Tácticas químicas para controlar a interacción de sistemas sintéticos con ácidos nucleicos

TESE DE DOUTORAMENTO TÁCTICAS QUÍMICAS PARA CONTROLAR A INTERACCIÓN DE SISTEMAS SINTÉTICOS CON ÁCIDOS NUCLEICOS Renata Calo Lapido ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN CIENCIA E TECNOLOXÍA QUÍMICA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2019 DECLARACIÓN DO AUTOR/A DA TESE TÁCTICAS QUÍMICAS PARA CONTROLAR A INTERACCIÓN DE SISTEMAS SINTÉTICOS CON ÁCIDOS NUCLEICOS Dna.: RENATA CALO LAPIDO. Presento a miña tese, seguindo o procedemento axeitado ao Regulamento, e declaro que: 1) A tese abarca os resultados da elaboración do meu traballo. 2) De selo caso, na tese faise referencia ás colaboracións que tivo este traballo. 3) A tese é a versión definitiva presentada para a súa defensa e coincide coa versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que a tese non incorre en ningún tipo de plaxio doutros autores nin de traballos presentados por min para a obtención doutros títulos. En Santiago de Compostela, a 21 de Outubro de 2019. Asdo. Renata Calo Lapido AUTORIZACIÓN DO DIRECTOR / TITOR DA TESE TÁCTICAS QUÍMICAS PARA CONTROLAR A INTERACCIÓN DE SISTEMAS SINTÉTICOS CON ÁCIDOS NUCLEICOS D. José Luís Mascareñas Cid. D. Marco Eugenio Vázquez Sentís. INFORMA/N: Que a presente tese, correspóndese co traballo realizado por Dna. Renata Calo Lapido, baixo a miña dirección, e a utorizo a súa presentación , considerando que reúne os r equisitos esixidos no R egulamento de Estudos de Doutoramento da USC, e que como director desta non incorre nas causas de abstención establecidas na Lei 40/2015. En .Santiago de Compostela, 21 de Outubro de 2019. Asdo. José Luis Mascareñas Cid. Asdo. Marco Eugenio Vázquez Sentís. mais soó os iñorantes e féridos e duros, imbéciles e escuros non nos entenden, non. […] fillos dos nobres celtas, fortes e peregrinos, luitade polos destinos dos eidos de Breogán. (Eduardo Pondal, Queixumes dos pinos, 1886) Para miña nai, meu pai e Juansiño. Por educarme, instruírme e apoiarme. Por compoñer cada pesa dos valores que me forman como persona hoxe en día. Por enseñarme a SER. FAMILIA. HATU hexafluorofosfato de 2-(1H -7azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3tetrametiluronio m Multiplete min minutos M Molar MeOH Metanol MeCN Acetonitrilo mL Mililitro MPAA 4-(carboximetil) tiofenol EM Espectrometría de masas N Nitróxeno NBS N-Bromosuccinimida NMM N-metilmorfolina nm Nanómetro RMN Resonancia magnética nuclear s Singlete t Triplete T Timina t.a Temperatura ambiente TFA ácido trifluoroacético THF Tetrahidrofurano TMR tetrametilrodamina tR Tempo de retención UV Ultravioleta VIS Visible 1. INTRODUCIÓN Introdución 19 1.1. A QUÍMICA BIOLÓXICA Non é doado establecer de maneira precisa o significado do termo Química Biolóxica, xa que estas dúas palabras abarcan milleiros de conceptos. Podería dicirse que a Química Biolóxica é unha nova rama multidisciplinar da ciencia na que se aplican técnicas e coñecementos químicos para o estudo de sistemas biolóxicos, e que adapta o coñecemento das ciencias da vida para progresar na Química A Química crea as ferramentas que permiten entender a bioloxía a nivel molecular. Exemplos destas ferramentas son a creación de pequenas moléculas capaces de interactuar cas biomoléculas que constitúen os seres vivos (ADN, proteínas, ARN…) ; os biomarcadores para detectar e explicar o funcionamento de estas biomoléculas, ou os medicamentos, para tratar determinadas enfermidades, combater a resistencia a antibióticos, deseñar novos antivirais etc. A finalidade última da Química Biolóxica consiste en entender os problemas biolóxicos e propoñer novas solucións no ámbito biomédico. Para isto, esta disciplina abrangue o deseño de modelos e sondas sintéticas, a introdución, liberación e estudo do seu comportamento a nivel celular, o control sobre asúa interacción con biomoléculas naturais ata o punto de poder manipular a expresión xénica, o ciclo celular, ou outros procesos. Aínda que as súas orixes poden considerarse no século XIX, a Química Biolóxica asentou os seus piares e acadou un progreso exponencial no século XX da man dos avances tecnolóxicos en técnica sintéticas e analíticas e as sinerxías co progreso na bioloxía molecular e celular. Poderiamos nomear como dous dos pioneiros deste campo a Joseph Priestley e Humprey Davy que, a finais do 1700 e comezos do 1800, comprobaban os efectos terapéuticos de gases químicos que eles illaban en organismos vivos: aplicaban a química para mellorar no eido da bioloxía. O primeiro usaba animais vivos, neste caso ratos, e testaba a súa supervivencia despois de expoñelos a diversos gases que illaba, como o óxido de nitróxeno. O segundo pola contra, experimentaba en si mesmo os efectos secundarios de inhalar ditos gases.1 Sen dúbida, foi uns anos máis adiante, en 1828, cando Friedrich Whöler marcou un antes e un despois na fronteira entre a química e a bioloxía. Por casualidade, este químico alemán deu 1 a) Priestly, J. Experiments and Observations on Different kinds if Air (Johnson Press, London, 1774). b) K. L. Morrison, G. A. Weiss, Nat. Chem. Biol. 2006, 2, 3. RENATA CALO LAPIDO 20 sintetizado urea a partir só de materiais inorgánicos,2 demostrándose así que non se precisaba de organismos vivos para sintetizar compostos biolóxicos. En 1856, o inglés Perkin sintetizou o primeiro colorante químico, a mauveina.3 Un derivado da anilina cunha rechamante cor malva (de aquí o nome) que abriu paso ao uso dos colorantes sintéticos na industria téxtil amais de iniciar o uso de ditos derivados da anilina para a tinguidura de células específicas. Grazas a isto, e baseándose en que unhas células eran capaces de tinguirse de maneira diferente que outras co mesmo colorante, podemos hoxe en día denominar ao que foi premio Nobel Paul Ehrlrich como o pai da quimioterapia, pois deu sintetizado un composto, o salvarsán,4 capaz de actuar selectivamente sobre os patóxenos causantes da sífilis e que non afectaba ao resto do organismo. Ponse así de manifesto o impacto e importancia que ten o controlar procesos celulares con pequenas moléculas sintetizadas no laboratorio para o tratamento de enfermidades. Todo isto, sumado á elucidación da estrutura do ADN, o descifrado do código xenético e o deseño da metodoloxía para a síntese química de péptidos e proteínas, xa na segunda metade do século XX contribuiron a que química biolóxica se reafirmase como unha disciplina científica. 2 F. Wöhler, Ann. Chim. Phys. 1828, 37, 330. 3 W. H. Perkin, J. Chem. Soc., Trans. 1896, 69, 596. 4 P. Ehrlich, A. Bertheim, Berichte. 1912, 45, 756. Introdución 21 1.2. O ADN, O FUNDAMENTO DA VIDA. 1.2.1. Estrutura O ADN, ou ácido desoxirribonucléico, é unha macromolécula formada por nucleótidos unidos a través do grupo hidroxilo 5' do fosfato dunha pentosa co grupo hidroxilo 3' da pentosa seguinte mediante enlaces fosfodiéster. Un nucleótido está formado por un monosacárido (a β-D-2'-desoxirribosa), unha base nitroxenada e un grupo fosfato.5 As bases están unidas ao carbono 1' do azucre mediante enlace N-β-glicosídico. Hai catro bases diferentes, dúas de tipo púrica que son a adenina(A) e a guanina (G) e dúas de tipo pirimidínica: a timina (T) e a citosina ( C). Tódolos nucleótidos que forman este polímero teñen a mesma desoxirribosa, polo que a diferencia entre diferentes ADN radica tan só na orde das bases nitroxenadas unidas a estas desoxirribosas. As propiedades das bases e a disposición destas inflúen no tipo de estrutura secundaria do ácido nucleico e son as que permiten xerar unha gran variabilidade. Os grupos fosfato están desprotonados a pH fisiolóxico polo que o ADN ten carácter ácido.6 Figura 1. Representación dos catro nucleótidos que forman o ADN. Debaixo escrito o nome da base que o forma. Na primeira molécula indícase a numeración estándar dos átomos de carbono da aldopentosa. Baseados nos experimentos de difracción de raios X de Rosalind Franklin e na lei de quivalencia de bases de Erwing Chargaff, Francis Crick e James Watson postulaban nun artigo en 1953 un modelo para a estrutura tridimensional do ADN.7 Anos despois, estes dous científicos mais Maurice Wilkins gañaban o Premio Nobel de Medicina grazas a este artigo. Iso si, a pesares de que foi Rosalin Franklin quen realizou a difracción de Raios X da dobre hélice na que se fundamentaron o Watson e Crick, nunca obtivo recoñecemento por parte dos seus 5D. L. Nelson, M. M. Cox, Lehninger. Principios de Bioquímica. Quinta edición, 2009, Editorial Omega. 6 R. Lavery, C. Zadecki, J. Westbrook, Oxford Handbook of Nucleic Acid Structure, Oxford 1999. 7 J. D. Watson, F. H. C. Crick, Nature 1953, 171, 737. RENATA CALO LAPIDO 22 colegas. É mais, crese que a investigadora nunca chegou a saber que os biólogos viran a súa imaxe de raios X antes de faceren o postulado da dobre hélice.8 Grazas a estes traballos e posteriores estudos, quedou establecido que o ADN está constituído por dúas cadeas antiparalelas de desoxirribonucleótidos que se asocian, unha coa outra, a través de pontes de hidróxeno entre pares de bases complementarias, formando unha dobre hélice dextróxira. Concretamente, a adenina forma dúas pontes de hidróxeno coa timina e a guanina forma tres coa citosina. As bases tentan minimizar a superficie en contacto coa auga e dispóñense no interior do dúplex mediante interaccións de amoreamento π. O esqueleto de pentosa-fosfatos quedan cara o exterior e asócianse con catións para neutralizar parcialmente a carga e estabilizar a estrutura.9,5 Figura 2. Representación da estrutura dunha cadea de ADN con conformación B. Amósanse tanto o suco maior (cunha anchura de 22 Å) e o suco menor (de 12Å de ancho). A pH fisiolóxico a forma máis estable na que se atopa unha molécula de ADN denomínase Forma B. Esta estrutura está caracterizada por ter unha anchura de hélice de 2 nm e conter 10,5 pares de bases e unha alzada de 3,6 nm por volta completa. A disposición entre as cadeas e a xeometría dos azucres forman dous sucos de tamaños desiguais e con atributos xeométricos diferentes, chamados suco maior e suco menor. O suco maior é ancho e pouco profundo (7,5 Å), mentres que o suco menor é máis estreito pero máis profundo (8,5 Å). 8 J. D.Watson, The double helix, 1968, Editorial Weindenfeld & Nicolson. 9 V. A. Bloomfield, D. M. Crothers, I. Tinoco, Nucleic Acids; structures, properties and functions, 2000, University Science Books, Sausalito. Introdución 23 1.2.2. Función biolóxica O ADN é, sen dúbida, a biomolécula orgánica máis importante, xa que garda a información codificada a partir da cal se forma un organismo vivo. As funcións do ADN son o almacenamento e a transmisión da información xenética. A secuencia liñar de nucleótidos conforma a estrutura primaria do ADN. A través dos procesos descritos no Dogma Central da Bioloxía Molecular,10 que se explicará mais adiante, esta secuencia de nucleótidos transfórmase en ARN e, finalmente nunha proteína funcional. A continuidade na existencia dunha especie esixe que a súa información xenética se manteña estable e íntegra. O ADN é o responsable de manter esta integridade intacta e de transmitir todo o material xenético dunha xeración de células é seguinte. Esta información xenética contén instrucións para formar tódolos compoñentes celulares, ademais de actuar como molde para producir moléculas idénticas de ADN que serán distribuídas á proxenie tras dividirse a célula. É por iso que o ADN é a única biomolécula que dispón de mecanismos de reparación propios As cadeas de ADN son enormes, polo que este adoita atoparse superenrolado. De toda a cantidade de ADN que teñen os organismos, tan só unha pequena porcentaxe se chega a traducir en polipéptidos ou ARN funcionais. Os pequenos fragmentos que codifican estas secuencias primarias denomínanse xenes, e o conxunto de todos eles dentro dun individuo é o seu xenoma.11Cada xene ten encriptado a secuencia para formar unha única proteína. 10 F.H.C Crick, Nature 1970, 227, 561. 11 H. Pearson, Nature 2006, 441, 398. RENATA CALO LAPIDO 24 1.3. AS PROTEÍNAS, O FUNCIONAMENTO DA VIDA. 1.3.1. Estrutura As proteínas son as biomoléculas máis abundantes nos seres vivos. Están formadas pola unión covalente de varios aminoácidos mediante un enlace que se chama comunmente enlace peptídico. Un aminoácido está constituído, alomenos, por un grupo amino e un grupo ácido (carboxilo) unidos a unha cadea carbonada. Segundo a posición do grupo amino, estas moléculas poden clasificarse en α, β, γ…-aminoácidos. Figura 3.Esquerda: Estrutura xeral dun aminoácido. Dereita: Representación dun enlace peptídico entre dous L-aminoácidos. Os que compoñen as proteínas son os α-aminoácidos e hai vinte diferentes amplamente estendidos. Para facilitar a escritura das proteínas, a estes vinte aminoácidos estándar asignóuselles unha abreviatura de tres letras ou símbolos dunha soa letra.12 O que os diferencia entre si é o outro grupo unido ao carbono α, que se denomina cadea lateral, que lles confire as propiedades individuais a cada un dos aminoácidos. Segundo a natureza do grupo R nas cadeas lateraies, os aminoácidos proteicos clasifícanse en tres grupos: básicos (posúen grupos amino na cadea lateral. Son os Arg, Lys, His), ácidos (teñen carboxilos na cadea lateral: Asp e Glu) e neutros (a carga neta é nula a pH neutro porque non teñen grupos ionizables nas cadeas laterais. Estes son: Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Gln, Asn). Debido a que o carbono α é quiral, estes monómeros presentan dous enatiómeros. A pesares diso, as proteínas só se compoñen de residuos na súa forma estereoisomérica L. As proteínas sintetízanse a través do acoplamento dun aminoácido cuxo extremo carboxílico reacciona co extremo amino doutro formando un enlace de tipo amida (tamén coñecido como enlace peptídico). Este enlace ten dúas formas resoantes que lle confiren 12 M. Saffran, Biochem. Educ. 1998, 26, 116. Introdución 25 estabilidade e carácter parcial de dobre enlace. Debido a isto, o enlace peptídico non pode rotar e os átomos de C, O, N colócanse no mesmo plano, quedando os grupos laterais ‘colgando’ do polipéptido.13,5 Segundo a cantidade de residuos que se unan para formar a cadea, os polímeros obtidos reciben o nome de oligopéptidos (poucas unidades de aminoácidos) ata péptidos ou proteínas (milleiros de residuos). Por mor da lonxitude destas macromoléculas e a diversidade de funcións que desenvolven dentro do organismo, as proteínas organízanse en catro niveis estruturais diferentes: Estrutura primaria: é a secuencia de aminoácidos dun péptido (ou proteína). É dicir, o número, tipo e orde dos residuos na cadea. Sempre hai un extremo co grupo amino libre que se denomina extremo N-terminal e outro co grupo carboxilo libre que se coñece como C-terminal. Os péptidos numéranse a partir do extremo N-terminal, e sempre se escribe a súa secuencia a partir de ese extremo. Estruturas secundaria: é a disposición espacial de determinados fragmentos do esqueleto polipeptídico que se repiten ao longo da proteína. En gran parte é consecuencia das pontes de hidróxeno entre os enlaces C=O e N–H e no que non interveñen as cadeas laterais. Dentro desta pregamento destacan dous tipos básicos: a hélice α14 e a lámina β.15A primeira consiste nun enrolamento en espiral da cadea sobre si mesma ao longo dun eixe lonxitudinal imaxinario no sentido de xiro das aguias dun reloxo. Cada volta contén 3.6 aminoácidos. As pontes de hidróxeno fórmanse entre un aminoácido e o cuarto que lle segue na cadea. As cadeas laterais dispóñense cara o exterior da hélice. Na lámina β, dous fragmentos peptídicos acóplanse mediante pontes de hidróxeno transversais. As cadeas adxacentes poden dispoñerse no mesmo sentido (paralelas) ou en sentidos opostos (láminas antiparalelas). A forma resultante semella unha folla pregada en zigzag. Os grupos R sobresaen da estrutura dispoñéndose alternativamente por riba ou por debaixo, en sentidos opostos, do plano da folla. Estrutura terciaria: É a organización que resulta de tódolos pregamentos secundarios ao longo de toda a cadea, e a disposición espacial final que esta adopta para dar lugar á estrutura 13 A) L. Pauling, R. B. Corey, H. R. Branson, Proc. Nat. Acad. Sci. 1951, 37, 205. B) L. Stryer, J. M. Berg, J. L. Tymoczko, Bioquímica con aplicaciones clínicas, 2012, Editorial Reverté. 14 D. Eisenberg, Proc. Nat. Acad. Sci. 2003, 100, 11207. 15 L. Pauling, R. B. Corey, H. R. Branson, Proc. Nat. Acad. Sci. 1951, 37, 251. RENATA CALO LAPIDO 32 pode dar lugar a péptidos ramificados nesa posición. Para solucionar tal problema, no 2015, o mesmo grupo de Dawson publicou a mesma metodoloxía mellorada, na que a amina en orto estaba metilada e ó que denominaron MeNbz, un Nbz de segunda xeración.39 Figura 8. Proceso de formación do RNbz (primeira e segunda xeración) a partir do RDbz en fase sólida. Adaptado da ref. [40]. 39 J. B. Blanco-Canosa, B. Nardone, F. Albericio, P. E. Dawson, J. Am.Chem. Soc. 2015, 137, 7197. 40 J. Palà-Pujadas, F. Albericio, J. B. Blanco-Canosa, Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 16120. Introdución 33 1.4. OS FACTORES DE TRANSCRICIÓN, A INTERACCIÓN CO ADN 1.4.1. O Dogma Central da Bioloxía Molecular A información xenética que contén o ADN é a causa da síntese de proteínas específicas, responsables de case tódalas funcións e características dun organismo. Amais, a continuidade nunha especie esixe a transmisión fiel desta información dende as células nai ás células fillas. Unha célula usa tres procesos principais para manter intacta e converter a información xenética codificada no ADN en produtos funcionais, que poden ser ben proteínas, ben ARN. Estes procesos denomínanse: replicación, transcrición e tradución. O fluxo da información xenética dende o ADN a ARN ou proteínas descríbese mediante o coñecido como Dogma central da Bioloxía Molecular, que deu a coñecer Francis Crick nun simposio a finais do 5741 e que sería publicado no 1970.42 Polo tanto, estableceuse que a información xenética flúe da seguinte maneira: o ADN copia a súa mensaxe en forma de ARN mensaxeiro (transcrición) e,posteriormente, esta mensaxe é usada para sintetizar proteínas (tradución). Estas dúas etapas son coñecidas co nome de Expresión Xénica. Figura 9. Esquema do dogma central da bioloxía molecular. As liñas continuas indican os pasos permitidos. As liñas descontinuas, só aqueles casos permitidos en ocasións excepcionais e a ausencia de liña indica que ese sentido de fluxo está prohibido. Adaptado da ref. [42] A maiores, hai outras rutas de intercambio de información posibles, que se representan na Figura 9. 1.4.1.1. A replicación Cando unha célula se divide, o seu material xenético debe pasar ás células fillas de forma exacta. É por iso que o primeiro paso fundamental do Dogma Central é a duplicación ADN en dúas copias iguais. Para isto, a dobre hélice ábrese e o enzima ADN Polimerasa III realiza unha 41 F. H. Crick, Symp. Soc. Exp. Biol. 1958, 12, 138. 42 F. H. Crick, Nature 1970, 227, 561. RENATA CALO LAPIDO 34 copia complementaria de cada cadea xerando dúas dobres hélices novas de maneira semiconservativa, é dicir, no que cada dobre hélice posúe unha cadea da febra nai. 1.4.2. A Expresión Xénica 1.4.2.1. A transcrición Nesta etapa, a secuencia de ADN do xene que se vai expresar é rescrita en forma de ARN, que se denomina pre-ARN mensaxeiro (ARNm). En células eucariotas ten lugar no núcleo celular. O proceso lévase a cabo cando a ARN polimerasa se fixa a rexión específicas do ADN (xene promotor) e crea unha cadea de ARN complementaria e antiparalela ao ADN que quere copiar. Nesta cadea de pre-ARNm, a T é substituída por uracilo (U). O pre-ARNm sofre algunhas modificacións que o converten nun ARNm maduro e este pasa ao citoplasma Figura 10. Representación do proceso de transcrición. A ARN polimerasa (en verde) únese ao promotor e vai xerando o ARN mensaxeiro (vermello) durante a elongación. Adaptada da ref. [43] 1.4.2.2. A tradución O último paso da expresión xénica consiste en descodificar o ARN mensaxeiro creado na transcrición, e convertelo na secuencia de aminoácidos determinada. Como neste paso se cambia da linguaxe dos nucleótidos aos aminoácidos, denomínase tradución. O ARNm viaxa dende o núcleo ata o citoplasma, onde se adhire aos ribosomas que se encargan de ler os nucleótidos do ARN e traducilos a aminoácidos para formar a proteína. O nucleótidos son lidos en grupos de tres, chamados codóns. Hai 61 codóns que codifican os 20 aminoácidos e 3 codóns que se usan para marcar o fin da tradución. Os codóns son recoñecidos por moléculas de ARN especiais, denominadas ARN de transferencia (ARNt), os cales levan enganchados nun extremo 43 Cell Biology, third edition, 2017, capítulo 10 pp 165-187. Introdución 35 o aminoácido correspondente co codón que len. Os ARNt axeitados únense aos codóns no ribosoma e provocan a que dous aminoácidos dos seus extremos próximos se unan, formando o polipéptido específico para ese ARNm. Cando os ARNt atopan o codón de terminación, as subunidades ribosómicas sepáranse e o péptido formado é liberado. Figura 11. Representación da expresión xénica nunha célula eucariota. Adaptada da ref. [16] A síntese de proteínas depende das necesidades celulares, só se realiza cando é preciso para non despilfarrar moléculas nin enerxía. Por outra banda, unha expresión descontrolada de xenes pode afectar a múltiples de procesos do ciclo celular e desencadear enfermidades. Dedúcese pois que a expresión dos xenes está altamente regulada, sobre todo en organismos pluricelulares para conseguir a especialización celular. A etapa máis controlada é o inicio da transcrición. De feito, é comunmente dito que se se controla a transcrición, contrólase a expresión xénica. Existen proteínas reguladoras que teñen o papel de inhibir ou activar esta etapa ao unirse a secuencias específicas de ADN dos promotores dos xenes que regulan. Estas proteínas denomínanse Factores de Transcrición. RENATA CALO LAPIDO 36 1.4.3. Tipos de Factores de transcrición Os factores de transcrición son as proteínas encargadas de activar ou inhibir a expresión dun xene mediante a súa unión a secuencias de ADN denominadas reguladoras. Esta unión permite controlar a transcrición dos xenes de forma espacial e temporal. Adoitan clasificarse segundo a súa estrutura de recoñecemento de ADN en: 1.4.3.1. Dedos de Zinc Este é o grupo de proteínas máis abundante. En células eucariotas, caracterízanse por ter unha rexión duns trinta aminoácidos que poden unirse tanto a ADN, como ARN ou outras proteínas ou lípidos, en forma de oligómeros. Adoitan ser estruturas de hélice α combinada con dúas rexións de lámina β ( chamadas ββα).44 Estes dominios presentan cistinas e histidinas cuxas cadeas laterais se coordinan ao ión metálico de Zn2+, coordinación que estabiliza a estrutura secundaria do dominio proteico, e facilita que a proteína adopte a conformación necesaria para a interacción co ADN. Figura 12. Esquerda: Estruturas tridimensionais dalgúns dominios de dedos de Zn de importantes factores de transcrición. As cistinas e as histidinas que coordinan o ión Zn están resaltadas na estrutura. Adaptada da ref. [45b]. Dereita: Proteína con tres dedos de cinc que recoñecen rexións con tres pares de bases consecutivas: GCG-TGG-GCG. Adaptada da ref. [43] 44 J. M. Matthews, M. Sunde, IUBMB Life 2002, 54, 351. Introdución 37 1.4.3.2. Hélice-xiro-hélice (HTH) e Homeodominio Este dominio é característico das células procariotas. Consta de dúas hélices α de aproximadamente 60 aminoácidos separadas por un xiro β. Unha das hélices, hélice de recoñecemento, interacciona co suco maior do ADN recoñecendo unha secuencia de 6 pares de bases. Os monómeros HTH non son estruturas estables por si mesmos, polo que poden chegar a formar complexos con maior número de hélices. En bastantes casos, do extremo N-terminal colga un brazo flexible, con residuos básicos, que interacciona co suco menor aportando estabilidade e maior afinidade. Este tipo de estruturas en eucariotas denomínanse Homeodominios. Figura 13. Exemplo de homeodominio recoñecendo a secuencia TAATGG. Adaptada da ref. [43] 1.4.3.3. Cremalleiras de Leucinas (bZip) Estes factores de transcrición caracterízanse por ter dous motivos diferenciados: unha rexión rica en aminoácidos leucina, situada no extremo C-terminal, que permiten a dimerización, e outra rexión denominada básica, situada no extremo N-terminal, que recoñece ADN. Normalmente as Leu sitúanse cada sete aminoácidos (dúas voltas de hélice) da secuencia C-terminal. Unha proteína con este patrón de repetición das leucinas interacciona de forma hidrofóbica con outra hélice do mesmo tipo, creando dímeros (coiled coil). A rexión adxacente ás leucinas é moi básica, comprende varios residuos de Arg ou Lys que establecen interaccións iónicas favorables cos fosfatos e coas bases do ADN e permiten así a unión con este. É pois que se denomina habitualmente cremalleira básica de leucinas(bZip) en lugar de LeuZip. RENATA CALO LAPIDO 38 Figura 14. Raios X do dímero bZip de c-Jun (vermello) e c-Fos (azul) recoñecendo a secuencia consenso de ADN. O dímero Fos-Jun está envolto en procesos de regulación da proliferación celular, da apoptose ou diferenciación. 1.4.3.4. Dominios hélice-bucle-hélice (HLHZip) O dominio de HLH comprende aproximadamente uns 60 aminoácidos con dúas rexións diferentes: unha é a rexión básica e a outra o motivo HLH. A parte básica adoita estar no extremo N-terminal e consta duns 15 aminoácidos cuns seis residuos básicos. Esta parte é a que recoñece ADN. A outra rexión, máis longa, contén dúas hélices α de carácter anfipático, separadas por un pequeno bucle, xeralmente de 8 aminoácidos. Esta parte hidrofóbica permite a dimerización entre proteínas,45 de forma similar a unha proteína bZIP. 1.4.4. c-MYC c-MYC é unha proteína de 439 aminoácidos da familia dos factores de transcrición MYC, que son cremalleiras de leucinas cunha rexión básica e con dominios hélice-bucle-hélice (HLH). Esta familia está formada por tres membros: c-MYC, N-MYC e L-MYC, pero moitas proliferacións celulares dependen unicamente de c-MYC. c-MYC (a partir dagora chamaráselle MYC) está involucrada en múltiples funcións biolóxicas das células somáticas: na regulación do crecemento, proliferación, no metabolismo, na apoptose e na diferenciación celular.46 Unha das funcións é promover a transcrición de determinados xenes e reprimir a expresión doutros: Por un lado, MYC encárgase de activar a transcrición de xenes que promoven o ciclo celular47 e, por outro, inhibe a transcrición de xenes que deteñen o ciclo celular, é por iso que pode 45 a) W. R. Atchley, W. Terhalle, A. Dress, J. Mol. Evol. 1999, 48, 501. b) S. Jones, Genome Biol. 2004, 5, 226. 46 N. Meyer, L. Z. Penn, Nat. Rev. Cancer 2008, 8, 976. 47 a) S. Adhikary, M. Eilers, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005, 6, 635. b) M. D. Cole, M. A. Nikiforov, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006, 302, 33. Introdución 39 promover a proliferación celular.48 A célula controla estritamente o mecanismo de regulación de MYC mais pequenos fallos provocan a súa sobreexpresión que se traduce nunha actividade proliferativa aumentada.49 A rexión básica de MYC encárgase de facer posible a unión ao suco maior do ADN, mentres que o dominio de cremalleira de leucinas rexe a súa capacidade de dimerización. De feito, para que MYC leve a cabo as súas funcións, debe heterodimerizar con outra bHLHZip chamada MAX.50 Este heterodímero MYC/MAX enlázase a unha rexión específica do xene promotor diana, o E-box (ou rexión E), que presenta a secuencia diana CACGTG.51 MAX é capaz de formar homodímeros MAX/MAX e tamén heterodímeros con outras proteínas: MYC/MAX, MXD/MAX, MNT/MAX etc (ver Figura 16). Pola contra, MYC só heterodimeriza con MAX e os homocomplexos MYC/MYC son moi inestables. Grazas ás estruturas cristalinas e á elucidación dos raios X dos dímeros unidos á secuencia de ADN CACGTG, puido descifrarse a topoloxía e a forma coa que estas familias de factores de transcrición interacionan co ADN.52 Cada proteína individualmente presenta dous dominios de hélices α separados polo bucle. A primeira hélice α contén residuos da rexión básica e da denominada hélice 1 (H1), a segunda hélice α abrangue a H2 e a cremalleira de leucinas. Os complexos de recoñecemento consisten en dous monómeros que se dispoñen paralelamente para dar un dímero con catro hélices α separadas por dous bucles. As rexións básicas insírense no suco maior do ADN mediante contactos específicos coa E-box. Os dous segmentos C-terminais interaccionan mediante forzas iónicas e hidrofóbicas estabilizando a unión das dúas proteínas.53 48 D. Kleine-Kohlbrecher, S. Adhikary, M. Eilers, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006, 302, 51. 49 M. Conacci-Sorrell, L. McFerrin, R. N. Eisenman, Cold Spring Harbor Perspect. Med. 2014, 4, a014357. 50 a) B. Amati, M. W. Brooks, N. Levy, T. D. Littlewood, G. I. Evan, H. Land, Cell 1993, 72, 233. b) E. M. Blackwood, B. Luscher, R. N. Eisenman, Genes Dev. 1992, 6, 71. c) A. L. Gartel, K. Shchors, Exp. Cell Res. 2003, 283, 17. 51 a) P. C. Fernández, S. R. Frank, L. Wang, M. Schroeder, S. Liu, J. Greene, A. Cocito, B. Amati, Genes Dev. 2003, 17, 1115. b) G. C. Prendergast, D. Lawe, E. B. Ziff, Cell 1991, 65, 395. 52 A) A. R. Ferre-D’Amare, G. C. Prendergast, E. B. Ziff, S. K. Burley, Nature 1993, 363, 38. B) S. K. Nair, S. K. Burley, Cell 2003, 112, 193 53 L. A. Jung, A. Gebhardt, W. Koelmel, C. P. Ade, S. Walz, J. Kuper, B. von Eyss, S. Letschert, C. Redel, L. d’Artista, A. Biankin, L. Zender, M. Sauer, E. Wolf, G. Evan, C. Kisker, M Eilers, Oncogene 2017, 36, 1911. RENATA CALO LAPIDO 40 Figura 15. Representación da interacción de heterodímero MYC (verde)/MAX (laranxa) co ADN. PDB 1NKP. MYC e MAX pertencen a unha rede moi ampla de factores de transcrición do tipo bHLHZip que se encargan de regular diferentes aspectos do comportamento da celular. A maiores da familia de proteínas de MYC, nesta rede transcricional tamén interveñen membros de MXD (coñecidos orixinalmente como MAD) ou MNT. Figura 16. Esquema simplificado do mecanismo de activación de xenes promotores da proliferación celular debido á dimerización de MYC/MAX. Para activar a proliferación celular, o dímero MYC/MAX únese á E-box dos xenes promotores para iniciar a súa transcrición. Os membros de Mxd actúan como antagonistas de MYC, así, as proteínas MXD e MNT forman heterodímeros con MAX e compiten co heterodímero MYC/MAX por unirse ás mesmas rexións de ADN (E-boxes) dos xenes promotores (ver Figura 16).54 O mecanismo para a inhibición da transcrición dos xenes 54 A) M. Conacci-Sorrell, L. McFerrin, R. N. Eisenman, Cold Spring Harbor Perspect. Med. 2014, 4, a014357. B) C. Grandori, S. M. Cowley, L. P. James, R. N. Eisenman, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000, 16, 653. Introdución 41 involucrados na supresión do ciclo celular non está tan claro, pero tamén depende da interacción do dímero MYC/MAX con outros co-reguladores e factores de transcrición.55 MYC está considerada como unha das principais dianas terapéuticas no cancro, de feito, estímase que MYC está desregulado no 75 % do tumores.56 Ao mesmo tempo, é unha das dianas máis difíciles de abordar directamente, por varios motivos: o primeiro é que MYC se localiza no núcleo celular, localización complicada de acadar para anticorpos ou moléculas grandes deseñados para interaccionar con MYC; o segundo, que non posúe un sitio activo característico cunha conformación determinada, como o das enzimas, que poida servir como diana para pequenas moléculas.57 Como aínda no existe un método efectivo de interaccionar con MYC directamente, cada vez son máis os métodos indirectos para bloquear as funcións desta proteína, actuando sobre outros compostos esenciais que interveñen na desregulación da oncoproteína. Porén, hai moito interés en bloquear a dimerización entre MYC-MAX que é necesaria para unirse ao ADN e activar a transcrición. De feito, xa se desenvolvéron varios compostos que inhiben esta dimerización: a molécula pequena IIA6B17,58 o composto 10058-F459 ou o péptido OMOMYC, creado e amplamente estudado pola Dr. Laura Soucek. 1.4.5. OMOMYC OMOMYC é unha miniproteína de 93 aminoácidos que xorde da mutación do dominio bHLHZip de MYC, e que actúa coma o seu dominante negativo.60 Ca mesma secuencia que o extremo C-terminal da rexión Zip de MYC, diferéncianse só en catro mutacións na cremalleira de leucinas. Este análogo de MYC é quen de homodimerizar e heterodimerizar formando tanto MYC/OMOMYC como MAX/OMOMYC. O homodímero OMOMYC/OMOMYC (ΔG = –41 55 A) S. Adhikary, M. Eilers, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005, 6, 635. B) M. Eilers, R. N. Eisenman, Genes Dev. 2008, 22, 2755. 56 M. Kalkat, J. De Melo, K. A. Hickman, C. Lourenco, C. Redel, D. Resetca, A. Tamachi, W. B. Tu, L. Z. Penn, Genes 2017, 8, 151. 57 A) L. Soucek, J. Whitfield, C. P. Martins, A. J. Finch, D. J. Murphy, N. M. Sodir, A. N. Karnezis, L. B. Swigart, S. Nasi, G. I. Evan, Nature 2008, 455, 679. B) L. A. Cabaret, P. S. Rennie, A. Cherkasov, Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 120. 58 T. Berg, S. B. Cohen, J. Desharnais, C. Sonderegger, D. J. Maslyar, J. Goldberg, D. L. Boger, P. K. Vogt, Proc. Natl Acad. Sci. 2002, 99, 3830. 59 H. Wang, D. I. Hammoudeh, A. V. Follis, B. E. Reese, J. S. Lazo, S. J. Metallo, E. V. Prochownik, Mol. Cancer Ther. 2007, 6, 2399. 60 A) L. Soucek, M. Helmer-Citterich, A. Sacco, R. Jucker, G. Cesareni, S. Nasi, Oncogene. 1998, 17, 2463. B) L. Soucek, R. Jucker, L. Panacchia, R. Ricordy, F. Tato, S. Nasi, Cancer Research, 2002, 62, 3507. RENATA CALO LAPIDO 48 1.5.2.3. Unión ao suco menor Este é o grupo maioritario de axentes que se unen ao ADN. Os compostos máis propensos a realizar insercións no suco menor presentan heterociclos aromáticos (coma os polipirrois) con dicatións, poliaminas ou poliamidas. Adoitan ter estruturas ríxidas e planas compatibles co tamaño e forma do suco e desprazan moléculas de auga ao inserirse.75 A conformación da dobre hélice non se ve demasiado afectada despois da inserción. A unión estabilízase por enlaces de hidróxeno, forzas de Van der Waals e interaccións hidrofóbicas. Estes compostos teñen preferencia por rexións ricas en A/T, sendo os mais coñecidos a neotripsina, o berenil, a penta e a propamidina, a distamicina, Hoechst ou o DAPI. Figura 22. Estruturas dalgúns compostos que se insiren no suco menor. 75 A) W. S. Somers, S. E. Phillips, Nature 1992, 359, 387. B) T. Li, Y. Jin, A. K. Vershon, C. Wolberger, Nucleic Acids Res. 1998, 26, 5707. Introdución 49 A química sintética permitiu a preparación de numerosos derivados da distamicina, neotripsina ou propamidina,76 algún dos cales presentan propiedades de recoñecemento interesantes. Figura 23 Estrutura cristalina formada por Hoescht 33258(esquerda) e pentamidina (dereita) co suco menor do ADN. Adaptada da ref. [65]. Bisbenzamidinas As bisamidinas son os axentes de recoñecemento do suco menor con aplicacións médicas máis antigos e dos máis estudados: o DAPI (usado como tinguidor de núcleos celulares), a furamidina ou a pentamidina son os máis relevantes, e téñense usado incluso na medicinacomo antiparasitarios.77 A pentamidina, ao unirse ao ADN, dispón a súa parte central inserida no interior do suco, mentres que os extremos amidínicos quedan interaccionando co esqueleto fosfato aniónico.78 A pesares de que estas moléculas son pequenas e relativamente simples, a súa obtención sintética non é trivial e normalmente conleva rendementos pobres.79 76 A) C. Sessa, O. Pagani, M. G. Zurlo, J. de Jong, C. Hofmann, M. Lassus, P. Marrari, M. Strolin Benedetti, F. Cavalli, Ann. Oncol. 1994, 5, 901. B) M. Broggini, H. M. Coley, N. Mongelli, E. Pesenti, M. D. Wyatt, J. A. Hartley, M. D'Incalci, Nucleic Acids Res. 1995, 23, 81. 77 A) W. D. Wilson, F. A. Tanious, A. Mathis, D. Tevis, J. E. Hall, W. D. Boykin, Biochimie 2008, 90, 999. B) J. K. Thuita, S. M. Karanja, T. Wenzler, R. E. Mdachi, J. M. Ngotho, J. M. Kagira, R. Tidwell, R. Brun, Acta Trop. 2008, 108, 6. C) S. Neidle, L. R. Kelland, J. O. Trent, I. J. Simpson, D. W. Boykin, A. Kumar, W. D. Wilson, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7,1403. D) G. Susbielle, R. Blattes, V. Brevet, C. Monod, E. Kas, Curr. Med. Chem.-Anti-Cancer Agents, 2005, 5, 409. 78 M. R. Conte, T. C. Jenkins, A. N. Lane, Eur. J. Biochem. 1995, 229, 433. 79 F. Rodríguez, I. Rozas, M. Kaiser, R. Brun, B. Nguyen, W. D. Wilson, R. N. García, C. Dardonville, J. Med. Chem. 2008, 51, 909. RENATA CALO LAPIDO 50 No noso grupo de investigación descubriuse que a substitución dos osíxenos da propamidina por nitróxenos provoca o desprazamento cara maiores lonxitudes de onda de excitación (λ = 329 nm) e de emisión (λ= 387 nm). Amais, a intensidade de emisión fluorescente ten gran sensibilidade á polaridade do seu entorno. Deste xeito, a bis(4-amidinofenil)propan-1,3diamina (BAPPA), mostrou un incremento de fluorescencia ao incubar unha disolución 0.5 µ M en tampón Tris·HCl pH 7.5 20 mM, 100 mM NaCl co o seu ADN diana (5´-GCGC AAATTT GCGTTTTTTCGC AAATTT GCGC-3´). Este novo ligando do ADN, selectivo para secuencias ricas en A/T, tamén foi quen de internalizar células HeLa conservando a súas propiedades fluoroxénicas.80 As propiedades solvatocrómicas permiten estudar a unión a ADN sen recorrer a técnicas máis agresivas como as que se viñan usando ata o momento, como a desnaturalización térmica de complexos ligando-ADN.81 Figura 24 Esquerda: estrutura da azapropamidina (BAPPA). Dereita: espectro de emisión do BAPPA tras realizar unha valoración fluorescente engadindo a unha disolución 0,5 µM de BAPPA, alícuotas do seu ADN diana. O noso grupo de investigación desenvolveu un método moi sinxelo para obter este tipo de bisbenzamidinas fluoróforas nun único paso.82 A reacción consiste nunha simple aminación redutora entre a 4-aminobenceno carboximidamida, reactivo comercial, e diferentes tipos de dialdehidos (ver Figura 25). Deste xeito, pódese acceder, dunha forma rápida e versátil, a numerosos derivados bisbenzamidínicos, capaces de interaccionar con secuencias de ADN ricas en A/T. Todos estes derivados mostraron ser selectivos para secuencias ricas en A/T, cunhas constantes de afinidade 80 O. Vazquez, M. I. Sanchez, J. Martınez-Costas, M. E. Vazquez, J. L. Mascareñas, Org. Lett. 2010, 12, 216. 81 W. D. Wilson, F. A. Tanious, M. Fernandez-Saiz, C. T. Rigl, Methods Mol. Biol. 1997, 90, 219. 82 M. I. Sánchez, O. Vázquez, J. Mart´nez-Costas, M. E. Vázquez, J. L. Mascareñas, Chem. Sci., 2012, 3, 2383. Introdución 51 arredor de baixo micromolar. Esta aproximación permitiu deseñar facilmente varios sistemas fluorescentes baseados en marcadores con bisbenzamidinas .83 A pesar de tódolos avances, aínda hai moitos desafíos e retos neste ámbito da investigación, tales como a preparación de compostos que poidan responder a estímulos externos, o derivados con afinidades mais altas e boas selectividades. Figura 25. Reacción de aminación redutora entre a 4-aminobenceno carboximidamida e diferentes dialdehidos descuberta no grupo para obter bisbenzamidinas. Abaixo: Diferentes substituíntes arilo que poden conter os dialdehidos. 83 A) M. I. Sánchez, O. Vázquez, M. E. Vázquez, J. L. Mascareñas, Chem. Eur. J. 2013, 19, 9923 B) M. I. Sánchez, C. Pernas, E. Vázquez Sentís, J. L. Mascareñas, Chem. Sci., 2014, 5, 1901. C) J. Bordello, M. I. Sánchez, M. E. Vázquez, J. L. Mascareñas, W. Al-Soufi, M. Novo, Chem. Eur. J. 2015, 21, 1609. D) M. I. Sánchez, G. Rama, R. Calo-Lapido, K. Ucar, P. Lincoln, M. Vázquez, M. Melle-Franco, J. L. Mascareñas, M. E. Vázquez, Chem. Sci. 2019, doi: 10.1039/C9SC03053K. 2. OBXECTIVOS XERAIS Obxectivos Xerais 55 Nesta tese de doutoramento preténdese deseñar e sintetizar sistemas capaces de interaccionar de forma específica cos ácidos nucleicos, fundamentalmente co ADN. Un dos obxectivos é descubrir métodos para manipular a interacción con ácidos nucleicos de forma eficiente tanto de moléculas grandes como de moléculas pequenas. Desenvolver sistemas que incorporen elementos moleculares específicos e permitan controlar a vontade a transición entre un estado inactivo e outro activo, en resposta a determinados sinais ou estímulos externos non daniños para sistemas biolóxicos. Outro obxectivo fundamental é obter unha síntese eficiente de derivados da rexión de recoñecemento de ADN de oncoproteínas. Levarase a cabo a análise das propiedades de interacción co ADN destas miniproteínas así como o estudo das súas propiedades de internalización celular. Por último, pénsase deseñar biomarcadores fluorescentes capaces de recoñecer secuencias longas de nucleótidos características de diferentes enfermidades. A maiores, proponse o reto de recoñecer tanto suco maior como o suco menor do ADN con diferentes sistemas. Para isto, será preciso a posta a punto da metodoloxía de obtención de ditos sistemas, a optimización das súas sínteses e o estudo da interacción destes sistemas co ADN, así como a internalización en células vivas de ser o caso. 3. CAPÍTULO PRIMEIRO: SÍNTESE QUÍMICA DE ANÁLOGOS DE OMOMYC E MYC E RECOÑECEMENTO DO SUCO MAIOR DO ADN. RENATA CALO LAPIDO 64 Dado que o grupo xa desenvolvera unha síntese de [AQ]MYC en tres fragmentos, decidiuse comprobar se se podía levar a cabo cunha simple desconexión (dous fragmentos, 2Fr-LQN). Para iso elixiuse como punto de corte a Ala537 do bucle HLH pois está perfectamente situada para romper o péptido en dous fragmentos A500K536 e C537L581 de 37 e 45 aminoácidos. Trala LQN, unha desulfuración dará a proteína desexada. Nótese que se cambiarán os residuos Asn500→Ala e Asn515→Gln debido aos problemas de aspartimidación comentados anteriormente. Esquema 1. Esquema retrosintético para a obtención de [AQ]MYC mediante a estratexia de dous fragmentos (2-Fr-LQN). En canto a OMOMYC, preferiuse ensaiar primeiro a estratexia baseada en tres fragmentos realizando dúas LQN e, finalmente, unha desulfuración para obter o produto natural. As rexións de desconexión elixidas sitúanse nas Ala523 e Ala548 que xeran tres fragmentos: M497F522, C523T546 e C547A586 de 27, 25 e 39 residuos respectivamente. Por último, os derivados peptídicos marcados realizaranse mediante as estratexias correspondentes de tres fragmentos con LQN (3 Fr-LQN), pois son mais convenientes para introducir un fluoróforo, xa que se sintetizarían fragmentos pequenos. 581 500 AVKRRTHNVLERQRR AELKRSFFALRDQIP ELENNEKAP KVVILKKATAYILSV QAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQL rexión básica hélice 1 bucle hélice 2 cremalleira de leucinas 537 A500K536 P538L581 C 581 500 AVKRRTHNVLERQRR AELKRSFFALRDQIP ELENNEKCP KVVILKKATAYILSV QAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQL 537 AVKRRTHNVLERQRRAELKRSFFALRDQIPELENNEK CPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQL 500 536 538 581 Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 65 Esquema 2. Esquema retrosintético para a obtención deOMOMYC mediante a estratexia de tres fragmentos. A numeración da secuencia mantén a de MYC para maior coherencia 497 MTEENVKRRTHNVLERQRR NELKRSFFALRDQIP ELENNEKAP KVVILKKATAYILSV QAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCA 523 548 586 rexión básica hélice 1 bucle hélice 2 cremalleira de leucinas 497 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFF CLRDQIPELENNEKAPKVVILKKAT CYILSV QAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCA 523 548 586 497 524 548 586 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFF CLRDQIPELENNEKAPKVVILKKAT CYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCA 522 M497F222 CY548A586 CL524T546 RENATA CALO LAPIDO 66 3.4. SÍNTESE DO AMINOÁCIDO FMOC-DBZ (ÁCIDO 3-FMOC-4-DIAMINOBENZOICO) Para que unha reacción de LQN teña lugar, é preciso que se forme un tioéster no estremo C-terminal do fragmento N-terminal que participa na reacción, como se comentou na introdución (ver 1.3.2.2). Este tioéster fórmase in situ na reacción e para iso, débese introducir na secuencia peptídica en forma dun precursor deste tioéster. No caso deste traballo, empregouse o método das N-metilbencimidazolinonas (Nbz) para obter os tioésteres.39 O Nbz fórmase en fase sólida a partir dun derivado do ácido benzoico, denominado Dbz. Polo tanto, o primeiro paso realizado foi a síntese do aminoácido Fmoc-Dbz-OH para ancoralo á resina. O ácido 9 foi obtido seguindo un procedemento xa escrito na bibliografía.90 A ruta de síntese do Dbz, tal como se amosa no Esquema 3, comeza ca substitución electrófila aromática do flúor no ácido 4-fluoro-3-nitrobenzóico 6 con metilamina e precipitar o composto 7 a pH 5. O grupo nitro do produto obtido foi reducido cunha hidroxenación catalizada por Pd/C. Por último, e xa que este aminoácido se vai usar para SPFS co protocolo Fmoc/t-Bu, protexeuse a amina primaria con Fmoc-hidroxisuccinimida (Fmoc-OSu) acadándose o aminoácido desexado 9 cun alto rendemento global do 69 %. Esquema 3. Ruta sintética para obter o aminoácido Fmoc-Dbz-OH 90 N. C. Kuzniweski, J. Gertsch, M. Wartmann, H. K. Altmann Org. Lett. 2008, 10, 1183. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 67 3.5. SÍNTESE DE DERIVADOS DE MYC MEDIANTE ESTRATEXIA 2-FR-LQN Vendo a secuencia de [AQ]MYC sintetizada previamente no grupo, e tal como se indicou na proposta sintética, pode deducirse que un dos sitios de desconexión viables para a súa síntese é a Ala537 situada na rexión do xiro. Este corte divide á proteína en dous fragmentos de lonxitude comparable, viables de someterse á ligazón química nativa: A500K536-Dbz (37 residuos + Dbz) e C537L581 (45 residuos). Figura 29. Secuencia de aminoácidos da rexión de unión de MYC ao ADN. En azul as mutacións introducidas con respecto á proteína natural. En vermello os sitios de desconexión que se usarán para a síntese 2 FrLQN. É por isto que se decidiu realizar a síntese de [AQ]MYC a partir de dous fragmentos, cunha única reacción de LQN a través da A537 e comparar as vantaxes/desvantaxes con respecto á síntese de tres fragmentos. Esquema 4. Esquema da ruta sintética total para obter [AQ]MYC a través dunha única LQN. 3.5.1. Síntese dos fragmentos A preparación dos fragmentos realizouse en fase sólida91 asistida por microondas, usando o método Fmoc/t-Bu. Como soporte sólido elixiuse a resina Fmoc-Rink Amida ChemMatrix, a cal libera como amida o extremo C-terminal dos péptidos unha vez desancorados da resina. 91 I. Coin, M. Beyermann, M. Bienert, Nat. Protoc. 2007, 2, 3247. RENATA CALO LAPIDO 68 Na síntese do fragmento N-terminal A500K536-Dbz o primeiro paso é o acoplamento manual do precursor do tioéster necesario para a LQN, o chamado Dbz. Para isto, desprotéxese a amina da resina (protexida con Fmoc) con 20 % de piperidina en DMF durante 20 min. De seguido, acóplase o aminoácido derivado do N-metildiaminobenzoico usando HATU como activador do ácido, DIEA como base, e DMF como disolvente. Unha vez acoplado o primeiro residuo, complétase a síntese do resto da sequencia de forma automática, co sintetizador de péptidos. Debido a que o grupo protector Fmoc é máis lábil, o último aminoácido acoplado estará protexido con Boc, para evitar que a amina N-terminal quede libre e susceptible de reaccionar no seguinte paso de formación de Nbz. Despois de precipitar unha pequena cantidade de resina e comprobar por HPLC-EM que a secuencia peptídica está correcta, fórmase o derivado activado Nbz (Nacilmetilbencimidazolinona) para que poida ter lugar a reacción de LQN. A transformación do Dbz en Nbz transcorre por acilación da N-metilamina e formación dunha o-aminoanilida,92 que de seguido por tratamento con base provoca o ataque intramolecular da anilida cara o carbamato e a subsecuente formación dunha N-acilurea aromática (Esquema 5) 92 J.B. Blanco-Canosa, J.B. Dawson, Angew.Chem.Int.Ed. 2008, 47, 6851. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 69 Esquema 5. Ruta sintética ara a obtención do fragmento A500K536 -Nbz, N-terminal de MYC. Nun primeiro intento realizouse o alongamento da cadea peptídica no sintetizador automático seguindo protocolos estándar do aparello. Ao comprobar por HPLC-EM a síntese dos primeiros 18 aminoácidos desta secuencia atopouse un subproduto 17 unidades de masa menor que a masa desexada, que tiña un tempo de retención moi parecido ao produto principal (ver Figura 30.).93 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 2 4 6 8 10 12 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) tr= 7.4 min tr= 7.6 min 93 A partir dagora de non ser que se indique o contrario, os cromatogramas serán a lonxitude de onda 222 nm. RENATA CALO LAPIDO 70 0 200 400 600 800 1000 1200 600 800 1000 1200 1400 tr= 7.4 min prod -17 umas m/z (amu) intensidade [M+2H]2+ 1167.90 [M+4H]4+ 5584.69 [M+3H]3+ 779.46 80 160 240 320 400 480 600 800 1000 1200 1400 tr= 7.6 min prod m/z (amu) intensidade [M+2H]2+ 1176.85 [M+4H]4+ 589.04 [M+3H]3+ 785.46 Figura 30. Arriba: cromatograma dos 19 primeiros aminoácidos do fragmento A500K536-Dbz, a 222 nm. Abaixo dereita: espectro de masas para o pico do produto a 7.6 min. Abaixo esquerda: espectro masas obtido para o pico a 7.4 min que se corresponde co subproduto de aspartimidación. Esta diferencia de masa atribuíuse a unha reacción lateral experimentada polos residuos de Asn ou Asp, denominada desamidación ou aspartimidación.94 Esta reacción secundaria ten lugar no paso de Nα-desprotección con base do grupo Fmoc. Os subprodutos orixinados neste paso caracterízanse por ter un tempo de retención moi semellante ao produto principal da síntese, nos mellores casos o tempo de retención é lixeiramente diferente e pode separarse esta impureza na purificación, mais no é o habitual. Porén na maioría das ocasións, estes subprodutos detéctanse como unha anomalía no espectro de masas do produto principal xa que as masas do produto desexado se superpoñen cas masas das impurezas. 94 R. Subiros-Funosas, A. El-Faham, F. Albericio, Tetrahedron 2011, 67, 8595. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 71 Esquema 6. Reacción lateral de aspartimidación e subproduto da desamidación A asistencia á síntese de péptidos con microondas xera moitas vantaxes como o incremento das velocidades de reacción e os crús dos produtos son moito máis limpos.95 A irradiación de microondas adoita aplicarse tamén no paso da Nα-desprotección do Fmoc. Nestes casos os tempos de reacción pasan de 20 min, para as desproteccións en condicións estándar a temperatura ambiente, a 0.5 ou 3 min usando as microondas a 50-90 ºC.96 Mais hai estudos que corroboran que o uso de radiación incrementa até nun 10 % as reaccións laterais de aspartimidación naqueles péptidos susceptibles de sufrir estas transformacións, é dicir, os que conteñen residuos de Asp ou Asn..97 Está comprobado que o uso de HOBT como aditivo na disolución de desprotección reduce a reacción lateral de desamidación.98 Polo tanto, probouse de novo a síntese do fragmento A500K536-Dbz pero esta vez usando como disolución de eliminación do grupo Fmoc unha mestura de piperidina ao 20 % en DMF e 0.1 M de HOBT. 95 M. Erdeyli, A. Gogoll, Synthesis, 2002, 11, 1592. 96 S. Park, S. Gunasekera, T. Aboye, U. Goransson, Int. J. Pept. Res. Ther. 2010, 16, 167. 97 a) Palasek, S.A.; Cox, Z.J.; Collins, J.M. J. Pept. Sci, 2007, 13, 143.b) S. L. Pedersen, Chem. Soc. Rev. 2012, 14, 1826. 98 J. L. Lauer, C. G. Fields, G. B. Fields, Lett. Pept. Sci. 1994, 1, 197. RENATA CALO LAPIDO 72 Figura 31. Cromatograma do fragmento sintetizado con 0.1 M de HOBT Como se observa na Figura 31. Cromatograma do fragmento sintetizado con 0.1 M de HOBTFigura 31, a impureza de desamidación diminuíu ao engadir HOBT como aditivo mais non se eliminou por completo xa que puideron observarse as masas correspondentes á formación de dúas piperididas (+134). A maiores, tamén se comprobou que a reacción de aspartimidación parece que estaba favorecida dalgún xeito polo aminoácido Dbz. Sintetizouse un péptido que contiña os cinco primeiros aminoácidos do fragmento N-terminal pero sen o Dbz, con secuencia Fmoc-ENNEK cunha masa esperada era 853.9, e atopouse unha masa despois do seu análise por HPLC-EM de 854.8 (ver Figura 32). Este fragmento non presentaba ningunha clase de reacción lateral. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 4 8 12 16 20 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) prod tr= 11.6 min 0 20 40 60 80 100 120 600 800 1000 1200 1400 tr= 11.6 min m/z (amu) Intensidade [M+1H]1+ 854.8 Figura 32. Espectro de masas dos cinco primeiros aminoácidos sen o Dbz. Por outra banda, sintetizouse co Dbz o mesmo fragmento Fmoc-LENNEK-Dbz. Neste caso si se observou unha impureza de desamidación a maiores do pico do produto desexado (ver Figura 33). Isto indica que o Dbz ten algunha influencia na desamidación. 0 100 200 300 400 500 600 4 8 12 16 20 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 73 0 40 80 120 160 200 240 4 8 12 16 20 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) prod tr= 6.0 min aspartimidacion tr= 6.8 min prod sen Dbz Figura 33. Cromatograma de Fmoc-LENNEK-Dbz. Vese pico de impureza de desamidación a 6.8 min. Unha búsqueda na bibliografía amosou que cambiar a base piridina por piperazina reduce a formación das aspartimidas.99 A maiores de reduciresta reacción lateral, a piperazina é un produto comercial máis barato e fácil de conseguir que a piperidina xa que este último é un precursor da droga fenilciclohexilpiperidina (comunmente coñecida como Po de Anxo) e cuxo uso está moi restrinxido e regulado. Polo tanto, decidiuse cambiar a disolución de desprotección por piperazina ao 5 % (m/v) en DMF mais 0.1 M de HOBT. Observándose, esta vez, a síntese do produto desexado satisfactoriamente, sen subprodutos como se observa na Figura 34. 0 40 80 120 160 200 240 280 6 8 10 12 14 16 18 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) tr= 10.1 min 0 20 40 60 80 100 120 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 tr= 10.1 min m/z (amu) Intensidade [M+4H]4+ 1189.3 [M+3H]3+ 1585.8 [M+10H]10+ 475.3 [M+5H]5+ 951.5 [M+6H]6+ 792.9 Figura 34. Esquerda cromatograma do cru da síntese do fragmento A500K536-Dbz a 222 nm. Dereita: espectro de masas do pico do produto a tempo de retención 10.1 min. Por último, o residuo Dbz transformouse en Nbz seguindo os pasos explicados anteriormente, desancórase da resina e purifícase por cromatografía en fase reversa. 99 J. D. Wade, M. N. Mathieu, M. Macris, G. W. Tregear, Lett. Pept. Sci. 2000, 7, 107. RENATA CALO LAPIDO 80 O primeiro paso desta ruta é introducir a anilida non natural xa coñecida como Dbz. Este paso realízase manualmente sobre a resina Rink-Amide ChemMatrix usando a sal de uronio HATU como axente activante. O resto dos aminoácidos acopláronse co sintetizador automático Liberty Lite. O último aminoácido introdúcese protexido como Boc para evitar a desprotección do Fmoc e calquera reacción lateral no paso seguinte, de acilación do Dbz. Por último, unha vez toda a secuencia está ancorada ao soporte sólido, transfórmase o Dbz en Nbz mediante a acilación da anilida con para-nitrocloroformato, como se explicou anteriormente. Despois de comprobar cunha pequena alícuota da resina que se obtivo o produto desexado, pásase a desancorar a secuencia peptídica da resina por tratamento con TFA. O cru de reacción amósase a continuación onde se pode ver o pico de 7 min maioritario atribúese ao fragmento desexado, mentres que o pico con tempo de retención 6 min posúe unha masa 147 umas menor que o produto requerido. Esta perda de masa atribúese a que non se acoplou o aminoácido Fmoc-Dbz. Mais non se observa en ningún caso indicio de desamidación. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 510 15 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod tr= 7 min tr= 6.5 min Figura 41. Cromatograma do cru da síntese do fragmento de OMOMYC M500F525-Dbz. Cando se procedeu á transformación do Dbz na N-acil-N-methylacilurea (Nbz) e posterior análise por HPLC-EM dunha alícuota de resina, non apareceu o pico do produto desexado e, en vez deste, xurdiu un pico maioritario con tempo de retención 8 min dunhas 29 unidades de masa superior ao produto buscado. A maiores, observouse o pico correspondente ao péptido acetilado pero sen o Dbz a 7.4 min. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 81 0 500 1000 1500 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod acetilado tr= 8.0 min prod acetilado - Dbz tr= 7.4 min Figura 42. Cromatograma despois da acilación con cloroformato Unha hipótese que explicaría este fenómeno pode ser que o para-nitrocloroformato está acilando non só o Dbz, senón que tamén pode estar atacando ao xofre da metionina N-terminal para ciclar intramolecularmente ca amina da mesma. Con este resultado, e tendo en conta que a secuencia MTEE da oncoproteína deriva da súa transfección en bacterias, non é unha secuencia propia da proteína nin indispensable para a súa síntese química,100 mais que non se apreciou desamidación neste fragmento, determinouse eliminala e sintetizar o fragmento sen estes catro aminoácidos iniciais. Polo tanto, a nova secuencia a sintetizar sería NVKRRTHNVLERQRRNELKRSFF-Nbz e que se denominará de aquí en diante N500F522-Nbz . O procedemento é exactamente o mesmo que o exposto no Esquema 8. Polo tanto, volveuse crecer en resina a secuencia peptídica correspondente mais cando se analizou por HPLC-EM o cru de reacción distinguíronse dous picos practicamente inseparables. O primeiro maioritario, con tempo de retención 10.0 min, ten unha masa igual ao produto de reacción menos 17 unidades. O pico a 10.3 min pertence ao produto buscado N500F522-Dbz, ainda que o espectro de masas presenta unha impureza de masa +116. Estas diferenzas nas masas moleculares correspóndense cos procesos de desamidación. No caso do pico a 10.0 min, produciuse unha aspartimidación con perda de NH3 e no segundo caso a masa da impureza cadra ca formación de dúas piperididas e unha aspartimida. 100L. Soucek, M. Helmer-Citterich, A. Sacco, R. Jucker, G. Cesareni, S. Nasi, Oncogene 1998, 17, 2463 RENATA CALO LAPIDO 82 0 100 200 300 400 500 600 700 800 4 8 12 16 20 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod+ desamidacion tr= 10.3 min aspartimidacion tr= 10.0 min Figura 43. Cromatograma do cru de reacción obtido para a síntese de N500F522-Dbz Coa inesperada desamidación obtida, e tendo en conta que no anterior apartado se solventou cambiando a disolución de desprotección, probouse aquí tamén a sintetizar de novo o fragmento pero usando a metodoloxía optimizada anteriormente para estes casos (piperazina ao 5 % en g/L en DMF mais 0.1 M de HOBT). Desafortunadamente, nesta ocasión a aplicación desta metodoloxía para eliminar o Fmoc non tivo efecto esperado. Despois desta terceira tentativa de síntese en SPFS do fragmento N500F522-Dbz volveu a analizarse por HPLC-EM e volveu observarse un cromatograma do cru parecido ao anterior cun pico de desamidación inseparable do produto desexado, cuxo pico do produto tratou de purificarse por fase reversa sen éxito. -50 0 50 100 150 200 250 300 4 8 12 16 20 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod + desamidacion tr= 10.4 min Figura 44. Cromatograma do produto obtido despois da purificación, para sintetizar N500F522-Dbz cambiando o cóctel no paso de desprotección. Xa que estas estratexias non solucionaron os problemas atopados, determinouse realizar o fragmento N-terminal mutando as asparaxinas das posicións 500 e 516 ao igual que se fixera Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 83 anteriormente no grupo, quedando a secuencia obxectivo final como: AVKRRTHNVLERQRRQELKRSFF (A500F522-Dbz). Agora si, seguindo a ruta marcada para o resto das tentativas, esta vez obtívose o fragmento sen detectar desamidacións. Tanto A500F522-Dbz como A500F522-Nbz se sintetizaron perfectamente. Como último paso, desancorouse da resina A500F522-Nbz, e purificouse, obtendo o fragmento cun rendemento final do 17 % aproximadamente. -50 0 50 100 150 200 250 300 2 4 6 8 10 12 14 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod Figura 45. Cromatograma do fragmento N-terminal mutado A500F522-Dbz e sen desamidación. A síntese do fragmento peptídico intermedio tamén se realizou en fase sólida, co soporte Rink Amide Chem Matrix e seguindo a metodoloxía Fmoc habitual. Figura 46. Representación dos fragmentos de OMOMYC. Rodeado aparece o fragmento cuxa síntese se trata neste apartado. Como se observa da secuencia, debe introducirse unha Cys na posición N-terminal deste fragmento. Para evitar oligomerizacións e/ou ciclacións indesexadas durante as reaccións de LQN, dito residuo protexerase como Thz (4-carboxo-1,3-tiazolidina) cuxa desprotección ortogonal se pode realizar en disolución unha vez rematada a LQN.101 O procedemento para 101 D. Bang , S. B. H. Kent, Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, 2534 500 524 548 586 AVKRRTHNVLERQRRAELKRSFF-Nbz ThzLRDQIPELENNEKAPKVVILKKAT-Nbz CYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSSA 522 A500F222 CY548A586 L524T546 NH2 O N N O ONH2 O NH2 O N N O O 546 O HN S RENATA CALO LAPIDO 84 este anaco require a ruta sintética explicada no Esquema 10. Neste caso, o primeiro aminoácido Dbz, sintetizado previamente, acóplase á man, seguido da síntese en fase sólida do resto da secuencia. Como último aminoácido introdúcese a cistina 27 enmascarada como Thz en condicións estándar e, finalmente, transfórmase o Dbz en Nbz con cloroformato. Esquema 10. Ruta sintética para obter o fragmento intermedio Thz523T546-Nbz. Por último, compróbase que se obtivo o produto precipitando unha pequena alícuota de resina e analizándoa por HPLC-EM. Identificouse o produto desexado no cru de reacción, polo que se desancorou do soporte sólido o resto do péptido con tratamento acedo de TFA, precipitouse en éter frío e liofilizouse. O cru ten poucas impurezas, polo que o produto obtido se usou nas reaccións posteriores sen mais purificación. Obtívose a secuencia desexada cun rendemento aproximado dun 29 %, tendo en conta a cantidade que se precipitou de resina con respecto da carga desta, Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 85 0 50 100 150 200 250 300 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod tr= 7.3 min Figura 47. Cromatograma do cru do fragmento intermedio Thz523T546-Nbz. Con respecto á secuencia que corresponde ao anaco C-terminal, atópase unha cistina na posición 585. Figura 48. Representación dos fragmentos de OMOMYC. Rodeado aparece o fragmento cuxa síntese se explica a continuación. Como a reacción de LQN é moi selectiva, posiblemente non houbera problemas en manter esa Cys, pois a fase da tioesterificación é reversible e o reagrupamento N-S non sería posible para este residuo posto que non ten grupos amino en posición beta con respecto do sulfhidrilo. A pesares desta circunstancia, considerouse substituír este residuo para evitar problemas de reaccións laterais ou impurezas que complicasen a metodoloxía. Así, a Cys86 foi trocada por unha Ser na mesma posición. Este cambio é debido a que a serina é o aminoácido con propiedades estruturais máis parecidas á cistina. Ámbolos dous son residuos neutros, aproximadamente do mesmo tamaño. Só difiren no intercambio dun átomo de xofre (Cys) por un de osíxeno (Ser) e a aminoácido conserva as súas propiedades hidrofílicas.102 102 M. J. Betts, R. B. Russell, Bioinforma Genet Wiley Chichester. 2003, 317, 289. Chapter 14-- RENATA CALO LAPIDO 86 Polo tanto, a síntese do fragmento de 39 aminoácidos, agora renumerado C547A586, realizouse mediante SPFS asistida por microondas, seguindo o método Fmoc estándar. Como soporte sólido escolleuse a resina Rink Amida Chem Matrix con carga aproximada 0.5 mmol/g para obter unha boa cantidade de péptido. Para acoplar os aminoácidos utilizouse unha disolución 0.5 M de N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC) como axente activante e 1 M de acetato de etil-2-ciano-2-(hidroxiiminio), (oxima), como aditivo, en DMF. A oxima actúa como base convertido rapidamente en éster reactivo o intermedio O-acilisourea. Ditos ésteres son bastante estables e diminúen os subprodutos de racemización ou outras reaccións laterais. A combinación DIC/oxima é unha alternativa ao uso de HOBT como aditivo. Comparado co HOBT, a oxima é un reactivo máis barato, ten baixo risco de explosión e maior capacidade para inhibir a racemización.103 Despois de ensamblar o fragmento no sintetizador de péptidos, unha pequena alícuota do cru analizouse por HPLC-EM corroborando que a síntese transcorrera perfectamente. Pasouse entón, a desancorar o péptido do soporte sólido por tratamento acídico e precipitouse en éter frío. Como o cru de reacción resultou moi limpo por HPLC, este fragmento usouse sen maior purificación. Despois de redisolver o péptido nunha mestura 10 % de MeCN en auga e liofilizalo, determinouse un rendemento global a partir da rotura da resina dun 12 % aproximadamente. Algo baixo, seguramente por mor de que se perde produto na etapa de precipitación. 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 6 8 10 12 14 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) tr= 8.9 min Figura 49. Cromatograma do cru da síntese por SPFS do fragmento C49A87 103 R. Subirós-Furanosas, R. Prohens, R. Barbas, A. El-Faham, F. Albericio, Chem. Eur. J. 2009, 15, 9394. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 87 3.6.2. Unión dos fragmentos por LQN e desulfuración para obter [AQS]OMOMYC Unha vez obtidos os fragmentos, o seguinte paso é unilos mediante LQN. Usarase a ligazón química nativa para obter péptidos máis longos crecendo a proteína de C a N-terminal en disolución. Para iso, comézase xuntando a través dunha primeira reacción de LQN o fragmento C-terminal co fragmento intermedio. Neste caso atopouse que as condicións óptimas para este paso son engadir 1 equiv do fragmento intermedio Thz523T546-Nbz xunto con 1.3 equiv do fragmento C-terminal C547A586. Esquema 11 Esquema dos pasos para a primeira LQN entre o fragmento C-terminal e o fragmento intermedio. As dúas substancias de partida uníronse seguindo o procedemento estándar de LQN explicado anteriormente, para dar o fragmento C523A587. O procedemento consiste en axitar a mestura dos dous fragmentos unhas 5 h hasta que se observa a consumición do reactivo limitante (HPLC). Logo desprotexeuse selectivamente a cistina C523 engadindo hidroxilamina sobre o cru de reacción anterior disolto no tampón da LQN e axustando o pH a catro. Deixando reaccionar toda a noite a temperatura ambiente observouse por HPLC a aparición de un novo pico que corresponde co produto coa Cys natural desprotexida. RENATA CALO LAPIDO 88 O cru de reacción é moi limpo, o que permitiu recuperar o produto de ligazón cun excelente rendemento do 43 % . 0 500 1000 1500 510 15 20 25 30 35 40 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod MPAA N-acilurea C49A87 0 200 400 600 800 1000 6 8 10 12 14 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) tr= 8.8 min Figura 50. Esquerda: Cromatograma do cru de reacción despois de engadir hidroxilamina e deixalo axitando toda a noite. Dereita: Cromatograma do produto puro obtido. Unha vez se liofilizou e illou o fragmento C523A586 puro, pasouse a efectuar a segunda ligazón. Os reactivos neste paso foron o fragmento N-terminal A500F522-Dbz que actuará como limitante nesta etapa, e C523A586 obtido da primeira LQN. Co mesmo procedemento da primeira LQN, realizouse a 2ª LQN axitando a mestura durante 4.5 h a temperatura ambiente. Trala purificación, obtívose un rendemento desta segunda etapa dun 49 %. 0 500 1000 1500 510 15 20 25 30 35 40 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod N-acilurea MPAA A1F23-MPAA 0 50 100 150 200 250 300 350 400 510 15 20 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod tr= 12.3 min Figura 51. Esquerda: Cromatograma a 222 nm do cru de reacción da segunda LQN , con gradiente do 20 % ao 60 % de MeCN + 0.1 % TFA en 30 min. Dereita: Cromatograma do produto puro obtido a 222 nm con gradiente do 5 % ao 95 % de MeCN + 0.1 % TFA en 19 min. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 89 3.7. SÍNTESE DE MINIPROTEINAS MYC MARCADAS CON FLUOROFOROS 3.7.1.1. Síntese de [AQ]MYC-FLU polo método 3 Fr-LQN Para levar a cabo a síntese das proteínas marcadas cun fluoróforo elixiuse a vía de síntese en tres fragmentos que serían unidos a través de dúas LQN, xa que é máis doado modificar un fragmento pequeno (coma os usados na estratexia 3 FrLQN) para introducir o fluoróforo, que modificar un fragmento cunha secuencia máis longa (como son os da estratexia 2FrLQN). Deste xeito a estratexia 3-FrLQN é máis versátil para introducir os marcadores fluorescentes. Primeiro considerouse a ancorar a fluoresceína no extremo C-terminal do péptido, pois era onde o equipo de Laura Soucek. introducía os fluoroforos para OMOMYC, aínda que no seu caso estaban obrigados a acoplalo a través de unha cistina introducida no método biosintético. Pensouse que a mellor estratexia para introducir o marcador nesa posición consistiría en usar unha lisina C-terminal coa amina da cadea lateral protexida polo grupo alloc (aliloxicarbonilo). Este grupo protector podería ser eliminado ortogonalmente e de maneira sinxela en fase sólida, con catálise de paladio. Por iso plantexouse unha desconexión a través da alanina 524 e 548, coloreadas en vermello na figura 11. A maiores, a miniproteina conten a lisina alloc en posición C-terminal, residuo 582, para acoplarlle o fluoróforo a través da desprotección selectiva deste residuo. As mutacións nos residuos de Ala500 e Gln516 con respecto da proteína natural están resaltadas en azul claro na ilustración. Figura 52. Secuencia do dominio de unión de MYC a ADN e representación da unión dos fragmentos peptídicos Síntese dos fragmentos peptídicos O camiño sintético para acadar os péptidos diana comeza por sintetizar en fase sólida, por separado, os tres fragmentos peptídicos. RENATA CALO LAPIDO 96 Esquema 15. Síntese total do análogo de OMOMYC marcado con fluoresceína en N-terminal. Síntese dos fragmentos peptídicos Tanto o fragmento N-terminal como o fragmento intermedio xa os tiñamos preparados das sínteses anteriores ( A500F522-Nbz e Thz523T547-Nbz que pasan a ser A1F23-Nbz e Thz24T48Nbz respectivamente). Despois de crecer a secuencia usando síntese de péptidos en fase sólida ca estratexia Fmoc, o extremo N-terminal deste fragmento protexeuse con Boc. A continuación eliminouse o grupo alloc, protector da Lys586durante toda a noite. A resina resultante tratouse con HATU e con pon o reactivo, e entón procedeuse a desancorar o produto peptídico da resina con TFA. O cru de reacción precipitouse en éter frío, liofilizouse e o produto, denominado C49A87-Flu, purificouse no HPLC semipreparativo (aproximadamente 15 % de rendemento). Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 97 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod 0 50 100 150 200 250 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) tr= 9.2 min Figura 58. Esquerda: Cromatograma a 222 nm do cru de reacción para obter C50-A87-Flu. Dereita: cromatograma do produto puro a 222 nm despois da purificación Unión dos fragmentos por LQN e desulfuración para obter [AQK]OMOMYC-FLU Cos fragmentos xa disponibles, procedeuse primeiro a realizar unha tioesterificación do fragmento intermedio Thz24T48-Nbz por tratamento con 40 mM de MPAA en.tampón GnHCl 6 M seguido de adición de C49A87-Flu para convertir a tiazolidina na cistina. O produto resultante do acoplamento illouse tras purificarse por fase revertida. Como se pode ver no cromatograma a 222 nm, o cru de reacción sae bastante sucio e o pico do produto aparece no medio dunha montaña de outros picos cun tempo de retención de 40 min aproximadamente. Aínda así, puido illarse o produto desexado , cun rendemento final de un 16 % aproximadamente, considerando as dúas etapas de ligazón. 0 500 1000 1500 10 20 30 40 50 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod MPAA N-acilurea C523T548-MPAA -50 0 50 100 150 200 250 300 510 15 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod Figura 59. Esquerda: cromatograma do cru de reacción. Dereita: cromatograma do produto puro C24K87Flu. RENATA CALO LAPIDO 98 De seguido, o produto puro da primeira ligazón usouse como reactivo para efectuar a unión do último fragmento peptídico. Deste xeito, e ao igual que en ocasións anteriores, os fragmentos A1F23-Nbz e C24K87-FLU disolvéronse en tampón desnaturalizante e deixáronse reaccionar durante 4 h a temperatura ambiente. De novo, o cromatograma do cru da reacción resultou ser moi complicado de purificar, pero conseguiuse illar o produto desexado (rendemento aproximado do 21%) -40 0 40 80 120 10 20 30 40 50 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod N-acilurea MPAA 0 200 400 600 800 1000 2 4 6 8 10 12 14 16 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) prod Figura 60. Esquerda: cru de reacción a 222 nm trala segunda LQN. Dereita: pico produto puro [AQK]OMOMyc(SH)-Flu a 222 nm. Xa por último, ensaiouse a desulfuración do péptido [AQK]OMOMYC(SH)-Flu usando as condicións standard. Desafortunadamente, despois de 5 h de reacción, a análise HPLCEM de unha alícuota do cru non mostrou a masa do produto indicado. En vista de que non fomos quen de realizar a desulfuración desexada, que os crús de reacción seguindo esta estratexia de marcaxe estaban resultando máis complexos do esperado, e que os rendementos eran un pouco baixos, cambiouse a estratexia de síntese destes derivados marcados. A nova estratexia B, explícase no seguinte apartado. 3.7.2. Miniproteinas marcadas con fluoresceína: ESTRATEXIA B 3.7.2.1. Síntese polo método 3 Fr-LQN de FLU[AQ]OMOMYC Nesta nova estratexia, o fluoróforo elixido segue sendo a fluoresceína e a ruta tamén envolve o acoplamento de tres fragmentos peptídicos. A novidade consiste en incorporar o fluoróforo no fragmento N-terminal das miniproteinas en lugar do C-terminal. Deste xeito, a síntese é máis doada porque se introduce o fragmento fluorescente na segunda reacción de LQN, co que se evita levar o reactivo limitante (o fragmento marcado) dende o primeiro paso. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 99 Amais, esperan obterse uns crús de reacción moito máis limpos. O esquema xeral da síntese total dos péptidos con esta estratexia amósase no Esquema 16. Esquema 16. Ruta sintética para obter as miniproteínas marcadas no extremo N-terminal mediante a estratexia B. Síntese dos fragmentos Para acoplar o grupo fluorescente no fragmento que se corresponde ca parte N-terminal foi preciso sintetizar un fragmento novo. O esquema que segue, reflexa os pasos sintéticos que foron precisos para obter dito fragmento, nomeado como Flu-A1F23: RENATA CALO LAPIDO 100 Esquema 17. Ruta sintética para a obtención do fragmento N-terminal marcado Flu-A1F23-Nbz. Ahx = ácido aminohexanoico que actúa como separador entre a cadea e o fluoróforo. A secuencia peptídica creceuse no sintetizador de péptidos seguindo os protocolos estándar. Introduciuse un aminoácido (Ahx) en posición N-terminal que serve como espaciador entre a secuencia peptídica e o fluoróforo,107 co fin de facilitar o acoplamento e evitar posibles interferencias indesexadas tales como que o impedimento estérico do marcador que poida chegar a condicionar a función bioactiva da secuencia Unha vez crecida a secuencia peptídica no sintetizador e ancorado o espaciador Ahx, introduciuse o fluoróforo seguindo o método estándar con DIEA en DMF. De seguido, desancorouse unha alícuota pequena de péptido da resina por tratamento con TFA, precipitouse en éter dietílico frío e analizouse por HPLC-EM, observándose o produto Flu-A1F23-Dbz desexado sen problema, tanto co fluoróforo como co Dbz intactos. Seguidamente, fíxose reaccionar unha pequena alícuota da resina que contiña Flu-A1F23Dbz con p-nitrofenilcloroformato. Sorprendentemente, a reacción deu unha conversión completa no produto Flu-A1F23-Nbz, sen ningún indicio de degradación do fluoróforo ou do 107 M. Jullian, A. Hernandez, A. Maurras, K. Puget, M. Amblard, J. Martinez, G. Subra, Tetrahedron Lett. 2009, 50, 260. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 101 Nbz, así como un cromatograma do cru bastante limpo. Despois de purificarse, illouse o fragmento cun 15 % de rendemento global. 0 50 100 150 200 250 300 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod tr= 8.1 min Figura 61. Cromatograma do cru de reacción para obter Flu-A1F23-Nbz. Os fragmento intermedios Thz24T48-Nbz e C-terminal C49A87, son os mesmos que se utilizaron anteriormente na síntese de OMOMYC (apartado 3.6). Unión dos fragmentos por LQN e desulfuración para obter FLU- [AQ]OMOMYC Cando os tres fragmentos estiveron sintetizados, efectuouse a primeira LQN entre os péptidos Thz24T48-Nbz e C49A87 para formar a miniproteina C24A87, seguindo os procedementos xa usados na síntese de [AQS]OMOMYC (3Fr-LQN) (ver apartado 3.6). Deseguido, fíxose a LQN de C24A87 co fragmento Flu-A1F23-Nbz, observándose a formación do produto desexado Flu-[AQS]OMOMYC(SH). O cru de reacción non era limpo, e quedaba moita sustancia de partida (Figura 62). De tódolos xeitos, o produto puido separarse cun rendemento do 14 %. RENATA CALO LAPIDO 102 Figura 62. Esquerda: Cromatograma do cru de reacción ( 222 nm). Dereita: Cromatograma despois do produto Flu-[AQ]OMOMYC(SH) obtido trala purificación. A miniproteína cas cistinas libres, someteuse á reacción de desulfuración para dar a secuencia peptídica con cadansúa alanina no lugar das cistinas, ao igual que o OMOMYC natural. Mais, de novo, e a pesares de probar a reacción varias veces, en ningún dos casos se chegou a detectar por HPLC-EM o produto desexado. Neste momento non quedou outra que realizar un estudo máis profundo sobre a compatibilidade das condiciones de desulfuración cos diferentes fluoróforos. 120 160 200 240 280 320 360 400 510 15 20 25 30 35 40 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod MPAA N-acilurea FLU-A1F23-OH FLU-A1F23-MPAA MPAA-C24A87 0 50 100 150 200 510 15 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod tr= 9.3 min Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 103 3.7.3. Estudo da resistencia de diferentes fluoróforos á reacción de desulfuración Sintetizáronse en fase sólida catro secuencias peptídicas curtas, de 14 aminoácidos cada unha, que contiñan unha cistina N-terminal, e que se correspondían co extremo C-terminal de MYC. A tres delas acoplóuselles cadanseu fluoróforo na lisina inicial. Os fluoróforos escollidos foron fluoresceína (FLU), cumarina (CUM) e tetrametilrodamina (TMR) posto que eran dos que se dispoñían no laboratorio naquel momento. Esquema 18. Ruta sintética seguida para a obtención dos péptidos modelo marcados con diferentes fluoróforos. A secuencia do péptido ca cistina terminal é CGGEQLKHKLEQLK(alloc). A maiores, prepararouse un péptido similar pero que conten unha proparxilglicina en lugar da lisina na posición C-terminal. Este péptido podería funcionalizarse a posteriori a través dunha reacción de tipo click entre o triplo enlace da poteína e a azida dun fluoróforo. Os péptidos sintetizáronse e purificáronse en condicions habituales. Os crús foron sometidos ás condicións de desulfuración engadindo 40 mM do iniciador de radicais VA-044, 4,6 % en volume de EtSH e 500 mM TCEP·HCl en 6M de Gn·HCl e 200 mM de tampón fosfato a pH= 7. As reaccions levaronse a cabo durante 4,5 h a 37 ºC. Como a reacción xera gran RENATA CALO LAPIDO 104 cantidade de residuos de moléculas pequenas, as masas dos péptidos non puideron detectarse a partir de analíticas dos crús, polo que tivo que procederse á súa purificación mediante cromatografía líquida en fase reversa e posterior liofilización dos produtos recollidos. Tra-la purificación, para o péptido modelo proparxilado, recuperouse un composto cuxa masa coincidía coa masa do péptido mais a fosfina xuntas ( péptido proba 2 + TCEP). Figura 63. Arriba: Esquema da reacción de desulfuración do péptido proparxilado, para obter o correspondente péptido cunha alanina. Abaixo: cromatograma do cru onde se detecta o péptido esperado ( 222 nm) Para o péptido con fluoresceína non se puido detectar o produto de desulfuración en ningún momento, recuperándose da purificación un único subproduto con tempo de retención de 11.4 min que non posuía cor e cuxa masa non puido asociarse con ningún composto coñecido. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 105 Figura 64. Arriba: esquema reacción da desulfuración co péptidos proba 1 con fluoresceína. Abaixo: cromatograma do cru de reacción (l: 222 nm.). Namentres, nos casos aos que se lle acoplara a TMR e a CUM si conseguiron illarse os produtos de desulfuración desexados e as reaccións transcorrían case de forma cuantitativa. Para o caso do péptido marcado con rodamina, recolleuse un produto cunha forte cor rosada a tempo de retención 6.5 min. Este resultou ser o produto de desulfuración esperado. A maiores, no caso do péptido con cumarina, tamén se conseguiu illar facilmente un sólido alaranxado cuxa masa coincidía perfectamente co produto de reacción desexado RENATA CALO LAPIDO 112 0 200 400 600 800 1000 510 15 20 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) MPAA N-acilurea prod TMR-A1F23-OH TMR-A1F23-MPAA 0 50 100 150 200 250 300 510 15 20 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) MPAA prod TMR-A1F23-OH TMR-A1F23-MPAA Figura 70. Esquerda: cru de reacción ás 4.5 h antes de ser filtrado con amicóns. Dereita: cru de reacción despois de pasar por amicóns. Método usado 5 % ó 75 % de MeCN e 0.1 % TFA en 19 min. Despois de illar por HPLC e liofilizar o produto desexado, determinouse un rendemento para esta etapa dun 39 %. 0 100 200 300 400 4 8 12 16 20 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) prod Figura 71. Cromatograma do produto puro. Gradiente do 5 % ó 95 % de MeCN e 0.1 % TFA en 19 min. Pasamos agora a levar a cabo a reacción de desulfuración. A diferencia do que pasaba cando o péptido tiña como fluoroforo a fluoresceina, observamos que reaccion funciona de forma moi eficiente. Despois dunhas 5 h de reacción a 37 ºC, o cru purificouse e liofilizouse, para dar a miniproteína buscada con secuencia: TMR-Ava-GGAVKRRTH NVLERQRRQE LKRSFFALRD QIPELENNEK APKVVILKKA TAYILSVQAE TQKLISEIDL LRKQNEQLKH KLEQLRNSSA-NH2 cun rendemento do 80 %. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 113 0 100 200 300 400 500 6 8 10 12 14 16 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) tr= 9.8 min Figura 72. Cromatograma do produto puro TMR-[AQS]OMOMYC con método 5 % → 95 % de MeCN en 15 min. Unión dos fragmentos por LQN e desulfuración para obter TMR-[AQ]MYC Para preparar o derivado de MYC marcado con rodamina seguiuse un esquema similar o caso anterior: esquema 20. Esquema representativo da ruta sintética que produce TMR-[AQ]MYC. O primeiro paso consistiu en unir o fragmento intermedio Thz523T547-Nbz co N-terminal C548L581 por LQN (4.5 h , 37ºC) para, de seguido, desprotexer ortogonalmente a tiazolidina por RENATA CALO LAPIDO 114 tratamento con hidroxilamina a pH= 4 durante toda a noite. Ao día seguinte o cru de reacción analizouse, observándose o pico do produto e a desaparición case completa dos sustratos de partida. Pasouse pois, a elaborar a mestura. Cas condicións xa optimizadas, engadiuse un volume de tampón guanidinio 6 M, 200 mM de K2HPO4 tal que triplicaba a dilución da disolución inicial. Esta mestura final, filtrouse a través de amicóns e recuperouse a proteína desexada en auga e no mesmo tampón. Despois disto, pasouse a purificar o recuperado da filtración nun HPLC semipreparativo onde puido separarse mellor o produto desexado das impurezas que formaban unha lomba co mesmo tempo de retención. A pesares disto, tan só se acadou un rendemento dun 20 % para este paso. 0 50 100 150 200 6 8 10 12 14 16 18 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) tr= 11.6 min Figura 73. Cromatograma do produto da primeira LQN, C523L581 , puro. O segundo paso consistiu na creación da esqueleto peptídico completo de TMR-[AQ]MYC(SH). Para o que se realizou unha segunda ligazón entre o precursor do tioéster TMR-A1F23-Nbz activado co MPAA e o produto puro da primeira LQN, C523L581. Unha vez rematada a reacción pasouse a filtrar o cru a través de amicons, recuperándose unha mestura moi limpa e fácil de purificar. Despois da purificación e correspondente liofilización, obtívose un sólido rosa que resultou ser o produto, cun rendemento excelente do 45 %. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 115 0 200 400 600 800 1000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) N-acilurea + MPAA impureza MPAA oxidado prod TMR-A1F23-OH 0 200 400 600 800 1000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Absorbencia 222nm (mAU) t (min) N-acilurea prod TMR-A1F23-OH impureza MPAA oxidado Figura 74. Esquerda: cru de reacción ás 4.5 h antes de ser filtrado con amicóns. Dereita: cru de reacción despois de pasar por amicóns. Método usado 5 % → 95 % de MeCN + 0.1 % TFA en 19 min. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 6 8 10 12 14 16 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) tr= 9.1 min Figura 75. Cromatograma trala purificación de TMR-[AQ]MYC(SH). Por último, levouse a cabo a desulfuración final na cal as dúas cistinas da miniproteína se convertiron en dúas alaninas, como na secuencia natural de MYC. Esta etapa final, acadouse cun rendemento do 70 %, obténdose o produto coa secuencia: TMR-Ava-GGAVKRRTHN VLERQRRQELK RSFFALRDQIP ELENNEKAPKV VILKKATAY ILSVQAEEQKL ISEEDLLRKRR EQLKHKLEQL-NH2 RENATA CALO LAPIDO 116 0 100 200 300 400 6 8 10 12 14 16 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) tr= 9.3 min Figura 76. Cromatograma do produto TMR-[AQ]MYC puro. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 117 3.8. FORMACIÓN DE PONTES DISULFURO EN MINIPROTEINAS MARCADOS CON RODAMINA Como se comentou na introdución deste capítulo, no grupo de investigación demostrarase en experimentos preliminares que a formación dunha ponte disulfuro intramolecular na proteína con dúas cistinas inhibía a sua capacidade para unirse a ADN en cooperación con MAX. Sobre esta base, tratamos de realizar una oxidación similar nas miniproteinas que conteñen a rodamina, co fin de forma o derivado indicado na seguinte figura. Figura 77. Representación da reacción de formación do disulfuro de TMR-[AQ]MYC(SH) En primeiro lugar, probouse a oxidación de TMR-[AQ]MYC(SH) usando unha disolución 1 mM do péptido en 100 mM de tampón Tris·HCl a pH 7,5, e engadindo 10 mM de DTNB, ou reactivo de Ellman (ácido5,5-ditiobis-(2-nitrobenzoico)). A mestura axitouse a temperatura ambiente, burbullando ar e con axitación magnética. Despois de dúas horas, a reacción analizouse por HPLC-MS pero non se detectou o produto desexado nin tampouco o pico correspondente ao substrato de partida. A mesma reacción probouse con TMR- [AQS]OMOMYC(SH) e usando como control a misma proteina sen o fluoroforo [AQS]OMOMYC(SH). Mentres que para esta miniproteina control, ás 2 h de reacción xa se detectara a formación do disulfuro, para o caso do péptido con TAMRA non se observou a formación do produto nin ás 24 h. A pesares de que o cru de reacción aparece moi limpo para o caso dos péptidos sen marcar xa que tan só se diferencian dous picos, un correspondente ao péptido de partida e o outro ao produto de oxidación ( ver Figura 78), para o caso dos péptidos con fluoróforo non se observa o mesmo patrón. Para TMR-[AQ]MYC(SH) aprécianse dous picos no cromatograma do cru, os cales se purificaron e se analizaron por separado. Sorprendentemente, o pico con tempo de retención en torno a 7 min ten unha masa que coincide coa masa do fluoróforo TMR desancorado do resto do péptido. O espectro de masas que se RENATA CALO LAPIDO 118 obtivo para o outro pico, con tempo de retención 9 min, non se puido asociar con ningún péptido coñecido nin con intermedios de reacción. Figura 78. Cromatograma a 222 nm do cru de reacción de oxidación para obter [AQS]OMOMYC(SS). O pico con tempo de retención 13.1 min correspóndese coa substancia de partida. O de 9.2 min é o produto oxidado [AQS]OMOMYC(SS). Figura 79. Esquerda: cromatograma a 222 nm do cru de reacción de oxidación a TMR-[AQS]OMOMYC(SS). Dereita: pico de 7,8 min despois da purificación. Ningún pico se corresponde ca substancia de partida nin co produto de reacción oxidado Por mor destes resultados negativos, decidiuse facer un estudo de diferentes condicións para acadar a oxidación variando os tampóns e os pH. Así mesmo, probouse un método de obtención do S-S atopado en bibliografía engadindo como codisolvente DMSO. Este protocolo demostraba que engadindo un 10 % de DMSO ao tampón fosfato a pH 7.5 promovíase a oxidación dos tiois nun tempo de reacción reducido.111 Desafortunadamente, ningunha das condicións probadas xerou o produto disulfuro para ningún dos dous análogos de MYC ou 111 J. Atcher, I. Alfonso, RSC Adv., 2013, 3, 25605. -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) prod tr= 9.2 min tr= 13.1 min -20 0 20 40 60 2 4 6 8 10 12 14 16 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) tr= 9.4 min tr= 7.7 min -20 0 20 40 60 80 100 2 4 6 8 10 12 14 16 Absorbencia 222 nm (mAU) t (min) tr= 7.8 min Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 119 OMOMYC equipados con TMR, A seguinte táboa presenta un resumo das condicións que se probaron e os tampóns e variacións introducidas en cada proba. Táboa 1. Optimización da reacción de oxidación para diferentes péptidos e diferentes condicións. péptido Tampón -pH observacións TMR-[AQ]MYC(SH) Tris·HCl 7.5 Non se observa produto TMR-[AQ]MYC(SH) Tris·HCl 8.3 Non se observa produto TMR-[AQ]MYC(SH) Fosfato 7.5+10 % DMSO Non se observa produto TMR-[AQS]OMOMYC(SH) Tris·HCl 7.5 Non se observa produto TMR-[AQS]OMOMYC(SH) Tris·HCl 8.3 Non se observa produto TMR-[AQS]OMOMYC(SH) Fosfato 7.5+10 % DMSO Non se observa produto [AQS]OMOMYC(SH) Fosfato 7.5+10 % DMSO Só péptido de partida [AQS]OMOMYC(SH) Tris·HCl 8.3 Produto [AQ]MYC(SH) Tris·HCl 7.5 Produto RENATA CALO LAPIDO 120 3.9. ESTUDOS ESPECTROSCÓPICOS DE INTERACCIÓN CO ADN DAS MINIPROTEINAS SINTÉTICAS Os péptidos [AQ]MYC e [AQS]OMOMYC obtidos por síntese química presentan alteracións na súa estrutura primaria, concretamente na rexión básica que recoñece o ADN. Polo tanto, é preciso comprobar se estas proteínas sintéticas conservan as súas propiedades de pregamento e dimerización, así como de interacción co ADN. Para iso, realizáronse experimentos espectroscópicos de dicroísmo circular a temperatura 25 ºC en tampón fosfato 10 mM a pH 7.4 con, 150 mM de KCl e 0.25 mM EDTA. 1 equivalente refírese a unha concentración na cubeta de 5 µ M de ADN ou de concentración de péptido monómero. O ADN de dobre cadea usado contén a secuencia diana denominada E-box (resaltada en cursiva na secuencia do oligo 5’- CTGTAGGC CACGTG ACCGGATG3’, esta apareuso coa complementaria para facer os estudos). No primeiro experimento, mostrado na Figura 80, comprobouse o pregamento e a interacción co ADN de [AQ]MYC -8 -4 0 4 8 200 220 240 260 280 300 ADN 1 eq [AQ]MYC 1eq [AQ]MYC 2eq MRE [deg cm2 dmol-1]  / nm Figura 80 Medidas de dicroísmo circular para comprobar o pregamento de [AQ]MYC e a súa interacción co ADN consenso. A liña punteada representa 1 equivalente de ADN. Obsérvase que a cantidade de hélice α máxima acádase cando a relación entre [AQ]MYC : ADN é de 2:1, banda marrón. Mentres que Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 121 a adición dun equivalente do péptido [AQ]MYC sobre un equivalente de ADN (liña laranxa) forma unha banda con dous mínimos a 209 nm e 240 nm, o que indica que existen segmentos helicoidales illados pero a maior parte da proteína non está pregada. En ningún caso se observan bandas claras características das hélices alfa a 208 e 222 nm.112 As bandas formadas son pouco intensas en tódolos casos e os mínimos en torno a 230-240 nm son anchos, polo tanto, conclúese que [AQ]MYC forma homodímeros inestables e amosa interacción débil co ADN, como era de esperar segundo a bibliografía.113 A formación dos complexos está máis estabilizada en presenza do ADN diana, pois a banda a 240 sofre un desprazamento cara 230 nm. No segundo experimento de DC (dicroísmo circular) estudouse a homodimerización de [AQS]OMOMYC.(Figura 81). -40 -30 -20 -10 0 10 20 200 220 240 260 280 300 [AQS]OMOMYC 1 eq [AQS]OMOMYC 2 eq ADN 1 eq MRE [deg cm2 dmol-1]  / nm Figura 81. Experimento de dicroísmo circular para comprobar o pregamento e a interacción coa secuencia diana de ADN de [AQS]OMOMYC. [AQS]OMOMYC por si mesmo xa contén dúas bandas a 208 nm e a 222 nm características dun pregamento en hélice alfa. Cando se engade outro equivalente deste péptido, o mínimo das bandas aumenta confirmándose que forman un homodímero estable. Ao adicionar un equivalente de ADN diana sobre esta disolución, as bandas aparecen máis pronunciadas 112 S. M. Kelly, T. J. Jess, N. C. Price, Biochim Biophys Acta, 2005, 1751, 119. 113 A)M.E. Beaulieu, F.O. McDuff, V. Frappier, M. Montagne, J.F. Naud, P.Lavigne J Mol Recognit. 2012; 25, 414. B) F.O. Mcduff, J-F. Naud, M. Montagne, S. Sauvé, P. Lavigne, J. Mol. Recognit., 2009, 22, 261. RENATA CALO LAPIDO 128 incuban a 50 nM tamén se aprecia internalización. Mais neste caso, a fluorescencia é tenue, precisando do aumento da exposición e intensidade do láser na toma das fotos. Por mor disto, decidiuse que a concentración óptima é de 250 nM. Ilustración 4. Células HeLa incubadas con TMR-[AQ]MYC(SH) en DMEM sen FBS. Os núcleos foron tinguidos con 10 µM de HOESCHT durante 15 minutos antes de lavar con DMEM fresco. Ilustración 5. Células HeLa incubadas con TMR-[AQ]MYC en DMEM sen FBS. Os núcleos foron tinguidos con 10 µM de HOESCHT durante 15 minutos antes de lavar con DMEM fresco 50 nM 4 h 2 h 250 nM 250 nM 2 h 4 h 50 nM Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 129 Unha vez atopada a concentración axeitada, leváronse a cabo medidas de incubación de péptidos a diferentes tempos, fixando a concentración en 250 nM. Nestes experimentos observouse que a tempos de incubación curtos, os péptidos non son capaces de penetrar correctamente, atopándose moi pouco péptido no interior. Para tempos de incubación de 2 h, boa cantidade de proteína marcada está no interior da célula pero hai bastantes agregados. Namentres, se se deixan tempos de incubación maiores, de 4 h, non se aprecian agregados, os péptidos entran mellor, a luminiscencia observada é máis homoxénea e a distribución máis regular do péptido pola célula, asociándose este fenómeno á menor agregación. Amais, 4 h é o tempo de incubación co que se observa máis cantidade de péptido internalizado. Ilustración 6. Incubación de células HeLa a diferentes tempos con 250 nM de péptido marcado, en DMEM sen FBS. TMR-[AQ]MYC(SH) TMR-[AQ]MYC 24 h 4 h 2 h 30 min RENATA CALO LAPIDO 130 Os ensaios nos que se trataron os cultivos con disolucións de proteínas marcadas durante 24 h, presentaron menos agregados, boa penetración dentro do ambiente celular por parte de ámbolos dous péptidos e unha distribución homoxénea destes péptidos no interior da célula. Así mesmo, hai menor ruído de fluorescencia grazas a que as proteínas non se pegan tanto ao fondo da placa de vidro. Mais este tempo de incubación relativamente longo, pode conlevar á degradación das proteínas marcadas. Polo tanto, a duración óptima de incubación fixouse como 4 h a unha concentración 250 nM dos péptidos marcados. 3.10.3. Estudos de internalización en diferentes liñas celulares e comparativa Dos experimentos anteriores pode comprobarse como os péptidos quedan moi pegados ao vidro da placa debido a algunha interacción forte co silicio desta, polo que se debe lavar moi ben cada pocillo antes de visualizar baixo o microscopio para evitar o ruído de fondo. O protocolo de lavado óptimo acadouse enxaugando dúas veces con tampón PBS e tres veces máis con DMEM fresco. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 131 Ilustración 7. Incubación de 250 nM dos péptidos marcados en DMEM sen FBS durante 4 h. Comparación entre diferentes liñas celulares. Amósase a canle vermella e a superposición entre o DIC e a canle vermella. Para realizar este estudo comparativo e estimar a relación de penetración dunha proteína con respecto doutra, elimináronse os valores de ruído de fluorescencia de fondo, polo que só se tiveron en conta os datos dos pixeles das sinais do primeiro plano. Aínda que se pode observar perfectamente a simple vista, cando se analizou cuantitativamente a internalización relativa das proteínas, determinouse que aquelas que conteñen os grupos SH das Cys libres, son internalizados máis eficientemente que os seus análogos desulfurados.115 Este feito é 115 N. Chuard, G. Gasparini, D. Moreau, S. Lörcher, C. Palivan, W. Meier, N. Sakai, S. Matile, Angew. Chem. Int. Ed 2017, 56 , 2947. TMR-[AQ]MYC HeLa A549 TMR-[AQ]MYC(SH) TMR-[AQS]OMOMYC TMR-[AQS]OMOMYC(SH) RENATA CALO LAPIDO 132 consistente con antecedentes bibliográficos nos que se afirman que o intercambio tiol-disulfuro na membrana celular favorece a introdución de cargos moleculares.116 A maiores, os análogos de OMOMYC adoitan penetrar mellor que os de MYC, formando vesículas máis homoxéneas e redondeadas arredor da rexión perinuclear. Figura 84. Comparación da densidade de fluorescencia integrada de cada péptido marcado internalizado en células A459 por cada célula. TMR-[AQ]MYC(SH) penetra arredor dunhas 3 veces máis que o seu análogo sen cistinas. Amais, TMR-[AQS]OMOMYC(SH) penetra unhas 4 veces mellor que TMR-[AQS]OMOMYC. Figura 85. Comparación da densidade de fluorescencia integrada de cada péptido marcado internalizado en células HeLa por cada célula. TMR-[AQ]MYC(SH) internaliza de 116 a) X. Meng, T. Li, Y. Zhao, C. Wu, ACS Chem. Biol. 2018, 13, 3078; b) T. Li, W. Gao, J. Liang, M. Zha, Y. Chen, Y. Zhao, C. Wu, Anal. Chem. 2017, 89, 8501;c) N. Chuard, G. Gasparini, D. Moreau, S. Lörcher, C. Palivan, W. Meier, N. Sakai, S. Matile, Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2017, 56, 2947. Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 133 7 a 8 veces máis que o seu análogo sen cistinas. Amais, TMR-[AQS]OMOMYC(SH) penetra unhas 7 veces mellor que TMR-[AQS]OMOMYC. Destes experimentos conclúese que pequenas variacións na secuencia peptídica de MYC pode ter consecuencias drásticas nas súas propiedades de internalización e agregación, así como na distribución dentro do ambiente celular. 3.10.4. Localización Estudos preliminares coas células HeLa indicaban que os péptidos sintetizados se quedaban en vesículas moi preto do núcleo. Para corroborar esta hipótese realizáronse incubacións das células que contiñan os polipéptidos marcados cun marcador de núcleo. O escollido foi o Hoescht 33342 que se trata dunha bis-benzamidina que se une ao suco menor de ADN de dobre cadea e que posúe fluorescencia na rexión azul. A marcación do núcleo confirmou que os péptidos se quedaban en vesículas arredor do núcleo. A maiores, coincubáronse as células con cloroquina, un derivado da quinoleína que serve para rebentar as vesículas e comprobar daquela, se as miniproteínas migran até acadar o núcleo cando non se atopan encapsuladas. Estes experimentos realizáronse tanto en células HeLa como en A549 mais en ningún dos casos se acadou a lise completa das vesículas. A cloroquina favorece que as vesículas teñan maior tamaño e sexan máis brillantes tanto para o caso de TMR-[AQ]MYC como para o derivado con cistinas. RENATA CALO LAPIDO 134 Ilustración 8. Células A549 incubadas con 250 nM en DMEM sen FBS dos péptidos marcados. O núcleo tinguiuse de azul incubando as células cunha disolución 10 µM de HOESCHT 15 min antes dos lavados. A 2º e 4º liña representan a incubación das células con 100 µM de cloroquina durante 4 h. TMR-[AQ]MYC 4 h TMR- [AQ]MYC(SH) 4 h TMR-[AQ]MYC 4 h TMR-[AQ]MYC(SH) 4 h cloroquina TMR-[AQ]MYC 4 h cloroquina Capítulo Primeiro: Síntese Química de análogos de OMOMYC e MYC e Recoñecemento de suco maior do ADN 135 Ilustración 9. Células HeLa incubadas con 250 nM en DMEM sen FBS dos péptidos marcados. O núcleo tinguiuse de azul incubando as células cunha disolución 10 µM de HOESCHT 15 min antes dos lavados. A 2º e 4º liña representan a incubación das células con 100 µM de cloroquina durante 4 h Ilustración 10. Superposición da canle vermella e azul da internalización dos derivados con cistinas libres. Móstrase unha ampliación dun cacho da imaxe na que se aprecia a localización perinuclear das vesículas dos péptidos. TMR- [AQ]MYC(SH) 4 h TMR-[AQ]MYC 4 h cloroquina TMR-[AQ]MYC(SH) 4 h cloroquina TMR-[AQ]MYC 4 h TMR-[AQ]MYC(SH) 4 h RENATA CALO LAPIDO 136 3.11. CONCLUSIÓNS - Sintetizáronse once dominios de unión a ADN das oncoproteínas MYC e OMOMYC seguindo dúas estratexias de retrosíntese diferentes. Nalgúns casos obténdose rendementos excelentes. - [AQ]MYC interacciona co ADN diana pero de xeito moi débil, formando homodímeros moi inestables. - [AQS]OMOMYC forma homodímeros con estrutura de hélice alfa estables tanto en presenza como en ausencia do seu ADN que recoñecen a rexión específica E-box. - Tanto os derivados marcados de MYC como de OMOMYC presentan unha excelente permeabilidade celular a concentracións de nanomolar, nunca antes reportado tan baixa concentración. - Os péptidos amosan unha localización perinuclear chegando a penetrar no núcleo en casos concretos. - A presenza de cistinas libres nas estruturas favorece a entrada na célula. - Os derivados de OMOMYC forman vesículas endosómicas máis homoxéneas e mellor formadas que os derivados de MYC, xerando unha internalización máis limpa e eficiente para estes derivados. Os resultados máis relevantes deste capítulo foron publicados en Org. Biomol. Chem., 2019, 17, 6748. 4. CAPÍTULO SEGUNDO: CONTROL DO RECOÑECEMENTO DO SUCO MENOR DO ADN CON MOLÉCULAS PEQUENAS FOTOMODULABLES RENATA CALO LAPIDO 144 O mesmo grupo estudou o efecto que producía nos espectros de absorción funcionalizar o azo orto-tetrafluorado na posición para.126 Estudaron tanto substituíntes electroatractores de electróns como electrodadores e descubriron que os grupos aceptores actúan en conxunto cos flúor, separando aínda máis as bandas n-π*. Os efectos máis acusados observáronse para os derivados substituídos con grupos éster e amida. Nos dous casos obtiveron separacións entre as bandas n-π* de 50 nm. 126 C. Knie, M. Utecht, F. Zhao, H. Kulla, S. Kovalenko, A. M. Brouwer, P. Saalfrank, S. Hecht, D. Bléger, Chem. Eur. J. 2014, 20, 16492. Capítulo Segundo: Control do Recoñecemento do suco menor do ADN con moléculas pequenas fotomodulables 145 4.1.3. Algunhas aplicacións de azobencenos Grazas á propiedade da fotomodulación, os azobencenos téñense aplicado á síntese de máquinas moleculares127, ciencia de materiais e polímeros128, interruptores moleculares,129 farmacoloxía,130 etc. Especialmente interesante é o seu uso nas aplicacións biolóxicas.131 O que abrangue o noso coñecemento, ata o de agora tódolos azoderivados que se usan para modificar as propiedades dalgunha biomacromolécula están covalentemente unidas a estas. 132 É dicir, precísase alterar quimicamente a estrutura primaria, e consecuentemente secundaria, da molécula a tratar polo que xa non se estaría ante un composto biolóxico ´puro´ senón que ante un derivado sintético muado que poida que non exerza as mesmas funcións no organismo. O uso adoita estar máis estendido no ámbito das proteínas aínda que tamén se ten utilizado con oligonucleótidos. A maiores, a isomerización destes biocompostos modificados implica o uso de luz ultravioleta a excepción duns poucos exemplos derivados dos precedentes comentados,133 un problema engadido se o fin último é traballar en organismos vivos. Foi só durante o transcurso desta tese que o grupo de Matczyszyn publicou un caso no que sintetizaban azoderivados con extremos poliamina que eran capaces de modificar as propiedades do ADN a través de interaccións non covalentes.134 127 a) X. M. Sun, W. Wang, L. B. Qiu, W. H. Guo, Y. L. Yu, H. S. Peng, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8520; b)Y.- J. Choi, J.-T. Kim, W.-J. Yoon, D.-G. Kang, M. Park, D.-Y. Kim, M.-H. Lee, S.-k. Ahn, K.-U. Jeong, ACS Macro Lett. 2018, 7,576. 128a) M.-M. Russew, S. Hecht, Adv.Mater. 2010, 22, 3348; b) E. Blasco, B. V. K. J. Schmidt, C. Barner-Kowollik, M. Piňol, L., Oriol, Macromol. 2014, 47, 3693. 129 E. Merino, M. Ribagorda, Beilstein J. Org. Chem. 2012, 8,1071. 130 M. J. Hansen, J. I. C. Hille, W. Szymanski, A. J. M. Driessen, B. L. Feringa, Chem. 2019, 5, 1293. B) W. A. Velema, J. P. van der Berg, M. J. Hansen, W. Szymanski, A. J. M. Driessen, B. L. Feringa, Nat. Chem. 2013, 5, 924. 131 a) A. M. Caamano, M. E. Vazquez, J. Martinez-Costas, L. Castedo, J. L. Mascareñas, Angew. Chem., Int. Ed. 2000, 39, 3104; b) L. Guerrero, O. S. Smart, C. J. Weston, D. C. Burns, G. A. Woolley, R. K. Allemann, Angew. Chem. Int.Ed. 2005, 44, 7778; c) L. Albert, O. Vázquez, Chem. Commun. 2019, doi:10.1039/C9CC03346G; d) M. Dong, A. Babalhavaeji, M. J. Hansen, L. Kálmán, G. A. Woolley, Chem. Commun. 2015, 51, 12981. 132 A. S. Lubbe, W. Szymanski, B. L. Feringa, Chem. Soc. Rev. 2017, 46, 1052. 133 a)A. Rullo, A. Reiner, A. Reiter, D. Trauner, E. Y. Isacoff, G. A. Woolley, Chem. Commun. 2014, 50, 14613; b) S. Samanta, T. M. McCormick, S. K. Schmidt, D. S. Seferos, G. A. Woolley, Chem. Commun. (Camb.) 2013, 49, 10314; c) C. Hoppmann, I. Maslennikov, S. Choe, L. Wang, J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 11218; d) J. B. Trads, J. Burgstaller, L. Laprell, D. B. Konrad, L. de la Osa de la Rosa, C. D. Weaver, H. Baier, D. Trauner, D. M. Barber, Org. Biomol. Chem. 2017, 15, 76; e) M. Dong, A. Babalhavaeji, M. J. Hansen, L. Kálmán, G. A. Woolley, Chem. Commun. 2015, 51, 12981. 134 a) M. Deiana, Z. Pokladek, K. Matczyszyn, P. Mlynarz, M, Buckle, M. Samoc, J. Mater. Chem. B 2017, 5, 1028; b) M. Deiana, Z. Pokladek, J. Olesiak-Banska, P. Mlynarz, M. Samoc, K. Matczyszyn, Sci. Rep. 2016, 6, 28605; c) M. Dudek, M. Deiana, Z. Pokladek, K. Pawlik, K. Matczyszyn, Chem Eur. J. 2018, 24, 18963. RENATA CALO LAPIDO 146 4.2. OBXECTIVOS135 A natureza posúe un grao de precisión no recoñecemento selectivo de secuencias de ADN difícil de mimetizar. Amais, moitos biosistemas modifican as súas propiedades de interacción segundo os sinais externos que perciban do seu entorno.136 Sería importante xerar sistemas sintéticos que, ó igual que os naturais, poidan recoñecer secuencias específicas de forma controlada no tempo e no espazo, só cando reciben un estímulo externo. De feito, un gran reto no eido da química biolóxica é poder modular a actividade biolóxica de compostos sintéticos mediante un estímulo externo inocuo en medios celulares. Sen dubida un dos estimulos externos mais atractivos é a luz, posto que se trata dunha fonte limpa, moi selectiva e compatible con ambientes biolóxicos. A maiores, a luz permite a manipulación precisa da intensidade e da lonxitude de onde de irradiación moi doadamente.137 A partir dos resultados obtidos no noso grupo de investigación sobre axentes fluoroxénicos que se unen ó ADN de tipo bisbenzamidina,138 e baseándose nos precedentes sobre a química de azobencenos, un dos obxectivos que nos propuxemos é a ‘’hibridación’’ entre un núcleo azobencénico e moléculas do tipo bisbenzamidinio co fin de obter azoderivados que deben unirse a secuencias específicas do ADN grazas á súa parte bisbenzamidínica. Espérase que o cambio de xeometría entre cis e trans teña unha influencia importante na interacción co ADN diana, ao facilitar ou impedir que os grupos amidinio se insiran no suco menor. O funcionamento do sistema bisbenzamidínico represéntase no seguinte esquema: Figura 91. Representación do sistema azobencénico. 135 Este proxecto realizouse en colaboración co doutor Mateo I. Sánchez. 136 J. M. Requena, Stress Response in Microbiology 2012, Caister Acad. Press. 137 a) C. Brieke, F. Rohrbach, A. Gottschalk, G. Mayer, A. Heckel, Angew. Chem., Int. Ed. 2012, 51, 8446; b)G. M. and A. Heckel, Angew. Chem., Int. Ed., 2006, 45, 4900. 138 a) O. Vázquez, M. I. Sánchez, J. Martínez-Costas, M. E. Vázquez, J. L. Mascareñas, Org. Lett. 2010, 12, 216; b) O. Vázquez, M. I. Sánchez, M. E. Vázquez, J. L. Mascareñas, Chem Commun. 2010, 46, 5518. c) M. I. Sánchez, O. Vázquez, J. Martínez-Costas, M. E. Vázquez, J. L. Mascareñas, Chem. Sci. 2012, 3, 2383. Capítulo Segundo: Control do Recoñecemento do suco menor do ADN con moléculas pequenas fotomodulables 147 Polo tanto, proponse a creación dun sistema facilmente conmutable que se una especificamente a secuencias diana de ADN e que permita intercambiar entre dous estados activo/inactivo, de maneira reversible e a vontade, mediante a aplicación dun estímulo externo non nocivo. RENATA CALO LAPIDO 148 4.3. CHAVES FOTOCONMUTABLES PARA O RECOÑECEMENTO SELECTIVO DE ADN: O AZOBENCENO. 4.3.1. Síntese: primeira aproximación Baseándose nos precedentes anteriormente descritos, decidiuse que o derivado amidínico que se mostra na seguinte figura serían os primeiros candidatos para comprobar se é posible acadar unha unión fotomodulable a secuencias específicas de ADN. Figura 92. Estrutura das dianas sintéticas da primeira aproximación Os grupos carbonilo en posición para ao grupo azo retiran carga do dobre enlace N=N, o que permite a separación entre as bandas do cis e do trans para a súa fácil isomerización. O grupo funcional amida posúe carácter parcial de dobre enlace é dicir, ten unha disposición atómica estabilizada por resonancia. Isto provoca unha restrición na liberdade de xiro do enlace CO–N, que fai que tódolos átomos implicados no enlace se atopen no mesmo plano. Esta característica aumenta a planaridade da forma trans desta diana sintética que, se cabe, favorecería a súa inserción no suco menor. Decidiuse realizar a síntese tanto do derivado tetrafluorado (azoFamida) esperando que se poida isomerizar con luz visible en ámbalas direccións coma do non fluorado (azoHamida) por se os átomos de flúor do primeiro comprometen a interacción e/ou o recoñecemento do ADN. Tal como demostrou o grupo de Stefan Hecht, 139 a alta electronegatividade dos flúor retira carga por efecto inductivo, polo que a densidade electrónica arredor do enlace N=N diminúe. Como consecuencia, a forma cis destes azoderivados tetrafluorados presenta unha estabilidade 139 D. Bléger, J. Schwarz, A. Brouwer, S. Hecht, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 20597. Capítulo Segundo: Control do Recoñecemento do suco menor do ADN con moléculas pequenas fotomodulables 149 térmica excepcional, cun tempo de vida media duns 700 días. Esta orto funcionalización resulta tamén na separación das bandas n-π* dos dous isómeros, que fai posible a fotoisomerización con luz visible bidireccionalmente e case cuantitativa. A maiores, os átomos de flúor teñen un tamaño moi pequeno que non afecta á planaridade da molécula como si o fan outros grupos como os metoxilo. Estes últimos, deseñados no grupo de Woolley140 tamén estabilizan a forma cis pero son moito máis voluminosos e distorsionan a forma plana do isómero trans. Amais, son vulnerables de sufrir redución en medio biolóxico. Estas característica podería dificultar a inserción no suco menor do ADN, polo que se decidiu usar os derivados fluorados. Para a síntese do azoHamida pensouse nun acoplamento dobre entre o diácido 11 e a amina comercial para-aminobenzamidina como se mostra no Esquema 21 de retrosíntese . Esquema 21. Aproximación retrosintética para obter a diana sintética azoHamida. En total, a ruta sintética consta só de tres pasos (ver Esquema 22). No primeiro, fórmase o enlace azo seguindo un procedemento descrito.141 Mediante o acoplamento oxidativo de dúas 140 A. Beharry, O. Sadovski, G. A. Woolley, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 19684. 141 C. Zhang, N. Jiao, Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 6174. RENATA CALO LAPIDO 150 benzocaínas en condicións suaves usando reactivos comerciais baratos, obtívose 14 cun alto rendemento. De seguido, hidrolizáronse os ésteres quentando en medio básico. Esquema 22. Ruta sintética para acadar azoHamida. Por último, realizouse o acoplamento entre a aminobenzamidina e o diácido 15. Probouse a condensación con HATU e DIEA en DCM e DMF a temperatura ambiente e, a pesares de observarse o produto en ámbalas dúas tentativas, este atopábase en forma minoritaria e o cru de reacción analizado por HPLC-MS tiña un aspecto moi sucio. Trocouse pois, o axente acoplante por PyAOP. Desta vez, a reacción transcorreu moito máis limpa en tan só unhas 3 h podendo illarse o produto azoHamida despois de purificar en fase revertida, cun 74 % de rendemento. Ao irradiar unha disolución de azoHamida en condicións típicas de isomerización (λ = 365 nm), non se apreciou ningún cambio nos espectros de UV nin RMN. Tamén se probou a quentar a mostra e, de novo, sen indicios de isomerización. Para a síntese do derivado fluorado, propúxose unha retrosíntese moi similar: Capítulo Segundo: Control do Recoñecemento do suco menor do ADN con moléculas pequenas fotomodulables 151 Esquema 23. Aproximación retrosintética para obter a diana sintética azoFamida. Para formar o núcleo azoico 15 seguiuse a estratexia sintética descrita por Hetch ata o diéster 21139. Na cal se broma rexioselectivamente en para con N-bromosuccinimida (NBS) a 2,6-difluoroanilina 16 comercial para logo substituír o bromuro por un nitrilo empregando CuCN. Cunha hidrólise en medio básico transfórmase o grupo nitrilo en ácido e, a continuación, coa esterificación de 19, acadouse a difluoroanilina 20, tal como se mostra no Esquema 24. RENATA CALO LAPIDO 152 Esquema 24. Primeira parte da ruta sintética seguida para acadar o núcleo azoico tetrafluorado. O éster 20 dimerizouse por tratamento con sulfato de ferro heptahidratado mais permanganato de potasio obténdose o núcleo do azocomposto 21 cun rendemento moderado despois de deixalo reaccionando durante dous días. Esquema 25. Segunda parte da ruta sintética para obter o azoFamida. Capítulo Segundo: Control do Recoñecemento do suco menor do ADN con moléculas pequenas fotomodulables 153 Esta etapa, con tan baixo rendemento, limita a síntese completa, de sete pasos en total. Xa que se tiñan os intermedios sintetizados, tratouse de optimizar devandito acoplamento. Probáronse paralelamente varias vías para obter o núcleo azoico. Na primeira vía, nomeada vía C no Esquema 26, reproducíronse as mesmas condicións que no caso do azoHamida. Tratouse de dimerizar o ester fluorado (9) con CuBr en condicións oxidantes até obter o núcleo de azo. con tan pouca fortuna, que só se obtivo unha mestura complexa de compostos. Por non desestimar este tipo de acoplamento oxidante que funcionara tan ben para o azoHamida, seguiuse a vía A. Así pois, en primeiro lugar, reduciuse o 4-amino-3,5-difluorobenzoato de etilo ao alcol 22 e protexeuse este con TBSCl para evitar calquera tipo de reacción de condensación secundaria en vindeiras etapas. Malia tódolos esforzos, o rendemento da protección de alcol foi pésimo, observándose que o produto se degradaba na etapa de purificación. Polo que se rexeitou esta vía sintética. A terceira e última estratexia probada, vía B, para obter o enlace azo baseouse na creación dunha amida de Weinreb.142 Esta comeza coa formación da amida de Weinreb 23 a través do acoplamento entre a N,O-dimetilhidroxilamina co ácido da 3,5-difluoroanilina 19 empregando o axente acoplante etildimetilcarbodiimida (EDC) e a diisopropiletilamina (DIEA) como base. Nun segundo paso, formouse o composto azoico 24 con sulfato de ferro heptahidratado en condicións oxidantes. só se logrou un 15% do dímero 24. Pode que a conxugación electrónica da amida de Weinreb ó ser especialmente rica en carga, dificulte o acoplamento para dar o azo dímero 24 explicando un rendemento tan miúdo. Consecuentemente, rexeitouse tamén esta terceira vía e decidiuse retomar a ruta do Esquema 25 no afán de acadar o azoFamida. Deste xeito, hidrolizouse en medio básico o diester tetrafluorado 21 e, posteriormente realizouse o acoplamento entre o diácido obtido mais a 4-aminobenzamidina, con HATU como axente activante de ácidos. Este procedemento resultou na obtención da segunda diana sintética nun 80 % de rendemento trala súa purificación por fase revertida. O composto analizouse por HPLC-EM, observándose un só pico no cromatograma, o que semellaba a presenza dun único isómero. 142 P.-Y Yang, M. Wang, C. Y. He, S. Q. Yao, Chem. Commun. 2012, 48, 835.