concreto de asociación entre un factor genético y el cáncer de próstata es el Síndrome de cáncer hereditario de mama y de ovario (HBOC), asociado con mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2. Aunque normalmente se asocia con mayor riesgo de cáncer de mama y ovario en mujeres, en varones se ha comprobado que se da un aumento del riesgo a desarrollar cáncer de mama y de próstata. Otro ejemplo son los varones con Síndrome de Lynch, una afección causada por cambios genéticos hereditarios, cuyo riesgo de desarrollar varios tipos de cáncer se ve incrementado. Sin embargo, ninguno de estos ejemplos ha probado ser una causa específica o directa del desarrollo de PCa (American Cancer Society, 2019; American Society of Clinical Oncology, 2019). 1.4. Marcadores genético moleculares. A lo largo de los apartados anteriores se ha esbozado un panorama que refleja el vínculo entre inflamación y cáncer de próstata, de tal modo que la presencia y actividad de moléculas como las citoquinas promoverán o inhibirán los procesos inflamatorios y, por lo tanto, podrían afectar al desarrollo del cáncer de próstata. Así, las variaciones en la expresión de estas moléculas implicarían a su vez variaciones en su actividad y en el proceso inflamatorio como precursor del PCa. Estos cambios en la expresión vendrían asociados a variaciones en los genes codificantes de dichas moléculas, como es el caso de los cambios de un único nucleótido (SNP) en la región promotora de los genes. De la misma forma, debido al daño celular que implica el proceso inflamatorio, cambios semejantes en genes implicados en las principales rutas de reparación de ADN también podrían asociarse a alteraciones en el desarrollo del cáncer de próstata. Los marcadores o polimorfismos genético moleculares se definen como fragmentos de ADN o de una proteína cuya secuencia es variable y puede detectarse mediante técnicas moleculares. Para ser útiles deben tener un grado de variabilidad mínima, con al menos dos alelos y con frecuencias relativamente elevadas en humanos (Benito-Jiménez & Espino-Nuño, 2012; Solari, 2011). De hecho, en general solo se consideran polimórficos los loci que presentan al menos dos alelos con una frecuencia mayor o igual a 0,1. 31 Existen diferentes clasificaciones de los marcadores genético moleculares pero la más utilizada es la siguiente: 1. Marcadores genético moleculares clásicos. a. Grupos sanguíneos. b. Proteínas plasmáticas. c. Proteínas eritrocitarias y leucocitarias. 2. Marcadores de ADN. a. SNP (Single Nucleotide Polymorphisms). b. CNV (Copy Number Variation). i. STR (Short Tandem Repeat). ii. VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). c. TE (Transposable Elements). En la presente tesis doctoral se han analizado una serie de marcadores de ADN, definidos como loci genéticos cuya posición es conocida, es decir, se sabe a qué cromosoma corresponden y en qué región de este se hallan. Estos marcadores pueden estar localizados en regiones génicas, aunque aparecen más frecuentemente en secuencias no génicas. Por lo tanto, los marcadores moleculares de ADN son secuencias únicas y específicas del ADN, la mayoría no codificantes, sin función conocida y variables en la población humana (Solari, 2011). En nuestro caso concreto los marcadores de ADN utilizados son SNPs de tipo sustitución, excepto en el caso de un indel. Un SNP es un polimorfismo que afecta a un único nucleótido del genoma. Pueden ser polimorfismos de sustitución o indels (inserciones/deleciones) que afectan a uno o unos pocos nucleótidos. En la actualidad se estima que existen en el genoma humano más de 10 millones de este tipo de marcadores (Guttmacher & Collins, 2002; Sanz-Ortiz, 2006; Solari, 2011). Todos los marcadores analizados en este trabajo son polimórficos y bialélicos, esto es, presentan dos alelos, cada uno de ellos con una frecuencia polimórfica. Se considera, en general y de forma arbitraria, frecuencia polimórfica como aquella que es igual o superior al 1%. 1.4.1. CITOQUINAS Son, por definición, moléculas con la capacidad de movilizar células, entendiendo por movilización una estimulación del crecimiento y la diferenciación celular (Lozano-Teruel, 1995). Las proteínas de esta familia contienen cerca de 160 aminoácidos y controlan diversos aspectos del crecimiento y diferenciación de tipos celulares específicos, desde la proliferación de células del sistema inmune hasta la formación de anticuerpos funcionales (Lodish et al., 2016). Son sintetizadas como respuesta a la presencia de microorganismos y de otros antígenos, siendo las moléculas clave de la señalización en la respuesta inflamatoria e inmune. En la fase de activación de las respuestas inmunitarias adaptativas las citoquinas estimulan el crecimiento y la diferenciación de los linfocitos, mientras que, en las fases efectoras de la inmunidad innata y adaptativa, actúan sobre diferentes células efectoras para eliminar microorganismos y antígenos. Además, también estimulan el desarrollo de células hematopoyéticas. El papel principal de las citoquinas es, por tanto, minimizar el daño celular y promover la reparación de tejidos. Sin embargo, su producción persiste en las enfermedades inflamatorias crónicas, que se asocian con el desarrollo de tumores (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2007; Vendramini-Costa & Carvalho, 2012). 32 Las citoquinas se unen a receptores específicos en la superficie de células diana, de forma que se genera una señal interna que alterará la actividad de dicha célula. Como respuesta a la actividad de una citoquina, la célula receptora de la señal puede prepararse para la división, diferenciación o secreción de citoquinas propias. Un ejemplo de este comportamiento son las interacciones de los linfocitos T, mediadas por citoquinas que actúan como mensajeros químicos (Karp, Patton, Blengio-Pinto, & Pérez Tamayo Ruiz, 2014). La respuesta de una célula a la citoquina depende de si expresa o no el receptor correspondiente, denominado cognado. Todos los receptores de citoquinas activan vías de señalización intracelular similares. Así, la respuesta de las distintas células dependerá de un conjunto de factores de transcripción de la propia célula, de estructuras de la cromatina y de otras proteínas implicadas en el desarrollo de la célula (Lodish et al., 2016) (Fig. 13). Figura 13. Red de interacciones de las citoquinas. Fuente “QIAGEN - GeneGlobe Pathways - Cytokine Network,” n.d. 33 Además de su función, las citoquinas comparten una estructura terciaria similar, consistente en cuatro hélices alfa plegadas en una orientación específica. De la misma forma, la estructura de los receptores para citoquinas es muy similar, con dominios extracelulares formados por dos subdominios, cada uno con siete hebras β plegadas juntas de un modo característico. Esta homología prueba el origen común de la familia de citoquinas (Lodish et al., 2016). Hay una serie de propiedades comunes a todas las citoquinas (Abbas et al., 2007): su secreción es breve y está autolimitada; su actividad es pleiotrópica y redundante; influyen en la síntesis y las acciones de otras citoquinas; pueden actuar de forma autocrina y paracrina y su actividad empieza con la unión a receptores específicos de membrana en las células diana. Se han establecido tres categorías funcionales dentro del grupo de las citoquinas: 1Mediadores y reguladores de la inmunidad innata, producidos en fagocitos mononucleares. 2Mediadores y reguladores de la inmunidad adaptativa, sintetizados en linfocitos T. 3Estimuladores de la hematopoyesis, producidos en células del estroma de la médula ósea, leucocitos y otras células. La clasificación de las citoquinas se basa en una subdivisión en familias, entre las que se encuentran las interleuquinas (IL), quimioquinas, interferones, factores de estimulación colonial, factores de crecimiento, factores de necrosis tumoral y factores de crecimiento tumoral (TGF). A su vez, se clasifican por su efecto pro y antinflamatorio (Vendramini-Costa & Carvalho, 2012). Las interleuquinas tienen gran importancia por su papel central en la respuesta inmunitaria. Son moléculas ubicuas, sintetizadas por muchos tipos de células, no únicamente linfocitos, y por ello pueden encontrarse en prácticamente todos los tejidos. Se trata de sustancias extraordinariamente pleiotrópicas, es decir, presentan gran variedad de funciones, participando en procesos tan distintos como el control de la temperatura corporal, la pigmentación epidérmica, la actividad de los condrocitos y el depósito de calcio en el hueso. La variedad de funciones de las interleuquinas no es exclusiva de éstas, sino que es común a otros tipos de mensajeros químicos, como hormonas y neurotransmisores. El tipo de respuesta a una determinada señal depende tanto del propio mensajero como del tipo y capacidad metabólica de la célula diana (Lozano-Teruel, 1995). 1.4.1.1. Familia IL-1. Esta familia de citoquinas consta de once ligandos, que actúan induciendo la inflamación local y sistémica. Además, regulan la inflamación descontrolada y las respuestas inmunes. La mayoría de sus componentes no ejercen su función de forma directa sobre las células del sistema inmune, considerándoselas citoquinas de efecto indirecto (Dinarello, 2009). Los miembros que componen esta familia son: - IL-1α (IL-1F1): Es una citoquina agonista, es decir, se une a un receptor dando lugar a una acción determinada en la célula. Las dos formas posibles, precursora y madura, son biológicamente activas. Puede actuar de forma específica a través de un ligando o de manera intracelular como factor nuclear de unión al ADN. 34 - IL-1β (IL-1F2): Funciona como interleuquina agonista, tiene únicamente una forma biológicamente activa. Es, junto con la IL-1α, uno de los componentes más estudiados en relación al desarrollo de múltiples enfermedades. - IL-1Ra (IL-1F3): Antagonista del receptor de IL-1, es un inhibidor específico de la actividad de IL-1α e IL-1β. - IL-18 (factor inductor de IFN-γ, IL-1F4): Se une a un receptor semejante al IL-1R para llevar a cabo sus funciones celulares. Es una citoquina proinflamatoria producida, entre otras células, por macrófagos. - FIL-1δ (IL-1F5): Su actividad es antinflamatoria. Funciona, junto con la IL-1F7, como inhibidor inespecífico de la inflamación y de la respuesta inmune innata. - FIL-1ε (IL-1F6): Es una interleuquina proinflamatoria que actúa como ligando para el receptor IL-1Rrp2, con el que forma un heterodímero. - IL-1ζ (IL-1H4, IL-1F7): Actúa como inhibidor inespecífico de la inflamación y de la respuesta inmune innata. También se encuentra en el núcleo pudiendo actuar como un factor nuclear. - IL-1H2 (IL-1F8): Comparte receptor con la IL-1F6 (IL-1Rrp2). Se expresa en fibroblastos sinoviales y en condrocitos articulares. Su efecto es, en principio, proinflamatorio. - IL-1ε (IL-1F9): Expresada constitutivamente en la placenta y en el epitelio escamoso del esófago con función proinflamatoria. También se une al IL-1Rrp2. - IL-1Hy2 (IL-1F10): Es una citoquina expresada en la piel, el bazo, y las amígdalas. Su función no está clara, aunque se supone que es semejante a la del IL-1Ra debido a sus semejanzas estructurales. - IL-33 (IL-1F11): Participa en las funciones del mastocito y dirige las respuestas alérgicas y de los linfocitos Th2. Puede actuar a través de su receptor específico ST2 (también llamado Interleukin 1 receptor-like 1, IL-1RL1), pero también actúa como factor nuclear de unión al ADN. Este grupo de ligandos se unen a una serie de receptores agrupados en la familia IL-1 de receptores, entre los que se incluyen IL-1R1 e IL-1R2. Todos los receptores de las interleuquinas de la familia IL-1 muestran una arquitectura similar, que comprende tres dominios Ig-like en su ectodominio y un dominio Toll/IL-1R (TIR) intracelular común a los TLR (Toll like receptor). Estos receptores incluyen activadores y supresores del proceso infamatorio. El control ejercido sobre la inflamación se produce, por lo tanto, a nivel nuclear y a nivel de receptores. Así, tanto receptores como ligandos han evolucionado hacia funciones de defensa mediante respuestas inmunes innatas y de reducción o supresión de la inflamación tanto específica, pudiendo llegar a ser altamente específica, como inespecíficamente mediante ligandos TLR y otras citoquinas (Dinarello, 2009; Krumm, Xiang, & Deng, 2014). Exceptuando las IL-18 e IL-33, los genes de todos los miembros de la familia IL-1 se localizan en el cromosoma 2. Algunos de ellos representan duplicaciones génicas en cuanto a la organización intrón-exón (Dinarello, 2009). 35 1.4.1.1.1. Interleuquina 1. Es producida esencialmente, pero no exclusivamente, por macrófagos activados. También la producen los queratinocitos de fibroblastos, astrocitos de células corneales y linfocitos B transformados (Bensi et al., 1987). La IL-1 es producida por tumores, células estromales y endoteliales, y en células inmunes de la infiltración tumoral (Multhoff, Molls, & Radons, 2012). Actúa co-estimulando las funciones propias de las células T, además de poder actuar como factor de crecimiento de timocitos. Sin embargo, es improbable que tenga un papel esencial en el crecimiento del timo. En modelos animales se ha observado que la IL-1 contribuye a la polarización de las células Th2 (Dinarello, 2009). Generalizando, la IL-1 muestra numerosos efectos de intensificación sobre las funciones fisiológicas de células innatas e inmunocompetentes (Multhoff et al., 2012). Se han identificado elevados niveles de IL-1 en muchos tumores humanos y dichos niveles suelen asociarse a un peor pronóstico. Favorece el crecimiento tumoral y la metástasis de forma autocrina y paracrina y sus funciones dependerán de su localización celular. La IL-1 puede estimular a otros tipos celulares para producir mediadores pro-angiogénicos y pro-metastásicos con lo que juega un importante papel en la carcinogénesis asociada a la inflamación (Multhoff et al., 2012). La IL-1 comprende dos ligandos bioactivos proinflamatorios, IL-1α e IL-1β, descubiertos en 1985, y un antagonista específico de receptor, IL-1Ra. Las dos interleuquinas α y β presentan relativa semejanza estructural y elevado parecido funcional, por lo que se las considera dos isoformas de una misma interleuquina, la IL-1, con un antecesor común. Ambas se han caracterizado como citoquinas de alarma ya que pueden provocar la inflamación e inducir la expresión de otros genes proinflamatorios. Estos ligandos se unen a dos tipos de receptores IL1 transmembrana, IL-1R1 e IL-1R2 (Bensi et al., 1987; Dinarello, 2009; Roerink, van der Schaaf, Dinarello, Knoop, & van der Meer, 2017; Torrealba et al., 2017; Xu, Ding, & Jiang, 2014). Tal y como se muestra en la figura 14, la señal de transducción se inicia cuando una de las IL-1 (ya sea α o β) se une al receptor IL-1R1. Entonces sufre un cambio conformacional que permite el reconocimiento por parte de la proteína accesoria del receptor 1, IL-1RAcP. La formación del heterodímero del complejo de receptor y ligando conduce al reclutamiento de la proteína MyD88 (dimeric myeloid differentiation protein 88) a través de su dominio TIR (toll interleukin receptor) seguido por la formación del complejo entre IRAK-4 (interleukin-1 receptor-associated kinase 4), MyD88 e IL-1RAcP y la consiguiente fosforilación de IRAK-4. Se produce el reclutamiento de IRAK1/Tollip (toll interacting protein) al complejo, después de lo cual se fosforila la IRAK-1 hasta terminar hiperfosforilada y disociada en el citoplasma. Una vez allí se une a TRAF-6 (TNF receptor-associated factor 6). La IRAK-1 interactúa con la proteína de membrana TAB-2 (membrane-bound TAK-binding protein 2) así como con el complejo TAK-1/TAB-1, a lo que le sigue la traslocación de TAB-2 desde la membrana plasmática al cuerpo de señalización (signalosoma) y posteriormente la activación parcial de TAK-1 (también llamada MAP3K7, mitogen-activated protein 3-kinase 7) por TAB-2. IRAK1 permite la dimerización de TRAF-6 con su consiguiente ubiquitinación y activación. Próxima a la TAB-2, la TAK-1 se activa parcialmente, seguido por la activación completa de TRAF-6 mediante su poliubiquitinación a través de IRAK-2, permitiendo así la activación de numerosas cascadas de señalización. Por una parte, la TAK-1 activa miembros de la familia de las MAP 36 quinasas, produciendo la activación de AP-1 (activator protein 1) y ATF (activating transcription factor), con un aumento adicional de la transcripción mediado por NF-κB vía transactivación. Por otra parte, TAK-1 fosforila y activa IKK resultando en la fosforilación e inactivación de IκBα. Después, IκBα se disocia del complejo con NF-κB y se somete a degradación proteosomal. A continuación, el NF-κB se transloca al núcleo y activa la transcripción dependiente del mismo. En estas rutas de señalización también están implicados inhibidores de la activación de NF-κB, que pueden suprimir la red de rutas inflamatorias en el desarrollo del cáncer, lo que indica el importante papel que juega este factor en la tumorigénesis. La señalización de IL-1 también relaciona el reclutamiento de PI3-quinasa al complejo del receptor IL-1 mediante la subunidad regulatoria p83 de PI3K y la consiguiente activación de AKT/PKB llevando a la activación de AP-1 y NF-κB dependiente de IKK. La unión del receptor también puede activar numerosas proteínas G, lo que lleva a la activación de AP-1 y ATF mediado por muchas MAP quinasas y una transactivación de NF-κB independiente de IκBα. La señalización de IL-1 finalmente regula la expresión genética de gran variedad de factores tumorigénicos que incluyen factores proangiogénicos (IL-8, VEGF), de crecimiento (IL-6, GM-CSF), antiapoptóticos (Bcl-x, c-FLIP), promotores de invasión (MMP-2, MMP-7, MMP-9, UPA), enzimas inflamatorias (PGHS-2, LOX), prostaglandinas, iNOS, quimioquinas (CCL2, CCL20, IL-8) y citoquinas proinflamatorias (IL-1, IL-6, IL-23, TNF, TGF-β, EGF, RANKL). Por lo tanto, este conjunto de reacciones lleva al reclutamiento y activación de macrófagos y neutrófilos, a la dilatación vascular y fiebre y a una potente respuesta inmune proinflamatoria. En cambio, cuando la IL-1Ra, la citoquina antinflamatoria, se une a los mismos receptores no se producirá señal de transducción y se bloqueará la actividad de la IL-1 (Multhoff et al., 2012; Xu et al., 2014). 37 Figura 14. Ruta de señalización de IL-1 en el microambiente tumoral. La IL-1 se une al IL-1RI y el heterodímero resultante se asocia con la IL-1RAcP, iniciando la activación de cascadas de transducción intracelular y reclutando moléculas adaptadoras intracelulares. NF-κB actúa como nexo central entre inflamación y tumorigénesis. Basada en Multhoff et al., 2012. Es importante tener en cuenta que la IL-1 no actúa de manera independiente en el proceso inflamatorio de la tumorigénesis, sino en combinación con otros mediadores tumorales cruciales como el TNF y la IL-6, tal y como se muestra en la figura 15. Estos mediadores activan los factores de transcripción en la inflamación (NF-κB, STAT-3 e HIF-1) de tal modo que sus efectos afectaran a las distintas fases de la tumorigénesis (Multhoff et al., 2012). Figura 15. Interacciones de mediadores inflamatorios en células tumorales. Basada en Multhoff et al., 2012. 38 Las funciones de IL-1α e IL-1β dependen de la forma en la que se presenten en las células, siendo la mayor parte de la IL-1β intracelular y únicamente secretada en pequeñas cantidades, mientras que la IL-1α suele unirse a la membrana plasmática y su secreción es incluso menor que la de IL-1β. Como ya se ha dicho, la IL-1Ra puede atenuar las señales producidas por IL1α e IL-1β. Tras la activación de NF-κB por ambas citoquinas, éste puede promover la supervivencia de las células tumorales de PCa a través de señales antiapoptóticas (Xu et al., 2014). A. Interleuquina 1 alfa (IL-1α). Estructura molecular y función. La IL-1α se identificó originalmente como un factor derivado de macrófagos y activador de linfocitos, sin embargo, en la actualidad se sabe que la secretan varios tipos de células entre las que se incluyen monocitos, neutrófilos, células del músculo liso y epitelio cervical. Su forma precursora, denominada pro-IL-1α, tiene un peso de 31 kDa, mientras que la forma madura es de aproximadamente 17 kDa y ambas son formas biológicamente activas como ligandos del receptor IL-1R. La citoquina ejerce sus funciones biológicas tanto en estado libre, cuando es secretada, como una vez que se ha unido a la membrana (Di Paolo & Shayakhmetov, 2016; Hashemi et al., 2018; Yu et al., 2016). La IL-1α está presente en gran variedad de células y es expresada en células hematopoyéticas y no-hematopoyéticas de forma similar, siempre en respuesta a estímulos determinados, como el estrés oxidativo, sobrecarga de lípidos, estimulación hormonal, exposición a citoquinas (incluidas las propias IL-1α e IL-1β) y mediadores proinflamatorios de origen microbiano. En tejidos sanos la IL-1α se expresa en distintos tipos celulares, como las células epiteliales y endoteliales, pero dicha expresión podrá aumentar en respuesta a ciertos factores de crecimiento y a estímulos proinflamatorios y asociados al estrés. La expresión inducida de IL-1α depende de la existencia de los sitios de unión para AP1 y NF-κB así como del tipo celular en que se encuentre (Di Paolo & Shayakhmetov, 2016). En respuesta a ciertos estímulos la IL-1α puede translocarse al núcleo, lo que es importante funcionalmente ya que puede interactuar directamente con histonas y estimula la transcripción de genes, incluyendo la de quimioquinas proinflamatorias, independientemente de la señalización del receptor. Por otra parte, la IL-1α puede funcionar como una citoquina de unión a la membrana plasmática tras recibir estímulos proinflamatorios en células tales como fibroblastos y células endoteliales. Esta capacidad para actuar unida a la membrana plasmática es única dentro de la familia de IL-1. Existen mecanismos moleculares especializados que regulan la translocación de la pro-IL-1α del citosol al lado externo de la membrana plasmática, permitiendo el inicio de la señalización mediada por el conjunto de la IL-1α unida al receptor IL-1R de forma paracrina. Posteriormente la pro-IL-1α unida a la membrana plasmática puede liberarse de dicha unión. El exceso de pro-IL-1α intracelular está sujeto a la degradación proteosómica a través de mecanismos dependientes de ubiquitina (Di Paolo & Shayakhmetov, 2016). 39 La pro-IL-1α y la IL-1α madura tienen actividades biológicas idénticas, aunque posiblemente la pro-IL-1α cortada en distintos sitios pueda producir formas de IL-1α madura con diferentes funciones biológicas. La pro-IL-1α se expresa de manera constitutiva e inducida en una amplia variedad de tipos celulares. Cuando se encuentra libre en el citosol es un elemento desencadenante de la inflamación en células necróticas, de modo que la IL-1α madura actúa como alarma celular, alertando al organismo del daño. Cuando la pro-IL-1α citosólica se une al inhibidor IL-1R2 puede prevenir o reducir la magnitud de la respuesta inflamatoria a células necróticas mediante el secuestro del precursor en complejos citosólicos. La pro-IL-1α citosólica es entonces trasladada al núcleo, lo que evita su liberación y, por lo tanto, la inflamación (Di Paolo & Shayakhmetov, 2016). La pro-IL-1α, para actuar como alarma extracelular, debe perder su integridad de membrana, ser liberada de forma pasiva y así activar la cascada inflamatoria. Sin embargo, esta molécula carece de péptido de señalización que medie su secreción desde la célula, por lo que la caspasa-1 y el inflamasoma podrían ser necesarios para su procesamiento y liberación como pro-IL-1α proteolítica. La caspasa-1, conocida también como enzima de conversión de IL-1 (ICE), suprime la muerte celular y la inflamación en las células hematopoyéticas como respuesta a ciertos estímulos, liberando IL-1α independientemente del inflamasoma, de manera que se lleva a cabo una ruta alternativa para desencadenar mecanismos de defensa dependientes del receptor IL-1R1 y alertando al huésped de una infección. La caspasa-1 es un miembro prototípico de la familia de caspasas inflamatorias que contienen un dominio específico denominado CARD (N-terminal caspase recruitment domain). Es activada por un complejo de proteínas intracelulares denominado inflamasoma, un complejo multiproteico activado a partir de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs – pathogen-associated molecular patterns), así como a patrones asociados a daño molecular (DAMPs – damage-associated molecular patterns). Este complejo no es solo responsable de la activación de la caspasa-1 sino también de su reclutamiento, así como de la maduración de citoquinas inflamatorias IL-1β e IL-18 (Di Paolo & Shayakhmetov, 2016; He, Fu, Tian, & Yan, 2018; Martinon, Burns, & Tschopp, 2002; Multhoff et al., 2012; Roerink et al., 2017). Se ha considerado que el proceso inflamatorio en el que está implicada la IL-1α consiste en un ciclo inflamatorio dependiente de dicha interleuquina. Frente a estrés oxidativo, genotóxico, metabólico, estimulación hormonal o infección se inician rutas de señalización de TNF-R1, IL-1R1 o TLR. Al no producirse muerte celular estos estímulos desencadenan la activación y traslocación de pro-IL-1α, trasladándola a la membrana plasmática y generando el complejo pro-IL-1α-membrana. A su vez esto activa quimioquinas y produce citoquinas a partir de células vecinas o macrófagos residentes en tejidos, lo cual produce movilización de células mieloides al lugar donde se inició el estrés. La IL-1α unida a la membrana en la superficie de células sometidas a estrés va a activar la producción de más IL-1α, así como de IL-1β. De esta forma, se produce un ciclo inflamatorio dependiente de la asociación de IL-1-IL-1R1, que señaliza la producción de quimioquinas y el reclutamiento de células inflamatorias hacia el lugar de estrés y que se mantendrá únicamente en células hematopoyéticas (Fig. 16a). En caso de muerte celular por daño, estrés o infección, la IL-1α se moviliza a partir de la liberación pasiva de pro-IL-1α al medio circundante, en el que la IL-1α actúa como alarma (Fig. 16b). La pro-IL-1α liberada a partir de células necróticas activa la señalización IL-1R1 en células vecinas, llevando al reclutamiento de células hematopoyéticas que pueden además mantener la inflamación como se observa en la figura 16a (Di Paolo & Shayakhmetov, 2016). 46 IL-1β y cáncer. Múltiples estudios relacionan la familia de IL-1 con el desarrollo del cáncer, así como su pronóstico y respuesta al tratamiento. Se ha observado una distribución homogénea en relación al efecto de la familia de IL-1 y las patologías prostáticas. Además, mediante el desarrollo de estudios epidemiológicos se ha demostrado que variantes genéticas del gen IL-1B podrían actuar como marcadores predictivos y estar vinculados a diferentes tipos de cáncer, entre los que se encuentran colon, pulmón, gástrico y prostático (Roerink et al., 2017; Torrealba et al., 2017). Se han encontrado niveles incrementados de expresión de IL-1β y CXCL6 en pacientes con peor pronóstico de cáncer de próstata (mayor estadio Gleason), con lo que parece existir una relación entre los tres factores. La IL-1β derivada de células del cáncer incrementa la expresión de la enzima COX-2 en las MSCs (mesenchymal stem cells) del estroma del tumor, lo que conlleva más secreción de prostaglandina E2 (PGE2). Otro vínculo entre el nivel de expresión de IL-1β y el PCa es la correlación inversa encontrada entre el antígeno prostático y la intensidad de la señal de IL-1β. Esto se debe a que la citoquina inhibe la expresión del PSA, así como del AR en las células tumorales del PCa. También se cree que la concentración de la IL-1β puede estar modulada por la testosterona, lo que añade otro posible vínculo con este cáncer (Q. He et al., 2018; Q. Liu et al., 2013; Roerink et al., 2017). La IL-1β parece ejercer un importante efecto sobre la progresión de metástasis ósea de PCa primario, especialmente en pacientes con terapia de deprivación androgénica (ADT). Esta citoquina proinflamatoria colabora en la supervivencia y proliferación de las células metastásicas presentes en el esqueleto. La ADT induce transdiferenciación, es decir, transformación de una célula en otro tipo celular, lo cual se combina con la expresión elevada de IL-1β y apoya la tendencia de las células del cáncer de próstata a colonizar el esqueleto y progresar, eventualmente, a lesiones secundarias óseas (Q. Liu et al., 2013). Se han llevado a cabo varios estudios que analizan el efecto de la expresión de IL-1β dependiente de sus variantes genéticas sobre la presencia de la fatiga durante y después del tratamiento en el cáncer. Lo observado en cáncer de próstata es que a medida que aumenta la concentración de la citoquina también se incrementa la fatiga (Roerink et al., 2017). En cuanto a los estudios realizados en el rs16944 del gen IL-1B en relación al desarrollo de cáncer los resultados no son concluyentes. Se han llevado a cabo en cáncer de ovario, cervical, de pulmón, leucemia, piel, esofágico y en mayor proporción en cáncer gástrico, de mama y próstata. Muchos de los resultados obtenidos no muestran asociación entre el desarrollo del tumor y la variante genética, sin embargo, en otros casos sí se han observado resultados de riesgo estadísticamente significativos vinculados generalmente al alelo A. No parece haber diferencias en cuanto a los estudios realizados en caucasoides, asiáticos y otros grupos poblacionales (Tabla II, Anexo 1). 47 1.4.1.1.2. Interleuquina 18 (IL-18). Estructura molecular y función. La interleuquina 18 (IL-18), originalmente conocida como Factor Inductor de Interferón-γ (IGIF), fue purificada a partir de hígado de ratones y clonada por primera vez en 1995 (Okamura et al., 1995). Se sintetiza como una proteína precursora de 24 kDa (pro IL-18) y se activa al ser procesada por una enzima conversora de IL-1β (ICE o caspasa 1) obteniéndose un péptido de cadena sencilla de 193 aminoácidos, con un tamaño molecular de 18 kDa (Nakanishi, Yoshimoto, Tsutsui, & Okamura, 2001). Esta citoquina está estrechamente relacionada con la IL-1β, ya que sus precursores requieren la misma enzima para su maduración, ambas están relacionadas en su estructura molecular, pertenecen a la misma familia y comparten una ruta de señal de transducción. El complejo receptor heterodimérico que lleva a cabo la actividad de IL-18 se denomina IL-18R y presenta una estructura similar a la del IL-1R (Dinarello, 1999b, 1999a; Nakanishi et al., 2001). La IL-18 es producida por macrófagos activos, especialmente las células de Kupffer, células mononucleares periféricas de la sangre (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) y células dendríticas y epidérmicas, especialmente queratinocitos. En individuos metastásicos se ha observado producción de IL-18 en osteoclastos. Por otra parte, esta citoquina también se sintetiza en nervios centrales y en el sistema endocrino, por lo que se cree que puede ser un nexo entre ambos sistemas. En cuanto a la próstata, la IL-18 es producida por células epiteliales en pacientes con PCa (Dinarello, 1999a; Lebel-Binay et al., 2003; Nakanishi et al., 2001; Okamura et al., 1995). Respecto a la función de la IL-18 ésta es una proteína pleiotrópica y proinflamatoria (Giedraitis, He, Huang, & Hillert, 2001). Tal y como su nombre original indicaba, su principal función es inducir la producción de IFN-γ aumentando su efecto en presencia de coestimuladores y, en especial, de la IL-12, con la que tiene una relación sinérgica. La IL-18 induce la producción de IFN-γ mediante la activación del promotor del interferón por unión directa al factor de transcripción AP-1 (proteína activadora 1). Esta función no es la única que vincula a estas interleuquinas, ya que ambas actúan sinérgicamente en la proliferación de células T para la síntesis de IL-2, GM-CSF y TNF-α y en la activación de células B, que funcionan como inhibidoras de la producción de Inmunoglobulina E. Además, los receptores de ambas interleuquinas presentan regulación recíproca (Barbulescu et al., 1998; Dinarello, 1999a; Okamura et al., 1995; S. Park, Cheon, & Cho, 2007). Por otro lado, la IL-18 es una molécula crítica en la activación de células T, tanto Th1 como NK, pero no Th2. Juega un papel central en la proliferación y activación de células NK, en un proceso vinculado a la actividad conjunta con la IL-12 y a la producción de IFN-γ. Además, la activación de células T y NK mediadas por IL-18 provoca la eliminación de células tumorales (Fig. 22) (Dinarello, 1999a; S. Park et al., 2007; Tomura et al., 1998). La IL-18 tiene la capacidad de regular la producción y actividad de distintas citoquinas dependiendo de las dianas celulares: suprime la producción de IL-10, induce quimioquinas CC y CXC, interviene en rutas dependientes de TNF, mejora la expresión del ligando Fas (FasL) en células T y NK e induce la apoptosis en las células mielomonocíticas humanas KG-1 (human 48 myelomonocytic KG-1 cells) (Dinarello, 1999a). Además, tiene propiedades angiogénicas ya que estimula la actividad de la molécula vascular de adhesión celular-1 (vascular cell adhesión molecule 1, VCAM-1) en fibroblastos de tejido sinovial. Incrementa la producción de SDF1α/CXCL12, MPC-1/CCL2 y VEGF vía superposición y, en ocasiones, mediante diferentes intermediarios de señalización. Dicha producción depende de JNK, PI3K p38 MAPK, PKCδ y NF-κB (Amin et al., 2007; Cho et al., 2006; C. C. Park et al., 2001). Así, la IL-18 activa la ruta IRAK/TRAF6, resultando en la activación de AP-1 vía JNK y NF-κB, aunque su efecto proliferativo sobre las células T y NK podría darse también a través de la ruta MAPK (mitogenactivated protein kinase) (Nakanishi et al., 2001). Figura 22. Funciones de la IL-18. Gen IL-18 (rs187238). El gen IL-18 humano se localiza en el cromosoma 11, en la posición 11q22.2-22.3 y contiene seis exones y cinco intrones (Wei et al., 2007; Y.-C. Yang et al., 2013). El análisis de la región promotora muestra una acumulación poco común de secuencias consenso de uniónSTAT, lo cual explica la unión específica de STAT5 en el promotor de IL-18 (Kalina et al., 2000). El promotor para IL-18 carece de región TATA y su actividad promotora upstream del exón 2 actúa de forma constitutiva (Dinarello, 1999b). El ARNm de IL-18 se expresa constitutivamente en varios tipos celulares lo que se debe, al menos parcialmente, a la particular estructura y características del gen. Dicha expresión no se da únicamente en condiciones patológicas, sino también en individuos sanos (Dinarello, 1999b; Nakanishi et al., 2001). 49 Dos de los SNPs localizados en la región promotora del gen regulan la expresión del mismo a nivel transcripcional. El cambio de C por A en la posición -607 (rs1946518) produce una alteración en el sitio de unión a la proteína cAMP de la misma forma que el cambio nucleotídico de C por G en la posición -137 (rs187238) altera el sitio de unión del factor nuclear H4TF-1 (Histone 4 Transcription Factor 1) (Fig. 23). Así, las variaciones polimórficas en la región promotora del gen IL-18 afectan a su actividad, aunque este efecto puede variar entre los distintos tipos celulares y dependiendo del ambiente local de la citoquina (Abdolahi, Dabbaghmanesh, Haghshenas, Ghaderi, & Erfani, 2015; Dehaghani et al., 2009; Giedraitis et al., 2001; Singh et al., 2014). Figura 23. Localización del rs187238 del gen IL-18. Fuente NCBI (Sherry et al., 2001). Las frecuencias alélicas del rs187238 observadas en las poblaciones de los distintos continentes son bastante homogéneas (0,66-0,92), siendo América el continente con menores frecuencias (0,69) para el alelo ancestral C, seguida de Europa (0,72) (Fig. 24). Las frecuencias más altas aparecen en el Este de Asia (0,88), aunque son muy similares a las que aparecen tanto en el Sur de Asia (0,82) como en el continente africano (0,80). Solo en la población Han de Beijing se observan frecuencias alélicas para el alelo C por encima de 0,9 mientras que la frecuencia menor se da en Colombia (0,66). En los datos disponibles para España la frecuencia del alelo ancestral (C) alcanza valores de 0,71 (The 1000 Genomes Project Consortium, 2015). Figura 24. Representación gráfica de la frecuencia del alelo C del rs187238 en distintas poblaciones humanas. Fuente 1000 Genomes (The 1000 Genomes Project Consortium, 2015). 50 IL-18 y cáncer. Se ha estudiado durante años el posible vínculo entre el nivel sérico de IL-18 y el cáncer. La mayoría de las funciones de la IL-18 podrían relacionarse con efectos cancerígenos, ya que su elevada expresión se asocia con la neoformación de vasos sanguíneos, la estimulación de VEGF así como de otros factores angiogénicos como (SDF-1α)/CXCL12, MCP-1/CCL2 o TSP-1 mediante la fosforilación de JNK-1/2, PI3K, p38MAPK, PKC y NF-κB (Dinarello, 1999a; Jablonska, Puzewska, Grabowska, Jablonski, & Talarek, 2005; S. Park et al., 2007). También se ha encontrado asociación entre los niveles séricos de IL-18 y la producción de TNFα y angiogenina (ANG), lo que reforzaría su efecto angiogénico (Alexandrakis et al., 2004; Amin et al., 2007). Además, su principal función está vinculada al IFNγ, a través del que se favorece el proceso inflamatorio y la diferenciación de células Th1, dendríticas o NK que, en condiciones de inflamación crónica e hiperplasia, pueden favorecer el desarrollo del tumor. Sin embargo, también se han observado casos en los que la IL-18 parecía ejercer efecto antitumorigénico, quizá vinculado a la función apoptótica observada en ciertos tumores, como el mieloma (Osaki et al., 1998; S. Park et al., 2007). Analizando los niveles séricos de IL-18 en pacientes oncológicos, se ha encontrado que los valores son más elevados en pacientes con cáncer de piel de células escamosas, en melanoma y otras líneas celulares de cáncer de piel, ovario, cervical de células escamosas, así como en tejidos tumorales de cáncer gástrico (Dehaghani et al., 2009; Haghshenas et al., 2009; H. Park et al., 2001; S. Park et al., 2007; Y.-C. Yang et al., 2013; Ye, Ma, Li, Jin, & Xu, 2007). En los pacientes con cáncer de mama los niveles séricos de IL-18 elevados se asociaron a niveles también elevados de nitrato, nitrito y la citoquina RANTES (Regulated on Activation Normal T Cell Expressed and Secreted; CCL5) (Eissa, Zaki, El-Maghraby, & Kadry, 2005; Günel et al., 2002, 2003). Por otra parte, no se encontró asociación estadísticamente significativa entre el cáncer de vejiga y los niveles séricos de IL-18 (Bukan et al., 2003). Los estudios realizados en mieloma y en leucemia mieloide aguda apoyan los efectos angiogénicos y proinflamatorios para niveles séricos de IL-18 elevados (Alexandrakis et al., 2004; B. Zhang et al., 2002). En el caso de cáncer de próstata, Lebel-Binay (2003) y su equipo demostraron que las células tumorales producen IL-18 y su secreción está modulada por interferones en las líneas celulares del tumor prostático. La producción de IL-18 por el tumor se asoció con un mejor pronóstico clínico. Aproximadamente el 75% de los casos de PCa estudiados presentaban células tumorales que producían IL-18, sin embargo, la presencia de IL-18 no se asoció con el estado de Gleason o con el estado patológico del PCa. La heterogeneidad observada en los niveles de IL-18 en el tumor podría explicarse por la heterogeneidad intratumoral característica de esta patología en lo que al grado de desarrollo y daño se refiere (Lebel-Binay et al., 2003). El rs187238 se ha estudiado en relación a múltiples tipos de cáncer (Tabla III, Anexo 1) entre los que se encuentra el esofágico y oral de células escamosas, gastrointestinal, mama, ovario, vejiga, hepatocelular y nasofaríngeo, obteniéndose en todos estos trabajos resultados significativos (Haghshenas et al., 2009; Jaiswal, Singh, Srivastava, & Mittal, 2013; KhaliliAzad et al., 2009; Lau et al., 2016; Nong, Luo, Zhang, & Nong, 2009; Singh et al., 2014; Wei et al., 2007). Por el contrario, en estudios de cáncer de pulmón, renal, cervical de células escamosas, linfoma de no-Hodgkin, tiroides, leucemia crónica y también en algunos casos de cáncer oral y nasofaríngeo no se encontró asociación significativa entre el SNP y el desarrollo de la enfermedad (Abdolahi et al., 2015; Farhat et al., 2008; Farjadfar et al., 2009; Pratesi et al., 2006; Sáenz-López et al., 2010; Surovtseva et al., 2014; Tsai et al., 2013; Yalçın et al., 51 2015; Y.-C. Yang et al., 2013). Independientemente de la significación estadística, generalmente el alelo C se ha asociado con un aumento en el riesgo del desarrollo del cáncer, aunque esa asociación no siempre se ha observado con el mismo genotipo. En alguno de los estudios el genotipo de mayor riesgo es el CG, mientras que en otros el riesgo es mayor para el genotipo CC. Resumiendo, la relación entre el alelo C y el cáncer es significativa en cáncer de mama, vejiga, hepatocelular, esofágico y oral de células escamosas y un estudio de nasofaríngeo. Únicamente se han encontrado dos trabajos publicados que analizan la posible asociación entre el cáncer de próstata y el rs187238. En el estudio llevado a cabo por Liu Y y su equipo (2007) se concluye que los genotipos CC y CG están asociados significativamente con el riesgo a desarrollar PCa mientras que para el equipo de Liu JM (2013) el genotipo CG se asociaría con una pobre prognosis. 1.4.1.2. Interleuquina 6 (IL-6). Se consideran varios niveles de clasificación de citoquinas: en base a sus respuestas biológicas como proinflamatorias o antinflamatorias, en función de sus receptores o de acuerdo a su estructura en tres dimensiones, es decir, su estructura cuaternaria. Todos los miembros agrupados en la familia de IL-6 son secretados como monómeros de subunidad simple y comparten una estructura formada por cuatro hélices α. Incluye a la IL-6, IL-11, LIF (leukaemia Inhibitory Factor), CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor), NP (Neuropoetin), CT-1 (Cardiotrophin-1), CLC (Cardiotrophin like cytokine), OSM (Oncostatin M), Epo (Erithropoietin), G-CSF (granulocyte colony-stimulatin factor), IL-12, hormona del crecimiento, prolactina, IL-10, IFN-α y β y leptina. Por otra parte, esta familia incluye sus receptores de membrana característicos entre los que se encuentran IL-6Ra, IL-11Ra y CNTFRa. Las citoquinas IL-6, IL-11, LIF, OSM, CNTF, CT.1 y CLC comparten la subunidad del receptor gp130 para la transducción de señal, de modo que sus respuestas fisiológicas son semejantes y superpuestas. Este grupo de citoquinas, denominadas “citoquinas tipo IL-6” señalizan a través de la activación de Janus quinasas (JAK) y factores de transcripción de la familia STAT, activando genes diana relacionados con la diferenciación, supervivencia, apoptosis y proliferación. Los receptores utilizados por este grupo de ligandos incluyen tanto receptores de la superficie celular como solubles (Heinrich, Behrmann, Haan, Hermanns, & Uller-Newen, 2003; Heinrich, Behrmann, Müller-Newen, Schaper, & Graeve, 1998; Jones & Vignali, 2011; Saavedra-Ramírez, Vásquez-Duque, & González-Naranjo, 2011). Todas las citoquinas tipo IL-6 son polipéptidos con masa molecular de aproximadamente 20 kDa. Son proteínas secretoras clásicas sintetizadas que presentan péptidos de señal Nterminal y sus receptores son proteínas de membrana tipo I pertenecientes a la familia de receptores de clase I. Sus propiedades son tanto antiinflamatorias como proinflamatorias, además de participar de forma central en la hematopoyesis, así como en respuestas inmunes y de fase aguda de la inflamación (Heinrich et al., 2003, 1998). Estructura molecular y función. La IL-6 es una citoquina polipeptídica con múltiples actividades, cuya forma biológicamente activa tiene un peso de 20,8 kDa y consta de 184 aminoácidos. Inicialmente se 52 la describió como un factor derivado de fibroblastos con actividad antiviral. Sin embargo, posteriormente se la vinculó con el factor estimulador de células B, así como con el factor de crecimiento de la hibridoma (hybridoma growth factor) y el factor estimulador de hepatocitos. Finalmente se llegó a la conclusión de que todos estos factores se correspondían básicamente con la misma molécula (Saavedra-Ramírez et al., 2011; Schindler et al., 1990). Es sintetizada por múltiples tipos celulares tales como linfocitos B y T, macrófagos, monocitos, fibroblastos, células endoteliales (incluidas las de la próstata) y mesoteliales, sinoviocitos, células de la glía, ciertas células tumorales y células del tejido adiposo (Azevedo, Cunha, Teixeira, & Medeiros, 2011; Saavedra-Ramírez et al., 2011). La IL-6 no se expresa constitutivamente, pero sí es inducible como respuesta a estímulos determinados, entre los que destacan la infección y la acción de citoquinas inflamatorias como IL-1, TNF-α y el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (Saavedra-Ramírez et al., 2011; Terry, Loukaci, & Green, 2000). Los niveles de IL-6 circulante son principalmente regulados a nivel de expresión debido a la rápida depuración plasmática de esta citoquina. La transcripción de la molécula está estrechamente regulada por los factores de transcripción NFIL6, NF-κB, Fos/Jun, CRBP y receptor glucocorticoide (Terry et al., 2000). La IL-6 es una citoquina pluripotencial con la capacidad de inducir gran variedad de respuestas tanto celulares como fisiológicas, que incluyen la respuesta inmune, inflamación, hematopoyesis y oncogénesis. Estas respuestas se generan mediante la regulación del crecimiento celular, la activación genética, proliferación, supervivencia y diferenciación (Azevedo et al., 2011; Heinrich et al., 1998). Tiene acciones proinflamatorias y antinflamatorias, es el principal mediador de la respuesta de fase aguda en el principio de la inflamación aguda, sus efectos en la inmunidad dependen del contexto y de su concentración local, de la presencia o ausencia de otras proteínas reguladoras y de la concentración del receptor soluble (Nguyen, Li, & Tewari, 2014; Saavedra-Ramírez et al., 2011). La IL-6 participa, además, en la diferenciación y activación de macrófagos, el crecimiento de células T y la diferenciación terminal de células B, en el apoyo de formación de colonias multipotenciales mediante células madre hematopoyéticas y la diferenciación neural, estimula la producción de inmunoglobulinas a través de las células B e inhibe la secreción de citoquinas proinflamatorias. En los últimos años se ha descubierto que la IL-6 promueve el desarrollo de células Th17, productoras a su vez de IL-17 (Fig. 25) (Saavedra-Ramírez et al., 2011; Terry et al., 2000). Figura 25. Esquema de las actividades de la IL-6 en el organismo. 53 La IL-6 participa en el proceso de carcinogénesis mediante varios mecanismos, incluyendo la estimulación de la proliferación celular, la reducción de la apoptosis, la alteración de enzimas implicadas en la invasión tumoral y la promoción de metástasis ósea. Además, en la próstata contribuye al aumento del crecimiento de las células del cáncer por activación del receptor de andrógenos. También contribuye a la transformación de células benignas de la próstata en células malignas y promueve la transición epitelio-mesénquima (Jureceková et al., 2018). Muchas de las actividades en las que participa la IL-6 son compartidas por otras citoquinas, por ejemplo, con la IL-1. Tal y como ya se ha comentado en el apartado de la IL-1 ambas actúan sinérgicamente en varias funciones como la proliferación de células T activas, el aumento de respuesta de los timocitos, la mejora de síntesis de inmunoglobulinas por las células B o la aparición de fiebre junto con TNF-α e IFN-γ. La IL-6 tiene un efecto supresor en la producción de IL-1β y TNF, lo que podría ser especialmente importante en tipos celulares que expresan grandes cantidades de IL-6 en respuesta a IL-1, tales como fibroblastos y células endoteliales. La regulación de la producción de IL-1 y TNF-α se considera su principal efecto antinflamatorio (Saavedra-Ramírez et al., 2011; Schindler et al., 1990). También actúa conjuntamente con la IL-27 produciendo la secreción de IL-10 por parte de las células T (Jones & Vignali, 2011). El hecho de que la IL-6 tenga la capacidad de inducir distintas respuestas se debe a su capacidad para activar la señalización a través de distintas rutas (Culig, Steiner, Bartsch, & Hobisch, 2005). El primer paso de activación de la señalización consiste en la unión del ligando IL-6 al receptor, formando el complejo IL-6/IL-6R/gp130. El receptor está formado por una subunidad α de 80 kDa, denominada gp80 o IL-6R, y dos componentes glucoproteicos de 130 kDa (gp130). El patrón de expresión de IL-6R está altamente definido y es muy específico de ciertos tipos celulares, además su unión con el ligando IL-6 es de baja afinidad y carece de dominio intracelular de transducción de señales. La gp130 presenta un dominio Ig aminoterminal seguido por 5 dominios de fibronectinas en tándem tipo III (FNIII), un dominio transmembrana y un dominio intracelular con 5 motivos de fosforilación de tirosina. El dominio FNIII es el responsable de la unión del receptor y la citoquina (Azevedo et al., 2011; Heinrich et al., 1998; Jones & Vignali, 2011). El receptor IL-6R existe también en forma soluble, con capacidad para fijar la IL-6 circulante, contribuyendo de esta forma a la activación celular. Las formas solubles de los receptores de IL-6 (IL-6Rs y gp130s) se encuentran en el plasma sanguíneo. La capacidad de formar un complejo con la forma soluble del receptor (IL-6Rs) se denomina transeñalización o transactivación y permite desencadenar respuestas en una amplia variedad de células que de otra forma permanecerían sin respuesta a la propia IL-6. Por otro lado, la forma soluble de gp130 (gp130s), previene la señalización producida por la gp130 unida a la membrana e inhibe los efectos de la IL-6 mediados por IL-6Rs, pero no los transmitidos por el receptor IL-6R (Saavedra-Ramírez et al., 2011). El IL-6Rs potencia la actividad antagonista del gp130s, de modo que la combinación de ambos podría actuar como amortiguador para modular las respuestas sistémicas a la IL-6 circulante (Heinrich et al., 2003). La señalización intracelular se da a través de las rutas JAK-STAT (janus kinase-signal transducer and activator of transcription), MAPK (mitogen-activated protein kinase) y PI3K/AKT (phosphatidylinositol 3-kinase/Akt kinase) para activar la expresión de diferentes genes con funciones esenciales en la inflamación y el desarrollo del cáncer (Fig. 26). La principal comienza con la activación de JAK quinasas, que fosforilan y activan los factores de transcripción STAT (signal transducers and activators of transcription), especialmente STAT3 y SHP2 (SH2 (Src Homology-2) domain-containing tyrosine phosphatase). STAT3 forma un dímero que se trasladará al núcleo activando la transcripción de genes diana de este transductor 54 de señal, así como el incremento de la expresión de RANKL (receptor activator of nuclear factor κB ligand) (Azevedo et al., 2011; Heinrich et al., 1998; Jones & Vignali, 2011; QIAGEN, 2013). Por su parte la SHP2 participa en la ruta Ras/MAPK, siendo imprescindible para la estimulación de la división celular. El aumento de la actividad de MAPK puede llevar a la regulación positiva del crecimiento celular, la proliferación y la mitosis. Además, la IL-6 también activa la PI3K, de modo que se inicia la cascada PI3K/Akt/NF-κB que alcanzará su máximo efecto antiapoptótico sobre TGF-β (transforming growth factor beta) y con ello se conseguirá mayor supervivencia celular. Esta ruta se relaciona con la caspasa-3, ya que es a través de esta molécula que la IL-6 bloquea al TGF-β. Sin embargo, este tipo de rutas no son exclusivas, ya que los receptores alfa pueden ser sustituidos por sus formas solubles, que carecen de regiones transmembrana y citoplasmáticas. La finalización de la señalización de citoquinas tipo IL-6 se da a través de la acción de tirosina fosfatasas, proteosoma e inhibidores SOCS (suppressor of cytokine signaling) de JAK quinasa, PIAS (protein inhibitors of activated STATs), e internalización de los receptores de citoquina vía gp130 (Azevedo et al., 2011; Culig et al., 2005; Heinrich et al., 1998; Jones & Vignali, 2011). Figura 26. Ruta esquemática de la IL-6. Incluye la ruta clásica, con activación de JAK/STAT, MAPK y PI3κ/AKT, y la ruta mediante receptores solubles (IL-6Rs y gp130s). Basada en Azevedo A et al. (2011). 55 Gen IL-6 (rs1800795). El gen IL-6 se localiza en el brazo corto del cromosoma 7 humano, concretamente en el locus 7p14-21(C. Chen, Gong, Yi, & Guo, 2015) e incluye 5 exones y 4 intrones. La expresión del gen y, por lo tanto, la concentración de IL-6, puede estar influida por la existencia de sitios polimórficos en el gen (Jureceková et al., 2018). Uno de ellos es el SNP rs1800795 que está incluido en una zona relativamente conservada, anexa a la región 5’ (5’ flanking region) y considerada al menos parcialmente responsable de la regulación del gen. Consiste en un cambio nucleotídico de G por C localizado en la posición Ch7: 22727026 (Fig. 27), siendo G el alelo ancestral (Tindall et al., 2012). Se ha descrito que este polimorfismo afecta a la transcripción del gen y posteriormente, a la producción de la citoquina (Abbasabad et al., 2018). La regulación de la transcripción es específica de cada tipo celular, lo cual puede tener relevancia fisiológica al considerarse distintos procesos patológicos (Terry et al., 2000). Figura 27. Localización del rs1800795 del gen IL-6 en el cromosoma. Fuente NCBI (Sherry et al., 2001). El alelo G de este SNP se ha asociado con mayor expresión y por tanto con mayor nivel de IL-6 en plasma en una población de individuos sanos (Terry et al., 2000). Se ha sugerido que el cambio de G por C del rs1800795 está asociado con alteración en la producción de IL-6, por su localización en la región promotora de las puertas GATA1. La región en la que está localizado este polimorfismo tiene una secuencia parcialmente homóloga con el elemento Smad4-binding. Se supone que el alelo C puede unirse a Smad4 más eficientemente e inhibe la transcripción de IL-6 (Jureceková et al., 2018). Este marcador es esencialmente monomórfico en África y el este de Asia (Fig. 28), mientras que en el sur de Asia el marcador pasa a ser polimórfico (0,861). Las poblaciones del continente americano muestran una considerable variación en sus frecuencias alélicas para este SNP, entre 0,713 en Colombia y 0,947 en Perú. Por último, en poblaciones de Europa se observan los valores más equilibrados entre los dos alelos, con el valor más elevado para el alelo G en España (0,650) y el más bajo en Finlandia (0,545). 62 IL-10 y cáncer. Se considera que la IL-10 es una citoquina inmunosupresora que inhibe la respuesta inmune contra el cáncer, de tal modo que un descenso en la producción de IL-10 podría mejorar las respuestas inmunes específicas de pacientes en algunos modelos de tumores preclínicos (Miteva, Stanilov, Deliysky, & Stanilova, 2014). La producción de IL-10 es estimulada tanto por factores endógenos como exógenos, pero también es importante tener en cuenta el efecto de ciertas variantes alélicas del gen, asociadas a su vez con diferencias en su expresión. El gen IL-10 es un candidato ampliamente estudiado en la fisiopatología de enfermedades autoinmunes, inflamatorias y neoplasias, ya que regula la inmunidad celular y humoral (Trifunovic et al., 2015). Múltiples estudios han contabilizado concentraciones elevadas de IL10 en pacientes con cáncer, que pueden deberse a múltiples razones y tener diferentes implicaciones. La IL-10 puede ser expresada por células tumorales, mientras que en otros casos puede ser producida por células implicadas en la reacción antitumoral, como indicador de una respuesta inflamatoria potente (Moore et al., 2001). La cantidad de IL-10 liberada a la sangre no parece estar afectada por la localización del tumor sino por su histología. Los niveles séricos de IL-10 parecen, además, depender más de la presencia de metástasis que de la masa, grado o nodos tumorales. Las células tumorales podrían producir IL-10 por sí mismas o estimular otras poblaciones celulares, como macrófagos o linfocitos de infiltración tumoral para que la liberen. Independientemente de la fuente, esta citoquina parece funcionar como un amortiguador de reacciones inmunes e inflamatorias (Fortis et al., 1996). En células de infiltración tumoral la IL-10 inhibe la inmunidad y la tolerancia inmune favoreciendo el crecimiento del tumor. La IL-10 es secretada por tumores de modo que permite a las células escapar de los ataques del sistema inmune (Miteva et al., 2014). En ciertos estudios se ha propuesto que el bloqueo de la señalización de IL-10 llevaría a producir inmunidad antitumoral, remarcando el efecto protumorigénico de esta citoquina (Acuner-Ozbabacan et al., 2014). En otros estudios se ha observado que una elevada concentración de IL-10 podría facilitar el desarrollo del cáncer mediante la supresión de expresión de los antígenos del MHC clase I y II y evitando la entrega del antígeno tumoral a los linfocitos T CD8 citotóxicos (Matsuda et al., 1994). En estudios con modelos animales se ha observado efecto antitumorigénico de esta citoquina, ya que al inhibir su producción se produjo un incremento del desarrollo tumoral. Estos efectos aparentemente opuestos se deben a la pleiotropía que caracteriza a esta citoquina, así como a la variedad de lugares en que se produce (AcunerOzbabacan et al., 2014). La aparente incoherencia de los resultados obtenidos refleja el papel dual de la IL-10 como citoquina antiapoptótica (potencialmente promotora del desarrollo del cáncer) y antiangiogénica (potencialmente inhibidora del cáncer). Mediante el estudio con diferentes modelos se han encontrado efectos inmunosupresores e inmunoestimuladores de la IL-10. Puede actuar como mediador negativo entre la inmunidad antitumoral adaptativa e innata. Su expresión en células tumorales ha sido asociada con la expresión incrementada de la molécula HLA de clase Ib (HLA-G), que puede inhibir la actividad citolítica de células NK y CTL. En varios estudios se ha aislado IL-10 de zonas tumorales, asociándolo además con un aumento en los efectos protumorales de otras moléculas como CTLA-4 o COX-2. Sin embargo, también se han encontrado resultados opuestos a estos, en los que al añadir IL-10 se ha observado un incremento de la acción inmune y regresión tumoral. In vivo, la IL-10 puede influir en la progresión y desarrollo del cáncer mediante fenómenos no inmunes relacionados, tales como la angiogénesis, la proliferación celular maligna y la apoptosis (Mocellin, Marincola, & Young, 2005). 63 En muchos estudios realizados sobre la influencia de polimorfismos del gen IL-10 en el riesgo a desarrollar cáncer se ha encontrado asociación positiva. En algunos se han asociado genotipos concretos con baja expresión de IL-10 como un factor de riesgo para el desarrollo y progresión de la enfermedad, mientras que en otros los genotipos o haplotipos analizados se han asociado con niveles de expresión de IL-10 elevados como factor de riesgo. Además, la asociación entre el genotipo de IL-10 y su expresión puede diferenciarse entre tejidos y estados de la enfermedad, así como de estímulos antigénicos y no antigénicos (Howell & Rose-Zerilli, 2006). El alelo G del polimorfismo rs1800896 se ha correlacionado con un incremento en la expresión de IL-10 debido a la elevada afinidad de esta variante alélica por el factor de transcripción Sp1, lo que puede contribuir a elevados niveles de producción de IL-10 (Miteva et al., 2014). En estudios realizados para ciertas enfermedades, incluidas varias neoplasias, se ha descrito una mayor presencia del alelo G en casos que en controles que se ha relacionado con un mayor nivel de expresión de la IL-10. Tanto la sobrexpresión como la deficiencia son probablemente fisiopatológicas y significativas (Trifunovic et al., 2015). El estudio de Miteva y colaboradores (2014) concluye que el SNP -1082A/G del gen IL-10 tiene efecto significativo sobre la progresión de cáncer colorrectal. Ser portador de los genotipos AG y GG, responsables de una mayor producción de IL-10, generaría una elevada transcripción del gen a nivel local y sistémico en pacientes con cáncer colorrectal, llevando a niveles elevados de IL-10 sérico, lo que podría estar asociado con la progresión del tumor. En las últimas décadas se han realizado múltiples estudios que analizan la posible relación entre el desarrollo del cáncer y el rs1800896 con resultados generalmente controvertidos debido a su elevada variabilidad (Tabla V, Anexo 1). En lo que respecta a los estudios caso-control de PCa, se comprobó que el polimorfismo -1082G>A altera la expresión de la interleuquina. De este modo se espera que exista relación entre el desarrollo de la enfermedad y el cambio nucleotídico (McCarron et al., 2002; Turner et al., 1997). Sin embargo, varios estudios muestran ausencia de asociación entre el desarrollo del PCa y el rs1800896 (Faupel-Badger et al., 2008; Kesarwani, Ahirwar, et al., 2009; Michaud et al., 2006; VanCleave et al., 2010; J. Xu et al., 2005; Zabaleta et al., 2008). En dos casos se han analizado haplotipos, con resultados significativos que asocian el alelo A al desarrollo de la enfermedad (Eder et al., 2007; FaupelBadger et al., 2008). En 2002 el equipo de McCarron obtuvo OR significativos de riesgo para el genotipo AA asociado a menor producción de la proteína. Wang y colaboradores (2009) concluyen que el heterocigoto AG ejerce efecto de riesgo frente al homocigoto GG (OR 1,69 (1,10-2,6)) y el homocigoto AA frente a GG presenta un riesgo ligeramente mayor (OR 1,81 (1,11-2,96)), en ambos casos estadísticamente significativos. Por último, en un estudio de 2012 se concluyó que hombres portadores de la variante alélica G tienen menor riesgo de recurrencia de PCa que los individuos AA (Dluzniewski et al., 2012). 1.4.1.4. Interleuquina 17A (IL-17A). La familia de citoquinas IL-17 consta de seis miembros muy semejantes entre sí, que van de la IL-17A a la IL-17F, de acuerdo con el orden en el que fueron descubiertas (Chang & Dong, 2007; Kawaguchi, Adachi, Oda, Kokubu, & Huang, 2004; Pappu, Ramirez-Carrozzi, & Sambandam, 2011). Paralelamente se han descrito cinco receptores (IL-17RA-E) a los que se unen cada uno de los ligandos (Chang & Dong, 2007; Pappu et al., 2011). Muchos estudios se 64 han centrado en la primera de estas citoquinas, la IL-17A o simplemente IL-17, además de en la última, IL-17F, debido a la elevada homología (50%) entre ambas. Por su parte IL-17B, IL17C, IL-17D e IL-17E presentan un nivel de homología bastante menor (16-30%). Los loci que codifican las citoquinas IL-17A e IL-17F, ambos situados en el cromosoma 6, son muy semejantes en su secuencia de aminoácidos, en su estructura molecular, en la transducción de señales y en sus funciones, teniendo ambas la capacidad para inducir quimioquinas relevantes para el reclutamiento y activación de neutrófilos. Ambas se unen a los receptores IL-17RA e IL-17RB mientras que IL-17F también posee la capacidad de unirse a su propio receptor IL17RC (Yanbo Liu et al., 2015; Moseley, Haudenschild, Rose, & Reddi, 2003; Quan et al., 2012; L.-J. Yang et al., 2016). Las citoquinas de la familia IL-17 son producidas por gran variedad de tejidos, entre los que se incluye el tejido prostático, sin embargo, no parecen estar totalmente estudiadas sus funciones en este órgano concreto, aunque se supone que son semejantes a las que llevan a cabo en otros tejidos (Fossiez et al., 1998; Lindén, 2001; Moseley et al., 2003). Estructura molecular y función. La IL-17 es un homodímero con peso molecular de 15 kDa, conocida originalmente como CTLA-8. Es un polipéptido de 155 aminoácidos conservativo en el extremo C-terminal, pero con una variación significativa en la secuencia N-terminal, consistente en 19-23 residuos de aminoácidos relacionados principalmente con la transducción de señal (L. Yang et al., 2016). El receptor de IL-17A está formado por IL-17RA emparejado con IL-17RC, complejo que también actúa como receptor para IL-17F y para el heterodímero IL-17A/F. La afinidad del ligando por la subunidad recíproca aumenta a medida que se produce unión del receptor al ligando. Se cree que IL-17RA podría ser la subunidad de señalización común a todos los miembros de la familia IL-17 (Gaffen, 2009, 2011). La IL-17 señaliza mediante la fosforilación de Act1 (Fig. 32), un adaptador y la ubiquitínligasa caja-U E3 (U-box E3 ubiquitín ligase), que contienen el dominio SEFIR y una uniónTRAF. Asimismo, activa la ruta clásica NF-κB mediante distintas vías, para lo que se requiere tanto Act1 como TRAF6. Además, activa otros factores de transcripción, como IκBζ y C/EBP, así como MAPK y, posiblemente, Pi3K. La actividad señalizadora de IL-17A es, en principio, modesta, aunque aumenta sinérgicamente con varias moléculas como LTα, IFN-γ, IL-1β y, especialmente, con TNF-α. Pese a no conocerse todos los mecanismos de esta sinergia se ha comprobado que un paso importante es la mejora en la estabilidad del ARNm de genes diana de la IL-17 gracias a la actuación sinérgica de la citoquina con las moléculas anteriormente citadas, como es el caso de la IL-6 y CXCL1, cuya transcripción se incrementa al actuar de forma combinada la IL-17 con el TNF-α (Gaffen, 2011). 65 Figura 32. Principales rutas de señalización de IL-17. Mediadas por el complejo IL17R, compuesto por IL-17RA e IL-17RC. Basada en Gaffen (2011). Como se refleja en la figura 33, hay varios factores de transcripción con influencia sobre la regulación de los promotores IL-17A. El factor de transcripción BATF, de la familia AP-1, así como STAT3, NFATc1 y RUNx1, están implicados positivamente en la regulación genética de IL-17A. Por otro lado, hay una serie de factores de transcripción que inhiben, directa o indirectamente, la IL-17A, como son el ROR-γt, que actúa con otros factores como Foxp3, STAT5 y la forma hormonalmente activa de la vitamina D. Tanto TGF-β, mediado por SMAD, como la quinasa IKKα participan a varios niveles en la regulación de la transcripción de IL17A. Todos estos factores de transcripción, regulan a su vez la diferenciación de células Treg y Th17 (Gaffen, 2011; Ichiyama et al., 2011; Ivanov, Zhou, & Littman, 2007; Murugaiyan & Saha, 2009; X.-P. Yang et al., 2011; F. Zhang, Meng, & Strober, 2008). Normalmente la regulación del IL-17A se compara con la de IL-17F, ya que ambos están estrechamente interrelacionados. Entre ambos genes hay una secuencia conservada no codificante cuya cromatina se remodela considerablemente al recibir señales a través de TGF-β e IL-6, lo que parece estar implicado en la regulación de estas citoquinas (Gaffen, 2011). Figura 33. Resumen de la regulación genética de IL-17A a partir de estudios realizados en seres humanos y ratones. Los factores de transcripción actúan sobre los promotores de IL-17A positiva (+) y negativamente (-). Basada en Gaffen SL (2011). 66 La IL-17 es un factor de iniciación temprana de la respuesta secretada únicamente por células T activas que conectan el sistema inmune adaptativo y el innato (N. Wang et al., 2014; L.-J. Yang et al., 2016). Dentro de los distintos tipos de células T, la IL-17 es secretada preferencialmente por las células T colaboradoras CD4+, denominadas Th17, que participan en el control de la respuesta inmune. Además, también puede ser secretada por células T CD8+ y células del sistema inmune innato como células NKT, células inductoras de tejido linfoide o células γδ-T. Las células Th17 llevan a cabo un papel importante contra patógenos extracelulares e intracelulares (Y.-W. Gao, Xu, Xu, Li, & Zhou, 2015; Huppler, Bishu, & Gaffen, 2012; Omrane et al., 2014). Estas células Th17 se originan por la acción de múltiples moléculas desencadenantes de la diferenciación e inducción, entre los que se incluyen TGF-β, IL-6, IL-1β e IL-12, siendo la IL6 y el TGF-β factores esenciales. También es relevante la IL-23, que es esencial para el mantenimiento y actividad de las células Th17. La IL-21, producida mediante diferenciación de células Th17 a partir de IL-6, va a llevar a su vez a la generación de más células Th17 de manera autocrina. Además, la IL-21 induce la expresión del receptor en células Th17 de manera que aumenta su sensibilidad a la estimulación de Th17. Esta diferenciación requiere la expresión del factor ROR-γt dependiente de STAT3. El factor de transducción STAT3 es activado por IL-6, IL-21 e IL-23 y se une coordinadamente a los promotores de IL-17, aumentando su producción, siempre y cuando no esté presente Foxp3 (Fig. 34) (Lv et al., 2015; Murugaiyan & Saha, 2009). Figura 34. Diferenciación de las células Th17 a) Las células Th17 surgen a partir de señales diferenciadoras de IL-1, IL-6 y TNF-α, mientras que la IL-23 es responsable de su estabilización y mantenimiento. Estas células producen IL-17A, IL-17F, IL-17A/F, IL-23, IL-26 y GM-CSF. Basada en Gaffen SL., 2011. b) Diferenciación y estabilización de células Th17. DC: células dendríticas; CT CD4+ naïve: células T CD4+ primitivas. Basada en Murugaiyan G y Saha B (2009). 67 Las células Th17 están estrechamente relacionadas con otras subpoblaciones celulares, como es el caso de las células Treg y las Th1, con las que comparte una elevada plasticidad, ya que las células Th17 y las Treg pueden transformarse las unas en las otras en caso de que sea necesario. Además, ambas tienen la capacidad de transformarse en células Th1. Este proceso de plasticidad tiene distintos niveles de regulación, dependientes de genes de factores de transcripción concretos, como el ROR-γt, considerado el principal regulador de las células Th17. Tanto estas células como las Treg surgen a partir de señales dependientes de TGF-β, un factor relevante en la regulación de IL-17A. La IL-2 inhibe, mediante STAT5, la generación de Th17, pero a su vez tiene un efecto positivo en la activación de células Treg con las que su receptor tiene elevada afinidad. Esta relación entre las células Treg y el IL-2R permite que las células reguladoras anclen la IL-2 y reduzcan el efecto supresor sobre las células Th17. Otra citoquina considerada un factor crucial en la reciprocidad entre Treg/Th17 es la IL-6, que junto con el TGF-β, aumenta la diferenciación de células Th a células Th17. El último eslabón de células T son las células Th1, cuya diferenciación está regulada por IL-17 y a su vez regulan la producción de IL-12. También inhiben la producción de células Th17 mediante IFN-γ. Un esquema sencillo de la diferenciación de las células Th17 se puede observar en la figura 34 a. (Gaffen, 2011). La IL-17 origina la migración de células endoteliales e induce a los fibroblastos a regular positivamente factores pro-angiogénicos como el VEGF, MIP, prostaglandinas y óxido nítrico, relacionados con la angiogénesis y el crecimiento in vivo de las células tumorales (Elkahwaji, 2013). La proliferación celular y angiogénesis se lleva a cabo mediante reclutamiento de neutrófilos que liberan citoquinas inflamatorias, de modo que induce el desarrollo de desórdenes como son los tumores o la inflamación crónica (L.-J. Yang et al., 2016). Los genes estimulados por IL-17 codifican proteínas antimicrobianas, factores de activación de neutrófilos e inductores de la respuesta de fase aguda. Pese a su origen, la IL-17 actúa fundamentalmente en células epiteliales, endoteliales y estromales. Muchos de los efectos mediados por células Th17 se atribuyen a la citoquina IL-17 debido a su elevada producción en células Th17 (Gaffen, 2011). Gen IL-17 (rs2275913). El gen IL-17A está situado en el cromosoma 6 humano, concretamente en la posición 6p12 y está constituido por 3 exones y 2 intrones. El rs2275913 está localizado en la región promotora del gen, en la posición 52186235 del cromosoma, tal y como se muestra en la figura 35 (Espinoza et al., 2011; Ouyang, Kolls, & Zheng, 2008; Sherry et al., 2001), y consiste en un cambio nucleotídico de A por G. 68 Figura 35. Localización del rs2275913 del gen IL-17A en el cromosoma 6. Fuente NCBI (Sherry et al., 2001). Se observa una considerable variabilidad en las frecuencias alélicas de este polimorfismo entre los principales grupos de poblaciones humanas, tal y como se puede observar en la figura 36. De manera global el alelo de menor frecuencia (MAF) para este marcador es el alelo A, que es también el alelo ancestral. Todos los datos de frecuencias alélicas se darán respecto a éste. La población que más difiere de las demás es la población africana, con una frecuencia alélica global de 0,049 para el alelo A. Por el contrario, en el este de Asia se observan las frecuencias más altas con valores que llegan a superar el 50%, como es el caso de la población Han del sur de China y de Xishuangbanna, también en China. En poblaciones de origen europeo se observan frecuencias de alrededor del 40%, mientras que en América la frecuencia se reduce con valores que oscilan entre 0,12 y 0,26. En España se observa una frecuencia alélica media para el alelo A de 0,369, que se sitúa dentro del rango de variación de las poblaciones europeas y del sur de Asia (The 1000 Genomes Project Consortium, 2015). Figura 36. Representación gráfica de la frecuencia del alelo A del rs2275913 en distintas poblaciones humanas. Fuente 1000 Genomes (The 1000 Genomes Project Consortium, 2015). 69 IL-17A y cáncer. Aunque la actividad de la IL-17 es de gran importancia para el correcto funcionamiento de la respuesta inmunitaria, bajo ciertas condiciones, como las que se presentan en el microambiente tumoral, la IL-17 puede favorecer el crecimiento tumoral. Los mediadores inflamatorios que inhiben la producción de IL-17, con sus funciones pro y anti-tumorigénicas, actúan en tándem regulando sus efectos (Lv et al., 2015; Murugaiyan & Saha, 2009). Por otra parte, se ha asociado un exceso de IL-17 con una inflamación anormal, que a su vez estaría implicada en distintas patologías entre las que se encuentra el cáncer, en el que produce tanto crecimiento del tumor como su regresión, dependiendo de ciertas condiciones y factores (Huppler et al., 2012; Murugaiyan & Saha, 2009). En lo que se refiere a la inflamación crónica, a partir de la ruta inflamatoria de la IL-3, que activa las Th17 para la activación de las IL-17A e IL-17F, se ha visto que la IL-17 está estrechamente asociada con el desarrollo de tumores. También tiene relación con la inflamación aguda, en la que la IL-17 es rápidamente secretada y acumulada en el lugar de la inflamación, destruyendo o eliminando carcinógenos externos y protegiendo al individuo del daño (L. Yang et al., 2016). En diversos estudios se ha asociado la IL-17 con el desarrollo de PCa, por su papel clave en respuestas de inmunidad innata y adaptativa, afín a la relación existente entre la inflamación y el desarrollo y progresión de dicho cáncer (De Angulo, Faris, Daniel, Jolly, & DeGraffenried, 2015; N. Wang et al., 2014). Entre los factores que intervienen en el efecto de la IL-17 en el desarrollo del cáncer se encuentran, por ejemplo, el subconjunto de células Th1 secretoras de IFN-γ y CTLs, que interceden en la inmunidad antitumoral; las células Treg y T1, que disminuyen la inmunidad frente a antígenos asociados a tumores y representan el principal obstáculo para el éxito del tratamiento por inmunoterapia; y el subconjunto de células Th17 que podría inducir el crecimiento tumoral, pero también la regresión del tumor, lo que resume la paradoja alrededor de la IL-17 y el desarrollo del cáncer (Murugaiyan & Saha, 2009). La IL-17 tiene actividad protumorigénica ya que colabora en la progresión del tumor, la proliferación de las células tumorales y su supervivencia. Favorece la producción de VEGF y, con ello, aumenta la capacidad de angiogénesis. Está vinculada a múltiples factores, entre los que se encuentra la IL-8, que aumenta la angiogénesis en células endoteliales, incrementa la proliferación y supervivencia de células endoteliales y cancerosas y potencia la migración de estas células. Otro ejemplo de interacciones protumorigénicas se da en macrófagos, en los que la IL-17 actúa sinérgicamente con IL-1β y TNF-α activando quimioquinas neutrófiloespecíficas. Muchos factores con efectos protumorigénicos vinculados con la IL-17 tienen en común la ruta NF-κB, que actúa como puente entre inflamación y cáncer. La supervivencia del tumor depende, de forma destacable, del balance entre quimioquinas, que pueden estimular o inhibir la proliferación y quimiotaxis de las células epiteliales de vasos sanguíneos, dando lugar a la angiogénesis o a efectos antiangiogénicos. Este balance está regulado por varios factores, por ejemplo, el IFN-γ es un inductor de quimioquinas angiostáticas como la CSCL10, mientras que IL-17 tiene la capacidad de alterar dicho equilibrio entre quimioquinas mejorando la actividad angiogénica (Murugaiyan & Saha, 2009). 70 En lo que se refiere a la actividad antitumoral de la IL-17 tienen gran importancia las células Th17 polarizadas, más efectivas que las Th1 en la eliminación del desarrollo de diversos tumores. Estas células Th17-polarizadas también segregan citoquinas asociadas con el fenotipo Th17, como IL-17F, IL-22, IL-21 y CCL20. El efecto de las respuestas mediadas por Th17 depende de IFN-γ. La IL-17 induce la producción de IL-6 y su estimulación induce la producción de IL-12 en macrófagos. Ambas interleuquinas, 6 y 12, inducen CTLs. Además, provoca la maduración de células dendríticas mejorando así la producción de IL-17 en tumores. Por tanto, la IL-17 permite un canal suplementario para que las células inmunes ataquen el interior del cuerpo del tumor (Murugaiyan & Saha, 2009). La IL-17 actúa de manera indirecta incrementando los niveles de otras citoquinas inflamatorias y factores de crecimiento liberados localmente en la próstata. También actúa directamente en células del tumor prostático e induce su crecimiento y metástasis, tal como parece indicar el incremento de ARNm y de expresión de citoquinas como IL-6 e IL-8 en células prostáticas tumorales y en células estromales tratadas in vitro. Se ha observado un incremento del nivel de ARNm de IL-17 en aproximadamente el 58% del tejido prostático maligno. Por otra parte, en más del 50% de los casos de cáncer de próstata se ha observado un incremento de la expresión de IL-17. Existe una relación directa entre el aumento en la expresión de IL-17 en tejidos con cáncer y el aumento del número de células Th17. En cuanto a los receptores de IL17 (IL-17RA e IL-17RC) también muestran una elevada actividad en individuos con cáncer de próstata (De Angulo et al., 2015; Elkahwaji, 2013; Steiner et al., 2003). Entre los distintos tipos de tumores que se han estudiado en relación con el SNP rs2275913 consistente en un cambio de A/G, se encuentran el colorrectal, cervical, esofágico, gástrico, hepatocelular, mama, ovario, leucemia mieloide aguda, toroides, pulmón y vejiga. En ningún estudio de casos-controles se ha analizado el cáncer de próstata y su posible relación con este polimorfismo concreto, pese a haberse estudiado en relación a otros SNPs localizados en el gen de la IL-17A. Los tumores más estudiados en relación al rs2275913 son el cáncer gástrico y el cervical. Los resultados obtenidos, independientemente de la presencia o ausencia de significación estadística, indican en su mayoría un efecto de riesgo del alelo A (MAF) frente al desarrollo de cáncer. Sin embargo, hay cinco estudios en los que los resultados parecen indicar un posible efecto de riesgo del genotipo GG frente al genotipo AA. Por último, en uno de los estudios, con resultado estadísticamente significativo, se observa un efecto de riesgo del heterocigoto (Tabla VI, Anexo 1). La mayor parte de estos estudios se han realizado en población asiática. Hasta la fecha se han realizado pocos estudios en poblaciones caucasoides que relacionen este polimorfismo y la patogénesis del cáncer. El mayor de ellos fue llevado a cabo en población rusa por Kutikhin y colaboradores ( 2014), en el que analizan la influencia de una serie de marcadores, entre los que se incluye el rs2275913, sobre distintos tipos de cáncer. 1.4.1.5. Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF). Estructura molecular y función. El Factor Inhibidor de la Migración de Macrófagos, llamado MIF por sus siglas en inglés (Macrophage Migration Inhibitory Factor), fue una de las primeras citoquinas mediadoras 71 estudiadas, caracterizada inicialmente como una citoquina derivada de células T con capacidad de inhibir la migración de los macrófagos (Bach et al., 2009). Se ha descrito este factor como una citoquina proinflamatoria con capacidad de regular la inflamación y la inmunidad específica e inespecífica al expresarse pleiotrópicamente (Y. Chen et al., 2010; K. L. MeyerSiegler, Iczkowski, & Vera, 2005; Muramaki, Miyake, Yamada, & Hara, 2006). En su forma monomérica MIF está formado por 115 aminoácidos con un peso molecular de 12,5 kDa. Su estructura secundaria consiste en dos α-hélices antiparalelas y seis láminas β plegadas y presenta un elevado grado de similitud con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). La forma activa de MIF consta de tres monómeros de MIF que se alinean formando una molécula homotrimérica (37,5 kDa). El MIF está íntimamente relacionado con la enzima D-dopacromo-tautomerasa (DDT), tanto en términos de secuencia y estructura del gen, como de actividad enzimática, ya que ambas son tautomerasas. Además, los genes DDT y MIF están estrechamente ligados en el cromosoma 22 (Babu, Chetal, & Kumar, 2012; Bach et al., 2009; Meyer-Siegler et al., 2005; Walker, 1976). La función del MIF se ha reevaluado a lo largo del tiempo. En la actualidad se la considera una citoquina pluripotente, con un amplio espectro de funciones relacionadas con el sistema inmune, que se expresa constitutivamente en varios tipos celulares y que actúa de forma paracrina y autocrina (Meyer-Siegler et al., 2005; Muramaki et al., 2006). Además, su actividad catalítica oxidorreductasa es la responsable de algunos de sus efectos biológicos (Hussain et al., 2013). Por lo tanto, actúa principalmente como una proteína proinflamatoria, regulando la inmunidad innata, colaborando en funciones de los macrófagos tales como fagocitosis, adherencia o expansión. Además, actúa como mediador inflamatorio, estimulando la expresión de citoquinas como TNF-α, IL-1 o IL-6 (Babu et al., 2012). Su actividad no se limita a actuar sobre los macrófagos, sino que también es producido por éstos como respuesta a endotoxinas, exotoxinas y citoquinas tales como TNF-α e IFN-γ (Bach et al., 2009). Por lo tanto, este factor regula la función de macrófagos y linfocitos, además de ser un inhibidor de glucocorticoides, es decir, anula la supresión inmune mediada por éstos como parte de su actuación sobre el sistema inmune (Y. Chen et al., 2010). Es una citoquina inducida por glucocorticoides y modula la producción de citoquinas como respuesta a niveles hormonales concretos (Meyer-Siegler et al., 2005). También lleva a cabo un papel relevante en la proliferación celular y la diferenciación, con la capacidad de suprimir la actividad del p53, lo que podría dar lugar a un crecimiento celular incontrolado. Además, puede inhibir ciertas funciones de células inmunes. También se lo vincula con el proceso de angiogénesis tumoral, ya que induce la secreción de factores angiogénicos como VEGF e IL-8 (Babu et al., 2012). Por otra parte, este factor regula genes COX, implicados en la regulación de la proliferación celular y en procesos de inflamación y, además, puede ser estimulado, a su vez, en respuesta a la inhibición de uno de ellos, concretamente el gen COX-2. Así, la forma activa de MIF también regula genes proinflamatorios y de supervivencia celular (Kleemann & Bucala, 2010; MeyerSiegler et al., 2005; Meyer-Siegler, 2001). En cuanto a su relación con las rutas de señalización, el MIF contrarresta la inducción de esteroides, los cuales inducen las fosfatasas MAPK (mitogen-activated protein), siendo este, por lo tanto, un paso esencial en la inhibición de la activación de MAPK (Bach et al., 2009). Además de actuar sobre la ruta MAPK también lo hace con la PI3K, lo que lleva a un incremento en la secreción de los factores angiogénicos bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) y VEGF (Fig. 40) (Babu et al., 2012). 78 El TNF-α como ligando es reconocido por dos receptores, denominados generalmente TNFRI y TNFRII. El TNFRI es expresado ubicuamente por la mayoría de tipos celulares mientras que la expresión del segundo es inducida principalmente en células endoteliales e inmunes. El TNFRI es el principal mediador de las actividades del TNF-α, incluyendo la apoptosis, la proliferación de fibroblastos y la actividad antiviral, y reconoce ambas formas de la molécula TNF-α (soluble y transmembrana). La formación del complejo de receptor y ligando de TFN-α se da mediante la unión de homotrímeros de TNF y de TNFRI y II dando lugar al inicio de la señalización. Al unirse el TNF-α al TNFRII se produce su trimerización, dando lugar a la activación de al menos cuatro rutas de señalización: una ruta proapoptótica inducida por la interacción de la caspasa 8 con FADD (Fas-associated death domain), una plataforma antiapoptótica activada por la cIAP-1 (cellular inhibitor of apoptosis protein-1) y la interacción con el TRAF-2, una ruta de señalización mediada por TRAF-2 y JNK y una ruta inducida por NF-κB (Fig. 41). La unión del complejo TNF-α/TNFRI a proteínas adaptadoras TRADD (TNF receptor associated death domain) activa al TRAF-2 (TNF receptor associated factor 2), lo que representa un punto de integración de señales pro y antiapoptóticas. La activación de TRAF-2 puede estimular dos rutas. Una iniciada por la interacción de TRAF-2 y NIK (NF-κB-inducing kinase), que activa el NF-κB, promoviendo factores de supervivencia como bcl-2 y bcl-XL. La otra ruta activa la cascada ASK 1 (signal regulating kinase) - MKK4 (mitogen activated protein kinase kinase 4) - JNK (Jun N-terminal kinase). Esta última quinasa fosforila la AP-1 dando lugar a la estimulación de la apoptosis (Fig. 42) (Kalliolias & Ivashkiv, 2016; Landskron, De La Fuente, Thuwajit, Thuwajit, & Hermoso, 2014; Qidwai & Khan, 2011; Royuela et al., 2008). Figura 41. Esquema de señalización y bioactividad de TNF. Basado en Kalliolias & Ivashkiv, 2016. 79 Figura 42. Ruta de señalización de TNF-α y su interacción con IL-1. Basado en Royuela et al., 2008. Resumiendo, el TNFRI, activado por ambas formas de TNF-α, tiene un dominio que recluta la proteína adaptadora TRADD. La unión del TNFRI con cualquiera de ambas formas de TNF lleva a la formación de un complejo que activa el NF-κB y las MAPks. Este complejo da lugar a procesos inflamatorios, degeneración tisular, supervivencia y proliferación celular y defensa contra patógenos. Otras opciones de señalización asociadas con la muerte celular también pueden ser activadas por este primer receptor TNFRI. En cambio, el TNFRII es activado, principalmente, por el TNF transmembrana en interacciones entre células. Este receptor recluta el factor TRAF-2 mediante su dominio TRAF, dando lugar a la activación de NF-κB, MAPks y AKT. El TNFRII media principalmente las actividades homeostáticas, como la regeneración tisular, la proliferación celular y la supervivencia. Esta ruta también puede iniciar efectos inflamatorios y defensa contra patógenos (Fig. 41) (Kalliolias & Ivashkiv, 2016). Durante la inflamación crónica ciertas citoquinas como el TNF-α y la IL-6 inducen la generación de radicales libres que dañan el ADN, causando mutaciones potenciales que pueden dar lugar al inicio del tumor. De la misma forma, la agresividad de los tumores también se vincula con las actividades de citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral y la IL-6 (Landskron et al., 2014). Gen TNF-α (rs1799964). El gen TNFA humano está localizado en el cromosoma 6, más concretamente en la posición 6p21.33, en la zona correspondiente a la región del complejo mayor de histocompatibilidad de tipo III (MHC III) (Fig. 43) y está regulado principalmente a nivel transcripcional (NCBI, 2019b; Qidwai & Khan, 2011). 80 Figura 43. Localización del rs1799964 del gen TNFA. Fuente NCBI (Sherry et al., 2001). El polimorfismo rs1799964 consiste en un cambio nucleotídico de C por T en la región promotora del gen, específicamente localizado en la posición 31574531. Se encuentra en la región reguladora ya que es una variante upstream (2kb upstream variant), por lo que puede alterar el nivel de expresión del gen y por lo tanto afectar a los efectos producidos por el TNF, incluida su influencia en el desarrollo de enfermedades (Qidwai & Khan, 2011; Sherry et al., 2001). Se han estudiado diversos SNPs de la región promotora del TNFA en relación al desarrollo del cáncer, ya que este tipo de variaciones en la secuencia de ADN modifican la regulación del gen a nivel transcripcional. Estas modificaciones en la regulación afectan a su vez al desarrollo de enfermedades complejas como el cáncer. Así, la presencia de polimorfismos en la región reguladora afecta a la interacción entre factores de transcripción y los sitios de unión al factor (TFBS, transcription factor-binding site), lo que influye en la expresión genética y en la susceptibilidad a determinadas patologías (Qidwai & Khan, 2011). Este SNP aparece con frecuencias minoritarias para el alelo ancestral (C), tanto a nivel global (0,219) como en las distintas poblaciones mostradas en la figura 44. Los valores más elevados se han encontrado en el Sur de Asia, siendo la población de Bangladesh la que presenta una mayor frecuencia del alelo C (0,436). En Europa las frecuencias obtenidas son menores que en el Sur de Asia, pero más homogéneas, oscilando entre 0,178 y 0,238 en España e Italia respectivamente (The 1000 Genomes Project Consortium, 2015). 81 Figura 44. Representación gráfica de la frecuencia del alelo C del rs1799964 en distintas poblaciones humanas. Fuente 1000 Genomes (The 1000 Genomes Project Consortium, 2015). TNF-α y cáncer. Los procesos infecciosos y la inflamación crónica son puntos de inicio de varios tipos de cáncer, ya que producen moléculas bioactivas que incluyen citoquinas, factores de crecimiento, quimioquinas, señales de supervivencia celular, factores pro-angiogénicos y enzimas que modifican la matriz extracelular. Durante la inflamación crónica las citoquinas pueden inducir la transformación celular, condicionar el equilibrio entre citoquinas pro y antinflamatorias, variar su concentración y la expresión de receptores, dando lugar al desarrollo tumoral (Landskron et al., 2014). Las células tumorales producen moléculas, como las quimioquinas, que actúan como factores de crecimiento o supervivencia, regulan la angiogénesis, determinan el desarrollo metastásico y controlan la infiltración leucocitaria, de modo que interrumpen las respuestas inmunes antitumorales. En varios estudios se ha observado que el epitelio prostático normal produce cantidades relativamente elevadas de quimioquinas angiostáticas y bajos niveles de quimioquinas angiogénicas (Tindall, Hayes, & Petersen, 2010). De entre las citoquinas que actúan como factores de crecimiento destaca el TNF-α. La expresión y acción de TNF-α y sus receptores se han estudiado en muchos tumores, tales como esofágico, folicular de tiroides, ovárico, mama y vejiga. En varios estudios se ha observado que el silenciamiento de este factor lleva al descenso de la proliferación e invasión del cáncer de vejiga. En otro estudio, con cáncer de ovario, se ha visto que el TNF-α estimula la secreción de otras citoquinas con efectos protumorigénicos, por lo que promovería el desarrollo del tumor de forma indirecta (Landskron et al., 2014). Muchos estudios han mostrado que el TNF-α está relacionado con el crecimiento celular del tumor y las interacciones del estroma, que facilitan la invasión tumoral y la metástasis. El TNF-α también puede proporcionar una señal de supervivencia para las células del cáncer y, por lo tanto, se lo considera un factor de “promoción” tumoral (Royuela et al., 2008). Los resultados obtenidos al estudiar los niveles de TNF-α en varias patologías prostáticas, incluido el PCa, son variados y poco concluyentes. Sin embargo, sí se ha asociado el nivel 82 elevado de TNF-α sérico con el grado de PCa, peor pronóstico y resistencia al tratamiento. Esto parece deberse al incremento de proliferación celular y apoptosis, mediados por TNF-α, que a su vez llevarían a un desequilibrio del ciclo celular, todas ellas características vinculadas a pacientes de PCa (Royuela et al., 2008). Se ha comprobado que la reducción en la producción de TNF-α induce el desarrollo del tumor mediante la producción de ROS (reactive oxygen species) y RNS (reactive nitrogen species). Estas moléculas pueden inducir daño en el ADN y así facilitar la tumorigénesis. Por otra parte, como ya se ha comentado anteriormente, la angiogénesis es importante en el desarrollo del cáncer ya que la formación de nuevos vasos sanguíneos aporta nutrientes y oxígeno a las células tumorales. Parece que el TNF-α podría ejercer un doble papel sobre la angiogénesis, actuando como angiostático cuando está presente en grandes cantidades y como angiogénico en pequeños niveles. Así, se ha descrito que bajos niveles de TNF-α incrementan el crecimiento tumoral e inducen la angiogénesis de diversos tumores. Por lo tanto, el TNF-α puede inducir la necrosis tumoral, afectando a la vascularización tumoral e iniciando la apoptosis, pero paradojicamente también puede promover la proliferación celular (Landskron et al., 2014; Royuela et al., 2008). Por lo tanto, el TNF tiene la capacidad de ejercer efectos variados sobre el desarrollo del cáncer, induciendo la carcinogénesis y promoviendo la progresión de tumores ya establecidos. Una vez está desarrollado el tumor, el TNF puede promover la supervivencia y proliferación de células malignas, directamente activando el NF-κB en células tumorales o indirectamente induciendo la producción de citoquinas protumorales como IL-6. Además, el TNF contribuye a la fuga de células tumorales mediante la promoción de la capacidad inmunosupresora de las MDSCs (myeloid-derived suppressor cells) y de las células T reguladoras. Finalmente, el TNF facilita la metástasis tumoral mediante la transición epitelial-mesenquimal e induciendo la síntesis de MMPs (Kalliolias & Ivashkiv, 2016). Se han llevado a cabo muchos estudios de caso-control con polimorfismos de la región promotora de TNF para analizar su posible relación con el desarrollo de múltiples enfermedades, incluido el cáncer (Qidwai & Khan, 2011). El polimorfismo rs1799964 se ha asociado con diversas patologías, en muchos casos asociadas a su vez con el cáncer. Se han encontrado más de 20 estudios de caso-control que analizan la posible relación entre el SNP y distintos tipos de cáncer, entre los que se encuentra el de próstata (Tabla VII, Anexo 1). Únicamente en ocho artículos se observó asociación estadísticamente significativa, pero sus resultados fueron variados ya que dos de ellos señalaban al alelo T como el de riesgo, uno al genotipo heterocigoto y cinco al genotipo CC. Estos estudios estadísticamente significativos incluyen el cáncer de ovario, mama, gástrico, oral, pancreático, cervical y próstata. 1.4.2. PROTEÍNAS DE REPARACIÓN DE ADN. 1.4.2.1. XRCC1 (X-ray repair cross complementing group 1). Estructura molecular y función. Existen diferentes procesos que provocan daños en el ADN. Estos daños van a ser reparados con mayor o menor eficacia por mecanismos de reparación del ADN, que en 83 múltiples estudios se relaciona con el riesgo de padecer diversos tipos de cáncer, entre los que se encuentra el cáncer de próstata (Abdel-Rahman et al., 2000; Geng, Zhang, Zhu, Wang, & Chen, 2009; Goode, Ulrich, & Potter, 2002; Ritchey et al., 2005; Sorour, Talaat, Youssif, & Atta, 2013; Takanami, Nakamura, Kubota, & Horiuchi, 2005; J. Zhang, Dhakal, Lang, & Kadlubar, 2010). Una capacidad reducida de reparación de ADN podría producir inestabilidad genética y carcinogénesis (Goode et al., 2002). En principio la capacidad de reparación del ADN está, hasta cierto punto, determinada genéticamente. Se han llevado a cabo estudios que permiten determinar las principales rutas de reparación, así como la variabilidad interpoblacional existente en la relación entre genes implicados en dichos procesos y el posible desarrollo de cáncer (Abdel-Rahman & El-Zein, 2000; Goode et al., 2002; J. Zhang, Dhakai, Greene, Lang, & Kadlubar, 2010). El XRCC1 (X-ray repair cross complementing group 1), participa en la ruta de reparación BER (Base Excision Repair), una de las rutas de reparación de ADN más importante (Fig. 45). Su función en dicha ruta consiste en actuar como apoyo y estimulador para otras enzimas implicadas en el proceso. La ruta BER comienza con la eliminación de la lesión mediante una enzima ADN-glucosilasa específica, generándose un sitio abásico, llamado AP (apúrico o apirimidínico). Posteriormente, una enzima AP endonucleasa (APE) rompe la cadena el enlace 5’ fosfodiéster en el sitio abásico. A continuación, la ADN-polimerasa-III y otras proteínas, entre las que se encuentra la proteína XRCC1, añaden el nuevo nucleótido al extremo 3'-OH y cortan la base y el residuo de fosfato libres. Finalmente, el complejo ADN-ligasa-III/XRCC1 sella la nueva unión. En apariencia la proteína XRCC1 no desempeña una función enzimática, pero sí como proteína soporte, uniéndose e interactuando con las enzimas citadas anteriormente y parece contribuir a la eficiencia del proceso (Biológicas & Vieira, 2010; Brem & Hall, 2005). Por lo tanto, se supone que la proteína XRCC1 sería una proteína soporte, que reclutaría y posicionaría otros componentes durante la BER e interactuaría con otras enzimas de esta ruta, para que sus formas complejas reparen los lugares AP (Kubota et al., 1996). Figura 45. Pasos de la ruta BER. Basado en Norjmaa, Tulgaa, & Saitoh, 2016. En mamíferos la ruta BER se divide en dos en función del número de nucleótidos sintetizados en el área de escisión. La primera es la ruta BER de nucleótido simple, mientras que la segunda es la de área larga. La ADN polimerasa beta (Polβ) actúa en ambas rutas BER, tanto la de nucleótido simple como la de área larga. En la ruta de área larga la polβ juega un papel esencial ya que produce la síntesis de desplazamiento de hebra y controla el tamaño de la sección eliminada (Dianov, Prasad, Wilson, & Bohr, 1999). La proteína XRCC1 humana tiene tres dominios interactivos y una señal de localización nuclear, además de un sitio de fosforilación para Ck2. El dominio N-terminal (NTD) es en el que se une la Polβ, así como la zona del ADN que se va a reparar. Dos de sus dominios son de 84 tipo BRCT, que pueden discriminar el grado de fosforilación de las proteínas. Estos dominios también están presentes en otras proteínas como BRCA1. Solo es necesaria una pequeña parte del dominio BRCT para la interacción de la XRCC1 y la ADN-ligasa III, sin embargo, esta pequeña zona carece de características (como hélices alfa) presentes en la región equivalente en otras proteínas (Caldecott, 2003; Ladiges, 2006). Gen XRCC1. El gen XRCC1 se encuentra en el cromosoma 19, concretamente en la posición 19q13.31 y contiene 17 exones, que ocupan una longitud de 32 kb. El rs25487 consiste en una transición de G por A en el codón 399 del exón 10. Esta variación es de tipo missense, lo cual implica que se produce un cambio de aminoácido, en este caso de Arginina (alelo G) por Glutamina (alelo A) (Arg399Gln) (Fig. 46). Figura 46. Localización del rs25487 del gen XRCC1. Fuente NCBI (Sherry et al., 2001). Los datos obtenidos a raíz de trabajos relacionados con el polimorfismo Arg399Gln permiten suponer que este cambio de aminoácido puede alterar el fenotipo de la proteína XRCC1, alterando su capacidad de reparación. Es decir, este polimorfismo altera la función normal de la proteína, lo que se asociaría con una deficiencia en la capacidad de reparación de ADN. Este tipo de polimorfismos podrían afectar concretamente a los procesos de reparación por escisión y recombinación. En lo que respecta a la asociación del SNP con la capacidad de reparación de ADN, generalmente se ha asociado el alelo 399Gln con una reducción de dicha capacidad (Abdel-Rahman & El-Zein, 2000; Abdel-Rahman et al., 2000; Ladiges, 2006). La frecuencia del alelo ancestral (G) es mayoritaria en todos los grandes grupos poblacionales (Fig. 47). En África se observan las frecuencias mayores (0,890) mientras que las menores son las del continente europeo (0,634). En la población española estudiada se observa la menor frecuencia de las europeas (0,579) y, por lo tanto, de todas las contabilizadas en la base de datos de 1000 genomas (The 1000 Genomes Project Consortium, 2015). 85 Figura 47. Representación gráfica de la frecuencia del alelo G rs25487 en distintas poblaciones humanas. Fuente 1000 Genomes (The 1000 Genomes Project Consortium, 2015). XRCC1 y cáncer. En diversos estudios se ha sugerido que variaciones en ciertos polimorfismos del gen XRCC1 tienen influencia sobre distintos tipos de cáncer, entre los que se han descrito el colorrectal, mama, próstata o páncreas. Además, también se han tenido en cuenta otras variables no genéticas, como el tabaquismo o la exposición a la radiación como posibles causas del aumento de riesgo de desarrollar la enfermedad (Abdel-Rahman & El-Zein, 2000; Duell, Holly, Bracci, Wiencke, & Kelsey, 2002; Duell et al., 2001). Así mismo, se han relacionado los polimorfismos de genes de reparación de ADN con el efecto de mutágenos ambientales sobre respuestas genotóxicas. Por eso, la capacidad de reparación de ADN constituye un factor de riesgo significativo para el cáncer inducido por el tabaquismo (Abdel-Rahman & El-Zein, 2000). Los resultados obtenidos en los distintos estudios no son concluyentes, lo que hace necesario llevar a cabo nuevos trabajos para asegurar si existe una variabilidad poblacional en la distribución alélica de los polimorfismos del XRCC1, así como en lo que se refiere a la susceptibilidad del cáncer en función de las variantes alélicas y su relación con la función de la proteína XRCC1 (Abdel-Rahman et al., 2000; Duell et al., 2002). El polimorfismo rs25487 produce un cambio de aminoácido que puede alterar la función de la proteína. Se ha asociado el alelo 399Gln con niveles elevados de aditivos de aflatoxinaB1-ADN en tejido placental, aditivos ADN polifenoles en células mononucleares, intercambio de cromatina hermana en linfocitos y mutaciones somáticas de glicoforina A en eritrocitos. Los resultados observados asocian la variante alélica 399Gln con una reducida capacidad de reparación de daño del ADN y por lo tanto a un aumento en la predisposición a desarrollar PCa (J. Zhang, Dhakal, et al., 2010). En varios estudios no se encontró asociación estadísticamente significativa entre el rs25487 y el desarrollo del PCa (Hamano, Matsui, Ohtake, Nakata, & Suzuki, 2008; Hirata et al., 2007; Kuasne et al., 2011; Mittal, Mandal, & Gangwar, 2012; Rybicki et al., 2004; Sorour et al., 2013; Van Gils, Bostick, Stern, & Taylor, 2002). Por el contrario, en el estudio de Ritchey y colaboradores (2005) se encontró asociación estadísticamente significativa entre el riesgo a 86 desarrollar PCa y el genotipo homocigoto GlnGln, mientras que en el de Xu y su equipo (2007) se asoció el genotipo heterocigoto con un incremento significativo del riesgo a desarrollar PCa. 1.4.2.2. ERCC4 (excision repair cross-complementing group 4). Estructura molecular y función. Esta subunidad de endonucleasa catalítica participa en diversas rutas de reparación de ADN, siendo especialmente importante en la ruta NER (nucleotide excision repair). En la actualidad además de este nombre también se la conoce como XPF (xeroderma pigmentosum group F-complementing protein), ya que la deficiencia de esta molécula promueve el desarrollo de la patología denominada xeroderma pigmentoso (Manandhar, Boulware, & Wood, 2015). La ERCC4 o XPF actúa asociada a la ERCC1 formando un complejo, normalmente denominado ERCC1-XPF, que tiene la capacidad de localizar y cortar la región de la cadena de ADN donde se encuentra el daño. Debido a su actividad reconociendo el sitio del ADN dañado su función no se limita únicamente a la ruta NER sino que también participa en la reparación por recombinación de ICLs (interstrand cross linking), así como en la reparación de roturas de doble cadena (DSB, double strand break) (Chu et al., 2013). En los casos en los que las lesiones de ADN no son reparadas, éstas interfieren con procesos básicos y esenciales como la replicación y transcripción del ADN, así como la división celular (Araújo & Wood, 1999). La ruta NER es uno de los sistemas de reparación de ADN más versátiles, que puede reparar un amplio rango de lesiones y en el que participan entre 30 y 40 genes expresados en tejidos proliferativos como la próstata (Hooker, Bonilla, Akereyeni, Ahaghotu, & Kittles, 2008). Este proceso de reparación se produce sobre alteraciones largas, es decir, aquellas que distorsionan áreas amplias de la cadena del ADN (entre 2 y 30 bases). Estas lesiones incluyen daños producidos por radiación ultravioleta (UV) y por compuestos químicos como carcinógenos externos policíclicos o mutágenos químicos como el cisplatino o el tabaco (Agalliu et al., 2010; Araújo & Wood, 1999; Chu et al., 2013; Fagbemi, Orelli, & Schärer, 2011). El mecanismo molecular de la ruta NER tiene dos pasos principales. El primero es el reconocimiento e incisión-escisión de la cadena de ADN donde se encuentra la lesión. El segundo consiste en la síntesis replicativa del ADN, restaurando la cadena hasta obtener una semejante a la original (Fig. 48) (Araújo & Wood, 1999). Al formarse el complejo XPF-ERCC1 se produce el corte de la región dañada en el extremo 5’. Posteriormente las polimerasas de ADN reparan dicha sección junto con otros factores, iniciando la síntesis de un parche con la secuencia correcta copiando la cadena complementaria. Entonces la XPG produce un corte en el extremo 3’ y las ADN ligasas unen la porción de la cadena reparada con la hebra hasta terminar con una doble hélice de ADN perfectamente funcional. La XPG y el complejo XPF-ERCC1 forman un complejo que separa las dos cadenas en la zona del daño, de tal modo que el XPF-ERCC1 se encargará del corte en el extremo 5’ (Fagbemi et al., 2011; Manandhar et al., 2015). El complejo XPF-ERCC1 también procesa las colas 3’ de ADN intermedias que se generan en algunas rutas de reparación de daño de doble cadena (DSB). En este tipo de reparación bicatenaria, el XPF-ERCC1 elimina las terminaciones 3’ no homólogas de algunas roturas bicatenarias durante el proceso final de unión (end-joining). Su participación en la reparación 87 de las DSB se da tanto en la recombinación homóloga (HR) como en la no homóloga (NHEJ, non-homologous DNA end-joiningx) siempre que la sección final contenga zonas de cadena sencilla en el extremo 3’. Además, participa en la reparación de los enlaces cruzados entre cadenas de ADN (Interstrand crosslink, ICL). El XPF-ERCC1 se une a la SLX4 con la que identifica la zona entrecruzada y corta una de las cadenas. A partir de ese punto se replica la secuencia sin entrecruzamiento y se corta y copia la sección correspondiente de la cadena complementaria. Después de la primera escisión la reparación se lleva a cabo mediante la ruta NER y la recombinación homóloga (Dehé & Gaillard, 2017; Fagbemi et al., 2011; Gregg, Robinson, & Niedernhofer, 2011; Manandhar et al., 2015). Figura 48. Resumen de las principales rutas en las que participa el complejo formado por XPF y ERCC1. Las flechas rojas indican cortes de ADN. Las azules indican síntesis de ADN y las verdes síntesis de ARN. Basada en Dehé & Gaillard, 2017. Se ha observado que en la ruta BER (base escision repair) esta nucleasa también puede eliminar un 3’-fosfoglicolato, producido por la actividad de ROS. Por ello se considera que también tiene cierta participación en esta ruta de reparación frente a daños producidos por especies reactivas de oxígeno. Por último, también se ha observado un vínculo entre este complejo y el mantenimiento de los telómeros, relacionándolo por lo tanto con la regulación de su longitud (Manandhar et al., 2015). Las variaciones genéticas en los genes implicados en las vías de reparación del ADN, como el ERCC4, pueden afectar a la capacidad de las enzimas de reparación de ADN codificadas para eliminar eficazmente compuestos o lesiones de ADN. Esto puede aumentar el riesgo de desarrollar cáncer (Agalliu et al., 2010). 94 2.1.1. PERIODO Y ÁREA DE ESTUDIO. La muestra analizada en este estudio se puede dividir en cinco grupos. Los dos primeros grupos, recogidos en el Hospital Arquitecto Marcide de Ferrol, incluyen los 200 primeros casos y controles del análisis y se han recogido durante el año 2011. El tercer grupo pertenece al mismo Hospital, pero se corresponde con muestras de fechas posteriores (2014). El cuarto grupo se recogió en el área sanitaria de Santiago de Compostela y consta de 30 casos. Por último, el quinto grupo pertenece a la zona de Sanxenxo, en el área sanitaria de Pontevedra, y las muestras fueron tomadas en julio de 2016. Todos estos datos se resumen en la tabla 1. Tabla 1. Distribución y periodo de recogida de muestras. Grupo de la muestra Identificación muestras Ferrol1 CA1-CA200; CA250; CA253 Ferrol2 CO1-CO200 Ferrol-Feb/14 CA261-CA320 Santiago de Compostela CA217-CA247 Pontevedra CO201-CO249 La recogida de muestras se llevó a cabo en las tres áreas indicadas en la tabla 1: Ferrol, Santiago de Compostela y Pontevedra. Estas zonas de muestreo delimitan el origen geográfico de la muestra total en la que aparecen tres núcleos como origen mayoritario, tal y como se observa en la figura 51. Figura 51. Distribución geográfica del origen de las muestras. 2.1.2. CRITERIOS DE INCLUSIÓN. La selección de los individuos participantes en este estudio se ha realizado aplicando los siguientes criterios: 95 - Todos los individuos de la muestra son varones gallegos autóctonos hasta la tercera generación. - La edad mínima requerida para formar parte del estudio se estableció en 50 años en el momento de toma de la muestra. - Los casos incluidos se corresponden con individuos que presentan cáncer de próstata primario con ausencia de metástasis. - Los individuos pertenecientes al grupo control son usuarios del Servizo Galego de Saúde (SERGAS) a los que no les ha sido diagnosticada ningún tipo de neoplasia. 2.1.3. CRITERIOS BIOÉTICOS. Este trabajo cumple todos los principios bioéticos establecidos en la Declaración de Helsinki con respecto a investigaciones médicas en seres humanos. Se ha llevado a cabo con la participación voluntaria de hombres en plena posesión de sus facultades mentales. No se ha obtenido beneficio alguno con este estudio y se ha realizado para contribuir al conocimiento sobre esta enfermedad y al bienestar de los pacientes de cáncer de próstata presentes y futuros. Durante el desarrollo del trabajo no se ha causado daño a ninguno de los participantes del estudio. 2.2. Recogida de las muestras. 2.2.1. MUESTRA BIOLÓGICA. El material biológico utilizado en este estudio ha sido sangre venosa total extraída mediante la punción de venas del área de la fosa cubital, almacenada en tubos de vacío con anticoagulante, tal y como se realiza para los análisis de sangre clínicos rutinarios. Una vez extraída la sangre de cada individuo y etiquetado cada tubo para su posterior identificación, éstos fueron almacenados a temperatura de congelación (-18ºC) para evitar la degradación de la muestra. 2.2.2. CUESTIONARIOS. Además del material biológico, para llevar a cabo este trabajo son imprescindibles una serie de datos personales proporcionados por cada participante del estudio. Por un lado, es necesario conocer sus antecedentes familiares, tanto en relación al área geográfica de procedencia como en relación a la enfermedad, para poder aplicar eficazmente los criterios de inclusión. Por otro lado, es importante conocer aspectos sobre hábitos personales y patologías no directamente relacionadas con el cáncer, con el objeto de analizar las posibles interacciones entre estos factores y el perfil genético en relación con el desarrollo de la enfermedad. Todas las cuestiones realizadas se muestran en el cuestionario incluido en el Anexo 2, en el cual se incluye una 96 explicación del proyecto, un formulario de consentimiento para el uso de los datos personales y también un cuadro de anulación en caso de que alguno de los participantes deseara dar de baja dicho consentimiento. En este trabajo no han sido utilizados todos los datos obtenidos mediante el cuestionario. Concretamente, los datos analizados han sido: fecha de nacimiento, altura, peso, PSA, cáncer de próstata y tabaquismo. 2.3. Selección de marcadores genético moleculares. El primer paso en la selección de los marcadores genético moleculares que se han incluido en esta tesis doctoral ha sido la elección, como cuerpo central del trabajo, de la función celular en la que interviene la expresión de los genes en los que están situados dichos marcadores. En este caso se ha seleccionado la inflamación como núcleo de la tesis por ser un proceso altamente relacionado con el cáncer y particularmente con el cáncer de próstata, como se ha detallado previamente en la introducción. En relación a este proceso también se han seleccionado marcadores situados en genes involucrados en la reparación del ADN. Al vincular dos funciones celulares vitales, que a su vez se pueden relacionar con el desarrollo de PCa, se pretende mostrar una imagen más completa del proceso que puede conducir al desarrollo de la enfermedad. A continuación, se llevó a cabo una exhaustiva revisión bibliográfica de artículos publicados que relacionaban SNPs e indels con los procesos de inflamación y reparación de ADN y con el desarrollo de cáncer, específicamente de PCa. Los marcadores seleccionados pueden agruparse en tres grupos: 1. Polimorfismos de los que existe un elevado número de estudios en cáncer de próstata, independientemente de su significación: estos tienen interés debido a la gran cantidad de información disponible, la cual nos permite llevar a cabo un análisis comparativo y epidemiológico completo. El hecho de que haya muchos datos disponibles permite la posibilidad de llevar a cabo estudios comparativos que aporten mayor fiabilidad a las conclusiones alcanzadas. En este grupo se incluyen la IL-1β rs16944, IL-6 rs1800795, la IL-10 rs1800896 y XRCC1 rs25487. 2. Polimorfismos estudiados en otros tumores, pero con pocos o ningún estudio de cáncer de próstata: el interés principal de estos SNPs radica en la novedad de los resultados obtenidos en este estudio. Además, permiten analizar las diferencias existentes entre el desarrollo de distintos tumores en lo que se refiere al marcador y su influencia. Este grupo incluye la IL-1α rs3783553, IL-18 rs187238, IL-17A rs2275913, TNF-α rs1799964 y ERCC4 rs744154. 3. SNPs nuevos o poco estudiados en cáncer: los resultados obtenidos pueden tener un impacto elevado por ser novedosos, aunque la ausencia de datos en otros estudios limita los análisis comparativos, como es el caso del MIF rs2070767. 97 De este modo quedan agrupados todos los marcadores genético moleculares incluidos en este trabajo, siendo un total de 10, de los cuales ocho están implicados en distintas etapas de procesos inflamatorios y dos en rutas de reparación de ADN. En todos los casos, en los marcadores seleccionados la frecuencia del alelo minoritario debe cumplir el criterio de polimorfismo (1%) en la población general o, en su defecto, en la población europea. Además, deben estar perfectamente identificados: pertenencia a la especie humana, ubicación en el genoma, disponibilidad de las frecuencias en distintas poblaciones y conocimiento de la secuencia alrededor del sitio polimórfico. Finalmente, deben estar validados, quedando perfectamente claro que no son artefactos, para lo que se utilizan las bases de datos online dbSNP (Sherry et al., 2001) y 1000 Genomes (The 1000 Genomes Project Consortium, 2015). Además de utilizar estas bases de datos para la validación de cada polimorfismo también se han consultado en busca de otros datos. La dbSNP es una base de datos que posee una completa colección de secuencias de SNPs, identificándolos con su código propio (rs) además de aportar otra información como la frecuencia alélica, la localización en el gen y el cromosoma, las últimas actualizaciones en los datos de cada polimorfismo, información sobre el efecto del cambio nucleotídico en el gen, etc. La información presente en esta base de datos, que a su vez forma parte del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, National Center for Biotechnology Information), se ha utilizado en varios apartados del trabajo. Por otra parte, el proyecto 1000 Genomes pretende generar una base de datos con la que estudiar la variabilidad genética humana. Dado que hoy en día el número de secuencias sigue aumentando, es una base de datos en continua actualización de la que se han extraído los datos de frecuencias poblacionales de este trabajo. 2.4. Extracción de ADN y genotipado. 2.4.1. EXTRACCIÓN DE ADN. El ADN se ha extraído a partir de sangre venosa mediante tres métodos: - Fenol-cloroformo-alcohol-isoamílico (Sambrook, Fritsch, & Maniatis, 1989). - Kit JetQuick (JetQuick® Genomic DNA Purification Kit; Genomed GmbH; Löhne, Alemania). - Kit de purificación Masterpure (MasterPure™ DNA Purification Kit; Epicentre, Illumina; Madison, EEUU). El método de extracción de ADN de fenol-cloroformo-alcohol-isoamílico consta de dos fases principales. En la primera fase el objetivo es extraer el ácido nucleico de su envoltura celular, mediante su lisado por agitación e incubación en un tampón de lisis. A continuación, es necesario degradar la fracción proteica asociada al ADN mediante la adición de proteinasa K. La segunda fase consiste en un tratamiento con fenol-cloroformo-alcohol-isoamílico, 98 mediante el cual se separa el ADN de otros componentes celulares. En esta etapa de la extracción se aprovecha la tendencia hidrofílica de los grupos fosfato del ADN para que éste quede disuelto en la fase acuosa, mientras que las proteínas y los lípidos se disolverán en la fase de solventes orgánicos como son el fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico. La adición de etanol a la fase acuosa provoca la precipitación del ADN, permitiendo su posterior recuperación y su disolución en agua estéril (Sambrook et al., 1989). El método de extracción mediante el kit JetQuick se basa en la utilización de columnas que incorporan membranas de sílica. Los silicatos presentan una elevada afinidad por el ADN en condiciones alcalinas y de elevada concentración salina. Los métodos de purificación de ácidos nucleicos basados en sílica emplean un proceso muy sencillo de unión, lavado y elución. En primer lugar, el ADN se fija a la membrana de sílica utilizando un tampón de elevada concentración salina y pH, mientras que el resto de moléculas atraviesan la membrana separándose del ADN. A continuación, se realiza un lavado de la membrana para eliminar trazas residuales de polisacáridos y proteínas. Finalmente, el ADN se eluye en condiciones de baja concentración salina utilizando tampones de elución o simplemente agua estéril (Vogelstein & Gillespie, 1979). El tercer método utilizado fue el kit de purificación MasterPure. Como en el primer método, se lleva a cabo una fase de lisis celular, seguida por una fase de desalinización (desalting o salting out) que provoca la precipitación de las proteínas celulares (Miller, Dykes, & Polesky, 1988). Mediante una centrifugación se separan estas proteínas precipitadas del ADN que queda en el sobrenadante. Y finalmente, al igual que en el método de fenol-cloroformoalcohol-isoamílico, se realiza una precipitación alcohólica del ADN y su posterior disolución. 2.4.1.1. Protocolo para extracción de ADN a partir de sangre total mediante FenolCloroformo-Isoamílico. Fase 1: Lavado y lisado. 1. Añadir 400 μl de sangre y 800 μl de agua destilada en un microtubo de 1,5 ml y mezclar por inversión. 2. Incubar 10 min a Tª ambiente. 3. Centrifugación a 13000 rpm (16060xg) durante 5 min (microcentrífuga Biofuge-pico, Heraeus, Hanau Alemania). 4. Descartar el sobrenadante. 5. Añadir 1 ml de agua destilada y resuspender, si es necesario con ayuda del vórtex. 6. Centrifugar 5 min a 13000 rpm y descartar el sobrenadante. 7. Añadir 450 μl de DBL (Tris-HCl a pH 7 y 1 M, EDTA-NaOH a pH 8 y 0,5 M, NaCl 5 M. y 50 μl de SDS al 10%). 8. Mezclar hasta disolver el pellet y dejar 1 hora en reposo a Tª ambiente. 9. Añadir 25 μl de proteinasa K (SIGMA-ALDRICH, St. Louis, EEUU) de 10 mg/ml. 10. Incubar a 56ºC toda la noche o a 65ºC 2 horas. 99 Fase 2: Fenol-cloroformo → extracción. 11. Sacar las muestras del baño y colocarlas 5 min en hielo picado. 12. Añadir 600 μl de fenol. Mezclar por inversión 40 veces. 13. Centrifugar 5 min a 13000 rpm en microcentrífuga. 14. Extraer el sobrenadante y pasar a nuevos tubos de 1,5 ml. 15. Añadir 500 μl de cloroformo-isoamílico (24:1) y mezclar 40 veces. 16. Centrifugar 5 min a 13000 rpm. 17. Extraer el sobrenadante a nuevos tubos, con especial cuidado de no arrastrar cloroformo. 18. Añadir 1 ml de etanol absoluto (mantenido a -20ºC) en cada tubo. 19. Dejar entre 15 y 30 min en el congelador, a -20ºC. 20. Descongelar moviendo suavemente, ayudando a la precipitación del ADN. 21. Centrifugar a 13000 rpm durante 5 min. 22. Vaciar el etanol por decantación. 23. Eliminar los restos de etanol: 15 min los tubos boca abajo sobre papel limpio. Después en gradilla boca arriba se deja evaporar el etanol. 24. Resuspender el ADN en 100 μl de agua estéril. Mezclar muy suavemente, asegurándose de que el ovillo se ha despegado de la pared. 25. Incubar a 56ºC toda la noche. 26. Resuspender suavemente con la pipeta. 27. Conservar en el congelador (-20ºC) para largos periodos o a 4ºC si se va a utilizar a corto plazo. 2.4.1.2. Protocolo kit JetQuick para la purificación de ADN a partir de sangre venosa total. 1. Pipetear 200 μl de sangre total en un tubo de 1,5 ml. 2. Añadir 20 μl de proteasa GENOMED (20mg/ml) y mezclar meticulosamente con vórtex o invirtiendo el tubo. 3. Añadir 200 μl del tampón K1 y mezclar. 4. Incubar durante 10 min a 58ºC. 5. Añadir 200 μl de etanol absoluto (Tª ambiente) y mezclar inmediata y meticulosamente para prevenir cualquier precipitación de ácidos nucleicos debida a las elevadas concentraciones de alcohol. 100 6. Montar una columna de micro-spin de JetQuick con un tubo receptor de 2 ml. Añadir la muestra a la columna de micro-spin sin humedecer el borde de la copa micro-spin y centrifugar la muestra durante 1 min a 10300 rpm (10000xg) para que atraviese la membrana de sílice. 7. Descartar el líquido filtrado del tubo receptor, volver a montar la unidad micro-spin con el tubo receptor y lavar la columna de JetQuick aplicando 500 μl de tampón KX reconstituido con etanol y centrifugar durante 1 min a 10300 rpm. 8. Descartar el líquido filtrado del tubo receptor, volver a montar la unidad micro-spin con el tubo receptor y lavar la columna JetQuick aplicando 500 μl de tampón K2 reconstituido con etanol y centrifugar durante 1 min a 10300 rpm. 9. Descartar el líquido filtrado del tubo receptor, volver a montar el micro-spin y el tubo receptor y centrifugar el tubo vacío otra vez durante 1 minuto a 11200 rpm (12000xg) para limpiar la membrana de sílice de cualquier líquido residual. 10. Descartar el tubo receptor e insertar el tubo micro-spin de JetQuick en un tubo nuevo de 1,5 ml, añadir 200 μl de agua precalentada a 70ºC al centro de la membrana, incubar la columna durante 2 min a Tª ambiente y centrifugar 2 min a 11200 rpm. El rendimiento de la extracción puede aumentar un 15% haciendo un segundo paso de elución de los 200 μl de ADN eluido. El volumen del tampón de elución puede ser reducido a 100 µl si se desea obtener una mayor concentración de ADN. 11. Almacenar el ADN eluido en el microtubo de 1.5 ml. Conservar en el congelador (-20ºC) para largos periodos o a 4ºC si se va a utilizar a corto plazo. 2.4.1.3. Protocolo kit MasterPure para la purificación de ADN a partir de sangre venosa total. 1. Añadir 200 μl de sangre en un tubo de 1,5 ml. 2. Añadir 600 μl de “Red Cell Lysis Solution”. Invertir 3 veces para mezclar y golpear el fondo del tubo para suspender cualquier resto de sangre. 3. Incubar a Tª ambiente 5 min y agitar con el vórtex brevemente. Incubar otros 5 min seguidos de otra breve mezcla con el vórtex. 4. Centrifugar 1 min a 13000 rpm (16060xg). 5. Eliminar la mayoría del sobrenadante (dejar unos 25 μl de líquido). Resuspender el pellet con vórtex. 6. Añadir 300 μl de “Tissue and Cell Lysis Solution” pipeteando varias veces. 7. Colocar las muestras en hielo entre 3 y 5 min. 8. Añadir 175 μl de “MPC Protein Precipitation Reagent” a la muestra lisada y mezclar vigorosamente con el vórtex durante 10 s. 9. Centrifugar durante 10 min a 13000 rpm. 101 10. Pasar el sobrenadante a un tubo limpio y descartar el pellet. 11. Añadir 500 μl de isopropanol. Invertir el tubo entre 30 y 40 veces. 12. Centrifugar durante 10 min a 13000 rpm. 13. Eliminar el isopropanol con pipeta, con cuidado de no soltar el pellet. 14. Añadir 200 μl de etanol al 70%, con cuidado de no soltar el pellet, eliminar el etanol con pipeta sin apurar demasiado. Repetir este lavado con otros 200 μl de etanol al 70%, 15. Centrifugar 1 min a 13000 rpm antes de eliminar el etanol. En esta ocasión eliminar el máximo etanol posible sin arrastrar el pellet. 16. Dejar evaporar el etanol. 17. Resuspender el ADN en 70 μl de agua estéril. Conservar en el congelador (-20ºC) para largos periodos o a 4ºC si se va a utilizar a corto plazo. 2.4.2. AMPLIFICACIÓN Y GENOTIPADO. El genotipado se ha llevado a cabo utilizando los servicios del Centro Nacional de Genotipado (CeGen), plataforma tecnológica creada en el año 2003 y que actualmente forma parte de la Plataforma en Red de Recursos Biomoleculares y Bioinformáticos (PPRB2) del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII). El protocolo seguido corresponde al publicado por Oeth y colaboradores (2005). El CeGen recibe las muestras de ADN en placas de 96 pocillos (Fig. 52). Seis de los pocillos de cada placa se entregan vacíos y son usados como controles, tres de ellos se mantendrán vacíos y serán los controles negativos, mientras que los otros tres son los controles positivos, con genotipos conocidos y parentesco de primer grado, es decir, padre, madre e hijo. Figura 52. Plantilla para placa de 96 pocillos. En gris los controles del CeGen. 102 El primer paso de la amplificación se lleva a cabo mediante el uso del robot de puntas fijas Tecan Freedom Evo. Se pasan 2 μl de ADN de las muestras a una placa de 384 pocillos. Las posiciones de los controles de calidad del CeGen, tanto positivos como negativos, se marcan en la parte inferior de la placa. A continuación, ya en las nuevas placas, se le añade la mezcla de PCR (Polymerase Chain Reaction) para la amplificación de ADN (Tabla 2). Esta mezcla se prepara con los reactivos correspondientes a la tecnología Agena Bioscience (antes Sequenom). En primer lugar, se hace una mezcla con los cebadores correspondientes a cada marcador. Para cada diseño suelen amplificarse conjuntamente entre 15 y 36 marcadores, siendo 36 el máximo teórico, por lo que se seleccionan cebadores que actúen de manera eficaz conjuntamente y se diluyen a una concentración de 10X a partir de una concentración de 100X y se mezclan para añadirlos a la mezcla de PCR. Dicha mezcla se dispensa con un volumen fijo de 3 μl por pocillo. Todo este primer proceso se lleva a cabo en la sala de pre-PCR, perfectamente aislada para intentar evitar posibles contaminaciones. Tabla 2. Cantidades y componentes de la mezcla de PCR (Oeth et al., 2005). Reactivo Concentración en 5 μl Volumen (1 reacción) Volumen (384 reacciones)* H2O nanopura NA 1,850 μl 888 μl Tampón PCR (10X) 1,25X 0,625 μl 300 μl MgCl2 (25 mM) 1,625 mM 0,325 μl 156 μl Mezcla dNTP (25 mM)** 500 mM 0,100 μl 48 μl Mezcla cebadores (500 nM de cada uno) 100 nM 1,000 μl 480 μl ADN genómico (5-10 ng/ μl) 5-10 ng/reacción 1,000 μl 480 μl Hotstar Taq® (5U/ μl) 0,5 U/reacción 0,100 μl 48 μl Total 5,000 μl 2400 μl *Volúmenes incluyen un 25% de excedente. **No más de 5 ciclos de descongelación El servicio de genotipado del CeGen utiliza un programa de termociclado fijo, de manera que las peticiones de los clientes deben adaptarse a dicho programa, el cual se detalla a continuación: ➢ 94º C 15 min ➢ 94º C 20 s ➢ 56º C 30 s (45 ciclos) ➢ 72º C 1min ➢ 72º C 3 min ➢ 4º ∞ Tras la PCR, antes de la reacción de extensión, mediante la utilización de una fosfatasa alcalina (SAP, shrimp alcaline phosphatase) se lleva a cabo la desfosforilación de los dNTPs no incorporados, que podrían interferir en la reacción de secuencia. Con este tratamiento de desfosforilación los dNTPs no incorporados se transforman en dNMPs que no interfieren en la extensión. Para ello se realiza una mezcla con los componentes y las cantidades indicadas en la tabla 3. Se añaden 2 μl de la mezcla en cada 5 μl de la reacción de PCR. Las placas se agitan brevemente con vórtex, se centrifugan suavemente y se introducen en el termociclador. 103 Tabla 3. Mezcla de SAP Reactivos Volumen (1 reacción) Volumen (384 reacciones)* H2O Nanopura 1,530 μl 734,4 μl Tampón SAP 10X 0,170 μl 81,6 μl Enzima SAP (10U/ μl) 0,300 μl 144,0 μl Total 2,000 μl 960,0 μl *Los volúmenes incluyen un 25% de excedente El programa de SAP es el siguiente: ➢ 37º C 20 min ➢ 85º C 50 min ➢ 4º C ∞ Los cebadores de extensión se diseñan de tal manera que sean de tamaño progresivamente ascendente, para que los picos resultado del análisis posterior con MALDI-TOF (MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization) no se solapen. Esto se lleva a cabo añadiendo colas para aumentar el peso molecular de los cebadores. Este procedimiento implica un aumento acumulativo de ruido de fondo que complicaría la lectura de los genotipos, por lo que se utiliza mayor concentración de los cebadores de extensión cuanto mayor es la masa de cada uno de ellos. El método general para ajustar la extensión de los cebadores es dividirlos en grupos de mayor masa y en grupos de menor masa. Todos los cebadores incluidos en el grupo de masa elevada presentan el doble de concentración con respecto al grupo de menor masa. La reacción iPLEX (increased Plexing Efficiency and Flexibility) es el siguiente paso en el proceso de genotipado, para lo cual se realiza la mezcla con las condiciones indicadas en la tabla 4 utilizando vórtex y un breve centrifugado final. Tabla 4. Mezcla iPLEX Reactivos Concentración en 9 μl Volumen (1 reacción) Volumen (384 reacciones)** H2O nanopura NA 0,755 μl 362,40 μl Tampón iPLEX (10X) 0,222X 0,200 μl 96,00 μl Mezcla extensión iPLEX 1X 0,200 μl 96,00 μl Mezcla cebadores (7 μM:14 μM)* 0,625 μM:1,25 μM 0,804 μl 385,92 μl Enzima iPLEX 1X 0,041 μl 19,68 μl Total 2,000 μl 960,00 μl *Ambas cantidades ilustran la concentración duplicada de los cebadores de elevada masa respecto a los de baja masa. **Los volúmenes incluyen un 25% de excedentes. 110 Las frecuencias esperadas según el equilibrio Hardy-Weinberg se calculan de la siguiente manera: 𝑓(𝐴𝐴)=𝐴𝐴2·𝑁 𝑓(𝐴𝑎)=(2·𝐴𝐴·𝑎𝑎)·𝑁 𝑓(𝑎𝑎)=𝑎𝑎2·𝑁 En este test se ha aplicado un nivel de significación (α) igual a 0,05, siendo los grados de libertad (g. l.) el número de clases genotípicas menos el número de alelos. Todos los marcadores analizados son dialélicos con tres genotipos posibles, por lo tanto, para todos los análisis realizados los grados de libertad son: 𝑔.𝑙.=𝑛º 𝑐𝑙𝑎𝑠𝑒𝑠 𝑔𝑒𝑛𝑜𝑡í𝑝𝑖𝑐𝑎𝑠−𝑛º 𝑎𝑙𝑒𝑙𝑜𝑠=3 − 2 𝑔.𝑙.=1 Cuando se realizan tests múltiples utilizando el mismo grupo de datos aumenta la probabilidad de cometer un error de Tipo 1 (rechazar la hipótesis nula cuando es cierta). Para corregir este problema en los tests χ2, llevados a cabo para evaluar el equilibrio Hardy-Weinberg en cada uno de los 10 marcadores analizados, hemos utilizado el método de Bonferroni-Sidak para comparaciones multiples (Sidak, 1967) que recalcula el nivel de significación utilizando la siguiente formula: α' = 1 - (1 - α) 1/k Siendo α' = Nivel de significación corregido. α = Nivel de significación original. k = Número de tests. 2.5.1.3. Índice de heterocigosidad esperado. Según Francisco J. Ayala (Ayala & Kiger, 1984) la heterocigosidad es la frecuencia esperada promedio de individuos heterocigotos por locus. Se calcula estimando la frecuencia de los individuos heterocigotos en cada locus asumiendo equilibrio genético y, a continuación, se obtiene la media de estas frecuencias para todos los loci. Este índice permite valorar el grado de polimorfismo de un locus. Estima la probabilidad de que, en un locus único, cualquier par de alelos escogidos al azar sean diferentes entre sí. Su valor oscila entre 0 y 1. Para un locus dialélico: ℎ=1−∑𝑝𝑖2=1−𝑓𝑟(𝐴)2+𝑓𝑟(𝑎)2 Siendo pi la frecuencia alélica Nei y Roychoudhury (1974) desarrollaron una corrección para estimar la heterocigosidad esperada insesgada o diversidad genética, teniendo en cuenta el tamaño muestral. ℎ=2𝑛[1−∑(𝑝)2]/2𝑛−1 Siendo n el tamaño de la muestra. 111 2.5.1.4. Estadístico ts. El estadístico ts, desarrollado por Sokal y Rohlf (1969), es un test de significación de diferencias entre dos porcentajes y se ha utilizado para valorar si hay diferencias estadísticamente significativas entre las frecuencias de casos y controles para cada uno de los dos alelos de cada marcador. 𝑡𝑠=𝑎𝑟𝑐.𝑠𝑒𝑛√𝑝1𝑎−𝑎𝑟𝑐.𝑠𝑒𝑛√𝑝2𝑎 √820,8( 1 2𝑛1+1 2𝑛2) Siendo: p1a y p2a las frecuencias relativas del alelo a en las poblaciones 1 y 2 respectivamente. En este caso la población 1 serían los casos y la población 2 los controles. 2n1 y 2n2 el número total de alelos muestreados en las poblaciones 1 y 2 respectivamente. Para obtener la probabilidad asociada a esta ts se compara con los valores de una tabla de áreas de una curva normal (nivel de significación, α, igual a 0,05), doblando la probabilidad ya que se trata de un test de dos colas. 2.5.2. ANÁLISIS DE PSA. La concentración de Antígeno Prostático Específico (PSA) es una variable cuantitativa, utilizada en procedimientos clínicos como marcador no genético del riesgo a desarrollar PCa. Según los criterios sanitarios establecidos, un valor de concentración de PSA en sangre por encima de 4 ng/μl implica un riesgo que hace necesario un estudio específico de la próstata del paciente. En este caso se ha llevado a cabo un análisis de la posible relación entre los niveles de PSA y el genotipo de los casos, ya que en los controles su valor es, generalmente, inferior a 4. Dicho análisis se ha realizado utilizando el software SPSS. El estudio de la posible relación entre PSA y genotipos se ha hecho a varios niveles y en todos ellos se ha llevado a cabo un análisis descriptivo que incluye: media, mediana y desviación típica. Los niveles en los que se ha estudiado la posible relación son los siguientes: 1. Análisis de relación entre PSA y los tres genotipos posibles independientemente. 2. Análisis de relación entre PSA con punto de corte en su media (10) y los tres genotipos. Cada uno de estos tres análisis sigue los siguientes pasos: - Comprobación del criterio de normalidad, se realiza mediante las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y de Shapiro-Wilk. Si la probabilidad obtenida es mayor que 0,05 cumple el criterio de normalidad y por tanto se realizan pruebas paramétricas. Si la probabilidad obtenida es menor que 0,05 no se puede asumir normalidad en la distribución y por lo tanto se realizan pruebas no paramétricas. - Comprobación del criterio de homocedasticidad o igualdad de varianzas. 112 - Pruebas Paramétricas: o ANOVA de 1 vía: permite explorar la existencia de posibles diferencias en las medias en los distintos grupos mediante contrastes a posteriori. Si se obtiene valor p significativo se pueden llevar a cabo pruebas Post Hoc (análisis múltiples), siendo el más común el de Bonferroni. o t de Student: es utilizada cuando la variable cualitativa tiene solo dos categorías. Permite comparar las medias de la variable continua en dos grupos independientes. ▪ Prueba de Levene: Comprueba la homogeneidad de varianzas y determina cuál es el valor de t de Student que debe escogerse. En caso de que p sea menor que 0,05 se duda de la homogeneidad de las varianzas mientras que en los casos en que el valor p sea mayor que 0,05 se supone que hay homogeneidad en las varianzas. - Pruebas no Paramétricas: o U de Mann-Whitney: Utilizada cuando no se cumple el criterio de normalidad y la variable categórica tiene dos categorías. o Kruskal-Wallis: Utilizada cuando la muestra no cumple el criterio de normalidad y la variable categórica tiene tres o más categorías. 2.5.3. CÁLCULO DE RIESGO. Para evaluar los resultados de los ensayos clínicos se han descrito diversas medidas de asociación, entre las cuales se encuentran el riesgo relativo (RR), el Hazard Ratio (HR) y el Odds Ratio (OR). En ocasiones se ha producido cierta confusión entre los términos de riesgo relativo y Odds Ratio siendo ambos utilizados como equivalentes. El HR tiene en cuenta el efecto temporal, por lo que resulta la forma idónea de valorar el riesgo cuando hay implicada una variable de supervivencia. Se calcula el riesgo en un instante concreto respecto al periodo de tiempo en el que se realiza el estudio, por lo tanto, esta medida de asociación no se utiliza en estudios de caso-control retrospectivos. Los resultados de RR y OR van siempre en la misma dirección, sin embargo, las discrepancias en magnitud entre ambas pueden ser muy significativas ya que los RR pueden variar en función del número de muestras analizadas. Por lo tanto, cuando se utilizan OR como medida de riesgo relativo en estudios de cohortes o en pruebas clínicas aleatorias en los que el efecto de una variable sobre un suceso es elevado, ofrece una sobreestima del RR (Knol, 2012). Las estimas de RR solo pueden derivarse de estudios de cohorte prospectivos, en los cuales un grupo de individuos de la misma población, expuestos y no expuestos a un factor de riesgo determinado, son monitorizados para comprobar en cuáles de ellos se desarrolla la enfermedad objeto de estudio. La posibilidad de ajustar los resultados para variables confusoras es una de las razones de la utilización de los OR en estudios de cohortes o en pruebas clínicas aleatorias. Sin embargo, existen estrategias alternativas para ajustar el riesgo relativo (RR), tales como el método de Mantel-Haenszel o la regresión log-binomial entre otras (Knol, 2012). 113 En los estudios de caso-control no es posible estimar los RR directamente porque la prevalencia del suceso adverso (por ejemplo, PCa) no se suele conocer ya que la relación numérica entre casos y controles es controlada por el investigador. (Clarke et al., 2011; Sackett, Deeks, & Atman, 1996). El cálculo de OR debe utilizarse únicamente en los estudios de casocontrol y en análisis de regresión logística ya que proporcionan las estimas más fiables de riesgo relativo (Deeks, 1998). En conclusión, en los estudios retrospectivos comparativos como el que se ha llevado a cabo en este trabajo, el posible riesgo a desarrollar una enfermedad asociado a poseer alguna característica, como un genotipo concreto, se evalúa mediante el cálculo de Odds Ratio (razón de probabilidades). 2.5.3.1. Odds Ratio. Para aplicar esta razón se analizan dos muestras que se corresponden con los sujetos en los que ocurre un suceso y los sujetos en los que no ocurre. Se estima para ambos grupos la proporción de sujetos que presentan el factor cuya asociación se investiga. En nuestro caso, el Odds Ratio relaciona la probabilidad de que se desarrolle cáncer de próstata en los individuos portadores de un genotipo(s) frente a la probabilidad de que esto ocurra en portadores de otro genotipo(s) (Tabla 5a). Los valores obtenidos oscilan entre 0 e ∞. Un valor de 1 implica que la probabilidad de desarrollar PCa es la misma independientemente de los genotipos comparados (Tabla 5b). Tabla 5a. Descripción de OR mediante una tabla de contingencia Casos (PCa) Controles (No PCa) Genotipo A a b Genotipo B c d Total de Casos Total de NO Casos N (total) 𝑂𝑅=𝑎𝑏 ⁄ 𝑐𝑑 ⁄=𝑃𝑟𝑜𝑏𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑃𝐶𝑎 𝑒𝑛 𝑔𝑒𝑛𝑜𝑡𝑖𝑝𝑜 𝐴 𝑃𝑟𝑜𝑏𝑎𝑏𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑃𝐶𝑎 𝑒𝑛 𝑔𝑒𝑛𝑜𝑡𝑖𝑝𝑜 𝐵 Tabla 5b. Interpretación de los resultados del cálculo de OR OR > 1 Asociación positiva Factor de riesgo OR = 1 No asociación OR < 1 Asociación negativa Factor protector 2.5.3.2. Cálculo de la significación estadística. Se han aplicado dos métodos estadísticos diferentes para cuantificar la bondad del ajuste del análisis de OR. 114 2.5.3.2.1 Intervalos de Confianza (95%). Se han calculado intervalos de confianza (IC) del 95% utilizando la siguiente fórmula (Piedrola Gil, 2001). 𝐼𝐶=𝑂𝑅(1±𝑍𝜒ℎ𝑚 ⁄) Siendo χhm la χ de Haenszel-Mantel: 𝜒ℎ𝑚=√(𝑁−1)·(𝑎·𝑑−𝑏·𝑐)2 (𝑎+𝑏)·(𝑐+𝑑)·(𝑎+𝑐)·(𝑏+𝑑) Siendo Z la constante dependiente del porcentaje, que para un intervalo de confianza al 95% tiene un valor de 1,96. Se considera una asociación estadísticamente significativa en aquellos casos en los que el valor de 1 no se encuentre dentro del intervalo. El valor exacto del OR calculado se encontrará dentro del propio intervalo, que será más reducido cuanto mayor sea el tamaño muestral (Piedrola Gil, 2001). 2.5.3.2.2. Test χ2. Permite valorar la significación de una relación sin cuantificarla. Su valor será mayor cuanta mayor sea la relación entre las variables y menor cuanto más cerca se esté de la ausencia de relación entre variables. Aquellos valores de χ2 asociados a la tabla de contingencia (Tablas 6 a y b), a partir de la cual se calculan los OR, cuyo valor p se encuentra por debajo del nivel de significación 0,05 indican una asociación estadísticamente significativa entre las variables analizadas. Tabla 6a. Tabla de contingencia de observados. Casos (PCa) Controles (No PCa) Genotipo A a b a+b Genotipo B c d c+d a+c b+d N Tabla 6b. Tabla de contingencia de esperados. Casos (PCa) Controles (No PCa) Genotipo A [(a+c)*(a+b)]/N [(b+d)*(a+b)]/N Genotipo B [(a+c)*(c+d)]/N [(b+d)*(c+d)]/N 𝜒2=∑(𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜𝑠−𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠)2 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 115 2.5.3.3. Ajuste de los Odds Ratio. Para evaluar si algún otro factor puede actuar como variable confusora en el análisis de asociación entre el genotipo y el riesgo a desarrollar PCa, hemos utilizado la metodología de Mantel-Haenszel para calcular las OR ajustadas usando como variables de ajuste edad, consumo de tabaco e IMC (Mantel & Haenszel, 1959; Miettinen, 1976). 2.5.4. MODELOS GENÉTICOS. El cálculo de OR se ha llevado a cabo aplicando diferentes modelos genéticos que tratan de plasmar la naturaleza de la interacción entre los marcadores genéticos y el desarrollo del PCa (Dorak, 2017; Horita & Kaneko, 2015) Normalmente, los estudios caso-control manejan solo dos grupos, tratamiento/control o expuesto/no expuesto. En contraste, los estudios de asociación genética tienen un mínimo de tres grupos (genotipos), y deben ser agrupados para su comparación de manera que reflejan la forma en que los diferentes genotipos afectan al riesgo de desarrollar la enfermedad. Esta dicotomización de los tres grupos se realiza aplicando diferentes modelos genéticos de herencia que tratan de plasmar la naturaleza de la relación entre genotipo y enfermedad (Attia, Thakkinstian, & D’Este, 2003; Dorak, 2017; Horita & Kaneko, 2015; Lewis, 2002) 2.5.4.1. Modelo dominante-recesivo: Asumiendo un locus con dos alelos, A y a, este modelo analiza una asociación genética con un alelo dominante y uno recesivo. En este modelo la presencia de una única copia del alelo dominante determina la existencia de dos genotipos asociados a un riesgo equivalente frente a un genotipo de riesgo diferente. Si el alelo dominante es el a los genotipos de riesgo equivalente serían aa y Aa, frente a un genotipo de riesgo diferente (AA). En este caso para el cálculo del OR se aísla el homocigoto recesivo, frente a los dos genotipos portadores del alelo dominante. 𝑂𝑅=𝐴𝐴/(𝐴𝑎+𝑎𝑎) 𝑂𝑅=(𝐴𝑎+𝑎𝑎)/𝐴𝐴 Si el alelo dominante es el A, la presencia de una única copia de este alelo determina la existencia de dos genotipos asociados a un riesgo equivalente, frente a un genotipo de riesgo diferente. Los grupos que se comparan en este caso para el cálculo del OR son la combinación del heterocigoto y la variante homocigótica AA, frente al genotipo homocigoto aa. 𝑂𝑅=(𝐴𝑎+𝐴𝐴)/𝑎𝑎 𝑂𝑅=𝑎𝑎/(𝐴𝑎+𝐴𝐴) 116 2.5.4.2. Modelo sobredominante. Se analiza una asociación genética basada en la ventaja/desventaja del heterocigoto frente a los dos homocigotos. Por lo tanto, en este caso se comparan ambos homocigotos agrupados respecto al heterocigoto. 𝑂𝑅=(𝐴𝐴+𝑎𝑎)/𝐴𝑎 𝑂𝑅=𝐴𝑎/(𝐴𝐴+𝑎𝑎) 2.5.4.3. Modelo codominante. El modelo codominante se corresponde a aquel en el cual el riesgo conferido por el heterocigoto Aa se sitúa entre el riesgo del homocigoto AA y del homocigoto aa. Los OR en este caso se calcularían por separado para cada una de las tres comparaciones posibles de genotipos: 𝑂𝑅=𝐴𝐴/𝐴𝑎 𝑂𝑅=𝐴𝐴/𝑎𝑎 𝑂𝑅=𝐴𝑎/𝑎𝑎 Dentro de este modelo se podrían incluir los modelos aditivo y multiplicativo, en los cuales el riesgo de cada genotipo se relacionaría del siguiente modo (Clarke et al., 2011): Aditivo: 𝐴𝐴=𝑓0;𝐴𝑎=𝑓0·𝛾;𝑎𝑎=𝑓0·2·𝛾 Multiplicativo: 𝐴𝐴=𝑓0;𝐴𝑎=𝑓0·𝛾;𝑎𝑎=𝑓0·𝛾2 Siendo a el alelo de riesgo, f0 el riesgo basal asociado al genotipo AA y γ el parámetro de riesgo asociado al alelo a, con valores de γ mayores que 1. 2.5.4.4. Modelo alélico. Analiza el impacto de cada alelo individualmente y su resultado es equivalente al modelo multiplicativo (Horita & Kaneko, 2015). En este caso los OR se calculan utilizando las frecuencias absolutas de cada alelo en casos y controles 𝑂𝑅=𝐴/𝑎 𝑂𝑅=𝐴/𝑎 Siendo: 𝐴=2𝐴𝐴+𝐴𝑎 y 𝑎=2𝑎𝑎+𝐴𝑎 De todas maneras, hay que tener en cuenta que estos modelos fueron originalmente desarrollados para el análisis de enfermedades de herencia mendeliana simple y por lo tanto pueden resultar demasiado sencillos para el estudio de enfermedades complejas influenciadas por la variación en múltiples loci (García-Closas, Jacobs, Kraft, & Chatterjee, 2011). En este sentido el modelo codominante es el más informativo a la hora de detectar asociaciones cuando, como ocurre habitualmente, no se conoce el modelo de herencia (Lettre, Lange, & Hirschhorn, 2007). En este caso, para evaluar cuál de los modelos genéticos se ajusta mejor a los resultados obtenidos el método más efectivo es calcular los OR entre los tres genotipos y observar cómo se relacionan entre sí los riesgos asociados a cada uno de ellos. 117 2.5.5. ESTRATIFICACIÓN POR VARIABLES. Una vez comprobado que los OR originales y los ajustados no presentan diferencias apreciables para cada marcador, además de estudiar la muestra a nivel global, se han hecho análisis estratificados en función de tres variables: edad, índice de masa corporal y tabaquismo. Se han calculado las medias de cada una de estas variables en casos y controles y se han comparado utilizando un test-t (Altman, 1991) para evaluar la homogeneidad de los 2 grupos de la muestra con respecto a dichas variables. 2.5.5.1 Variables analizadas. 2.5.5.1.1. Edad. La edad se ha calculado a partir de dos fórmulas diferentes para casos y controles. En los casos se ha hecho el cálculo utilizando la fecha en que se diagnosticó la enfermedad. En los controles ese cálculo se realizó utilizando la fecha del último contacto, que se corresponde con el último momento conocido en que los varones no tenían cáncer de próstata. En el programa estadístico Microsoft Excel (2010) no se incluye el comando Edad, por lo que se ha creado el siguiente: 𝑒𝑑𝑎𝑑=𝑆𝐼𝐹𝐸𝐶𝐻𝐴(𝑓𝑒𝑐ℎ𝑎𝑛𝑎𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜;𝑓𝑒𝑐ℎ𝑎𝑎𝑐𝑡𝑢𝑎𝑙;y) De esta manera se ha llevado a cabo el cálculo de la edad de forma exacta en años (y) para todos los individuos de la muestra, teniendo en cuenta que el valor “fecha actual” es diferente en casos y controles, tal y como se explicó anteriormente. 2.5.5.1.2. Índice de Masa Corporal (IMC). Es una medida ampliamente utilizada para indicar el estado nutricional en adultos y se calcula a partir de la altura y el peso de cada individuo. La fórmula utilizada es la establecida por la Organización Mundial de la Salud (World Health Organization, 2019d): 𝐼𝑀𝐶= 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑛 𝑘𝑔 (𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑒𝑛 𝑚)2 Dicha organización establece una clasificación global para asociar el estado nutricional del individuo con el IMC calculado, tal y como se muestra en la tabla 7. 118 Tabla 7. Clasificación del estado nutricional en función del IMC (OMS) Clasificación IMC (kg/m2) Bajo peso <18,50 Delgadez severa <16,00 Delgadez moderada 16,00 – 16,99 Delgadez leve 17,00 – 18,49 Normal 18,50 – 24,99 Sobrepeso ≥ 25,00 Preobesidad 25,00 – 29,99 Obesidad ≥ 30 Obesidad leve 30,00 – 34,99 Obesidad media 35,00 – 39,99 Obesidad mórbida ≥ 40 Los rangos de IMC descritos en la tabla 6 se basan en el efecto potencial del exceso de grasa corporal sobre diversas enfermedades. El IMC fue desarrollado como un indicador de riesgo de patologías tales como enfermedades cardiovasculares, elevada presión arterial, osteoartritis, algunos cánceres y diabetes. Como cualquier otra medida, el IMC no es perfecto ya que solo depende del peso y la altura, y no tiene en cuenta diferentes niveles de adiposidad basados en edad, actividad física y género. Por esta razón en algunos casos puede sobreestimarse la adiposidad y en otros subestimarse. En adultos los valores son, teóricamente, independientes de edad y género. Sin embargo, en la población estudiada, todos ellos varones de más de 50 años, se ha observado una frecuencia muy inferior de individuos de bajo peso comparado con los individuos de sobrepeso, independientemente de que sean casos o controles. Esto podría deberse al sedentarismo asociado a la jubilación, a un tipo de vida semejante entre los varones del rango de edad estudiado en esta zona geográfica (alimentación y clima semejantes, condiciones físicas comparables, etc) o al supuesto de que a partir de cierta edad se produce, generalmente, un aumento de tejido adiposo y con él un incremento de IMC. En cualquier caso, para el análisis de esta variable por intervalos se han agrupado los individuos de bajo peso y de normopeso de tal manera que es posible comparar ese grupo con los de sobrepeso y obesidad. 2.5.5.1.3. Tabaquismo. El consumo tabáquico se ha cuantificado mediante pack-years, un índice ampliamente utilizado que establece una relación entre la cantidad de tabaco consumido y el tiempo durante el cual se ha consumido dicho tabaco (National Cancer Institute, 2019b; Prignot, 1987). 𝑝𝑎𝑐𝑘−𝑦𝑒𝑎𝑟𝑠=(𝑛º𝑐𝑖𝑔𝑎𝑟𝑟𝑖𝑙𝑙𝑜𝑠𝑑í𝑎 ⁄·𝑎ñ𝑜𝑠 𝑓𝑢𝑚𝑎𝑛𝑑𝑜)/20 119 2.5.5.2. Análisis de estratificación. La estratificación consistió en el establecimiento de intervalos para cada variable que permitan caracterizar la naturaleza y magnitud de la interacción entre genotipo y desarrollo de PCa. Los OR obtenidos, así como su significación estadística, nos permiten detectar los rangos de mayor impacto respecto al desarrollo del PCa. El primer paso consistió en el establecimiento de criterios comunes para todos los marcadores a la hora de establecer los intervalos de la estratificación. Así, para la edad se ha utilizado tanto la media de edad de la muestra, como algunos intervalos comúnmente utilizados en la bibliografía. En cuanto al IMC se ha usado la media de la muestra y la estratificación estandarizada por la OMS, aunque debido a las características concretas de los varones analizados, el bajo-peso y el normo-peso se han agrupado juntos. En el caso del tabaquismo, por desgracia, no se aplica un criterio homogéneo de clasificación en los trabajos publicados en la literatura científica. En muchos casos solo se establece la diferencia entre fumadores y no fumadores, mientras que, en otras ocasiones, en los que se cuantifica la intensidad del consumo tabáquico, los criterios de clasificación son muy heterogéneos. Teniendo esto en mente, en este trabajo se han aplicado algunas de las clasificaciones más utilizadas en el estudio del cáncer (World Health Organization, 2004). Posteriormente se llevó a cabo el cálculo de OR dicotómicas utilizando diferentes puntos de corte a lo largo de la distribución de cada variable. Por ejemplo, para la edad se calculó el riesgo vinculado a cada año, comparando todos aquellos individuos que se encontraban por encima y por debajo de dicha edad. De este modo se pueden localizar los puntos de efecto máximo y mínimo, así como la evolución del efecto del marcador en función de las variables analizadas en lo que se refiere al desarrollo de PCa. Este estudio de estratificación se ha representado mediante gráficas de dispersión, en las que cada una de las líneas corresponde a un modelo genético y cada punto (representado con triángulos, cuadrados, círculos y asteriscos) a un valor de OR, tal y como se observa en la figura 57. En cada uno de los marcadores analizados se ha realizado la progresión ascendente y descendente de cada variable, con los modelos genéticos más representativos, generalmente los codominantes y excepcionalmente otro modelo de especial interés. En todas ellas el eje de abscisas se corresponde con las variables analizadas mientras que el de ordenadas es siempre el eje correspondiente a los OR calculados. Además, la línea horizontal puntuada indica el nivel de OR = 1, es decir, el valor de neutralidad. En este manuscrito no se incluyen todas las progresiones realizadas, sino únicamente aquellas que aportan información concreta y representativa del comportamiento del marcador. Figura 57. Ejemplo de evolución del riesgo a desarrollar cáncer de próstata con el aumento de la variable. 222 Chen, Y., Zhang, X., Niu, X., Xin, D., Zhao, W., Na, Y., & Mao, Z. (2010). Macrophage migration inhibitory factor is a direct target of HBP1-mediated transcriptional repression that is overexpressed in prostate cancer. Oncogene, 29(21), 3067–3078. https://doi.org/10.1038/onc.2010.97 Cho, M.-L., Jung, Y.-O., Moon, Y.-M., Min, S.-Y., Yoon, C.-H., Lee, S.-H., … Kim, H.-Y. (2006). 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Escamosas China 235 326 34,04 32,67 Ins protección Ins/Del 1,35 (0,95-1,93) (Huang et al., 2015) Ins/Del riesgo Ins/Ins 0,48 (0,25-0,95) Colorrectal China (Han) 339 313 65,5 62,5 No asociación Ins/Del 0,96 (0,69-1,34) (Yan et al., 2015) Ins/Ins 0,71 (0,43-1,16) Endometrio China 272 294 67,1 32,9 No asociación Ins/Del 0,95 (0,66-1,35) (Yu et al., 2016) Ins/Ins 0,56 (0,52-0,96) Epitelio ovárico China 301 240 69,4 62,1 Ins Protección Ins/Del 0,74 (0,51-1,06) (Zhang et al., 2014) Significativo Ins/Ins 0,52 (0,30-0,90) Gástrico China (Han) 207 381 68,1 62,6 Ins/Ins protección Ins/Del 0,91 (0,64-1,30) (Zeng et al., 2014) Significativo Ins/Ins 0,48 (0,26-0,90) Hepatocelular China (Han) 1477 1673 67,03 29,11 Ins protección Ins/Del 0,79 (0,68-0,92) (Gao et al., 2009) Significativo Ins/Ins 0,62 (0,49-0,78) Hepatocelular + HBV China 1012 1021 33,84 64,89 No asociación Ins/Del 0,98 (0,88-1,08) (Du et al., 2014) Ins/Ins 1,09 (0,79-1,49) Nasofaríngeo China (Han) 248 296 67,3 58,8 Del protección Ins/Del 0,76 (0,53-1,10) (Yang et al., 2011) Significativo Del/Del 0,47 (0,28-0,80) xviii Tabla I (continuación). Resumen de estudios de asociación caso-control entre IL-1α rs3783553 y cáncer. Cáncer Población N casos N controles % Alelo Del Efecto OR (IC 95%) Referencia Casos Controles Cervical China (Han) 319 424 69,9 62,1 Ins/Ins protección Ins/Del 0,74 (0,55-1,00) (Pu et al., 2014) Oral céls. escamosas + HPV EEUU 325 335 Del/Del riesgo (Zhang et al., 2015) Significativo Del/Del 1,60 (1,20-2,20) Papilar de Tiroides China 273 509 65,2 65,2 No asociación Ins/Del 1,03 (0,75-1,40) (Gao et al., 2014) Ins/Ins 0,98 (0,59-1,61) Próstata China (Han) 131 229 Del protección Ins 0,56 (0,40-0,79) (Liao et al., 2014) Significativo (Del/Del)/Ins 0,48 (0,31-0,74) Próstata Irán 150 155 34,3 25,5 Del riesgo Ins/Del 1,44 (0,90-2,30) (Hashemi et al., 2018) Significativo Del/Del 3,01 (1,17-7,76) Tabla II. Resumen de estudios de asociación caso-control entre IL-1B rs16944 y cáncer. Cáncer Población N casos N controles % Alelo A Efecto OR (IC 95%) Referencia Casos Controles Cervical de útero + HPV India (Bengal) 110 107 66 51 A riesgo 1,87 (1,01-3,44) (Dutta et al., 2015) Modelo desconocido Esofágico China 380 380 59,47 48,03 AG y AA protección AG/GG 0,68 (0,48-0,95) (Zheng et al., 2013) Significativo AG+AA/GG 0,71 (0,510,99) Gástrico + H. pylori Caucasoides 366 429 42,08 30,07 AG y AA riesgo AA 2,60 (1,70-3,90) (El-Omar et al., 2000) Significativo AG 1,80 (1,30-2,40) Gástrico Portugal 152 218 39,2 34,2 A riesgo AG 2 (1,2-3,1) (Machado et al., 2001) Significativo AA 1,1 (0,6-2,2) xix Tabla II (continuación). Resumen de estudios de asociación caso-control entre IL-1B rs16944 y cáncer. Cáncer Población N casos N controles % Alelo A Efecto OR (IC 95%) Referencia Casos Controles Gástrico Portugal 287 306 38,85 34,15 A riesgo AG+AA 1,8 (1,3-2,5) (Machado et al., 2003) Significativo GG referencia Gástrico China 220 230 44,5 46,5 No asociación AG 0,76 (0,49-1,16) (Wu et al., 2003) AA 0,88 (0,52-1,51) Gástrico China 250 300 46,2 50,5 No asociación AG 0,70 (0,47-1,06) (Lu et al., 2005) AA 0,72 (0,44-1,20) Gástrico Italia 86 + 98 146 + 216 34,88 + 32,14 31,51 + 58,8 No asociación (Perri et al., 2005) Hepatocelular + HPV Tailandia 46 90 40,22 52,78 No asociación (Hirankarn et al., 2006) Leucemia mieloide aguda China 383 300 48,3 49 No asociación AA 0,95 (0,62-1,45) (Wang et al., 2017) AG 1,02 (0,71-1,47) Leucemia mieloide crónica China 267 344 49,1 50,6 No asociación GG 1,13 (0,72-1,77) (Zhang et al., 2018) CT 1,15 (0,77-1,70) Mama Caucasoides 144 263 32,99 40,49 No asociación (Smith et al., 2004) Mama Caucasoides 269 227 32,71 36,78 No asociación AG 0,7 (0,5-1,1) (Hefler et al., 2005) AA 0,8 (0,4-1,4) Mama China 365 631 50,96 44,61 A riesgo AG/GG 1,20 (0,86-1,67) (Jiyong Liu et al., 2006) Significativo AG+AA/GG 1,36 (1,00-1,85) Mama India 200 200 65,75 64 No asociación A/G 0,93 (0,69-1,24) (Pooja et al., 2012) AA/GG+AG 0,78 (0,53-1,16) Mama Afroamericanas 213 208 55,9 53,6 No asociación AG 1,65 (0,97-2,83 (Gong et al., 2013) GG/AG 1,44 (0,87-2,39) Mama Americanas europeas 141 146 43,26 29,8 A y A riesgo AG 1,54 (0,91-2,61) (Gong et al., 2013) Significativo AA 3,58 (1,58-8,14) xx Tabla II (continuación). Resumen de estudios de asociación caso-control entre IL-1B rs16944 y cáncer. Cáncer Población N casos N controles % Alelo A Efecto OR (IC 95%) Referencia Casos Controles Mama China 530 628 47,55 50 AA y AG protección AG/GG 0,60 (0,41-0,90) (Zuo et al., 2018) Significativo GG/AG+AA 0,67 (0,46-0,97) Ovario Caucasoides 147 129 86,2 84,2 No asociación GG 0,99 (0,75-1,31) AG 0,82 (0,48-1,41) (Braicu et al., 2007) AA 1,06 (0,88-1,28) Piel Caucasoides 528 529 31,2 34,3 No asociación AA/GG 0,78 (0,52-1,18) (Wilkening et al., 2006) AG/GG 0,95 (0,73-1,23) Próstata Caucasoides 247 263 33,6 40,49 No asociación (McCarron et al., 2002) Próstata EEUU (mezcla) 473 607 32,35 36,57 No asociación AG 0,86 (0,66-1,12) (Michaud et al., 2006) AA 0,80 (0,54-1,20) Próstata Caucasoides 477 444 34,38 30,86 No asociación AA 0,90 (0,59-1,39) (Zabaleta et al., 2008) AG 1,07 (0,80-1,42) Próstata Afroamericanos 67 129 57,46 50 No asociación AA 1,71 (0,77-3,82) (Zabaleta et al., 2008) AG 1,39 (0,65-2,99) Próstata EEUU 193 197 No asociación AA+AG/GG 1,12 (0,70-1,80) (Zhang et al., 2010) Próstata Caucasoides 78 259 48,1 52,5 No asociación (Ianni et al., 2013) Próstata Turquía 71 76 45,7 44 AG protección AG 0,34 (0,16-0,74) (Yencilek et al., 2015) Significativo AA 1,48 (0,57-3,84) Pulmón Japón 462 379 39,5 43,7 No asociación AA 0,73 (0,50-1,07) (Kiyohara et al., 2014) AG 0,84 (0,62-1,14) Pulmón EEUU (mezcla) 625 625 30,4 35,28 A protección AG/GG 0,74 (0,58-0,94) (Eaton et al., 2018) Significativo AA/GG 0,71 (0,50-1,01) xxi Tabla III. Resumen de estudios de estudios caso-control entre IL-18 rs187238 y cáncer. Cáncer Población N casos N controles % Alelo C Efecto OR (IC 95%) Referencia Casos Controles Cervical de céls. Escamosas China 470 722 13,8 11,9 No asociación CG 1,20 (0,91-1,58) (Yang et al., 2013) CC 1,23 (0,48-3,15) Colorrectal España 156 502 22,8 28,1 No asociación CC/CG 1,39 (0,55-3,45) (Sáenz-López et al., 2010) GG/CG 0,77 (0,51-1,08) Esofágico de céls. Escamosas China 235 250 26,6 16,4 C riesgo CG/GG 1,91 (1,29-2,82) (Wei et al., 2007) Significativo CC/GG 2,95 (1,23-7,04) Hepatocelular China 342 559 11,55 7,87 CG riesgo CG/GG 1,675 (1,18-2,38) (Lau et al., 2016) Significativo CC/GG 1,074 (0,26-4,53) Leucemia linfocítica crónica Turquía 20 30 25 11,7 No casos CC CG 0,36 (0,07-1,97) (Yalçın et al., 2015) No asociación CC 16,64 (0,84-328,4) Leucemia mieloide crónica Turquía 30 30 31,6 11,7 No casos CC CG 1,902 (0,62-5,86) (Yalçın et al., 2015) No asociación CC 10,358 (0,53-201,5) Linfoma no Hodgkin Rusia 238 371 28,8 29,1 No asociación CG/GG 1,11 (0,79-1,57) (Surovtseva et al., 2014) CC/GG 0,82 (0,45-1,49) Mama Brasil 154 118 34,7 27,11 CC riesgo CG/GG 0,908 (0,53-1,55) (Back et al., 2014) Significativo CC/GG 3,989 (1,33-12,77) Nasofaríngeo Italia 89 130 59,55 48,46 Cohorte CG/GG 1,2 (0,5-3,0) (Pratesi et al., 2006) No asociación CC/GG 2,1 (0,4-4,3) Nasofaríngeo Túnez 163 164 63,19 57,32 No asociación CG/GG 1,19 (p = 0,45) (Farhat et al., 2008) CC/GG 1,28 (p = 0,55) Nasofaríngeo China 250 270 26,4 17 C riesgo CG/GG 1,697 (1,16-2,49) (Nong et al., 2009) Significativo CC/GG 2,70 (1,27-5,75) Oral China 567 559 12,2 7,87 No asociación CG/GG 1,41 (0,82-2,41) (Tsai et al., 2013) CC/GG 1,32 (0,13-13,08) Oral de céls. Escamosas N. India 272 185 9,37 17,03 C y CG riesgo CG/GG 2,238 (1,46-3,44) (Singh et al., 2014) No casos CC C/G 1,984 (1,34-2,95) xxviii Tabla IV (continuación). Resumen de estudios de asociación caso-control entre IL-6 rs1800795 y cáncer. Cáncer Población N casos N controles % Alelo G Efecto OR (IC 95%) Referencia Casos Controles Próstata EEUU 166 175 No asociación GG ref (Zhang et al., 2010) CG+CC 1,30 (0,78-2,17) Próstata (RFPCS) Australia No recuentos Alélico 0,95 (0,82-1,09) (Tindall et al., 2012) Modelo desconocido Heterocig 1,09 (0,87-1,36) No asociación Homocig 0,86 (0,65-1,15) Próstata Caucasoides 84 78 76 52,6 Modelo desconocido GG 2,941 (1,548-5,587) (Mandal et al., 2014) Aislado en numerador CG 0,7 (0,41-1,463) CC protección Significativo CC 0,19 (0,074-0,54) Próstata Afroamericanos 80 62 82,5 88,7 Modelo desconocido GG 0,7 (0,355-1,664) (Mandal et al., 2014) aislado en numerador CG 0,8 (0,381-1,925) No asociación CC 10,91 (0,602-197,6) Próstata China 212 230 77 98 No asociación CG/GG 1,15 (0,75-1,78) (Chen et al., 2015) CC/GG 1.86 (0,79-4,56) Próstata Irán 112 200 74,1 67 C Ref G 1,73 (1,05-2,21) (Abbasabad et al., 2018) Modelo desconocido GG 1,85 (1,12-2,63) C asociado a metástasis CG 0,90 (0,61-1,29) Próstata Eslovaquia 446 276 60,4 55 CG protección CG 0,61 (0,43-0,86) (Jureceková et al., 2018) GG denominador Significativo CC+CG 0,63 (0,46-0,88) Pulmón céls. No pequeñas Caucasoides 243 207 49,2 52 No asociación CG/GG 0,91 (0,56-1,46) (Campa et al., 2004) CC/GG 1,24 (0,72-2,14) Pulmon céls. Escamosas Caucasoides 77 207 40,9 52 CC riesgo CG 1,20 (0,59-2,42) (Campa et al., 2004) Significativo CC 2,20 (1,10-4,68) xxix Tabla IV (continuación). Resumen de estudios de asociación caso-control entre IL-6 rs1800795 y cáncer. Cáncer Población N casos N controles % Alelo G Efecto OR (IC 95%) Referencia Casos Controles Pulmón Europeo 1995 1982 55,4 56,1 No asociación CG 0,89 (0,76-1,04) (Campa et al., 2005) CC 1,00 (0,82-1,22) Pulmón Turquía 44 58 56 66 Modelo desconocido GG 0,34 (0,13-0,88) (Colakogullari et al., 2008) Significativo CG 3,16 (1,24-7,82) Rectal España 133 311 96,4 68 C riesgo CG/GG 1,81 (1,16-2,82) (Landi et al., 2003) Significativo CG+CC/GG 1,78 (1,16-2,73) Rectal EEUU 777 995 63,6 63,3 No asociación CG 1,08 (0,87-1,33) (Slattery et al., 2007) CC 1,03 (0,76-1,38) Vejiga EEUU 444 443 CC riesgo CG+GG ref (Leibovici et al., 2005) Significativo CC 1,77 (1,25-2,51) Vejiga India 136 200 72 79 CC riesgo Significativo CG/GG 0,647 (0,373-1,122) (Ahirwar et al., 2008) CC/GG 2,811 (1,389-5,69) Vesícula biliar India 124 200 8,3 87,5 No asociación CG 0,89 (0,49-1,60) (Vishnoi et al., 2007) Modelo desconocido CC 0,60 (0,06-5,90) Tabla V. Resumen de estudios de asociación caso-control entre IL-10 rs1800896 y cáncer. Cáncer Población N casos N controles % Alelo A Efecto OR (IC 95%) Referencia Casos Controles Céls. basales Suecia 241 260 48,7 24,2 No asociación AG 0,80 (0,51-1,25) (Zhang et al., 2004) Mismos datos Festa AA 0,76 (0,47-1,24) Céls. basales Suecia y Finlandia 241 260 48,8 52,7 No asociación AG 0,80 (0,51-1,25) (Festa et al., 2005) Mismos datos Zhang AA 0,76 (0,47-1,24) xxx Tabla V (continuación). Resumen de estudios de asociación caso-control entre IL-10 rs1800896 y cáncer. Cáncer Población N casos N controles % Alelo A Efecto OR (IC 95%) Referencia Casos Controles Adenoma colorrectal EEUU 222 207 53,1 56,3 No asociación AG 0,8 (0,5-1,3) (Gunter et al., 2006) GG 1,3 (0,7-2,4) Colorrectal Suecia 308 585 50,6 52,2 No asociación AG 1,04 (0,75-1,45) (Wilkening et al., 2008) GG 1,11 (0,75-1,64) Colorrectal EEUU 205 372 58,3 51,5 GG protección Significativo AG 0,79 (0,53-1,18) (Tsilidis et al., 2009) GG 0,58 (0,35-0,95) Colorrectal Bulgaria 119 154 58 61 No asociación AG 0,974 (0,552-1,718) (Miteva et al., 2014) GG 1,414 (0,614-3,11) Adenocarcinoma esofágico EEUU 108 210 51,4 52,6 No asociación AG 1,2 (0,7-2,2) (El-Omar et al., 2003) Modelo desconocido AA 0,8 (0,4-1,7) Esofágico EEUU 53 210 56,6 52,6 No asociación AG 1,3 (0,5-3,0) (El-Omar et al., 2003) Modelo desconocido AA 1,1 (0,4-2,9) Esofágico China 246 492 38,2 30,1 AA y AG riesgo AG 1,28 (0,90-1,80) (Yang & Fa, 2015) Significativo AA 2,19 (1,31-3,64) AG+AA 1,44 (1,05-1,99) Gástrico cardio EEUU 126 210 51,6 52,6 No asociación AG 1,0 (0,6-1,8) (El-Omar et al., 2003) Modelo desconocido AA 1,1 (0,6-2,1) Gástrico no cardio EEUU 188 210 64,6 52,6 Significativo AG 1,0 (0,6-1,8) (El-Omar et al., 2003) Modelo desconocido AA 1,9 (1,1-3,5) Gástrico Finlandia 112 205 54,9 58,5 No asociación AG 0,93 (0,55-1,57) (Kamangar et al., 2006) GG 1,38 (0,73-2,60) Gastroesofágico Escocia 200 223 49,7 47,5 No asociación GG 1,077 (0,70-1,66) (Deans et al., 2007) Modelo desconocido AG 0,746 (0,51-1,09) Leucemia linfocítica crónica Italia 39 111 64,1 74,3 No asociación AG 1,9 (0,8-4,2) (Ennas et al., 2008) GG 1,9 (0,5-8,0) xxxi Tabla V (continuación). Resumen de estudios de asociación caso-control entre IL-10 rs1800896 y cáncer. Cáncer Población N casos N controles % Alelo A Efecto OR (IC 95%) Referencia Casos Controles Linfoma de Hodgkin Grecia 37 84 35,1 33,3 No asociación AG 1,17 (0,34-4,04) (Andrie et al., 2009) GG 0,89 (0,26-3,02) Linfoma eBL África subsahariana 117 88 67,9 66,5 No asociación AG 1,23 (0,54-2,78) (Oduor et al., 2014) Modelo desconocido GG 0,91 (0,24-3,46) Linfoma no Hodgkin InterLymph Consortium 2710 3108 54,1 55,6 No asociación AG 1,08 (0,95-1,22) (Rothman et al., 2006) GG 1,13 (0,96-1,32) Linfoma no Hodgkin EEUU 510 587 52,3 57,3 GG riesgo Significativo AG 1,14 (0,86-1,51) (Lan et al., 2006) GG 1,53 (1,08-2,17) Linfoma no Hodgkin Grecia 48 84 35,4 33,3 No asociación AG 0,88 (0,29-2,66) (Andrie et al., 2009) GG 0,81 (0,28-2,33) Linfoma no Hodgkin China (Han) 93 204 89,2 91,1 No asociación AA ref (Gu et al., 2014) AG+GG 1,38 (0,735-2,59) Linfoma no Hodgkin China (Uygur) 65 231 82,3 74,5 No asociación AA ref (Gu et al., 2014) AG+GG 0,603 (0,3391,072) Mama India 200 200 81 85 No asociación G/A 1,329 (0,917-1,926) (Pooja et al., 2012) AG+GG/AA 1,358 (0,8862,08) Oral de céls. escamosas Caucasoides 144 141 65,3 78,7 0 controles GG AG 3,05 (1,84-5,05) (Vairaktaris et al., 2008) Modelo desconocido GG 7,13 (0,33-155,37) Ovario Hawaii 180 218 54,7 52,3 No asociación AG 1,58 (0,98-2,54) (Bushley et al., 2004) Modelo desconocido GG 1,06 (0,57-1,96) Papilar de tirides Turquía 190 216 51 60 G riesgo GG/AA 2,07 (1,21-3,55) (Çil et al., 2014) Significativo G/A 1,45 (1,10-1,92) Próstata Caucasoides 247 223 54,4 47,5 Modelo desconocido AA 1,78 (1,14-2,77) (McCarron et al., 2002) Significativo xxxii Tabla V (continuación). Resumen de estudios de asociación caso-control entre IL-10 rs1800896 y cáncer. Cáncer Población N casos N controles % Alelo A Efecto OR (IC 95%) Referencia Casos Controles PLCO* EEUU 1245 1763 52,6 54 No asociación AG 0,97 (0,81-1,15) (Michaud et al., 2006) GG 0,98 (0,80-1,21) Próstata Finlandia 509 382 58,6 55,5 No asociación AG 0,86 (0,64-1,16) (Faupel-Badger et al., 2008) GG 0,79 (0,52-1,15) Próstata Caucasoides 475 394 48,3 52 No asociación AG 1,08 (0,78-1,49) (Zabaleta et al., 2008) GG 1,36 (0,93-2,00) Próstata Afroamericanos 66 129 60,6 61,2 No asociación AG 1,03 (0,53-1,98) (Zabaleta et al., 2008) GG 1,08 (0,37-3,10) Próstata N. India 159 259 67,9 62,7 Significativo AG 2,8 (1,26-6,14) (Kesarwani et al., 2009) AA y AG riesgo AA 2,3 (1,05-5,14) Próstata EEUU 255 257 GG riesgo AG/GG 1,69 (1,10-2,60) (Wang et al., 2009) Significativo AA/GG 1,81 (1,11-2,96) Próstata China 262 270 91,6 93,9 No asociación AG 1,50 (0,87-2,57) (Liu et al., 2010) GG 1,68 (0,35-8,17) Próstata EEUU 192 660 36,2 35,1 No asociación AG 1,30 (0,92-1,84) (VanCleave et al., 2010) AA 0,92 (0,54-1,56) Próstata EEUU 867 836 51 50,1 No asociación AG 0,98 (0,78-1,24) (Winchester et al., 2015) GG 0,92 (0,70-1,21) Pulmón Turquía 44 59 59 74 Modelo desconocido AG 3,38 (1,57-9,71) (Colakogullari et al., 2008) Significativo AA 0,26 (0,10-0,67) xxxiii Tabla VI. Resumen de estudios de asociación caso-control entre IL-17A rs2275913 y cáncer. Cáncer Población N casos N controles % Alelo A Efecto OR (IC 95%) Referencia Casos Controles Cervical China 311 463 47,3 40,5 AA y A riesgo Significativo AA/GG 1,72 (1,15-2,57) (Quan et al., 2012) Cervical China 352 352 37,07 28,84 A y AA riesgo Significativo AA/GG 2,01 (1,15-3,49) (Cong et al., 2015) Cervical China 216 431 36,11 28,65 AA riesgo Significativo AA/GG 1,99 (1,12-3,50) (Li et al., 2015) Cervical China 264 264 36,17 27,46 AA riesgo Significativo AA/GG 2,34 (1,24-4,49) (Lv et al., 2015) Cervical China 306 354 36,28 26,84 AA riesgo Significativo AA/GG 2,84 (1,57-5,23) (Sun et al., 2015) Colon Rusia 104 300 36,54 39,5 No asociación GG/AA 0,92 (0,44-1,92) (Kutikhin et al, 2014) Colorrectal Rusia 220 300 38,18 39,5 No asociación GG/GA 0,74 (0,5-1,09) (Kutikhin et al., 2014) Colorrectal Túnez 102 139 31,5 17,4 A y AA riesgo Significativo A/G 2,14 (1,10-4,15) (Omrane et al., 2014) Colorrectal Irán 202 203 69 67,8 AG riesgo Significativo AG genot 3,64 (1,8147,296) (Nemati et al., 2015) Esofágico China 380 380 44,74 43,68 No asociación GG/GA+AA 1,16 (0,841,59) (Yin et al., 2014) Gástrico Japón 287 523 45,64 37,95 AA riesgo Significativo A/A homo 3,53 (2,345,34) (Shibata et al., 2009) Gástrico China (Han) 945 768 52,12 50,72 No asociación AG/GG 1,23 (0,96-1,56) (Wu et al., 2010) Gástrico Japón 333 583 45,8 37,48 AA riesgo Significativo AA/GG 2,38 (1,63-3,46) (Arisawa et al., 2012) [Document text truncated for crawler view.]