Desarrollo de un método basado en LAMP para la detección de serotipos de Salmonella en muestras de origen avícola

FACULTADE DE CIENCIAS GRAO EN BIOQUÍMICA D.ª Anne Doval Expósito DESARROLLO DE UN MÉTODO BASADO EN LAMP PARA LA DETECCIÓN DE SEROTIPOS DE SALMONELLA EN MUESTRAS DE ORIGEN AVÍCOLA Traballo Fin de Grao Xuño 2024 1 Índice Índice ............................................................................................................................................. 1 Índice de tablas .............................................................................................................................. 2 Índice de figuras ............................................................................................................................ 3 Resumen ........................................................................................................................................ 4 Resumo .......................................................................................................................................... 5 Abstract ......................................................................................................................................... 6 Abreviaturas .................................................................................................................................. 7 1. Introducción .......................................................................................................................... 8 1.1. Salmonella ..................................................................................................................... 8 1.2. Clasificación de Salmonella .......................................................................................... 9 1.3. Planes nacionales de control de Salmonella en industria avícola ................................ 11 1.4. Técnicas de diagnóstico .............................................................................................. 12 2. Objetivos ............................................................................................................................. 18 3. Material y métodos .............................................................................................................. 19 3.1. Cepas bacterianas ........................................................................................................ 19 3.2. Procesamiento de muestras ......................................................................................... 20 3.3. Extracción de ADN ..................................................................................................... 22 3.4. Calidad y pureza de ADN ............................................................................................ 23 3.5. Diseño de primers o cebadores .................................................................................... 23 4. Desarrollo de LAMP ........................................................................................................... 26 4.1.1. LAMP en tiempo real .......................................................................................... 26 4.2.1. LAMP colorimétrico ........................................................................................... 27 5. Resultados y discusión ........................................................................................................ 28 5.1. Pureza y concentración del ADN extraído .................................................................. 28 5.2. LAMP en tiempo real .................................................................................................. 30 5.3. LAMP colorimétrico ................................................................................................... 37 6. Conclusión ........................................................................................................................... 39 7. Bibliografía ......................................................................................................................... 40 2 Índice de tablas Tabla 1. Condiciones de crecimiento de Salmonella. ................................................................... 8 Tabla 2. Distribución de casos confirmados de salmonelosis humana en la UE para los 20 serotipos de Salmonella más frecuentes. ..................................................................................... 10 Tabla 3. Cronograma de aplicación del Reglamento (CE) Nº 2160/2003 para el control de determinados serotipos de Salmonella en las poblaciones de aves. ............................................ 12 Tabla 4. Colección de cepas de Salmonella empleadas para el estudio asociadas a su serotipo. 19 Tabla 5. Inoculaciones de los distintos serotipos de UFC en muestra. ....................................... 21 Tabla 6. Genomas empleados para el diseño de primers asociados a su secuencia de referencia de NCBI. .......................................................................................................................................... 23 Tabla 7. Diseño de cebadores para ensayos de amplificación isotérmica mediada por bucle. ... 24 Tabla 8. Resumen de volúmenes añadidos para la preparación de mezcla de primers. .............. 26 Tabla 9. Componentes y volúmenes de mezcla de reacción para LAMP. .................................. 27 Tabla 10. Resultados de absorbancia y concentración de ADN medidos con NanoDrop Lite Plus y Qubit. ........................................................................................................................................ 29 Tabla 11. Resultados LAMP fluorimétrico de muestras de ADN de un cultivo puro. ................ 31 Tabla 12. Resultados LAMP fluorimétricos de muestras de ADN extraído y obtenidas de los distintos medios: MSRV, RAPID´Salmonella y XLD. ................................................................ 34 Tabla 13. Resultados de LAMP mediante el empleo de un primer general ttr con muestras de ADN extraído. ............................................................................................................................. 36 3 Índice de figuras Figura 1. Morfología de Salmonella. Adaptada de NIAID bajo licencia CC BY 2.0. ................. 8 Figura 2. Esquema procedimiento de muestra según norma ISO 6579-1:2017/A1:2021. Creado por BioRender.com ..................................................................................................................... 13 Figura 3. Medios de cultivo con crecimiento característico de Salmonella spp. De izquierda a derecha son MSRV, XLD y RAPID´Salmonella Medio. Elaboración propia. ............................ 14 Figura 4. Proceso de amplificación por LAMP. ......................................................................... 16 Figura 5. Resumen del proceso realizado durante el estudio. Creada con BioRender.com ....... 17 Figura 6. Diluciones seriadas. Creada con BioRender.com ....................................................... 20 Figura 7. Esquema del procedimiento de extracción del ADN. Creado con BioRender.com. ... 22 Figura 8. Amplificación por LAMP de la muestra de la cepa C11/21 correspondiente al serotipo Hadar. .......................................................................................................................................... 30 Figura 9. Curva de melting de muestra de ADN extraído inoculada con 10 UFC de Salmonella. ..................................................................................................................................................... 31 Figura 10. Amplificaciones de la cepa C4/22 correspondiente al serotipo Typhimurium en los distintos métodos de análisis empleados: mediante extracción de ADN o obtenidos de los 3 distintos medios. .......................................................................................................................... 35 Figura 11. Comparación en muestras procesadas por LAMP colorimétrico con una muestra negativa (izquierda) y otra positiva (derecha). ............................................................................ 37 Figura 12. Resultado LAMP colorimétrica en luz blanca (izquierda) y a luz ultravioleta (derecha). Cada fila de tubos, de izquierda a derecha corresponde con las cepas C11/22, C12/20, C4/22, C2/22 y C11/21. Mientras que de arriba abajo las concentraciones inoculadas van de mayor a menor indicadas por la Tabla 5. ................................................................................................... 38 4 Resumen Salmonella spp. es uno de los principales patógenos de origen alimentario a nivel mundial, especialmente en productos avícolas, requiriendo un riguroso control a lo largo de la cadena alimentaria para proteger al consumidor. El método de referencia para su detección es la norma ISO 6579: 2017, un método dependiente de cultivo. Aunque es un método robusto, requiere de varios días para determinar la muestra como positiva y determinar el serotipo de Salmonella aislado, lo que enlentece el funcionamiento de la industria alimentaria y la respuesta a brotes alimentarios. Para solventar estas limitaciones en los últimos años se están desarrollando métodos alternativos como los basados en la amplificación de ácidos nucleicos. En este trabajo se desarrolló un método rápido de detección de los principales serotipos de Salmonella (Typhimurium, Enteritidis, Infantis, Virchow, Hadar) en productos avícolas, combinando un enriquecimiento rápido de la muestra con el empleo de la técnica molecular isotérmica LAMP. Los resultados se compararon con el método de referencia basado en la norma ISO 6579:2017, aplicando la determinación del serotipo mediante LAMP en los siguientes puntos: preenriquecimiento (agua de peptona), enriquecimiento selectivo (MSRV), agar selectivo y diferencial (XLD y RAPID´Salmonella). En las muestras de preenriquecimiento se realizó una extracción de ADN mediante lisis térmica. Para el resto se realizó el análisis sin una extracción previa de ADN. Fue posible determinar el serotipado en todos los puntos analizados. Además fue posible realizar el LAMP a partir de los medios selectivos sin extracción previa de ADN, aunque hubo diferences en los tiempos de amplificación entre los diferentes medios. El empleo de una versión colorimétrica del LAMP permite realizar la determinación del serotipo empleando como único equipo un termobloque. Esto hace que el método puede ser aplicado directamente en puntos de interés, como las propias granjas avícolas. Palabras clave: Salmonella, serotipo, LAMP, Infantis, Virchow, Enteritidis, Hadar, Typhimurium 5 Resumo Salmonella spp. é un dos principais patóxenos de orixe alimentario a nivel mundial, especialmente en productos avícolas, requerindo un riguroso control ao longo da cadea alimentaria para protexer ao consumidor. O método de referencia para a súa detección é a norma ISO 6579: 2017, un método dependente de cultivo. Aunque é un método robusto, require de varios días para determinar a mostra como positiva e determinar o serotipo de Salmonella aislado, o que enlentece o funcionamento da industria alimentaria e a resposta a brotes alimentarios. Para solventar estas limitacións nos últimos anos estanse a desenvolver métodos alternativos como os baseados na amplificación de ácidos nucleicos. Neste traballo desenvoloveuse un método rápido de detección dos principais serotipos de Salmonella (Typhimurium, Enteritidis, Infantis, Virchow, Hadar) en productos avícolas, combinando un enriquecemento rápido da mostra co empleo da técnica molecular isotérmica LAMP. Os resultados compararonse co método de referencia baseado na norma ISO 6579:2017, aplicando a determinación do serotipo mediante LAMP nos seguintes puntos: preenriquecemento (auga de peptona), enriquecemento selectivo (MSRV), agar selectivo e diferencial (XLD y RAPID´Salmonella). Nas mostras de preenriquecemento realizouse unha extracción de ADN mediante lisis térmica. Para o resto realizouse o análise sen unha extracción previa de ADN. Foi posible determinar o serotipado en todos os puntos analizados. Ademais foi posible realizar el LAMP a partir dos medios selectivos sen extracción previa de ADN, aínda que houbo diferencias nos tempos de amplificación entre os diferentes medios. O empleo dunha versión colorimétrica del LAMP permite realizara determinación do serotipo empleando como único equipo un termobloque. Esto fai que o método poda ser aplicado directamente en puntos de interés, como as propias granxas avícolas. Palabras chave: Salmonella, serotipo, LAMP, Infantis, Virchow, Enteritidis, Hadar, Typhimurium 6 Abstract Salmonella spp. is one of the main foodborne pathogens worldwide, especially in poultry products, requiring rigorous control throughout the food chain to protect the consumer. The reference method for its detection is ISO 6579: 2017, a culture-dependent method. Although it is a robust method, it requires several days to determine the sample as positive and determine the Salmonella serotype isolated, which slows down the operation of the food industry and the response to food outbreaks. To overcome these limitations, alternative methods such as those based on nucleic acid amplification have been developed in recent years. In this work, a rapid method for the detection of the main Salmonella serotypes (Typhimurium, Enteritidis, Infantis, Virchow, Hadar) in poultry products was developed, combining rapid enrichment of the sample with the use of the isothermal molecular technique LAMP. The results were compared with the reference method based on ISO 6579:2017, applying serotyping by LAMP at the following points: preenrichment (peptone water), selective enrichment (MSRV), selective and differential agar (XLD and RAPID'Salmonella). For the pre-enrichment samples, DNA extraction was performed by thermal lysis. For the rest, the analysis was performed without prior DNA extraction. It was possible to determine serotyping at all points tested. It was also possible to perform LAMP from the selective media without prior DNA extraction, although there were differences in amplification times between the different media. The use of a colorimetric version of LAMP allows serotyping using only a thermoblock as a single instrument. This means that the method can be applied directly at points of interest, such as poultry farms. Keywords: Salmonella, serotype, LAMP, Infantis, Virchow, Enteritidis, Hadar, Typhimurium 7 Abreviaturas ATP: Agua de peptona tamponada BIP: Backward Inner Primer B3: Backward Outer Primer Cq: Ciclo de cuantificación ENT: Enteritidis ETA: Enfermedades transmitidas por alimentos FIP: Forward Inner Primer F3: Forward Outer Primer HAD: Hadar INF: Infantis ISO: International Organization for Standardization LAMP: Amplificación isotérmica mediada por bucle LB: Loop Backward Primer LB: Loop Forward Primer MSRV: Medio semisólido agar Rappaport-Vassiliadis modificado PCR: Reacción de cadena de la polimerasa qPCR: Reacción de cadena de la polimerasa cuantitativa Tm: Temperatura de melting TYP: Typhimurium UFC: Unidades formadoras de colonias UV: Ultravioleta VIR: Virchow WHO: Wordl Health Organization XLD: Medio Agar Xilosa Lisina 8 1. Introducción 1.1. Salmonella Salmonella es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Estas bacterias gram negativas tienen varias características principales. Son bacilos (Figura 1) anaerobios facultativos, es decir, capaz de crecer en condiciones de aerobiosis o anaerobiosis y fermentan la glucosa mientras que con la excepción de algunas cepas no son capaces de fermentar la lactosa (Seguridad Alimentaria Elika, 2023). Son oxidasas negativas, no forman esporas, son capaces de producir sulfuro de hidrógeno y convertir nitratos en nitritos. La mayoría de las cepas son móviles gracias a sus flagelos, a excepción de Salmonella entérica serotipo Gallinarum y Pullorum, serotipos específicos de aves (Merino, Procura, Trejo, Bueno, & Golowczyc, 2019). Figura 1. Morfología de Salmonella. Adaptada de NIAID bajo licencia CC BY 2.0. En relación a su crecimiento y supervivencia, Salmonella se multiplica favorablemente en varios medios según sus condiciones resumidas en la Tabla 1. Su temperatura óptima de crecimiento es de 37°C, pero puede desarrollarse a temperaturas oscilantes entre 5-45°C (Seguridad Alimentaria Elika, 2023). Su pH óptimo varía entre 6,5 y 7,5, en algunas cepas pudiendo a crecer en condiciones de pH de hasta 3,7. Incluso poseen la capacidad de sobrevivir en condiciones de baja humedad durante un periodo prolongado, siendo su actividad o disponibilidad del agua de 0,99 (Shaji, Selvaraj, & Shanmugasundaram, 2023). Tabla 1. Condiciones de crecimiento de Salmonella. Mínimo Óptimo Máximo Temperatura (°C) 5 37 45 pH 3,7 6,5-7,5 9,5 Actividad de agua 0,93 0,99 0,99 15 La PCR es una técnica especifica, sensible y rápida, aunque requiere de equipos específicos con capacidad de detectar fluorescencia y con capacidad de trabajar a distintas temperaturas a lo largo de un mismo análisis (Vichaibun & Kanchanaphum, 2020). Esta metodología es sensible a la contaminación e inhibición por compuestos presentes en la muestra analizada (Francois et al., 2011). Para tratar de contrarrestar estas limitaciones, han surgido otras técnicas moleculares innovadoras para el diagnóstico de varios patógenos basadas en amplificaciones isotérmicas como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). LAMP es un método de amplificación de ADN en condiciones isotérmicas, mediante el uso de un conjunto de cebadores específicos para el ADN diana. El tiempo estimado de reacción es alrededor de 40 minutos a una temperatura constante de 60-65°C. Este método proporciona varias ventajas como su especificidad y sensibilidad, y no requiere de equipos sofisticados ya que sólo con un termobloque se podría realizar la reacción (da Silva et al., 2023). El conjunto de cebadores para realizar LAMP, se compone de dos cebadores externos (F3 y B3), dos cebadores internos (cebador interno directo (FIP) y cebador interno inverso (BIP)) y adicionalmente cebadores de bucle (bucle hacia delante y bucle hacia atrás) (Wong, Othman, Y.- L. Lau, Radu., & Chee, 2018). El cebador FIP consta de una región F2 en el extremo 3´ y otra región F1c en el extremo 5´, mientras que el cebador BIP consta de una región B2 situada en el extremo 3' y una región B1c en el extremo 5'. Los cebadores externos como el F3 que es directo, consta de una región F3 que es complementaria a la región F3c de la secuencia plantilla, por otra parte, está el B3 que es inverso consta de una región B3 que es complementaria a la región B3c de la secuencia plantilla. Conociendo la composición de los distintos primers, la amplificación o síntesis de la cadena complementaria, mostrada en la Figura 4, comienza a producirse una vez la región F2 de FIP se hibrida con la región F2c del ADN. Seguidamente, el cebador F3 se hibrida con la región F3c del ADN, extendiéndose y desplazando la cadena complementaria unida a FIP, esto forma un bucle en el extremo 5´. Dicho bucle en el extremo 5´ de ADN monocatenario sirve como molde para el cebador BIP (Wong, Othman, Y.-L. Lau, Radu., & Chee, 2018). El cebador B2 se hibrida con la región B2c del ADN molde, iniciando así la síntesis de ADN complementario y apertura del bucle del extremo 5´. A posteriori, el cebador B3 se hibrida con la región B3c del ADN objetivo y procede a su extensión, de modo que desplaza la cadena complementaria unida a BIP obteniendo así un ADN con forma de mancuerna (Wong, Othman, Y.-L. Lau, Radu., & Chee, 2018). 16 La función de la ADN polimerasa Bst es adicionar nucleótidos al extremo 3´ de F1, extendiendo y provocando la apertura del bucle en el extremo 5´ convirtiendo el ADN en estructura de tallo y bucle. Siendo esta estructura el iniciador del ciclo LAMP, agregándose cebadores de bucle para una amplificación exponencial (Wong, Othman, Y.-L. Lau, Radu., & Chee, 2018). Figura 4. Proceso de amplificación por LAMP. 17 Los ensayos LAMP pueden indicar reacciones positivas según fluorescencia, turbidez o cambio de color, siendo la detección a simple vista el método más simple y económico, aunque no el más fiable debido a la imposibilidad de detectar reacciones positivas debido a amplificaciones inespecíficas (Kim, Yang, & Kim, 2024). Estudios han demostrado que la sensibilidad detectada mediante el uso de un fluoróforo uniéndose al ADN es mayor que la obtenida con turbidez (Le, Nguyen, Truong, & De Nguyen Van, 2012). En este trabajo, mostrado en la Figura 5, se desarrolló un nuevo método de detección de distintos serotipos de Salmonella que permite su detección en muestras preenriquecidas en distintas condiciones como son el aislamiento acorde a la norma EN/ISO 6579-1 :2017 o mediante un método de extracción simple. Posteriormente, se probaron dos estrategias de detección con LAMP, en fluorescencia en tiempo real y detección colorimétrica a simple vista. Figura 5. Resumen del proceso realizado durante el estudio. Creada con BioRender.com 18 2. Objetivos El objetivo de este trabajo es el desarrollo de un método basado en la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para la detección de los cinco serotipos de Salmonella de mayor interés epidemiológico en muestras de origen avícola. Para ello se establecieron los siguientes objetivos específicos: • Diseñar y optimizar ensayos LAMP para la detección de los serotipos S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Infantis, S. Virchow, S. Hadar. • Evaluación de un procedimiento de extracción de ADN simple. • Evaluación de la detección mediante LAMP sin la realización de extracción de ADN previa a partir de los diferentes diferentes medios selectivos empleados en el proceso de detección de Salmonella según la ISO 6579-1:2017. 19 3. Material y métodos 3.1. Cepas bacterianas Las cepas de Salmonella empleadas pertenecen a una colección del propio laboratorio obtenidas a partir de ensayos interlabotatoriales, estas pueden observarse en la Tabla 4. Tabla 4. Colección de cepas de Salmonella empleadas para el estudio asociadas a su serotipo. Cepas bacterianas de Salmonella Serotipos Cepas bacterianas de Salmonella Serotipos Fresno C13/20 S. Infantis C12/20 Lawndale C6/20 C2/21 S. Abony C11/20 S. Lagos C10/22 S. Agama C15/21 S. Stanley C12/21 S. Agbeni C13/21 C5/22 S. Augustenborg C12/22 S. Teddington C3/20 S. Berta C14/21 S. Typhimirium C13/22 C8/22 C3/21 S. Coeln C8/20 C4/20 S. Dublin C1/22 C4/22 C5/21 C7/21 S. Enteritidis C1/20 C9/20 C1/21 S. Typhimirium Monofásica C15/22 C10/20 C9/21 C10/21 C9/22 C2/22 C7/20 C7/22 S. Virchow C11/22 S. Give C5/20 C15/20 S. Gloucester C4/21 C6/21 S. Hadar C11/21 S. Wernigerode C14/22 C2/20 C8/21 C3/22 S. Yoruba C14/20 Estas cepas fueron las que se emplearon para el desarrollo del método. Finalmente para los ensayos de inoculaciones sólo se analizó la detección de los serotipos Enteritidis, Typhimurium, Hadar, Infantis, y Virchow, donde las cepas escogidas fueron C2/22, C4/22, C11/21, C12/20 y C11/22, siendo estas las correspondientes a los serotipos más comunes en la industria avícola. 20 3.2. Procesamiento de muestras Para el desarrollo del método basado en LAMP se emplearon muestras simuladas a las que se recogen en los Planes Nacionales de Control de Salmonella. Las cepas de Salmonella empleadas fueron conservadas en unos crioviales a -20 ºC. Para revitalizar las cepas se sembró una criobola de los viales de conservación en placas de Agar Nutritivo (VWR, Alemania), las placas fueron incubadas a 37ºC durante 24 horas. Estas placas fueron conservadas a 4 ºC y empleadas para los procesos descritos a continuación. Las muestras simuladas fueron inoculadas con diferentes concentraciones de Salmonella. En primer lugar, el inóculo se preparó a partir de una suspensión de Salmonella en solución salina al 0,85%. Mediante el uso de un asa de siembra fueron recuperadas colonias de la placa de agar nutriente y disueltas en la solución salina de modo que se obtuvo un valor de absorbancia de 0,2 en el densitómetro (Photometer DEN600, Biosan, Letonia). Este valor es equivalente a 108 UFC/mL de Salmonella según se ha validado previamente en el laboratorio. A partir de la suspensión inicial se realizan diluciones seriadas 1:100 en microtubos de 1,5 mL como se puede observar en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.Figura 6. De este modo diluimos hasta alcanzar la dilución -6 que se espera que tenga 102 UFC/mL. Esta dilución fue utilizada para la inoculación de las muestras de heces. Figura 6. Diluciones seriadas. Creada con BioRender.com Para determinar la concentración de bacterias viables presentes en las diluciones posteriormente inoculadas, se sembraron 100 µL 102 UFC y 10 µL 102 UFC en dos placas de Agar Nutritivo (VWR, Alemania), se incubaron a 37 º C durante 24 horas. Tras la incubación, se realiza el recuento de colonias en cada una de las placas, calculando individualmente la concentración de cada placa cuya unidad es UFC/mL mediante la siguiente ecuación: 21 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑥 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 (𝑚𝐿) = 𝑈𝐹𝐶 𝑚𝐿 Una vez obtenido el valor para cada placa se realiza una media de los dos valores para obtener la concentración de Salmonella spp. en el tubo original. El método de referencia para la detección de Salmonella se rige por EN/ISO 65791:2017/Amd1:2020 (International Organization for Standardization, 2021). Comienza con el preenriquecimiento, se realiza mediante la adición de 225 mL de agua de peptona tamponada (APT, Merck Millipore) por muestra. En este momento también se inocula la cantidad de Salmonella mostrada en la Tabla 5, se homogeiniza y se introduce en la estufa a 37 ºC durante 18 horas. Tabla 5. Inoculaciones de los distintos serotipos de UFC en muestra. Cepa Serotipo Inoculado Inoculado Inoculado Inoculado Inoculado C11/21 S. Hadar 2,5 x 103 40 20 10 5,5 C11/22 S. Virchow 3,0 x 103 39 19,5 9,8 3,3 C12/20 S. Infantis 2,2 x 103 46,2 23,1 4,6 2,5 C2/22 S. Enteritidis 3,1 x 103 50 25 5 4,9 C4/20 S. Typhimurium 3,4 x 103 40 20 10 19,9 A continuación, se realiza un enriquecimiento selectivo en medio de agar semisólido como es Agar Rappaport-Vassiliadis Semi-Sólido Modificado (MSRV, DifcoTM, BD, Francia), inoculando 100 µL de muestra preenriquecida en tres gotas equidistantes formando un triángulo (International Organization for Standardization, 2021). Las placas se incubaron a 42 °C durante 24 horas. Tras estas 24 horas se realiza una primera revisión de placas. Las placas sospechosas se resiembran en los medios selectivos como se indica a continuación, mientras que las presuntivamente negativas son incubadas otras 24 horas, tras las que se realiza una nueva revisión de estas. Asimismo, las placas positivas en agar MSRV deben sembrarse en dos medios selectivos como son agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD, Thermo Scientific, Oxoid) y un segundo medio de aislamiento a elección del laboratorio entre los medios disponibles en el mercado y validados por la norma ISO 6579-1:2017. (International Organization for Standardization, 2021). En este caso el elegido fue RAPID´ Salmonella Medio (Bio-Rad, EE.UU). En ambos medios se realiza la siembra por estrías tras obtener muestra de la placa de MSRV, luego serán incubados a 37°C durante 24 horas. 22 3.3. Extracción de ADN Para realizar la extracción del ADN, pueden emplearse distintos métodos o protocolos. En este estudio fue empleado el método de lisis térmica, siendo este el más sencillo de realizar y el que menos tiempo requiere, con el fin de reducir costes de reactivos y tiempo. En la Figura 7 se resume el procedimiento. Se toma 1 mL de muestra preenriquecida, se centrifuga a 900 × g por un minuto, para eliminar los restos macroscópicos indeseados de la muestra. El sobrenadante se transfirió a un microtubo nuevo y se centrifugó a 16,000 × g durante dos minutos. Después, se descartó el sobrenadante y el pellet bacteriano se utilizó para la extracción de ADN (Costa-Ribeiro, Lamas, Mora, Prado, & Garrido-Maestu, 2024). Se añadieron 100 µL de agua libre de nucleasas (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.) al pellet. Posteriormente calentado a 99ºC durante 5 minutos con agitación continua a 1400 rpm en un termobloque (Thermomixer, Eppendorf AG, Alemania). Una vez completada la lisis, la muestra se volvió a centrifugar a 16,000 × g durante dos minutos para eliminar los restos celulares. Por último, el sobrenadante con el ADN, fue transferido un nuevo microtubo (CostaRibeiro, Lamas, Mora, Prado, & Garrido-Maestu, 2024). Figura 7. Esquema del procedimiento de extracción del ADN. Creado con BioRender.com. El ADN extraído fue almacenado a 4°C durante un corto plazo, alternativamente, para almacenamiento a largo plazo fueron congeladas a -20°C. 23 3.4. Calidad y pureza de ADN Con el fin de evaluar o cuantificar la calidad del ADN extraído se emplearon técnicas espectroscópicas y fluorimétricas. Mediante técnicas espectroscópicas empleando el espectrofotómetro UV de microvolúmenes NanoDrop Lite Plus (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.) podemos estimar la pureza del ADN en base a los ratios 260/280 y 260/230 relacionados en función de las mediciones de absorbancia a 230, 260 y 280 nm (Thermo Fisher Scientific, 2022). Para determinar la concentración de los extractos de ADN se utilizó el fluorímetro QubitTM4 (Invitrogen™ Thermofisher, Carlsbad, CA, EE. UU.). Para la medición de concentración de ácidos nucleicos se realizó con el kit comercial QubitTM dsDNA BR Assay Kit con un rango de cuantificación de 4 - 2000 ng de acuerdo a las instrucciones del productor (Thermo Fisher Scientific., 2014). 3.5. Diseño de primers o cebadores El diseño de primers para LAMP utilizados para este estudio fue basado en los siguientes genomas descargados de Gen Bank de NCBI mostrados en la Tabla 6. Tabla 6. Genomas empleados para el diseño de primers asociados a su secuencia de referencia de NCBI. Cepas bacterianas Secuencia de referencia de NCBI Salmonella Virchow NZ_CP025094.1 Salmonella Infantis NZ_CP121068.1 Salmonella Hadar NZ_CP022069.2 Los primers diseñados para obtener seis cebadores específicos de LAMP siendo estos dos internos (FIP y BIP), dos externos (F3 y B3) y dos cebadores de bucle (LF y LB), se diseñaron con Primer Explorer V5 (https://primerexplorer.jp/e/index.html), cuyas secuencias se muestran en la Tabla 7. Mientras que los primers empleados para los serotipos Typhimurium y Enteritidis fueron diseñados en estudios previos. 24 Tabla 7. Diseño de cebadores para ensayos de amplificación isotérmica mediada por bucle. Target Primer Name Sequence (5´-3´) Reference Salmonella spp. FIP_ttr GCATCAGCCAACATAGCGCCA-CTACGCCATCCGTTATCACA (Costa-Ribeiro, Lamas, & Garrido-Maestu, 2024) BIP_ttr TCAGGTACAAACCGTCCCCAAG-CATCCGTTCCGCCTGGTA F3_ttr ACACTGCTGTTCTGTAGCCT B3_ttr AGGTGCCGAGAATAGCCA LB_ttr CCAGCAGGACGCGTCTT LF_ttr CGCGCAATTTAACCCTTACTCG S. Typhimurium FIP_STM ACCTGCAGCTCATTCTGAGCAG-TCAAAAACAACGGCTCCGG (Azinheiro Sarah, Carvalho, Prado, & Garrido-Maestu, 2018) BIP_STM GAAAAGGACCACAAGTTCGCGC-TCAGTGAGCATGTCGACGAT F3_STM AGCCGCATTAGCGAAGAG B3_STM GCGGTCAAATAACCCACGT LB_STM TCA AAA ATC CAG LF_STM AAC CCA ATC TCA S. Enteritidis FIP_SEN AGCCCACAGTGAGTATCGTG-CGCTGCTGGTAGTGCATGG (Azinheiro Sarah, Carvalho, Prado, & Garrido-Maestu, 2018) BIP_SEN CAGAGGTCATGGCGCGCAAAT-GGCATTGGTATCAAAGGTGA F3_SEN GTTGCTAACACGACACTGGAC B3_SEN GTGGGATATTCTGAGCCCCTAT 31 Figura 9. Curva de melting de muestra de ADN extraído inoculada con 10 UFC de Salmonella. Se realizó un control negativo para cada serotipo de modo que si este amplificase sería a causa de contaminaciones, ya que en esta reacción no habría ADN de Salmonella, por lo que no debería amplificar nada. Del mismo modo, la curva de melting del blanco no debería mostrar picos de amplificación ni una Tm similar a la de la muestra, si esto ocurriese los resultados serían invalidados. En primer lugar, se realizó el análisis de LAMP de 2 cepas de cada uno de los 5 serotipos incluídos en el estudio Tabla 11. Por otro lado, los valores de Cq SD hacen referencia a la desviación estándar en la medición de la muestra, siendo relevante por la realización de duplicados de muestras para asegurar la precisión y reproducibilidad de la amplificación. Tabla 11. Resultados LAMP fluorimétrico de muestras de ADN de un cultivo puro. Cepa Serotipo Media Cq Cq SD Tm (°C) C6/21 VIR 28,88 1,24 83,66 C11/22 VIR 21,44 0,39 83,96 C2/22 SEN 15,48 1,20 86,74 C1/21 SEN Undetermined Undetermined 81,41 C12/20 INF 9,60 1,85 86,62 C2/21 INF 9,75 0,39 86,62 C3/22 HAD 8,52 0,31 83,42 C11/21 HAD 12,33 5,10 83,13 C4/22 STM 8,60 1,81 87,34 C3/21 STM 9,24 0,90 87,22 El color azul marca las cepas finalmente empleadas para el estudio. 32 Los métodos basados en la detección de ácidos nucleicos incluyen un paso de extracción, y en algunos casos, purificación de ADN. Este paso suele enlentecer el proceso y según el método empleado puede incrementar el precio del análisis. Por lo tanto, en este trabajo se evaluó la posibilidad de realizar el LAMP sin realizar una extracción previa del ADN. La reacción de LAMP se realizó a 65ºC, una temperatura a la que empiezan a lisarse las células de Salmonella (Ko & Yoo, 2019). De forma que se combina en el mismo paso la lisis de las células y la amplifiación del ADN. Este método solo fue aplicado a partir del enriquecimiento selectivos y las placas diferenciales y selectivas. La razón de no realizarlo directamente sobre el agua de peptona incubada fue la alta contaminación de estas muestras. Los resultados de las muestras contaminadas con los diferentes serotipos, tanto a partir del ADN extraído como el análisis directo a partir de los medios MSRV Agar, XLD y RAPID´Salmonella agar se presentan en la Tabla 12. Se observa amplificación en todas las muestras realizadas a difererentes concentraciones, serotipos y medios. El nivel más bajo de bacterias detectado mediante LAMP en tiempo real fue de 2,5 UFC por muestra. Otros estudios muestran límites de detección de LAMP entre 1,9 o 2,2 UFC/reacción (Hara-Kudo, Yoshino, Kojima, & Ikedo, 2005) o 1,3 a 28 UFC/reacción para seis cepas de diversos serotipos en cultivos puros, mientras que para muestras simuladas fue de 50 UFC/mL (Xu et al., 2019). Las muestras con mayores concentraciones inciales de Salmonella, como era esperable, presentaron un menor tiempo de amplificación. Además, se observa en cada serotipo que las muestras con niveles de inoculación similares presentaron tiempos de amplificación similares. Los valores obtenidos de Cq fueron más bajos en las muestras de ADN extraído que en las obtenidas directamente de los medios. Esto probablemente se debe a que en el caso de la muestra directa primero tiene que producirse una lisis de las células durante la reacción, lo que ralentiza la fase exponencial de amplificación. Otros trabajos también observaron el potencial de LAMP para trabajar con muestras biológicas donde el ADN está poco purificado, demostrando mayor resistencia a la presencia de substancias inhibitorias en comparación con otras técnicas moleculares (Francois et al., 2011). La mayoría de amplificaciones en ADN extraido que tienen menor tiempo de amplificación se corresponden con aquellas que tenían una concentración de ADN más alta (Tabla 10). Los tiempos de amplificación en MRSV fueron mayores en este medio en comparación con los medios sólidos diferenciales. La selectividad del MSRV está basada en varios de sus componentes como el suplemento antibiótico novobiocina, el oxalato verde malaquita o su bajo pH alrededor de 5,2. (Difco & BBL manual: Manual of microbiological culture media second edition2009). Su pH es bajo, minimizando así la capacidad de migración a través del agar de enterobacterias 33 móviles, exceptuando Salmonella, Enterobacter cloacae y Citrobacter freundii (WorcmanBarninka, Destro, Fernandes, & Landgraf, 2001). Al recoger la muestra a partir del MRVS, debido a su consistencia semisólida, junto con la bacteria también se arrastra parte del medio. Por tanto, la presencia de estas substancias inhibidoras del medio y el bajo pH podrían afectar al tiempo de amplificación de la reacción de LAMP. Se observaron menores tiempos de detección en las colonias obtenidas del RAPID´ Salmonella agar en comparación al XLD. Esto puede ser debido a que este medio presente determinadas sustancias que causen cierta inhibición en la reacción de LAMP. El principio del medio XLD está basado en el uso de un componente inhibidor selectivo desoxicolato de sodio, inhibiendo el crecimiento de microorganismos no deseados, y tres indicadores como xilosa, lactosa y sacarosa combinados con rojo de fenol. En la detección de Salmonella, es relevante la xilosa siendo esta fermentada. Cuando se agota, Salmonella descarboxila la lisina a cadaverina aumentando el pH y formando las colonias típicas de Salmonella cuyo característico color es rojo con el centro negro debido a la metabolización del tiosulfato de sodio perteneciente al medio. Mediante su metabolización se convierte en sulfuro de hidrógeno (H2S) dando lugar al depósito en la superficie de las colonias de sulfuro de hierro responsable del color negro. (Bio-Rad Laboratories, 2020). Mientras que el medio RAPID´ Salmonella agar (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) detecta Salmonella móvil e inmóvil, así como Salmonella lactosa positiva. Su principio se basa en la expresión de actividad enzimática durante su incubación durante 24 horas a 37 °C, donde Salmonella crece en colonias color magenta a causa de la esterasa C8 (Bio-Rad Laboratories., ). Por otro lado, en el medio selectivo, RAPID´ Salmonella agar se observa una mejor amplificación en Hadar, pudiendose deber a una mala homogeinización de la muestra antes del realizar la extracción de ADN. Del mismo modo el serotipo Enteritidis se detectó mejor en los medios selectivos RAPID´ Salmonella agar y XLD. 34 Tabla 12. Resultados LAMP fluorimétricos de muestras de ADN extraído y obtenidas de los distintos medios: MSRV, RAPID´Salmonella y XLD. Cepa Serotipo Inóculo (UFC/mL) Cq ADN extraído Cq SD ADN extraído Tm ADN extraído Cq medio MSRV Cq SD Medio MRSV Tm medio MSRV Cq medio RAPID´ Salmonell a Cq SD medio RAPID´Salmonella Tm RAPID´ Salmonella Cq medio XLD Cq SD medio XLD Tm medio XLD C12/20 INF 2,2 x 103 9,09 0,18 86,51 - - - 12,78 0,19 86,80 16,56 0,29 86,80 46,2 13,92 0,41 86,33 - - - 15,52 - 86,80 18,30 0,27 86,92 23,1 11,83 0,16 86,23 15,98 0,25 86,67 11,97 0,01 86,74 13,58 0,51 86,32 4,6 17,09 0,02 86,92 15,76 0,07 86,73 10,67 0,10 86,55 14,98 1,15 86,38 2,5 11,82 0,65 86,74 13,84 0,002 86,80 10,92 0,06 86,74 11,92 0,51 86,50 C11/21 HAD 2,5 x 103 9,42 0,08 83,13 - - - 8,46 0,07 83,61 9,95 0,46 83,51 40 8,92 0,31 83,50 - - - 9,01 0,03 83,72 9,90 - 83,60 20 10,18 0,40 83,62 12,45 0,09 83,56 8,48 0,53 83,42 11,61 0,45 82,71 10 9,07 0,19 83,84 17,48 10,74 84,07 8,19 0,12 83,71 10,16 0,12 83,47 5,5 9,44 0,23 83,54 10,90 0,42 83,48 6,59 0,01 83,00 13,48 1,04 82,82 C2/22 ENT 3,1 x 103 25,46 2,14 86,21 - - - 9,81 0,03 81,30 19,29 1,20 86,44 50 18,45 0,82 86,09 - - - 12,54 - 85,38 18,19 0,38 86,32 25 22,06 2,65 86,09 21,58 0,45 86,49 14,79 0,06 85,61 16,31 0,30 83,71 5 14,04 0,91 86,50 20,84 0,94 86,55 13,74 0,13 85,72 20,53 0,43 86,08 4,9 15,94 0,37 86,56 21,26 2,29 86,56 9,54 0,33 81,22 17,70 0,06 86,32 C4/22 TYP 3,4 x 103 11,66 0,33 86,86 - - - 11,47 0,03 87,21 12,37 0,14 87,27 40 12,82 0,08 86,68 - - - 13,02 0,11 87,33 11,99 0,78 87,10 20 13,15 0,28 86,68 15,15 0,24 87,21 10,27 0,30 86,92 12,30 0,40 86,80 10 14,60 0,49 87,27 9,67 - 87,21 11,75 2,52 87,21 11,59 0,27 87,21 19,9 12,40 0,64 86,78 15,87 1,26 87,04 10,50 0,07 86,50 17,48 2,27 86,44 C11/22 VIR 3,0 x 103 17,55 0,23 84,31 - - - 27,73 0,34 83,81 25,93 1,25 83,99 39 21,16 0,36 84,40 - - - 16,65 1,36 81,23 20,47 0,93 83,48 19,5 23,27 1,54 84,52 24,59 0,09 84,46 22,03 0,32 84,07 17,92 4,28 83,77 9,8 26,64 0,24 84,31 25,04 1,54 84,13 18,39 2,72 83,71 21,78 2,73 83,95 3,3 24,62 3,21 84,19 24,33 0,23 84,19 16,54 0,30 84,07 17,28 1,62 83,95 Los “-“ observados en las columnas “CT medio MSRV” y “Tm medio MSRV” hacen referencia a muestras que no fueron procesadas. 35 En la Figura 10 se observa las distintas amplificaciones según las muestras empleadas, donde la que antes amplifica es la de ADN extraído, y la que más tiempo requeriría para amplificar sería la del medio MSRV. Figura 10. Amplificaciones de la cepa C4/22 correspondiente al serotipo Typhimurium en los distintos métodos de análisis empleados: mediante extracción de ADN o obtenidos de los 3 distintos medios. Debido a los exhaustivos planes de control implementados para Salmonella en granjas avícolas, la mayoría de muestras suelen ser negativas. Por esta razón, la estrategia propuesta para implementar la técnica de LAMP en los planes nacionales de control de Salmonella sería la siguiente. Inicialmente, se realizaría un cribado empleando un primer general para la detección de Salmonella spp. a partir de las muestras enriquecidas de la bolsa con agua de peptona. En el caso de obtener un resultado positivo, se procedería a realizar el serotipado de las cepas mediante LAMP usando primers específicos de los serotipos de interés en la industria avícola. Por tanto en este estudio las muestras de ADN extraído a partir del agua de peptona enriquecida fueron analizadas mediante LAMP usando unos primers generales para la detección de Salmonella spp previamente validados en el laboratorio, en este caso dirigidos a la detección del gen ttr. En la Tabla 13 se observa la amplificación de todos los serotipos, a excepción de Hadar, en la inoculación más baja. La amplificación producida es más lenta que con los primers específicos. No se observa una gran diferencia de amplificación entre los distintos serotipos ya que amplifican a tiempos similares, tampoco muestran una diferencia relevante en relación a la cantidades inoculadas. 36 Tabla 13. Resultados de LAMP mediante el empleo de un primer general ttr con muestras de ADN extraído. Cepa Serotipo Inóculo (UFC/mL) Cq Tm (°C) C12/20 Infantis 2,2 x 103 11,34 88,93 46,2 17,97 88,93 23,1 11,95 88,93 4,6 15,72 88,69 2,5 13,14 88,81 C11/21 Hadar 2,5 x 103 14,33 88,69 40 16,25 88,69 20 18,20 88,93 10 14,57 88,69 5,5 - 81,22 C2/22 Enteritidis 3,1 x 103 13,32 88,93 50 15,96 88,81 25 14,79 88,81 5 16,21 88,69 4,9 12,62 88,81 C4/22 Typhimurium 3,4 x 103 12,94 88,93 40 11,64 88,81 20 11,23 88,81 10 16,13 88,69 19,9 11,42 88,81 C11/22 Virchow 3,0 x 103 15,37 88,81 39 16,55 88,69 19,5 18,85 88,81 9,8 18,58 88,69 3,3 16,70 88,69 LAMP es una prueba de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que ha ganado popularidad en comparación con la PCR convencional para la detección de patógenos. Se determinó que las condiciones óptimas para la detección de Salmonella mediante LAMP eran 65 °C durante 30 min, aunque la amplificación de los productos comenzó alrededor de los 20 ciclos o antes, es decir, a los 10 minutos. Este método requiere aproximadamente 24 horas, mientras que el método convencional con cultivos requiere de 5 a 7 días. 37 El método LAMP presenta varias ventajas respecto a la PCR convencional o a qPCR, las principales son que tienen mayor sensibilidad, especificidad y requieren menos tiempo (Li, Fan, Zhou, & Zhang, 2017). Esta disminución de tiempos son cruciales en la detección de patógenos para sostener la inocuidad y asegurar la seguridad e higiene en la industria alimentaria. Los factores limitantes de este método es su alto riesgo de contaminación cruzada, conduciendo así a falsos positivos, por lo que se recomienda visualizar los resultados con el tubo de reacción cerrado (Karthik et al., 2014) o el requerimiento de conocimientos para realizar el diseño de cebadores (Kokkinos, Ziros, Bellou, & Vantarakis, 2014). 5.3. LAMP colorimétrico En la Figura 12 se observan los resultado del LAMP colorimétrico. La concentración de SYBR Green necesaria para observar a simple vista muestras positivas es elevada. Esto hace que si se añade directamente a la reacción de LAMP esta pueda ser inhibida. Para evitar esto, los microtubos fueron cubiertos con Parafilm® donde se añadió 1 µL de SYBR Green, y posteriormente fueron cerrados. Una vez transcurrido el tiempo de incubación los tubos fueron agitados para mezclar la reacción con el SYBR y así visualizar el resultado. Las muestras negativas adquieren un color naranja y son poco visibles en el UV, mientras que las muestras positivas adquieren un color verde y son visibles en el UV como se observa en la Figura 11. Figura 11. Comparación en muestras procesadas por LAMP colorimétrico con una muestra negativa (izquierda) y otra positiva (derecha). Se observan los microtubos con los resultados del LAMP colorimétrico correspondientes a cada cepa e inoculación. Para la realización de esta metodología, el ADN extraído empleado para la reacción fue obtenido de las muestras correspondientes con las inoculaciones mostradas en Tabla 5. 38 Figura 12. Resultado LAMP colorimétrica en luz blanca (izquierda) y a luz ultravioleta (derecha). Cada fila de tubos, de izquierda a derecha corresponde con las cepas C11/22, C12/20, C4/22, C2/22 y C11/21. Mientras que de arriba abajo las concentraciones inoculadas van de mayor a menor indicadas por la Tabla 5. Comparando estos resultados con los del LAMP fluorimétrico en tiempo real hubo una correspondencia completa, obteniendo todo resultados positivos. De este modo, se logra un método con aplicación simple a condiciones del campo donde personas no especializadas y con equipos limitados pueden obtener resultados a simple vista en forma de fluorescencia visual. Hay un factor muy importante a tener en cuenta cuando se realizan ensayos de LAMP. Es especialmente relevante no abrir el tubo de LAMP para evitar contaminaciones que conduzcan a resultados de falsos positivos (Karthik et al., 2014). 39 6. Conclusión Salmonella es un problema zoonótico global en la industria avícola, que requiere de una rápida detección para poder realizar análisis rutinarios. Los productos avícolas son una de las principales fuentes de Salmonella en la cadena alimentaria. El desarrollo de métodos moleculares que ayuden a reducir los tiempos de detección de la cadena alimentaria ayuda a mantener la seguridad alimentaria al tiempo que agilizada los procesos de la cadena alimentaria. Las conclusiones obtenidas del presente trabajo son las siguientes. -El diseño de primers específicos permitió realizar una identificación de los cinco principales serotipos de Salmonella spp. en muestras ambientales de granjas de pollo. -La identificación de los serotipos se pueden realizar en diferentes puntos del protocolo de aislamiento de Salmonella. Desde el enriquecimiento en agua de peptona hasta en cualquiera de los métodos selectivos que forman parte del método de referencia. Esto permite acortar los tiempos que requiere la realización del serotipado mediante el empleo de antisueros. -Fue posible realizar la identificación de los serotipos a partir de las placas de agar selectivo sin realizar una extracción previa de ADN, lo que permite acortar los pasos del flujo de trabajo y acelerar los tiempos de detección. -El empleo de LAMP colorimétrico permite realizar la detección de los serotipos mediante el empleo de equipamiento sencillo como un simple termobloque. 40 7. Bibliografía Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición. (2022). Salmonella. Retrieved from https://www.aesan.gob.es/AECOSAN/web/seguridad_alimentaria/subdetalle/salmonela. htm Azinheiro Sarah, Carvalho, J., Prado, M., & Garrido-Maestu, A. (2018). 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