Caracterización molecular y desarrollo de métodos de PCR en tiempo real para evaluar y cuantificar genes de virulencia de enterococos en alimentos fermentados y no fermentados, y "Bacillus sporothermodurans" en leche UHT

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Caracterización molecular y desarrollo de métodos de PCR en tiempo real para evaluar y cuantificar genes de virulencia de enterococos en alimentos fermentados y no fermentados, y "Bacillus sporothemodurans" en leche UHT Mohamed Abouelnaga Lugo, Julio de 2016 D. Carlos Manuel Franco Abuín, Profesor Titular del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología D. José Manuel Miranda López, Profesor Ayudante doctor, integrantes del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología . AUTORIZAN A: Dª Mohamed Abouelnaga, a la presentación de la tesis doctoral, titulada “Caracterización molecular y desarrollo de métodos de PCR en tiempo real para evaluar y cuantificar genes de virulencia de enterococos en alimentos fermentados y no fermentados, y "Bacillus sporothermodurans" en leche UHT“ realizada bajo su dirección en el Laboratorio de Higiene, Inspección y Control de Alimentos (LHICA) del Dpto de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, en la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, firman la presente en Lugo, a 26 de Julio de 2016. Fdo. Carlos Manuel Franco Abuín Fdo. José Manuel Miranda López Fdo. Mohamed Abouelnaga Agradecimientos AGRADECIMIENTOS En primer lugar, quiero dar las gracias a mis directores de tesis, Carlos Manuel Franco Abuín y José Manuel Miranda López, por su supervision, guiar mis pasos y su conducción científica que han hecho posible la realización de este trabajo. Quiero extender este agradecimiento a los otros profesores e investigadores del LHICA (Laboratorio de Higiene, Inspección y Control de Alimentos) por su asistencia, colaboración en todo momento, trabajo en equipo y motivación que he recibido de todos A todos los compañeros del Laboratorio de Higiene, Inspección y Control de Alimentos (LHICA), siempre dispuestos a colaborar, dar ánimo y ayudar en todos los problemas que se han ido presentando a lo largo de todo el trabajo, nunca nos olvidaré. A Alexandre (Alexandre lamas), por su asistencia y disposición a ayudarme en cada momento y su participación para resolver los problemas que me encontré en este trabajo. Finalmente, quiero agradecer el apoyo recibido de toda mi familia, tanto aquí en España o en Egipto, por sus apoyo, paciencia conmigo y por lo que han soportado y sufrido durante la realización de esta tesis doctoral. También deseo hacer constar mi agradecimento a la Ministerio de Educación Superior de Egipto, por concederme una beca por dos años, lo que han permitido realizar el trabajo de esta tesis doctoral: “Caracterización molecular y desarrollo de métodos de PCR en tiempo real para evaluar y cuantificar genes de virulencia de enterococos en alimentos fermentados y no fermentados, y "Bacillus sporothermodurans" en leche UHT”. Abreviaturas ABREVIATURAS AND Ácido desoxirribonucleico 16S RNA Gen que codifica para el ARN que constituye la subunidad menos de los ribosomas bacterianos BHI Medio de infusión cerebro corazón (Brain Heart Infusion medium) CT Ciclo umbral (Cycle Threshold) D140 El tiempo que se requiere cuando se calienta a 140 °C para inactivar las esporas por un ciclo logarítmico E Eficacia de reacción EEA Espacio Económico Europeo FAO Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación HACCP Análisis de Peligro y Puntos de Control Críticos “APPCC” HRS Esporas altamente resistentes al calor IDF International Dairy Federation LAB Bacterias ácido-lácticas Mg Miligramo MGB Enlazante al surco menor MSCRAMMS Moléculas de la matriz adhesiva que reconoce los componentes de la superficie microbiana Abreviaturas NCBI Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (National Center for Biotechnology Information) ºC Grados Celsius Pb Pares de bases PCR Polimerase chain reaction o Reacción en cadena de la polimerasa RTi-PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real (Real time - polymerase chain reaction) TEM Imágenes de Microscopio Electrónico de Transmisión (Transmission Electron Microscopy) UE Unión Europea UFC Unidades formadoras de colonias por gramo UHT Temperatura Ultra Alta (Ultra High Temperature) RAPD ADN polimórfico amplificado al azar (Random Amplification of Polymorphic DNA) REP Reacción en Cadena de la Polimerasa (repetitive extragenic palindromic) TEM Microscopio Electrónico de Transmisión Z El valor de Z es la temperatura requerida para reducir el valor D por un ciclo logarítmico 1 ÍNDICE Índice I ÍNDICE ÍNDICE ................................................................................................................................. I RESUMEN .......................................................................................................................... 1 INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 7 3.1 Seguridad y calidad de los productos alimentarios ................................................ 9 3.2 Aspectos microbiológicos ...................................................................................... 10 3.3 Genero Enterococcus ............................................................................................. 12 3.3.1 Características generales del género Enterococcus .............................................. 12 3.3.2 La naturaleza dual de enterococos ...................................................................... 15 3.3.3 El potencial de virulencia de los Enterococcus ................................................... 18 3.3.3.1 Identificación de los factores de virulencia ....................................................... 19 3.3.3.1.1 Sustancia de agregación (agg) ...................................................................... 19 3.3.3.1.2 Proteína de superficie (esp) ........................................................................... 20 3.3.3.1.3 Proteína de unión al colágeno (ace) .............................................................. 20 3.3.3.1.4 Gelatinasa (gelE) ........................................................................................... 21 3.3.3.1.5 Adhesinas causantes de endocarditis en Enterococcus faecium (efaAfm) y Enterococcus faecalis (efaAfs) ..................................................................................... 21 3.3.3.1.6 Las feromonas sexuales ..................................................................................... 22 3.3.4 Resistencia a los antibióticos de Enterococcus .................................................... 22 3.3.4.1 Difusión de la resistencia a los antibióticos ....................................................... 23 3.4 Genero Bacillus ..................................................................................................... 25 3.4.1 Bacillus sporothermodurans .............................................................................. 26 Índice II 3.4.2 Importancia de Bacillus sporothermodurans ..................................................... .26 3.4.3 Fuentes de contaminación por Bacillus sporothermodurans .............................. 27 3.4.4 Características generales de Bacillus Sporothermodurans ................................. 28 3.4.5 Esporas de Bacillus sporothermodurans ............................................................ 28 3.4.6 La identificación de Bacillus sporothermodurans .............................................. 29 3.4.6.1 PCR para endosporas altamente resistente al calor (HRS-PCR) ..................... 30 3.4.6.2 La secuenciación de gen 16S rRNA ................................................................ 30 3. 4.6.3 ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD) ............................................. 31 3. 4.6.4 Amplificación de secuencias palindrómicas extragénicas repetitivas (REPPCR) ............................................................................................................................. 31 3.5 Procesamiento ultra alta temperatura (UHT) ........................................................ 32 3.5.1 Tipos de tratamiento UHT .................................................................................. 33 3.5.1.1 Sistema UHT directo........................................................................................ 33 3.5.1.2 Sistema UHT indirecto .................................................................................... 34 3.5.2 Diferencias entre los sistemas de UHT .............................................................. 34 3.6 Principales aplicaciones de métodos moleculares para la detección y cuantificación de los genes codificantes de factores de virulencia y B. sporothermodurans ............. 34 3.6.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) .................................................... 34 3.6.2 PCR cuantitativa en tiempo real (RTi-PCR) ...................................................... 36 OBJETIVOS ......................................................................................................................... 41 RESULTADOS ................................................................................................................... 44 5.1 CAPÍTULO 1 ................................................................................................................... 47 Índice III 5.1.1 Evaluación de la extensión de la difusión de los factores de virulencia y la resistencia a los antibióticos en Enterococci aislados de los alimentos fermentados y no fermentados ................................................................................................................... 49 5.2 CAPÍTULO 2 ................................................................................................................... 61 5.2.1 Evaluación de la seguridad de los alimentos utilizando un nuevo ensayo de PCR en tiempo real para la detección y cuantificación de los factores de virulencia de enterococos en muestras de alimentos .......................................................................... 63 5.3 CAPÍTULO 3 ................................................................................................................ 93 5.3.1 Desarrollo de un ensayo de PCR en tiempo real para la detección y cuantificación directa de Bacillus sporothermodurans en la leche UHT ........................................... 95 6. DISCUSIÓN ..................................................................................................................111 7. CONCLUSIONES ………………........ ......................................................................123 7.1 Conclusiones generales .........................................................................................123 7.2 Conclusiones específicas .......................................................................................126 8. BIBLIOGRAFÍA ..........................................................................................................131 Introducción 9 INTRODUCCIÓN 3.1 Seguridad y calidad de los productos alimentarios La seguridad y calidad de los alimentos son los factores más importantes que determinan la decisión del consumidor acerca de qué tipo de alimento optan por comprar. Tanto es así que tanto los consumidores como las autoridades sanitarias se muestran cada vez más preocupados por la calidad y la seguridad de los alimentos y los efectos negativos que la ingesta de los mismos pueda tener sobre la salud. Para abordar estos retos, los sistemas de garantía de calidad permiten aplicar y verificar medidas de control con el fin de asegurar la calidad y seguridad de los alimentos. Dichas medidas son exigidas en cada paso en la cadena de producción de alimentos para garantizar una alimentación segura y de los productos comercializados cumplen con los requisitos legales y los exigidos por los clientes (Trienekens y Zuurbier, 2008). La confianza en la seguridad y la integridad del suministro de alimentos es un requisito fundamental para los consumidores. En dicha seguridad e integridad se incluyen todos los factores que potencialmente pueden aportar algún peligro para los consumidores, incluyendo desde prácticas agrícolas inadecuadas, falta de higiene en la cadena alimentaria, falta de controles preventivos en las operaciones de procesamiento y preparación de alimentos, uso inadecuado de productos químicos, contaminación de materias primas, ingredientes y o el agua, así como almacenamiento y transporte inadecuado. El mantenimeinto de unas prácticas adecuadas en todos estos pasos es Introducción 10 necesario para garantizar que los alimentos llegen a los consumidores en buen estado y sean seguros para los mismos. A este fin, el procesamiento de alimentos es fundamental para conseguir la eliminación de microorganismos patógenos de los alimentos y controlar los potencialmente alterantes, a fin de evitar que estos se multipliquen y deterioren los alimentos al mismo tiempo que se evitan intoxicaciones (FAO/WHO, 2003). 3.2 Aspectos microbiológicos Los microorganismos tienen una gran importancia y un gran impacto en nuestras vidas, pero no siempre de manera positiva. Distintos tipos de microorganismos se podrían emplear como indicadores de la seguridad alimentaria. Sin embargo, su presencia en los alimentos depende de muchos factores, tales como la presencia endógena de dichos microorganismos, la adición voluntaria de los mismos y contaminaciones cruzadas, las condiciones de almacenamiento, especialmente cuando se requieren temperaturas concretas, y finalmente el procesamiento de alimentos, incluyendo los tratamientos térmicos para lograr productos seguros. De entre las difrentes poblaciones microbionas que están habitualmente presents en los alimentos, las bacterias ácido-lácticas (LAB) juegan un papel importante en el proceso de fermentación, aportando en muchos casos, propiedades beneficiosas a los alimentos fermentados en cuya elaboración participan. Su actividad metabólica contribuye a aumentar la seguridad y la demanda de productos alimenticios fermentados, como muchos tipos de quesos y carnes fermentadas (Caplice y Fitzgerald, 1999). Los enterococos son bacterias ácido-lacticas que pueden participar Introducción 11 tanto en fermentaciones naturales como artificiales, y son empleados en numerosas ocasiones como cultivos iniciadores. Sin embargo, estas bacterias plantean el problema de que también pueden ser patógenos oportunistas. Por otra parte, algunos de los productos alimenticios que necesitan de tratamientos térmicos a altas temperaturas podrían encontrar problemas relacionados con el incumplimiento de las especificaciones legales. Por ejemplo, Bacillus sporothermodurans es un motivo de preocupación constante para los fabricantes de leche UHT, ya que es capaz de formar endosporas de alta resistencia térmica. Sin embargo, a día de hoy no se han desarrollado ningún método que permita la detección cuantitativa de B. sporothermodurans directamente en leche UHT, lo cual facilitaría de modo importante su temprana detección y la modificación de las condiciones del tratamiento para permitir su correcta eliminación. El empleo de criterios microbiológicos como herramientas de gestión de riesgos se debe aplicar cuando se puede demostrar que son eficaces y pueden contribuir al suministro de productos seguros. Sin embargo, los ensayos microbiológicos por sí solos no pueden garantizar la seguridad de los alimentos. Los criterios microbiológicos se utilizan para apoyar buenas prácticas de higiene y análisis de riesgos y puntos críticos de control (APPCC o HACCP, por sus siglas en inglés). La industria alimentaria tiene el deber de garantizar que los microorganismos se eliminan o minimizan en la medida en que no puedan causar daño a la salud humana, y los controles oficiales son conformes a los requisitos de las reglamentos de seguridad alimentaria. Introducción 12 La detección de las bacterias patógenas transmitidas por los alimentos preparados representa un riesgo inaceptable para la salud, independientemente del número de bacterias presents. Además, la presencia de bacterias indicadoras en alimentos preparados, aunque no en todos los casos sea peligrosa, puede ser indicativo de una mala práctica higiénica durante el procesado como puede ser la utilización de materias primas inadecuadas, un insuficiente tratamiento térmico, presencia de contaminación cruzada; limpieza y desinfección inadecuada, o deficiente control de temperaturas y tiempo. 3.3 Genero Enterococcus 3.3.1 Características generales del género Enterococcus Anteriormente, los Enterococcus spp. fueron clasificados como pertenecientes a los Streptococcus grupo D de Lancefield. Más tarde, a partir de la década de los ochenta fueron considerados un género separado del género Streptococcus, gracias a estudios taxonómicos y genómicos que demostraron su relación distante con el género Streptococcus (Ogier y Serror, 2008). A partir de dichos estudios, el anterior género Streptococcus ha sido dividido en tres diferentes géneros: Streptococcus, Lactococcus y Enterococcus (Figura 1). Introducción 13 Genus Streptococcus Genus Streptococcus Genus Lactococcus Genus Enterococcus Figura 1. Subdivisiones del género Streptococcus Actualmente, la posición filogenética del género Enterococcus, determinado mediante comparación de secuencias de 16S rRNA y la posterior construcción de dendrogramas muestra la siguiente configuración, tal y como se muestra en las Figuras 2 y 3 (Klein y col., 2003). Figura 2. Análisis filogenético del género Enterococcus a partir de secuencias del gen 16S ARNr Introducción 14 Figura 3. Dendograma basado en la amplificación del gen 16S rRNA que refleja la relación de especies y sub-especies incluídas en el género Enterococcus. Como se puede observar en la Figura 3, según el actual conocimiento científico, el género Enterococcus spp. está formado por 54 especies. Las bacterias incluídas dentro de este género son cocos gram-positivos, no formadores de endosporas, anaerobios facultativos que se presentan agrupadas en parejas o en cadenas. Son bacterias quimiorganotrofas, que fermentan un amplio rango de carbohidratos con producción principalmente de L (+)- ácido láctico pero no gas, acidificando el medio en el cual se encuentran hasta alcanzar un pH final de 4,2 – 4,6. Los enterococos son capaces de crecer en medios con concentraciones de sal de hasta un 6,5%, en un caldo con pH hasta de Introducción 15 9,6, 40% de sales biliares y además sobreviven a temperaturas de entre 10 °C y 45°C (Manero y Blanch, 1999). 3.3.2 La naturaleza dual de los enterococos El género Enterococcus es el grupo más controvertido de las bacterias ácido-lacticas que forman una parte importante de la microbiota de alimentos, especialmente en los de origen animal. El habitat natural de estas bacterias es el tracto gastrointestinal de humanos y animales, en los cuales son capaces de sobrevivir incluso en condiciones muy adversas. Como característica positiva, varias cepas del género Enterococcus han sido utilizadas como probióticos, ya que tienen un impacto positivo en el equilibrio microbiano gastrointestinal (Giraffa, 2003; Ogier y Serror, 2008). Además, varias especies de Enterococcus presentan potencial bacteriocinogénico, siendo capaces de producir una amplia variedad de enterocinas contra microorganismos patógenos. Algunas cepas también juegan un papel importante en la producción, maduración y desarrollo del aroma de diferentes tipos de quesos (Giraffa, 2003; Foulquié-Moreno y col., 2006; Xu y Kong, 2013). Los enterococos tienen también una larga historia de utilización segura en la producción de productos tradicionales fermentados, tales como quesos y embutidos o en fermentaciones naturales (Hammad y col., 2015). Muchos productos cárnicos fermentados por métodos tradicionales y artesanales en los países mediterráneos dependen de la flora endógena de conservar sus cualidades organolépticas tradicionales. En contraste, los enterococos son considerados como un parámetro indicador de higiene que proporcionan información sobre la possible contaminación fecal de los alimentos (De Medici y col., 2015). Por lo tanto, su presencia no está permitido en Introducción 16 algunos tipos de productos de queso y carne procesada porque se consideran una fuente de deterioro y, en algunos casos, un riesgo para la salud humana (Franz y col., 1999), principalmente E. faecalis (80%) y E. faecium (5-20%) (Morrison y col., 1997; Martin col., 2005). Los enterococos también han sido implicados como agentes patógenos cusantes de una gran variedad de infecciónes, tales como endocarditis, bacteriemia, infecciones de vías urinarias, del sistema nervioso central, así como infecciones intraabdominales y pélvicas (Franz, 1999), así como en la difusión de la resistencia a los antibióticos a través de la cadena alimentaria (Giraffa, 2002). Estos niveles altos de resistencia a los antimicrobianos en los enterococos siguen siendo una causa importante de infecciones relacionadas con la asistencia sanitaria, en Europa y un gran desafío para controlar a las infecciones. E. faecalis ha mostrado una alta prevalencia de resistencia a aminoglucósidos, mientras que la resistencia a la vancomicina en E. faecium mostró una tendencia creciente durante los últimos años (20112014), como puede observar en las Figura 4 y 5, respectivamente, según los países de la UE / EEA (ECDC, 2014). Introducción 17 Figura 4. Porcentaje (%) de los aislamientos de E. faecalis con resistencia de alto nivel a los aminoglucósidos, en los diferentes países de la UE / EEA, 2014. Figura 5. Porcentaje (%) de los aislamientos de E. faecium resistentes a la vancomicina, en los países de la UE / EEA, 2014. Introducción 18 Sin embargo, para causar la infección, los Enterococcus deben poseer factores de virulencia que permiten que dichas bacterias puedan colonizar e invadir el tejido del huésped y posteriormente translocarse a través de las células epiteliales, evitando la respuesta inmune del huésped (Valenzuela y col., 2008). En cualquier caso, los efectos beneficiosos de algunas especies de enterococos para la salud humana y animal frente a los efectos negativos observados confirman la naturaleza dual de los enterococos (Figura 6). Figura 6. Naturaleza dual de los enterococos con indicación de sus beneficios y riesgos. 3.3.3 El potencial de virulencia de los Enterococcus El primer paso hacia la comprensión del potencial patógeno de los enterococos es la identificación de los factores de virulencia potenciales que dirigirá las líneas generales de la infección por estas bacterias en el tracto gastrointestinal del huésped. “Factor de virulencia” es el nombre que se le da a una molécula que mejora la capacidad de un Introducción 25 La gran mayoría de los mecanismos de resistencia pueden agruparse en tres categorías:  Inactivación enzimática, consiste en la inactivación o destrucción de los antimicrobianos por medio de las enzimas que producen los microorganismos.  Modificaciones en el punto de acción sobre el que actúa el agente antimicrobiano.  Alteraciones de la permeabilidad, lo que dificulta la penetración o acumulación de los antimicrobianos en el interior de la célula bacteriana. 3.4 Genero Bacillus Los microorganismos pertenecientes al género Bacillus son bacilos, grampositivos y esporógenos, que forman esporas extraordinariamente resistentes a condiciones desfavorables. Son bacterias caracterizadas por la capacidad de crecer a temperaturas mesófilas y termófilas, y pueden ser además tanto aerobias estrictas como anaerobias facultativas. Por estos motivos, debido a su extraordinaria capacidad de adaptación, el género Bacillus a menudo se encuentra en la leche cruda, pasteurizada, leche de ultra alta temperatura (leche de UHT), leche en polvo, queso y yogur (Klijn y col., 1997). Las especies de Bacillus presentan una acción para el hombre muy diversa. Así, aunque la mayoría de las especies de Bacillus son seguras, algunas son potencialmente patógenas, para las personas como para los animales. Algunos ejemplos significativos de Bacillus para la industria alimentaria son B. coagulans, B. sporothermodurans, B. subtilis y B. cereus, que en algunos casos son potencialmente patógenos. Gracias a su capacidad de producer esporas altamente resistentes al calor, estos microorganismos son capaces de tolerar tratamiento tratamientos térmicos tan severos como la UHT. Anteriores estudios Introducción 26 investigación han demostrado la extrema resistencia al calor de esporas de B. sporothermodurns (Huemer y col., 1998; Scheldeman y col., 2002). Esta especie constituye un serio problema para las fábricas de productos lácteos, debido a sus efectos sobre la estabilidad de las proteínas y el cumplimiento de los requisitos legales para la comercialización de la lecha UHT. 3.4.1 Bacillus sporothermodurans El proceso de UHT es un tratamiento térmico alto de corta duración empleado con el fin de producir productos comercialmente estériles. El tratamiento UHT utiliza una temperatura de 135-140 °C durante 1-2 segundos (Jay y col., 2005), que es capaz de destruir las células vegetativas y las endosporas presentes en la leche cruda (Pettersson y col., 1996). Por lo tanto, la leche UHT puede ser almacenada sin necesidad de refrigeración. Sin embargo, algunas las bacterias formadoras de esporas con una alta resistencia al calor como B. sporothermodurans suponen un importante problema para la industria lactea, ya que deben asegurar los procesos de esterilización y la seguridad alimentaria en productos de leche UHT. 3.4.2 Importancia de Bacillus sporothermodurans La especie B. sporothermodurans puede producir endosporas que posteriormente pueden germinar durante el almacenamiento en productos UHT y crecer hasta 105 ufc/ ml, deagradando el producto debido a su acción proteolítica (Klijn y col., 1997; Montanari y col., 2004). De este modo, estas especie bacteriana provoca una reducción en la calidad de la leche, un acortamiento de su vida útil, así como una reducción en la Introducción 27 aceptabilidad por parte del consumidor (Pettersson y col., 1996; Claeys y col., 2001). B. sporothermodurans se detectó por primera vez en leche UHT en Italia y Austria en 1985 y luego también en Alemania en 1990 (Hammer y col., 1995). Ya más recientemente, Herman y col., (2000) encontraron esta especie en leche esterilizada y otros productos lácteos, como la leche UHT, leche con chocolate, leche evaporada y leche reconstituida. De acuerdo con las regulaciones relativas a la comercialización de la leche y los productos lácteos, cuya norma básica es la Directiva Europea 92/46/CEE, los recuentos de colonias de paquetes sin abrir, después de 15 días de incubación a 30 oC, deben estar por debajo de 10 ufc por 0.1 ml (Anónimo, 1992). Por lo tanto, las esporas que sobreviven después del proceso de esterilización han llegado a ser un obstáculo para la industria láctea, ya que complican el cumplimiento de los requisitos legales establecidos por la legislación europea. 3.4.3 Fuentes de contaminación por Bacillus sporothermodurans B. sporothermodurans ha sido indentificado en contaminaciones masivas de productos de leche UHT desde mediados de los años ochenta. Esta especie puede proceder de numerosos orígenes, como son el suelo, compost, tracto digestive de los animales, estiércol, ubre, utensilios de ordeño, la leche cruda, así como de la propia alimentación que reciban los animales (Vaerewijck y col., 2001; Guillaume-Gentil y col., 2002). Como resultado de la naturaleza competitiva de la flora de leche cruda, es difícil aislar B. sporothermodurans en cultivos microbiológicos convencionales. Para una correcta detección de B. sporothermodurans en muestras de leche, debe realizarse empleando Brain Heart Infusion (BHI) agar después de calentar la muestra hasta 100 oC Introducción 28 durante 30-40 minutos (Scheldeman y col., 2006). También se han descrito casos en los cuales la contaminación de los productos UHT con esporas de B. sporothermodurans no procedían del origen de la material prima, sino que llegaron al producto durante el procesamiento en la planta de envasado (Hammer y col., 1995). 3.4.4 Características generales de Bacillus Sporothermodurans Al igual que otras especies de Bacillus, B. sporothermodurans es una bacteria gram positiva, con forma de bastón, es formadora de esporas. Las propiedades hidrófobas de las endosporas producidas por esta especie, permiten que dichas esporas se adhieran al acero y su elevada resistencia general a la desecación y acción de los desinfectantes les permiten contaminar los productos durante el procesamiento (Andersson y col., 1995; Simmonds y col., 2003). Aunque los métodos fenotípicos juegan un papel importante en su identificación a nivel de género, el escaso de crecimiento y las reacciones negativas para muchas pruebas estándar y bioqímicas como el API 50CHB pueden acarrear algunas dificultades para conseguir una identificación fiable de B. sporothermodurans mediante métodos fenotípicos. Además, estos métodos de identificación tardan mucho tiempo, debido a la baja velocidad de crecimiento de esta especie (Pettersson y col., 1996). 3.4.5 Esporas de Bacillus sporothermodurans Las esporas producidas por B. sporothermodurans tienen forma cilíndrica y su rango de longitud va desde 1,1 – 1,2 µm y 0,7 – 0,8 µm para la anchura. La principal diferencia estructural entre las esporas producidas por diferentes espcies de Bacillus es la estructura Introducción 29 y el número de capas de revestimiento, mientras que la corteza y el núcleo de dichas esporas son muy similares (Burgess y col., 2010). Por ejemplo, las esporas producidas por B. sporothermodurans tienen varias capas de revestimiento, que pueden protegerlos del tratamiento UHT (Figura 7). Además, diversos estudios han demostrado que la estructura de las endosporas de B. sporothermodurans se ve afectada por las condiciones ambientales. Las esporas aisladas de leche UHT son generalmente más densas y más pequeñas que las aisladas a partir de leche cruda (Scheldeman y col., 2006), lo que las hace aún más resistentes. Figura 7. Imágenes de Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM) de una espora producida por B. sporothermodurans (Fuente: Tabit y Buys, 2010). 3.4.6 La identificación de Bacillus sporothermodurans Debido al hecho de que las esporas producidas por B. sporothermodurans son un obstáculo para el correcto cumplimiento de la legislación europea por parte de la industria lacteal, numerosos métodos de identificación molecular se han utilizado para identificar y caracterizar B. sporothermodurans, tales como la PCR para endosporas altamente resistentes al calor (HRS-PCR), ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD), Introducción 30 amplificación de secuencias palindrómicas extragénicas repetitivas (REP) o el análisis de la secuencias amplicadas del gen 16S rRNA (Pettersson y col., 1996; Klijn y col., 1997; Hermany col., 1997; Herman y col., 1998). 3.4.6.1 PCR para endosporas altamente resistentes al calor (HRS-PCR) La ténica HRS-PCR fue empleada previamente para detectar esporas de B. sporothermodurans en muestras de leche cruda. Los cebadores empleados para la realización de éste método se han realizado con secuencias obtenidas mediante hibridación sustractiva; SH2-F1 (5' GAT TCA GGC AGA ATG TAG CA 3') y SH2-R (5' TTT CGC CAC TTG ATG GTA CA 3'), (Herman y col., 1997; Scheldeman y col., 2002). Mediante esta técnica, la detección de B. sporothermodurans en la leche cruda se basa en provocar en primer lugar la activación y germinación de las esporas, seguido de su identificación mediante PCR. 3.4.6.2 La secuenciación del gen 16S rRNA La secuenciación del gen 16S rRNA se puede utilizar para la identificación de B. sporothermodurans porque el gen 16S rRNA contiene regiones con una alta variabilidad (Klijn y col., 1997). El gen 16S rRNA de B. sporothermodurans ha sido amplificado mediante PCR, y los productos resultantes de la PCR fueron posteriormente purificados y secuenciados, con los que constituyó una gran base de datos. Una vez realizada esta etapa, las secuencias obtenidas de la amplificación del gen 16S rRNA, pueden ser identificados por búsqueda de la secuencia en las bases de datos conocidas. Las porciones Introducción 31 de los genes 16S rRNA se han amplificado para la detección de B. sporothermodurans utilizando cebadores específicos: BSPO-F2 (5'ACG GCT CAA CCG TGG AG 3') y BSPO-R2 (5' GTA ACC TCG CGG TCT A 3') (Scheldeman y col., 2002). Sin embargo, la presencia de muchas copias del gen 16S rRNA en el bacteriana genómico causa dificultad ADN en 16S rRNA análisis de la secuencia de B. sporothermodurans (Klijn y col., 1997). 3.4.6.3 ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD) La técnica amplificación polimórfica al azar (RAPD) es una forma de PCR arbitrariamente cebada que utiliza cebadores aleatorios de aproximadamente 10 pares de bases; mediante las cuales se buscan amplicones en todo el genoma y se amplifican. Esta técnica se emplea para repetir el ensayo con cada uno de una serie de diferentes cebadores porque diferentes cebadores producen diferentes fragmentos y de este se modo se consigue aumentar la probabilidad de detección de diferencias entre las cepas. La técnica de RAPD se ha utilizado para discriminar B. sporothermodurans de otros Bacillus spp. aislado de muestras de compost (Zhang y col., 2002). 3.4.6.4 Amplificación de secuencias palindrómicas extragénicas repetitivas (REP-PCR) El método ADN Rep-PCR se dirige a la secuencia palindrómica extragénica repetitiva que está presente en varios lugares, produciendo como característica una especial de “huellas dactilares” de las diferentes cepas bacterianas. B. sporothermodurans ha sido previamnete identificado mediante REP-PCR con éxito. Los cebadores Introducción 32 específicos se han empleado previamente para amplificar en el gen 16S rRNA de B. sporothermodurans segmentos de reacción de PCR, a lo cual sigue una etapa de análisis de electroforesis en gel de agarosa (Scheldeman y col., 2002; Herman y col., 1997). Además, la técnica REP-PCR no sólo ha permitido distinguir B. sporothermodurans de otras especies de Bacillus conocidos, sino que también puede diferenciar entre los B. sporothermodurans aislados de UHT y leche cruda (Scheldeman y col., 2006), lo que hace que esta técnica sea especialmente interesante para este trabajo. 3.5 Procesamiento ultra alta temperatura (UHT) Según la International Dairy Federation, el tratamiento UHT utiliza un rango de temperatura de 135 a 150 °C durante un tiempo corto, tales como 140 °C durante 2-3 s (Comité del Codex sobre la Leche y los Productos Lácteos, 2000). Este proceso garantiza la eliminación de las células vegetativas y las endosporas presentes en la leche cruda. Sin embargo, las esporas de B. sporothermodurans tienen una resistencia al calor excepcionalmente alta a temperaturas UHT, que es los valores D140 de esta especie que van desde 3.4 - 7.9s y los valores Z que van desde 13.1 – 14.2 °C (Huemer y col., 1998). Debido al hecho de que el aumento de la temperatura o el tiempo durante el cual se aplica el tratamiento térmico podrían conducir a la desnaturalización de proteínas, procesos de isomerización de la lactosa y reacciones de Maillard, no es recommendable incrementar el tratamineto término o su duración. Por este motivo, estas esporas de B. sporothermodurans pueden alcanzar el producto final y sus recuentos en el mismo pueden llegar hasta incluso 105 ufc/ml. Introducción 33 3.5.1 Tipos de tratamiento UHT 3.5.1.1 Sistema UHT directo En los sistemas de UHT directos, el calentamiento se realiza mediante la mezcla del producto con el vapor de agua (medio de calentamiento), seguido de un enfriamiento ultrarápido en una cámara de vacío (Figura 8). El proceso UHT directo puede incluir un sistema de calentamiento mediante inyección o mediante infusión. En el sistema de inyección, el vapor se inyecta en el product, mientras que en el sistema calentamiento por infusion, el producto es introducido en un recipiente lleno de vapor de agua. Sin embargo, el proceso UHT directo no se utiliza a menudo debido a que resulta más difícil y complejo controlar su correcto funcionamiento (Grijspeerdt y col., 2004). Figura 8. Diagrama de flujo para la producción de leche UHT (Jay y col., 2005). Introducción 34 3.5.1.2 Sistema UHT indirecto En los sistemas UHT indirectos, el calentamiento se transfiere desde el agua o vapor (medio de calentamiento) hacia el producto a través de un intercambiador del calor con presiones de funcionamiento elevadas para evitar la ebullición de la leche. Los sistemas indirectos se pueden basar en dos tipos de intercambiador, estos son los intercambiadores de calor de placas y los intercambiadores de calor tubulares. Además, es posible combinar los intercambiadores de calor en los sistemas indirectos de acuerdo con los requisitos del producto y de proceso. 3.5.2 Diferencias entre los sistemas de UHT De acuerdo con los dos tipos de proceso UHT, la calidad de la leche UHT que se procesa a través de UHT indirecto difiere de la producida mediante el sistema UHT directo. El proceso UHT directo requiere el consumo de una mayor cantidad de energía que el tratamiento UHT indirecto. Además de este importante inconveniente, el daño causado el producto, especialmente en los cambios químicos inducidos en la leche debidos al calentamiento, también son mayores en el sistema UHT directo que en el UHT indirecto (Hammer y col., 2000a). 3.6 Principales aplicaciones de métodos moleculares para la detección y cuantificación de los genes codificantes de factores de virulencia y B. sporothermodurans 3.6.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) La reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica genética consistente en Objetivos 43 OBJETIVOS Como primer objetivo de este trabajo fue poner de relieve los efectos del proceso de fermentación en la prevalencia real de los factores virulencia y los determinates de resistencia a antimicrobioanos en bacterias aisladas a partir de alimentos fermentados y no fermentados. Como marcador, fueron empleadas bacterias pertenecientes al género Enterococcus aisladas de alimentos de diferentes fuentes. Por otra parte, se desarrolló un método molecular, sensible, específico y rápido, capaz de detectar y cuantificar de forma directa los genes de virulencia ace, esp y gelE en los alimentos fermentados o no fermentados. Este método fue desarollado mediante RTiPCR TaqMan®, que es una técnica sensible y específica, que no había probada con anterioridad para la detección y cuantificación de genes de virulencia, en aislamientos procedentes de muestras de alimentos. El tercer objetivo de la presente Tesis doctoral fue el desarrollo de un nuevo método para la detección cuantitativa de B. sporothermodurans directamente en muestras de leche. Este método podría ser utilizado para el control de estos microorganismos en la leche UHT, y es el primer método diseñado para cuantificar B. sporothermodurans mediante RTi-PCR TaqMan® en muestras de leche. 5 RESULTADOS 5.1 CAPÍTULO 1 Resultados 49 RESULTADOS 5.1 CAPÍTULO 1 http://dx.doi.org/10.1007/s13213-015-1138-6 5.2 CAPÍTULO 2 Resultados 63 5.2 CAPÍTULO 2 http://dx.doi.org/10.1111/jam.13306 5.3 CAPÍTULO 3 Resultados 95 5.3 CAPÍTULO 3 http://dx.doi.org/10.3168/jds.2016-10852 6 DISCUSIÓN Discusión 117 col., 2006). En consecuencia, algunos autores han desarrollado previamente técnicas de PCR convencionales para detectar B. sporothermodurans (Herman y col., 1998; Scheldeman et al., 2002; Tabit y Buys 2011), si bien éstas habían sido desarrolladas sobre cultivos puros de microorganismos y no sobre la leche UHT, que es una matriz mucho más complicada. En este trabajo hemos desarrollado por primera vez, desarrollar un método para detectar mediante RTi-PCR TaqMan la presencia de B. sporothermodurans en leche UHT. El límite de detección del método desarrollado fue de 10 bacterias por ml (1 log ufc/ml) de B. sporothermodurans en muestras de leche UHT, que confirman la sensibilidad de este método para la detección y cuantificación de la especie bacteriana diana, mejorando resultados previos como el Martínez-Blanche y col., (2009), desarrollado para la detección de B. cereus en alimentos (60 ufc/ml). Es interesante observar que el límite de detección para nuestro nuevo método cumple con la legislación de la UE para la leche y productos lácteos (Anónimo 1992), así como con otros límites legales establecidos en algunos paíes terceros. Como otros resultados relevantes obtenidos en este trabajo, pudimos comprobar que los recuentos obtenidos en muestras comerciales de B. sporothermodurans result ser significativamente mayor en muestras de leche UHT entera en comparación con leche UHT desnatada. Esta diferencia podría relacionarse con la capacidad de la grasa para aliviar el efecto de las altas temperaturas en B. sporothermodurans (Ahmed y col., 1995). Además, algunas muestras de leche UHT recogidas en el mercado han dado resultados positivos mediante la técnica desarrollada RTi-PCR TaqMan, mientras que no mostraba resultados positivos mediante los métodos microbiológicos convencionales consistentes en siembra en placas de medios de cultivo. Esto podría ser debido a la acción residual de agentes inhibidores del crecimiento que Discusión 118 pueden usarse en algunas industrias lácteas como son: nisina y /o sorbato de potasio en las esporas y células vegetativas de B. sporothermodurans o también tratamientos de homogeneización de ultra-alta presión (Espejo col., 2014; Aouadhi col., 2015). No obstante es llamativo comprobar que es relativamente frecuente la presencia de B. sporothermodurans en muestras de leche UHT tomadas directamente de los mercados al por menor. Este hecho es possible explicarlo debido a que su presencia ocurre con mayor frecuencia en leches tratadas mediante UHT indirecta, en comparación la tratada mediante UHT directa (Scheldeman y al., 2006), además de contaminación de la leche en la granja (Vaerewijck y al., 2001). Estas bacterias formadoras de esporas tienen un efecto negativo en la calidad, la vida útil y la aceptabilidad por parte de los consumidores de leche UHT (Pettersson y col., 1996; Herman et al., 1998). Sin embargo, es posible controlar estos problemas mediante el uso del RTi-PCR Taqman desarrollado en este trabajo, para detectar las esporas o células vegetativas de B. sporothermodurans en un gran número de muestras de leche cruda de un modo rápido (menos de 2 h) para identificar las granjas lecheras con altas cantidades de estas bacterias. Del mismo modo, también ayudaría a dichas granjas, ya que una vez conocida su presencia deben modificar sus protocolos de limpieza, desinfección y ordeño a fin de comercilizar lecxhe con una mayor calidad microbiológica. Del mismo modo, es también un hecho muy importante el que a pesar de que se encontró una mayor presencia de dicho micoorganismo en leche entera, muy probablemente debido a la capacidad de la grasa para aliviar el efecto de las altas Discusión 119 temperaturas en B. sporothermodurans (Ahmed et al., 1995), las diferencias enocntradas no resultados estadístacamente significativas comparando los resultados obtenidos en leche UHT entera y desnatada. Este resultado abre la puerta a que el método desarrollado pueda ser empleado a nivel de industria lactea tanto en el caso de la leche UHT entera como en el caso de la leche UHT desnatada. 7 CONCLUSIÓN Conclusiones 123 CONCLUSIONES 8.1 Conclusiones generales Mediante este trabajo se ha revelado los efectos del proceso de fermentación de los alimentos tiene en la prevalencia de factores de virulencia y resistencia a antimicrobianos en bacterias pertenecientes al género Enterococcus spp en alimentos fermentados y no fermentados. Por otra parte, se ha diseñado un método específico y eficaz, capaz de detectar y cuantificar de forma directa, rápida y sensible tres de los genes de virulencia de enterococos en alimentos. Asimismo, se ha desarrollado tambien un método para la detección y la cuantificación B. sporothermodurans en leche UHT, lo cual puede servir como herramienta de control en la industria láctea. La incidencia de genes determinantes de factores de virulencia y resistencia a los antibióticos en enterococcos presentes en diferentes matrices alimentarias (leche, leche fermentada, queso, carne fresca y carne fermentada), varía dependiendo de las condiciones de los procesos de fermentación (temperatura, presencia de nitritos, alta presión, la sal, pH). Por ello es necesario conocer que factores promueven su presencia, ya que dichos factores de virulencia desempeñan un papel crucial en la patogenia y en el tratamiento de la enfermedades nosocomiales producidas por enterococos. Adicionalmente, por lo general dichas enfermedades nosocomiales producidas por enterococos suelen ser tratadas mediante la aplicación de antibióticos, que en el caso de no ser efectivos, pueden aumentar la virulencia de las cepas causantes de dichas Conclusiones 124 enfermedades en lugar de eliminar las bacterias. Varios estudios han intentado esclarecer esta regulación en respuesta a los efectos del medio ambiente de los alimentos. Dichos estudios han demostrado que la capacidad de adaptación genética y la capacidad de multiplicación de los enterococos desempeña un papel importante en el desarrollo de los linajes problemáticos, pero aportaron pocos datos acerca del efecto de las condiciones en las cuales de procesan los alimentos sobre la transferencia de genes en microbiota de alimentos y sobre la dinámica de la difusión de resistencia a antibióticos en alimentos fermentados como el queso y la carne curada. Además, algunos de estos estudios sobre los enterococos se han llevado a cabo utilizando las condiciones ambientales óptimas, lo que permite que las células crecen y se dividen normalmente. Esto so siempre se corresponde con las condiciones reales, por lo que la presente investigación resulta más relevante a la hora de esclarecer el impacto del proceso de fermentación en la prevalencia de factores de virulencia y resistencia a antibióticos en los alimentos fermentados y no fermentados. Un aspecto importante del concepto de seguridad alimentaria se basa en el control de los factores ambientales que eliminan o limitan el crecimiento de bacterias patógenas o no deseados en una matriz alimentaria. A fin de lograr eficazmente este objetivo, se requiere el conocimiento de las respuestas bacterianas a las condiciones ambientales, así como el desarrollo de nuevos métodos para detection de estas bacterias o genes de virulencia. El ensayo desarrollado mediante RTi-PCR TaqMan demostró ser una técnica más sensible y específica que empleando SYBR Green, y no había sido empleada anteriormente para la detección y cuantificación de genes de virulencia en muestras de alimentos. Por lo tanto, el método desarrollado podría ser utilizado directamente en los Conclusiones 125 productos alimenticios para la detección y cuantificación rápida de genes codificantes de factores de virulencia, lo cual representa un importante avance con respecto a la evaluación de la seguridad alimentaria. Por otra parte, este es el primer estudio para cuantificar estos factores de virulencia por ensayo específico TaqMan RTi-PCR en muestras de alimentos. Además trabajo también incluye un nuevo método para la detección cuantitativa en muestras de leche de B. sporothermodurans, una especial bacteriana capaz de producir esporas de alta resistencia térmica, que puede resistir la temperatura ultra alta tratamiento (UHT) o la esterilización industrial. Para su detección se ha diseñado un ensayo de PCR cuantitativa altamente específica capaz de cuantificar B. sporothermodurans directamente en muestras de leche, que podría ser utilizado para el control de estos microorganismos en leche UHT envasada. Los métodos similares que habían sido previamente publicados no eran directamente aplicables a muestras de leche, sino que habían sido realizados en cultivos puros. Conclusiones 126 8.2 Conclusiones específicas 1Los productos lácteos y la carne pueden desempeñar un papel importante en la difusión de factores de virulencia y resistencia a antimicrobianos a través de la cadena alimentaria. Se ha determinado que en este proceso puede tener una especial importancia E. faecalis, que contiene múltiples determinantes de virulencia y resistencia a los antibióticos en comparación con E. faecium. 2Los factores de virulencia fueron más prevalentes dentro de las cepas de Enterococcus aisladas a partir de alimentos fermentados y de origen lácteo, mientras que la resistencia a los antibióticos no pudo correlacionarse con el proceso de fermentación. 3En particular, los resultados obtenidos también han demostrado que el gen ace fue detectado en E. faecium, especialmente en cepas de alimentos fermentados. Por lo tanto, más interés se debe dar a las cepas utilizadas en aplicaciones biotecnológicas para la presencia de determinantes de virulencia y los antibióticos, especialmente en los productos lácteos fermentados para reducir la incidencia de infección nosocomial asociada a enterococos. 4Se ha desarrollado un metodo original de RTi-PCR acoplado a sondas TaqMan® que permite la detección y cuantificación de los genes de virulencia; ace, esp y gelE en Conclusiones 127 muestras de alimentos, lo que puede permitir un control microbiologico estricto de la presencia de estos factores de virulencia en cepas de enterococos. 5Ha podido establecerse un metodo basado en RTi-PCR TaqMan® que permite la detección y cuantificación de B. sporothermodurans en leche UHT, lo que puede ayudar en la localización de la presencia de este microorganismo en muestras de leche cruda o incluso en las muestras que se han producido del ambiente de la planta. 6Se ha demostrado que el procedimiento RTi-PCR Taqman® representa un método rápido y específico para detectar la presencia de los genes de virulencia de Enterococcus y B. sporothermodurans en muestras de alimentos y leche UHT, respectivamente. 8 BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 137 Franz, C., Holzapfel, W., Stiles, M. 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