El pelo como matriz biológica alternativa y su uso en la determinación de la exposición intraútero a drogas ilícitas y fármacos

T ESIS D O C TO RA L EL PELO COMO MATRIZ BIOLÓGICA ALTERNATIVA Y SU USO EN LA DETERMINACIÓN DE LA EXPOSICIÓN INTRAÚTERO A DROGAS ILÍCITAS Y FÁRMACOS Elena Lendoiro Belío D E PA R TA ME N TO D E A NATOMÍA P ATOLÓGICA Y C IENCIAS F ORENSES F A C U LT A DE D E M EDICINA Y O DONTOLOGÍA S ANTIAGO D E C OMPOSTELA 2015 ! UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Anatomía Patológica y Ciencias Forenses EL PELO COMO MATRIZ BIOLÓGICA ALTERNATIVA Y SU USO EN LA DETERMINACIÓN DE LA EXPOSICIÓN INTRAÚTERO A DROGAS ILÍCITAS Y FÁRMACOS Elena Lendoiro Belío Memoria para optar al grado de Doctora con Mención Internacional por la Universidad de Santiago de Compostela Santiago de Compostela, Noviembre 2015 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Anatomía Patológica y Ciencias Forenses Dña. ANA DE CASTRO RÍOS, Dña. MARTA CONCHEIRO GUISÁN, y D. ÓSCAR QUINTELA JORGE, Doctores en Farmacia, Como directores de la Tesis Doctoral titulada “El pelo como matriz biológica alternativa y su uso en la determinación de la exposición intraútero a drogas ilícitas y fármacos”, presentada por la Licenciada Dña. Elena Lendoiro Belío, alumna del Programa de Doctorado Ciencias Forenses y Patología, para optar al grado de Doctora con Mención Internacional, AUTORIZAN la presentación de la Tesis indicada, considerando que reúne los requisitos exigidos en el artículo 34 del reglamento de Estudios de Doctorado y que como directores de la misma no incurren en las causas de abstención establecidas en la Ley 30/1992. Santiago de Compostela, a 9 de noviembre de 2015. Fdo. Ana de Castro Ríos Fdo. Marta Concheiro Guisán Fdo. Óscar Quintela Jorge UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Anatomía Patológica y Ciencias Forenses Dña. ANA DE CASTRO RÍOS, Dña. MARTA CONCHEIRO GUISÁN y D. ÓSCAR QUINTELA JORGE, como directores de la Tesis Doctoral titulada “El pelo como matriz biológica alternativa y su uso en la determinación de la exposición intraútero a drogas ilícitas y fármacos”, por la presente DECLARAN, Que la Tesis presentada por Dña. Elena Lendoiro Belío es idónea para ser presentada, de acuerdo con el artículo 41 del Reglamento de Estudios de Doctorado de la Universidad de Santiago de Compostela, por la modalidad de compendio de ARTÍCULOS, en los que el investigador en formación tuvo participación en el peso de la investigación y su contribución fue decisiva para llevar a cabo este trabajo. Y que está en conocimiento de los coautores, tanto doctores como no doctores, participantes en los artículos, que ninguno de los trabajos reunidos en esta Tesis serán presentados por ninguno de ellos en otra Tesis Doctoral, lo que firmamos bajo nuestra responsabilidad. Santiago de Compostela, a 9 de noviembre de 2015. Fdo. Ana de Castro Ríos Fdo. Marta Concheiro Guisán Fdo. Óscar Quintela Jorge UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Anatomía Patológica y Ciencias Forenses Dña. ANGELINES CRUZ LANDEIRA, Catedrática de Toxicología de la Universidad de Santiago de Compostela, Como tutora de la Tesis Doctoral titulada “El pelo como matriz biológica alternativa y su uso en la determinación de la exposición intraútero a drogas ilícitas y fármacos”, presentada por la Licenciada Dña. Elena Lendoiro Belío para optar al grado de Doctora con Mención Internacional, CERTIFICA que la Tesis ha sido realizada en el Departamento de Anatomía Patológica y Ciencias Forenses y AUTORIZA la presentación de la Tesis indicada, considerando que reúne los requisitos exigidos en el artículo 34 del reglamento de Estudios de Doctorado. Además DECLARA que la presente Tesis es idónea para ser presentada, de acuerdo con el artículo 41 del Reglamento de Estudios de Doctorado de la Universidad de Santiago de Compostela, por la modalidad de compendio de ARTÍCULOS. Santiago de Compostela, a 9 de noviembre de 2015. Fdo. Angelines Cruz Landeira Índice 3. PUBLICACIONES……………………………………………………………….105 3.1. Artículo 1: Target screening and confirmation of 35 licit and illicit drugs and metabolites in hair by LC-MSMS………………107 3.2. Artículo 2: Hair analysis of amphetamine-type-stimulant (ATS) drugs, including synthetic cathinones and piperazines, by LC-MSMS……………………………….…………...119 3.3. Artículo 3: Hair analysis interpretation of an unusual case of alleged scopolamine-facilitated sexual assault…………….145 3.4. Artículo 4: Maternal hair analysis for the detection of illicit drugs, medicines and alcohol exposure during pregnancy……………………………………………………………….153 4. DISCUSIÓN………………………………………………………………………167 4.1. Desarrollo de metodologías analíticas en pelo……………………...169 4.2. Interpretación de los resultados en pelo…………………………….187 4.2.1. Efecto de la contaminación externa………………………………187 4.2.2. Efecto de la variabilidad interindividual en el ratio de crecimiento del pelo………………………………………………...193 4.2.3. Efecto del color del pelo………………………………..................194 4.2.4 Efecto de los tratamientos cosméticos…………………………..195 4.2.5 Correlación dosis/concentración en pelo………………………..199 4.3. Aplicaciones de los análisis de pelo: Exposición a drogas intraútero………………………………………………………..203 Bibliografía………………………………………………………………………225 5. CONCLUSIONES/CONCLUSIONS…………………………………………..245 Abreviaturas 15 ABREVIATURAS A ACN: acetonitrilo AEME: anhidroecgoninametiléster B BE: benzoilecgonina C CV: coeficiente de variación D DCM: diclorometano E EDADES: Encuesta Domiciliaria sobre Alcohol y Drogas en España EMCDDA: European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction ELISA: ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas ESI: ionización por electrospray ESTUDES: Encuesta Estatal sobre el uso de drogas en Enseñanzas Secundarias EtG: etilglucurónido Abreviaturas 16 F FAEEs: ésteres etílicos de los ácidos grasos FPIA: inmunoensayo de polarización fluorescente G GC-MS: cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas GC-MSMS: cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en tándem GHB: gammahidroxibutirato GTFCh: Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie M mCPP: 1-(3-clorofenil)piperazina MDA: metilendioxianfetamina MDEA: metilendioxietilanfetamina MDMA: metilendioximetanfetamina MDPV: 3,4-metilendioxipirovalerona MeOH: metanol MIP: impresión molecular polimérica MRM: monitorización por reacción múltiple Abreviaturas 17 N NPS: nuevas drogas sintéticas L LC-MSMS: cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem LLE: extracción líquido-líquido LOD: límite de detección LOQ: límite de cuantificación LSD: dietilamida de ácido lisérgico O OED: Observatorio Español sobre Drogas Q QC: control de calidad R RIA: radioinmunoensayo S SAMHSA: Substance Abuse and Mental Health Services Administration Abreviaturas 18 SFTA: Société Française de Toxicologie Analytique SoHT: Society of Hair Testing SPE: extracción en fase sólida SPME: microextracción en fase sólida T TFMPP: 3-trifluorometilfenilpiperazina THC: ∆9-tetrahidrocannabinol THCCOOH: carboxi-∆9-tetrahidrocannabinol U UNODC: Oficina de Naciones Unidas sobre Drogas y Crimen 6 6-AM: 6-monoacetilmorfina 7 7-AF: 7-aminoflunitrazepam RESUMEN Resumen 21 RESUMEN El uso de matrices biológicas alternativas en el ámbito de la Toxicología Clínica y Forense se ha incrementado de forma significativa en los últimos años. Estas matrices complementan la información obtenida con el análisis de las matrices biológicas tradicionales (sangre y orina), y presentan una toma de muestra menos invasiva y más sencilla. El pelo es una matriz biológica alternativa muy útil debido a su amplia ventana de detección, de meses o incluso años, lo que permite realizar el estudio retrospectivo del consumo y establecer el perfil cronológico del mismo. Sin embargo, se requieren métodos analíticos suficientemente sensibles para su análisis toxicológico, ya que las concentraciones encontradas en esta matriz biológica suelen ser bajas (del orden de pg/mg). Por ello, uno de los objetivos de esta Tesis Doctoral ha sido el desarrollo y validación de métodos multianalito que permitan la determinación simultánea de varios grupos de sustancias en pelo. Se ha desarrollado y validado un método de screening que permite la determinación simultánea de las principales drogas de abuso (opioides, cocaína y su principal metabolito, cannabis, anfetaminas, dietilamida de ácido lisérgico (LSD) y ketamina) y fármacos de uso común (benzodiazepinas, antidepresivos e hipnóticos) mediante la técnica de cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MSMS). Cabe destacar la inclusión del ∆9-tetrahidrocannabinol (THC) en esta metodología, empleando el mismo procedimiento de extracción y la misma técnica analítica que los utilizados para la determinación del resto de sustancias. También se ha desarrollado y validado un método analítico para la determinación simultánea de anfetaminas clásicas y drogas emergentes con efectos estimulantes mediante LC-MSMS, incluyendo además dos fármacos que producen como metabolito la piperazina sintética 1-(3-clorofenil)piperazina (mCPP), por lo que es posible distinguir entre el uso clínico e ilícito de esta sustancia. En ambos métodos se han obtenido límites de cuantificación (LOQ) al menos iguales a los recomendados por la Society of Hair Testing (SoHT). Otro de los objetivos de esta Tesis Doctoral fue la evaluación de diferentes factores que pueden influir en la interpretación de los resultados analíticos en pelo. Entre estos factores, se ha estudiado especialmente el efecto de la Resumen 22 contaminación externa y de los tratamientos cosméticos en diferentes casos reales. Por último, se ha evaluado la utilidad del pelo como matriz biológica para el estudio de la exposición fetal a drogas de abuso y fármacos. El análisis del pelo materno presentó mayor sensibilidad para la detección de la exposición intraútero que la entrevista materna (a excepción del alcohol), ya que esta matriz permite la identificación objetiva del consumo por parte de la madre. Asimismo, el cabello materno permitió identificar un mayor número de casos positivos en comparación con otras matrices biológicas (meconio, placenta y cordón umbilical), debido a su amplia ventana de detección que permite estudiar la exposición durante todo el embarazo. Summary 23 SUMMARY The use of alternative biological matrices in the field of the Clinical and Forensic Toxicology has significantly increased in the last years. These matrices complement the information obtained with the analysis of the traditional ones (urine and blood), and their sample collection is easier and less invasive. Hair is a very useful alternative biological matrix due to its long window of detection, months or even years, which allows performing retrospective study of drug consumption and its chronological profile. However, sensitive analytical methodologies are required for its toxicological analysis, due to the low concentrations found in this matrix (around pg/mg). Thus, one of the aims of this Doctoral Thesis was the development and validation of multianalyte methods that allow the simultaneous determination of several groups of substances in hair. A screening method was developed and validated for the main drugs of abuse (opioids, cocaine and its main metabolite, cannabis, amphetamines, LSD and ketamine) and commonly used medicines (benzodiazepines, antidepressants and hypnotics) by LC-MSMS. It should be pointed out the inclusion of THC in this methodology, using the same extraction procedure and detection technique as those used for the determination of the rest of substances. Also an analytical method was developed and validated for the determination of classical amphetamines and stimulant new psychoactive substances (synthetic cathinones and piperazines) by LC-MSMS. Two medicines, which produce mCPP (piperazine) were also included in this methodology, to distinguish between the clinical and illicit use of mCPP. LOQ values obtained in both methods were at least equal to those recommended by SoHT. Another aim of this Doctoral Thesis was the evaluation of different factors that may influence interpretation of hair analytical results. Among these factors, the effect of external contamination and cosmetic treatments were particularly studied in different real cases. Finally, the usefulness of hair as a biological matrix for the study of in utero drug exposure to drugs of abuse and medicines was evaluated. Hair analysis showed a better sensitivity for the detection of in utero exposure than the 1.1. Aspectos generales 30 número de nuevos diagnósticos de VIH entre los consumidores de drogas inyectables. A pesar de estos datos, una proporción muy alta de los usuarios de drogas por vía intravenosa están infectados por VIH (20-30%), por el virus de la hepatitis B (20-35%), o por el virus de la hepatitis C (65-90%) [4]. Los estimulantes tipo anfetamina incluyen a varias sustancias relacionadas estructuralmente que presentan efectos estimulantes sobre el sistema nervioso central (anfetamina, metanfetamina, 3,4-metilendioxianfetamina, 3,4metilendioximetanfetamina, N-metildietanolamina, etc). Estas sustancias muestran una prevalencia de consumo, tanto en la población adulta como entre los estudiantes, que desciende lentamente desde 2000-2001. Además, son consumidas de forma bastante esporádica, por lo que los problemas originados por su consumo son escasos, y tanto el número de urgencias hospitalarias como el de muertes se han mantenido estables desde 2000. De hecho, la prevalencia de consumo en la población adulta en los últimos 30 días se encuentra en un 0,3% (en 2011). Dentro del grupo de los denominados alucinógenos se incluyen una serie de sustancias con propiedades propiamente alucinógenas, como el LSD (dietilamida de ácido lisérgico), y otras sustancias con propiedades disociativas, como la ketamina. La prevalencia de consumo de estas sustancias es muy baja (2,9% de la población entre 15-64 años los había probado alguna vez en la vida, pero sólo el 0,2% los habían consumido en el último mes según el informe del OED de 2013) y parece estabilizada o en descenso. La prevalencia anual de consumo se mantiene estable para la población adulta desde 1999, en torno a un 0,6%. Destaca también el consumo de las drogas legales (tabaco, alcohol y medicamentos hipnosedantes), debido a que son fácilmente accesibles. El tabaco ha mantenido una prevalencia estable hasta el 2003, año en que estos valores comenzaron a descender. Un 47,8% de la población adulta había fumado en los últimos 12 meses según los resultados obtenidos en la encuesta de 2003, mientras que en 2013 este valor fue del 40,7%. Este descenso también se observa en la prevalencia de consumo en la población adulta en los últimos 30 días (42,9% en 2003 a 38,3% en 2013), y en el consumo diario 1. Introducción 31 (36,7% en 2003 a 30,8% en 2013) [3]. La edad media de inicio del consumo se encuentra entorno a los 16,5 años, y la edad media de inicio en el consumo diario está en los 18,6 años. En función del sexo, los datos de prevalencia continúan siendo más altos para los hombres que para las mujeres en la población adulta, sin embargo, en los jóvenes de 15-24 años las diferencias intersexuales se reducen mucho (28,7% en hombres y 24,8% en mujeres). Si bien, los hombres fuman más cigarrillos de media que las mujeres, 14,6 y 12,3, respectivamente. El alcohol es la sustancia que ha consumido alguna vez en la vida un mayor porcentaje de la población entre 15 y 64 años, ya que se estima que un 90,9% lo han probado alguna vez, un 76,6% lo han consumido en el último año, y un 62,3% en el último mes. La edad de inicio de su consumo es muy similar a la observada para el tabaco, ya que los jóvenes inician el consumo a los 16,7 años. Si bien todos los grupos de edad realizan fundamentalmente un consumo de fin de semana, esa diferencia en el consumo es especialmente relevante en el caso de los jóvenes de 15-34 años. La prevalencia del consumo diario en el último mes mostró estabilidad hasta el 2005 y, posteriormente, se observó un descenso en el consumo (14,9% en 2005 y 9,8% en 2013); sin embargo, se observó una diferencia significativa entre la prevalencia en los hombres (15,3%) y en las mujeres (5,0%). El porcentaje de intoxicaciones etílicas entre la población adulta en los últimos 12 meses fue del 19,3%, siendo mucho mayor entre los hombres de 15 a 34 años (41,3%). En relación al binge drinking o consumo de alcohol en “forma de atracón” (5 o más bebidas en hombres y 4 o más en mujeres en un intervalo de 2 horas), fue realizado por 15,5% de la población entre 15 a 64 años en el último mes, principalmente en fin de semana, obteniéndose la mayor prevalencia entre el grupo de adultos jóvenes de 15 a 29 años. Además, se estima que un 4,9% de la población de 15 a 64 años tiene un consumo problemático de alcohol y un 0,4% una posible dependencia [3]. Otras sustancias incluidas dentro de las drogas legales son los medicamentos hipnosedantes, tanto tranquilizantes como somníferos, siendo los más habituales los pertenecientes al grupo farmacológico de las benzodiacepinas. Un 22,2% de la población entre 15 y 64 años los han consumido alguna vez en 1.1. Aspectos generales 32 la vida, principalmente en forma de tranquilizantes, mientras que en 2005 este porcentaje era del 8,7% [3]. Pese al ascenso de su prevalencia en los últimos años, en la mayoría de los casos se adquieren bajo prescripción médica. La prevalencia anual de consumo observada en 2011 en la población adulta fue de un 11,4%, el doble de lo registrado en 2005; no obstante, sólo un 1,2% se trataba de consumo sin preinscripción médica. El consumo sin receta de estos medicamentos suele estar relacionado con los consumidores de cocaína y/o heroína, de tal forma que en una encuesta realizada en 2003-2004 se observó que un 25,6% de los admitidos a tratamiento por consumo de cocaína y un 47,0% de los admitidos a tratamiento por consumo de heroína, o heroína y cocaína, habían consumido algún hipnosedante en el mes previo a su ingreso [4]. Estas sustancias son mayoritariamente consumidas por mujeres, duplicando el porcentaje de hombres que las consumen (16,0% y 8,5%, respectivamente en el último año) y siendo el único grupo de drogas en el que la prevalencia de consumo es mayor en las mujeres que en los hombres. La mayor prevalencia de consumo en el último año se observa entre las mujeres entre 35 y 64 años (19,8%) [5]. Por último, cabe destacar que el informe EDADES [5] publicado con los datos recogidos entre los años 2011-2012, se incluye por primera vez preguntas relacionadas con las nuevas drogas emergentes, cuya expansión se encuentra fuertemente relacionada con su comercio por Internet. La venta de estos productos se realiza mayoritariamente a través de tiendas online, aunque también es posible encontrarlos en ciertos establecimientos denominados smart shops (tiendas dedicadas a la venta de parafernalia relacionada con las drogas). Dentro de las drogas emergentes se incluyen múltiples sustancias con gran diversidad química y estructural, que han aparecido en el mercado en los últimos años como sustitutos “legales” a los compuestos psicoactivos tradicionales controlados por las autoridades, como el cannabis, las anfetaminas, la cocaína, el LSD o los opiáceos [6]. Estas sustancias pueden presentarse al consumidor en forma de polvo o sobre preparados herbales que también pueden presentar alguna actividad psicoactiva. Destacan entre los más conocidos los cannabinoides sintéticos, las catinonas sintéticas y las piperazinas sintéticas. Los cannabinoides sintéticos son moléculas inicialmente 1. Introducción 33 diseñadas como potenciales medicamentos por su actuación en los receptores CB1 y CB2, sobre los que ejerce su efecto el THC (∆9-tetrahidrocannabinol), principal componte activo del cannabis. Estos compuestos se venden como inciensos o ambientadores, que contienen productos “naturales” y “no ilegales”, pero con efectos psicotrópicos similares a los producidos por el cannabis. Las catinonas sintéticas son derivados de la catinona, sustancia presente de forma natural en la planta Catha edulis, y con actividad estimulante tipo anfetamina. Estos compuestos suelen venderse en forma de “sales de baño”, y en el envase se suele indicar que no son aptas para el consumo humano. También se han detectado preparados con compuestos análogos a la psilocina y a las piperazinas con efectos alucinógenos [7]. La aparición de estos productos en Europa data de finales del año 2008, cuando se detectó la venta de preparaciones herbales con efectos psicoactivos denominadas Spice en varias páginas de Internet, pero no fue hasta el año 2009 cuando el equipo de Auwärter et al. [8] determinaron que los efectos psicoactivos de estas mezclas herbales eran atribuibles a los cannabinoides sintéticos. A partir de entonces el EMCDDA comenzó a realizar el control y monitorización de la venta y consumo de estas nuevas sustancias [9]. En la última encuesta EDADES [3] se pregunta por el consumo de 11 tipos diferentes de estas nuevas sustancias entre la población adulta alguna vez en la vida. Se incluyen: setas mágicas, ketamina, GHB (gammahidroxibutirato), salvia, Spice, Nexus, mefedrona, piperazinas, legal highs, research chemicals y esteroides anabolizantes. La prevalencia de consumo varía entre un 1,9% para las setas mágicas y un 0,0% para los legal highs y las piperazinas, alguna vez en la vida. En conjunto, la prevalencia de estas sustancias es de un 3,0%, pero cabe destacar que un 74,1% de los encuestados nunca habían oído hablar de ellas. El 69,2% de los consumidores de estas nuevas sustancias son consumidores también de otras drogas ilegales. Además, un 78% realiza un policonsumo experimental de las nuevas drogas, habiendo probado 5 o más de estas sustancias [3]. El policonsumo es un factor importante que debe tenerse en cuenta al estudiar la prevalencia de las diferentes drogas, ya que en estos casos una misma persona consume varias sustancias psicoactivas, tanto legales como ilegales, 1.1. Aspectos generales 34 de manera simultánea durante el mismo periodo de tiempo. El alcohol y el cannabis son las sustancias que se consumen en mayor medida en forma de policonsumo. El alcohol está presente en el 90% de los policonsumos, y se asocia con una mayor prevalencia de consumo de otras drogas cuando se realiza en forma de binge drinking, mientras que el cannabis está presente en el 90% de los policonsumos de sustancias ilegales [3]. En la Tabla 1 se reflejan los porcentajes de consumo de otras drogas en consumidores habituales de cannabis, cocaína, éxtasis o heroína entre las personas de 15 a 64 años. TABLA 1. Porcentaje de policonsumo en consumidores de cannabis, cocaína, éxtasis y heroína en los últimos 12 meses en la población de 15 a 64 años (2011, España) [5]. Consumidores de cannabis Consumidores de cocaína Consumidores de éxtasis Consumidores de heroína Alcohol 94,4 98,2 97,2 94,5 Tabaco 84,0 87,8 87,7 100,0 Hipnosedantes 13,6 19,3 18,2 73,8 Cannabis 100,0 81,5 84,7 90,3 Cocaína 19,2 100,0 65,0 56,7 Éxtasis 6,0 19,6 100,0 24,7 Anfetaminas 5,0 18,0 51,4 37,1 Heroína 0,9 2,4 3,5 100,0 Alucinógenos 3,7 9,9 29,7 24,7 1.1.2. Matrices biológicas clásicas y alternativas en Toxicología Debido a que cada matriz biológica proporciona una información diferente, es necesario seleccionar correctamente la matriz a analizar en función del propósito para el que se realiza dicho análisis [10]. Tradicionalmente, matrices biológicas como la sangre y la orina se han empleado en la realización de los análisis de rutina debido a su disponibilidad y 1. Introducción 35 características. A estas dos matrices biológicas se las conoce por ello como matrices biológicas clásicas. La sangre (y por similitud el plasma y el suero) permite establecer una correlación entre la concentración hallada para una sustancia con los efectos o síntomas producidos sobre el individuo en el momento de la toma de la muestra. No obstante, la vida media de la mayoría de las sustancias en sangre es inferior a las 24 horas, lo que limita su utilidad cuando la toma de muestra se efectúa con retraso o se requiere conocer un consumo pasado. Además, la toma de muestra es invasiva y por ello requiere personal especializado para su recolección, cuando se realiza fuera del ámbito hospitalario. Numerosos métodos analíticos emplean sangre o alguno de sus derivados (plasma o suero) para la determinación de las principales drogas de abuso [11-15], fármacos o alcohol [16-18]. La orina es producida continuamente por el riñón como un ultrafiltrado de la sangre, y mediante su producción son eliminados el exceso de agua y productos de desecho producidos por el cuerpo. La composición y cantidad diaria producida varían considerablemente en función de la cantidad de líquidos ingeridos, la dieta, el estado de salud, el uso de ciertos medicamentos y las condiciones ambientales. La orina es la muestra más utilizada para el cribado o screening en los análisis toxicológicos, en preferencia a la sangre debido a sus características: las concentraciones de los compuestos diana y sus productos de biotransformación (metabolitos) son mayores; el volumen de muestra disponible suele ser mayor; la toma de muestra no resulta cruenta; y su ventana de detección es superior (días en lugar de horas). Además, existen numerosos sistemas de automatización disponibles en el mercado para la realización de inmunoensayos que permiten la detección cualitativa de las principales familias de las drogas de abuso, utilizando esta matriz biológica, de manera rápida y con poca manipulación de la muestra. Sin embargo, las concentraciones encontradas en orina no pueden correlacionarse con el efecto producido sobre el individuo, permitiendo simplemente identificar la exposición a la/s sustancia/s. Hay que tener en cuenta que su adulteración es sencilla y, por ello, la toma de muestra debe ser realiza bajo supervisión, lo que conlleva una invasión de la intimidad del individuo [19-21]. Por todo lo anterior, 1.1. Aspectos generales 36 habitualmente los análisis de screening cualitativos se realizan en las muestras de orina y los cuantitativos de confirmación en sangre. En las últimas décadas otras matrices, denominas matrices biológicas alternativas, han aportado una nueva herramienta para la interpretación de los resultados toxicológicos. En general, estas matrices alternativas presentan como ventaja sobre las matrices clásicas una toma de muestra menos invasiva y más sencilla, aportando además información no suministrada por las matrices clásicas, debido a sus diferentes ventanas de detección. Como desventaja se debe destacar las bajas concentraciones que suelen presentar en ellas los compuestos y sus metabolitos, por lo que requieren el empleo de equipos analíticos con una alta sensibilidad para su análisis. Las principales matrices alternativas son el pelo, el fluido oral, el sudor y el meconio; pero también pueden incluirse en este grupo matrices menos utilizadas como los dientes, las uñas, la placenta, el cordón umbilical, la vernix caseosa, etc [22]. El pelo fue la primera matriz alternativa en ser empleada en el campo de la Toxicología, siendo Baumgartner el primero en utilizarla en 1979 [23] para la determinación del abuso de opiáceos a través del análisis de pelo de ratones a tratamiento con morfina y de personas con consumo habitual de heroína. Desde entonces el número de métodos analíticos desarrollados y sus aplicaciones en Toxicología se ha extendido, hasta convertir a este espécimen en la matriz alternativa más utilizada. La principal aportación que supone la utilización del pelo en el campo de la Toxicología, frente a las matrices tradicionales, es su amplia ventana de detección, ya que las drogas, una vez incorporadas al pelo, no son eliminadas por el lavado del cabello y, por tanto, permanecen en el interior del mismo meses o incluso años. Consecuentemente, la ventana de detección de esta matriz biológica sólo se ve limitada por la longitud del mechón de pelo a analizar. Esta característica otorga la posibilidad de realizar estudios del patrón cronológico de consumo, al analizar diferentes segmentos del pelo del mismo individuo. Además, la toma de muestra es sencilla, ya que no requiere personal médico para su realización, y es no invasiva, pudiendo ser fácilmente supervisada para evitar la manipulación o adulteración de la muestra. Siempre que fuese necesario recoger una segunda muestra de características similares a la inicial, ésta 1. Introducción 37 puede ser obtenida del mismo sujeto sin ningún problema. Sin embargo, en aquellos casos en los que la muestra de cabello no estuviera disponible para su recolección, debido por ejemplo a la calvicie, es posible el empleo de otro tipo de pelo corporal, como el púbico, de axilas, brazos, piernas y barba. Por último, otra ventaja del uso del pelo como matriz biológica es que tanto su almacenaje y como su transporte se realiza de una forma sencilla, sin necesidad de ninguna medida de conservación especial. A nivel analítico, cabe destacar que los niveles de las drogas y sus metabolitos en el pelo pueden ser muy bajos (del orden de los pg/mg), por lo que es necesario el uso de métodos muy sensibles para su análisis. En general, las drogas sin metabolizar se detectan en mayor proporción que sus metabolitos. La interpretación de los resultados obtenidos es compleja, y la posibilidad de un falso positivo es elevada si no se realiza una adecuada descontaminación externa de la muestra. El pelo, a diferencia de la orina, no permite la determinación de un consumo reciente; sin embargo, en la práctica, estas dos matrices son complementarias en relación a la información toxicológica que proporcionan [22,24,25]. La morfología, la incorporación de las drogas al pelo, los procedimientos para la eliminación de la contaminación externa, etc serán objeto de una descripción en mayor profundidad en secciones posteriores de esta Tesis Doctoral. El fluido oral es una matriz biológica alternativa cuyo uso ha ido ganando relevancia en los últimos años, sobre todo por su empleo en el análisis de muestras de conductores para determinar la presencia de drogas o medicamentos. El fluido oral también puede ser utilizado en casos de determinación del consumo de drogas en el lugar de trabajo y en Toxicología Clínica para la monitorización de fármacos [26]. El término “fluido oral” engloba todo fluido producido en la cavidad oral, fundamentalmente compuesto por la mezcla de las secreciones de las tres glándulas salivares mayoritarias (submandibular, parótida y sublingual), así como las secreciones de otras glándulas menores, restos de la mucosa oral y otros fluidos presentes en la boca [22]. La mayoría de las drogas y fármacos pasan desde la sangre hacia el fluido oral por difusión pasiva y, por ello, 1.1. Aspectos generales 38 representan la fracción libre no ionizada del plasma; es decir, las sustancias que mayoritariamente se encuentran en fluido oral se corresponden con las moléculas más apolares, lo que generalmente equivale a una menor presencia de metabolitos polares [27]. Para algunas sustancias es posible establecer una correlación entre la concentración encontrada en el fluido oral, con la concentración de la fracción libre de esa sustancia en el plasma [28-32]. Sin embargo, la ingesta por vía oral, intranasal o fumada puede ocasionar una contaminación de la cavidad oral con las sustancias consumidas y producir concentraciones elevadas en el fluido oral, lo que alterará la correlación entre la concentración de dichas sustancias en el fluido oral y en el plasma, y sus efectos sobre el individuo. En esta matriz, a diferencia de la sangre, la toma de muestra es un proceso incruento y no invasivo, y además es posible realizarla bajo la observación directa del sujeto sin intromisión en su intimidad. La ventana de detección es comparable a la de la sangre, por lo que permite detectar un consumo reciente de las sustancias [33-35]. Para su análisis se requieren métodos analíticos con alta sensibilidad debido a que las concentraciones de las drogas y metabolitos suelen ser bajas, el volumen de muestra es limitado y en ciertas ocasiones es necesario reanalizar una misma muestra. Debe tenerse en cuenta también durante la toma de muestra que algunas drogas, medicamentos o situaciones patológicas pueden inhibir la secreción de fluido oral de los individuos y, por tanto, la cantidad del espécimen para la realización del análisis puede ser escaso [24]. Otra matriz alternativa empleada en el campo de la Toxicología es el sudor. El sudor es un líquido acuoso, claro e hipotónico, producido por dos tipos de glándulas, ecrinas y apocrinas, localizadas en la epidermis. La función primaria del sudor es la termorregulación corporal y, por tanto, la cantidad producida dependerá en gran medida de las condiciones medioambientales. Su componente principal en más de un 99% es agua, con una alta concentración de cloruro sódico. La fracción libre no ionizada de las drogas puede ser excretada en el sudor, principalmente por un mecanismo de difusión pasiva. Mediante el uso de parches semipermeables (que permiten el intercambio de oxígeno, dióxido de carbono y agua, pero retienen las drogas) es posible acumular el sudor producido por un individuo en un determinado periodo de 1. Introducción 39 tiempo (generalmente entre 1-14 días), y estimar su consumo de drogas en esa franja temporal [22]. Por ello, la ventana de detección del sudor es mayor a la obtenida por el análisis de plasma u orina. Además, la toma de muestra es poco invasiva y no interfiere con la privacidad del individuo sujeto a dicho análisis. El parche permite una rápida aplicación y retirada, sin necesidad de personal médico, y sus características lo hacen difícilmente manipulable o adulterable. Sin embargo, debido a que no es posible determinar el volumen de sudor acumulado en el parche durante el periodo de recogida de muestra, los análisis solo permiten obtener resultados cualitativos. Los analitos suelen encontrarse en muy bajas concentraciones (del orden de ng/parche), por lo que las determinaciones analíticas deben realizarse con equipos de elevada sensibilidad [24,36]. Por todas estas características, el empleo del sudor como matriz biológica alternativa se reduce a la monitorización cualitativa del consumo de drogas durante un periodo de tiempo determinado, como por ejemplo en casos de monitorización de la abstinencia. El meconio puede definirse como la primera materia fecal del neonato, y se ha convertido en la matriz de referencia para la detección de la exposición a drogas por parte del neonato durante el embarazo. El meconio está compuesto principalmente por agua, mucopolisacáridos, sales y ácidos biliares, células epiteliales y residuos de la ingestión del líquido amniótico por parte del feto [37]. Su formación comienza en torno a la semana 12 de gestación y se acumula en el intestino del feto hasta el nacimiento. Durante el tercer trimestre (semana 28-40) su formación aumenta, produciéndose el 75% del meconio en las últimas 8 semanas del embarazo [38]. Debido a esto, el meconio refleja principalmente la exposición durante el último trimestre del embarazo, siendo su ventana de detección mayor a la proporcionada por la orina, y algo mayor a la del pelo del neonato [39]. El meconio es excretado por el neonato varias veces al día en los primeros 5 días tras el parto, y la toma de muestra es sencilla y no invasiva. En algunas ocasiones, el feto excreta el meconio intraútero, haciendo imposible su recolección. Desde el punto de vista analítico es una matriz compleja con numerosas interferencias y, por ello, se requieren métodos analíticos muy sensibles para su determinación. 1.2. El pelo como matriz biológica 46 queratinocitos y de los melanocitos es más ácido que el del plasma (de 3 a 6 en los queratinocitos y melanocitos, frente a 7,3 del plasma), las moléculas básicas penetrarán con mayor facilidad en el interior celular [44,55]. Una vez en el interior, estos compuestos se unen a los diferentes componentes que conforman las células durante la queratogénesis, de modo que permanecen retenidas en su interior. La melanina es uno de los componentes a los que se adhieren con mayor afinidad [43]. Sin embargo, este no es el único mecanismo posible, ya que en animales albinos también se ha observado incorporación de drogas o medicamentos en el pelo, si bien en mucha menor medida. Otro mecanismo de incorporación propuesto es la unión a los aminoácidos con grupos sulfhidrilo, como la cisteína, ya que este tipo de aminoácidos son muy abundantes en el pelo, al ser los encargados de formar las uniones de los puentes disulfuro [56]. Es este paso desde la sangre hacia los folículos pilosos el que permite obtener un perfil cronológico del consumo de drogas, mediante el análisis de segmentos contiguos y sucesivos de un mechón de pelo. 2. Incorporación desde el sudor y las secreciones sebáceas que bañan el pelo durante su formación. Debido a que el pelo es muy poroso, este puede aumentar hasta un 18% de su peso al absorber líquidos y, por tanto, las sustancias presentes en el sudor y en las secreciones sebáceas pueden ser transferidas hacia el pelo y retenidas en él. La fracción libre y no ionizada de las drogas difunde desde la sangre al sudor. La diferencia de pH existente entre el sudor y la sangre (5,8 y 7,4 respectivamente), favorece la difusión pasiva de las moléculas básicas no ionizadas desde la sangre hacia el sudor dónde se ionizan, impidiendo su difusión de nuevo hacia la sangre [57]. La gran variabilidad interindividual en la producción de estas dos secreciones puede explicar la gran dispersión de concentraciones encontradas en individuos que han recibido la misma dosis, así como la dispersión de las drogas por una larga zona del tallo piloso, que no se corresponde con las dosis y tiempos administrados [40]. Sin embargo, como estas secreciones se transfieren al pelo cuando éste ya está formando, su 1. Introducción 47 unión suele ser más débil y, por tanto, pueden eliminarse (al menos en parte) en los procesos de lavado previos a la realización de los análisis. Los distintos lavados realizados en los diferentes laboratorios pueden explicar las diferencias encontradas cuando se realiza una comparación de resultados inter-laboratorio. 3. Exposición pasiva a las drogas que se encuentran en el ambiente. Esta exposición puede llevarse a cabo a través de la suspensión de las drogas en el ambiente, del humo producido al fumarlas, del contacto con las manos contaminadas, etc. Como el pelo es una matriz porosa, si se ve expuesto a ambientes con elevadas concentraciones de contaminantes, éstos pueden incorporarse a sus capas más externas. Esta exposición no indica consumo activo, y es por ello que las proporciones entre los compuestos y sus metabolitos suelen presentar unos valores diferentes a los encontrados en aquellos casos en los que si se produce dicho consumo activo y, por tanto, si ha existido incorporación desde la sangre [55]. Esta exposición también debe ser eliminada (al igual que el sudor y las secreciones sebáceas) mediante la realización de procedimientos de lavado previos a la realización de los análisis, para minimizar su aportación y evitar resultados falsos positivos. La disposición de las drogas incorporadas al pelo dependerá, por lo tanto, de una combinación entre la velocidad a la que crece y el tiempo que permanece cada folículo en cada una de las fases del ciclo de crecimiento. Estos dos factores varían, a su vez, en función de diferencias interindividuales como la raza, el sexo y la edad, del tipo de pelo del que se trata y de la localización anatómica del mismo. Debido a esta gran variabilidad, el pelo de la región del vértex posterior fue seleccionado como el indicado para la realización de los análisis de drogas, ya que en esta zona la cantidad de folículos en fase anágena es mayor y el ratio de crecimiento es más estable. Diferentes estudios han observado que la velocidad de crecimiento en esta zona varía entre 0,6 a 1,4 cm al mes; y aproximadamente el 85% del pelo se encuentra en fase 1.2. El pelo como matriz biológica 48 anágena, mientras que 15% restante está en una de los otras dos fases [4358]. Como simplificación, se estableció que la velocidad de crecimiento del pelo en esta región es de 1 cm al mes [46]. FIGURA 3. Modelo de incorporación de las drogas al pelo mediante tres mecanismos: incorporación a través de la sangre que nutre la papila dérmica, incorporación a través del sudor y del sebo que bañan la fibra capilar e incorporación a través de la exposición pasiva al ambiente (polvos, vapores o humos con drogas). Modificado de Kronstrand et al. [55]. 1. Introducción 49 Estabilidad de las drogas y fármacos incorporados al pelo Las sustancias incorporadas al interior del pelo desde los capilares que irrigan la papila dérmica permanecen en su interior de forma estable y permanente. Por ello, el tiempo durante el cual estas sustancias pueden ser detectadas en pelo está sólo limitado por la propia longitud disponible de pelo para la realización del análisis. Prueba de esta estabilidad es el hallazgo de compuestos como la cocaína y la nicotina en los restos de pelo conservados en varias momias egipcias y precolombinas (de hasta 3000 años de antigüedad) [59-62]. Aunque puede afirmarse que las condiciones normales de higiene, como los lavados diarios con champú, no interfieren en la estabilidad de las drogas incorporadas al pelo en el momento de su formación ni en su eliminación [63]; se ha observado que las concentraciones encontradas a lo largo de un mechón de pelo disminuyen ligeramente al aumentar la longitud del pelo, es decir, al aumentar su edad. Por ejemplo, al analizar varios segmentos consecutivos del pelo de un mismo individuo con un tratamiento crónico pautado a dosis constante, puede apreciarse como las concentraciones halladas en los sucesivos segmentos disminuyen ligeramente al aumentar la distancia desde la raíz, es decir, al aumentar el tiempo que ha transcurrido desde la formación y, por tanto, desde la incorporación de las drogas al pelo [44]. Este fenómeno se produce, fundamentalmente, porque con el paso del tiempo la cutícula se vuelve más susceptible a los daños mecánicos que actúan sobre ella, lo que finalmente origina un aumento en su permeabilidad, y por tanto, los compuestos son más fácilmente eliminados del interior de la fibra capilar. Otro fenómeno que debe tenerse en cuenta al analizar cabellos de gran longitud, y por tanto, que han sufrido numerosas agresiones externas desde su formación, es que pueden haberse modificado las relaciones entre las concentraciones de la droga y las de sus metabolitos. Este cambio en las proporciones se relaciona con que los compuestos más polares son eliminados más lentamente del interior del pelo que los menos polares, y la proporción metabolito/droga puede verse aumentada al incrementarse el tiempo de permanencia de los compuestos polares en el pelo. Además, aquellos 1.2. El pelo como matriz biológica 50 metabolitos que pueden ser formados por hidrólisis química (como la benzoilecgonina en el caso de la cocaína, y la 6-monoacetilmorfina en el caso de la heroína) pueden seguir produciéndose una vez incorporadas las sustancias al pelo por degradación hidrolítica del compuesto inicial [44]. Aunque todas estas modificaciones en el contenido y relación de las drogas y sus metabolitos deben tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados analíticos cuando se analizan mechones muy largos, en la práctica son poco significativas. Existen ciertos tratamientos cosméticos y ciertas agresiones externas prolongadas que dañan la estructura de la matriz del pelo de manera mucho más significativa que los procesos descritos anteriormente, debido a que alteran la estructura más internamente, e incluso afectan al contenido de pigmento del interior de la fibra. Por ello, pueden causar una pérdida mayor en el contenido de las drogas incorporadas en su interior que sí modifica sustancialmente los resultados cuantitativos obtenidos en la determinación analítica. Las exposiciones prolongadas a los fenómenos atmosféricos, como pueden ser la radiación solar, la lluvia, el viento, el agua o la contaminación atmosférica, pueden causar un daño en la cutícula y una alteración en la concentración de los pigmentos del interior del pelo y, por tanto, en las concentraciones de drogas o fármacos de su interior unidos a ellos [44]. No obstante, este efecto es mucho más significativo en aquellos pelos que han sido tratados previamente con tratamientos cosméticos agresivos como tintes, mechas o permanentes, ya que éstos degradan en mayor medida la matriz del pelo [43]. Las bases fuertes que se usan en los tratamientos cosméticos producen un elevado daño en la matriz del pelo que puede originar tanto una pérdida de las drogas que previamente habían sido incorporadas al interior del pelo a través de la sangre, como una posible incorporación hacia el interior del pelo en los cabellos expuestos a una contaminación externa ambiental. El objetivo de la realización de tintes o mechas en un cabello es lograr la degradación total o parcial del pigmento del pelo para lograr una variación en la coloración natural. Habitualmente, los productos utilizados para la realización 1. Introducción 51 de estos tratamientos contienen peróxido de hidrógeno (H2O2), agente básico que actúa sobre las escamas de la cutícula, separándolas, para favorecer la entrada de los demás elementos de la composición del producto. Las concentraciones de H2O2 varían dependiendo del tratamiento, siendo menores en los tintes que en las aplicaciones de mechas, pero pudiendo llegar a contener hasta un 12% de este compuesto en la fórmula aplicada al cabello. Además, como el H2O2 es un potente oxidante, no sólo actúa sobre la cutícula, sino que también ataca al pigmento contenido en el interior del pelo, eliminándolo en parte para lograr la decoloración deseada. En el caso de los tintes, los pigmentos naturales son sustituidos por pigmentos exógenos que colorean nuevamente el cabello del tono deseado. Todo este proceso agresivo afecta y altera la estructura y estabilidad de la fibra de pelo [64]. En el caso de los tratamientos cosméticos conocidos como permanentes, lo que se busca es una modificación de la estructura del pelo para obtener una nueva apariencia. Estos tratamientos se basan en la rotura de los puentes disulfuro, para luego restaurarlos en una nueva posición y lograr la nueva forma deseada. La rotura de los puentes se realiza con mercaptanos y la neutralización posterior con H2O2 al 2%. En este caso también se usan componentes muy reactivos que afectan a la estructura y composición del pelo y, por tanto, a la cantidad de drogas incorporadas en el mismo [65]. En general, las mechas causan un mayor descenso en las concentraciones que los tintes, seguramente porque son un tratamiento mucho más agresivo y ocasionan un mayor daño en el pelo. Se han encontrado disminuciones del 40 al 60% entre las porciones de pelo tratadas cosméticamente (tinte o mechas) con respecto a las que no lo fueron, en pelos de adictos a opiáceos, cocaína, cannabis y nicotina [64]. En otros trabajos donde se analizaron cabellos de adictos a opiáceos y cocaína, las disminuciones encontradas fueron mayores (65-80%), probablemente debido a que el tratamiento empleado para la decoloración fue más agresivo [66,67]. Las disminuciones en las concentraciones encontradas en el pelo tras la aplicación de un tratamiento cosmético han sido sistemáticamente recogidas por diversos autores [64,66-77]. Además de las disminuciones en el contenido, también pueden producirse cambios en las relaciones entre las drogas y sus metabolitos debido, 1.2. El pelo como matriz biológica 52 fundamentalmente, al uso de bases fuertes que pueden hidrolizarlas [65]. Por tanto, puede decirse que más que el tipo de tratamiento cosmético en sí, lo que origina un cambio en las concentraciones de las drogas del interior del pelo es el grado de daño que ha sufrido la fibra de pelo con la realización de ese tratamiento cosmético. Además del daño en la fibra, debe tenerse en cuenta también que se ha perdido parte o la totalidad de la melanina contenida en dicha fibra y, por ello, los compuestos que se encontraban unidos a ella probablemente han sido también eliminados [64]. 1.2.3. Protocolos generales de análisis En el año 2012 la Society of Hair Testing (SoHT) estableció una guía de buenas prácticas para aquellos laboratorios que realizasen análisis toxicológicos de pelo [78]. Ya con anterioridad la propia SoHT, así como varios autores, habían publicado artículos y guías con sugerencias sobre el correcto tratamiento de las muestras de pelo y diversas consideraciones sobre su análisis [44,79-81]. La necesidad de estas guías se debe a que el análisis de una muestra de pelo requiere, a diferencia de otras matrices biológicas, un proceso de pretratamiento de la muestra muy complejo, incluyendo una correcta toma de muestra, una serie de medidas destinadas a la minimización de la posible contaminación externa, una adecuada extracción de los analitos incorporados en la matriz sólida y el uso de métodos instrumentales suficientemente sensibles para conseguir detectar y cuantificar correctamente las bajas concentraciones de analitos encontradas en esta matriz. Previamente a la realización propiamente dicha del análisis del pelo, es necesario realizar un estudio del caso y una correcta documentación del mismo. Deben, por tanto, registrarse las posibles sustancias que se han consumido, el tipo de pelo disponible para el análisis, la fecha del posible consumo y la fecha de recogida de la muestra, la longitud del mechón, color, tratamientos cosméticos realizados, y cualquier otro tipo de información que se considere de relevancia para el caso. Con estos datos deben estudiarse las diferentes opciones disponibles entre las que figuran: decidir que tipo o tipos de análisis deben realizarse, el pelo de elección que debe recogerse (en caso de 1. Introducción 53 que el cabello no esté disponible pueden utilizarse el pelo del pubis, axila, pecho, brazos, piernas, barba, etc), la cantidad mínima de pelo necesaria para realizar todos los análisis necesarios, la necesidad de segmentar el pelo para estudiar el patrón cronológico de consumo, etc [44]. De forma genérica, los pasos necesarios para el análisis toxicológico del pelo son: 1. Recogida de la muestra y almacenamiento. 2. Segmentación del mechón. 3. Eliminación de la contaminación externa. 4. Extracción de los analitos de la matriz. 5. Procesos de purificación. 6. Análisis instrumental. 1.2.3.1. Recogida de la muestra y almacenamiento La recogida de muestras de pelo puede realizarse de diferentes regiones anatómicas como el cuero cabelludo, pubis, axila, o cualquier otra zona corporal con pelo. Sin embargo, siempre que esté disponible, se seleccionará preferentemente el cabello como la muestra de elección para el análisis rutinario de drogas, alcohol o medicamentos. La recogida del cabello debe realizarse en la parte posterior de la cabeza conocida como vértex posterior, debido a que es en esta zona donde existe menor variabilidad tanto entre el ratio de crecimiento de los folículos pilosos (con un 85% en fase anágena) como por razones de edad o sexo, y por tanto, la muestra obtenida en esta zona es más reproducible [44]. Cuando se analiza el pelo procedente de otras regiones anatómicas debe tenerse en cuenta que el ratio de crecimiento es diferente al ratio aplicado en la interpretación de los casos de cabello (1 cm/mes). Asimismo, las concentraciones encontradas y la relación entre sus metabolitos podrán también ser diferentes, y por ello, los cut-offs empleados serán distintos a los empleados en cabello [78]. Además, debe tenerse en cuenta durante la toma de muestra que cuando se recoge pelo de zonas íntimas, como el pubis, es 1.2. El pelo como matriz biológica 54 necesario garantizar la privacidad del donante, mientras se asegura la integridad del proceso de toma de muestra manteniendo la cadena de custodia. La toma de muestra debe ser preferentemente realizada por personal especializado, en una instalación libre de sustancias contaminantes y usando guantes durante toda la manipulación de la muestra, para evitar la contaminación de ésta. Sin embargo, es posible que en casos excepcionales personal no cualificado realice la toma de muestra, siempre y cuando siga un protocolo escrito de recolección donde se indiquen detalladamente los pasos a seguir. La cantidad de pelo recogida debe ajustarse al número de determinaciones toxicológicas requeridas y a la cantidad de pelo necesario para cada metodología analítica. En general, se recomienda un mechón del diámetro de un lápiz [22,44,78-81]. Para ello, es necesario fijar el mechón con una goma o un hilo, marcando de este modo la zona del mechón más próxima a la cabeza y alineando las fibras del pelo. El mechón debe ser cortado lo más cerca posible al cuero cabelludo. Cuando se desea realizar el análisis por segmentos, por ejemplo, para realizar un estudio del patrón cronológico de consumo, debe tenerse en cuenta que podrá ser necesario recoger un mechón de mayor grosor. En caso de que fuera necesario, es posible recoger varios mechones de un mismo individuo para tener una muestra gemelar de la muestra analizada. En aquellos casos donde la cantidad de pelo disponible sea limitada, el pelo sea muy fino o no se quiera dejar calvas evidentes en la cabeza de una persona, es posible y está aceptado el recoger pequeños mechones de múltiples localizaciones en la zona del vértex posterior [78]. Como ocurre con cualquier otra muestra toxicológica, la muestra recogida debe ser identificada de forma inequívoca y la cadena de custodia debe mantenerse durante todo el proceso. El pelo no requiere condiciones especiales de almacenamiento. Las muestras deben ser conservadas a temperatura ambiente, introducidas simplemente en un sobre de papel, en papel de aluminio, o bien en un tubo de cristal o plástico. Es aconsejable almacenarlas en un lugar seco y oscuro, evitando la luz directa del sol, y no es recomendable guardarlas en la nevera o el congelador. 1. Introducción 55 Existen ciertas recomendaciones especiales para la toma de muestra en casos postmortem y casos de sumisión química. Para los casos postmortem es aconsejable que la recogida del cabello se realice al comienzo de la autopsia y que se tomen dos mechones de cabello, uno arrancado de raíz y otro cortado, para obtener también la información sobre las drogas consumidas más próximas a la muerte del individuo. En los casos de sumisión química, es necesario que la toma de muestra se realice como mínimo unas 4-6 semanas después del incidente de sumisión, de modo que las posibles sustancias que se hayan podido incorporar a la fibra capilar en formación en el momento del incidente sean ya detectadas en el cabello recogido. También es aconsejable que la persona víctima de sumisión química no se realice ningún tratamiento cosmético o se corte el pelo antes de que las investigaciones toxicológicas concluyan. Por último, es recomendable recoger una segunda muestra de cabello y analizarla cuando los resultados de la primera son positivos, para corroborar el resultado del primer análisis [78]. 1.2.3.2. Segmentación del mechón La segmentación del mechón de pelo permite realizar un estudio del patrón cronológico de consumo, para obtener información sobre el uso de las sustancias a lo largo del tiempo. Sin embargo, no en todos los casos es necesario realizar la segmentación del mechón de pelo, bien porque la naturaleza del caso a estudio no lo aconseja o bien porque el cabello es muy corto (menor a 1 cm). La segmentación del cabello se basa en la admisión de dos premisas: el ratio de crecimiento medio del cabello de un individuo es de 1 cm/mes, y la toma de muestra se realiza cortando el pelo lo más próximo posible al cuero cabelludo [82]. Por ello, deben seguirse una serie de recomendaciones durante la toma de muestra y durante el propio proceso de segmentación para realizarla de manera adecuada. Durante la toma de muestra es fundamental evitar que las fibras de pelo se desalineen durante el corte. Cuando el mechón de pelo se sujeta para ser 1.2. El pelo como matriz biológica 62 TABLA 2. Concentraciones (ng/mg) establecidas como cut-offs por la Society of Hair Testing en 2012 para consumo crónico de las principales drogas de abuso en pelo [78]. Grupo Compuesto Metodología Screening Metodología Confirmación Cut-off (ng/mg) Cut-off (ng/mg) Anfetaminas Anfetamina 0,2 0,2 Metanfetamina 0,2 MDA 0,2 MDMA 0,2 Cannabinoides THC 0,1 0,05 THCCOOH - 0,0002 Cocaínicos Cocaína 0,5 0,5 BE, EME, CEt, NC - 0,05 Opiáceos Morfina 0,2 0,2 Codeína 0,2 6-AM 0,2 Metadona Metadona 0,2 0,2 EDDP - 0,05 Buprenorfina Buprenorfina 0,01 0,01 Norbuprenorfina - 0,01 BE: benzoilecgonina; CEt: cocaetileno; EDDP: 2-ethylidene-1,5-dimethyl-3,3diphenylpyrrolidine; EME: ecgoninametiléster; MDA: metilendioxianfetamina; MDMA: metilendioximetanfetamina; NC: norcocaína; THC: 9-tetrahidrocannabinol; THCCOOH: carboxi-THC; 6-AM: 6-monoacetilmorfina. 1.2.3.4. Extracción de los analitos de la matriz El pelo es una matriz sólida y, debido a ello, las drogas que han sido incorporadas desde la sangre hacia su interior se encuentran firmemente unidas a las proteínas, a la melanina y/o a los lípidos que forman su estructura. Por ello es necesario realizar previamente al análisis un procedimiento de 1. Introducción 63 extracción de estos analitos de la matriz sólida, que libere las drogas y permita su análisis. La eficacia de esta extracción dependerá de diversos factores como son: el estado de conservación de la matriz, la estructura química de los analitos, la polaridad del disolvente empleado, y la duración y forma de extracción [107]. El proceso de extracción incluye un primer paso de homogenización de la muestra y un segundo paso de extracción mediante la solubilización los analitos con un disolvente que penetre en el interior de la fibra pilosa, o mediante la digestión de la matriz del pelo [44]. La homogenización puede efectuarse mediante el corte del pelo en pequeños fragmentos de 1-3 mm o por pulverización del mismo hasta obtener un polvo fino. Estas acciones aumentan la superficie de contacto entre el pelo y el disolvente usado en la extracción de los analitos y, por tanto, maximizan la extracción de los mismos. Durante este proceso se suele perder una pequeña cantidad del pelo, que dependerá de la habilidad del operario así como de las características del pelo (se perderá más cantidad de pelo en caso de que presente mucha electricidad estática). En general, al pulverizar se pierde mucho menos pelo y la superficie de contacto entre el pelo y el disolvente es mucho mayor, por tanto, la cantidad de compuesto extraído también será mayor. No obstante, también pueden extraerse más sustancias interferentes del interior del pelo y, consecuentemente, disminuir la relación señal/ruido analítica. Varias publicaciones han recomendado la pulverización del pelo como el sistema con mayor recuperación en comparación con aquellas técnicas que emplean el pelo sólo cortado [108-110]. Una vez homogeneizado el pelo, se realiza la extracción por solubilización o digestión. Se ha observado que la completa digestión de la matriz permite obtener una mejor recuperación de los analitos [110], pero las técnicas empleadas para ello suelen ser más agresivas y los extractos obtenidos tienen más impurezas e interferentes. Para la elección entre uno u otro sistema, deben tenerse en cuenta una serie de parámetros fisicoquímicos tanto de las propias sustancias a extraer (estructura de las moléculas) como de los disolventes empleados para ello (polaridad). Se debe tratar de maximizar la cantidad de droga extraída del pelo, manteniendo su estabilidad química, y la de sus metabolitos [44,111]. Asimismo, debe optimizarse el tiempo empleado 1.2. El pelo como matriz biológica 64 en dicho proceso para lograr la máxima extracción en el mínimo tiempo posible. También debe tenerse en consideración que, en aquellos métodos analíticos en los que se pretendan determinar un amplio número de sustancias con diferente naturaleza química, será necesario alcanzar un compromiso entre las características óptimas de extracción de cada uno de los analitos y el procedimiento de extracción seleccionado, para maximizar la extracción sin afectar a la estabilidad química de los compuestos. La extracción de los analitos suelen hacerse con: - Disolventes orgánicos: la extracción con este tipo de disolventes es compatible con la mayoría de sustancias, ya que el disolvente penetra en el interior del pelo y los compuestos son extraídos hacia el exterior por difusión. La alta compatibilidad de los disolventes orgánicos con sustancias químicamente muy diversas permite su uso en la extracción en métodos multianalito. Debido a esta alta inespecificidad, los extractos obtenidos suelen ser muy “sucios” y requieren otros procesos de purificación posteriores. Debe tenerse en cuenta que la recuperación obtenida mediante estos disolventes suele ser incompleta y menor que la obtenida por otros medios. Podemos encontrar numerosos trabajos que emplean disolventes orgánicos en la extracción de drogas y fármacos [112-122]. - Tampones ácidos: su uso favorece la extracción de compuestos básicos, tales como cocaína, metadona, opiáceos, anfetaminas y algunos fármacos [123-126]. Se utilizan fundamentalmente disoluciones acuosas de ácido clorhídrico (0,01-0,5 M) o disoluciones de tampón fosfato (pH 6,4-7,6) [127]. La principal ventaja del empleo de este tipo de disoluciones ácidas frente a los disolventes orgánicos es que el extracto obtenido es mucho más limpio y, por tanto, con menos interferentes a nivel analítico. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el empleo de este tipo de disoluciones conlleva la hidrólisis parcial de la cocaína en su metabolito BE, así como la hidrólisis de la 6-AM en morfina. 1. Introducción 65 - Tampones básicos: este tipo de disoluciones a pH básico (generalmente disoluciones acuosas de NaOH) permiten la completa digestión de la matriz sólida del pelo. Esto permite obtener una mayor recuperación de la extracción, pero no todas las sustancias son estables a pH básicos, ya que por ejemplo, la cocaína se hidroliza espontánea y completamente a BE bajo estas condiciones [127]. Por tanto, su aplicabilidad se ve reducida a sustancias como las anfetaminas [128,129], THC y metabolitos [130,131], nicotina y metabolitos [132-134] y fármacos como anabolizantes [135] y antidepresivos [136]. - Digestión enzimática: se emplean enzimas que permiten la rotura de los puentes de hidrógeno y los puentes disulfuro, como pueden ser –glucuronidasa, la pronasa o la proteinasa K, que liberan las sustancias retenidas en dichas estructuras. Se ha empleado este tipo de digestión tanto para la determinación de drogas [137-139] como de fármacos [140] en pelo, ya que su uso es adecuado para todo tipo de sustancias. Como inconveniente cabe destacar su elevado coste y que pueden desnaturalizar (bajo ciertas condiciones) los anticuerpos empleados en la determinación de los compuestos por técnicas de inmunoensayo [141]. La solubilización o la digestión del pelo suele realizarse acompañada de una incubación con calor de los extractos o bien de una extracción con ultrasonidos. La incubación con calor causa una mayor solubilización de los compuestos en el disolvente y la ultrasonicación causa una alta degradación de la estructura del pelo y por ello, favorecen el proceso de extracción. Asimismo, se ha observado que no todos los disolventes orgánicos penetran de igual modo que las disoluciones acuosas en el interior de la fibra pilosa. La extracción utilizando metanol como disolvente orgánico (acompañada de ultrasonicación o no) ha demostrado que permite una solubilización de las moléculas, con una recuperación similar a la obtenida con las disoluciones acuosas [110]. 1.2. El pelo como matriz biológica 66 Un error común durante el desarrollo de un procedimiento de extracción de los analitos de la matriz es el uso de un tiempo de extracción demasiado corto que no permita la total recuperación de las sustancias presentes en la muestra de pelo, especialmente en el caso de la solubilización de los analitos con disolventes orgánicos. Musshoff et al. [127] observaron que los compuestos menos polares (heroína y 6-AM) eran extraídos más rápido que los compuestos más polares (morfina y codeína) (Figura 4). Debido a esto, es aconsejable realizar siempre las pruebas de extracción con muestras de pelo de consumidores, y también es recomendable utilizar como control, una vez desarrollado el método, y debido a las variaciones individuales, una segunda extracción de la muestra que se está analizando, utilizando el mismo procedimiento para comprobar la total recuperación de los analitos de la matriz. FIGURA 4. Porcentaje de recuperación de opiáceos extraídos en un cabello sometido a una extracción con metanol y baño de ultrasonidos a 50ºC a diferentes tiempos (modificado de Musshoff et al. [127]). 1.2.3.5. Procesos de purificación Debido a que el pelo es una matriz compleja, los extractos obtenidos después de la extracción de los analitos de la matriz del pelo deben ser sometidos a un proceso de purificación que elimine los interferentes y concentre las sustancias para su posterior análisis. Aunque es posible encontrar en la bibliografía algunos trabajos en los que el extracto metanólico 1. Introducción 67 es directamente inyectado en el cromatógrafo de líquidos acoplado a espectrometría de masas en tándem (LC-MSMS) o el cromatógrafo de gases acoplado a espectrometría de masas en tándem (GC-MSMS) [113,142-144], en general, es recomendable hacer un paso previo de limpieza y concentración de los compuestos para eliminar impurezas e interferentes. El proceso de purificación al que se someten los extractos es similar al que se emplea para la determinación de drogas en sangre u orina. Los métodos más empleadas para este fin son la extracción líquido-líquido (LLE) y la extracción en fase sólida (SPE). La selectividad del proceso de purificación afecta al resultado final del análisis, ya que una técnica selectiva proporciona extractos más limpios, aumentando la detectabilidad de los compuestos. Asimismo, es importante que estas técnicas proporcionen una buena recuperación de los analitos de interés y una baja recuperación de sus interferentes y, por lo tanto, se debe encontrar una solución de compromiso entre la selectividad y la intensidad de la limpieza del procedimiento. Generalmente, los métodos SPE son los más usados debido a que producen extractos más limpios, tienen una mayor selectividad y reproducibilidad, y evitan la formación de emulsiones, comparados con los métodos de LLE [145]. Además, las extracciones con técnicas SPE permiten su automatización. Sin embargo, como desventaja cabe destacar que los cartuchos de extracción empleados en SPE encarecen el análisis. Wada et al. [146] y Vogliardi et al. [147] publicaron en 2010 y 2015, respectivamente, extensas revisiones bibliográficas con los principales métodos de extracción empleados para los diferentes tipos de sustancias. También es posible encontrar publicaciones que emplean otro tipo de técnicas para la purificación de los extractos, como pueden ser la microextracción en fase sólida (SPME) y la impresión molecular polimérica (MIP). La SPME fue inventada por Zang et al. [148], y admite su acoplamiento directo con un GCMSMS. Esta técnica permite la miniaturización y automatización de la extracción, así como la preconcentración y purificación de los compuestos en un solo paso. La SPME emplea una fibra de sílice fundida y recubierta por una fase estacionaria polimérica, que se introduce en un vial de espacio de cabeza 1.2. El pelo como matriz biológica 68 donde se encuentra la muestra a analizar. Los compuestos forman un equilibrio entre la muestra, la fase de vapor y la fibra de sílice y, bajo unas determinadas condiciones de tiempo y temperatura, los compuestos en la fase de vapor son adsorbidos a la fibra de sílice. Posteriormente, las altas temperaturas del propio GC producen la desorción de los mismos [149]. Se han publicado diversos trabajos para la detección de cannabinoides, metadona, anfetaminas, y otras drogas y medicamentos empleando esta técnica [149-157]. La técnica MIP permite una extracción selectiva de los compuestos de interés, a diferencia de la purificación con SPE, que se basa en interacciones no selectivas y, por tanto, se produce la co-extracción de sustancias interferentes junto con los analitos de interés. Esta técnica se basa en el desarrollo de materiales poliméricos que poseen cavidades de unión con un tamaño, forma y funcionalidad complementarias a la molécula de interés o molécula plantilla, actuando, por tanto, como anticuerpos sintéticos [158]. En los últimos años se han desarrollado metodologías para la determinación de cocaína y sus metabolitos [159], ketamina y norketamina [160], LSD [161], nicotina [162] y diazepam [163] en pelo empleando como técnica de purificación la extracción con MIP. 1.2.3.6. Análisis instrumental El análisis de pelo requiere el empleo de técnicas instrumentales que permitan determinar las sustancias de manera inequívoca, cuantificarlas con una adecuada precisión y exactitud, y con suficiente sensibilidad para alcanzar concentraciones en el rango de los picogramo por miligramo de pelo. Por ello, las dos metodologías de elección en el análisis cuantitativo de pelo son la cromatografía de gases acoplada a un espectrómetro de masas y la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas en tándem. Sin embargo, es frecuente el uso de técnicas inmunoquímicas como método de barrido o screening. Las técnicas inmunoquímicas que se basan en la reacción entre un antígeno (el compuesto a determinar) y un anticuerpo, permiten un análisis rápido y a bajo coste de un gran número de muestras. Sin embargo, presentan una 1. Introducción 69 sensibilidad y especificidad limitadas, que reducen su campo de aplicación al screening toxicológico, y requieren siempre una confirmación de los resultados positivos por técnicas con mayor especificidad como GC-MS o LC-MSMS. El primer análisis de pelo se realizó empleando la técnica inmunoquímica de radioinmunoensayo o RIA [23], pero en los últimos años se han desarrollado otro tipo de ensayos inmunoquímicos como ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas) o FPIA (inmunoensayo de polarización fluorescente) [164-172]. La mayoría de los métodos utilizados en el análisis del pelo emplean la espectrometría de masas como sistema de detección, ya que presenta un alto grado de sensibilidad y fiabilidad. La detección se realiza mediante la relación masa/carga de los compuestos, lo que convierte a este detector en un identificador prácticamente inequívoco de las moléculas. El acoplamiento de esta técnica de detección a la cromatografía de gases se produjo a finales de los años 50 del siglo pasado [173]. GC-MS es una técnica robusta, sensible y selectiva, utilizada de forma rutinaria en los laboratorios de Toxicología. La fragmentación de los compuestos utilizando impacto electrónico como sistema de ionización, produce espectros de masas característicos de los compuestos, permitiendo la creación de librerías y la realización de screening sistemático [174]. Sin embargo, las sustancias poco volátiles o con baja estabilidad térmica presentan serias dificultades para su análisis mediante esta técnica, y requieren procedimientos de derivatización para mejorar sus características cromatográficas, proporcionarles mayor volatilidad y estabilidad térmica, así como incrementar la especificidad del espectro de masas. El empleo de la técnica de LC-MSMS es una alternativa para compuestos polares y termolábiles, sin el paso previo de la derivatización, siendo por tanto un análisis más rápido y barato. Las aplicaciones de la LC-MSMS en la Toxicología Forense han sido múltiples, desde anfetaminas, cocaína, THC, opiáceos, LSD, benzodiazepinas, neurolépticos, etc, tanto para la identificación como la cuantificación de estas sustancias [90,115,116,121,125,129,140,159,175,176]. Además, en los últimos años los avances técnicos han permitido el empleo de LC-MSMS para la realización del screening toxicológico [177]. Como inconveniente, cabe destacar el alto precio de los equipos empleados de LC- 1.2. El pelo como matriz biológica 70 MSMS, por lo que no están disponibles en todos los laboratorios de Toxicología. 1. Introducción 71 1.3. APLICACIONES DEL ANÁLISIS DE PELO EN EL ÁMBITO DE LA TOXICOLOGÍA CLÍNICA Y FORENSE El análisis de pelo es una importante herramienta en el campo de la Toxicología, tanto clínica como forense, debido a sus características diferenciadoras en relación con las demás muestras disponibles, como orina, sangre, fluido oral, sudor, meconio, etc. Como se indicó previamente, las drogas o medicamentos incorporados en la estructura del pelo permanecen en su interior inalterados durante un largo periodo de tiempo y, por ello, la ventana de detección empleando esta matriz se amplía en gran medida. Esto permite un estudio retrospectivo del historial de consumo de drogas y medicamentos. En los últimos años, se han ido incrementando los campos en los que es posible aplicar el análisis de pelo para obtener información que con las matrices biológicas tradicionales no sería posible conseguir. El análisis de pelo puede realizarse mediante segmentación o no del mechón a estudio. Sin segmentación de la muestra puede establecerse si un individuo ha consumido o no durante el periodo de tiempo correspondiente con la longitud del mechón analizado, pero no el perfil cronológico de dicho consumo. La cronicidad del consumo se determina empleando los criterios de cut-off establecidos por la SoHT [78], en función de las concentraciones encontradas. Si los valores de concentración son superiores a dicho cut-off se determina un consumo crónico y si son inferiores, puede establecerse un consumo esporádico. La monitorización del consumo de drogas utilizando pelo es mucho más sencilla que empleando las matrices biológicas tradicionales (sangre y/u orina), ya que en el caso del pelo sólo se requiere una toma de muestra y un análisis, mientras que en el caso de la sangre y de la orina deben tomarse 2-3 muestras por semana. Las matrices tradicionales presentan una menor ventana de detección que el pelo y, por ello, los consumos esporádicos (consumos con días de abstinencia entre los mismos) pueden proporcionar resultados negativos en los controles. La segmentación del mechón proporciona mayor información sobre el perfil de consumo. El análisis por segmentos implica efectuar una toma de muestra adecuada, siguiendo los criterios previamente señalados para ello, resaltando 1.3. Aplicaciones del análisis de pelo 78 segmentos consecutivos analizados, podrá establecerse una falta de adherencia al tratamiento. 1. Introducción 79 BIBLIOGRAFÍA [1] United Nations Office on Drugs and Crime. 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A estas sustancias de abuso clásicas se han unido en los últimos años nuevas drogas cuyo consumo y distribución no están regulados, pero que presentan efectos psicoactivos similares a los de las drogas tradicionales, por lo que son empleados como sustitutos “legales” de las mismas. También es bien conocido y frecuente el patrón de policonsumo entre los usuarios de sustancias de abuso, con el consiguiente consumo de varias de estas sustancias psicoactivas de forma simultánea durante el mismo periodo de tiempo. Todo ello genera la necesidad de disponer de métodos analíticos multianalito sensibles y específicos en los laboratorios de Toxicología que permitan la determinación de las principales drogas y fármacos de abuso tradicionales, pero también de estas sustancias emergentes, en las distintas matrices biológicas. La utilización de las matrices biológicas alternativas ha aumentado considerablemente en los últimos años, ya que permiten complementar la información obtenida con el análisis de las matrices biológicas tradicionales (sangre y orina) al presentar unas ventanas de detección diferentes a las de estas matrices, y además posibilitan una toma de muestra menos invasiva y más sencilla. Entre las matrices alternativas destaca el pelo como una de las más utilizadas en el ámbito de la Toxicología Clínica y Forense, ya que permite realizar un estudio retrospectivo del consumo gracias a su amplia ventana de detección, de meses o incluso años. Asimismo, esta matriz biológica permite establecer el perfil cronológico de consumo mediante la segmentación de la muestra de pelo. Otras ventajas de la misma son su toma de muestra no invasiva, que no necesita ser realizada por personal sanitario, y que tampoco requiere medidas especiales para su almacenamiento y conservación. Sin embargo, los métodos analíticos necesarios para determinar drogas de abuso y fármacos en pelo deben ser lo suficientemente sensibles para detectar las bajas concentraciones de estas sustancias y sus metabolitos, generalmente del orden de los pg/mg. 2. Justificación y Objetivos 102 En los últimos años se ha incrementado el uso del pelo en numerosos ámbitos, ya previamente destacados en la Introducción. Sin embargo, el análisis de muestras de pelo requiere de unas consideraciones especiales que afectan a todo el proceso, incluyendo la toma de muestra, la segmentación del mechón, la eliminación de la contaminación externa o la extracción de los analitos de la matriz sólida. Todas estas etapas son críticas para la obtención de unos resultados analíticos válidos y una correcta interpretación de los mismos. Teniendo en cuenta todo lo anterior, los objetivos de esta Tesis Doctoral han sido los siguientes: 1. Objetivos generales: a. Desarrollar métodos analíticos multianalito que permitan la determinación simultánea de varios grupos de sustancias de interés toxicológico, empleando la misma alícuota de pelo y con una sensibilidad adecuada para, como mínimo, satisfacer los cutoffs recomendados por la SoHT. b. Analizar los factores que influyen en la interpretación de los resultados en pelo. c. Explorar la aplicación del análisis de pelo a la detección de la exposición intraútero a sustancias de abuso, fármacos y alcohol. 2. Objetivos específicos: a. Desarrollar y validar un método de screening y confirmación para la determinación de las principales drogas de abuso (opioides, cocaína y su principal metabolito, cannabis, anfetaminas, LSD y ketamina) y fármacos de uso común (benzodiazepinas, antidepresivos e hipnóticos) mediante LC-MSMS. b. Desarrollar y validar un método de confirmación para la determinación de anfetaminas clásicas (anfetamina, metanfetamina, MDMA y MDA) y drogas emergentes con efectos estimulantes como catinonas y piperazinas sintéticas (metilona, mecedrona, mefedrona, 3,4-metilendioxipirovalerona o MDPV, 4fluorometcatinona, 4-fluorometanfetamina, 1-(3clorofenil)piperazina o mCPP, y 3-trifluorometilfenilpiperazina o 2. Justificación y Objetivos 103 TFMPP), así como los fármacos trazodona y fenazona (para diferenciar consumo lícito de ilícito de mCPP, ya que ambos compuestos producen esta piperazina sintética como metabolito) mediante LC-MSMS c. Evaluar el efecto de la contaminación externa y de los tratamientos cosméticos en la interpretación de resultados de muestras de pelo de casos reales analizados en el periodo de desarrollo de esta Tesis Doctoral. d. Estudiar la utilidad del análisis de cabello materno para detectar la exposición a drogas y fármacos intraútero, en comparación con la entrevista materna, y con el análisis de otras muestras biológicas (meconio, placenta y cordón umbilical). e. Investigar la correlación entre los resultados analíticos de pelo materno con los parámetros clínicos neonatales. 3. Publicaciones 119 ARTÍCULO 2 Hair analysis of amphetamine-type-stimulant (ATS) drugs, including synthetic cathinones and piperazines, by LC-MSMS Elena Lendoiro, Cristian Jiménez-Morigosa, Angelines Cruz, Mario Páramo, Manuel López-Rivadulla, Ana de Castro Drug Testing and Analysis (2015) En revisión ISSN: 1942-7611 3.2. Artículo 2 120 Resumen: Los estimulantes tipo anfetamina (ATS) son el segundo grupo de sustancias ilícitas más consumidas a nivel mundial. Sin embargo, en los últimos años nuevas drogas sintéticas (NPS) con efectos estimulantes han aparecido en el mercado ilegal, las cuáles no pueden ser detectadas con los métodos analíticos tradicionales. Un método de LC-MSMS para la determinación en pelo de ATS clásicos (anfetamina, metanfetamina, 3,4-metilendioximetanfetamina y 3,4-metilendioxianfetamina), catinonas sintéticas (metilona, mecedrona, mefedrona, 3,4-metilendioxipirovalerona, (±)-4-fluorometanfetamina y 4fluorometcatinona), piperazinas sintéticas (1-(3-clorofenil)piperazina y 3trifluorometilfenilpiperazina), y fármacos (trazodona y fenazona) que producen mCPP como metabolito, fue desarrollado y completamente validado. Las muestras de pelo (30 mg) fueron incubadas en metanol ácido (0,1% HCl) y se realizó su extracción por fase sólida empleando cartuchos de modo mixto. La separación cromatográfica fue realizada usando una columna analítica Atlantis T3 (3 µm; 2,1x50 mm), y formiato amónico 2 mM pH 3 y acetonitrilo como fases móviles. El método fue validado, incluyendo selectividad (sin interferencias endógenas ni exógenas); linealidad (2-20 a 2000-4000 pg/mg); límites de detección (0,2 a 5 pg/mg) y cuantificación (2 a 20 pg/mg); exactitud (93,4109,4% de la concentración teórica); imprecisión (%CV<11,6%); recuperación de la extracción (40,5-92,1%); efecto matriz (24,1-227,2%); eficacia total del proceso (9,8-165,7%) y estabilidad en el inyector (-14,5% de pérdida). El método fue aplicado al análisis de 16 muestras de pelo. Se determinó la presencia de anfetamina (n= 7; 69,1-777,1 pg/mg), metanfetamina (n= 3; 120,41538,9 pg/mg), MDA (n= 2; 27,8-135,4 pg/mg) y MDMA (n= 8; 73,4-3654,5 pg/mg). Además, se encontraron 10 resultados positivos para mCPP (341,725008,9 pg/mg); pero en todos los casos también se identificó trazodona (2085,3-567521,7 pg/mg), lo que probó que el consumo de mCPP había presentado un origen lícito. 3. Publicaciones 121 Abstract Amphetamine-type-stimulants (ATS) are the second most commonly used group of illicit drugs worldwide. However, in the last years new psychoactive substances (NPS) with stimulant effects have appeared in the illegal market, which are not detected with traditional analytical methods. An LC-MSMS method for the determination in hair of classical ATS (amphetamine, methamphetamine, 3,4methylenedioxymethamphetamine and 3,4-methylenedioxyamphetamine), synthetic cathinones (methylone, methedrone, mephedrone, 3,4-methylenedioxypyrovalerone, ()-4-fluoromethamphetamine and 4-fluoromethcathinone), synthetic piperazines (1- (3-chlorophenyl)piperazine and 3-trifluoromethylphenylpiperazine), and medicines (trazodone and phenazone) that produce mCPP as metabolite, was developed and fully validated. Hair samples (30mg) were incubated in acid methanol (0.1% HCl) and extracted by a mixed-mode solid phase extraction. Chromatographic separation was performed using an Atlantis T3 (3 µm; 2.1x50 mm) analytical column, and ammonium formate 2 mM pH 3 and acetonitrile as mobile phase. The method was validated, including selectivity (no endogenous or exogenous interferences); linearity (2-20 to 2,000-4,000 pg/mg); limits of detection (0.2 to 5 pg/mg) and quantification (2 to 20 pg/mg); accuracy (93.4-109.4% of target concentration); imprecision (%CV<11.6%); extraction recovery (40.5-92.1%); matrix effect (24.1-227.2%); process efficiency (9.8165.7%) and stability in the autosampler (-14.5% of loss). The method was applied to the analysis of 16 hair samples. Amphetamine (n= 7; 69.1-777.1 pg/mg), methamphetamine (n= 3; 120.4-1,538.9 pg/mg), MDA (n= 2; 27.8-135.4 pg/mg) and MDMA (n= 8; 73.4-3654.5 pg/mg) were found. Moreover, 10 positive results for mCPP were detected (341.7-25,008.9 pg/mg); however, in all cases trazodone identification (2,085.3-567,521.7 pg/mg) probed a licit origin of mCPP. Keywords: hair, amphetamine-type-stimulants, new psychoactive substances, synthetic cathinones, synthetic piperazines. 3.2. Artículo 2 122 1. Introduction Amphetamine-type-stimulants (ATS) include classical drugs of abuse such as amphetamine, methamphetamine, methylenedioxyamphetamine (MDA) and methylenedioxymethamphetamine (MDMA). These substances act as central nervous system stimulants, increasing alertness, physical activity and libido; decreasing appetite and inhibitions; and causing euphoria and/or hallucinations1. ATS are the second most frequently group of illicit drugs used worldwide. However, its use declined globally in 2010-2012, mainly in Western and Central Europe2, in agreement with the progressive popularization of the new psychoactive substances (NPS). NPS were introduced in the drug market in recent years as “legal” substitutes of classical drugs of abuse. In fact, only few of these new substances have been scheduled in some countries in the last years3,4. Among NPS, synthetic cathinones and synthetic piperazines are consumed as an alternative to classical ATS because they mimic their stimulant effects. For example, synthetic piperazines such as 1-(3chlorophenyl)piperazine (mCPP) and 3-trifluoromethylphenylpiperazine (TFMPP) are claimed to act like MDMA; synthetic cathinones such as methylone and mephedrone were described to have stimulant and partly entactogen effects analogous to MDMA; and 3,4-methylenedioxypyrovalerone (MDPV) was reported to have cocaineand amphetamine-like effects5. Hair represents a useful alternative matrix in forensic toxicology as its analysis allows a retrospective evaluation of drug use history, and its collection is easy and noninvasive6,7. This matrix has been used for forensic and clinical analysis of drugs of abuse and medicines in a wide range of situations, such as workplace testing8,9, gestational exposure10-12, drug facilitated sexual assaults13,14, doping control15,16, drug abuse history and withdrawal control17, driving license regranting18,19 or postmortem toxicology20,21. However, limited amount of sample is frequently supplied for testing and, consequently, multianalyte methods are recommended, saving time, costs and amount of specimen required. Moreover, classical ATS and NPS with similar effects could be detected in the same user, due to the long window of detection of hair samples. 3. Publicaciones 123 The aim of this study was to develop and validate a method for the determination of ATS, including classical drugs (amphetamine, methamphetamine, MDMA and MDA) and NPS such as synthetic cathinones (methylone, methedrone, mephedrone, MDPV, 4-fluoromethcathinone (4-FMC) and ()-4-fluoromethamphetamine (4-FMA)), and piperazines (mCPP and TFMPP) in hair using LC-MSMS. Moreover, the medicines trazodone and phenazone were included in the method as they produce mCPP as a metabolite22,23. 2. Materials and Methods 2.1. Chemicals and Reagents Amphetamine, methamphetamine, MDMA, MDA, methylone, methedrone, mephedrone, mCPP, MDPV, TFMPP and trazodone standards at 1 mg/mL, and amphetamine-d5, methamphetamine-d5, MDMA-d5, MDA-d5, methylone-d3, mephedrone-d3, mCPP-d8 and TFMPP-d4 at 0.1 mg/mL in methanol were purchased from Cerilliant™ (Round Rock, TX, USA). Phenazone in solid form was obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), and 4-FMA and 4-FMC in solid form from the National Measurement Institute, Australian Government (Lindfield, Sydney, Australia). Reagent grade formic acid (FA) 98-100%, reagent grade hydrochloric acid (HCl) 37% and reagent grade ammonia solution 32% (v/v) (NH4OH) were from Scharlau (Sentmenat, Spain). Methanol HPLC grade (MeOH), 2-propanol (2-PROP) and reagent grade dichloromethane (DCM) were from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), and LCMS acetonitrile (ACN) from Panreac (Castellar del Vallès, Spain). Water was purified with a Milli-Q water system (Millipore, Le-Mont-sur-Lausanne, Switzerland). Strata X-C cartridges (30 mg, 3 mL) were purchased from Phenomenex (Torrence, CA, USA). 2.2. Preparation of calibrators, quality controls (QC) and internal standard solutions Individual solutions of 4-FMA and 4-FMC were prepared at 1 mg/ml in methanol. A stock solution at 20 g/mL in methanol was generated from the individual standards at 1 mg/mL. Working solutions were prepared by further dilutions in methanol at 6, 0.6, 0.06, 0.006 and 0.0006 g/mL. An eight-point calibration curve (2-4,000 pg/mg) was 3.2. Artículo 2 124 generated by addition of 20, 50 or 100 L of the appropriate working solution to 30 mg of blank hair samples. QC solutions at 20, 0.6, 0.12, 0.012 and 0.0024 g/mL were prepared in methanol from different stock solutions than those used for calibrators. Low (6 pg/mg for methylone, methedrone, mephedrone and MDPV; and 30 pg/mg for the rest of the analytes), medium (300 pg/mg) and high (1500 pg/mg) QCs samples were prepared by the addition of 75 L of the corresponding solution. An internal standard (IStd) mixture containing amphetamine-d5, methamphetamine-d5, MDMA-d5, MDA-d5, methylone-d3, mephedrone-d3, mCPP-d8 and TFMPP-d4 at 10 g/mL was prepared by dilution of the individual IStd stock solution in methanol. Working IStd solution at 120 ng/mL was obtained by dilution, and 25 L were added to hair samples. All these solutions were stored at −20°C in the absence of light until use. 2.3. Hair samples Hair samples for the preparation of the calibrators and quality control (QC) samples were donated by the staff personnel. Moreover, 16 real specimens were analyzed in order to demonstrate the applicability of the method. Seven hair specimens with a previously positive result for classical amphetamine derivatives using the routine method employed in our laboratory were reanalyzed using the present methodology. Samples were received in our laboratory from 2009 to 2013, and gave positive results to amphetamine (n= 7), methamphetamine (n= 3), MDA (n= 2) and MDMA (n= 7). In addition, 9 hair specimens were collected in 2014 from patients under daily trazodone treatment, 6 males and 3 females, with doses ranging between 50 to 500 mg/day. Hair samples were collected from the vertex posterior of the head, as close as possible from the scalp, indicating with a string the hair root, as recommended by the Society of Hair Testing (SoHT)24. Specimens were stored at room temperature in an envelope until analysis. 3. Publicaciones 125 2.4. Sample preparation 2.4.1. Decontamination process Prior to analysis, hair samples were washed to remove external contamination. Each hair sample was washed with 2 mL of dichloromethane three times during 2 min. After that, samples were completely dried in a heater at 40ºC. The last wash solvent was collected and dried under nitrogen at 35ºC in a TurboVap LV evaporator (Zymark, Hopkinton, MA, USA), and injected into the LC-MSMS to confirm the total removal of external contamination. 2.4.2. Hair incubation Thirty milligrams of decontaminated hair were powdered in a ball mill (Precellys, Montigny le Bretonneux, France). The powder was incubated with 2 mL 0.1% HCl in methanol for 1 h at 60ºC in a bath, after the addition of 25 L IStd working solution. The sample was centrifuged (4,000 rpm, 10 min) and the supernatant was evaporated to dryness under nitrogen at 35ºC. After that, the residue was reconstituted in 2 mL of 2% FA in water to achieve the optimum pH for the solid phase extraction (SPE). 2.4.3. Clean-up Strata X-C cartridges were selected for carrying out the SPE. Cartridges were conditioned by sequential addition of 2 mL methanol and 2 mL water. After loading the samples in acid solution, the cartridges were washed with 2 mL 2% FA in water and 2 mL MeOH:Water:FA (47.5:47.5:5; v:v:v), and then dried for 10 min under vacuum. Analytes were eluted with 2 mL DCM:2-PROP:NH4OH (47.5:47.5:5; v:v:v), and subsequently evaporated to dryness with nitrogen at 35ºC after addition of 25 L acidic methanol (0.1% HCl). Samples were reconstituted in 75 L of initial mobile phase, and 30 L were injected into the LC-MSMS. 2.5. LC-MS/MS The HPLC system was an Alliance 2795 Separation Module equipped with an Alliance 3.2. Artículo 2 126 series column heater/cooler (Waters Corp., Mildford, MA, USA). Gradient elution was performed using an Atlantis T3 (2.1 mm x 50 mm, 3 µm) reversed-phase analytical column (Waters, Mildford, MA, USA), maintained at 35ºC. Ammonium formate 2mM with 0.1% FA (pH= 3) (A) and ACN (B) were used as mobile phase at a flow rate of 0.3 mL/min. The gradient program was as follows: 0-3 min 0% B: 3-5 min from 0% to 20% B; 5-6.8 min 20% B; 6.8-7.3 min from 20% to 25% B; 7.3-8.8 min 25% B; 8.8-9.3 min from 25% to 30% B; 9.3-9.4 min return to initial conditions; and 9.4-13 min column reequilibration. A divert valve was set to direct the flow to the MS from 4 to 11 min, and to waste the remaining time. A Quattro Micro ™ API ESCI triple quadrupole (Waters Corp., Mildford, MA, USA) was employed for detection. The instrument was operated in electrospray in the positive mode (ESI+) to produce protonated molecules of the analytes with the following optimized settings: capillary voltage 1.0 kV; source block and desolvation gas (nitrogen) temperature 150 ºC and 400 ºC, respectively; desolvation and cone gas (nitrogen) flow rate 800L/h and 60 L/h, respectively. Data were acquired in multiple reaction monitoring (MRM) mode. A post-column infusion of each individual analyte at 10 L/mL connected with a “T” valco to the chromatographic effluent (ammonium formate 2mM with 0.1% of FA (pH= 3) and ACN, 50:50, v:v) was employed to select multiple reaction monitoring (MRM) transitions, cone voltages and collision energies for the target analytes and IStds (Table 1). Data acquisition was controlled with MassLynx 4.1 software and processed with QuanLynx 4.1 software (Waters Corp., Milford, USA). Table 1. MRM transitions, cone voltage (CV), collision energy (CE), retention time (Rt) and internal standard (IStd) selected for each analyte. Analyte MRM transition CV (V) CE (eV) Rt (min) IStd Amphetamine 136.1>119.0 136.1>90.6 20 9 15 5.7 Amphetamine-d5 Amphetamine-d5 141.2>124.1 15 9 5.7 3. Publicaciones 127 4-FMC 182.3>164.2 182.3>149.2 22 13 19 5.3 Mephedrone-d3 Methylone 208.4>160.2 208.4>190.3 22 17 13 5.4 Methylone-d3 Methylone-d3 211.3>163.2 22 19 5.4 Methamphetamine 150.1>90.6 150.1>119.0 24 11 17 5.8 Methamphetamine-d5 Methamphetamine-d5 155.1>120.9 22 11 5.8 4-FMA 168.3>109.0 168.3>137.2 22 21 11 6.3 Methylone-d3 Mephedrone 178.3>160.2 178.3>145.1 20 12 18 6.5 Mephedrone-d3 Mephedrone-d3 181.4>163.3 22 13 6.5 MDA 180.3>105.1 180.3>133.2 15 20 16 5.9 MDA-d5 MDA-d5 185.1>168.1 15 9 5.9 Methedrone 194.4>176.3 194.4>161.2 20 13 19 6.4 Methylone-d3 MDMA 194.0>163.0 194.0>104.8 20 12 25 6.4 MDMA-d5 MDMA-d5 199.1>165.0 22 12 6.4 Phenazone 189.2>76.9 189.2>104.1 35 40 24 7.3 MDMA-d5 mCPP 197.3>154.2 197.3>118.9 32 19 25 7.5 mCPP-d8 mCPP-d8 205.3>158.2 36 21 7.5 MDPV 276.3>126.2 276.3>175.2 28 27 23 7.9 mCPP-d8 TFMPP 231.3>188.2 231.3>118.9 36 23 31 9.0 TFMPP-d4 TFMPP-d4 235.3>190.3 36 21 9.0 3.2. Artículo 2 134 Methamphetamine-d5 227.5 (10.9) 4-FMA 68.6 82.0 153.9 153.9 224.3 (5.7) 187.7 (6.6) Mephedrone 51.1 59.8 101.7 113.6 199.1 (6.8) 190.0 (7.4) Mephedrone-d3 203.9 (7.3) MDA 84.6 88.0 100.3 74.1 118.6 (20.6) 75.8 (13.4) MDA-d5 114.9 (17.9) Methedrone 67.6 72.4 111.2 88.4 164.6 (7.2) 122.1 (10.0) Methedrone-d3 153.6 (5.4) MDMA 82.7 92.1 128.9 86.9 155.9 (19.6) 94.4 (10.2) MDMA-d5 131.3 (8.3) mCPP 70.3 79.7 75.2 54.4 106.9 (11.6) 68.2 (14.0) mCPP-d8 111.4 (14.1) MDPV 75.8 85.0 106.7 108.8 140.7 (2.9) 128.1 (3.6) Phenazone 53.1 60.4 20.3 29.9 38.3 (14.8) 49.6 (6.3) TFMPP 61.5 68.9 105.2 117.1 171.0 (7.4) 169.9 (8.1) TFMPP-d8 180.8 (8.1) Trazodone 40.5 49.4 9.8 21.8 24.1 (17.3) 44.2 (7.1) Matrix effect= 100% means no matrix effect; 4-FMC: ()-4-fluoromethcathinone; 4-FMA: ()-4fluoromethamphetamine; MDA: 3,4-methylenedioxyamphetamine; MDMA: 3,4methylenedioxymethamphetamine; mCPP: 1-(3-chlorophenyl)piperazine; MDPV: 3,4methylenedioxypyrovalerone; TFMPP: 3-trifluoromethylphenyl)piperazine All the analytes were stable in the autosampler for 72 h at 6ºC after the analysis of 5 replicates at 2 QC concentrations (low and high). Percentage of loss when compared to fresh QC samples was lower than 14.5% in all cases (Table 5). 3. Publicaciones 135 Tabla 5. Stability at low (6 or 30 pg/mg, depending on the analyte), and high (1500 pg/mg) QC concentrations after 72 h in the autosampler at 6ºC. Data expressed as % loss compared to fresh controls. Analyte % loss Low (n= 5) High (n= 5) Amphetamine -10.9 -5.0 4-FMC 5.5 1.6 Methylone -4.7 3.1 Methamphetamine -2.8 -0.8 4-FMA 2.7 -11.1 Mephedrone -14.5 5.2 MDA -2.4 -6.4 Methedrone -12.2 5.2 MDMA -2.3 -3.7 mCPP -8.9 -2.5 MDPV 2.7 0.9 Phenazone -13.3 10.5 TFMPP 3.5 -8.0 Trazodone -3.5 6.6 4-FMC: ()-4-fluoromethcathinone; 4-FMA: ()-4fluoromethamphetamine; MDA: 3,4-methylenedioxyamphetamine; MDMA: 3,4-methylenedioxymethamphetamine; mCPP: 1-(3chlorophenyl)piperazine; MDPV: 3,4-methylenedioxypyrovalerone; TFMPP: 3-trifluoromethylphenyl)piperazine 3.2. Application to real specimens Sixteen real hair specimens were analyzed to probe the applicability of the present method (Table 6). Samples with a previous positive result for classical ATS (samples 17) gave a positive result for the same analytes. Seven specimens were positive for amphetamine (69.1-777.1 pg/mg), 3 for methamphetamine (120.4-1,538.9 pg/mg), 2 for MDA (27.8-135.4 pg/mg) and 7 for MDMA (98.7-3,654.5 pg/mg). Moreover, a positive result for mCPP was found in sample 7 (6,527.9 pg/mg), but the presence of 3.2. Artículo 2 136 trazodone (17,094.6 pg/mg) in this sample probe mCPP origin from consumption of this prescription drug and not from a recreational use. Nine hair specimens (samples 816) from patients under trazodone daily treatment showed positive results for trazodone (2,085.3-567,521.7 pg/mg) and its metabolite mCPP (341.7-25,008.9 pg/mg). In addition, sample 16 showed a positive result for MDMA at low concentration (73.4 pg/mg). Figure 2 shows MRM chromatograms of the positive results found in sample 7. Figure 2. MRM chromatograms of the positive results found in sample 7 containing amphetamine (383.7 pg/mg), MDMA (98.7 pg/mg), mCPP (6,527.9 pg/mg) and trazodone (17,094.6 pg/mg). Table 6. Concentrations (pg/mg) of the study analytes found in the 16 real hair specimens. Samples Concentration (pg/mg) Amphetamine Methamphetamine MDMA MDA mCPP Trazodone 1 91.3 - 1,536.4 27.8 - - 2 777.1 1,538.9 3,654.5 135.4 - - 3 69.1 1,243.6 103.9 - - - 4 424.7 - 131.5 - - - 5 44.9 120.4 109.0 - - - 6 679.2 - 223.1 - - - 3. Publicaciones 137 7 383.7 - 98.7 - 6,527.9 17,094.6 8 - - - - 25,008.9 567,521.7 9 - - - - 869.2 4,814.4 10 - - - - 3,411.4 25,835.4 11 - - - - 22,398.4 65,628.2 12 - - - - 4,942.6 11,096.6 13 - - - - 12,748.2 19,992.6 14 - - - - 8,000.9 23,089.8 15 - - - - 341.7 2,085.3 16 - - 73.4 - 963.3 3,211.0 MDMA: 3,4-methylenedioxymethamphetamine; MDA: 3,4-methylenedioxyamphetamine; mCPP: 1-(3chlorophenyl)piperazine 4. Discussion An LC-MSMS method for the determination in hair of classical ATS (amphetamine, methamphetamine, MDMA and MDA), synthetic cathinones (methylone, methedrone, mephedrone, MDPV, 4-FMC and 4-FMA), synthetic piperazines (mCPP and TFMPP), and medicines that produce mCPP as metabolite (trazodone and phenazone) was developed and fully validated. All the analytes eluted within 10 min, with a total run time of 13 minutes. The studied parameters (selectivity, linearity, LOD, LOQ, imprecision, accuracy, extraction recovery, matrix effect, process efficiency and stability) yielded satisfactory results for the all compounds. Several authors have reported the determination of synthetic cathinones and piperazines in hair5,20,23,28-36. However, the majority of these studies only included a few number of these molecules20,23,28,30,32,34,35-36, whereas with this method it is possible to determine not only 8 NPS but also 4 classical amphetamine derivatives. Multianalyte methodologies are necessary in hair analysis because the amount of hair available is frequently low6. In addition, some of the previously published methodologies have been developed using GC-MS or GC-MSMS28-30,34,35, which 3.2. Artículo 2 138 required a derivatization step, extending the time of analysis and also increasing the cost. Only in one manuscript the determination of classical ATS were also included31. The presence of classical ATS and NPS in hair samples of drug users can be expected, because many users changed the illegal ones (classical ATS) for the unregulated NPS, to avoid prosecution, or use both. Over the period 2009-2013 the number of NPS on the global drug market increased more than double2, while the prevalence of classical ATS decreased. Rust et al.5 performed a retrospective study in hair samples, previously tested positive for classical ATS, to determine the prevalence of new psychoactive drugs. Fifty-nine positive results for NPS in 334 analyzed samples were found. StranoRossi et al.33 applied their method for the determination of new synthetic cannabinoids, cathinones and piperazines to 50 authentic hair samples from forensic cases (driving license renewals, postmortem toxicological analyses and workplace drug testing), and previously analyzed for the most common drugs of abuse (including amphetamines). In this case samples with positive results for synthetic cathinones (n= 3) were negative for other drugs of abuse. All these findings remark the interest of developing multianalyte methods for classical ATS and NPS, such this here described. The LOQs achieved in the present method (5-20 pg/mg), using 30 mg of hair sample, were lower or equal to those set for other multianalyte methodologies with similar amounts of hair, employing LC-MSMS or GC-MSMS (5-100 pg/mg)5,29,31,33 . However, Strano-Rossi et al.33 and Rust et al.5 included a higher number of analytes compared with this method. Nevertheless, their methods are more tedious, because they employed two LC methods and a two-step extraction, respectively. In addition, our method’s LOQs for classical ATS (amphetamine, methamphetamine, MDMA and MDA) were 20 pg/mg, lower than SoHT cut-off recommendation (≥200 pg/mg)37 to guarantee chronic exposure. Therefore, the application of the present method to previously positive real hair specimens probed chronic exposure to these substances in 6 cases, in which the concentration of at least one of these compounds was higher than the SoHT cut-off. The medicines trazodone and phenazone were included in the method because they produce mCPP as main metabolite in the liver, by N-dealkylation of the nitrogen in the 3. Publicaciones 139 piperazine ring23. Therefore, simultaneous determination of trazodone, phenazone and mCPP allow distinguishing between therapeutic or recreational use. Trazodone users had higher hair trazodone concentrations (2,085.3-567,521.7 pg/mg) than those of mCPP (341.7-25,008.9 pg/mg). Phenazone was not detected in the analyzed real specimens. A correlation between the given doses and mCPP hair concentrations was found (r= 0.796, p= 0.010); however, no correlation with trazodone concentrations was determined (r= 0.411, p= 0,271). Stanaszek et al.23 also developed a methodology for the determination of trazodone and mCPP in hair, and applied it to a patient under treatment with this antidepressant. Both analytes were detected with similar concentrations to those reported in the present manuscript. Therefore, a positive hair result for mCPP could be falsely attributed to a recreational use if trazodone or phenazone consumption is not discarded. Rust et al.5 found mCPP as the more prevalent drug detected (10.5%, 34 samples out of 334 analyzed samples). However, only 5 of these samples showed also a positive result for trazodone, proving the prevalence of this compound as a drug of abuse, but also the importance of distinguishing between licit and illicit origin of this substance. 5. Conclusion The present manuscript describes the successful development of an LC-MS/MS method for the determination of amphetamine, methamphetamine, MDMA, MDA, methylone, methedrone, mephedrone, MDPV, 4-FMC, 4-FMA, mCPP, TFMPP, trazodone and phenazone in hair. The method was fully validated and applied to authentic samples. Classical ATS were found in real specimens with a previous positive result; however, only the NPS mCPP was detected. Method inclusion of prescription drugs that produce mCPP as main metabolite is important to distinguish between licit and illicit use. Acknowledgement E. Lendoiro and A. de Castro would like to thank Consellería de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria, Xunta de Galicia, for their predoctoral (PRE/2011/072), and post-doctoral (POS-B/2013/003) contracts, respectively. 3.2. Artículo 2 140 References [1] M. Carvalho, H. Carmo, V.M. Costa, J.P. Capela, H. Pontes, F. Remiao, F. Carvalho, M.L. Bastos. Toxicity of amphetamines: an update. 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Discusión 169 El pelo se ha convertido en una matriz biológica de enorme relevancia en el campo de la Toxicología Clínica y Forense a lo largo de los últimos treinta años, debido, fundamentalmente, a que permite realizar el análisis retrospectivo del consumo de drogas y fármacos, a diferencia de las matrices biológicas tradicionales. Pero, además de su amplia ventana de detección, presenta otras características ya previamente señaladas, como la toma de muestra no invasiva o el almacenamiento sencillo, que hacen de esta matriz una herramienta muy útil en numerosas aplicaciones toxicológicas. Como esta Tesis Doctoral se ha elaborado por la modalidad de compendio de artículos, se realizará, a continuación, una discusión general, para resaltar los aspectos más destacables de los mismos. Dentro de la misma, se abordarán algunos de los principales retos por afrontar en el análisis de muestras de pelo, especialmente los relacionados con el desarrollo de las metodologías analíticas y la interpretación de los resultados obtenidos. Además, se discutirá el papel del análisis del pelo materno en la detección y diagnóstico de la exposición prenatal a drogas y fármacos, comparando su utilidad con la proporcionada por marcadores indirectos de consumo, como la entrevista materna, o con otros marcadores objetivos, como el análisis toxicológico de otras matrices biológicas. 4.1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS EN PELO Una de las características esenciales de las metodologías analíticas desarrolladas en pelo es que deben poseer una elevada sensibilidad, ya que los niveles de concentración de drogas y fármacos detectados en esta matriz biológica pueden encontrarse en el rango de los pg/mg, niveles significativamente inferiores a los encontrados en las matrices biológicas tradicionales (ng/mL-μg/mL). En esta Tesis Doctoral se han desarrollado y validado dos metodologías analíticas en pelo. En primer lugar, se realizó un método de screening para la detección, confirmación y cuantificación de un amplio número de drogas y fármacos de uso común (Artículo 1). En segundo lugar, se desarrolló un 4.1. Desarrollo de metodologías analíticas en pelo 170 método para la determinación y cuantificación de compuestos anfetamínicos, y nuevas drogas sintéticas (NPS) con efectos estimulantes (catinonas y piperazinas sintéticas), incluyendo además dos fármacos que producen una piperazina sintética como metabolito (Artículo 2). Ambas metodologías emplearon la espectrometría de masas en tándem como sistema de detección, la cual ha probado ser una técnica altamente sensible y adecuada para el análisis de este tipo de muestras [1-3], ya que permite alcanzar los bajos niveles de detección requeridos. En ambos métodos fue posible establecer unos límites de cuantificación (LOQ) iguales o inferiores a los aconsejados por la SoHT para la determinación de exposición o consumo crónico a sustancias de abuso, en su documento de consenso publicado en 2004 [4]. Estos límites son de 200 pg/mg para opioides, 500 pg/mg para cocaína y 50 pg/mg para su principal metabolito (BE), 200 pg/mg para anfetaminas y 100 pg/mg para THC. Sin embargo, en el año 2011 la SoHT publicó una nueva recomendación [5], rebajando el valor de LOQ para la confirmación de THC, que se estableció en 50 pg/mg (el límite de detección (LOD) del método de screening desarrollado), mientras que se mantuvo en 100 pg/mg para el screening. El método de screening aquí desarrollado presenta, por tanto, un LOQ adecuado para el screening del THC, pero no para su confirmación, mientras que para el resto de sustancias incluidas en dicho método, los valores de LOQ son inferiores a los recomendados por la SoHT para realizar su confirmación. Sin embargo, algunas aplicaciones del análisis de pelo requieren la detección del consumo esporádico o, incluso, a dosis única, como los casos de sumisión química. En la bibliografía es posible encontrar referencias sobre los niveles de concentración detectados en pelo tras la exposición controlada a una dosis única de algunas sustancias, como codeína, benzodiazepinas, cotinina, cocaína, ketamina o hipnóticos (Tabla 1). Sin embargo, para muchas otras sustancias no se han descrito este tipo de estudios, y las concentraciones tras este tipo de exposición no son conocidas. Entre las sustancias incluidas en las dos metodologías analíticas desarrolladas en esta Tesis Doctoral, es posible detectar una única exposición a codeína, cocaína, zolpidem, ketamina y lorazepam, tetrazepam, diazepam y nordiazepam, ya que su LOQ fue menor o igual a los niveles descritos en la bibliografía. No obstante, son necesarios más 4. Discusión 171 estudios, ya que para una misma sustancia las concentraciones encontradas en cabello por los diferentes autores pueden diferir significativamente, como en el caso del zolpidem [6-10] y el tetrazepam [11,12]. Tabla 1. Concentraciones encontradas en la bibliografía en muestras de pelo con exposición a dosis única de diferentes drogas y fármacos. Referencia Técnica Analítica Muestra Sustancia Dosis (mg) Concentración máxima (pg/mg) Wilkins, 1995 [13] GC-MS Cabello (arrancado) (n= 2) Codeína 120 115-4000 Gwent, 1995 [14] GC-MS Barba (n= 6) Cotinina Nicotina 4 1800 <LOQ (30) Callaghan, 1996 [15] RIA Barba (n= 6) Codeína 60 - Herdenson, 1996 [16] GC-MS Cabello (n= 1) Cocaína deuterada 120170 282 Rollins, 1996 [17] GC-MS Cabello (n= 19) Codeína 120 30 Negrusz, 2000 [18] GC-MS Cabello (n= 2) CLO 7-AC 2 <LOQ (10) 4,8 Negrusz, 2001 [19] GC-MS Cabello (n= 10) FLU 7-AF 2 <LOQ (2,5) 8 Negrusz, 2002 [20] GC-MS Cabello (n= 10) CLO 7-AC 3 <LOQ (20) 23 Kintz, 2004 [6] LC-MSMS Cabello (n= 4) Zolpidem 7-AF Lorazepam -* -* -* 4,4-67 5,2 8 Kintz, 2004 [21] LC-MSMS Cabello (n= 3) Lorazepam 2,5 <LOQ (1) Villain, 2004 [22] LC-MSMS Cabello (n= 2) Bromazepam 6 4,7 4.1. Desarrollo de metodologías analíticas en pelo 172 Cabello (n= 3) Pelo púbico (n= 1) -* -* 0,9-15 4,1 Villain, 2004 [7] LC-MSMS Cabello (n= 3) Zolpidem 10 1,8-9,8 Villain, 2004 [8] LC-MSMS Cabello (n= 2) Zopiclona 7,5 5,4-9,0 Chezè, 2005 [23] LC-MSMS Cabello (n= 2) CLO y 7-AC FLU y 7-AF -* -* 1,9 y 41,2 <LOQ (2) y 4,2 Concheiro, 2005 [11] LC-MSMS Cabello (n= 2) Barba (n= 1) Tetrazepam 50 Cabello: 123176 Barba: 15 Laloup, 2007 [12] LC-MSMS Cabello (n= 6) Tetrazepam Diazepam Nordiazepam 50 10 17,3-59,7 2,3-6,0 Trazas-5,4 Bernert, 2011 [24] LC-MSMS Barba (n= 6) Nicotina Cotinina 4 1,4-70,8 1,3-47,4 Xiang, 2011 [25] LC-MSMS Cabello (n= 14) Cabello (n= 2) Estazolam CLO y 7-AC 1-6 -* 0,56-2,6 1,31-15,5 y 33,47-45,30 Xiang, 2011 [26] LC-MSMS Cabello (n= 4) Ketamina Norketamina 10 2,0-28,4 2,1-38,2 Schräder, 2012 [27] LC-MSMS Barba (n= 3) EtG 153200 g 74-242 Cui, 2013 [9] LC-MSMS Cabello (n= 20) Zolpidem 10 135-554,6 Shima, 2015 [10] LC-MSMS Cabello (n= 1) Zolpidem 10 214 * Se desconoce la dosis administrada por tratarse de un caso de supuesta sumisión química CLO: Clonazepam; FLU: Flunitrazepam; EtG: Etilglucurónido; RIA: Radioinmunoensayo; 7-AC: 7aminoclonazepam; 7-AF: 7-aminoflunitrazepam