Detección de micotoxinas reguladas, emergentes y modificadas en la cadena alimentaria

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Inés Rodríguez Cañás Tesis doctoral DETECCIÓN DE MICOTOXINAS REGULADAS, EMERGENTES Y MODIFICADAS EN LA CADENA ALIMENTARIA Lugo, 2024 Programa de doctorado en Medicina y Sanidad Veterinaria TESIS DOCTORAL DETECCIÓN DE MICOTOXINAS REGULADAS, EMERGENTES Y MODIFICADAS EN LA CADENA ALIMENTARIA Inés Rodríguez Cañás Directores: María Amparo Alfonso Rancaño Jesús María González Jartín Tutor: Luis Miguel Botana López PROGRAMA DE DOCTORADO EN MEDICINA Y SANIDAD VETERINARIA LUGO, 2024 Yo, Inés Rodríguez Cañás, doctoranda en el Programa de Medicina y Sanidad Veterinaria declaro no tener ningún conflicto de interés en relación con la tesis doctoral. Lugo, a 10 de octubre de 2024 A mis abuelos, a mis tíos y a padrino AGRADECIMIENTOS Se termina una etapa importante para mí, y por ello, quiero agradecer a todas las personas involucradas y que me han acompañado a lo largo de este trayecto. En primer lugar, gracias a Luis, por darme la oportunidad de realizar la tesis doctoral en el departamento y brindarme ayuda en todo momento. A mi directora Amparo y a mi director Jesús, sin vosotros esto no habría sido posible, gracias por todo lo que me habéis enseñado, por guiarme y aconsejarme. Durante estos años, me habéis ayudado a crecer como investigadora y también como persona. A Mª. Jesús, del departamento de producción vegetal y proyectos de ingeniería. A mis compañeros de laboratorio, Rebeca, Nadia, Sandra G., Celia, Alex y Sandra R., con los que he compartido buenos momentos y que espero logren todo aquello que se propongan. A Noelia y a Luis, a pesar de haberos conocido más tarde, os deseo también lo mejor y que disfrutéis de esta etapa. Gracias a mis amigas, por estar ahí y apoyarme incluso en la distancia. Vuestros ánimos me daban fuerza. A los amigos que he conocido estando en Lugo: María, Lu, Aida, Dani, Xian, Ely… Gracias de corazón, espero que nuestros caminos se vuelvan a cruzar. A mi amiga y gran descubrimiento, Lucía G., gracias por sacarme siempre una sonrisa. Paula, Lu y Alba, me llevo recuerdos muy especiales con vosotras, no me olvido de que todavía nos queda un karaoke pendiente. Andrea, por tu ayuda y por la empatía que mostraste conmigo. A mi abuela, a mis padres y a mi hermano, por apoyarme siempre en las decisiones que he tomado y confiar en mí. Hicisteis que el camino fuese más fácil. Y, sobre todo, gracias Vero por ser mi apoyo incondicional y animarme siempre. RESUMEN Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por ciertos hongos filamentosos, que presentan toxicidad para humanos y animales. Los principales hongos productores de micotoxinas pertenecen a los géneros Aspergillus, Penicillium y Fusarium. Estos hongos pueden contaminar materias primas, como los cereales, tanto durante el cultivo como después de la cosecha, en las etapas de procesamiento, transporte o almacenamiento. Con el fin de evitar intoxicaciones, la Unión Europea (UE) establece niveles máximos permitidos de ciertas micotoxinas en productos alimenticios, pero no propone métodos oficiales para su detección. En el caso de estos contaminantes, establece criterios de funcionamiento para los métodos analíticos destinados al análisis de toxinas reguladas, los cuales deben ser validados para las distintas matrices de interés. Además de las micotoxinas reguladas, existen formas modificadas de estas y toxinas emergentes que no están contempladas en la legislación debido a la falta de datos toxicológicos y de incidencia, pero que pueden estar presentes en materias primas y productos derivados, lo que podría suponer un riesgo. En la presente tesis doctoral se han optimizado métodos analíticos que incluyen métodos de extracción basados en la metodología QuEChERS y métodos de detección por cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas en tándem (UHPLCMS/MS) para analizar de forma simultánea micotoxinas reguladas, emergentes y modificadas. Los métodos fueron validados en diversas matrices, incluyendo materias primas destinadas a alimentación animal, concretamente TMR (ración total mezclada), productos lácteos como queso y yogur, y bebidas vegetales. La validación de los métodos se realizó en términos de linealidad, límites de detección y cuantificación, exactitud y precisión, cumpliendo con los criterios de funcionamiento establecidos en la legislación para métodos confirmatorios destinados al análisis de micotoxinas. Además, se estudió el perfil metabólico del hongo Gnomoniopsis smithogilvy aislado de castañas, alimento habitual de los animales domésticos en Galicia. Para ello se empleó un método UHPLC acoplado a espectrometría de masas de alta resolución, utilizando un analizador de trampa de iones y tiempo de vuelo (UHPLC-MS-ITTOF). De esta forma, se descartó que el hongo produjera micotoxinas; sin embargo, se identificaron tres metabolitos, adenosina, oxasetina y fitosfingosina, con interesantes propiedades farmacológicas y fitotoxicológicas. Una vez validados, los métodos analíticos se emplearon para estudiar la incidencia de las micotoxinas a lo largo de la cadena alimentaria. Se observó que se produce un arrastre de las micotoxinas emergentes eniatinas, beauvericina y roquefortina C desde el TMR, utilizado en la alimentación de ganado vacuno, hasta la leche. Además, las eniatinas y la beauvericina se detectaron en queso y yogur. Los hongos empleados en la maduración del queso son responsables de la contaminación adicional de este alimento con toxinas como la roquefortina C y el ácido ciclopiazónico. En el queso también se observó la presencia de toxinas no producidas por los hongos de maduración, como la ocratoxina A, que se encontró esporádicamente, pero en niveles que podrían representar un riesgo para la salud humana. Esta toxina también se detectó en yogures naturales. Por otra parte, se evidenció que la adición de avena a los yogures incrementa la cantidad de micotoxinas, como el neosolaniol o la toxina HT2, que son arrastradas del cereal. En el caso de bebidas vegetales, se identificaron las toxinas T2 y HT-2 en productos a base de avena, mientras que las aflatoxinas se observaron en bebidas de arroz y almendra. Nuevamente, las micotoxinas emergentes eniatinas y beauvericina se detectaron en todos los tipos de bebidas. INTRODUCCIÓN 3 1. INTRODUCCIÓN 1.1. SEGURIDAD ALIMENTARIA Y LEGISLACIÓN La seguridad alimentaria está definida por la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) como la “situación que se da cuando todas las personas tienen, en todo momento, acceso físico, social y económico a suficientes alimentos inocuos y nutritivos para satisfacer sus necesidades alimenticias y sus preferencias en cuanto a los alimentos a fin de llevar una vida activa y sana” (1). La FAO y la Organización Mundial de la Salud (OMS) trabajan para garantizar la inocuidad de los alimentos y de esta forma proteger la salud de los consumidores, así como, proporcionar ayuda de calidad a los trabajadores del sector agroalimentario para que puedan producir, procesar y distribuir alimentos inocuos (2). Tras las fuertes crisis alimentarias de los años 90, en el año 2000, la Comisión Europea (CE) publica el “Libro Blanco sobre Seguridad Alimentaria”. En él se explica la estrategia para alcanzar los niveles más altos en términos de seguridad alimentaria dentro de la Unión Europea (UE), basándose en el principio general “de la granja a la mesa”, considerando de forma integral la cadena alimentaria, es decir, desde la producción primaria hasta llegar al consumo del alimento. Como resultado del plan de acción sobre seguridad alimentaria, se aprueba el Reglamento (CE) Nº 178/2002 por el que se establecen los principios y los requisitos generales de la legislación alimentaria, y se crea la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (European Food Safety Authority, EFSA) (3). La EFSA es una agencia europea independiente que cuenta con paneles de expertos altamente cualificados que brindan asesoramiento científico y comunicación sobre los riesgos asociados a la seguridad de alimentos y piensos dentro de la cadena alimentaria. La evaluación de los riesgos da lugar a la elaboración de dictámenes científicos y consejos para colaborar con la CE, el Parlamento Europeo y los estados miembros de la UE en la toma de decisiones de gestión de riesgos que comprometan la inocuidad de los alimentos. En este sentido, se establece que se debe llevar a cabo el análisis del riesgo: evaluación del riesgo, gestión del riesgo y, por último, comunicación del riesgo. En el año 2001, se crea la Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición (AESAN) que pertenece actualmente al Ministerio de Derechos Sociales, Consumo y Agenda 2030. El objetivo principal de AESAN es garantizar la seguridad alimentaria y ofrecer información objetiva y de calidad, tanto a los consumidores como al sector agroalimentario. En el año 2004, se publica la legislación acerca de la higiene general de los productos alimenticios, conocido como paquete de higiene, en el que se incluyen los Reglamentos (CE) Nº 852/2004, 853/2004 y 854/2004 modificados por el Reglamento (CE) 2074/2005 (4). En el año 2017, se dicta el Reglamento (UE) 2017/625 para asegurar la aplicación de los controles oficiales y normas sobre la salud humana y animal, así como, la protección del medio ambiente (5, 6). Una de las funciones de AESAN es gestionar el riesgo en alimentos, es decir, aplicar medidas regidas por normativas nacionales y de la UE que logren prevenir, minimizar o eliminar el riesgo. De esta forma, se garantiza el grado más alto en términos de seguridad alimentaria. Dentro de la gestión de riesgos se diferencian la seguridad biológica, la seguridad nutricional y la seguridad química. La seguridad biológica trata los riesgos que tienen relación con bacterias, virus o priones presentes en alimentos, especialmente, en los productos alimenticios que proceden de animales. La seguridad nutricional se enfoca en garantizar la protección dentro del mercado interior de alimentos, especialmente, en establecer el correcto etiquetado de los alimentos para poner a disposición del consumidor información clara y transparente acerca de la composición nutricional INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 4 y de los ingredientes. Por otro lado, la seguridad química se centra en la producción y la distribución de los alimentos, consiguiendo una mejora gracias a la adición intencionada de ciertos compuestos, como los productos fitosanitarios o medicamentos de uso veterinario para obtener mejor producción de los cultivos o del ganado, la adición de aditivos en alimentos para mejorar características organolépticas o sensoriales, o el uso de materiales para el envasado o embalaje del alimento, facilitando de esta manera su distribución y mejorando su aspecto. El uso de sustancias químicas puede conllevar a un arrastre hacia los alimentos, por lo tanto, es necesario garantizar a través de controles de calidad que son inocuos para el consumidor. Por otro lado, existen sustancias que no se han añadido de manera intencionada y también se consideran un peligro químico, denominadas contaminantes. Dentro de este grupo se incluyen metales, dioxinas, nitratos, hidrocarburos aromáticos policíclicos, toxinas marinas y micotoxinas. A finales de la década de los 50, principios de los 60, ocurrió una crisis alimentaria como consecuencia de una enfermedad inicialmente desconocida que provocó la muerte de 100.000 pavos en Reino Unido. Posteriormente, se descubrió que la causa residía en el pienso contaminado con micotoxinas, en concreto, con aflatoxinas (AFs). Paralelamente, se produjo una epizootia de cáncer de hígado en truchas arcoíris de piscifactoría en California. Se identificó que el pienso con el que se alimentaban los peces también estaba contaminado con AFs (7, 8). La palabra micotoxina proviene del griego “mycos” (hongo) y del latín “toxicum” (tóxico). Las micotoxinas son metabolitos secundarios de bajo peso molecular con potencial tóxico, producidos por ciertos hongos filamentosos (mohos), que suelen formarse al final de la fase exponencial o en la fase estacionaria del crecimiento del hongo. La mayor parte de micotoxinas pertenecen al género Aspergillus, Fusarium y Penicillium. Por otro lado, los géneros Alternaria y Claviceps también producen micotoxinas, aunque en menor proporción (9, 10). Estos metabolitos pueden contaminar alimentos o piensos, suponiendo un riesgo para la salud humana y animal, ya que la ingesta, inhalación o contacto directo provoca intoxicaciones conocidas como micotoxicosis. Se ha demostrado que ciertas micotoxinas son carcinógenas, genotóxicas, nefrotóxicas y/o mutagénicas. Además, una única especie fúngica es capaz de producir múltiples micotoxinas y por lo tanto es común detectar varias micotoxinas en un mismo producto alimenticio. A raíz de estos sucesos la UE empezó a controlar la presencia de micotoxinas en alimentos y piensos. En el año 2006, se publica el Reglamento (CE) Nº 1881/2006 que establece el contenido máximo de determinados contaminantes, incluyendo a las micotoxinas, en los productos alimenticios (11). Tras el aumento de la incidencia de micotoxinas en alimentos, el reglamento sufre una serie de modificaciones. En 2015, se modifica a través del Reglamento (UE) 2015/1137 que establece un contenido máximo de ocratoxina A (OTA) en las especias Capsicum spp. (15-20 µg/kg) (12). En 2021, sufre una modificación a través del Reglamento (UE) 2021/1399 y se establecen niveles máximos de esclerocios de cornezuelo (0,2 µg/kg) y alcaloides de cornezuelo (20-400 µg/kg) en cereales y productos derivados (13). En 2022, el Reglamento (UE) 2022/1370 añade nuevos datos en relación con el contenido máximo de OTA en productos alimenticios, como las semillas de soja en las que se fija un nivel de 5 µg/kg, así como semillas de girasol, calabaza, melón, sandía y cáñamo. Finalmente, tras varias modificaciones realizadas, el Reglamento (CE) Nº 1881/2006 queda derogado por el actual Reglamento (UE) Nº 2023/915 (Tabla 1) (14). Por otro lado, la legislación de alimentación animal establece niveles máximos de aflatoxina B1 (AFB1) y cornezuelo de centeno según la Directiva 2002/32/CE (15) y niveles recomendados de deoxinivalenol (DON), zearalenona (ZEA), OTA, fumonisina B1 (FB1) y fumonisina B2 (FB2), toxina HT-2 (HT-2) y toxina T-2 (T2) según la Recomendación 2006/579/CE (16). Introducción 5 Micotoxinas Productos alimenticios Nivel máximo permitido (µg/kg) Niveles permitidos (1) o recomendados (2) (µg/kg) en pienso Reglamento (UE) Nº 2023/915 Directiva 2002/32/CE (1) Recomendación 2006/576/CE (2) AFs Cereales 4 5-20 (AFB1) AFM1 Leche cruda y preparados para lactantes 0,025-0,05 - OTA Granos de cereales, productos derivados de cereales 3-5 10-250 Alimentos infantiles elaborados a base de cereales 0,50 - DON Granos de cereales, productos derivados de cereales 500-1250 900-12000 Alimentos infantiles elaborados a base de cereales 200 - ZEA Granos de cereales, productos derivados de cereales 50-100 100-3000 Alimentos infantiles elaborados a base de cereales 20 - FBs Granos de maíz, productos derivados de maíz 800-4000 500-6000 Alimentos infantiles elaborados a base de maíz 200 - CTN Complementos alimenticios a base de arroz fermentado 100 - T-2 y HT-2 Granos de cereales, salvado de cereales, productos derivados de panadería 20-50 50 Granos de avena sin transformar 1250 - Copos de avena, productos derivados de avena 100 - Alimentos infantiles elaborados a base de cereales 10 - Tabla 1. Resumen de niveles máximos permitidos (µg/kg) de las principales micotoxinas según el Reglamento (UE) Nº 2023/915 que deroga el Reglamento (CE) Nº 1881/2006, que establece el contenido máximo de contaminantes en determinados productos alimenticios. Niveles permitidos o recomendados (µg/kg) en piensos según la Directiva 2002/32/CE y según la Recomendación 2006/579/CE. Aflatoxina M1 (AFM1), fumonisinas (FBs), citrinina (CTN). La contaminación por hongos micotoxigénicos se suele desarrollar en una amplia variedad de cultivos, antes de la cosecha o después, es decir, durante el procesado, el transporte o el almacenamiento de las materias primas. No obstante, la presencia de hongos no siempre conlleva a una contaminación por micotoxinas, ya que los factores que afectan a la producción de micotoxinas no son los mismos que afectan a la proliferación de hongos. Por otro lado, la ausencia del hongo no garantiza la ausencia de micotoxinas ya que se trata de metabolitos que son termoestables y estables químicamente. Su producción va a depender de factores como la INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 6 temperatura, la actividad de agua, la humedad, el pH, el sustrato y el tipo de cepa. Además, los hongos pueden regular el pH del entorno a través de la secreción de ácidos residuales, siendo el pH ácido adecuado para la producción de micotoxinas en la mayoría de los casos (17). Además, la contaminación de micotoxinas en productos agrícolas genera un gran impacto económico-social debido a las pérdidas de producción del campo (18). Las condiciones climáticas son de vital importancia tanto en la producción de los hongos como de las micotoxinas. Los hongos Fusarium crecen en zonas de elevada humedad, siendo habituales durante la precosecha. En cambio, los hongos Aspergillus y Penicillium crecen en entornos con humedades relativas al 80 % o menos, y suelen aparecer en etapas posteriores a la cosecha. Existe una preocupación actual debido al cambio climático y al impacto en la contaminación de micotoxinas ya que se ha detectado un aumento de la incidencia en nuevas áreas geográficas. En el caso de las AFs, que suelen detectarse en regiones como el sur de África, también se espera que ocurran con mayor frecuencia en países del mediterráneo como Italia y España, debido al aumento de temperatura y de épocas de sequía (17, 19). Actualmente, se conocen aproximadamente más de 400 metabolitos secundarios identificados como micotoxinas, sin embargo, solo están reguladas en la UE las que se mencionan a continuación: las AFs, OTA, patulina (PAT), DON, ZEA, FB1 y FB2, CTN, T-2 y HT-2, esclerocios y alcaloides de cornezuelo (20). En la Tabla 1 se indican los niveles máximos permitidos en alimentos y piensos según el reglamento actual, así como, los niveles de concentración recomendados en productos destinados a la alimentación animal. Las micotoxinas pueden sufrir modificaciones en su estructura química, tras la acción metabólica de animales, plantas u hongos. Estas micotoxinas se conocen bajo el concepto de “micotoxinas modificadas” adoptado por la EFSA en una opinión científica del año 2014 (21). Son aquellas que han sufrido alteraciones en la estructura de las toxinas precursoras o libres, definidas como los compuestos secundarios que se han producido por el metabolismo de ciertos hongos filamentosos. Las micotoxinas modificadas pueden encontrarse en niveles similares a las micotoxinas libres, y en ciertos casos, la concentración será superior en alimentos procesados (22). Por ello, la evaluación de riesgos en la cadena alimentaria debe tener en cuenta a las formas modificadas ya que pueden contribuir a la toxicidad. Estas modificaciones se producen como consecuencia del mecanismo de defensa de plantas infestadas, tras sufrir reacciones de hidrólisis, oxidación o reducción (fase I) o tras la conjugación con moléculas orgánicas (fase II) en plantas, en el metabolismo de ciertos microorganismos (hongos o bacterias) o del animal mamífero. Los metabolitos formados en la fase II de las plantas también se denominan micotoxinas enmascaradas, y suelen conjugarse con moléculas polares de bajo peso molecular como la glucosa (23). Por ejemplo, las micotoxinas α-ZEA y β-ZEA han sido modificadas tras la acción del metabolismo de las plantas en la fase I. No obstante, existe la posibilidad de que sean metabolitos modificados por el mecanismo de defensa de hongos o bacterias. Por otro lado, las formas modificadas pueden producirse tras procesos físicos o químicos donde intervienen parámetros como el pH, la presión, la temperatura o la radiación. En general, las micotoxinas son estables al procesado de alimentos, sin embargo, pueden sufrir modificaciones transformándose en un análogo o asociándose a algún componente de la matriz alimentaria, y, por lo tanto, el nivel de la micotoxina precursora o libre va a disminuir en el alimento (22). El deepoxi deoxinivalenol (DOM-1) es un análogo del DON que puede producirse tras la acción metabólica de microorganismos, pero también por degradación del DON tras un proceso de calor (24). Por otro lado, existe un amplio grupo denominado micotoxinas emergentes que no están monitorizadas en análisis rutinarios, por lo que no están reguladas debido a la falta de datos toxicológicos y de presencia en alimentos (25). Sin embargo, existen evidencias de su alta Introducción 7 incidencia en productos alimenticios (25). Alguna de las micotoxinas emergentes más importantes son las eniatinas (ENNs), la beauvericina (BEA), el ácido fusárico (FA), la esterigmatocistina (STC), el alternariol (AOH), el alternariol metil éter (AME), el ácido micofenólico (MPA), la roquefortina C (ROQC) y la gliotoxina (GLIO). Cabe destacar que, en la industria alimentaria, se emplean cepas de hongos no micotoxigénicos en etapas de producción, como el uso de Penicillium roqueforti para elaborar queso denominación de origen Roquefort (26). Sin embargo, la ROQC está producida por esta especie, pudiendo aparecer en queso (27). 1.2. MICOTOXINAS REGULADAS 1.2.1. Aflatoxinas Las AFs son un grupo de 18 compuestos de bisfuranocumarina, aunque las más conocidas hasta el momento son aflatoxina B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1), G2 (AFG2), AFM1 y M2 (AFM2) (28). La estructura química de cada una se muestra en la Fig. 1. Son sustancias cristalinas, solubles en agua y en disolventes orgánicos como el metanol. Son sensibles a pH muy ácidos o fuertemente alcalinos. En estado sólido son estables en ausencia de luz (29). La AFM1 y AFM2 son los compuestos hidroxilados de sus micotoxinas precursoras AFB1 y AFB2. La reacción de hidroxilación tiene lugar en el metabolismo del animal que ingiere el alimento contaminado con AFB1 y/o AFB2. No obstante, la evaluación de riesgos excluye a la AFM2 porque no hay datos de incidencia en alimentos. Las AFs son un grupo de compuestos producidos por diferentes especies del género Aspergillus, A. flavus y A. parasiticus, consideradas patógenos para los humanos y los animales (30). Se suelen desarrollar en climas húmedos y cálidos pudiendo crecer en regiones tropicales e infestar cultivos durante la cosecha o durante el almacenamiento. Las AFs de tipo B están producidas por ambas especies, mientras que las de tipo G son específicas de A. parasiticus. La “B” y la “G” hacen referencia a los colores azul (blue) y verde (green) que se manifiestan frente a la luz ultravioleta. Las AFs son genotóxicas, mutagénicas y consideradas carcinógenos hepáticos por la Agencia Internacional de Investigación contra el Cáncer (IARC). La AFB1, se considera el análogo más tóxico, ya que está clasificada como carcinógeno del grupo 1 lo que significa que su carcinogenidad está demostrada en humanos (31). Las AFs suelen aparecer en cereales y productos derivados, frutos secos, arroz, especias y leche. El cambio climático juega un papel fundamental en el incremento de los niveles de AFs en los países europeos en diversos cultivos (32). El aumento de contaminación de AFB1 en maíz, u otras materias primas, está relacionada con el aumento en los niveles de AFM1 en la leche, ya que este cereal es la base de la alimentación animal y el análogo hidroxilado (AFM1) es capaz de transferirse a los tejidos y fluidos del animal (33). La AFM1 es resistente a altas temperaturas, por lo tanto, los procesos de industria alimentaria para transformar la leche en productos derivados, como la uperización no asegurarían la eliminación de este contaminante (34). INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 8 1.2.2. Tricotecenos Los tricotecenos son una familia formada por aproximadamente 18 compuestos cíclicos denominados sesquiterpenoides, divididos en cuatro grupos (A, B, C y D) según su estructura química, diferenciándose en los distintos radicales (R1, R2, R3, R4, R5) que están enlazados a la estructura cíclica (12,13-epoxitricotec-9-eno) común a todos ellos (Fig. 2). Están producidos por diferentes especies de Fusarium, Myrothecium, Cephalosporum, Verticimonosporum, Trichoderma, Trichothecium y Stachybotrys. Tricoteceno A Tricoteceno B Micotoxina R1 R2 R3 R4 R5 Fórmula molecular Peso molecular Tricoteceno A T-2 OH OCOCH3 OCOCH3 H OCOCH2CH(CH3)2 C24H34O9 466,2 HT-2 OH OH OCOCH3 H OCOCH2CH(CH3)2 C22H32O8 424,2 NEO OH OCOCH3 OCOCH3 H OH C19H26O8 382,2 DAS OH OCOCH3 OCOCH3 H H C19H26O7 366,2 T2 triol OH OH OH H OCOCH2CH(CH3)2 C20H30O7 382,2 Tricoteceno B Micotoxina R1 R2 R3 R4 R5 Fórmula molecular Peso molecular DON OH H OH OH - C15H20O6 296,3 3-AcDON OCOCH3 H OH OH - C17H22O7 338,4 15-AcDON OH H OCOCH3 OH - C17H22O7 338,4 DON-3-Glu C6H11O6 H OH OH - C21H20O11 448,1 Nivalenol OH OCOCH3 OH H - C15H20O7 312,1 Fig. 2. Estructura química de tricotecenos A y B Los tricotecenos A, B y C se diferencian en el grupo funcional posicionado en el carbono 8. Los del grupo A incluyen un grupo hidroxilo o un grupo éster, mientras que los de tipo B poseen un grupo carbonilo. Por otra parte, los de tipo C poseen un grupo epóxido en la posición del carbono 7 y carbono 8, o carbono 9 y carbono 10. Por último, los de tipo D tienen un anillo macrocíclico unido al carbono 4 y al carbono 15. Los tricotecenos más importantes son los de tipo A y B, debido a una mayor incidencia en cereales. Los tricotecenos A incluyen T-2, HT-2, AFB1 AFB2 AFM1 AFG1 AFG2 Fórmula molecular C17H12O6 C17H14O6 C17H12O7 C17H12O7 C17H14O7 Peso molecular (g/mol) 312,3 314,3 328,3 328,3 330,3 Fig. 1. Estructura química de las principales AFs Introducción 15 simultánea con micotoxinas reguladas, ya que los hongos productores son de la misma especie (25). Las toxinas emergentes más conocidas por su frecuencia de aparición dentro de la cadena alimentaria son BEA, ENNs, STC, MPA, AME, ROQC, GLIO, NIV, DAS y ácido fusárico (FA) (67, 68). 1.3.1. Beauvericina y eniatinas La BEA es un hexadepsipéptido cíclico que consiste en unidades alternadas de D-hidroxiisovaleril-(ácido 2-hidroxi-3-metilbutanoico) y N-metilfenilalanina como se muestra en la Fig. 9. Está producida por hongos como Baveria bassiana o Fusarium spp. Por otro lado, las ENNs tienen una estructura muy similar, pero difieren en que en las ENNs A y B poseen los aminoácidos N-metil-valina o N-metil-isoleucina alifáticas o mezclas de estas dos. Las estructuras se muestran en la Fig. 9. La BEA y ENNs se consideran compuestos lipofílicos porque las cadenas laterales apolares están situadas en la cara exterior de la molécula. Muestran baja solubilidad en agua y no presentan inestabilidad en condiciones de pH ácido o básico (69). Pueden actuar como nucleófilos debido a su par de electrones libres situados en el oxígeno del grupo carbonilo. El mecanismo de acción todavía no está bien definido, sin embargo, se ha demostrado que producen efectos en los canales de calcio en células de neuroblastoma humano (70). En cuanto a la incidencia en alimentos, suelen encontrarse con frecuencia en cereales y productos derivados, frutos secos, cerveza, huevos y leche (71, 72). BEA ENNA ENNA1 ENNB ENNB1 Fórmula molecular C45H57N3O9 C36H63N3O9 C35H61N3O9 C33H57N3O9 C34H59N3O9 Peso molecular (g/mol) 783,95 681,5 667,4 639,4 653,4 R1 - CH(CH3)CH2CH3 sec-butyl CH(CH3)CH2CH3 sec-butyl CH(CH3)2 iso-propyl CH(CH3)2 iso-propyl R2 - CH(CH3)CH2CH3 sec-butyl CH(CH3)CH2CH3 sec-butyl CH(CH3)2 iso-propyl CH(CH3)2 iso-propyl R3 - CH(CH3)CH2CH3 sec-butyl CH(CH3)2 iso-propyl CH(CH3)2 iso-propyl CH(CH3)CH2CH3 sec-propyl Fig. 9. Estructura química de la BEA y de las ENNs 1.3.2. Esterigmatocistina La STC es la abreviatura de ((3aR, 12cS)-3a,12c-dihidro-8-hidroxi-6-metoxi-7Hfuro[3’,2’:4,5]furo[2,3-c]xanten-7-ona. Su fórmula molecular es C18H12O6 y el peso molecular de 324,3 g/mol. En la Fig. 10 se muestra su estructura química. Es un policétido producido por más de 50 especies Aspergillus, principalmente A. versicolor. Esta micotoxina cristaliza en agujas de color amarillo pálido, y su punto de fusión está en torno a 245-246 ºC. Es soluble en INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 16 disolventes orgánicos como el cloroformo, metanol o acetonitrilo y muestra baja solubilidad en disoluciones acuosas. Esta micotoxina, que comparte su vía biosintética con las AFs y que está relacionada con la estructura de la AFB1, afecta a cereales y productos a base de cereales, además, se ha aislado de diferentes variedades de queso (73, 74). La STC es hepatotóxica, causa necrosis hepatocelular y hemorragias. También es capaz de causar lesiones premalignas y malignas como carcinomas hepatocelulares (75). En este sentido, la EFSA considera que se precisan métodos analíticos más sensibles y más datos de toxicidad para averiguar el posible riesgo que supone su presencia en alimentos y piensos (74). 1.3.3. Ácido micofenólico El MPA se conoce como ácido 6-[4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-ftalanil]-4-metil-4hexenoico (Fig. 11). Su fórmula molecular es C17H20O6 y su peso molecular de 320,3 g/mol. Es un policétido producido principalmente por especies de Penicillium siendo el principal productor P. roqueforti, y otras especies como P. brevicompactum, y P. carneum (76). Esta micotoxina se puede encontrar en silos, jengibre, vino y queso (25). Es un agente inmunosupresor comúnmente empleado en la profilaxis del rechazo agudo en trasplantes. Los niveles en los que se encuentra en los alimentos son muy inferiores a las dosis terapéuticas en humanos, sin embargo, podría causar un cierto nivel de inmunosupresión en animales expuestos a grandes cantidades (25, 77). Fig. 11. Estructura del MPA 1.3.4. Roquefortina C La ROQC (Fig. 12) es una micotoxina producida por el género Penicillium, en especial P. roqueforti. Su fórmula molecular es C22H23N5O2 y su peso molecular es de 389,5 g/mol. Es totalmente soluble en etanol, y la solubilidad en metanol es de 10 mg/mL. El punto de fusión es de 303,1 ºC. El hongo productor suele añadirse de manera intencionada en la producción de ciertos quesos durante la etapa de maduración. Como consecuencia, en estos productos se suelen encontrar cantidades elevadas de ROQC, pero el consumo de quesos no considera un peligro importante para la salud ya que, hasta el momento, no se han reportado intoxicaciones humanas por consumo de estos productos lácteos (64). Fig. 10. Estructura de la STC Introducción 17 Fig. 12. Estructura de la ROQC 1.3.5. Gliotoxina La GLIO pertenece a la clase de compuestos epipolitiodioxopiperacina, caracterizada por un enlace disulfuro. Su fórmula molecular es C13H14N2O4S2 y su peso molecular es 326,1 g/mol (Fig. 13). Fue aislada originalmente de Trichoderma virens, como antibiótico para el control de hongos patógenos de plantas (78). Es producida por varias especies como Aspergillus fumigatus, Eurotium chevalieri, Gliocladium fimbriatum, y Dichotomyces cejpii y también algunas especies de Penicillium (79, 80). Se encuentra con frecuencia en los silos y es inmunosupresora ya que causa la apoptosis de linfocitos y macrófagos (81). 1.3.6. Toxinas de Alternaria Dentro de las toxinas de Alternaria, se incluyen las dibenzo-α-pironas AOH (C14H10O5, 258,2 g/mol) y AME (C15H12O5, 272,3 g/mol) (Fig. 14). Estas micotoxinas son solubles en disolventes orgánicos, como el metanol o etanol, suelen encontrarse en cereales, productos derivados, tomate y productos a base de tomate, semillas de girasol y aceite de girasol, frutas, productos elaborados a base de frutas, cerveza y vino (82). Recientemente se ha detectado la presencia de AME en leche humana (83). Aunque existen pocos datos acerca de su toxicidad, ensayos in vitro los clasifican como citotóxicos y genotóxicos (84). Fig. 13. Estructura de la GLIO (a) (b) Fig. 14. Estructura de AOH (a) y AME (b) INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 18 1.3.7. Diacetoxiscirpenol El DAS conocido también como (3α,4β)-3hidroxi-12,13-epoxi-tricotec-9-eno-3,4,15-triol4,15-diacetato es un compuesto cristalino de color blanco, con un punto de fusión entre 12 ºC y 164 ºC. Pertenece al grupo de tricotecenos de tipo A y lo producen distintas especies Fusarium (36). La estructura química se diferencia de la T-2 en el R5, ya que no posee el grupo isovaleril (Fig. 2) (85). Es un compuesto soluble en disolventes orgánicos como acetato de etilo, acetona o cloroformo. Sin embargo, es menos polar que los tricotecenos de tipo B. Se mantiene estable en condiciones de pH neutro y ácido pero en disoluciones alcalinas de hidróxido sódico o hidróxido de amonio se hidroliza a un análogo denominado scirpentriol (86). Generalmente suele detectarse en cereales y productos derivados, así como también en piensos y silos de maíz. Sus efectos tóxicos son similares a los mencionados de los anteriores tricotecenos de tipo A (87). 1.3.8. Ácido ciclopiazónico El CPA también conocido como ácido α-ciclopiazónico, es una toxina del ácido indoltetrámico, con fórmula molecular C20H20N2O3 y peso molecular de 336,4 g/mol. Es cristalino, incoloro y soluble en disolventes orgánicos como metanol, acetonitrilo o cloroformo e insoluble en agua. Su estructura química se muestra en la Fig. 15. Se aisló por primera vez de una cepa de Penicillium griseofulvum. El CPA es producido por varias especies de Penicillium, como P. camemberti y por especies de Aspergillus, como A. flavus, A. fumigatus y A. oryzae. Debido a que estas especies son productoras de AFs, el CPA se puede llegar a detectar en los mismos alimentos, como cereales y productos derivados, e incluso en leche (88, 89). El CPA se ha detectado en queso azul, probablemente porque la especie P. camemberti se emplea en la etapa de producción para la maduración del queso (90). Fig. 15. Estructura química del CPA 1.4. EXTRACCIÓN DE MICOTOXINAS DE MATRICES ALIMENTARIAS El método de extracción permite separar el analito de la matriz alimentaria. La técnica de extracción va a depender de la naturaleza de ambos y todas tienen un objetivo común que es la obtención de un extracto libre de interferentes. Existen diversos métodos para extraer compuestos de matrices alimentarias entre los que se incluyen extracción líquido-líquido, sólido-líquido, extracción en fase sólida o SPE (Solid Phase Extraction) o microextracción en fase sólida o SPME (Solid Phase Micro Extraction). La técnica de extracción líquido-líquido es de la más empleadas cuando la matriz es líquida, permite recuperar los analitos de interés utilizando un disolvente inmiscible con la matriz. De esta forma, el analito se reparte entre las dos fases según el coeficiente de distribución. Generalmente se emplea un disolvente de naturaleza orgánica cuando la matriz es acuosa. La Introducción 19 extracción SPE es otra técnica aplicable a matrices liquidas. En este caso, la matriz se introduce en un cartucho que contiene una fase sólida que actúa a modo de adsorbente, y en ella se retiene el analito de interés. A continuación, este compuesto se recupera empleando un disolvente de elución que permite su recuperación selectiva, minimizando el arrastre de otras moléculas. Por ello, esta técnica también puede utilizarse como un método de limpieza en muestras complejas, después de una extracción sólido-líquido. Los procedimientos de SPE tradicionales utilizan como adsorbentes materiales de fase reversa como C8 o C18, intercambiadores catiónicos o aniónicos o materiales poliméricos. Además, también se emplean columnas de inmunoafinidad, que utilizan anticuerpos específicos contra el analito de interés, lo que permite una adsorción específica, aunque son menos usados debido a su alto coste (91). La extracción sólido-líquido consiste en extraer el analito de la matriz sólida con el uso de un disolvente adecuado y a través de distintos procedimientos. El disolvente tiene que poseer ciertas características que lo hagan apropiado, es decir, la solubilidad de las sustancias que se desean extraer deben ser afines al disolvente de extracción, las propiedades físicas como una baja viscosidad y tensión interfacial para poder penetrar a través de los poros de la matriz sólida deben ser adecuadas. Además, hay que tener en cuenta el coste y la toxicidad del disolvente (92). Existen procedimientos de extracción más comunes como son la maceración, en los que el analito está unido débilmente a la matriz, o el soxhlet, para extraer analitos orgánicos unidos fuertemente a la matriz empleando un disolvente orgánico volátil. Por otro lado, existen técnicas de extracción que demandan menos uso de disolvente orgánico y son más respetuosas con el medio ambiente. Por ejemplo, la SPME utiliza una fase extractante a base de fibras, hechas de sílice fundida y recubierta de un adsorbente que suele ser polimérico. En este tipo de técnicas, la ratio de extractante/muestra es mucho menor (93). Existen otros métodos de extracción y purificación como las columnas de inmunoafinidad o IAC (InmunoAffinity Column), la extracción con fluidos supercríticos o SFE (Supercritical Fluid Extraction), la extracción con microondas o MWE (Micro-Wave Assisted Extraction) o la extracción acelerada con disolventes o ASE (Accelered Solvent Extraction) (91). En los últimos años, se popularizó la extracción basada en la metodología QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Ruuged y Safe). Esta se dio a conocer en el año 2003 a través de la publicación científica de Anastassiades et. al (94) donde se mencionó por primera vez este acrónimo. El método original se desarrolló para el análisis de pesticidas en frutas y verduras. La ventaja de este método frente a los convencionales fue que se basaba en los principios de la química analítica verde. El método original se basa en dos etapas. La primera consiste en una extracción sólido-líquido seguido de una partición con sales inorgánicas. En esta primera etapa se lleva a cabo la extracción de los contaminantes con la adición de 10 mL de acetonitrilo en 10 g de muestra homogenizada. Posteriormente, se añaden las sales inorgánicas sulfato de magnesio (MgSO4) y cloruro sódico (NaCl) para inducir la separación de fases mediante agitación y centrifugado. La segunda etapa del método consiste en una extracción en fase sólida dispersiva (d-SPE) como etapa limpieza del extracto. En este paso se reducen o eliminan los compuestos secundarios presentes en la matriz que pueden interferir en el análisis. Para esta etapa se emplea MgSO4 y PSA (amina primaria/secundaria), y mediante agitación y centrifugado se consigue un sobrenadante limpio que constituye el extracto de análisis. A partir del método original se han realizado múltiples modificaciones con el fin de mejorar la eficacia de extracción en función de la matriz y los analitos objeto de estudio. Concretamente, el método AOAC 2007.01 validado por Lehotay (95) para analizar pesticidas en alimentos. Este método emplea 15 mL de acetonitrilo mezclados con una solución buffer de ácido acético y acetato de sodio para conseguir un pH de 4,5 que se añaden a 15 g de muestra hidratada y homogenizada (95). A continuación, se usan 6 g de MgSO4 y 1,5 g de acetato de sodio, y tras INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 20 aplicar agitación y centrifugación se consigue separar en dos fases. Posteriormente, 1 mL del sobrenadante obtenido se somete a una etapa de limpieza con MgSO4 y PSA. El extracto se conserva en ácido fórmico 6,7 mM para su posterior análisis por LC-MS/MS. Otra variante del método original es la que realizó Anastassiades (96) validada como el método estándar EN 15662 por el Comité Europeo de Estandarización (CEN, European Committe for standardizartion). En este caso se emplea la combinación de MgSO4:NaCl en un ratio de 4:1 y se añade citrato tribásico de sodio dihidratado y citrato de sodio dibásico sesquihidrato para facilitar la separación de la fase acuosa y de la fase orgánica. Para llevar a cabo la d-SPE se emplean los sorbentes PSA, C18 y la sal inorgánica, MgSO4 anhidro. El extracto final se conserva en ácido fórmico al 5 % en acetonitrilo. Posteriormente, se realizaron múltiples modificaciones y se extendió su uso al análisis de otros contaminantes como micotoxinas, toxinas marinas o residuos de fármacos (97). El disolvente de extracción más empleado es el acetonitrilo porque permite extraer en un único paso una amplia gama de analitos de polaridades intermedias. Si la muestra contiene un porcentaje bajo de agua es necesario humedecer la muestra mediante la adición de agua o agua acidificada, porque facilita la entrada del disolvente dentro de la matriz y permite que la unión analito-matriz se rompa con mayor facilidad. En segundo lugar, la ratio muestra/disolvente depende de la naturaleza de la matriz y del disolvente, generalmente se aplica una proporción 1/1 porque resulta adecuada para la extracción. Las sales empleadas para inducir la separación de fases suelen ser MgSO4 y NaCl en un ratio de MgSO4:NaCl 1:4. Estas sales favorecen la separación de la fase orgánica y de la fase acuosa mejorando la recuperación del analito en la fase orgánica. Además, la combinación de las dos permite controlar la polaridad del medio y mejorar la forma de los picos cromatográficos (98). 1.5. DETECCIÓN DE MICOTOXINAS La legislación europea establece métodos de referencia para el control oficial de ciertos contaminantes en alimentos, como las toxinas marinas. Sin embargo, en el caso de las micotoxinas, no se han establecido métodos específicos para su detección; en su lugar se permite el uso de métodos validados siempre que cumplan los criterios de funcionamiento establecidos en el Reglamento de Ejecución (UE) 2023/2782 (99). Por ello, este campo se presta a desarrollar nuevos métodos que permitan la determinación de micotoxinas en alimentos y piensos. En primer lugar, existen los métodos de cribado que proporcionan información sobre la presencia o ausencia de los contaminantes en las muestras de estudio. Se emplean con la finalidad de analizar un gran número de muestras en poco tiempo. En general, solo permite la detección cualitativa de la/s micotoxina/s en la muestra problema y sirven como sistemas de alerta (100). Los métodos de cribado engloban varios ensayos o técnicas que poseen ciertas ventajas, entre ellas, la rapidez de respuesta y la sencillez en el tratamiento de muestra. El ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas, abreviado como ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), consiste en un método de detección basado en el enlace de la toxina a un anticuerpo específico. Se ofrece en formato kit y se puede aplicar para realizar un cribado de varias micotoxinas simultáneamente. Las ventajas que ofrece esta técnica son que se requiere poco volumen de muestra y su preparación es sencilla (101). Sobre la misma base se han desarrollado las pruebas de flujo lateral. El método más empleado para la determinación de micotoxinas es el competitivo indirecto, donde el anticuerpo está marcado y el antígeno (toxina) está fijado a la membrana. De esta manera, el anticuerpo es suspendido en una muestra líquida que se deja fluir a través de la membrana. En ausencia de Introducción 21 micotoxinas en la muestra, los anticuerpos se unen al antígeno, dando lugar a una línea T (línea test) y a la línea C (línea control). En presencia de micotoxinas por encima del límite de detección, sólo aparece la línea C, ya que los anticuerpos específicos están saturados por la unión con las micotoxinas presentes en la muestra, lo que impide la unión con el antígeno fijado en la membrana (102). Del mismo modo que en el ELISA, existen múltiples test disponibles comercialmente (102, 103). Otros métodos propuestos como técnicas de cribado incluyen los inmunosensores, el inmunoensayo por polarización de fluorescencia, los aptasensores o biochip (104-106). Por otra parte, las técnicas analíticas de confirmación emplean una etapa de separación de los componentes de la muestra mediante técnicas como la cromatografía líquida (LC) seguida de técnicas de detección como fluorescencia (FLD), UV o espectrometría de masas (MS) (107, 108). La cromatografía de gases rara vez se emplea en la determinación de micotoxinas, debido a que son compuestos polares y no volátiles. En el caso de utilizarse, es necesario una etapa de derivatización para convertirlas en análogos o derivados volátiles (109). Un cromatógrafo de líquidos incluye los siguientes elementos: reservorios o botellas para las fases móviles, sistema de bombeo, un inyector o dispositivo para introducir la muestra y una columna cromatográfica, normalmente dentro de un horno termostatizado. La columna está formada por un material granular formado por pequeñas partículas sólidas muy compactas denominado fase estacionaria. La muestra se inyecta en el sistema y es arrastrada por la fase móvil a través de la columna a una presión elevada, por ello se habla de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). Cuando se emplean columnas empaquetadas con partículas de un tamaño inferior a 2 μm, la técnica se denomina cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC), este tipo de columnas aumentan el rendimiento de separación y permiten un análisis más rápido en comparación con las columnas de HPLC, con tamaños de partículas más grandes. En cuanto a fases móviles se refiere, hay dos formas de trabajar: elución isocrática, la composición de la fase móvil es constante, y elución en gradiente, en la que la composición de la fase móvil varía con el tiempo (107). La cromatografía puede clasificarse según la polaridad de la fase estacionaria en dos tipos principales: cromatografía de fase normal y cromatografía de fase reversa. En la cromatografía de fase normal, la fase estacionaria es polar y la fase móvil es no polar. Por otro lado, en la cromatografía de fase reversa, la fase estacionaria es no polar y la fase móvil es polar. En HPLC o UHPLC, en el caso de columnas en fase normal, se emplean rellenos polares como la sílice, amida, ciano o resinas de cromatografía líquida de interacciones hidrofílicas (HILIC) para separar compuestos polares. En cuanto a columnas en fase reversa, se trabaja con resinas de sílice unidas a hidrocarburos alifáticos como C6, C8 o C18, o hidrocarburos aromáticos, como el fenil. Suelen emplearse para la separación de analitos polares, no polares, iónicos o ionizables. En general, suele emplearse la cromatografía de fase reversa para la separación de micotoxinas. El mecanismo general se basa en interacciones hidrofóbicas entre el analito y la fase estacionaria, en concreto con los hidrocarburos enlazados a la resina. El tiempo de retención es mayor para los analitos que tienen una naturaleza no polar, debido a que se quedan retenidos en la fase estacionaria. Por el contrario, los analitos polares eluyen más rápido. Este parámetro va a variar dependiendo de la interacción entre los analitos, la fase estacionaria y la fase móvil. Factores como el pH, el tipo de columna, la temperatura y la composición de la fase móvil van a influir en el tiempo de retención (110). Las fases móviles más utilizadas en este tipo de cromatografía son agua, metanol y acetonitrilo. En ocasiones, se añaden soluciones tampón, ácidos o bases. Es conveniente que el pH de la fase móvil sea estable y las soluciones buffer o tampón sean adecuadas para ello, las más empleadas son el tampón de fosfato, de acetato, de trietilamina o dietilamina. A medida INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 22 que la concentración de tampón en la fase móvil aumenta, el tiempo de retención de los compuestos polares es menor. Por otro lado, el pH de la fase móvil juega un papel importante en la sensibilidad y la selectividad de los analitos (111). Una vez se consigue la separación de los analitos de interés del resto de componentes de la muestra, deben ser detectados en base a sus propiedades fisicoquímicas. Los detectores principales que se emplean en el análisis de micotoxinas son la FLD, la UV, la matriz de fotodiodos (PDA) y la espectrometría de masas (MS) y MS en tándem (MS/MS). Debido a la presencia de cromóforos en las micotoxinas, es posible su detección por FLD o UV. El DON, T-2 y HT-2 se detectan frecuentemente por UV, mientras que las AFs o CTN poseen propiedades fluorescentes y pueden ser medidas directamente por LC-FLD. Sin embargo, otras toxinas como las FBs carecen de cromóforos y por lo tanto se necesita una etapa de derivatización, bien sea preo postcolumna (112). El detector más empleado en la actualidad es el espectrómetro de masas. Este detector emplea la relación masa-carga (m/z) de iones positivos o negativos para la identificación de los compuestos. Por ello, las moléculas presentes en la muestra deben ser ionizadas empleando distintos sistemas entre los que destaca la ionización por electrospray (ESI) y la ionización química a presión atmosférica (APCI). En el caso de ESI, la muestra en solución pasa a través de un capilar al que se aplica un potencial eléctrico, normalmente de 2 a 6 kV, entre el capilar de entrada de la muestra y el contraelectrodo. A la salida del capilar, la muestra sale dispersa en forma de aerosol formado por pequeñas gotas cargadas que se evaporaran debido a un fenómeno de desorción del campo eléctrico o por evaporación del disolvente. A medida que las gotas se evaporan, las moléculas de la muestra se aproximan y se repelen, hasta que llega un momento en el que son atraídas hacia el contraelectrodo de entrada del espectrómetro por capilaridad dieléctrica. Una vez ionizada la muestra, los iones pasan a una región de alto vacío y son guiados al analizador de masas que se encarga de separarlos en función de su m/z. Existen varios tipos de analizadores como el tiempo de vuelo (TOF), trampa de iones (IT), resonancia ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICR) o el cuadrupolo (Q) (108) . En la actualidad, los equipos más empleados en el análisis de las micotoxinas son instrumentos híbridos en los que se combinan dos analizadores. Por ejemplo, los equipos de triple cuadrupolo (QqQ) combinan dos cuadrupolos, esto les permite operar en diferentes modos de trabajo incluyendo scan de iones producto (product ion scan), scan de iones precursores (parent ion scan), scan de pérdida neutra (constant neutral Ioss scan), scan de iones seleccionados (SIM, selected ion monitoring) o monitorizando una reacción múltiple (MRM, multiple reaction monitoring). De ellos, el MRM es el modo de trabajo que permite la detección simultánea de múltiples compuestos y por ello es el más empleado en la determinación de micotoxinas (113). En el primer cuadrupolo se lleva a cabo una preselección, diferenciando los iones del analito o de los analitos de interés de otros compuestos. Luego, los iones seleccionados se dirigen hacia la celda de colisión, donde los iones precursores se disocian y forman iones producto, los cuales son monitorizados en el tercer cuadrupolo. De este modo, se obtienen al menos dos transiciones por cada analito: una transición para identificación y otra para cuantificación. Estos analizadores permiten una alta selectividad y sensibilidad gracias a una ionización eficiente y la detección específica de iones por los cuadrupolos. Además, son capaces de minimizar las interferencias y mejorar la relación señal/ruido (114). Por otro lado, los instrumentos TOF ofrecen exactitud de masa a nivel sub-ppm y permiten la medición en un amplio rango de masas. A diferencia del analizador QqQ, los iones se van a separar en función de la velocidad alcanzada en el tubo de vuelo, la cual está inversamente relacionada con la raíz cuadrada de m/z. Los analizadores TOF pueden acoplarse a otros Introducción 23 analizadores como la IT. El sistema IT-TOF permite la elucidación tentativa de moléculas de interés aplicando el proceso MSn. Su funcionamiento consiste en que los iones generados en la fuente se transportan a través de una guía de iones (DQarray) y se acumulan en un octopolo durante un tiempo de acumulación definido por el usuario. Desde allí, los iones se impulsan hacia la IT, donde pueden acumularse, permitiendo varias etapas de MS/MS. El ión precursor puede disociarse mediante inducción por colisión con moléculas neutras como el argón y luego ser separado según su tiempo de vuelo (115). 1.6. VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO La validación de un método se define, según la ISO/IEC 17025, como la “confirmación, a través del examen y aportación de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico previsto”. La validación de un método analítico es la única forma de demostrar que el método empleado es adecuado para el fin previsto, obteniendo un resultado fiable. Según la Guía Eurachem sobre la Adecuación al uso de métodos analíticos para validar un método es necesario evaluar las características de desempeño, así como valorar la idoneidad del método (116). Las características de desempeño son las siguientes: selectividad, límite de detección (LOD) y cuantificación (LOQ), rango o intervalo de trabajo, veracidad, precisión y robustez. Selectividad: Se relaciona con la capacidad del método para identificar y/o cuantificar los analitos en presencia de compuestos secundarios, en una muestra de la matriz en las condiciones establecidas por el método. LOD: Se define como la mínima cantidad de analito en una muestra que puede ser detectada. Existen varias formas de calcularlo basándose en la señal/ruido (S/N), o en la desviación estándar (SD) de la respuesta analítica del análisis de blancos y la pendiente (m) de la curva de calibrado LOQ: Se define como la mínima cantidad de analito en una muestra que puede ser determinada con precisión y veracidad. Existen varias opciones para calcular este parámetro, entre ellas, se suele aplicar una de estas dos ecuaciones: LOQ = 10 m LOQ = 3.3 · LOD Intervalo de trabajo: La capacidad de un método analítico para generar resultados directamente proporcionales a la concentración del analito o valor del parámetro de la muestra, dentro de ese rango de trabajo. Veracidad o exactitud: Grado de concordancia entre el valor medio obtenido de una serie de resultados y un valor de referencia aceptado. Precisión: Es el grado de concordancia entre los resultados independientes de una medición obtenidos en condiciones de repetibilidad o de reproducibilidad. Repetibilidad: Se refiere a la variabilidad de los resultados cuando una medición se repite varias veces en condiciones idénticas, utilizando el mismo equipo y operario. Reproducibilidad: Es la variabilidad observada cuando las mediciones se realizan en diferentes laboratorios, con equipos distintos y por distintos operarios. Precisión intermedia: Es la medida de precisión cuando se realizan mediciones en el mismo laboratorio, pero bajo condiciones variables, como diferentes días, diferentes equipos, o diferentes operadores. INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 24 Robustez: Susceptibilidad de un método analítico a los cambios de las condiciones experimentales. La UE establece procedimientos a seguir para la validación de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados a través de la Decisión de la Comisión 2002/657/EC, cuando no existen regulaciones específicas para resolver un caso concreto. No obstante, en el año 2006 se publica el Reglamento (CE) Nº 401/2006, que se establece los métodos de muestreo y análisis para el control oficial del contenido de micotoxinas en productos alimenticios. Este reglamento estableció los requisitos generales y específicos que debían cumplir los métodos empleados para el análisis de las micotoxinas. Los requisitos generales hacen referencia a los parámetros que deben ser evaluados durante la validación: exactitud, aplicabilidad, LOD, LOQ, precisión, repetibilidad, reproducibilidad, recuperación (RE), selectividad, sensibilidad, linealidad e incertidumbre de medición. Los requisitos específicos son los criterios de funcionamiento que tienen que cumplir los métodos para el análisis de las micotoxinas en productos alimenticios. Estos criterios incluyen el intervalo de concentración, la desviación estándar relativa (RSDR y RSDr) y la RE para cada micotoxina (117). El Reglamento (CE) Nº 401/2006 ha sido recientemente derogado por el Reglamento de Ejecución (UE) 2023/2782, que establece nuevos requisitos específicos para el análisis de micotoxinas en productos alimenticios. Este nuevo reglamento se centra en criterios actualizados, basados en la RE, precisión y LOQ (99). Debido a que los cambios introducidos son sustanciales, se establece un periodo de adaptación hasta el año 2029, durante el cual los requisitos específicos del Reglamento (CE) 401/2006 seguirán aplicándose a los métodos que hayan sido validados antes de la entrada en vigor del nuevo Reglamento (99). En la Tabla 2 se muestran las principales características y requisitos de funcionamiento de los dos reglamentos. En concreto, se especifican para cada nivel de concentración (µg/kg) la RSDr %, la RSDR % y la RE. Además, en el nuevo reglamento se incluye un nuevo parámetro adicional: el LOQ. Por lo tanto, la legislación comunitaria no establece ningún método de análisis específico, pero sí exige que los métodos empleados sean validados de acuerdo con los criterios generales y específicos establecidos en el Reglamento (UE) 2023/2782. De esta manera, la validación de un método analítico garantiza su fiabilidad (116). MATERIAL Y MÉTODOS 33 3. MATERIAL Y MÉTODOS Esta sección contiene los materiales, reactivos, muestras comerciales, métodos analíticos y preparación de las muestras que se han empleado o llevado a cabo durante la presente tesis doctoral. 3.1. REACTIVOS Y MATERIALES Metanol, acetonitrilo, ácido acético glacial, sulfato de magnesio anhidro y cloruro de sodio fueron adquiridos de Panreac Química S.A. (Barcelona, España). El ácido fórmico fue suministrado por Merck (Madrid, España), el formiato de amonio y el acetato de amonio por Fluka (Buchs, Suiza). La C18 PolygoprepTM 60-50 fue adquirida a través de Macherey-Nagel (Düren, Alemania). Los filtros centrífugos de membrana ultrafree-MC durapore de tamaño de poro de 0,22 µm fueron suministrados por Millipore (Billerica, EEUU). El agua se obtuvo del sistema Milli-Q Plus de Millipore (Millipore, EEUU). Los estándares analíticos se adquirieron a través de las siguientes casas comerciales: • Sigma (Madrid, España): AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, ENNA, ENNB, ENNA1, ENNB1, GLIO, ROQC, ZEA • Romer Labs (Tulln, Austria): 3-AcDON, 15-AcDON, AFM1, AOH, AME, CPA, CTN, DAS, FB1, FB2, h-FB1, HT-2, MPA, NEO, STC, T-2, T-2 triol y ZOL • Santa Cruz biotechnology (Santa Cruz, CA): CTA • CIFGA S.A. (Lugo, España): OTA • ENZO (Barcelona, España): BEA El estándar analítico de la adenosina se adquirió en Merck (Madrid, España). Quesos: Se adquirieron en supermercados locales. Se evaluaron 38 muestras de queso de distintos lotes, en concreto, 12 muestras de queso emmental, 10 de queso azul, 9 de queso brie y 7 de queso camembert. Bebidas vegetales: Se adquirieron en supermercados locales. Se evaluaron 16 muestras de bebida de avena (con porcentajes de avena entre 11 % y 15 %), 6 muestras de bebida de arroz (entre 15% y 17% de arroz), 7 muestras de bebida de almendra (entre 2 % y 14 % de almendra) y 9 muestras de bebida de soja (8 % y 15 % de soja). Las muestras contienen ingredientes secundarios como estabilizadores, aromas, sal, azúcares y vitaminas. Yogures: Se adquirieron en supermercados locales. Se evaluaron 27 muestras de yogur natural y 16 muestras de yogur de avena. Muestras de TMR: Se evaluaron muestras procedentes de granjas situadas en Vila do Conde (Norte de Portugal). En el año 2019 se colectaron 33 muestras durante el otoño. En 2020, se colectaron 3 muestras en otoño y 15 en primavera. En 2022, se colectaron 2 muestras en otoño, 5 en invierno, y 4 en primavera. Las cepas de Gnomoniopsis smithogilvyi (Gnomoniaceae, Diaporthales) fueron aisladas de castañas procedentes de bosques afectados por un brote de este hongo en el sur de Galicia. De todos los aislados, 5 se seleccionaron para realizar el estudio de la producción de metabolitos. INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 34 3.2. INSTRUMENTACIÓN 3.2.1 Análisis UHPLC-MS/MS Para el análisis dirigido se ha empleado un sistema UHPLC Agilent 1290 Infinity acoplado a un espectrómetro de masas triple cuadrupolo (Agilent 6460) equipado con una fuente de ionización electrospray (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany). La adquisición de datos se ha llevado a cabo con el software Agilent MassHunter LCMS Acquisition Console y el procesado de datos con el software QQQ Quantitative Analysis. Para separar los analitos, se ha empleado una columna cromatográfica Waters Acquity UPLC HSS T3 100 mm x 2.1 mm, 1.8 µm. Se ha empleado a una temperatura de 40 ºC. Las fases móviles y el gradiente de elución se optimizaron en función de las necesidades de cada método, siendo las más habituales: Fase móvil A: agua con ácido fórmico (0,1 %) y formiato de amonio (5 mM) o agua con ácido fórmico (1 %) y formiato de amonio (5mM). Fase móvil B: metanol o metanol/agua/ácido fórmico 97/2/1 (v/v/v). El flujo de las fases móviles fue de 0,3 mL/min y se aplicó una elución en gradiente de 13 minutos de duración según la Tabla 3. Tiempo (min) % B 0,0 0 0,5 14 2,0 14 3,0 60 3,5 60 8,0 100 10,0 100 10,5 0 13,0 0 Tabla 3. Gradiente empleado para el análisis Los parámetros del espectrómetro de masas fueron los siguientes: temperatura del gas de nebulización (N2) 400 ºC; flujo del gas de nebulización, 12 L/min; temperatura del gas de secado, 350 ºC; flujo del gas de secado, 8 L/min; nebulizador, 45 psi; voltaje de capilaridad, 4000 V; voltaje de la boquilla, 0 V. El análisis fue llevado a cabo en modo ESI negativo y positivo a través de un método dinámico de MRM, es decir, se siguieron dos transiciones m/z para cada micotoxina como se muestran en la Tabla 4. Material y métodos 35 3.2.2 Análisis UHPLC-MS-IT-TOF Para el análisis no dirigido se ha empleado un sistema Shimadzu (Kyoto, Japón). El sistema UHPLC consiste en dos bombas (LC-30AD), un desgasificador (DGU-20), un autoinyector (SIL-10AC) con un rack de muestras refrigerado y un horno de columna (CTO-10AS). La columna empleada fue Waters ACQUITY HSS T3, 100 mm x 2,1 mm, 1,8 µm (Waters, Milford, MA), que se mantuvo a una temperatura de 40 ºC. Las fases móviles empleadas consistieron en (A) agua con 0,1 % de ácido fórmico y (B) metanol. El flujo de la fase móvil fue de 0,3 mL/min y se empleó una elución en gradiente que se detalla a continuación: el eluyente B se mantuvo en 0 % durante 0,5 min, a continuación, se incrementó hasta 50 % de B en 0,5 min y se mantuvo durante un tiempo de 2,5 min. Posteriormente, el gradiente se incrementó hasta 100 % de B en 3 min y se mantuvo durante 3,5 minutos. Finalmente, el gradiente descendió hasta el 0 % B en 0,5 min y las condiciones iniciales se mantuvieron durante 3,5 min para re-equilibrar la columna cromatográfica. El volumen de muestra inyectado en el UHPLC fueron 5 µL. Micotoxina Precursor m/z y modo Producto m/z (CE) Polaridad FV CAV Tiempo de retención (min) Identificación Cuantificación AFB1 313 [M+H]+ 285 (24) 241 (44) Positiva 144 2 6,54 AFB2 315 [M+H]+ 287 (28) 259 (32) Positiva 147 1 6,25 AFG1 329 [M+H]+ 243 (28) 200 (48) Positiva 132 2 6,15 AFG2 331 [M+H]+ 245 (32) 217 (40) Positiva 146 2 5,95 AFM1 329 [M+H]+ 273 (25) 259 (29) Positiva 120 2 6,00 AOH 257 [M+H]- 213 (20) 215 (24) Negativa 155 2 7,34 AME 271 [M+H]- 256 (20) 228 (28) Negativa 125 6 8,40 BEA 801 [M+NH4]+ 134 (70) 784 (14) Positiva 90 2 10,15 CPA 335 [M+H]- 154 (28) 140 (24) Negativa 255 2 8,80 CTA 394 [M+H]+ 379 (24) 350 (32) Positiva 83 2 7,35 CTN 251 [M+H]+ 205 (20) 233 (9) Positiva 110 2 6,70 DAS 384 [M+NH4]+ 307 (4) 105 (36) Positiva 90 2 6,65 DON 297 [M+H]+ 249 (8) 203 (12) Positiva 74 2 5,00 DOM-1 281 [M+H]+ 109 (16) 79 (48) Positiva 90 6 5,50 15 Ac-DON 339 [M+H]+ 261 (8) 137 (8) Positiva 75 2 5,72 3 Ac-DON 339 [M+H]+ 261 (8) 213 (8) Positiva 75 2 5,72 ENNA 699 [M+NH4]+ 100 (60) 228 (28) Positiva 170 2 10,50 ENNA1 685 [M+NH4]+ 210 (28) 668 (12) Positiva 145 2 10,35 ENNB 657 [M+NH4]+ 196 (28) 640 (12) Positiva 90 2 10,10 ENNB1 671 [M+NH4]+ 196 (30) 654 (14) Positiva 130 2 10,25 FB1 722 [M+H]+ 352 (40) 334 (40) Positiva 170 1 7,20 FB2 706 [M+H]+ 336 (40) 318 (48) Positiva 165 1 8,10 FA 180 [M+H]+ 162 (8) 134 (16) Positiva 88 2 6,10 FX 355 [M+H]+ 175 (8) 71 (20) Positiva 90 4 5,40 GLIO 327 [M+H]+ 263 (10) 245 (14) Positiva 86 2 6,50 h-FB1 406 [M+H]+ 388 (9) 370 (17) Positiva 105 2 7,05 HT-2 447 [M+Na]+ 345 (16) 285 (20) Positiva 108 2 7,20 MPA 321 [M+H]+ 207 (16) 303 (0) Positiva 80 2 7,60 NEO 400 [M+H]+ 215 (16) 169 (28) Positiva 74 2 5,45 OTA 404 [M+H]+ 239 (22) 102 (75) Positiva 84 2 8,15 ROQC 390 [M+H]+ 193 (40) 322 (16) Positiva 150 2 7,15 STC 325 [M+H]+ 281 (40) 310 (24) Positiva 130 1 8,40 T-2 TOXIN 484 [M+NH4]+ 215 (16) 197 (16) Positiva 84 2 7,80 T-2 TRIOL 405 [M+Na]+ 303 (16) 125 (12) Positiva 110 2 6,70 ZEN 317 [M+H]- 273 (20) 131 (28) Negativa 123 2 8,25 ZOL 319 [M+H]- 275 (24) 107 (28) Negativa 120 2 8,10 Tabla 4. Parámetros de detección UHPLC-MS/MS. a ion precursor (m/z) y modo de ionización, ion producto (m/z) empleado para la identificación, ion producto (m/z) empleado para la cuantificación, energía de colisión (CE), voltaje de fragmentación (FV), voltaje de la celda de aceleración (CAV) y tiempo de retención (min) de cada micotoxina. INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 36 El espectrómetro IT-TOF de Shimadzu (Kyoto, Japón), equipado con una fuente ESI, mantuvo las siguientes condiciones de trabajo: voltaje del detector, 1,65 kV; temperatura del bloque térmico, 200 ºC; flujo del gas de nebulización, 1,5 L/min; presión del gas de secado, 105 kPa. La presión en la trampa iónica fue de 1,8 x 10-2 Pa, mientras que la región del TOF estuvo en 1,4 x 10-4 Pa. El método MS operó en modo positivo y negativo full scan MS entre un rango de masas de 150 y 1000 Dalton (Da). El tiempo de acumulación de iones se configuró en 20 ms, con un tiempo de evento de 300 ms con tres repeticiones. Para los experimentos de disociación inducida por colisión (CID, del inglés collision-induced-dissociation), los iones se aislaron en MS1 con un rango de tolerancia de 1 Da. El gas de colisión empleado fue el argón, con un parámetro de energía de colisión configurado al 50 % y el parámetro de frecuencia a 45 kHz. A continuación, los rangos de masas del método en MS2 se ajustaron para cada metabolito, donde el tiempo de acumulación de iones se estableció en 30 ms. 3.3. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA 3.3.1. Extracción basada en QuEChERS El método de extracción se basó en la metodología QuEChERS, los protocolos concretos fueron optimizados para cada tipo de matriz analizada. De manera general, se detalla a continuación el procedimiento a seguir: se pesan la muestra homogenizada en un tubo Falcon y se añade un volumen de disolución acuosa acidificada. Durante 5 minutos se homogeniza por agitación mediante vórtex. A continuación, se añade el volumen correspondiente de acetonitrilo y se vuelve a homogenizar durante 5 minutos. Más tarde, se añaden las sales MgSO4 y NaCl y se agitan durante 30 s y se centrifuga la mezcla a 3134 g, durante 10 min. Como se muestra en la Fig. 16, este paso favorece la separación de la fase acuosa (parte inferior) y de la fase orgánica (parte superior). Después de esta primera etapa, se lleva a cabo una etapa de limpieza a través de una extracción de dispersión en fase sólida (d-SPE). A un volumen concreto de extracto orgánico se le añade una cantidad de MgSO4 anhidro y, en menor proporción, C18. Esta mezcla se agita durante 30 s y se centrifuga (3134 g, 10 min). El sobrenadante se trasvasa a un vial silanizado y se evapora hasta sequedad. Finalmente, se redisuelve en un volumen de una mezcla de acetonitrilo/agua/ácido acético (49/50/1 v/v/v), se agita durante 30 s y se sonica. El extracto final se filtra a través de 0,22 µm (16000 g, 5 min) y se analiza por UHPLC-MS/MS. En algunos casos es necesario omitir la etapa de limpieza, en estes casos el extracto orgánico se evapora hasta sequedad y se redisuelve en la mezcla de disolventes según lo mencionado anteriormente. Material y métodos 37 Fig. 16. Esquema del método de extracción basado en la metodología QuEChERS 3.3.2. Extracción de hongos Gnomoniopsis smithogilvyi (Gnomoniaceae, Diaporthales) Para establecer el perfil de metabolitos producido por la especie G. smithogilvyi, se seleccionaron 5 aislados cultivados en PDA (del inglés, potato dextrose agar) a 25 ºC en oscuridad durante una semana y paralelamente se prepararon controles, es decir, PDA sin hongo. Una vez transcurridos los siete días, de cada cultivo se cortaron 6 discos de agar de 6 mm de diámetro y también de los controles. A continuación, se adicionaron 0,5 mL de una mezcla de acetonitrilo/agua/ácido acético (49/50/1 v/v/v) a los discos de agar y se agitaron durante 3 min. El extracto resultante se filtró a través de 0,22 µm y se conservó a -20 ºC. Fig. 17. Extracción de cultivo de G. smithogilvyi en PDA para su posterior análisis UHPLC-MS-IT-TOF 3.3.3. Caracterización del perfil metabólico de G. smithogilvyi En primer lugar, se emplearon estándares analíticos de micotoxinas para verificar el rendimiento del método. En segundo lugar, se analizaron los extractos con el objetivo de realizar un cribado para detectar posibles metabolitos. Los iones fueron seleccionados para CID. En Muestra homogeneizada Adicionar agua acidificada Adicionar acetonitrilo Adición de sales MgSO4 NaCl Fase orgánica Fase acuosa Evaporar hasta sequedad Reconstituir en acetonitrilo/agua/ácido acético ETAPA DE LIMPIEZA C18 MgSO4 ANÁLISIS UHPLCMS/MS Filtrar (ø = 0,22 µm) Fase orgánica +acetonitrilo/agua/ácido acético Cultivo G. smithogilvyi en PDA Discos 6 mm diámetro Extracto resultante. Conservar a -20ºC UHPLC-MS-IT-TOF INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 38 función de la masa exacta del ion precursor y del ion producto, se predijo la fórmula molecular del compuesto mediante un software predictor ad hoc (Formula Predictor Software, Shimadzu Corp., Kyoto, Japón). Se emplearon varios filtros para incrementar la precisión de la predicción, aplicando la regla del nitrógeno y la regla del grado de insaturación. RESULTADOS Y PUBLICACIONES Resultados y publicaciones 47 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 48 Resultados y publicaciones 49 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 50 Resultados y publicaciones 51 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 52 Resultados y publicaciones 53 2. First description of adenosine production by Gnomoniopsis smithogilvyi, causal agent of chesnut brown rot Resumen: Gnomoniopsis smithogilvyi (Gnomoniaceae, Diaporthales) es el principal agente que causa la pudrición parda de la castaña en todo el mundo. La pudrición de los frutos provoca alteraciones en las cualidades organolépticas y una disminución en la producción de frutos, lo que resulta en pérdidas económicas significativas. En 2021, hubo un importante brote de pudrición de castañas en el sur de Galicia (noroeste de España). Se estudió el perfil de metabolitos secundarios de G. smithogilvyi, especialmente para determinar su capacidad de producir micotoxinas, como ocurre con otros hongos causantes de pudriciones, debido a las posibles consecuencias sobre la seguridad del consumo de castañas. Los metabolitos secundarios producidos por aislados de G. smithogilvyi que crecieron en medio de agar dextrosa de patata (PDA) fueron identificados utilizando cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución. Se identificaron tres metabolitos con propiedades farmacológicas y fito-toxicológicas interesantes basadas en su masa exacta y patrones de fragmentación, a saber, adenosina, oxasetina y fitosfingosina. Se evaluó la capacidad de G. smithogilvyi para producir adenosina en cultivos de PDA, encontrándose concentraciones que oscilan entre 176 y 834 µg/kg. De manera similar, se descartó la producción de micotoxinas, lo que indica que el consumo de castañas con lesiones necróticas no representa un riesgo para la salud del consumidor en términos de micotoxinas. INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 54 Información revista: First description of adenosine production by Gnomoniopsis smithogilvyi, causal agent of chestnut brown rot Jesús M. González-Jartín 1, Olga Aguín 2, Inés Rodríguez-Cañás3, Rebeca Alvariño 4, María J. Sainz 5*, Mercedes R. Vieytes 4, Cristina Rial 2, Pilar Piñón 2, Carmen Salinero 2, Amparo Alfonso 3*, Luis M. Botana 3 1Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia, IDIS, Universidade de Santiago de Compostela, 15782, Santiago de Compostela, Spain. 2 Estación Fitopatolóxica Areeiro, Deputación de Pontevedra, 36153, Pontevedra, Spain. 3Departamento de Farmacología, Facultad de Veterinaria, IDIS, Universidade de Santiago de Compostela, 27002, Lugo, Spain. 4Departamento de Fisiología, Facultad de Veterinaria, IDIS, Universidade de Santiago de Compostela, 27002, Lugo, Spain. 5Departamento de Producción Vegetal y Proyectos de Ingeniería, Facultad de Veterinaria, Universidade de Santiago de Compostela, 27002, Lugo, Spain. Revista: World Journal of Microbiology and Biotechnology Año de la publicación: 2024 DOI: doi.org/10.1007/s11274-024-03958-4 ISSN/eISSN: 0959-3993 / 1573-0972 Editorial: Springer, Van Godewijckstraat 30, Dordrecht, Netherlands, 3311 GZ Índices de calidad: Factor de impacto (2023): 4,0 Factor de impacto de 5 años (2023): 2,477 Categoría: Biotechnology & Applied Microbiology Contribución del doctorando: Investigación Autorización revista: Resultados y publicaciones 55 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 56 Resultados y publicaciones 63 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 64 Resultados y publicaciones 65 SECCIÓN 2: MICOTOXINAS EN PRODUCTOS ELABORADOS 3. Detection of mycotoxins in cheese using an optimized analytical method based on a QuEChERS extraction and UHPLC-MS/MS quantification Resumen: Las micotoxinas pueden producir efectos tóxicos en los seres humanos; por lo tanto, es de gran importancia determinar su presencia en los productos alimenticios. Este trabajo presenta un método confiable para la cuantificación de 32 micotoxinas en queso. El procedimiento de análisis se optimizó basándose en un proceso de extracción QuEChERS y la detección por cromatografía líquida de ultra alta eficiencia acoplada a espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS). El método de análisis se validó para cuatro variedades de queso (emmental, azul, brie y camembert) en términos de linealidad, sensibilidad, efecto matriz, exactitud y precisión. Se lograron valores satisfactorios de precisión y exactitud, con recuperaciones superiores al 70 % para la mayoría de las micotoxinas. El método desarrollado se aplicó al análisis de 38 muestras comerciales de queso. Se encontró una alta presencia de beauvericina y eniatinas, que varió del 31 % para eniatina A al 100 % para eniatina B. La ocratoxina A se detectó en tres muestras en concentraciones que pueden representar un riesgo para la salud humana. INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 66 Información revista: Detection of mycotoxins in cheese using an optimized analytical method based on a QuEChERS extraction and UHPLC-MS/MS quantification Inés Rodríguez-Cañás a, Jesús M. González-Jartín a*, Rebeca Alvariño a, Amparo Alfonso a*, Mercedes R. Vieytes b, Luis M. Botana a. a Departamento de Farmacología, Facultad de Veterinaria, Universidade de Santiago de Compostela, 27002, Lugo, Spain. b Departamento de Fisiología, Facultad de Veterinaria, Universidade de Santiago de Compostela, 27002, Lugo, Spain. Revista: Food Chemistry Año de la publicación: 2023 DOI: 10.1016/j.foodchem.2022.135182 ISSN/eISSN: 0308-8146/1873-7072 Editorial: ELSEVIER SCI LTD, 125 London Wall, London, England, EC2Y 5AS Índices de calidad: Factor de impacto (2022): 8,8 Factor de impacto de 5 años (2022): 8,6 Categoría: “Chemistry, Food Science & Technology; Nutrition & Dietetics” Q1 (5/73, 9/142, 5/88) Contribución del doctorando: Investigación, redacción borrador original Autorización revista: Resultados y publicaciones 67 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 68 Resultados y publicaciones 69 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 70 Resultados y publicaciones 71 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 72 Resultados y publicaciones 79 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 80 Resultados y publicaciones 81 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 82 Resultados y publicaciones 83 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 84 Resultados y publicaciones 85 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 86 Resultados y publicaciones 87 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 88 Resultados y publicaciones 95 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 96 Resultados y publicaciones 97 INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 98 Resultados y publicaciones 99 DISCUSIÓN 103 5. DISCUSIÓN Las micotoxinas son compuestos tóxicos producidos por la actividad metabólica de ciertos hongos filamentosos. Estos contaminantes representan un riesgo para la salud humana y animal, ya sea por ingestión o por inhalación. Los hongos colonizan alimentos y piensos, provocándoles un deterioro que, en algunos casos, no es perceptible a simple vista. Los niveles máximos de contaminantes en alimentos destinados al consumo humano, así como las materias primas, estuvieron regulados inicialmente por el Reglamento (CE) Nº 1881/2006, que ha sido recientemente derogado por el Reglamento (UE) 2023/915 el cual establece niveles máximos permitidos, entre otros contaminantes, de las siguientes micotoxinas: AFs, OTA, PAT, DON, ZEA, FB1, FB2, CTN, HT-2 y T-2, así como también para esclerocios y alcaloides de cornezuelo (14). En el caso de la alimentación animal, el Reglamento de la Comisión (UE) Nº 574/2011 que modifica el Anexo I de la Directiva 2002/32/CE sobre sustancias indeseables en alimentación animal establece, entre otros contaminantes, el contenido máximo permitido de AFB1 y cornezuelo de centeno en materias primas y en piensos para animales destinados al consumo humano. Además, la Recomendación 2006/576/CE de la Comisión establece valores orientativos en materias primas de piensos y piensos compuestos para las siguientes micotoxinas: DON, ZEA, OTA, FB1, FB2, HT-2 y T-2 (16, 118). La toxicidad e incidencia de las toxinas reguladas está bien establecida, sin embargo, se conocen más de 500 metabolitos producidos por hongos. De estos, se consideran micotoxinas emergentes aquellas que no están reguladas, pero han demostrado algún tipo de toxicidad in vitro. Además, todos estos compuestos pueden sufrir modificaciones en su estructura como resultado de la acción metabólica de animales, plantas u hongos. La detección de micotoxinas es compleja debido al gran número de matrices que pueden estar afectadas, el elevado número de compuestos y su variabilidad en cuanto a propiedades químicas. Por lo tanto, surge la necesidad de desarrollar métodos que permitan la detección y cuantificación fiable de estos contaminantes en alimentos y piensos (25, 119). En la presente tesis doctoral, se han optimizado métodos de extracción y detección de micotoxinas con el fin de disponer de nuevas herramientas que permitan analizar múltiples matrices a lo largo de toda la cadena alimentaria, y dentro de esta, en el sector lácteo. En este sentido, se han desarrollado métodos dirigidos de UHPLC-MS/MS para evaluar la presencia de micotoxinas en materias primas obtenidas en distintas granjas y en productos finales adquiridos en supermercados locales. En primer lugar, se evaluaron productos destinados a la alimentación del ganado lechero, concretamente TMR (120). Por otro lado, se han desarrollado métodos destinados al análisis de queso y yogur, además de un método para el análisis de bebidas vegetales, empleadas como sustituto de productos lácteos. Por otro lado, se ha determinado la capacidad de Gnomoniopsis smithogilvyi, un patógeno causante de la podredumbre parda de la castaña, para producir micotoxinas y otros metabolitos secundarios, empleando un método no dirigido de UHPLC-MS-IT-TOF (121). La Eurorregión formada por Galicia y el Norte de Portugal destaca por ser la principal zona de producción de leche en la península ibérica. En la industria agroalimentaria española, el sector lácteo es fundamental debido al gran volumen de consumo de leche y productos lácteos. Galicia lidera la producción de leche en ámbito nacional, porque supone un 55 % de las explotaciones. Así mismo, el sector lácteo es también uno de los pilares de la economía del Norte de Portugal. La producción de leche en la Eurorregión se incrementó debido a la ampliación de granjas y modernización de instalaciones impulsadas por la Política Agraria Común (122). INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 104 Uno de los principales riesgos del sector lácteo es la presencia de contaminantes. Por lo tanto, es importante conocer la incidencia de micotoxinas en los productos destinados a la alimentación animal. En este sentido, el TMR consiste en una mezcla de distintas proporciones de forrajes, subproductos, vitaminas y aditivos que proporciona al ganado una dieta equilibrada y rica en nutrientes. El objetivo principal de la dieta TMR es asegurar que cada vaca pueda consumir los nutrientes necesarios en la cantidad adecuada. La composición del TMR varía según la zona, pero en la Eurorregión Galicia-Norte de Portugal está compuesta principalmente por silo (75 %), concentrado (20 %) que incluye maíz, cebada, soja, colza, DDG (granos de destilería desecados) y otros productos, y en menor proporción por forrajes secos como paja y alfalfa. Todos estos productos son susceptibles de ser contaminados por micotoxinas, por lo que se evaluó la presencia de estos contaminantes en muestras de TMR del Norte de Portugal recolectadas entre el 2019 y 2022. Asimismo, se estudió la posible transferencia de las micotoxinas presentes en el TMR a la leche animal. En primer lugar, se estudió si era posible la extensión de un método previamente validado para el análisis de silos a TMR. El método de extracción empleado, junto con el resto de los optimizados en la presente tesis doctoral, se ha basado en la metodología de extracción denominada bajo el acrónimo QuEChERS. Originalmente fue diseñado para el análisis de pesticidas, pero se ha demostrado que su uso es eficaz en el análisis de micotoxinas y otros contaminantes presentes en matrices complejas (123). El método original está formado por dos etapas. La primera consiste en una extracción sólido-líquido en la que normalmente se emplean disolventes orgánicos como acetona, acetato de etilo o acetonitrilo, este último es el más empleado porque es capaz de extraer compuestos con un amplio rango de polaridades. Si la muestra no posee un porcentaje elevado de agua (8085 %) es recomendable adicionarla previamente. A continuación, mediante la adición de sales inorgánicas, se consiguen separar la fase acuosa y la fase orgánica. Las sales inorgánicas que se suelen utilizar son MgSO4, MgCl2, NaNO3, NaCl, Na2SO4 y LiCl. La mezcla de MgSO4 con NaCl logra una separación de fases adecuada y una buena forma de los picos cromatográficos. La segunda etapa consiste en una limpieza adicional del extracto, a través de una d-SPE, utilizando adsorbentes como N-propiletildiamina, PSA, carbon negro grafitizado o C18. El objetivo del adsorbente es eliminar interferencias como ácidos grasos, pigmentos y azúcares (123). El método empleado para el análisis de TMR había sido previamente optimizado para silos (124). En este sentido, se realizó una humectación de 2,5 g de muestra con 10 mL de una disolución acuosa de ácido acético al 1 %. Seguidamente, se añadieron 20 mL de acetonitrilo y se realizó la separación de las fases empleando 8 g de MgSO4 combinados con 2 g de NaCl. Del extracto obtenido se evaporaron 0,1 mL y se redisolvieron con 0,4 mL de disolvente (acetonitrilo/agua/ácido acético [49/50/1 (v/v/v)]). Las alícuotas se filtraron (0,22 μm) previamente antes del análisis por UHPLC-MS/MS. Empleando el método de extracción descrito, se realizó una validación en términos de LOQ, precisión y exactitud para la determinación de 29 micotoxinas. Los LOQs de los métodos empleados en la tesis toctoral fueron calculados siguiendo la guías de EU-RL (125). En general los LOQ están en el rango de los obtenidos para el análisis de los silos (126). En el presente método de análisis se mantuvieron todas las toxinas reguladas y emergentes, pero se redujo el número de toxinas modificadas, eliminando principalmente toxinas derivadas de ZEA ya que no se han encontrado previamente en materias primas y proceden principalmente de la metabolización animal. De esta forma se consiguió mejorar la sensibilidad para algunos metabolitos como las AFs. En todos los casos, los LOQs están por debajo de los niveles máximos permitidos o recomendados y por lo tanto la sensibilidad del método es adecuada. Por ejemplo, en el caso de AFB1, el LOQ fue de 0,9 µg/kg, siendo el límite máximo permitido de 20 µg/kg. Discusión 111 varía en función de la toxina y de la bebida, encontrándose la mayor supresión en un 11 % para ENNB1 en bebida de arroz. Sin embargo, se observó una mejora de la señal para el grupo de las FBs. Estos resultados coincidieron con otros datos reportados previamente en bebidas de arroz y soja (155). El efecto de matriz para la HT-2 es más marcado en las bebidas de avena, arroz y soja (valores de SSE del 44 % al 58 %) en comparación con las de almendra (SSE del 85 %). De forma similar, se ha observado anteriormente un alto efecto de matriz para HT-2 y DON, con una supresión de señal del 39 % en bebidas de avena, soja, arroz y alpiste (156). A continuación, se estudió la precisión del método mediante la recuperación en tres niveles de concentración. Las recuperaciones varían según la matriz y el nivel de contaminación, pero en general se alcanzaron valores superiores al 80 %. Sin embargo, existen algunas excepciones, como la de HT-2 y T-2 triol en bebida de soja, con valores del 45 % y 48 %, respectivamente, y de la CTN en bebida de arroz, con una recuperación del 21 %. En el caso de las AFs, se obtuvieron valores superiores al 65 % para todas las matrices en los tres niveles de contaminación (0,02, 0,09 y 0,19 µg/L). Por lo tanto, el método propuesto logra buenas recuperaciones para los distintos grupos de micotoxinas. La precisión se estudió mediante RSD de recuperaciones obtenidas por triplicado en el mismo día y en tres días consecutivos, obteniendo en ambos casos valores de RSD inferiores al 20 %. En este sentido, el método cumple con los criterios de funcionamiento establecidos en la legislación (99, 117). Por lo tanto, aunque el método propuesto incluye múltiples toxinas, mantiene unas características de rendimiento adecuadas. Una vez validado, el método fue aplicado al análisis de 38 bebidas vegetales, concretamente: 9 de soja, 6 de arroz, 16 de avena y 7 de almendra. Se encontró una alta incidencia de micotoxinas emergentes, especialmente para BEA y ENNs. Estos resultados concuerdan con datos reportados previamente (157). Además, se detectaron HT-2 y T-2 en bebida de avena. Estas dos toxinas suelen infestar los cultivos de este cereal, por lo tanto, es posible que exista un arrastre desde la materia prima hacia la elaboración de la bebida vegetal. También se encontró OTA a un nivel de 0,741 µg/L en una muestra de bebida de avena, mientras que la AFB1 se detectó en bebida de arroz (0,042-0,09 µg/L) y en una muestra de bebida de almendra, pero con una concentración inferior a 0,04 µg/L. De los cuatro tipos de bebidas vegetales analizados, la de soja resultó ser la matriz con niveles más bajos de contaminación. Por lo tanto, se necesita más investigación para proporcionar datos de incidencia y evaluar el riesgo para los consumidores. Además de estudiar la presencia de micotoxinas mediante métodos dirigidos, en la presente tesis doctoral también se empleó un método no-dirigido por UHPLC-MS-IT-TOF con el fin de establecer si G. smithogilvyi era productor de micotoxinas. Este hongo es el principal agente causal de la pudrición parda del castaño a nivel mundial. En 2021 se produjo un importante brote de podredumbre del castaño en el sur de Galicia. Este hongo puede vivir endofíticamente y causar lesiones que pueden pasar desapercibidas, por lo que los humanos pueden consumir castañas afectadas por este hongo (158). Por ello, es importante determinar si esta especie de hongo es capaz de producir micotoxinas para determinar las consecuencias del consumo humano y animal. Con este fin se estudió el perfil de metabolitos secundarios producidos por G. smithogilvyi Para el análisis del hongo se obtuvieron tres tapones de agar (6 mm de diámetro) de aislados cultivados en medio PDA. Estos se extrajeron con una mezcla de acetonitrilo/agua/ácido acético [49:50:1 (v/v/v)] y el extracto resultante se filtró y analizó mediante UHPLC-MS-IT-TOF en modo scan. De esta forma se identificaron varios picos que no estaban presentes en la muestra control (PDA sin hongo). En este sentido, se detectó un pico m/z 268,1051 a un tiempo de retención de 3,4 minutos y se identificó tentativamente como adenosina. La presencia de este INÉS RODRÍGUEZ CAÑÁS 112 compuesto se confirmó empleando un estándar analítico. Por otro lado, se estudió un pico m/z 360,2166 que eluyó a los 5,8 min. El compuesto se identificó tentativamente con la oxatesina, ya que la fórmula más probable y el patrón de fragmentación coincidió con este compuesto. De forma similar, el pico m/z 318,2992 que eluyó a 8 minutos fue identificado como fitoesfingosina (159). Por lo tanto, este estudio demostró que G. smithogilvvi no es una especie micotoxigénica, pero produce metabolitos con interesantes propiedades farmacológicas y fitotoxicológicas. En resumen, en la presente tesis doctoral se han desarrollado métodos analíticos para la detección de micotoxinas en matrices alimentarias que no están controladas por las autoridades competentes, debido a que la legislación europea no las contempla todavía. En vista a los resultados obtenidos, las micotoxinas son contaminantes presentes en la cadena alimentaria y que, por transferencia, pueden pasar sufrir un arrastre desde una materia prima a un producto derivado. Este suceso podría suponer un riesgo en término de salud humana y animal. Es conveniente recopilar datos de incidencia sobre micotoxinas en nuevas matrices alimentarias para evaluar si es necesaria su regulación. CONCLUSIONES 115 6. CONCLUSIONES 1. La extracción tipo QuEChERS con la detección por LC-MS permite la cuantificación de hasta 32 micotoxinas en TMR, queso, yogur y bebidas vegetales. 2. La detección por LC-MS de CPA requiere la adición de ácido fórmico 0,03 M en las fases móviles. 3. Gnomoniopsis smithogilvyi produce adenosina, oxasetina y fitosfingosina. 4. Entre el 2 % y el 10 % de la BEA, ENNs y ROQC presente en el TMR es arrastrado a la leche. 5. La BEA y las ENNs se transfieren a lo largo de la cadena alimentaria a productos lácteos y bebidas vegetales. 6. En bebidas vegetales y yogures con base de avena se detectan las micotoxinas T-2 y HT2. BIBLIOGRAFÍA 119 7. BIBLIOGRAFÍA 1. FAO. El estado mundial de la agricultura y la alimentación. Lograr que los sistemas agroalimentarios sean más resilientes a las perturbaciones y tensiones. Roma: Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura; 2021. p. 1-21. 2. United Nations Coordinatrion Unit, Follow-up mechanism. 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Además, se establece el perfil metabólico de Gnomoniopsis smithogilvyi, hongo responsable de la podredumbre en la castaña, descartando la producción de micotoxinas.