Estudio de niveles de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) en aves rapaces y sus implicaciones en el ecosistema

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología ESTUDIO DE NIVELES DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (PAHs) EN AVES RAPACES Y SUS IMPLICACIONES EN EL ECOSISTEMA SUSANA GONZÁLEZ AMIGO 1999 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología ESTUDIO DE NIVELES DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (PAHs) EN AVES RAPACES Y SUS IMPLICACIONES EN EL ECOSISTEMA Memoria presentada por Susana González Amigo en la Universidad de Santiago de Compostela para optar al grado de Doctor. Santiago de Compostela, Junio de 1999. JESÚS SIMAL LOZANO, CATEDRÁTICO DE ANÁLISIS QUÍMICO APLICADO, NUTRICIÓN Y TOXICOLOGÍA Y Mª ASUNCIÓN LAGE YUSTY, CATEDRÁTICA DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA, DE LA FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA, AUTORIZAN a Dña. Susana González Amigo a presentar el trabajo titulado “ESTUDIO DE NIVELES DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (PAHs) EN AVES RAPACES Y SUS IMPLICACIONES EN EL ECOSISTEMA” para optar al Grado de Doctor en Farmacia, el cual ha sido realizado bajo su dirección en los Laboratorios de Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, se expide la presente en Santiago de Compostela, en Junio de mil novecientos noventa y nueve. Fdo. Dr. D. J. Simal Lozano Fdo. Dra. Dña. Mª A. Lage Yusty AGRADECIMIENTOS Quiero manifestar mi más sincero agradecimiento a todas aquellas personas que de un modo u otro, han hecho posible la realización de esta Tesis Doctoral. En primer lugar, a los directores de esta memoria, catedráticos Dr. D. Jesús Simal Lozano y Dra. Dña. Mª Asunción Lage Yusty, por toda la orientación y el apoyo prestado durante estos años, sin olvidar su gran contribución a mi formación personal e investigadora. A todos los profesores del Departamento de Química Analítica Nutrición y Bromatología, Área de Nutrición y Bromatología, por su continua colaboración en mi formación científica. A todos mis compañeros de este Departamento, tanto a los que están ahora, como a los que ya se fueron, especialmente a Dña. Teresa de Jesús López y López Leyton, a la Dra. Dña. Elena Álvarez Piñeiro, a Dña. Elena Sandomingo López y a la Dra. Dña. Mercedes Sonia García Falcón, por el cordial ambiente de trabajo y por su desinteresada colaboración. Al Prof. Dr. D. Rafael García-Villanova Ruiz, catedrático del Área de Nutrición y Bromatología de la Universidad de Salamanca, por proporcionarnos algunos de los patrones. Al Departamento de Química Analítica de la Universidad de La Coruña, por la ayuda prestada en los programas de espectrofluorimetría FLDM (versión 3..5) y FL WinLab (versión 2.01), y en especial a D. Darío Prada Fernández, Dña. Purificación López Mahía y Dña. Soledad Muñiategui Lorenzo. Al Dr. D. Jesús Domínguez Conde, profesor titular de Departamento de Biología Animal, de la Universidad de Santiago de Compostela, por facilitarnos información sobre las aves objeto de este estudio. A la Consellería de Educación e Ordenación Universitaria, por la financiación del proyecto titulado: ”Estudio de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), policlorobifenilos (PCBs) y policloroterfenilos (PCTs) en aves rapaces y sus implicaciones en el ecosistema”, y permitieron con ello la realización de este estudio. Al Laboratorio de Parasitología del Instituto de Investigación de Análisis Alimentarios, y en especial al catedrático Dr. D. Manuel Sanmartín Durán por habernos suministrado las muestras objeto de este estudio. Y por último, y muy especialmente a D. Manuel Merelles Pérez por demostrarme su confianza y apoyo durante todos estos años. A mi familia A mi marido Í ÍN ND DI IC CE ES S Índice General Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 I ÍNDICE GENERAL ABREVIATURAS IV ÍNDICE DE FIGURAS VII ÍNDICE DE TABLAS XV INTRODUCCIÓN 1. HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS 1 1.1. NOMENCLATURA 2 1.2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES 5 1.3. ETIOLOGÍA 26 1.3.1. FUENTES NATURALES 26 1.3.2. FUENTES ANTROPOGÉNICAS 27 1.4. OBTENCIÓN COMERCIAL 29 1.5 TOXICOLOGÍA 30 1.5.1 REVISIÓN HISTÓRICA 31 1.5.2 ACTIVACIÓN METABÓLICA 32 1.6 CONTROL 35 2. PRESENCIA DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS EN LAS AVES RAPACES 37 2.1 Buteo buteo (RATONERO COMÚN)39 2.2 Strix aluco (CÁRABO COMÚN)41 2.3 Tyto alba (LECHUZA)44 2.4 LEGISLACIÓN 46 3. EXTRACCIÓN DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS 47 3.1 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN 48 3.1.1 MÉTODO "OFFLINE" 48 Índice General Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 II 3.1.2 MÉTODO "ONLINE" 49 3.2 APLICACIÓN A PROCESOS DE EXTRACCIÓN 50 3.2.1 PODER SOLVENTE, DENSIDAD Y PRESIÓN 50 3.2.2 FLUIDOS Y FLUJO 52 3.3 SOLVENTES MODIFICADORES 53 3.4 ADSORBENTES EN FASE SÓLIDA Y SOBRECARGAS 54 3.5 VENTAJAS 56 3.6 EXTRACTOR DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS HP7680A 57 ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS Antecedentes bibliográficos 58 Otras técnicas analíticas 82 OBJETIVO Objetivo 99 PARTE EXPERIMENTAL 1. MATERIAL Y APARATOS 100 2. ORDENADORES Y PROGRAMAS 101 3. REACTIVOS 102 4. PREPARACIÓN DE PATRONES 103 5. PROTOCOLO ANALÍTICO 103 5.1DESCRIPCIÓN DE LAS MUESTRAS 103 5.2DETERMINACIÓN DE HUMEDAD 106 5.3DETERMINACIÓN DE GRASA 106 5.4EXTRACCIÓN DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS 106 6ANÁLISIS 109 6.1. ANÁLISIS ESPECTROFLUORIMÉTRICO 109 6.2CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN Índice de Figuras Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 IX Fig. 43. Mapa de contorno del Antraceno en ACN, y a) zoom del espectro de emisión fijando la λexc a 250 nm, b) zoom del espectro de excitación fijando ∆λ a 150 nm. 129 Fig. 44. Mapa de contorno del Fluoranteno en ACN, y a) zoom del espectro de emisión fijando la λexc a 288 nm, b) zoom del espectro de excitación fijando ∆λ a 170 nm. 129 Fig. 45. Mapa de contorno del Pireno en ACN, y a) zoom del espectro de emisión fijando la λexc a 334 nm, b) zoom del espectro de excitación fijando ∆λ a 40 nm. 130 Fig. 46. Mapa de contorno del Benzo[a]antraceno en ACN, y a) zoom del espectro de emisión fijando la λexc a 288 nm, b) zoom del espectro de excitación fijando ∆λ 100 nm. 130 Fig. 47. Mapa de contorno del Criseno en ACN, y a) zoom del espectro de emisión fijando la λexc a 270 nm, b) zoom del espectro de excitación fijando ∆λ a 95 nm. 131 Fig. 48. Mapa de contorno del Benzo[b]fluoranteno en ACN, y a) zoom del espectro de emisión fijando la λexc a 300 nm, b) zoom del espectro de excitación fijando ∆λ a 145 nm. 131 Fig. 49. Mapa de contorno del Benzo[k]fluoranteno en ACN, y a) zoom del espectro de emisión fijando la λexc a 307 nm, b) zoom del espectro de excitación fijando ∆λ a 105 nm. 132 Fig. 50. Mapa de contorno del Benzo[a]pireno en ACN, y a) zoom del espectro de emisión fijando la λexc a 296 nm, b) zoom del espectro de excitación fijando ∆λ a 110 nm. 132 Fig. 51. Mapa de contorno del Benzo[ghi]perileno en ACN, y a) zoom del espectro de emisión fijando la λexc a 298 nm, b) zoom del espectro de excitación fijando ∆λ a 110 nm. 133 Fig. 52. Mapa de contorno del Indeno[1,2,3cd]pireno en ACN, y a) zoom del espectro de emisión fijando la λexc a 305 nm, b) zoom del espectro de excitación fijando ∆λ a 165 nm. 133 Índice de Figuras Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 X Fig. 53. Espectros de excitación y de emisión del Antraceno, Fluoranteno, Pireno y Benzo[a]antraceno en ACN. 134 Fig. 54. Espectros de excitación y de emisión del Criseno, Benzo[b]fluoranteno, Benzo[k]fluoranteno y Benzo[a]pireno en ACN. 134 Fig. 55. Espectros de excitación y de emisión del Benzo[ghi]perileno e Indeno[1,2,3cd]pireno en ACN. 135 Fig. 56. Mapa de contorno de la sílica al 15% en ACN, purificada seis horas por soxhlet con ACN MERCK y a) zoom de los espectros de emisión fijando la λexc a 250, 300 y 334 nm, b) zoom de los espectros de excitación fijando ∆λ a 40, 100 y 170 nm. 135 Fig. 57. Mapa de contorno de una mezcla de los diez PAHs en ACN y a) zoom de los espectros de emisión fijando la λexc a 250, 300 y 334 nm, b) zoom de los espectros de excitación fijando ∆λ a 40, 100 y 170 nm. 136 Fig. 58. Mapa de contorno de una muestra de hígado comercial de pollo y a) zoom de los espectros de emisión fijando la λexc a 250, 300 y 334 nm, b) zoom de los espectros de excitación fijando ∆λ a 40, 100 y 170 nm. 136 Fig. 59. Sistema de mantenimiento de la columna de HPLC a temperatura constante. 138 Fig. 60. Anchuras características del pico cromatográfico del Antraceno. 141 Fig. 61. Anchuras características del pico cromatográfico del Fluoranteno. 141 Fig. 62. Anchuras características del pico cromatográfico del Pireno. 141 Fig. 63. Anchuras características del pico cromatográfico del Benzo[a]antraceno. 142 Fig. 64. Anchuras características del pico cromatográfico del Criseno. 142 Fig. 65. Anchuras características del pico cromatográfico del Benzo[b]fluoranteno. 142 Fig. 66. Anchuras características del pico cromatográfico del Benzo[k]fluoranteno. 143 Índice de Figuras Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 XI Fig. 67. Anchuras características del pico cromatográfico del Benzo[a]pireno. 143 Fig. 68. Anchuras características del pico cromatográfico del Benzo[ghi]perileno. 143 Fig. 69. Anchuras características del pico cromatográfico del e Indeno[1,2,3cd]pireno. 144 Fig. 70. Rectas de calibrado del Antraceno, Pireno, Benzo[a]antraceno, Benzo[k]fluoranteno y Benzo[a]pireno en ACN, obtenidas por HPLC-FL en las condiciones de cuantificación. 147 Fig.71. Rectas de calibrado del Fluoranteno, Criseno, Benzo[b]fluoranteno y Benzo[ghi]perileno en ACN, obtenidas por HPLC-FL en las condiciones de cuantificación. 147 Fig.72. Cromatograma de HPLC de patrón de los diez PAHs en ACN en: a) condiciones de inyección 1, y b) condiciones de inyección 2. 152 Fig.73. Espectros sincrónicos del Antraceno en ACN (0.4, 1 y 3 µg/L) realizados mediante HPLC-FL. 153 Fig. 74. Espectros sincrónicos del Fluoranteno en ACN (3, 4 y 5 µg/L) realizados mediante HPLC-FL. 153 Fig. 75. Espectros sincrónicos del Pireno en ACN (0.5, 1 y 3 µg/L) realizados mediante HPLC-FL. 153 Fig. 76. Espectros sincrónicos del Benzo[a]antraceno en ACN (1, 3 y 5 µg/L) realizados mediante HPLC-FL. 153 Fig. 77. Espectros sincrónicos del Criseno en ACN (2, 3 y 5 µg/L) realizados mediante HPLC-FL. 154 Fig. 78. Espectros sincrónicos del Benzo[b]fluoranteno en ACN (5 y 20 µg/L) realizados mediante HPLC-FL. 154 Fig. 79. Espectros sincrónicos del Benzo[k]fluoranteno en ACN (1, 2 y 3 µg/L) realizados mediante HPLC-FL. 154 Fig. 80. Espectros sincrónicos del Benzo[a]pireno en ACN (0.5, 1 y 3 µg/L) realizados mediante HPLC-FL. 154 Índice de Figuras Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 XII Fig. 81. Espectros sincrónicos del Benzo[ghi]perileno en ACN (2, 3 y 5 µg/L) realizados mediante HPLC-FL. 154 Fig. 82. Espectros sincrónicos del Indeno[1,2,3cd]pireno en ACN (30 y 35 µg/L) realizados mediante HPLC-FL. 154 Fig. 83. Espectros sincrónicos de Antraceno, sílica y sílica sobrecargada con Antraceno en ACN realizados mediante HPLC-FL. 155 Fig. 84. Espectros sincrónicos de Pireno, sílica y sílica sobrecargada con Pireno en ACN realizados mediante HPLC-FL. 155 Fig. 85. Espectros sincrónicos en ACN de patrón de Antraceno y Antraceno en el pulmón de la muestra C-2 y en el hígado de la muestra R-8, realizados mediante HPLC-FL. 156 Fig. 86. Espectros sincrónicos en ACN de patrón de Fluoranteno y Fluoranteno en el músculo de la muestra L-8, realizados mediante HPLC-FL. 156 Fig. 87. Espectros sincrónicos en ACN de patrón de Pireno y Pireno en el intestino de la muestra R-8, realizados mediante HPLC-FL. 156 Fig. 88. Espectros sincrónicos en ACN de patrón Benzo[a]antraceno y Benzo[a]antraceno en intestino de la muestra L-11 y en el pulmón de las muestras L-10 y L-4, realizados mediante HPLC-FL. 156 Fig. 89. Cromatogramas de HPLC-FL de un patrón de los diez PAHs antes y después de ser sometido durante 16 h en lámpara UV a 254 nm en: a) condiciones de inyección 1, y b) condiciones de inyección 2. 157 Fig. 90. Cromatogramas de HPLC-FL de un patrón de los diez PAHs y del corazón de la muestra R-1 en: a) condiciones de inyección 1, y b) condiciones de inyección 2. 162 Fig. 91. Cromatogramas de HPLC-FL de un patrón de los diez PAHs y del hígado de la muestra L-3 en: a) condiciones de inyección 1, y b) condiciones de inyección 2. 163 Fig. 92. Cromatogramas de HPLC-FL de un patrón de los diez PAHs y de las vísceras de la muestra R-5 en: a) condiciones de inyección 1, b) Índice de Figuras Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 XIII condiciones de inyección 2, y c) espectro sincrónico de confirmación del Pireno. 165 Fig. 93. Niveles de PAHs (µg/kg) en materia seca, encontrados en las vísceras de la muestra R-4. 166 Fig. 94. Cromatogramas de HPLC-FL de un patrón de los diez PAHs y de las vísceras de la muestra C-1 en: a) condiciones de inyección 1, b) condiciones de inyección 2, y c) espectro sincrónico de confirmación del Fluoranteno. 167 Fig. 95. Niveles de PAHs (µg/kg) en materia seca, encontrados en las vísceras de la muestra C-1. 168 Fig. 96. Cromatogramas de HPLC-FL de un patrón de los diez PAHs y de las vísceras de la muestra L-7 en: a) condiciones de inyección 1, b) condiciones de inyección 2, c) espectro sincrónico de confirmación del Antraceno y d) espectro sincrónico de confirmación del Benzo[b]fluoranteno. 169 Fig. 97. Niveles de PAHs (µg/kg) en materia seca, encontrados en las vísceras de la muestra L-5. 170 Fig. 98. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función del tipo de víscera. 173 Fig. 99. Análisis de la varianza de Pireno y las distintas vísceras de la lechuza. 176 Fig. 100. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función del sexo y especie. 177 Fig. 101. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función de la edad. 178 Fig. 102. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función de la provincia. 179 Fig. 103. Análisis de la varianza de Pireno y las cuatro provincias del ratonero. 180 Fig. 104. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función del tipo de víscera. 183 Índice de Figuras Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 XIV Fig. 105. Análisis de la varianza de Pireno y las distintas vísceras. 184 Fig. 106. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función del sexo. 184 Fig. 107. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función de la edad. 185 Fig. 108. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función de la provincia. 186 Fig. 109. Análisis de la varianza de Pireno y las cuatro provincias. 187 Índice de Tablas Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 XV ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. PAHs más usualmente formados en procesos de combustión. 27 Tabla 2. Evaluación carcinogénica de los diez PAHs analizados según IARC (Ware, 1994). 34 Tabla 3. Valores de temperatura y presión críticas de diferentes fluidos. 52 Tabla 4. Características de las muestras analizadas para la determinación de PAHs. 104 Tabla 5. Longitudes de onda de excitación óptimas (nm), ∆λ (nm) y nº sincron, para los diez PAHs analizados en ACN. 110 Tabla 6. Longitudes de onda de excitación (λexc) y de emisión (λem) utilizadas para la cuantificación de los diez PAHs analizados. 111 Tabla 7. Longitudes de onda de excitación (λexc) y de emisión (λem) utilizadas para la confirmación de los diez PAHs analizados. 113 Tabla 8. Relación de las áreas obtenidas en las longitudes de onda de cuantificación y confirmación para los PAHs. 113 Tabla 9. λexc y λem iniciales para realizar los espectros en modo sincron mediante HPLC-FL. 114 Tabla 10. Características de las 87 vísceras utilizadas para la determinación del % de grasa y humedad. 117 Tabla 11. Variables estadísticas del % de humedad y de grasa. 118 Tabla 12. Valores medios de % de humedad y % de grasa en materia seca, en función del tipo de víscera. 119 Tabla 13. Valores medios de % de humedad y % de grasa en materia seca, en función de la especie. 119 Tabla 14. Valores medios de % de humedad y % de grasa en materia seca, en función del sexo. 120 Tabla 15. Características de los picos cromatográficos según la Farmacopea Europea (EP). 140 Índice de Tablas Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 XVI Tabla 16. Características de los picos cromatográficos según la Farmacopea Americana (USP). 140 Tabla 17. Límites de detección (LD) y cuantificación (LQ) utilizados para la cuantificación de los diez PAHs en ACN por HPLC-FL. 145 Tabla 18. Rectas de calibrado utilizadas para la cuantificación de los PAHs estudiados. 146 Tabla 19. LD y LQ del adsorbente extraído por SFE, obtenidos por HPLCFL (λex= 250 y λem= 400), en la señal interferente con el Ant y Pir. 148 Tabla 20. RSD% y %R obtenidos al someter seis veces el adsorbente sobrecargado con los 10 PAHs, al procedimiento experimental. 148 Tabla 21. RSD% y %R obtenidos al someter seis veces una muestra hígado de pollo sin sobrecargar y sobrecargada con los diez PAHs, al procedimiento experimental. 149 Tabla 22. Límites de detección (LD) y cuantificación (LQ) utilizados para la confirmación de seis PAHs en ACN por HPLC-FL. 150 Tabla 23. Rectas de calibrado utilizadas para la confirmación de seis PAHs. 151 Tabla 24. Contenido de humedad (p/p), muestra seca extraída y PAHs (µg/kg) en materia seca en las muestras de ratonero. 159 Tabla 25. Contenido de humedad (p/p), muestra seca extraída y PAHs (µg/kg) en materia seca en las muestras de cárabo. 160 Tabla 26. Contenido de humedad (p/p), muestra seca extraída y PAHs (µg/kg) en materia seca en las muestras de lechuza. 160 Tabla 26 (Cont.). Contenido de humedad (p/p), muestra seca extraída y PAHs (µg/kg) en materia seca en las muestras de lechuza. 161 Tabla 27. Variables estadísticas de los resultados obtenidos en la especie ratonero. 171 Tabla 28. Variables estadísticas de los resultados obtenidos en la especie cárabo. 171 Tabla 29. Variables estadísticas de los resultados obtenidos en la especie lechuza. 172 Índice de Tablas Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 XVII Tabla 30. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función del tipo de víscera. 173 Tabla 31. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función del sexo y especie. 176 Tabla 32. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función de la edad. 178 Tabla 33. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función de la provincia. 179 Tabla 34. Variables estadísticas de los niveles totales de PAHs. 181 Tabla 35. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función del tipo de víscera. 182 Tabla 36. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función del sexo. 184 Tabla 37. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función de la edad. 185 Tabla 38. Valores medios de PAHs (µg/kg) en materia seca, en función de la provincia. 185 I IN NT TR RO OD DU UC CC CC CI IÓ ÓN N Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 7 - RTECS Accession Number: >>CA9350000. Supplier(s): Aldrich 14106-2; Fluka 10590; Rare Chemicals Library S44234-8; Sigma A3885; Supelco R42-3010. Derivative: Trinitrotoluene complex Chapman Hall Number: FQB15-V CAS Registry Number: 29506-24-9 Melting Point: Mp 162 deg. Derivative: Picrate Chapman Hall Number: FQB07-U CAS Registry Number: 17356-96-6 Physical Description: Dark red needles (CHCl3). Melting Point: Mp 138-139 deg. Derivative: Trinitrobenzene complex Chapman Hall Number: MJJ10-G CAS Registry Number: 1700-13-6 Physical Description: Yellow needles (EtOH). Melting Point: Mp 161-165 deg. References: Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra,1992, 2, 48C (nmr) Aldrich Library of FT-IR Spectra, 1st edn.,1985, 1, 961D (ir) Aldrich Library of FT-IR Spectra: Vapor Phase,1989, 3, 884C (ir) Dumas, et al.,Annalen,1833, 5, 5 (isol) Clar, E., Ber.,1932, 65, 506; ,1939, 72, 1645 (uv, purifn) Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,Wiley, 1967, 1, 539; ,1975, 5, 662; ,1977, 6, 173 (use) Beynon, J.H. et al.,Org. Mass Spectrom.,1970, 3, 455 (ms) Analyst (London),1972, 97, 740 (microanal) Agranat, T. Et al.,Synthesis,1974, 865 (synth) Fleming, I. Et al.,J.C.S. Perkin 1,1975, 964 (synth) Hansen, P.E. et al.,Org. Magn. Reson.,1979, 12, 50 (cmr) IARC Monog.,1983, 32, 105; ,Suppl. 7, 57 (rev, tox) Brock, C.P. et al.,Acta Cryst. B,1990, 795 (cryst struct) Patty’s Ind. Hyg. Toxicol. (3rd Rev. Edn.),Vol. 2, Wiley, 1980, 3353 Lewis, R.J., Sax’s Dangerous Properties of Industrial Materials,8th edn., Van Nostrand Reinhold, 1992, APG500 [00074094-8] Fig.2. Espectro de masas del Antraceno. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 8 - Fig. 3. Espectro de UV del Antraceno. FICHA TÉCNICA (Datos suministrados por la casa comercial Sugelabor): DATOS DE TOXICIDAD -Sospechoso carcinógeno. - Irrita la piel. DATOS FÍSICOS Punto de fusión: 217-218ºC Color: azul Solubilidad en agua: insoluble, soluble en solventes orgánicos. Estable a 20ºC. Sensible a la luz PELIGROSIDAD PARA LA SALUD Evitar contacto con la piel y ojos. No inhalar. Carcinógeno sospechoso Fluoranteno (Fl) Entry Name: Fluoranthene, 9CI, 8CI Synonym(s): 1,2-Benzacenaphthene. Benzo[jk]fluorene. Idryl. 1,2-(1,8-Naphthylene)benzene Chapman Hall Number: BLK07-M CAS Registry Number: 206-44-0 Type of Compound Code(s): VQ9000, VQ7700 Molecular Formula: C16H10 Molecular formula = C16 H10 Molecular Weight = 202.251 Composition = C(95.02%) H(4.98%) Molar Refractivity = 67.02 ± 0.3 cm3 Molar Volume = 164.7 ± 3.0 cm3 Parachor = 450.5 ± 4.0 cm3 Index of refraction = 1.748 ± 0.02 Surface tension = 55.9 ± 3.0 dyne/cm Density = 1.227 ± 0.06 g/cm3 Dielectric Constant = 3.35 ± 0.1 Polarizability = 26.57 ± 0.5 10-24cm3 Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 9 - Molecular Weight: M 202.255. Source/Synthesis: Constit. of Elsholtzia ciliata. Use/Importance: Shows antiviral activity. Physical Description: Needles or plates (EtOH). Melting Point: Mp 110 deg. Boiling Point: Bp 384 deg. Bp 60 250-251 deg. Other Data: Warm conc. H2SO4 -> blue colour. Hazard Toxicity: >>LD50 (rat, orl) 2000 mg/kg. Mutagenic and carcinogenic props.. RTECS Accession Number: >>LL4025000. Supplier(s): Aldrich 42394-7; Fluka 46530; Rare Chemicals Library S44235-6; Sigma F4418; Supelco 4-8535. Derivative: Picrate Chapman Hall Number: BLK08-N CAS Registry Number: 55671-71-1 Melting Point: Mp 184-185 deg. Derivative: 1,3,5-Trinitrobenzene complex (1:1) Chapman Hall Number: BLK09-O CAS Registry Number: 55671-70-0 Melting Point: Mp 208.5-209.4 deg. References: Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra,1992, 2, 53C (nmr) Aldrich Library of FT-IR Spectra, 1st edn.,1985, 1, 965C (ir) Aldrich Library of FT-IR Spectra: Vapor Phase,1989, 3, 887D (ir) Meyer, R. et al.,Ber.,1920, 53, 1261 (synth) v. Braun, J. et al.,Ber.,1929, 62, 145 (synth) Orchin, M.T. et al.,J.A.C.S.,1947, 69, 505 (synth, uv) Horwood Tucker, S. et al.,Chem. Rev.,1952, 50, 483 (rev) Heffernan, M.L. et al.,Aust. J. Chem.,1967, 20, 589 (pmr) Sasaki, T. et al.,J.C.S. Perkin 1,1974, 1213 (synth) Hazell, A.C. et al.,Acta Cryst. B,1977, 33, 1516 (cryst struct) Das Gupta, N.K. et al.,Bull. Chem. Soc. Jpn.,1978, 51, 1211 (uv) Shushan, B. et al.,Org. Mass Spectrom.,1980, 15, 445 (ms) Maly, E., Monatsh. Chem.,1981, 112, 1103 (synth) Qui, Z.W. et al.,J.A.C.S.,1982, 104, 2747 (cmr) Harvey, R.G., Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: Chemistry and Carcinogenicity,Cambridge University Press, 1991, 238 Yip, L. et al.,Planta Med.,1995, 61, 187 (isol, activity) Lewis, R.J., Sax's Dangerous Properties of Industrial Materials,8th edn., Van Nostrand Reinhold, 1992, FDF000 [00070739-0] Fig. 4. Espectro de masas del Fluoranteno. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 10 - Fig. 5. Espectro de UV del Fluoranteno. FICHA TÉCNICA (Datos suministrados por la casa comercial Aldrich): DATOS DE TOXICIDAD Dosis letal 50 vía oral en ratas o ratones: 2000 mg/kg -Ligeramente tóxico+ -Carcinogenicidad: OSHA: (NO) IARC: (YES) ACGIH: (NO) NIOSH: (NO) OTROS: (NO) DATOS FÍSICOS Punto de fusión: 107-110ºC Punto de ebullición: 375ºC Densidad: 1.252 Presión de vapor: 0.01 mm@20C Densidad de vapor: 7.0 Olor: inodoro Color: amarillo pálido Fase: sólido cristalino Solubilidad en agua: insoluble (inmiscible) PELIGRO DE EXPLOSIÓN E INCENDIO Medio de extinción: sin peligro de explosión o fuego Límite inferior de explosión: 1%. PELIGROSIDAD PARA LA SALUD No se deben de llevar lentes de contacto en el laboratorio. Se deben considerar peligrosos todos los productos químicosEvitar el contacto físico directo. Posible carcinógeno. Puede ser perjudicial inhalación, ingestión o absorción dérmica. Puede causar irritación en los ojos. Puede causar irritación en la piel. Puede ser irritante para las membranas mucosas. Posible mutágenoPuede causar defectos de nacimiento en generaciones futuras. DATOS DE REACTIVIDAD Combustible. Emite gases tóxicos en caso de incendio. Productos de descomposición o combustión peligrosos: monóxido y dióxido de carbono. Incompatible con agentes oxidantes fuertes. La descomposición libera vapores tóxicos. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 11 - Pireno (Pir) Entry Name: Pyrene Chapman Hall Number: FPS46-F CAS Registry Number: 129-00-0 Molecular Formula: C16H10 Molecular Weight: M 202.255. Source/Synthesis: Constit. of coal tar. Use/Importance: Intermed. in synth. of Benzo[a]pyrene #FMP62-X. Physical Description: Pale-yellow plates by subl.. Solubility: Sol. Et2O, CS2, C6H6, toluene. Melting Point: Mp 149-150 deg. Boiling Point: Bp 360 deg. Dissociation Constant: pKa -8.2 (H2SO4 aq.). Other Data: Solns. show blue fluor.. Hazard Toxicity: >>Poss. carcinogen (theory predicts weak activity, no certain evidence). Skin irritant. LD50 (rat, orl) 2700 mg/kg. RTECS Accession Number: >>UR2450000. Supplier(s): Aldrich 13159-8; Fluka 82650; Rare Chemicals Library S44354-9; Sigma P2146; Supelco R43-0780. References: Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra,1992, 2, 55A (nmr) Aldrich Library of FT-IR Spectra, 1st edn.,1985, 1, 967B (ir) Elsevier's Encycl. Org. Chem.,Ser. III, Vol. 14, 1940, 376 Baker, W. et al.,Chem. Ind. (London),1950, 77 (synth) Saha, N.N. et al.,J.O.C.,1955, 20, 1392 (synth) Hansen, P.E. et al.,Acta Chem. Scand.,1971, 25, 3377 (cmr) Hazell, A.C. et al.,Acta Cryst. B,1972, 28, 2977 (cryst struct) Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis,Wiley, 1974, 4, 414 Mullens, K., Helv. Chim. Acta,1978, 61, 2307 (nmr) Kimura, T. et al.,J.O.C.,1978, 43, 1247 (synth) IARC Monog.,1983, 32, 431; ,Suppl. 7, 71 (rev, tox) Harvey, R.G., Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: Chemistry and Carcinogenicity,Cambridge University Press, 1991, 174 (rev) Sakamoto, Y. et al.,Chem. Pharm. Bull.,1992, 40, 1991 (bibl, tox) Lewis, R.J., Sax's Dangerous Properties of Industrial Materials,8th edn., Van Nostrand Reinhold, 1992, PON250 [00073833-9] Molecular formula = C16 H10 Molecular Weight = 202.251 Composition = C(95.02%) H(4.98%) Molar Refractivity = 72.46 ± 0.3 cm3 Molar Volume = 161.9 ± 3.0 cm3 Parachor = 449.6 ± 4.0 cm3 Index of refraction = 1.851 ± 0.02 Surface tension = 59.4 ± 3.0 dyne/cm Density = 1.248 ± 0.06 g/cm3 Dielectric Constant = 3.41 ± 0.1 Polarizability = 28.72 ± 0.5 10-24cm3 Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 12 - Fig. 6. Espectro de masas del Pireno. Fig. 7. Espectro de UV del Pireno. Benzo[a]antraceno (BaA) Molecular formula = C18 H12 Molecular Weight = 228.288 Composition = C(94.70%) H(5.30%) Molar Refractivity = 79.78 ± 0.3 cm3 Molar Volume = 191.7 ± 3.0 cm3 Parachor = 518.7 ± 4.0 cm3 Index of refraction = 1.771 ± 0.02 Surface tension = 53.5 ± 3.0 dyne/cm Density = 1.190 ± 0.06 g/cm3 Dielectric Constant = 3.24 ± 0.1 Polarizability = 31.62 ± 0.5 10-24cm3 Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 13 - Entry Name: Benz[a]anthracene Synonym(s): 1,2-Benzanthracene. Naphthanthracene. 2,3-Benzophenanthrene. Tetraphene. 1,2-Benzanthrene Chapman Hall Number: FMM78-R CAS Registry Number: 56-55-3 Molecular Formula: C18H12 Molecular Weight: M 228.293. Physical Description: Leaflets (EtOH/AcOH). Melting Point: Mp 158-159 deg. Dissociation Constant: pKa –7.5 (H2SO4 aq.). Other Data: Sublimes. Sols. Fluor. Intense yellowish-green. Hazard Toxicity: >>Probable human carcinogen. Exp. Weak carcinogen. RTECS Accession Number: >>CV9275000. Supplier(s): Aldrich B220-9; Fluka 12090; Rare Chemicals Library S43594-5; Sigma B2750; Supelco R43-0720. Derivative: Picrate Chapman Hall Number: FMM79-S CAS Registry Number: 5928-81-4 Physical Description: Red needles. Melting Point: Mp 133 deg. References: Aldrich Library of FT-IR Spectra, 1st edn.,1985, 1, 966ª (ir) Aldrich Library of FT-IR Spectra: Vapor Phase,1989, 3, 888ª (ir) Aldrich Library of NMR Spectra, 2nd edn.,1983, 1, 769C (nmr) Graebe, C., Annalen,1905, 340, 249 (synth) Badger, G.M. et al.,J.C.S.,1939, 802 (synth) Batterham, T.J. et al.,Aust. J. Chem.,1966, 18, 1959 (nmr) Mukherji, S.M. et al.,Tetrahedron,1967, 23, 3859 (synth, ir, uv) Buchta, E. Et al.,Annalen,1968, 716, 102 (synth) Mitra, A.K. et al.,J. Indian Chem. Soc.,1971, 48, 391 (synth) Newman, M.S. et al.,J.O.C.,1979, 44, 1347 (synth) Akiyama, I. Et al.,J.A.C.S.,1981, 103, 6330 (pe) IARC Monog.,1983, 32, 135; ,Suppl. 7, 58 (rev, tox) Harvey, R.G., Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: Chemistry and Carcinogenicity,Cambridge University Press, 1991, 164 (rev) Takeuchi, I. Et al.,Chem. Pharm. Bull.,1993, 41, 747 (uv) Lewis, R.J., Sax’s Dangerous Properties of Industrial Materials,8th edn., Van Nostrand Reinhold, 1992, BBC250 [00071378-8] Fig. 8. Espectro de masas del BaA. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 14 - Fig. 9. Espectro de UV del BaA. Criseno (Cri) Entry Name: Chrysene, 9CI Synonym(s): Benzo[a]phenanthrene. 1,2-Benzophenanthrene Chapman Hall Number: FNB48-M CAS Registry Number: 218-01-9 Molecular Formula: C18H12 Molecular Weight: M 228.293. Physical Description: Plates (C6H6 or AcOH) with reddish-violet fluor.. Melting Point: Mp 255-256 deg. Boiling Point: Bp 448 deg. Hazard Toxicity: >>Human carcinogen, exp. carcinogen by skin contact. RTECS Accession Number: >>GC0700000. Supplier(s): Aldrich 24518-6; Fluka 27220; Sigma C6898; Supelco 4-8565. References: Aldrich Atlas of IR Spectra,2nd Ed., 518 (ir) Aldrich Library of FT-IR Spectra, 1st edn.,1985, 1, 966D (ir) Jarrett, A.D. et al.,J.C.S.,1955, 4052 Davies, W. et al.,J.C.S.,1957, 4967 (synth) Hunt, S.E. et al.,J.C.S.,1958, 227 (uv) Memory, J.D., J. Chem. Phys.,1966, 45, 3567 (pmr) IARC Monog.,1983, 32, 247; ,Suppl. 7, 60 (rev, tox) Jones, A.J. et al.,Aust. J. Chem.,1984, 37, 561 (pmr, cmr) Bax, A. et al.,J.O.C.,1985, 50, 3029 (cmr, pmr) Harvey, R.G., Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: Chemistry and Carcinogenicity,Cambridge University Press, Molecular formula = C18 H12 Molecular Weight = 228.288 Composition = C(94.70%) H(5.30%) Molar Refractivity = 79.78 ± 0.3 cm3 Molar Volume = 191.7 ± 3.0 cm3 Parachor = 518.7 ± 4.0 cm3 Index of refraction = 1.771 ± 0.02 Surface tension = 53.5 ± 3.0 dyne/cm Density = 1.190 ± 0.06 g/cm3 Dielectric Constant = 3.24 ± 0.1 Polarizability = 31.62 ± 0.5 10-24cm3 Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 15 - 1991, 159 (rev) Lewis, R.J., Sax's Dangerous Properties of Industrial Materials,8th edn., Van Nostrand Reinhold, 1992, CML810 [00071962-X] Fig. 10. Espectro de masas del Criseno. Fig. 11. Espectro de UV del Criseno. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 16 - Benzo[b]fluoranteno (BbF) Entry Name: Benz[e]acephenanthrylene, 9CI Synonym(s): Benzo[b]fluoranthene. 3,4-Benzofluoranthene Chapman Hall Number: FMM92-R CAS Registry Number: 205-99-2 Molecular Formula: C20H12 Molecular Weight: M 252.315. Physical Description: Needles (C6H6 or EtOH). Melting Point: Mp 168 deg. Hazard Toxicity: >>Possible human carcinogen. Exp. Carcinogen and neoplastic agent. RTECS Accession Number: >>CU1400000. Supplier(s): Aldrich 27533-6; Supelco R43-0740. Derivative: Picrate Chapman Hall Number: FMM93-S Physical Description: Yellow needles (EtOH). Melting Point: Mp 156 deg. Derivative: 1,3,5-Trinitrobenzene complex Chapman Hall Number: FMM94-T Physical Description: Orange-yellow needles (EtOH). Melting Point: Mp 179 deg. References: Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra,1992, 2, 56ª (nmr) Tobler, R. Et al.,Helv. Chim. Acta,1941, 24, 100E (synth) Buu-Hoi, N.P. et al.,J.C.S.,1959, 1845 (synth) Bartle, K.D. et al.,Spectrochim. Acta A,1964, 25, 1603 (nmr) Lavitt Lamy, D. Et al.,Bull. Soc. Chim. Fr.,1966, 2613 (uv) Jutz, C. et al.,Angew. Chem., Int. Ed.,1972, 11, 315 (synth) Jones, D.W. et al.,Spectrochim. Acta A,1974, 30, 489 (nmr) Brennan, J. et al.,J. Chem. Res., Synop.,1977, 107 (synth) Praefcke, K. et al.,Annalen,1978, 1399 (synth, ms) Amin, S. Et al.,J.O.C.,1981, 46, 2573 (synth, tox, bibl) IARC Monog.,1983, 32, 147; ,Suppl. 7, 58 (rev, tox) Anthony, I.J. et al.,Aust. J. Chem.,1984, 37, 1283 (synth) Chung, Y.-S. Et al.,J.O.C.,1987, 52, 1284 (synth, uv, pmr, ms) Cho, B.P. et al.,J.O.C.,1987, 52, 5668; ,5679 (synth, pmr, cmr) Lewis, R.J., Sax’s Dangerous Properties of Industrial Materials,8th edn., Van Nostrand Reinhold, 1992, BAW250 [00071387-3] Molecular formula = C20 H12 Molecular Weight = 252.309 Composition = C(95.21%) H(4.79%) Molar Refractivity = 84.86 ± 0.3 cm3 Molar Volume = 198.8 ± 3.0 cm3 Parachor = 554.3 ± 4.0 cm3 Index of refraction = 1.798 ± 0.02 Surface tension = 60.4 ± 3.0 dyne/cm Density = 1.268 ± 0.06 g/cm3 Dielectric Constant = 3.46 ± 0.1 Polarizability = 33.64 ± 0.5 10-24cm3 Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 23 - Fig. 18. Espectro de masas del BghiP. Fig. 19. Espectro de UV del BghiP. FICHA TÉCNICA (Datos suministrados por la casa comercial Sugelabor): DATOS DE TOXICIDAD No se han encontrado datos de toxicidad. Se asume que es peligroso. DATOS FÍSICOS Punto de fusión: 277-279ºC Punto de ebullición: >500ºC Color: amarillo Fase: sólido cristalino Solubilidad en agua: insoluble (inmiscible). PELIGRO DE EXPLOSIÓN E INCENDIO Medio de extinción: dióxido de carbono, polvo seco o spray. No se disponen de límites de explosión para este compuesto. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 24 - PELIGROSIDAD PARA LA SALUD No se deben de llevar lentes de contacto en el laboratorio. Se deben considerar peligrosos todos los productos químicosEvitar el contacto físico directo. Puede ser fatal si se absorbe a través de la piel. Puede ser fatal si se inhala. Puede ser fatal si se traga. Indeno[1,2,3-cd]pireno (IndP) Entry Name: Indeno[1,2,3-cd]pyrene, 9CI Synonym(s): 1,10-(1,2-Phenylene)pyrene Chapman Hall Number: BLG60-D CAS Registry Number: 193-39-5 Molecular Formula: C22H12 Molecular Weight: M 276.337. Source/Synthesis: Component of industrial smog, cigarette smoke, car exhausts, etc.. Physical Description: Yellow cryst. (cyclohexane), bright-yellow plates (petrol/C6H6). Melting Point: Mp 161-163.5 deg. Other Data: Green-yellow fluor. In soln.. Hazard Toxicity: >>Possible human carcinogen. Exp. Carcinogen. RTECS Accession Number: >>NK9300000. Supplier(s): Rare Chemicals Library S45913-5; Supelco R43-0830. References: Aitkin, J.M. et al.,J.C.S.,1956, 3487 (synth) Studt, P., Annalen,1978, 528 (synth) IARC Monog.,1983, 32, 373; ,Suppl. 7, 64 (rev, tox) Cho, B.P. et al.,J.O.C.,1987, 52, 5668; ,5679 (synth, pmr, cmr) Harvey, R.G., Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: Chemistry and Carcinogenicity,Cambridge University Press, 1991, 250 (rev) Lewis, R.J., Sax’s Dangerous Properties of Industrial Materials,8th edn., Van Nostrand Reinhold, 1992, IBZ000 [00070610-6] Molecular formula = C22 H12 Molecular Weight = 276.331 Composition = C(95.62%) H(4.38%) Molar Refractivity = 95.39 ± 0.3 cm3 Molar Volume = 203.1 ± 3.0 cm3 Parachor = 589.1 ± 4.0 cm3 Index of refraction = 1.912 ± 0.02 Surface tension = 70.7 ± 3.0 dyne/cm Density = 1.360 ± 0.06 g/cm3 Dielectric Constant = 3.72 ± 0.1 Polarizability = 37.81 ± 0.5 10-24cm3 Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 25 - Fig. 20. Espectro de masas del IndP. Fig. 21. Espectro de UV del IndP. FICHA TÉCNICA (Datos suministrados por la casa comercial Sugelabor): Otro nombre: 2,3-fenileno pireno DATOS DE TOXICIDAD Dosis letal 50 vía oral en ratas o ratones: 72 mg/kg -Tóxico+ -Carcinogenicidad: OSHA: (NO) IARC: (NO) NTP: (YES) ACGIH: (NO) NIOSH: (NO) OTROS: (YES). DATOS FÍSICOS Punto de fusión: 161-163ºC Punto de ebullición: 536ºC Presión de vapor: <0.1 mm@40 C Color: amarillo Fase: sólido cristalino Solubilidad en agua: insoluble (inmiscible) PELIGRO DE EXPLOSIÓN E INCENDIO Punto de inflamación: 200+ C Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 26 - Medio de extinción: dióxido de carbono, polvo seco o spray. No se disponen de límites de explosión para este compuesto. PELIGROSIDAD PARA LA SALUD No se deben de llevar lentes de contacto en el laboratorio. Se deben considerar peligrosos todos los productos químicosEvitar el contacto físico directo. Carcinógeno sospechosoPuede producir cáncer. Basándose en la toxicidad de compuestos de estructura similar este material es con probabilidad altamente peligroso. DATOS DE REACTIVIDAD Baja reactividad. Incompatible con agentes oxidantes fuertes. Inflamable. Incompatible con metales activos (por Ej. sodio). 1.3. ETIOLOGÍA Básicamente, en todo proceso en que compuestos orgánicos sean calentados a elevada temperatura o se produzca su combustión de forma incompleta, se pueden originar PAHs. Por tanto, su origen puede ser natural (incendios) o antropogénico (combustión de automóviles, etc.). Sin embargo, las cantidades de PAHs procedentes de fuentes naturales son insignificantes comparadas con las cantidades generadas por la actividad humana (Gadzala y Buszewski, 1995; Connell, 1997). 1.3.1. FUENTES NATURALES Las principales fuentes naturales de PAHs en el medio ambiente son las siguientes (Derache, 1990; Gadzala y Buszewski, 1995; ATSDR, 1996; Connell, 1997): - Procesos de biosíntesis: la presencia de PAHs en alimentos no procesados se atribuye principalmente a la polución ambiental (Guillén, 1994). - Reacciones geoquímicas: Un ejemplo típico es la transformación de la materia orgánica en petróleo, carbón y pizarras bituminosas. Durante la formación geológica de gasolinas, se pueden originar por diferentes procesos. En la formación de carbón y petróleo, materiales biológicos se rompen bajo presiones y temperaturas moderadas (inferiores a 200ºC), bajo estas condiciones, los PAHs se pueden formar por mecanismos similares a los implicados en combustiones incompletas. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 27 - A causa de las bajas temperaturas implicadas, las transformaciones ocurren más lentas. - Procesos naturales de pirólisis: actividad volcánica e incendios forestales, son las más comunes. 1.3.2. FUENTES ANTROPOGÉNICAS A altas temperaturas, superiores a 500ºC, algunos enlaces C-C, C-H y otras uniones, se rompen para formar finalmente radicales libres. Dependiendo de la cantidad de oxígeno presente, algunos de estos fragmentos orgánicos reaccionan con otros radicales formando moléculas más complejas, como los PAHs (Fig. 22) (Connell, 1997). Como consecuencia, se puede originar una gran variedad de PAHs en función de las condiciones que existan en la atmósfera. Las trazas de PAHs formados, también dependen de la temperatura de combustión y de la naturaleza del material orgánico. Sin embargo, independientemente del tipo de material quemado (celulosa, tabaco, poliestireno y otros materiales poliméricos), similares grupos de PAHs se forman a una temperatura determinada. Los PAHs recogidos en la Tabla 1, son los más comúnmente formados en procesos de combustión (Connell, 1997). Tabla 1. PAHs más usualmente formados en procesos de combustión. PAHs Fórmula Presión de vapor (kPa) solubilidad en agua (mol/L) log Kow Ant C14H10 1,44∗10-64,10∗10-74,54 Fl C16H10 2,54∗10-41,29∗10-64,90 Pir C16H10 8,86∗10-76,68∗10-75,18 BaA C18H12 -------- 6,14∗10-85,61 BaP C20H12 6,67∗10-13 1,51∗10-86,04 Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 28 - Fig. 22. Posible mecanismo de formación de PAHs durante la combustión. (Connell, 1997). Las principales fuentes antropogénicas de los PAHs son (Derache, 1990; Gadzala y Buszewski, 1995; ATSDR, 1996): - Industria: producción de alúmina, acero, asfalto, hierro, etc. - Calefacciones: calderas de calefacción central, chimeneas, estufas de carbón, madera, gas, fuel-oil, etc. - Incineraciones municipales e industriales, combustión de residuos, quema de rastrojos, praderas, etc. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 29 - - Transporte: vehículos de gasolina y diesel, abrasión de las llantas de los coches, etc. - Accidentes: de especial interés los buques petroleros, en los que además del gran impacto ambiental que suponen, pueden producirse incendios en los que se generan cantidades elevadas de PAHs, como ocurrió en el buque "Aegean Sea", que naufragó en la ciudad de La Coruña en diciembre de 1992. - Humo de tabaco. 1.4. OBTENCIÓN COMERCIAL Los PAHs en Estados Unidos, solo son producidos por un único laboratorio químico. Sin embargo, los principales PAHs (Ant, Fl, Pir, Cri, etc.), compuestos sólidos que presentan diferentes colores (blanco, amarillo-verdoso, etc.) (ATSDR, 1996), se obtienen en el ámbito comercial a partir del alquitrán de hulla y del aceite de creosota, que se forma en los procesos de pirólisis del carbón bituminoso o hulla con un rendimiento del 3% con relación al peso original del carbón (Fieser y Fieser, 1966; ATSDR, 1990). El primer componente aislado (1820), y el más abundante en el alquitrán, fue el Naftaleno (rendimiento medio con relación al peso del alquitrán próximo al 11%). Sin embargo, el que mayor interés tenía para los fabricantes era el Antraceno (aislado en 1832), por su importante valor como materia prima para la fabricación de la alizarina (el primer colorante natural que se preparó sintéticamente en 1868) y de los colorantes del grupo del Indantreno (1901). La mayoría de los hidrocarburos restantes, al no presentar aplicaciones importantes, sólo unos pocos se utilizan en medicina, colorantes, plásticos y pesticidas (ATSDR, 1996), se obtienen en cantidades limitadas para la síntesis de laboratorio, y con altos costes, ya que la obtención de los mismos en estado puro implica numerosos y Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 30 - complejos tratamientos (Karcher, 1985), no habiéndose desarrollado grandes tecnologías para su producción a mayor escala. 1.5. TOXICOLOGIA El principal problema o inquietud de la presencia de PAHs en el medio ambiente, es su reconocida capacidad para producir cáncer en los organismos expuestos. Es importante empezar definiendo tres conceptos toxicológicos que posteriormente van a ser utilizados para la clasificación toxicológica de los PAHs (Connell, 1997): Teratógeno: "sustancias que causan defectos en el proceso de la reproducción". Mutágeno: "sustancias que producen cambios hereditarios en el DNA del esperma o del óvulo". Carcinógeno: "sustancias que causan en las células pérdida de sensibilidad a factores que normalmente regulan su crecimiento y replicado. Cada célula replicada con una restricción, forma el crecimiento de una masa llamada tumor". Un grupo de PAHs presentan una actividad carcinogénica fuerte en animales de experimentación (cáncer de piel), particularmente el BaA, BaP, BbF e IndP, y por lo tanto también pueden ser carcinógenos para el hombre; aunque en otros PAHs dicha actividad no está demostrada. Sin embargo, casi todos los PAHs son sospechosos de ser carcinogénos, aunque estos niveles puedan ser muy bajos (ATSDR, 1990; Connell, 1997). Estudios epidemiológicos ocupacionales de cánceres de piel, han proporcionado una fuerte evidencia presuntiva del papel positivo de los PAHs en ciertos tipos de cáncer humano (Fawell y Hunt, 1988), y otros ensayos realizados con sistemas bacterianos y líneas celulares en "vitro" e "in vivo", han evidenciado el carácter mutagénico de algunos de ellos (WHO, 1984). Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 31 - Por lo que se refiere a la teratogenicidad de los PAHs, los datos de los que se disponen son escasos, pero los que se tienen del BaP, indican que estos efectos ocurren solamente a dosis comparativamente altas. Es aceptado, que prácticamente todos los carcinógenos son mutágenos, pero no todos los mutágenos son carcinógenos (Shaw y Connell, 1994; Ware, 1994). No es mucha la información que se dispone sobre la toxicidad aguda, subaguda y crónica de los PAHs después de su ingestión. No obstante, se ha comprobado que los PAHs causan hiperqueratosis, hiperplasias y pérdidas de glándulas sebáceas en la piel, y que algunos como el 7,12-dimetilbenzo[a]antraceno, tiene un marcado efecto en la médula ósea y en el tejido linfoide (suprimen o reducen la respuesta inmunitaria) (Borget y col, 1993). Los síntomas que evidencian fenómenos de toxicidad no suelen aparecer hasta que la dosis es la suficiente para originar tumores (WHO, 1984). 1.5.1 REVISION HISTORICA En 1775, Sir Percival Pott, cirujano inglés, observa cáncer de escroto en los deshollinadores, cuyo agente causal era el hollín (Fabre y Truhaut, 1976; Katiyar y col., 1993, Sherma, 1993). Como resultado de este descubrimiento, se estudiaron los efectos biológicos del alquitrán de hulla. El Dibenzo[a,h]antraceno fue el primer compuesto (sintetizado en 1930), en el que se encontro actividad carcinogénica. En 1933, se aisló a partir del alquitrán de hulla, el BaP, compuesto químico que exhibía una alta actividad cancerígena, y que era, al igual que en el caso anterior, un hidrocarburo aromático de cinco ciclos. A partir de entonces, numerosos estudios permitieron confirmar las propiedades carcinogénicas de algunos PAHs, subproductos de la combustión incompleta de combustibles orgánicos fósiles, tales como el carbón, y de otros que fueron obtenidos más tarde sintéticamente (Katiyar y col., 1993, Sherma, 1993). Entre los cánceres profesionales de origen químico descritos posteriormente, hay que destacar sobre todo los cánceres de piel que aparecen en los obreros que manipulan ciertos productos de la hulla, y en particular, los alquitranes y sus residuos de Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 32 - destilación (breas), o incluso ciertos productos pesados de la destilación de los petróleos crudos, y en especial, las parafinas (cánceres de los parafinadores) y de los aceites pesados (cánceres de los refinadores de petróleo) (Fabre y Truhaut, 1976). La actividad cancerígena no es patrimonio exclusivo de los compuestos del grupo de los hidrocarburos aromáticos altamente condensados, pero hay que resaltar que es precisamente en este grupo en el que se encuentran los agentes cancerígenos más activos (Fabre y Truhaut, 1976). 1.5.2 ACTIVACIÓN METABÓLICA Conocida su alta liposolubilidad, los PAHs sufren una rápida absorción a través del intestino y/o pulmones, y se distribuyen vía sanguínea o hepática a una gran variedad de tejidos, con una particular tendencia a localizarse en el tejido adiposo. Esta tendencia, sin embargo, no es muy manifiesta debido a su rápido metabolismo, como consecuencia de la cual se forman metabolitos, que pueden ser carcinógenos, y que son eliminados principalmente en la orina y las heces como compuestos hidrosolubles (WHO, 1987; Fawell y Hunt, 1988). El metabolismo de los PAHs se produce vía citocromo P-450 dependiente del sistema enzimático presente en el retículo endoplasmático de las células de los mamíferos y más abundantemente en el hígado, e incluye como primeras etapas la oxidación o la hidroxilación (Shaw y Connell, 1994; Gadzala y Buszewski, 1995; Connell, 1997). Los epóxidos o fenoles resultantes pueden sufrir detoxificación y producir glucorónidos, sulfatos o conjugados con el glutation. Algunos de los epóxidos formados pueden, a su vez, ser metabolizados a dihidrodioles, los cuales pueden experimentar conjugación para formar productos de detoxificación solubles, o bien, oxidación dando diol-epóxidos. Estos últimos compuestos son considerados los carcinógenos "últimos" en los casos que se observa la carcinogenicidad (WHO, 1984). Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 39 - sólo ocurre en los ejemplares muertos, resulta un buen criterio de medida (Perrins, 1987). - El peso de las aves varía considerablemente según las condiciones de alimentación, la estación, la raza geográfica y otros muchos factores; en particular las aves acumulan grandes cantidades de grasa antes de la migración, y algunos pájaros pequeños pueden doblar su peso antes de iniciar un vuelo largo (Perrins, 1987). - El número habitual de nidadas anuales y de días que dura la incubación. - El número de días que transcurren habitualmente desde que el polluelo sale del huevo hasta que echa las plumas. Cuando el pájaro joven ha alcanzado la fase en que puede volar, pasa por un período de inmadurez (Inm) durante el cual conserva su plumaje juvenil hasta mudar al plumaje adulto (Adulto) (Perrins, 1987). - Respecto a la edad se indican tres datos. La primera cifra es la edad (en años) en que la especie suele empezar a criar. La segunda cifra indica la edad más avanzada que alcanza la especie en estado silvestre. Y la tercera cifra muestra el porcentaje de pájaros adultos que sobreviven de un año al siguiente (Perrins, 1987). - Hábitat y distribución, comportamiento, alimentación, reproducción, factores limitantes y medidas de conservación. 2.1 Buteo buteo (Ratonero común) (Perrins, 1987, Del Hoyo y col., 1994; Díaz y col. , 1996; Inter Natura). Fig. 24. Fotografía del ratonero. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 40 - Descripción: Es un ave rapaz diurna de tamaño mediano (longitud: 50-57 cm, envergadura: 113-128 cm, peso: Macho: 525-1183 g y Hembra: 625-1364 g), con plumaje relativamente variable; alas relativamente largas y anchas, cola ancha y corta de forma redondeada con varias finas franjas transversales y con una franja terminal más ancha. Cabeza robusta y cuello corto. Al remontarse presenta las alas elevadas y echadas hacia adelante. Edad 3, 25, 81%. Los Adultos presentan una parte superior marrón oscuro, con líneas blancas en la cabeza. Parte inferior de gran variedad de colorido desde muy oscuros a muy claros presentando unas manchas claras llamativas debajo de las alas. El pecho es blanquecino con multitud de manchas oscuras. En la cola presenta unas bandas transversales oscuras, finas y una línea subterminal más ancha. Los dos sexos son iguales respecto al colorido. Los Jóvenes son muy parecidos a los adultos, pero con la cabeza, dorso y partes inferiores más claras. En la cola falta la banda subterminal ancha. Hábitat: Predominan en las zonas boscosas frente a las de matorral, que normalmente son utilizadas junto a las zonas cultivadas como cazaderos. Se observan también en las zonas boscosas mixtas. En invierno utilizan los terrenos abiertos con árboles dispersos. Es decir, se encuentran en hábitats abiertos: montañas, costas, regiones agrícolas con bosques. Comportamiento: Es una especie sedentaria en España, que se distribuye por toda la Península, detectándose las mayores densidades invernales en la Meseta Norte, Extremadura y Galicia, más cuanto más cerca de áreas montañosas. Alimentación: La alimentación es muy variada, adaptándose a diferentes tipos de presa, según la localidad donde se encuentre, y según la estación del año. Está basada principalmente Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 41 - en reptiles, mamíferos pequeños y medianos (ratas, hámsters...), especialmente conejos, pequeñas aves y carroña. Reproducción: Suelen nidificar en pinos, donde construyen varios nidos de tamaño medio junto a la horquilla principal. Para la construcción utilizan troncos y ramas de pino y matorral leñoso tapizando esta estructura con ramitas y hojas de pino. La puesta suelen efectuarla a mediados de marzo-abril. En ocasiones muy aisladas pueden nidificar en repisas de cortados rocosos. Suelen ser de 1 a 5 huevos blancos, moteados de pardo rojizo, 57 mm. Los huevos eclosionan a los 30-35 días. Factores limitantes y medidas de conservación: Es una de las rapaces que más ha disminuido en los últimos años debido fundamentalmente a la gran deforestación (incendios forestales) y a la persecución directa por parte del hombre, sobre todo por la caza ilegal. 2.2 Strix aluco (Cárabo común) (Perrins, 1987; Díaz y col. , 1996; Brinzal, 1998; Inter Natura) Fig. 25. Fotografía del cárabo. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 42 - Descripción: Es un ave rapaz nocturna de mediano tamaño (longitud: 37-46 cm, envergadura: 90-100 cm, peso: Macho:330-490 g y Hembra: 336-695 g). Tienen forma rechoncha, no posee penachos y el rostro está dividido por una franja. El plumaje es muy críptico, y existen dos coloraciones: gris y pardo-rojiza, con estados intermedios. Posee alas cortas y anchas, y cola corta también para maniobrar bien entre ramas y follaje. Tienen el pico amarillo y los ojos negros, con el borde del párpado rosado. Existe un fuerte diformismo sexual en cuanto al peso: las hembras son mucho mayores que los machos. Edad 1, 18, 74%. Los Adultos presentan el dorso, alas y cabeza de color castaño rojizos o grises gaspeados de negro. Sobre las plumas escapulares y las coberturas de las alas destacan unas manchas blanquecinas. El pecho y vientre va de colores rojizos a grisáceos con manchas verticales oscuras. El disco facial bien delimitado, dividido por una raya gruesa y negra que parte de la frente y llega a la base del pico. Presenta gran variabilidad de colorido individual, aunque predominan los rojizos y grises en España, aunque existe otro marrón en Europa, Hábitat y Distribución: Permanecen en el territorio en el que nidifican durante todo el año, siendo su hábitat más típico el bosque caducifolio, de coníferas, dehesas, aunque pueden vivir próximos al hombre, y utiliza cortados rocosos de barrancos. Distribución discontinua en la Península por la fragmentación de bosques. Sólo accidental en las Islas. Comportamiento: Es una especie sedentaria en España, aunque los más jóvenes pueden dispersarse hasta distancias moderadas (39 Km). Es uno de los búhos más nocturnos. Normalmente son monógamos y mantienen la misma pareja año tras año, aunque se ha dado casos de machos polígamos. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 43 - El método de caza es la espera desde un posadero, aunque también lo hacen en vuelo. Caza siempre de noche. Tiene dos picos de actividad: inmediatamente después de la puesta de sol y un poco antes de amanecer. El territorio de caza del cárabo es de aproximadamente de 1 Km2. Alimentación: Tienen una dieta muy variada, consumiendo pequeños mamíferos (32.1% de las presas), insectos, invertebrados (64.3%) y, minoritariamente aves, anfibios y reptiles, dependiendo de las estaciones del año. Es muy generaliza en su alimentación, explotando una u otra presa según su abundancia. Este factor, unido a la adaptabilidad de la especie, determina la tendencia a la alta de su población. Reproducción: No construye nido alguno, simplemente utilizan como nido agujeros naturales de árboles o agujeros en las rocas de los cortados e incluso utiliza agujeros de edificaciones humanas como iglesias, aunque aceptan muy bien las cajas de nido. No aportan ningún tipo de material al nido. La época de cría comienza a mediados de marzo. Ponen de 2 a 4 huevos de 47 mm, con intervalos de 48 horas, casi redondos y completamente blancos. Son incubados durante 28-30 días, y desde el primer huevo, por la hembra, mientras que el macho aporta la comida. Los pollos dejarán el nido a los 30 días, siendo posible observarlos por las ramas de los árboles, pero dependen de los padres para comer hasta 3 meses después. La actual política forestal ha propiciado que los cárabos se vean obligados a utilizar los sitios tradicionales de cría de la lechuza. Factores limitantes y medidas de conservación: Las mayores densidades están situadas por encima de la línea de los 800 m, y la causa más importante de su distribución es el expolio, a veces bienintencionado, de los jóvenes no volanderos. A causa de su estatus poblacional y de la competencia que ejerce con la lechuza, no se estiman necesarias medidas especiales para su conservación. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 44 - 2.3 Tyto alba (Lechuza) (Perrins, 1987; Díaz y col. , 1996; Brinzal, 1998; Inter Natura) Fig. 26. Fotografía de la lechuza. Descripción: Es un ave rapaz nocturna de tamaño mediano (longitud: 33-39 cm, envergadura: 90-95 cm, peso: Macho: 290-340 g y Hembra: 330-360 g), fácilmente reconocible por su blanca coloración general y por su característico disco facial en forma de corazón. A diferencia de otras especies no posee penachos. Sus ojos son de color negro y el pico color marfil. Edad 1(2), 18. Se diferencian dos subespecies: T. a. alba: Predominante en el sur de Europa, posee el pecho de color blanco más o menos moteado y el dorso es color ante. T. a. guttata: Más característica del centro y norte de Europa, se diferencia de la anterior en que el pecho es color ante, muy moteado, y las partes dorsales de color pardo rojizo dorado. Existen coloraciones intermedias resultado de la hibridación de ejemplares de ambas subespecies (Brinzal, 1998). Los Adultos presentan el dorso y partes superiores de las alas de colores rojizos, con tonalidades doradas de tonos grises. La cabeza es amarilla dorada con tonos grises en la parte más alta. El disco facial forma un corazón enmarcado de plumas cortas y tonos dorados. En las partes inferiores destaca el blanco puro del pecho y vientre, en las alas este color esta salpicado por unos puntos negros. Las patas sobresalen enormemente. Los jóvenes son muy similares a los adultos (Internatura). Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 45 - Hábitat y Distribución: Es una especie de espacios abiertos. Descansa y cría en casas viejas, graneros, buhardillas, etc., es decir, muy ligada a zonas pobladas, aunque también habita grietas y cuevas en escarpes rocosos por debajo de los 1300m de altitud. La lechuza común puede encontrarse en toda la Península Ibérica (Brinzal, 1998). Comportamiento: Es una especie sedentaria en España, con un territorio fijo durante todo el año, con dispersiones juveniles de corta distancia (87 Km). El tamaño de su territorio varía en función de la existencia de sitios para alojarse y de la disponibilidad de alimento. Generalmente habitan en zonas agrícolas abiertas. La mayoría de los adultos permanecen emparejados en invierno. Tienen dos fases de actividad: la primera poco después de la puesta de sol, y la otra antes del amanecer. Sin embargo, durante la época de cría o en invierno, puede cazar durante todo el día. La caza la realizan desde algún posadero o percha, o bien mediante cernidos e inspecciones por el terreno con vuelo bajo. La mayoría de las presas las consigue en el suelo, a veces sobre arbustos. Su vuelo es completamente silencioso, lo que le permite escuchar los ruidos que delaten a las presas y acercarse a ellas sin ser escuchada. Alimentación: La dieta es muy diversa, basada principalmente en micromamíferos, sobre todo pequeños murinos (ratón de campo y ratón doméstico), microtinos (ratillas y topillos) e insectívoros (musarañas), aunque también de forma ocasional pueden alimentarse de otros mamíferos de tamaño medio, aves, ranas, lagartos e insectos. En Galicia concretamente su principal alimentación consiste en microtinos, murinos e insectívoros. Ingiere diariamente unos 100 g de comida, y tragan las presas enteras, o si se trata de pollos, decapitadas. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 46 - Reproducción: Anidan en campanarios, graneros, desvanes o cualquier hueco de edificios, pero no construyen nido sino que la puesta se realiza sobre una capa de egagrópilas. La primera puesta suele ser hacia el mes de abril, a veces se da una segunda en el mes de julio, e incluso existen citas de una tercera puesta. Suelen ser de 4 a 7 huevos blancos elípticos de 40 mm. Los huevos eclosionan a los 3034 días, y los pollos estarán recubiertos de un primer plumón los primeros 15 días, siendo sustituido por otro más largo. A esta edad ya tragan las presas enteras y hacia la novena semana vuelan perfectamente. Factores limitantes y medidas de conservación: El principal factor limitante es la línea de los 800 m, lo que limita el gradiente poblacional. Sin embargo, fuera de este factor natural, la pérdida de lugares de nidificación supone el principal problema para la especie. Además cabe destacar la altísima tasa de mortalidad que se produce en carreteras (atropello), caza ilegal, expolio de nidos, así como la influencia que tienen los raticidas y rodenticidas debido a sus hábitos alimenticios. 2.4. LEGISLACIÓN La Orden del 9 de Julio de 1998 (BOE 172/1998 del 20 de Julio de 1998), corregida el 11 de Agosto de 1998 (BOE 191/1998), por la que se incluyen determinadas especies en el Catálogo Nacional de Especies amenazadas y cambian de categorías otras especies que ya están incluidas en el mismo, catalogan la propuesta de la Comisión Nacional de Protección de la Naturaleza, y en virtud de lo establecido en el Anexo II del Real Decreto 439/1990 (BOE 82/1990 del 30 de Marzo de 1990), a las especies de aves objeto de este estudio, como Especies de Interés Especial. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 47 - 3. EXTRACCIÓN DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS La extracción de fluidos supercríticos (SFE) es una buena alternativa a los métodos convencionales de extracción con solventes líquidos (soxhlet, sonicación...), donde la extracción "líquida" se realiza con un fluido supercrítico. Este fluido supercrítico, es una sustancia que se encuentra en condiciones de presión y temperatura superiores a las de su punto crítico. Los valores de presión y temperatura en el punto crítico se denominan respectivamente presión y temperatura críticas, y dependen de la naturaleza del fluido (Langelfeld y col., 1994; Tena y col., 1994; Gadzala y Buszewski, 1995). En el diagrama de fases (presión frente a temperaturas), el punto crítico es aquel en que se interrumpe la curva de equilibrio líquido-gas o curva de vaporización (Fig. 27). Fig. 27. Diagrama de fases del CO2. El área situada encima del punto crítico y hacia la derecha, es la región supercrítica. En esta región, un fluido no es ni un líquido ni un gas, tiene propiedades de ambos. Lo cual es indicativo de que no importa cuanta presión es aplicada, ya que un Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 48 - fluido en esta región no se condensa. Y además, no importa que la temperatura sea incrementada, porque el fluido en esta región no es vaporizado. Por tanto, un fluido supercrítico posee propiedades físicas de un gas (viscosidad y difusividad), y propiedades químicas de un líquido (poder de solvatación y densidad). Lo cual le confiere una serie de ventajas (Hewlett Packard, 1990; Gadzala y Buszewski, 1995): - Poder solvente: muchas sustancias son solubles en el fluido. - Elevada difusividad: las sustancias químicas disueltas se propagan rápidamente a través del fluido a velocidades comprendidas entre aquellas de los gases y líquidos verdaderos. - No presentan tensión superficial: el fluido penetra en pequeñas hendiduras del material. - Baja viscosidad: facilita la entrada del fluido en las matrices a extraer. Esta combinación de propiedades permite a los fluidos supercríticos penetrar en un material como un gas, pero con la diferencia importante de que poseen propiedades solventes, similares a las de los líquidos. Por todo ello, son unos candidatos muy interesantes para la extracción de muestras. 3.1. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN La extracción con fluidos supercríticos puede llevarse a cabo con dos tipos de métodos: "offline" y "online" (Hewlett Packard, 1990; Camel y col., 1992b). 3.1.1. MÉTODO "OFFLINE" Se caracterizan porque los procesos de extracción y análisis se realizan individualmente. Las principales variaciones para la realización de la extracción son las siguientes: Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 55 - soporte inerte como el papel de filtro, ya que se aumenta el área de superficie expuesta al fluido supercrítico (Camel y col., 1992b). Los adsorbentes en fase sólida se utilizan en técnicas combinadas de SFE-SFC, donde el adsorbente actúa como columna cromatográfica, permitiendo la elución selectiva de los analitos. Alternativamente, se han utilizado los adsorbentes en fase sólida como eficaces rellenos de columnas de retención para la extracción con fluidos supercríticos por métodos "offline" (sílica gel, alúmina, florisil...), así como para mezclar directamente con la muestra, ejerciendo una primera purificación de la misma, y permitiendo la retención de la matriz en el vaso de extracción. La elución de analitos desde adsorbentes en fase sólida está controlada por una serie de factores interrelacionados (Furton y Lin, 1993). Entre estos cabe citar la afinidad de los analitos por el adsorbente, la presión de vapor de los analitos, la solubilidad y el coeficiente de difusividad de los mismos en el fluido supercrítico. Otra consideración es la forma en que los analitos se incorporan a la matriz (sobrecarga). Todos los solutos no pueden ser extraídos, especialmente si la matriz es muy adsorbente (partículas de aire). Por ello, las muestras sobrecargadas no siempre representan la verdadera extractibilidad de los materiales contaminados, pudiendo sobrestimar la eficacia de los métodos de extracción (Camel y col., 1992b; Tena y col., 1994). Dicha eficacia depende en gran medida de la naturaleza de la matriz y del procedimiento de sobrecarga. Además, las técnicas de sobrecarga, habitualmente requieren un solvente orgánico como vehículo para depositar el analito en la matriz, y este solvente puede afectar a la integridad química de la muestra y producir diferentes condiciones de deposición en comparación con los analitos ya presentes en ella. La competición entre moléculas de solvente y analito por los lugares de adsorción presentes en la matriz cuando el analito es depositado desde una solución líquida, puede impedir Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 56 - recuperaciones elevadas. Se ha propuesto la deposición del analito desde una fase vapor para eliminar esta competición. La dificultad de los analitos sobrecargados de representar exactamente el comportamiento en la extracción de los analitos presentes en las muestras no es exclusiva de la extracción con fluidos supercríticos, sino que es un problema generalizado en los métodos de extracción sólido-líquido. Por tanto, las recuperaciones dependen de las condiciones experimentales (presión, temperatura, fluido, flujo, tiempo y modo de extracción), de la naturaleza del compuesto a extraer (Pm, volatilidad, estructura química y polaridad), y de la matriz (tamaño de partícula, porosidad, área específica, polaridad y humedad) (Camel y col., 1992a). 3.5 VENTAJAS La aplicación de los fluidos supercríticos a procesos extractivos reporta numerosas ventajas frente a los métodos utilizados convencionalmente en el laboratorio, entre las cuales destacan (Camel y col., 1992a; Barnabas y col., 1995): - Menor volumen de solvente necesario, lo cual reporta una ventaja tanto económica como medioambiental. - Tiempos más cortos de extracción. - No degrada los analitos. - Flexibilidad. - Selectividad, siendo en muchos casos innecesarias etapas posteriores de purificación. - Mayor automatización. Introducción Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 57 - 3.6 EXTRACTOR DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS HP7680A El extractor de fluidos supercríticos de Hewlett Packard HP7680A (Fig. 29), utiliza el método de extracción "offline", combinando extracción estática y dinámica, las cuales son controladas por el usuario. Para ello sigue las siguientes etapas de extracción: 1El fluido extractante llena el thimble con la muestra. La bomba y el sistema de control de temperatura, lleva el fluido a la densidad y temperatura especificadas. No hay flujo a través de la muestra en ese tiempo. 2La muestra se empapa del fluido extractante (extracción estática) durante un tiempo fijado por el usuario. 3El fluido extractante se bombea hacia la muestra que posteriormente se dirige hacia la columna (extracción dinámica). 4El solvente, elegido por el usuario, lava la columna de retención seleccionada donde se disuelven y transfieren los analitos deseados a un número de viales seleccionado. 5Se recoge un volumen (mL) conocido que posteriormente se analiza a través de una técnica de análisis cuantitativa. Fig. 29. Extractor de fluidos supercríticos HP7680A. A AN NT TE EC CE ED DE EN NT TE ES S B BI IB BL LI IO OG GR RÁ ÁF FI IC CO OS S Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 58 - ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS La determinación de PAHs continua siendo un reto para los analistas, ya que se presentan en niveles muy bajos y en matrices complejas, siendo necesario disponer de técnicas analíticas sensibles y rápidas que puedan ser utilizadas para el control efectivo de estos compuestos. Con el fin de facilitar las tareas investigadoras relacionadas con la determinación de contaminantes orgánicos, entre ellos los PAHs, el NIST, ha preparado una serie de materiales de referencia estándar. Estos SRMs de PAHs representan tres niveles de dificultad analítica: 1) soluciones simples de calibración que contienen un nº de analitos (SRM 1491, 1647b, 2260) 2) mezclas naturales complejas (SRM 1597), y 3) matrices de material natural (SRM 1941, 1974). Las soluciones de calibración se utilizan para validar los métodos cromatográficos (tiempo de retención, respuesta del detector, estudios de recuperación); mientras que las mezclas naturales y las matrices son similares a las muestras analizadas, y se utilizan para validar el proceso analítico completo, incluyendo extracción, purificación, separación cromatográfica y cuantificación. Entre los materiales de referencia estándar para la determinación de PAHs hay una solución de calibración en ACN que contiene los 16 PAHs de la EPA certificados (SRM 1647b), e incluyendo 23 PAHs certificados hay una en hexano/tolueno (SRM 1491) y una en tolueno (SRM 2260). Mezcla natural existe una de alquitrán con 12 PAHs certificados, y de matrices naturales existen dos: una de sedimentos marinos con 11 PAHs certificados (SRM 1941), y otra de tejido de mejillón con 9 PAHs certificados (SRM 1974). Para la certificación de los PAHs se han utilizado las técnicas de HPLC-FL, GC-FID y GC-MS (Wise y col., 1992). Los métodos de análisis utilizados para la determinación de PAHs son muy variados. Los primeros métodos analíticos utilizados han sido la cromatografía de papel y cromatografía en capa fina. Posteriormente se ha utilizado la espectrometría de absorción UV/Vis y la espectrofluorimetría sincrónica, sin encontrar ninguna aplicación a material Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 59 - biológico o alimentos. Con la introducción de la cromatografía de gases y líquida, se aumenta la selectividad y/o precisión en el análisis. La gran capacidad de resolución que presenta la cromatografía de gases, ha hecho que durante mucho tiempo haya sido la técnica de elección para el estudio de mezclas de PAHs en matrices muy variadas (alimentos, material biológico, sedimentos, etc.), utilizando como sistemas de detección el FID y/o MS. Acoplada al MS tiene la ventaja de presentar una mayor sensibilidad, sensitividad y poder de resolución (Perfetti y col., 1992) En los años setenta surge la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), siendo desde entonces la técnica más utilizada para la determinación de PAHs en diferentes matrices, debido a su alta capacidad de separación, rapidez, mayor selectividad y sensibilidad, con detector de UV y fluorescencia. Sin embargo, con detector de fluorescencia es más sensible, particularmente para los PAHs de alto Pm, fijando longitudes de onda de excitación y emisión específicas (Perfetti y col., 1992), siendo esta técnica propuesta en diferentes métodos oficiales para el análisis de PAHs: - El método recogido en la sección 6440 de la APHA (1992), aprobado anteriormente en 1987 por el Standard Methods Committee y aceptado por la EPA como equivalente del método 610 de la EPA, indica dos técnicas de análisis para la resolución de 16 PAHs: cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama (Método 610d), y HPLCFL y UV (Método 610). - El procedimiento propuesto por el ASTM (1989) para la determinación de los mismos compuestos en aguas (superficiales y potables); prácticamente coincide con el Método 610. - Para aguas potables, el método 550.1 de la EPA, basado también en HPLC-FL y UV (PERKIN ELMER, 1993). En los últimos años, se puede observar un creciente interés por los llamados fluidos supercríticos como técnica de extracción. La extracción con fluidos supercríticos (SFE), es Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 60 - de desarrollo relativamente reciente, y por ello son numerosos los estudios realizados en los últimos años con la finalidad de determinar múltiples variables para la optimización del proceso (temperatura, presión, utilización de modificadores y adsorbentes) y/o su aplicación a diferentes matrices en la que extraen los analitos de interés, siendo pocos los análisis de PAHs en muestras de material biológico, en comparación con los trabajos realizados con técnicas de extracción más tradicionales (soxhlet, extracción líquido-líquido, etc.). Entre los artículos recogidos de mayor interés desde 1986, destacan: HAWTHORNE and MILLER, 1986, extraen Fl, Pir, BaA y BaP de material de referencia estándar (NBS1650), utilizando dos métodos de SFE con presión de 300 atm: 1) CO2 a 45ºC durante 90 min., y 2) CO2 modificado con 5% de metanol a 65ºC durante 30 min. El extracto se analiza por GC-MS, obteniendo recuperaciones similares, entre un 92±5% y 123 ±1.2% por el primero y del 98±2% al 125±0.2% por el segundo. La aplicación del segundo método al análisis de PAHs en gas-oil detecta un porcentaje mayor del 90% en su composición. Los mismos autores en 1987, analizan 5 PAHs (Fl, BaA, BaP, BghiP e IndP) en polvo urbano (SRM 1649) por SFE; y tres PAHs deuterizados (d10-Fenantreno, d10-Pir y d12Perileno) en partículas de aire y sedimentos de río mediante SFE, soxhlet y sonicación. Para el SFE estudian diferentes fluidos supercríticos: CO2 y NO2 puros y con 5% de metanol como modificador y etano. Cada muestra se extrae durante 30 min. a 300 atm, temperatura 45ºC para los fluidos puros y 65ºC para los fluidos modificados con metanol. Las mejores recuperaciones en las tres matrices estudiadas se obtienen cuando se utilizan CO2 y NO2 con 5% de metanol, y en los PAHs de menor Pm. Los porcentajes de recuperación obtenidos en los 5 PAHs son del 100% para el Fl y BaA, del 60% y el 80% para el BaP con CO2+MeOH y NO2+MeOH, e inferiores al 50% para el BghiP e IndP. Los análisis de los extractos se realizan por GC-MS. Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 61 - HAWTHORNE y col., 1989, estudian diferentes polucionantes ambientales, entre ellos PAHs, en espuma de poliuretano utilizando SFE a 380 atm y 45ºC durante 20 min. de extracción. Las recuperaciones obtenidas para una concentración de 50 µg de PAHs son: Naftaleno y Fenantreno del 100±2%, para el Pir 103±5%, Cri 100±7% y para el Perileno del 97±6%. La cuantificación del extracto se realiza por GC-MS. ISCO APPLICATIONS BULLETIN, 1991, determina 14 PAHs en suelos utilizando como método de extracción los fluidos supercríticos (CO2). Realiza tres etapas de extracción con presión de 350 atm, dos de las cuales se realizan a temperatura de 90ºC durante 30 min., y la tercera se realiza a temperatura de 120ºC durante 60 min. El extracto se recoge en hexano y se analiza por GC-MS. Los porcentajes totales de recuperación de las tres extracciones para el Ant, Fl, Pir, BaA, Cri, BbkF y BaP son respectivamente del 117, 104, 115, 103, 106, 118 y 74%. Todos excepto el BaP dan recuperaciones altas en la segunda fracción. LANGENFELD y col., 1992, extraen 66 compuestos, entre ellos PAHs, a 400 atm de presión y 50ºC durante 40 min. de extracción mediante SFE. Estudian cinco solventes para la separación de dichos compuestos: cloruro de metileno, cloroformo, acetona, metanol y hexano. Los PAHs objeto de estudio son: Ant, Fl, Pir, Cri, BbF, BkF, BaP y BghiP. El solvente que muestra recuperaciones más bajas es el metanol (55-60%), seguido del hexano (70-80%). Entre los otros tres (cloroformo, acetona y cloruro de metileno) apenas hay diferencias, consiguiendo recuperaciones próximas al 90%. LOPEZ-AVILA y col., 1992, analizan hidrocarburos del petróleo en varias muestras de suelos mediante SFE. La extracción se realiza a 340 atm y 80ºC durante 30 min. (dinámica), con columna SS y temperatura del restrictor 150ºC, usando como fluido supercrítico CO2. El extracto se recoge en tetracloroeteno, que posteriormente es purificado con sílica gel y se analiza por IR. Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 62 - PORTER y col.,1992, determinan PAHs en sedimentos marinos (SRM 1941) y tejidos de mejillón (SRM 1974). La muestra de SRM 1941 se mezcla con agua y se le añade tierra de diatomeas como agente desecante para favorecer la extracción. Como fluido supercrítico se utiliza CO2 modificado al 10% con cloruro de metileno, a 500 atm y 125ºC durante 40 min., con el restrictor a 200ºC. Se recogen 15 mL de extracto en cloruro de metileno que se purifican a través de una columna 1:1 ácido sulfúrico sílica gel y 10% de sílica gel nitrato de plata, eluyendo con hexano, que posteriormente se concentra para ser analizado por GCMS. El SRM 1974 se mezcla directamente con tierra de diatomeas, siguiendo el mismo proceso de extracción. Las recuperaciones obtenidas para el Ant, Fl, Pir, BbF, BaP, BghiP e IndP en el tejido de mejillón oscilan entre el 80±8.5% para el BbF y 111±16% para el BghiP, y en el sedimento marino entre el 104±3.2% para el Ant y Fl y 133±13% para el BbF; en este sedimento determinan además, dos PAHs más, el BaA y el BkF, obteniendo recuperaciones del 143±8.2% y 148±13% respectivamente. BICKING y col., 1993, estudian condiciones de presión y temperatura óptimas para la extracción de PAHs de suelos con SFE. El suelo desecado con sulfato sódico anhidro, se coloca en la celda de extracción y se extrae durante 60 min. en el modo dinámico a 55ºC, 290 atm, y densidad 0.846 g/mL, obteniéndose unas recuperaciones superiores al 92%. BURFORD y col., 1993, analizan tres muestras medioambientales: suelo de vías de tren, polvo urbano (SRM 1649) y lodos, modificando el sistema de sobrecarga. Cada muestra se extrae: a) con un tiempo de equilibrio de 10 min. a 60ºC, seguido de una extracción a 400 atm, 60ºC durante 30 min. con CO2 puro; b) modificado con 10% de metanol durante 30 min. en iguales condiciones que a), y se compara con extracción por sonicación durante 30 min. con cloruro de metileno. Los tres extractos son cuantificados por GC/FID, concluyendo que los alcanos se encuentran exclusivamente en el extracto de CO2 puro, mientras que los PAHs se encuentran en los tres extractos. Las recuperaciones de PAHs en los tres procesos oscilan de un 73 a un 113 % de SRM 1649. Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 63 - DANKERS y col., 1993, comparan dos métodos de extracción: SFE y extracción líquidolíquido de acuerdo al procedimiento estándar NEN 5731, en material de referencia SRM 1647B (16 PAHs de la EPA) y muestras de suelo. Para ello 100 g de suelo desecado químicamente por adición de sulfato sódico, es enfriado bajo nitrógeno líquido y homogeneizado a partículas de 1 mm. La muestra se introduce en el thimble, añadiendo DCM como modificador; y se extraen con densidad 0.76 g/mL, presión 350 atm y temperatura 90ºC, durante 15-20 min., recogiendo un extracto de 15 mL en DCM, que se analiza por HPLC-UV con bomba de gradiente; columna termostatizada a 30ºC, ACN:agua como fase móvil y flujo 1.5 mL/min. Las recuperaciones por SFE son pobres para los PAHs de Pm mayor que el Pir (30-70%), y para el resto oscilan entre un 88 y un 100%, con una desviación estándar de 2-15%. HAWTHORNE y col., 1993, estudian factores que influyen en la extracción de PAHs de matrices ambientales, utilizando la técnica SFE. Comparan los métodos "on-line" y "offline", encontrando que en el segundo se obtienen recuperaciones más pobres de analitos volátiles (hexano, benceno). Evalúan el solvente de elución del método, obteniendo recuperaciones menores en hexano y metanol (58-80%), mientras que para el cloruro de metileno aumentan hasta un 90-93%, para el Pir y el BghiP. Estudian el flujo de CO2 frente al porcentaje de recuperación, seleccionando 1.5 mL/min., así como los tiempos de extracción estática y dinámica necesarios, 5 y 15 min., respectivamente, y la posibilidad de añadir modificador directamente en la muestra ya puesta en la celda de extracción (metanol, anilina y tolueno, en proporciones de 10 y 1% de volumen), a 400 atm y 80ºC: Los datos muestran que los resultados varían para los distintos modificadores, según el PAH, encontrando que si el modificador actúa extrayendo los analitos desde la matriz, y no por incremento de su solubilidad en el fluido de extracción, la simple adición de modificador a la muestra directamente puede ser suficiente, eliminando tener un doble sistema de bomba o de fluidos mezclados. Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 70 - obtenidos, muestran que los PAHs de bajo Pm se extraen en 30 min., siendo necesarios 60 min. para los PAHs de alto Pm. Las recuperaciones oscilan entre un 79% y 107% (RSD% inferior al 10%), obteniendo valores inferiores con soxhlet. También realizan pruebas con un sistema de SFC con detector de FL y UV/Vis conectados en serie, loop 20 µL, donde alcanzan límites de detección mucho más bajos. HÜSERS and KLEIBÖHMER, 1995, indican que la recogida de analitos relativamente volátiles mediante SFE puede ser difícil, observando pérdidas superiores al 30% de PAHs con algunos solventes de lavado, estudiando diferentes solventes orgánicos (hexano, cloruro de metileno y acetona), así como varios adsorbentes: sílica gel 10% y dos distintos octadecisilanos (ODS y dionex), siendo innecesario el paso posterior de purificación cuando se utiliza sílica gel. Se encuentran buenas recuperaciones de los 16 PAHs utilizando CO2 como fluido de extracción, presión 40 MPa, temperatura de la columna 90ºC y del restrictor 150ºC, durante 30 min. con CO2 puro o modificado con 5% de tolueno. El analito se recoge en 10 mL de hexano, cloruro de metileno o acetona a 5ºC, y se analiza por HPLC-FL, con bomba cuaternaria de gradiente, columna Bakerbond PAH 16-Plus de 250 mm y precolumna de 20 mm termostatizadas a 30ºC, flujo 0.5 mL/min., con fase móvil ACN:agua. Los mejores resultados se encuentran con acetona, recuperaciones comprendidas entre 74.0-91.5 %, con RSD% inferior al 3.6%. Las recuperaciones con cloruro de metileno oscilan del 66.7 a 85.2 % con RSD% inferior al 5.9 %, y con hexano del 69.1 a 88.6 % con RSD% inferior al 18.7%, observando en todos los casos, que en los PAHs de bajo Pm se obtienen las mayores recuperaciones. KANAGASABAPATHY y col., 1995, evalúan los efectos de diferentes modificadores (metanol, 2-propanol, 2.metoxi.etanol, acetona, cloroformo con 0.7% de etanol, cloruro de metileno, tolueno, clorobenceno, ACN y N,N-dimetil formamida), para la recuperación de 5 PAHs (Acenafteno, Ant, Pir, Cri y BaP) en las siguientes condiciones de SFE: 0.500 mL de modificador, temperatura y presión 100ºC y 450 atm, tiempo de extracción estático 15-16 min., tiempo de extracción dinámico 80-109 min. y flujo 0.45-0.94 mL/min., obteniéndose Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 71 - las mejores recuperaciones con clorobenceno (mayores del 79% con RSD% inferior al 11%). Elegido el modificador estudian diferentes cantidades del mismo (0.5, 1.0 y 1.2 mL) y diferentes temperaturas de extracción (100 y 115ªC), a la misma presión y tiempo de extracción estática, con tiempo de extracción dinámica de 86 min. y flujo 0.59-0.78 mL/min., obteniendo las mejores recuperaciones a 100ºC y 1.2 mL de clorobenceno (mayores al 83%). Fijadas estas variables, realizan tres estudios de diferentes tiempos de extracción estática y dinámica, a 15 y 86 min., 15 y 65 min. y 25 y 65 min., respectivamente; manteniendo las otras variables, seleccionando 25 y 65 min. Las recuperaciones obtenidas oscilan entre 58.4+6% y un 93.5+2.8%. Los extractos se analizan por GC-MS. LANGENFELD y col., 1995, extraen polucionantes orgánicos, entre ellos PAHs mediante SFE a diferentes temperaturas (40, 120 y 200ºC), y presiones (105, 373 y 650 atm), manteniendo constante la densidad a 0.67 g/mL, y flujo 0.8 mL/min., durante 60 min. El analito se recoge en cloruro de metileno y se analiza por GC-MS. Los resultados muestran que al aumentar la temperatura incrementa la eficacia de extracción del CO2, seleccionando 200ºC y 650 atm, como valores de temperatura y presión, respectivamente. REIMER and SUAREZ, 1995, comparan dos métodos de extracción por SFE con la extracción por Soxhlet (método de la EPA 3540), para PAHs en suelos determinados por GC-MS. Añaden directamente a la muestra DCM como modificador (método "Manual"), mientras que añaden isooctano:DCM (1:3 v/v) como modificador de fluido supercrítico al CO2 (método "Bomba"). Las condiciones de extracción para el método "Manual" son: presión 370 atm, temperatura 120ºC, 10 min. de extracción estática y 40 min. de extracción dinámica. La temperatura del restrictor es 50ºC, y de la columna 10ºC, siendo aumentada a 25ºC en el lavado con 1 mL de hexano y DCM. Las condiciones de extracción para el método "Bomba" consiste en tres etapas: 1) CO2 puro a 333 atm de presión, temperatura 120ºC, 2 min. de extracción estática y 10 min. de extracción dinámica con temperatura del restrictor 55ºC, y de la columna 15ºC, siendo aumentadas a 55ºC en el lavado con 1.5 mL de isooctano:DCM (1:3 v/v). 2) fluido supercrítico modificado con 1% de metanol y 4% de Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 72 - DCM, extrayendo 1 y 30 min. de extracción estática y dinámica, manteniendo la temperatura del restrictor a 45ºC, sin lavar la columna. 3) 2.5 min. de extracción dinámica manteniendo la temperatura del restrictor a 45ºC, y recogiendo 0.9 mL de isooctano:DCM. Las recuperaciones de los PAHs desde sedimentos marinos HS-4, usando ambos métodos, son equivalentes y mejores que usando la extracción por Soxhlet. La precisión media obtenida por SFE es del 16%, similar a la obtenida por Soxhlet, 13%. La exactitud de las concentraciones de PAHs en suelos usando SFE son menores. YANG y col., 1995, extraen PAHs de materiales de referencia (sedimentos marinos, hollíndiesel, partículas de aire) mediante SFE a 400 atm de presión con CO2 puro o modificado (10% vol. de metanol, dietilamina, o tolueno añadido directamente a la muestra), temperatura 80 y 200ºC durante 15 min. de extracción estática y 15 min. de extracción dinámica, recogiendo el analito en 5 mL de cloruro de metileno, y se analiza por GC-MS. Las extracciones con CO2 puro se llevan a cabo durante 30 min. en la extracción dinámica, sin mostrar incrementos significativos en las recuperaciones. Se observa un incremento en las recuperaciones de PAHs de los tres tipos de muestra analizada al modificar la temperatura de 80 a 200ºC, siendo por tanto la temperatura independiente de la matriz de la muestra. En contraste, los efectos del modificador a ambas temperaturas son dependientes de la matriz de la muestra y del modificador utilizado. En general, con el metanol se obtienen las peores recuperaciones en los tres tipos de muestra a ambas temperaturas. El tolueno y la dietilamina, incrementan las recuperaciones a ambas temperaturas desde partículas de aire, pero sólo la dietilamina incrementa significativamente las recuperaciones en los tres tipos de muestra analizada. La extracción con dietilamina a 200ºC presenta las recuperaciones más altas, similares a las obtenidas por soxhlet durante 14-48 horas. CARDELLICCHIO y col., 1996, describen la aplicación del SFE para la extracción de PAHs (Fenantreno, Ant, Fl, Pir, BaA, Cri, BaP, BghiP e IndP) de sedimentos marinos. El sedimento deshidratado se extrae a 400 atm de presión, temperatura del restrictor 150ºC durante 40 min., modificando la temperatura de extracción (80 y 130ºC) y el uso de Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 73 - modificadores en el CO2 (metanol, cloruro de metileno, tolueno, freon-22 y dietilamina). El analito se recoge en 10 mL de 1:1 (v/v) de metanol:cloruro de metileno, se purifica por columna cromatográfica que contiene lana de cuarzo, florisil 5% y sulfato sódico anhidro. Los extractos se analizan por GC-MS. Los resultados muestran que al incrementar la temperatura (130ºC) aumentan las recuperaciones de los PAHs de bajo Pm, pero las recuperaciones de los PAHs de alto Pm son inferiores al 60%. El uso de CO2 modificado al 10% con cloruro de metileno es más eficiente que la extracción por soxhlet (150 mL de 1:1 acetona:cloruro de metileno durante 48 h) para todos los PAHs, obtiene recuperaciones entre 84±12% para el IndP y 121±19 % para el Ant. El método aplicado a la extracción de PAHs de material de referencia (SRM 1941), obtiene recuperaciones entre un 90 y 125%; y en muestras de sedimentos marinos del golfo de Taranto (Mar Jónico, en el Sur de Italia), encuentran 115 ng/g de Ant, 1145 ng/g Fl, 1184 ng/g Pir, 878 ng/g BaA, 305 ng/g Cri, 474 ng/g BaP, 11 ng/g BghiP y 44 ng/g IndP. FERNÁNDEZ y col., 1996, optimizan variables de presión y temperatura para la extracción mediante SFE de los 16 PAHs de la EPA y PCBs de sedimentos desecados, usando tres etapas: la primera con CO2 puro, la segunda con CO2 conteniendo 2% (v/v) de metanol, y la tercera con CO2 modificado al 10% (v/v) de metanol, a 150ºC la temperatura del restrictor, flujo 1 mL/min., recogiendo el extracto en 10 mL de hexano que se analiza por GC-MS. Las recuperaciones se incrementan al aumentar la presión (de 80 a 340 atm), y la temperatura (de 50 a 150ºC). Mientras que los PAHs de tres y cuatro anillos (Ant, Fl y Pir) se extraen con CO2, los compuestos de seis anillos (BghiP e IndP) necesitan la tercera etapa. Optimizadas las condiciones de extracción por SFE, las recuperaciones totales de PAHs y de PCBs, son un 17% más altas que las obtenidas por soxhlet (20 h con DCM:metanol 2:1, cuyo extracto hay que purificar con una columna de alúmina neutra). La precisión del SFE y del soxhlet son del 3.7 y 9%, respectivamente. JÄRVENPÄÄ y col., 1996, extraen 10 PAHs de pescado ahumado y asado mediante SFE y cuantifican por HPLC-UV. Las muestras de pescado deben de estar homogeneizadas y Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 74 - liofilizadas, y se mezclan con arena de cuarzo. La extracción se realiza a 350 atm de presión, flujo 1.5-1.7 mL/min., recogiendo el analito en 3 mL de hexano:DCM (3:1) a 5-10ºC, que es evaporado a sequedad bajo corriente de nitrógeno y redisuelto en 1 mL de hexano. La extracción de PAHs usando arena de cuarzo como adsorbente presenta buenas recuperaciones, comprendidas en un rango del 80 al 100%, con RSD% del 3 al 11%. La extracción de pescado, muestra que el metanol puede ser usado como modificador dinámico, ya que los PAHs de alto Pm son débilmente extraídos con CO2 puro. El uso de metanol (10%) implica que los compuestos lipofílicos son coeluídos en grandes proporciones, interfiriendo en el análisis de PAHs por HPLC-UV (límites de detección de 2 a 20 ng/mL, para Ant y Pir, respectivamente), por ello, los extractos son purificados usando SPE (alúmina y sílica gel) antes de la determinación cromatográfica. LIENERT y col., 1996, comparan la extracción por un método convencional, el soxhlet (se extrae dos veces con 70 mL de tolueno durante 6 h), con la extracción por SFE, para 14 PAHs en creosota de madera de árboles. Los extractos se analizan, tras previa purificación, por GC-MS. Para la optimización de las condiciones se realizan sobrecargas en creosota, que se extraen por SFE con CO2, densidad 0.65 g/mL, temperatura 120ºC (presión de 376 bar), flujo 1 mL/min., columna ODS a temperatura de -20ºC, durante 10 min. de extracción estática y 50 min. de extracción dinámica. Después de la extracción, los analitos son eluídos con tolueno a 30ºC. Para los PAHs de alto Pm, la extracción por SFE muestra ser una buena alternativa al soxhlet, obteniendo unas recuperaciones entre un 80 y 95%. PLATE and GIESBERG, 1996, extraen 6 PAHs (Fl, BbF, BkF, BaP, BghiP e IndP) de muestras de suelos y sobrecargados por SFE, utilizando CO2 modificado al 9% con metanol:tolueno (2:1), con un programa de presiones de 20 MPa durante 10 min., 30 MPa durante 10 min. y 40 MPa durante 40 min., temperatura del restrictor 80ºC, temperatura de extracción 120ºC durante 60 min. de extracción, recogiendo el analito en acetona a 2ºC, que se analiza posteriormente por HPLC-FL, con bomba isocrática, fase móvil de ACN:agua (95:5), flujo 0.8 mL/min., columna a 27ºC, longitud de onda de emisión 250 nm, y longitud Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 75 - de onda de excitación 365 nm, y loop de 20 µL. Las recuperaciones obtenidas oscilan entre un 91% para el IndP, y un 100% para el BkF. Los valores que encuentran en las muestras de suelos expresados en µg/kg son de 353 para el Fl, 99.5 para el BbF, 39.5 para el BkF, 78.5 para el BaP, ND para el BghiP y 50.0 para el IndP. DEUSTER y col., 1997, presentan un método de SFE para la extracción de 13 PAHs de suelos industriales. Las condiciones de extracción son 40 MPa de presión, temperatura 90ºC y temperatura del restrictor 150ºC, diferenciando tres métodos de extracción para evaluar los efectos del modificador: 1) CO2 durante 120 min. de extracción dinámica, 2) CO2 modificado con 5% de tolueno durante 120 min. de extracción dinámica, y 3) el modificador se añade directamente en la muestra, 10 min. de extracción estática y 30 min. de extracción dinámica con CO2. El analito es purificado a través de sílica gel previamente al análisis por HPLC-FL. Las condiciones utilizadas para el análisis son: temperatura 27ºC, bomba de gradiente con fase móvil ACN:agua y flujo 0.5 mL/min. Los resultados muestran la eficacia de extracción por SFE al utilizar modificadores polares, directamente en la muestra o como fluido supercrítico. FRIEDRICH and KLEIBÖHMER, 1997, presentan un método de SFE basado en la técnica de adición directa del modificador. Los analitos de interés son PAHs y policlorados dibenzo-p-dioxinas y furanos en muestras de suelos naturales. La muestra de suelo se extrae a 90ºC, presión 20 MPa, durante 15 min. de extracción estática, siendo innecesaria la etapa de purificación para los PAHs. El análisis del analito se realiza mediante HPLC-FL. Los mejores resultados se obtienen si se usan mezclas binarias como solvente de extracción (tolueno) con pequeñas trazas (2%) de TFA, que aumentan la eficacia de la extracción. HOLLENDER y col., 1997, extraen los 16 PAHs de la EPA de matrices ambientales naturales polucionadas (suelos) mediante SFE, usando CO2 y modificadores (n-hexano, ciclohexano, tolueno, metiltert-butil éter, metoxibenceno, DCM, propanona, piridina y metanol) y mezclas de modificadores (metanolconteniendo dietilamina, 2-aminoetan-1-ol, Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 76 - ácido acético). Las condiciones de extracción por SFE comienzan a 20 MPa de presión, incrementándose 5 MPa cada 3 min. hasta alcanzar 40 MPa, columna Dionex, y temperatura 90ºC durante 39 min. Los extractos se recogen en propanona a 5ºC, y se analizan por HPLC-FL-UV, a 23ºC con bomba de gradiente, ACN:agua como fase móvil y flujo 0.7 mL/min. Comparando los resultados que se obtienen utilizando DCM por Soxhlet durante 24 h, y usando CO2 puro por SFE, muestran que los modificadores ácidos o básicos dan mayores recuperaciones de PAHs en todos los casos. La eficacia de la extracción decrece cuando se reduce la polaridad del modificador usado, y cuando se incrementan las concentraciones de cosolvente. HSIEH and CHANG, 1997, estudian la eficacia de extracción mediante SFE para 5 PAHs (Ant, Pir, Cri, BaP y Perileno), investigando los efectos de diferentes variables en la interacción del analito-matriz. Las extracciones se realizan con 0.7 g/mL de densidad, presión 220-450 bar, temperatura 70, 90, 110 y 140ºC durante 5 min. en la extracción estática, recogiendo los analitos en cloruro de metileno. En este estudio utilizan CO2 puro y modificado con 10% de metanol, cloruro de metileno y tolueno. También estudian dos adsorbentes: XAD (2, 4 y 16) y sílica gel (40 y 100). Las recuperaciones más altas se obtienen utilizando como adsorbente sílica gel, y como la sílica gel 40 tiene mayor superficie de área y menor tamaño de poro que la sílica gel 100, las recuperaciones desde sílica gel 100 son mayores, siendo superiores al 70% en los PAHs estudiados en todas las temperaturas investigadas. Los resultados indican que los principales factores que influyen son las propiedades químicas de la matriz superficial, área de superficie y tamaño de poro, pudiendo influir significativamente en las interacciones del analito-matriz. La polarizabilidad del analito es otro factor importante para estas interacciones. Elevar la temperatura o añadir modificadores puede incrementar las recuperaciones por SFE. MONSERRATE and OLESIK, 1997, extraen los 16 PAHs de la EPA de polvo de casa usando SFE con CO2 puro y modificado con metanol en diferentes porcentajes (10, 20, 30 y 40%), estudiando diferentes temperaturas (50, 75 y 100ºC). Las condiciones de extracción Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 77 - son 1 min. de extracción estática, presión 233 atm o 238 atm si se usa bomba binaria y columna SS, recogiendo el analito en diferentes volúmenes (5, 10, 15, 20, 25 y 30 mL de cloruro de metileno). También añaden modificador directamente a la muestra (100 y 200 µL) y agua (100 µL), estudiando 75 y 100ºC, manteniendo la presión a 233 atm y 10 min. de extracción estática. Los resultados indican que al aumentar la proporción de metanol como modificador del fluido supercrítico, incrementa las recuperaciones y disminuye el tiempo total de extracción. La adición directamente a la muestra de modificador da similares resultados que al utilizarlo como fluido supercrítico, obteniendo un 72±2% y de un 73±4%, respectivamente, siendo ambos resultados óptimos . PICHON y col., 1997, optimizan el uso de modificadores para la extracción de micropolucionantes orgánicos, incluyendo pesticidas y PAHs de suelos y hollín, respectivamente, mediante SFE. Las condiciones de extracción para los seis PAHs investigados (Fenantreno, BaA, BkF, BaP, BghiP e IndP) son 400 atm de presión, temperatura 150ºC, durante 40 min. de extracción (10 min. estática y 30 min. dinámica), con CO2 puro y modificado al 10% con tolueno, ACN y cloruro de metileno. Obtienen unas recuperaciones muy bajas, comprendidas entre un 20% para el BghiP y un 70% para el BaA con CO2 puro, mejorando las recuperaciones con CO2 modificado con tolueno, oscilando entre un 25% para el BghiP y 120% para el BaP. RODRIGUEZ y col., 1997, estudian la técnica de SFE para la separación de 18 PAHs, de muestras de suelos. La muestra, previamente desecada, se somete a tres etapas de extracción con columna ODS a temperatura constante de 30ºC. La primera etapa, se lleva a cabo con densidad 0.6 g/mL y temperatura 80ºC con CO2 puro, durante 3.5 min. de equilibrio y 6.8 min. de extracción, extrayendo un 80% de los PAHs de bajo Pm (del Acenafteno al Pir). La segunda etapa, con densidad 0.8 g/mL y temperatura 50ºC con CO2 modificado al 5% con metanol, durante 3.5 min. de equilibrio y 9 min. de extracción, extrayendo un 80% de los PAHs de Pm medio. La tercera y última etapa, con densidad 0.8 g/mL y temperatura 80ºC con CO2 modificado al 5% con metanol, durante 3.5 min. de equilibrio y 9 min. de Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 78 - extracción, extrayendo el 100% de los PAHs de alto Pm. La cuantificación del extracto se realiza mediante HPLC-FL, termostatizada la columna a 30ºC, flujo 1 mL/min. y bomba de gradiente. WENCLAWIAK y col., 1997, extraen 12 PAHs (Fenantreno, Ant, Fl, Pir, BaA, Cri, BbF, BkF, BaP, Dibenzo[a,h]Ant, BghiP e IndP) en un rango de mg/kg de suelos y partículas de aire. Las extracciones se realizan con tolueno en soxhlet (8h), y por SFE con presión 40.5 MPa, temperatura 150ºC, con CO2 puro y modificado con 5% de tolueno y con DME puro y modificado al 5% con tolueno; recogiendo el analito en 5 mL de hexano, que se purifica con sílica gel, previamente al análisis por HPLC-FL-UV. Las condiciones del análisis se realizan con bomba de gradiente, flujo 1 mL/min. de ACN:agua, y columna termostatizada a 25ºC. Los resultados obtenidos mediante las extracciones con DME puro son similares a las obtenidas con tolueno en soxhlet, 32 mg/kg, siendo más bajas las obtenidas con CO2 puro, 21 mg/kg. Los mejores resultados se obtienen con DME modificado con tolueno (50 mg/kg), seguidos de los obtenidos con CO2 modificado con tolueno (43 mg/kg). ALI and COLE, 1998, desarrollan un método de extracción selectivo, aplicado a muestras de tejido biológico (cangrejo) con alto contenido lipídico, el cual representa una interferencia potencial para la extracción de 10 PAHs (Fenantreno, Ant, Fl, Pir, Cri, BaA, Benzofluoranteno, Benzo[e]Pireno, BaP y Perileno). Utilizan C18 como adsorbente (previamente purificado con hexano, metanol y cloruro de metileno), que retiene los lípidos, y extraen los PAHs, tras previa optimización de las condiciones de SFE: columna SS, 100ºC, 350 bar, CO2 con flujo 1.5 mL/min., durante 5 min. de equilibrio y 25 min. de extracción. Se recoge el extracto en 3 mL de cloruro de metileno y se analiza por GC/MS. Las recuperaciones se encuentran en un rango del 94-100%, mientras que sólo un 9-17% de lípidos son coextraídos. BENNER, 1998, estudian la extracción de PAHs en cuatro SRMs mediante SFE. Investigan los efectos del fluido de extracción (CO2, clorodifluorometano (R22), y 1,1,1,2- Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 79 - tetrafluoroetano (HFC134a)), el uso de fluidos como modificadores (DCM y anilina) y diferentes temperaturas. Para SRM 1649 (polvo urbano), se obtienen excelentes recuperaciones con R22 (90%) para todos los PAHs a 400 atm y 110ºC, mientras que usando HFC134a a 400 atm y 125ºC, las recuperaciones son inferiores al 80%. Para SRM 1941 y 1944, ambos sedimentos acuáticos con similar composición física y química, la extracción a 400 atm de presión, 150ºC durante 15 minutos de extracción estática y 30 min. de extracción dinámica, flujo 1 mL/min. y CO2 modificado al 10% con DCM, dan lugar a recuperaciones inferiores al 52% para todos los PAHs contenidos en el primero, y mayores del 228% para el segundo. Los resultados desde SRM 1650 (diesel), muestran que se obtienen recuperaciones más bajas que las obtenidas por soxhlet, de un 20% para el BghiP e Indp. KENNY and OLESIK, 1998a, comparan la extracción mediante SFE con CO2 puro y modificado (EFE: 60% CO2-40% metanol y ASE: metanol) para los 16 PAHs de la EPA extraídos de lignita de carbón, analizándolos por GC-MS. Las mejores recuperaciones (4774%) se obtienen para los de menor Pm, usando CO2 modificado al 10% con metanol, 70ºC y 238 atm. En el grupo de Pm medio se obtienen recuperaciones del 106% usando 100% de CO2, a 90ºC y 238 atm por SFE, y a 70ºC, 238 atm utilizando EFE, con ASE se recupera el 100%. En el grupo de los PAHs de alto Pm se obtienen buenas recuperaciones con las condiciones intentadas, pero las condiciones de EFE a 70ºC y 238 atm muestran recuperaciones mayores al 85% con RSD% inferior al 5%. Los mismos autores, 1998b, estudian la ASE para la extracción de los 16 PAHs de la EPA de bituminosos de carbón, y análisis mediante GC. Utilizan como solventes de extracción el metanol, cloruro de metileno y tolueno, a 136 atm durante 1 h a diferentes temperaturas (40150ºC con metanol, y 150ºC con tolueno y cloruro de metileno). Ninguna de las técnica de ASE puede extraer cuantitativamente los PAHs de bajo Pm. Los de Pm medio y alto son mejor recuperados con tolueno, obteniendo valores mayores del 80%, pero con RSD% 25%. Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 86 - McDONALD y col., 1992, determinan PAHs en pescados de la Península Antártica, mediante saponificación con KOH 6N a 35ºC durante 18 h. Los extractos se purifican a través de columnas de alúmina/sílica o alúmina/sulfato, y se analizan por GC/MS. Los resultados se expresan como PAHs totales, y los valores se determinan por la suma de los analitos encontrados (Naftaleno, Fluoreno, Fenantreno, Ant, Fenantreno, Dibenzotiopeno, Fl, Pir y Cri). Utilizan también la técnica de HPLC-FL para determinar los metabolitos encontrados en la bilis: Naftaleno (290/335), Fenantreno (260/380) y BaP (380/430). Las concentraciones más altas de metabolitos biliares y de PAHs en tejidos, se presentan en el pescado capturado cerca del lugar del naufragio del petrolero Bahía Paraíso en 1989. En general, las concentraciones más altas de PAHs se encuentran en el estómago (201-17000 ng/g expresado en materia seca), seguidas del hígado (50-1884 ng/g expresados en materia seca). La polución por PAHs es baja en los pescados capturados en los sitios lejanos de la actividad humana (13-400 ng/g expresado en materia seca). La confirmación de metabolitos de PAHs en la bilis del pescado muestra que la presencia de humanos en la Península Antártica tiene como resultado la exposición del pescado a derivados del petróleo (PAHs), siendo los niveles de BaP encontrados más bajos que el LD. MOTHERSHEAD and HALE, 1992, exponen cangrejos a altas concentraciones medio ambientales de PAHs no sustituidos. Las muestras de tejido liofilizadas se extraen por soxhlet con DCM durante 48 h, y en una alícuota del extracto determinan gravimétricamente los lípidos. El extracto se purifica a través de una columna de sílica gel activada, y las muestras se analizan por GC-FID, cuyo LQ es de 5 ng/g, y se confirman por GC-MS. La concentración media total de PAHs (Ciclopental(def)fenantreno, Fl y Pir) en el hepatopancreas oscila entre 3369 y 9560 ng/g y en músculo entre 498 y 1380 ng/g. PERFETTI y col., 1992, modifican un método publicado para la determinación de 12 PAHs (Acenafteno, Ant, Fl, Pir, BaA, Cri, BbF, BkF, BaP, Dibenz(a,h)Ant, BghiP e IndP) en alimentos marinos. Después de la digestión alcalina de la muestra, el extracto se purifica con alúmina, sílica y C18 y se analiza por HPLC-FL, inyectando 20 µL de alícuota, con flujo Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 87 - 1 mL/min., bomba de gradiente y fase móvil ACN:agua Las longitudes de onda utilizadas para la cuantificación son 250-420 (Ant, Fl, Pir), 270-390 (BaA, Cris), 290-410 (BbF, BkF, BaP, DBahA) y 300-465 ( BghiP e IndP). Las recuperaciones de los 12 PAHs analizados desde 5 matrices diferentes (mejillones, ostras, almejas, cangrejo y salmón) sobrecargados con ppb oscilan entre un 76-94%, siendo más bajas en el salmón. Los LQ oscilan entre un 0.01 a 0.06 ppb en los extractos sin material interferente. Los resultados obtenidos de material de referencia de mejillón (SRM 1647) son buenos. AL-YAKOOB y col., 1993, determinan las concentraciones de 10 PAHs en partes comestibles de pescado capturado en 1992, después del derrame de petróleo en el Golfo. La extracción se realiza por agitación durante 3 h con metanol/cloroformo, el extracto se purifica a través de alúmina y florisil, y se analiza por GC-MS. Si la muestra presenta un exceso de grasa, se realiza una saponificación durante 2 h. La media total de los PAHs encontrados es 105.3 g/kg, expresados en materia seca, comprendida en un rango de 2.51563.6 µg/kg, expresado en materia seca. El Pir (ND-144.9 µg/kg) y Fenantreno (ND-100.8 µg/kg) se detectan más frecuentemente (en el 75% de los peces), mientras que el Cri y el BaA presentan los valores más bajos de frecuencia de detección (en el 5% de los peces). Los PAHs que presentan una evidente carcinogenicidad (BaP, Cri y BaA), son los que se encuentran en concentraciones más bajas (ND-7.63, ND-0.05 y ND-0.3 µg/kg en materia seca, respectivamente), y con una menor frecuencia de detección. SETO y col., 1993, determinan PAHs acumulados en hígado humano de hombres (n=236) y mujeres (n=128), mediante HPLC, examinando su asociación con cáncer de hígado. Una muestra de hígado se homogeniza con etanol y KOH. Posteriormente, se extrae dos veces con hexano, cuyo extracto desecado con sulfato sódico anhidro, se concentra en rotavapor y se purifica a través de alúmina y sílica, y se analiza por HPLC. Las recuperaciones de 50 ng de BaP, BkF y 250 ng de BghiP son de 87.8±5.4%, 87.6±3.1% y 93.7±4.3% (n=4), siendo los LD de 1.0, 2.0 y 5.0 pg, respectivamente. Los valores medios de BaP, BkF y BghiP en el hígado (ng/g, hígado seco) de pacientes japoneses encontrados al realizar la autopsia es de Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 88 - 0.54, 0.44 y 0.87, respectivamente. Cada concentración de PAHs está altamente correlacionada con los otros (r > 0.83). Las concentraciones de estos tres PAHs muestran que son mayores en los hombres que en las mujeres y en aquellos que presentan cáncer de hígado. Sólo concentraciones de BghiP en el hígado de hombres fumadores son significativamente más altas (P<0.10) que en el grupo de hombres no fumadores. THOMPSON y col., 1993, extraen PAHs de ostras mediante saponificación con KOH a 80ºC durante 4 h. Los extractos son acidificados con ácido acético glacial y se extraen 3 veces por partición con 50 mL de hexano. Los extractos se purifican usando ácido silícico y alúmina, y se analizan mediante HPLC-FL y HPLC-UV, utilizando columna y precolumna C18 termostatizadas a 30ºC, con bomba de gradiente y flujo 1 mL/min. Las recuperaciones obtenidas con NBS 1647a son satisfactorias para el BaA, BbF, BkF, BaP, Dibenz(ah)Ant y BghiP, superiores al 82% con RSD% inferiores al 10%. Mientras que para el Fenantreno, Ant, Fl y Pir, las recuperaciones no son buenas, 46-250% con RSD% inferior al 10%. DUJMOV y col., 1994, analizan PAHs en pescados y sedimentos recogidas en la costa Adriática. Los sedimentos se someten a saponificación con metanol durante 1.5 h, extracción con n-pentano, y el extracto se purifica a través de alúmina. Las muestras desecadas de pescado, se extraen con metanol en soxhlet. Posteriormente se saponifican los lípidos con KOH, y determinan los lípidos saponificados en el extracto hexánico. La fracción acuosa se acidifica con ácido sulfúrico 1M, se extrae con hexano, y se determinan los lípidos insaponificados en el extracto hexánico. El valor total de lípidos se obtiene de los lípidos saponificados e insaponificados. El extracto hexánico se purifica mediante sílica-gel y alúmina, y se cuantifica por HPLC-FL. Los resultados obtenidos en sedimentos, muestran concentraciones de PAHs en un rango de 0.05 a 2.00 µg equivalente de Cri/g en materia seca. Mientras que los pescados presentan concentraciones más bajas, de 0.02 a 1.00 µg de equivalente de Cri/g en materia seca. La cantidad de lípidos oscila entre 38 y 131 mg/g extraídos desde 33.5 y 33.1 g de muestra. Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 89 - HELLOU y col., 1994a, determinan 27 PAC incluyendo los 16 PAHs de la EPA en músculo, hígado y ovarios de abadejo del Noroeste del Atlántico. Las muestras se someten a digestión cáustica (50% KOH-MeOH), el extracto se purifica a través de sílica gel, y se analiza por GC-MS. Las muestras de hígado contienen entre 1 y 9 PAC. Sólo el Acenafteno (18 ng/g, peso seco), Fluoreno (28 ng/g) y Cri (22 ng/g) son detectados en la mitad de las muestras de hígado, mientras que el Fluoreno (72 ng/g) se detecta en cada ovario. HELLOU y col., 1994b, exponen 20 machos de rodaballos a sedimentos contaminados con aceite de petróleo, durante cuatro meses. Las medidas de bioacumulación en términos de fluorescencia o en términos de concentración de aromáticos específicos, se incrementa con la dosis, observándose la bioacumulación en músculo e hígado. De los 27 PAC analizados, predominan los naftalenos alquilados en músculo (90-100%), y sedimentos (30-60%). VAN DER OOST y col., 1994, analizan los 16 PAHs de la EPA en muestras de sedimentos y anguila recogidas en seis lugares de Amsterdam, con diferentes niveles de agua polucionada. Además, en la anguila determinan metabolitos biliares de PAHs, y aductos hepáticos de PAHs-ADN para evaluar las técnicas de monitorización de exposición a PAHs. La extracción desde tejido de anguila desecado se realiza en soxtec durante 1 h, lavando con hexano:acetona (1:1). El extracto desecado y concentrado se purifica mediante sílica-gel, se evapora a sequedad bajo corriente de nitrógeno, se redisuelve en 1 mL de metanol y se analiza por HPLC. El contenido en lípidos de los tejidos se determina por evaporación de una alícuota de la mezcla hexano:acetona recogida en soxtec. Se observa una clara diferencia entre los perfiles de PAHs encontrados en sedimentos y anguilas. Principalmente, PAHs con dos y tres anillos (Naftaleno, Acenafteno, Acenaftileno, Fluoreno, Fenantreno y Ant) son detectados en anguilas, mientras que en los sedimentos predominan los PAHs de cuatro y cinco anillos (Fl, Pir, BaA, Cri, BbF, BkF, BaP y Dibenz(a,h)Ant). Un incremento significativo de niveles de aductos de PAHs-DNA se observa en el hígado de las anguilas procedentes de lugares polucionados. Además, estos parámetros parecen ser biomarcadores sensibles de la exposición a PAHs mutagénicos y carcinogénicos. Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 90 - HELLOU and UPSHALL, 1995, evalúan la bioacumulación de contaminantes en tejidos de pescado (rodaballo), expuestos a sedimentos polucionados con hidrocarburos de petróleo, durante cuatro meses de invierno. Presentan los resultados usando una multiespectroscopia UV-FL y GC-MS, observando la acumulación de dosis-respuesta en el músculo, en el hígado, y en los metabolitos de la vejiga biliar. MÄKELÄ and PYY, 1995, estudian los efectos de la temperatura en la retención de 15 PAHs incluidos en la EPA (método 610) utilizando relleno ODS. Utilizan columna ChromSpher PAH (100 mm*3 mm) termostatizada a 23.7 ºC (18ºC de temperatura ambiente) con bomba de gradiente. El IndP, Dibenz[a,h]Ant y BghiP son especialmente propensos a cambiar sus tiempos de retención en fase polimérica ODS con la temperatura. Usando un control de temperatura (incremento de T< 0.1ºC) obtienen buena reproducibilidad en los tiempos de retención: RSD% menor que 0.07% (n=10), para los 15 PAHs. Las longitudes de onda de excitación y de emisión que utilizan y los LQ encontrados para diez de los PAHs son: Ant (250-420) 5 pg, Fl y Pir (240-420) 10 pg, BaA y Cris (260385) 10 pg, BbF (292-431) 10 pg, BkF (297-410) 5 pg, BaP (250-405) 10 pg, BghiP (291411) 10 pg e IndP (294-499) 10 pg, respectivamente. MCDONALD y col., 1995, determinan PAHs (Naftaleno, Fenantreno y BaP) en pescados capturados en la península Antártica. Los niveles de los metabolitos del Naftaleno (51000140000 ng/g) y Fenantreno (7200-25000 ng/g) se encuentran en niveles más altos en la bilis del pescado, no habiendo diferencias significativas en la concentración del BaP (780-940 ng/g). SHCHEKATURINA y col., 1995, cuantifican 15 PAHs en mejillones capturados en el Mar Negro (zona crónicamente contaminada y zona relativamente limpia) por GC, previa hidrólisis alcalina. Los resultados muestran que las concentraciones de PAHs en los mejillones capturados en la zona contaminada, son de 6 a 50 veces mayores que en la zona limpia (0.6 a 300 µg/kg), y encuentran los 15 PAHs analizados. Mientras que en la zona Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 91 - limpia no encuentran BkF, Dibenz(ah)Ant ni BghiP, y las concentraciones oscilan entre 0.1 y 6 µg/kg). El PAHs que se encuentra en mayor concentración en ambos lugares es el Fl. CHEE y col., 1996, utilizan la técnica de microondas-asistido con extracción de solvente (MASE), en un sistema de extracción por microondas (MES) desarrollado para la extracción de PAHs en sedimentos marinos. La comparación con Soxhlet y MASE muestra que ambas técnicas dan resultados comparables en material de referencia (HS-4 y HS-6); siendo necesario menor volumen de solvente y tiempo de extracción con MASE. Los métodos analíticos utilizados son HPLC-UV, HPLC-FL y GC-MS. Las recuperaciones obtenidas en los materiales de referencia son superiores al 73%. Las concentraciones en los sedimentos marinos recogidos en áreas industriales se encuentran en un rango de 0.03 a 0.35 µg/g, expresados en materia seca. LESKO y col., 1996, capturan hembras de Ameiurus nebulosus en tres lagos de Ohio entre el 8 y el 25 de Mayo de 1989, para determinar los efectos de la presencia de sedimentos contaminados en su reproducción. La fecundidad, diámetros de los huevos, longitud y peso de los pescados , y la presencia de anomalías externas se recogen para cada muestra. Las Ameiurus procedentes de lugares contaminados son más largas y su fecundidad es significativamente diferente (P ≤0.05) en los tres ríos. Además, el río más polucionado es el que presenta el mayor número de huevos por hembra, individualmente. La alta frecuencia de anomalías externas que se observan en las Ameiurus de zonas contaminadas, no parecen tener influencia sobre la fecundidad. Estos resultados sugieren que la fecundidad de las Ameiurus no se ve afectada adversamente en los ecosistemas alterados con la presencia de sedimentos contaminados. MCDONALD y col., 1996, determinan PAHs y PCBs en tejido de pescado (bilis e hígado) y sedimentos de Texas por HPLC-FL. Los sedimentos se extraen por Soxhlet con cloruro de metileno, purificando el extracto mediante columna cromatográfica de alúmina/sílica gel. Los tejidos de pescado son macerados y extraídos con cloruro de metileno, y purificados a Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 92 - través de alúmina/sílica gel o alúmina/sulfato sódico. Los niveles de PAHs encontrados en sedimentos oscilan entre 81 y 1060 ng/g y los PCBs son inferiores a 20 ng/g. No hay diferencias significativas en las concentraciones hepáticas de los distintos contaminantes, sin embargo hay diferencias significativas en las concentraciones biliares del Naftaleno, Fenantreno y en los metabolitos del BaP. PEÑA y col., 1996, examinan el contenido de n-alcanos y PAHs en moluscos (Osilinus attratus) mediante hidrólisis alcalina y extracción con n-hexano. La capa orgánica lavada con HCl y neutralizada se concentra en rotavapor. Las fracciones de alifáticos y aromáticos se separan mediante columna cromatográfica de florisil-alúmina-sílica, eluyendo con hexano y n-hexano/DCM (8+2). Ambas fracciones se llevan a sequedad en rotavapor, disolviendo la fracción de alifáticos en n-hexano, y la de aromáticos en tolueno. Ambas fracciones son analizadas por GC-MS. Sólo ocho (Naftaleno, Fl, Pir, BaA, Cri, BbA, Perileno y BaP) de los diecinueve PAHs cuantificados se detectan en las muestras analizadas, y sólo el Naftaleno está presente en casi todas las muestras (23%). READMAN y col., 1996, extraen PAHs de tejidos de corales (Porites lutea) recogidos en la costa del golfo de Kuwait y Arabia Saudí. La muestra se extraen por ultrasonidos con nhexano/DCM (1:1) durante 45 min. El contenido en lípidos se determina de una alícuota de este extracto. El extracto se purifica a través de sílica gel-alumina-sulfato sódico anhidro, se concentra en rotavapor y se cuantifica por GC/MS. Las concentraciones de PAHs encontradas son extremadamente bajas (0.1 ng/g expresadas en peso seco), y el contenido en lípidos expresados en mg/g oscila entre 0.3 y 11.1. SMITH y col., 1996, investigan la adsorción de BaP en barbos a partir de sedimentos con diferente contenido en carbón orgánico. Los sedimentos sobrecargados con BaP se aplican durante 6 h a la superficie de distintos tejidos del barbo. En todos ellos, excepto en la sangre y las gónadas, se incrementa la concentración de BaP cuando la concentración de carbón orgánico disminuye. Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 93 - SISOVIC y col., 1996, extraen PAHs (Ant, Fl, BbF, BkF, BaP, BghiP y B(b)Cri) de muestras de aire recogidas en filtros mediante ultrasonidos con ciclohexano durante 1 hora, evaporando a sequedad con rotavapor a temperatura ambiente. El extracto se redisuelve en ACN y se analiza por HPLC, obteniendo LD que oscilan entre 0.05 ng para BkF y 0.1 ng para Fl. Los valores que encuentran en el aire oscilan entre 1.88 y 35.34 ng/m3 para Ant y Fl, en invierno, y de 0.008 a 0.33 ng/m3 para Ant y Fl, en los meses de verano. Aplicado a muestras de aire del interior de una vivienda obtienen valores similares entre 1.5 y 10.17 ng/m3 para Ant y Fl, en invierno, y de 0.009 a 0.32 ng/m3 para Ant y Fl, en los meses de verano. UTHE y col., 1996, estiman las concentraciones de PAHs deuterizados en glándulas de tejido digestivo de langosta americana (8 machos y 8 hembras) capturadas en dos zonas diferentes de Canadá, realizando el análisis por GC/MS. Los niveles hallados de PAHs demuestran una gran varianza interanimal, constante en los especímenes capturados al mismo tiempo en el mismo lugar (longitud de caparazón, peso de langosta y peso de la glándula digestiva). Las concentraciones medias de PAHs (ng/g, expresada en materia húmeda), son más altas en machos que en hembras, encontrando las concentraciones más elevadas en Fl, Pir y Cri; por el contrario, el PAHs que se encuentra en menor concentración es BaA. La concentración de PAHs en langosta individualmente, depende generalmente del tamaño, sexo y área de captura. VAN BRUMMELEN y col., 1996a, analizan 10 PAHs (Fluoreno, Fenantreno, Ant, Fl, Pir, BaA, Cri, BbF, BkF, BaP) en cuatro estratos diferentes de suelos a distintas zonas distanciadas de una planta de alto horno. Las muestras se extraen por soxhlet con ACN durante 5 h. Los extractos adicionados de agua destilada se extraen con hexano, se purifica con columna de sílica-gel activada, y se eluye con hexano:DCM (85:15 v/v). El análisis se realiza por HPLC con bomba de gradiente a flujo 1.5 mL/min., loop 20 µL, columna termostatizada a 25ºC, con detector de FL y UV-diode array. Las recuperaciones oscilan entre 75 y 100% para los 16 PAHs de la EPA analizados en material de referencia (SRM Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 94 - 1647a). La concentración de los 10 PAHs decrece al aumentar la distancia desde la planta, encontrándose 370 mg/m2 a 0.30 Km y 36.9 mg/m2 a 6.55 Km. Los diferentes estratos de suelos revelan un enriquecimiento de PAHs con la materia orgánica. Este efecto, se incrementa al aumentar el peso molecular del compuesto, y es usado para estimar la vida media del PAHs en el suelo. VAN BRUMMELEN y col., 1996b, continúan con el estudio anterior, recogiendo en este caso, tres especies de isópodos y una especie de lombriz. El tejido del animal se extrae mediante soxhlet con hexano durante 4.5 h. Una alícuota del mismo se utiliza para la determinación de lípidos. El extracto se purifica y concentra a través de columna de sílica, y se analiza por HPLC-FL, con bomba de gradiente, flujo 1.5 mL/min., y UV-Diode array para el Fenantreno y Fl. El peso fresco de los animales varía considerablemente entre los lugares de recogida, aunque no hay correlación con la distancia desde el horno de la planta, el contenido en lípidos difiere entre las especies. La concentración de PAHs en las especies decrece al aumentar la distancia a la planta, encontrando elevados niveles de todos los PAHs analizados en lombriz y Porcellio scaber, mientras que en las otras dos especies de isópodos sólo se encuentran niveles elevados de Fl y Pir. VAN BRUMMELEN y col., 1996c, estudian la ecotoxicidad de cinco PAHs (Fluoreno, Fenantreno, Fl, BaA y BaP) en dos especies de isópodos (Oniscus asellus y Porcellio scaber). Para ello sobrecargan el alimento con PAHs, observando que en el Porcellio scaber después de 16 semanas no se presentan efectos adversos de supervivencia (mueren el 6.7%), ni de crecimiento. En el Oniscus asellus se observa una mortalidad más alta, un 14% después de 16 semanas de tratamiento, y un 28% después de 48 semanas, así como una pequeña pero significativa reducción en su crecimiento, y una significativa estimulación de la reproducción. VAN DER KRAAN and VAN WINGERDEN, 1996, utilizan saltamontes para conocer los efectos de la exposición de sus huevos a PAHs en dos ensayos: en el primero, son Antecedentes Bibliográficos Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 95 - expuestos a distintas concentraciones de Fenantreno durante 118 días, y en el segundo a diferentes concentraciones de Ant, Fenantreno, Fl, BaA y Cri durante dos períodos: primero 26 días, y después del día 61 al 83. En ambos ensayos, el 70% de los huevos han anidado. Los resultados demuestran que el tratamiento con PAHs no tiene efectos en la duración del desarrollo del embrión, ni en la nidada de los huevos. Sin embargo, retrasa e inhibe la actividad de la alimentación y anula la fecundidad femenina. BAUMARD y col., 1997, desarrollan un método rápido, selectivo y sensible para la determinación de PAHs en organismos biológicos. Los tejidos liofilizados se someten a saponificación, con posterior extracción por partición. El extracto se purifica a través de microcolumnas de sílica y alúmina, siendo analizado el extracto final por GC-MS. Las recuperaciones obtenidas usando material de referencia de tejido de mejillón (SRM 1974a) oscilan entre un 63.5 y 113%, con una media de 90±16%, y en sobrecargas de mejillón entre el 91 y 109%, obteniendo una media de 100±6%. CLEEMANN y col., 1997, analizan 484 muestras de sedimentos y biota, incluyendo mejillones, peces, pájaros y focas de cuatro localizaciones diferentes de Groenlandia, tres en la costa oeste y una en la costa este. Los análisis realizados incluyen PCBs, HCB, HCH, Dieldrin, DDTs, clordanos, toxafenos y 22 PAHs. Los resultados muestran niveles comparables o ligeramente más bajos que los encontrados en otras regiones del Ártico. Para todas las especies analizadas, se encuentran niveles más altos de PCBs y DDT en la costa oeste que en la costa este. Los organoclorados se encuentran en animales de altos niveles tróficos, mientras que los PAHs muestran los niveles más altos en el hígado de múgol de cuernocorto o trompacorta (839 µg/kg, expresados en materia húmeda), y los valores más bajos en grasa de focas (97 µg/kg, expresados en materia húmeda). WANG y col., 1997, analizan PAHs por GC-MS en cuatro pájaros contaminados por aceites desconocidos. Encuentran niveles de Ant, Fl, Pir, BaA, Cri, Bb+kF, BaP, BghiP e IndP en concentraciones que oscilan entre ND para el IndP y 858.7 µg/g para el Cri. Parte Experimental Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 100 - PARTE EXPERIMENTAL 1. MATERIAL Y APARATOS a) Extractor de fluidos supercríticos Hewlett Packard 7680A, controlado por ordenador. b) Espectrofluorímetro de luminescencia Perkin-Elmer LS-50, equipado con una lámpara pulsante de Xenon, monocromadores de Monk-Gillieson y cubetas de cuarzo de 1 cm, conectado en serie (RS232C) a un ordenador. c) Cromatógrafo de líquidos SPECTRA-PHYSICS, equipado con bomba isocrática P100, precolumna C-18 Tracer Tr-C-160, columna en fase reversa Hypersil Green PAH (tamaño de partícula de 5 µm; 0.46 cm x 100 mm), inyector Rheodyne en bucle de 20 µL, detector de Fluorescencia FL2000; integrador DATAJET, conectado vía LABNET a un ordenador. La temperatura de la columna se ha mantenido a 32 ºC mediante un baño de agua. d) Microbalanza modelo SARTORIUS 2405, con seis decimales de precisión (Departamento de Bioquímica de la Facultad de Farmacia de Santiago de Compostela). e) Balanza electrónica Salter-And ER-120A, con cuatro decimales de precisión. f) Estufa Heraeus T-340. g) Jeringas HAMILTON para HPLC. h) Jeringas de vidrio con adaptador metálico BECTON-DICKINSON. i) Extractor Soxhlet AFORA. j) Viales de vidrio de 2 mL para la extracción de SFE, Hewlett Packard(Ref. 5181-3375). k) Placa calefactora Combimax 230 A. l) Arcón congelador Edesa de 1000 L. m) Frigorífico Radiber mod. EC-1200L. n) Lámpara UV Atom 70 con longitudes de onda de 254 y 360 nm. Parte Experimental Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 101 - ñ) Cartuchos de celulosa WHATMAN para extracción Soxhlet (35 mm de diámetro externo y 118 mm de longitud externa). o) Otro material de uso corriente en el laboratorio. 2. ORDENADORES y PROGRAMAS El SFE está conectado al ordenador Hewlett Packard Vectra VL2 4/33se, equipado con software SFE, versión 2.00. Para la adquisición y tratamiento de los datos espectrofluorimétricos se ha utilizado un ordenador HANDOK HNS (CPU: 12.5 MHz, RAM: 4 MB, disco duro: 43 MB), equipado con el software de aplicaciones luminescentes FLUORESCENCE DATA MANAGER (FLDM), versiones 2.50 y 3.50; y a un ordenador portátil Pentium II ACER EXTENSA 710 TE, con la versión del software en Windows FL WinLab, versión 2.01. Para la adquisición y tratamiento de los datos cromatográficos se ha usado el ordenador OLIVETTI PCS 44 (CPU: 25 MHz, RAM: 4 MB, disco duro: 85 MB), con el sistema operativo MS-DOS, con entorno Windows versión 3.1, equipado con los software WINNER ON WINDOWS (WOW) (versión 2.0), SPECTRA-PHYSICS CHROMATOGRAM OVERLAY (versión 1.00), DISPLAY (versión 4.05) y SYSTEM SUITABILITY TEST (SST) (versión 4.1). Para la redacción de la memoria y para la realización de las gráficas se ha utilizado un ordenador Pentium AOC Spectrum (CPU: 120 MHz, RAM: 16 MB y disco duro 1.2 GB) y un ordenador portátil Pentium II ACER EXTENSA 710 TE (CPU: 233 MHz, RAM: 96 MB, disco duro: 4 GB), con el sistema operativo MS-DOS versión 6.20, y entorno Windows 95 y 98, provisto de los software MICROSOFOT WORD (versión 97), MICROSOFOT EXCEL (versión 97), ACD/ChemSketch (versión 3.5), CHAPMAN & HALL (Diciembre, 1998), Masslab (versión 1.3), HP ChemStation for Parte Experimental Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 102 - LC and L/MS Systems (Rev. A.06.01, 1998), HARVARD GRAPHICS (versión 4.0) y STATGRAPHICS (versión 2.6). 3. REACTIVOS a) Patrones de PAHs ALDRICH Fluoranteno (CAS: 206-44-0) - Pireno (CAS: 129-00-0) - Benzo[a]Antraceno (CAS: 56-55-3) - Criseno (CAS: 218-01-9) - Benzo[a]pireno (CAS: 50-32-8) b) Patrones de PAHs SUGELABOR -Antraceno (CAS: 120-12-7) -Benzo[b]fluoranteno (CAS: 205-99-2) -Benzo[k]fluoranteno (CAS: 207-08-9) -Benzo[ghi]perileno (CAS: 191-24-2) -Indeno[1,2,3-cd]pireno (CAS: 193-39-5) (Precaución: Todos estos patrones se consideran tóxicos y, a excepción del BghiP, carcinógenos probables, por lo que deben tenerse en cuenta una serie de precauciones en su manejo. Ver ficha técnica en la Introducción, pags 8 - 26). c) Agua de grado HPLC, obtenida por ósmosis en un equipo MILLI-Q Plus, MILLIPORE. d) Acetonitrilo para cromatografía MERCK, SCHARLAU, CARLO ERBA y J. BAKER. e) Metanol grado HPLC, SCHARLAU. f) Ácido clorhídrico fumante 37% para análisis MERCK. g) Bencina de petróleo para análisis, intervalo de ebullición 40-60ºC MERCK. h) n-hexano para análisis de trazas orgánicas, MERCK. i) Papeles de filtro WHATMAN 541. Parte Experimental Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 103 - j) Sílica gel 60 para cromatografía en columna MERCK. Tamaño de partícula 0.0630.200 mm (70-230 mesh ASTM). k) Óxido de aluminio 90 MERCK, estandarizado para análisis cromatográfico por adsorción según Brockmann. Tamaño de partícula 0.063-0.200 mm (70-230 mesh ASTM). l) Filtros MFS-25; membrana PTFE; poro:0.5 µm y diámetro:25 mm. m) CO2 sifón de la SEO. n) CO2 calidad SFC Tube Plongeur de la SEO. ñ) Nitrógeno de la SEO N-45. o) Helio de la SEO N-50. 4. PREPARACIÓN DE LOS PATRONES Se han preparado soluciones madre en hexano de los PAHs estudiados, de 100 mg/L de concentración, soluciones de trabajo de 100 µg/L (el IndP de 1004 µg/L), y se han mantenido refrigeradas a 4ºC. A partir de éstas, se han preparado las soluciones de trabajo en ACN, evaporando a sequedad bajo corriente de nitrógeno y redisolviendo en ACN, excepto para el Ant que se ha preparado en ACN en las mismas concentraciones, ya que se degrada por evaporación a sequedad. 5. PROTOCOLO ANALÍTICO 5.1. DESCRIPCIÓN DE LAS MUESTRAS Se han analizado vísceras de 23 aves rapaces catalogadas de interés especial (nocturnas y diurnas), las cuales han sido suministradas ya diseccionadas y congeladas por los cuatro Centro de Fauna Salvaje de Galicia localizados en Oleiros (La Coruña), El Veral (Lugo), Rodicio (Orense) y Cotorredondo (Pontevedra), a través del Departamento de Parasitología, del Instituto de Investigación y Análisis Alimentarios de la Universidad de Santiago de Compostela. En la Tabla 1 y Fig. 30, se recogen las Parte Experimental Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 104 - características aportadas por dicho Centro para las aves estudiadas: 10 diurnas (Buteo buteo o Ratonero), y 13 nocturnas (2 Strix aluco o Cárabo y 11 Tyto alba o Lechuza), con un total de 133 vísceras (hígado, corazón, pulmón, riñón, músculo e intestino). Tabla 4. Características de las muestras analizadas para la determinación de PAHs. Muestra Provincia Lugar de recogida Sexo Edad Fecha de muerte Causa de muerte (1)Buteo buteo R-1 La Coruña Oleiros HA25/12/93 Disparo Buteo buteo R-2 La Coruña Noya MA01/03/94 Disparo Buteo buteo R-3 La Coruña Negreira MA30/11/94 Disparo Buteo buteo R-4 La Coruña Puebla del Caramiñal HA06/03/95 Disparo (2)Buteo buteo R-5 Lugo Sarria MA15/10/93 Disparo Buteo buteo R-6 Orense Castro Caldelas HA14/04/94 Disparo* Buteo buteo R-7 Orense Castro Caldelas MInm 05/12/93 Disparo Buteo buteo R-8 Orense Castro Caldelas MA24/04/94 Disparo Buteo buteo R-9 Pontevedra Salvatierra HA07/12/93 Disparo Buteo buteo R-10 Pontevedra Bueu MA18/12/93 Disparo Strix aluco C-1 Pontevedra Vigo MA19/03/94 Golpeado Strix aluco C-2 Pontevedra Las Nieves HA27/04/96 Desconocida Tyto alba L-1 La Coruña Muros HInm 02/11/85 Atropello (3)Tyto alba L-2 La Coruña Santiago MA26/08/91 Golpeado Tyto alba L-3 Orense Orense HA07/11/93 Desconocida Tyto alba L-4 Orense Orense MA10/01/95 Golpeado Tyto alba L-5 Pontevedra Vigo HA05/11/94 Atropello Tyto alba L-6 Pontevedra La Guardia MA18/11/94 Atropello Tyto alba L-7 Pontevedra Sangenjo HA02/11/94 Atropello Tyto alba L-8 Pontevedra Cangas HA25/11/94 Atropello Tyto alba L-9 Pontevedra Pontevedra MA21/12/95 Disparo Tyto alba L-10 Pontevedra Bueu HA15/04/96 Disparo Tyto alba L-11 Pontevedra Moaña HA02/11/94 Atropello *Sacrificado por irrecuperable; H = Hembra; M = Macho; A = Adulto; Inm = Inmaturo. (1)Se dispone de riñón, corazón y pulmón. (2)No se dispone de riñón. (3)Se dispone de músculo Parte Experimental Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 105 - Fig. 30. Mapa de localización de las muestras analizadas. Parte Experimental Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 106 - 5.2. DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD Se toma una alícuota de la víscera y se pesa en fresco en placa Petri de vidrio, previamente tarada. Se tritura y se somete a desecación en estufa a 70ºC hasta peso constante, necesitándose un total de 14 o 20 horas, según el peso de la muestra fresca (menor o mayor de un gramo, respectivamente). Una vez desecada, la muestra se pesa, calculándose por diferencia el % de humedad. 5.3. DETERMINACIÓN DE GRASA DE LA MUESTRA Se ha calculado según el Método Oficial (BOE, 29-8-79). Con los datos de humedad de la muestra se expresan los resultados en % grasa en materia seca. 5.4. EXTRACCIÓN DE PAHs Para la extracción mediante SFE se ha utilizado el modelo HP7680A (Fig. 31). Se ha utilizado anhídrido carbónico supercrítico como fluido de extracción (Fig. 32), y sílica activada al 15% como adsorbente, previamente purificada durante 6 horas en soxhlet con ACN MERCK. La sílica una vez purificada, se ha introducido en la estufa a 100 ºC durante 4 horas, enfriándola en desecador (proceso de activación). A continuación se ha desactivado parcialmente mediante la adición de un 15% de agua MILLI-Q, y posterior homogeneización por agitación manual durante quince minutos. Parte Experimental Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 107 - Fig. 31. Módulo de extracción del HP7680A. Fig. 32. Esquema básico del extractor supercrítico HP 7680A Parte Experimental Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 108 - Debido a la pequeña cantidad de muestra disponible, los estudios preliminares se han realizado sobre hígado de pollo comercial, para posteriormente repetir los mismos ensayos con las muestras objeto de estudio. La muestra previamente desecada, se pulveriza en un molinillo para obtener un tamaño de partícula homogéneo. En una cápsula se pesan 2 g de sílica parcialmente desactivada al 15%, se añade la muestra desecada pulverizada, y se mezcla bien. En el "thimble" o vaso de extracción se coloca un papel de filtro (Whatman 541) del mismo diámetro del vaso de extracción, previamente al cierre del tapón. Se introduce la mezcla de la muestra con la sílica parcialmente desactivada al 15% y sobre ella 1 g de sílica parcialmente desactivada al 15%, y 200µL de metanol como modificador. A continuación se pone otro papel de filtro (Whatman 541), igual que en el extremo inferior y se cierra. Las condiciones de trabajo han sido las siguientes (Fig. 33): Fig.33. Condiciones del SFE para realizar la extracción de PAHs. Parte Experimental Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 109 - Se recoge el ACN de lavado de tres viales y se lleva a 5 mL. Este eluato se filtra a través de un filtro MFS-25 (tamaño de poro 0.5 µm), y a continuación se analiza por HPLC-FL. 6. ANÁLISIS 6.1. ANÁLISIS ESPECTROFLUORIMETRICO Además de los espectros de excitación y de emisión convencionales, en los que uno de los monocromadores permanece fijo mientras el otro varía a lo largo de longitudes de onda, existe otra modalidad sincrónica, que resulta de efectuar un barrido simultáneo de las longitudes de onda de excitación y de emisión con un intervalo de longitud de onda constante, ∆λ, entre ellas, aumentando la selectividad y resolución. Para la optimización de las longitudes de onda de los diez PAHs estudiados en ACN, se han realizado 50 espectros sincrónicos de cada PAH individualmente en las siguientes condiciones de trabajo: - Rango espectral: 200-500 nm. - Rendija de excitación: 5 nm. - Rendija de emisión: 5 nm. - Velocidad de barrido: 240 nm/minuto. - Intervalo de longitud de onda inicial: 10 nm. - Incremento: 5nm. - Numero de registros: 50. De acuerdo con los valores asignados a estos tres últimos parámetros (intervalo, incremento y nº de registros), el intervalo de longitud de onda correspondiente a cada uno de los 50 registros vendrá dado por la fórmula: R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S Y Y D DI IS SC CU US SI IÓ ÓN N Resultados y Discusión Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 116 - RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las muestras descritas en la Tabla 4, consisten en alícuotas muy diferentes de vísceras congeladas, envueltas cada una por separado en papel de aluminio, y a su vez clasificadas por cada ave en bolsas de plástico. Para su estudio se han utilizado cantidades variables debido al diferente tamaño de las muestras, tomando siempre que ha sido posible 0.5 g (Furton y Lin, 1993 y Gere y col., 1993). Debido a la dificultad de determinar todos los parámetros de estudio en una misma muestra, se han decidido dedicar un total de 87 vísceras (Tabla 10), para la determinación del % de humedad y % de grasa en materia seca, de las tres especies de aves rapaces, nocturnas y diurnas, objeto de este estudio: Buteo buteo (Ratonero), Strix aluco (Cárabo) y Tyto alba (Lechuza); correspondiendo 39 vísceras a Hembras Adultas, y 48 vísceras a Machos Adultos. Se han seleccionado vísceras de las que no se dispone de todos los datos identificativos (Causa de muerte, Provincia, lugar de recogida...), y que no permitirían realizar estudios estadísticos sobre los resultados encontrados de PAHs. Los parámetros objeto de estudio, y el % de humedad se ha determinado en 133 muestras. 1. HUMEDAD Inicialmente, se ha hecho un estudio con muestras comerciales de hígado de pollo fresco para conocer el número de horas que deben estar en estufa a temperatura constante de 70ºC, para alcanzar peso constante (la diferencia de pesada entre dos determinaciones simultáneas, no debe de ser superior a 0.1 g de agua por 100 g de muestra (0,1%)). Se han hecho tres determinaciones sobre la misma muestra, con tres cantidades diferentes de pesada en muestra fresca: 0.50, 2 y 5 g. La temperatura se ha fijado a 70ºC, para evitar modificaciones en la grasa, ya que las sustancias objeto de este estudio presentan un alto carácter lipofílico y a temperaturas más altas se observaba una separación de la misma. El estudio se ha empezado en 12 horas, incrementándose cada dos horas hasta un total de 24, alcanzándose peso constante en: Resultados y Discusión Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 117 - - 14 horas si la muestra es inferior a 1g. - 20 horas si la muestra es superior a 1g. Además de las 87 muestras citadas anteriormente, la humedad se ha determinado en las 133 muestras objeto de análisis. Tabla 10. Características de las 87 vísceras utilizadas para la determinación del % de grasa y humedad. Muestra Provincia Lugar de recogida Sexo Edad Fecha de muerte Causa de muerte Buteo buteo GR-1 HA Buteo buteo GR-2 Pontevedra Bueu HA12/09/95 Enfermedad Buteo buteo GR-3 MA3/08/93 Enfermedad Buteo buteo GR-4 MADisparo Buteo buteo GR-5 MADisparo Buteo buteo GR-6 Lugo Sarria MA15/10/93 Disparo Strix aluco GC-1 HA11/12/91 Strix aluco GC-2 HA Strix aluco GC-3 MA Strix aluco GC-4 Pontevedra Vigo MA20/03/94 Tyto Alba GL-1Covelo HA26/11/95 Golpeado Tyto Alba GL-2 Castrelo de Miño HAAtropello Tyto Alba GL-3 Pontevedra Moaña HA02/11/94 Atropello Tyto Alba GL-4 MA Tyto Alba GL-5 MAGolpeado Tyto Alba GL-6 MA6/01/94 2. GRASA A los resultados obtenidos de extraer las muestras según el Método Oficial (BOE, 29-8-79), se les ha aplicado el programa STATGRAPHICS, recogiéndose en la Tabla 11 las variables estadísticas para el contenido en humedad en las 220 (87 +133) vísceras analizadas y % grasa (87 vísceras) expresado en materia seca. Resultados y Discusión Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 118 - Tabla 11. Variables estadísticas del % de humedad y de grasa. % Humedad n=220 % grasa n=87 Media 75.77 11.15 Desviación estándar 4.580 7.105 Mediana 75.87 9.430 Moda 75.78 9.430 Varianza 20.98 50.49 Mínimo 57.52 1.240 Máximo 86.88 39.44 Cuartil inferior 72.35 6.270 Cuartil superior 78.97 13.54 Asimetría -0.2710 1.684 Aplastamiento 0.6570 3.232 El valor medio de humedad es de 75.77% con una desviación estándar del 4.580%, observando que el cuartil inferior de las muestras tienen un valor por debajo de 72.35%, y el cuartil superior de las muestras de 78.97%. La distribución es normal, es decir, presenta una distribución simétrica con un factor de aplastamiento de 0.657. Respecto al valor medio de % grasa en materia seca, es de 11.15% con una desviación estándar de 7.105%, repitiéndose el valor de 9.430%. En el cuartil inferior de las muestras se encuentra un valor por debajo de 6.270%, mientras que en el cuartil superior es de 13.54%. También presenta una distribución simétrica, con un factor de aplastamiento de 3.232. Se ha aplicado el análisis de la varianza (intervalo 95% y nivel de significación 0.05) con el fin de dilucidar si existen diferencias significativas en función del tipo de víscera (Tabla 12, Fig. 35), de la especie (Tabla 13, Fig. 36) o del sexo (Tabla 14, Fig. 37). Resultados y Discusión Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 119 - Tabla 12. Valores medios de % de humedad y % de grasa en materia seca, en función del tipo de víscera. Corazón Hígado Intestino Músculo Pulmón Riñón nº de muestras 16 16 10 14 15 16 % de Grasa 12.71 13.49 10.60 8.460 11.29 9.810 nº de muestras 39 38 32 35 38 38 %de humedad 72.91 73.41 78.95 74.04 78.26 76.45 Fig. 35. Valores medios de % de humedad y % de grasa en materia seca, en función del tipo de víscera. Los resultados obtenidos en la Tabla 12 y Fig. 35, ponen de manifiesto que el % de grasa expresado en materia seca y % de humedad en las seis vísceras analizadas, no presentan diferencias significativas. Se observa que poseen mayor cantidad de grasa, el hígado y corazón, con la correspondiente menor cantidad de humedad. Tabla 13.. Valores medios de % de humedad y % de grasa en materia seca, en función de la especie. Ratonero Cárabo Lechuza nº de muestras32 21 34 % Grasa 11.54 9.810 11.61 nº de muestra 88 33 99 % Humedad 75.82 75.04 75.96 Corazón Hígado Intestino Músculo Pulmón Riñón 0 10 20 30 40 50 60 70 80 % Grasa % Humedad Resultados y Discusión Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 120 - Fig. 36. Valores medios de % de humedad y % de grasa en materia seca, en función de la especie. En la Tabla 13 y Fig. 36, se observa que no hay diferencias significativas en % de grasa según las especie analizada, presentando valores ligeramente más altos lechuza y ratonero, sin prácticamente variación en el contenido de humedad. Tabla 14. Valores medios de % de humedad y % de grasa en materia seca, en función del sexo. Hembras Machos nº de muestras 39 48 % Grasa 12.16 10.33 nº de muestras 108 112 % Humedad 75.23 76.29 Fig. 37. Valores medios de % de humedad y % de grasa en materia seca, en función del sexo. Ratonero Cárabo Lechuza 0 20 40 60 80 % Grasa % Humedad Hembras Machos 0 20 40 60 80 % Grasa % Humedad Resultados y Discusión Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 121 - En la Tabla 14 y Fig. 37, los resultados muestran que contienen más % de grasa las hembras (12.16±1.19%) que los machos (10.33±0.98%) sin presentar diferencias significativas. 3. EXTRACCIÓN DE PAHs POR SFE Elección del adsorbente y modificador La técnica de extracción de fluidos supercríticos en muestras sólidas con un alto contenido en grasa, aconseja utilizar un adsorbente en fase sólida, para purificar la muestra lo máximo posible, y así evitar pasos posteriores de purificación del extracto obtenido. Los adsorbentes más comúnmente utilizados para la extracción de PAHs por SFE son: sílica (Meyer y Kleibömer, 1993; Tena y col., 1994; Hüsers y Kleiböhmer, 1995; Hsieh y Chang, 1997), alúmina (Meyer y Kleibömer, 1993), florisil (Meyer y Kleibömer, 1993), C18 (Ali y Cole, 1998), tierra de diatomeas (Porter y col., 1992; Lee y col., 1993), sulfato sódico (Bicking y col., 1993 y Dankers y col., 1993) y arena de cuarzo (Järvenpää y col., 1996). En un trabajo previo a este estudio, en el que realizamos la extracción de BaP en aromas de humo por esta técnica (Laffon y col., 1997), se obtuvieron buenas recuperaciones utilizando sílica parcialmente desactivada al 15% (2 g) o alúmina parcialmente desactivada al 10% (4 g), por lo que decidimos probar ambos adsorbentes en las mismas condiciones. En primer lugar, en las condiciones de trabajo seleccionadas, se realizó la extracción de sílica parcialmente desactivada al 15% (2 g) y de alúmina parcialmente desactivada al 10% (4 g), inyectándolas por HPLC-FL en las condiciones de cuantificación de los diez PAHs objeto de este estudio, para conocer su respuesta Los resultados obtenidos en ambos adsorbentes, muestran una interferencia importante coincidente con el tiempo de retención de los picos del Ant y Pir para la alúmina Resultados y Discusión Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 122 - parcialmente desactivada al 10%, y además para el Fl en la sílica parcialmente desactivada al 15% (Fig. 38). Fig. 38. Cromatogramas de HPLC de sílica al 15% y alúmina al 10% en: a) condiciones de inyección 1, y b) condiciones de inyección 2. Resultados y Discusión Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 123 - Se ha procedido entonces a la purificación del adsorbente mediante su extracción en soxhlet durante seis horas, con un solvente orgánico apolar generalmente utilizado para la extracción de PAHs, el n-hexano. Los resultados obtenidos, muestran una purificación en la señal interferente con el pico del Ant en el caso de la sílica parcialmente desactivada al 15%, sin observar ninguna purificación en el caso de la alúmina parcialmente desactivada al 10%. Se procede a continuación, a la purificación con un solvente polar, el ACN. Aunque para la alúmina parcialmente desactivada al 10% no se consigue ningún tipo de purificación con dicho solvente, si para la sílica parcialmente desactivada al 15%, probándose dos tipos de ACN: MERCK (que da menos respuesta en espectrofluorimetría tras la realización de su mapa de contorno (Fig. 41)) y SCHARLAU, obteniendo menos señal con el MERCK, donde desaparece la señal interferente con el Fl, y las otras dos señales disminuyen mucho (Fig. 39). La respuesta interferente en este solvente corresponde al mismo tiempo de retención que dos PAHs estudiados: Ant y Pir. Se ha probado también la purificación de dichos adsorbentes mediante la misma técnica de SFE, inyectándolos por HPLC-FL. La respuesta que se obtiene en ambos casos, no mejora con relación a los anteriormente citados. Por ello finalmente, se ha elegido como el adsorbente más idóneo para la extracción de PAHs por SFE la sílica parcialmente desactivada al 15% previamente purificada 6 horas por Soxhlet con ACN MERCK. El uso de modificadores (metanol, anilina, tolueno...) es recomendado por numerosos autores en la bibliografía consultada para la extracción de PAHs, incrementando la eficiencia de la extracción actuando, bien por la eliminación de los analitos desde la matriz (adición de modificadores directamente en la muestra), o incrementando la solubilidad del analito en presencia del fluido de extracción (doble sistema de bomba o fluidos mezclados) (Hawthorne y col., 1993). Uno de los más utilizados es el metanol (Hawthorne y Miller, 1987; Burford y col., 1993; Tena y col., 1994; Barnabas y col., 1995; Fernández y col., 1996; Laffon y col., 1997; Monserrate y Olesik, 1997). En nuestro caso, se han utilizado 200 µL de metanol añadido directamente sobre la muestra previamente a la colocación del papel de filtro (Tena y col., 1994; Laffon y col., 1997). Resultados y Discusión Tesis Doctoral: S. González Amigo, 1999 - 124 - Fig. 39. Cromatogramas de HPLC de sílica al 15%, purificada seis horas por soxhlet con ACN SCHARLAU y MERCK, en: a) condiciones de inyección 1, y b) condiciones de inyección 2. Elección de la columna, solvente y volumen de extracción Una vez que el fluido supercrítico ha pasado a través de la muestra es bombeado hacia la columna (trap), en donde deberán quedar retenidos los analitos (PAHs) que arrastra. En un trabajo previo a este estudio en el que realizamos la extracción de BaP en aromas de humo por esta técnica (Laffon y col., 1997), se estudiaron dos columnas: