Estudio de la función biológica de la protimosina α mediantela caracterización de sus dianas moleculares

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR TESIS DOCTORAL ESTUDIO DE LA FUNCIÓN BIOLÓGICA DE LA PROTIMOSINA α MEDIANTE LA CARACTERIZACIÓN DE SUS DIANAS MOLECULARES Memoria que, para optar al grado de Doctor en Bioquímica, presenta Pablo Barbeito González Santiago de Compostela, julio de 2014 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Biología Universidad de Santiago de Compostela Manuel Freire Rama, catedrático del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, Concepción Sarandeses da Costa, profesora del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, y Cristina Díaz-Jullien, profesora del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, CERTIFICAN: Que la memoria adjunta, titulada “ESTUDIO DE LA FUNCIÓN BIOLÓGICA DE LA PROTIMOSINA α MEDIANTE LA CARACTERIZACIÓN DE SUS DIANAS MOLECULARES”, presentada por el licenciado en Biología Molecular y Biotecnología Pablo Barbeito González para optar al grado de Doctor en Bioquímica, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela y, considerándola concluida, autorizamos su presentación para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Fdo. Manuel Freire Rama Fdo. Concepción Sarandeses da Costa Fdo. Cristina Díaz-Jullien Fdo. Pablo Barbeito González Santiago de Compostela, 4 de julio de 2014 Agradecimientos AGRADECIMIENTOS A mi director, el profesor Manuel Freire Rama, por darme la oportunidad de trabajar en su grupo de investigación y compartir conmigo la pasión de una vida por el conocimiento de una proteína. La ProTα me acompañará siempre en mi vida. A mis directoras, Concepción Sarandeses da Costa y Cristina Díaz Jullien, por los consejos diarios, conocimientos compartidos y ayuda que hicieron posible terminar este trabajo, lo que en algún momento no parecía tan claro. Al profesor Guillermo Covelo Artos, por tratarme como un compañero y su disponibilidad para ayudarme. Al profesor Primitivo Barja, por su preocupación y apoyo durante todos estos años. A Juan, por hacer que el mantenimiento de los cultivos celulares fuese “darlle de comer aos peixes”, cuestionar los “porque siempre se hizo así”, su experiencia y ayuda en el trabajo diario. A David Moreira por ser más que un compañero de laboratorio, por esos debates de los primeros años, las conversaciones diarias y por tu ayuda desinteresada. A mi hermano y a Xiana, por sus apoyos y darme a mi sobrina, su fuerza y alegría han ayudado a terminar este trabajo. A mis padres, por estar siempre apoyándome, animándome y ser un ejemplo de trabajo y esfuerzo. Simplemente sin vosotros este trabajo sería imposible. A Noela, todo lo que pueda decir es poco, gracias por estar ahí, por conocerme mejor que yo mismo...Muchísimas gracias. Aos meus pais e a Noela ÍNDICE Índice ÍNDICE ABREVIATURAS.......................................................................................................................i I. INTRODUCCIÓN...................................................................................................................1 1. LAS TIMOSINAS.................................................................................................................5 2. LAS TIMOSINAS α Y SU PRECURSOR.................................................................................6 3. ESTRUCTURA DE LA PROTIMOSINA α Y SU EXPRESIÓN EN LOS DIFERENTES TEJIDOS.....8 4. GENES DE LA PROTIMOSINA α.......................................................................................13 5. CONCENTRACIÓN Y DISTRIBUCIÓN SUBCELULAR DE LA PROTIMOSINA α.....................14 6. EVOLUCIÓN ESTRUCTURAL DE LA PROTIMOSINA α.......................................................17 6.1.PROTEÓLISIS DE LA PROTIMOSINA α EN DIVERSOS TIPOS CELULARES..................17 6.2.LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTIMOSINA α...........................................................19 7. FUNCIÓN BIOLÓGICA DE LA PROTIMOSINA α................................................................23 7.1.RELACIÓN ENTRE LA PROTIMOSINA α Y LA PROLIFERACIÓN CELULAR..................23 7.2.RELACIÓN DE LA PROTIMOSINA α CON LA ACTIVIDAD DE LA CROMATINA...........25 7.3.LA PROTIMOSINA α EN LA ACTIVIDAD CITOPLASMÁTICA DE LAS CÉLULAS...........30 II. OBJETIVOS........................................................................................................................35 III. MATERIAL Y MÉTODOS....................................................................................................39 1. MATERIAL BIOLÓGICO....................................................................................................43 1.1. CÉLULAS..................................................................................................................43 1.2. ANTICUERPOS.........................................................................................................43 1.3. OTROS PRODUCTOS................................................................................................44 2. MATERIAL NO BIOLÓGICO..............................................................................................45 2.1. MEDIOS DE CULTIVO..............................................................................................45 2.2. DISOLUCIONES Y TAMPONES.................................................................................45 2.3. OTROS PRODUCTOS................................................................................................46 Índice 3. MÉTODOS.......................................................................................................................48 3.1. CULTIVOS CELULARES.............................................................................................48 3.2. PREPARACIÓN DE EXTRACTOS CELULARES.............................................................50 3.3. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO.........................................................51 3.4. ANÁLISIS ELECTROFORÉTICOS................................................................................51 3.5. PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS...........................................................................52 3.6. IMMUNOWESTERN BLOT.......................................................................................52 3.7. PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPLEJOS INMUNOREACTIVOS CON ANTI-ProTα.............................................................................................................54 3.8. ROTURA DE LOS ENLACES DE FORMALDEHIDO POR TRATAMIENTO TÉRMICO.....55 3.9. IDENTIFICACIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS SET, ANP32A Y ANP32B.....55 3.10. ESPECTROMETRÍA DE MASAS............................................................................56 3.11. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.......................................................................57 3.12. ISOELECTROENFOQUE.......................................................................................57 3.13. FPLC DE INTERCAMBIO IÓNICO.........................................................................57 3.14. CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN MOLECULAR...............................................58 3.15. ENSAYOS DE COINMUNOPRECIPITACIÓN..........................................................58 3.16. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD A ProTα..........................................................59 3.17. ENSAYOS DE INMUNOFLUORESCENCIA Y MICROSCOPÍA CONFOCAL...............60 3.18. ENSAYOS DE ACTIVIDAD APOPTÓTICA..............................................................61 IV. RESULTADOS...................................................................................................................63 1. ESTABILIZACIÓN DE LAS INTERACCIONES TRANSITORIAS DE LA PROTα EN LINFOCITOS EN PROLIFERACIÓN MEDIANTE LA INDUCCIÓN DE ENLACES CRUZADOS CON FORMALDEHIDO.............................................................................................................67 2. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS COMPLEJOS INMUNOREACTIVOS CON ANTI-PROTα....................................................................................................................75 Índice 3. ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES IN VIVO DE LA PROTα CON LAS PROTEÍNAS SET, ANP32A Y ANP32B..........................................................................................................84 4. ESTUDIO DE LA TRANSCENDENCIA BIOLÓGICA DE LAS INTERACCIONES DE LA PROTα CON LAS PROTEÍNAS SET, ANP32A Y ANP32B..............................................................101 5. ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES DE LA PROT α EN CÉLULAS 293T............................126 V. DISCUSIÓN.....................................................................................................................129 VI. CONCLUSIONES.............................................................................................................141 VII. BIBLIOGRAFÍA..............................................................................................................147 VIII. ANEXO.............................................................................................................................I Introducción 3 I. INTRODUCCIÓN 1. LAS TIMOSINAS..........................................................................................................5 2. LAS TIMOSINAS α Y SU PRECURSOR...........................................................................6 3. ESTRUCTURA DE LA PROTIMOSINA α Y SU EXPRESIÓN EN LOS DIFERENTES TEJIDOS..8 4. GENES DE LA PROTIMOSINA α.................................................................................13 5. CONCENTRACIÓN Y DISTRIBUCIÓN SUBCELULAR DE LA PROTIMOSINA α.................14 6. EVOLUCIÓN ESTRUCTURAL DE LA PROTIMOSINA α..................................................17 6.1. PROTEÓLISIS DE LA PROTIMOSINA α EN DIVERSOS TIPOS CELULARES..................17 6.2. LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTIMOSINA α...........................................................19 7. FUNCIÓN BIOLÓGICA DE LA PROTIMOSINA α...........................................................23 7.1. RELACIÓN ENTRE LA PROTIMOSINA α Y LA PROLIFERACIÓN CELULAR..................23 7.2. RELACIÓN DE LA PROTIMOSINA α CON LA ACTIVIDAD DE LA CROMATINA...........25 i. Interacción de la ProTα con las histonas........................................................25 ii. Participación de la ProTα en la actividad de la cromatina..............................26 iii. Relación de la ProTα con la actividad transcripcional.....................................28 7.3. LA PROTIMOSINA α EN LA ACTIVIDAD CITOPLASMÁTICA DE LAS CÉLULAS...........30 Introducción 5 I. INTRODUCCIÓN 1. LAS TIMOSINAS El papel esencial del timo en el desarrollo del sistema inmune se ha dirigido a la búsqueda intensiva, aislamiento e identificación de los factores tímicos biológicamente activos que pueden suplir muchas de las deficiencias ocasionadas por su extirpación, o potenciar la competencia inmunológica en individuos normales. A mediados de los sesenta, una fracción de timo de ternera denominada timosina (Goldstein et al., 1966) mostró que potenciaba la inmunofunción en varios sistemas in vitro e in vivo (revisado en Low & Goldstein,. 1985). La preparación de timosina mejor conocida es un extracto de timo de ternera denominado fracción de timosina 5 (TF5), la cual contiene unos 30 polipéptidos termoestables con un peso molecular comprendido entre los 1 kDa y 15 kDa (Goldstein et al., 1972; Hooper et al., 1975; Low et al., 1979a). El sistema de nomenclatura para las timosinas está basado en su punto isoeléctrico (pI): α para pI menores de 5, β para pI entre 5 y 7, y γ para pI mayores de 7 (indicado en la figura 1A). El componente más característico de la TF5 es un polipéptido ácido (pI 4,2) denominado timosina α1 (Tα1). Este polipéptido fue el primer componente de la TF5 en ser purificado y secuenciado (Goldstein et al., 1977): es un polipéptido de 28 aminoácidos, con una serina acetilada en el fragmento N-terminal y sin residuos aromáticos ni azufrados (figura 1A). Otro componente α de la TF5 fue purificado más tarde y establecida su secuencia: la timosina α11 (Tα11) (Caldarella et al., 1983). La Tα11 es un polipéptido de 35 aminoácidos relacionado estructuralmente con la Tα1, pero contiene 7 aminoácidos adicionales en su extremo C-terminal (figura 1A). Este polipéptido es aproximadamente 4 veces menos abundante que la Tα1 en la TF5, aunque muestra una actividad similar a la Tα1 en algunos ensayos in vivo. Los componentes β de la TF5 también han sido aislados y secuenciados. La timosina β1 ha sido identificada como ubiquitina (Low et al., 1979b); la timosina β4 (el miembro más abundante de esta familia de péptidos) (Low et al., 1981) y sus homólogos β8, β9 (Hannappel et al., 1982b) y β10 (Hall et al., 1990), así como sus derivados, han sido también aislados y sus estructuras establecidas. Introducción 6 Los efectos de las β-timosinas en la función inmunológica, de acuerdo con diversos ensayos biológicos (Low et al., 1985), son menos relevantes que los de las α-timosinas. La ubicua distribución de las β-timosinas en extractos de tejidos de mamíferos (Hannappel et al., 1982a), aves y anfibios (Erickson-Vitanen et al., 1982), así como su expresión génica en diversos tejidos animales (Gómez-Márquez et al., 1989a, 1996; Gómez-Márquez & Anadón, 2002), sugieren fuertemente que las β-timosinas tienen una función biológica más generalizada (incluso funciones celulares no relacionadas específicamente con el sistema inmune han sido descritas -revisado en Huff et al., 2001-). En este sentido, las β-timosinas han sido caracterizadas como proteínas de unión a actina, y la función bioquímica de la timosina β4 como péptido regulador de los mecanismos de polimeración de la actina es bien conocida (Safer et al., 1991; Sanders et al., 1992; Huff et al., 2001). La timosina β4 está implicada en la reparación de tejidos lesionados (Goldstein et al., 2005), en procesos de angiogénesis (Malinda et al., 1997) y neovascularización (Smart et al., 2007), en la movilidad celular, sinaptogénesis y otros fases relacionadas con la plasticidad sináptica (Bamburg & Bernstein, 1991), en la diferenciación neuronal (Carpintero et al., 1995) y en el desarrollo cardiovascular (Gómez-Márquez et al., 1996). Así, en estas y otras actividades biológicas (en las que la actina tiene un papel crucial) la timosina β4 participa controlando el remodelado del citoesqueleto celular. Las γ-timosinas no han sido caracterizadas. 2. LAS TIMOSINAS α Y SU PRECURSOR La glándula tímica es un órgano linfoide en el que se produce la inmunocapacitación de los linfocitos T, responsables tanto de la inmunidad humoral como de la celular. A las timosinas α se les atribuía un papel como señalizadores moleculares de los linfocitos T en el timo, influenciando su diferenciación e inmunocapacitación dentro de este órgano. La interacción de las timosinas, y otros componentes del medio intratímico, con los linfocitos inmunológicamente incompetentes recién llegados a este órgano, procedentes de la médula ósea, propiciaría la generación de las diferentes poblaciones de linfocitos T capaces de ejercer la actividad inmunológica después de su exportación del timo a los demás tejidos del sistema inmune. Estas poblaciones de linfocitos T diferenciados: células CD4+, CD8+, y linfocitos T de Introducción 7 memoria, son las responsables de la inmunidad celular y también de la inmunidad humoral, puesto que cooperan con la actividad de los linfocitos B (Low & Goldstein, 1985). La importancia aparente de las α-timosinas como efectores del desarrollo y de la función de los linfocitos dependientes del timo animó, desde 1977, la investigación dirigida a caracterizar el origen celular de estos polipéptidos y su función biológica. Entre estos péptidos tímicos, la timosina α1 era el más característico, siendo éste el primero en ser purificado (Goldstein et al., 1977). El descubrimiento posterior de dos péptidos, la Tα11 y la des-timosina α1, que poseían la misma secuencia que la Tα1 en su extremo Nterminal (Caldarella et al., 1983), apoyaba la idea de la existencia de un precursor común. La estrategia seguida para investigar si estos péptidos podrían estar sintetizados a partir de un precursor común fue la caracterización de los productos de la traducción in vitro de los mRNAs aislados de timo de ternera, empleando anticuerpos contra la timosina α1. El análisis estructural de los productos inmunoprecipitados demostró la existencia de una proteína de 16 kDa (determinada mediante el protocolo de Weber & Osborn, 1969: en SDSPAGE a pH 7) que incluye a la Tα1 en su secuencia (Freire et al., 1978) (figura 1B). El aislamiento del mRNA que codifica para esta proteína (Freire et al., 1981; Rey-Campos et al., 1983) confirmó la existencia de un precursor de la Tα1 y apoyó la hipótesis original: la Tα1 y quizás la Tα11 eran generadas por proteólisis de un péptido de mayor tamaño. Posteriormente, este precursor fue aislado y secuenciado de extractos de timo de rata (Haritos et al., 1984b; Haritos et al., 1985a) usando procedimientos que minimizaban la actividad proteolítica: el análisis de los componentes de los extractos tímicos preparados en estas condiciones indicaron la ausencia de la Tα1 y la presencia de un polipéptido de mayor longitud con la secuencia de la Tα1 en su extremo N-terminal, y que mostraba las características del precursor descrito previamente (Haritos et al., 1984a). A esta proteína (figura 1C), de secuencia muy conservada, con alto contenido de residuos aminoacídicos ácidos y que contiene en su estructura la secuencia de las timosinas α, se la denominó protimosina α (ProTα). Introducción 8 Figura 1. A) Composición de la TF5 de timo de ternera y secuencia de las timosinas α purificadas. B) Análisis por SDS-PAGE de los productos de traducción de mRNA de timo in vitro. C) Secuencia de la protimosina α 3. ESTRUCTURA DE LA PROTIMOSINA α Y SU EXPRESIÓN EN LOS DIFERENTES TEJIDOS Posteriormente, la ProTα fue aislada en diferentes tejidos y secuenciada en humanos (Pan et al., 1986), ternera (Panneerselvam et al., 1988), cerdo (Economou et al., 1988), ratón (Low et al., 1990) y cabra (Frillingos et al., 1991). Su estructura primaria se confirmó por Introducción 9 secuenciación de su cDNA procedente de células humanas (Eschenfeldt & Berger, 1986; Goodall et al., 1986; Gómez-Márquez et al., 1989b). Polipéptidos similares a la ProTα han sido hallados en otros vertebrados, incluyendo pollo y trucha, a concentraciones 30 veces menores que las encontradas en timo de ternera (Yialouris et al., 1988); mientras que el mRNA de una proteína acídica que muestra una fuerte homología en su secuencia con la ProTα de mamíferos ha sido encontrado en rana, aunque los niveles celulares de esta proteína no han sido determinados (Aniello et a l. , 2002). Al mismo tiempo, la ProTα procedente de rata (Frangou-Lazaridis et al., 1988), ratón (Schmidt et al., 1991), y cerdo (Wintero et al., 1996) fueron clonadas y sus cDNA secuenciados. Los resultados de estos trabajos concluyeron las siguientes características de esta proteína:  La ProTα presenta una distribución tisular generalizada, lo que es indicativo de una función básica de esta proteína en la actividad de las células de mamífero no relacionada exclusivamente con la actividad del sistema inmunitario y la inmunocapacitación intratímica de los linfocitos T. Además, muestra una elevada concentración en las células (del orden de 0,2 pg/célula) (Franco et al., 1992), muy superior a la de una hormona y a los demás polipéptidos timosínicos, esto último parece indicar que esta proteína es la principal responsable de la actividad biológica de las timosinas α.  La ProTα es un polipéptido altamente acídico (pI 3,55, puede considerarse la proteína más acídica conocida en animales) con un peso molecular de 12,5 kDa. Posee entre 109-111 residuos aminoacídicos de los cuales los 28 primeros se corresponden con la secuencia de la timosina α1, mientras que la des-timosina α1 y la timosina α11 coinciden respectivamente con los primeros 24 y 35 aminoácidos. En su secuencia hay una gran proporción de residuos ácidos (Glu 37% y Asp 25%) que se localizan mayoritariamente en su región central, lo que le confiere un carácter ácido y altamente hidrofílico. No posee aminoácidos azufrados ni aromáticos (figuras 1B y 2).  La ProTα humana se presenta en dos isoformas, que difieren en la existencia o no de un resto de ácido glutámico en la posición 39 de la molécula (Eschenfeldt & Berger, 1986), confirmando los datos obtenidos mediante la secuenciación de esta proteína (Pan et al., 1986).  La estructura primaria de la ProTα predice estructuras secundarias en hélice α y lámina β (Haritos et al., 1985a); sin embargo, ningún tipo de estructura secundaria ha sido detectada en condiciones fisiológicas (Watts et al., 1990; Gast et al., 1995). A pH Introducción 10 neutro, la ProTα se mantiene como una cadena no plegada, debido probablemente a las repulsiones entre las cargas negativas (Watts et al., 1990). Este hecho podría explicar su comportamiento anómalo en cromatografía de filtración molecular, donde se deduce un peso molecular unas 5 veces superior al que realmente posee (Haritos et al., 1989). La ProTα no forma estructuras cuaternarias, encontrándose en forma de monómero (Gast et al., 1995; Haritos et al., 1989).  Otras características estructurales destacables de la ProTα con importantes implicaciones funcionales son la acetilación de la Ser-N-terminal (Goldstein et al., 1977; Michalewsky et al., 1983; Sburlati et al., 1993; Nogueira & Freire, 1985), la presencia de una señal de localización nuclear en su extremo C-terminal (T100KKQKT105) (Gómez-Márquez & Segade, 1988; Manrow et al., 1991; Rubtsov et al., 1997) y la existencia en su secuencia de lugares de fosforilación para la caseín kinasa 2 (CK-2) en sus extremos N y C-terminal (Barcia et al., 1992). Entre las proteínas más reseñables que presentan homología con la ProTα se encuentra la paratimosina α, un péptido inicialmente aislado a partir de extractos tímicos de rata (Haritos et al., 1985b, 1985c), que se halla distribuido en varios tejidos de mamíferos (Clinton et al., 1989) y presenta una similitud del 43% con la ProTα (Komiyama et al., 1986), y que se ha demostrado que interviene en el metabolismo de carbohidratos (Brand & Heinickel, 1991; Brand et al., 1991). Asimismo, la ProTα presenta un 47% de homología parcial con la proteína nuclear no histónica HMG1 (Otero et al., 1993). Además, su dominio acídico central la asemeja a ciertos péptidos nucleares que interactúan con histonas, como la nucleoplasmina (Laskey et al., 1978), N1/N2 (Kleinschmidt et al., 1986), la nucleolina (Lapeyre et a l. , 1987) o la nucleofosmina (Chang et al., 1989). Introducción 11 Figura 2. Comparación de la estructura primaria de la ProTα: humana (2 isoformas), de rata, murina y bovina. En negrita y minúscula se señalan los aminoácidos no conservados con respecto a la ProTα humana. Los primeros estudios sobre la expresión de la ProTα en diferentes tejidos se llevaron a cabo mediante técnicas de inmunofluorescencia y de radioinmunoensayo. Utilizando la técnica de radioinmunoensayo, la ProTα se ha localizado fundamentalmente en timo, aunque también se ha encontrado en cerebro, hígado, riñón, pulmón y bazo de rata (Haritos et al., 1984b). En humanos se ha inmunodetectado en timo (Dalakas et a l. , 1981), encontrándose altos niveles en leucocitos y, en muy pequeña cantidad, en plasma (Panneerselvam et al., 1987), atribuida a lisis celulares. Estudios de nuestro laboratorio evaluando la distribución de la ProTα y Tα1 (Franco et al., 1992) y los niveles de mRNA (Bustelo et al., 1991) en los diferentes tejidos de ratón mostraron que la ProTα se expresa principalmente en tejidos linfoides (figura 3). Además, el estudio de la expresión en otros tejidos y células demostró que la ProTα es expresada exclusivamente en tejidos de mamíferos. Introducción 12 Figura 3. Distribución de la ProTα y expresión del gen de esta proteína en diversos tejidos de ratón. A) (Franco et al., 1992). B) (Bustelo et al., 1991). Cabe destacar que la ProTα es sintetizada en polisomas libres y carece de secuencia de señal secretora (Eschenfeldt et al., 1989), lo que indica que posee un sitio intracelular de acción, o que su liberación al medio extracelular ocurre por un mecanismo no convencional de secreción. Por otra parte, la presencia de la ProTα en el suero (Panneerselvam et al., 1987) y en los sobrenadantes de cultivos de timocitos (Franco et al., 1989) debería, quizás, ser atribuida a la liberación de las células tímicas y otros tipos celulares a causa de la apoptosis. Introducción 19 6.2. LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTIMOSINA α A inicios de los años 90 se demostró en experimentos realizados en nuestro laboratorio que la ProTα era fosforilada in vitro por la caseín quinasa-2 (CK-2) (Barcia et al., 1992) en residuos de Ser y Thr localizados en su región N-terminal (aminoácidos 1-14 de su secuencia). Posteriormente, se encontró que la ProTα también resultaba fosforilada in vivo en residuos de Thr localizados en la secuencia de sus primeros 14 aminoácidos, en varios tipos celulares: timocitos, esplenocitos y células HeLa; en las cuales la fosforilación era dependiente de su actividad proliferativa (Barcia et al., 1993). El estudio comparativo de los residuos de Thr fosforilados demostró que en células tumorales se fosforilaba el residuo Thr 7 (Díaz-Jullien et al., 2011), mientras que en linfocitos no tumorales se fosforilaban los residuos Thr 7 y Thr 12 (Pérez-Estévez et al., 1997) (figura 4). En posteriores trabajos de nuestro laboratorio se aisló esta proteína quinasa en extractos de esplenocitos de ratón activados para proliferar (Pérez-Estévez et al., 1997) (figura 4A). Esta proteína (ProTαK), a diferencia de la CK-2, fosforilaba a la ProTα en los mismos residuos de Thr que resultaban fosforilados in vivo (Pérez-Estévez et al., 1997), tal como se indica en la figura 4B y C. Además, en este trabajo se confirmó que los niveles más elevados de actividad fosforilante de la ProTα se encontraban en los extractos citosólicos, y que solo la ProTαK y no la CK-2 era separada mediante cromatografía de afinidad sobre ProTα-Sepharosa en los extractos citosólicos de varios tipos celulares estudiados: hepatocitos y timocitos activados mitóticamente (ambos de ratón), cultivos subconfluentes de células HeLa y células NC37, en las cuales de nuevo la fosforilación era dependiente de su actividad proliferativa (Pérez-Estévez et al., 1997). Introducción 20 Figura 4. A) Caracterización de la ProTαK que fosforila la ProTα (Pérez-Estévez et al., 1997). B) Secuencia de la ProTα con los residuos de Thr fosforilados: Thr 7 en células tumorales (Azul) (DíazJullien et al., 2011) y Thr 7 y Thr 12 en linfocitos no tumorales (Pérez-Estévez et al., 1997). C) Residuos fosforilados in vivo y por la ProTαK citosólica (Pérez-Estévez et al., 1997). Los resultados del análisis de fosfoaminoácidos, junto con que la ProTαK citosólica no fosforila a la caseína, ni tampoco utiliza GTP como donador de fosfato, que en experimentos de inmunosupresión con anticuerpos contra la subunidad α de la CK-2 no se bloqueaba la actividad de la ProTαK (PérezEstévez et al., 1997), y que el efecto de los cationes divalentes: Ca+2, Mg+2, Mn+2, y Co+2 presente un patrón diferente en ProTαK y CK-2 (Pérez-Estévez et al., 2000) descarta la posibilidad de que CK-2 sea la responsable de la fosforilación de la ProTα, al menos en esplenocitos. Introducción 21 Los datos de filtración en gel de la actividad ProTαK citosólica indican que la enzima tiene una masa molecular de 180 kDa; y el análisis SDS-PAGE de la enzima separada mediante HPLC señala que la actividad quinasa parece residir en una proteína de 60-64 kDa (PérezEstévez et al., 1997). Estos resultados sugieren que la enzima forma una estructura oligomérica in vivo. Por otra parte, estudios de la actividad ProTαK en diferentes fases del ciclo celular mostraron que, manteniendo una ubicación citosólica, esta sigue la misma evolución que la expresión de la ProTα (Pérez-Estévez et al., 2000). Una importante característica de la ProTαK en linfocitos de bazo activados para proliferar (concavalina A + interleuquina-2) es que su actividad es dependiente de un proceso de fosforilación, incluido en una ruta de señalización en la que está implicada la actividad PKC, aunque esta quinasa no fosforila directamente a la ProTαK (Pérez-Estévez et al., 2000). La desfosforilación de la ProTαK anula su actividad (Pérez-Estévez et al., 2000). Recientemente en nuestro laboratorio se ha caracterizado a la ProTαK como la isoforma M2 de la piruvato quinasa (M2-PK) (Díaz-Jullien et al., 2011). Lo que pone de manifiesto, por primera vez, una habilidad excepcional de la PK. En este trabajo se demuestra que solo una parte del contenido celular de la M2-PK (un 10%) en el citoplasma de las células en proliferación adquiere la capacidad para fosforilar a la ProTα debido a un proceso de fosforilación en residuos de Ser y Thr de la M2-PK. Esta fosforilación propicia una asociación en forma de trímero (180 kDa) de la M2-PK para generar la ProTαK más activa, frente a asociaciones monoméricas (60 kDa) y tetraméricas (240 kDa) menos activas. Una habilidad similar de la M2-PK fue posteriormente demostrada, de manera que la actividad protein quinasa de esta enzima fue encontrada en M2-PK importada al núcleo en células tumorales, donde fosforila a la histona H3 (Yang et al., 2012) y a STAT3 (Gao et al., 2012), afectando a la activación de la transcripción. En la figura 5 se resume la evolución celular y las actividades de la M2-PK en células de mamíferos. Introducción 22 Figura 5. Efecto de diversos metabolitos y mecanismos reguladores en la estructura cuaternaria y actividades biológicas descritas para la proteína M2. Introducción 23 7. FUNCIÓN BIOLÓGICA DE LA PROTIMOSINA α El descubrimiento de que la ProTα era el precursor de las timosinas α hizo que, en principio, se le asignara una función relacionada con la actividad inmunorreguladora de estas proteínas (Low & Goldstein, 1985). En este sentido se realizaron ensayos que encontraron que poseía mayores efectos protectores frente a infecciones de microorganismos oportunistas que la Tα1 (Pan et al., 1986; Salvin et al., 1987), que sus niveles estaban disminuidos en ratones inmunodeprimidos (Low et al., 1990) y que mostraba características inmunopotenciadoras (revisado en Piñeiro et al., 2000). Sin embargo, estos efectos han sido atribuidos a mecanismos xenobióticos (Eschenfeldt et al., 1989), ya que las características de la síntesis de la ProTα, su amplia distribución y elevada concentración en diversos tipos celulares, su regulación estructural con proteínas nucleares acídicas, y los experimentos de migración al núcleo (Watts et al., 1989; Clinton et al., 1991; Manrow et al., 1991) apuntan hacia una función bioquímica intracelular de la ProTα en las células de mamíferos y descartan su supuesta función hormonal. Estas evidencias de una actividad intracelular de la ProTα se han fortalecido con la caracterización de una señal de localización nuclear en su extremo C-terminal (Rubsov et al., 1997), que demuestra necesariamente un cometido nuclear de esta proteína en células HeLa (Clinton et al., 1991), COS (Manrow et al., 1991), y 293 (Rubtsov et al., 1997). 7.1. RELACIÓN ENTRE LA PROTIMOSINA α Y LA PROLIFERACIÓN CELULAR El estudio de la expresión del gen de la ProTα fue importante para avanzar en el esclarecimiento de la función que esta proteína pudiera desempeñar en la actividad de las células. Las investigaciones de los niveles de expresión de la ProTα y de su mRNA en linfocitos mitóticamente activados (Gómez-Márquez et al., 1989; Franco et al., 1992; Eschenfeldt et al., 1989; Bustelo et al., 1991) y en diferentes poblaciones celulares (Eschenfeldt et al., 1989; Gómez-Márquez et al., 1989; Zalvide et al., 1992) demostraron una clara relación entre los niveles de expresión de la ProTα con la actividad proliferativa de estas células, con un incremento de la concentración del mRNA de esta proteína en células en división; sin embargo, este incremento era moderado en la mayoría de los tipos celulares estudiados (Bustelo et al., 1991). La correspondencia observada entre los niveles del mRNA de la ProTα y los niveles de la propia ProTα confirmaron la traducción activa del mensajero de la ProTα en los diferentes tejidos. Introducción 24 De esta manera, la expresión del gen de la ProTα en linfocitos con mayor capacidad proliferativa era superior a la que presentaban los linfocitos con menor capacidad para proliferar. Este resultado parecía establecer una dependencia entre los niveles de la concentración celular de la ProTα y la actividad proliferativa de las células. Esta consideración se vio confirmada por los experimentos en los que se analizó la variación de la expresión del gen de la ProTα en células en las que se indujo la actividad proliferativa in vitro e in vivo (Bustelo et al., 1991). Los elevados niveles de mRNA de la ProTα permanecen casi invariables a lo largo del ciclo celular, aunque se aprecia un incremento en el tránsito de G1-S; sin embargo, la expresión del gen no parece estar ligada a la síntesis de DNA (Bustelo et al., 1991). Este patrón ha sido corroborado por otros estudios en los que se determinaron los niveles del mRNA o de la ProTα (Zalvide et al., 1992; Vareli et al., 1996; Conteas et al., 1990; Rosón et al., 1990). No obstante, no hay evidencias de que la expresión de la ProTα regule directamente la mitosis, ya que la presencia de su mRNA no es suficiente para promover la progresión a lo largo del ciclo celular (Álvarez et al., 1993). La relación de la expresión de la ProTα con la proliferación celular también quedó señalada en experimentos de transfección en poblaciones celulares con un oligonucleótido antisentido complementario al mRNA de la ProTα, en los que se demuestra la paralización de la proliferación celular (Sburlati et al., 1991; Rodríguez et al., 1999). También en células HL-60 y NIH3T3 se observó que la sobreexpresión de la ProTα acelera la proliferación y retarda la diferenciación celular (Rodríguez et al., 1998; Wu et al., 1997); complementando los datos que demuestran que los elevados niveles del mRNA de la ProTα en las células en crecimiento logarítmico descienden cuando son inducidas a su diferenciación terminal (Smith et al., 1993; Dosil et al., 1993). El hallazgo de un incremento de la expresión del gen de la ProTα en células tumorales refuerza la relación de esta proteína con la proliferación celular (Eschenfeldt et al., 1986; Tsitsiloni et al., 1993; Gómez-Márquez et al., 1989b; Wu et al., 1997; Álvarez et al., 1993; Mori et al., 1993). Los linfocitos de pacientes con linfomas, células con una alta actividad mitótica, poseen unos niveles de mRNA de la ProTα 4-6 veces superiores a los de las células normales (Gómez-Márquez et al., 1989b; Conteas et al., 1990; Álvarez et al., 1993). Los detalles moleculares de la relación existente entre la expresión del gen de la ProTα y la proliferación celular comenzaron con el descubrimiento de la capacidad de c-myc, una Introducción 25 proteína involucrada en división la celular, para promover la transcripción del gen de la ProTα (Eilers et al., 1991; Gaubatz et al., 1994). Aunque este hallazgo fue cuestionado (Mol et al., 1995), posteriores resultados han confirmado el efecto de la proteína c-myc en la regulación de la expresión del gen de la ProTα (Wu et al., 1997; Mori et al., 1993; Vareli et al., 1995; Lutz et al., 1996; Kinoshita et al., 1997; Ben-Yosef et al., 1998). De todas estas aportaciones, puede deducirse que la función de la ProTα está relacionada con la actividad proliferativa de las células, y los resultados derivados son consistentes con la teoría de que la ProTα es necesaria para la división celular. Asimismo, la demostrada capacidad de la ProTα para migrar al núcleo y los datos que muestran que la actividad proliferativa celular es concomitante con un incremento de la concentración nuclear de la ProTα (Conteas et al., 1990) parecen indicar que la función de esta proteína en la división celular es realizada en el núcleo. 7.2. RELACIÓN DE LA PROTIMOSINA α CON LA ACTIVIDAD DE LA CROMATINA i. Interacción de la ProTα con las histonas La caracterización de proteínas que interaccionan con la ProTα en el núcleo de la célula ha propiciado progresos en la elucidación del mecanismo por el cual la ProTα está involucrada en el metabolismo nuclear. Así, las histonas son las proteínas nucleares cuya capacidad para interaccionar in vitro con la ProTα fue demostrada en primer lugar. Algunos estudios han indicado que la ProTα interacciona solo con la histona H1 (Papamarcaki & Tsolas, 1994), mientras que otros experimentos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que puede interactuar fuertemente las histonas H3, H4, H2A y H2B del octámero del nucleosoma (Díaz-Jullien et al., 1996; Covelo et al., 2006) mientras que con la histona H1 la interacción es mucho más débil (Freire et al., 2001; Díaz-Jullien et al., 1996). Los experimentos que indican la interacción de la ProTα con H1 no constituyen evidencias en contra de la interacción de esta proteína con otras histonas, ya que en estos casos no se habían realizado ensayos de inmunoprecipitación cruzada ni tampoco analizado la presencia de otras histonas en los componentes con afinidad por la ProTα. Así, la demostración de la capacidad de la ProTα para interactuar in vitro con las histonas constituyó un paso importante en la caracterización funcional de esta proteína. En la Introducción 26 interacción con estas proteínas, más fuerte con las histonas H3 y H4, se ve implicada tanto la región menos acídica de la ProTα, localizada en su extremo N-terminal, como la secuencia poliacídica (con Glu y Asp entre los residuos 41 y 85) situada en la parte central de su estructura (figura 1C). En este sentido, en nuestro laboratorio hemos encontrado que la Tα1, el péptido correspondiente a los 28 primeros aminoácidos de la secuencia de la ProTα, también se une in vitro a las histonas del octámero con gran afinidad (Díaz-Jullien et al., 1996), sugiriendo que esta región puede estar involucrada en la interacción in vivo de la ProTα con las histonas. Esta capacidad de interacción de la ProTα con las histonas, similar a la que presentan otras proteínas acídicas de función nuclear como N1 y N2 de Xenopus (Kleinschmidt & Franke, 1982), que también muestran una afinidad preferente por las histonas H3 y H4, SET (Seo et al., 2001; Kato et al., 2011), ANP32A (Seo et al., 2001, 2002; Matilla et al., 2005), ANP32B (Tochio et al., 2010) y otras proteínas de estructuras similares a la ProTα que han sido descritas en anfibios (Dingwall et al., 1987) y levaduras (Ishimi & Kikuchi, 1991), es muy significativa a la hora de establecer una relación funcional de esta proteína en el proceso de la organización estructural del cromosoma y, más concretamente, del ensamblaje del nucleosoma. En experimentos realizados en nuestro laboratorio se señaló una relación funcional para la interacción de la ProTα con las histonas core al demostrarse la capacidad de la ProTα para inducir el ensamblado de los nucleosomas in vitro (Díaz-Jullien et al., 1996). Esta capacidad es independiente de H1 y dependiente de otras proteínas separadas en extractos de linfocitos mediante cromatografía de afinidad sobre ProTα (afines también a ATP). Por otro lado, la capacidad de la ProTα para interactuar con las histonas está probablemente facilitada por su alta concentración intracelular, similar a la de las proteínas del octámero (aprox. una molécula de ProTα por nucleosoma) (Franco et al., 1992; Palvimo & Linnala-Kankkunen, 1990; Sburlati et al., 1990, 1993). ii. Participación de la ProTα en la actividad de la cromatina Otra aportación a la relación de la ProTα con el metabolismo nuclear se manifiesta en el estudio de la interacción de esta proteína con otras proteínas nucleares (Covelo et al., 2006), en el que además de corroborar la afinidad de la ProTα por las histonas core, se demuestra la interacción con un complejo nuclear multiproteico, separado por cromatografía de afinidad, cuyos componentes incluyen enzimas modificadoras de histonas como las Introducción 27 acetiltransferasas de H3 y H4 y la metiltransferasa de H3, proteínas de unión a RNA/DNA como las ribonucleoproteínas (hnRNPs) A3, A2/B1 y R y las DNA helicasas de tipo II (dependientes e independientes de ATP), y proteínas del citoesqueleto como la β-actina y la vimentina. La presencia de acetiltransferasas (HAT) y metiltransferasas (HMT) de histonas en este complejo sugiere una posible función de la ProTα en la modificación estructural de H3 y H4, las histonas más significativas en el control de la actividad de la cromatina. Esta teoría se ve reforzada por la capacidad de la ProTα para interaccionar con proteínas que se unen a HATs, como el antígeno nuclear del virus Epstein-Barr (EBNA3C) (Cotter & Robertson, 2000; Subramanian et al., 2002) y la proteína de unión a CREB (Karetsou et al., 2002) (ambas con afinidad por la acetiltransferasa p300). Otro trabajo realizado en nuestro laboratorio ha indicado que la ProTα interacciona con las proteínas PCNA, Cdk2, la ciclina A, cdc2, Cdk4, la ciclina B y las proteínas de transporte nuclear: la carioferina β1, Rch-1, Ran, y RCC1 (Freire et al., 2001). La bien documentada implicación de la proteína PCNA (Kelman et al., 1997) y de Cdk2 y la ciclina A (Fang & Newport, 1991; Cardoso et al., 1993) en la replicación del DNA sugieren la posibilidad de que la ProTα pueda estar implicada en la actividad de replicación de la cromatina y en el control del ciclo celular. Las características estructurales y funcionales de la ProTα sugieren que esta proteína forma parte del grupo de proteínas de mamíferos que interaccionan con histonas, proteínas acídicas, con las que la ProTα comparte una similitud estructural, que participan en mecanismos nucleares y citoplasmáticos, relacionados con la regulación de la cromatina y en algunos casos con la apoptosis. Son miembros de este grupo NAP1/NAP2 (Ishimi et al., 1987; Rodríguez et al., 2004), CAF-1 (Kaufman et al., 1995), SET (Seo et al., 2001; Fan et al., 2003), ANP32A (Seo et al., 2001, 2002; Fan et al., 2003; Jiang et al., 2003) y ANP32B (Tochio et al., 2010;Roth et al., 2001; Shen et al., 2010): estas proteínas han sido implicadas en la regulación de la transcripción, en la replicación del DNA y en el ensamblaje de los nucleosomas en las células de mamíferos. Además, la ProTα muestra una marcada homología estructural con proteínas de unión a histonas descritas en otros organismos, especialmente la nucleoplasmina de anfibios (Dingwall et al., 1987). La señal cariofílica en su extremo C-terminal, su larga región acídica central e incluso la propiedad de ser fosforilada son semejanzas que comparten la ProTα y estas proteínas de unión a histonas (Earnshaw, 1987). Ya que se ha demostrado que la nucleoplasmina y otras proteínas acídicas similares están involucradas en la movilidad del octámero de histonas dentro de la célula y en el remodelado de la cromatina (Philpott et al., Introducción 28 2000), es plausible que la ProTα tenga una función similar en las células de mamíferos. En este sentido, la participación de la ProTα en la organización estructural de la cromatina facilitaría la unión de las polimerasas de RNA y DNA favoreciendo la transcripción, la replicación y la reparación del DNA, de hecho, la ProTα colocaliza en el núcleo con la RNA polimerasa II activa (Enkemann et al., 2000; Vareli et al., 2000). Sin embargo, durante la mitosis, la ProTα permanece excluida del volumen ocupado por el DNA, probablemente para favorecer la condensación de éste (Enkemann et al., 2000). iii. Relación de la ProTα con la actividad transcripcional Más argumentos a favor de la relación de la ProTα con la actividad de la cromatina vienen determinados por la caracterización de otras proteínas que interactúan con ella: el antígeno nuclear del Epstein-Barr virus (EBNA3C), el coactivador de la transcripción CBP (proteína de unión a CREB), la acetiltransferasa de histonas p300, la oncoproteína SET, el factor de transcripción STAT3 y el represor del receptor de estrógeno (REA). La ProTα interacciona con el coactivador de la transcripción CBP in vivo e in vitro y estimula la transcripción génica a través de la reorganización de la estructura de la cromatina (Karetsou et al., 2002). El sitio de interacción ha sido mapeado en el extremo Nterminal de CBP (residuos 1-771) y en una región rica en glutámico de la ProTα. Evidencias experimentales muestran que la sobreexpresión de la ProTα potencia la actividad de transcripción de promotores dependientes de CBP como TRE y NF-KB; sin embargo, otro blanco de CBP, el promotor del gen de la clase II de MHC (Kretsovali et al., 1998), no se ve afectado por la ProTα (lo que indica que otros factores adicionales, el estado de la cromatina del promotor y/o la composición del complejo coactivador están implicados en el mecanismo) (Karetsou et al., 2002). Se ha postulado que el efecto de la ProTα en la transcripción mediada por CBP podría ser ejercido sobre el estado de la cromatina del promotor o sobre la actividad enzimática de la propia CBP (Martínez-Balbas et al., 1998). Por otra parte, se ha encontrado que la acetiltransferasa de histonas p300, una proteína con gran homología a CBP, se une a la ProTα a través de su región C-terminal (Cotter & Robertson., 2000) colocalizando en dominios subnucleares discretos, y sugiriendo la implicación de ésta última en la regulación de la transcripción y la acetilación de histonas. II. OBJETIVOS Objetivos 37 II. OBJETIVOS DEL PRESENTE TRABAJO Como queda reflejado en la descripción de las características de la actividad biológica de la ProTα presentadas en la Introducción de este trabajo, es clara su implicación en las actividades citoplasmática y nuclear de las células de mamíferos en procesos que especialmente influencian la vida celular. De manera que, interacciones de ProTα con diferentes proteínas propician en el citoplasma el control de la actividad apoptótica y en núcleo especialmente influencian la actividad proliferativa. Nuestra investigación y la de otros grupos ha permitido caracterizar algunas de las proteínas que participan en la actividad nuclear de la ProTα: histonas, enzimas modificadoras de histonas, factores de transcripción, ribonucleoproteínas, etc. Todas ellas confluyendo en distintas facetas de la actividad de la cromatina de las cuales son desconocidos los mecanismos moleculares mediante los cuales se produce la participación de la ProTα. Respecto a la actividad citoplasmática de la ProTα lo único hasta ahora establecido es su participación en la actividad apoptótica, que, como se ha indicado, parece relacionarse con su capacidad para la fosforilación y la interacción con componentes implicados en la actividad del apoptosoma. Pero tampoco son conocidos los mecanismos moleculares por lo que se produce esta y otras posibles actividades citoplasmáticas de la ProTα. En cualquier caso, sí es clara la importancia de la ProTα en el control de la supervivencia de las células de mamíferos al influir en su actividad proliferativa y participar en el control de su muerte mediante la apoptosis. Con todo ello, parece evidente que es necesario avanzar en el esclarecimiento de los mecanismos mediante los cuales la ProTα participa en las descritas actividades celulares. Con esta finalidad planteamos unos objetivos orientados a caracterizar interacciones con diferentes componentes celulares que nos ayuden a conocer los mecanismos de su función biológica. Las características estructurales de la ProTα, una proteína muy acídica y con una inmunogenicidad muy baja, dificulta el aislamiento y caracterización de complejos de esta proteína que reflejen la composición de los componentes que interaccionan con ella in vivo. Por ello, llevamos a cabo una estrategia basada en la posibilidad de estabilizar las interacciones proteína-proteína, induciendo la formación de enlaces cruzados covalentes, in vivo, en células Objetivos 38 de mamíferos. Usando para ello el formaldehido, un compuesto utilizado para estabilizar interacciones entre proteínas y entre proteínas y ácidos nucleicos, dada su fácil permeabilización celular y su capacidad para establecer enlaces cruzados reversibles entre componentes celulares sin distorsiones estereoquímicas. De acuerdo con esta estrategia, nos planteamos los siguientes objetivos: 1Poner a punto un protocolo para la inducción de enlaces cruzados con formaldehido en cultivos de linfocitos en proliferación, células en las que la expresión de la ProTα es más elevada. 2Establecidas las condiciones más favorables para la estabilización de complejos in vivo, por enlaces cruzados por formaldehido, procederemos a un fraccionamiento subcelular de los linfocitos tratados y a la identificación de posibles complejos en los que la ProTα esté presente. Llevando a cabo, para ello, la separación por SDS-PAGE de los diferentes fraccionados y al análisis por immunowesternblotting, usando anticuerpos que reconocen diferentes parte de la secuencia de la ProTα. 3A los complejos inmunoreactivos de la ProTα, localizados en los diferentes subfraccionados celulares y purificados por SDS-PAGE, se les analizará su composición por espectrometría de masas, para establecer las estructuras de las proteínas que pudieran estar interactuando con la ProTα. Los inmunoensayos con anticuerpos contra las proteínas caracterizadas nos permitirán confirmar su habilidad para interaccionar con la ProTα, bien en el citoplasma o el núcleo o en ambos, de los linfocitos en proliferación. 4Establecidas las interacciones de la ProTα en linfocitos en proliferación y con la intención de establecer su relación con las actividades celulares en las que se ha demostrado la implicación de la ProTα, procederemos a analizar la evolución de estas interacciones en células en la que se ha inducido un descenso de la actividad proliferativa y en células en la que se ha promovido la apoptosis. Utilizando para ello el mismo procedimiento que el indicado en el apartado 3. Esta experimentación debería contribuir a esclarecer los mecanismos moleculares por los que la ProTα se relaciona con la proliferación y la muerte de las células. III. MATERIAL Y MÉTODOS Material y Métodos 41 III. MATERIAL Y MÉTODOS 1. MATERIAL BIOLÓGICO..............................................................................................43 1.1. CÉLULAS..................................................................................................................43 1.2. ANTICUERPOS.........................................................................................................43 1.3. OTROS PRODUCTOS................................................................................................44 2. MATERIAL NO BIOLÓGICO........................................................................................45 2.1. MEDIOS DE CULTIVO..............................................................................................45 2.2. DISOLUCIONES Y TAMPONES.................................................................................45 2.3. OTROS PRODUCTOS................................................................................................46 3. MÉTODOS................................................................................................................48 3.1. CULTIVOS CELULARES.............................................................................................48 3.1.1.Condiciones de manipulación.........................................................................48 3.1.2.Inicio de cultivos celulares..............................................................................48 3.1.3.Mantenimiento de los cultivos celulares........................................................48 3.1.4.Análisis del número y viabilidad celular..........................................................49 3.1.5.Tratamiento con formaldehido.......................................................................49 3.1.6.Descenso de la actividad proliferativa celular................................................49 3.1.7.Inducción de la apoptosis celular....................................................................50 3.2. PREPARACIÓN DE EXTRACTOS CELULARES.............................................................50 3.2.1.Fraccionamiento subcelular............................................................................50 3.2.2.Lisis nuclear.....................................................................................................50 3.3. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO.........................................................51 3.4. ANÁLISIS ELECTROFORÉTICOS ...............................................................................51 Material y Métodos 42 3.5. PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS...........................................................................52 3.6. IMMUNOWESTERN BLOT.......................................................................................52 3.7. PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPLEJOS INMUNOREACTIVOS CON ANTI-ProTα.............................................................................................................54 3.8. ROTURA DE LOS ENLACES DE FORMALDEHIDO POR TRATAMIENTO TÉRMICO.....55 3.9. IDENTIFICACIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS SET, ANP32A Y ANP32B.....55 3.9.1. Identificación de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B..................................55 3.9.2. Electroelución de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B................................55 3.10. ESPECTROMETRÍA DE MASAS............................................................................56 3.11. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.......................................................................57 3.12. ISOELECTROENFOQUE.......................................................................................57 3.13. FPLC DE INTERCAMBIO IÓNICO.........................................................................57 3.14. CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN MOLECULAR...............................................58 3.15. ENSAYOS DE COINMUNOPRECIPITACIÓN..........................................................58 3.16. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD A ProTα..........................................................59 3.17. ENSAYOS DE INMUNOFLUORESCENCIA Y MICROSCOPÍA CONFOCAL...............60 3.18. ENSAYOS DE ACTIVIDAD APOPTÓTICA..............................................................61 3.18.1. Preparación de extractos de células Jurkat apoptóticas.......................61 3.18.2. Ensayos de actividad caspasa 9 y caspasa 3..........................................61 3.18.3. Extracción de DNA y electroforesis.......................................................62 Material y Métodos 43 III. MATERIAL Y MÉTODOS 1. MATERIAL BIOLÓGICO 1.1. CÉLULAS Células Jurkat: línea celular estable procedente de linfocitos T humanos. Células 293T: línea celular estable procedente de epitelio de riñón humano, que expresa el antígeno T del virus SV-40. 1.2. ANTICUERPOS ANTICUERPO ORIGEN EPITOPO APLICACIÓN/ENSAYO CONCENTRACIÓN Anti-NT-ProTα purificado (Neosystem) Conejo Extremo Nterminal de la ProTα (a.a. 121) Detección de la ProTα y complejos (western blot) Inmunoprecipitación de la ProTα Citolocalización de la ProTα (microscopía de inmunofluorescencia) 1,5 μg/ml 10 μg/mg de proteína total d: 1/2.000 Anti-CT-ProTα purificado (Neosystem) Conejo Extremo Cterminal de la ProTα (a.a. 95109) Detección de la ProTα y complejos (western blot) Inmunoprecipitación de la ProTα 1,5 μg/ml 10 μg/mg de proteína total Anti-SET (I2PP2A sc-25564 , Santa Cruz Biotechnology) Conejo Extremo Nterminal de SET (a.a. 1-120) Detección de SET y complejos ( western blot) Inmunoprecipitación de SET Citol ocalización de SET (microscopía de inmunofluorescencia) d:1/500 o 1/1.000 10 μg/mg de proteína total d: 1/250 Material y Métodos 44 ANTICUERPO ORIGEN EPITOPO APLICACIÓN/ENSAYO CONCENTRACIÓN Anti-ANP32A/B (ANP32A/B sc292113, Santa Cruz Biotechnology) Conejo Extremo Nterminal de ANP32B (a.a. 1163) Detección de ANP32A y ANP32B y complejos ( western blot ) Inmunoprecipitación de ANP32A y ANP32B Citolocalización de ANP32A y ANP32B (microscopía de inmunofluorescencia) d:1/500 o 1/.1000 10 μg/mg de proteína total d: 1/250 Anti-ANP32A (I1PP2A sc5652, Santa Cruz Biotechnology) Cabra Extremo Cterminal de ANP32A (a.a.231 - 249 ) Detección de ANP32A y complejos ( western blot) Inmunoprecipitación de ANP32A Citolocalización de ANP32A (microscopía de inmunofluorescencia) d:1/500 o 1/1.000 10 μg/mg de proteína total d: 1/250 Anti-conejo-HRP (2ario) (GE Healthcare BioSciences) Burro IgG western blot d: 1/5.000 Anti-cabra-HRP (2ario) (Sigma) Conejo IgG western blot d: 1/5.000 Anti-conejo - AlexaFluor-488 (2ario) (Invitrogen) Cabra Cadena pesada de la IgG Microscopía de inmunofluorescencia (emisión en verde) d: 1/5.000 Anti-cabra - AlexaFluor-594 (2ario) (Invitrogen) Burro Cadena pesada de la IgG Microscopía de inmun ofluorescencia (emisión en rojo ) d: 1/5.000 1.3. OTROS PRODUCTOS La ProTα fue purificada de timocitos de ternera siguiendo el protocolo descrito por Franco et al., 1992. Seroalbúmina bovina (BSA) (Merck) Material y Métodos 51 homogeneizaron en un potter y se incubaron durante 30 minutos a 25°C. Después, se realizó una segunda adición de DNasa y RNasa, se volvieron a homogeneizar y se incubaron 30 minutos a 25°C. El homogeneizado fue centrifugado (50.000xg, 15 minutos, 4°C) y el sobrenadante, el extracto nucleoplasmático, fue dializado en tripa de 12 kDa durante 24 horas frente a tampón de diálisis A. 3.3. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Alícuotas de los diversos extractos (de 20 a 25 mg) fueron separadas por cromatografía de intercambio iónico en una columna HiTrap Q HP (columna de intercambio aniónico de 1 ml -GE Healthcare-), siguiendo las indicaciones del fabricante. En resumen, la columna fue lavada y equilibrada con el tampón de equilibrado. La muestra una vez centrifugada (1.500xg, 10 minutos, 4°C) y filtrada (0,22 μm), se cargó en la columna, se recogió la fracción no retenida (NR) y se lavó la columna con 5 ml de tampón de equilibrado. A continuación, se realizó una elución discontinua con tampón conteniendo 0,2 M; 0,5 M y 1 M NaCl, con 5 ml de cada tampón. Las fracciones de estos eluatos con contenido proteico, determinado por absorbancia a 280nm, se juntaron y se denominaron fracción 0,2M; 0,5M y 1M respectivamente. Las fracciones NR; 0,2M; 0,5M y 1M fueron dializadas en tripa de 12 kDa de límite de exclusión durante 24 horas frente a tampón de diálisis B para su posterior concentración por liofilización. Las fracciones liofilizadas fueron resuspendidas en tampón 10 mM Tris-HCl pH7,6 y cuantificadas mediante el test de Bradford (Bradford, 1976). 3.4. ANÁLISIS ELECTROFORÉTICOS Alícuotas (del orden de 70 μg) de los diferentes extractos celulares y de los fraccionados de intercambio iónico de células tratadas y no tratadas con formaldehido fueron separadas por electroforesis en geles desnaturalizantes discontinuos de poliacrilamida (SDSPAGE), que constan de un gel concentrador del 4% de acrilamida y un gel separador del 15% o 8% de acrilamida, de dimensiones de 12x16 cm (Protean II. BIO-RAD) y un grosor de 0,75 mm. A las muestras a analizar se les añadió tampón de muestra, se hirvieron, menos las muestras de extractos de células tratadas con formaldehido para evitar la ruptura de los enlaces cruzados, y se microfugaron. La electroforesis fue llevada a cabo junto con marcadores de peso molecular (Precision Plus Protein Standards, All Blue. BIO-RAD) Material y Métodos 52 Para la tinción con Azul de Coomassie los geles fueron sumergidos en la disolución de Azul Brillante de Coomassie R-250 de 4 horas a toda la noche a 25°C, con agitación, pasado este tiempo se les añadió solución decolorante. 3.5. PURIFICACION DE ANTICUERPOS La purificacion de los anticuerpos anti-ProTα se realizó siguiendo el protocolo descrito por Harlow & Lane, 1988: los sueros anti-CT-ProTα y anti-NT-ProTα (NeoSystem) fueron centrifugados (3.000xg durante 30 minutos a 4°C) y se les añadió un volumen de solución saturada (4 M) de sulfato amónico (en agitación y mantenidos a temperatura ambiente durante 2 h). Después permanecieron durante 7 horas a 4°C y fueron centrifugados (3.000xg, 30 minutos, 4°C). Los sedimentos se secaron al aire 10 minutos y se resuspendieron en PBS en 1/2 del volumen inicial de suero. Finalmente, fueron dializados en tripas de diálisis de 12 kDa frente a PBS pH 7,4 a 4°C durante 24 horas. A continuación, fueron incubados con una matriz de afinidad ProTα-Sepharosa (como se describe en el punto 3.16) en tampón de equilibrado durante 24 horas a 4°C en agitación. Se cargaron en columnas y se lavaron con tampón de equilibrado y tampón de equilibrado conteniendo 0,5 M NaCl. Se llevó a cabo una primera elución con tampón de elución 1. Y seguidamente, se realizó un lavado con tampón de lavado y una segunda elución con tampón de elución 2. Las fracciones recogidas se combinaron y concentraron en Amicon (límite de exclusión de 10 kDa) a 3.000xg a 4°C en ciclos de 15 minutos. Cuando se alcanzó un volumen final en torno a 400-500 μl de eluido, se realizaron 5 ciclos de diálisis con 10 volúmenes de PBS. La concentración final de anticuerpos purificados anti-NT-ProTα y anti-CT-ProTα en los eluidos concentrados y dializados se determinó en base a su absorbancia a 280 nm. Finalmente se congelaron a -20°C hasta su uso. 3.6. IMMUNOWESTERN BLOT Alícuotas (del orden de 70 μg) de los diferentes extractos celulares y de los fraccionados cromatográficos de intercambio iónico fueron separadas por SDS-PAGE como se describe anteriormente. Material y Métodos 53 Los geles fueron transferidos a membranas de nitrocelulosa activadas para la retención de proteínas ácidas (Lauritzen et al., 1990). Brevemente, la activación se llevó a cabo mediante la incubación de la membrana de nitrocelulosa (0,2 μm) en una solución de 5% divinil sulfona y 10% dimetilformamida en 0,5 M NaHCO3/Na2CO3 pH 10 durante 1 hora a temperatura ambiente y en agitación suave; seguidamente, fue incubada 30 minutos en 1% dietilamina y, finalmente, tratada con 1% glutaraldehido en 0,5 M NaHCO3/Na2CO3 pH 10 durante 15 minutos. Tras el proceso, las membranas se lavaron en agua a 25°C durante 18 h. Las proteínas se transfirieron durante 12 horas a 45 mA constantes y 13 V a 4°C, en tampón acetato sódico 20 mM pH 4,5 (Karetsou et al., 1998; Covelo et al., 2006). Cuando fue necesario se realizó mediante transferencia estándar a membranas de nitrocelulosa (0,2 μm) siguiendo el protocolo de Towbin (1979) a 50V durante 2 horas. En ambos casos la inmunodetección se realizó según los protocolos estándar, utilizando TBS-T (TBST-2 para los anticuerpos anti-ProTα y TBST-1 para el resto de anticuerpos) para los lavados de las membranas y para los bloqueos e incubaciones con los anticuerpos específicos leche en polvo disuelta al 5% en TBS-T. Así, las membranas fueron bloqueadas e incubadas con los anticuerpos primarios, y secundarios conjugados con la enzima peroxidasa (HRP), a la concentración y tiempo que se indica a continuación: ANTICUERPO PRIMARIO ANTICUERPO SECUNDARIO Anti-CT-ProTα purificado (Neosystem) 1,5 μg/ml 4 horas/ 25°C. con agitación Anti-conejo-HRP (ECL Western blotting analisis system, GE healthcare) d: 1/5.000, 1h30´/25°C. Anti-NT-ProTα purificado (Neosystem) 1,5 μg/ml 4 horas/ 25°C. con agitación Anti-conejo-HRP (ECL Western blotting analisis system, GE healthcare) d: 1/5.000, 1h30´/25°C. Anti -SET ( Santa Cruz Biotechnology) d: 1/500 (Transferencia ácida) d: 1/1 .000 (Transf erencia estándar) 2 horas/25°C+2horas/4°C con agitación Anti-conejo-HRP (ECL Western blotting analisis system, GE healthcare) d: 1/5.000, 1h/25°C. Material y Métodos 54 ANTICUERPO PRIMARIO ANTICUERPO SECUNDARIO Anti-ANP32A/B (Santa Cruz Biotechnology) d: 1/500 (Transferencia ácida) d: 1/1 . 000 (Transferencia estándar) 2 horas/25°C+2horas/4°C con agitación Anti-conejo-HRP (ECL Western blotting analisis system, GE healthcare) d: 1/5.000, 1h/25°C. Anti-ANP32A (Santa Cruz Biotechnology) d: 1/500 (Transferencia ácida) d: 1/1 . 000 (Transferencia estándar) 2 horas/25°C+2horas/4°C con agitación Anti-cabra-HRP (Sigma) d: 1/5.000, 1h/25°C. El revelado de las membranas se realizó utilizando el kit ECL (Western blotting analisis system, GE Healthcare) siguiendo las instrucciones del fabricante, sobre una placa fotográfica (Medical X-Ray Film, Fujifilm), usando un revelador y fijador de Kodak (Kodak GBX Developer and Replenisher y Kodak GBX Fixer and Replenisher, respectivamente). 3.7. PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPLEJOS INMUNOREACTIVOS CON ANTIProTα Alícuotas de las fracciones 1M (del orden de 70 μg) de intercambio iónico de extractos de células tratadas con formaldehido fueron separadas por SDS-PAGE (15% acrilamida, 0,75 mm grosor) y teñidas con Azul de Coomassie, y paralelamente analizadas mediante western blot con anti-ProTα (mediante transferencia en condiciones específicas para proteínas ácidas como se describe en el punto 3.6). Después, se estableció la correspondencia entre los complejos detectados por immunowestern y las bandas de proteína visualizadas con Coomassie tomando como referencia los marcadores de peso molecular. Las bandas fueron cortadas del gel de acrilamida, lavadas con agua durante 2 horas a 25°C, y cargadas de nuevo en SDS-PAGE (15% acrilamida, 1 mm grosor) y teñidas con Azul de Coomassie o analizadas por immunowestern blot con anti-ProTα (mediante transferencia en condiciones específicas para proteínas ácidas como se describe en el punto 3.6). A continuación, las bandas inmunoreactivas fueron de nuevo cortadas del gel descartando impurezas, lavadas y analizadas mediante SDS-PAGE (15% Material y Métodos 55 acrilamida, 1,5 mm grosor) y tinción de Coomassie o immunowestern blot con anti-NT-ProTα, anti-CT-ProTα, anti-SET o anti-ANP32A/B (en condiciones específicas para proteínas ácidas). 3.8. ROTURA DE LOS ENLACES DE FORMALDEHIDO POR TRATAMIENTO TÉRMICO Las bandas de los complejos de la ProTα en el gel de acrilamida y de la propia ProTα purificadas como se describe en el apartado anterior fueron sometidas a tratamiento térmico para propiciar la ruptura de los enlaces cruzados del formaldehido. Las bandas fueron cortadas en dos fragmentos: uno de un tercio y otro de dos tercios. El fragmento de dos tercios fue tratado con 100 μl tampón de muestra Laemmli 1,5X y sometido a 100°C durante 90 minutos. El fragmento de un tercio fue utilizado como control y no se sometió a tratamiento térmico. Ambos fragmentos fueron cargados en un gel de SDSPAGE (15% de acrilamida, 1 mm grosor) y una vez terminada la electroforesis fueron teñidos con tinción de plata (Silver Stain Pluis Kit. BIO-RAD), siguiendo las indicaciones del fabricante. 3.9. IDENTIFICACIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS SET, ANP32A Y ANP32B 3.9.1. Identificación de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B Las proteínas SET, ANP32A y ANP32B fueron purificadas a partir de la fracción 1M de intercambio iónico de citoplasma de células Jurkat proliferantes no tratadas con formaldehido. Para ello, las proteínas de la fracción 1M (del orden de 70 μg) fueron separadas por SDS-PAGE (15% acrilamida, 0,75 mm grosor), teñidas con Coomassie, y cortadas las bandas de proteína correspondientes al tamaño molecular de SET, ANP32A y ANP32B. La identificación fue realizada mediante la separación por SDS-PAGE de alícuotas de las bandas, al igual que se hizo con los complejos de la ProTα, y visualizadas mediante tinción de Coomassie o analizadas por immunowestern blot con los anticuerpos anti-SET, anti-ANP32A y anti-ANP32A/B respectivamente (mediante transferencia en condiciones estándar como se describe en el punto 3.6). 3.9.2. Electroelución de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B Alícuotas (del orden de 70 μg cada una) de la fracción 1M de intercambio iónico de citoplasma de células Jurkat no tratadas con formaldehido fueron separadas por SDS-PAGE Material y Métodos 56 (15% acrilamida, 0,75 mm grosor) y teñidas con una disolución de cobre que marca la posición de las proteínas de manera reversible (Lee et al., 1987). El gel una vez acabada la electroforesis fue lavado brevemente con agua, incubado con la disolución de cobre (0,3 M CuCl2) durante 10 minutos y lavado de nuevo con agua. A continuación, las bandas de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B fueron cortadas, lavadas con 0,25 M Tris pH 9; 0,25 M EDTA para eliminar los restos de la tinción de cobre y utilizadas para la electroelución. Para la electroelución se siguieron las instrucciones del fabricante. Brevemente, las bandas (5 bandas de cada proteína) fueron cortadas en fragmentos de unos pocos milímetros, depositadas en los correspondientes tubos acoplados a una membranas de un poro de 12 kDa, electroeluidas con tampón de electroelución conteniendo 0,05% SDS en el cátodo y el mismo tampón sin SDS en el ánodo, durante 4 horas a 50 mA y 25°C, y finalmente electrodializadas en la misma carcasa de electroelución con el tampón sin SDS durante toda la noche a 20 mA y 4°C (Model 422 Electro-Eluter, BIO-RAD). Las proteínas ya electroeluidas fueron recogidas, concentradas por liofilización y estimadas sus concentraciones a partir de cantidades conocidas de BSA mediante un análisis densitométrico (software Quantity One de BIO-RAD) de un gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie. 3.10. ESPECTROMETRÍA DE MASAS Los complejos de la ProTα y las proteínas SET, ANP32A y ANP32B purificadas y contenidas en las bandas teñidas con Coomassie en geles de SDS-PAGE se analizaron mediante espectrometría de masas MS/MS en trampa iónica por nLC-ESI-Trampa (espectrómetro de masas AMAZON ETD de BRUKER), en el Servicio de Proteómica de la Universidad de Santiago de Compostela. Las bandas de los complejos de la ProTα se procesaron de dos formas diferentes previamente al análisis de espectrometría de masas. Así, las bandas de los complejos purificados y teñidos con Coomassie (punto 3.7) fueron cortadas en dos fragmentos iguales, uno antes del análisis de MS/MS se sometió a tratamiento térmico (a 100°C en 100 μl de agua MilliQ durante 90 minutos) para propiciar la ruptura de los enlaces de formaldehido previamente a la digestión con tripsina, y el otro fue sometido directamente al tratamiento con tripsina para su posterior análisis espectrométrico. Material y Métodos 57 Además, se analizaron por espectrometría de masas las diferentes bandas en que se desdoblan los complejos de la ProTα en células en proliferación después del tratamiento térmico, que se describe en el punto 3.8. Las bandas purificadas y teñidas con Coomassie de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B procedentes de extractos de células no tratadas con formaldehido se analizaron directamente por MS/MS. 3.11. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS La cuantificación de las proteínas inmunoreactivas con anti-ProTα, anti-SET, antiANP32A y anti-ANP32A/B en los diferentes fraccionados fue determinada mediante un análisis densitométrico (software Quantity One de BIO-RAD) de los respectivos immunowestern blot, utilizando como referencia los análisis densitométricos de blots de cantidades conocidas de las proteínas ProTα, SET, ANP32A y ANP32B analizadas en paralelo. 3.12. ISOELECTROENFOQUE El fraccionado 1M de intercambio iónico de extracto citoplasmático de células Jurkat proliferantes tratadas con formaldehido (200 μg por canal) fue separado por isoelectroenfoque. Este se llevó a cabo según lo descrito en trabajos previos (Franco et al., 1992). Brevemente, las muestras fueron aplicadas en láminas PAG con un rango de pH 3,0-9,0 (GE Healthcare BioSciences) y separada 2,5 horas (2000 V, 25 mA, 25 W), usando una LKB Multiphor isoelectric focusing cell temostatizada a 10°C. El gel de isoelectroenfoque fue fijado con ácido tricloroacético/sulfosalicílico y teñido con Azul Brillante de Coomassie G. 3.13. FPLC DE INTERCAMBIO IÓNICO Una alícuota (del orden de 8 mg) de extracto citoplasmático de células Jurkat tratadas con formaldehido fue cromatografiado mediante FPLC (Fast Protein liquid chromatography) en un aparato AKTA FPLC (Pharmacia) acoplado a una columna de intercambio iónico Mono Q de 5 ml (Pharmacia), siguiendo las indicaciones del fabricante. La cromatografía se realizó a un flujo constante de 1 ml/minuto. La columna fue lavada y equilibrada con el tampón de equilibrado. Después, la muestra fue centrifugada (1.500xg, 10 minutos, 4ºC), filtrada (0,22 Material y Métodos 58 μm) y cargada en la columna. Se recogió el volumen vacio y se lavó la columna con 5 ml de tampón de equilibrado. Finalmente, se realizó una elución continua con tampón de equilibrado conteniendo NaCl hasta una concentración final de 1 M, recogiéndose 70 fracciones de elución de 0,5 ml cada una. Alícuotas de las fracciones (60 μl) fueron separadas por SDS-PAGE (15% acrilamida) y teñidas con Coomassie (como se describe en el punto 3.4) o analizadas por immunowestern blot con anti-ProTα, anti-SET y anti-ANP32A/B (mediante transferencia en condiciones específicas para proteínas ácidas como se describe en el punto 3.6). 3.14. CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN MOLECULAR Alícuotas (del orden de 6 mg) de extracto citoplasmático de células Jurkat no tratadas con formaldehido fueron cromatografiadas en una columna Superdex 200 10/300 GL (Tricorn, High Performance Columns Amersham) en tampón de filtración molecular a un flujo de 0,45 ml/minuto. Se recogieron 19 fracciones de 1 ml hasta un volumen final de elución de 19 ml. Las últimas 10 fracciones fueron concentradas por liofilización, resuspendidas en agua (200 μl) y determinadas sus concentraciones por el test de Bradford (Bradford, 1976). Las fracciones concentradas (20 μg de cada una) fueron separadas por SDS-PAGE (15% acrilamida) y analizadas por immunowestern blot con anti-CT-ProTα, anti-SET y anti-ANP32A/B (mediante transferencia en condiciones específicas para proteínas ácidas como se describe en el punto 3.6). 3.15. ENSAYOS DE COINMUNOPRECIPITACIÓN Los ensayos de coinmunoprecipitación en extractos citoplasmáticos (2 mg) de células Jurkat no tratadas con formaldehido se realizaron con 20 μg de los anticuerpos anti-CT-ProTα, anti-SET, anti-ANP32A, anti-ANP32A/B y anticuerpo preinmune acoplados a proteína G inmovilizada en agarosa (20 mg) según el protocolo descrito por Harlow & Lane, 1988. Brevemente, el acoplamiento a proteína G-agarosa se llevó a cabo en PBS durante 1 h a 4°C con agitación suave. A continuación, los complejos anticuerpo-proteína G fueron lavados con tampón borato, se les añadió dimetilpimelimidato (DMP) a una concentración final de 20 mM en el mismo tampón para una unión covalente y se incubaron durante 30 minutos con agitación. Finalmente, la reacción de acoplamiento se detuvo mediante la incubación con 0,1 Material y Métodos 59 M Tris-HCl pH 8, seguida de 2 lavados con tampón NET y resuspensión en PBS. Los complejos fueron obtenidos por centrifugación a 420xg durante 1 minuto. En la inmunoprecipitación la muestra de extracto citoplasmático fue incubada primero con el anticuerpo preinmune acoplado a proteína G durante 2 horas a 4°C con agitación y a continuación, con el correspondiente anticuerpo (anti-CT-ProTα, anti-SET, anti-ANP32A y antiANP32A/B) durante toda la noche a 4°C con agitación suave. Pasado ese tiempo, la mezcla de incubación se centrifugó (420xg durante un minuto) y los sedimentos resultantes, junto con los obtenidos de la incubación con el anticuerpo preinmune, fueron lavados 2 veces con tampón NET y 2 veces con PBS (5 minutos a 25°C con agitación). Los inmunoprecipitados se eluyeron con 40 μl de tampón de muestra 1,5X; se calentaron a 100°C durante 5 min y se microfugaron. Los inmunocomplejos obtenidos y una alícuota (30 μg) del extracto citoplasmático fueron separados por SDS-PAGE (15% acrilamida) y analizados mediante immunowestern blot. Los inmunocomplejos precipitados con anti-CT-ProTα fueron inmunodetectados con los anticuerpos anti-SET, anti-ANP32A y anti-ANP32A/B (mediante transferencia en condiciones estándar), y los inmunoprecipitados con anti-SET, anti-ANP32A y anti-ANP32A/B fueron inmunodetectados con anti-CT-ProTα (mediante transferencia en condiciones específicas para proteínas ácidas como se describe en el punto 3.6). 3.16. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD A ProTα A la matriz de la columna de cromatografía Sepharosa 4B preactivada con CNBr se le acopló la ProTα purificada de timo de ternera (Franco et al., 1992) según el procedimiento recomendado por el fabricante a una concentración de 1 mg proteína/ml de matriz. La eficacia del acoplamiento, que fue determinada por ensayo colorimétrico de la proteína no ligada (Bradford, 1976), fue siempre superior al 85%. Una alícuota (15 mg) de extracto citoplasmático de células Jurkat no tratadas con formaldehido fue cromatografiada a través de 1 ml de matriz de ProTα-Sepharosa depositada en una columna y equilibrada en tampón de afinidad. Se recogió la fracción no retenida y se lavó la columna con el tampón afinidad conteniendo 0,15 M NaCl. Finalmente, la fracción de alta afinidad a la ProTα fue eluida con tampón de afinidad conteniendo 1 M NaCl, concentrada y dializada contra tampón de afinidad mediante centrifugación en concentradores Amicon (límite de exclusión de 10 kDa), y determinada su concentración por el test de Bradford (Bradford, 1976). Material y Métodos 60 Alícuotas de la fracción de alta afinidad a la ProTα y de extracto citoplasmático (50 μg de cada uno) fueron separadas por SDS-PAGE (15% acrilamida) y respectivamente analizadas por immunowestern blot con anti-SET, anti-ANP32A y anti-ANP32A/B (mediante transferencia en condiciones estándar como se describe en el punto 3.6). 3.17. ENSAYOS DE INMUNOFLUORESCENCIA Y MICROSCOPÍA CONFOCAL Para realizar los ensayos de inmunofluorescencia de las células Jurkat se siguió el protocolo de Tinari et al., 2008. Brevemente, las células (5·105) fueron centrifugadas (900xg, 5 minutos), lavadas con PBS y fijadas con 3,7% paraformaldehido en PBS (5 ml) durante 15 minutos a 25°C. Después, fueron lavadas 2 veces con PBS, resuspendidas en 20 μl PBS y depositadas sobe cubreobjetos previamente tratados con poli-L-Lisina (0,1 mg/ml). Después de 30 minutos a 25°C, fueron lavadas con PBS y permeabilizadas con 0,2% Tritón X-100 en PBS durante 2 minutos. Se lavaron de nuevo con PBS 3 veces y se incubaron con 3% BSA en PBS durante 1 hora a 25°C. Los anticuerpos primarios fueron diluidos en 3% BSA en PBS (ver tabla) y la incubación se llevó a cabo durante 1 hora a 25°C. Después de 4 lavados con PBS, se añadieron los anticuerpos secundarios diluidos en 3% BSA en PBS, incubándolos durante 45 minutos a 25°C en oscuridad. Los núcleos fueron teñidos con DAPI diluido (0,2 μg/ml) en la mezcla de incubación de los anticuerpos secundarios. Finalmente, se lavaron 2 veces con PBS, se añadió una gota de Mowiol 4-88 a los cubreobjetos y estos se montaron en el portaobjetos para su observación en un microscopio confocal espectral Leica TCS-SP2 con software Leica, y la captura de imágenes se realizó con una cámara Leica DFC 350 FX. Resultados 67 IV. RESULTADOS 1ESTABILIZACIÓN DE LAS INTERACCIONES TRANSITORIAS DE LA PROTα EN LINFOCITOS EN PROLIFERACIÓN MEDIANTE LA INDUCCIÓN DE ENLACES CRUZADOS CON FORMALDEHIDO El estudio de componentes celulares que forman parte de complejos resultantes de interacciones proteína-proteína débiles o transitorias es difícil de abordar únicamente con el uso de técnicas bioquímicas clásicas, dado que estos componentes pueden perderse en las condiciones de lavado usadas para eliminar las proteínas unidas inespecíficamente. Esto se puede evitar induciendo, previamente a la purificación de los complejos, la formación de enlaces covalentes entre sus componentes mediante el uso de moléculas co-enlazadoras (cross-linkers) que unan químicamente las proteínas de forma estable. Una de estas moléculas es el formaldehido. El formaldehido establece enlaces cruzados entre las proteínas a través de los grupos amino primarios de las lisinas y el nitrógeno del grupo amido del enlace peptídico. Además, presenta unas características que lo hacen útil para la identificación de interacciones proteínaproteína: 1. El formaldehido presenta una distancia corta de unión de solo 2Å, por lo que las proteínas que son ligadas deben de estar físicamente muy próximas. 2. Es permeable a las membranas celulares y bastante inespecífico, esto lo hace válido para la detección de un amplio rango de interacciones. 3. Es conocido que el formaldehido inactiva las enzimas casi inmediatamente a su adición a las células, manteniendo como si fuera una fotografía instantánea las interacciones que ocurren en el momento de la adición. 4. Una vez que la reacción de unión o cross-linking se completó, el producto puede ser sometido a condiciones no fisiológicas sin perder su estructura. 5. Las uniones o cross-links son reversibles, lo que permite un análisis posterior de los componentes del complejo. 6. El procedimiento de tratamiento de las células con formaldehido es simple. Por estos motivos se usó el formaldehido para la estabilización de las posibles interacciones de la ProTα con otras proteínas en células de mamíferos en proliferación. Resultados 68 El tratamiento con formaldehido para la formación de enlaces cruzados se realizó en células Jurkat, una línea celular de linfoma humano de células T, ya que, como se describe en la introducción, los linfocitos presentan una alta concentración de la ProTα. En el procedimiento se siguieron las indicaciones de trabajos previos en los que se llevaron a cabo experimentos similares para caracterizar interacciones entre proteínas, para luego analizar estos complejos por espectrometría de masas (Vasilescu et al., 2004; Huyen et al., 2004). Las células Jurkat en proliferación se incubaron con 1% de formaldehido (5·106 células/ml). A continuación, se lisaron las células para obtener los subfraccionados citosólico y nuclear, sus componentes fueron separados por SDS-PAGE y analizados, bien por tinción con Azul de Coomassie o determinada la presencia de la ProTα y de los posibles complejos de esta con otras proteínas por immunowestern blot. Esta inmunodetección se realizó usando dos anticuerpos policlonales anti-ProTα generados contra epitopos de su secuencia localizados en los segmentos Nterminal: anti-NT-ProTα (secuencia epitopo 1-21) y C-terminal: anti-CT-ProTα (secuencia epitopo 95-109) y purificados por afinidad a ProTα-Sepharosa (como se describe en Material y Métodos 3.5). La utilización de los dos anticuerpos facilita una mejor inmunocaracterización y conocimiento de los complejos de la ProTα, y por otra parte, el uso de estos anticuerpos va a permitir diferenciar la presencia de la Timosina α1 (Tα1) y de la propia ProTα en los complejos, puesto que el anticuerpo anti-CT-ProTα no detecta a la Tα1 (Sarandeses et al., 2003). Además, una cuestión a tener en cuenta en los experimentos de western blot es la dificultad para retener a la ProTα en las membranas habitualmente usadas en estos análisis, debido a su pequeño tamaño (12,5 kDa) y carácter acídico (pI 3,55). Por ello, para la búsqueda de complejos de la ProTα se utilizó, además del procedimiento habitual, el procedimiento descrito previamente para transferir la ProTα (Covelo et al., 2006). Así, se realizó una transferencia específica de los diferentes fraccionados a membranas de nitrocelulosa activadas mediante el tratamiento con 1% glutaraldehido (como se describe en Material y Métodos 3.6). La figura 1 muestra el resultado del análisis por SDS-PAGE de los componentes citoplasmáticos y nucleoplasmáticos de células tratadas y sin tratar con formaldehido, teñidos con Azul de Coomassie o analizados por immunowestern blot. Resultados 69 Figura 1. Análisis electroforético e immunowestern blot anti-ProTα de los componentes en extractos citoplasmáticos y nucleoplasmáticos de células Jurkat tratadas y no tratadas con formaldehido. Alícuotas de los extractos citoplasmáticos y nucleoplasmáticos de células Jurkat, tratadas o no tratadas con 1% formaldehido, fueron separados por SDS-PAGE (15% acrilamida) y teñidos con Azul de Coomassie o analizados por western blot con anti-CT-ProTα (transferencia en condiciones específicas para proteínas ácidas como se describe en Materiales y Métodos 3.6). Paralelamente se analizaron marcadores de peso molecular que se indican en kDa. La flecha indica la movilidad de la ProTα. En la tinción con Azul de Coomassie se puede ver que las células Jurkat tratadas con formaldehido, debido a la capacidad de este para formar complejos estables entre proteínas, presentan un patrón de los componentes celulares diferente a las células sin tratar, apreciándose una clara disminución del número de bandas de proteína, una variación de los pesos moleculares de las mismas y una acumulación de material proteico de alto peso molecular en la cabeza del gel, más destacable en el caso del nucleoplasma. Este material presente en la cabeza del gel teñido con Coomassie podría corresponderse con grandes agregados proteicos mayores de 250 kDa que no logran penetrar en el gel de un tamiz de acrilamida del 15%, pero lo mismo sucede con geles de un menor tamiz de acrilamida del 8% (datos no mostrados). Los resultados no mostraron variación en el patrón de bandas cuando utilizamos una mayor concentración de formaldehido de 2% (datos no mostrados). El análisis por immunowestern de estos extractos usando el anticuerpo anti-CT-ProTα revela que solo entre los componentes citoplasmáticos de células Jurkat tratadas con formaldehido se aprecian complejos inmunoreactivos con anti-CT-ProTα con una movilidad Resultados 70 inferior a la propia ProTα. Similar resultado se obtuvo utilizando el anticuerpo anti-NT-ProTα (datos no mostrados). Dado que este análisis se realizó en geles del 15% de acrilamida se repitió el experimento de immunowestern blot empleando geles del 8% de acrilamida, para lograr una mayor migración de posibles complejos de la ProTα de mayor peso molecular, que no fuesen detectados en las condiciones anteriores. Los resultados no mostraron nuevos complejos inmunoreactivos a anti-CT-ProTα ni a anti-NT-ProTα diferentes a los anteriores tanto en el citoplasma como en el nucleoplasma (datos no mostrados). En cuanto a la localización casi exclusivamente citoplasmática de la ProTα, especialmente en las células no tratadas y aparentemente también en las células tratadas con formaldehido, se ha demostrado que entre esta ProTα citosólica se incluye también y mayoritariamente la ProTα de ubicación nuclear, que con el proceso extractivo, aunque se mantengan unas cuidadas condiciones isotónicas, se produce un inevitable vertido en el citoplasma de la ProTα nuclear en todo tipo de células de mamíferos (Manrow et al., 1991; Enkeman et al., 2000; Covelo et al., 2006). Para progresar en el estudio de los posibles complejos inmunoreactivos a anti-ProTα, con la finalidad de lograr un enriquecimiento en la cantidad de estos complejos de la ProTα y para ver si aparecen otros nuevos no detectables por su baja concentración, procedimos a separar los componentes citoplasmáticos y nucleoplasmáticos por cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía se llevo a cabo mediante una elución secuencial con diferentes concentraciones de NaCl (0,2M; 0,5M y 1M) (como se describe en Material y Métodos 3.3). En el esquema de la figura 2 se resume el proceso de búsqueda de complejos de la ProTα con otras proteínas en células Jurkat. Resultados 71 Figura 2. Esquema del proceso de búsqueda de complejos proteína-proteína inmunoreactivos a anticuerpos anti-ProTα. Las concentraciones de proteína en los distintos extractos citoplasmáticos y nucleoplasmáticos de células Jurkat tratadas y sin tratar con formaldehido y sus fraccionados cromatográficos de intercambio iónico se presentan en la tabla 1. En la cuantificación se observa una notable diferencia en la concentración de proteína. El tratamiento con el formaldehido hace descender la concentración de la proteína soluble en un 60% en extractos citoplasmáticos y un 18% en nucleoplasmáticos. Diferencias que también se mantienen en los fraccionados de la cromatografía de intercambio iónico. Resultados 72 CONCENTRACIÓN (μg/106 células) EXTRACTO EXTRACTO NO FRACCIONADO FRACCIONES CROMATOGRAFÍA HiTrap Q NR 0.2 M 0.5 M 1 M Citoplasma (células sin tratar) 25,73±2,6 9,37±0,84 4,02±0,95 4,62±1,16 0,39±0,11 Citoplasma (células tratadas con formaldehido) 10,38±1,3 5,18±0,61 0,41±0,16 1,36±0,11 0,19±0,06 Nucleoplasma (células sin tratar) 9,58±1,8 1,98±0,23 1,18±0,17 2,34±0,57 0,10± 0,03 Nucleoplasma (células tratadas con formaldehido) 7,8±1,13 1,05±0,21 0,33±0,12 1,69±0,50 0,07±0,0 1 Tabla 1: Concentración de los fraccionados de las cromatografías de intercambio iónico HiTrap Q. Los subfraccionados celulares se cromatografiaron como se describe en Material y Métodos 3.3. La fracción NR es la fracción no retenida, y la 0,2M; 0,5M y 1M son las eluidas con tampón conteniendo la concentración indicada de NaCl. Todas las concentraciones se corresponden con medias±desviación típica de al menos cuatro experimentos diferentes. El resultado del análisis por immunowestern blot con anti-CT-ProTα de los diferentes fraccionados obtenidos en la cromatografía de intercambio iónico de los subfraccionados citosólicos y nucleares de las células Jurkat tratadas o sin tratar con formaldehido se muestra en la figura 3. Resultados 73 Figura 3. Análisis por immunowestern blot con anti-CT-ProTα de los fraccionados de intercambio iónico de extractos citoplasmáticos y nucleoplasmáticos de células Jurkat sin tratar y tratradas con formaldehido. A) Immunowestern blot anti-CT-ProTα de fraccionados de citoplasma. Alícuotas de los distintos fraccionados eluidos con tampón (NR) o con tampón conteniendo NaCl 0,2M; 0,5M y 1M de células Jurkat sin tratar (-) o tratadas (+) con formaldehido, fueron separadas por SDSPAGE (15% acrilamida) y analizadas por western blot con anti-CT-ProTα (transferencia en condiciones específicas para proteínas ácidas como se describe en Materiales y Métodos 3.6). El canal 1´ (derecha del panel superior) se corresponde con una imagen con menos tiempo de revelado de la fracción 1M. B) Immunowestern blot anti-CT-ProTα de fraccionados de nucleoplasma. Alícuotas de los distintos fraccionados eluidos con tampón (NR) o con tampón conteniendo NaCl 0,2M; 0,5M y 1M de células Jurkat sin tratar (-) o tratadas (+) con formaldehido, fueron separadas por SDSPAGE (15% acrilamida) y analizadas por western blot con anti-CT-ProTα (transferencia en condiciones específicas para proteínas ácidas como se describe en Materiales y Métodos 3.6). Paralelamente se analizaron marcadores de peso molecular que se indican en kDa. Resultados 74 De estos análisis se deduce la presencia de complejos inmunoreactivos al anticuerpo anti-CT-ProTα, especialmente ubicados en extractos citoplasmáticos, y se demuestra que la cromatografía de intercambio iónico fue muy eficaz en la concentración de los complejos, que se localizan exclusivamente entre los componentes más acídicos. Así, en la fracción 1M de citoplasma de células tratadas con formaldehido se observan siete complejos inmunoreactivos a anti-CT-ProTα en el rango de 50 kDa a 20 kDa, cuya visualización está favorecida en el canal 1´, correspondiente a un menor tiempo de revelado de los componentes eluidos con 1M NaCl. La presencia de estos complejos en la fracción 1M permite deducir que se tratan de complejos ácidos y por lo tanto las proteínas que acompañan a la ProTα pudieran ser también ácidas. Por el contrario, en el mismo análisis de las fracciones cromatográficas de nucleoplasma no se observa ningún complejo de la ProTα con movilidad inferior a 250 kDa, confirmándose lo observado en la figura 1. El análisis con el anticuerpo anti-NT-ProTα no reconoció nuevos complejos ni en el citoplasma ni en el nucleoplasma (datos no mostrados). Esta doble inmunodetección confirma la presencia de la ProTα en una serie de complejos solubles estabilizados por el formaldehido en células Jurkat en proliferación. Los mismos resultados se obtuvieron en el análisis por immunowestern blot con antiCT-ProTα y con anti-NT-ProTα de los fraccionados cromatográficos separados por SDS-PAGE en geles del 8% de acrilamida (datos no mostrados). No aparecieron nuevos complejos de mayor peso molecular tanto en las fracciones cromatográficas del citoplasma como del nucleoplasma que no pudiesen penetrar en el tamiz de un gel del 15% de acrilamida. Por otra parte, en análisis de immunowestern con una transferencia realizada en condiciones estándar, no acídicas, no aparecen nuevos complejos inmunoreactivos con antiCT-ProTα y con anti-NT-ProTα, y en los complejos de la ProTα en el rango de 35 kDa a 25 kDa se observa una mucha menor inmunoreactividad con los anticuerpos de la ProTα, probablemente por una menor eficiencia en la transferencia estándar (datos no mostrados). Resultados 75 2PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS COMPLEJOS INMUNOREACTIVOS CON ANTI-PROTα A continuación, iniciamos el estudio de los complejos solubles de la ProTα detectados mediante immunowestern blot en la fracción 1M de la cromatografía de intercambio iónico de citoplasma de células Jurkat tratadas con formaldehido. Primero, tratamos de establecer la correspondencia entre los complejos inmunodetectados y las proteínas presentes en los componentes de la fracción 1M separada por SDS-PAGE y teñida con Coomassie. En la figura 4A se presenta la correspondencia entre las bandas de proteínas teñidas con Coomassie (asignadas como C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 y C10) y los respectivos complejos de la ProTα inmunoreactivos según su movilidad electroforética. Para corroborar la correspondencia, las bandas indicadas en el gel teñido con Coomassie fueron fraccionadas en tres partes iguales y cada una separada por SDS-PAGE para una respectiva tinción con Coomassie o análisis por immunowestern blot con anti-CT-ProTα y anti-NT-ProTα. En la figura 4B se puede observar el resultado de este análisis, del que se deduce que de las diez bandas de proteína analizadas solo seis fueron inmunoreactivas con ambos anticuerpos (C2, C5, C6, C7, C8 y C9), mientras que las bandas C1, C3, C4 y C10 no presentaron inmunoreactividad, bien por su baja concentración o por una baja inmunoreactividad en la fracción 1M. De acuerdo a su movilidad a estos seis complejos inmunoreactivos con anti-ProTα les asignamos los siguientes tamaños moleculares aparentes: C2-40 kDa, C5-34 kDa, C6-30 kDa, C7-28 kDa, C8-25k Da y C922 kDa. Resultados 76 Figura 4. Análisis de las proteínas inmunoreactivas con anti-ProTα de la fracción 1M de intercambio iónico de citoplasma de células Jurkat tratadas con formaldehido. A) Identificación de las proteínas inmunoreactivas con anti-CTProTα Alícuotas de la fracción 1M del extracto citoplasmático de células Jurkat tratadas con formaldehido fueron separadas en paralelo por SDS-PAGE para su tinción con Coomassie o para su análisis por immunowestern blot con anti-CT-ProTα. Se indica la correspondencia entre las bandas de proteína teñidas con Coomassie (C1 a C10) con los complejos del immunowestern. B) Purificación de las proteínas inmunoreactivas con anti-ProTα Fragmentos de las bandas cortadas del gel teñido con Coomassie fueron separados por SDS-PAGE, teñidos con Coomassie o analizados por immunowestern blot con anti-CT-ProTα o anti-NT-ProTα (como se describe en Material y Métodos 3.7). Para continuar con el estudio de los complejos se trató de determinar si las bandas inmunoreactivas con anti-ProTα se correspondían con complejos proteínicos estabilizados por el tratamiento con formaldehido, incluyendo en este análisis la banda con la movilidad de la ProTα en la fracción 1M. Para ello, alícuotas (dos tercios) de las bandas fueron sometidas a tratamiento térmico para propiciar la ruptura de los enlaces cruzados del formaldehido y separadas por SDS-PAGE. Alícuotas (un tercio) de las mismas bandas sin tratamiento térmico fueron paralelamente separadas por SDS-PAGE en los mismos geles. Resultados 83 abundancia relativa de los diferentes complejos solubles de la ProTα presentes en la fracción 1M de extractos citoplasmáticos. Figura 7. Cuantificación de la ProTα en células Jurkat tratadas y no tratadas con formaldehido. A) Concentración de la ProTα en los extractos citoplasmáticos y nucleplasmáticos de células Jurkat tratadas y no tratadas con formaldehido. El análisis densitométrico fue llevado a cabo como se describe en Material y Métodos 3.11. B) Concentración relativa de la ProTα en células Jurkat tratadas y no tratadas con formaldehido Concentraciones relativas al contenido total de la ProTα de la ProTα libre y ligada en complejos solubles en células tratadas con formaldehido. Analizadas tal como se indica en el panel A. C) Concentraciones relativas de los complejos solubles de la ProTα de la fracción 1M de extractos citoplasmáticos. La concentración de cada complejo de la ProTα fue relativizada a la concentración total de los complejos y representada en porcentaje. Los valores son medias±desviación típica de cuatro análisis diferentes. Resultados 84 Estos datos confirman la predominante presencia de la ProTα en extractos citosólicos, debida a la descrita movilización al citoplasma de la ProTα nuclear durante el proceso extractivo en todo tipo de células, aún en condiciones isotónicas (Manrow et al., 1991; Enkeman et al., 2000; Covelo et al., 2006). El tratamiento con formaldehido provoca la disminución de más de la mitad de la ProTα total, probablemente atrapada en complejos nucleares insolubles. Del resto, la mayoría de la ProTα está libre (33%) y solo un 10% se corresponde con la ProTα ligada a los seis complejos descritos de preferente localización citoplasmática. Refiriéndonos a estos complejos, sobresale la abundancia relativa de los complejos 30 kDa y 28 kDa que representan un 53% y contienen las proteínas ANP32A y ANP32B, que también están presentes en el complejo 34 kDa (14%) y 25 kDa (8%), los cuales destacan sobre los complejos 40 kDa y 22 kDa, que contienen la proteína SET y suman un 25% del total de los complejos de la ProTα. El conjunto de estos resultados demuestra que solo una parte del contenido celular de la ProTα está implicada en las interacciones para constituir los complejos caracterizados, y, dadas las características de las proteínas presentes en estos complejos, estas interacciones parecen relacionarse con una función citoplasmática de la ProTα, especialmente relacionada con las actividades de SET, ANP32A y ANP32B. 3ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES IN VIVO DE LA PROTα CON LAS PROTEÍNAS SET, ANP32A Y ANP32B Para avanzar en la caracterización de las interacciones de la ProTα con las proteínas SET, ANP32A y ANP32B investigamos el comportamiento de estas proteínas en diferentes extractos de células Jurkat. Primero, analizando las capacidades de co-purificación de la ProTα con estas proteínas en extractos citoplasmáticos de linfocitos en separaciones cromatográficas, para después, pasar a demostrar la capacidad de coinmunoprecipitación y de afinidad a ProTα de SET, ANP32A y ANP32B, así como la localización celular de estas proteínas. 3.1Estudio de la co-purificación cromatográfica En primer lugar, se investigó el comportamiento de SET, ANP32A, ANP32B y de la propia ProTα en extractos citoplasmáticos y nucleoplasmáticos de células Jurkat tratadas y sin tratar con formaldehido realizando una cromatografía de intercambio iónico (como se describe Resultados 85 en Material y Métodos 3.3). Los diferentes fraccionados cromatográficos fueron analizados por immunowestern blot con los anticuerpos policlonales anti-SET y anti-ANP32A/B capaz de reconocer a ANP32A y ANP32B. El resultado se presenta en la figura 8. Figura 8. Análisis por immunowestern blot anti-SET y anti-ANP32A/B de los fraccionados de intercambio iónico de extractos citoplasmáticos y nucleoplasmáticos de células Jurkat sin tratar y tratradas con formaldehido. Alícuotas de los fraccionados de citoplasma y nucleoplasma eluidos con tampón (NR) o con tampón conteniendo NaCl 0,2M, 0,5M y 1M de células Jurkat sin tratar (-) o tratadas (+) con formaldehido, fueron separadas por SDS-PAGE (15% acrilamida) y analizadas por western blot con anti-SET y antiANP32A/B (transferencia en condiciones específicas para proteínas ácidas como se describe en Materiales y Métodos 3.6). Paralelamente se analizaron marcadores de peso molecular que se indican en kDa. En los blots se puede apreciar como la proteína SET en las células no tratadas con formaldehido tiene exclusivamente una localización citoplasmática. Dada su prominente función nuclear (Kato et al., 2011; Seo et al., 2001), puede ser, como ocurre con la ProTα, que su exclusiva localización citoplasmática se debiera a un vertido del núcleo al citosol durante el proceso extractivo. En cambio, las proteínas ANP32A y ANP32B en los extractos de células Jurkat no tratadas con formaldehido presentan una localización citoplasmática y nuclear, aunque la cuantificación de estas proteínas en los immunowestern blot indica que en el citoplasma la concentración de ambas es 20 veces superior a la del núcleo. Resultados 86 Además, se puede observar la co-purificación, en las fracciones 1M, de las proteínas SET, ANP32A yANP32B entre los componentes más acídicos de los extractos de las células Jurkat, lo que, tal como se muestra en la figura 3, implica también una co-purificación con parte del contenido celular de la ProTα. Del análisis de la figura 8 se deduce la coincidencia entre las movilidades de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B libres, de células no tratadas con formaldehido, con componentes inmunoreactivos con anti-SET y anti-ANP32A/B de las fracciones 1M de células tratadas, que a su vez, presentan movilidades coincidentes con complejos de la ProTα: 40 kDa, 30 kDa y 28 kDa. Coincidencia que pasamos a estudiar. Para ello, nos propusimos purificar las proteínas SET, ANP32A y ANP32B entre los componentes acídicos que co-purifican en las fracciones eluidas con 1M NaCl en los extractos citoplasmáticos de células no tratadas con formaldehido, para compararlas con los componentes en la misma fracción 1M de citoplasma de células tratadas con formaldehido. Estos fraccionados fueron separados por SDS-PAGE y teñidos con Azul de Coomassie (Figura 9A). Las bandas del fraccionado 1M de las células sin tratar con formaldehido en el entorno de las movilidades de 40 kDa y 30-25 kDa marcadas con un asterisco en el panel A de la figura 9 (zonas de inmunoreactividad positiva con anti-SET y anti-ANP32A/B de la figura 8) fueron cortadas, purificadas y electroeluidas como se indica en Material y Métodos 3.9. Alícuotas de estas fueron separadas por SDS-PAGE y teñidas con Azul de Coomassie o analizadas por immunowestern blot con anti-SET, ANP32A y anti-ANP32A/B. El resultado de este análisis, indicado en la figura 9B, junto con la espectrometría de masas de estas bandas (datos no mostrados) permitió identificar a las proteínas purificadas como SET, ANP32A y ANP32B con unas movilidades respectivas de: 40 kDa, 30 kDa y 28 kDa. Como se deduce de la figura 9A, las movilidades de estas proteínas coinciden respectivamente con las de los complejos de la ProTα: C2-40 kDa, C6-30 kDa y C7-28 kDa. El análisis por immunowestern blot de los seis complejos de la ProTα indicados en la figura 9A, obtenidos por escisión de las bandas de dicho gel, usando anticuerpos anti-SET y antiANP32A/B, mostrado en la figura 9C, confirmó la coincidencia de las movilidades de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B libres con los complejos: C2-40 kDa, C6-30 kDa y C7-28 kDa, respectivamente. Además, se confirma la presencia de SET en el complejo C9-22 kDa y de ANP32A y ANP32B en el complejo C8-25 kDa, así como una débil señal de ANP32A en el complejo C5-34 kDa, lo que coincide con los resultados de la espectrometría de masas. Estos resultados indican que la separación electroforética hace indistinguible la movilidad de las Resultados 87 proteínas SET, ANP32A y ANP32B libres, no enlazadas a la ProTα, de las que, respectivamente, aparecen unidas a ProTα en los complejos C2-40 kDa, C6-30 kDa y C7-28 kDa. Figura 9. Purificación e identificación de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B en fracciones de células Jurkat sin tratar y tratadas con formaldehido. A) Análisis de la movilidad electroforética de los fraccionados 1M de citoplasma de células Jurkat sin tratar y tratradas con formaldehido. Alícuotas de los fraccionados 1M de citoplasma de células sin tratar (-) y tratadas (+) con formaldehido fueron separadas por SDS-PAGE y teñidas con Azul de Coomassie. En la fracción 1M (-) se indica con un asterisco la región cuyas bandas coinciden con la movilidad de SET, ANP32A y ANP32B. En la fracción 1M (+) se señalan las bandas de los complejos de la ProTαidentificados. Paralelamente se analizaron marcadores de peso molecular que se indican en kDa. B) Análisis de las bandas de la misma movilidad que SET, ANP32A y ANP32B purificadas por electroforesis. Las bandas de las proteínas del gel de 1M (-) del panel A indicadas con asterisco se cortaron y sus proteínas se obtuvieron por elución electroforética. Alícuotas de estas proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y teñidas con Azul de Coomassie (panel superior) o analizadas por immunowestern blot con anti-SET, anti-ANP32A o anti-ANP32A/B respectivamente (panel inferior) (como se describe en Material y Métodos 3.9). C) Análisis de las bandas de los complejos de la ProTα por immunowestern blot con anti-SET y antiANP32A/B. Las bandas de proteína asignadas como complejos de la ProTα en el gel 1M (+) en el panel A se cortaron. Alícuotas de cada banda fueron separadas por SDS-PAGE y analizadas por immunowestern con anti-SET (panel superior) o anti-ANP32A/B (panel inferior) (como se describe en Material y Métodos 3.7). Resultados 88 Llevamos a cabo, a continuación, un intento para separar y diferenciar las proteínas SET, ANP32A y ANP32B de sus complejos con la ProTα. Para esto se realizó una separación de estos componentes en extractos citoplasmáticos de células Jurkat tratadas con formaldehido por isoelectroenfoque (como se describe en Material y Métodos 3.12). El análisis no dio resultado, debido al muy bajo y estrecho rango de pI de estas proteínas (ProTα: pI 3,5; SET: pI 4,1; ANP32A: pI 3,8 y ANP32B: pI 3,8) (datos no mostrados). Aparentemente el elevado carácter acídico de estas proteínas y de la propia ProTα no solo altera el tamaño molecular aparente de los complejos de la ProTα, tal como refleja su movilidad electroferética, si no que también dificulta su separación cromatográfica. En otro intento para separar y diferenciar estas proteínas de sus complejos procedimos a separar por FPLC de intercambio iónico mediante elución continua con NaCl un extracto citoplasmático de células tratadas con formaldehido. Alícuotas de las diferentes fracciones se analizaron por SDS-PAGE y se tiñeron con Azul de Coomassie o bien por immunowestern blot usando los anticuerpos anti-ProTα, anti-SET y anti-ANP32A/B. El resultado de este análisis se presenta en la figura 10. El panel A muestra el diagrama de elución por FPLC de un extracto citoplasmático de células Jurkat tratadas con formaldehido. En el panel B se recoge la separación por SDS-PAGE y tinción de Coomassie de alícuotas de las fracciones. De este análisis se deduce que los componentes con la movilidad electroforética de los complejos de la ProTα (ver figura 9A), cuyas posiciones se indican en el margen del panel B, eluyen entre los 17 y 23 ml. En los paneles C y D se presentan los análisis por immunowestern blot de las respectivas fracciones con anti-SET (panel C) y anti-ANP32A/B (panel D), los cuales indican la presencia esperada de SET en los complejos C2 y C9, y de ANP32A y ANP32B en los componentes marcados como C6 y C7. El immunowestern blot con anti-ProTα de los 17 a 23 ml (datos no mostrados) confirmó también la presencia de la ProTα entre los componentes con movilidad de C2, C6, C7 y C9. Por lo tanto, estos resultados nos indican que la cromatografía de alta resolución no permite tampoco separar entre si los componentes más acídicos de las células tratadas con formaldehido que coinciden con los principales complejos en los que se caracterizó la presencia de la ProTα con la proteína SET (C2 y C9) y con ANP32A y ANP32B (C6 y C7). Además, no se observa diferencias entre las movilidades de SET, ANP32A y ANP32B nativas, que puedan considerarse indistinguibles de las de sus complejos con la ProTα. Resultados 89 Figura 10. Análisis de la cromatografía de FPLC de intercambio iónico del citoplasma de células Jurkat tratadas con formaldehido. Una alícuota de citoplasma de células Jurkat tratadas con formaldehido fue separada por FPLC y su diagrama de elución se muestra en el panel A. Alícuotas de las fracciones cromatográficas recogidas fueron separadas por SDS-PAGE y teñidas con Coomassie (panel B) o analizadas por immunowestern blot con anti-SET (panel C) y anti-ANP32A/B (panel D) como se describe en Material y Métodos 3.13. Paralelamente se analizaron marcadores de peso molecular que se indican en kDa. Con todo ello, dos posibilidades pueden explicar el comportamiento de las movilidades electroforéticas de SET, ANP32A y ANP32B; que en las células tratadas con formaldehido no son detectables estas proteínas en estado libre y las detectables están unidas en los complejos con la ProTα, o bien las proteínas libres presentan las mismas movilidades que C2-40 kDa, C630 kDa y C7-28 kDa. Resultados 90 Para contribuir a resolver esta cuestión y para confirmar las interacciones de la ProTα con SET, ANP32A y ANP32B realizamos experimentos en los que analizamos el comportamiento de estas proteínas en células Jurkat no tratadas con formaldehido. En primer lugar, separamos por filtración molecular de alta presión los componentes citoplasmáticos de células Jurkat no tratadas con formaldehido. El resultado de esta cromatografía en la que se hizo un seguimiento de la elución de la ProTα, SET, ANP32A y ANP32B mediante immunowestern blot de alícuotas de las diferentes fracciones, usando los anticuerpos anti-ProTα, anti-SET y anti-ANP32A/B, se presenta en la figura 11. De él se desprende que una parte del contenido celular de la ProTα en el citoplasma de células Jurkat coeluye con SET, ANP32A y ANP32B, principalmente entre los componentes de tamaño molecular en el rango de los 35 kDa-40 kDa, con un participación similar de las cuatro proteínas. En una proporción mucho menor se aprecia una coelución de la ProTα y SET entre los componentes del orden de los 150 kDa. Estos resultados parecen indicar que, además de la demostrada participación de una pequeña parte del contenido celular de la ProTα en los complejos (ver figura 7), solo una parte de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B parece participar en la formación de los complejos con la ProTα. Resultados 91 Figura 11. Análisis de la cromatografía de filtración molecular del citoplasma de células Jurkat no tratadas con formaldehido. El panel A muestra el patrón de elución de los marcadores de peso molecular indicados en la figura. Alícuotas de las fracciones indicadas fueron analizadas mediante immunowestern blot con anti-CTProTα, anti-ANP32A/B y anti-SET (panel B) como se describe en Material y Métodos 3.14. 3.2.- Cuantificación de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B libres y asociadas en los complejos Una importante cuestión a resolver en el estudio de las interacciones de la ProTα con SET, ANP32A y ANP32B es establecer las concentraciones celulares de estas proteínas, para así, poder ponderar las proporciones de estas proteínas que pudieran interaccionar con la ProTα. Con el mismo procedimiento seguido para cuantificar la ProTα libre y ligada a los complejos Resultados 92 (presentado en la figura 7) llevamos a cabo una cuantificación de SET, ANP32A y ANP32B mediante el análisis densitométrico de los immunowesterns de fraccionados de células Jurkat sin tratar y tratadas con formaldehido similares al presentado en la figura 8, en los que se analizaron paralelamente cantidades conocidas de estas proteínas identificadas como se indica en la figura 9B, y recuperadas y concentradas por electroelución (como se describe en Material y Métodos 3.9.2). En la figura 12 se presenta el histograma en el que se resume la cuantificación de estas proteínas en las células Jurkat en proliferación. De acuerdo con estos datos, aunque las concentraciones de SET, ANP32A y ANP32B son del orden de un 40% inferiores a la de la ProTα, los contenidos celulares de SET (67 ng/106 células), de ANP32A (62 ng/106 células) y de ANP32B (60 ng/106 células) son elevados, como corresponde a sus capacidades multifuncionales. Su papel similar al de la ProTα, de proteínas chaperonas de histonas con predominante localización nuclear (Kato et al., 2011; Matilla & Radrizzani, 2005; Tochio et al., 2010) es el principal responsable de la abundante presencia de estas proteínas, especialmente en células de mamíferos en proliferación. Las elevadas concentraciones de las histonas core propician, por tanto una abundante presencia de estas proteínas ácidas implicadas en su movilidad y actividad celular. A juzgar por la distribución de estas proteínas en los extractos celulares, estas parecen comportarse como la ProTα. Es decir, se produce una salida del contenido nuclear de estas proteínas como consecuencia de su elevada permeabilidad a través de la membrana nuclear, acrecentada con el proceso extractivo. Las características estructurales de SET, ANP32A y ANP32B con señales cariofílicas (Kato et al., 2011; Matilla & Radrizzani, 2005; Tochio et al., 2010) y con una gran región acídica central como indica su secuencia (figura 6), las asemeja a la ProTα y a su comportamiento en los extractos celulares. Como se muestra en la figura 12B, las concentraciones de SET, ANP32A y ANP32B que aparecen, bien libres o ligadas a complejos solubles después del tratamiento con formaldehido de las células Jurkat, es similar en las tres proteínas (en el rango de 45-34 ng/106 células) y del mismo orden que la concentración encontrada de la ProTα. Concentraciones que se corresponden principalmente con su contenido citoplasmático. Dada esta cuantificación y de acuerdo con la demostrada participación de parte del contenido celular de la ProTα en la formación de los complejos y lo encontrado en el experimento de la filtración molecular, parece que también solo una parte de las proteínas Resultados 99 molecular con otras proteínas nucleares implicadas en la remodelación de la cromatina, justificaría el alto porcentaje de la ProTα encontrado en forma insoluble, así como, de SET, ANP32A y ANP32B, debido a la magnitud y masa molecular aparente de los complejos estabilizados por el formaldehido que forman estas proteínas con las histonas y otras proteínas relacionadas con su actividad nuclear, tal como demostramos con la ProTα (Covelo et al., 2006). En este sentido no se puede descartar que otros complejos de la ProTα de localización citoplasmática pudieran no ser detectadas por las mismas circunstancias. Resultados 100 Figura 15. Estudio de la localización subcelular de la ProTα, SET, ANP32A y ANP32B en células Jurkat mediante microscopía de inmunofluorescencia. Las células Jurkat fueron fijadas y sometidas a inmunofluorescencia indirecta con los anticuerpos antiNT-ProTα (verde), anti-ANP32A/B (verde), anti-ANP32A (rojo) y anti-SET (verde) como se describe en Material y Métodos 3.17. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). La imagen merge consiste en una superposición de las otras 2. Cada experimento se realizó, al menos, 3 veces y las células mostradas en las imágenes son representativas de los efectos observados para las condiciones ensayadas. Resultados 101 4ESTUDIO DE LA TRANSCENDENCIA BIOLÓGICA DE LAS INTERACCIONES DE LA PROTα CON LAS PROTEÍNAS SET, ANP32A Y ANP32B A fin de conocer la transcendencia que en la actividad celular pudieran tener las interacciones de la ProTα que hemos caracterizado en células en proliferación investigamos la evolución de estas interacciones. Primero, en células en las que se ha inducido el descenso de la actividad proliferativa por privación de suero en el medio de cultivo, y luego en células en las que se ha promovido la apoptosis, dado que la función citoplasmática descrita para la ProTα se relaciona con su implicación en este proceso (Jiang et al., 2003, Qi et al., 2010). 4.1Estudio de las interacciones de la ProTα en células con baja actividad proliferativa Las células Jurkat en proliferación (1-1,5·106 células/ml) fueron mantenidas en medio de cultivo sin suero durante 60 horas para reducir su actividad proliferativa (como se describe en Material y Métodos 3.1.6), al cabo de las 60 horas el crecimiento celular se detiene casi totalmente y el número de células se estabiliza (1,5-1,7·106 células/ml). Después, las células fueron tratadas con formaldehido y lisadas para obtener los componentes citoplasmáticos y nucleoplasmáticos, para su análisis por immunowestern blot con anti-CT-ProTα. El resultado de este análisis que se muestra en la figura 16A indica, como en las células en proliferación, una localización predominantemente citoplasmática de la ProTα y de sus complejos estabilizados por el formaldehido. A continuación, como se hizo con los extractos de las células en proliferación, se procedió a la separación de los extractos celulares mediante cromatografía de intercambio iónico con elución discontinua. Los distintos fraccionados recogidos fueron separados por SDSPAGE y teñidos con Azul de Coomassie o analizados por immunowestern blot con anti-CTProTα. En este análisis los fraccionados de nucleoplasma no mostraron complejos inmunoreactivos con anti-ProTα (datos no mostrados), mientras que en los fraccionados de citoplasma, presentados en la figura 16B, se observa la presencia de complejos inmunoreactivos con anti-CT-ProTα entre los componentes más ácidicos, en la fracción 1M, con una movilidad electroforética similar a los complejos caracterizados en células en proliferación. El anticuerpo anti-NT-ProTα inmunodetectó los mismos complejos en el citoplasma y ninguno en el nucleoplasma al igual que con anti-CT-ProTα (datos no mostrados). Seguidamente, procedimos a purificar e identificar los componentes inmunoreactivos con antiProTα. Resultados 102 Figura 16. Análisis de los extractos citoplasmáticos y nucleoplasmáticos de células Jurkat con baja actividad proliferativa tratradas con formaldehido. A) Immunowestern blot con anti-CT-ProTα de los subfraccionados celulares. Alícuotas de citoplasma y nucleoplasma crudo de células Jurkat tratadas con formaldehido fueron separadas por SDS-PAGE (15% acrilamida) y analizadas por western blot con anti-CT-ProTα (transferencia en condiciones específicas para proteínas ácidas como se describe en Materiales y Métodos 3.6). B) Análisis de los fraccionados cromatográficos de intercambio iónico de extractos citoplasmáticos. Alícuotas las fracciones eluidas con tampón (NR) o con tampón conteniendo NaCl 0,2M, 0,5M y 1M de células Jurkat con baja actividad proliferativa tratadas con formaldehido fueron separadas por SDS-PAGE (15% acrilamida) y teñidas con Azul de Coomassie o analizadas por western blot con anti-CT-ProTα (transferencia en condiciones específicas para proteínas ácidas como se describe en Materiales y Métodos 3.6). Paralelamente se analizaron marcadores de peso molecular que se indican en kDa. Para ello, primero se estableció la posible correspondencia entre los complejos inmunodetectados y las proteínas presentes en los componentes de la fracción 1M separada por SDS-PAGE y teñida con Azul de Coomassie, tal como se indica en la figura 17A. Resultados 103 Figura 17. Análisis de las proteínas inmunoreactivas con anti-ProTα de la fracción 1M de intercambio iónico de citoplasma de células Jurkat con baja actividad proliferativa tratadas con formaldehido. A) Identificación de las proteínas inmunoreactivas con anti-CTProTα Alícuotas de la fracción 1M del extracto citoplasmático de células Jurkat con baja actividad proliferativa tratadas con formaldehido fueron separadas en paralelo por SDS-PAGE para su tinción con Coomassie o para su análisis por immunowestern blot con anti-CT-ProTα. Se indica la correspondencia entre las bandas de proteína teñidas con Coomassie (C1 a C10) con los complejos del immunowestern. B) Purificación de las proteínas inmunoreactivas con anti-ProTα Fragmentos de las bandas cortadas del gel teñido con Coomassie fueron separados por SDS-PAGE, teñidos con Coomassie o analizados por immunowestern blot con anti-NT-ProTα (como se describe en Material y Métodos 3.7). Seguidamente, las bandas señaladas en el gel teñido con Azul de Coomassie correspondientes con los diferentes complejos determinados por immunowestern fueron cortadas y alícuotas de estas bandas separadas de nuevo por SDS-PAGE y teñidas con Azul de Coomassie o sometidas a immunowestern blot con anti-CT-ProTα y anti-NT-ProTα. El resultado de este análisis, figura 17B, indica que de las diez bandas de proteína analizadas solo cinco fueron inmunoreactivas (C2-40 kDa, C6-34 kDa, C7-30 kDa, C8-28 kDa y C9-22 kDa). En la figura 17B solo se muestra el immunowestern blot con anti-NT-ProTα, pero con anti-CT-ProTα Resultados 104 presenta el mismo resultado (datos no mostrados). Las bandas no inmunodetectadas pueden deberse bien a su baja concentración o una baja inmunoreactiviad en la fracción 1M. Continuando con el estudio de las proteínas inmunoreactivas con anti-ProTα purificadas, llevamos a cabo el tratamiento térmico para determinar si se correspondían con complejos estabilizados por el formaldehido. El resultado fue similar a con los complejos de células proliferantes presentado en la figura 5 (datos no mostrados). Finalmente, se realizó la identificación de las proteínas que se asocian a ProTα en los complejos anteriores por espectrometría de masas, en las mismas condiciones descritas para los análisis de los complejos en células en proliferación. Las proteínas identificadas en los cinco complejos inmunoreactivos se resumen en la tabla 3 (resultados completos en la figura 3 del anexo), de la misma forma que en los complejos de la ProTα en células proliferantes: ordenados por su movilidad electroforética en kDa y las proteínas identificadas en cada complejo dispuestas de mayor a menor score. Los cinco complejos inmunoreactivos con anti-ProTα presentan la misma movilidad electroforética que cinco de los seis complejos citoplasmáticos de células proliferantes, no detectándose el complejo de 25 kDa en células con baja actividad proliferativa. Como se puede ver en la tabla 3 su composición es también muy parecida. Así, las proteínas SET, ANP32A y ANP32B siguen siendo las proteínas preponderantes en los cinco complejos, cuya composición difiere sin embargo en alguno de sus componentes respecto a las caracterizadas en células en proliferación. En los complejos en los que se mantiene la interacción de la ProTα con la proteína SET (40 kDa y 22 kDa) el descenso de la actividad proliferativa produce la pérdida de la interacción con la β-actina en el complejo 40 kDa y la presencia de tres nuevas proteínas en el complejo 22 kDa: la proteína Rab-11A relacionada con Ras (presente en el complejo 25 kDa de proliferantes), la proteína Rab-6A relacionada con Ras y el inhibidor 2 de la disociación RhoGDP (Rho GDI 2), regulador del intercambio GTP/GDP de la proteína Rho; proteínas de localización citoplasmática e implicadas en el tráfico a través de las membranas intracelulares (Hutagalung & Novick, 2011; Takai et al., 2001). El complejo 34 kDa se caracteriza por la pérdida de la β-actina, la proteína mitocondrial transportadora de fosfato y ANP32A, que son sustituidas por: la tropomiosina α, proteína citosólica implicada en la estabilización de los filamentos de actina (Lin et al., 2008); y las proteínas delta(3,5)-delta(2,4)-dionil-CoA isomerasa mitocondrial y la proteína transportadora Resultados 105 2-oxoglutarato/malato mitocondrial implicadas en la actividad mitocondrial (Filppula et al., 1998; Monné et al., 2013). El descenso de la actividad proliferativa de las células induce también la pérdida de ANP32B del complejo 30 kDa, mientras que aparecen cuatro nuevas proteínas: la subunidad β tipo 7 del proteasoma, que acompaña a la subunidad α tipo 3 del proteasoma, presente también en el complejo de células en proliferación; y tres proteínas de la familia 14-3-3 (14-3-3 gamma, 14-3-3 zeta/delta y 14-3-3 beta/alpha), proteínas citoplasmáticas implicadas en el control de las rutas de señalización del ciclo celular y apoptosis (Morrison, 2009; Gardino & Yaffe, 2011) En el complejo 28 kDa se produce la pérdida de la proteína ANP32A y la inclusión de la proteína 29 del Retículo Endoplasmático (ERp29), implicada en el procesamiento de proteínas en este orgánulo (Zhang & Richardson, 2011), y la Endopeptidasa Clp, proteasa de localización mitocondrial dependiente de ATP (Kang et al., 2002). Resultados 106 Tabla 3. Resumen de los resultados de Espectrometría de MS/MS en trampa iónica de los complejos de la ProTα del fraccionado 1M de citoplasma de células Jurkat con baja actividad proliferativa. Resultados 107 4.2Estudio de las interacciones de la ProTα en células en apoptosis Dada la bien caracterizada implicación de la ProTα en el control citoplasmático de la apoptosis (Jiang et al., 2003, Qi et al., 2010), estudiamos las interacciones de la ProTα en células Jurkat en las que se ha inducido este proceso mediante estaurosporina (como se describe en Material y Métodos 3.1.7), un esteroide inhibidor de proteínas kinasas de amplio espectro que tiene la capacidad de inducir apoptosis mediante un mecanismo en el que se activa la vía del apoptosoma y por tanto las caspasas 9 y 3 (Manns et al., 2011). En primer lugar, se analizó la influencia de la estaurosporina sobre la inducción de las actividades de la caspasa 9 y de la caspasa 3, con el objetivo de evaluar la capacidad para promover la activación del apoptosoma. Para esto, las células Jurkat en proliferación se trataron con estaurosporina (0,5 μM o 1 μM durante 1, 2 y 4 horas). Inmediatamente, las células fueron lisadas y en los sobrenadantes de los microcentrifugados se ensayaron las actividades caspasa 9 y caspasa 3 mediante la utilización de sustratos que llevan acoplados un marcador fluorescente. En la figura 18 se muestra como la estaurosporina induce la activación de la caspasa 9, propia de la ruta apoptosómica; y la caspasa 3. La caspasa 9 sufre un incremento de su actividad por la acción de la estauroporina de 2,8 veces a las 2 horas y 3,8 veces a las 4 horas a una concentración de 0,5 μM, mientras que con 1 μM hay un aumento mayor de: 4,3 veces a 2 horas y 5,3 veces a las 4 horas. La caspasa 3 experimenta una subida de su actividad mayor que la caspasa 9, pero se mantiene la mayor inducción a concentraciones de 1 μM de estaurosporina. Además, se comprobó que el tratamiento con estaurosporina induce la fragmentación nucleosómica del DNA a las 4 horas de incubación con 0,5 μM de estaurosporina (datos no mostrados). Resultados 108 Figura 18. Análisis de la inducción de la apoptosis con estaurosporina en células Jurkat mediante la cuantificación de las actividades caspasa 9 y caspasa 3. Las células Jurkat se trataron con estaurosporina 0,5 µM (Azul) o 1 µM (Rojo) durante 1, 2 y 4 horas, se lisaron y en el extracto citoplasmático se probaron las activividades caspasa 9 y caspasa 3 mediante ensayos de fluorescencia como se describe en Material y Métodos 3.18. Los controles son ensayos de actividades en extractos citoplasmáticos de células en proliferación. Los valores son medias±desviación típica de tres análisis diferentes realizados por duplicado. A la vista de los resultados anteriores, llevamos a cabo la inducción de apoptosis por tratamiento con estaurosporina 0,5 µM durante 2 horas para desencadenar una fase temprana de la activación de las caspasas 9 y 3, y por tanto de la ruta apoptótica dependiente del apoptosoma. Una vez inducida la apoptosis, las células fueron tratadas con formaldehido y lisadas. Alícuotas del extracto celular crudo o fraccionado por cromatografía de intercambio iónico con elución discontinua fueron separados por SDS-PAGE y teñidos con Azul de Coomassie o analizados por immunowestern blot con anti-ProTα. En la figura 19 se presentan los resultados de este estudio. En el análisis de immunowestern blot con anti-NT-ProTα del extracto crudo (figura 19A) se observa la presencia de componentes inmunoreactivos a tamaños superiores a 25 kDa. Además, se aprecia una diferencia en los componentes con la movilidad de la ProTα: se detectan dos componentes inmunoreactivos con anti-NT-ProTα. De acuerdo con nuestros datos (datos no mostrados) y datos publicados por otros investigadores Resultados 115 En el complejo 30 kDa la ProTα mantiene la interacción con las proteínas presentes en las células proliferantes y con baja actividad proliferativa: ANP32A, la subunidad α tipo 3 del proteasoma y la ADP/ATP traslocasa 2. Mientras que la proteína 14-3-3 zeta/delta, que está incluida solo en el complejo de células con baja actividad proliferativa, sustituye a la ANP32B del complejo de proliferantes. La ProTα se asocia en el complejo 28 kDa con las mismas proteínas ANP32A y ANP32B que constituyen el complejo del mismo tamaño en las células proliferantes, a las que se añaden las proteínas 14-3-3 zeta/delta, 14-3-3 gamma y la subunidad α tipo 6 del proteasoma, nueva subunidad componente del proteasoma. El complejo 25 kDa de células apoptóticas tiene un equivalente en las células proliferantes que no aparece en células con una baja actividad proliferativa. Sin embargo, su composición es diferente, la ProTα se asocia a SET, que sustituye a ANP32A y ANP32B de proliferantes, y a las proteínas Rab-1A y Rab-1B relacionadas con Ras, que sustituyen a la proteína Rab-11A relacionada con Ras del complejo de células proliferantes y que están implicadas en el tráfico de componentes celulares a través de las membranas intracelulares en el citoplasma (Hutagalung & Novick, 2011). 4.3Análisis comparativo de las interacciones de la ProTα en células Jurkat en proliferación, con baja actividad proliferativa y en apoptosis A manera de recopilación de nuestra investigación, presentamos un análisis comparativo de los resultados obtenidos en el estudio de las interacciones de la ProTα en células Jurkat en proliferación y en situaciones en las que se induce un descenso de la actividad proliferativa y la apoptosis. En la figura 21 se resumen los análisis de immunowestern blot de los complejos de la ProTα, inmunodetectados en las células Jurkat en estos tres estadios de actividad, en la fracción 1M de la cromatografía de intercambio iónico, tal como se indicó en las figuras 3, 16 y 19. En los tres casos los complejos inmunoreactivos con anti-ProTα muestran una movilidad electroforética similar, sin embargo se aprecia una notable diferencia en la concentración de la ProTα presente en los complejos, que disminuye con el descenso de la actividad proliferativa y la inducción de la apoptosis. A la vez que se observa un incremento de la ProTα libre, tal como se deduce de la cuantificación densitométrica presentada en la figura 22. Resultados 116 Figura 21. Resumen de los análisis por immunowestern blot con anti-ProTα de los fraccionados 1M de intercambio iónico de extractos de células Jurkat proliferantes, con baja actividad proliferativa y apoptóticas, tratradas con formaldehido mostrados en las figuras 3, 16 y 19. Otra característica destacable en los análisis de immunowestern blot de los diversos complejos es que todos son inmunoreactivos a ambos anticuerpos de la ProTα generados contra parte de su secuencia N-terminal (anti-NT-ProTα) y C-terminal (anti-CT-ProTα). Esta propiedad contribuye a confirmar la presencia de la ProTα en todos ellos, pero no podemos descartar que la Timosina α1 (Tα1) pudiera estar incluida en todos o alguno de los complejos, ya que este polipéptido derivado del procesamiento de la ProTα que se corresponde con los primeros 28 aminoacidos de su secuencia, que está presente en el citoplasma de las células de mamíferos y es inmunoreactiva a los anticuerpos anti-NT-ProTα, pero no a anti-CT-ProTα (Sarandeses et al 2003). Los análisis de espectrometría de masas no resuelven esta cuestión, dado que los fragmentos de la ProTα identificados se incluyen en su región N-terminal, coincidente con la secuencia de la Tα1. Como aporte necesario a este estudio comparativo de la evolución de los complejos de la ProTα, realizamos la cuantificación de la ProTα libre y ligada a los complejos en células con Resultados 117 baja actividad proliferativa y apoptóticas, siguiendo el mismo procedimiento indicado para la cuantificación en las células proliferantes mostrado en el histograma de la figura 7, y que presentamos de nuevo en la figura 22. En los histogramas de la figura 22A se muestran los niveles de la ProTα libre y ligada a los complejos solubles en células proliferantes, con baja actividad proliferativa y apoptóticas obtenidos mediante el estudio densitométrico de análisis de immunowestern blot como los de las figuras 3, 16 y 19, respectivamente. De acuerdo con estos datos, se aprecia una notable diferencia entre las concentraciones de la ProTα ligada a complejos solubles estabilizados por el tratamiento con el formaldehido en las células en proliferación respecto a las observadas en células con baja actividad proliferativa o apoptóticas. De manera que, con el descenso de la actividad proliferativa la concentración de la ProTα ligada a complejos solubles es unas dos veces menor que la ligada en células proliferantes, y con la inducción de la apoptosis esta disminución es más acusada, unas cuatro veces menor. Respecto a la ProTα no ligada a complejos, su concentración se mantiene dentro de un rango similar (39-42 ng/106 células) con el descenso de la actividad proliferativa con respecto a la de células en proliferación, pero en las células que inician su apoptosis esta es notablemente superior, del orden de 2 veces, incluyendo aquí la ProTα no ligada que aparece fragmentada por las caspasas 3 y 7. En la figura 22B se comparan las concentraciones de los complejos citoplasmáticos solubles identificados en las células en los tres estadios estudiados a lo largo de este trabajo. El descenso de la actividad proliferativa resulta en una bajada general del orden del 50% del conjunto de las concentraciones de los complejos con las mismas movilidades que los caracterizados en células proliferantes, a la vez que desaparece el complejo 25 kDa. El descenso de las concentraciones de los complejos de la ProTα es todavía mayor, más de cuatro veces, en las células en apoptosis temprana, respecto a las concentraciones de los complejos de la misma movilidad en células proliferantes. Con la circunstancia de que desaparecen los complejos 40 kDa y 22 kDa, que son sustituidos por los nuevos complejos 50 kDa y 32 kDa, con unas concentraciones que no superan a la menor concentración de los complejos detectados en las células proliferante. Resultados 118 Figura 22. Cuantificación de la ProTα en células Jurkat proliferantes, con baja actividad proliferativa y apoptóticas, tratadas con formaldehido. A) Concentración de la ProTα en las células Jurkat proliferantes, con baja actividad proliferativa y apoptóticas, tratadas con formaldehido. El análisis densitométrico fue llevado a cabo como se describe en Material y Métodos 3.11 en experimentos de immunowestern blot como los mostrados en las figuras 3, 16 y 19. B) Concentraciones de los complejos solubles de la ProTα de la fracción 1M de extractos citoplasmáticos en células proliferantes y con baja actividad prolifertativa, y de extracto celular de células apoptoticas. El análisis densitométrico se realizó como en el apartado A. Los valores son medias±desviación típica de al menos tres análisis diferentes. Resultados 119 La relación entre las estructuras de los diferentes complejos de la ProTα se resume en la tabla 5, en ella se muestra como los complejos 34 kDa, 30 kDa y 28 kDa presentes en células en proliferación también aparecen en células con baja actividad proliferativa y en apoptosis temprana. Esta coincidencia en la movilidad electroforética se refleja también en la presencia común de algunas de las proteínas que acompañan a la ProTα, de tal forma que el descenso de la actividad proliferativa y la inducción de la apoptosis, además de promover una disminución en la concentración de los diferentes complejos, afecta a la estructura de estos, al variar la composición de las diferentes proteínas que en ellos se integran, lo que modifica sus características como ya hemos indicado en los respectivos estudios y que resumimos a continuación. Si nos fijamos en el complejo 34 kDa, vemos que el descenso de la actividad proliferativa induce la desaparición de la interacción de la ProTα con ANP32A, la proteína mitocondrial transportadora de fosfato y con la β-actina, que son sustituidas por la tropomiosina α, la delta(3,5)-delta(2,4)-dionil-CoA isomerasa mitocondrial y la proteína transportadora 2-oxoglutarato/malato mitocondrial; mientras que se mantienen las relaciones de la ProTα con la proteína de unión al subcomponente Q1 del complemento mitocondrial y la subunidad α tipo 1 del proteasoma. En la apoptosis en este complejo se mantiene la interacción de la ProTα con la subunidad α tipo 1 del proteasoma, también se pierde la interacción con ANP32A, la proteína mitocondrial transportadora de fosfato, la proteína de unión al subcomponente Q1 del complemento mitocondrial y con la β-actina que son sustituidas por la delta(3,5)-delta(2,4)-dionil-CoA isomerasa mitocondrial y la proteína transportadora 2-oxoglutarato/malato mitocondrial, que también están en células con baja actividad prolifertativa, y por las proteínas nuevas: 40S proteína ribosomal S3, 60S proteína ribosomal L7 y la proteína 14-3-3 epsilon. En el complejo 30 kDa la bajada de la actividad proliferativa induce la pérdida de la interacción con ANP32B, que es sustituida por la subunidad β tipo 7 del proteasoma y las proteínas 14-3-3 gamma, 14-3-3 zeta/delta y 14-3-3 beta/alpha; manteniéndose la interacción de los demás componentes de este complejo: ANP32A, la ADP/ATP traslocasa 2 y la subunidad α tipo 3 del proteasoma. Con la inducción de la apoptosis la interacción con estas proteínas se mantiene, también se pierde la interacción con ANP32B, y aparece como nuevo componente la proteína 14-3-3 zeta/delta, presente en el mismo complejo en células con baja actividad proliferativa. Resultados 120 En el complejo 28 kDa las interacciones de la ProTα con ANP32A y ANP32B evolucionan de forma diferente. Se pierde la interacción de la ProTα con ANP32A al descender la actividad proliferativa y se mantienen las dos en apoptosis, pero en muy baja concentración, a la vez que aparecen nuevos componentes con la evolución de la actividad celular. La proteína 29 del retículo endoplasmático y la endopeptidasa Clp se incluyen en el complejo con el descenso de la proliferación, mientras que las proteínas 14-3-3 gamma, 14-3-3 zeta/delta y la subunidad α tipo 6 del proteasoma lo hacen en el complejo apoptótico. En lo que respecta a los demás complejos y sus componentes, el complejo 40 kDa evoluciona de forma que con el descenso de la actividad proliferativa se pierde la interacción con la β-actina y con la apoptosis el complejo desaparece totalmente. Una evolución similar la presenta el complejo 22 kDa, que en células con baja actividad proliferativa incorpora las interacciones con las proteínas: Rab-11A relacionada con Ras, Rab-6A relacionada con Ras y el inhibidor 2 de la disociación Rho-GDP; y desaparece en la apoptosis. La presencia de estas proteínas de ubicación citoplasmática al descender la actividad proliferativa compartiendo la interacción de la ProTα con SET en este complejo refuerza la posibilidad de que el complejo 22 kDa (ProTα-SET) en células proliferantes sea de localización citoplasmática. Es precisamente la inducción de la apoptosis la que produce la más notable variación de las dianas celulares de la ProTα. De manera general se produce un descenso de las concentraciones de los complejos de la ProTα y, además de las variaciones indicadas en su composición, surgen dos nuevos complejos: 50 kDa y 32 kDa. Complejos en los que se agrupan interacciones de la ProTα con proteínas relacionadas con la actividad mitocondrial y citoesqueletal, proteasas y proteínas relacionadas con la actividad apoptótica. El complejo 25 kDa apoptótico similar en tamaño al caracterizado en células proliferantes presenta como más significativas diferencias la desaparición de la interacción con ANP32A y ANP32B, que son sustituidas en menor concentración por SET. Resultados 121 Tabla 5. Resumen de los resultados de Espectrometría de MS/MS en trampa iónica de los complejos de la ProTα del fraccionado 1M del extracto celular de células Jurkat proliferante, con baja actividad proliferativa e inducidas a apoptosis con estaurosporina. Resultados 122 En resumen, podemos concluir que la estabilización de las interacciones de la ProTα, inducidas por el tratamiento con formaldehido de las células Jurkat en proliferación, se concreta en la formación de complejos en los que se implica sobre un 10% del contenido de la ProTα. La composición de los complejos formados denota su origen citoplasmático y que, a juzgar por la estructura de sus componentes, parecen relacionarse principalmente con la actividad citoplasmática de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B. Actividad que, de acuerdo con las propiedades descritas para estas proteínas, se correspondería con el control de la apoptosis. De acuerdo con la cuantificación de estas proteínas y de los resultados de nuestra investigación, parece evidente que solo una parte del contenido celular de SET, ANP32A y ANP32B interaccionaría, así mismo, con una porción de la ProTα celular. El descenso de la actividad proliferativa promueve la disminución de más del 50% de las concentraciones de estos complejos, descenso que se acrecienta con la apoptosis, manifestándose una progresiva pérdida de la capacidad de interacción con estas proteínas, especialmente ANP32A y ANP32B. Las propiedades de los componentes que bajo estas condiciones se incorporan a los complejos confirman la ubicación citoplasmática de los complejos y la relación de estos con la actividad mitocondrial y con la actividad apoptótica promovida por estos orgánulos. En el caso de las interacciones de la ProTα con ANP32A, su efecto sobre la supervivencia pudiera corresponderse con la capacidad de la ProTα para bloquear las actividades descritas para la ANP32A en extractos celulares, en los que esta proteína parece ejercer un efecto pro-apoptótico a través de la activación del apoptosoma, efecto que in vitro se ha demostrado que es contrarrestada por la ProTα (Jiang et al., 2003). A falta de conocer los mecanismos moleculares por los cuales los diferentes complejos ejercen su papel en la actividad celular, de acuerdo con las funciones citoplasmáticas descritas para SET y ANP32B, estas podrían cooperar en la función anti-apoptótica de la ProTα. 4.4Estudio de las interacciones de la ProTα en células en apoptosis inducida por Actinomicina D Para profundizar en el conocimiento de la transcendencia biológica de los complejos de la ProTα, especialmente en lo que respecta a su relación con la actividad del apoptosoma, llevamos a cabo un experimento en el que hemos inducido la apoptosis de las células Jurkat con Actinomicina D (Act D) un antibiótico que inhibe las RNA polimerasas dependientes de DNA y por tanto la síntesis de RNA, induciendo apoptosis en diferentes tipos celulares por un mecanismo que, aunque no esclarecido, se caracteriza porque promueve la degradación Resultados 123 apoptótica del DNA en condiciones en las que no parece activarse la caspasa 9 y por tanto el apoptosoma (Kumarswamy et al., 2009; Kleff et al., 2000). Para ello, incubamos las células Jurkat en crecimiento exponencial con Act D 1 µg/ml (concentración usual para la rápida inducción de la apoptosis) durante diversos tiempos y en los extractos celulares determinamos las actividades de la caspasa 9 y caspasa 3. En la figura 23 se presenta el resultado de estos ensayos, en el que se comparan estas actividades con las obtenidas en células activadas con estaurosporina. Figura 23. Análisis de la inducción de la apoptosis con actinomicina D y estaurosporina en células Jurkat mediante la cuantificación de las actividades caspasa 9 y caspasa 3. En alícuotas de extacto citoplasmático de células Jurkat tratadas con Act D 1 µg/ml o estaurosporina 0,5 µM durante 1, 2 y 4 horas se probaron las activividades caspasa 9 y caspasa 3 como se describe en Material y Métodos 3.18. Los controles son ensayos de actividades de células en proliferación en ausencia de activadores. Los valores son medias±desviación típica de tres análisis diferentes realizados por duplicado. Estos resultados indican que después de 4 horas de incubación con Act D no se aprecia activación de la caspasa 9 y solo después de ese tiempo se observa un modesto incremento de la caspasa 3, tal como se describe que ocurre en la activación apoptótica con Act D (Kumarswamy et al., 2009; Kleff et al., 2000). Este resultado, sin embargo, contrasta con los niveles de activación de las caspasas 9 y 3 alcanzada por la activación con estaurosporina, que se corresponde con la demostrada activación de la apoptosis por la vía apoptosómica (Manns et al., 2011). Resultados 124 Para estudiar la presencia de complejos de la ProTα en estas células apoptóticas inducidas por Act D procedimos a la separación cromatográfica por intercambio iónico de extractos de células incubadas con Act D 1 μg/ml durante 4 horas y tratadas con formaldehido, para su posterior análisis por immunowestern blot. En este análisis usando el anticuerpo antiNT-ProTα, que se muestra en la figura 24A, no se observan complejos de la ProTα y se aprecia una muy ligera fragmentación de la ProTα (del orden del 5%), tal vez relacionada con la modesta activación de la caspasa 3 observada en la figura 34. De este análisis se deduce un comportamiento diferente de los complejos de la ProTα del observado en las células Jurkat apoptóticas por el tratamiento con estaurosporina (ver figura 19). Hay que tener en cuenta que en las condiciones en las que se ha llevado a cabo el tratamiento con Act D, y tal como se ha descrito, en diferentes tipos celulares se produce una rápida paralización de la actividad del DNA y su fragmentación después de 2 horas, aunque su influencia en la actividad mitocondrial y en la aparición de la caspasa 3 activa es tardía, después de 4 horas de incubación (Kumarswamy et al., 2009; Kleff et al., 2000).En estas condiciones, la paralización de la actividad mitogénica puede explicar la total desaparición de complejos de la ProTα que pudieran relacionarse con la supervivencia celular. En cualquier caso, estaríamos ante un mecanismo de inducción de la apoptosis no relacionado con la activación del apoptosoma y por consiguiente de la caspasa 9 y de un alto nivel de la caspasa 3, que si ocurre con el tratamiento con estaurosporina, en el cual además se produce una rápida y cuantitativa proteólisis de la ProTα. Con la finalidad de comprobar la evolución de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B en células Jurkat tratadas con Act D y para apreciar tanto su posible proteólisis como la formación de complejos con otras proteínas que no fueran la propia ProTα, llevamos a cabo la separación por SDS-PAGE de los diferentes fraccionados de intercambio iónico para su posterior análisis por immunowestern blot con los anticuerpos anti-SET y anti-ANP32A/B. El resultado mostrado en la figura 24B indica que los únicos componentes inmunoreactivos que aparecen entre los más acídicos (fracción 1M) presentan las movilidades electroforéticas de las propias SET, ANP32A y ANP32B. La tinción con Coomassie de la fracción 1M de células tratadas con Act D que se incluyen en la figura 24B indica un patrón de proteínas similar a la fracción 1M procedente de células tratadas con estaurosporina (ver figura 19). En estos patrones se observan proteínas con la movilidad de SET, ANP32A y ANP32B. En los resultados de immunowestern blot de la figura 24B también se aprecia la no fragmentación de estas proteínas en las células Jurkat tratadas con Act D. Discusión 131 V. DISCUSIÓN La estabilización de interacciones proteína-proteína llevada a cabo por tratamiento de células Jurkat con formaldehido nos ha permitido aislar seis complejos que resultan de la interacción de la ProTα con otras proteínas, entre las que son principales componentes las proteínas SET, ANP32A y ANP32B. Estructuralmente estos complejos son muy acídicos como resultado del bajo punto isoeléctrico de las proteínas que los componen (pI entre 3,5-4.1). Esta propiedad confiere a los complejos un bajo tamaño molecular aparente en electroforesis y aunque ello dificulta su purificación por cromatografía de intercambio iónico, sin embargo, facilita una eficiente separación de los demás componentes de los extractos celulares y la posterior caracterización y purificación por SDS-PAGE. De acuerdo con nuestros análisis los complejos son de localización citoplasmática y solo una porción, del orden del 10%, del contenido celular de la ProTα forma parte de ellos, con una asociación selectiva de ProTα/SET (complejos 40 kDa y 22 kDa) y de ProTα/ANP32A/ANP32B (complejos 30 kDa, 28 kDa y 25 kDa). Así como, una especial asociación de ProTα/ANP32A en el complejo 34 kDa. En referencia a la localización de la ProTα en los extractos celulares, es característica su predominante presencia citoplasmática resultado de la propiedad de vertido originado en los procesos de homogeneización, aún en condiciones isotónicas (Manrow et al., 1991; Enkeman et al., 2000; Covelo et al., 2006) y que contrasta con los análisis de inmuofluorescencia en los que se observa una muy preferente ubicación nuclear de la ProTα (figura 15). Con ellos, surge una controversia sobre el origen celular de los complejos de la ProTα. Sin embargo, y de acuerdo con la composición de estos complejos con la excepción del complejo ProTα/SET de 22 kDa, todas o algunas de las proteínas que aparecen en los demás complejos son de ubicación citoplasmática, por lo que ese 10% del contenido celular de la ProTα unida a los complejos debería, originalmente, tener una ubicación citoplasmática. De manera que el 33% del contenido celular de la ProTα que acompaña a los complejos en los extractos citosólicos de las células Jurkat tratadas con formaldehido pudiera corresponderse con la ProTα no enlazada a otras proteínas de origen tanto nuclear como citoplasmático. A este respecto hay que reseñar que el resto de la ProTα celular (un 60%) que no es detectada en los extractos celulares debería estar incluida en macrocomplejos con proteínas relacionadas con la actividad Discusión 132 nuclear de la ProTα, incluidas histonas, cuyo tamaño hemos demostrado que superan los 700 kDa (Covelo et al., 2006). En lo que respecta a las principales proteínas que están presentes en los complejos con la ProTα: SET, ANP32A y ANP32B, desde un punto de vista de su distribución celular son proteínas de prominente ubicación nuclear tal como se deduce de nuestros análisis de inmunofluorescencia (figura 15) y de lo descrito por otros autores (Adachi et al., 1994; Pan et al., 2009; Fries et al., 2007; Brennan et al., 2000). En cambio, en extractos de Jurkat (figura 8) la proteína SET aparece exclusivamente en la fracción citoplasmática mientras que ANP32A y ANP32B aparecen distribuidos en ambos extractos: nucleares y citoplasmáticos, aunque con una preferente localización citoplasmática, lo que es más acorde con el análisis de inmunofluorescencia. Dadas las características estructurales de estas proteínas similares a la ProTα, que se incluyen entre el grupo de proteínas acídicas de fácil movilidad núcleocitoplasma, parecen presentar también una acusada tendencia a movilizarse al citoplasma con la homogeneización celular. Dada la alta concentración celular de estas proteínas que se aproxima a la de la ProTα y la propia concentración de los complejos de la ProTα, parece que solo una parte del contenido celular de SET, ANP32A y ANP32B, tal vez en una proporción equimolecular, participa en los complejos de la ProTα con ubicación citoplasmática. La dificultad para separar la porción de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B libres de las que se encuentran formando parte de los complejos 40 kDa, 30 kDa y 28 kDa, en los que están unidas a la ProTα, dificulta el cálculo del porcentaje de estas proteínas que interaccionan con la ProTα en el citoplasma celular. Sin embargo, de los resultados obtenidos en nuestros experimentos de filtración molecular (figura 11), de coinmunoprecipitación (figura 13), de afinidad a ProTα (figura 14) y del análisis de inmunofluorescencia que muestra su distribución celular (figura 15) contribuyen a demostrar una asociación parcial del contenido celular de todas estas proteínas con la ProTα en el citoplasma de las células Jurkat. A este respecto, debemos de recordar que estas proteínas, como ocurre con la misma ProTα, se encuentran en las células a una concentración similar al de una histona core (Freire et al., 2002), por lo que concentraciones del orden del 10% de cada una de estas proteínas, significa que los diferentes complejos pueden alcanzar, dentro del citoplasma de las células Jurkat en proliferación, niveles de concentración significativos en el metabolismo citoplasmático. De acuerdo con la composición de los complejos, la ProTα muestra una preferente afinidad por las proteínas ANP32A y ANP32B (complejos 34 kDa, 30 kDa, 28 kDa y 25 kDa) en Discusión 133 las células en proliferación, en su conjunto más de 3 veces superior a los complejos 40 kDa y 22 kDa en los que se encuentra la proteína SET. Sin embargo, es claro que las demás proteínas que acompañan a la ProTα en los diferentes complejos deben de jugar un papel fundamental, tanto en la orientación de afinidades para dar lugar a la formación de los complejos diferenciados, como en la localización subcelular de cada uno de ellos. Esta influencia, además, debe de repercutir en la capacidad funcional, bien diferencial o coordinada, de los complejos formados. Aunque, hace unos años se ha publicado la capacidad de la ProTα para interaccionar con SET en extractos de células HeLa (Karetsou et al., 2004), en nuestro trabajo se muestra, por primera vez, la interacción in vivo de ProTα con SET, ANP32A, ANP32B y con los demás componentes de los complejos caracterizados, como un paso fundamental para esclarecer los mecanismos moleculares de las actividades de dichos complejos. Evolución y posible función de los complejos en distintas condiciones celulares La principal cuestión a resolver ahora es el establecer la significación biológica de estas interacciones de la ProTα. A este respecto, los más significativos componentes de los complejos son proteínas de las que se han descrito una preferente función nuclear relacionada con la actividad de la cromatina, tanto SET (Seo et al., 2001), como ANP32A (Seo et al., 2001, 2002) y ANP32B (Tochio et al., 2010), a través de su capacidad de interaccionar con las histonas core, con enzimas modificadoras de histonas y proteínas relacionadas con las actividad de la cromatina, lo que constituye una capacidad funcional similar a la demostrada para la propia ProTα (Díaz-Jullien et al., 1996; Covelo et al., 2006; Freire et al., 2001). No obstante, la estructura de los complejos de la ProTα que hemos caracterizado parece vincular a estas proteínas a una función citoplasmática junto con la ProTα. En lo hasta ahora publicado, la función citoplasmática de SET, ANP32A y ANP32B es su papel en el control de la supervivencia celular. De manera que se ha descrito el efecto anti-apoptótico de SET en el citoplasma como controlador de la actividad de la DNasa activada por Granzima A (GAAD) (Fan et al., 2003). SET participa en el control de GAAD formando un complejo (complejo SET) con ANP32A, HMG2 (proteína que se une a DNA) y Ape 1 (enzima reparadora de DNA). La inducción de la apoptosis por un mecanismo independiente de caspasas promovido por la Granzima A provoca la degradación proteolítica de SET por este enzima, liberándose la actividad DNasa de GAAD para degradar el DNA. Los complejos de SET con la ProTα parecen no guardar relación con el descrito por Fan et al. (2003) Por lo que respecta a ANP32A, además de la indicada interacción con SET en el control de una vía apoptótica no dependiente del apoptosoma, hay una extensa descripción del efecto Discusión 134 pro-apoptótico de esta proteína relacionado con la vía apoptosómica de la inducción de la apoptosis (Jiang et al., 2003; Qi et al., 2010). En esta vía se ha demostrado in vitro un efecto anti-apoptótico de la ProTα, antagonizando la acción de ANP32A en el citoplasma celular, por un mecanismo no esclarecido. Menos conocida es la función citoplasmática de ANP32B, se ha descrito un papel anti-apoptótico independiente de ProTα, relacionado con el control de la expresión del inhibidor de la apoptosis (XIAP) (Roth et al., 2001), aunque no se conoce el mecanismo de esta implicación. De acuerdo con nuestros resultados, las interacciones de la ProTα con estas proteínas, podían relacionarse con un mecanismo de control de la apoptosis inducida por la activación del apoptosoma. Por otra parte, las propiedades de las proteínas que acompañan a la ProTα en los complejos detectados en las células en proliferación, todas ellas implicadas en actividades multifuncionales de ubicación preferentemente citoplasmática, bien relacionadas con la actividad mitocondrial, vacuolar, proteolítica o del citoesqueleto, parecen indicar que la participación de los complejos de la ProTα en el posible control de la supervivencia celular se produciría por un mecanismo en el que el control de la permeabilidad mitocondrial y de la actividad proteolítica afectaría a la capacidad de iniciar la ruta de activación del apoptosoma. Las características estructurales de los diferentes complejos nos indican una participación de las proteínas SET, ANP32A y ANP32B en el control de la actividad celular de una manera diferente a lo que hasta ahora se había encontrado para estas proteínas. Las asociaciones diferenciadas de la ProTα con SET en los complejos 40 kDa y 22 kDa y de la ProTα con ANP32A y ANP32B en los complejos 34 kDa, 30 kDa, 28 kDa y 25 kDa, representan una novedad respecto a las asociaciones de SET-ANP32A descritas en el complejo SET con GAAD (Fan et al., 2003) antes mencionado y en el complejo inhibidor de la acetilación de histonas core INHAT (Seo et al., 2001, 2002). La presencia de los diferentes complejos permite especular sobre la posibilidad de que cada uno pudiera relacionarse con una participación individual en el mecanismo de regulación de la supervivencia o bien funcionar de una manera concertada con alguno o todos los demás. En cualquier caso, nuestro estudio sobre la influencia del descenso de la actividad proliferativa y la inducción de la apoptosis, permiten orientar un posible mecanismo de su participación en la actividad celular. Así, las características del complejo 40 kDa denotan una relación de parte del contenido celular de la ProTα y SET con una actividad citoesqueletal vinculada a la β-actina y a la proteína relacionada con MARKS (MRP). La disminución de la concentración de la ProTα en este complejo y la pérdida de la interacción con la β-actina que conlleva una bajada de la Discusión 135 actividad proliferativa, así como la desaparición de este complejo con la inducción de la apoptosis, demuestra una correspondencia de la estructura del complejo con la proliferación celular. Dada la relación encontrada entre la actividad citoesqueletal de la β-actina y su efecto pro-apoptótico, relacionado con el control de la activación de las mitocondrias para iniciar la vía apoptosómica de la apoptosis (Tang et al., 2006) y el propio papel de MRP como reductor de la plasticidad de la β-actina (Sundaram et al., 2004), hacen plausible el que un papel antiapoptótico de la ProTα y SET podría resultar de su capacidad para prevenir la actividad proapoptótica de la β-actina, en la que colaboraría la interacción con la proteína MRP. Por otra parte, la interacción de la ProTα con la β-actina, que ya en trabajos previos habíamos demostrado (Covelo et al., 2006; Freire et al., 2001) es una propiedad que la ProTα comparte con la timosina β4. Este péptido, originalmente relacionado con la defensa inmunológica junto con las timosinas α (Goldstein et al., 1972), posee la capacidad de interaccionar con la actina, participando en la regulación de su polimerización (Sanders et al., 1992; Huff et al., 2001) y en la angiogénesis (Smart et al., 2007). La interacción de la ProTα con la β-actina que encontramos en el complejo 50 kDa, que aparece solamente en la iniciación de la apoptosis inducida por estaurosporina, reforzaría la relación apoptótica de esta interacción. Además, la presencia en este complejo de las proteína VAT-1 (Eura et al., 2006), la subunidad-2 del complejo cit b-c1 (Hosokawa et al., 1989) y la proteína de migración nuclear nudC (Aumais et al., 2003), todas ellas relacionadas con la actividad mitocondrial y la apoptosis, corroboran una función citoplasmática de la ProTα, relacionada con mecanismos de control de la actividad mitocondrial para iniciar la apoptosis. Por lo que respecta a la función que pudiera desempeñar el complejo ProTα/SET de 22 kDa, la evolución de sus componentes con el descenso de la actividad proliferativa, con la incorporación de las proteína Rab11A y Rab6A, relacionadas con el control del tráfico entre membranas en el citoplasma (Hutagalung & Novick, 2011), y con la proteína Rho GDI 2, inhibidora del intercambio GDP/GTP de las proteínas Rho (Takai et al., 2001), parece demostrar que este complejo ProTα/SET, que en las células en proliferación no aparece relacionado con otras proteínas, tendría una localización citoplasmática. De tal manera que la función del complejo, que desaparece con la apoptosis, podría estar vinculada al mantenimiento de la supervivencia celular por un mecanismo no conocido. En este sentido, el papel anti-apoptótico de la proteína Hsp90, relacionada con la ProTα debido a su capacidad para inhibir la apoptosis iniciada por las mitocondrias (Pandey et al., 2000) en un mecanismo en el que se implica su capacidad para interaccionar con GTPasas y proteínas semejantes a Rab Discusión 136 (Kang et al., 2007, McClellan et al., 2007), pudiera tener una correspondencia en el papel del complejo ProTα/SET de 22 kDa. De acuerdo con la evolución de las estructuras de los complejos en los que se manifiestan las interacciones de la ProTα con las proteínas ANP32A y ANP32B en células en las que se ha producido el descenso de la actividad proliferativa y la inducción de la apoptosis, que se muestra en la tabla 5, se aprecia también una relación de estos complejos con la supervivencia celular asociada con la actividad mitocondrial y la actividad proteolítica intracelular. De acuerdo con la evolución de los componentes del complejo 34 kDa, en la que se manifiesta una permanente interacción con proteínas implicadas en la actividad mitocondrial, así como con proteínas de la familia 14-3-3 relacionadas con las vías de señalización en el mantenimiento de la supervivencia y muerte celular (Gardino & Yaffe, 2011), hacen pensar que este complejo pudiera estar vinculado con el control de la iniciación de la actividad apoptótica ligada a las mitocondrias. De manera que el descenso de la concentración de este complejo (figura 22) y la pérdida de la interacción con ANP32A y con la β-actina en células con baja actividad proliferativa y apoptóticas marcarían la pérdida de la capacidad para promover la supervivencia de las células proliferantes. Una situación similar se refleja en la evolución del complejo 30 kDa. Se mantiene la relación entre la estructura del complejo y la actividad mitocondrial y la interacción con las proteínas de la familia 14-3-3, más acusado que en el complejo 34 kDa. El gran descenso de su concentración, 50% en células no proliferantes y 90% en células apoptóticas, que conlleva la pérdida de la capacidad de la ProTα para interaccionar con ANP32B y un descenso de su capacidad para interaccionar con los demás componentes del complejo, parece corresponderse con la pérdida de la actividad proliferativa y la inducción de la apoptosis. Por otra parte, la estrecha relación estructural entre el complejo 30 kDa en células no proliferantes con el complejos 32 kDa, que aparece exclusivamente en células apoptóticas, contribuye a relacionarlos con una función similar en el mantenimiento de la actividad proliferativa y la prevención de la apoptosis. En el caso del complejo 28 kDa, la aparentemente exclusiva interacción de la ProTα con ANP32A y ANP32B en las células en proliferación no permite deducir su ubicación celular. Sin embargo, la presencia de proteínas como la endopeptidasa Clp de localización mitocondrial (Kang et al., 2002) y la proteína ERp29, relacionada con el transporte reticular (Zhang & Discusión 137 Richardson, 2011), en el complejo de células no proliferantes, y la presencia de las proteínas 14-3-3 zeta/delta y gamma en el complejo apoptótico, parece demostrar su localización citoplasmática y, de forma similar al complejo de 30 kDa, su función estaría especialmente relacionada con el nivel de interacción con ANP32A. El descenso del grado de interacción con esta proteína, a medida que se bloquea la actividad proliferativa, marcaría el declive de la resistencia a la apoptosis. Las características estructurales del complejo 25 kDa, en el que la interacción de la ProTα con ANP32A y ANP32B es compartida por su interacción con la proteína Rab11A, lo relaciona con una función citoplasmática vinculada con la supervivencia celular, por un mecanismo similar al descrito para el complejo de 28 kDa, tal como se deduce por su desaparición con el descenso de la actividad proliferativa y por su presencia residual en células apoptóticas, manteniendo una baja concentración de la ProTα unida a proteínas Rab y sustituyendo la proteína SET a las ANP32A y ANP32B. De acuerdo, entonces, con el estudio de la evolución de los complejos estabilizados por formaldehido en células con diferente actividad proliferativa o apoptóticas, parece deducirse que las interacciones de la ProTα con SET y con ANP32A y ANP32B, se corresponden con capacidades de estas proteínas para prevenir la entrada en apoptosis de las células Jurkat en proliferación mediante un mecanismo en el que, de manera independiente o coordinada, estos complejos regularían la capacidad de las mitocondrias para activar la vía apoptosómica de la apoptosis. La caracterización de complejos de ProTα en células 293T, similares a los encontrados en células Jurkat indica que la participación de los complejos de ProTα con SET, ANP32A y ANP32B pudiera ser extensible a otras células de mamíferos. Nuestros resultados constituyen una novedosa aportación al esclarecimiento de los mecanismos de control in vivo de la actividad del apoptosoma. Estableciendo, por primera vez, la participación de la proteína SET en este proceso, a través de su inclusión en los complejos 40 kDa y 22 kDa de la ProTα. A la vez que se demuestra que el papel pro-apoptótico descrito para ANP32A (Jiang et al., 2003; Qi et al., 2010) parece ser controlado por su inclusión en los complejos 34 kDa, 30 kDa, 28 kDa y 25 kDa en los que la proteína ANP32B podría favorecer la acción anti-apoptótica de la ProTα. En cualquier caso, nuestros datos parecen demostrar una acción conjunta de ProTα/SET/ANP32A/ANP32B que, con la participación de componentes citoplasmáticos y mitocondriales, afectaría a la formación del apoptosoma. Lo que difiere del propuesto mecanismo en el que la ProTα inhibirá el ensamblado de los componentes del apoptosoma y ANP32A activará al complejo apoptosómico ya formado, según los resultados obtenidos Discusión 138 mediante experimentos en extractos celulares (Jiang et al., 2003; Qi et al., 2010). Hay que tener en cuenta que nosotros no encontramos interacciones de la ProTα con Apaf-1 ni otros componentes del apoptosoma, o con proteínas anti/pro-apoptóticas de la familia Bcl-2, lo que concuerda con los resultados de estudios sobre la composición del apoptosoma (Twiddy et al., 2004). Tampoco detectamos interacciones de la ProTα con CAS o Hsp70, que se han descrito como cooperantes de ANP32A en la promoción de la actividad del apoptosoma in vitro (Kim et al., 2008). Lo que no descarta la posibilidad de que ANP32A pueda implicarse, por mecanismos diferentes a los aquí presentados, en el control de la actividad del propio apoptosoma. Mediante experimentos de transfección de células 293T con vectores de expresión de ProTα mutada en Thr 7 para evitar su fosforilación, hemos demostrado recientemente la posible implicación de la ProTα fosforilada en Thr 7 por la isoforma M2 de la piruvato quinasa (M2-PK) en los mecanismos anti-apoptóticos de la ProTα en estas células, de manera que la sobreexpresión de la ProTα fosforilada favorecería la acción anti-apoptótica de ProTα (Moreira et al., 2013). Dado que solo un 10% del contenido celular de la ProTα es fosforilada por la M2PK, hace plausible que esta modificación estructural de la ProTα pudiera corresponderse con el porcentaje celular de esta proteína que se implica en la formación de los complejos citoplasmáticos reguladores de la supervivencia celular. Sin embargo, no encontramos fragmentos de ProTα fosforilados en los análisis de los diversos complejos por espectrometría de masas. Fallo tal vez achacable al agresivo tratamiento utilizado para la rotura previa de los enlaces de formaldehido en los complejos. En experimentos de estabilización de complejos con formaldehido en células 293T transfectadas con ProTα mutada en Thr 7, no detectamos diferencias en la composición de complejos de la ProTα formados respecto a los encontrados en células transfectadas con el vector vacío (datos no mostrados). Ello pudiera ser debido a que no se puede evitar la expresión endógena de un 30-40% de la ProTα, que conlleva la presencia de ProTα nativa fosforilada (Díaz-Jullien et al., 2011; Moreira et al., 2013) por lo que la oferta de ProTα recombinante mutada tendría una opción limitada para desplazar a la ProTα fosforilada en la interacción con SET, ANP32A y ANP32B y los demás componentes en la formación de los complejos descritos. Los datos aquí presentados constituyen una importante aportación al conocimiento de la biología de la ProTα, al demostrar una función citoplasmática de esta proteína aparentemente relacionada con la capacidad para frenar la apoptosis, promovida por mecanismos que implican una asociación con la actividad mitocondrial y del citoesqueleto, Discusión 139 contribuyendo así al mantenimiento de la actividad proliferativa de las células. Tal vez todo ello constituya una manifestación de la multifuncionalidad de ProTα, de manera que su actividad oncogénica sería el resultado del control citoplasmático de la apoptosis, simultaneando con su esencial papel en el metabolismo nuclear para propiciar la proliferación celular. La futura investigación, en la que se pueda esclarecer el mecanismo molecular del funcionamiento de cada uno de los complejos aquí caracterizados, debería de contribuir a completar la panorámica de la biología de la ProTα.