Nuevas metodologías para la determinación de edulcorantes y otras sustancias polares mediante cromatografía líquida

D M D E NUE V ETER M O T M EDI A E PARTAM E P V AS M M IN A T RAS A NTE C ED G E NTO DE Q P ROGRA M M ET O A CIÓ N SUS T C RO M G AR YESI D Q UIMICA A M A DE CIE N FACUL T Santia g O DOL O N DE E T ANC I M AT O D ORDÓ Ñ A NALÍTIC A N CIA Y TE C TAD DE Q U g o de Co m 2017 TE S O GÍA S E DUL C I AS P O O GRA F Ñ EZ ORJ U A , NUTRIC I C NOLOGÍ A U IMICA m postela S IS D S PA R C OR A O LAR F ÍA LÍ U ELA I ÓN Y BR O A QUÍMIC A OC T R A LA A NTE S ES QUI D O MATOLO G A T OR A S Y D A G ÍA A L D. José Benito Quintana Álvarez, Dña. Mª del Rosario Rodil Rodríguez y D. Rafael Cela Torrijos, profesores del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, Como directores de la Tesis Doctoral titulada “NUEVAS METODOLOGÍAS PARA LA DETERMINACIÓN DE EDULCORANTES Y OTRAS SUSTANCIAS POLARES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA” presentada por D. Edgar Yesid Ordóñez Orjuela alumno del Programa de Doctorado Ciencia y Tecnología Química, AUTORIZAN la presentación de la Tesis indicada, considerando que reúne los requisitos exigidos en el artículo 34 del reglamento de Estudios de Doctorado y que como directores de la misma no incurren en las causas de abstención establecidas en la Ley 30/1992. Santiago de Compostela, 24 de febrero de 2017. Fdo. D. José Benito Quintana Álvarez Fdo. Dña. Mª del Rosario Rodil Rodríguez Fdo. D. Rafael Cela Torrijos D. José Benito Quintana Álvarez, Dña. Mª del Rosario Rodil Rodríguez y D. Rafael Cela Torrijos, como directores de la Tesis Doctoral titulada “NUEVAS METODOLOGÍAS PARA LA DETERMINACIÓN DE EDULCORANTES Y OTRAS SUSTANCIAS POLARES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA”, Por la presente DECLARAN: Que la tesis presentada por D. Edgar Yesid Ordóñez Orjuela es idónea para ser presentada, de acuerdo con el artigo 41 del Reglamento de Estudios de Doctoramiento, por la modalidad de compendio de ARTICULOS, en los que el doctorando tuvo participación en el peso de la investigación y su contribución fue decisiva para llevar a cabo este trabajo. Que los artículos que forman parte del trabajo de esta Tesis han sido realizados durante la etapa de los estudios de doctorado y que han sido aceptados en revistas de reconocido prestigio internacional con revisión anónima por pares de acuerdo con el artículo 41 del presente Reglamento. Que está en conocimiento de los coautores, tanto doctores como no doctores, participantes en los artículos, que ninguno de los trabajos reunidos en esta tesis serán presentados por ninguno de ellos en otra tesis de Doctorado, lo que firmamos bajo nuestra responsabilidad. Y, para que así conste, firmamos el presente informe en Santiago de Compostela, 24 de febrero de 2017. D. José Benito Quintana Álvarez Dña. María del Rosario Rodil Rodríguez D. Rafael Cela Torrijos AGRADECIMIENTOS Durante todo este tiempo de trabajo científico y a punto de finalizar una de las etapas más largas de mi vida académica no me resta más que expresar un sincero agradecimiento a todos aquellos que han hecho realidad este sueño. Recuerdo cuando decidí emprender este camino que para muchos loco, pero para mí el más gratificante, viajar desde 8000 Km de distancia a una tierra completamente desconocida de costumbres y cultura diferente a la natal pero llena de riqueza humana y mítica en su sentir. Que linda tierra Gallega la que me acogió por este tiempo con enseñanzas en su cultura, en su gastronomía, en su historia en fin gracias señores gallegos, eso son ustedes unos señores en todo el sentido de la palabra que acogen al extranjero con cariño y abrigo como si fuese uno más de su casa. Agradecer al Ministerio de Ciencia e Innovación / de Economía y Competitividad, a los fondos europeos (FEDER) y autonómicos (Xunta de Galicia) por la financiación recibida a través de los proyectos CTQ2009-08377, CTQ2010-18927, CTQ2012-33080 y GRC2013-020. Gracias grupo de compañeros con los cuales compartí momentos especiales de tertulia a la hora de la comida o en momentos diferentes a los académicos pero siempre haciéndome participe de ustedes me refiero a Inés, Eugenia Tamara, Sarita, Tania, Iria, Jorge, Juan, en fin tanto otros que pasaron por el laboratorio durante este lapso de tiempo les presento excusas si no los recuerdo a todos pero es normal que con el pasar de los años los nombres se olviden pero nunca sus rostros o sus vivencias gracias compañeros. No puedo dejar de agradecer a Rafael Cela que confió en mí y me acepto en su grupo de investigación sin poner reparo alguno y siempre dispuesto ayudarme y hacer lo mejor de mí. A mis demás tutores Tito y Charo gracias por formarme, por escucharme por permitirme aprender aunque haya sido un poco de todo ese mar de ciencia que son ustedes, unos lideres verdaderos que realmente se comprometen con su quehacer diario, no importa la juventud o el clima, solamente importan sus compromisos académicos ejemplos dignos de imitar, pocos como ustedes siempre dispuestos aportar lo mejor de sí para cada uno de sus investigadores. Gracias señores. Esposa mía no puedo dejar de terminar este escrito sin decirte gracias preciosa por ser como eres fuerte como un roble incólume ante las adversidades y sobre todo ese apoyo irrestricto que siempre has sido, me apoyaste en esta locura de estudiar en tierras lejanas sin dinero solamente con las ganas del querer ser. Eso amor mío vale más que mil palabras como reza el adagio popular “no basta con ser la mujer del Cesar si no parecerlo”. Una dama que me apoyo a lo largo de este proceso desde el inicio y ahora hasta el final. Gracias… esposa mía. No puedo dejar de agradecer al pueblo español y en especial a Santiago de Compostela que hermosa ciudad, los secretos que encierra en sus calles estrechas en los bares antiguos y lúgubres en sus calles adoquinadas, en ese sentir de pueblo pero a la vez de ciudad moderna a ese encanto indescriptible que tiene el pueblo de Santiago a eso que solamente se puede describir si has vivido en Santiago. A mi universidad llena de conocimiento de historias, de lugares llenos de secretos, de laboratorios antiguos y modernos en fin un millón de gracias. “La constancia vence lo que la dicha no alcanza” (Anónimo) I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 3 En la última década una serie de contaminantes que ha suscitado gran atención e importancia son los denominados contaminantes emergentes. Esto se debe a la gestión insostenible de productos químicos sintéticos y algunos naturales que a través de su ciclo de vida han dado lugar a una contaminación generalizada y masiva del medio ambiente. La regulación para este tipo de compuestos no es lo suficientemente estricta, aunque investigaciones muy sólidas han encontrado efectos adversos en la salud. Por ello es necesario monitorizar su comportamiento e incidencia en el medio ambiente. Entre los contaminantes emergentes se encuentran los edulcorantes, en general sintéticos, que aportan bajo contenido calórico utilizados por un amplio espectro de la población. Los edulcorantes sintéticos más conocidos han sido la sacarina y el ciclamato, cuyo uso ha generado una fuerte controversia a nivel internacional que perdura hasta la fecha, dado que algunos estudios vinculan su empleo en altas dosis con el cáncer de vejiga en animales de laboratorio, mientras que otros estudios lo niegan [1]. El aspartamo, menos tóxico que los anteriores, presenta sin embargo efectos secundarios neuropsíquicos así como ciertos efectos paradojales que pueden provocar inhibición del supresor del apetito cuando son consumidos en dosis elevadas. En los últimos tiempos han surgido los edulcorantes obtenidos a partir de productos naturales como taumatina y esteviosidos, entre otros, los que parecen presentar menores efectos tóxicos [2]. Estos compuestos se encuentran a niveles traza en matrices de mayor o menor complejidad. Por ello, para su determinación se requieren metodologías analíticas con bajos límites de cuantificación, buena repetibilidad y exactitud, que además resulten sostenibles, atendiendo al consumo de disolventes y la generación de residuos, y aplicables a efectos prácticos en base a su robustez y su coste. La principal dificultad para la determinación de estos compuestos reside en su alta polaridad, que dificulta su extracción y determinación. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 4 Para la realización de esta tesis se han seleccionado un grupo de edulcorantes (acesulfamo, ácido ciclámico, alitamo, esteviosido, aspartamo, neotamo, neohesperidina dihidrochalcona, sacarina y sucralosa) altamente consumidos. Estos contaminantes se introducen en el medio ambiente, fundamentalmente, a través de las aguas residuales urbanas (como resultado, en último lugar, de tratamientos de depuración incompletos). Por este motivo, los principales objetivos de la presente tesis doctoral han sido: - Desarrollar metodologías analíticas, robustas, selectivas y sensibles que permitan determinar la presencia de estos analitos altamente polares en muestras de aguas residuales (tratadas y sin tratar), así como en aguas de rio, lagos y lagunas, buscando mejorar en la medida de lo posible metodologías existentes. - Aplicar las metodologías desarrolladas a muestras reales con el fin de validarlas y comprobar la robustez de las mismas. - Desarrollar metodologías analíticas robustas, sensibles y selectivas para la determinación de edulcorantes en lodos de depuradora para determinar su posible asociación con los mismos. - Evaluar nuevas metodologías cromatográficas ambientalmente más amigables para la determinación de compuestos altamente polares. - Desarrollar técnicas analíticas capaces de ser amigables con el medio ambiente disminuyendo el consumo de disolventes orgánicos tóxicos y aumentando el consumo de agua como disolvente verde. II. INTRODUCCIÓN edu l ali m per m cant i al gu per m edu l (AS P (SU C mu e lista d edu l el A l en o edu l Tabl a ED U 1. 1.1. As p Los e d l corantes n m entos, be b m iten la s e idad. Ha y u nos se us a m itidos v a l corantes d P ), Ciclam C ), Neohe s e stran en l a do corres p l corante d e l itamo (A L tros paíse s La est r l corantes e a 1 . U LCORA N p ectos g en e d ulcorante s n o nutriti v b idas, co n e nsación d y un g ran a n en la i n a ría de p a d e alta in t ato de So d s piridina D a Figura 1 p ondiente e altísima i L I), el cual s como Au r uctura q u e studiados N TES e rales de l o s artificia l v os forma n n fitería e d ulce sin i número n dustria m o a ís en paí s t ensidad a d io (CIC), D ihidroch a [3, 4], mi e no inclu i ntensida d aún no se stralia, C h u ímica y en el pres o s edulcor a l es de a l n una clas e industria i n g esta d e de edulc o o derna. E l s . En la U a utorizad o Neotamo a lcona (N H e ntras qu e uy e CIC n d , 2000 ve c ha aprob a h ina y Nue v a las pr o ente traba j a ntes artif i l ta intens i e importa n farmacé u e calorías o rantes co n l listado d e U nión Eu r o s: Acesul f (NEO), S a H DC) y E s e en los E s n i NHDC es más en d do en los E v a Zeland a o piedades j o se mue s ED U i ciales i dad tam b n te de adit i u tica. Est o o en una n ocidos, p e edulcora n r opea (UE f amo (AC a carosa (S A s teviósido s tados Un i [5]. Ade m d ulzante q E EUU ni e n a [2] físico-q u s tran en la U LCORA N b ién lla m t ivos usad o o s comp u mu y pe q p ero sola m ntes artifi c E ) existen C E), Aspar S AC), Sucr (STEV), q u i dos (EEU U m ás, exist e q ue la sac a n la UE, p e u ímicas d e Figura 1 y N TES 7 m ados o s en estos q ueña m ente c iales ocho t amo a losa u e se U ) el e un a rosa, e ro sí e los en la INTRODUCCIÓN 8 Figura 1. Edulcorantes artificiales estudiados en este trabajo. Para aquellos aprobados por la UE se muestra el código E EDULCORANTES 9 1.1.1. Acesulfamo El acesulfamo (ACE), también llamado acesulfamo K debido a que se utiliza como sal de potasio, es un polvo blanco cristalino, aproximadamente 200 veces más dulce que la sacarosa, tan dulce como el ASP, pero presenta un sabor ligeramente amargo. Fue descubierto de manera accidental en 1967. Se utiliza normalmente en mezclas con otros edulcorantes como SUC o ASP. Una vez combinado, su perfil endulzante es muy similar al de la sacarosa [6]. Es estable térmicamente por lo que se puede utilizar como aditivo en la cocina y el horneado [7]. Es estable también a diversos pHs, incluyendo exposición prolongada en medio acuoso y pH ácido [8]. El ACE no es metabolizado por el cuerpo humano, y se elimina inalterado a través de la orina [2]. Es un compuesto muy polar que se encuentra en disolución siempre ionizado debido a que posee un pKa muy bajo (-0,28). 1.1.2. Ácido ciclámico El ácido cliclámico (CIC) se utiliza en forma de sal de Na o Ca. Es un polvo sólido cristalino inodoro entre 30 y 50 veces más dulce que la sacarosa, por lo que es el menos potente de los edulcorantes artificiales comercializados. Fue descubierto en 1937. Debe usarse en mezcla con otros edulcorantes, el más común SAC. Su uso como edulcorante está permitido en al menos 130 países pero está prohibido en EEUU desde 1970 [5]. Es estable térmicamente por lo que se puede utilizar como aditivo en la cocina y el horneado [9, 10]. No se metaboliza en el cuerpo humano y se elimina sin modificar. Es un compuesto polar (logKow =1.033) que se encuentra ionizado en disoluciones acuosas, debido a su bajo pKa (ver Tabla 1). INTRODUCCIÓN 16 Tabla 2. Legislación de la UE de uso en bebidas para los edulcorantes estudiados [4, 25] TIPO DE BEBIDA Concentración en mg/L Compuestos Néctares de fruta, tal como se definen en la Directiva 2001/112/CE, y néctares de productos similares a Bebidas aromatizadasa Cervezas y bebidas a base de maltad Sidra y Perada Otras bebidas alcohólicase ACE 350 350 350, 25a 350 350 CIC 250 250 NP NP 250 ALI NP NP NP NP NP STEV 100 80 70 NP 150 ASP 600 600 600, 25a 600 600 NEO 20 20 20, 1a 20 20 NHDC 30 30, 50b 10, 10a 20 30 SAC 80 80, 100c 80 80 80 SUC 300 300 250, 10a 50 250 a Solo de valor energético reducido o sin azúcares añadidos; b solo leche y bebidas lácteas aromatizadas de valor energético reducido o sin azúcares añadidos; c solo bebidas carbónicas de valor energético reducido o sin azúcares añadidos; d solo cerveza sin alcohol o con grado alcohólico inferior a 1,2 % vol., Table Beer (que contenga menos de un 6 % de mosto primitivo), cervezas con una acidez mínima de 30 miliequivalentes expresada en NaOH y cervezas negras del tipo oud bruin; e exceptuando vino, hidromiel y bebidas espirituosas; NP No permitido. 1.3. Toxicidad y ecotoxicidad Para la caracterización de riesgo de los edulcorantes no nutritivos, el Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA) ha establecido niveles de ingesta diaria admisible (IDA). Estos niveles varían de un compuesto a otro (Tabla 1), pero se encuentran entre 1 mg/kg de peso corporal para ALI a 40 mg/kg de peso corporal para ASP [19]. Para el CIC no existe un IDA establecido por el JECFA pero si por el Comité Científico en Alimentación de la UE en 5 mg/kg de peso corporal [20]. EDULCORANTES 17 Desde el comienzo del uso de edulcorantes artificiales, hay un debate continuo sobre sus posibles riesgos para la salud. Numerosos estudios evalúan dichos riesgos y otras cuestiones de seguridad sobre estos compuestos [2, 22, 26-28]. Muchas investigaciones relacionan la SAC con problemas de cáncer de vejiga en ratas y la correlación en humanos con este tipo de cáncer en pacientes que consumen habitualmente SAC [1, 29-31]. Aunque algunos estudios correlacionan el consumo de ACE, SUC, STEV y CIC y la incidencia de cáncer en ratas, perros y monos [23, 28, 32-35]. A pesar de todos los estudios realizados aún no se puede afirmar que los edulcorantes artificiales produzcan cáncer en humanos. Existen algunas investigaciones donde se le atribuye a la SUC ser un potenciador de la migraña [32]. Además, otros estudios sobre SUC dicen que la mezcla con otros edulcorantes como maltodextrinas produce efectos adversos en las ratas macho, como alteraciones en el peso corporal, problemas en la microflora intestinal, cambio en la actividad enzimática intestinal y fallos a nivel proteico [36]. Una posible causa de los efectos tóxicos del consumo de edulcorantes artificiales podría ser debida a los productos de degradación de estos compuestos. Por ejemplo el CIC por sí mismo presenta baja toxicidad, pero es parcialmente metabolizado por las bacterias intestinales a ciclohexilamina, la cual es muy tóxica para el organismo humano [9]. Algunas personas al consumir CIC durante un largo periodo de tiempo lo excretan sin transformarse y otras lo metabolizan en ciclohexilamina [37]. Uno de los productos de degradación del ACE es la acetoacetamida, la cual, si se consume en grandes cantidades, es tóxica para el ser humano [38]. Este compuesto es producido durante el almacenamiento prolongado de bebidas que contienen ACE. El ASP es metabolizado por el cuerpo humano en sus estructuras fundamentales: ácido aspártico, fenilalanina y metanol. La fenilalanina es tóxica para personas que presentan fenilcetonuria (enfermedad metabólica). El ASP al INTRODUCCIÓN 18 almacenarlo por largos periodos de tiempo a altas temperaturas también se degrada en ácido aspártico, fenilalanina, metanol así como un subproducto la dicetopiperazina que en altas concentraciones es tóxica para el ser humano [2]. La única información que existe sobre ecotoxicidad de los edulcorantes se remite a la SUC. En una investigación sobre bioacumulación de SUC, se estudió el comportamiento y los efectos fisiológicos de la SUC en crustáceos [39]. Se encontró que tanto la fisiología como el comportamiento de locomoción se vieron afectados por la exposición a este edulcorante. Independiente de si estas repuestas de comportamiento se iniciaron mediante mecanismos tradicionales tóxicos o efectos estimulantes, debe considerarse como una advertencia, ya que los organismos pueden cambiar de comportamiento normal, lo que en última instancia puede tener consecuencias ecológicas de gran impacto [40]. Es necesario realizar más investigaciones sobre el impacto ecotoxicológico de los edulcorantes artificiales, debido a que los efectos a largo plazo de una exposición continua a niveles bajos de estos compuestos es bastante desconocida [41]. 1.4. Presencia de edulcorantes en el medio ambiente 1.4.1. Edulcorantes en agua de depuradora Los edulcorantes artificiales son contaminantes traza, que al igual que los productos farmacéuticos y los productos de cuidado personal (PPCPs), se encuentran en las aguas residuales y de allí migran a las aguas superficiales. De los siete edulcorantes artificiales que se suelen analizar en las aguas residuales (ACE, ASP, CIC, NEO, NHDC, SAC y SUC) sólo cuatro, ACE, CIC, SAC y SUC, suelen ser detectados [41-43], esto es esperable ya que ASP, NEO, ALI y NHDC se metabolizan en el cuerpo y humano por lo que será más probable encontrar en las aguas residuales los principales metabolitos que los compuestos originales [37]. EDULCORANTES 19 La mayoría de estudios existentes concentran sus esfuerzos en la SUC. Las determinaciones de SUC han sido realizadas en efluentes e influentes de plantas de tratamiento de aguas residuales en Suecia [44-46], Suiza [47-49], Alemania [43, 49, 50], Austria [49], Canadá [51, 52] e Israel [43]. En todos estos estudios la concentración de SUC se encontró entre 0,02 y 80 µg/L. Los estudios realizados en Suiza, Alemania y Suecia además mostraron que no existe una eliminación significativa de la SUC durante los tratamientos mecánicobiológicos de aguas residuales. Otro edulcorante que no se elimina en las plantas de tratamiento de aguas residuales es el ACE, que se ha encontrado en aguas residuales de Suiza [47, 49], Alemania [43, 49, 50], Austria [49], Canadá [51, 52] e Israel [43]. Los niveles de ACE encontrados en Suiza y Alemania fueron 1 o 2 órdenes de magnitud mayores que los niveles de SUC. Por otro lado el CIC si es eliminado en más de un 99% durante los tratamientos secundarios y terciarios en las plantas de tratamiento de aguas residuales. En influentes se ha encontrado en aguas residuales de Suiza y Alemania en [47, 49] a concentraciones entre 10 y 200 µg/L. La eliminación de SAC en las plantas de tratamiento de aguas residuales es similar al CIC, mayor del 90%, encontrándose concentraciones en influentes en de varias decenas de µg/L y en efluente del orden de 1 µg /L [47, 49]. Debido a las altas concentraciones de ACE y SUC [42, 47, 53, 54], combinado con su persistencia [42], la alta solubilidad en agua, su baja absorción en sólidos, y la alta sensibilidad de los métodos analíticos modernos para la detección de trazas, los hacen marcadores antropogénicos ideales de contaminación con aguas residuales [47, 50, 52, 54, 55]. Usando el ACE como marcador, se pueden detectar incluso aportaciones de agua residual en las corrientes de agua de menos del 1% [47]. INTRODUCCIÓN 20 1.4.2. Edulcorantes en aguas superficiales y subterráneas Al igual que en aguas residuales los edulcorantes artificiales que han sido encontrados en aguas superficiales y subterráneas son SUC, ACE, CIC y SAC, siendo ACE y SUC los compuestos encontrados con mayor frecuencia y mayor concentración [43, 47]. Como se desarrolla a continuación las concentraciones de ACE y SUC encontradas estuvieron en el rango de ng/L a µg/L en ríos y lagos. La SUC ha sido el edulcorante más estudiado y su distribución ha sido monitorizada de forma muy extensa en Europa por Loss y col. [56], encontrando concentraciones de hasta 1 µg /L de SUC a lo largo de 120 ríos en 23 países. Las primeras mediciones en aguas de lago se realizaron en Suiza en 2008, donde la SUC no fue detectada en grandes concentraciones [47]. En otro estudio realizado en agua de lago, en este caso en el lago Constanza en Suiza se encontraron concentraciones de SUC entre 0,013 y 0,009 µg/L en el epilimnio y el hipolimnio del lago respectivamente [49]. Además de los estudios de agua dulce, existen algunas publicaciones sobre la presencia de SUC en agua de mar, detectándose en concentraciones de 0,0008 a 0,39 µg/L en aguas de la costa de EEUU [57, 58]. En otro estudio realizado en agua del mar Ártico de Noruega no se detectó SUC, hay que tener en cuenta que este mar noruego tiene un aporte insignificante de aguas residuales [58]. El ACE se encontró en ríos de Alemania y Suiza a concentraciones mayores que la SUC, entre 0,01 y 2,7 µg/L [43, 47]. En aguas subterráneas en un estudio llevado a cabo por Buerge y col. en el área de Zurich (Suiza) se encontraron concentraciones de hasta 4,7 µg/L [47]. En agua subterránea en Alemania los niveles de ACE fueron más altos, entre 12 y 6,9 µg/L [59]. 1.4.3. Edulcorantes en lodos Los principales estudio en lodos se realizaron en Suecia, con lodos de dos plantas de tratamiento de aguas residuales [45, 46], y en Suiza, en lodo digerido EDULCORANTES 21 de cuatro plantas de tratamiento de aguas residuales [53]. Estos estudios concluyen que no existe una adsorción significativa de los edulcorantes ACE, CIC, SAC [53] y SUC [45, 46, 53] en partículas de lodo. En el estudio suizo, ACE se encontró a mayor concentración entre 23-43 µg/L, para los otros compuestos las concentraciones estaban en el rango entre 0,6 y 16 µg/L. En general las concentraciones medidas en el lodo digerido fueron similares a las concentraciones en las aguas residuales sin tratar, a excepción de CIC, que se degrada en aproximadamente un 90% en los tanques de digestión [53]. de c aisl a con de o bus c la c o doc t lod o sóli d cro m se r e en t á pres dat a resi n con c la r e en u los s MET O ME T 2. ED U Uno de c ualquier a a r el anali t el sistema o tras espe c c ando así m o ncentraci ó t oral se ha o s y bebid a d a (SPE) m ato g ráfic o e alizó me d á ndem (H P En esta ente tesis. 2.1. Ext r Se trat a a de la déc n a Rohm c entracion e e tención s e u n disolve n s i g uientes o O DOLOGÍ A T ODOLO G U LCORA N los punt o a nalito es t o de la m a de deter m c ies que p u m e j orar la ó n, con el abordad o a s siendo l y extra c o de los a n d iante cro m P LC-MS/ M sección s r acción en a de una t ada de lo s y Haas e s contam i e lectiva de n te adecu a o b j etivos: A PARA L G ÍA PARA N TES s clave en la prepar a a triz que l m inación a u edan cau selectivid a f in de me j o la deter m l as técnic a c ción por n alitos extr m ato g rafía M S). e reco g e u fase sólid a é cnica de s 70 cuan d XAD fue r i nantes or g analitos e n a do. Con l a L A DETER M A LA DET E n el proces o a ción de l a l o contien e a utilizar. L sar interf e a d del mé t orar la se n m inación d a s de extr a líquidos r aídos por a líquida a c u na revisi ó a (SPE) preparaci ó d o column a r on usad a g ánicos d e n un adso r a SPE se p M INACI Ó E RMINAC I o de análi s a muestra . e haciend o L o ideal e s e rencia en t odo. Tam b n sibilidad d e edulcor a a cción usa d presuriz las técnic a c oplada a ó n de las ó n y trat a a s empaq u a s para c e muestras r bente sól i p retende c o Ó N DE ED U I ÓN DE s is para la . El princi p o que este s poder se p el mome n b ién se de b del méto d a ntes artif i d as: la ext r a da (PL E s descrita s espectro m técnicas u miento d e u etadas co n c oncentrar de a g ua. do y su p o o nse g uir u U LCORA N determin a i pal ob j eti v sea comp a p arar el a n n to del an á be increm e d o. En esta i ciales en a racción e n E ). El a n s anterior m m etría de m u tilizadas e e muestra s n partícul a a mu y Está basa d o sterior el u u no o vari o N TES 23 a ción v o es a tible n alito á lisis, e ntar tesis ag ua, n fase álisis m ente m asas e n la s que a s de ba j as d a en u ción o s de INTRODUCCIÓN 24 • Enriquecimiento de trazas: extracción de grandes cantidades de muestra a pequeños volúmenes de elución. De esta manera, los analitos a niveles de trazas se ven concentrados antes de la etapa de medida. • Limpieza de las muestras: debido a la selectividad del adsorbente y/o utilizando los disolventes de lavado adecuados se eliminan interferencias presentes en la muestra. • Fraccionamiento de la muestra: ésta se divide en grupos de compuestos que son eluídos con el disolvente adecuado en cada caso. • Almacenamiento de analitos: se pueden guardar de esta manera analitos que son inestables en medio líquido o que tienen una alta volatilidad. Entre sus múltiples ventajas se destacan frente a la extracción líquidolíquido: baja manipulación de muestra, bajo consumo de disolventes orgánicos y facilidad de automatización [60]. Por estos y otros motivos, la SPE es la técnica de referencia en la preparación de muestras de agua [61] y de matrices líquidas en general. 2.1.1. Etapas del proceso de extracción mediante SPE Las etapas de la técnica de SPE se detallan a continuación (Figura 2) [60, 62]:  Acondicionamiento: Etapa necesaria para obtener resultados reproducibles cuando se trabaja con fases ligadas o enlazadas sobre partículas, específicamente con fases no polares como C18. Consiste en tratar el adsorbente con uno o varios disolventes capaces de solvatarlo, facilitando así su posterior contacto con los componentes de la muestra. Entre los disolventes más empleados están el metanol (que interacciona tanto con los grupos silanoles polares como con los grupos funcionales ligados apolares), el acetonitrilo, el isopropanol, el tetrahidrofurano y la acetona. Con otros materiales, el aco n ob j e t sóli d inte r ads o pas a sóli d par a lava sie m son fuer t MET O n dicionam i t ivo es li m  P d a, que r e r ferentes. o rbente se g  a un disol v d a; es imp a lo cual s do (sufici e m pre se rea  eluidos d t emente c O DOLOGÍ A i ento pue d m piar el ad s Figura 2 P aso de la e tiene sele c La reten c g enera un a Lavado o v ente que ortante q u e debe pr e e ntement e liza. Elución d el adsorb e c on ellos A PARA L d e realiza r s orbente. 2 . Etapas tí p muestra: c tivament e c ión se p r a atracció n elución d ten g a m á u e en este e star espe e selectivo d e los ana l e nte medi a que las p L A DETER M r se o no, p icas de un p se hace p a e los anal i r oduce p o n intermol e d e la matr á s afinida d proceso n e cial atenc i o ) y de l a l itos: los a ante una p artículas M INACI Ó y si se ll rocedimient o a sar la m u i tos y al gu o rque ent r e cular. iz: una v e d por las i n o se vea n i ón a la e l a fase est a a nalitos co n fase líqui d de fase Ó N DE ED U e va a ca b o de SPE u estra a tr a u nos de l o r e estas m e z car g ada n terferenc arrastrad o l ección de l a cionaria. n centrado s d a que in t sólida. L a U LCORA N b o su pri n a vés de l a os comp u m oléculas la muest r c ias que l a os los an a l disolven t Esta etap s y purifi c t eracciona a cantida d N TES 25 n cipal a fase estos y el r a, se a fase a litos, t e de a no c ados más d de INT R 32 de s pud i cicl o el m la Fi g con s R ODUCC I s u volum e i esen que d o s de extra c 2.2.2. E La técn i m odelo má s g ura 4 . Indepe n s tan de: • u n • u n m • u n • n i I ÓN e n interio r d ar en ell a c ción, es d E quipami e i ca de PL E s utilizad o F n dienteme n n a bomba n horno m antenerla s n vial cole c i tró g eno p r , para a r a . Ese vol u i vidido e n nto para P E fue com e o es el extr a F i g ura 4. E q n te del m o para imp u donde s s a la tem p c tor en do n ara pur g a r r rastrar p o u men, en n tre el nú m P LE e rcializada a ctor ASE q ui p o ASE 2 0 o delo y la u lsar el dis s e introd u p eratura s e n de se rec o r la celda a o sibles tra el caso d e m ero de los en 1995 p 200, cu y a 0 0 de Dione x casa com e o lvente, u cen las e leccionad a og e el extr a a l final del z as de lo e que se u mismos. p or la com p foto g rafí a x . e rcial, los e celdas d a , a cto líqui d proceso d e o s analitos u sen dos o p añía Dio n a se muest r e quipos d e d e acero d o, e extracci ó que más n ex y r a en e PLE para ó n. METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE EDULCORANTES 33 2.2.3. Etapas del proceso de extracción por PLE Las etapas del proceso de extracción por PLE se explican a continuación [68]: Preparación de muestra: Con esta etapa se pretende reducir el tamaño de partícula para aumentar la superficie de contacto entre la muestra y el disolvente, evitando también la agregación de las partículas de la muestra. Para ello, se utilizan agentes dispersantes como la arena o la tierra de diatomeas. La muestra debe secarse para evitar la presencia de agua que dificulte la penetración de disolvente en sus poros, sobre todo cuando se trata de extraer analitos poco polares con disolventes apolares. Para ello, se aconseja la liofilización de la muestra, el secado en horno o la adición de agentes desecantes. Preparación de celda: Se colocan filtros de celulosa y/o fibra de vidrio en los extremos de la celda con el fin de evitar la obturación de los conductos del extractor de PLE. La celda se rellena con la muestra y con una matriz inerte (tierra de diatomeas, arena) para ocupar el volumen muerto. Además se pueden introducir co-adsorbentes para purificar el extracto en la misma etapa. Extracción: La celda se introduce en el horno a la temperatura de extracción, se rellena con disolvente y se presuriza. También se puede precalentar la celda previamente y mantenerla a esa temperatura un tiempo determinado. Después de recoger el disolvente con los analitos en el vial colector, se bombea disolvente fresco a través de los conectores y celda (% de flush). Finalmente, se purga la celda con nitrógeno para arrastrar el disolvente que permanece impregnando la muestra, el dispersante y, en su caso, el coadsorbente en la celda. INT R 34 sep a anal un r e El a n fase vol ú quí m Dep de l a com met a Este a lo s mat r com diso actu R ODUCC I 2.3. Cro d 2.3.1. C La cro m a rar comp o ito y la c o e servorio d n alito se p a móvil lí q ú menes al f m icas con l El reta r ende de l a a fase m ó m binacione s a nol o ace t Estas c o consiste e s diferent e r iz del an a m posición d 2.3.1.1. 2.3.1.1. 1 Es uno lución, se ales por H I ÓN mato g rafí a d e masas ( H C romato gr m ato g rafía o nentes u s o lumna cr o d e fase m ó a sa a trav é q uida con f lu j o de la a fase esta r do se co n a naturalez ó vil. Los d s de a g u a t onitrilo [7 0 o mbinacio n e n la varia c e s analitos a lito y de o d e la fase m Mecani 1 .Croma t de los pr i estima qu e H PLC se a Líquida d H PLC-MS ) r afía Líqui d líquida d e s ando una o mato g ráf i ó vil, bomb a é s de una c alta pres i fase móv i c ionaria m n oce co m a del anal i isolventes a purifica d 0 , 71]. n es intro d c ión de la c y conse gu tros analit o m óvil [72]. smos de s e t o g rafía d e i ncipales m e entre el 8 realizan p d e alta res o ) d a de alta r e alta reso variedad i ca. Física m a , in y ecto r c olumna d e i ón. La m i l y allí se m ientras at r m o tiempo i to, de la f a más co m d a con di s d ucen el c composici u ir me j ore s os en func e paración e e fase reve r m étodos p 8 0 y 90% d p or RPLC o lución ac o r esolució n lución (H P de intera c m ente es u , columna e la fase e s m uestra se retarda p o r aviesa la c de rete n a se estacio n m unes usa d s olventes oncepto d ón de la f a s resultad o ión de la a e n HPLC r sa (RPLC ) p ara la se p d e las sep a [73]. Se c o plada a e s (HPLC) P LC) es u n c ciones qu u n sistema de separa c s tacionari a introduc e o r medio d c olumna [ 6 n ción par a n aria y de d os en la f or g ánicos , d e g radie n a se móvil, o s. El g ra d a finidad d e ) p aración d e a raciones c c aracteriz a spectrom e n a técnica u ímicas en t a compues t c ión y det e a bombea n e en peq u d e interacc i 6 9, 70]. a cada a n la compo s f ase móvi l , normal m n te de el u para ada p d iente sep a e l analito p e molécul a c romato g r á a por una e tría para t re el t o de e ctor. do la u eños i ones n alito. s ición l son m ente ción. p tarse a ra la p or la a s en á ficas fase esta c 18 c pol a par a mis m mó v or ga Ta m actú fase utili z met a pro p trad u alta s com y la (HI L esp e pol a pue d sob r or gá MET O c ionaria a p c arbonos i n a ridad mo d a molécula m o, los tie m v il apolar. a nización m m bién es i m an como t a Existe u acuosa p u z an unos a nol. El is p iedades d u ce en m e s . La eluci m ún en la R C4, emple a 2.3.1.1. 2 Las pri m L IC) se p u e cíficas pa r HILIC e a res, débil m d e ser car a r e column a á nicos mis c O DOLOGÍ A p olar, por nj ertados d erada [7 4 s apolares m pos de r e Sin emb a m olecular m portante a mpón. u na g ran v u eden ser pocos. L o opropano l d e elución, e nor eficie n ón suele l R PLC es la a das en m e 2 . Crom a m eras ap l u blicaron h r a el anális e s una val i m ente áci d a cterizado a s polares c ibles con a A PARA L lo g eneral , sobre la s 4 -76]. Por e y las de c a e tención d a r g o, todo s de las cad el contro v ariedad d utilizado s o s dos m l (2prop a pero está n cia de la s l levarse a octadesil s e nor medi d a to g rafía d e l icaciones h ace más d i s de carb o i osa alter n d os o bás i como fas e en fases m ag ua, por l L A DETER M , con cade n s uperficie e llo, los ti e a rácter po l d isminu y e n s los proc e d enas in j er t o l del pH d e disolve n s en RPL C m ás ampli a a nol) pue d á mu y lim i s columna s cabo en g s ilano (C1 8 da. e interacci ó de crom a d e 30 año s o hidratos [ n ativa a la s i cos. En p e normal, m óviles ac u l o g eneral M INACI Ó n as alquíl i de la síli e mpos de l ar eluirán n al aume n e sos de r e t adas a la por med i n tes or g á n C , pero en a mente u s d e emple a i tado por s s y por en d g radiente. L 8 ), aunqu e ó n hidrofí l a to g rafía d s , y fuero n 78]. s separaci o rincipio, e con la pa r u oso-or g á n acetonitril Ó N DE ED U i cas de lo n c e y una retención antes de l n tar la pro p e tención d f ase estac i o de mo d n icos que la práctic a s ados son rse debid o s u alta vis c d e g enera L a fase e s existen o t l ica (HILI C d e interac c n durante o nes de R P e ste modo r ticularida d n icas ricas o [79]. U LCORA N ng itud ent r fase mó v serán ma y l a column a p orción d e d ependen d i onaria [7 4 d ificadore s mezclado s a solame n acetonitr i o a sus f u cosidad q u presiones s tacionaria t ras como l C ) c ión hidr o mucho ti e P LC de an a de separ a d de reali z en disolv e N TES 35 r e 1 a il de y ores a . Así e fase d e la 4 , 77]. s que s con n te se i lo y u ertes u e se mu y más l a C8 o fílica e mpo a litos a ción z arse e ntes INT R 36 se m esp e con c g el d poli o esta c per m de c car g [82, 8 g ru p pod e cati ó posi car g es u mie n se c o g ru p cuat R ODUCC I Con fa s m e j ora la i e ctrómetro c entracion e L d e sílice d o l, sulfob e c ionarias p 2.3.1.1. 3 La cro m m ite la se p ar g a de l a g ada, incl u 8 3]. La fase p os funcio n e mos divi d ó nico y cr o La cro m tivamente g ado ne g at i u n sulfona t n tras que a o nsideran r La cr o p os funci o t ernario, c a I ÓN s es móvile s i onizació n de masas e s de a g ua L as fases e s d erivatiza d e taína zwi t p olares [80 , 3 .Croma t m ato g rafía p aración d e a s molécul a uy endo g r a estacion a n ales ióni c d ir este m o mato g rafí a m ato g rafí a debido a i vamente ( t o (SO 3- ) s a quéllas c u r esinas áci o mato g rafí a o nales ca r a mbiador f s altamen t n en la fu e (MS), en utilizada s s tacionari a d a con g r u t teriónica o , 81]. t o g rafía lí q de interc a e iones y m a s. Puede a ndes pro t a ria (resin a c os que int m odo cro m a de interc a de inter c que la f a ( ej: SO 3- , C s e conside r uy o g rupo das débile a de int e rg ados p o f uerte, o u n t e or g ánic a e nte de i o comparac i s g eneral m a s más co m u pos ami n o poli (2s q uida de i n a mbio ióni c m oléculas ser usada t eínas, pe q a de inte r t eractúan c m ato g ráfic o c ambio ani c ambio c a a se estacio n C O 2- ). Las r ran resin a funcional e s. e rcambio o sitivame n n catión a m a s en el m o o nes del e i ón con fa s m ente en fa s m unes en H n o, amida , s ulfoetil a s n tercambi o c o es un m polares b a en casi c u q ueños n u r cambio) p c on iones d o en crom a ó nico. a tiónico r e n aria mu e r esinas cu y a s interca m activo es aniónico n te, como m onio terc i o do HILI C e lectrospr a s es móvil e s e reversa. H ILIC son , ciano, c a s partamid a o iónico m odo cro m a sado en l a u alquier ti p u cleótidos p resenta e n d e car g a o p a to g rafía d e tiene cat i e stra un gr y o g rupo f u m biadoras u n ión ca r retiene a n un cati ó i ario, cam b C g eneral m ay (ESI) d e s con ma y : g el de sí l a rbamato, a ) y otras m ato g ráfic o a s propie d p o de mol é y aminoá c n la supe p uesta. Po r d e interca m i ones car g r upo func u ncional a ácidas fu e r boxilato ( C n iones us ó n de a m b iador déb m ente e un y ores l ice y diol, fases o que d ades é cula c idos r ficie r ello m bio g ados ional a ctivo e rtes, C O 2- ) ando m onio il. g ra d dife r sup e com mez esto s por rein y nor m pro b lar go com han de l a Alte mo d mo d rete n per m con d de c o MET O La sep a d os de i n r encias en e rficie. Es t m o la fuerz a 2.3.1.1. 4 En al g u clas comp l s problem e j emplo f y ectando m al, interc b lemas co n o s de eq u m patibilida d desarroll a a HILIC la rnativam e d o mixto c d os de RP n er analit o m iten el a n Los pri m diferentes o lumnas d  C f u O DOLOGÍ A a ración s e n teracción sus car ga t as intera c a iónica y l a 4 .Croma t nos casos, l e j as de co as estaba e f ormación los extra ambio ió n n ocidos co n u ilibrio d e d con HP L a do fases p cual ha r e e nte a ell o c omo una LC e inte r o s polares n álisis de m m eros ex p funcional i d e modo m C olumnas u ncionali d A PARA L e produce con la r e a s, densid a c ciones p u a variació n t o g rafía d e la RPLC n mpuestos e n tratar l de par-i ó c tos por n ico o pari n el tipo d e la colu m L C-MS ent r p olares e m e suelto pa r , hace 20 opción i n r cambio i ó como no m uestras c o p erimentos i dades [87 ] m ixto: tipo I: E m d ades. L A DETER M porque l e sina de a des de c a u eden ser n del pH [ 8 e modo mi x n o puede s polares. D as muestr a ó nico cro m diferente s i ónico). Si n d e fase m ó m na, apar i r e otros. C m bebidas e s r cialmente años apa r n teresante ó nico [85, polares o o mple j as. fueron d e ] , aunque a m paqueta m M INACI Ó l as sustan c intercam b a r g a y di s controlad a 8 2, 83]. x to eparar si m D urante m u a s con pr o m ato g ráfic o s modos n embar go ó vil, la cla s i ción de p C omo solu c s tables a a al g unos d r ecieron l a y a que 86]. Son analitos c a e sarrollad o a ctualmen t m ientos e s Ó N DE ED U c ias tiene n b io iónico tribución a s por co n m ultánea y u cho tiem p o cedimien t o o por d e cromato g o , estos m é s e de par i p icos fan t c ión a esto ltos pHs c e los inco n a s fases e s estas fas e por lo ta n a r g ados. D o s con col u t e existen d s pecíficos U LCORA N n varieda d debido a de car g a e n diciones selectiva m p o la soluc t os altern a e rivatizac i g ráficos ( m é todos g e n i ónico, tie m t asma o l o s proble m c omo es el n veniente s s tacionari a e s inclu y e n n to capac e D e esta m a u mnas en d iferentes con difer e N TES 37 d de a las e n la tales m ente ión a a tivos i ón o m odo n eran m pos a no m as se caso [84]. a s en n los e s de a nera serie tipos e ntes INTRODUCCIÓN 38  Columnas tipo II: Fases químicamente unidas que incorporan funcionalidades usando mezcla de ligandos. Teniendo en cuenta el tipo de ligando y la forma como este está unido a la sílice las columnas tipo II podemos clasificarlas en:  Columnas tipo III: Los grupos funcionales son incrustados en la mitad de las cadenas hidrofóbicas unidos a la sílice.  Columnas tipo IV: Donde los grupos funcionales se colocan en el extremo de las cadenas hidrófobas. Por otro lado existen columnas trimodales fase reversa, intercambio aniónico e intercambio catiónico (RP/AX/CX) basadas en el sistema de doble funcionalización de los ligandos y en una nanotecnología de sílice desarrollada recientemente [88]. Las columnas de modo mixto se usaron inicialmente para separar biomoléculas tales como aminoácidos, ácidos nucleicos, péptidos y proteínas [89-92]. A medida que pasa el tiempo el campo de aplicación se ha extendido al desarrollo de fármacos e impurezas en el desarrollo de drogas [93, 94], estudios de metabolismo [95, 96], análisis de especiación [97], vitaminas liposolubles [98] entre otros. El número de variables de operación con estas columnas es mayor por ende se debe tener cuidado con el pH de la fase móvil, la fuerza iónica y la proporción del modificador orgánico ya que variables necesarias para controlar la retención y la selectividad de la fase estacionaria para analitos iónicos, polares e hidrofóbicos. En general, todo tipo de moléculas ácidas, básicas y neutras son menos retenidas cuando la proporción de modificador orgánico se incrementa, aunque cambios importantes en la selectividad pueden aparecer si las otras variables se modifican simultáneamente. Por otro lado, si el modificador orgánico sobrepasa el 80 ó 90%, las columnas pueden presentar un modo HILIC en vez de un modo de R efici e pro p (co n Las ioni z sep a con g en e esp e de s u MET O R P. Amb o ente. 2.3.2. E La es p p orciona i n centració n molécula s z ación do n a ran en el su relaci ó e ran señal e e ctro de m a u relación O DOLOGÍ A o s modos E spectrom e p ectrometr í i nformaci ó n ) de las m s de inte r n de se ioni analizado r ó n masa/ c e s que son a sas que m m/z. A PARA L cromato gr e tría de m a í a de m a ó n tanto m oléculas a r és se int r zan adqui r r de mas a c ar g a (m/ z re g istrad a m uestra la a Figura 5. E t L A DETER M r áficos pr a sas (MS) a sas (MS ) cualitativ a a nalizadas r oducen e r iendo car a s hasta q u z ). Una v e a s en el or d abundanc i t a p as del an á M INACI Ó oveen m e ) es un a a (estruc t previame n e n primer g a ne g ati v u e alcanza e z en con d enador y i a relativa á lisis p or M S Ó N DE ED U e canismos a técnica t ura) co m n te conve r lu g ar a u v a o positi v n el detec t t acto con son repre de las señ a S U LCORA N de separ a analítica m o cuanti t r tidas en i o u na fuen t v a. Los io n tor de ac u el detect o sentadas e ales en fu n N TES 39 a ción que t ativa o nes. t e de n es se u erdo o r, se e n un n ción INT R 40 bási c for m en e de i o de foto i em p utili z hast a si g n i exp e ESI. Joh n com pue r Fen n [101 ] cola b R ODUCC I Así pu e c amente, l o  I o  S  D  T 2.3.2.1. La ioni z m as, se g ún l análisis. o nización a ionizació n i onización Tenien d p leó ESI c o z ada. El fenó m a comien z ificar su e rimentos Pasaron o n Fenn d e m puestos d r ta a su c o n el premi o ]. En las p b oradores I ÓN e s, para el a o s cuales s o nización S eparación D etección d T ratamien t Ionizac i z ación de l a la natura l En HPLC a presión a n : la ion i a presión d o en cue n o mo técni c m eno de e z os del si gl aplicació n pioneros d o tros 20 a ñ e mostrara e importa o nsi g uien t o Nobel d e p ublicacio n demostra r a nálisis d e s e resume n de la mue s de los io n d e los ione o de los d a i ó n por el e a muestra l eza de la p las técnic a a tmosféric i zación q u atmosféri c n ta la pola r c a de ioni lectrospra y l o XX no s a la cie n d e Dole [ 1 ñ os hasta q por prim e n cia bioló e análisis e Química n es ori g in a r on los pr i e las mues t n en la Fi gu s tra n es se g ún m s a tos e ctrospra y es clave y p ropia m u a s más ha b a (API). E x u ímica a c a (APPI) y ridad de l zación, si e y se cono c s e compre n n cia [99]. 1 00] desa r que el tra b e ra vez l a g ica y alt a por MS. E en 2002, c a les de fi n incipios b á t ras por M u ra 5 : m /z (ESI) puede lle v u estra y lo b ituales h o x isten fun d presión y ESI. os edulco r e ndo ade m c e desde h a n dió verd a A finale s rollaron l a b a j o reali z a utilidad a masa m E ste traba j c omo uno n ales de l o á sicos exp S se prod u v arse a ca b que se pr e oy en día s d amental m atmosféri c r antes, en m ás la má a ce ciento s a deramen t s de los a a primera z ado en el de la E S olecular, l j o le prop o de los pio n o s años 19 8 e rimental e u cen 4 pro c b o de difer e e tenda de t s on las téc n m ente tres c a (APC I este estu d á s amplia m s de años, t e lo que p a ños 196 0 aplicació n laborator i S I para io n l o que ab r orcionó a neros de l a 80, Fenn y e s de la té c c esos e ntes t ectar n icas tipos ), la d io se m ente pero p odía 0 , los n por i o de n izar r ía la John a MS y sus c nica ESI y no v com des d Fi g u r licen c htt p s bo m pas a cual de l pol a de l a tem p atra v su t a den s Fin a pun t g as e MET O y describi e v olátiles y m ple j os int a d e sus inic i r a 6. Es q ue m c ia Creative ://commons. El anal i m ba in y ect o a a través d se le apli c as g otas c a ridad que a fuente d p eratura e v iesan el e a maño po r s idad de a lmente, l a t o crítico e osa para l O DOLOGÍ A e ron las p r y térmica m a ctos. La f i os, pero e l m a de ioniza c Commons A wikimedia.o r i to es intr o o ra, o bie n d e un tub o c a una ele v c ar g adas e el propio c d e muestr e e n la fuen t e spacio en t r evapora c car g a su p a fuerza d en el cua l l os iones d A PARA L imeras ap l m ente lábi l f uente ES I l esquema c ión en una fu A ttributionS rg /wiki/File: o ducido e n n , procede n o capilar d e v ada difer e e n el capi l c apilar. L a e o del co n t e ESI y / o t re el capi c ión del di p erficial c o d el campo l es cinéti c d e la supe r L A DETER M l icaciones: l es, de pr o I ha expe r básico co n fu ente p or el e S hare Alike 4 Electros p ra y n la fuent e n te de la e e acero in o e ncia de p o lar, con u a s g otas so n n traelectro o de g as n lar y el c o i solvente, l o nforme d eléctrico c a y ener g r ficie. En e M INACI Ó la ionizac i o teínas co n r imentad o n tinúa sie n e ctros p ra y ( c 4 .0 Internati o y _Ionization _ e en disol u e lución d e o xidable, c o tencial. E s u na car g a n repelida s d o. Con l a n itró g eno, o no van re l o que su p d isminu ye en las g o g éticamen t e se mome n Ó N DE ED U i ón suave n car g as m un desa r do el mis m c reada p or E v o nal, _ S p ectrosco p u ción bie n e un siste m u arzo sílic s to fuerza l superficia s del capil a a a y uda d a medid a duciendo p one un in c el radio t as car g a d t e posible n to, la ten s U LCORA N de comp u m últiples r rollo con t m o ( Fi g ura v an Mason, py .sv g # f ileli n n mediant e m a de HP L c e o cerám i la nebuliz a a l de la m a r hacia el d e una el e a que las g continua m n cremento de las g d as alcan z el paso a s ión supe r N TES 41 estos y de t inuo 6 ). n ks). e una L C, y i ca al a ción m isma cono e vada g otas m ente de la g otas. a un a fase r ficial INT R 48 cro m au m con s líqu i term del t [61]. dis m efici e con c fase s par a diso sup e cro m sup e hast a inte n tem p más g raf i de t e exp r R ODUCC I m ato g ráfic a m enta sust a s i g uiente, i da, cuan d ostatizar el t iempo de La te m m inución d encia y re s c entración s móviles f a el medio a lvente pu e La HT L e riores a 1 0 m ato g rafía e riores a 6 0 a 100 ó 1 5 n tado des a p eraturas adecuad a i tizado, ó x e mperatur 2.4.1.1. 2.4.1.1. 1 La infl u r esada se gú I ÓN a , por lo q a ncialmen t todavía h o d o se habl sistema a análisis y m peratura d el tiemp o s olución. A de modif i f ormadas p a mbiente ( e de ser su s L C requier e 0 0ºC y , p u líquida b a 0 ºC, aun q 5 0 ºC de p a rrollar fa s de traba jo a s para t x ido de cir c a está en 1 Parám e 1 .Veloci d u encia de l a ú n parám e q ue su in c t e la co m oy en un a de cont r una temp e y se lo g re l de la c o o de análi s A demás, la i cador or g p or disolv e ( cromato gr tituido o c e fases es t u esto que, l a sada en s í q ue en al gu p endiendo s es estaci o de hasta r aba j ar a c onio y P S 50 ºC). e tros en lo s d ad de aná l a tempera t e tros term o c lusión co m m ple j idad d g ran nú m r olar la te m e ratura q u l a estabili d o lumna j u s is y la r e a disminuc i g ánico en l e ntes pur o r afía verd e c ombinad o t acionaria s las colum n í lice no p u u nos caso s del tiem p o narias ba s 200 ºC. S i temperat u S -DVB [11 9 s que influ y lisis t ura en la r o dinámic o m o un pa d el proce s m ero de e q m peratura d u e sea posi b d ad de la e g a un p e tención, a i ón de la p l a fase m ó o s y disolv e e ). En al g u o con el g r a s capaces d n as tradic i u eden ser u s pueden s p o de exp o s adas en s i n embar g u ra eleva d 9 , 123] (en y e la tem p r etención c o s. La cons t r ámetro m s o de opt i q uipos de d e la colu m b le mante n misma al r p apel im p a lterando l p resión pe r ó vil, pudie n e ntes men o n os casos e a diente de d e soporta r onalment e u tilizadas a s oportar t e o sición [1 1 í lice capa c g o, las fas e d a son l a este últim eratura c romato g r á t ante de e q m ás a con t imización . cromato g m na se refi e n erla a lo l r ededor d e p ortante e l a selectiv i r mite red u e ndo empl e o s per j udi c el g radie n temperat u a r tempera e emplead a a tempera e mperatur a 1 8-122], s e c es de alc a e s estacio n a s de car m o caso el l í áfica pue d q uilibrio ( K t rolar . Por g rafía e re a l ar g o e l 1% e n la i dad, cir la e arse c iales n te de u ra. t uras a s en t uras a s de e han a nzar n arias b ono í mite d e ser K ) de un a de G ∆° =  la v tem p 1 K -1 ) mó v entr e ter m rete n tem p incr e mó v anál mu e pro b pro g MET O a nalito ent r G ibbs (∆󰇜 =∆°−  ∅ =−°  La rete n v ariación d p eratura a b ) ; k es el f a v il y la fas e La ecu a e la temp e m odinámic o n ción. En p eratura p e mento d e v il, lo que isis. 2.4.1.1. 2 Cuand o e stras co m b lema ve n g ramas de O DOLOGÍ A r e la fase e (Ecuación  ∆°=−  +∆°  + n ción de u n d e entalpí a b soluta (e n a ctor de r e e estaciona r a ción de V e ratura y l o s para d la ma y o r p rovoca u n e la temp e permite t r 2 .Resolu c o se requi e m ple j as el n dría pro p temperat u A PARA L stacionari a 1):   + ∅ n a molécu a 󰇛∆°󰇜 y n Kelvin), e tención y r ia. V an’t Hoff l a retenci ó d eterminar r ía de las n a dismin u e ratura es r aba j ar a f l c ió n e re un au m tiempo d p orcionad a u ra. En cro m L A DETER M a y la fase Ecuación 1 Ecuación 2 Ecuación 3 u la en la fa s y la de e n R es la co n ϕ es la r e f (Ecuació n ó n (1/T fr la contr i separaci o u ción en l a la dismi n l u j os más m ento de d e análisi s a por el e m ato g rafí a M INACI Ó móvil es f u s e estacio n n tropía 󰇛∆  n stante d e e lación en t n 3) es la ente a ln i bución d e o nes en R a retenció n n ución de altos, au m la resolu c s aument a e mpleo d e a , todos lo s Ó N DE ED U u nción de n aria está r  °󰇜 del si s e los g ases t re el volu que desc r k ) emplea d e la 󰇛∆° 󰇜 P LC un a n . Otra co la viscosi d m entando l c ión en la a . Una s o e la HTL s factores q U LCORA N la ener g ía r elacionad a s tema. T (8,31441 J u men de l a r ibe la rel a da en est u 󰇜 y 󰇛∆°󰇜 a umento d o nsecuenci a dad de l a l a velocid a separaci ó o lución a L C o me d q ue afecta n N TES 49 libre a con es la mol - a fase a ción u dios a la d e la a del fase a d de ó n de este d iante n a la INTRODUCCIÓN 50 Resolución (Rs): eficiencia (N), selectividad (α) y retención (k), están influenciados por la temperatura (Ecuación 4).  =√ 4∝−1 ∝  1+ Ecuación 4 • Eficiencia La eficiencia, en cromatografía, se define en base a la altura del plato (H) y al número de platos (N). La eficiencia de la columna aumenta cuanto mayor es el número de platos, y cuanto menor es la altura de plato. La eficiencia o número de platos N, nos da una idea del ancho de banda, y por tanto, de la efectividad de separación de la columna. Un aumento en el número de platos supondrá una disminución del ancho de banda y en consecuencia, un aumento de la resolución si la retención se mantiene constante. En el año 2006, Yang [124] desarrolló un modelo para el estudio del efecto de la temperatura en la eficiencia de la columna en HTLC, concluyendo que la temperatura es un parámetro que puede emplearse como una variable a controlar para optimizar la eficiencia de la separación La máxima eficiencia se conseguirá empleando columnas largas con un tamaño de partícula pequeño. Sin embargo, en la práctica esta opción tiene dos grandes inconvenientes: largos tiempos de análisis y presiones de trabajo demasiado elevadas para los equipos convencionales de cromatografía líquida. En este caso el uso de altas temperaturas es una buena alternativa para superar estos inconvenientes. • Selectividad La selectividad describe la capacidad de la cromatografía para separar o diferenciar entre varios compuestos. Está determinada por la fase estacionaria, fase móvil, así como otros parámetros, donde la temperatura juega un papel METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE EDULCORANTES 51 importante, especialmente en compuestos polares e ionizables donde los equilibrios de ionización son función de la temperatura [125-128]. El empleo de la temperatura como un factor de selectividad presenta la ventaja de su facilidad de control y modificación. Además, el orden de elución de los compuestos puede alterarse variando la temperatura, manteniendo la misma composición de la fase estacionaria y fase móvil. Buckenmaier y col. [129] han demostrado como la temperatura modifica la selectividad en cromatografía como consecuencia de la modificación de la ionización de los analitos por cambios en los valores de pKa. La selectividad se ve incrementada por la combinación de programas de temperatura y gradientes de fase móvil. La influencia de la temperatura en la selectividad abre nuevas posibilidades, aunque incrementa la complejidad del desarrollo de los métodos, ya que se convierte en un parámetro adicional en el desarrollo de los mismos. Por ello, la gran mayoría de los programas de software desarrollados incluyen la temperatura como una variable. • Retención Bowermaster [130] y Chen [131] han demostrado que el uso de programas de temperatura tiene un efecto similar al empleo de gradientes de disolventes en análisis cromatográfico, pudiendo variar la retención según se empleen programas de temperatura o de composición de la fase móvil. Variaciones de 3-5 ºC presentan el mismo efecto en la retención que un aumento de 1% de la concentración de modificador orgánico. Una de las principales ventajas de trabajar a elevada temperatura es que permite reducir la cantidad de disolvente orgánico, utilizando disolventes menos agresivos con el medio ambiente, por reducción de la viscosidad con la temperatura, tales como etanol o 2-propanol, o emplear incluso agua pura como fase móvil [121, 132, 133] INT R 52 colu mis m con l y u n imp o aire, y m á tem p mó v mó v ante hor n vari a deb e ban d pue d una enfr i Tec h trab a por e hast a una sup e de l a R ODUCC I 2.4.1.2. La HT L mna, así c m a a trav é la column a n a elevad a o sibilidad , donde la á s emplea d Actual m p eratura P v il a la m i v il se reali s de la e n n o o en c o a ción entr e e ser, com o d as. La el e d e ser un p línea ba s i amiento d En este h nolo g ies, aj ar a alta e ncima d e a 200ºC, a u capacida d e rior a la t a fase mó v I ÓN Instru m L C requi e c omo de l a é s de bloq u a , camisas a capacid a de utiliza r temperat u d os para e l m ente exi P olarather m i sma tem p za introd u n trada a l a o ntacto c o e la temp e o máximo , e vada te m p roblema s e inestab d e la fase m estudio s Kortri j k, B temperat u e la tempe r u mentand o d de enfri a t emperatu r v il de vol u m entación d e re un co n a fase móv i u es de cal e de a g ua o a d calorífi c r a g ua a T u ra se mo d l control d e s te un ú m que se o b p eratura q u ciendo u n a columna , o n el bloq ratura de l , del orde n m peratura para dete r le, por l o m óvil ante s s e utilizó B el g ium) ( F u ra, que pe r atura am b o la temp e a miento d e r a ambien t u men infer i d e alta te m ntrol exh a i l, pudien d e ntamient o o baños, q u c a, aunqu > 100ºC o d ifica rápi d e la tempe r ú nico eq u b serva en q ue la col u n tubo d e , pudiend q ue de cal e la fase m ó n de ± 5º C de la fas e r minados t o que pu e s de su ent r un horno F i g ura 9 ), u e rmite un c b iente (en a e ratura a u e 200 ºC a te en 2,5 m i or a 1μL, m peratura a ustivo d e d o realiza r o que req u u e proporc e present a mediante d amente, s r atura [11 2 u ipo com e la Figura 9 u mna. El c e acero in o o estar co e ntamient o ó vil y la te m C para evi t e móvil a t ipos de d e de ser n r ada en el Polarath e u n horno c c ontrol de l a usencia d n a veloci d 50 ºC en 3 m in. Cuen el cual pe r e la tem p r se el cale n u ieren con t i onan una a el incon v hornos d e i endo los m 2 , 117, 133, e rcial el capaz de c alentami e o xidable i n l ocado en o o con l a m peratura t ar el ensa n la salida d etectores, n ecesario u detector. e rm 9000 ( c omercial l a temper a e la opció n d ad de 1–3 0 3 ,5 min y d t a con un r mite una p eratura d n tamiento t acto adec ma y or ef i n veniente d e circulaci ó m ás adec u , 134]. horno a calentar l a e nto de la n mediata m el interio a s camisa s a de la col u a nchamien t de la col u conducie n u n siste m ( SandraSe l adecuado a tura desd e n crio g éni c 0 ºC/min y d e 50 ºC a pre-calen t precisión d e la de la u ado i cacia d e la ó n de u ados alta a fase fase m ente r del s . La u mna t o de u mna n do a a de l erit y para e 5ºC c a), y y con 5 ºC t ador en el con t vez per m per m mm un p mét o tem p g ra n des a indi v AS P ate n mie n com de l MET O t rol de la t e un sistem a m ite traba j m ite empl e y de lon g p anel fro n o dos dife r p eratura. Fi g 2.5. Ap l A la d e n varieda d a rrollado v idualiza d P , SAC, C Y n ción, exi s n tras que p m o NHDC, l os méto d O DOLOGÍ A e mperatu r a de enfri a j ar con d e e ar colum n itudes de h n tal numé r r entes, ta n g ura 9. Ima g l icaciones a e terminac i d de técn para la d a. Para l o Y C y AC E s ten muc h p ara aquel l NEO, AL I d os multi r A PARA L r a de la fa s a miento d e e tectores s e n as empaq u h asta 25 c m r ico el c u n to a te m g en del horn o a edulcora n ón de ed u i cas analí t determi n o s edulcor a E y para o h os méto d l os edulco r I o STEV e esiduo p u L A DETER M s e móvil e e l elu y ent e e nsibles a u etadas c o m . El con t u al permit e m peratura o de alta te m n tes u lcorantes t icas. La n ación d e a ntes que o tros com o d os desa r rantes qu e e xiste mu c u blicados M INACI Ó n la colu m e a la sali d la eleva d o n diámetr o t rol del ho r e memori z constante mp eratura Po l artificial e ma y oría d e un e d se llevan u o SUC q u r rollados p e han sido c ha menos se han e Ó N DE ED U m na de ± 1 d a de la c o d a temper a o s interno s r no se rea l z ar hasta como e n l aratherm 9 0 e s pueden d e los m é d ulcorant e u tilizando u e ha cent r p ara su r ecientem e biblio g ra f n focado e U LCORA N ºC. Pose e o lumna, l o a tura. Ad e s de 1 mm l iza a trav é un total n g radien t 0 00 n aplicarse é todos se e de m a décadas c r ado una determin a e nte apro b f ía. La ma y e n sólo 3 N TES 53 e a su o que e más, a 4,6 é s de de 9 e de una han a nera c omo g ran a ción, b ados y oría o 4 INT R 54 com mét o capí t cub r dete eme r elev a dete dilu c tam p bebi real i ba j o las p Pos t ante anál uni v com mu e Z ygl y D u adic i mu e R ODUCC I m puestos, s i o dos que t ulo nos v r en un gr e rminan lo s 2.5.1. P 2.5.1.1. Las m rg éticas, e t a dos nive l e rminació n c ión de la p ón con m da es car b i zarse el a n vacío. En p roteínas u t eriorment e riores, se isis. Estos v ersalmen t En al gu m ple j os us a e stras carb o l er y col. [ 1 u lcina (D U ionando á e stra obte n I ÓN i n embar go cubren u n v amos a c e r an ran g o s edulcora n P reparació n Edulco r m uestras d t c) se cara c l es de ed u n se reali z muestra e n m etanol o e b onatada, n álisis, n o al g unos m u tilizando e todas filtran co n tratamie n t e utilizad o u nos caso s a ndo SPE o natadas t 1 40] deter m U L) en be b á cido fór m n iendo rec u o en la últ i n amplio e ntrar en e de edul c n tes artifi c n de mue s r antes en m d e bebid a c terizan p o u lcorates ( m z a un pr e n a g ua ult r e tanol, no r se debe i o rmalment e m étodos se el reacti v las mue s n filtros d n tos de m u o s [139]. s se han u [139]. A l i enen que m inaron A b idas y z u m ico–N,N u peracion e t ima déca d ran g o d e e stos últi m c orantes a c iales per m s tra m uestras d a s (zum o o r ser ma t mg /L) p o e tratamie n r apura, e n r malment e i ncluir un e por son i inclu y e t a v o de Car r s tran, in d d e memb r u estra so n u tilizado t l i g ual q u ser previ a A CE, SAC, u mos utili z N -diisopro p e s entre 83 d a si se ha n e edulcora n m os métod o a rtificiales , m itidos en l d e bebida o s, refres t rices relat i o r lo que s n to que n o n un tamp ó e entre 2 y paso de i cación, o a mbién un r ez, ZnSO d ependien t r ana o se n rápidos, t ratamient o u e con la m a mente de s CIC, ASP , z ando SP E p il etilam i y 107 %. O n empeza d n tes artifi c o s, es deci r especial m l a UE. c os, cer v i vamente s s impleme n o rmalmen t ó n apropia d y 50 veces des g asific a burbu j eo d paso de p 4 /NaOH t emente d centrifu ga simples y o s de mu e m etodolo g sg asificad a , SUC, AL I E con cart u i na (FAO tro estud i d o a desar r i ciales. En r, aquello s m ente los v ezas, be b s imples y t n te antes d n te consis t do o mez c [135-138]. a ción ant e de nitró ge p recipitaci ó u otro si m de los p a n antes d y baratos y e stra al g o g ía anteri o a s. Por e j e m I , NHDC, uchos Str a DIPEA) io desarro r ollar este s que que b idas t ener d e su t e en c la de Si la e s de e no o ó n de m ilar. p asos d e su y son más o r las m plo, NEO a ta X a la llado por los e Oas i en m los l í dete n g / L extr a En l poli m Stra t Stra t Chr o imp o dife r exh a Sch e la r e con t [142 ] obti e Sch e C18 HL B X-A W MET O Gao y col . e dulcoran t i s HLB en c 2.5.1.2. Aunqu e m uestras d ímites de d e rminació n L ) o resid u La té c a cción de e l a biblio gr m éricos d e t a X-RP), a t a X-AW) o mabond o rtancia ya r entes (su l a ustivame n e urer y col . e cuperaci ó t inuación. ] y Scheur e ne me j o r e urer y col . Scheur e (Isolute C 1 B , Varian P W , Oasis M O DOLOGÍ A . [141] det t es ACE, S c ontrándo s Edulco r e la in y ecc i d e bebidas d etección a n de estos u al (n g /L). c nica que e dulcoran t r afía está e fase reve r a bsorbente y adsor b C18ec) [ 4 a que los e l famatos, p n te estudi a . [43] que ó n de edu l Cabe indi er y col. [ 4 r es recup e . lo hace c o e r y col. [4 3 1 8), polim é P PL, Bake r M AX, Oa s A PARA L e rminaro n S AC, CIC , s e las recu p r antes en m i ón de la m puede ut i a lcanzado s compues t ha sido s t es artifici a reco g ido r sa (Oasis H s poliméri b ente de 4 1]. La s e e dulcorant e p éptidos y a da en do s e valúan u n l corantes e car que l a 4 3] puede n e raciones c o n cartuch o 3 ] compar é ricos de f r bond SPE s is MCX, O L A DETER M n 30 aditiv , ASP y N p eracione s m uestras d m uestra d i i lizarse pa r s (μ g /L) n tos en m u s elecciona d a les en a gu el uso d e HLB, Isol u i cos de m o base síli c e lección d e e s artificia y derivado s s traba j os r n a g ran v a e n la SPE a s conclus i n parecer c c on cartu c o s de base r aron 10 c a f ase revers a SDB-1) y O asis WA X M INACI Ó os sintétic N EO utiliz s entre 81 y d e a g ua su p rectament e r a el análi n o son sufi c u estras d e d a por m u as de div e e diverso s u te ENV+, o do mixto ( c e de fa s e la fase l es perten e s de carb o r ealizados a riedad de y sus co n i ones alca n c ontradict o c hos de b poliméric a a rtuchos d e a (Isolute E poliméric o X ) y exa m Ó N DE ED U o s en beb i a ndo SPE y 99% [141 ] p erficial y r e (tras la f i s is de mu e c ientemen t e a g ua su p m últiples a u e rsa natur a s cartuch o HR-X, Ba k ( Oasis M A e reversa adsorben t e cen a tres hidratos). por Z yg l e parámetr o n clusiones n zadas po r o rias y a q u b ase sílice a . e SPE de d E NV+, Str a o s de mod m inaron e l U LCORA N i das entre con cart u ] . r esidual iltración) c e stras de a t e ba j os p a p erficial ( b utores pa r a leza es la o s: adsorb e k erbond S D A X, Oasis M a (Isolute t e es de clase quí m Esta tare a e r y col. [1 o s que afe c se comen t o r Z yg ler y u e Z yg ler y mientras d iferentes a ta X-RP, O d o mixto ( S l efecto d e N TES 55 ellos u chos c omo ag ua, a ra la b a j os r a la SPE. e ntes D B-1, M CX, C18, g ran m icas a está 4 2] y c tan a t an a y col. y col. que tipos O asis S trata e l pH INTRODUCCIÓN 56 sobre las recuperaciones ACE, ASP, CIC, NHDC, SAC, SUC y NEO en aguas residuales y superficiales. Los mejores resultados de recuperación los obtuvieron con los cartuchos poliméricos de fase reversa Bakerbond SBD-1 y ajustando el pH de la muestra a 3, con un rango entre 53 y 113% para aguas residuales y entre 60 y 102% para aguas superficiales. Sin embargo, los rendimientos no fueron óptimos para todos los compuestos. Para ASP y NHDC en agua embotellada las recuperaciones fueron del 41% y 59% respectivamente. Por otro lado, las recuperaciones de ACS, CIC, SAC y SUC parecen descender con el aumento de la materia orgánica disuelta, es decir, las recuperaciones descendían en el orden: agua de bebida > agua superficial > agua residual. Por otro lado, Zigler y col. [142] realizaron un estudio comparativo de siete adsorbentes con base silice (Chromabond C18ec, Bakerbond SPE Octadecyl, Bakerbond SPE Pheny, LiChrolut RP-18, Supelclean LC-18, Discovery DSC-18 y Zorbax C18) y tres poliméricos de fase reversa (Strata XRP, Oasis HLB y Bakerbond SPE SDB-1) para la extracción de edulcorantes artificiales de un tampón acuoso, pero no fue aplicado a muestras reales. Las características de los adsorbentes (estructura, porosidad, diámetro de partícula, contenido de carbón, área superficial y existencia o no de “end-capping”) se correlacionaron con las recuperaciones. Además también se estudió el efecto del pH y del tipo de tampón sobre la recuperación. Se concluyó que todos los cartuchos C18 retienen bien los edulcorantes estudiados con eficiencias alrededor del 95%. Los edulcorantes que presentaron resultados más bajos en todos los cartuchos fueron el ACE y el CIC. En los cartuchos poliméricos de fase reversa Bakerbond SDB1 el ASP y ALI se perdieron totalmente y el NEO solamente se recuperó en un 74%. Los cartuchos poliméricos Strata X presentaron buenas recuperaciones para todos los compuestos del estudio, mientras que los Oasis HLB presentaron recuperaciones más bajas. El ACE y CIC se recuperaron en un 74 y 41%, cuando solamente se usaron 60 mg de adsorbente Oasis HLB, y al rellenar un cartucho con 300 mg de este mismo adsorbente la recuperación fue cuantitativa. de p es n e y 1 dis m cue n exte n mat r el a n dep u met o sido extr a ultr a mu e pre c cart u la m HP L 158] HIL I sist e MET O Por otr o p reconcent r e cesario e x L, y elui r m inuir est e n ta que la n sión co m r iz, partic u n álisis me d 2.5.1.3. Existen u radora y o dolo g ía d aplicadas a cción só l a sonidos [ e stra en l a c oncentrac i u chos Oas i 2.5.2. A Tenien d m a y oría de L C de inte r . También I C [159]. La téc n e mas de d e O DOLOGÍ A o lado, ha y r ación pa r x traer g ra n r con peq u e volumen s muestr a m o las mu e u larmente d iante HP L Edulco r pocos e s esto conl d edicada a para la e x l ido-líqui d 143] y P L a s metod o i ón y lim p i s HLB [45 A nálisis in s d o como b los méto d r cambio ió n se ha apl i n ica más p e tección, U A PARA L y que tene r a la deter m n des volú m u eños vol ú final med i a s de a g u a stras de a g d ebido a l o L C-ESI-M S r antes en l o s tudios q u leva que e su deter m x tracción d e d o [45, 4 6 L E [144, 1 4 o lo g ías p u p ieza del , 46] [144, 1 s trumenta l ase la nat u d os de an á n ico [146, i cado par a p opular e s U V-VIS [1 4 L A DETER M r en cuent a m inación d m enes de m ú menes e n i ante eva p a residual g ua de be b o s efectos S . odos de d e u e deter m existan p o m inación e n e edulcor a 6 ], extracc 4 5]. Todo s u blicadas extracto 1 45]. l u raleza ió n á lisis está n 147, 155] y a la separ a s RPLC q 4 8-151, 15 3 M INACI Ó a que se n e d e edulco r m uestra, n n tre 3 y 7 p oración. A no pued e b ida debi d de matriz e puradora m inen ed u o cos artíc u n esta mat r a ntes en lo d ión con d s estas téc n se comb i b asada e n n ica de lo s n basados y electrofo r a ción de e d q ue se ha 3 ], disper s Ó N DE ED U e cesitan el e antes en a n ormalme n mL y en A demás, h a e n concen t d o a la co m que se pr o u lcorantes u los que d r iz. Las t é d os de de p d isolvente s n icas de p i nan con n SPE no r s edulcora n en RPLC r esis capil a d ulcorant e aplicado s ión de ra d U LCORA N e vados fa c ag ua por l o n te entre 5 0 muchos c ay que ten t rarse en m ple j idad o ducen du r en lodo d esarrolle n é cnicas qu e p uradora s s asistida p reparaci ó una etap r malment e n tes artifi c [138, 146 - a r [42, 139 , e s las colu m con difer e d iación (E N TES 57 c tores o que 0 mL c asos er en tanta de la r ante s de n una e han on la por ó n de a de e con c iales - 154], , 156m nas e ntes L SD) INTRODUCCIÓN 64 totalmente automáticos que concluyen con la propuesta de una o más posibilidades que deben ser verificadas experimentalmente por el operador. 3.1.6. Estudio de la robustez del procedimiento La robustez es uno de los elementos clave en la validación de los métodos de separación. La robustez es una medida de la capacidad del procedimiento para proporcionar resultados que no se vean afectados por los pequeños cambios que pueden tener lugar en los parámetros del procedimiento. Obviamente en los estudios de robustez, estos cambios son intencionales y por lo general de mayor magnitud que los previstos en virtud de la operación de rutina de las condiciones del procedimiento. Si estos cambios intencionales demuestran que el procedimiento es robusto, a continuación, la aplicación rutinaria del procedimiento puede llevarse a cabo sin problemas. Sin embargo, los límites de tolerancia de los diferentes parámetros que garantizan el funcionamiento controlado del proceso de separación deben ser evaluados. Normalmente, las evaluaciones de consistencia se realizan por DOE. Sin embargo, como la separación puede verse afectada por un gran número de parámetros, se utilizan diseños factoriales fraccionados o de Plackett – Burman (en ambos casos, se utilizan diseños de resolución III) con el objetivo de reducir el número de experimentos requeridos [168, 169]. Normalmente, los estudios de robustez son conducidos en la etapa de validación del procedimiento de separación. Por ejemplo cuando el método se considera definitivo o semi definitivo. Obviamente, si los resultados del estudio de robustez demuestran que el procedimiento no es robusto, el tiempo, el dinero y el esfuerzo invertidos en el desarrollo pueden haber sido desaprovechados. Es claro que el método se puede re optimizar para establecer un set final de condiciones que garanticen un suficiente grado de robustez. Alternativamente, el estudio de robustez puede llevarse a cabo durante el desarrollo del procedimiento. Es decir, el diseño debería tener en cuenta la OPTIMIZACIÓN COMPUTERIZADA DE SEPARACIONES EN HPLC 65 solidez, utilizando un diseño de enfoque QbD [170-172]. Para este fin, el procedimiento se desarrolla por un diseño experimental adecuado que toma en cuenta los factores que pueden ser críticos para la robustez, junto con otros factores que afectan a la separación. Factores tales como la temperatura, el pH, la composición de la fase móvil, el tiempo de ejecución del gradiente, además del flujo de la fase móvil y los porcentajes iniciales y finales del modificador que generalmente también son importantes. Si el estudio de robustez se lleva a cabo con el fin de transferir el procedimiento a otros equipos o laboratorios, el tipo de columna y el tiempo de desfasaje en el instrumento son importantes. Los CAMD son de gran interés en este tipo de enfoque ya que el esfuerzo experimental se reduce al mínimo y casi sin experimentos, haciendo uso de los datos obtenidos durante el establecimiento del modelo de retención. 3.1.7. Transferencia del procedimiento La transferencia de los procedimientos de separación de un instrumento a otro, de un laboratorio a otro, o de una columna a otra de diferente longitud o de diferente diámetro interno o el mantener la fase estacionaria constante para lograr una separación más rápida y eficiente, se pueden realizar mediante CAMD. En la práctica, tiene poco sentido la optimización de un procedimiento de separación, si el proceso que implica inversión de tiempo y costo, solamente se limita a uso exclusivo en el equipo en que se desarrolló. Por definición, un método de rutina está destinado para la distribución y el funcionamiento en numerosos laboratorios. Por lo tanto, la transferencia de los procedimientos de separación debe ser considerada como un paso más en el desarrollo y la optimización de la separación. Obviamente, para una transferencia exitosa, el procedimiento debe haber superado claramente los estudios de robustez. La transferencia de procedimientos isocráticos es mucho más simple que la transferencia de procedimientos de gradiente [164]. INTRODUCCIÓN 66 3.2. Programa PREGA El grupo de investigación en Cromatografía y Quimiometría (ChromChem) del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología del Instituto de Investigación y Análisis Alimentario (IIAA) de la Universidad de Santiago de Compostela ha desarrollado un programa informático denominado PREGA. Esta herramienta informática consta de un conjunto de programas que pretenden facilitar el proceso de optimización en sistemas de HPLC. Se parte de un número pequeño de datos experimentales, capaces de generar un modelo de retención para una mezcla de compuestos a separar. Este modelo se utiliza con fines predictivos, logrando realizar optimizaciones isocráticas y también de variedad de gradientes (lineales, curvos, multilineales y escalonados) de cualquier perfil, también se puede manipular la temperatura a la que se desarrolla la separación y el flujo de la fase móvil. Es un programa con una interfaz muy amigable la cual permite abordar optimizaciones de tipo más convencional (utilizando funciones de respuesta de tipo CRF) o por primera vez, realizar optimización Pareto en cromatografía liquida. La versión más reciente disponible públicamente (www.usc.es/gcqprega) es la 7.0. El módulo DM en la versión PREGA 7.0 se encarga de todo el trabajo de manipulación de los datos de inicialización y creación de los modelos de retención. Podemos entrar a PREGA desde este módulo para generar nuevos problemas de separación. Todas las versiones de PREGA mantienen la misma filosofía, y esto teniendo en cuenta que cada vez se introducen mejoras que facilitan el manejo del mismo. Lo que se busca con este programa es generar aproximaciones sistemáticas a la optimización de las diferentes separaciones por HPLC. Permite procesos de aproximación rápidos (que requieren mínimo trabajo experimental OPTIMIZACIÓN COMPUTERIZADA DE SEPARACIONES EN HPLC 67 previo), y a su vez procesos más seguros y precisos pero son más lentos y los cuales requerirán un mayor trabajo experimental previo. En PREGA se pueden realizar dos tipos de proyectos:  Proyectos de tipo I (PREGA convencionales), que utilizan tanto datos de retención isocráticos como en gradiente para construir los modelos de retención de los picos en la mezcla.  Proyectos de tipo II, que utilizan solamente gradientes de “Scouting” para construir los modelos de retención de los picos. Las dos opciones son compatibles y están diseñadas para utilizar todo el trabajo experimental realizado. Uno de los objetivos en cualquier aproximación al desarrollo de métodos asistido por ordenador es limitar al máximo el trabajo experimental previo, necesario para disponer de los datos de inicialización que requiere el desarrollo del modelo de retención, el cual permitirá la simulación de las separaciones. Dicho trabajo es función del número de parámetros incluidos en el modelo, de modo que si solamente nos interesa estudiar la influencia de la variación en el contenido de modificador de la fase móvil, el número de datos necesario es mucho menor que si queremos estudiar además, la influencia del pH y/o de la temperatura, etc. En muchas ocasiones con nuevas mezclas de compuestos a separar, no es fácil predecir cuales de estos factores tendrán influencia real en la calidad de las separaciones (es decir, qué parámetros nos permitirán optimizar realmente la separación), pero tampoco se sabe si se llega a una solución suficientemente satisfactoria. Por tanto, una aproximación de tipo general, que incluya desde el principio todos los factores en el modelo y que exija un gran número de experimentos previos al objeto de disponer de los datos necesarios para ajustar el modelo es poco recomendable. Por el contrario, es preferible una aproximación de tipo secuencial que aprovechando el trabajo realizado en cada momento nos permita evaluar con seguridad cual es la influencia de cada parámetro y cuales son realmente las posibilidades de lograr una solución INTRODUCCIÓN 68 suficientemente satisfactoria. PREGA 7.0 ha sido desarrollado con esta filosofía y además permite explorar este tipo de aproximación de una forma sencilla y eficiente. Los proyectos de tipo II son los más rápidos y simples de construir, requiriendo menor trabajo experimental. Están basados en los desarrollos y ecuaciones publicadas por Snyder y colaboradores a lo largo de varias décadas de trabajos fundamentales en el desarrollo de la HPLC [173]. Constituyen además la base de los principales programas comerciales para el desarrollo de métodos asistido por ordenador en HPLC (Drylab, ACD-labs LC-Simulator, etc.). PREGA 7.0 incorpora la versión más simple de estas ecuaciones [174], requiriendo de esta manera un número mínimo de experimentos previos. La aproximación implica registrar dos gradientes con un amplio intervalo de porcentajes de modificador para garantizar que todos los picos de la mezcla eluirán durante el desarrollo de dichos gradientes y realizar estos gradientes con tiempos diferentes (o lo que es lo mismo, variar la pendiente del cambio del % de modificador con el tiempo). Los datos de retención de los picos en estos gradientes se utilizan para ajustar un modelo lineal simple que relaciona el logaritmo neperiano de K con el porcentaje de modificador y, por tanto, nos proporciona un mapa de retención aproximado para cada pico. A partir de ese mapa de retención se pueden generar simulaciones de las separaciones, bien utilizando el propio modelo para la elución en gradientes o bien, calculando los valores de retención isocrática y con ellos, los datos de entrada para otros modelos de simulación como, por ejemplo, PREGA. Los proyectos de tipo I son los convencionales de PREGA ya disponibles en anteriores versiones del programa. Estos modelos se construyen a partir de datos de retención en eluciones isocráticas y también de datos de retención en eluciones programadas [175]. El proceso de generación de un modelo de retención en PREGA asume la utilización de datos isocráticos para la creación del modelo, pero también la ausencia de algunos de tales datos, caso frecuente por etc. los p mo d par a tien e rete n por dat o los d sido ima g inte r colo r los v OPT I la elevad a El proc e p icos en l a d elo de re t a ese pico e por qué s n ción par a En la F i la curva r o o s de rete n d atos no d calculado Claram e g inar que r valo que r azul. Di c v alores re a I MIZACI Ó a retención e so de g e n a mezcla s t ención “ e (el númer s er el mis m a poder a j u ig ura 11 p o oj a. En di c n ción isocr á d isponible s s por extr a Figura 11. E e nte, eso s el verda d viene rep c ho interv a a lmente ex p Ó N COMP U de al g un o n eración d e e realiza e e n bruto” o de dato s m o, aunqu e star el mo d o demos o b c ha fi g ura, á tica disp o s , que util i a polación. Ej em p lo de u n s datos e d ero mod e r esentado a lo será ta p erimenta l U TERIZA D o s picos a e un mod e e n dos eta p utilizand o s disponi b e deberá d i d elo a un p b servar el , se han d i o nibles re a i zando el m n modelo de xtrapolad o e lo de ret e en el esq a nto más a les. Esta s i D A DE SE P ciertos po r e lo de rete p as. En p r o los dat o b les para c i sponerse a p ico). modelo d i bu j ado co n a lmente (c u m odelo d e retención e n o s son p o e nción es t uema por mplio cu a i tuación e s P ARACIO r centa j es d n ción par a r imer lu ga s isocráti c a da pico, o a l menos d e retenció n n símbolo s u adrados d e retenció n n PREGA 7. 0 o co fiabl e ará comp r las línea s nto más n s completa m O NES EN H d e modific a a cualquie r a r se g ene r c os dispo n obviamen t d e tres dat o n represe n s diferent e d e color r o n en bruto , 0 e s y pod e r endido e n s de punt o n os ale j am o mente ha b H PLC 69 a dor, r a de r a un n ibles t e no o s de n tado e s los o jo) y , han e mos n un o s en o s de b itual INTRODUCCIÓN 70 en modelos de retención calculados a partir de datos de retención isocrática. Habitualmente, se renuncia a evaluar el modelo fuera de los límites definidos por los datos realmente disponibles, lo que convierte el sistema en poco útil puesto que normalmente la región a explorar es mucho más amplia que la cubierta por los datos experimentales. La alternativa utilizada por PREGA tanto en sus versiones anteriores como en la versión 7.0 consiste en validar y recalibrar el modelo de retención en bruto mediante un cierto número de gradientes registrados experimentalmente. Este proceso de re-calibración del modelo se esquematiza en la parte superior de la figura. En este esquema superior se representa como se efectúa el cálculo en PREGA para la retención del pico en un programa de elución cualquiera, teniendo en cuenta que PREGA siempre transforma los programas de elución en programas de tipo escalonado para efectuar los cálculos mediante el denominado modelo de escalones (desarrollado por Cela y colaboradores en 1986 [176] y formalizado a partir de 2000 por Nikitas y colaboradores [177]) Tal y como vemos en el esquema el cálculo de la retención se basa en estimar la velocidad de avance del pico en la columna en etapas isocráticas sucesivas que equivalen al programa de gradiente original. Es evidente que no se dispone de datos experimentales para todas y cada una de esas etapas (nuevamente, se han señalizado con símbolos diferentes y coincidentes con los empleados en el esquema del modelo de la parte inferior). Por tanto, lo que se hace es permitir una cierta variación de los valores de velocidad de pico para las etapas que no disponen de datos reales y ajustar esos valores para lograr coincidencia entre los tiempos predichos para la retención del pico en gradiente y los medidos experimentales. En la práctica, PREGA utiliza un algoritmo genético para efectuar este ajuste. El resultado de este proceso es un modelo de retención re-calibrado que permite ajustar tanto la retención en modo isocrático como en modo programado y que puede permitir simulaciones en un amplio rango de valores OPTIMIZACIÓN COMPUTERIZADA DE SEPARACIONES EN HPLC 71 y con ello, convertirse en una herramienta eficiente para la optimización asistida por ordenador de separaciones en HPLC. Adicionalmente, y tal como se ha indicado previamente, los gradientes utilizados por un modelo PREGA convencional para la re-calibración son los mismos que el programa propone para calcular modelos SCOUT, de modo que el trabajo experimental realizado siempre es utilizado de la forma más eficiente posible y el proceso de creación del modelo de retención resulta así un proceso secuencial que va incorporando más parámetros y exigiendo más trabajo según se va comprobando la necesidad de realizar esos experimentos y no a priori. Este modelo de retención es utilizado posteriormente para el desarrollo del proceso de optimización de las separaciones. Tanto el proceso de desarrollo del modelo de retención isocrático como la re-calibración del mismo y el propio proceso de optimización de las separaciones son realizados mediante algoritmos evolutivos [178, 179], adaptados a cada uno de estos objetivos. En el caso de la optimización de las separaciones, se usan cualquiera de las funciones de respuesta cromatográficas (CRFs) como función objetivo [180]. 3.2.1. Aplicaciones del PREGA Como se mencionó anteriormente El PREGA es una herramienta de quimiometría que facilita el trabajo a los analistas cuando utilizan cromatografía líquida, permitiendo a estos mejorar las separaciones cromatográficas y lograr procesos de desarrollo más eficientes. Puede ser aplicado a cualquier tipo de compuesto que se quiera separar. Es decir compuestos ionizable o no ionizables, polares, etc. Ejemplo de las separaciones hechas con PREGA encontramos polifenoles, arilaminas, piroretardantes, edulcorantes, pesticidas y fármacos entre otros [163, 181]. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. REF E 4. 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Carac t D ICE DE T i pales pro p ................. . ación de l a ................. . t erísticas d A BLAS p iedades f í ................. . a UE de us ................. . d e diferent e í sico-quí m . ................. . s o en bebi d . ................. . e s adsorb e m icas de lo s . ................. . d as para lo s . ................. . e ntes poli m ÍNDI C s edulcora n . ................. . s edulcora n . ................. . m éricos ...... . C E DE TA B n tes .................. a ntes .................. .................. B LAS 89 .... 12 .... 16 .... 28 ARTÍCULO CIENTIFICO 1 97 ARTÍCULO CIENTIFICO 1 1. “Determination of artificial sweeteners in water samples by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry” E.Y. Ordoñez, J.B. Quintana, R. Rodil, R.Cela Journal of Chromatography A 1256 (2012) 197-205 DOI: 10.1016/j.chroma.2012.07.073 ARTÍCULO CIENTÍFICO 2 111 ARTÍCULO CIENTÍFICO 2 2. “Determination of artificial sweeteners in sewage sludge samples using pressurised liquid extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry” E.Y. Ordóñez, J.B. Quintana, R. Rodil, R. Cela Journal of Chromatography A 1320 (2013) 10-16 DOI: 10.1016/j.chroma.2013.10.049 ARTÍCULO CIENTÍFICO 3 121 ARTÍCULO CIENTÍFICO 3 3. “Determination of artificial sweeteners in beverages with green mobile phases and high temperature liquid chromatography–tandem mass spectrometry “ E. Y. Ordoñez, R. Rodil, J.B. Quintana, R. Cela Food Chemistry 169 (2015) 162–168 DOI: 10.1016/j.foodchem.2014.07.132 ARTÍCULO CIENTÍFICO 4 137 ARTÍCULO CIENTÍFICO 4 4. “Computer assisted optimization of liquid chromatographic separations of small molecules using mixed-mode stationary phases” E. Y. Ordoñez, J. B. Quintana, R. Rodil, R. Cela Journal of Chromatography A 1238 (2012) 91-104 DOI: 10.1016/j.chroma.2012.03.055 inte n lod o met o cro m en t con t pro c niv e mu e sist e (m g/ bebi y co m nec e aun q (en edu l par a (SP E estr u anf ó alta m tipo s que DIS C 5. Esta te s n sidad, en o s, y en m o dolo g ías m ato g rafía t ándem ( M t inuación s c eso analít i PREPA R En esta e les de con e stras men e ma HPL C / L) la pre p das carbo n m o se de m En el c e sario una q ue las co n torno a 1 l corantes, a el uso d e E ) la técnic a u ctura ho m ó teros, lo q m ente des a s de adso r combina n C USIÓN D s is ha in v su ma y or í m uestras d de prepa r líquida ( H M S/MS) y s e discute n i co, así co m R ACIÓN D tesis se h a centració n os compl ej C -MS/MS p aración d n atadas), d m uestra en c aso de l a etapa de n centracio n µ g /L), n o su polari d e técnicas d a de refer e m o g énea, q ue implic a fiante. P o r bentes di n retenció n DIS C D E RESUL T v esti g ado í a sintétic o d e bebid a r ación de H PLC), la d y finalme n los resu l m o tras su a D E MUES T a n conside r n esperabl e j as son la s y las co n d e muestr a d ilución y f el artículo a s muestr a preconce n n es son el e o lo sufic i d ad tan el e d e microe x e ncia. Ade m e xistiendo a que obt e o r eso en e l f erentes d n mediant e C USIÓN D T ADOS I N la deter m o s, en mue s a s. Para e muestra, detección e nte se h a l tados obt e a plicación T RA r ado tres m e s de los e d s bebidas, n centracio n a se limit a f iltración, o científico a s de a gu ntración p e vadas pa r i ente en t evada ha c x tracción, m ás, no so o compues e ner un m l artículo c d e SPE, in c e fase rev e D E RESUL T N TEGRAD O m inación d s tras med i llo se ha n de separ a mediante a aplicad o e nidos en a muestr a m atrices m u d ulcorante donde de b n es a me d a a una de s o bteniénd o 3. u a residu a p revia a l a r a estas m u odos los c c e que no siendo la n un g rup tos neutr o m étodo de c ientífico 1 , c lu y endo a e rsa y ca m T ADOS I N O RA d e edulco r oambient a n investi g a ción cro m espectro m o a mue s las difere n a s. uy difere n s y a su c o b ido a la s d ir de est o sg asificaci ó o se bueno s a l y supe r a determi n u estras me d c asos. En sean bue n extracció n o de com p o s, mu y á c SPE satis f , se han e v a l g unos d e m bio iónic o N TEGRAD rantes de a les, de a gu g ado difer e m ato g ráfic a m etría de m s tras real e ntes parte n tes en cua o mple j ida d s ensibilida d o s comp u ó n (caso d s resultad o r ficial, se n ación, p o dioambie n el caso d n os candi d n en fase s p uestos co n c idos e in c f actorio es v aluado h a e modo m o . Sin emb ORA 163 alta u as y e ntes a por m asas e s. A s del nto a d . Las d del estos d e las o s, tal hace o rque n tales e los d atos ólida n una c luso al g o a sta 7 m ixto, a r g o, METODOLOGÍA DESARROLLADA 170 6. Montes R, Aguirre J, Vidal X, Rodil R, Cela R, Quintana JB; Screening for polar chemicals in water by trifunctional mixed-mode liquid chromatographyhigh resolution mass spectrometry. Environ Sci Technol (2017) en revisión. 7. Kokotou MG, Thomaidis NS; Determination of eight artificial sweeteners in wastewater by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Methods 5 (2013) 3825-3833. 8. Salas D, Borrull F, Fontanals N, Marce RM; Hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry to determine artificial sweeteners in environmental waters. Anal Bioanal Chem 407 (2015) 4277-4285. 9. Subedi B, Kannan K; Fate of artificial sweeteners in wastewater treatment plants in New York State, U.S.A. Environ Sci Technol 48 (2014) 1366813674. IV. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 173 En esta tesis se han investigado diferentes metodologías analíticas basadas en cromatografía de líquidos de alta resolución combinada con espectrometría de masas (HPLC-MS) para la determinación de edulcorantes de alta intensidad, en su mayoría sintéticos, en muestras medioambientales, de aguas y lodos, y en muestras de bebidas. Las principales conclusiones que se pueden derivar de la misma son las siguientes: 1. Los edulcorantes son compuestos de elevada polaridad, por lo que es necesario optimizar cuidadosamente el proceso de extracción en fase sólida (SPE) para su determinación en aguas. Entre los distintos adsorbentes utilizados, el Oasis HLB ha proporcionado los mejores resultados. 2. La comparación de cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) frente a cromatografía líquida de fase reversa (RPLC) muestró que, en general, ambos modos cromatográficos proporcionan una buena separación, sin embargo, la RPLC proporcionó mejores límites de detección (LODs) y cuantificación (LOQs) y menores efectos de matriz. 3. Los edulcorantes están presentes de manera ubicua en las aguas residuales y superficiales en niveles elevados (µg/L) debido a su alta polaridad y persistencia. 4. La extracción con fluidos presurizados (PLE) usando un tampón acuoso permite una buena extracción automatizada de los edulcorantes de lodos de depuradora. Posteriormente, estos extractos pueden tratarse como si fuesen una muestra de agua, mediante SPE. 5. Los edulcorantes están también presentes en los lodos de depuradora e niveles de hasta 630 ng/g. Estas concentraciones se deben sin embargo al agua presente en los lodos y no a una eliminación por adsorción en los mismos. CONCLUSIONES 174 6. Ni el aspartamo ni la neohesperidina dihidrochalcona fueron encontrados en las muestras medioambientales, debido probablemente a que se metabolizan en el cuerpo humano y es posible que también en las aguas residuales. 7. La cromatografía de líquidos de alta temperatura (HTLC) permite la separación de los edulcorantes presentes en bebidas hipocalóricas de manera eficiente, reduciendo el consumo de disolvente orgánico a menos de 1 mL de etanol por inyección. Esto es mucho menos que los varios mL empleados en métodos convencionales, que usan disolventes más tóxicos, como metanol o acetonitrilo. 8. La combinación HTLC-MS permite la determinación de los edulcorantes (se consideraron 9) en bebidas hipocalóricas tras la simple dilución, desgasificiación y filtración de las muestras, con LOQs entre 0.2 y 33 mg/L. 9. Tras el análisis de 25 bebidas hipocalóricas, se pudo comprobar como en el caso del ciclamato, una de las 9 muestras que lo contenía presentaba niveles superiores a los permitidos, mientras que otras 3 estaban en el límite legal. 10. El uso de la optimización computerizada de separaciones (CAMD) en HPLC es de gran utilidad, ya que permite obtener de manera eficiente el óptimo de separación y simular miles de gradientes en múltiples modos cromatográficos. En esta tesis se ha empleado en HTLC con una columna de RPLC, y también en cromatografía de modo mixto (MMLC). 11. Por primera vez se ha descrito un procedimiento de CAMD en MMLC, un tipo de cromatografía especialmente complejo, por incluir mecanismos de RPLC, cambio catiónico y aniónico, y en ciertas circunstancias HILIC. CONCLUSIONES 175 12. Para la CAMD en MMLC se ha recurrido a ecuaciones empíricas de Hoerl, que han producido resultados con errores de predicción menores del 5% en la mayoría de los casos. V. ANEXO PUBLICACIONES RELACIONADAS 179 PUBLICACIONES RELACIONADAS “Chemometric-assisted method development in reversed-phase liquid chromatography” R. Cela, E.Y. Ordóñez, J.B. Quintana, R. Rodil Journal of Chromatography A 1287 (2013) 2-22 DOI: 10.1016/j.chroma.2012.07.081