Caracterización de la Estructura Genética Poblacional de Fasciola hepatica Mediante Marcadores Alozímicos y Microsatélites

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA LABORATORIO DE PARASITOLOGÍA Caracterización de la Estructura Genética Poblacional de Fasciola hepatica Mediante Marcadores Alozímicos y Microsatélites Memoria que presenta D. Severo Vázquez Prieto para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Santiago de Compostela Santiago de Compostela, abril de 2012 Esperanza Paniagua Crespo, Profesora Titular de Parasitología del Departamento de Microbiología y Parasitología, y Román Vilas Peteiro, Profesor Contratado Doctor del Departamento de Genética, Universidad de Santiago de Compostela, INFORMAN: Que la presente Tesis Doctoral titulada “Caracterización de la Estructura Genética Poblacional de Fasciola hepatica Mediante Marcadores Alozímicos y Microsatélites” que, para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Santiago de Compostela, presenta el Licenciado en Farmacia D. Severo Vázquez Prieto, ha sido realizada en el Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Farmacia bajo nuestra dirección y que, hallándose concluida, autorizamos su presentación a fin de que pueda ser juzgada por el Tribunal correspondiente. En Santiago de Compostela, a 23 de abril de 2012. Fdo. Dra. Esperanza Paniagua Crespo Fdo. Dr. Román Vilas Peteiro AGRADECIMIENTOS Aunque los años de trabajo dedicados a la elaboración de esta Tesis Doctoral no constituyan el final, ni siquiera el principio del fin, de este enredo en el cual he tenido el placer de sumergirme, tal vez puedan constituir, al menos, el final del principio. Sin embargo, no habría sido posible llegar a término tan aparentemente simple sin la colaboración de distintas personas a las cuales desearía expresar mi más sincera gratitud. En primer lugar, a mis directores de Tesis, la Dra. Dña. Esperanza Paniagua Crespo y el Dr. D. Román Vilas Peteiro, por haber compartido conmigo todos sus consejos y enseñanzas, no solo académicas sino también humanas. Asimismo, debo agradecerles el respaldo, confianza y apoyo que me han otorgado a lo largo de cada una de las fases del desarrollo de este trabajo. El resultado final del mismo habría sido muy distinto si no hubiese contado con la cooperación de ambos. A la Dra. Dña. Mercedes Mezo Menéndez y a la Dra. Dña. Marta González Warleta del Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo (A Coruña), por su participación directa en la obtención del material biológico, los adultos de Fasciola hepatica, utilizados en el presente estudio. Al Dr. D. Paulino Martínez Portela, por permitirme acceder tan generosamente al Laboratorio de Genética de la Facultad de Veterinaria de Lugo. Asimismo, quiero hacer constar mi agradecimiento a todo el equipo de trabajo de Acuigen por compartir sus conocimientos, recomendaciones y generosa colaboración. En especial, a las personas que forman parte de su soporte técnico sin cuya ayuda no habría sido posible esta tarea. A todos mis compañeros, así como profesores, del Laboratorio de Parasitología, por la enorme riqueza humana que han significado para mí los momentos compartidos. A mis amigos, con quienes he crecido y compartido una larga etapa de mi vida, por ser los culpables de mi formación como ser humano. A todas aquellas personas que se han ido incorporando a mi existencia a lo largo de estos años, brindándome su alegría, confianza y amistad. A mis padres, por su inmenso querer, protección y apoyo incondicional. Sin ellos no habría llegado a donde estoy. A mi familia, por estar siempre ahí. A Lucía, por su continuo cariño, afecto y, sobre todo, paciencia, aún en las situaciones más difíciles. No me olvido de los momentos vividos. A todos, gracias. Este trabajo de investigación ha sido financiado por los Proyectos de Investigación titulados: La fasciolosis bovina y ovina en Galicia. Estudio de prevalencias, posibles resistencias al triclabendazol y variabilidad genética de los parásitos, subvencionado por la Consellería do Medio Rural, Xunta de Galicia (PGIDIT04RAG503019PR). Fasciola hepatica: estudio de variabilidad genética y caracterización molecular de antígenos de relevancia en diagnóstico y/o vacunación, subvencionado por el Ministerio de Educación y Ciencia (AGL2006-13936-C02-01). Nuevas estrategias en el diseño de vacunas empleando discriminación self-nonself: vacunas quiméricas poliepitópicas para el control de la fasciolosis en rumiantes, subvencionado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (AGL2010-22290-C03-01). Diseño y construcción de antígenos quiméricos poliepitópicos empleando discriminación self-nonself. Aplicaciones al control de la fasciolosis en rumiantes, subvencionado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (AGL2011-30563-C03-01). Durante su desarrollo, D. Severo Vázquez Prieto disfrutó de una beca para la realización de los estudios de tercer ciclo concedida por la Dirección Xeral de Ordenación e Calidade do Sistema Universitario de Galicia, así como del apoyo de la Consellería de Innovación e Industria mediante el Programa María Barbeito en el marco del Plan Galego de Investigación, Desenvolvemento e Innovación Tecnolóxica de Galicia-Incite. PARTE DE LOS RESULTADOS QUE APARECEN EN LA PRESENTE MEMORIA SE HAN PUBLICADO, CONSTITUYENDO LOS SIGUIENTES ARTÍCULOS: González-Díaz, H.; Pérez-Montoto, L.G.; Duardo-Sánchez, A.; Paniagua, E.; Vázquez-Prieto, S.; Vilas, R.; Dea-Ayuela, M.A.; Bolás-Fernández, F.; Munteanu, C.R.; Dorado, J.; Costas, J.; Ubeira, F.M. 2009. Generalized lattice graphs for 2D-visualization of biological information. Journal of Theoretical Biology, 261: 136-147. Vázquez-Prieto, S.; Vilas, R.; Mezo, M.; González-Warleta, M.; Ubeira, F.M.; Paniagua, E. 2011. Allozyme markers suitable for population genetic analysis of Fasciola hepatica. Veterinary Parasitology, 176: 84-88. Vilas, R.; Vázquez-Prieto, S.; Paniagua, E. 2012. Contrasting patterns of population genetic structure of Fasciola hepatica from cattle and sheep: implications for the evolution of anthelmintic resistance. Infection, Genetics and Evolution, 12: 45-52. XVI Índice Amplificación mediante PCR ............................................................................ 50 Genotipado de los loci microsatélites .............................................................. 52 Análisis de datos ..................................................................................................... 53 Identificación de individuos clonales ................................................................ 53 Equilibrio Hardy-Weinberg y estimación de la variabilidad genética ............... 55 Análisis de estructura genética poblacional ..................................................... 56 RESULTADOS ........................................................................................................... 61 Variabilidad genética intrapoblacional .................................................................... 63 Diversidad genotípica y estructura clonal ............................................................... 69 Desviación del equilibrio Hardy-Weinberg y desequilibrio genotípico ........................... 72 Estructura poblacional y diferenciación genética ................................................... 78 DISCUSIÓN ............................................................................................................... 85 Estructura genética poblacional de Fasciola hepatica en ganado bovino y ovino ...... 87 Implicaciones para la resistencia frente a antihelmínticos ..................................... 97 CONCLUSIONES ...................................................................................................... 101 ANEXO ................................................................................................................... 105 BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................... 117 INTRODUCCIÓN Introducción 3 El estudio de la forma en que la variabilidad genética se distribuye en el espacio geográfico, lo que se ha denominado el análisis de la estructura genética poblacional, resulta clave para la comprensión de la dinámica evolutiva de las especies. Mediante la consideración de determinados modelos matemáticos, tal estudio permite inferir la intensidad relativa con la que distintos factores evolutivos modifican las frecuencias alélicas a lo largo de sucesivas generaciones. Por ejemplo, la estimación de escasa diferenciación genética entre poblaciones relativamente distantes puede levantar sospechas sobre la participación de selección estabilizadora o la circulación entre aquellas de un alto grado de flujo génico. Por el contrario, la detección de alta divergencia interpoblacional es coherente con bajas tasas de flujo génico en relación con la deriva genética, entre otras hipótesis. Sin embargo, ciertas características de la biología de los organismos influyen en la actuación relativa de tales factores y, por lo tanto, contribuyen a la configuración de la estructura genética poblacional. Así, es evidente que la existencia de mecanismos de dispersión, tales como la presencia en el ciclo vital de una forma larvaria pelágica, aumentan las posibilidades de flujo génico, implicando homogeneidad en largas distancias. El análisis de la estructura genética poblacional al que nos estamos refiriendo es posible mediante el uso de marcadores moleculares codominantes, tales como las alozimas y los microsatélites. Su condición de codominantes hace referencia a la posibilidad de distinción entre heterocigotos y homocigotos, lo cual simplifica el cálculo de frecuencias genotípicas. Las alozimas son distintas formas moleculares que catalizan una misma reacción enzimática y que presumiblemente son codificadas por distintos alelos en un locus. En la medida en que distintas alozimas sean discriminadas, por ejemplo mediante técnicas electroforéticas, podrán identificarse genotipos que servirán para estimar frecuencias genotípicas y alélicas en una o varias poblaciones y, así, llevar a cabo su descripción genética fundamental. Los microsatélites son secuencias de unos pocos nucleótidos que se repiten en tándem a lo largo de todo el genoma. Dado que las secuencias que flanquean a un microsatélite son singulares, este tipo de loci también pueden ser amplificados específicamente mediante PCR si se dispone de información a priori acerca de las secuencias flanqueantes. Los diferentes alelos en un locus microsatélite se definen por un número distinto del motivo de repetición, 4 Introducción de manera que pueden ser identificados en un análisis de fragmentos convencional, lo que permite la inferencia de los correspondientes genotipos. Con la estimación de frecuencias genotípicas y alélicas en distintas poblaciones se pueden calcular estadísticos que describen los niveles de variabilidad genética de las especies y cómo esta se distribuye a lo largo de su rango geográfico. En el caso de los organismos parásitos, no cabe duda de que algunas de sus peculiaridades configuran la estructura genética poblacional, dotándola de una morfología singular que tendrá influencia en el modo en que sus poblaciones evolucionan y afrontan desafíos ambientales, tales como el deterioro del hábitat en el que viven sus hospedadores, el uso de fármacos antiparasitarios, etc. A continuación, revisaremos algunos de los principales estudios dedicados a analizar cómo la ingente diversidad de ciclos vitales que caracteriza a los organismos parásitos afecta a la estructura genética de sus poblaciones y, por ende, determina la dinámica evolutiva de los distintos linajes. ASPECTOS DEL CICLO BIOLÓGICO QUE DETERMINAN LA ESTRUCTURA GENÉTICA DE LAS POBLACIONES DE PARÁSITOS MEDIO ACUÁTICO O TERRESTRE En teoría, aquellas especies que desarrollan completamente su ciclo vital en el medio acuático (especies autogénicas) tienen una mayor capacidad de dispersión que las especies que maduran en hospedadores terrestres o aves ictiófagas y solo utilizan a los peces como hospedadores intermediarios o paraténicos (especies alogénicas) (Esch et al., 1988). Así, resulta razonable esperar que las especies autogénicas presenten menor subdivisión genética en el espacio geográfico que las especies alogénicas, debido a mayores posibilidades de flujo génico. En consonancia con esta hipótesis, Criscione y Blouin (2004) estudiaron poblaciones de cuatro especies de digeneos que parasitan a salmónidos del género Oncorhynchus y observaron un grado de estructuración genética claramente inferior en las tres especies autogénicas en comparación con la cuarta especie, cuyo ciclo vital incluía hospedadores terrestres de gran movilidad. Generalizando sus resultados, Criscione y Blouin (2006) han sugerido que las especies de parásitos estrictamente Introducción 5 acuáticas, con varios hospedadores intermediarios en su ciclo vital, integran poblaciones esencialmente panmícticas, ya que dichas cualidades ofrecen amplias oportunidades para la mezcla de la progenie del parásito antes de su incorporación al hospedador definitivo, donde tiene lugar la reproducción sexual. Por lo tanto, en hábitats acuáticos, es previsible un alto grado de mezcla genética y, si existiese reproducción asexual, una baja transmisión agregada de clones a los hospedadores definitivos. Presumiblemente, tales poblaciones deberían caracterizarse por mostrar frecuencias genotípicas acordes con los valores esperados en el equilibrio Hardy-Weinberg (HWE), así como escasa diferenciación interpoblacional. Sin embargo, esta hipótesis se ha testado empíricamente muy pocas veces en el hospedador definitivo (Criscione y Blouin, 2006; Criscione et al., 2011), realizándose la mayoría de los trabajos en hospedadores intermediarios secundarios (Rauch et al., 2005; Keeney et al., 2007a,b; Leung et al., 2009). Todos estos estudios, no obstante, apoyan dicha hipótesis, pues se han detectado muy pocos clones (más del 89 % de los helmintos genotipados son genotipos únicos) y no se han observado desviaciones del HWE en las poblaciones estudiadas, excepto en las examinadas por Leung et al. (2009) que fueron atribuidas a la posible presencia de alelos nulos. Una aparente excepción a la hipótesis de altos niveles de mezcla en poblaciones de helmintos parásitos con ciclo vital estrictamente acuático fue observada por Vilas et al. (2003) en el digeneo marino Lecithochirium fusiforme. Estos autores encontraron diferenciación alozímica moderada entre infrapoblaciones (conjunto de individuos de una especie que parasitan al mismo individuo hospedador), así como déficits significativos de heterocigotos a nivel infrapoblacional, cuya magnitud variaba considerablemente entre loci. Los autores sugirieron la posibilidad de que tales desviaciones del HWE fueran debidas al efecto Wahlund, causado por el hecho de que las infrapoblaciones estuvieran integradas por parásitos pertenecientes a grupos genéticamente diferenciados. Esta hipótesis fue experimentalmente comprobada mediante microsatélites por Criscione et al. (2011), evidenciándose tres grupos genéticamente diferenciados que podrían corresponder a sendas especies crípticas, cuya estructura, considerada individualmente, resultó coherente con la expectativa de panmixia y la alta mezcla de clones facilitada por un ciclo biológico acuático. 6 Introducción Los parásitos que presentan ciclos semiacuáticos con un hospedador definitivo terrestre, tales como Schistosoma mansoni y Fascioloides magna, tienen un alto riesgo de depositar sus huevos en un hábitat inadecuado para la transmisión, lo que aumenta la varianza en el éxito reproductivo entre genotipos y, por consiguiente, contribuye a explicar la baja diversidad genética observada (Mulvey et al., 1991; Théron et al., 2004; Prugnolle et al., 2005c). Sin embargo, en especies puramente acuáticas la puesta siempre se produce en el agua, medio propicio para la dispersión de estadios larvales de tales especies (Criscione y Blouin, 2006). Además, en especies hermafroditas, las de transmisión acuática presentan mayores niveles de variabilidad genética que aquellas con ciclos vitales completamente terrestres, como Echinococcus granulosus, debido a que la mezcla facilitada por el medio acuático reduce las posibilidades de apareamiento entre individuos del mismo clon y, por tanto, de consanguinidad (Šnábel et al., 1996; Lymbery et al., 1997; Vilas y Paniagua, 2004; Criscione y Blouin, 2006). MOVILIDAD DEL HOSPEDADOR La diseminación de los parásitos depende de la movilidad y capacidad de dispersión de sus hospedadores, lo que condiciona la magnitud del flujo génico entre las poblaciones parasitarias y contribuye a dar forma a su estructura genética poblacional a escala local o regional (Blouin et al., 1995; McCoy et al., 2003a; Criscione y Blouin, 2004). Esta influencia será especialmente notable en parásitos con ciclos vitales directos y escasa capacidad de dispersión, donde la existencia de hospedadores móviles o vectores en el ciclo vital generalmente conduce a un elevado flujo génico entre las poblaciones parasitarias, reduciendo la diferenciación genética entre ellas. Por ejemplo, Blouin et al. (1995) examinaron la estructura genética de cinco especies de nematodos tricostrongílidos: cuatro de ellas parásitas de ganado doméstico y una de rumiantes salvajes. Todas las poblaciones estudiadas presentaron alta diversidad genética, pero solo los helmintos parásitos del ganado doméstico revelaron bajo grado de estructuración geográfica, coherente con alto flujo génico entre poblaciones. Los autores atribuyeron la falta de estructuración genética en los parásitos del ganado doméstico al transporte frecuente de este por parte de los ganaderos a lo largo del área geográfica estudiada. Resultados similares se observaron incluso en situaciones donde, a priori, se espera un alto grado de Introducción 7 estructuración genética como es el caso de las poblaciones de Teladorsagia en el archipiélago de Santa Kilda, geográficamente aisladas de otras poblaciones (Braisher et al., 2004). No obstante, Leignel y Humbert (2001) detectaron subdivisión genética significativa entre poblaciones aisladas de Teladorsagia circumcincta que parasitan a ganado doméstico, posiblemente debido a diferencias de manejo del ganado en la zona. La presencia de hospedadores que no favorecen la dispersión parasitaria contribuye a intensificar la estructuración genética y con frecuencia sus poblaciones se ajustan a un modelo de aislamiento por distancia. Por ejemplo, las poblaciones del nematodo Heterorhabditis marelatus, cuyos hospedadores son insectos de escasa movilidad, presentan menor variación genética y mayor subdivisión que las poblaciones de parásitos con hospedadores vertebrados (Blouin et al., 1999). Asimismo, los platelmintos no parásitos integran, por lo general, poblaciones altamente estructuradas desde el punto de vista genético, incluso a escala microespacial, debido a sus limitadas posibilidades de dispersión (Hebert y Payne, 1985; Dynes et al., 2001; Pongratz et al., 2002). Evidentemente, la movilidad del hospedador también influye en la estructura genética del parásito a nivel infrapoblacional. Por ejemplo, en el archipiélago caribeño de Guadalupe, los hospedadores intermediarios de S. mansoni casi siempre están infectados por un solo genotipo, mientras que los hospedadores definitivos, ratas del género Rattus, albergan una amplia gama de genotipos parasitarios debido a su movilidad relativamente elevada (Barral et al., 1996; Théron et al., 2004). No obstante, el comportamiento territorial de este hospedador es un factor que potencialmente aumenta la estructuración genética a este nivel del ciclo vital (Sire et al., 2001). ESPECIFICIDAD POR EL HOSPEDADOR El grado de especificidad por su hospedador que manifiestan los organismos parásitos afecta a los niveles de flujo génico parasitario entre las especies hospedadoras (Nadler, 1995; Criscione et al., 2005; Poulin y Keeny, 2008), por lo tanto, es previsible que el modelo de estructura genética que presenten estos organismos varíe en función del espectro de especies hospedadoras que posean. Así, los parásitos que maduren sexualmente en un número restringido de especies hospedadoras es probable que muestren un escaso flujo génico interpoblacional. 8 Introducción Por el contrario, es razonable esperar que los parásitos generalistas integren poblaciones genéticamente más homogéneas en el espacio, pero a la vez más diversas, debido a la existencia de mayores oportunidades de flujo génico y de selección equilibradora. Sin embargo, las diferencias de comportamiento o ecológicas entre múltiples especies hospedadoras también pueden promover la estructuración genética en las poblaciones parasitarias, incluso si la especificidad de hospedador es baja, ya que tales diferencias afectan a la probabilidad de contacto entre hospedadores (McCoy et al., 2001). Generalmente, la dinámica demográfica y evolutiva de las especies parásitas que explotan un amplio espectro de hospedadores difiere de aquellas que solo infectan a una especie. Así, los parásitos especialistas suelen estar mejor adaptados localmente a sus hospedadores que los generalistas (Lajeunesse y Forbes, 2002). Además, los parásitos con un estrecho espectro de hospedadores están sometidos a eventos de extinción-recolonización con mayor frecuencia que las especies generalistas, sobre todo si parasitan a poblaciones pequeñas y fragmentadas como son las constituidas por muchos animales salvajes (Ericson et al., 1999; Thrall et al., 2001). Tales procesos demográficos pueden provocar la pérdida de la diversidad genética en las poblaciones parasitarias e incrementar su diferenciación a través de mayores efectos de deriva genética. Por el contrario, los parásitos capaces de infectar a múltiples especies no dependen de la dinámica poblacional de una única especie hospedadora, siendo menos probable que sus poblaciones sufran fluctuaciones extremas, lo que les permitiría mantener un mayor tamaño efectivo de población (Dobson, 2004; Barret et al., 2008). MODO DE REPRODUCCIÓN El modo de reproducción influye directamente sobre la génesis y distribución de la variabilidad genética. En general, las especies que experimentan recombinación sexual presentan niveles más altos de diversidad genética que aquellas cuyo modo de reproducción es únicamente asexual (Huyse et al., 2005); sin embargo, muchos parásitos exhiben tanto reproducción sexual como mecanismos de amplificación clonal. La importancia relativa de ambas formas de reproducción determinará la estructura genética poblacional del parásito. Así, las poblaciones de nematodos tricostrongílidos que se reproducen sexualmente son Introducción 9 desde el punto de vista genético más diversas y menos estructuradas que las de otros nematodos filogenéticamente relacionados que exhiben partenogénesis, tales como Strongyloides, ciertos parásitos de plantas y nematodos entomopatogénicos (Blouin, 1998; Anderson et al., 1998). No obstante, en poblaciones predominantemente partenogenéticas de Strongyloides ratti, la mayor parte de la variación genética tiene lugar entre parásitos de un mismo hospedador definitivo, observándose una pequeña subdivisión genética entre distintas localidades geográficas, presumiblemente debido a la movilidad del hospedador, ratas del género Rattus, y a la reproducción sexual que ocurre ocasionalmente (Fisher y Viney, 1998). En aquellas especies hermafroditas en las que predomina la autofecundación sobre la fecundación cruzada (Lymbery et al., 1997), los niveles de variabilidad genética con frecuencia son inferiores a los observados en especies relacionadas con mecanismos que impiden o limitan la autofecundación (Šnábel et al., 1996; Vilas y Paniagua, 2004; Criscione y Blouin, 2006). Por otra parte, en poblaciones de parásitos hermafroditas con baja intensidad de infección pueden incrementarse tanto la tasa de autofecundación como la probabilidad de consanguinidad, si tiene lugar la transmisión agregada de individuos genéticamente idénticos. Dado que las especies hermafroditas suelen recurrir a la fecundación cruzada siempre que les es posible, ya que la autofecundación sirve como recurso solo cuando no encuentran a otros congéneres en el hospedador definitivo, la estructura reproductiva de la población se verá influenciada por la dinámica de la transmisión parasitaria, la cual determinará la distribución de los parásitos en los hospedadores definitivos (Criscione y Blouin, 2006). En S. mansoni se ha observado una estructura genética poblacional diferente según el sexo del parásito, de tal forma que la diferenciación genética entre infrapoblaciones es mayor en las hembras que en los machos. De acuerdo con el ciclo biológico y los excesos de heterocigotos detectados en las hembras con respecto a los valores esperados bajo panmixia, la estructura observada no pudo ser explicada únicamente por diferencias de dispersión del parásito según el sexo (Prugnolle et al., 2002). Estudios posteriores demostraron que este modelo resulta de la interacción entre la alta variabilidad en el tamaño de progenie, la existencia 16 Introducción el flujo génico, que es un agente homogeneizador; y la selección natural, que puede tanto aumentar como disminuir el grado de estructuración. De los ejemplos relatados anteriormente puede inferirse que las diferencias en el ciclo vital que afecten a estos tres factores fundamentales repercuten en la manera en que la variabilidad genética se distribuye en el espacio y en el tiempo, y, en este sentido, determinan la evolución de los distintos linajes. Sin embargo, en comparación con los invertebrados de vida libre, existen ciertas características comunes a los helmintos parásitos que influyen en su dinámica evolutiva de manera particular. Los organismos parásitos se caracterizan, en general, por presentar ciclos vitales cortos, breves tiempos de generación y alta fecundidad. Asimismo, no son raros los modos de reproducción hermafrodita, partenogenética o asexual. Además, las poblaciones parasitarias se encuentran característicamente fragmentadas. La subdivisión de la población parasitaria en grupos de individuos reproductores que la existencia de infrapoblaciones implica, las importantes fluctuaciones demográficas causadas por el contraste entre fecundidades elevadas y mortalidades igualmente altas y la posibilidad de reproducción asexual son factores que explicarían fuertes efectos de deriva genética. En otras palabras, tales propiedades, características del modo de vida parasitario, reducirían el tamaño efectivo de población con respecto a organismos de vida libre con el mismo tamaño censal. Según esta hipótesis, los organismos parásitos deben constituir poblaciones genéticamente poco variables y altamente estructuradas, consecuencias fundamentales del proceso de deriva. De acuerdo con esto, Price (1977, 1980) propuso que las especies parásitas conforman, por lo general, poblaciones en gran medida homocigóticas y altamente diferenciadas entre sí, especialmente si la probabilidad de dispersión del parásito es baja. El escenario descrito por Price resulta particularmente plausible si la progenie de una infrapoblación tiende a infectar al mismo individuo hospedador. Muchos de los ejemplos utilizados por Price son insectos fitófagos que pueden presentar generaciones recurrentes en una única planta hospedadora y, por consiguiente, la misma infrapoblación puede sufrir deriva genética a lo largo de sucesivas generaciones. Sin embargo, existe una enorme diversidad de ciclos vitales entre los organismos parásitos y se han relatado algunos ejemplos que Introducción 17 ilustran cómo aspectos cruciales, entre los que se incluyen el modo de reproducción y transmisión, así como el número, tipo y especificidad de hospedador, llegan a conformar la estructura genética poblacional. Así, la progenie de muchos parásitos cuenta con numerosas posibilidades para su mezcla y posterior incorporación a nuevos hospedadores definitivos, lo cual contribuye a aumentar sus niveles de variabilidad genética. De hecho, se ha comprobado que son muchos los helmintos parásitos que muestran niveles de diversidad alozímica y de ADN mitocondrial similares a los descritos en invertebrados de vida libre (Blouin et al., 1992; Bush et al., 2001; Criscione y Blouin, 2004). EL ENFOQUE GENÉTICO POBLACIONAL EN PARASITOLOGÍA El conocimiento de la estructura genética resulta fundamental a la hora de comprender los cambios evolutivos que se producen en el seno de las poblaciones parasitarias, es decir, los denominados procesos microevolutivos. El análisis de la variación genética y su distribución a distintos niveles es frecuentemente la única forma de estimar parámetros poblacionales ecológicamente relevantes, tales como los modos y estrategias de reproducción, la capacidad de dispersión o el tamaño efectivo de población. Asimismo, la estructura genética poblacional puede ser utilizada para inferir procesos epidemiológicamente relevantes o dilucidar aspectos ecológicos y evolutivos en los organismos parásitos (Nadler, 1995; Paterson y Viney, 2000; Criscione et al., 2005; Archie et al., 2009). La observación directa de la dispersión parasitaria entre hospedadores es muy difícil debido al pequeño tamaño, localización y biología de los organismos parásitos (De Meeûs et al., 2007). No obstante, el análisis de la estructura genética de las poblaciones parasitarias proporciona un método alternativo para dilucidar los modelos de transmisión, incluso a escala local (Criscione et al., 2005; Archie et al., 2009). Así, marcadores moleculares altamente polimórficos (v. g., los microsatélites) y potentes métodos de asignación poblacional (Manel et al., 2005; Francois et al., 2006) permiten examinar la existencia de distintos grupos genéticos de parásitos dentro de una población hospedadora (McCoy et al., 2003b; Criscione y Blouin, 2006; Chevillon et al., 2007), para después testar posibles correlaciones con factores ecológicos que podrían afectar a la distribución de la variación 18 Introducción genética dentro y entre estos grupos (Storfer et al., 2007). La incorporación de los resultados de agrupación genética a las variables espaciales, epidemiológicas y ecológicas permite resaltar aquellos factores que afectan a los patrones de dispersión parasitaria (Criscione et al., 2010). A partir de la estructura genética de las poblaciones parasitarias se puede obtener información sobre la de sus hospedadores (Wirth et al., 2005; Nieberding y Olivieri, 2007). Los organismos parásitos han sido ampliamente utilizados como marcadores biológicos en la discriminación de stocks de organismos marinos migratorios (MacKenzie y Abaunza, 1998; MacKenzie, 2002). En estos estudios, la presencia o ausencia de especies de parásitos ha servido para identificar el origen geográfico de sus hospedadores. Sin embargo, si la subdivisión genética del parásito es mayor que la del hospedador, los genotipos de aquel permitirían la identificación de la población de origen del hospedador, incluso con mayor precisión que el análisis del genotipo de este (Manel et al., 2002; Criscione et al., 2006). Las estructuras genéticas del parásito y el hospedador pueden ser muy diferentes debido, por ejemplo, a que el flujo génico sea distinto entre parásitos que entre hospedadores o a que la población hospedadora presente un tamaño efectivo de población diferente a la de los parásitos. De hecho, diversas especies de parásitos muestran un grado de estructuración genética igual o mayor que el de sus hospedadores (Nadler et al., 1990; Mulvey et al., 1991; Jobet et al., 2000; Nieberding et al., 2004; McCoy et al., 2005; Prugnolle et al., 2005c). Los organismos parásitos también pueden resultar útiles en la identificación de: 1) focos de transmisión en estudios epidemiológicos, 2) formas de dispersión del hospedador o zonas de alimentación en el caso de especies migratorias, y 3) unidades evolutivamente significativas (ESUs), que representan grupos de poblaciones genéticamente diferenciados con un potencial adaptativo específico (Criscione y Blouin, 2007). La posibilidad de cambio sustancial en la composición genética de una población cualquiera, por ejemplo en la dirección de un fenotipo resistente, está determinada por la variabilidad genética que alberga la población. La distribución espacial y temporal de dicha variación genética poblacional se encuentra conformada por diferentes procesos que interactú an entre sí e influyen en la Introducción 19 selección de rasgos adaptativos. Por lo tanto, los estudios de estructura genética poblacional permiten obtener información sobre la magnitud de tales procesos que, a su vez, resulta útil en la elaboración de hipótesis sobre la evolución de rasgos adaptativos, tales como la resistencia a fármacos o el desarrollo de virulencia (v. g. Hawdon et al., 2001; Koffi et al., 2006; Churcher et al., 2008; Silvestre et al., 2009; Criscione et al., 2010). En particular, el flujo génico y la deriva genética, dos procesos que generalmente ejercen efectos antagónicos en la estructura genética de las poblaciones, determinan la eficacia de la selección natural en la propagación de mutaciones favorables durante el transcurso de varias generaciones. Así, la selección direccional es más eficaz en poblaciones de gran tamaño que presentan un flujo génico elevado ya que, a medida que se incrementa el tamaño efectivo de población, la fluctuación aleatoria en la frecuencia alélica es menor. Además, la dispersión de la mutación se verá favorecida por la presencia de cualquier factor que incremente el flujo génico, sin embargo, este puede retardar la adaptación local cuando las presiones selectivas difieren entre poblaciones. Teniendo en cuenta estas variables fundamentales, se ha sugerido que el rápido desarrollo y extensión de las resistencias a los benzimidazoles en los nematodos tricostrongílidos de importancia veterinaria están causados por el gran tamaño efectivo de población y el alto flujo génico que presentan estas especies (Blouin et al., 1995; Conder y Campbell, 1995). FASCIOLA HEPATICA: MORFOLOGÍA Y CICLO BIOLÓGICO Los adultos de Fasciola hepatica (Trematoda: Digenea: Fasciolidae) presentan un cuerpo aplanado en forma de hoja, con un tamaño comprendido entre 20-50 mm de largo y 6-13 mm de ancho (Figura 1). En la parte anterior, muestran una proyección cónica característica, en cuyo extremo se observa una ventosa oral que rodea a la boca. Próxima a esta, en la base del cono, se localiza la ventosa ventral o acetábulo, algo mayor que la oral. De la boca parte una faringe musculosa y prominente, seguida del esófago que se bifurca formando dos ramas laterales que se ramifican dendríticamente. El aparato reproductor masculino, que consta de dos testículos ramificados y situados en tándem, termina en un órgano copulador, el cirro, que se desenvaina durante la cópula para introducir el esperma en el poro genital femenino, situado junto al poro genital masculino, en un atrio genital común. 20 Introducción A un lado del útero se puede observar el ovario, una estructura arborescente de pequeño tamaño y forma digitada. Tanto el ovario como el útero confluyen hacia la zona media del cuerpo y se reúnen en el ootipo, rodeado por las glándulas de Mehlis que desembocan en él. A la zona ocupada por estas glándulas llegan los conductos vitelógenos que se disponen por todo el margen exterior del parásito. El tegumento, cubierto de espinas dirigidas hacia atrás que varían en tamaño y distribución, ayuda al parásito a mantener la homeostasis, esencial para la supervivencia dentro del hospedador definitivo, y desempeña una función en la absorción e intercambio de nutrientes y sustancias de desecho, así como en la regulación iónica y en la protección ante la reacción inmunológica del hospedador (Dangprasert et al., 2001). Figura 1. Morfología básica de un adulto de Fasciola hepatica. Introducción 21 Este helminto tiene una distribución mundial e infecta a numerosas especies de mamíferos, predominantemente al ganado bovino, ovino y caprino; sin embargo, tanto el ganado porcino como diversas especies de équidos y camélidos también pueden actuar como hospedadores definitivos. Asimismo, animales herbívoros salvajes como ungulados, lagomorfos y suidos son susceptibles a la infección. Otros animales y el hombre son considerados hospedadores definitivos accidentales, pudiendo desempeñar un papel importante en la transmisión del parásito (Mas-Coma et al., 2005). El ciclo biológico de F. hepatica es indirecto y complejo (Figura 2). Los huevos, depositados en los conductos biliares por las formas adultas, son arrastrados con las secreciones biliares al intestino delgado y posteriormente expulsados al medio externo con las heces del hospedador definitivo. Estos son de gran tamaño, oscilando entre 120-160 x 60-90 μm, de forma ovoide, operculados y de color pardo amarillento. En el momento de la puesta no están segmentados y, aunque pueden experimentar un desarrollo embrionario parcial en las heces, la culminación del mismo requiere la liberación del huevo de la masa fecal, normalmente facilitada por factores tales como las fuertes lluvias o la deposición de heces en agua. Los huevos pueden permanecer viables durante largos periodos de tiempo, desde tres semanas a varios meses. En condiciones favorables de temperatura, concentración de oxígeno y humedad tiene lugar en el huevo la apertura del opérculo y la liberación de una larva móvil denominada miracidio que, en un periodo máximo de 24 horas después de la eclosión, deberá alcanzar al hospedador intermediario, molusco gasterópodo de la familia Lymnaeidae. El miracidio penetra activamente en el caracol por la acción mecánica de su papila anterior y la secreción de enzimas proteolíticas (Smyth y Halton, 1983). En el molusco, donde tiene lugar la multiplicación asexual del parásito, los miracidios se transforman en esporocistos, que constituyen el primer estadio larvario de F. hepatica generado en el hospedador intermediario, y a partir de sus células germinales se forman las redias, segundo estadio larvario. Finalmente, las redias dan lugar a las cercarias o, en condiciones adversas, a una segunda generación de redias, pudiendo incluso producirse hasta cuatro generaciones de estas (Rondelaud et al., 2009). De cinco a siete semanas después de la infección, 22 Introducción las cercarias maduras abandonan activamente el caracol y en el medio externo se adhieren a la vegetación acuática a través de su ventosa oral, convirtiéndose en metacercarias por un proceso de enquistamiento. La resistencia de estas en el medio externo es muy alta y depende principalmente de las condiciones ambientales, especialmente de la humedad relativa, la temperatura y la luz solar directa (Boray y Enigk, 1964; Hodasi, 1971). Además, mantienen su viabilidad durante largos periodos de tiempo, aunque son muy sensibles a las altas temperaturas y a la desecación (Ashrafi et al., 2006). Figura 2. Ciclo biológico de Fasciola hepatica. Esquema modificado del publicado por el CDC (Centers for Disease Control and Prevention). La infección del hospedador definitivo se produce cuando este ingiere pasto o agua contaminada con metacercarias en terrenos inundados, al borde de arroyos, pantanos o charcas. También, aunque las metacercarias son muy sensibles a la desecación que se origina durante el procesado de la hierba para su conservación, Introducción 23 es posible que la infección ocurra en estabulación mediante, por ejemplo, la alimentación con henos procedentes de ensilados incorrectos, donde las metacercarias pueden mantener su capacidad infectante. Parte de las metacercarias ingeridas por el hospedador definitivo mueren en el tracto gastrointestinal y son relativamente pocas las que logran alcanzar el estadio adulto. Aproximadamente una hora después de la ingestión, el parásito se desenquista en el intestino delgado. Este proceso se ve favorecido in vitro por la elevada concentración de dióxido de carbono, las condiciones reductoras y la alta temperatura, así como por la presencia de bilis, sales biliares y jugo gástrico (Dixon, 1966; Smith y Clegg, 1981; Sukhdeo y Mettrick, 1986). Una vez desenquistadas, las formas inmaduras atraviesan la pared intestinal, migran por la cavidad peritoneal hasta perforar la cápsula de Glisson y acceden al parénquima hepático, donde pueden causar importantes lesiones. De ocho a diez semanas después de la infección, las formas juveniles alcanzan los conductos biliares donde adquieren la madurez sexual. Las fasciolas quedan adheridas a las paredes de los conductos biliares gracias a sus ventosas y espinas, provocando lesiones del epitelio y vasos sanguíneos. Es en esta localización donde tiene lugar la reproducción sexual y la formación de una nueva generación de huevos que serán arrastrados con la bilis al intestino y liberados al exterior a través de las heces. Ocasionalmente, se pueden producir infecciones ectópicas causadas por la migración de formas inmaduras a través de otros órganos diferentes al hígado. ESTRUCTURA GENÉTICA POBLACIONAL DE FASCIOLA HEPATICA: HIPÓTESIS En teoría, una especie como F. hepatica, con un ciclo vital que involucra a un solo hospedador intermediario, caracoles con una capacidad de dispersión muy limitada, en cuyo interior se producen multitud de especímenes clonales, a su vez, de escasa movilidad, y que se enquistan en el pasto formando agregados de individuos emparentados que serán incorporados de manera conjunta al hospedador definitivo, debería caracterizarse por integrar infrapoblaciones que alberguen múltiples parásitos genéticamente idénticos, un factor que contribuiría a aumentar los índices de consanguinidad y a reducir el tamaño efectivo de población. Los presumiblemente bajos tamaños efectivos darían lugar a una pérdida de la 24 Introducción variabilidad genética dentro de las poblaciones del parásito y a un incremento de la divergencia interpoblacional. Tales efectos de deriva genética se verían recrudecidos si el modo de reproducción predominante en el hospedador definitivo fuese la autofecundación o bien la fecundación cruzada entre individuos clonales. No obstante, dados los niveles de variabilidad genética que se han detectado en ciertas poblaciones de F. hepatica (Agatsuma et al., 1994; Hurtrez-Boussès et al., 2004; Walker et al., 2007, 2011a), el modo de reproducción predominante parece ser la fecundación cruzada, además de existir importantes niveles de flujo génico. Con todo, se han detectado casos de reproducción partenogenética en formas diploides y triploides, principalmente de origen asiático (Agatsuma et al., 1994; Terasaki et al., 1998, 2000); aunque también en Europa se ha hallado un aislado triploide que se reproduce mediante partenogénesis (Fletcher et al., 2004). Por otra parte, dado que la capacidad de dispersión intrínseca de F. hepatica es limitada, debido a su ciclo vital y a la extrema labilidad de sus formas larvarias, el flujo génico establecido entre las poblaciones del parásito estaría básicamente determinado por la movilidad del hospedador definitivo. Luego, si el efecto de la selección natural es pequeño y la tasa de mutación relativamente baja, el grado de diferenciación entre poblaciones será el resultado, básicamente, del equilibrio que se establezca entre la homogeneización ocasionada por el flujo génico y la diversificación causada por la deriva genética. Por lo tanto, si el tamaño efectivo es bajo y no existen importantes movimientos de ganado entre explotaciones, cabría esperar que las infrapoblaciones de distintas localidades geográficas difirieran de manera notable en su composición genética. Por el contrario, un elevado flujo génico interpoblacional favorecido, por ejemplo, por la mano del hombre, mantendría la homogeneización genética, retardando la adaptación del parásito a las condiciones ambientales si las presiones selectivas difiriesen entre poblaciones. ESTRUCTURA GENÉTICA POBLACIONAL DE FASCIOLA HEPATICA: DATOS A pesar de la importancia de los estudios de estructura genética poblacional en el control eficaz de las enfermedades parasitarias, prácticamente no hay datos experimentales que permitan revelar la estructura genética de las poblaciones de F. hepatica. Esta carencia es particularmente sorprendente si se considera el Introducción 25 impacto de la fasciolosis en la salud humana y animal (Mas-Coma et al., 2009), así como el rápido desarrollo de resistencias a antihelmínticos en este parásito. Se desconoce, por ejemplo, si las infrapoblaciones de adultos de F. hepatica contienen un alto número de clones y si estos tienen o no una distribución agregada entre hospedadores. Tampoco se han hecho estimaciones precisas de variabilidad genética poblacional y se ignora cómo esta se distribuye en el espacio geográfico. No obstante, existen razones para pensar que los niveles de variabilidad podrían ser más elevados de lo que se ha sospechado en un principio. Así, un estudio preliminar llevado a cabo con seis loci microsatélites en una población del parásito sugiere que las poblaciones de F. hepatica podrían contener una importante variabilidad genética y que la fecundación cruzada sería el modo de reproducción preferencial (Hurtrez-Boussès et al., 2004). Haciendo uso de marcadores RAPDs en tres especies hospedadoras, Vargas et al. (2003) demostraron un alto nivel de polimorfismo de F. hepatica tanto entre parásitos de la misma infrapoblación como de distintas infrapoblaciones. Utilizando este tipo de marcadores genéticos, Semyenova et al. (2003) analizaron la variación de poblaciones geográficamente aisladas, concluyendo que el 86,54 % de la diversidad genética total se debió a diferencias dentro de infrapoblaciones; el 8,16 % se atribuyó a diferencias entre infrapoblaciones de cada componente poblacional (conjunto de infrapoblaciones que parasitan a una misma especie hospedadora en una localidad geográfica determinada); y el 5,3 % restante a diferencias entre poblaciones. Estos resultados indican alta diversidad genética, así como una escasa, aunque significativa, diferenciación entre poblaciones. Además, los datos sugieren que cada individuo hospedador es infectado por numerosos parásitos genéticamente diferentes. Con todo, estos resultados deben tomarse con la debida precaución, ya que las muestras utilizadas son relativamente pequeñas para sacar conclusiones fiables desde un punto de vista poblacional. Además, los RAPDs no parecen los marcadores más adecuados para dilucidar la estructura poblacional del parásito, ya que su reproducibilidad se ha puesto en entredicho (v. g. Backeljau et al., 1995) y se trata de marcadores dominantes, es decir, no permiten discernir directamente heterocigotos de homocigotos (Whitkus et al., 1994; Backeljau et al., 1995), por lo que la estimación de las frecuencias alélicas debe realizarse de manera indirecta, asumiendo HWE (Aagaard et al., 1998). 32 Introducción Otros procesos relacionados con la dinámica del fármaco en los tejidos parasitarios también pudieran contribuir al desarrollo de la resistencia. Así, se ha demostrado que mientras la absorción del TCBZ y el TCBZ.SO en las cepas resistentes es significativamente menor que en las susceptibles (Álvarez et al., 2005; Mottier et al., 2006), la absorción del albendazol es similar en ambos tipos (Mottier et al., 2006). Este resultado sugiere que el mecanismo de resistencia es específico para el TCBZ, pudiendo estar implicada una proteína transportadora de membrana, la glicoproteína-P (Gp-P), que impediría a la molécula antiparasitaria alcanzar concentraciones activas en el lugar de acción. La sobreexpresión de la Gp-P se ha relacionado con el desarrollo de resistencias frente a diferentes clases de antihelmínticos (Wolstenholme et al., 2004; Prichard y Roulet, 2007; James y Davey, 2009; Messerli et al., 2009) y, aunque un cambio en la actividad de la Gp-P puede representar un mecanismo no específico, es probable que juegue un papel significativo en el desarrollo de la resistencia al TCBZ. Además, experimentos llevados a cabo con inhibidores de la Gp-P han revelado la posibilidad de revertir el estatus de las cepas resistentes (Mottier et al., 2006), así como de incrementar la biodisponibilidad de los metabolitos del TCBZ en ovinos (Lifschitz et al., 2009). Asimismo, se ha demostrado que la incubación del TCBZ.SO con R (+)-verapamilo, otro inhibidor de la Gp-P, provoca una alteración severa del tegumento en las cepas resistentes, mayor incluso que la sufrida por las sensibles tratadas únicamente con TCBZ.SO (Fairweather et al., 2008). EL ENFOQUE GENÉTICO POBLACIONAL El conocimiento de la estructura genética de las poblaciones de F. hepatica resulta básico a la hora de valorar las posibilidades de desarrollo y extensión de resistencias a fármacos antihelmínticos, tales como el TCBZ. Dicho conocimiento, inferido del análisis de la variación presumiblemente neutral, es en este sentido relevante en cuanto que permite la relación con las tasas de flujo génico y el tamaño efectivo de población. Además, junto con la clarificación del modo de reproducción del parásito, es posible establecer una serie de predicciones cualitativas en relación con la dinámica evolutiva de mutaciones que confieran resistencia al TCBZ. Por ejemplo, si se confirmaran evidencias que sugirieran un tamaño efectivo relativamente pequeño, resultaría previsible que la dinámica Introducción 33 poblacional de la variante resistente estuviese determinada más por la deriva genética que por la selección natural, incluso si la presión de selección fuese importante (Hedrick, 2009). Esto significa que, simplemente por azar, la mutación podría llegar a fijarse rápidamente en unas poblaciones y no en otras que están siendo igualmente tratadas. Semejante estructura poblacional, caracterizada por la subdivisión genética, implicaría además una menor probabilidad de extensión de la resistencia y una mayor probabilidad de pérdida de la misma. Por otro lado, si el tamaño efectivo fuese grande, la variabilidad genética muy probablemente sería mayor y la selección más eficaz, mientras que el efecto de deriva devendría despreciable. En esta situación, la frecuencia de los alelos de resistencia podría incrementarse rápidamente y la población sería mayoritariamente resistente en un tiempo relativamente breve. Dado que el flujo génico es una fuerza que se opone tanto al efecto de la deriva genética como al de la selección diversificadora, se trata de un factor que potencialmente aumenta las probabilidades de diseminación de la resistencia. Sin embargo, si el flujo génico fuese marcadamente direccional, de tal manera que procediese esencialmente de poblaciones donde no existen alelos de resistencia, la velocidad con la que aumentaría la resistencia en la población que los contiene podría verse ralentizada, pues el flujo génico se opondría entonces a la adaptación local a través de la ruptura por recombinación de complejos génicos coadaptados (v. g., genes implicados en el fenotipo resistente). Ciertos aspectos del ciclo biológico de F. hepatica, tales como una supuesta distribución no aleatoria del parásito en el pasto y su transmisión agregada, ejercen una importante influencia, especialmente si la mutación resistente fuese recesiva. Según Cornell et al., (2003), la transmisión agregada del parásito promueve la extensión preferente de genes recesivos raros, posibilitando que un rasgo completamente recesivo pueda extenderse en la población tan rápidamente como uno parcial o completamente dominante. El modo de reproducción del parásito potenciaría este efecto en la medida en que contribuyese a una mayor homocigosis. Por otro lado, la laxa especificidad de F. hepatica respecto a su hospedador definitivo posibilita que animales herbívoros salvajes actúen como refugio para fenotipos resistentes al TCBZ, lo que puede contribuir a la extensión de la resistencia entre granjas (Walker et al., 2011b). 34 Introducción Este tipo de especulaciones representan algunos ejemplos de razonamiento guiado por la perspectiva evolutiva, que traemos a colación, tal vez prematuramente, para ilustrar su aplicabilidad en la problemática particular que supone la resistencia frente a antihelmínticos. Esta forma de razonamiento es análoga a la realizada en párrafos anteriores, allí donde las peculiaridades del ciclo vital del parásito fueron examinadas en consonancia con su capacidad de conformación de la estructura genética poblacional. De igual manera que a la luz de un ciclo de vida conocido pudo entonces postularse un patrón de estructura genética, ahora pueden derivarse del mismo aquellas implicaciones para el comportamiento de una mutación favorecida por la selección natural. Es en estos argumentos donde precisamente radican las principales hipótesis asociadas a la tarea experimental llevada a cabo. OBJETIVOS Objetivos 37 La capacidad de respuesta de una población parasitaria frente a presiones selectivas, como las impuestas por el tratamiento con fármacos antihelmínticos, depende de sus niveles de variabilidad genética y de cómo esta se distribuye entre hospedadores y a lo largo del espacio geográfico, es decir, de su estructura genética poblacional. Sin embargo, hasta la fecha, la mayor parte de los estudios genéticos llevados a cabo con poblaciones naturales de F. hepatica han supuesto el análisis de marcadores altamente conservados, útiles para la caracterización taxonómica, pero que apenas aportan información a escala microespacial. Por otro lado, es sabido que la arquitectura genética de las poblaciones parasitarias está influenciada por la biología del hospedador, así como por aspectos fundamentales del ciclo biológico del parásito. Por ejemplo, en trematodos digeneos, la reproducción clonal en el primer hospedador intermediario afecta a la distribución de la variabilidad genética dentro y entre hospedadores definitivos. En particular, la variación en el éxito reproductivo de los clones puede disminuir el tamaño efectivo de la población del parásito e incrementar la diferenciación entre hospedadores definitivos. Así, tanto la abundancia de clones como su transmisión son aspectos importantes a la hora de entender cómo se organiza la diversidad genética en este grupo de parásitos y sus implicaciones evolutivas. En el presente estudio, nos hemos propuesto analizar, mediante el uso de dos tipos de marcadores genéticos codominantes ampliamente utilizados en genética de poblaciones, la estructura genética poblacional de F. hepatica con el fin de obtener información fundamental en una discusión teórica sobre las posibilidades de desarrollo y diseminación de resistencias al TCBZ en el noroeste de España. Asimismo, hemos querido investigar la estructura genética poblacional del parásito en relación con su especie hospedadora. Por todo ello, nos planteamos los siguientes objetivos concretos: 1. Calcular mediante el uso de loci microsatélites y alozímicos polimórficos el grado de variación genética de distintas poblaciones geográficas de F. hepatica en el noroeste de España. 2. Determinar la existencia de posibles clones en las dos especies de hospedadores definitivos estudiadas (vacas y ovejas), así como su impacto en la estructura genética de la población. 38 Objetivos 3. Averiguar si el parásito integra poblaciones panmícticas y si una supuesta fecundación cruzada predominante tiene lugar con alta probabilidad entre individuos pertenecientes a un mismo clon. 4. Dilucidar la estructura genética de poblaciones de F. hepatica que parasitan a vacas y ovejas, además de estimar el grado de diferenciación genética entre poblaciones bovinas de este parásito en el noroeste de España. 5. Analizar los resultados obtenidos en relación con la dinámica evolutiva de posibles resistencias al TCBZ en el contexto geográfico estudiado. MATERIAL Y MÉTODOS Material y Métodos 41 R ECOLECCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS PARÁSITOS Los especímenes adultos de F. hepatica destinados a este estudio fueron obtenidos de hígados de vacas sacrificadas en distintos mataderos de la provincia de A Coruña, así como de hígados de ovejas sacrificadas in situ, durante el período comprendido entre octubre de 2004 y septiembre de 2008. Un total de 587 ejemplares fueron recolectados a partir de 20 hospedadores, 10 vacas (N = 438) y 10 ovejas (N = 149), procedentes de diferentes explotaciones ganaderas situadas en el noroeste de España: Cerceda (CCD), Mabegondo (MBO), Abegondo (ABG), Mesía (MES), Melide (MEL), Guntín (GUN), Cervantes (CER), Bóveda (BOV1 y BOV2), Chantada (CHAN) y Colunga (COL) (Figura 3). Cada una de las vacas estudiadas pertenecía a una granja diferente, por lo que todos los parásitos de cada hospedador (infrapoblación) pueden ser considerados muestras de diferentes poblaciones geográficas. Solo los parásitos obtenidos de dos hospedadores bovinos procedieron de dos granjas situadas en la misma localidad (BOV1 y BOV2). Así, se analizaron muestras procedentes de un total de 11 granjas, 10 de las cuales fueron explotaciones de ganado vacuno. Figura 3. Localización de los distintos puntos de muestreo. 48 Material y Métodos El revelado para todos los sistemas enzimáticos, excepto para la enzima GOT, pues en este caso la disolución de revelado estuvo en permanente agitación durante su incubación, implicó la utilización de una solución de agarosa al 2 %. La incubación se realizó a temperatura ambiente y en oscuridad, salvo en los casos de las enzimas ACO y HK que requirieron una temperatura de 37 °C, hasta la aparición de los correspondientes electromorfos. La actividad enzimática se detuvo con una mezcla de fijación elaborada a base de ácido acético y agua destilada (2:8), que además permitía la conservación de los geles durante varios días. Para descartar la posibilidad de contaminación enzimática procedente del tejido del hospedador, se realizaron controles para cada sistema enzimático con muestras de tejido hepático homogeneizado de vacas y ovejas. Estos extractos fueron obtenidos en las mismas condiciones que los de los parásitos y almacenados a -80 °C hasta ser sometidos a electroforesis. En todos los controles se detectó una actividad enzimática notable, pero hubo siempre una gran diferencia entre las movilidades relativas de las alozimas del parásito y las de los hospedadores, por lo que siempre resultaron de utilidad. La interpretación genética de los zimogramas se realizó siguiendo las recomendaciones de May (1992), que tienen en cuenta el número de bandas y la intensidad de tinción, así como la estructura cuaternaria conocida para estas enzimas, información disponible de estudios análogos realizados en otros helmintos parásitos (Vilas et al., 2002b). Para la denominación de las alozimas se adoptó el siguiente criterio: se nombró como 101 el alelo más próximo al origen y los demás fueron denominados consecutivamente según su posición hacia el frente de electroforesis. Los genotipos se obtuvieron a partir de los fenotipos electroforéticos por observación directa de los geles. La estructura cuaternaria de algunas de las enzimas pudo ser deducida a partir del número de bandas que mostró el individuo presuntamente heterocigoto, teniendo en cuenta el carácter diploide de los organismos considerados. Material y Métodos 49 MARCADORES MICROSATÉLITES EXTRACCIÓN DEL ADN La obtención del ADN genómico se realizó según el método clásico de extracción con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (Sambrook et al., 1989). Las muestras de tejido se troceaban para facilitar la digestión enzimática y se introducían en tubos estériles de 2 ml, convenientemente rotulados, a los que se añadían: 45 μl de SDS al 10 %, 450 μl del tampón de extracción utilizado por Blanquer (1990) y 2,25 μl de proteinasa K (20 mg/ml). Este tampón está compuesto por: NaCl 0,30 mM; Tris base 0,05 mM; EDTA 0,20 mM; EGTA 0,20 mM; espermidina 0,50 mM y espermina 0,10 mM. Para la digestión de los tejidos, los tubos eran incubados en un horno de hibridación durante toda la noche a 56 °C, en rotación suave y constante. Al día siguiente, se añadía 1 μl de ARNasa libre de ADNasa (10 mg/ml) y se incubaba a 37 °C durante una hora. Posteriormente, se añadían a cada tubo 500 μl de fenol equilibrado con Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0). Tras incubar la mezcla durante unos minutos a temperatura ambiente, se centrifugaba durante 10 minutos a 13 000 rpm. Inmediatamente, se transfería la fase acuosa a tubos de 2 ml y se añadían 500 μl de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1). La mezcla era incubada a temperatura ambiente unos minutos y centrifugada de nuevo a 13 000 rpm durante 10 minutos, transfiriendo el sobrenadante final a tubos de 2 ml. Para la precipitación del ADN, cada sobrenadante era mezclado con 1 000 μl de etanol absoluto en frío y se centrifugaban los tubos durante 10 segundos a 13 000 rpm. Posteriormente, el alcohol era eliminado por decantación y los sedimentos lavados con etanol de 70° a 4 °C para eliminar los restos de sales, centrifugándose de nuevo 10 segundos a 13 000 rpm. El etanol era aspirado y los tubos se dejaban destapados a temperatura ambiente hasta asegurar una completa evaporación de los restos de etanol. El sedimento obtenido se resuspendía en 50-200 μl de tampón TE 1X pH 8,0. El resultado de las extracciones era verificado midiendo las concentraciones de ADN en un espectrofotómetro. A continuación, se procedía a la preparación de alícuotas mediante la dilución de una pequeña parte de cada una de las muestras en agua mili-Q, a una concentración de aproximadamente 35 ng/μl, en las que se medía 50 Material y Métodos nuevamente la concentración de ADN. Todas las alícuotas fueron almacenadas a 4 °C. Este procedimiento, aunque laborioso, proporcionó un ADN limpio, de buena calidad y perdurable. AMPLIFICACIÓN MEDIANTE PCR Los seis marcadores microsatélites caracterizados hasta el momento en F. hepatica (Hurtrez-Boussès et al., 2004) fueron ensayados con algunos individuos de ciertas poblaciones del área de estudio. Este ensayo preliminar reveló el carácter monomórfico de uno de los marcadores, así como la interpretación confusa en términos genotípicos de otro locus, lo que derivó en la selección de los cuatro restantes (FH15, FH23, FH25 y FH222CBP) para llevar a cabo la investigación en las poblaciones de estudio. Estos loci fueron amplificados mediante PCR (Saiki et al., 1985), utilizando los cebadores previamente publicados, y genotipados mediante un análisis del tamaño de los fragmentos. La amplificación de cada locus microsatélite se realizó siguiendo el protocolo descrito por Hurtrez-Boussès et al. (2004), ligeramente modificado (Tabla 4). De modo general, se optimizó el volumen final de reacción a 15 μl para cada muestra analizada. El tampón de amplificación utilizado fue GeneAmp® 10X PCR Gold Buffer (Applied Biosystems) a una concentración del 10 %. Cada uno de los cuatro dNTPs se añadió en cantidades equimolares a una concentración final de 100 μM. Los cebadores, tanto el directo como el reverso, se agregaron a una concentración de 10 pmol. Con objeto de poder detectar los fragmentos amplificados en el secuenciador automático, el extremo 5’ de los cebadores directos fue marcado con un compuesto fluorescente sensible al haz del láser de los detectores del secuenciador, distinto según el locus a analizar. Las concentraciones de MgCl2 utilizadas fueron ajustadas previamente para optimizar las PCRs de los distintos loci, ya que la ADN polimerasa es muy sensible a pequeñas variaciones en la concentración de Mg2+. Por cada mezcla de reacción se empleó 1 μl de ADN extraído y 0,5 unidades de Taq ADN polimerasa (AmpliTaq Gold® DNA Polymerase; Applied Biosystems), completándose el volumen final requerido con agua mili-Q. Asimismo, se realizaron controles con el ADN de los hospedadores para descartar posibles contaminaciones, resultando negativos en todos los casos. Tabla 4. Condiciones de amplificación y características de los loci microsatélites utilizados en el presente estudio. Locus Unidad de repetición Secuencias de los cebadores (5’→3’) Ta (°C) MgCl2 (mM) Fluoróforo FH15 (GT)5AC(GTAT)2GCAT (GTAT)2(GT)2CT(GT)9 F:TTCTTCAAGCCGAATTGC R:AATTGTTGTGCTGAAACTGG 48 1,5 6-FAM FH23 (GTTT)4(GT)8CT(GT)6CT (GT)7(GGT)4(GT)6AA(GT)3 F:AGCACCAGGAAAATTGAG R:GCGAATTAATACAGCAAACC 48 1,5 PET FH25 (AC)8 F:TAGCGGTTTTGACTCTAC R:GATTCGGTTAGGATGTTG 51 1,5 VIC FH222CBP (CA)17 F:GTGGATCCCCACTGTGAGAC R:TGTCCAACTGCATGAACCAT 50 1,2 NED F: cebador directo; R: cebador inverso; Ta: temperatura de anillamiento. 52 Material y Métodos El programa de amplificación se llevó a cabo en un termociclador automático PTC-100 (MJ RESEARCH), utilizando tubos de paredes ultrafinas de 200 μl, según el siguiente protocolo: desnaturalización inicial del ADN a 94 °C durante cuatro minutos, 30 ciclos de amplificación (94 °C durante 30 segundos; temperatura de anillamiento correspondiente durante 30 segundos; 72 °C durante 30 segundos) y una extensión final a 72 °C durante 10 minutos. Una vez finalizada la reacción de PCR, se evaluó el éxito del proceso de amplificación mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 % (p/v) en tampón TBE 0,5X, teñidos con bromuro de etidio. En el primer pocillo de cada gel se cargó una mezcla de 7,5 μl de agua mili-Q; 0,5 μl del marcador de tamaño molecular (100 Base-Pair Ladder; GE Healthcare) y 1 μl del marcador del frente de electroforesis. Los restantes pocillos fueron cargados con 7 μl del correspondiente producto de amplificación y 1 μl del marcador del frente de electroforesis. Una vez conectados los electrodos a la fuente de alimentación, se aplicó en la cubeta de electroforesis una corriente constante de 135 V durante aproximadamente 20 minutos. Finalizada la electroforesis, se visualizaron las bandas de ADN mediante un transiluminador de luz ultravioleta. Con el fin de valorar la amplificación conseguida en la reacción de PCR, se fotografiaron los geles con una cámara Polaroid. GENOTIPADO DE LOS LOCI MICROSATÉLITES La determinación precisa del tamaño de los fragmentos de ADN microsatélite amplificados se realizó mediante electroforesis capilar en un secuenciador automático ABI PRISM 3730xl® (Applied Biosystems). El equipo consta de un conjunto de 16 capilares que operan en paralelo y de un sistema de detección por láser de cinco fluoróforos. Así, en un mismo capilar, se pueden analizar varios loci microsatélites con rangos de tamaño solapante, al poder emplear fluoróforos diferentes para cada uno de ellos. Al mismo tiempo, es posible marcar con el mismo fluoróforo aquellos loci que no se solapan. Este sistema permitió analizar simultáneamente en un solo capilar los cuatro loci microsatélites pertenecientes a cada individuo. Para llevar a cabo el genotipado en el secuenciador, se utilizaron placas de 96 pocillos. En cada pocillo se cargó una Material y Métodos 53 mezcla de 19,75 μl de formamida (Applied Biosystems); 0,25 μl del marcador de tamaño (GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard; Applied Biosystems) y 0,5 μl del producto de amplificación, adecuadamente diluido para evitar problemas de saturación de la señal. Las muestras se inyectaron automáticamente en los capilares previamente cargados con un polímero específico (POP-4) que actúa como matriz de separación. El genotipado se realizó con el software GeneMapper® 4.0. Los fragmentos de distinto tamaño fueron expresados como picos de absorbancia en un cromatograma, de manera que los individuos homocigotos y heterocigotos se caracterizaron por revelar uno y dos picos, respectivamente. Los alelos se identificaron según el tamaño de los fragmentos en pares de bases, lo que permitió la inferencia del genotipo en cada locus microsatélite. En aquellos casos en los que el genotipado resultó dudoso, se repitió alguno de los pasos anteriores hasta obtener un resultado fiable o fue considerado “missing data”. ANÁLISIS DE DATOS IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS CLONALES La variación detectada en los 12 marcadores genéticos codominantes estudiados, ocho alozimas y cuatro microsatélites, permitió la obtención de genotipos para múltiples loci (MLGs) correspondientes a cada individuo. Los MLGs idénticos fueron identificados con GENCLONE 2.0 (Arnaud-Haond y Belkhir, 2007). Este programa también se utilizó para calcular la probabilidad de que los grupos de MLGs idénticos correspondan a individuos clonales, es decir, individuos resultantes de mecanismos de amplificación asexual y, por consiguiente, genéticamente idénticos para todos sus loci. El análisis estadístico dirigido a la identificación de clones se llevó a cabo utilizando las frecuencias alélicas estimadas en cada población geográfica. Dada la posibilidad de que dos MLGs idénticos puedan ser producto de reproducción sexual, probabilidad evidentemente mayor cuanto menor sea la variabilidad genética de la población, se calcularon los valores de psex para cada MLG repetido, es decir, la probabilidad de observar n copias de un MLG en una muestra determinada bajo la hipótesis de panmixia. De esta manera, si un grupo con idéntico MLG presenta un valor de psex estadísticamente significativo para n = 2 (psex < 0,05), todos los individuos con ese 54 Material y Métodos mismo MLG pueden ser considerados resultado de amplificación clonal. Sin embargo, cuando este valor es estadísticamente significativo para n > 2, es poco probable que existan más de n - 1 clones con ese mismo MLG (Gregorius, 2005). Así, si un determinado MLG presenta cuatro copias y su valor de psex es estadísticamente significativo para n = 3, pero no para n = 2, podemos concluir que al menos tres de los cuatro individuos genéticamente idénticos son clones. El cálculo de los valores psex se realizó para cada población geográfica, es decir, los parásitos de cada una de las 11 granjas representaron un conjunto de datos independientes que se utilizaron como archivo de entrada en GENCLONE, a fin de evitar la sobreestimación del número de clones debida a diferencias en las frecuencias alélicas entre poblaciones. En este cálculo se tuvo en cuenta la posible desviación del HWE. La diversidad genotípica (G) se calculó como el número de MLGs observado dividido por el número total de individuos muestreados. En el caso de las ovejas, donde la presencia de clones fue frecuente, se testó si los MLGs repetidos estadísticamente significativos (psex < 0,05 para n = 2) se presentaron en los mismos hospedadores con mayor frecuencia que la esperada por azar, ya que ello puede considerarse una evidencia adicional de que tales grupos estarían compuestos por individuos resultantes de amplificación clonal. Para ello, se construyó una tabla de contingencia de cada supuesto clon por infrapoblación mediante el programa RxC (Miller, 1997), que emplea el algoritmo de Metrópolis para obtener estimas no sesgadas de los valores de P, según el test de Fisher. Los resultados de la tabla se confrontaron con la hipótesis nula de la falta de asociación entre los miembros de un supuesto clon y las infrapoblaciones en las que se recolectó cada miembro. La asociación significativa sugeriría la transmisión agregada de los grupos de individuos con el mismo MLG, lo cual, en virtud del ciclo vital del parásito, corroboraría la hipótesis de que tales grupos son verdaderos clones. Una vez identificados los clones, el análisis de estructura genética poblacional se llevó a cabo con y sin clones, con el fin de evaluar el efecto que la reproducción asexual tiene sobre la misma. En los análisis sin clones, todos los grupos con el mismo MLG se redujeron a una sola copia en el conjunto de los datos. Los MLGs incompletos fueron excluidos a la hora de identificar los Material y Métodos 55 especímenes verdaderamente clonales, aunque se incluyeron en el análisis de estructura genética poblacional con objeto de aumentar el tamaño de muestra. EQUILIBRIO HARDY-WEINBERG Y ESTIMACIÓN DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA La estimación de frecuencias alélicas y genotípicas en cada población se realizó con la ayuda del programa GENEPOP 4.0.10 (Raymond y Rousset, 1995; Rousset, 2008). Este programa se utilizó además en la comparación de las estimaciones obtenidas con los valores esperados según un modelo teórico que asume panmixia, el HWE. La magnitud de la desviación entre los valores observados y esperados en el HWE fue cuantificada mediante el estadístico F de Wright (1965), que en un contexto de estructuración equivale al estadístico FIS. Si la única causa de la desviación del equilibrio es la existencia de apareamientos consanguíneos, el estadístico F coincide con el índice de consanguinidad. Este estadístico cuantifica la desviación dentro de una población y se relaciona con la heterocigosis de la siguiente manera:   1  donde Ho y He son las proporciones de heterocigotos observadas y esperadas en el HWE, respectivamente. Luego, FIS puede variar entre menos uno y uno. FIS es igual a cero cuando no existe desviación, es decir, cuando el número de heterocigotos observado coincide con el esperado; vale menos uno cuando la muestra contiene el máximo exceso de heterocigotos y vale uno cuando exhibe el máximo defecto de heterocigotos. Por ejemplo, en un locus con dos alelos, la máxima heterocigosis esperada en el HWE es del 50 %; si en estas condiciones la muestra estuviese integrada únicamente por heterocigotos, de manera que la heterocigosis observada fuese igual a uno, FIS valdría menos uno. Por el contrario, si la muestra revelase una heterocigosis igual a cero, FIS valdría uno. En general, valores negativos indican un exceso de heterocigotos con respecto a lo esperado bajo panmixia, mientras que valores positivos indican un déficit. 56 Material y Métodos En particular, las desviaciones del HWE detectadas en este estudio fueron cuantificadas mediante el estimador de Weir y Cockerham (1984) del estadístico F de Wright y su significación estadística fue examinada mediante el test de Fisher con la ayuda de GENEPOP 4.0.10 (Raymond y Rousset, 1995; Rousset, 2008). Este programa también se utilizó en la estimación de posibles asociaciones no aleatorias entre pares de loci. Cuando se realizó el mismo test múltiples veces, el nivel de significación se ajustó de acuerdo con el método de Bonferroni (Rice, 1989). Los niveles de variabilidad genética fueron estimados mediante el número medio de alelos por locus (A), el porcentaje de loci polimórficos según los criterios del 95 % (P95) y del 99 % (P99), la heterocigosis observada (Ho) y la heterocigosis esperada (He). Concretamente, en este último caso se utilizó un estimador no sesgado (Nei, 1987). Estos parámetros fueron calculados con el programa GENETIX 4.05 (Belkhir et al., 1996-2004). Además, se calculó la riqueza alélica (AR) mediante el programa FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 1995), lo que representa una corrección que se aplica al número observado de alelos de acuerdo con el tamaño de muestra, facilitando así cualquier análisis comparativo. ANÁLISIS DE ESTRUCTURA GENÉTICA POBLACIONAL La estructura genética de una población subdividida puede analizarse por medio de los estadísticos F de Wright (1965). Así, la desviación dentro de cada subpoblación, presumiblemente debida al apareamiento no aleatorio, se cuantifica mediante el estadístico FIS. Sin embargo, puede haber panmixia en cada subpoblación y aún así la población en su conjunto desviarse de los valores esperados en el HWE, debido a la existencia de diferencias significativas en las frecuencias alélicas entre las subpoblaciones, un fenómeno denominado efecto Wahlund. La cuantificación de estas diferencias en una población subdividida viene dada por el estadístico FST y, en este sentido, proporciona una estimación del grado de desviación atribuible a diferencias genéticas entre subpoblaciones. Finalmente, el estadístico FIT supone una medida global de desviación, que no discrimina entre la desviación que tiene lugar dentro de cada subpoblación y la causada por el efecto Wahlund. En un contexto de subdivisión poblacional, los tres Material y Métodos 57 estadísticos pueden ser calculados para un locus a partir de las heterocigosis observadas y esperadas. Los tres estadísticos pueden ser calculados como:   ;    ;     donde HI y HS son la media de las heterocigosis observadas y de las heterocigosis esperadas en el conjunto de las subpoblaciones, respectivamente; HT es la heterocigosis esperada cuando el conjunto de la población es considerada una sola unidad panmíctica, es decir, cuando se asume que no está subdividida, lo que implica calcular la heterocigosis esperada a partir de la media de las frecuencias alélicas entre las subpoblaciones. El estadístico FST varía entre cero y uno, proporcionando cierta información de divergencia genética. Por ejemplo, en el caso de un locus con dos alelos, el estadístico vale cero cuando todas las subpoblaciones tienen las mismas frecuencias alélicas y uno cuando las subpoblaciones están fijadas para alelos distintos. Al igual que FIS, FIT puede tomar cualquier valor entre menos uno y uno. Evidentemente, los tres estadísticos valen cero cuando no existe desviación con respecto a los valores esperados en el HWE. La relación entre ellos no es aditiva, sino que:          o, lo que es lo mismo: 󰇛1󰇜󰇛1 󰇜󰇛1󰇜 Generalmente, los valores de los estadísticos F correspondientes a una muestra de loci se calculan como una media ponderada sobre todos los loci. Este cálculo se realizó mediante el programa FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 1995). La significación estadística de FIS y FIT fue determinada mediante 10 000 randomizaciones de alelos entre individuos dentro de las infrapoblaciones (cada infrapoblación fue considerada una subpoblación) y en la población en su conjunto, 64 Resultados De los 16 loci analizados, siete mostraron variación en las tres infrapoblaciones estudiadas, 10 en al menos dos infrapoblaciones y 11 en al menos una. Los loci Ak, Got-1, Idh, Pgd y Pgm-2 fueron polimórficos, según el criterio del 95 %, en las tres infrapoblaciones, mientras que los loci Hk y Aco solo lo fueron en dos y en una, respectivamente (Figura 4). El número de individuos analizados por locus, las frecuencias alélicas y la magnitud de la desviación del HWE cuantificada mediante el estimador de Weir y Cockerham del estadístico FIS de Wright, así como las heterocigosis estimadas en cada infrapoblación, se muestran en la Tabla 6. Tabla 6. Tamaño de muestra (N), frecuencias alélicas, heterocigosis observada (Ho) y esperada (He), y desviación del equilibrio Hardy-Weinberg (FIS) en tres infrapoblaciones de Fasciola hepatica. VAL COR NOG VAL COR NOG Aco N 101 102 103 Ho He FIS 48 0,906 0,083 0,010 0,187 0,173 -0,082 30 0,967 0,033 0,000 0,067 0,065 -0,017 31 0,984 0,016 0,000 0,032 0,032 0,000 Hk N 101 102 Ho He FIS 42 0,857 0,143 0,143 0,248 0,427 23 0,826 0,174 0,261 0,294 0,114 27 1,000 0,000 0,000 0,000 -- Ak N 101 102 Ho He FIS 48 0,469 0,531 0,229 0,503 0,547* 30 0,483 0,517 0,167 0,508 0,676* 32 0,375 0,625 0,312 0,476 0,347 Idh N 101 102 Ho He FIS 48 0,073 0,927 0,146 0,137 -0,068 30 0,167 0,833 0,333 0,282 -0,184 32 0,109 0,891 0,219 0,198 -0,107 Fh N 101 102 Ho He FIS 48 0,958 0,042 0,083 0,081 -0,033 30 0,967 0,033 0,067 0,065 -0,017 31 0,984 0,016 0,032 0,032 0,000 Mdh-1 N 101 102 Ho He FIS 48 1,000 0,000 0,000 0,000 -- 30 1,000 0,000 0,000 0,000 -- 31 0,952 0,048 0,097 0,094 -0,034 Resultados 65 Tabla 6. Continuación. VAL COR NOG VAL COR NOG Gdh N 101 Ho He FIS 48 1,000 0,000 0,000 -- 30 1,000 0,000 0,000 -- 32 1,000 0,000 0,000 -- Mdh-2 N 101 Ho He FIS 48 1,000 0,000 0,000 -- 30 1,000 0,000 0,000 -- 31 1,000 0,000 0,000 -- Got-1 N 101 102 Ho He FIS 48 0,198 0,802 0,271 0,321 0,157 30 0,183 0,817 0,233 0,304 0,237 32 0,250 0,750 0,375 0,381 0,016 Me N 101 Ho He FIS 48 1,000 0,000 0,000 -- 30 1,000 0,000 0,000 -- 32 1,000 0,000 0,000 -- Got-2 N 101 Ho He FIS 48 1,000 0,000 0,000 -- 30 1,000 0,000 0,000 -- 32 1,000 0,000 0,000 -- Pgd N 101 102 Ho He FIS 48 0,448 0,552 0,396 0,500 0,210 30 0,550 0,450 0,567 0,503 -0,128 32 0,563 0,437 0,562 0,500 -0,127 Gpd N 101 Ho He FIS 48 1,000 0,000 0,000 -- 30 1,000 0,000 0,000 -- 32 1,000 0,000 0,000 -- Pgm-1 N 101 102 Ho He FIS 48 1,000 0,000 0,000 0,000 -- 30 0,983 0,017 0,033 0,033 0,000 32 0,984 0,016 0,031 0,031 0,000 Gpi N 101 102 Ho He FIS 48 1,000 0,000 0,000 0,000 -- 30 0,967 0,033 0,067 0,065 -0,017 32 0,984 0,016 0,031 0,031 0,000 Pgm-2 N 101 102 103 Ho He FIS 48 0,531 0,073 0,396 0,396 0,562 0,297 30 0,483 0,067 0,450 0,433 0,569 0,241* 32 0,609 0,141 0,250 0,344 0,555 0,384 *P < 0,0045 66 Resultados Cabe destacar que la infrapoblación NOG se caracterizó por la presencia en exclusiva del alelo 102 en Mdh-1 y por la ausencia del alelo 102 en el locus Hk. Asimismo, la infrapoblación VAL fue la única que presentó el alelo 103 en el locus Aco y que careció del alelo 102 en los loci Gpi, Mdh-1 y Pgm-1. Además, excepto para el locus Pgd en la infrapoblación VAL, el alelo más común para cada locus en las tres infrapoblaciones fue siempre el mismo. La heterocigosis esperada en el HWE por locus varió entre 0 y 0,569. Únicamente los loci Ak y Pgm-2 mostraron desviaciones estadísticamente significativas con respecto al HWE en alguna de las tres infrapoblaciones analizadas. Tales desviaciones siempre fueron en el sentido de un defecto de heterocigotos. Solo la infrapoblación COR reveló ambos loci en desequilibrio Hardy-Weinberg, mientras que la infrapoblación NOG no mostró desviaciones significativas para ningún locus. No se detectaron asociaciones genotípicas estadísticamente significativas entre pares de loci en ninguna de las tres infrapoblaciones. Los siete loci alozímicos polimórficos según el estudio preliminar, además del Pgm-1 y los cuatro microsatélites seleccionados, se analizaron posteriormente en otras 11 poblaciones geográficas, 10 muestreadas en ganado vacuno y una en ganado ovino. Cabe señalar que las 10 poblaciones bovinas estuvieron representadas por una sola infrapoblación, mientras que la población ovina estuvo compuesta por la mezcla de 10 infrapoblaciones. Figura 4. Polimorfismo alozímico obtenido en Fasciola hepatica. A. Aconitasa: 1 y 3 (Aco101/Aco101); 2 (Aco101/Aco102); 4 (Aco102/Aco102). B. Adenilato quinasa: 1 (Ak102/Ak102); 2 y 3 (Ak101/Ak101); 4 y 5 (Ak101/Ak102). C. Glutamato oxalacetato transaminasa: 1 (Got-1102/Got-1102); 2 (Got-1101/Got-1101); 3 y 4 (Got-1101/Got-1102). D. Fosfoglucomutasa (Pgm-1 bandas anódicas, Pgm-2 bandas catódicas): 1 y 2 (Pgm-1101/Pgm-1101, Pgm-2103/Pgm-2103); 3 (Pgm-1101/Pgm-1101, Pgm-2101/Pgm-2103); 4 (Pgm-1101/Pgm-1101, Pgm-2102/Pgm-2103); 5 (Pgm-1101/Pgm-1101, Pgm-2101/Pgm-2101); 6 (Pgm-1101/Pgm-1101, Pgm-2102/Pgm-2102). E. Fosfogluconato deshidrogenasa: 1 (Pgd101/Pgd101); 2 (Pgd102/Pgd102); 3, 4 y 5 (Pgd101/Pgd102). F. Isocitrato deshidrogenasa: 1, 5 y 6 (Idh102/Idh102); 2 y 4 (Idh101/Idh102); 3 (Idh101/Idh101). G. Hexoquinasa: 1 y 2 (Hk101/Hk101); 3 (Hk101/Hk102); 4 (Hk102/Hk102). 68 Resultados Los datos referentes a la variabilidad de los microsatélites examinados se muestran en la Tabla 7. El número de alelos observado en el ganado bovino varió entre cinco para el locus FH25 y 20 para el locus FH222CBP. En el caso de las ovejas, el número de alelos osciló entre cinco y nueve para los loci FH23 y FH222CBP, respectivamente. Este último locus mostró los valores más elevados de heterocigosis esperada y observada, tanto en vacas como en ovejas. Asimismo, en ambos tipos de ganado, el locus FH15 fue el menos variable en cuanto a los dos índices de heterocigosis, aunque presentó un número relativamente elevado de alelos. El número medio de alelos por locus fue 11,5 en el ganado bovino y 6,75 en el ganado ovino. Tabla 7. Variabilidad genética y rango de tamaño para cuatro microsatélites de Fasciola hepatica analizados en ganado bovino y ovino. Locus Número de alelos Intervalo alélico (pb) Ho He Vacas Ovejas Vacas Ovejas Vacas Ovejas Vacas Ovejas FH15 11 7 228-260 228-240 0,147 0,068 0,322 0,148 FH23 10 5 275-321 275-299 0,315 0,206 0,654 0,661 FH25 5 6 276-284 276-288 0,377 0,436 0,415 0,530 FH222CBP 20 9 143-181 147-173 0,856 0,617 0,861 0,745 Media 11,5 6,75 -- -- 0,424 0,332 0,563 0,521 Ho: heterocigosis observada; He: heterocigosis esperada. Las frecuencias alélicas correspondientes a los dos tipos de marcadores se recogen en las Tablas 1 y 2 del Anexo. Además, se detalla el número de individuos analizados, la riqueza alélica y las heterocigosis obtenidas por locus en las 11 poblaciones geográficas de F. hepatica estudiadas, así como en las 10 infrapoblaciones ovinas. Los niveles de variabilidad genética estimados en las poblaciones geográficas de F. hepatica estudiadas fueron relativamente elevados, independientemente del marcador empleado (Tabla 8). Los microsatélites presentaron índices de variabilidad Resultados 69 genética significativamente superiores a los detectados en los loci alozímicos (prueba U de Mann-Whitney de dos colas, P < 0,001). Además, cabe señalar que las poblaciones bovinas revelaron índices de variabilidad genética más elevados que la población ovina, aunque las diferencias no resultaron estadísticamente significativas (prueba U de Mann-Whitney de dos colas, P > 0,05). Tabla 8. Niveles de variabilidad genética estimados mediante marcadores alozímicos y microsatélites en 10 poblaciones geográficas de Fasciola hepatica en ganado bovino y una en ganado ovino (MBO). Loci alozímicos Loci microsatélites N A AR Ho H e A AR Ho H e ABG 51 2,2 2,20 0,172 0,262 5,5 5,21 0,412 0,576 BOV2 46 2,4 2,31 0,252 0,375 7,0 6,33 0,439 0,540 CHAN 41 2,0 1,96 0,215 0,312 6,0 5,66 0,416 0,549 COL 34 2,1 2,12 0,245 0,357 5,7 5,55 0,436 0,532 MES 33 2,1 2,12 0,188 0,350 6,0 5,87 0,338 0,494 CER 50 2,1 2,12 0,230 0,343 6,5 6,10 0,371 0,582 MEL 37 2,1 2,10 0,241 0,325 5,5 5,13 0,446 0,526 CCD 49 2,1 2,07 0,238 0,355 6,0 5,39 0,457 0,572 GUN 54 2,1 2,07 0,232 0,339 7,2 6,46 0,434 0,536 BOV1 43 2,2 2,21 0,342 0,378 6,7 6,23 0,475 0,555 MBO 149 2,2 2,11 0,224 0,318 6,7 4,85 0,332 0,521 N: número de individuos analizados; A: número medio de alelos; AR: riqueza alélica; Ho: heterocigosis observada; He: heterocigosis esperada. DIVERSIDAD GENOTÍPICA Y ESTRUCTURA CLONAL De los 328 MLGs diferentes de F. hepatica observados en el ganado bovino, solo uno estuvo presente en dos poblaciones geográficas, en ambas representado por un ejemplar. Este resultado sugiere que la variabilidad de los marcadores genéticos 70 Resultados utilizados es suficiente para la detección de individuos genéticamente idénticos. El número de MLGs con más de una copia por infrapoblación fue relativamente bajo, variando entre cero y cinco (Tabla 9). En consecuencia, la diversidad genotípica en las infrapoblaciones bovinas, que representan diferentes poblaciones geográficas, fue relativamente alta, variando entre 0,652 en ABG y 1,000 en MEL, CCD y BOV1. No obstante, todos los grupos de parásitos con MLGs idénticos presentaron valores de Psex estadísticamente significativos para n = 2 (Psex < 0,05), de manera que todos los individuos con el mismo MLG pudieron ser considerados resultado de amplificación clonal. Las infrapoblaciones ABG y CHAN mostraron el mayor número de MLGs multicopia, albergando cinco y cuatro respectivamente. Sin embargo, solo dos MLGs presentaron más de tres copias en la infrapoblación ABG. Tabla 9. Número de genotipos multilocus (MLGs) y MLGs repetidos de Fasciola hepatica en 10 poblaciones geográficas de ganado bovino. N MLGs MLGs > 1 copia G ABG 46 30 5 0,652 BOV2 41 40 1 0,976 CHAN 31 27 4 0,871 COL 23 22 1 0,956 MES 23 22 1 0,956 CER 44 42 2 0,954 MEL 34 34 0 1,000 CCD 32 32 0 1,000 GUN 48 47 1 0,979 BOV1 32 32 0 1,000 N: tamaño de muestra después de excluir los genotipos en los que faltan datos (MLGs incompletos); G: diversidad genotípica. Las infrapoblaciones procedentes de ganado ovino mostraron 71 MLGs diferentes, de los cuales 20 fueron multicopia (Tabla 10). La diversidad genotípica de la única población geográfica estudiada de F. hepatica en ovinos fue más baja que la observada en poblaciones geográficas procedentes del ganado bovino, las cuales estuvieron representadas únicamente por una infrapoblación (G = 0,577). Tabla 10. Distribución de MLGs (en cursiva, sus números de identificación) con valores de Psex significativos en 10 infrapoblaciones ovinas de Fasciola hepatica. ID N 9 12 14 15 16 17 20 24 26 27 36 42 44 46 48 51 56 65 67 70 MBO1 21 6 9 MBO2 9 6 MBO3 11 5 MBO4 5 2 MBO5 10 4 2 MBO6 26 2 2 3 4 2 1 2 MBO7 11 8 2 1 MBO8 11 2 2 MBO9 13 1 2 2 MBO10 6 2 Total 123 8 2 2 4 6 2 2 5 9 2 6 2 4 2 2 6 2 2 2 2 ID: número de identificación; N: número de parásitos analizados por hospedador, después de excluir los genotipos en los que faltan datos (MLGs incompletos). 72 Resultados Estos 20 MLGs multicopia, supuestamente clones, fueron estadísticamente significativos para n = 2 (Psex < 0,05), excepto dos, MLG 16 y MLG 26, representados por seis y nueve copias respectivamente. Estos dos últimos presentaron valores de Psex significativos para n = 3, lo que sugiere que, como máximo, cinco individuos con MLG 16 y ocho con MLG 26 pueden ser clones. Los individuos con MLGs idénticos se presentaron en el mismo hospedador con mayor frecuencia que la esperada por azar (P < 0,05), de hecho solo tres MLGs multicopia estuvieron presentes en infrapoblaciones diferentes. DESVIACIÓN DEL EQUILIBRIO HARDY-WEINBERG Y DESEQUILIBRIO GENOTÍPICO Después de reducir los MLGs multicopia estadísticamente significativos a un único ejemplar en cada muestra, los niveles de variabilidad genética en las poblaciones geográficas de F. hepatica que parasitan al ganado bovino y ovino fueron similares (Tabla 11). Aunque la población estudiada en ovejas presentó el mayor tamaño de muestra (N = 98), estando constituida en realidad por una mezcla de varias infrapoblaciones, esta no mostró mayor riqueza alélica que las poblaciones bovinas, representadas por una sola infrapoblación. La heterocigosis media esperada en el HWE de las infrapoblaciones bovinas de F. hepatica fue del 41,1 %. Todas las poblaciones geográficas, excepto BOV1, mostraron un déficit global de heterocigotos estadísticamente significativo respecto a las frecuencias genotípicas previstas en el HWE. El 31 % de las combinaciones de pares de loci probadas manifestaron un desequilibrio genotípico significativo en MBO; sin embargo, de las infrapoblaciones estudiadas en ganado vacuno solo una (CCD) presentó un porcentaje similar, mientras que seis de las restantes revelaron un desequilibrio genotípico mayor que el esperado por azar. En general, tales asociaciones no implicaron a los mismos loci, aunque el locus FH222CBP formó parte de dichos pares de manera recurrente. Resultados 73 Tabla 11. Tamaño de muestra (N), desviación del equilibrio Hardy-Weinberg (FIS), número de combinaciones de pares de loci que se encuentran en desequilibrio genotípico significativo (GD) con P < 0,05 (entre paréntesis el número de combinaciones probadas), heterocigosis esperada (He) y riqueza alélica (AR) para 10 poblaciones geográficas de Fasciola hepatica en ganado bovino (ID: número de identificación) y una en ganado ovino (MBO). Los datos fueron calculados después de reducir los MLGs repetidos significativos a un único ejemplar en cada muestra. Se incluyen los genotipos en los que faltan datos (MLGs incompletos). ID N FIS GD HeAR ABG 1 36 0,309* 3 (66) 0,378 3,292 BOV2 2 45 0,276* 2 (66) 0,428 3,641 CHAN 3 37 0,289* 10 (65) 0,395 3,220 COL 4 33 0,263* 7 (66) 0,421 3,265 MES 5 32 0,408* 5 (66) 0,397 3,363 CER 6 48 0,346* 12 (66) 0,426 3,442 MEL 7 37 0,214* 5 (66) 0,393 3,087 CCD 8 49 0,276* 20 (66) 0,429 3,166 GUN 9 53 0,254* 4 (55) 0,404 3,522 BOV1 10 43 0,118 7 (66) 0,438 3,530 MBO - 98 0,293* 20 (65) 0,404 3,188 *P < 0,0045 Las desviaciones del HWE detectadas en cada población estuvieron principalmente asociadas a los loci Pgm-2, FH15 y FH23 (Tabla 12). Así, el locus Pgm-2 reveló déficits de heterocigotos estadísticamente significativos en cada una de las 11 poblaciones estudiadas, mientras que los loci FH15 y FH23 manifestaron deficiencias de heterocigotos en nueve y en 10 de ellas, respectivamente. El exceso de homocigotos fue particularmente acusado para Pgm-2 en las infrapoblaciones BOV2 y COL, observándose una ausencia total de heterocigotos para este locus en la infrapoblación CHAN. Asimismo, los loci Aco, Ak, FH222CBP y FH25 manifestaron importantes desviaciones del equilibrio en, al menos, alguna de las 80 Resultados Los valores correspondientes a los parásitos de ovejas fueron altamente variables, oscilando entre 0 y 0,309; y solo algunas comparaciones resultaron estadísticamente significativas. En el ganado bovino, los valores de diferenciación más elevados se detectaron entre los pares de infrapoblaciones COL (IP4)-MEL (IP7) y COL (IP4)-CCD (IP8). Si las infrapoblaciones ovinas se agrupan según la fecha de muestreo (2006: MBO1, MBO2, MBO3 y MBO4; 2008: MBO6, MBO7, MBO8, MBO9 y MBO10), el AMOVA determina que no existen diferencias significativas entre muestras temporales (Tabla 17). Así, la diferenciación entre ellas únicamente representa el 0,79 % de la diversidad genética total. La variación se debe principalmente a diferencias dentro de las infrapoblaciones (88,45 %) y, en menor grado, a diferencias entre infrapoblaciones dentro de cada muestra temporal (10,76 %). Tabla 17. Análisis de varianza molecular (AMOVA) según la fecha de muestreo en el ganado ovino (2006/2008). d.f.: grados de libertad. Fuente de variación d.f. Suma de cuadrados Componentes varianza % Variación Estadísticos F Entre los grupos 1 8,85 0,019 0,79 0,008 (FCT) Entre las infrapoblaciones dentro de los grupos 8 49,43 0,269 10,76 0,108* (FSC) Dentro de las infrapoblaciones 186 356,67 2,212 88,45 0,115* (FST) Total 195 414,95 2,500 100 -- * P < 0,0001 Resultados 81 Análogamente, si las muestras se definen en función de la especie hospedadora (Tabla 18), la mayor parte de las diferencias se observan, una vez más, dentro de las infrapoblaciones (90,16 %) y solo un 3,51 % de la diversidad se debe a diferencias entre parásitos de distintas especies hospedadoras. Tabla 18. Análisis de varianza molecular (AMOVA) según la especie hospedadora. d.f.: grados de libertad. Fuente de variación d.f. Suma de cuadrados Componentes varianza % Variación Estadísticos F Entre los grupos 1 37,25 0,094 3,51 0,035* (FCT) Entre las infrapoblaciones dentro de los grupos 18 192,14 0,169 6,33 0,065* (FSC) Dentro de las infrapoblaciones 806 2355,31 2,409 90,16 0,098* (FST) Total 825 2584,70 2,672 100 -- * P ≤ 0,0001 La diferenciación genética entre las infrapoblaciones se estimó además mediante distancias genéticas Da (Tabla 19). Tales distancias variaron entre 0,023 y 0,094 en vacas y entre 0,033 y 0,156 en ovejas. Estos resultados se encuentran en concordancia con los valores de diferenciación genética entre pares de infrapoblaciones estimados con el estadístico FST. Así, las infrapoblaciones ovinas mostraron, en general, valores de distancia genética más elevados que los obtenidos entre las poblaciones bovinas, que manifestaron una escasa diferenciación genética. Este hecho es consistente con las diferencias detectadas en las estructuras genéticas de sus poblaciones. Es interesante observar que la infrapoblación BOV2 (IP2) guarda un parecido genético mayor con algunas de las infrapoblaciones estudiadas que con aquella con la que comparte localidad (BOV1; IP10). Tabla 19. Matriz de las distancias genéticas de Nei (Da) entre infrapoblaciones (IP) de Fasciola hepatica representadas en la parte superior para el ganado ovino y en la parte inferior para el ganado bovino. Los números de identificación de cada infrapoblación se muestran en las Tablas 10 y 11. IP1 IP2 IP3 IP4 IP5 IP6 IP7 IP8 IP9 IP10 IP1 - 0,137 0,090 0,115 0,156 0,101 0,091 0,105 0,096 0,134 IP2 0,038 - 0,144 0,103 0,111 0,102 0,077 0,114 0,129 0,076 IP3 0,045 0,032 - 0,098 0,153 0,069 0,100 0,118 0,085 0,116 IP4 0,040 0,027 0,034 - 0,104 0,035 0,058 0,072 0,059 0,125 IP5 0,046 0,032 0,040 0,029 - 0,082 0,057 0,106 0,083 0,122 IP6 0,045 0,038 0,049 0,033 0,031 - 0,046 0,086 0,033 0,076 IP7 0,072 0,080 0,085 0,082 0,079 0,087 - 0,063 0,043 0,068 IP8 0,075 0,072 0,083 0,094 0,084 0,078 0,030 - 0,086 0,118 IP9 0,072 0,063 0,069 0,071 0,071 0,066 0,031 0,037 - 0,098 IP10 0,070 0,057 0,074 0,085 0,079 0,070 0,034 0,030 0,023 - Resultados 83 A partir de la matriz de distancias genéticas Da, se construyó un árbol filogenético mediante el método de Neighbor-Joining (Figura 5). De este análisis derivan tres resultados básicos: 1) las ramas más largas corresponden a las infrapoblaciones ovinas, 2) se distinguen claramente dos grupos genéticamente diferenciados de infrapoblaciones bovinas, y 3) no hay asociación aparente entre las distancias genéticas y geográficas. Figura 5. Árbol filogenético sin raíz obtenido a partir de las distancias genéticas de Nei (Da) mediante Neighbor-Joining que incluye a las 20 infrapoblaciones de Fasciola hepatica procedentes del ganado ovino (círculos blancos) y bovino (círculos negros). Los números de identificación de cada infrapoblación se muestran en las Tablas 10 y 11. 0.01 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 84 Resultados Mediante un FCA, se observa como las infrapoblaciones bovinas que constituyen los dos grupos definidos por el análisis filogenético están integradas por individuos genéticamente muy similares, en lo que a su composición alélica respecta (Figura 6). Este resultado está en consonancia con las pequeñas distancias genéticas estimadas entre las infrapoblaciones, así como con los bajos valores de FST calculados. Figura 6. Representación gráfica del análisis factorial de correspondencias (FCA) incluyendo a los individuos de Fasciola hepatica procedentes de las infrapoblaciones bovinas IP1-IP6 (cuadrados amarillos) e IP7-IP10 (cuadrados azules), según los dos primeros ejes. DISCUSIÓN Discusión 87 ESTRUCTURA GENÉTICA POBLACIONAL DE FASCIOLA HEPATICA EN GANADO BOVINO Y OVINO Las poblaciones geográficas estudiadas presentaron niveles de variabilidad similares a los estimados en otras poblaciones de digeneos (Lydeard et al., 1989; Vilas et al., 2004; Prugnolle et al., 2005c; Criscione y Blouin, 2006). De hecho, al menos en lo referente a la cantidad de variación alozímica observada, resultó similar a la detectada en invertebrados de vida libre no artrópodos (Nadler, 1987). Estos resultados sugieren la existencia de fenómenos que contrarrestan ciertas causas que teóricamente explicarían una menor variabilidad genética, las cuales son inherentes a la forma de vida parasitaria o bien caracterizan al ciclo de vida de este parásito en particular. Por ejemplo, es sabido que la fragmentación de la población en grupos de individuos reproductores, representados por las infrapoblaciones, reduce el tamaño efectivo de población (Criscione y Blouin, 2005). Esto significa que las poblaciones de parásitos sufrirán mayores efectos de deriva genética, entre ellos la pérdida de alelos y el incremento del grado de autocigosis, haciendo que la variabilidad genética mantenida en el equilibrio mutación-deriva disminuya (Hedrick, 2009). Otro ejemplo, en este caso relacionado con una característica particular del ciclo vital, es el planteado por la reproducción asexual a la que está obligada la especie F. hepatica; fenómeno que, en combinación con la posibilidad de autofecundación, debería incrementar los índices de consanguinidad de la población y así, la frecuencia de individuos homocigotos. Entre los hechos que contrarrestarían tales factores, sin duda deberían contarse las enormes fecundidades que caracterizan a la mayor parte de los helmintos parásitos, incluidos los digeneos, así como prevalencias e intensidades de parasitación a menudo elevadas. Los niveles de variabilidad genética revelados por F. hepatica difirieron significativamente en función de la especie hospedadora. Así, pudo observarse que las infrapoblaciones que parasitan al ganado ovino suelen ser menos variables, especialmente si la variación es cuantificada por el número de alelos o la riqueza alélica (el efecto es menos acusado sobre la heterocigosis). Por supuesto, tales comparaciones deben realizarse una vez identificados los clones potenciales y excluidos del análisis los individuos con el mismo genotipo multilocus 88 Discusión presuntamente clonales. Esto es importante porque la presencia de clones perturba los datos poblacionales, eclipsando el efecto que la reproducción sexual en el hospedador definitivo ejerce sobre la variación de la población en general. Por ejemplo, la clonalidad no detectada puede ser causa de un exceso de heterocigotos, que oculte datos tan interesantes como déficits genotípicos, los cuales pueden representar evidencias de consanguinidad o subdivisión poblacional (Criscione et al., 2011). Como se verá más adelante, este riesgo es mayor en el caso de la población que parasita al ganado ovino, pues la presencia de clones fue particularmente abundante en este hospedador. Las poblaciones que parasitan al ganado bovino y ovino difirieron en sus niveles de variabilidad genética, pero además se han detectado fuertes evidencias que sugieren que su distribución a lo largo del espacio geográfico es muy diferente dependiendo de la especie hospedadora. Así, en el ganado ovino, se observa una mayor estructuración genética a nivel infrapoblacional, es decir, la diferenciación genética entre infrapoblaciones es sustancialmente mayor para los parásitos de ovejas. Este resultado es especialmente sorprendente cuando se tiene en cuenta que todas las ovejas estudiadas formaron parte de un mismo rebaño, mientras que cada vaca pertenecía a una granja diferente y algunas de estas explotaciones se hallaban bastante alejadas geográficamente entre sí. De hecho, una vez considerada la diferencia en la composición de clones, excluyendo su efecto sobre la variación, la fracción de la desviación del HWE atribuible a diferencias entre individuos de distintas infrapoblaciones fue del 8,7 % en el caso de las vacas y del 17 % en el caso de las ovejas. Esta diferencia fue confirmada mediante el cálculo de distancias genéticas absolutas, ya que las infrapoblaciones ovinas mostraron generalmente valores más elevados que los calculados entre las poblaciones bovinas. Luego, ovejas de un mismo rebaño albergaron conjuntos de parásitos con mayores diferencias genéticas que las observadas en el caso de vacas procedentes de granjas ubicadas en distintas localidades geográficas. Otro dato que confirma el mayor grado de estructuración observado en F. hepatica del ganado ovino se refiere a la desigual presencia de clones. Al contrario de lo observado en las infrapoblaciones de ganado bovino, los grupos de parásitos con MLGs idénticos fueron frecuentes en la población que parasita a Discusión 89 ovejas. Además, el análisis realizado en el presente estudio indicó que la mayor parte de los individuos que muestran un mismo MLG son el resultado de la reproducción asexual que se produce en el hospedador intermediario. Así pues, en las ovejas se detectaron muchos más clones que en las vacas, lo cual sugiere en las primeras un grado de mezcla de parásitos de origen diverso considerablemente menor. En otras palabras, la presencia de clones en las ovejas es indicativa de transmisión agregada en el parásito, lo cual es consecuencia de la distribución no aleatoria del parásito en los pastos, así como de una movilidad del individuo hospedador relativamente escasa. Individuos genéticamente idénticos, resultado de la amplificación asexual producida en el caracol, tienden a permanecer juntos como metacercarias y, a menudo, son incorporados conjuntamente al hospedador definitivo, explicando así la presencia de clones en la infrapoblación. Otra evidencia de transmisión agregada, que además refuerza la hipótesis de que los grupos de MLGs idénticos que se han identificado definen verdaderos clones, es la fuerte asociación estadística entre estos grupos y los hospedadores individuales, es decir, los individuos genéticamente idénticos no se distribuyeron aleatoriamente en los individuos hospedadores. La mayor frecuencia de clones en las ovejas podría también estar relacionada con las diferencias en longevidad que exhiben los parásitos según se hallen en ovejas o vacas. Se cree que F. hepatica puede llegar a vivir tanto como sus hospedadores ovinos, mientras que solo persiste de uno a dos años en los conductos biliares del ganado bovino (Rojo-Vázquez y Ferre-Pérez, 1999; Robinson et al., 2008). Esta diferencia supone una mayor rapidez en la formación de nuevas infrapoblaciones en el caso de las vacas, lo cual conllevaría a su vez la menor acumulación de clones distintos. Sin embargo, el hecho de que la estructura clonal a nivel infrapoblacional no se observe en las vacas en un grado similar, es probablemente debido a un mayor flujo génico entre poblaciones de las duelas que parasitan a vacas, el cual puede deberse a varias razones. Por ejemplo, la costumbre de alimentarlas con forraje almacenado, procedente de diferentes lugares y potencialmente contaminado con metacercarias de distintas poblaciones; una mayor movilidad de las reses; un acceso dispar a extensiones de pasto mucho mayores que las reservadas a las ovejas; así como la reunión del ganado procedente de distintas granjas en ferias u otros eventos en los que pueda infectarse de una misma fuente, son factores que 96 Discusión es coherente con el estudio preliminar de Hurtrez-Boussès et al. (2004) llevado a cabo en una población natural de F. hepatica, donde no se detectó evidencia alguna de consanguinidad o estructura clonal. La autofecundación parece ser, entonces, una estrategia reproductiva a la que el parásito recurre solamente cuando no encuentra a otros congéneres en el hospedador definitivo. La ausencia de evidencia de poblaciones altamente consanguíneas debida a la desviación de panmixia (seguramente la consanguinidad por deriva es mucho más importante, especialmente en el caso de las poblaciones que parasitan a las ovejas) explica los niveles relativamente elevados de heterocigosis que se han detectado en ambos hospedadores. El impacto de la deriva genética sobre la variabilidad se visualiza principalmente en la pérdida de alelos, fenómeno que puede atisbarse en el análisis comparativo. A pesar de que no se estudiaron muestras geográficas de F. hepatica en ovejas, los resultados obtenidos sugieren fuerte heterogeneidad espacial en esta especie hospedadora. Por el contrario, las poblaciones geográficas analizadas en el ganado bovino mostraron distancias genéticas relativamente bajas. Este escaso grado de estructuración genética contrasta con el obtenido en estudios previos de F. magna (Lydeard et al., 1989; Mulvey et al., 1991), si bien, tal y como se ha afirmado anteriormente, es muy probable que, en este caso, el grado de estructuración haya sido sobrevalorado por no tener en cuenta la presencia de clones. Sin embargo, los datos correspondientes al ganado bovino son similares a los revelados por otros trabajos llevados a cabo con nematodos tricostrongílidos (Blouin et al., 1992; Blouin et al., 1995; Braisher et al., 2004), e incluso con parásitos que tienen un ciclo biológico predispuesto a la reinfección como S. ratti (Paterson et al., 2000). La hipótesis más probable que explique este resultado son unas tasas de flujo génico relativamente elevadas que contribuyen a aumentar el tamaño efectivo de población. En este sentido, cabe destacar que el grado de divergencia genética entre las poblaciones bovinas de F. hepatica no estuvo correlacionado con la distancia geográfica entre las granjas, lo cual podría estar relacionado, precisamente, con altas tasas de flujo génico causadas por influencia humana, ya sea por el uso común de forraje almacenado como alimento o el movimiento del ganado por razones comerciales. Discusión 97 En definitiva, los resultados del presente estudio sugieren fuertemente diferencias en la estructura genética poblacional de F. hepatica, dependiendo de si parasita a vacas u ovejas. Como se ha venido discutiendo, evidencias de distinto tipo apuntan a un grado variable de flujo génico interpoblacional en la génesis de tales diferencias. Sin embargo, las diferencias en tamaño efectivo parecen ser, en último término, las responsables de un patrón más estructurado en las infrapoblaciones de ovejas. Así, las supuestas diferencias en las tasas de flujo génico no vienen más que a incrementar la disparidad de las poblaciones, en lo que a sensibilidad a la deriva se refiere. De hecho, son varios los factores, además del menor flujo génico, que podrían intervenir en concierto y explicar un tamaño efectivo sustancialmente menor de las poblaciones del parásito en ovejas. Por ejemplo, la mayor probabilidad de cruzamiento entre individuos clonales dentro del hospedador definitivo y, muy especialmente, la menor carga parasitaria que caracteriza al animal ovino, lo que quizás represente una mayor subdivisión de la población en grupos reproductivos. Por otro lado, si la supervivencia y la transmisión del parásito estuviesen de alguna manera correlacionadas, cosa muy probable si se tiene en cuenta la escasa capacidad de dispersión de las larvas y la contingencia asociada al éxito en la transmisión (v. g., el hospedador apropiado ha de estar disponible), la transmisión agregada, de especial importancia en el caso de las ovejas debido al menor grado de mezcla de la población parasitaria, podría exacerbar el éxito reproductivo de algunas infrapoblaciones con respecto a otras, disminuyendo considerablemente el tamaño efectivo de población (Criscione y Blouin, 2005). IMPLICACIONES PARA LA RESISTENCIA FRENTE A ANTIHELMÍNTICOS Las diferencias en estructura genética poblacional, que se derivan de la interpretación de los resultados, tienen implicaciones para la resistencia frente a antihelmínticos en base a dos aspectos fundamentales. En primer lugar, las presuntas diferencias en tamaño efectivo conllevan efectos de deriva variables, que en algunos casos pueden llegar a eclipsar el efecto de la selección incluso con coeficientes de selección muy elevados, como se esperan en un escenario de fuerte presión selectiva impuesta por el tratamiento antihelmíntico. En segundo lugar, las diferencias en flujo génico introducen variación en las posibilidades de diseminación de mutaciones favorables, pero también afectan al proceso de 98 Discusión adaptación local. A continuación, desarrollaremos estas ideas en relación con la situación planteada por F. hepatica en el contexto geográfico estudiado. El hecho de que las poblaciones de F. hepatica puedan diferir en el tamaño efectivo de población en función de la especie hospedadora, debido a diferencias en la dinámica de transmisión, tiene importantes implicaciones en una eventual evolución de la resistencia frente a fármacos antihelmínticos. Teóricamente, si la población tiene un tamaño efectivo grande, es previsible que la selección natural sea más eficiente a la hora de incrementar la frecuencia de una mutación favorable, especialmente si esta es dominante, ya que la fluctuación aleatoria en su frecuencia alélica asociada a un tamaño de población finito será menor. En otras palabras, ya que la muestra en la población de gametos en una generación es relativamente grande, el “error de muestreo” cometido en la siguiente generación a la hora de reproducir la variabilidad genética de la población es menor. Esta deriva en las frecuencias alélicas atribuible al azar, cuya magnitud depende del tamaño efectivo de población, tiene un sentido impredecible, esto es, la frecuencia puede tanto aumentar como disminuir en cada generación, por lo que contrasta con el efecto determinista de la selección natural. Así, si en la población está presente una mutación favorable, digamos una variante alélica que confiere resistencia a una población que está siendo tratada con fármacos, la selección incrementará la frecuencia de dicha variante, pero este efecto puede verse eclipsado por la deriva genética cuando el tamaño efectivo es pequeño. En realidad, la probabilidad de que una mutación favorable se pierda en las primeras generaciones por deriva es muy alta incluso en poblaciones grandes, pues la frecuencia de la mutación es inicialmente muy pequeña y simplemente por azar termina por desembocar en familias de tamaño cero, individuos que no contribuyen con sus genes a la siguiente generación. Así, se ha demostrado que, bajo ciertas asunciones, la probabilidad de fijación de una mutación favorable es aproximadamente igual al doble del coeficiente de selección. Esto significa que para coeficientes altos, por ejemplo, que la mutación confiera a los heterocigotos una ventaja del 10 %, la probabilidad de fijación sería únicamente el 20 %. Pero si el tamaño efectivo es relativamente pequeño, la deriva genética prevalece sobre la selección y la probabilidad de fijación de una mutación favorable es aproximadamente la de una mutación neutral (Kimura, 1962). Evidentemente, si la mutación es dominante Discusión 99 superará antes el tamiz de Haldane, es decir, alcanzará una frecuencia suficiente para que la selección tenga la oportunidad de oponerse al efecto de deriva. En cualquier caso, con independencia de si la mutación es perjudicial o favorable, recesiva o dominante, existe una alta probabilidad de que una nueva mutación se pierda por azar en unas pocas generaciones debido a que su frecuencia inicial es muy baja (Hedrick, 2009). Asumiendo HWE, una nueva mutación va estar presente casi exclusivamente en heterocigotos, de ahí que la ventaja selectiva solo se manifestaría en caso de que exista dominancia o aditividad (para el caso de un locus con dos alelos, que el heterocigoto manifieste un fenotipo intermedio entre ambos homocigotos). Se ha argumentado que las mutaciones que confieren resistencia a fármacos en helmintos parásitos son generalmente recesivas (Cornell et al., 2003), por lo que frecuentemente se perderían por deriva genética antes de que alcanzasen una frecuencia lo suficientemente elevada como para encontrarlas en un número significativo de homocigotos. Puesto que la consanguinidad aumenta la homocigosis, es razonable esperar que el fenómeno de la resistencia sea particularmente común en poblaciones con tamaño efectivo grande en las que estén interviniendo mecanismos que aumenten los índices de consanguinidad (Cornell et al., 2003; Conner y Hartl, 2004). Según esto, si las mutaciones que confieren resistencia al TCBZ en F. hepatica fuesen recesivas, el incremento de su frecuencia por selección direccional en las poblaciones del área de estudio podría estar favorecido en ambas especies hospedadoras por, al menos, dos razones diferentes. Por un lado, las poblaciones que parasitan al ganado bovino podrían desarrollar resistencia con mayor probabilidad porque albergan mayor diversidad genética y probablemente poseen un mayor tamaño efectivo en comparación con las duelas de ovejas. Por otro lado, la resistencia podría verse favorecida en las infrapoblaciones de ovejas debido a que presentan un mayor potencial para la consanguinidad. La presencia de clones es particularmente frecuente en este hospedador, lo cual aumenta las posibilidades de apareamiento entre individuos genéticamente idénticos, y de esta manera conduce a una mayor frecuencia de homocigotos en la población. Este incremento de la homocigosis reduciría la probabilidad de que nuevas mutaciones favorables recesivas se perdiesen por deriva genética, resultando más probable su acumulación en las poblaciones. No obstante, el tamaño efectivo relativamente elevado de las 100 Discusión poblaciones de F. hepatica en el ganado bovino proporcionaría un escenario especialmente favorable para el desarrollo de la resistencia, si algún otro factor incrementase los índices de consanguinidad. Por ejemplo, la existencia de focos de transmisión independientes, a pesar de un flujo génico elevado, puede incrementar la homocigosis debido a consanguinidad local. Un modelo de transmisión focal de este tipo se ha observado recientemente en otro helminto parásito, Ascaris lumbricoides, cuyas poblaciones muestran a menudo un alto flujo génico (Criscione et al., 2010). Respecto a las diferencias en las tasas de flujo génico detectadas en F. hepatica de vacas y ovejas, existen también implicaciones potenciales para la resistencia frente a fármacos antihelmínticos, pues este factor contribuye a aumentar el tamaño efectivo, favorece la propagación de alelos raros, incluyendo aquellos que confieren resistencia a fármacos, pero igualmente puede ralentizar el efecto de la selección cuando es cuantioso el flujo de genes desde poblaciones que no están siendo sometidas a las mismas presiones selectivas. En el caso particular de las explotaciones gallegas de ganado bovino, el riesgo de desarrollo y diseminación de resistencias es alto cuando se considera la costumbre generalizada de tratar a los animales con TCBZ, a menudo sin responder a un diagnóstico previo (Mezo et al., 2008). Esto implicaría que son múltiples las poblaciones sometidas a una fuerte presión de selección, haciendo más probable no solo la emergencia de la mutación (por supuesto, con carácter preadaptativo) sino también su diseminación. CONCLUSIONES Conclusiones 103 1. Las poblaciones geográficas de F. hepatica estudiadas se caracterizan por tener niveles de variabilidad genética relativamente elevados, pero también por manifestar importantes déficits de heterocigotos probablemente relacionados con subdivisión críptica a nivel infrapoblacional, particularmente en el caso del ganado bovino. 2. El impacto de la reproducción clonal sobre la variabilidad genética de los grupos reproductivos que van a dar lugar a la siguiente generación del parásito es notablemente mayor en el caso de las ovejas que en el de las vacas, debido a la desigual presencia de clones. La conformación de las infrapoblaciones en el hospedador definitivo está determinada por la transmisión agregada en las ovejas y por mayores tasas de flujo génico en las vacas. 3. Las poblaciones de F. hepatica estudiadas son predominantemente panmícticas, siendo la fecundación cruzada el principal modo de reproducción de este parásito. 4. Los parásitos de las ovejas muestran, en general, menor variabilidad genética y un grado de divergencia considerablemente mayor a nivel infrapoblacional que en el caso de las vacas. Esto sugiere tamaños efectivos de población más pequeños y menores tasas de flujo génico en el caso de las ovejas, lo cual es coherente con diferencias en el manejo del ganado ovino y bovino. 5. La ausencia de correlación entre las distancias genéticas interpoblacionales y la distancia geográfica entre granjas, sugiere la mezcla de parásitos de orígenes diversos en cada vaca y es coherente con la hipótesis de mayor tamaño efectivo y grado de flujo génico en las poblaciones que parasitan al ganado bovino. 6. Por razones distintas, mayor tamaño efectivo de las poblaciones que parasitan a vacas y mayor potencial para la consanguinidad en los parásitos de ovejas, la estructura genética poblacional de F. hepatica favorece el desarrollo de fenotipos resistentes frente a antihelmínticos en el contexto geográfico estudiado. 104 Conclusiones 7. Las condiciones más propicias para la aparición del fenómeno de la resistencia son: grandes poblaciones parasitarias en explotaciones de ganado bovino profusamente tratadas y que estén sometidas a procesos que aumenten la frecuencia de homocigotos. Por ejemplo, la exposición periódica del ganado a focos de infección que favorezcan la reproducción sexual del parásito entre individuos genéticamente emparentados. ANEXO Tabla 2. Tamaño de muestra (N), riqueza alélica (AR), frecuencias alélicas y heterocigosis esperada (He) y observada (Ho) para 10 infrapoblaciones de Fasciola hepatica en ganado ovino. Los datos fueron calculados después de reducir todos los grupos estadísticamente significativos de MLGs idénticos a un único ejemplar en cada muestra. Se incluyen los genotipos en los que faltan datos (MLGs incompletos). MBO1 MBO2 MBO3 MBO4 MBO5 MBO6 MBO7 MBO8 MBO9 MBO10 Aco N AR 101 102 He Ho 11 1,00 1,000 - 0,000 0,000 5 1,00 1,000 - 0,000 0,000 10 1,00 1,000 - 0,000 0,000 8 1,50 0,937 0,063 0,125 0,125 11 1,36 0,955 0,045 0,091 0,091 16 1,70 0,875 0,125 0,226 0,125 6 1,67 0,917 0,083 0,167 0,167 11 1,00 1,000 - 0,000 0,000 14 1,90 0,786 0,214 0,349 0,143 5 1,98 0,800 0,200 0,356 0,400 Ak N AR 101 102 He Ho 11 1,61 0,909 0,091 0,173 0,000 5 2,00 0,700 0,300 0,467 0,600 10 2,00 0,550 0,450 0,521 0,300 8 1,99 0,687 0,313 0,458 0,125 11 1,61 0,909 0,091 0,173 0,182 17 1,94 0,735 0,265 0,401 0,412 6 1,91 0,833 0,167 0,303 0,333 11 1,92 0,773 0,227 0,368 0,273 14 1,99 0,643 0,357 0,476 0,571 5 1,98 0,800 0,200 0,356 0,400 Got-1 N AR 101 102 He Ho 11 1,76 0,136 0,864 0,247 0,273 5 2,00 0,300 0,700 0,467 0,600 10 1,65 0,100 0,900 0,189 0,200 8 1,90 0,187 0,813 0,325 0,375 11 1,61 0,091 0,909 0,173 0,182 17 1,83 0,176 0,824 0,299 0,353 6 1,00 - 1,000 0,000 0,000 11 1,61 0,091 0,909 0,173 0,182 12 1,33 0,042 0,958 0,083 0,083 5 1,80 0,100 0,900 0,200 0,200 Tabla 2. Continuación. MBO1 MBO2 MBO3 MBO4 MBO5 MBO6 MBO7 MBO8 MBO9 MBO10 Hk N AR 101 102 He Ho 11 2,00 0,545 0,455 0,519 0,545 5 1,00 1,000 - 0,000 0,000 10 2,00 0,400 0,600 0,505 0,600 8 1,99 0,687 0,313 0,458 0,125 11 1,00 1,000 - 0,000 0,000 17 1,99 0,618 0,382 0,487 0,529 5 1,98 0,800 0,200 0,356 0,400 10 1,95 0,750 0,250 0,395 0,300 14 1,99 0,607 0,393 0,495 0,500 5 2,00 0,700 0,300 0,467 0,600 Idh N AR 101 102 He Ho 9 1,85 0,167 0,833 0,294 0,333 5 1,80 0,100 0,900 0,200 0,200 10 1,90 0,200 0,800 0,337 0,400 8 1,77 0,125 0,875 0,233 0,250 11 1,76 0,136 0,864 0,247 0,091 17 1,42 0,059 0,941 0,114 0,118 6 1,98 0,250 0,750 0,409 0,167 11 2,00 0,409 0,591 0,506 0,818 14 1,76 0,143 0,857 0,254 0,286 5 1,98 0,200 0,800 0,356 0,400 Pgd N AR 101 102 103 He Ho 11 1,76 - 0,864 0,136 0,247 0,273 5 2,00 - 0,400 0,600 0,533 0,400 9 2,69 0,111 0,333 0,556 0,601 0,667 8 2,00 - 0,625 0,375 0,500 0,500 11 2,63 0,182 0,136 0,682 0,506 0,636 17 1,97 - 0,324 0,676 0,451 0,647 6 2,00 - 0,333 0,667 0,485 0,333 11 1,76 - 0,864 0,136 0,247 0,091 13 2,00 - 0,423 0,577 0,508 0,385 5 1,80 - 0,100 0,900 0,200 0,200 Tabla 2. Continuación. MBO1 MBO2 MBO3 MBO4 MBO5 MBO6 MBO7 MBO8 MBO9 MBO10 Pgm-2 N AR 101 102 103 He Ho 11 2,47 0,091 0,727 0,182 0,450 0,000 5 2,00 0,300 - 0,700 0,467 0,200 10 2,85 0,550 0,200 0,250 0,626 0,100 8 2,27 0,125 0,062 0,813 0,342 0,125 11 2,84 0,500 0,182 0,318 0,645 0,273 17 2,21 0,647 0,029 0,324 0,490 0,353 6 2,91 0,417 0,166 0,417 0,682 0,500 11 2,85 0,364 0,182 0,454 0,658 0,364 14 2,61 0,607 0,286 0,107 0,558 0,071 5 2,00 0,600 - 0,400 0,533 0,400 Pgm-1 N AR 101 102 He Ho 11 1,00 1,000 - 0,000 0,000 5 1,00 1,000 - 0,000 0,000 10 1,00 1,000 - 0,000 0,000 8 1,00 1,000 - 0,000 0,000 11 1,00 1,000 - 0,000 0,000 17 1,00 1,000 - 0,000 0,000 6 1,00 1,000 - 0,000 0,000 11 1,36 0,955 0,045 0,091 0,091 14 1,00 1,000 - 0,000 0,000 5 1,00 1,000 - 0,000 0,000 FH15 N AR 228 230 232 234 236 238 240 He Ho 11 1,00 - - 1,000 - - - - 0,000 0,000 5 1,80 - - 0,900 0,100 - - - 0,200 0,200 10 4,07 0,050 0,100 0,500 - 0,050 0,150 0,150 0,726 0,500 8 2,00 0,062 0,063 0,875 - - - - 0,242 0,125 10 1,00 - - 1,000 - - - - 0,000 0,000 17 1,66 - 0,059 0,912 0,029 - - - 0,169 0,059 6 1,00 - - 1,000 - - - - 0,000 0,000 11 1,86 - 0,182 0,818 - - - - 0,312 0,000 14 1,78 - 0,071 0,893 - 0,036 - - 0,204 0,143 5 1,00 - - 1,000 - - - - 0,000 0,000 Tabla 2. Continuación. MBO1 MBO2 MBO3 MBO4 MBO5 MBO6 MBO7 MBO8 MBO9 MBO10 FH222CBP N AR 147 157 159 161 163 165 167 169 173 He Ho 11 2,23 - - - 0,182 0,773 - 0,045 - - 0,385 0,182 5 3,96 - 0,300 - 0,300 0,200 - 0,200 - - 0,822 0,400 10 3,65 - - 0,150 0,250 0,400 0,200 - - - 0,753 0,800 8 5,29 - 0,062 0,188 0,125 0,250 0,188 0,125 - 0,062 0,883 1,000 11 4,07 - 0,045 0,091 0,091 0,546 0,045 0,046 0,136 - 0,693 0,636 17 3,95 - - 0,147 0,294 0,353 0,118 0,088 - - 0,768 0,765 6 4,39 - 0,166 0,083 0,167 0,417 - 0,167 - - 0,803 0,833 11 2,89 - - 0,227 0,091 0,636 - 0,046 - - 0,558 0,273 14 4,51 - 0,036 0,250 0,107 0,286 0,036 0,214 - 0,071 0,820 1,000 5 3,40 0,100 - - 0,700 0,100 - 0,100 - - 0,533 0,400 FH23 N AR 275 277 279 281 299 He Ho 10 1,90 - 0,200 0,800 - - 0,337 0,000 4 3,00 - 0,625 0,250 0,125 - 0,607 0,250 8 1,77 - 0,125 0,875 - - 0,233 0,000 4 3,00 - 0,125 0,375 - 0,500 0,679 0,250 10 2,55 - 0,200 - 0,100 0,700 0,484 0,000 17 2,67 - 0,117 0,471 - 0,412 0,613 0,235 5 3,00 - 0,300 0,300 - 0,400 0,733 0,800 10 2,70 0,050 0,700 0,050 - 0,200 0,489 0,200 14 3,47 0,036 0,250 0,321 0,036 0,357 0,730 0,500 5 1,98 - 0,800 0,200 - - 0,356 0,000 Tabla 2. Continuación. MBO1 MBO2 MBO3 MBO4 MBO5 MBO6 MBO7 MBO8 MBO9 MBO10 FH25 N AR 276 278 280 282 286 288 He Ho 11 3,32 - 0,409 0,409 0,091 0,046 0,045 0,684 0,909 5 1,80 - 0,100 0,900 - - - 0,200 0,200 10 2,35 - 0,250 0,700 0,050 - - 0,468 0,600 8 2,73 0,250 0,125 0,625 - - - 0,567 0,625 11 2,69 - 0,227 0,637 0,136 - - 0,550 0,636 17 2,77 0,088 0,324 0,559 0,029 - - 0,592 0,294 6 2,33 - 0,083 0,834 0,083 - - 0,318 0,333 11 1,97 0,091 - 0,864 0,045 - - 0,255 0,273 14 3,03 0,036 0,464 0,357 0,143 - - 0,659 0,214 5 2,78 - 0,100 0,700 0,200 - - 0,511 0,400 BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 119 Aagaard, J. E.; Krutovskii, V. K.; Strauss, H. S. 1998. RAPDs and allozymes exhibit similar levels of diversity and differentiation among populations and races of Douglas-fir. Heredity, 81: 69-78. Adlard, R. D.; Barker, S. C.; Blair, D.; Cribb, T. H. 1993. Comparison of the second internal transcribed spacer (ribosomal DNA) from populations and species of Fasciolidae (Digenea). 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