Evaluación in vivo e in vitro de los efectos crónicos de toxinas marinas emergentes en costas europeas

TESIS DE DOCTORADO EVALUACIÓN IN VIVO E IN VITRO DE LOS EFECTOS CRÓNICOS DE TOXINAS MARINAS EMERGENTES EN COSTAS EUROPEAS Andrea Boente Juncal ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN INVESTIGACIÓN BÁSICA Y APLICADA EN CIENCIAS VETERINARIAS LUGO 2021 DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS EVALUACIÓN IN VIVO E IN VITRO DE LOS EFECTOS CRÓNICOS DE TOXINAS MARINAS EMERGENTES EN COSTAS EUROPEAS Dña. Andrea Boente Juncal Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Lugo, abril de 2021 Fdo. Andrea Boente Juncal . AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS EVALUACIÓN IN VIVO E IN VITRO DE LOS EFECTOS CRÓNICOS DE TOXINAS MARINAS EMERGENTES EN COSTAS EUROPEAS D. Luis M. Botana López Dª. María del Carmen Vale González D. José Manuel Cifuentes Martínez INFORMA/N: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por Dª. Andrea Boente Juncal, bajo mi dirección, y a utorizo su presentación , considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de COMPENDIO DE PUBLICACIONES con reproducción de publicaciones, en los que la participación del doctorando/a fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Lugo, abril de 2021 Fdo. Luis M. Botana López Fdo. María del Carmen Vale González Fdo. José Manuel Cifuentes Martínez AGRADECIMIENTOS La presente tesis doctoral ha supuesto mucho tiempo, cariño y dedicación, y su culminación ha sido posible gracias a la cooperación y apoyo de todas y cada una de las personas e instituciones que reseñaré a continuación. Mis primeras palabras son de agradecimiento a mi director de tesis Luis, por brindarme esta oportunidad para formarme, por facilitarme las herramientas y por sus sabios consejos para guiarme en mi futuro. Quisiera darle las gracias a mi directora Carmen, por haber hecho fácil lo difícil. Gracias por todos los momentos en los que se comportó más como una amiga que como una tutora, especialmente cuando más lo necesitaba. Su gran cercanía, corazón y generosidad constituyen recuerdos que me llevaré de por vida. Gracias por enseñarme qué es ciencia, por compartir tus conocimientos conmigo, por inculcarme el rigor científico y hacerme más crítica, y en definitiva, conseguir que esté mejor preparada para mi siguiente etapa. Quisiera darle las gracias al resto de los profesores del departamento de Farmacología a Amparo, M. Carmen y Natalia por confiar en mí y en mi trabajo, por vuestro aliento y consejo durante la tesis doctoral. También al resto de miembros de otros departamentos, especialmente a Mercedes Camiña, Manolo Cifuentes y a Juan Rubiolo que me han enseñado a trabajar y colaborar eficazmente, intentando hacer de mi la mejor profesional posible. A mis compañeros de laboratorio, a los ya doctores Jesús y Rebeca, y a los que les queda un exitoso camino por recorrer, a Sandra R., Sandra G., Celia y Nadia, gracias por todo lo vivido y reído, por acompañarme en esta aventura, por vuestras palabras cálidas y ayuda incondicional, para ellas mis mejores deseos, estáis y estaréis por siempre en mi memoria y corazón. No me quiero olvidar del resto de personas con las que he coincidido en el seminario, no nos ha dado tiempo a conocernos mucho, pero os deseo todo lo mejor. Al resto de trabajadores de la Universidad de Santiago de Compostela que se han convertido en todo este tiempo en una gran familia, y pese a que no los nombre espero que se sientan identificados en esta mención, pues han sido de gran valor y ayuda para guiarme y finalizar esta etapa de mi vida. La facultad me ha preparado para el desafío de enfrentar el futuro, sé que lo hago con las mejores armas y con un fuerte espíritu de superación. Estos tan solo son los primeros pasos de un largo camino. También me gustaría agradecer a todos los que me han dado apoyo financiero durante este tiempo imprescindible para poder terminar con éxito este trabajo, especialmente gracias al programa estatal de promoción del talento y su empleabilidad y al subprograma de Formación de Profesorado Universitario (FPU16/07129) por la beca que se me ha concedido. Por último y más importante, a mi familia al completo, a todos mis tí@s y primos, haciendo mención especial a mi padre, a mi madre y hermano Alejandro, gracias por apoyarme y confiar en mi para iniciar esta travesía. El sustento emocional que me habéis proporcionado no solo a lo largo de la tesis doctoral, sino en toda mi vida, es lo que me ha hecho ser como soy. A mis buenas amigas, compañeras de vida, por apoyarme en todo momento y estar siempre ahí incluso en la distancia. A Enrique, por convertirte en la casualidad más importante de mi vida. ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS [Ca+2]c: Concentración de calcio citosólico 4-OHT: 4-hidroxitamoxifeno A: Amperio AD: Ácido domoico AMPA: Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metilo-4-isoxazolpropiónico AO: Ácido ocadaico AOAC: del inglés, Association of Official Analytical Chemists (Asociación de Químicos Analíticos Oficiales) ASIC: del inglés acid sensing ion channels (Canales iónicos sensibles al ácido) ASP: del inglés, amnesic shellfish poisoning (Intoxicación amnésica por moluscos) BTX: Batracotoxina BUN: del inglés blood urea nitrogen (Nitrógeno ureico en sangre) C-CTX: Ciguatoxina del Caribe CI: Iminas cíclicas CIEM: Consejo Internacional para la Exploración del Mar CK: Creatina quinasa CP: del inglés ciguatera poisoning (Intoxicación por ciguatoxina) CTX: Ciguatoxina DL50: Dosis letal 50 DSP: del inglés, diarrhetic shellfish poisoning (Intoxicación diarreica por moluscos) DTX: Dinofisistoxinas EFSA: del inglés, European Food Safety Authority (Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria) 1 RESUMEN, RESUMO, ABSTRACT RESUMEN Las biotoxinas marinas son compuestos tóxicos producidos por microalgas que se incorporan y acumulan a lo largo de la cadena trófica hasta llegar al ser humano. La proliferación de los microorganismos productores de toxina está en auge y se trata de un hecho multifactorial influenciado por la actividad humana, por variaciones en la temperatura del agua, la concentración de nutrientes, las precipitaciones, la acidificación en los océanos y otros factores favorecidos por el cambio climático. La confluencia de estos factores promueve condiciones óptimas de proliferación de microalgas y sus toxinas dando lugar a intoxicaciones alimentarias por el consumo de productos pesqueros que suponen un riesgo para la seguridad alimentaria. Muchas de estas toxinas se consideran emergentes y su contenido en los productos pesqueros aún no está regulado, por lo que las medidas encaminadas a su control y regulación deben basarse en datos toxicológicos que garanticen la salud de los consumidores. El trabajo titulado Evaluación in vivo e in vitro de los efectos crónicos de toxinas marinas emergentes en costas europeas aporta datos toxicológicos de las principales biotoxinas emergentes. Se presentaron estudios sobre la actividad biológica de compuestos del grupo de las ciguatoxinas. Además, por primera vez, se aportaron datos toxicológicos in vivo sobre los efectos crónicos derivados de la administración oral repetida de la tetrodotoxina. Por otra parte, se realizó una evaluación de la toxicidad de la palitoxina, uno de los compuestos marinos más tóxicos que contamina las costas del Mar Mediterráneo. Además, se estudiaron los efectos a largo plazo de los espirólidos que representan una fuente de antagonistas de receptores nicotínicos, examinando sus efectos en células neuronales humanas. Y para concluir, se pretende aportar datos sobre los efectos de los azaspirácidos en células humanas, toxinas que, a diferencia de las biotoxinas anteriores, ya están reguladas en la Unión Europea, pero cuyo mecanismo de acción se desconoce. En definitiva, los resultados presentados en esta tesis doctoral confirman el potencial tóxico de determinadas toxinas emergentes como la tetrodotoxina y la palitoxina y sus efectos acumulativos tras la administración repetida a ratones, así como los efectos in vitro derivados de la exposición crónica de los cultivos celulares a las toxinas causantes de la ciguatera, a los azaspirácidos o los espirólidos, todos ellos compuestos bioactivos comúnmente encontrados en productos pesqueros recolectados a lo largo de las costas europeas. Palabras clave: toxinas marinas emergentes, seguridad alimentaria, ciguatera, tetrodotoxina, azaspirácidos, palitoxina, espirólidos, efectos acumulativos, canales iónicos, líneas celulares, toxicidad subcrónica. ANDREA BOENTE JUNCAL 2 RESUMO As biotoxinas mariñas son compostos tóxicos producidos por microalgas que se incorporan e acumúlanse ao longo da cadea alimentaria ata chegar aos humanos. A proliferación de microorganismos produtores de toxinas está en aumento e é un feito multifactorial influído pola actividade humana, polas variacións da temperatura da auga, a concentración de nutrientes, as precipitacións, a acidificación nos océanos e outros factores favorecidos polo cambio climático. A confluencia destes factores promove condicións óptimas para a proliferación de microalgas e as súas toxinas, o que leva a intoxicacións alimentarias polo consumo de produtos pesqueiros que supoñen un risco para a seguridade alimentaria. Moitas destas toxinas considéranse emerxentes e o seu contido en produtos pesqueiros aínda non está regulado, polo que as medidas encamiñadas ao seu control e regulación deben basearse en datos toxicolóxicos que garantan a saúde dos consumidores. O traballo titulado Avaliación in vivo e in vitro dos efectos crónicos das toxinas mariñas emerxentes nas costas europeas proporciona datos toxicolóxicos sobre as principais biotoxinas emerxentes. Preséntáronse estudos sobre a actividade biolóxica de compostos do grupo das ciguatoxinas. Ademais, proporcionáronse por primeira vez datos toxicolóxicos in vivo sobre os efectos crónicos derivados da administración oral repetida de tetrodotoxina. Por outra banda, levouse a cabo unha avaliación da toxicidade da palitoxina, un dos compostos mariños máis tóxicos que contaminan as costas do mar Mediterráneo. Ademáis, estudáronse os efectos a longo prazo dos espirólidos que representan unha fonte de antagonistas do receptor nicotínico, examinando os seus efectos sobre as células neuronais humanas. E para concluír, preténdese aportar datos sobre os efectos dos azaspirácidos nas células humanas, toxinas que, a diferenza das biotoxinas anteriores, xa están reguladas na Unión Europea, pero o seu mecanismo de acción é descoñecido. En resumo, os resultados presentados nesta tese doutoral confirman o potencial tóxico de certas toxinas emerxentes como a tetrodotoxina e a palitoxina e os seus efectos acumulativos despois da administración repetida a ratos, así como os efectos in vitro derivados da exposición crónica de cultivos celulares ás toxinas que causan ciguatera, azaspirácidos ou espirólidos, todos eles compostos bioactivos que se atopan habitualmente nos produtos da pesca recollidos ao longo das costas europeas. Palabras chave: toxinas mariñas emerxentes, seguridade alimentaria, ciguatera, tetrodotoxina, azaspirácidos, palitoxina, espirólidos, efectos acumulativos, canles iónicos, liñas celulares, toxicidade subcrónica. Resumen 3 ABSTRACT Marine biotoxins are toxic compounds produced by microalgae that are incorporated and accumulate throughout the food chain reaching humans. The proliferation of toxin-producing microorganisms is increasing and it is a multifactorial fact influenced by human activity, by variations in water temperature, nutrient concentration, rainfall, acidification in the oceans and other factors promoted by climate change. The confluence of these factors promotes optimal conditions for the proliferation of microalgae and its toxins, leading to food poisoning from the consumption of fish products that pose a risk to food safety. Many of these toxins are considered emerging and their content in fishery products is not yet regulated, so the measures aimed at their control and regulation must be based on toxicological data that guarantee the health of consumers. The work entitled In vivo and in vitro evaluation of the chronic effects of emerging marine toxins on european coasts provides toxicological data on the main emerging biotoxins. Studies on the biological activity of compounds of the group of ciguatoxins were presented. In addition, for the first time, in vivo toxicological data on chronic effects derived from repeated oral administration of tetrodotoxin were provided. On the other hand, an evaluation of the toxicity of palitoxin, one of the most toxic marine compounds that pollutes the coasts of the Mediterranean Sea, was carried out. Furthermore, the long-term effects of spirolides representing a source of nicotinic receptor antagonists were studied, examining their effects on human neuronal cells. And to conclude, it is intended to clarify the unknowns about the effects of azaspiracids in human cells, toxins that, unlike the previous biotoxins, are already regulated in the European Union, but whose mechanism of action is unknown. In summary, the results presented in this doctoral thesis confirm the toxic potential of certain emerging toxins such as tetrodotoxin and palitoxin and their cumulative effects after repeated administration to mice, as well as the in vitro effects derived from chronic exposure of cell cultures to toxins that cause ciguatera, azaspiracids, or spirolides, all of them are bioactive compounds commonly found in fishery products collected along European coasts. Key words: emerging marine toxins, food safety, ciguatera, tetrodotoxin, azaspiracids, palitoxin, spirolides, cumulative effects, ion channels, cell lines, subchronic toxicity. 4 5 1. INTRODUCCIÓN 1.1 CONTEXTUALIZACIÓN Históricamente, el mar ha constituido una fuente de riqueza en múltiples vertientes como la económica y la social, además de su indiscutible función como reserva de biodiversidad, y es transcendente en el contexto de la presente tesis doctoral puesto que constituye una gran reserva alimentaria. En concreto, la Unión Europea se configura como la sexta potencia pesquera a nivel mundial, visto que produce 6.6 millones de toneladas anuales de productos pesqueros según las últimas estadísticas consolidadas del año 2020 (EUMOFA, 2020). La pesca es una de las actividades con más tradición en el contexto de nuestro país, y este arraigo pesquero se debe, en gran parte, al extenso litoral costero y al pasado cultural, patrimonial e incluso gastronómico vinculado al mar (Iglesias, 2020). Todos estos factores son determinantes para el mantenimiento del sector pesquero español que supone un 20% del total del sector pesquero europeo. En este sentido, España es el mayor productor a nivel comunitario de productos acuícolas con una producción que tiene una repercusión económica estimada de aproximadamente 300 millones de euros y es el segundo productor en lo que a pesca extractiva se refiere (Ministerio de Agricultura et al., 2020). Además de la constatada envergadura que tiene la pesca extractiva, tanto para la actividad económica como por su efecto en la seguridad alimentaria, la acuicultura también desempeña un papel destacado en la alimentación a nivel mundial (FAO, 2020). Los productos pesqueros pueden ser susceptibles de contaminación por biotoxinas marinas que dan lugar a intoxicaciones en humanos, con importantes efectos perjudiciales para la salud pública, la economía y la biodiversidad en general (Botana, 2014). En nuestro entorno, la acuicultura española y, en concreto la gallega, destaca como referente a nivel europeo y mundial, siendo la principal especie cultivada en Galicia el mejillón, que alcanzó una producción de 261.513 toneladas en el año 2019 y que abasteció fundamentalmente a todo el mercado europeo (APROMAR, 2020). Este liderazgo europeo en la producción de marisco concede a Galicia y a España un compromiso especial para garantizar la inocuidad alimentaria de los productos pesqueros y, por consiguiente, para realizar estudios de las biotoxinas marinas evaluando su toxicidad tanto in vivo como in vitro para cada una de las toxinas emergentes en aguas europeas, que pueden representar una amenaza creciente tanto para la seguridad alimentaria como para el sector pesquero nacional. 1.2 INCORPORACIÓN DE LAS BIOTOXINAS MARINAS A LA CADENA TRÓFICA Ya en el siglo XIX, Ludwig Andreas Feuerbach, filósofo y antropólogo alemán, pronunció en su obra la frase “somos lo que comemos”, plasmando la importancia que ANDREA BOENTE JUNCAL 6 tiene la alimentación y, por ende, la seguridad alimentaria en la salud humana. Y como no puede ser de otra manera, cualquier producto tanto de origen animal como vegetal que se incorpore a la cadena trófica y llegue al ser humano puede influir en su salud, lo que por supuesto incluye a las biotoxinas marinas. La base de la cadena trófica relacionada con los productos pesqueros está constituida por zooplancton y fitoplancton. Este último está formado por seres vivos de origen vegetal, que viven flotando en la columna de agua, fundamentalmente microalgas, entre las que se encuentran dinoflagelados y diatomeas, productores de las toxinas marinas evaluadas en esta tesis. Ante determinadas circunstancias ecológicas y medioambientales, las microalgas proliferan dando lugar a floraciones algales nocivas (FANs), cuya terminología científica proviene del inglés de “Harmful Algal Blooms” (HAB). Este fenómeno es habitualmente denominado marea roja ya que, en algunos casos, los pigmentos de las microalgas otorgan una tonalidad rojiza a las aguas (Raven et al., 2020). Este sobrecrecimiento algal produce metabolitos secundarios con actividad tóxica denominados biotoxinas marinas (Botana, 2012; Botana, 2014). Como se muestra en la Figura 1, estas biotoxinas marinas se incorporan a la cadena trófica esencialmente a través de los moluscos bivalvos, organismos acuáticos que se localizan en las zonas costeras o en estuarios donde la concentración de nutrientes es más alta que en el océano abierto, y al mismo tiempo hay una mayor intensidad de luz que contribuye al mayor desarrollo del fitoplancton. En el proceso de acumulación de toxinas marinas a la cadena trófica, adquieren especial relevancia los moluscos bivalvos que se alimentan por filtración del agua como es el caso de los mejillones, las almejas, las ostras, y los berberechos, puesto que ingieren y concentran el fitoplancton presente en la columna de agua. Por su mecanismo de alimentación por filtración, los moluscos concentran en el tracto gastrointestinal y en el hepatopáncreas los residuos y biotoxinas marinas presentes en el agua, compuestos químicos responsables a escala mundial de un elevado número de intoxicaciones humanas por consumo de productos contaminados (Nzoughet et al., 2008; Louzao et al., 2010; O'Driscoll et al., 2014). Además de producir intoxicaciones alimentarias, los productos pesqueros también actúan como portadores de infecciones de tipo bacteriano, vírico y/o parasitario y originan intoxicaciones químicas por metales pesados o compuestos orgánicos persistentes. Sin embargo, la presente tesis doctoral se centra en evaluar las posibles consecuencias y repercusiones que pueden estar asociadas a la presencia de biotoxinas marinas en alimentos y concretamente, en analizar el potencial efecto de toxinas emergentes en las costas europeas sobre la salud de los consumidores. Introducción 7 Figura 1. Introducción de las biotoxinas marinas en la cadena trófica. A la intoxicación alimentaria por consumo de peces y mariscos, se añade la toxicidad de algunos compuestos por contacto dérmico con agua contaminada, o por la inhalación de aerosoles tóxicos que también pueden entrañar riesgos para la salud (Vilariño et al., 2018). Además, las biotoxinas marinas no producen alteraciones organolépticas en el producto que contaminan, y por lo general, son compuestos termoestables que no se destruyen con los tratamientos culinarios convencionales usados en restauración o en el domicilio. A esta problemática, se le suma la inexistencia de tratamiento específico frente a estas intoxicaciones, cuya única opción de tratamiento consiste en disminuir los síntomas asociados a las mismas. Otro hecho destacable en este contexto es la elevada presencia de productos pesqueros en el mercado comunitario, que son susceptibles de vehicular biotoxinas marinas a otros países. Este fue el caso de los azaspirácidos, puesto que esta intoxicación se detectó por primera vez en Holanda como consecuencia del consumo de mejillones contaminados con azaspirácido procedente de Irlanda (McMahon, 1996; McMahon, 1998). Por otra parte, cabe resaltar que la distribución de las intoxicaciones por biotoxinas marinas es mundial y, a pesar del elevado número de intoxicaciones reportadas anualmente, la cifra final de incidencias alimentarias provocadas por biotoxinas marinas está muy subestimada, principalmente debido a que la mayoría de los cuadros clínicos que producen son muy parecidos a los observados en otros procesos patológicos. 1.3 EFECTO DEL CAMBIO CLIMÁTICO SOBRE EL INCREMENTO DE LAS FLORACIONES ALGALES NOCIVAS El sobrecrecimiento de estas producciones algales ha sido núcleo de varios estudios por su impacto en la salud pública, señalando los posibles efectos que tiene el cambio climático sobre la proliferación de floraciones algales nocivas (Botana, 2016; Estevez et al., 2019; Chapman et al., 2020). Entre los determinantes de la expansión de las floraciones algales tóxicas hacia nuevas zonas geográficas, se encuentra el aumento de ANDREA BOENTE JUNCAL 8 temperatura del agua de los océanos, puesto que el cambio climático viene desempeñando una influencia múltiple tanto en las aguas marinas y continentales, donde el océano absorbe gran cantidad de la energía adicional, sobre la cantidad de CO2 emitido (Stocker, 2014). Como consecuencia, las aguas superficiales mundiales se calentaron de promedio 0.7 ºC anualmente, apreciándose el incremento más acusado en el Atlántico Norte (Huang et al., 2015). El cambio de temperatura de los océanos está íntimamente ligado con la acidificación, el incremento de los niveles de CO2 modifica los ecosistemas marinos, a medida que también disminuyen los niveles de oxígeno disuelto (FAO, 2018). Asimismo, el cambio climático influye en las corrientes marinas y puede afectar a la expansión de las floraciones algales, puesto que las corrientes arrastran hasta la superficie los hipnozigotes, definidos como la forma inmóvil de los dinoflagelados. Otros determinantes de la expansión de las floraciones algales, incluyen el cambio en la salinidad, la concentración de nutrientes y la eutrofización de las aguas así como el grado de iluminación de la superficie marina (Otero et al., 2010; Botana et al., 2015; Botana, 2016). Todas estas circunstancias, repercuten en la concentración de microalgas presentes en las costas europeas a lo largo del tiempo, tal y como se muestra a continuación, en la Figura 2, aparecen reflejados los datos recogidos por el programa Copérnico, que constituye una de las apuestas más ambiciosas para obtener datos sobre el medioambiente a nivel mundial, y refleja las consecuencias que está teniendo el cambio climático en los ecosistemas marinos y terrestres. Con los datos extraídos de este programa, se ha elaborado la Figura 2 que muestra dos imágenes obtenidas con un intervalo de 4 años, concretamente los datos se refieren a enero del 2017 (A) y a enero del 2021 (B), y las muestras, que han sido obtenidos a una profundidad de 0.494 metros representan la concentración de fitoplancton que tal y como se aprecia es mucho más elevada en los momentos actuales que hace cuatro años. Figura 2. Concentración de fitoplancton expresada en carbón de agua de mar (mmol/m3). Esta imagen se ha realizado utilizando información del servicio marítimo de Copernicus E.U. (Lamouroux et al., 2019) Introducción 9 Este fenómeno del cambio climático constituye un enorme desafío para los toxicólogos, los sanitarios y la comunidad científica en general, puesto que estas condiciones más extremas, suscitan preocupación con respecto a la inocuidad de los productos pesqueros que pueden suponer una amenaza en materia de seguridad alimentaria. Cabe destacar, así mismo, que durante las últimas décadas se han encontrado diferentes dinoflagelados y otros organismos productores de toxinas en países europeos donde era impensable su presencia dado que estos especímenes eran propios de otras latitudes (Munday and Reeve, 2013; Wells et al., 2015; Botana, 2016; Farabegoli et al., 2018; Wells et al., 2020). En aras de plasmar gráficamente el aumento de distribución de toxinas marinas emergentes en aguas europeas, se muestra la Figura 3 donde aparecen reseñada la distribución en nuestras costas de los compuestos empleados en la presente tesis doctoral. Figura 3. Distribución de los organismos productores de toxinas marinas emergentes en Europa. Elaboración propia siguiendo revisiones bibliográficas recientes (Farabegoli et al., 2018; Vilariño et al., 2018; Katikou, 2019; Soliño et al., 2020; Wietkamp et al., 2020). Durante las últimas décadas, los esfuerzos científicos se han centrado en dilucidar y caracterizar los riesgos toxicológicos que supone la ingestión de alimentos contaminados con biotoxinas marinas para la salud humana, que producen intoxicaciones agudas, a menudo, de carácter grave. No obstante, ante la falta de estudios crónicos sobre los efectos de estos contaminantes alimentarios sobre la salud humana, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, European Food Safety Authority) ha puesto de manifiesto la necesidad de analizar los efectos derivados de la ingestión de pequeñas cantidades de toxina durante largos periodos de tiempo. En este sentido, la EFSA manifestó la necesidad de realizar estudios toxicológicos adicionales para entender el riesgo que suponen las biotoxinas marinas y regular apropiadamente sus niveles en productos pesqueros, abarcando tanto las toxinas legisladas como las emergentes en la Unión Europea (EFSA, 2020). Todo ello, ANDREA BOENTE JUNCAL 16 poliéter y de estructura compleja entre los que se encuentran las maitotoxinas (FAO and WHO, 2020). Las maitotoxinas son poliéteres de elevado peso molecular que, aunque son producidos por la misma especie de microalga, estructuralmente difieren de las ciguatoxinas, categorizándose como un grupo aparte. Tanto las maitotoxinas como las ciguatoxinas pueden causar la ciguatera, ambas comparten microorganismos productores, y son toxinas emergentes que englobamos en el contexto de esta tesis en el mismo apartado. Actualmente, se han descrito 4 análogos de maitotoxinas identificándose como: maitotoxina-1 (MTX1), maitotoxina-2 (MTX2), maitotoxina-3 (MTX3) y maitotoxina-4 (MTX4) (Holmes et al., 1990; Holmes and Lewis, 1994; Kretzschmar et al., 2017; Boente-Juncal et al., 2019b; Pisapia et al., 2020). Tal y como aparece reseñado en la Figura 6, la maitotoxina es una molécula de gran tamaño, y por ende, de elevado peso molecular, que comparte similitud estructural con las ciguatoxinas (Vale et al., 2015). Figura 6. Estructura en 2D de la MTX1 Dada la gran diversidad de toxinas implicadas en la ciguatera, y con el fin de evaluar los riesgos emergentes asociadas a la misma, en la presente tesis doctoral se evaluarán los efectos de la CTX3C, la gambierona, la MTX1 y la MTX3. 1.6.1.4 Mecanismo de acción La sintomatología producida en humanos tras la ingesta de productos pesqueros contaminados con toxinas del grupo de las ciguatoxinas se explica, en parte, por el mecanismo de acción de las ciguatoxina sobre los canales de sodio dependientes de voltaje (Nav). Concretamente, la ciguatoxina interactúa con el sitio 5 de los canales de sodio dependientes de voltaje, haciendo que se activen a potenciales más negativos. En consecuencia, la ciguatoxina aumenta la permeabilidad de la célula a los iones de sodio hacia el interior celular y se despolariza la membrana celular (Bidard et al., 1984). El resultado de este proceso electrofisiológico da lugar a la hiperexcitabilidad de las membranas celulares, y conlleva una generación de potenciales de acción espontáneos, que podría originar la sintomatología nerviosa desencadenada tras esta intoxicación (Pearn, 2001; Mattei et al., 2014; Martin et al., 2015a; Martin et al., 2015b). Asimismo, se ha demostrado que la ciguatoxina también bloquea los canales Introducción 17 de potasio en neuronas, si bien, no se ha confirmado un efecto directo de la toxina sobre los canales de potasio dependientes de voltaje, ya que la disminución en la salida de potasio observada en presencia de ciguatoxinas, podría ser debida a una respuesta indirecta del canal de potasio a la despolarización neuronal producida por la CTX (Pérez et al., 2011). También se han reseñado numerosas modificaciones en diversos tipos celulares, que implican el aumento de la concentración de calcio citosólico tanto para ciguatoxinas, gambierona, y muy en especial, para las maitotoxinas (Gusovsky and Daly, 1990; Molgó et al., 1993; Gutierrez et al., 1997; Lewis et al., 2016). No obstante, cabe destacar que los diferentes grupos de compuestos químicos que contribuyen a la intoxicación por ciguatera, parecen diferir en su mecanismo de acción, puesto que mientras que los compuestos relacionados con las ciguatoxinas interaccionan con los canales de sodio dependientes de voltaje, el gambierol interacciona principalmente con los canales de potasio dependientes de voltaje (Kopljar et al., 2013; Rubiolo et al., 2015; Molgó et al., 2020), mientras que los compuestos relacionados estructuralmente con las maitotoxinas provocan un incremento masivo en el calcio intracelular que podría estar relacionado con su efecto sobre los receptores de potencial transitorio (TRP, del inglés transient receptor potential cation channel) que permiten la entrada de cationes incluyendo el calcio al interior celular (Boente-Juncal et al., 2018a). 1.6.2 Tetrodotoxina 1.6.2.1 Epidemiología y situación actual Originalmente, la tetrodotoxina (TTX), estaba asociada a intoxicaciones en el Sureste Asiático, en particular protagonizadas por el consumo de pez globo, una de las exquisiteces por las que los japoneses arriesgan su vida. La tetrodotoxina se acumula de manera preponderante en el hígado, ovarios y en la piel. A diferencia de las toxinas empleadas en la presente tesis doctoral, la producción de tetrodotoxina también proviene de las bacterias, principalmente de los géneros Vibrio y Pseudomonas aunque también se han descrito otros géneros asociados a la producción de tetrodotoxina como por ejemplo: Alteromonas, Bacillus, Listonella, Microbacterium, Serratia, Shewanella y Aeromonas (Jal and Khora, 2015). Asimismo, se ha detectado tetrodotoxina en floraciones algales que contienen dinoflagelados de la especie Prorocentrum mínimum y Alexandrium tamarense (Kodama et al., 1996; Vlamis et al., 2015; Rodríguez et al., 2017). La tetrodotoxina es una toxina muy ubicua, se introduce en la cadena trófica hallándose en animales marinos como en peces de la familia Gobiidae, así como en crustáceos, gasterópodos (pulpo), moluscos bivalvos, equinodermos (estrella de mar) y al mismo tiempo en tritones y ranas en diversos países como Australia, Nueva Zelanda, Bangladesh, Brasil, China, Israel, Marruecos, Singapur, Taiwán y EE. UU. (Vilariño et al., 2018; Biessy et al., 2019). La importancia de esta toxina transciende hasta llegar a aguas europeas, donde se detectó por primera vez como resultado de una intoxicación humana por consumo de una caracola de la especie Charonia lampas ANDREA BOENTE JUNCAL 18 lampas en 2007 en España, que requirió el ingreso en la unidad de cuidados intensivos de la persona intoxicada (Rodriguez et al., 2008; Fernández-Ortega et al., 2010). Este hecho, se consideró como punto de inicio a partir del cual se han descrito numerosos episodios de la llegada de la tetrodotoxina a las costas europeas, detectándose episodios en Grecia, Holanda, Reino Unido, Francia, Italia y Portugal configurándose así la tetrodotoxina como un desafío emergente en la salud pública (Gerssen et al., 2018; Leão et al., 2018; Blanco et al., 2019; Dell'Aversano et al., 2019; Katikou, 2019; Silva et al., 2019; Hort et al., 2020; Costa et al., 2021). Una de las principales hipótesis que justifican la introducción de la TTX en las costas europeas es la apertura del canal de Suez que ha permitido la migración de peces de la familia Tetrodontidae, concretamente de la especie Lagocephalus sceleratus, vector de la tetrodotoxina. La presencia de L. sceleratus fue constatada por primera vez en 2003 en el Mar Mediterráneo, en las costas que bañan Turquía, y desde entonces, su distribución y frecuencia de aparición se ha incrementado, indicando la alta tasa de expansión de vectores de TTX (Katikou et al., 2009; Kosker et al., 2019). Este hecho plasma a la perfección como la acción antropogénica, en consonancia con la búsqueda de nuevos recursos alimenticios, y la captura de especies pesqueras para satisfacer la demanda de la población, puede exponer a los consumidores a nuevos vectores de toxinas que no están controladas ni reguladas. Hasta hace poco, no se había detectado TTX en productos pesqueros comestibles capturados en aguas europeas, por lo que esta toxina no estaba regulada a nivel comunitario, del mismo modo que tampoco se encontraba regulada a nivel internacional. La identificación de la tetrodotoxina en Europa y su propagación en diferentes productos de la pesca, sucedió en un contexto en el que el bioensayo en ratón, que permitía identificar la toxicidad de los compuestos marinos emergentes, fue sustituido (European Comision, 2011) por métodos de detección analíticos como por ejemplo, el método Lawrence para la detección de las toxinas PSP (European Comision, 2017). Estos hechos desencadenan una respuesta por parte de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria, que manifiesta la necesidad de obtener datos toxicológicos tras la exposición oral a la tetrodotoxina. La información toxicocinética, así como la evaluación de la toxicidad de la TTX y sus análogos, es necesaria para establecer el oportuno análisis de riesgo y poder asentar futuras bases legislativas sobre el límite máximo de tetrodotoxina en productos pesqueros (EFSA, 2017), de hecho, la presencia habitual de TTX en productos pesqueros de aguas europeas instó a Holanda a establecer un límite de TTX de 20 µg/kg (Gerssen et al., 2018). Es por ello que, en la actual tesis doctoral, se han llevado a cabo estudios toxicológicos in vivo sobre los efectos crónicos derivados de la administración oral repetida de la tetrodotoxina a ratones. 1.6.2.2 Sintomatología La intoxicación aguda por consumo de productos contaminados con tetrodotoxina y sus análogos, conlleva la inhibición de la conducción del potencial de acción a nivel Introducción 19 del sistema nervioso y del músculo. El bloqueo de los canales de sodio dependientes de voltaje desencadena cuadros gastrointestinales, neurológicos y cardíacos en los pacientes intoxicados, debido a que la TTX afecta al músculo esquelético, al sistema digestivo y al sistema respiratorio y cardiovascular. El inicio de los síntomas tóxicos ocurre inmediatamente tras la ingestión de la tetrodotoxina, y la gravedad de estos síntomas depende de la dosis ingerida. De un modo general, la sintomatología incluye entumecimiento perioral, parestesia facial que se puede distribuir paulatinamente por todo el cuerpo, cefalea, vértigos, visión borrosa, incoordinación motora, parálisis generalizada, incluyendo síntomas cardiovasculares y respiratorios como hipoxia, hipotensión, bradicardia y arritmias que, en casos muy graves, culminan con fallo respiratorio y colapso cardíaco (Ahasan et al., 2004; Kotipoyina et al., 2020). 1.6.2.3 Estructura química La Figura 7 muestra la estructura química de la tetrodotoxina, que consiste en una molécula con una estructura heterocíclica con un grupo guanidinio conectado a un esqueleto formado por átomos de carbono altamente oxigenado y con diversos hidroxilos (Chau et al., 2011). Su estructura no fue confirmada hasta los años 70, y actualmente, se han descrito aproximadamente 30 análogos de la tetrodotoxina cuyo grado de toxicidad depende de la estructura. De todos ellos, los que están presentes en los productos marinos incluyen la 4-epi-TTX, la 4,9-anhydro-TTX y la 5,6,11-trideoxy-TTX (Woodward and Gougoutas, 1964; Bane et al., 2014; Kotipoyina et al., 2020). Figura 7. (A) Estructura química de la TTX con el grupo guanidinio marcado en azul. (B) Estructura 3D de la TTX. 1.6.2.4 Mecanismo de acción La diana de la tetrodotoxina se encuentra en los canales de sodio dependientes de voltaje, encargados de la excitación nerviosa y muscular. La unión de la tetrodotoxina con los Nav es el resultado de la interacción entre el grupo guanidinio de la tetrodotoxina que está cargado positivamente, con los grupos carboxilatos cargados negativamente presentes en las cadenas laterales de la entrada del canal de sodio (Catterall et al., 2005; Bane et al., 2014). Gracias a los recientes avances en el campo ANDREA BOENTE JUNCAL 20 de la criomicroscopía electrónica y los estudios realizados sobre la estructura de los canales de sodio y las toxinas animales (Shen et al., 2019), se puede mostrar a continuación, en la Figura 8, la tetrodotoxina y su unión con el canal de sodio dependiente de voltaje Nav1.7 humano. Figura 8. Visión general de la unión de la TTX a la subunidad α1.7 del canal de sodio dependiente de voltaje humano (hNav1.7). Imagen obtenida de Protein Data Bank, PDB ID: 6G8I (Sehnal et al., 2018). 1.6.3 Palitoxinas 1.6.3.1 Epidemiología y situación actual La palitoxina (PLTX), así como sus compuestos análogos, constituyen uno de los grupos más tóxicos de biotoxinas marinas catalogadas hasta la fecha. La producción de palitoxina está asociada a corales del género Palythoa, Zoanthus y Parazoanthus, así como a dinoflagelados del género Ostreopsis, y a cianobacterias del género Trichodesmium (Vilariño et al., 2018). La PLTX contamina productos marinos acumulándose en peces, moluscos bivalvos, crustáceos y equinodermos (Amzil et al., 2012; Patocka et al., 2018). Inicialmente, la palitoxina y sus análogos se detectaron en aguas del Pacífico, particularmente en Hawái y en Japón, pero hoy en día se contemplan como sustancias naturales emergentes puesto que su distribución está en aumento llegando hasta las costas europeas. De hecho, ya se ha detectado la presencia de palitoxina en las costas de países como Italia, Croacia, Grecia, Francia, Portugal, y por supuesto en España (Fraga et al., 2017; Ninčević Gladan et al., 2019; Gémin et al., 2020; Soliño et al., 2020). El aumento de estas floraciones tóxicas de palitoxina en Europa suscita gran preocupación, y pone de manifiesto la necesidad de obtener datos toxicológicos preferentemente tras la administración oral y a largo plazo de la toxina para poder asentar futuras reglamentaciones en los productos pesqueros capturados en las costas europeas (EFSA, 2009a). Introducción 21 1.6.3.2 Sintomatología Al ser una de las sustancias no proteicas más potentes, la PLTX causa un cuadro sintomático muy variado que depende de la vía de exposición a la toxina. Las vías de intoxicación más comunes son la oral, por ingestión de productos contaminados con PLTX, la vía respiratoria por inhalación y por vía dérmica y ocular (Vilariño et al., 2018). Por lo general, la sintomatología incluye mialgia y debilidad muscular, así como problemas respiratorios y gastrointestinales después de la ingestión, que cursan principalmente con náuseas, vómitos y diarrea. En los casos más graves, son frecuentes los mareos, calambres musculares, agitación, delirios, disnea y bradicardia, que pueden desencadenar la muerte (Tubaro, 2014). La intoxicación por inhalación de aerosoles es frecuente en labores de limpieza de los acuarios que contienen corales, o en la playa por proliferaciones intensas de dinoflagelados, dando lugar a síntomas como rinorrea, mucosidad, tos y disnea que concurren con las intoxicaciones por vía ocular provocando queratitis y conjuntivitis. Los edemas y eritemas locales son frecuentes en exposiciones por vía dérmica a la palitoxina y análogos, generalmente con recuperación completa en unos pocos días o semanas (Moshirfar et al., 2020). 1.6.3.3 Estructura química La palitoxina, cuya estructura química se muestra en la Figura 9, está formada por una larga cadena de átomos de carbono con numerosos grupos hidroxilo y grupos amida, es una molécula de elevado peso molecular que ronda los 2700 Da. Hasta la fecha se han descrito más de 25 análogos entre los que se encuentran: ostreocina-B y - D, desde ovatoxina-a hasta ovatoxina -k, 42-hidroxi PLTX, homoPLTX, bishomoPLTX, deoxiPLTX, neoPLTX, isoPLTX, isobaricPLTX y mascarenotoxinasA y -B (Vilariño et al., 2018). Figura 9. Estructura en 2D de la palitoxina. ANDREA BOENTE JUNCAL 22 1.6.3.4 Mecanismo de acción La principal diana de la palitoxina es la unión a la bomba de sodio-potasio (ATPasa de Na+/K+), que es una proteína transmembrana crítica para mantener la polaridad de la membrana y que aparece representada en la Figura 10 (Ogawa et al., 2009). Su función principal es el intercambio activo de iones entre el medio extracelular y el citoplasma, bombeando 3 iones de Na+ hacia el exterior celular, y 2 iones de K+ hacia el interior celular por cada molécula de ATP consumida. La PLTX se une a la bomba de sodio-potasio y la convierte en un canal iónico inespecífico posibilitando la entrada y salida descontrolada de iones, y consecuentemente, alterando el gradiente electroquímico necesario para realizar las funciones celulares (Artigas and Gadsby, 2004; Munday, 2011). Figura 10. Estructura obtenida por criomicroscopía electrónica de la bomba de sodiopotasio y su unión a la ouabaina uno de los inhibidores específicos de esta proteína (Artigas and Gadsby, 2006). La subunidad α aparece reseñada en verde mientras que la subunidad β se muestra en marrón. Imagen obtenida de Protein Data Bank, PDB ID: 3A3I (Sehnal et al., 2018). 1.6.4 Iminas cíclicas 1.6.4.1 Epidemiología y situación actual Las iminas cíclicas son un numeroso grupo de toxinas constituido por diversos tipos de compuestos macrocíclicos, incluyendo los espirólidos (SPXs), las gimnodiminas (GYMs), las pinnatoxinas (PnTXs), las pteriatoxinas (PtTX), los prorocentrólidos, las espiro-prorocentriminas y la portimina que son producidas por fitoplancton y están presentes en los productos pesqueros de aguas europeas (Davidson et al., 2015). En las investigaciones de la presente tesis doctoral, se abordarán los espirólidos puesto que forman el grupo más numeroso dentro de las iminas cíclicas. Introducción 23 Los espirólidos son metabolitos secundarios producidos por dinoflagelados principalmente de la especie Alexandrium ostenfeldii (Nieva et al., 2020). Desde la primera detección de los espirólidos en Canadá, durante un control rutinario de biotoxinas marinas en moluscos bivalvos a finales del siglo pasado, las iminas cíclicas se han distribuido mundialmente (Stivala et al., 2015). La distribución geográfica de los espirólidos está en expansión en las costas del continente americano, asiático, oceánico y en el continente europeo (Qiu et al., 2018; D'Agostino et al., 2019; Bacchiocchi et al., 2020; Liu et al., 2020a). La importancia de los espirólidos radica en la aparición de numerosos episodios de floraciones de las microalgas productoras, y en su ubicua presencia en productos pesqueros, especialmente en moluscos bivalvos capturados en Noruega, Holanda, Dinamarca, Irlanda, Italia, Francia, España y Portugal (Rambla-Alegre et al., 2018). A continuación, en la Figura 11 se muestra una imagen del dinoflagelado Alexandrium ostenfeldii en una muestra de fitoplancton procedente del Mar del Norte recolectada en agosto del 2017 y como su distribución se ha expandido por las costas europeas. Figura 11. Imagen de Alexandrium ostenfeldi fijada con formalina y su distribución por las costas europeas. Imagen modificada de Plankton*Net Data Provider at the Alfred Wegener Insitute for Polar and Marine Research. Los últimos estudios publicados relatan que el 86 % de las muestras de mejillones procedente del Mar Adriático presentan espirólidos, concretamente los análogos 13desmetil espirólido C (13-desMeC) y el 13,19-didesmetil espirólido C (13,19didesMec) (Bacchiocchi et al., 2020). Asimismo, hay que destacar el aumento de vectores invertebrados que pueden difundir estas toxinas en el Océano Atlántico donde el análogo 13-desmetil espirólido C se detectó en el 80% de las muestras analizadas (Silva et al., 2020). Pese a que hasta la fecha no se han detectado intoxicaciones en humanos causadas por espirólidos, ni tampoco existen datos específicos sobre su toxicidad oral en animales, la EFSA ha manifestado la necesidad de ampliar la base de datos toxicológica para los espirólidos y demás iminas cíclicas, y mientras tanto, se ha propuesto el límite recomendado para su presencia en productos pesqueros de 400 µg/kg de SPX en carne de molusco (EFSA, 2010a). ANDREA BOENTE JUNCAL 24 1.6.4.2 Sintomatología Los espirólidos son toxinas lipofílicas que dan lugar a una aparición rápida de signos neurológicos (Otero et al., 2012). Hasta el momento, no se han detectado intoxicaciones graves en humanos, pero en estudios in vivo en ratones se ha descrito disminución de la conducta exploratoria y del movimiento, coexistente con un cuadro neurológico que puede incluir calambres parálisis, extensión y flexión de los miembros posteriores, convulsiones e incluso llegar a la muerte del animal tras la administración intraperitoneal del compuesto (Otero et al., 2012). Sin embargo, por vía oral la toxicidad de los espirólidos es menor que cuando se inyectan intraperitonealmente. Por orden decreciente, el análogo más tóxico es el 13-desmetil espirólido C, seguido del 13,19-didesmetil espirólido C y el menos tóxico es el 20-metil espirólido G (20MeSPXG) (Otero et al., 2012). 1.6.4.3 Estructura química Los compuestos anteriormente mencionados se clasifican dentro del grupo de las iminas cíclicas por su semejanza estructural. En el caso de los espirólidos, contienen un anillo imina heptacíclico y grupos éter cíclicos unidos por grupos espiro. Desde el descubrimiento de los espirólidos, se han descrito más de 15 análogos. La identificacion de los mismos comenzó con la clarificación de la estructura del 13desmetil espirólido C, presente tanto en productos pesqueros contaminados como en el fitoplancton de cultivos acuícolas. Junto con este análogo, se identificó y dilucidó la estructura del 13,19-didesmetil espirólido C procedente de extractos de A. ostenfeldii de Dinamarca. Otro de los análogos presente en aguas europeas es el 20-metil espirólido G, aislado del cultivo de mejillones y del fitoplancton recolectado en las costas de Noruega (Hu et al., 2001; Aasen et al., 2005; MacKinnon et al., 2006). Estos tres análogos de los cuales se conoce la estructura química y de los que se dispone de material de referencia son los empleados en la presente tesis doctoral. A continuación, en la Figura 12 se muestra la estructura en 3D del 13-desmetil espirólido C, del 13,19didesmetil espirólido C y del 20-metil espirólido G. Figura 12. Estructura en 3D de los espirólidos. Introducción 25 1.6.4.4 Mecanismo de acción Los estudios realizados hasta el momento avalan que la diana celular de los espirólidos son los receptores nicotínicos, sobre los que actúan como potentes antagonistas (Molgó et al., 2017). A diferencia de las biotoxinas anteriormente recogidas, estos compuestos marinos que provienen de dinoflagelados tóxicos, representan una fuente de antagonistas de receptores nicotínicos neuronales y musculares (Bourne et al., 2010; Couesnon et al., 2016). 1.6.5 Azaspirácidos 1.6.5.1 Epidemiología y situación actual Los azaspirácidos (AZAs) son un grupo de biotoxinas marinas que están producidas por dinoflagelados del género Azadinium y Amphidoma, ambos de la familia Amphidomataceae (Krock et al., 2019). El primer episodio de intoxicación por azaspirácidos fue en 1995 en Holanda tras el consumo de mejillones contaminados cultivados en Irlanda (McMahon, 1996; Satake et al., 1998) y desde entonces, se han descubierto en torno a 40 análogos con distinta toxicidad (Kilcoyne et al., 2018). Estas toxinas se incorporan a la cadena trófica y se acumulan en los organismos marinos, particularmente en las especies de moluscos que se alimentan por filtración. Los azaspirácidos se han aislado en una gran variedad de organismos marinos tales como mejillones y otros moluscos bivalvos como almejas, ostras y vieiras, así como en crustáceos y equinodermos situados a lo largo de toda la costa europea (Kilcoyne et al., 2018). Biogeográficamente, se ha constatado un aumento de la presencia y distribución de las especies productoras de azaspirácidos en aguas del Atlántico que bañan Irlanda, Reino Unido, Dinamarca, Suiza, Noruega, Francia, así como en España e Italia describiéndose principalmente en aguas templadas (James et al., 2002; Magdalena et al., 2003; Krock et al., 2008; Bacchiocchi et al., 2015; Wietkamp et al., 2020). Hay que destacar, que la expansión de esta biotoxina marina no se acota solo al continente europeo, sino que su distribución es mundial, puesto que se ha descrito la presencia de los organismos productores y de los azaspirácidos en los continentes africano, asiático y americano (Tillmann et al., 2016; Krock et al., 2019; Wang and Doucette, 2021). La EFSA, consciente del riesgo para la seguridad alimentaria que suponen los azaspirácidos, ha regulado la presencia de los análogos más tóxicos (azaspirácido-1, azaspirácido-2 y azaspirácido-3) en los moluscos bivalvos destinados al consumo humano, estableciendo un límite de 160 µg de equivalentes de AZA por kg de carne de molusco (European Comision, 2004, 2019). 1.6.5.2 Sintomatología Al incorporarse a la cadena alimentaria, los azaspirácidos provocan en humanos un cuadro gastrointestinal agudo que incluye náuseas, vómitos, diarreas, calambres, ANDREA BOENTE JUNCAL 32 Básicamente, la estructura de la subunidad α de los canales de sodio dependientes de voltaje que se presenta en la Figura 16, contiene todos los componentes clave tanto para la formación, como para la función del Nav. Estructuralmente, está compuesta por cuatro dominios homólogos (I-IV), que tienen 6 segmentos helicoidales (S1-S6) conectados por bucles intracelulares. El segmento S1-S4, presente en cada uno de los dominios, constituye un sensor de voltaje y contiene residuos de aminoácidos cargados positivamente a lo largo de la hélice S4. Entre el segmento S5 y S6, se encuentra un filtro selectivo de iones que faculta la entrada de sodio y restringe el paso de otros iones lo que permite la conductancia específica de iones sodio (Catterall et al., 2020a). La parte estructural que forma el poro selectivo de iones sodio puede abrirse parcialmente después de que cada uno de los sensores de voltaje se haya movido en respuesta a los cambios en el voltaje de la membrana celular (Ahern et al., 2016). En este marco, los canales de Nav están regulados por vías de señalización intracelular y erigen la base de numerosas enfermedades neurológicas, psiquiátricas y cardiovasculares. La subunidad α de los distintos subtipos del canal Nav constituye la diana celular para distintas toxinas marinas y también para fármacos como anestésicos locales, analgésicos, antiarrítmicos y antiepilépticos que actúan sobre los canales de sodio dependientes de voltaje (Catterall et al., 2020a). A continuación, en la Figura 17, se muestran los sitios de unión de las toxinas naturales a los canales de sodio dependientes de voltaje. Básicamente, las toxinas que se vinculan al sitio 1 de los canales de sodio son compuestos heterocíclicos con un grupo guanidinio, solubles en agua y están representados por toxinas marinas como la tetrodotoxina y la saxitoxina. Además, dentro de este grupo que se une al sitio 1 bloqueando el canal de sodio, están las toxinas formadas por péptidos como las µ-conotoxinas. Por el contrario, las toxinas liposolubles que se unen al sitio 5 como las ciguatoxinas y las brevetoxinas, activan el canal de sodio dependiente de voltaje haciendo que se active a potenciales de membrana más negativos y bloquean la inactivación del canal de sodio (Cestèle and Catterall, 2000; Stevens et al., 2011). Aparte de las toxinas anteriormente mencionadas, existen muchos otros tipos de toxina naturales que se unen al canal de sodio dependiente de voltaje en los sitios 2 al 6 de los diferentes dominios de la subunidad alfa, modulando las propiedades del Nav, y que representan un amplio grupo de compuestos en los que no se entra más en detalle porque no incluyen compuestos que se aborden en la presente tesis doctoral. Introducción 33 Figura 17. Representación de la arquitectura de la subunidad α del Nav humano e identificación de las zonas de unión de toxinas que afectan al sistema nervioso. La subunidad α consta de 4 dominios conectados por bucles intracelulares. Cada dominio tiene seis segmentos helicoidales transmembrana. A continuación, se muestra la Tabla 3 que representa la gran diversidad de isoformas del canal de sodio dependientes de voltaje y la correspondiente selectividad por los ligandos en función del subtipo. La sensibilidad de las células musculares o nerviosas a la tetrodotoxina depende del tipo de subunidad alfa de los canales de sodio que se expresen en la célula, y permite establecer dos grandes grupos de Nav en función de la sensibilidad al bloqueo de la TTX. Así se distinguen las isoformas sensibles a TTX (Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.6 y Nav1.7), cuya conductancia de iones sodio se bloquea por concentraciones nanomolares de tetrodotoxina, y que están codificadas por un clúster de genes localizados en el cromosoma 2. Por otro lado, están las isoformas resistentes a TTX (Nav1.5, Nav1.8, y Nav1.9), cuya sensibilidad a la tetrodotoxina está en el rango micromolar y están codificadas por genes localizados en el cromosoma 3 (Geffeney and Ruben, 2006). Algunos de los canales sensibles a la tetrodotoxina, se expresan en mayor medida en las neuronas sensoriales y están relacionados con la epilepsia, la inflamación y en especial con el dolor neuropático. En este sentido, se ha descrito que el daño nervioso está asociado a una regulación positiva de la expresión de los Nav sensibles a tetrodotoxina y a un incremento de las corrientes de sodio sensibles a TTX, en conjunción con una disminución de la expresión de los canales de sodio resistentes a la tetrodotoxina y de las corrientes de sodio asociadas a los mismos. Es por ello que los compuestos que pueden bloquear selectivamente las distintas subunidades del Nav que se expresan en el sistema nervioso periférico (SNP) y que evitan al sistema nervioso central (SNC) y el músculo cardíaco son de gran interés en el tratamiento del dolor neuropático (Nieto et al., 2012). ANDREA BOENTE JUNCAL 34 Tabla 3. Subtipos de las subunidades α del canal de sodio dependiente de voltaje, el gen que las codifica y su expresión tisular, principales moduladores selectivos y sensibilidad a la tetrodotoxina (TTX). Sistema Nervioso Central (SNC), Sistema Nervioso Periférico (SNP), Saxitoxina (STX), Batracotoxina (BTX) (Alexander et al., 2019). Canal Gen Máxima expresión Activadores selectivos Bloqueantes selectivos Sensibilidad TTX hNav1.1 SCN1A SNC, SNP Veratridina, BTX TTX, STX Sensible hNav1.2 SCN2A SNC, SNP Veratridina, BTX, toxina β de escorpión TTX, STX, lacosamida Sensible hNav1.3 SCN3A SNC, SNP Veratridina, BTX TTX, STX Sensible hNav1.4 SCN4A Músculo esquelético Veratridina, BTX, grayanotoxina, toxina β de escorpión TTX, STX, µconotoxina Sensible hNav1.5 SCN5A Músculo cardíaco Veratridina, BTX TTX No sensible hNav1.6 SCN8A SNC, SNP Veratridina, BTX, toxina β de escorpión TTX, STX Sensible hNav1.7 SCN9A SNP Veratridina, BTX TTX, STX Sensible hNav1.8 SCN10A SNP, músculo cardíaco No reseñado TTX No sensible hNav1.9 SCN11A SNP No reseñado TTX No sensible Los canales de sodio dependientes de voltaje son estructuras muy dinámicas que experimentan cambios cíclicos correspondientes a tres estados, mostrados en la Figura 18. El estado cerrado es el estado en el que se encuentra el canal cuando los iones de sodio no pueden pasar, pero el canal es susceptible de ser abierto como respuesta a un estímulo. El estado abierto o activado, se corresponde con la situación en la cual los iones pueden pasar a través del canal, mientras que el estado inactivado refleja la conformación en la cual el canal está cerrado y no es susceptible de abrirse en respuesta a un estímulo. El potencial de membrana detectado por el sensor de voltaje del canal, va a determinar el estado en el que se encuentra el canal. Cuando la membrana celular está hiperpolarizada (el potencial de membrana se vuelve más negativo) la probabilidad de que el canal de sodio se abra es baja, mientras que cuando la membrana se despolariza (el potencial de membrana se vuelve menos negativo) los canales de sodio son susceptibles de activarse (Catterall et al., 2020b). Introducción 35 Figura 18. Esquema simplificado de los estados del canal de sodio dependientes de voltaje y los principales eventos del potencial de acción subyacentes. La célula excitable mantiene un potencial de reposo (-70 mV), en estas condiciones de reposo los canales de sodio y los de potasio están cerrados. Los Nav comienzan a abrirse en respuesta a la despolarización de la membrana, el flujo interno de iones provoca una mayor despolarización siempre y cuando se rebase el umbral. Esta retroalimentación positiva genera una respuesta de todo o nada. Tras unos milisegundos los canales de sodio se inactivan y se abren los canales de potasio dependientes de voltaje (Kv) dando lugar a una corriente de salida de potasio, la membrana se hiperpolariza y finalmente los canales de sodio se recuperan de la inactivación volviendo a su conformación cerrada. La despolarización de la membrana celular facilita un cambio conformacional de la subunidad α, este cambio está asociado al movimiento de la región sensible al voltaje que hace que el segmento S4 se mueva y desplace el conector S4 y S5 hacia arriba, hacia la superficie interna de la membrana, induciendo una flexión y rotación del segmento S6 y permite la apertura del poro del canal. Los canales de sodio se abren rápidamente y entra sodio dentro de la célula, dando lugar a un potencial de acción. El potencial de acción, también denominado impulso eléctrico, es una onda de descarga eléctrica que se traslada a lo largo de la membrana de las células excitables. En cuestión de milisegundos, la corriente de entrada de sodio se detiene debido a la inactivación o bloqueo del canal. El canal de sodio presenta dos tipos de inactivación que se originan por distintos mecanismos y en diferentes partes del canal. La inactivación rápida, sucede en milisegundos mientras que la inactivación lenta puede durar segundos (Ulbricht, 2005; Catterall et al., 2020b). Estos procesos de activación e inactivación del canal de sodio permiten que la despolarización de la membrana ocurra de una manera controlada, y después de estar el canal abierto durante unos milisegundos el canal se inactiva deteniendo la entrada de sodio intracelular incluso en ANDREA BOENTE JUNCAL 36 presencia de un estímulo. En este momento, el canal no puede abrirse otra vez hasta que la célula se repolarice y los canales vuelvan al estado de cerrado. Por último, cabe reseñar que, para llevar a cabo sus funciones, los canales de sodio dependientes de voltaje deben interactuar con proteínas de membrana específicas de la matriz extracelular y del citoesqueleto formando complejos multiproteicos esenciales para el correcto funcionamiento del canal (Shaw and Koleske, 2021). Las mutaciones o alteraciones en alguna de estas proteínas pueden afectar a la integridad de este complejo y, por ende, a la funcionalidad del canal de sodio dependiente de voltaje. Estas consideraciones son de especial interés con relación a la presente tesis doctoral, concretamente en los resultados obtenidos tras la evaluación de los efectos celulares del azaspirácido que se detallarán con posterioridad. 1.7.2 Canales de cloro dependientes de voltaje A pesar de que el cloro es uno de los iones más abundantes en los seres vivos puesto que constituye aproximadamente el 70% de los aniones existentes en el fluido intersticial, y es un ion muy permeable a través de la membrana celular, el interés puesto en los canales de cloro ha sido camuflado por los canales catiónicos. No fue hasta comienzos del siglo XXI cuando los canales de cloro comenzaron a tener cierta visibilidad en los estudios científicos, donde se puso de manifiesto su relevancia fisiológica (Duran et al., 2010) y se dilucidó que cualquier mutación o mal funcionamiento puede dar lugar a muchas condiciones patológicas como disfunciones cardiovasculares, desordenes neurológicos, enfermedades metabólicas e incluso cáncer (Gururaja Rao et al., 2020). Actualmente, se conoce que los canales de cloro tienen un papel esencial en multitud de procesos celulares, incluyendo la estabilización del potencial de membrana, el mantenimiento del pH intracelular, la proliferación celular, la secreción de fluidos y, en lo que a la presente tesis respecta, en la regulación del volumen celular. La regulación del volumen y la homeostasis iónica se mantiene en un equilibrio extremadamente vulnerable y delicado gracias a los canales tanto aniónicos como catiónicos, así como por los transportadores de cloro (Gururaja Rao et al., 2020). Parte de los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral abordan los canales de cloro y otros transportadores, y su relación entre la modificación del volumen celular causada por la exposición de las células a los azaspirácidos. Por lo tanto, a continuación, se realiza una breve reseña de los canales de cloro dependientes de voltaje centrada en los canales aniónicos dependiente de voltaje regulados por volumen (VRAC, del inglés volume regulated anion channels). Los canales de cloro dependientes de voltaje constituyen una superfamilia de canales muy diversa y difícil de acotar, pero hasta el momento los canales de cloro se pueden clasificar en las siguientes superfamilias que aparecen recogidas en la Tabla 4 (Verkman and Galietta, 2009). Tabla 4. Familias de canales de cloro identificadas hasta la fecha, mecanismo de activación, principales funciones fisiológicas y miembros representativos de cada familia. Introducción 37 Familia Mecanismo de regulación Función fisiológica Miembros representativos Canales regulados por voltaje Cambios en el potencial de membrana, el ClC-2 por incremento del volumen celular Conductancia de Clen el músculo esquelético (repolarización después del potencial de acción). Homeostasis Clen neuronas (regulación del volumen celular) Familia ClC sensibles a voltaje Canales regulados por ligando Activados por GABA, glicina, β-alanina y taurina Transmisión sináptica inhibitoria en el cerebro y en la medula espinal Receptores de glicina y receptores GABA Canales de cloro activados por calcio Activados por elevación Ca+2 citosólico Secreción de Clen el epitelio, contracción del músculo liso CaCC, TMEM16A que ha experimentado gran interés científico (Paulino et al., 2017) Canales de cloro activados por AMPc Activados por fosforilación dependiente de AMPc Secreción de Cl− por las células epiteliales en las vías respiratorias, glándulas submucosas, páncreas, intestino y testículos. Absorción de Cl− en las glándulas sudoríparas Regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) Canales de Clregulados por volumen Activados GTPγS Secreción de fluidos y osmolitos, liberación de glutamato, proliferación y muerte celular, regulación volumen celular, motilidad celular, electrogénesis, angiogénesis VRAC, Maxi ClEstas familias de canales aniónicos, así como los transportares con función preponderante en la homeostasis de cloro, se muestran en la Figura 19, en la que se recogen además las concentraciones iónicas intracelulares y extracelulares de una célula de mamífero, puesto que el cloro es el principal anión celular que regula las concentraciones de otros cationes tanto a nivel intra como a nivel extracelular. ANDREA BOENTE JUNCAL 38 Figura 19. Representación de los principales canales iónicos y transportadores que intervienen en la homeostasis del cloro, así como las concentraciones intracelulares y extracelulares de los principales iones presentes en las células de mamífero. En la tarea de profundizar en el mecanismo de acción de los azaspirácidos, uno de los objetivos planteados en esta tesis doctoral, se demostró que estas toxinas interaccionan con canales aniónicos dependientes de voltaje regulados por volumen por lo que este tipo de canal de cloro se describe con mayor detalle en esta sección. Los cambios en el volumen celular y, consecuentemente, en las concentraciones intracelulares de iones, pueden afectar a la excitabilidad y a la señalización celular debido a las alteraciones de los gradientes iónicos de la membrana celular (Jentsch, 2016). Es preciso mencionar que las alteraciones prolongadas en el tiempo del volumen celular pueden implicar modificaciones en el citoesqueleto, variaciones en la expresión de transportadores de iones y pueden influir en una gran diversidad de procesos fisiológicos como el transporte transepitelial y la migración, proliferación y muerte celular, puesto que los cambios en el volumen celular funcionan como señales específicas reguladoras de multitud de procesos fisiológicos (Hoffmann et al., 2009; Pedersen et al., 2016). A continuación, en la Figura 20 se muestra una representación de las funciones fisiopatológicas en las que intervienen los canales VRAC. Introducción 39 Figura 20. Principales funciones fisiopatológicas en las que intervienen los canales VRAC. De un modo general, los mecanismos por los cuales las células regulan su volumen comprenden un proceso dual. Por un lado, están los procesos de reguladores del aumento de volumen (del inglés regulatory volumen increase RVI), proceso en el que la célula se hincha, y que está moderado principalmente por el intercambio de Na+/H +, el cotransporte de Na+-K+-2Cl− y los canales de Na+. Por otro lado, el proceso opuesto mediante el cual la célula se contrae obedece a los procesos reguladores de la disminución del volumen (del inglés regulatory volumen decrease RVD) que implica la activación del cotransporte de K+/Clademás de los canales de K+ y de los canales de Cl- (principalmente protagonizado por los VRAC) (Hoffmann et al., 2009; Jentsch, 2016). Es interesante mencionar que en la bibliografía los VRACs también se denominan como VRC (del inglés volumen regulated channel), VSORs (del inglés volume-sensitive outwardly rectifying anion channels) e incluso VSOACs (del inglés volume-sensitive organic osmolyte anion channels). Las corrientes de cloro activadas por modificaciones en el volumen celular se conocen desde hace aproximadamente 50 años. Debe subrayarse que también se han caracterizado las propiedades biofísicas de los canales VRAC, su regulación, así como sus principales funciones (Jentsch, 2016). No obstante, la identidad molecular del canal entrañó un misterio durante casi tres décadas, hasta que se identificaron los componentes de estos canales aniónicos reguladores de volumen que se encuentran exclusivamente en vertebrados. El descubrimiento revolucionario de las proteínas LRRC8 (del inglés leucine-rich repeat containing protein 8) permitió determinar que estas estructuras eran componentes esenciales del VRAC. Posteriormente, los estudios genómicos desvelaron que la proteína LRRC8A (también llamada SWELL1, debido a que la hinchazón celular es la principal responsable de su activación) forma Activación VRAC Regulación del volumen celular Proliferación y muerte celular Secrección fluidos Motilidad celular Alteración transportadores Liberación de ATP Liberación glutamato ANDREA BOENTE JUNCAL 40 heterómeros compuestos por LRRC8A y otras isoformas de la proteína LRRC8 (LRRC8 -B, -C, -D, o -E) (Voss et al., 2014). En relación con la estructura de estas proteínas de membrana, cabe mencionar que están compuestas por hélices transmembrana y contienen repeticiones ricas en leucina que se ensamblan conjuntamente formando hexámeros complejos. Estas seis subunidades se disponen alrededor de un eje de simetría por el que pasan los iones, con los extremos N y C terminal situados en el citoplasma celular y dispuestos hacia la luz del poro. El dominio del poro de cada subunidad contiene cuatro hélices transmembrana (TM) con regiones de conexión que se pliegan en estructuras compactas y constituyen la entrada del poro (Deneka et al., 2018). En la estructura del LRRC8 se pueden diferenciar los siguientes dominios: dominio extracelular, transmembrana, citoplasmático y el dominio repetido rico en leucina (LRRD) (Bertelli et al., 2021). A continuación, en la Figura 21 se señala la estructura del LRRC8A del canal aniónico dependientes de voltaje regulado por volumen (Duran et al., 2010). Figura 21. Representación de la estructura hexamérica del LRRC8A desde distintas vistas, vista lateral (A) y vista desde la región extracelular (B) obtenida mediante criomicroscopía electrónica. Cada subunidad se muestra en un color diferente y los dominios aparecen reseñados en la vista lateral. Imagen modificada de Protein Data Bank, PDB ID: 6G9L (Sehnal et al., 2018). Como se indicó anteriormente, la región LRRC8A (SWELL1) es indispensable para el funcionamiento del canal. Si las células tienen alterados los genes que codifican para LRRC8A, es necesaria la cotransfectación de la isoforma LRRC8A para poder reconstituir las corrientes de VRAC (Voss et al., 2014). Además, la composición de las subunidades LRRC8 va a determinar las propiedades del canal y la selectividad por el sustrato entre una gran variedad de VRACs diferentes, pero en todo caso, este complejo SWELL1 es suficiente para reconstruir la actividad del canal si se incorpora a las bicapas lipídicas (Osei-Owusu et al., 2018). Cuando los canales VRAC se activan por el aumento de volumen de la célula, las corrientes que atraviesan los canales VRAC se denominan ICl,vol o ICl,swell. Estas Introducción 41 corrientes de cloro son principalmente positivas por lo que se designan como “outward currents” o corrientes de salida. Esta corriente de salida es moderada y mantenida en el tiempo, y además, la cinética de inactivación de los canales a voltajes positivos varía en función de la composición de las subunidades del canal, así como también según el tipo celular del que se trate y de las concentraciones extracelulares de otros iones como H+, Mg+2 y Clasí como con la magnitud de la propia corriente. La permeabilidad del canal se ha caracterizado por diversos grupos traduciéndose en la siguiente secuencia de selectividad: SCN > I- > NO3- > Br- > Cl- > HCO3- > glicina > F- > taurina > lactato > gluconato > glutamato > aspartato (Pedersen et al., 2016). Asimismo, es necesario tener en cuenta otras consideraciones complementarias para explicar el funcionamiento de estos canales, como es la presencia imprescindible de ATP intracelular, cuya concentración va a modular la activación del canal. Se trata de una característica funcional indispensable, que además de otras propiedades fenotípicas, permite diferenciar las corrientes del canal VRAC de las corrientes que atraviesan los canales ClC-2 y Maxi Clque también pueden ser activados por el aumento de volumen celular (Okada et al., 2018). 1.7.3 Receptores de potencial transitorio La superfamilia de los canales TRP, del inglés transient receptor potential cation channel están constituidos por proteínas transmembrana que desempeñan un papel clave en la fisiología del sistema nervioso. Estas proteínas estás involucradas en numerosos trastornos neurológicos como la enfermedad de Alzheimer, el Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica y la epilepsia (Lee et al., 2021). La identificación casual de una mutación en el locus TRP de Drosophila que confiere una respuesta sostenida a la luz derivada de un influjo de Ca+2, bautizó a esta superfamilia de canales hace menos de medio siglo (Montell and Rubin, 1989). Actualmente, se conoce que estas proteínas funcionan como canales catiónicos no selectivos, que se activan por estímulos químicos, mecánicos y térmicos, así como por cambios en el pH, en la osmolaridad, al igual que por ligandos endógenos o exógenos, segundos mensajeros y moléculas de señalización cuya selectividad y mecanismos de activación varían enormemente a tenor de la familia de TPR que se trate (Jardín et al., 2017). De forma muy general, en los mamíferos se conoce seis familias nombradas: clásica o canónicos (TRPC), melastatina (TRPM), vainilloide (TRPV), ANKTM1 (TRPA), policistina (TRPP) y muclopina (TRPML) (Moran et al., 2004) y en el contexto de esta tesis tiene especial relevancia la TRPC que intervienen en la despolarización y en el incremento sostenido de calcio intracelular (Putney, 2004; Birnbaumer, 2009). El incremento sostenido del calcio intracelular es uno de los efectos característicos de la MTX1, uno de los compuestos más tóxicos susceptibles de causar ciguatera. Pese a los esfuerzos realizados, se desconoce la diana de la maitotoxina, pero algunos investigadores ya han demostrado en que los TRPCs están relacionados con el incremento de calcio citosólico evocado por la MTX en diferentes tipos celulares (Brereton et al., 2001; Flores et al., 2017). Por ello, a fin de analizar los efectos de esta toxina en células madre neuronales diferenciadas, se realizan estudios de viabilidad de determinación de los niveles de calcio intracelular empleando un abordaje farmacológico. En este documento, nos centramos en la participación de los 49 3. MÉTODOS Durante la realización de la presente tesis doctoral se han empleado las siguientes herramientas metodológicas recogidas en la Figura 23. Asimismo, a lo largo de esta sección se recoge una breve descripción de cada una de ellas junto con el protocolo empleado. Figura 23. Herramientas metodológicas empleadas 3.1 MODELOS DE ESTUDIO IN VITRO Los cultivos celulares constituyen una herramienta fundamental para evaluar los mecanismos de acción de ciertos compuestos, así como la toxicidad in vitro de forma complementaria a los estudios in vivo. Por consiguiente, durante la realización de la presente tesis doctoral se han empleado diversos cultivos celulares a tenor de los objetivos perseguidos. Los modelos in vitro que se utilizaron consisten en: células madre humanas de origen cortical, células embrionarias de riñón humano denominadas HEK293 transfectadas con las subunidades Nav1.5, Nav1.6 y Nav1.7 del canal de sodio dependiente de voltaje, línea de neuroblastoma y cultivos primarios de neuronas corticales de ratón. A continuación, se realizará una breve descripción de cada una de las líneas empleadas. 3.1.1 Células progenitoras neuronales humanas (hNPC) Durante el desarrollo de la presente tesis doctoral se utilizó la línea neuronal humana CTX0E16 proporcionada por la compañía biofarmacéutica ReNeuron Group plc (Guildford, UK) mediante un acuerdo de transferencia de material con los investigadores del Departamento de Farmacología, Farmacia y Tecnología Farmacéutica de la Facultad de Veterinaria de Lugo. Estas células neuronales humanas provienen de la corteza cerebral de un embrión de 12 semanas de gestación y han sido ANDREA BOENTE JUNCAL 50 inmortalizadas mediante la integración de un retrovirus c-mycERTAM que permite la replicación de las células en presencia de 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) (Pollock et al., 2006; Stevanato et al., 2009). Estas células son pluripotentes y se pueden diferenciar en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos bajo determinados medios suplementados con factores de crecimiento (Anderson et al., 2015). Las células progenitoras neuronales se cultivaron hasta llegar al pase 30 como máximo, se siembran en placas o flask de cultivos previamente tratados con poli-Dlisina y laminina y se incubaron a 37 °C en una atmosfera con 5% de CO2. Para su mantenimiento, se empleó medio reducido modificado (RMM), concretamente DMEM/F12 que contiene 15 mM HEPES (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperacinil-(1)] etanosulfónico) y bicarbonato sódico, al que se le añade un suplemento para cultivo de células neuronales (B-27), albúmina sérica humana, apotransferrina, putrescina, insulina humana, progesterona, L-glutamina y selenito sódico. Para que las células CTX0E16 sigan proliferando es preciso agregar al medio el factor de crecimiento de fibroblastos humano y el factor de crecimiento epidérmico humano, así como hidroxitamoxifeno. El medio se sustituye completamente cada 2 o 3 días y las células se levantan cuando estas alcanzan el 70-80% de confluencia utilizando una solución de acutasa comercial que contiene enzimas proteolíticas y colagenolíticas. 3.1.1.1 Diferenciación de las células progenitoras neuronales Para la diferenciación de las células CTX0E16, se sustituye el medio de proliferación por uno de diferenciación carente de factores de crecimiento, que contiene los mismos suplementos que el medio de diferenciación, pero se prepara a partir de medio comercial Neurobasal. Los resultados de esta tesis se obtuvieron con células diferenciadas durante 60 días en cultivo. 3.1.2 Células embrionarias de riñón humano (HEK293) Durante el desarrollo de esta tesis se han empleado tres líneas de células embrionarias de riñón humano, que expresan de forma estable diferentes subunidades alfa de los canales de sodio dependientes de voltaje, concretamente las subunidades Nav1.5, Nav1.6 o la subunidad Nav1.7. Estas líneas celulares se han obtenido bajo un acuerdo de transferencia de material establecido con el Dr. Andrew Powell (GlaxoSmithKline I+D, Stevenage, Reino Unido). Las células HEK293 se cultivaron en medio DMEM/F12 complementado con glutamax, con solución de aminoácidos no esenciales, suero bovino fetal al 10% y 400 µg/ml de geneticina. Las líneas celulares se mantuvieron en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 y 95% de aire a 37 °C sustituyendo el medio cada 2 o 3 días. Cuando las células alcanzan aproximadamente el 80 % de confluencia se incuban a 30 °C durante 24 a 48 h antes de realizar, con el objetivo de maximizar la expresión de los canales de sodio dependientes de voltaje previamente a la realización de los experimentos electrofisiológicos y de viabilidad celular. Métodos 51 3.1.3 Línea de neuroblastoma La línea de neuroblastoma SH-SY5Y empleada en la presente tesis doctoral se obtuvo de American Type Culture Collection (CRL-2266). Las células se cultivaron en medio DMEM/F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 1% de glutamax, y antibióticos (penicilina y estreptomicina). La línea celular de neuroblastoma se sembró en flask de cultivo de 25 cm2 y se pasó semanalmente levantándolas con tripsina y EDTA. El cultivo se incuba a 37 °C en una atmósfera con 5% de CO2. 3.1.4 Cultivos primarios de neuronas corticales de ratón Los cultivos de neuronas corticales primarias se obtuvieron a partir de fetos de ratones Swiss de 16-18 días de desarrollo embrionario. Los animales gestantes procedían del Animalario de la Universidad de Santiago y el cultivo celular se desarrolló bajo el amparo del proyecto titulado “Estudios farmacológicos con compuestos de origen natural y sintético” de acuerdo con el procedimiento aprobado número 3 (número de registro AE-LU-022/14-5, relativo al cultivo primario de neuronas a partir de ratones neonatos o ratones gestantes para estudios de neuroactividad). Todos los protocolos se aprobaron por el Comité de Bioética de Universidad de Santiago de Compostela (Informe favorable a 14 mayo 2014) y se realizaron conforme a los principios aprobados por la legislación europea (Directiva UE 2010/63/EU) y la legislación nacional y autonómica (Real Decreto 53/2013, Decreto 296/2008) y también se tuvo en cuenta aspectos éticos como el principio de las 3R (reducción, refinamiento y reemplazo). Las hembras gestantes se sacrificaron en una cámara de CO2 para ratones. Posteriormente, se extrajeron los fetos a partir de los cuales se aísla la corteza cerebral que permitirá la posterior disociación y cultivo de una población homogénea de neuronas corticales mediante procedimientos enzimáticos y mecánicos (Martin et al., 2014). Las células se suspendieron en medio neurobasal al que se le añadió suplemento B-27, L-glutamina y antibióticos (penicilina y estreptomicina). La suspensión celular se sembró en placas de 12 pocillos acondicionadas con poli-Dlisina para permitir la adhesión celular y las células se mantuvieron en una atmósfera con 5% de CO2 a 37 ºC. En este caso, los cultivos neuronales primarios no proliferan por lo que el medio de cultivo se reemplazó cada 3-4 días y las células se emplearon entre 7 y 10 días de cultivo. 3.2 DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR Durante la presente tesis se realizaron numerosos ensayos de viabilidad celular (Boente-Juncal et al., 2018b; Boente-Juncal et al., 2018a; Boente-Juncal et al., 2019a; Boente-Juncal et al., 2020a). La determinación de la viabilidad celular es una de las herramientas metodológicas básicas en los estudios de toxicidad in vitro, pues permite determinar mediante la elaboración de curvas de dosis-respuesta la IC50, definida como la concentración, en este caso de toxina, que disminuye la viabilidad celular o la ANDREA BOENTE JUNCAL 52 función mitocondrial en un 50% de la población celular. Básicamente, en el transcurso de esta tesis se empleó el ensayo MTT, que permite evaluar la capacidad de las deshidrogenasas mitocondriales celulares para reducir el colorante vital MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazolio) o azul de tiazolilo. Este ensayo se emplea para determinar la viabilidad celular puesto que hay una buena correlación entre la capacidad de un producto químico para disminuir la función mitocondrial y su citotoxicidad (Vale, 2018). Se trata de una prueba colorimétrica, que tiene como fin evaluar la toxicidad de los distintos compuestos empleados en esta tesis a diferentes concentraciones, y determinar la viabilidad de los cultivos celulares estimando la actividad metabólica de las células. Como control de muerte celular se usó DMSO o saponina. Las enzimas oxidoreductasas dependientes de NAD(P)H reducen el colorante MTT que es soluble en agua a un derivado formazán granate e insoluble en agua. El protocolo empleado consiste en realizar los siguientes pasos concretados a continuación. Tras la exposición de las células a los compuestos de interés, las células se incuban durante 1 hora a 37 ºC con el colorante MTT a una concentración final de 500 µg/ml disuelto en tampón salino Locke´s compuesto por (concentraciones en mM) 154 NaCl, 5.6 KCl, 1.3 CaCl2, 1 MgCl, 5.6 glucosa y 10 HEPES (pH 7.4). Posteriormente, se elimina el MTT mediante aspiración y se añade docecil sulfato sódico al 5% disuelto en agua para romper las membranas y liberar el colorante, mientras tanto, las placas se mantienen en la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas. Finalmente, para obtener los resultados y poder elaborar una curva de dosis respuesta, la absorbancia emitida se lee a 595 nm en un espectrofotómetro (Synergy, Biotek). Otro de los ensayos empleados para evaluar la actividad mitocondrial en el transcurso de esta tesis doctoral fue el ensayo de la resazurina o azul alamar (también denominado Alamar Blue). Se basa en el uso de un indicador llamado resazurina (7hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona 10-óxido) que se utiliza a para evaluar la proliferación celular o para monitorizar la citotoxicidad de un compuesto. A diferencia del MTT, la resazurina no requiere el lisado de las células para medir la absorbancia, por lo que las células se pueden someter a análisis posteriores para estudiar los efectos crónicos de las toxinas a determinados periodos de tiempo. Las células se incuban con el Alamar Blue en el medio de cultivo en proporción 1:10. Este indicador redox es un reactivo ampliamente utilizado que exhibe propiedades fluorimétricas y colorimétricas en respuesta a la actividad metabólica. Inicialmente, el indicador es de color azul no fluorescente y se reduce por las células metabólicamente activas a un indicador rosa que es fluorescente denominado resorufina. A medida que disminuye el número de células vivas, también disminuye la intensidad de la fluorescencia. El cambio de color inducido por la reducción varía proporcionalmente en función del número de células y del tiempo transcurrido. Mediante este ensayo, se pueden realizar mediciones de fluorescencia o absorbancia. Específicamente, en este trabajo, se recurre a la medición de la absorbancia a 570 y 600 nm mediante un espectrofotómetro después de 24 y 48 horas de tratamiento con azaspirácido. Métodos 53 3.3 INMUNOCITOQUÍMICA Y ANÁLISIS MICROSCÓPICO Durante la realización de la presente tesis doctoral se llevaron a cabo técnicas inmunocitoquímicas que consisten en realizar un marcaje que permite demostrar una variedad de antígenos presentes en las células empleando anticuerpos marcados. Esta técnica se considera un método muy útil para evaluar los efectos de las toxinas marinas en la integridad celular (Vale and Botana, 2008; Vilarino, 2008; Vale et al., 2010; Espiña et al., 2011). La metodología y el protocolo empleado para evaluar el citoesqueleto y las consiguientes alteraciones que se producen a consecuencia de los azaspirácidos y los espirólidos se muestra en la Figura 24. Esta técnica se empleó en la línea neuronal CTX0E16 así como en células HEK293 que expresan la subunidad Nav1.7 del canal de sodio (Boente-Juncal et al., 2018b; Boente-Juncal et al., 2020a). Los pasos seguidos durante esta técnica se describen a continuación. En primer lugar, las células se lavaron con tampón fosfato salino (PBS) que contiene en mM 137 NaCl, 8.2 Na2HPO4, 1.5 KH2PO4, y 3.2 KCl, y a continuación se fijaron con una mezcla de paraformaldehido al 4 % y sacarosa al 4 % en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron con PBS y la reactividad inespecífica se bloqueó con PBS suplementado con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% y se permeabilizaron con 0.1% Tritón X-100 a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadieron los anticuerpos primarios en una solución de PBS que contenía 2.5 % de BSA y 0.1 % de Tritón X-100 y las células se incubaron con el anticuerpo primario durante toda la noche a 4 ºC, posteriormente se lavó el anticuerpo primario y las células se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios fluorescentes. Posteriormente, los cubreobjetos se lavan con PBS, se cubren con líquido de montaje (PBS/glicerol 4:1 v/v), se sellan con esmalte de uñas y los resultados se visualizan con un microscopio láser confocal (Nikon TE2000E). ANDREA BOENTE JUNCAL 54 Figura 24. Representación de la metodología empleada en el análisis inmunocitoquímico de las células y los efectos que tienen las toxinas marinas sobre el citoesqueleto. 3.4 WESTERN BLOT La técnica del Western Blot permite identificar las proteínas específicas extraídas de las células control y de las tratadas con diferentes biotoxinas y cuantificar su expresión. Empleando esta herramienta se evaluó el nivel de proteína de los receptores de glutamato en cultivos de neuronas corticales humanas mantenidas durante 15 días en presencia de gambierona o MTX3 (Boente-Juncal et al., 2019a). Esta técnica también se empleó para determinar cómo afecta a las células el tratamiento prolongado con la maitotoxina en la expresión de los canales TPRC4 (Boente-Juncal et al., 2018a) y finalmente para evaluar el efecto crónico de los espirólidos sobre la expresión de receptor nicotínico de acetilcolina (α7 nAChR), de la enzima responsable de la síntesis de acetilcolina (colinacetiltransferasa ChAT), doblecortina, nestina y de otros marcadores relacionados con la diferenciación axonal y dendrítica (MAP2 y TUC4) (Boente-Juncal et al., 2018b). Tal y como se muestra en la Figura 25, para la realización de esta técnica las células se lavaron con PBS frio y se obtuvieron los lisados celulares empleando un tampón de lisis comercial (RIPA, ThermoFisher) que contiene 25 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% NP (nonil fenoxipolietoxiletanol)-40, 1% sodio desoxicolato y 0.1% SDS al que se le añadió una mezcla comercial de inhibidores de fosfatasas y proteasas. Una vez realizada la lisis celular, se midió la concentración de proteína empleando el método de Bradford y albúmina sérica bovina (BSA) como estándar para cuantificar la cantidad de proteína cargada en cada pocillo. Las muestras de los lisados celulares se diluyeron en tampón Métodos 55 de carga comercial (BioRad) y se sometieron a electroforesis en geles de distintos porcentajes de poliacrilamida empleando un voltaje de 200 V durante un periodo de tiempo de 30 - 60 minutos en función del peso molecular de la proteína a cuantificar. A continuación, las proteínas se transfirieron desde el gel a la membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno) o de nitrocelulosa empleando una placa de transferencia semiseca (TransferBlotSD), conectada a la fuente de alimentación de Biorad aplicando 10 V durante 30 minutos. Las membranas se bloquearon durante 1 hora en tampón con 5% de BSA o leche en polvo y se incubaron durante toda la noche a 4 ºC con los anticuerpos primarios siguiendo las indicaciones de los fabricantes para cada uno de los anticuerpos empleados. Las bandas inmunorreactivas se detectaron empleando un revelador quimioluminiscente con luminol y un equipo Diversity4. La quimioluminiscencia se midió con un software de análisis Diversity Gene Snap software (Syngene). Finalmente, como control de carga y para normalizar los valores e intensidad de las bandas obtenidas se empleó β-actina. ANDREA BOENTE JUNCAL 56 Figura 25. Representación del procedimiento de Western Blot empleado en el presente trabajo para identificar variaciones en la cuantificación proteica obtenida a partir de los lisados de células tratadas con toxina. Métodos 57 3.5 DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE CALCIO CITOSÓLICO Para evaluar la función celular en las células in vivo hay múltiples técnicas entre las que se incluyen la determinación del calcio citosólico que supone una técnica comúnmente empleada en la evaluación de los efectos de los compuestos marinos (Audoin et al., 2014; Martin et al., 2014; Sánchez et al., 2015; Mendez et al., 2017). Durante la presente tesis doctoral se analizó la respuesta de las neuronas corticales humanas a la maitotoxina-1, a la ciguatoxina y a la gambierona. A continuación, en la Figura 26, se detallan los pasos seguidos para determinar cómo afectan estas toxinas a los niveles de calcio citosólico. En primer lugar, las células se diferenciaron durante 30 días en cubreobjetos de 18 mm de diámetro y se incubaron con el indicador de calcio Fura-2-acetoximetil éster (Fura-2 AM) a una concentración final de 2.5 μM durante 30 minutos a 37 ºC en tampón salino Locke´s (cuya composición se detalló con anterioridad) suplementado con 0.1% de BSA. Posteriormente, las células se lavaron con tampón salino frio y los cubreobjetos se insertaron en una cámara termostatizada a 37 °C (Life Science Resources). Las células se visualizaron empleando un microscopio Nikon Diaphot 200 equipado con una óptica de fluorescencia (objetivo Nikon 40X de inmersión en aceite). A continuación, se añaden las toxinas aspirando e incorporando medio nuevo. Los inhibidores empleados para evaluar el efecto de la maitotoxina, se agregaron previamente a la toxina. Los niveles de calcio citosólico expresados como relación entre la fluorescencia emitida tras la excitación de las células a 340 y a 380 nm y expresados como ratio 340/380 se obtuvieron a partir de las imágenes recogidas por el equipo de fluorescencia (Lambda-DG4, Sutter Instruments). La fuente de iluminación consiste en una lámpara de xenón de alta velocidad que permite (Lambda DG-4 / DG-5 Ultra High Speed Wavelength Switcher, Sutter Instruments) y las diferentes longitudes de onda se seleccionaron mediante filtros. Con el propósito de determinar los niveles de calcio citosólico, las células previamente cargadas con el indicador se excitaron alternativamente a longitudes de onda de 340 y 380 nm y la emisión se obtuvo a 520 nm. Antes de la adición de las toxinas, se realizó un registro basal en cada experimento y los resultados se analizaron con el software Metafluor (Molecular Devices) obteniendo la ratio 340 nm/380 nm. ANDREA BOENTE JUNCAL 64 que el electrodo se acople a un amperímetro o a un voltímetro. La solución extracelular empleada en los experimentos electrofisiológicos de esta tesis doctoral consiste en una solución fisiológica de Locke´s (anteriormente reseñada), mientras que para la solución intracelular se consideró como referencia la solución empleada en los análisis electrofisiológicos de las células HEK293 que expresan las subunidades de los canales de sodio (Burbidge et al., 2002). Concretamente, la solución intracelular empleada contiene en mM, 110 CsCl, 10 NaCl, 5 MgCl2, 11 EGTA, 10 HEPES, 2 ATP y 1 GTP (pH 7.25), durante esta tesis también se realizaron determinados estudios en los que la solución intracelular varió sensiblemente puesto que se excluyeron de la misma el ATP y el GTP. Los electrodos de registro se fabricaron con microcapilares de borosilicato con un diámetro externo de 1.5 mm y un diámetro interno de 0.86 mm. Estos microcapilares se estiran y se dividen en dos mediante un estirador de pipetas horizontal llamado puller, y presentan resistencias de 4 a 10 MΩ. A continuación, el electrodo de registro se rellena de solución intracelular, entra en contacto con el electrodo y se controla la precisión de movimiento del cabezal mediante un micromanipulador (Sutter instruments). Una vez que se ha hecho un sello hermético en la célula se empleó la configuración de célula entera (anteriormente descrita). Las corrientes de sodio y de cloro dependientes de voltaje se registraron a temperatura ambiente empleando un amplificador Multiclamp 700B y se digitalizaron con la Digidata 1440A (ambos de Axon Instruments). Los registros se obtuvieron a frecuencias de 50 kHz y se filtraron con un filtro Bessel a 10 kHz. Las resistencias se compensaron con el circuito de compensación interna en un 70-80%. Cabe mencionar que las corrientes de fuga se restaron de las corrientes activas empleando el protocolo P/N proporcionado por el software pClamp10. Entre el equipamiento también hay que destacar una mesa antivibratoria (Newport Breadboard) acoplada a una botella de aire comprimido que amortigua las vibraciones procedentes del entorno y sobre la que se encuentra el microscopio (NikonEclipse TE2000-U), todo ello rodeado por una caja de Faraday para evitar las interferencias eléctricas. Todo este equipamiento aparece recogido en la Figura 31 que se muestra a continuación. Métodos 65 Figura 31. Equipamiento empleado para realizar los registros electrofisiológicos. El ordenador donde están instalados los diferentes programas está conectado al resto del equipamiento, en el estante se disponen los distintos aparatos como el digitalizador, el amplificador, el osciloscopio, el controlador del micromanipulador etc. Encima de la mesa antivibratoria se encuentra el microscopio y todo ello está recubierto con una caja de Faraday. Las puntas se realizaron en el estirador de pipetas y se acoplan al electrodo para realizar el sello con las células. Los cubreobjetos se montan en una cámara de registro que puede conectarse a un sistema de perfusión con una bomba peristáltica acoplada a jeringuillas que se rellenan con distintas soluciones. Durante la realización de estos experimentos, se aplicó un protocolo de fijación de voltaje en el que las células HEK se mantuvieron a un potencial de membrana de -55 mV y los registros se realizaron después de 5 minutos tras alcanzar la configuración de célula entera. Las toxinas, concretamente los azaspirácidos, y los inhibidores de canales iónicos se añadieron directamente en la cámara de registro, salvo en los casos en los que se evaluó el efecto crónico de los azaspirácidos donde las células se conservaron en el incubador y después del tratamiento se montaron los cubres en la cámara de registro para realizar los estudios electrofisiológicos. ANDREA BOENTE JUNCAL 66 Para registrar la activación de las corrientes de sodio dependientes de voltaje se empleó el protocolo de activación basado en el que describió Burbidge para las células HEK293 transfectadas con la subunidad alfa Nav1.6 (Burbidge et al., 2002) que trata de despolarizar las células empleando pulsos de voltaje de corta duración. Este protocolo consiste en aplicar pulsos de voltaje que van desde -80 mV hasta + 80 mV empleando incrementos de 10 mV para registrar la corriente de sodio dependiente de voltaje. Este protocolo permite obtener una curva de corriente voltaje (I-V) donde se representa la corriente en función de los pulsos de voltaje aplicados. Como ya se mencionó, la corriente de sodio tiene una fase de activación rápida seguida de una fase de inactivación rápida y una fase de inactivación lenta, tanto la cinética de activación como la de inactivación son dependientes de voltaje y ambas se caracterizaron en la realización de esta tesis. Para ello, se aplicaron pulsos que van desde -100 mV hasta 0 mV en incrementos de 10 mV, empleando un pulso condicionante previo de 0 mV, este pulso tiene una duración de 10 ms en el caso de la inactivación rápida, y de 1000 ms en el caso de la inactivación lenta. Para el registro de las corrientes de cloro, se empleó un protocolo de fijación de voltaje en el que se aplicaron varios pulsos que parten de -100 mV hasta llegar a 100 mV, y tienen unos saltos de voltaje de 20 mV, estos pulsos tienen una duración de 400 ms. La corriente de cloro se analiza al final del pulso y se obtiene una curva de corriente voltaje. 3.7 MODELOS DE ESTUDIO IN VIVO En la realización de esta tesis doctoral se emplearon ensayos in vivo para obtener datos de toxicidad aguda y crónica. Para la realización de estos experimentos se tuvieron en cuenta las consideraciones en experimentación animal de acuerdo al principio de las 3R (reducción, refinamiento y remplazo) así como la legislación europea relativa a la protección de los animales empleados en experimentación (Directiva 2010/63/UE) (Parlamento Europeo y Consejo, 2010) y la legislación nacional (Real Decreto 53/2013) (BOE, 2013) y autonómica (Decreto 296/2008) (DOG, 2008). Todo ello bajo la autorización y los principios aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad de Santiago de Compostela (Informe favorable con fecha 22/07/2014). Bajo los procedimientos experimentales 011/14, autorizado el 14 de agosto del 2014 (MR110250) y el procedimiento 06/19/LU-002, autorizado el 1 marzo 2019 (A12X00509) amparados por el proyecto “Estudios farmacológicos con compuestos de origen natural y sintético”. Para el planteamiento de los protocolos utilizados para evaluar la toxicidad aguda y crónica se siguieron las directrices internacionales de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE) donde se recogen las normas recomendadas para testar la toxicidad de los compuestos químicos. Estas directrices recogen los métodos estandarizados aceptados por todos los países miembros de la OCDE después de un acuerdo para la aceptación y validación de los datos obtenidos. Pese al intento de reducción de los animales de experimentación, estos continúan siendo imprescindibles en numerosas áreas de trabajo. Este es el caso de los estudios toxicológicos en los que los ensayos in vivo constituyen un sistema biológico insustituible para los test de toxicidad donde suponen un modelo preciso Métodos 67 para extrapolar la toxicidad de los compuestos al ser humano y poder evaluar los riesgos que supondría la ingestión por parte del consumidor de productos pesqueros contaminados con biotoxinas marinas. Concretamente en el marco de la presente tesis doctoral se realizaron estudios de toxicidad aguda basados en el protocolo Up-andDown recogido en las directrices abordadas en el Test 425 (OECD, 2008b) y estudios de toxicidad subcrónica basados en el Test 407 (OECD, 2008a). Para la realización de estos estudios se emplearon ratones Swiss hembra de 4 semanas (ICR (CD-1). Estos animales se obtuvieron del animalario de producción de la Universidad de Santiago de Compostela y se mantuvieron en el Animalario de la RAIDT de la Facultad de Veterinaria, USC (Code: AE-LU-002). A su llegada al Animalario Facultad de Veterinaria los animales fueron sometidos a un periodo de aclimatamiento para minimizar la ansiedad y el estrés. Los animales se estabularon en el animalario bajo condiciones estrictas de control de temperatura, humedad y ventilación, con un fotoperiodo controlado y empleando una dieta equilibrada específica para los animales de experimentación. Los animales se mantuvieron en jaulas de 5 animales como máximo y cada jaula representó un grupo experimental, es decir, se empleaban jaulas de animales control y otras donde se disponían los animales tratados con una dosis determinada de toxina. Los grupos de tratamientos se formaron aleatoriamente para minimizar los efectos del sesgo subjetivo. 3.7.1 Estudios de toxicidad aguda El procedimiento experimental agudo incluye ensayos en los que se emplean dos vías de administración distintas. Por un lado, se empleó la vía de administración intraperitoneal, en esta vía la toxina se absorbe desde la cavidad peritoneal y pasa a la circulación sanguínea, no obstante, con el fin de simular unas condiciones más parecidas a la realidad, la mayoría de los ensayos están realizados empleando la vía de administración oral, para determinar la dosis exacta ingerida de la toxina, esta se administra por intubación oral empleando un catéter flexible de calibre 20G acoplado a una jeringa de 1 ml. Durante el procedimiento es importante utilizar un tamaño de catéter adecuado para el animal en función de su tamaño, así como también es relevante emplear un tamaño de aguja adecuado para los experimentos donde la toxina se administró por vía intraperitoneal. A continuación, se muestran los principales grupos de animales empleados durante el diseño de los estudios de toxicidad aguda tanto intraperitoneal como oral. Grupos diseñados para evaluar la toxicidad aguda de la palitoxina • En primer lugar, se definieron los grupos experimentales de los estudios de toxicidad aguda por vía intraperitoneal resultando en los siguientes grupos a tenor de la dosis administrada (0.0068, 0.022, 0.068, 1.5 y 3 μg/kg) así como grupos control. • Para los estudios de toxicidad aguda por vía oral provocada por la palitoxina se definieron distintos grupos experimentales en función de la dosis administrada (15, 36, 100, 350, 500, 750 y 1200 μg/kg) así como unos grupos control. ANDREA BOENTE JUNCAL 68 Durante la realización de los estudios toxicológicos agudos, los ratones recibieron una única dosis de toxina bien sea por vía oral, mediante una sonda gástrica en la que la toxina se diluye en 200 μl de solución salina fisiológica, o bien una única administración intraperitoneal de toxina empleando un tamaño de aguja para la administración de las sustancias de 25G. Una vez administrada la toxina los animales se observaron de manera continuada durante las 2 primeras horas y periódicamente hasta el sacrificio de los animales. Mientras se realizan estos experimentos los animales tienen acceso a la comida y al agua de manera constante. Los ratones que durante el experimento están moribundos o mostraron signos de dolor manifiestos fueron sacrificados en una cámara de CO2 para ratones y se consideraron en la interpretación de los resultados de los estudios de toxicidad aguda de la misma manera que los animales que se murieron durante el ensayo. Una vez que los animales se sacrifican, se confirmó la muerte del mismo mediante dislocación cervical y seguidamente se extrajo la sangre directamente de la cavidad ventricular del corazón de los ratones empleando agujas (25G) y jeringas sin heparina y la sangre obtenida se transfirió a microtubos con heparina (2.5 U. I./ml), se mezcló bien durante 30 segundos y se envió al laboratorio del Hospital Veterinario Universitario Rof Codina donde se procesó y se realizaron las determinaciones bioquímicas mediante IDEXX Catalyst Dx (IDEXX VetLab Station). Los parámetros que se determinaron en la sangre de los ratones durante la realización de este trabajo fueron los siguientes: • Niveles de electrolitos (Cl-, Na+, K+) • La enzima alanina aminotransferasa (ALT) • La enzima aspartato aminotransferasa (AST) • La enzima lactato deshidrogenasa (LDH) • La enzima creatina quinasa (CK) • Niveles de glucosa • Niveles de colesterol Asimismo, tras sacrificar a los ratones se realizó una observación macroscópica de cada uno de los órganos de los animales. Durante la necropsia se obtuvieron muestras representativas (corazón, pulmón, hígado, riñón, bazo, estómago, intestino delgado, intestino grueso y cerebro) y se procesaron para realizar un análisis histológico y también se recogieron muestras de algunos de estos órganos de 1 mm3 aproximadamente para procesar y poder realizar estudios de microscopía electrónica de transmisión (TEM). Para ampliar la toma de muestras durante la realización de algunos estudios de toxicidad aguda los animales se pusieron en jaulas metabólicas tras la administración de la toxina durante un máximo de 24 horas puesto que son instrumentos que permiten la monitorización de la cantidad de comida y de agua ingerida y asimismo permiten separar las heces y la orina producida con el fin de poder tomar muestras y procesarlas para la realización de análisis de orina y poder Métodos 69 determinar la cantidad de toxina expulsada en las heces mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS). 3.7.2 Estudios de toxicidad crónica Los estudios de toxicidad crónica de las toxinas marinas realizados en la presente tesis doctoral pretenden determinar el efecto a largo plazo en ratones Swiss hembra de 4 semanas de edad. Para ello se administró la toxina por vía oral empleando un catéter flexible y una jeringa (de la misma manera que para los estudios agudos) diariamente durante 28 días y la administración de la sustancia se realizó por la mañana (9:30 h). Se trata de un procedimiento poco invasivo para el que no es preciso emplear anestesia ni analgesia puesto que los ratones se habitúan progresivamente tras el manejo diario evitando así que los fármacos puedan interferir en los estudios de toxicidad de las sustancias empleadas. El stock de toxina se diluyó en suero salino fisiológico justo antes de su administración a los animales, de manera que el volumen final administrado fue de aproximadamente 200 µl. Este volumen se ajustó en función del peso de cada ratón y se tiene en cuenta el volumen de líquido que se queda retenido en el cono de la jeringa. A continuación, se muestran los principales grupos de animales empleados durante el diseño de los estudios de toxicidad subcrónica oral. • Grupos experimentales tetrodotoxina: control, animales tratados diariamente con 20 μg/kg, 25 μg/kg, 44 μg/kg, 75 μg/kg y 125 μg/kg. • Grupos experimentales tetrodotoxina combinada con saxitoxina: control 44 μg/kg TTX + 5.3 μg/kg STX, 44 μg/kg TTX + 17 μg/kg STX, 44 μg/kg TTX + 54 μg/kg STX. • Grupo experimentales palitoxina: control 0.03 μg/kg, 0.1 μg/kg, 0.3 μg/kg, 1 μg/kg, 3.5 μg/kg, 10 μg/kg. Durante el experimento, los animales control, reciben la misma cantidad de diluyente de la toxina (ácido acético o DMSO) diluido en suero salino fisiológico. Después de la administración, los animales se observan minuciosamente. Durante los 28 días en los que se prolonga el experimento, se realizaron controles de peso semanales de los animales (Día 0, día 7, día 14, día 21 y día 28). También se monitorizó la cantidad de comida ingerida en el mismo intervalo de tiempo en cada uno de los grupos estipulados. Tal y como se mencionó anteriormente, durante este periodo de tiempo, los animales se albergaron en las instalaciones del animalario de la Facultad de Veterinaria de la USC (Code: AE-LU-002) con un control estricto de las condiciones ambientales. Antes de la administración de la última dosis de toxina, es decir, por la mañana del día 27 del experimento, los animales se albergan individualmente en cajas metabólica durante 24 horas para poder obtener muestras de orina y de heces. Finalmente, tras la última administración de la toxina los animales se sacrifican en una cámara de CO2 y justo después de la confirmación de la muerte por dislocación cervical se obtuvo la sangre para realizar bioquímicas, determinando los mismos parámetros analítico que se recogieron en la sección anterior. Seguidamente, se realizó una necropsia detallada de cada uno de los animales y se tomaron muestras ANDREA BOENTE JUNCAL 70 de los órganos para visualizar por microscopía histológica y microscopía electrónica y realizar técnicas de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas. Estas herramientas metodológicas no se describen en la presente tesis doctoral puesto que se realizaron en colaboración con otros investigadores de la Universidad de Santiago de Compostela que fueron los responsables de su ejecución. A continuación, en la Figura 32, se muestra una representación del procedimiento seguido para evaluar la toxicidad oral repetida de las toxinas empleadas durante la realización de la presente tesis doctoral. Figura 32. Representación del proceso seguido para evaluar los efectos de la administración oral repetida de toxinas marinas en ratones Swiss hembra. Imagen parcialmente creada con BioRender.com 71 4. RESULTADOS A continuación, se recogen los resultados obtenidos durante la realización de la presente tesis doctoral que han sido publicados en diversas revistas internacionales. Este apartado se agrupará en distintos bloques temáticos a tenor de si se ha establecido un límite máximo en productos pesqueros o no. TRABAJOS PUBLICADOS • Synergistic effect of transient receptor potential antagonist and amiloride against maitotoxin induced calcium increase and cytotoxicity in human neuronal stem cells. • Structure elucidation and biological evaluation of maitotoxin-3, a homologue of gambierone, from Gambierdiscus belizeanus. • Transcriptomic analysis of ciguatoxin-induced changes in gene expression in primary cultures of mice cortical neurons. • Chronic in vivo effects of repeated exposure to low oral doses of tetrodotoxin: preliminary evidence of nephrotoxicity and cardiotoxicity. • Oral chronic toxicity of the safe tetrodotoxin dose proposed by the European Food Safety Authority and its additive effect with saxitoxin. • Reevaluation of the acute toxicity of palytoxin in mice: determination of lethal dose 50 (LD50) and No-observed-adverse-effect level (NOAEL). • In vivo evaluation of the chronic oral toxicity of the marine toxin palytoxin. • In vitro effects of chronic spirolide treatment on human neuronal stem cell differentiation and cholinergic system development. • Partial blockade of human voltage-dependent sodium channels by the marine toxins azaspiracids. • Targeting chloride ion channels: new insights into the mechanism of action of the marine toxin azaspiracid. ANDREA BOENTE JUNCAL 72 BLOQUE I: TOXINAS NO REGULADAS, PARA LAS QUE NO SE HA ESTABLECIDO UN LÍMITE MÁXIMO EN PRODUCTOS PESQUEROS. En este bloque se recogen los resultados obtenidos tras la evaluación de las toxinas sobre las cuales no se ha establecido un límite máximo en los productos pesqueros y que pertenece al grupo de las ciguatoxinas y maitotoxinas, al grupo de la tetrodotoxina, las palitoxinas y las iminas cíclicas y que se consideran emergentes por lo que se pretendió obtener datos toxicológicos empleando modelos in vitro e in vivo. Este bloque de resultados se subdivide en función de la toxina evaluada y a esta parte le corresponden las siguientes publicaciones. Sección I: Ciguatoxinas y maitotoxinas Publicación Synergistic effect of transient receptor potential antagonist and amiloride against maitotoxin induced calcium increase and cytotoxicity in human neuronal stem cells. Boente-Juncal, A., Vale, C., Alfonso, A. and Botana, L. M. Departamento de Farmacología, Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Facultad de Veterinaria , Universidad de Santiago de Compostela , 27002 Lugo , Spain. Resumen Las maitotoxinas se encuentran entre las toxinas marinas más potentes identificadas hasta la fecha e incluyen compuestos que causan la muerte celular a través del influjo masivo de calcio. Sin embargo, aún se desconoce el mecanismo exacto de la entrada de calcio inducida por la maitotoxina-1 y su relación con la citotoxicidad. En este trabajo, se evalúo el efecto de la MTX1 sobre la concentración de calcio citosólico y la viabilidad celular en cultivos de células madre neuronales humanas. Los resultados obtenidos demostraron que la toxina provocaba una disminución de la viabilidad celular dependiente de la concentración que ya era evidente después de 1 hora de tratamiento de las células neuronales con 0.25 nM MTX. Sin embargo, a una concentración de 0.1 nM, la toxina no ocasionó muerte celular, ni siquiera después de 14 días de exposición de las células a la toxina en el medio de cultivo. Además, la toxina provocó un aumento de calcio citosólico dependiente de la concentración que fue máximo a la concentración de 1 nM MTX y se produjo solamente cuando existía calcio en la solución extracelular. En la realización de este trabajo se emplearon varios abordajes farmacológicos para evaluar el papel de los canales iónicos asociados a los receptores canónicos de potencial transitorio (TRPC), puesto que estos canales permiten la entrada de calcio al interior celular, en los efectos celulares producidos por la maitotoxina. Los resultados Resultados 73 obtenidos condujeron a la identificación de los canales TRPC4 como principales contribuyentes en la entrada de calcio producida por la maitotoxina en células neuronales humanas. Tanto el aumento de calcio citosólico como la citotoxicidad de la MTX se revirtieron de manera total (en el caso del aumento del calcio citosólico) o parcialmente (en el caso de citotoxicidad) mediante el bloqueo de los receptores TRPC4 con el antagonista selectivo ML204. Además, el amiloride, que actúa como bloqueante del intercambiador Na+/H+, también inhibió parcialmente el aumento de calcio y la muerte celular inducida por la MTX, mientras que la combinación de amiloride y ML204 permitió eliminar por completo los efectos celulares de la toxina. Estos resultados indican que los rápidos efectos celulares de la maitotoxina-1 en células neuronales están relacionados con canales celulares y transportadores presentes en todas las células, lo cual permite justificar en parte la elevada potencia de esta toxina marina. Información publicación ACS CHEMICAL NEUROSCIENCE Volumen: 9 Número: 11 Páginas: 2667-2678 ISSN: 1948-7193 (Electronic) 1948-7193 (Linking) DOI: 10.1021/acschemneuro.8b00128 Fecha de publicación: NOV 2018 Enlace: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29733572 Índices de calidad de la revista (2018) Citas totales 5238 Factor de impacto: 3,861 Factor impacto 5 años: 4,287 Clasificación por categoría: Neurosciences Q2 (83/267), Biochemistry and Molecular Biology Q2 (93/299) Chemistry, Medicinal Q1 (3/61) Contribución doctorando: A.B.-J. mantuvo los cultivos celulares y realizó los experimentos, analizó los datos y preparó las figuras. ANDREA BOENTE JUNCAL 80 Información publicación TOXINS Volumen: 11 Número: 2 ISSN: 2072-6651 (Electronic) 2072-6651 (Linking) DOI: 10.3390/toxins11020096 Fecha de publicación: FEB 2019 Enlace: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30736354 Índices de calidad de la revista (2019) Citas totales 9582 Factor de impacto: 3,531 Factor impacto 5 años: 3,832 Clasificación por categoría: Food Science and Technology Q1 (34/139) Toxicology Q1 (21/92) Contribución doctorando: A.B.-J. participo en la metodología y en la investigación, en el análisis formal de los datos, en la redacción del borrador original del manuscrito y en la revisión y edición. Resultados 81 Publicación Oral chronic toxicity of the safe tetrodotoxin dose proposed by the European Food Safety Authority and its additive effect with saxitoxin. Andrea Boente-Juncal1, Paz Otero1, Inés Rodríguez2, Mercedes Camiña3, Mercedes Rodriguez-Vieytes3, Carmen Vale1, Luis M Botana1 1Departamento de Farmacoloxía, Farmacia e Tecnoloxía Farmacéutica, Universidade de Santiago de Compostela, Facultade de Veterinaria, Campus Universitario s/n, 27002 Lugo, Spain. 2Laboratorios Cifga, Benigno Rivera, 56. 27003 Lugo, Spain. 3Departamento de Fisiología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela, 27002 Lugo, Spain. Resumen En consonancia con los resultados presentados en el artículo anterior, y puesto que la publicación de los datos previos había coincido temporalmente con la publicación de la opinión de la EFSA sobre las toxinas relativas al grupo de las tetrodotoxinas y que más o menos simultáneamente se había fijado la regulación sobre los límites de TTX en Holanda, en este trabajo se realizó el estudio in vivo sobre la toxicidad crónica de la dosis de TTX propuesta como segura por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria que permitiría garantizar la inocuidad de los productos pesqueros. Además, la tetrodotoxina comparte mecanismo de acción con las toxinas paralizantes de los mariscos (saxitoxina y análogos), toxinas habituales en Europa y también en Galicia, y reguladas en la legislación (se permite su presencia en productos pesqueros hasta un límite de 800 µg/kg), no obstante, muy pocos estudios habían evaluado el potencial efecto aditivo de ambos grupos de toxina, aspecto que se abordó en el presente trabajo. Puesto que la presencia de TTX en productos pesqueros sólo se monitoriza de forma regular en Holanda, aunque la EFSA estableció un nivel de seguridad de 44 µg/kg TTX, entendido como la cantidad de toxina que no causaba efectos adversos en humanos, no existían datos sobre la seguridad de la ingesta repetida de contaminantes conteniendo este límite de tetrodotoxina. Por ello, en vista de los antecedentes, el objetivo fundamental de este trabajo se centró en evaluar la toxicidad crónica tras la administración oral de tetrodotoxina, tomando como referencia los niveles de seguridad recomendados inicialmente por la EFSA, para excluir los posibles riesgos potenciales para la salud humana asociados a la expansión mundial de los organismos productores de tetrodotoxina. Los datos obtenidos en este trabajo permiten respaldar el límite de tetrodotoxina propuesto por la EFSA, confirmando que se trata de una cantidad que no provoca efectos adversos, incluso después de la exposición diaria crónica a la toxina. Sin embargo, la combinación de la tetrodotoxina con STX, esta última a dosis superiores al nivel de exposición máximo de 5.3 µg/kg de peso corporal, propuesto por la EFSA, aumentó la letalidad de TTX, lo que confirma que tanto la TTX como las toxinas paralizantes de los mariscos deben de tenerse en cuenta para evaluar los riesgos que suponen para la salud humana. ANDREA BOENTE JUNCAL 82 Información publicación TOXINS Volumen: 12 Número: 5 ISSN: 2072-6651 (Electronic) 2072-6651 (Linking) DOI: 10.3390/toxins12050312 Fecha de publicación: MAY 2020 Enlace: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32397553 Índices de calidad de la revista (2019) Citas totales 9582 Factor de impacto: 3,531 Factor impacto 5 años: 3,832 Clasificación por categoría: Food Science and Technology Q1 (34/139) Toxicology Q1 (21/92) Contribución doctorando: A.B.-J. metodología e investigación, análisis y preparación de las figuras. Redacción del borrador original y revisión y edición. Resultados 83 Sección III: Palitoxinas Publicación Reevaluation of the acute toxicity of palytoxin in mice: determination of lethal dose 50 (LD50) and No-observed-adverse-effect level (NOAEL). Andrea Boente-Juncal1, Carmen Vale 1, Mercedes Camiña 2, J Manuel Cifuentes3, Mercedes R Vieytes 2, Luis M Botana1 1Departamento de Farmacoloxía, Farmacia e Tecnología Farmacéutica, Facultade de Veterinaria, Universidade de Santiago de Compostela, Lugo, 27002, Spain. 2Departamento de Fisioloxía, Facultade de Veterinaria, Universidade de Santiago de Compostela, Lugo, 27002, Spain. 3Departamento de Anatomía, Producción Animal y Ciencias Clínicas Veterinarias, Facultad de Veterinaria, Universidade de Santiago de Compostela, Lugo, 27002, Spain. Resumen La palitoxina (PLTX) es una toxina emergente en Europa y una de las sustancias más tóxicas conocidas hasta la fecha, que interrumpe el funcionamiento fisiológico de la bomba de sodio-potasio (Na+/K+-ATPasa) convirtiendo la enzima en un canal catiónico permeable. Las intoxicaciones humanas por PLTX debidas al consumo de productos pesqueros contaminados, son un problema de salud grave y pueden llegar a provocar la muerte. En el momento de realización de este trabajo, diversos estudios habían investigado previamente la toxicidad oral e intraperitoneal de PLTX en ratones. Sin embargo, en todos los casos se habían monitorizado los animales durante períodos de observación muy cortos (24 y 48 horas) después de la administración de la toxina, por lo cual y en vista de los números efectos producidos en animales por una única dosis de toxina en este trabajo se replanteó la necesidad de reevaluar la toxicidad in vivo de la PLTX, empleando protocolos reconocidos a nivel mundial para determinar la toxicidad in vivo de compuestos químicos y periodos de observación más largos (los animales se observaron durante 96 horas después de la administración de toxina). En este trabajo, se administraron dosis únicas, tanto orales como intraperitoneales, de PLTX a ratones sanos y se realizó un seguimiento de los animales que sobrevivieron al tratamiento durante 96 h. Los datos obtenidos en este trabajo permitieron calcular las dosis letales 50 oral e intraperitoneal (LD50) de la toxina que se encontraban en el rango de los valores descritos anteriormente. Sorprendentemente, el NOAEL oral para la PLTX obtenido en este estudio fue más de 10 veces menor que el descrito anteriormente, para la palitoxina, observación que remarca la necesidad de reevaluar los niveles de la toxina en los productos pesqueros comestibles, y de establecer protocolos para evaluar de forma coherente la toxicidad de los productos pesqueros por los diferentes laboratorios. ANDREA BOENTE JUNCAL 84 Información publicación Reevaluation of the acute toxicity of palytoxin in mice: determination of lethal dose 50 (LD50) and No-observed-adverse-effect level (NOAEL). Andrea Boente-Juncal1, Carmen Vale 1, Mercedes Camiña 2, J Manuel Cifuentes3, Mercedes R Vieytes 2, Luis M Botana1 1Departamento de Farmacoloxía, Farmacia e Tecnología Farmacéutica, Facultade de Veterinaria, Universidade de Santiago de Compostela, Lugo, 27002, Spain. 2Departamento de Fisioloxía, Facultade de Veterinaria, Universidade de Santiago de Compostela, Lugo, 27002, Spain. 3Departamento de Anatomía, Producción Animal y Ciencias Clínicas Veterinarias, Facultad de Veterinaria, Universidade de Santiago de Compostela, Lugo, 27002, Spain. TOXICON Volumen: 177 Páginas: 16-24 ISSN: 0041-0101 DOI: 10.1016/j.toxicon.2020.01.010 Fecha de publicación: APR 15 2020 Enlace: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32056831/ Índices de calidad de la revista (2019) Citas totales 11863 Factor de impacto: 2,201 Factor impacto 5 años: 2.232 Clasificación por categoría: Toxicology Q3 (67/92) Pharmacology and Pharmacy Q3 (182/271) Contribución doctorando: A.B.-J. realización de los experimentos, análisis de datos, investigación, metodología, software, validación, visualización, redacción borrador original, redacción, revisión y edición Resultados 85 Publicación In vivo evaluation of the chronic oral toxicity of the marine toxin palytoxin. Andrea Boente-Juncal, Sandra Raposo-García, Carmen Vale, M Carmen Louzao, Paz Otero, Luis M Botana Departamento de Farmacoloxía, Farmacia e Tecnoloxía Farmacéutica, Facultade de Veterinaria, Universidade de Santiago de Compostela, Campus Universitario s/n, 27002 Lugo, Spain. Resumen En consonancia con los resultados obtenidos en el artículo anterior, y puesto que la palitoxina (PLTX) es una potente toxina emergente en Europa y que actúa sobre la bomba de sodio-potasio (Na+ - K+ ATPasa), convirtiendo la enzima en un canal catiónico permeable, en este trabajo se planteó el estudio de la toxicidad crónica empleando protocolos adoptados internacionalmente para el estudio de la toxicidad crónica de compuestos químicos. Esta toxina es conocida por originar intoxicaciones en humanos asociadas al consumo de pescado y crustáceos contaminados como cangrejos, meros, caballa y pez loro. En la actualidad, las intoxicaciones en el ser humano derivadas del consumo de productos pesqueros contaminados con PLTX suponen un problema de salud grave. A pesar de que diferentes trabajos habían evaluado previamente la toxicidad oral aguda de la PLTX en ratones, no se había descrito su toxicidad por vía oral empleando los protocolos establecidos por la OECD. Si bien, la presencia de palitoxina en productos marinos no está regulada aún en Europa, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria ha publicado una opinión donde se revisó el riesgo para la seguridad alimentaria que supone la presencia de este grupo de toxinas en alimentos y en la cual se hacía hincapié en solicitar la evaluación de la toxicidad crónica de esta potente toxina marina. Por ello, en este trabajo, se evaluó la toxicidad crónica de la palitoxina después de la administración oral mediante sonda gástrica de la toxina a ratones durante un período de 28 días. Después de la exposición crónica de los ratones a la toxina, se determinó una dosis letal 50 (LD50) de 0.44 µg/kg y una dosis sin efecto adverso observable (NOAEL) de 0.03 µg/kg, considerando la administración oral diaria repetida de PLTX. Estos resultados demostraron una toxicidad crónica mucho más alta de PLTX que la toxicidad producida después de la administración de una única dosis de toxina, y un NOAEL mucho menor que el descrito previamente tras la administración aguda de una o incluso varias dosis de toxina y periodos de observación más cortos, remarcando la inminente necesidad de reevaluar los niveles de este compuesto en productos marinos teniendo en cuenta los datos toxicológicos aportados. ANDREA BOENTE JUNCAL 86 Información publicación TOXINS Volumen: 12 Número: 8 ISSN: 2072-6651 (Electronic) 2072-6651 (Linking) DOI: 10.3390/toxins12080489 Fecha de publicación: AUG 2020 Enlace: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32751719 Índices de calidad de la revista (2019) Citas totales 9582 Factor de impacto: 3,531 Factor impacto 5 años: 3,832 Clasificación por categoría: Food Science and Technology Q1 (34/139) Toxicology Q1 (21/92) Contribución doctorando: A.B.-J. metodología investigación, análisis formal y software. Redacción de la preparación del borrador original, revisión y edición. Resultados 87 Sección IV: Espirólidos Publicación In vitro effects of chronic spirolide treatment on human neuronal stem cell differentiation and cholinergic system development. Andrea Boente-Juncal1, Aida G Méndez1, Carmen Vale1, Mercedes R Vieytes2, Luis M Botana1 1Departamento de Farmacología, Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Facultad de Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela, 27001 Lugo, Spain. 2Departamento de Fisiología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela, 27001 Lugo, Spain. Resumen Los espirólidos (SPX) son toxinas marinas, producidas por dinoflagelados que actúan como potentes antagonistas de los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR). Estos compuestos no son tóxicos para el ser humano, y dado que no hay informes de intoxicaciones humanas causadas por este grupo de toxinas, todavía no están regulados en Europa. Actualmente, el 13-desmetil espirólido C, el 13,19didesmetil espirólido C y el 20-metil espirólido G, están disponibles comercialmente como materiales de referencia. Los trabajos previos de este laboratorio habían demostrado que el tratamiento durante 4 días con 13-desmetil espirólido C de los cultivos primarios de neuronas corticales de ratón, disminuía la toxicidad inducida por el glutamato, aumentaba los niveles de acetilcolina, la expresión de la enzima que media la síntesis de acetilcolina y que era un compuesto útil tanto in vitro como in vivo para disminuir la patología cerebral asociada con la enfermedad de Alzheimer. Por ello en este trabajo, el objetivo consistió en ampliar el estudio de los efectos neuronales de los espirólidos empleando células neuronales humanas. Para tal fin, se emplearon células progenitoras neuronales humanas (CTX0E16) para evaluar el efecto in vitro de los espirólidos sobre el desarrollo neuronal. Los resultados presentados en este trabajo indicaron que la exposición a largo plazo (30 días) de células madre neuronales humanas a compuestos de la familia de los SPX, en concentraciones de hasta 50 nM, mejoraba la neurotoxicidad inducida por la toxina MPP+ y aumentaba la expresión de marcadores neuríticos y dendríticos, los niveles de la enzima colina acetiltransferasa y los niveles de expresión de la subunidad α7 de los receptores nicotínicos de acetilcolina. Estos efectos podrían estar relacionados con la interacción, previamente descrita, de estos compuestos con receptores nicotínicos que contienen las subunidades α7 y α4. En conjunto, estos datos corroboran, en células neuronales humanas, la idea inicial de que los espirólidos podrían ser moléculas interesantes para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos. ANDREA BOENTE JUNCAL 88 Información publicación ACS CHEMICAL NEUROSCIENCE Volumen: 9 Número: 6 Páginas: 1441-1452 ISSN: 1948-7193 (Electronic) 1948-7193 (Linking) DOI: 10.1021/acschemneuro.8b00036 Fecha de publicación: JUN 2018 Enlace: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29518322 Índices de calidad de la revista (2018) Citas totales 5238 Factor de impacto: 3,861 Factor impacto 5 años: 4,287 Clasificación por categoría: Neurosciences Q2 (83/267) Biochemistry and Molecular Biology Q2 (93/299) Chemistry, Medicinal Q1 (3/61) Contribución doctorando: A.B.-J. mantuvo los cultivos celulares, realizó los experimentos y analizó los datos y preparó las figuras en colaboración con A.G.M. Resultados 89 BLOQUE II: TOXINAS REGULADAS PARA LAS QUE YA SE HA ESTABLECIDO UN LÍMITE MÁXIMO EN PRODUCTOS PESQUEROS. En este bloque se recogen los resultados obtenidos tras el estudio del efecto de los azaspirácidos, toxinas cuyo límite en productos pesqueros está regulado, pero de las cuales todavía se desconoce su mecanismo de acción. Si bien existen datos previos que indican que estos compuestos podrían alterar la homeostasis iónica celular, un efecto común a todos los grupos de toxinas incluidos en la presente tesis doctoral. Por ello, se plantearon estudios que permitieron profundizar sobre los efectos in vitro de estas toxinas, ampliamente distribuidas en aguas europeas, con el objetivo final de mejorar la seguridad alimentaria de los productos pesqueros y por ende la confianza del consumidor. A este bloque pertenecen los resultados publicados en los siguientes artículos: Azaspirácidos Publicación Partial blockade of human voltage-dependent sodium channels by the marine toxins azaspiracids. Andrea Boente-Juncal, Sandra Raposo-García, Celia Costas, M Carmen Louzao, Carmen Vale, Luis M Botana Departamento de Farmacologıa, Farmacia y Tecnologıa Farmacéutica, Facultade de Veterinaria, Universidade de Santiago de Compostela, Campus Universitario s/n, 27002 Lugo, Spain. Resumen Los azaspirácidos se identificaron por primera vez, a finales del siglo pasado, en mejillones irlandeses, y durante las dos últimas décadas se han descrito numerosos efectos citotóxicos y neurotóxicos provocados por estas toxinas. Al igual que los otros grupos de toxinas incluidas en esta tesis doctoral, los azaspirácidos son compuestos sintetizados por dinoflagelados y se acumulan en diversas especies de moluscos bivalvos que se alimentan por filtración, incorporándose así a la cadena trófica y causando intoxicaciones en el ser humano. Entre los efectos celulares de los azaspirácidos se ha señalado que producían inhibición del potencial de acción en neuronas e hiperpolarizaban el potencial de membrana neuronal, si bien en la actualidad, se desconoce el mecanismo subyacente que desencadena estos efectos. Tampoco se ha descrito aún la relación existente entre las numerosas alteraciones que provocan los azaspirácidos en el citoesqueleto celular y los canales iónicos. Por ello, el objetivo principal de este trabajo fue evaluar el efecto citotóxico de los azaspirácidos en células humanas, así como su actividad sobre los canales de sodio dependientes de voltaje y su efecto sobre la morfología celular con el fin de profundizar en el ANDREA BOENTE JUNCAL 96 en cultivo durante 60 días (Anderson et al., 2015) representando una ventaja considerable para evaluar la toxicidad crónica de las toxinas marinas y los efectos celulares que desencadenan. En primer lugar, puesto que durante los últimos años se ha constatado la existencia de organismos productores de ciguatoxinas en aguas europeas (Tudó et al., 2020a; Tudó et al., 2020b), se evaluó la utilidad de un modelo neuronal humano para estudiar el mecanismo de acción de una de las toxinas más potentes producidas por dinoflagelados del género Gambierdiscus, concretamente la maitoxoxina-1. Por ello, en células corticales humanas se analizó el efecto de la MTX sobre la viabilidad celular y se indagó en el proceso subyacente derivado del incremento de la concentración de calcio citosólico ([Ca+2]c) provocado por esta potente toxina marina, puesto que todavía es desconocido (Wang et al., 2009; Martin et al., 2014). Por ello, en la publicación titulada “Synergistic effect of transient receptor potential antagonist and amiloride against maitotoxin induced calcium increase and cytotoxicity in human neuronal stem cells” se demostró que la maitotoxina-1 causa un aumento del calcio citosólico dependiente tanto de la concentración de maitotoxina, como de la presencia de calcio extracelular. Igualmente, se realizó una aproximación farmacológica encaminada a elucidar los mecanismos subyacentes al incremento de calcio intracelular empleando diferentes inhibidores de canales y transportadores que median la homeostasis del calcio. Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que el influjo de calcio provocado por la maitotoxina en las células neuronales está en parte mediado por el receptor TRPC4 puesto que la adición del antagonista ML204 previene el incremento del calcio citosólico evocado por la MTX de forma dependiente de la concentración. Además, el tratamiento prolongado durante 14 días con bajas concentraciones de MTX en cultivos de la línea CTX0E16 diferenciados durante 30 días provocó un incremento de la expresión de las proteínas TPRC4. Asimismo, la combinación del ML204, un inhibidor selectivo del canal TPRC4, con el amiloride (que bloquea el intercambiador de sodio-hidrógeno, NHE), los canales iónicos sensibles al ácido (ASIC) y diversas subfamilias de los receptores de potencial transitorio), evitó el incremento del calcio citosólico provocado por la toxina, así como también revirtió el efecto tóxico de concentraciones bajas de MTX (0.25 nM). El logro principal de este trabajo evidencia la contribución de los TRPC4 al incremento de calcio evocado por la maitotoxina en las células neuronales humanas, lo que está en consonancia con estudios previos que indican el papel que tienen los TRPC1 en las corrientes inducidas por la MTX (Brereton et al., 2001; Flores et al., 2017). Sin embargo, la maitotoxina-1 no es la única biotoxina involucrada en la ciguatera que provoca un incremento del calcio citosólico, puesto que se han identificado otros análogos producidos por los mismos dinoflagelados, pero cuya estructura era hasta el momento objeto de controversia (Pisapia et al., 2020). Por ello, durante el transcurso de esta tesis también se ha evaluado la actividad biológica de diversos análogos de la ciguatoxina y de la maitotoxina cuyos resultados se recogen en la publicación titulada “Structure elucidation and biological evaluation of maitotoxin-3, a homologue of gambierone, from Gambierdiscus belizeanus”. En este trabajo, se ha resulto por primera vez la estructura de la MTX3 (también denominada 44-metilgambierona Discusión 97 puesto que corresponde con un homólogo de la gambierona) procedente de especies de dinoflagelados del género Gambierdiscus. Este dinoflagelado también produce otro compuesto denominado gambierona, considerado como un análogo de la ciguatoxina (Rodríguez et al., 2015). Por ello, durante la presente tesis doctoral se comparó la actividad de la ciguatoxina sintética CTX3C con la actividad de la MTX1 y con la actividad biológica de los análogos recién descubiertos, la gambierona y la maitotoxina-3 en neuronas corticales humanas y en células de neuroblastoma. Utilizando este modelo celular, se concluyó que la CTX3C la gambierona y la MTX3C no afectan a la viabilidad celular a bajas concentraciones (de hasta 20 nM) tras una exposición prolongada a la toxina durante 5 días. No obstante, si se aumenta la concentración hasta rangos de 100 y 1000 nM la MTX3 disminuye la viabilidad celular, a diferencia de la gambierona, mientras que la MTX1 provoca neurotoxicidad a concentraciones muy bajas (0.1 nM) después de la exposición de las células a la toxina durante tan solo 24 h. Asimismo, en consonancia con la publicación anterior (Boente-Juncal et al., 2018a), la MTX1 a 5 nM provocó un incremento notable en la [Ca+2]c mientras que la gambierona y la MTX3 tienen un efecto menor, incluso a concentraciones más altas. Ambos efectos, baja citotoxicidad a concentraciones nanomolares y el pequeño efecto en el incremento del calcio citosólico, hace que la actividad de la gambierona y de la MTX3 sea similar a las de la P-CTX (Lewis et al., 2016; L'Herondelle et al., 2021). A este hallazgo, se le suma el hecho de que la exposición crónica de las neuronas corticales humanas tanto a gambierona como a MTX3, modificó la expresión de las subunidades de los receptores excitatorios de glutamato, disminuyendo la expresión de la subunidad GluR2-3-4, una de las alteraciones que está en consonancia con las observaciones previamente descritas después de la exposición de neuronas corticales de ratón a la ciguatoxina CTX3C (Martin et al., 2015b). En este trabajo se sugiere que estos resultados pueden estar relacionados con el cuadro neurológico que causa la ciguatera (Friedman et al., 2017; Kumar et al., 2017) puesto que las alteraciones en la transmisión sináptica como consecuencia de la disminución de la actividad excitatoria, se relacionan con la reducción de los niveles de los receptores ionotrópicos de glutamato. En definitiva, los resultados aportados en esta publicación han contribuido a dilucidar la estructura del compuesto MTX3 obtenido de cultivos de Gambierdiscus belizeanus y a determinar su actividad biológica, que ha resultado menor en comparación con otras toxinas protagonistas de la ciguatera. En este sentido, cabe reseñar que en esta tesis doctoral también se comparó el efecto de estas toxinas (CTX3C, gambierona, MTX3 y MTX1) empleando modelos in vivo y evaluando sus efectos tras la administración oral repetida de pequeñas cantidades de toxina durante 28 días. Estos resultados están pendientes de publicación, pero confirman una menor toxicidad tanto de la maitotoxina-3 como de la gambierona en comparación con la MTX1, datos que corroboran resultados recientes en los que se describe una baja toxicidad de la MTX3 en ratones tras la administración intraperitoneal única de la toxina (Murray et al., 2020). Entender el comportamiento neuronal tras la exposición prolongada a las ciguatoxinas ayuda a comprender mejor los síntomas neurológicos presentes en la ciguatera; como puede ser la aparición de parestesias, alodinia, vértigo, ataxia, dolor ANDREA BOENTE JUNCAL 98 de cabeza y alteraciones de la percepción de la temperatura (FAO and WHO, 2020). Esta cuestión ya se ha puesto en el punto de mira en diversos trabajos realizados en este laboratorio, que demostraron, en cultivos primarios de ratón, que la ciguatoxina potencia la actividad neuronal a través de los canales de sodio activados por voltaje y que, para prevenir la sobreexcitación, las neuronas utilizan mecanismos homeostáticos que tienden a restaurar la actividad neuronal a niveles normales (Martin et al., 2015a; Martin et al., 2015b). Continuando en esta dirección, durante la realización de esta tesis doctoral se profundizó en este sentido y se identificaron los genes responsables de los efectos funcionales de las ciguatoxinas en las neuronas. Estudios previos ya habían caracterizado la respuesta transcripcional global en el cerebro de ratón tras la inyección de P-CTX1 que desembocaba en una respuesta antiinflamatoria y neuroprotectiva para evitar el daño celular causado por la toxina (Ryan et al., 2010). En el artículo titulado “Transcriptomic analysis of ciguatoxin-induced changes in gene expression in primary cultures of mice cortical neurons” se examinó la respuesta genómica producida por la ciguatoxina en cultivos primarios de células corticales de ratón tratados con una concentración de 5 nM CTX3C durante 6, 24 o 72 horas y se identificaron diversos genes relacionados con el efecto de la CTX3C en neuronas. Entre las vías de señalización reguladas a la baja después de 72 h de tratamiento con la toxina, se identificaron las rutas relacionadas con la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), la calmodulina, la fosfolipasa A2 (PLA2), la fosfolipasa C, la proteína quinasa asociada a microtúbulos (MAPK 6), los receptores de la hormona liberadora de gonadotropina y la proteína tirosina quinasa 2. En vista de los cambios en las rutas asociadas con las enzimas fosfolipasa A2 y la fosfolipasa C, cabe reseñar que la fosfolipasa A2 está implicada como mediadora en la aparición y mantenimiento del dolor en la inflamación y en la lesión neural, modulando la nocicepción y la señalización excitatoria neuronal (Quindlen-Hotek et al., 2020). Este hallazgo puede tener relación con los resultados obtenidos in vitro que demostraron que las ciguatoxinas alteraban la expresión de los receptores de AMPA y NMDA (Massicotte, 2000). Además, en este estudio se ha determinado que la regulación tanto al alza como a la baja de los distintos genes no depende únicamente del tiempo de exposición, sino que está relacionado con los efectos de la ciguatoxina sobre la activación de los canales de sodio dependientes de voltaje, en vista de que el pretratamiento de las células con tetrodotoxina (que actúa bloqueando los canales de sodio dependientes de voltaje), anuló los cambios transcripcionales provocados por la ciguatoxina. Por lo tanto, en la presente tesis doctoral se publicaron tres artículos relacionados con las toxinas causantes de la ciguatera, una de las intoxicaciones que está en auge en Europa y que requiere una comprensión completa para mitigar las posibles repercusiones existentes para la salud de los consumidores, así como las consecuencias socioeconómicas derivadas de su aparición, y además se obtuvieron datos in vivo pendientes de publicación donde se analiza la toxicidad comparativa de la CTX3C, la gambierona y la metilgambierona. El trabajo presentado también engloba estudios in vivo que se realizaron para evaluar la toxicidad subcrónica de la tetrodotoxina, puesto que la presencia de esta toxina es cada vez más más habitual en productos pesqueros procedentes de aguas Discusión 99 europeas (Gerssen et al., 2018; Silva et al., 2019; Hort et al., 2020) y la EFSA ha puesto de manifiesto la necesidad de obtener datos toxicológicos para regularla (EFSA, 2017; Katikou, 2019). Esta compilación de experimentos se focalizó en el objetivo último de contribuir a la caracterización del efecto que supone la presencia de este contaminante alimentario para el consumidor, y simultáneamente obtener información útil para realizar un análisis del nivel adecuado de toxina en moluscos que interfiera mínimamente en la comercialización de productos pesqueros. Los resultados obtenidos de este trabajo se han publicado en el artículo titulado “Chronic in vivo effects of repeated exposure to low oral doses of tetrodotoxin: preliminary evidence of nephrotoxicity and cardiotoxicity”. En esta publicación se examinaron los efectos que produce la administración continuada de pequeñas cantidades de tetrodotoxina por vía oral a ratones Swiss. Ante la falta de estudios de toxicidad siguiendo directrices adoptadas internacionalmente, y empleando compuestos químicos certificados, en el caso de las toxinas marinas, este trabajo se planteó para evaluar el efecto de la tetrodotoxina tras su administración oral siguiendo directrices internacionales (OECD, 2008a). Para ello, los ratones Swiss se trataron diariamente con tetrodotoxina durante 28 días, siendo las dosis de toxina aplicadas 25, 75 y 125 µg/kg. La racionalidad para la elección de las dosis orales de TTX se basó en trabajos previos realizados en este laboratorio, donde los ratones tras una administración única de TTX a dosis de 25 y 75 µg/kg por vía oral no exhibieron signos de toxicidad aguda (Abal et al., 2017), no obstante, tras la administración diaria de tetrodotoxina a dosis de 75 y 125 µg/kg de TTX el 50% de los animales no completó el estudio. Los resultados relativos a los efectos de la toxina apuntaron a un descenso del peso corporal de los ratones, no obstante, estos datos no fueron significativos, probablemente debido al reducido número de animales empleados en este estudio con el fin de preservar los principios relativos a las 3R de reducción, refinamiento y reemplazo de animales de experimentación. Los efectos funcionales causados por la administración subcrónica de tetrodotoxina mostraron un descenso de la producción de orina en aquellos animales a los que se le administraron dosis diarias de tetrodotoxina de 75 y 125 µg/kg. Por ello, se pensó que la disminución del volumen de orina podría ser indicativa de una lesión renal aguda, en la que la tasa de filtración glomerular estuviera comprometida. Cabe destacar que, en estos casos, al principio tras la lesión, los niveles de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y los niveles de creatinina pueden estar dentro del rango normal, y el único signo temprano de la lesión sea la oliguria (Koeze et al., 2017; Goyal et al., 2021). En este estudio no se detectó un aumento de la concentración sanguínea de enzimas indicativas de daño renal, pero la disminución de la producción de orina llevó a realizar más pruebas analíticas para determinar si la tasa de filtración glomerular estaba afectada tras la administración repetida de tetrodotoxina. En este sentido, el análisis de las características de la orina de los ratones señaló una posible lesión renal, visto que los animales tratados con tetrodotoxina (en especial los de la dosis más alta), presentaban proteínas en orina, además de glucosa, cetonas, bilirrubina y urobilinógeno, sustancias que deben estar ausentes en un animal sano y que no se detectaron en los ratones control. A los resultados anteriores, se sumaron los datos obtenidos por microscopía electrónica en ANDREA BOENTE JUNCAL 100 los que se demostró que en los animales tratados con tetrodotoxina a dosis de 125 µg/kg, la organización de la barrera de filtración glomerular estaba alterada. Estructuralmente, esta barrera de filtración está compuesta por los podocitos, la membrana basal y las células endoteliales del capilar, y su correcto funcionamiento impide el paso de moléculas al espacio urinario (Trimarchi, 2020). Entre las alteraciones renales observadas en las muestras de ratones tratados con tetrodotoxina observadas al microscopio electrónico, se encontraron modificaciones compatibles con la necrosis de los podocitos y un exceso de restos celulares en la luz de los capilares renales. Todos estos hallazgos llevaron a hipotetizar que la TTX ejerce un efecto tóxico en el riñón, debido a que en este órgano los canales de sodio dependientes de voltaje desempeñan una importante función puesto que se ha descrito que las mutaciones de la subunidad α del canal Nav 1.8 pueden ocasionar patologías renales en humanos (Nettuwakul et al., 2018). Por ende, la actividad nefrotóxica de la TTX está en consonancia con la inervación predominante en el riñón, que se atribuye a las neuronas que contienen principalmente las isoformas Nav1.7 (sensibles a TTX), Nav1.8 y Nav1.9 (resistentes a TTX) de los canales de sodio dependientes de voltaje (Freisinger et al., 2013), lo que llevó a proponer que el bloqueo de los canales de sodio dependientes de voltaje por la TTX era la responsable de los efectos nefrotóxicos descritos tras la administración oral repetida de la toxina. Por último, en este mismo trabajo se confirmó un efecto cardiotóxico de la toxina puesto que se apreciaron incrementos significativos de la enzima creatina quinasa (CK) en sangre con respecto a los ratones control. Inicialmente, se pensó que el aumento de los niveles sanguíneos de CK podría derivarse tanto de lesiones en el músculo cardíaco, como en el músculo esquelético, sin embargo , la observación del miocardio de los ratones tratados con 125 µg/kg de TTX mediante microscopia electrónica desveló una vacuolización multifocal del músculo cardíaco, principalmente en el área subsarcolemal, así como una dilatación del retículo sarcoplasmático y una desintegración y desorganización de las miofibrillas cardíacas. Estas alteraciones estructurales del corazón denotan la toxicidad cardíaca derivada de la administración de TTX en ratones, un efecto similar al descrito previamente también tras la intoxicación en humanos (Zimmer, 2010). La TTX es un potente inhibidor de la isoforma Nav1.4 del canal de sodio dependiente de voltaje (a concentraciones nanomolares) que predomina en el músculo esquelético, pero son necesarias concentraciones micromolares de tetrodotoxina para bloquear la isoforma Nav1.5 que es la predominante en el corazón (Zimmer et al., 2014). Asimismo, el bloqueo de los canales de sodio dependientes de voltaje desencadena cuadros gastrointestinales, neurológicos y cardíacos en los pacientes intoxicados debido a que la TTX afecta al músculo esquelético, al sistema digestivo y al sistema respiratorio y cardiovascular. Toda esta información sugiere que los efectos nefrotóxicos y cardiotóxicos tras la ingestión de pequeñas cantidades de tetrodotoxina durante un largo periodo de tiempo no son desdeñables, no obstante, estos hechos no excluyen la toxicidad en otros sistemas tanto a nivel local como sistémico, por ello es preciso realizar más estudios para determinar de forma exhaustiva los efectos potenciales que puede tener la exposición de los humanos a bajas dosis de tetrodotoxina durante largos periodos de tiempo. Con todo, los hallazgos presentados en este trabajo constituyen el Discusión 101 primer estudio de los efectos a largo plazo de la administración oral de la TTX, que se demostró que eran dependientes de la dosis y provocaban efectos en el sistema cardiovascular y renal en un contexto en el que se había establecido un NOAEL de 75 µg/kg para los estudios de toxicidad aguda (Abal et al., 2017). Este trabajo se realizó en un escenario en el que la EFSA había solicitado datos sobre la toxicidad subcrónica y crónica de la TTX y sus análogos, con el objetivo futuro de poder establecer recomendaciones sobre los niveles permitidos de esta toxina emergente en productos pesqueros (EFSA, 2017; Katikou, 2019). Actualmente, no se han establecido límites legales para la presencia de TTX en alimentos de origen marino, y además esta toxina no se monitoriza de forma rutinaria en los productos pesqueros de la UE, salvo en los Países Bajos donde en 2016 se introdujeron medidas sanitarias nacionales fijando un límite de 20 µg de TTX/kg de carne de molusco para garantizar la seguridad de los consumidores (European Commission, 2016; Gerssen et al., 2018). Posteriormente, la Comisión Europea solicitó al Panel de Contaminantes de la Cadena Alimentaria de la EFSA que diera su opinión al respecto, y en este marco, gracias a los estudios de toxicidad aguda donde se estableció una LD50 de 232 µg/kg de TTX y un NOAEL de 75 µg/kg (Abal et al., 2017), la EFSA recomendó una dosis de referencia de 44 µg/kg de toxina, basándose en una porción de 400 g de bivalvo. Es decir, con los datos de toxicidad aguda por vía oral, llegó a concluir que 44 µg de TTX por kg para mariscos era una concentración de toxina suficientemente baja para preservar la salud de las personas (EFSA, 2017). En vista de la toxicidad crónica por vía oral de la TTX, observada en el anterior artículo, y puesto que la dosis de referencia recomendada por la EFSA era solamente tres veces menor que la dosis de toxina que producía alteraciones renales y cardíacas tras la administración repetida, en el siguiente estudio, se evalúa el efecto que tiene la administración crónica por vía oral de la TTX a las dosis propuestas por la EFSA como seguras. Los resultados obtenidos se recogieron en la publicación titulada “Oral chronic toxicity of the safe tetrodotoxin dose proposed by the European Food Safety Authority and its additive effect with saxitoxin”. Una vez más, el planteamiento de estos ensayos siguió las directrices internacionales de la OECD, pero a mayores, también se evaluaron los riesgos asociados al consumo de productos pesqueros contaminados con toxinas que comparten el mecanismo de acción y además pueden coexistir en el mismo vector, como es el caso de la tetrodotoxina y las toxinas paralizantes (Pinto et al., 2019), por ello, se combinó la administración oral repetida a ratones de una combinación de tetrodotoxina a la dosis de 44 µg/kg con diferentes dosis de saxitoxina durante 28 días. El efecto aditivo de la toxicidad de ambos compuestos ya se había señalado en estudios agudos (Finch et al., 2018), pero este estudio fue el primero que evaluó los efectos a largo plazo derivados de la administración oral de combinaciones de TTX con STX. En conjunto, los datos presentados en esta tesis doctoral indicaron que la exposición oral subcrónica de ratones a TTX (en los niveles de seguridad establecidos por la EFSA) no provocó efectos importantes sobre el comportamiento animal ni sobre los marcadores bioquímicos en sangre. Si bien, se observaron algunas desviaciones en los niveles sanguíneos de algunas enzimas como la creatina quinasa, hecho relevante, sobre todo teniendo en cuenta que es poco probable que se alcance este nivel de ANDREA BOENTE JUNCAL 102 exposición de los seres humanos a la tetrodotoxina, puesto que en los programas de monitoreo de este compuesto, que abarcan desde el 2015 al 2017, la concentración más alta de TTX alcanzó los 253 µg/kg en ostras y los 101 µg/kg en mejillones (Gerssen et al., 2018). Por otro lado, además se analizó en este trabajo el efecto tóxico de la presencia simultánea de TTX y STX y se demostró que los efectos toxicológicos de ambas toxinas presentan una dificultad adicional para la seguridad alimentaria y, por ende, para la salud pública, puesto que los resultados obtenidos indicaron los posibles efectos nocivos de la concentración segura de TTX combinada con STX. Estos datos tienen que ser examinados en relación con el riesgo que supone la TTX y la STX para la seguridad alimentaria, donde para el caso de la STX el consumo de una ración de 400 g de carne de molusco, de acuerdo con el límite máximo permitido de 800 μg de STX por kg de carne de molusco (European Comision, 2004) puede suponer una dosis de toxina de 5.3 µg/kg para una persona de 60 kg (EFSA, 2009b), y permiten sugerir que tanto los límites de TTX sugeridos por la EFSA como los límites de STX vigentes en la legislación son suficientemente amplios para garantizar la seguridad de los productos pesqueros, incluso en el caso de la ingesta diaria de alimentos que contengan ambas toxinas. Paralelamente a estos estudios in vivo, en la presente tesis doctoral también se pretendió averiguar las posibles repercusiones que conllevaría la expansión de la palitoxina, otra de las protagonistas emergentes de las costas europeas que todavía no está regulada (European Comision, 2004). Esta toxina puede causar intoxicaciones mortales en humanos asociadas con el consumo de pescado y mariscos contaminados (Tubaro et al., 2011a; Wu et al., 2014; Vilariño et al., 2018). La producción de PLTX está asociada a dinoflagelados bentónicos del género Ostreopsis (Patocka et al., 2018), se ha puesto de manifiesto. Durante la última década, los organismos productores de esta toxina que antes solían encontrarse en áreas tropicales, se han distribuido hacia aguas templadas y se han identificado en algunos países europeos (Fraga et al., 2017; Soliño et al., 2020). El cometido de esta investigación se centró en evaluar la toxicidad de bajas concentraciones de toxina por vía oral, para llevarlo a cabo, previamente fue necesario establecer un punto de partida sobre la base de los ensayos agudos. En el momento de plantear el estudio, solo existían dos trabajos que caracterizaban la toxicidad aguda de la palitoxina y de sus análogos por vía oral (Sosa et al., 2009; Tubaro et al., 2011b). En este contexto, la EFSA evaluó los riesgos para la salud humana relacionados con la presencia de palitoxina y publicó una opinión sobre PLTX (EFSA, 2009a) concluyendo que la base de datos toxicológica para el grupo de toxinas del grupo de la PLTX era limitada. Se estableció una dosis de referencia aguda (ARfD) en humanos de 0.2 μg/kg de peso corporal para el sumatorio de la PLTX y su análogo, la ostreocina-D. De acuerdo con este dictamen, una porción de 400 g de carne de marisco no debe contener más de 12 μg de la suma de PLTX y ostreocina-D, lo que supondría un límite de 30 μg de palitoxina y análogos por kg de carne de marisco. Los escasos datos existentes sobre la toxicidad aguda por vía oral de la palitoxina y sus análogos, en consonancia con el corto periodo de observación de los animales después de la administración de la toxina (24 h), y las recomendaciones de la OECD que fomentan el aumento del periodo de monitorización de los animales para evaluar la Discusión 103 toxicidad de los compuestos químicos (OECD, 2008a), justificaron la realización del estudio de la toxicidad aguda por vía oral de la palitoxina, para de este modo, poder llevar a cabo con posterioridad los estudios de toxicidad a largo plazo inexistentes hasta el momento, con el objetivo de emplear toxinas y protocolos uniformes que permitiesen hacer un estudio toxicológico detallado. A este respecto, se publicó el artículo titulado “Reevaluation of the acute toxicity of palytoxin in mice: determination of lethal dose 50 (LD50) and No-observed-adverse-effect level (NOAEL)”. En esta investigación se evaluó la toxicidad aguda de PLTX, tanto después de la administración oral de una sola dosis mediante sonda gástrica, como después de la administración de una dosis por vía intraperitoneal estableciendo un período de observación de los animales de cuatro días después de la administración. La información obtenida permitió calcular una dosis letal 50 (LD50) oral para PLTX de 599 μg/kg, resultado que concuerda con los trabajos publicados previamente tras periodos de observación de los animales más cortos (Munday, 2006; Sosa et al., 2009; Munday, 2011; Del Favero et al., 2013). No obstante, el NOAEL oral establecido en este estudio fue aproximadamente diez veces menor que el publicado previamente (Sosa et al., 2009), hecho relevante puesto que se observaron efectos adversos después de la administración de PLTX a dosis de 36 μg/kg mientras que a la dosis más baja evaluada (15 μg/kg) no se detectaron efectos adversos. Asimismo, las determinaciones bioquímicas realizadas durante este trabajo demostraron la existencia de alteraciones de los parámetros sanguíneos después de la administración de una sola dosis de 36 μg/kg de palitoxina, en contraste con el artículo anterior que describía alteraciones sanguíneas después de dosis orales únicas de 300 μg/kg de PLTX (Sosa et al., 2009). Además, las modificaciones observadas tras la administración oral e intraperitoneal de PLTX a ratones, fueron similares a las descritas en humanos tras la exposición cutánea a PLTX (Pelin et al., 2016) que causó niveles elevados de CK y lactato deshidrogenasa que se atribuyeron en principio al desarrollo de los síntomas producidos en humanos por la toxina y que incluyen mialgias y alteraciones musculares. Igualmente, en el análisis ultraestructural de los tejidos de los ratones tratados por vía oral con 500 y 750 μg/kg de PLTX se observaron por primera vez cambios sustanciales en el hígado y en el riñón, y se puso de manifiesto que una única dosis oral de PLTX podía causar alteraciones hepáticas y renales después de 96 horas post-ingestión. La mayor toxicidad de la PLTX relatada en este estudio podría atribuirse, al menos en parte, a los períodos de observación más prolongados empleados en este trabajo (96 h frente a 24 h en el estudio anterior). Con todo, los datos de toxicidad aguda para la PLTX recogidos en este estudio proporcionaron una evaluación sintomatológica, bioquímica, y funcional de los efectos de la toxina por vía oral, además de recoger los efectos ultraestructurales para los órganos afectados, y constituyó el primer artículo en el que se describieron estas alteraciones después de la administración oral de una dosis única de 750 µg/kg de palitoxina. Además, la relevancia de este estudio en el contexto de la presente tesis doctoral, se basa en que los datos obtenidos constituyeron el punto de partida para poder realizar la evaluación toxicológica derivada de la administración prolongada de palitoxina por vía oral, cuyos resultados se han publicado en el trabajo “In vivo evaluation of the chronic oral toxicity of the marine toxin palytoxin”. Los ANDREA BOENTE JUNCAL 104 resultados obtenidos en este trabajo constituyeron el primer estudio en el que se evaluó la toxicidad subcrónica de esta potente toxina marina siguiendo las recomendaciones de la OCDE, cuyo método se basa la administración oral repetida de la sustancia de interés durante un período limitado de 28 días (OECD, 2008a). El trabajo realizado proporcionó información sobre la condición general de los animales después de la administración oral de distintas dosis de toxina durante el tiempo en el que se extendió el experimento (28 días), una necropsia detallada para evaluar cómo afectaba la toxina a determinados órganos, así como un análisis histológico y ultraestructural de los órganos con alteraciones perceptibles. Los resultados obtenidos mostraron unos índices toxicológicos muy diferentes a los obtenidos para el caso de la exposición única por vía oral a la toxina, y en este caso se calculó una LD50 oral de 0.44 µg/kg (en contraste con la LD50 de 599 μg/kg obtenida en el trabajo anterior después de la administración de una sola dosis de toxina por vía oral) y un NOAEL de 0.03 µg/kg tras la exposición repetida de los ratones a la PLTX mientras que con una sola dosis de toxina por vía oral el NOAEL determinado fue de 15 µg/kg. Dada la ubicuidad y la expansión de esta toxina, actualmente es crucial considerar un escenario en el que puedan surgir exposiciones sucesivas a bajas dosis de PLTX, especialmente para aquella población cercana a zonas costeras afectadas por floraciones algales donde cohabitan las microalgas del género Ostreopsis. Aunque no se ha considerado en el presente estudio de toxicidad, la PLTX puede provocar intoxicaciones en humanos introduciéndose por otras vías como por vía dérmica, respiratoria e intraocular (Wieringa et al., 2014; Hall et al., 2015; Murphy and Charlton, 2017; Thakur and Jha, 2017; Barbany et al., 2019; Gaudchau et al., 2019). Hasta la realización de este trabajo se habían publicado datos estableciendo diferentes índices toxicológicos para la PLTX, pero en los que no se tenía en cuenta la pureza de las toxinas empleadas ni se seguían protocolos validados para determinar la toxicidad de los compuestos químicos. Por ello, se consideró necesario el empleo de métodos estandarizados, y aprobados internacionalmente, como es el caso de las guías de la OECD para realizar los ensayos, así como el uso de material certificado de referencia para poder obtener datos fiables y repetibles que permitiesen establecer una base científica sólida para instaurar una correcta caracterización del riesgo, y fijar los límites de biotoxinas marinas emergentes en aguas europeas. De hecho, diversos autores habían descrito un NOAEL de 300 µg/kg para la palitoxina y dosis letales 50 que oscilaban entre 510 µg/kg (Munday, 2006) y 767 µg/kg tras de la administración oral única de palitoxina después de un periodo de observación de 24 h (Sosa et al., 2009). Mientras en otros estudios publicados no se observaron muertes en los ratones después de administrar la ostreocina-D a dosis de 200 y 300 µg/kg, pero sí que se habían observado alteraciones estructurales en el estómago (Ito and Yasumoto, 2009). Previamente, se había descrito que la letalidad oral de la toxina aumentaba después de la administración de dosis sucesivas, disminuyendo el NOAEL hasta 3 µg/kg tras la administración de PLTX durante 7 días (Del Favero et al., 2013), pero sin embargo, no existían en la literatura datos toxicológicos adicionales sobre la toxicidad in vivo de la PLTX después de tratamientos más prolongados. Por consiguiente, en este contexto, los datos presentados en este trabajo constituyen el primer enfoque inicial para la evaluación Discusión 105 subcrónica de la toxicidad de la PLTX después de la ingestión diaria de productos de la pesca contaminados. Además, hasta el momento, este fue el primer trabajo publicado sobre la toxicidad oral de esta potente toxina marina siguiendo las recomendaciones de la OCDE para evaluar la toxicidad subcrónica de los productos químicos (OECD, 2008a). En resumen, los datos obtenidos sobre la toxicidad oral de la palitoxina permitieron concluir que después de una administración diaria de PLTX durante 28 días, la tasa de mortalidad de los animales obtenida era del 75% después de la administración oral de PLTX a dosis de 3.5 µg/kg. También se observó, que la exposición de los ratones a palitoxina a dosis bajas (1 µg/kg) por vía oral producía importantes cambios ultraestructurales en el estómago que aparecían ya a los 9 días después del inicio del tratamiento, así como signos de intoxicación en los animales, algunos de los cuales se iniciaron ya al tercer día de tratamiento. Además, mediante microscopía electrónica se observaron alteraciones de las células mucosas y parietales del estómago, que llevaron a sugerir que la PLTX probablemente produce erosión y desprendimiento del epitelio gástrico, lo que está en consonancia con trabajos previos donde se recogieron los efectos citotóxicos de esta toxina sobre células intestinales (Fernández et al., 2013; Reale et al., 2019). Estas alteraciones podrían ser originadas por una deficiencia de nutrientes, hecho que estaría en concordancia con la pérdida de peso de los animales que se observó ya después de la administración oral de PLTX a dosis de 1 y 3.5 µg/kg. En vista del prominente aumento de la toxicidad después de la exposición repetida de los animales a PLTX, se estableció un NOAEL de 0.03 µg/kg para la PLTX, muy inferior al observado tras la administración de una sola dosis de toxina por vía oral, pero que fue la dosis de toxina más baja a la que no se apreciaron alteraciones macroscópicas en los órganos de los animales ni tampoco alteraciones funcionales en ninguno de los ratones tratados con esta dosis de toxina. Sin embargo, hay que reseñar que incluso a la dosis más baja de toxina empleada se apreció una ligera hiperpotasemia que apareció en dos de cinco animales tratados con 0.03 µg/kg de palitoxina, estas modificaciones están en consonancia con estudios previos que recogieron los cambios en electrolitos después de la administración de PLTX (Tubaro et al., 2011b; Del Favero et al., 2013; Boente-Juncal et al., 2020b). A la vista de estos resultados y del incremento creciente de floraciones algales de Ostreopsis en Europa (David, 2012; Katikou and Vlamis, 2014; Gémin et al., 2020), se evidencia la necesidad de realizar más estudios crónicos sobre la toxicidad oral in vivo de esta potente toxina marina, con el fin de prevenir patologías a largo plazo en humanos y regular con precisión los niveles de esta toxina marina emergente en los alimentos. Otro grupo de toxinas marinas no reguladas cuya distribución geográfica está en aumento, y que se aborda en la presente tesis doctoral, son las iminas cíclicas. Actualmente, han aparecido numerosos episodios de floraciones de microalgas productoras de iminas cíclicas y se ha descrito su presencia en productos pesqueros, en especial, en moluscos bivalvos (Rambla-Alegre et al., 2018; Otero et al., 2020; Silva et al., 2020). Pese a encontrarse habitualmente en productos comercializados en Europa, en la actualidad no existe regulación para las toxinas pertenecientes al grupo de las ANDREA BOENTE JUNCAL 112 datos de exposiciones agudas, resalta la necesidad de estudios toxicológicos a largo plazo para garantizar la seguridad de los productos pesqueros. 8. Los espirólidos a concentraciones nanomolares previenen la neurotoxicidad inducida en células madre neuronales humanas lo que convierte estos compuestos en moléculas con potencial terapéutico en enfermedades neurodegenerativas. 9. Los azaspirácidos, a concentraciones nanomolares, disminuyen la amplitud de las corrientes de sodio dependientes de voltaje, de forma dependiente de la concentración sin afectar a la inactivación del canal de sodio tanto en exposiciones agudas de las células a la toxina como en tratamientos más prolongadas. 10. La exposición prolongada de células humanas a concentraciones nanomolares de azaspirácidos produce alteraciones en los canales aniónicos que se reflejan en un incremento en la intensidad de las corrientes de cloro dependientes de voltaje, efecto en el que participan los canales aniónicos regulados por volumen. 113 7. BIBLIOGRAFÍA Aasen J, MacKinnon SL, LeBlanc P, Walter JA, Hovgaard P, Aune T, Quilliam MA (2005) Detection and identification of spirolides in norwegian shellfish and plankton. Chemical research in toxicology 18:509-515. Abal P, Louzao MC, Antelo A, Alvarez M, Cagide E, Vilariño N, Vieytes MR, Botana LM (2017) Acute Oral Toxicity of Tetrodotoxin in Mice: Determination of Lethal Dose 50 (LD50) and No Observed Adverse Effect Level (NOAEL). Toxins 9. Ahasan HA, Mamun AA, Karim SR, Bakar MA, Gazi EA, Bala CS (2004) Paralytic complications of puffer fish (tetrodotoxin) poisoning. Singapore medical journal 45:73-74. 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