Estudio de enzimas clave en el metabolismo energético del ciliado parásito del rodaballo Philasterides dicentrarchi: ¿posibles dianas terapéuticas para el desarrollo de fármacos frente a la escuticociliatosis?

Universidad de Santiago de Compostela Departamento de Microbiología y Parasitología Instituto de Investigaciones y Análisis Alimentarios Laboratorio de Parasitología “Estudio de enzimas clave en el metabolismo energético del ciliado parásito del rodaballo Philasterides dicentrarchi: ¿posibles dianas terapéuticas para el desarrollo de fármacos frente a la escuticociliatosis?” Memoria presentada para optar al grado de Doctora en Biología por: Natalia Mallo Seijas Santiago de Compostela, septiembre de 2015 José Manuel Leiro Vidal, Catedrático de Parasitología del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela y Jesús Lamas Fernández, Profesor Titular del Área de Biología Celular, del Departamento de Biología Celular y Ecología de la Universidad de Santiago de Compostela Certifican: Que la presente Tesis Doctoral titulada: “Estudio de enzimas clave en el metabolismo energético del ciliado parásito del rodaballo, Philasterides dicentrarchi: ¿posibles dianas terapéuticas para el desarrollo de fármacos frente a la escuticociliatosis?” que, para optar al grado de Doctora en Biología, presenta Doña Natalia Mallo Seijas, ha sido realizada en el Departamento de Microbiología y Parasitología del Instituto de Investigaciones y Análisis Alimentarios bajo nuestra dirección y que, considerándola concluida, autorizamos su presentación a fin de que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Santiago de Compostela, septiembre de 2015 Fdo: José Manuel Leiro Vidal Fdo: Jesús Lamas Fernández Fdo: Natalia Mallo Seijas Los resultados expuestos en la presente Tesis Doctoral han sido publicados o están pendientes de publicación, en los siguientes artículos de investigación: Mallo, N., Lamas, J., Leiro, J. (2013). Evidence of an alternative oxidase pathway for mitochondrial respiration in the scuticociliate parasite Philasterides dicentrarchi. Protist, 164: 824-836. Mallo, N., Lamas, J., Leiro, J. (2014). Alternative oxidase inhibitors as antiparasitic agents against scuticociliatosis. Parasitology, 141(10): 1311-1321. Mallo, N., Lamas, J., Piazzón, C, Leiro, J. (2015). Presence of a plant-like proton-translocating pyrophosphatase in a scuticociliate parasite and its role as a possible drug target. Parasitology, 142(3):449-62. Mallo, N., Lamas, J., de Felipe, A.P., de Castro, M.E., Sueiro, R.A., Leiro, J.M. Characterization and physiological role of an isoform of H+- pyrophosphatase located in the alveolar sacs of a scuticociliate parasite (enviado a Journal of Eukaryotic Microbiology el 28/07/15). Mallo, N., Lamas, J., de Felipe, A.P., Sueiro, R.A., Fontenla F., Leiro, J. Regulation of intracellular pH in a histiophagous scuticociliate parasite of turbot and its physiological transcendence (pendiente de ser enviado). Mallo, N., Lamas, J., de Felipe, A.P., Sueiro, R.A., Fontenla F., Leiro, J. Pyrophosphate and calcium metabolism enzymes as chemotherapeutic targets against turbot escuticociliatosis (pendiente de ser enviado).  A mi familia “La inspiración existe, pero tiene que encontrarte trabajando." Pablo Picasso Agradecimientos  Me gustaría expresar mi gratitud a los profesores José Manuel Leiro Vidal y Jesús Lamas Fernández, por darme la oportunidad de desarrollar este trabajo, y cuya experiencia, apoyo, paciencia y dedicación han sido fundamentales para que se llevase a cabo. Por otra parte, quería agradecer su colaboración a Mª Eugenia de Castro y Mª Isabel González Siso del Departamento de Biología Celular y Molecular de Facultad de Ciencias de la Universidad de A Coruña. También me gustaría dar las gracias por su ayuda a todos los compañeros que he tenido durante estos años; a Belén, Raquel, Fany, Laura y Manolo, por sus ánimos, a Mónica, Jonal, Patri, Pedro, Marcela, Silvana, Tania, Berta, Nuria, Iria, Eva, Fran, Vero y Sergio, con los que he pasado muy buenos ratos y de los que he aprendido mucho, sobre todo de Carla, a la que he freído a preguntas en su día con mis ya clásicos “berenjenales”, y a Rosa Ana, Eva y Paula, en las que además me he apoyado mucho en la última etapa de escritura . Muchas gracias por vuestra ayuda y vuestros ánimos, como soy un “toxiño” no voy a dejar aquí escrito nada emotivo con lo que luego me podáis vacilar… Especialmente, quiero agradecer a mi familia el apoyo sin el cual me habría sido imposible llegar al finalizar este trabajo. Y a los que no sois mi familia pero como si lo fueseis: calabazas, os llevo en el corazón. La realización de la presente memoria de Tesis Doctoral ha sido posible gracias al aporte económico recibido a través de subvenciones concedidas por diversos organismos públicos y privados y que se relacionan a continuación: PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN EN CONVOCATORIAS COMPETITIVAS 1. IMPROVEMENT OF AQUACULTURE PRODUCTION BY THE USE OF BIOTECHNOLOGICAL TOOLS. (MEJORA DE LA PRODUCCIÓN EN ACUICULTURA MEDIANTE HERRAMIENTAS DE BIOTECNOLOGÍA) Agradecimientos  (AQUAGENOMICS). Ayudas de financiación estratégica de programas de actividad investigadora efectuadas por equipos de investigación de alto nivel, en el marco del Programa Consolider-Ingenio 2010. Convocatoria 2007. Ministerio de Educación y Ciencia. Referencia: CSD2007-00002. 2. CONTROL Y SEGUIMIENTO DE ENFERMEDADES BACTERIANAS Y PARASITARIAS EN UN SISTEMA DE RECIRCULARIZACIÓN EN ACUICULTURA. INCITE-Programas sectoriales de investigación aplicada, PEME+I+D e I+D Suma, de la Xunta de Galicia. Convocatoria de proyectos I+D liderados por empresas privadas. Entidad solicitante: Aquacria S.L. Código 08MMA018E. 3. CARACTERIZACIÓN DE LA VARIABILIDAD INTRAESPECÍFICA EN ESCUTICOCILIADOS DEL RODABALLO Y BÚSQUEDA DE ANTÍGENOS PROTECTORES PARA SU DIAGNÓSTICO Y CONTROL. Programa Nacional de Proyectos de investigación Fundamental, VI Plan Nacional de Investigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica 20082011. Ministerio de Ciencia e Innovación. Código del Proyecto: AGL2010-21219. 4. ADVANCED TOOLS AND RESEARCH STRATEGIES FOR PARASITE CONTROL IN EUROPEAN FARMED FISH. PARAFISHCONTROL. Strategic objetive: SFS-10a-2014 –Scientific basis and tools for preventing and mitigating parasitic diseases of European farmed fish. Horizon 2020 – Research and Innovation Framework Programme. Proposal number: 634429-2. 5. DISEÑO Y ELABORACIÓN DE NUEVAS VACUNAS QUE PERMITAN UNA MAYOR PROTECCIÓN E INOCUIDAD FRENTE A ESCUTICOCILIADOS PARÁSITOS DEL RODABALLO. Proyecto I+D+i, Programa estatal de Investigación, Desarrollo e Innovación orientada a los retos de la sociedad, Convocatoria 2014. Ministerio de Economía y Competitividad. Referencia: AGL2014-57125-R. AYUDAS A PROGRAMAS DE CONSOLIDACIÓN Y ESTRUCTURACIÓN DE UNIDADES DE INVESTIGACIÓN COMPETITIVAS DEL SISTEMA UNIVERSITARIO DE GALICIA (SUG): SOLICITANTE: JOSÉ BLANCO MÉNDEZ MODALIDAD: GRUPOS CON POTENCIAL DE CRECIMIENTO (GPC) Nº EXPEDIENTE: GPC2014/069 INICIO-FIN: 2014-2016 Agradecimientos  ENTIDAD SUBVENCIONADORA: CONSEJERÍA DE CULTURA, EDUCACIÓN Y ORDENACIÓN UNIVERSITARIA. DIRECCIÓN GENERAL DE PROMOCIÓN CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA DEL SISTEMA UNIVERSITARIO DE GALICIA (XUNTA DE GALICIA). PROGRAMA DE CONSOLIDACIÓN Y ESTRUCTURACIÓN DE UNIDADES DE INVESTIGACIÓN COMPETITIVAS. AYUDA DE FORMACIÓN DE PERSONAL INVESTIGADOR Beca de Formación de Personal Investigador (FPI) de la Dirección General de Investigación y Gestión del Plan Nacional de I+ D + i del Ministerio de Ciencia e Innovación (BES-2011-043910), asociada al proyecto: Caracterización de la variación intraespecífica en escuticociliados del rodaballo y búsqueda de antígenos protectores para su diagnóstico y control (AGL2010-21219).  Abreviaturas ADN: ácido desoxirribonucleico ADNc: ácido desoxirribonucleico complementario ADP: adenosín difosfato AMA: antimicina A AMDP: aminometilendifosfonato Aminoácido: aa AOX: oxidasa alternativa ARN: ácido ribonucleico ARNm: ácido ribonucleico mensajero ARNr: ácido ribonucleico ribosómico ART: artemisinina ATP: adenosín trifosfato BALB/c: línea de ratones Bagg Albino BSA: seroalbúmina bovina CM -TRP: medio completo sin triptófano COL: colaboradores COX: citocromo c oxidasa CQ: cloroquina CTE: cadena de transporte de electrones DAB: 3,3’-diaminobenzidina DAPI: 4 ',6-diamino-2-fenilindol DEPC: dietilpirocarbonato DIG: digitonina DMSO: dimetilsulfóxido Abreviaturas dNTP: desoxinucleótidos trifosfato DPBS: tampón fosfato salino Dulbeco. DTT: ditiotreitol EDTA: ácido etilendiaminotetraacético EGTA: ácido etilenglicoltetraacético ELISA: enzyme-lynked immunosorbent assay FADH2: Flavin adenin deshidrogenasa FBS: suero fetal bovino FCA: Adyuvante completo de Freund FITC: isotiocianato de fluoresceína G: glutamato IC50: concentración inhibitoria que provoca el 50% de la mortalidad. ICR/CD-1: línea de ratones, Institute for Cancer Research Caesarian Derived-1 Ig: inmunoglobulina HBSS: solución salina balanceada de Hanks. HRP: Peroxidasa de rábano (horseradish peroxidase) Hsp70: proteínas de choque térmico 70 IPTG: isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido KCN: cianuro potásico kDa: kiloDaltons KLH: Keyhole Lympet Hemocyanin L15: Medio de cultivo Leivobitz -15 LB: Luria Broth Índice  6.5.1.- Regulación de los niveles de Ca+2 en los acidocalcisomas y vacuolas 46 6.6.- PPasas inorgánicas 47 6.6.1.- Clasificación y funcionamiento de las PPasas 48 6.6.2.- Distribución de las H+-PPasas 49 6.6.3.- Estructura y regulación de las H+-PPasas 50 6.6.4.- Localización, funciones de las H+-PPasas y regulación de su expresión 53 7.- Búsqueda de agentes quimioterapéuticos frente a la escuticociliatosis 55 7.1.- Agentes antioxidantes 55 7.1.1.- Propil galato 56 7.1.2.- Resveratrol 56 7.2.- Análogos del PPi 58 7.3.- Agentes antimaláricos 60 7.3.1.- Artemisinina 60 7.3.2.- Cloroquina 62 Objetivos 65 Material y métodos 69 1.- Animales de experimentación 69 1.1.- Rodaballos 69 1.2.- Ratones 69 1.3.- Ciliados: Bioética 69 2.- Reactivos químicos 70 3.- Técnicas parasitológicas 70 3.1.- Parásitos 70 3.1.1.- Ciliados: Philasterides dicentrarchi. Cultivo e infecciones experimentales 70 3.1.2.- Apicomplejos: Plasmodium berghei. Infecciones experimentales y obtención del parásito 71 3.1.2.1. Tinción de glóbulos rojos 72 3.2.- Microscopía electrónica de transmisión (TEM) 72 3.3.- Determinación de la actividad antiparasitaria en los ciliados 73 4.- Técnicas de Biología Molecular 74 4.1.- Purificación de ácidos nucleicos 74 4.2.- Obtención de ADNc 75 4.3.- PCR y RT-PCR 75 Índice  4.4.- RT-PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) 76 4.5.- RACE-PCR (rapid amplification of cDNA ends) 77 5.- Técnicas inmunológicas 78 5.1Producción antígenos, proteínas recombinantes y péptidos sintéticos 78 5.1.1.- Extracción de proteínas totales de P. dicentrarchi 78 5.1.2.- Extracción de proteínas de membrana de P. dicentrarchi 79 5.1.3.- Construcciones plasmídicas para producción de vacunas de ADN. 80 5.1.4.- Producción proteínas recombinantes en vector pET21d 81 5.1.5.- Producción de proteínas recombinantes en levadura 84 5.1.6.- Síntesis péptidíca 86 5.1.7.- Determinación de la concentración proteica 87 5.2.- Inmunizaciones y obtención de los sueros policlonales 87 5.2.1.- Inmunización genética 87 5.2.2.- Inmunización con proteínas/péptidos 87 5.2.3.- Obtención del suero 88 5.3.- Inmunoensayos 88 5.3.1.- Determinación de los niveles de anticuerpos en el suero 88 5.3.1.1.- ELISA 88 5.3.2.- Immunoblot / Western blot 5.3.2.1.- Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDSPAGE) 89 89 5.3.2.2.- Western blot 89 5.3.3.- Inmunohistoquímica 92 5.3.3.1.- Inmunohistoquímica al microscopio óptico 92 5.3.3.2.- Inmunohistoquímica al microscopía inmunoelectrónico 93 5.3.4.- Inmunofluorescencia 94 6.- Técnicas bioquímicas 95 6.1.- Técnicas para el estudio de la función mitocondrial 95 6.1.1.- Determinación del consumo de oxígeno mitocondrial 95 6.1.2.- Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) 96 6.2.- Actividad translocadora de H+ dependiente de pirofosfato 97 6.3.- Técnicas de análisis del pH intracelular: tinciones fluorescentes con colorantes sensibles al pH 100 Índice  6.4.- Determinación del calcio intracelular 100 6.5.- Determinación de los niveles de PPi 101 7.- Análisis filogenéticos, bioinformáticos y estadísticos 102 7.1.- Análisis filogenéticos 102 7.2.-Análisis Bioinformático 103 7.3.- Análisis estadístico 104 Resultados 107 1.- Estudio de la existencia de una oxidasa alternativa (AOX) en la respiración mitocondrial de P. dicentrarchi y su modulación 107 1.1Crecimiento in vitro de P. dicentrarchi bajo condiciones de normoxia e hipoxia 107 1.2.- Presencia de una ruta alternativa de la respiración mitocondrial en P. dicentrarchi 108 1.3.- Efecto antiparasitario del SHAM en condiciones de normoxia e hipoxia 109 1.4.- Identificación inmunoquímica de una AOX insensible al cianuro en P. dicentrarchi 111 1.5.- Efecto de los inhibidores de cadena de respiración mitocondrial en la expresión de la AOX en P. dicentrarchi 112 1.6.- Consumo de O2 y expresión de la AOX después de una infección de P. dicentrarchi en rodaballo 113 1.7.- Consumo de oxígeno y nivel de expresión de la AOX durante el cultivo in vitro de P. dicentrarchi 114 2.- Inhibidores de la oxidasa alternativa como agentes antiparasitarios frente a la escuticociliatosis 117 2.1.- Efecto de los antioxidantes propilgalato y resveratrol en la respiración del ciliado 117 2.2.- Efecto del PG en la expresión de la AOX 119 2.3.- Efecto antiparasitario de PG y AMA en el crecimiento in vitro de P. dicentrarchi 119 2.4.- Efecto de los antioxidantes PG y RESV en la expresión de la AOX 122 2.5.- Efecto de los antioxidantes en el potencial de membrana mitocondrial 122 2.6.- Efecto de los antioxidantes en la expresión de chaperonas Hsp70 123 2.7.- Expresión de la AOX en diferentes cepas de P. dicentrarchi 125 Índice  3.- Estudio de la existencia de una H+-PPasa en P. dicentrarchi y su función como posible diana quimioterapéutica 126 3.1.- Identificación de ADNc que codifica para una pirofosfatasa en P. dicentrarchi 126 3.2.- Caracterización de la H+-PPasa de P. dicentrarchi 127 3.3.- Análisis filogenético de la H+-PPasa de P. dicentrarchi 131 3.4.- Caracterización bioquímica de la H+-PPasa en P. dicentrarchi 133 3.5.- Localización subcelular de la H+-PPasa en P. dicentrarchi 135 3.6.- Efecto del NaF y los bisfosfonatos en la translocación de H+ dependiente de PPi y expresión génica 136 4.- Caracterización y papel fisiológico de una isoforma de la H+-PPasa localizada en los sacos alveolares de P. dicentrarchi 138 4.1.- Características de la secuencia de las isoformas de la H+-PPasa 138 4.2.- Marcaje inmunohistoquímico de la H+-PPasa con el anticuerpo policlonal (PABHK) 140 4.3.- Inmunolocalización celular de la H+-PPasa de P. dicentrarchi en compartimentos ácidos 141 4.4.- Análisis filogenético de la H+-PPasa en 7 aislados de P. dicentrarchi 143 4.5.- Efecto de la concentración de NaCl en la expresión de la H+-PPasa 144 5.- Modulación del pH intracelular en P. dicentrarchi en diferentes condiciones fisiológicas 145 5.1.- Presencia de calcio en orgánulos ácidos en P. dicentrarchi 145 5.2.- Efecto del ATP en la actividad translocadora de protones 148 5.3.- Efecto del calcio en la actividad translocadora de protones 150 5.4.- Influencia del calcio y el ATP en la expresión génica de la H+-PPasa 152 5.5.- Efecto del calcio y el ATP en la expresión proteica de la H+-PPasa 152 5.6.- Efecto de la salinidad sobre la actividad translocadora de protones 153 5.7.- Efecto de la salinidad sobre los niveles de calcio intracelular 155 Índice  6.- Enzimas del metabolismo del pirofosfato y del calcio como agentes quimioterapéuticos frente a la escuticociliatosis 156 6.1.- Antimaláricos 156 6.1.1.- Efecto de antimaláricos sobre el crecimiento del ciliado 156 6.1.2.- Efecto de los antimaláricos sobre la acidificación celular 157 6.1.3.- Efecto de los antimaláricos sobre la expresión de la H+-PPasa 159 6.1.4.- Efecto de los antimaláricos y los bisfosfonatos en los niveles de pirofosfato 160 6.2.- Efecto de los bisfosfonatos 162 6.2.1.- Efecto antiparasitario de los bisfosfonatos 162 6.2.2.-Efecto de los bisfosfonatos sobre la actividad translocadora de H+ de la H+-PPasa de P. dicentrarchi 163 6.2.3.- Efecto de los bisfosfonatos sobre la expresión génica de la H+-PPasa 163 6.2.4.- Efecto del RIS, sobre los niveles de calcio intracelular 164 Discusión 169 Conclusiones 209 Bibliografía 215     Introducción  Introducción 3  1.- Acuicultura Bajo el término “acuicultura” se entienden todas las actividades relacionadas con el cultivo de especies acuáticas. Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (F.A.O.), se define la acuicultura como: el cultivo de organismos acuáticos, incluyendo peces, moluscos, crustáceos y algas, lo cual implica la intervención del hombre en el proceso de cría para aumentar la producción, en operaciones como la siembra, la alimentación, la protección frente a depredadores, etc. La acuicultura se ha venido practicando desde hace 4000 años. En la antigüedad, la piscicultura surgió como una forma de mantener vivas las especies capturadas hasta su posterior venta (en China, la carpa; en Egipto, la tilapia, etc.) (Rueda González, 2011), sin embargo, la acuicultura ha sufrido sus mayores avances en los últimos 50 años, pasando de dedicarse exclusivamente al engorde, a la cría. Esto sucedió cuando se llegó al estancamiento de la capacidad máxima de la pesca extractiva, de 86,4 millones de toneladas en el año 1996, año en que alcanzó su máximo de producción, según datos de la F.A.O., y a partir de ahí ha ido descendiendo debido a que la mayoría de las especies se encontraban explotadas a un nivel biológicamente insostenible. A partir de ese momento, se ha visto forzada la introducción de nuevas tecnologías para obtener un mayor rendimiento y poder abastecer el mercado, es por ello que presenta un papel esencial en el futuro, como complemento a la pesca. En la actualidad, según el último informe de la F.A.O., la acuicultura representa alrededor del 50% de la procedencia del pescado consumido a nivel mundial, debería superar el 50 % del total en 2015 y llegar al 60 % para 2030, (F.A.O. 2014; European Aquaculture report 2004-2013 European aquaculture production industry (Feap, 2014). Introducción 4  En concreto, en España, debido a sus características climatológicas y geográficas, existe un gran potencial para estas actividades, por lo que en las últimas décadas se ha experimentado una gran expansión del sector. Galicia, especialmente, debido a la gran cantidad de costa que posee, se ha convertido en un lugar idóneo para desarrollo de actividades acuícolas que además tienen gran potencialidad, ya que a diferencia de la ganadería, las tasas de reproducción de los peces son muchísimo más altas. La producción mundial en el sector de la acuicultura sigue en crecimiento, aunque en menor medida. Según las últimas estadísticas de la F.A.O., a nivel mundial, la acuicultura alcanzó un máximo histórico en el año 2012 con 90,4 millones de toneladas, de los cuales 66,6 millones correspondieron a peces. Entre los retos de la acuicultura moderna se encuentran la disponibilidad de materias primas para los piensos y el desarrollo de nuevos avances tecnológicos que permitan un mayor control sanitario y una mayor producción sin la destrucción de los ecosistemas. Dentro de las finalidades de la acuicultura, aparte de abastecer el mercado alimenticio, se engloban también la suelta de ejemplares para repoblación en su medio natural, la producción de fármacos y la investigación científica (F.A.O., 2014). 1.1.- Acuicultura del rodaballo, Scophthalmus maximus, (Linnaeus, 1758) La acuicultura del rodaballo comenzó a desarrollarse en los años 70 en Escocia, desenvolviéndose poco después en España y primordialmente en Galicia. Actualmente se cultiva en gran parte de Europa y China (Eurostat, Cultivo de rodaballo en Europa, Comisión Europea, 2012; Fernández-Casal y col., 2008). La cantidad de rodaballo salvaje capturado con respecto a la producción total es cada vez menor, siendo en la actualidad mayor el Introducción 5  abastecimiento de esta especie por parte de la producción acuícola que por la pesca (fig. 1, F.A.O. 2014). La producción de rodaballo en Europa a través de la acuicultura fue de 7.721 t en el año 2013, de las cuales, el 88,3% procedían de España, un 38,1% menos que en el año 2012, y de estas, el 99% procedieron de Galicia, en donde se generan prácticamente la totalidad de los alevines (Informe: La Acuicultura en España 2014, Asociación Empresarial de Productores de Cultivos marinos en España, A.P.R.O.M.A.R.). A nivel mundial, el mayor productor de rodaballo es China, según datos de la F.A.O., aunque no se asegura que la especie de cultivo sea exactamente la misma. 1.2.- Hábitat, biología y patología del rodaballo El rodaballo, Scophthalmus maximus (Linneus, 1758), es un pez marino ubicado dentro de la Clase Actinopterygii, División Teleostei, Orden Pleuronectiformes y Familia Scophthalmidae. Se trata de un pez bentónico Figura 1: Evolución de la producción europea (t.) de rodaballo (Scophthalmus maximus), mediante acuicultura y pesca durante el periodo 1980-2012 (F.A.O. 2014). Introducción 6  que, en su hábitat natural, reside en fondos arenosos y fangosos de 20 a 70 metros de profundidad. Su distribución llega desde el Mar Báltico hasta el Atlántico nororiental en la zona de Marruecos, el Mar Mediterráneo y el Mar Negro. Su cuerpo aplanado es romboide y asimétrico en los adultos, posee los ojos en el lado izquierdo y una mandíbula grande y prominente. Su pigmentación, únicamente en la cara cenital, es críptica, imitando el color del sustrato para mimetizarse, yendo desde el color pardo al grisáceo. No posee escamas pero sí tiene tubérculos óseos en el dorso que le aportan una ligera rugosidad en la piel y la aleta caudal es homocerca. Alcanza su madurez sexual al quinto año de vida y no presenta diferenciación sexual externa. Desova en primavera y es una especie carnívora, alimentándose de moluscos, crustáceos, peces, cefalópodos, etc. (Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos (J.A.C.U.M.A.R.), 2006; Fernández-Casal y col., 2008 A.P.R.O.M.A.R., 2014; Martínez González, 2014; F.A.O. 2014). Debido a las altas densidades de cultivo en los tanques de engorde, además de otros factores relacionados con el estado sanitario de los peces como por ejemplo un mayor sometimiento al estrés debido al confinamiento a altas densidades en espacios reducidos, diferencias nutricionales y posibles problemas con la calidad del agua, los mecanismos de defensa del pez pueden verse alterados y favorecer la transmisión de parásitos y otros microorganismos. En los últimos años han aparecido enfermedades de las que en muchos casos no se tienen grandes conocimientos todavía y muchas de ellas suponen grandes pérdidas económicas debido a las altas tasas de mortalidad que presentan. Estas enfermedades pueden poseer diferentes orígenes: viral (como la Encefalopatía producida por especies del género Nodavirus o la Septicemia Hemorrágica Viral, (VHSV)), bacteriano (furunculosis, edwarseliosis, vibriosis) o parasitario. Entre las enfermedades producidas por parásitos, algunos ejemplos de las más comunes son: Introducción 13  mediante histología (Iglesias y col., 2001, Paramá y col., 2006). Para determinar la especie es necesario recurrir a diagnóstico por PCR (Paramá y col., 2006, Rossteuscher y col., 2008; Song y col., 2009; Smith y col., 2009) y/o al empleo de tinciones de plata con el fin de poder observar caracteres taxonómicos relevantes para la identificación (Dragesco y col., 1995; Iglesias y col., 2001; Budiño y col., 2011). El control de las enfermedades en acuicultura se lleva a cabo a través del empleo de tratamientos químicos, antibióticos y vacunas. En la actualidad se están realizando también muchas investigaciones en relación al uso de inmunoestimulantes (Paramá y col., 2004; Iglesias y col., 2002; Jin y col. 2010, Harikrishnan y col., 2010a; 2012a; 2012b). En P. dicentrarchi se han realizado diversos estudios para encontrar un tratamiento quimioterapéutico efectivo como por ejemplo el uso compuestos con anillos de piperacina (Quintela y col., 2003) o el empleo de compuestos naturales como los antioxidantes, que poseen una importante efectividad in vitro (Leiro y col., 2004a; Lamas y col., 2009; Morais y col., 2009; Budiño y col., 2012) y que además reducen la respuesta inflamatoria, obteniéndose diferentes niveles de eficacia terapéutica aunque sin llegar a ser total con ninguno de ellos. Al existir una regulación muy exigente en cuanto a los tratamientos permitidos en acuicultura, la vacunación constituye el método con mayores posibilidades de ser utilizado frente a la escuticociliatosis. Se han investigado tratamientos inmunoestimulantes con microesferas de quitosano (Paramá y col., 2005; León-Rodríguez y col., 2013). Con el empleo de formulaciones de vacunas que contienen escuticociliados inactivados se han obtenido buenos resultados, produciendo una buena respuesta de anticuerpos en el pez frente a las cepas homólogas, sin embargo, no hay protección cruzada entre cepas heterólogas (protección dependiente del serotipo) (Woo y col., 1987; Leiro y col., 2004b; Sanmartín y col., 2008; Piazzón y col., 2008; 2013; Palenzuela y col., 2009, Budiño y col., 2011). Introducción 14  Algunos estudios recientes se están centrando en seleccionar individuos más resistentes (Pardo y col., 2008; 2012; Rodríguez-Ramilo, 2013; Domínguez y col., 2013) y en la búsqueda de los componentes del sistema inmunitario que juegan un papel clave en la defensa frente a Philasterides. En este sentido se ha observado que los factores humorales de la respuesta inmune del pez, en especial el complemento, son muy importantes en la defensa frente a escuticociliados (Leiro y col., 2008; Piazzón y col., 2011b). 4. Biología de Philasterides dicentrarchi 4.1.- Morfología de ciliados: P. dicentrarchi Al tratarse de organismos unicelulares, los ciliados no poseen células especializadas para distintas funciones (alimentación, balance osmótico, movimiento...), por lo que su estructura es mucho más compleja. Se caracterizan por poseer dimorfismo nuclear, son heterocariontes. Presentan al menos un micronúcleo generativo diploide, con un genoma completo y solamente activo durante la reproducción sexual por conjugación (otra de sus características más representativas) (Katz, 2001; Álvarez-Pellitero y col., 2004); un macronúcleo vegetativo poliploide, con un genoma incompleto y que está transcripcionalmente activo durante el desarrollo somático y el mantenimiento de las funciones y fisiología celulares. Además, en los ciliados aeróbicos existe también un genoma mitocondrial. Entre sus particularidades también está la posesión de un gran número de cilios cubriendo su superficie (Lynn y Small, 2000). Otra las características más distintivas de los ciliados es la existencia de una corteza muy compleja que le aporta consistencia y forma a la célula manteniendo su elasticidad. En la corteza se encuentra un sistema de sacos alveolares planos (fig. 2), una zona continua localizada todo a lo largo de la periferia celular que cumple un importante papel en el intercambio iónico y Introducción 15  que también contiene mitocondrias y diferentes tipos de vesículas, entre otros orgánulos (Stelly y col., 1995). Los ciliados también cuentan con numerosas vacuolas citoplasmáticas que emplean para diferentes funciones, como las digestivas, y una vacuola contráctil que controla la osmorregulación celular. Los alveolos, junto con la membrana, conforman la película, la cual está cubierta de cilios locomotores (Möller y Anders, 1986; Lynn y Corliss, 1991). Al estar la célula cubierta de cilios se necesitan importantes cantidades de Ca +2 para su motilidad, además de emplearse también para la señalización intra y extracelular y a nivel de la infraciliatura para regular la contractilidad. Parte de este Ca +2 se libera a través de los tricocistos (fig. 2). En Paramecium el Ca +2 es secuestrado activamente hacia dentro de los alveolos, en un proceso dependiente de ATP y Mg +2 (Stelly y col., 1995; Sahoo y col., 2004; Plattner y Klauke, 2001). La disposición de los cilios en hileras que emplean para nadar y alimentarse, recibe el nombre de cinetias; conformando un patrón o ciliatura somática característico, que resulta un rasgo taxonómico muy relevante a nivel de clasificación. P. dicentrarchi posee entre 13 y 14 cinetias, dicinétidas Fi g ura 2: Estructura del córtex en Paramecium ( modificado de Corliss , 1979 ) . Introducción 16  anteriormente y monocinétidas en la zona posterior. En la base del cilio se localiza el cuerpo basal ciliar (fig. 2) o cinetosoma, pudiendo ser simple o doble y conjuntamente con el cilio forma la cinétida. En la región anterior se localiza el citostoma, que junto con las policinétidas orales y la membrana paraoral constituyen el aparato bucal del ciliado. En P. dicentrarchi pueden observarse 3 policinétidas orales (OPK 1 , OPK 2 , OPK 3 ) y una membrana paraoral constituida por dos piezas (PM 1 , PM 2 ) (fig. 3). En el extremo posterior se localiza el citoprocto, o ano celular, entre la primera y la última cinetia (Lynn y Corliss, 1991; Dragesco y col., 1995; Lynn y Small, 2000; Iglesias y col., 2001; Pan y col., 2015). P. dicentrarchi tiene forma ovoide, aplanada lateralmente, con el extremo anterior afilado y el extremo posterior redondeado, en donde dispone de un cilio caudal más largo que los demás. También está presente la escutica, propia de escuticociliados, que se forma durante la morfogéneis del sistema oral, y después desaparece. Comenzando en la zona de la escutica, muestra un meridiano director, sin cilios, que se fusiona con la primera cinetia en el extremo posterior, pudiéndose observar en esta zona el poro de la vacuola contráctil (fig. 3). Figura 3: Morfología de P. dicentrarchi impregnado con plata. Introducción 17  Muchos ciliados pueden cambiar su morfología en respuesta a señales externas y/o internas. La inanición por ejemplo, induce la transformación de la cepa Miamiensis avidus Ma/2 en una forma “tomite”, que no se alimenta, a través del uso de una señal de un factor soluble. Esta forma también se desarrolla cuando el cultivo entra en fase estacionaria y/o existen cambios en el pH del medio por lo cual se supone que estos cambios en la morfología podrían tener la función de incrementar la supervivencia en M. avidus en respuesta a factores ambientales de estrés. Otra teoría postula que podría tratarse de un ejemplo de diferenciación celular primitiva. Este tipo de formas también se han detectado en otros ciliados del género Uronema y Pseudochonilembus (Gómez-Saladín y Small, 1993a, b, c). 4.2.- Reproducción en ciliados: P. dicentrarchi. Los ciliados, además de presentar reproducción sexual por conjugación, también poseen reproducción asexual por bipartición siendo este último su medio más común de división.Durante la fisión binaria transversal, el aparato bucal permanece en el individuo anterior o próter y en el posterior, el opiste, se produce una nueva boca. El proceso de división de las estructuras ciliares orales se conoce como estomatogénesis(Lom y Dyková, 1992). Durante la división sexual, que normalmente sucede durante situaciones adversas, los preconjugantes se acercan y establecen contacto, se fusionan por sus regiones orales y establecen un puente citoplasmático. Seguidamente, el macronúcleo se desintegra mientras que el micronúcleo se divide por meiosis resultando 4 núcleos haploides. Posteriormente, el pronúcleo Figura 4: Fotografía de 2 conjugantes de P. dicentrarchi obtenida por microscopía de Introducción 18  migratorio se fusionará con el de la célula con la que está conjugando. La conjugación solamente ocurre entre ciliados conjugantes (fig. 4) compatibles y no implica un aumento del número de individuos, sino un intercambio de material genético (Lom y Dyková, 1992). 4.3.- Taxonomía de escuticociliados; P. dicentrarchi. Los escuticociliados son el taxón más problemático de los ciliados con respecto a relaciones sistemáticas debido a que las primeras clasificaciones se establecieron en base a la estomatogénesis (Small, 1967) y muchas especies tienen una morfología similar que no ha sido estudiada empleando métodos moleculares (Gao y col., 2010). Este problema persiste especialmente en el orden Philasterida que comprende 70 géneros (Gao y col., 2012). Los escuticociliados se clasifican filogenéticamente dentro del Clado Alveolata, grupo probablemente de origen monofilético, que comprende ciliados, apicomplejos y dinoflagelados, caracterizados todos ellos por la presencia de alveolos corticales, que debido a las diversas funciones que realizan, les confieren una mayor complejidad celular. Basándose únicamente en las relaciones filogenéticas, dentro de Alveolata estaría el Superphylum Heterokariota, Phylum Ciliophora, Clase Oligohymenophorea, Subclase Scuticociliatia. Philasterides dicentrarchi pertenecería al Orden Philasterida, Familia Philasteridae, Género Philasterides, (Cavalier-Smith y col., 1993; Dragesco y col., 1995). Posteriormente a esta clasificación surgió el clúster de los Chromalveolata (Alveolata en conjunto con Chromista, de Cavalier-Smith y col., 1998) propuesto por Adl y col en 2005 en base a estudios de ultraestructura y moleculares, que propone un sistema de jerarquía sin denominaciones formales (Adl y col., 2005). Según esto, los escuticociliados se clasificarían del siguiente modo: Introducción 19  Eukaryota Chatton, 1925 Chromalveolata Adl y col., 2005 Alveolata Cavalier-Smith, 1991 Ciliophora Doflein, 1901 Intramacronucleata Lynn, 1996 Oligohymenophorea de Puytorac y col., 1974 Scuticociliatia Small, 1967 Una de las teorías evolutivas en algas sugiere un ancestro común para los Alveolata, que contendría un plástido derivado de un alga roja. En Tetrahymena y Paramecium se han identificado 16 proteínas con este posible origen (Reyes Prieto y col., 2008; Köhler y col., 1997), sin embargo, según la clasificación más reciente de eucariotas (Adl y col., 2012) que estudia el posible origen polifilético del clúster Chromalveolata, incorporando avances recientes a través de criterios de filogenia realizada mediante el uso de secuencias de ARN ribosómico, se propone SAR como un grupo compuesto por Rizaria (Cercozoa, Radiolaria y Formaminífera), Alveolata y Stramenopiles (algas pardas, diatomeas y muchos hongos zoospóricos con los Haptophyta y Cryptophyceae) (Burki y col., 2007). Según esta clasificación (Adl y col., 2012), P. dicentrarchi estaría incluido en: Eukaryota Chatton 1925 Diaphoretickes Adl y col., 2012 Alveolata Cavalier-Smith, 1991 Ciliophora Doflein, 1901 Intramacronucleata Lynn, 1996 Oligohymenophorea de Puytorac y col., 1974 Scuticociliatia Small, 1967 Philasterida Small, 1967 Introducción 20  Los métodos moleculares, especialmente la determinación de la secuencia del gen de la subunidad pequeña del ARN ribosómico (SSUrRNA), han sido utilizados comúnmente para investigar las relaciones filogenéticas en escuticociliados (Jung y col., 2005; 2011; Li y col., 2006) aunque se ha determinado que se necesitan marcadores moleculares adicionales para solucionar la posición filogenética de los escuticociliados y resolver algunas incongruencias que surgen dependiendo de los criterios que se establezcan para realizar la filogenia (Gao y col., 2012). 5.- Ecología de ciliados Los protozoos son eucariotas unicelulares muchos de ellos heterótrofos, ocupando un sitio clave en la cadena alimenticia microbiológica. Los que se alimentan de bacterias recuperan la materia orgánica particulada que se encuentra disuelta en el agua y a través de la excreción contribuyen a la remineralización de nutrientes. Incluidos en los protozoos, los ciliados colonizan un amplio espectro de nichos ecológicos debido a su capacidad para adaptarse fácilmente a diferentes condiciones medioambientales como por ejemplo, la variación en las concentraciones de oxígeno en el medio (Fenchel y Finlay, 2008; Rocke y Liu, 2014), siendo muchos de ellos parásitos, pudiendo ser ecto, o endoparásitos, oportunistas u obligados (Fenchel, 1980; Dickerson y Clarck., 1996). Algunos ciliados aparecen en la interfase óxica/anóxica y están presentes a través del hipolimnion anóxico y por debajo de la oxiclina en hábitats eutróficos (Miracle y col., 1992; Hayward y col., 2003; Fenchel, 2014), comportándose como microaerófilos. Los microaerófilos crecen mejor y muestran preferencia quimiosensorial por las tensiones de O2 en un rango entre 0-10% de saturación siendo por ejemplo, en el caso del ciliado Uronema filificum, de entre1-2% (Fenchel, 2012). Introducción 21  Los protozoos aeróbicos pueden alcanzar su máximo consumo de oxígeno en ambientes en los que este está en muy baja concentración. En Euplotes se observó que mientras que el consumo de oxígeno se incrementó a medida que aumentaba su concentración en el ambiente hasta alcanzar el 100% de saturación atmosférica, el nivel de crecimiento y el tamaño celular se maximizaron a concentraciones de 4-5% de saturación ambiental y que tanto el tamaño como el nivel de crecimiento disminuyeron sobre un 30% cuando los ciliados crecieron a saturación atmosférica (Fenchel, 2012). Los ciliados parásitos de peces pueden ser de agua marina o dulce y aunque existen muchas especies eurihalinas (Urrutxurtua y col., 2003). En algunos casos, las condiciones de baja salinidad (300-500 mOsm/kg) son favorables para su supervivencia (Takagishi y col., 2009). Los niveles de Na+ y Clintracelulares son más bajos que las concentraciones externas en un amplio rango de salinidades, pero las concentraciones intracelulares de estos iones cambian más o menos proporcionalmente con los cambios de las condiciones externas. Paramecium y Miamiensis avidus se mantienen hiperosmóticos con respecto al ambiente. El significado funcional de este estado hiperosmótico, puede ser debido a la obtención de agua para operar con la vacuola contráctil, responsable de la eliminación de deshechos metabólicos (Kaneshiro y col., 1969; Stock y col., 2002). La temperatura es otro factor importante en su desarrollo. Generalmente, en ambientes naturales alcanzan su máxima densidad a finales de primavera e inicios de verano (Urrutxurtua y col., 2003). Los escuticociliados destacan especialmente por su ubicuidad, conseguida gracias a su alta capacidad de reproducción así como su facilidad de dispersión y adaptación a cambios en el medio (Finlay y col., 1998). Muchos de ellos son parásitos facultativos de organismos acuáticos. Particularmente, los escuticociliados bentónicos son bacterívoros micrófagos, microaerófilos, y por tanto sensibles a altas concentraciones de oxígeno. P. Introducción 22  dicentrarchi es un escuticociliado microaerófilo de vida libre, bacterívoro, micrófago, que se comporta como histiófago cuando se encuentra como parásito oportunista (Iglesias y col., 2001). Muchos organismos parásitos, particularmente aquellos que residen en ambientes microaerófilos, han desarrollado una serie de modificaciones en su metabolismo energético que facilitan su adaptación al parasitismo (Saz, 1981). Aunque, generalmente, las enzimas y sus metabolitos se han conservado a lo largo de la evolución, la reconfiguración metabólica del parásito y las mutaciones en sus enzimas pueden contribuir al desarrollo de rutas metabólicas que aparecen en los hospedadores y que en los parásitos están ausentes, dejando el metabolismo en manos del hospedador (Von Brand, 1973), sin embargo, también se puede dar el caso opuesto, en el que el parásito presenta enzimas exclusivas, que no se encuentren en el hospedador, pudiendo ser éstas, dianas quimioterapéuticas interesantes (Hochachka y col., 1993; Kita y col., 2003). Identificar las diferencias moleculares y bioquímicas entre los parásitos y sus hospedadores es crucial para el desarrollo de nuevos tratamientos quimioterapéuticos frente a infecciones parasitarias. Las mitocondrias poseen un importante papel en el mantenimiento de las funciones de metabolismo bioenergético celular, muerte celular programada, homeostasis del Ca+2 y señalización celular, entre otras. Además, en parásitos, éstas pueden ser muy diferentes a la del hospedador, tratándose por tanto de dianas atractivas para el desarrollo de fármacos (Hackstein y col., 2006). 6.- Bioquímica parasitaria: Metabolismo bioenergético en eucariotas y adaptaciones a condiciones de estrés A causa de las diferencias de hábitat de los parásitos, el metabolismo varía mucho entre especies, asociándose algunas de las adaptaciones metabólicas con una transición al parasitismo obligado (Ginger y col., 2010). Introducción 29  procíclicos la cadena respiratoria se presenta ramificada. A pesar de poseer los 4 complejos respiratorios, los dos primeros aparecen modificados (van Hellemond y col., 2015). En helmintos como Fasciola hepática y Ascaris lumbricoides, el complejo mitocondrial forma H2O2 desde el O2 en lugar de H2O y es insensible a KCN, azida y AMA. Existen evidencias de que su mitocondria contiene una cadena respiratoria ramificada con dos oxidasas terminales, una de ellas ligada a la producción de H2O2 (Docampo, 1995) y la CTE clásica hasta la citocromo c oxidasa está generalmente ausente o tiene muy baja actividad (Hochachka y col., 1993; Kakkar y Singh, 2007). Nyctotherus ovalis es un ciliado anaeróbico que habita en el intestino de cucarachas, posee un orgánulo mitocondrial parecido a un hidrogenosoma, pero contiene cadena de transporte de electrones y genoma, por lo que se considera un orgánulo intermedio entre la mitocondria y el hidrogenosoma (Müller y col., 2012). Sin embargo, su cadena respiratoria está incompleta; posee genes que codifican para componentes de los complejos I y II pero carece de los genes que codifican para los complejos III y IV, y la ATP sintasa (de Graaf y col., 2011). Además, se ha comprobado que este orgánulo es sensible a los inhibidores del complejo I y produce succinato como producto final del metabolismo. Se cree que su origen puede ser el de una mitocondria que ha ido adquiriendo las enzimas necesarias para funcionar en condiciones de anaerobiosis, o que mitocondrias e hidrogenosomas evolucionaron desde un ancestro común y después se especializaron (Boxma y col., 2005). En el protozoo anaeróbico Blastocystis también existe un orgánulo a caballo entre la mitocondria y el hidrogenosoma; posee material genético y potencial transmembrana, y aunque presenta los complejos I y II de la respiración mitocondrial, los complejos III y IV, y la ATPasa, están ausentes (Stechmann y col., 2008). Los hidrogenosomas son orgánulos que, por definición, producen ATP e hidrógeno, usando protones como aceptores de electrones. Algunas especies Introducción 30  de organismos anaeróbicos poseen un hidrogenosoma que produce H2 y ATP a partir de la oxidación de piruvato o malato (De Graaf y col., 2011). Los electrones del donador son empleados por la ferredoxina-oxido-reductasa y la hidrogenasa, enzimas ausentes en la mitocondria, para producir H2 (Martin y col., 2005; Hackstein y col., 2006; Müller y col., 2012). En el caso de Trichomonas, los hidrogenosomas no poseen ATP sintasa ni crestas, pero intervienen en el metabolismo del piruvato, incorporan Ca+2, o se dividen de una forma similar a la mitocondria. Los hidrogenosomas se encuentran en muchos organismos que no están estrechamente relacionadoscomo flagelados anaeróbicos, algunos hongos y varios ciliados anaeróbicos (Boxma y col., 2005), lo cual se piensa que puede ser debido a que estos orgánulos cumplen una misma función esencial para la célula y por eso ha evolucionado para adaptarse a las diferentes condiciones ambientales en lugar de desaparecer (Embley y col., 2003). Los mitosomas no producen hidrógeno ni ATP. El parásito apicomplejo Cryptosporidium parvum posee un mitosoma con capacidad metabólica muy reducida y que no posee genoma (Alock y col., 2012), por lo que es totalmente dependiente del genoma nuclear para obtener proteínas funcionales (Henríquez y col., 2005). Algunos microsposporidios anaerobios también carecen de metabolismo energético mitocondrial y poseen mitosomas, como Giardia, por ejemplo (Ginger y col., 2010; Williams y col., 2010). Al tratarse de parásitos que habitan en el tracto digestivo al igual que ocurre con los que colonizan el tracto reproductivo, la reducida disponibilidad de O2 ha ocasionado que posean un sistema alternativo a la respiración oxidativa para la obtención de energía. Esta estrategia evolutiva se basa en la fermentación anaeróbica a partir de glucosa o aminoácidos, lo que provoca que para el caso de este tipo de parásitos, el enzima clave sea la fosfofructoquinasa PPi dependiente (PPi-PFK), y por tanto la energía sea dependiente de PPi inorgánico (PPi) en lugar de ATP (Ginger, 2006). Introducción 31  Según Müller, los MROs se clasifican en 5 clases diferentes basándose la capacidad de producir ATP y el compuesto de aceptor de electrones (Tabla 1): Tabla 1: Clasificación de los orgánulos derivados de la mitocondria (MROs). Modificado de Müller y col., 2012. Los MROs poseen modificaciones de la CTE, gracias a ello existirán diferencias entre la CTE de parásitos y la del hospedador, por lo que los MROs podrían ser interesantes para la búsqueda de nuevas dianas quimioterapéuticas, permitiendo desarrollar tratamientos que afectasen únicamente al parásito. 6.2.- Ruta alternativa de la respiración mitocondrial; Oxidasa alternativa (AOX) La AOX es una proteína insensible al KCN localizada en la membrana interna mitocondrial que capta los electrones de la ubiquinona y los transfiere al O2, permitiendo la formación de una ruta de transporte alternativa a la Clase Producción deATP Generación deH2 Cadenade transporte e‐ UsodeO2 como aceptor 1 Mitocondria aeróbica No Si NoNo 2 Mitocondria anaeróbica No Si No Si 3 Mitocondria productorade H2 No No No Si 4 Hidrogenosomas No No Si Si 5 Mitosomas Si Si Si ‐‐ Introducción 32  cadena de transporte electrónico descrita previamente (fig. 6) (McIntosh, 1994; Sircar y col., 2012). A diferencia de los complejos I, III y IV de la cadena respiratoria, donde el transporte electrónico está acoplado a la translocación de protones, el transporte a través de la AOX no genera ATP, por lo que la energía derivada de la oxidación del ubiquinol se pierde en forma de calor (Albury y col., 2009; Rogov y col., 2015). 6.2.1.- Distribución de la AOX La AOX es una proteína de la cadena respiratoria que se encuentra ampliamente distribuida en plantas, hongos, levaduras no fermentativas y protozoos (Henry y Nyns, 1974; Lambowitz y col., 1989; Sakajo y col., 1991, 1997; Jarmuskiewicz y col., 1997, 1999, 2001b, 2002; Maxwell y col., 1999; Moore y col., 2002; Czarna y col., 2010; Williams y col., 2010; WoydaPloszczyca y col., 2011). Se ha descrito en protozoos apicomplejos como por ejemplo Cryptosporidium, flagelados como Trypanosoma, amebas como Acanthamoeba y ciliados como Tetrahymena thermophyla. También está presente en algunos procariotas como las α-proteobacterias, por lo que se asume que esta enzima fue adquirida en un paso temprano de la evolución a través de la endosimbiosis que dio lugar a la mitocondria en el ancestro común de eucariotas (Young, 1983; Clarkson y col., 1989; Murphy y col., 1997; Roberts y col., 2004; Chaudhuri y col., 2006; Eisen y col., 2006; Seeber y col., 2008). Mediante estudios filogenéticos se ha evidenciado que la AOX de protozoos se encuentra más próxima a la de hongos que a la de plantas o bacterias (Chaudhuri y col., 2006). En estos organismos existen 2 vías en la respiración mitocondrial; la vía clásica, que actúa a través de la citocromo c oxidasa, sensible al KCN, y la vía alternativa, insensible al KCN, que lo hace a través de la que se conoce como AOX, que desvía la ruta desde el ubiquinol transfiriendo los electrones Introducción 33  directamente al O 2 y reduciéndolo a H 2 O (Affourtit y col., 2001; Moore y col., 2008; Williams y col., 2010; Xu y col., 2012). 6.2.2.- Estructura y funcionamiento de la AOX La AOX es una proteína integral de membrana que interactúa con la bicapa lipídica a través de dos hélices hidrofóbicas cortas. Está carboxilada con dos grupos que emplea para catalizar la oxidación del ubiquinol hasta la reducción completa del O 2 a H 2 O (Anderson y Nordlund, 1999; Affourtit y col., 2001; Berthold y Stenmark, 2003; Moore y col., 2008).Posee una región hidrofóbica de unión al ubiquinol muy conservada (Gln242, Asn247, Tir253, Ser256, His261 y Arg262), situada entre las hélices II y III (Albury y col., 2010; Moore y Albury, 2008). En Trypanosoma brucei se ha descrito el residuo Tir220 como indispensable para la actividad catalítica de la enzima (Shiba y col., 2013). Se han propuesto dos modelos estructurales para la AOX, que se distinguen por su estructura en subunidades y sus reguladores (fig. 5): el modelo dimérico, de plantas, y el monomérico, de hongos y protozoos (Sluse y Jarmuskiewicz, 1998; Umbach y Siedow, 2000; McDonald y col., 2009) aunque en Trypanosoma brucei, la AOX es un homodímero (Shiba y col., 2013). A) B) Figura 6: Estructura del modelo propuesto para la AOX de protistas y hongos (A) y de angiospermas (B) y su modo de activación. (Modificado de McDonald y col., 2009). Introducción 34  La AOX homodimérica de plantas está relativamente inactiva cuando sus subunidades están unidas por puentes di-sulfuro (fig. 6). Cuando estas uniones se reducen, el enzima puede ser estimulada por sus activadores, αcetoácidos y succinato, que sin embargo éstos no parecen estimular la AOX de hongos.El guanosín monofosfato (GMP) es un buen activador en hongos y en protozoos como Acanthamoeba castellanii; en Plasmodium falciparum lo es el ADP y en la levadura Debaryomyces hansenii, el AMP, que, a su vez, no activan a la AOX de plantas (Cabrera-Orefice y col., 2014). Por otra parte, se ha visto que los niveles de expresión en levaduras oxidativas y hongos como Pichia y Neurospora, respectivamente, dependen de las condiciones del cultivo y de la presencia de inductores (Lambowitz y col., 1989; Umbach y Siedow, 2000, Uyemura y col., 2000), al igual que en Trypanosoma, en donde se ha observado que el estado del ciclo de vida también afecta a la expresión de la AOX (Chaudhuri y col., 2006). La AOX tanto de plantas como de hongos es resistente al cianuro, pero sensible a los ácidos hidroxámicos sustituidos, como el ácido salicilhidroxámico (SHAM) (Vanlerberghe y McIntosh, 1997; Roberts y col., 2004), un inhibidor específico reversible de la ruta alternativa, que no afecta a la ruta clásica. La naturaleza del grupo radical en estos compuestos, afecta a la concentración a la cual los ácidos hidroxámicos son efectivos (Schonbaum y col., 1971). Al existir inhibidores específicos de la ruta alternativa, el empleo de estos permite estudiar ambas rutas por separado (fig. 7). Introducción 35  La capacidad de la respiración de la ruta alternativa se mide en presencia de un inhibidor de la ruta del citocromo c, como la fracción el consumo de O 2 resistente a ese inhibidor (Møller y col., 2001) y que es posteriormente inhibida por un inhibidor específico de la ruta alternativa (Monzote y Gille, 2010). Figura 7: Resumen esquemático de la cadena de transporte de electrones. El complejo I inicializa el proceso de flujo de electrones oxidando el NADH a NAD+. Los electrones fluyen secuencialmente a través del complejo III y IV, donde se unen al oxígeno para reducirlo hasta formar agua. Durante este proceso, cada uno de los complejos (I, II y IV), catalizan la translocación de protones a través de la membrana mitocondrial interna. Los protones generados en los diferentes puntos de la cadena de transporte de electrones se emplean para generar ATP a través de la ATPasa. La ruta puede desviarse a través de la AOX para formar agua directamente: SHAM (ácido salicilhidroxámico), AMA y KCN son inhibidores específicos de cada uno de los complejos. Modificado de McDonald y col., 2009. Introducción 36  6.2.3.-Funciones de la AOX y regulación de su expresión Desde un punto de vista funcional, la AOX debería cumplir un papel muy importante dado que ha sido conservada a lo largo de la evolución en una gran variedad de organismos. La baja afinidad por el O2 que presenta, se piensa que podría tratarse de una adaptación a la baja concentración de O2 que había en la atmósfera primigenia de la Tierra, por lo que se propone que la proteína ancestral debe haber actuado como una reductasa de O2 temprana, operando en los primeros estadíos de la transición entre la atmosfera anóxica y óxica, con la intención de reducir las ROS (Moore y col., 2002). La AOX no compite con la citocromo c oxidasa (COX) debido a su baja afinidad por el O2, pero lo elimina del medio disminuyendo la producción de ROS (Maxwell y col., 1999; Gupta y col., 2009), por lo que se piensa que su función más relevante es la de mantener la homeostasis de la mitocondria. En eucariotas inferiores, la función principal que se propone para la AOX también es la de detoxificación frente a ROS para mantener la homeostasis mitocondrial, pudiendo comprobarse que se trata de un factor importante para la supervivencia del patógeno en macrófagos (Magnani y col., 2007). La AOX puede incrementar la patogenicidad de algunos organismos, ya que la respuesta de defensa frente al parásito está caracterizada por la generación de ROS o tóxicos en defensa a invasores (McDonald y col., 2009) por lo que su existencia podría tratarse de una adaptación metabólica al hospedador. Otro dato que concuerda con esta hipótesis es el caso del parásito T. brucei, en el que la AOX solo está presente en su forma infectiva en mamíferos, la forma procíclica (Walker y col., 2005). Esta enzima permitiría la rotación del ciclo de Krebs cuando la carga energética de la célula fuese alta y así la protegería frente al estrés oxidativo (Affourttit y col., 2002). Por otra Introducción 37  parte, parece que la AOX podría tener un papel importante en la regulación de la muerte celular programada (Chaudhuri y col., 2006). En plantas, los niveles de expresión de AOX están inducidos por diferentes factores de estrés; heridas, ataque de patógenos, estrés osmótico o inhibidores de la cadena respiratoria en general (Moore y col., 2002; McDonald y col., 2009) y se ha demostrado que en estos organismos la AOX juega un papel indispensable en la regulación de la termogénesis para la polinización, la fotoprotección, como defensa anti-estrés oxidativo… (Popov y col., 2003; Zhang y col., 2011; Wagner y col., 2008; Xu y col., 2012; Rogov y col., 2015). En estudios realizados en soja, se ha comprobado que el pretratamiento en anoxia genera una protección frente a la muerte celular provocada por producción de H2O2. Esto es debido a que durante las condiciones de anoxia funcionan la AOX y las peroxidasas (Amor y col., 2000), manifestándose su función de defensa frente al estrés oxidativo. La AOX también podría ser de gran importancia en proteobacterias, las cuales están sujetas a cambios constantes de condiciones ambientales, pudiendo así variar su metabolismo energético en función de sus necesidades (Purvis y Shewfelt, 1993). Existe también una hipótesis en la que se postula que la ruta alternativa podría ser una vía de escape de la del citocromo c en situaciones de carencia de fosfato (Roy y col., 2008). En plantas, el PPi puede actuar como un donador de energía alternativo, especialmente bajo condiciones de estrés como pueden ser la anoxia o la deprivación de Pi. El PPi, que puede encontrarse en cantidades relativamente abundantes debido a su producción como subproducto de biosíntesis, permitiría así conservar en cierto modo la generación de ATP. Se ha observado que la expresión de las enzimas dependientes de PPi como la PPi-PFK y la H+-PPasa, se ve aumentada en respuesta al estrés. La reducción en los niveles de Pi y el ADP limitan el flujo de electrones en la cadena respiratoria a través de la ruta del citocromo c, sin Introducción 38  embargo, este transporte podría realizarse a través de la ruta alternativa, lo que puede contribuir a la supervivencia (Plaxton, 2009). Esta hipótesis concuerda con los estudios realizados en plantas que revelan que la respiración es más baja en aquellas que carecen de Pi; cuando el ADP o el Pi son limitantes, la fuerza protón motriz se incrementa y la proporción de transporte acoplado de electrones a través de la vía del citocromo se restringe alrededor de un 20%, consecuentemente se incrementa la participación de la ruta alternativa de la respiración (Theodoru y Plaxton., 1993). Del mismo modo, se especula que una de las funciones esenciales que tendría la AOX en este caso sería la síntesis de ATP para el mantenimiento de la homeostasis y el nivel de crecimiento. Sin embargo, en algunos casos, cuando se expresa la AOX, decrece la eficiencia del metabolismo energético mitocondrial, como sucede en el caso de Schizosaccharomyces pombe; en el cual se traduce en una bajada en el nivel de crecimiento (Affourtit y col., 2002). Al igual que en plantas, la activación de la AOX por la adición de AMA en A. castellanii y Trypanosoma brucei, disminuye la producción de H2O2 (Jarmuskiewicz y col., 1997; Czarna y Jarmuskiewicz, 2005), y la inhibición de la AOX por uso de inhibidores específicos como el SHAM y el propil galato (PG) estimula la producción de H2O2, (Popov y col., 1997; Fang y Beattie., 2003; Roberts y col., 2004). La presencia de la AOX en protozoos de importancia patogénica como Trypanosoma, (Clarkson y col., 1989; Chaudhuri y col., 2006), Cryptosporidium (Putignati y col., 2004; Mogi y Kita, 2010; Roberts y col., 2004) y Plasmodium (Mogi y Kita, 2010; Torrentino y col., 2010, Murphy y col., 1997), es muy relevante, ya que esta enzima está ausente en sus hospedadores, convirtiéndola en una posible diana terapéutica (Nihei y col., 2002; Roberts y col., 2004, Chaudhuri y col., 2006). Además se ha comprobado que el empleo de inhibidores específicos de la AOX como el SHAM y el PG no producen H2O2 en la mitocondria de hígado de rata (Popov Introducción 45  En la membrana del ciliado Euplotes crassus y en Paramecium se ha localizado un intercambiador de Na + /Ca +2 que coopera en la regulación del Ca +2 a nivel de la membrana plasmática con la Ca +2 -ATPasa (Burlando y col., 1999; Brini y Carafoli., 2011). En Paramecium, para la liberación del Ca +2 también se han identificado unos canales conocidos como CRCs localizados en los alveolos y diferentes vacuolas (fig. 8) y los receptores de rianodina (RyR) para la liberación de Ca +2 a nivel de los depósitos corticales (Plattner 2015a; b). Figura 8: Esquema indicando el flujo de Ca+2 en protozoos, así como las bombas y depósitos implicados. Modificado de Docampo y col., 2014; Plattner, 2014; 2015 a; b y Lourido y Moreno, 2015. Los puntos rojos simbolizan el Ca+2. En Paramecium se han descrito varios tipos de CRCs en diversos orgánulos, para la liberación de Ca+2 que aquí no se muestran.VC: Vacuola contráctil, RE: Retículo endoplasmático. Introducción 46  6.5.1.- Regulación de los niveles de Ca+2 en los acidocalcisomas y vacuolas: El pH ácido dentro de las vacuolas favorece la retención de Ca+2 y para que éste se libere es necesaria una neutralización (Bonansea y col., 2012). En el mantenimiento del pH generalmente intervienen diversas bombas como la H+-PPasa, la H+-ATPasa, los intercambiadores de Na+/H+ y Ca+2/H+ y la Ca+2ATPasa (fig. 9) localizadas en la membrana de vacuolas y acidocalcisomas (Luo y col., 2001; Rodrigues y col., 2002. Docampo y col., 2005). El ión Na+ también interviene en la regulación del pH de las vacuolas. Este ión interfiere a través de otro transportador, el de Na+/H+, que se activa bajo condiciones de osmolaridades altas y media la alcalinización de la vacuola seguida de la liberación de Ca+2 ya que esta acoplado a otro transportador, Ca+2/H+ (fig. 9) (Vercesi y col., 2000; Bonansea y col., 2012). Este cotransportador se ha localizado en los acidocalcisomas de L. donovani, T. brucei y T. gondii, y en el ciliado T. pyriformis (Kramhøft y Jessen, 1992; Vercesi y col., 2000; Bonansea y col., 2012). En T. cruzi, en condiciones de estrés hiperosmótico, se produce una activación del transportador de Na+/H+ de las vacuolas acídicas. Este transportador interviene en la alcalinización de estas vacuolas y se ha observado en diversos organismos que como consecuencia de la acumulación de Na+, se produce un incremento en el volumen vacuolar (Bonansea y col., 2012). EL extremo C-terminal del intercambiador Na+/H+ (fig. 9) reside en la vacuola y se sugiere que ahí se regula en función de cambios en el pH (Yamaguchi y col., 2005). Introducción 47  Figura 9: Representación esquemática de un acidocalcisoma y las enzimas localizadas en su membrana. Modificada de Docampo y Huang, 2015. Las Ca+2-ATPasas están inhibidas por vanadato. La liberación de Ca+2 se produce a través de un receptor inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3R). El gradiente de H+ establecido por H+-ATPasa vacuolar es inhibido por la bafilomicina A1(Baf A1) y la H+-PPasa vacuolar inhibida por el aminometiledfosfonato (AMDP). Existe una aquaporina que permite el transporte de agua. Están presentes otros transportadores (por ejemplo los intercambiadores Na+/H+ o Ca+2/H+) y los transportadores para el Zn+2, Fe+2, y el PPi inorgánico (Pi) también probablemente esté presente. La translocación y síntesis del Poli P (poli P) tiene lugar a través de una chaperona de transporte vacuolar (VTC) a expensas de ATP. Los acidocalcisomas son ricos en Pi, poli P y cationes. También se han identificado una exopolifosfatasa (PPX) y una pirofosfatasa soluble vacuolar (VSPasa). 6.6.- PPasas inorgánicas El PPi puede formarse espontáneamente bajo determinadas reacciones geoquímicas y podría haber precedido al ATP como molécula energética (Holm y Baltscheffsky, 2011; Kajander y col., 2013). Ello podría explicar su presencia en bacterias, protistas y plantas participando en reacciones enzimáticas y en mecanismos de transporte asociados a la membrana que utilizan PPi en vez de ATP. En los organismos actuales hay más de 200 Introducción 48  reacciones en las que los nucleósidos trifosfato se convierten en nucleósidos monofosfato y PPi (Baykov y col., 2013). Tanto el PP inorgánico (PPi) como el ATP llevan a cabo funciones similares en cuanto a su capacidad energética se refiere. Se cree que el empleo de PPi como fuente de energía fue adquirido en la evolución anteriormente al ATP y la dependencia de sodio anteriormente a la dependencia de protones (Kajander y col., 2013). El PPi es elemental en el metabolismo celular actuando como donador de energía y regulador alostérico de muchas vías, ya que su concentración afecta al equilibrio de muchas reacciones moleculares en diversas rutas (Pace y col., 2011). Entre las enzimas que utilizan PPi como fuente de energía están las pirofosfatasas de membrana (H+-PPasas), las cuales han sido descritas en una gran cantidad de especies procariotas. Se trata de proteínas integrales de membrana que emplean la energía liberada de la hidrólisis del PPi en ortofosfato inorgánico (Pi), para transportar protones a través de la membrana en contra del gradiente electroquímico (Belgurov y Lathi, 2002). Recientemente, se han descrito también Na+-PPasas (Luoto y col., 2011). Entre los eucariotas, todas las plantas y muchos protistas poseen pirofosfatasas translocadoras de protones, las cuales parecen estar ausentes en animales y hongos (Baykov y col., 2013). 6.6.1.- Clasificación y funcionamiento de las PPasas Se han descrito 2 tipos diferentes de PPasas: integrales de membrana (H+-PPasas) y las solubles o citosólicas; que a su vez pueden ser de 3 tipos: I, II y III (s-PPasas) (Pérez-Castiñeira y col., 2002b; Kajander y col., 2013). Las pirofosfatasas solubles son enzimas ubicuas que hidrolizan PPi para darle direccionalidad a las reacciones biosintéticas y para liberar calor; relacionadas con estas, están las pirofosfatasas mitocondriales (Lundin y col., 1991). Por otra parte, las PPasas de membrana emplean la energía obtenida de la hidrólisis en el movimiento de H+ para generar un gradiente electroquímico a Introducción 49  través de la membrana (Baltscheffsky y col., 1999; Pérez-Castiñeira, 2002a). Se diferencian también por su distinta respuesta a inhibidores como el fluoruro sódico (NaF) o los bisfosfonatos y también en los cationes divalentes que precisan para su funcionamiento, Mg+2 o Mn+2 (Drozdowicz y col., 1999; Kajander y col., 2013, Gajadeera y col., 2015). Englobando a las PPasas de membrana, otra clasificación se centra en la naturaleza de las bombas: si son bombas de Na+ o de H+. El mecanismo hidrolítico se conserva pero cambia la especificidad del ión (Gajadeera y col., 1999; Kajander y col., 2013), aunque en un estudio reciente se propone que se trataría de la misma enzima y que esta, dependiendo de las condiciones del medio, presentaría mayor afinidad por estos iones (Luoto y col., 2013). Las bombas de Na+ solamente se han descrito hasta el momento en organismos procariotas. 6.6.2.- Distribución de las H+-PPasas La actividad PPasa fue descubierta por primera vez en la bacteria fotosintéticaRodospirillum rubrum (Baltscheffsky y col., 1966) y posteriormente en plantas superiores (Karlsson y col., 1975), describiéndose más tarde su localización en las vacuolas (Rea y Poole, 1986) y más recientemente en acidocalcisomas de protozoos (Scott y col., 1998). Las H+-PPasas son proteínas integrales de membrana, altamente hidrofóbicas, que en el momento de su descubrimiento se pensaba que solamente existían en plantas superiores y ciertas bacterias fotosintéticas (Petel y Genraud, 1989). Sin embargo, desde entonces, han sido identificadas en un amplio rango de organismos, incluyendo procariotas extremófilos y protozoos parásitos de vida libre como los kinetoplastidos Trypanosoma y Leishmania y los apicomplejos Plasmodium y Toxoplasma (Scott y col., 1998; Luo y col., 1999; Rodrigues y col., 1999a; Hill y col., 2000; Pérez-Castiñeira y col., 2002b; Drozdowicz y col., 2003; Miranda y col., 2008; Sen y col., Introducción 50  2009).Existe una clara evidencia para la amplia distribución de estas enzimas en ciliados de vida libre como P. tetraurelia, Histriculus caviota y Vorticella microstoma, así como en los ciliados anfizoicos como T. pyriformis y parásitos ciliados como Ichtyopthyrus multifilis (Pérez-Castiñeira y col., 2002b); sin embargo, en ninguno de estos protozoos se ha caracterizado esta enzima. En la arquea metanogénica Methanosarcina mazei se han detectado en su genoma dos marcos abiertos de lectura (ORFs) para H+-PPasas (Baümer y col., 2002). Estas proteínas se encuentran, además de en la membrana vacuolar (tonoplasto), en la membrana plasmática celular en plantas (Rea y Poole, 1993; Long y col., 1995; Robinson y col., 1996). En protozoos, además de en los acidocalcisomas, también se ha descrito esta proteína en el aparato de Golgi, en la membrana de las vacuolas digestivas, en la membrana plasmática y en un compartimento de maduración vacuolar de tripanosomátidos (Harper y col., 2006). Sin embargo, las H+-PPasas no existen en las membranas plasmáticas de los hospedadores de los parásitos (Rea y Poole, 1993) y ha sido demostrado que los inhibidores de estas enzimas, como los análogos del PPi (bisfosfonatos) presentan efectos antiprotozoarios, por lo que podría ser una diana para el futuro desarrollo de tratamientos quimioterapéuticos (Docampo y Moreno, 2008; Sen y col., 2009). 6.6.3.- Estructura y regulación de las H+-PPasas Las H+-PPasas (EC 3.6.1.1) son proteínas homodiméricas de origen ancestral, tratándose de la clase de bombas primarias de iones más sencilla estructuralmente descrita hasta la actualidad (Maeshima y col., 2000; Drozdowicz y Rea, 2001), y para las que existe un alto grado de conservación entre proteínas homólogas de todos los organismos evolutivamente muy alejados que las poseen (Serrano y col. 2007). El sustrato de la enzima es un complejo Mg+2-PPi del cual emplean la energía del enlace fosfoanhidro del Introducción 51  PPi para transportar H + en contra de un gradiente electroquímico. El PPi o el H + -PPi son inhibidores competitivos de la H + -PPasa(Belogurov y Lahti, 2002; Saliba y col., 2002, Gaxiola y col., 2007). Se trata de proteínas hidrofóbicas relativamente grandes, con 15-17 segmentos α-hélice transmembranales. Los modelos moleculares prevén su extremo N-terminal en el lumen vacuolar, mientras que el C-terminal se cree que se localiza en el citosol. Bioquímicamente se clasifican en dos grandes grupos, dependiendo de si su actividad catalítica es estimulada o no por K + (poseen una lisina conservada, la cual está ausente en las H + -PPasas dependientes de K + ) (Maeshima y col., 2000; Drozdowicz y Rea 2001; Pérez-Castiñeira y col., 2001b). El sitio catalítico es el único que se parece a la estructura de las PPasas solubles y se propone el mismo mecanismo para las vacuolares y de membrana (fig. 10) (Rea y col., 1992b; Kajander y col., 2013). Figura 10: Funcionamiento del sitio catalítico de una H+-PPasa o Na+-PPasa de membrana propuesto por Kajander y col., 2013. Según lo propuesto, el sustrato, PPi, se uniría al sitio catalítico, que se cerraría por el lado interno, liberando los cationes (H+ o Na+) al exterior. El sitio activo permanecería cerrado hasta que se hidroliza el PPi, momento en el que se abre de nuevo y se libera el Pi al interior. Modificado de Kajander y col., 2013. Introducción 52  Algunas plantas, protistas y procariotas poseen varias isoformas de H+- PPasa que, aunque están estrechamente relacionadas, poseen una diferenciación funcional (Pérez-Castiñeira y col., 2001b; Drozdowicz y Rea, 2001; Segami y col., 2010). En Arabidopsis thaliana se han descrito dos tipos de H+-PPasas, la AVP1 (tipo I), sensible a K+ y la AVP2 (tipo II) insensible a K+ (Drozdowicz y col., 2000). En P. falciparum también se han descrito dos tipos en función de su sensibilidad a K+: PfVP1 y PfVP2 (McIntosh y col., 2001) al igual que en arroz, Oryza sativa, cacao, Theobroma cacao, vid, Vitis vinífera, remolacha, Beta vulgaris, cebada, Hordeum vulgare y tabaco, Nicotiana tabacum, además de varias isoformas de PPasas solubles en cacao, Theobroma cacao, y patata, Solanum tuberosum (Kim y col., 1994; Lerchl y col., 1995; Sakakibara y col., 1996; Rojas-Beltrán, y col., 1999; Drozdowicz y col., 2000; 2001; Venter y Groenewald, 2006; Motamayor y col., 2013). La PPasa de tipo II funciona como una bomba de H+ en el retículo endoplasmático de Golgi y está relacionada con vesículas en los tejidos jóvenes, aunque su contenido es mucho más bajo que el de la enzima de tipo I (Segami y col., 2010). En una investigación reciente, a través del estudio de la estructura tridimensional, se propone que las H+-PPasas tipo I de plantas superiores y algas son homodímeros, mientras que las H+-PPasas de tipo II y las de tipo I de bacterias y protozoos, son monómeros (Wang y col., 2013) Englobadas en las H+-PPasas, existen un subtipo de enzimas que se caracterizan por ser inhibidas por Na+, al margen de su inhibición o activación dependiendo de la concentración de PPi y de iones K+. Recientemente se ha definido una nueva subfamilia de H+-PPasas de membrana que parcialmente retuvo sus patrones de regulación por Na+ y K+ de su precursor, la PPasa transportadora de Na+ (Scott y col., 1998; Luoto y col., 2015). Las Na+-PPasas son dependientes de K+ y podrían preceder evolutivamente a las H+-PPasas (Luoto y col., 2011). Introducción 53  También similares a las H+-PPasas, las ectoPPasas, descritas por ejemplo en la membrana plasmática de Leishmania amazonensis, contribuyen a la supervivencia del parásito por la participación en el metabolismo del fosfato. Se ha descrito una enzima ectoPPasa que comparte algunas características en común con las H+-PPasas. La actividad ectoPPasa resulta ser insensible al MnCl2, pero altamente sensible al MgCl2. Además, la hidrólisis extracelular de PPi es más eficiente a pHs alcalinos y sensible al NaF y al CaCl2. Esta actividad fue mayor en fases de cultivo exponencial, lo que sugiere un posible papel de la enzima en el crecimiento del parásito (FreitasMesquita y col., 2014). En las formas epimastigotes de Trypanosoma rangeli también se identificó una H+-PPasa en la membrana plasmática modulada de una forma muy similar. El pH óptimo para esta actividad PPasa es de 7,5 y el NaF bloquea su actividad. Esta enzima se muestra estimulada de una manera dosis dependiente por MgCl2 e inhibida por Ca+2, a través de la formación de Ca2PPi al competir éste con el Mg2PPi (Rea, y col., 1992b; Gordon-Weeks y col., 1996). La actividad también decreció cuando se incrementó la proliferación celular in vitro. Además, su actividad parece estar modulada por la concentración de PPi extracelular, y se incrementó aproximadamente al doble cuando las células fueron mantenidas en medio de cultivo sin PPi (Fonseca de Souza y col., 2014). 6.6.4.- Localización, funciones de las H+-PPasas y regulación de su expresión Las H+-PPasas integrales de membrana están presentes principalmente en las membranas de las vacuolas en plantas, y en los acidocalcisomas en protistas. Aparecen especialmente en especies en las que la limitación energética es frecuente y bajo condiciones de inanición y/o estrés abiótico (sequía, deficiencia de nutrientes, anoxia, estrés por frío, baja intensidad de luz, estrés por sal) incrementan su expresión para proveer un gradiente de H+ cuando escasea el ATP (Liu y col., 2010). Introducción 54  Las H+-PPasas cumplen el papel fisiológico en las vacuolas de hidrolizar PPi de manera acoplada a la translocación de H+ hacia el interior del orgánulo. Este gradiente puede emplearse en el transporte secundario de iones como el Cl-, Na+ y Ca+2, fundamentales para mantener la presión osmótica y el pH adecuados, para el funcionamiento de las enzimas localizadas en ese compartimento (Baykov y col., 1994; Pérez-Castiñeira y col., 2001a). La presencia de la combinación de dos bombas de H+, la H+-ATPasa y la H+- PPasa, en la vacuola digestiva de P. falciparum, es similar a la de las vacuolas de plantas, provocando la acidificación de la misma (Maeshima, 2001). De igual forma, en los acidocalcisomas de los tripanosomátidos, la H+-PPasa tiene un papel similar al de las H+-ATPasas, en la acidificación del interior del orgánulo (Docampo y col., 2013), lo que interviene en la supervivencia del parásito. La inanición y la autofagia química inducida, están acompañadas de la acidificación de los acidocalcisomas y el bloqueo de la acidificación por completo inhibe la formación de autofagosomas. En Trypanosoma se ha comprobado que bloqueando la biogénesis de los acidocalcisomas, se inhibe la autofagia (Li y He, 2014). Empleando la metodología del ARN de interferencia, se ha contemplado que la H+-PPasa de T. brucei no solo juega un importante papel en la regulación del Ca+2, el Poli P, el contenido de H+ de los acidocalcisomas regulando el pH, sino que también es requerida para un crecimiento normal in vitro de las formas procíclicas (Lemercier y col., 2002). La exclusión del exceso de Na+ del citoplasma y la acumulación de Na+ en vacuolas, son los principales mecanismos de las plantas al estrés por sal (López-Marqués y col., 2004). En Solanum tuberosum esto generalmente se lleva a cabo por transportadores transmembrana que excluyen iones Na+ del citosol y los cambian por H+, un proceso dependiente de energía (Silva y Gerós, 2009). En situaciones de estrés inducido por la salinidad, la capacidad de compartimentalizar la sal en vacuolas es muy importante para mantener la Introducción 61  2015). La ART juega un rol central en el incremento de la resistencia a fármacos causada por el parásito de la malaria Plasmodium falciparum. Además de frente a la malaria, la ART y sus derivados resultan potencialmente efectivos frente a otras enfermedades parasitarias como la esquistosomiasis, aunque no es efectivo para todas las especies (Borrmann y col., 2001), así como frente a Toxoplasma gondii y Trypanosoma. Asimismo, se ha visto que la ART también posee propiedades antihelmínticas (Ekanem y Brisibe., 2010). Actúa destruyendo las células de los organismos parásitos a través de la generación de radicales libres de oxígeno altamente reactivos y la oxidación de proteínas y lípidos de las membranas, así como la inactivación de proteínas canal, ocasionando una pérdida del potencial de membrana mitocondrial y por lo tanto una disfunción en la mitocondria (Golenser y col., 2006). El principal sitio de actuación y acumulación de la ART es el retículo endoplasmático (Liu y col., 2010), aunque también se ha detectado la inhibición de las cisteína-proteasas de la vacuola digestiva y la producción de daños a nivel de la membrana vacuolar (Crespo y col., 2008). Por otra parte, en el ciliado T. thermophila, otro de los efectos que se ha percibido en derivados de la ART (artesunato y dihidroartemisinina) es la modulación del crecimiento (Shen y col., 2010). Otro de los posibles mecanismos de acción que se ha propuesto para la ART es la inhibición de la Ca+2-ATPasa, por ejemplo en P. falciparum (Eckstein-Ludwig y col., 2003; Golenser y col., 2006; Shandilya y col., 2012); esto concuerda con la observación de una alteración en la homeostasis del Ca+2 intracelular en T. gondii provocada por este compuesto (Nagamune y col., 2007). Introducción 62  7.3.2.-Cloroquina La cloroquina ((RS)-N'-(7-cloroquinolina-4yl)-N, N-diethil-pentano-1,4-diamina; CQ, fig. 15), es un derivado de la quinina.Se ha venido empleando desde hace tiempo como tratamiento preventivo de la malaria, producida por P. falciparum.Se acumula preferentemente en los lisosomas y en las vacuolas acídicas y acidocalcisomas, a los que entra por difusión simple; una vez allí, se protona (CQ +2 ) por lo que no puede salir e interfiere con procesos esenciales para la supervivencia del parásito, liberando ROS (López y Segura Latorre, 2008; Li y He, 2014), aunque también puede mostrar propiedades antioxidantes en función de su dosis (Herrerías-Gutiérrez y col., 1996; Tripathy y col., 2012). En P. falciparum tratados con concentraciones subletales de CQ durante 36h, se observa una regulación positiva de la expresión de dos genes implicados en la acidificación vacuolar, la P-ATPasa y la V-H + -Pirofosfatasa II (Mwai y col., 2012); esta última podría estar implicada en la resistencia a CQ según datos de un reciente estudio, aunque es necesario realizar más investigaciones al respecto (Jovel y col., 2014).  Figura 15: Estructura de la CQ. Fuente: ChEMBL     Objetivos  Objetivos 65  Philasterides dicentrarchi es un parásito histiófago emergente, causante de la escuticociliatosis en el rodaballo en cultivo, entre otras especies, que provoca actualmente enormes pérdidas en el sector de la acuicultura. La problemática de la escuticociliatosis se ve agravada por la inexistencia de tratamientos quimioterapéuticos, por lo que la búsqueda de dianas para el diseño y desarrollo de nuevos fármacos efectivos y no tóxicos, tanto para el hospedador como para el consumidor humano, es esencial para abordar el control farmacológico de esta enfermedad. En la búsqueda de potenciales dianas farmacológicas efectivas, proponemos estudiar el papel de moléculas clave que participan en rutas metabólicas relacionadas con la obtención de energía por este protozoo. En primer lugar, evaluaremos la presencia de enzimas específicas que aparecen en organismos parásitos y que están asociadas a la cadena de transporte de electrones mitocondrial, ya que la mitocondria es el orgánulo central encargado del metabolismo energético. A este respecto, la propuesta inicial de este estudio está basada en resultados previos que sugieren la posible existencia de una ruta alternativa de la respiración en este ciliado, en la que participaría una oxidasa terminal (AOX) que podría ser vital para su supervivencia en ambientes acuáticos microaerófilos y, adicionalmente, le podría servir también como mecanismo de adaptación bioquímica al parasitismo cuando este ciliado infecta al pez. La otra diana que proponemos es una enzima, la pirofosfatasa inorgánica translocadora de protones (H+-PPasa), que juega un importante papel en el metabolismo energético de muchos organismos, incluidas varias especies de protozoos parásitos, proporcionando un recurso termodinámico adicional al ATP para muchas reacciones biosintéticas, catalizando la hidrólisis del pirofosfato (PPi), un elemento crítico en el metabolismo celular, que actúa tanto como un donador de energía como un regulador alostérico en varias rutas metabólicas. Estas dos enzimas comparten las siguientes características: a) aunque inicialmente se han descrito en hongos y plantas superiores, hoy se Objetivos  66  sabe que existen también en varias especies de protozoos patógenos y de vida libre; b) están ausentes en los animales vertebrados y, por tanto, en su hospedador. En definitiva, una investigación sobre inhibidores de estas enzimas, nos proporcionaría información muy importante para desarrollar una nueva quimioterapia antiparasitaria frente a la escuticociliatosis del rodaballo evitando efectos adversos sobre su hospedador (el pez) y sobre los consumidores (el hombre). Por todo ello, en el presente estudio nos hemos planteado dos objetivos principales 1. Investigar la posible existencia de una oxidasa terminal (AOX) insensible al cianuro en la cadena respiratoria mitocondrial del parásito escuticociliado P. dicentrarchi, con fin de realizar su caracterización, estudiar su actividad y sus variaciones de expresión bajo diferentes condiciones fisiológicas, y analizar el efecto de dos polifenoles con actividad antioxidante: el propilgalato y el resveratrol, sobre las rutas clásica y alternativa de la respiración, así como su posible efecto antiparasitario. 2. Comprobar la existencia de una H+-PPasa en P. dicentrarchi, llevar a cabo su caracterización tanto bioquímica como funcional, investigando particularmente su papel fisiológico en la osmorregulación, el mantenimiento del pH y la regulación del calcio intracelular. Asimismo, nos propusimos estudiar el efecto antiparasitario de varios compuestos que podrían actuar a nivel de enzimas relacionadas con el metabolismo del pirofosfato y del Ca+2, con el fin de demostrar que estas enzimas podrían suponer dianas terapéuticas para el desarrollo de nuevos fármacos frente a la escuticociliatosis.     MaterialyMétodos  MaterialyMétodos 69  1. - Animales de experimentación 1.1.- Rodaballos Rodaballos, Scophthalmus maximus (L.), de aproximadamente 50 g de peso, fueron obtenidos de varias piscifactorías en Galicia y distribuidos en tanques de 250 L con recircularización de agua de mar y aireación constante. Durante los experimentos, los peces se mantuvieron a una temperatura de 1718 ºC, bajo un fotoperiodo de 12 h luz/oscuridad y se alimentaron diariamente con pienso comercial (Skretting, Burgos, España). Antes de dar comienzo a los experimentos, los peces se aclimataron previamente a las condiciones de laboratorio durante como mínimo 2 semanas. 1.2.- Ratones Se utilizaron ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad, obtenidos de Harlan OLAC Ltd. (Oxon, Inglaterra) e ICR (Swiss) CD-1 de 8-10 semanas de edad adquiridos de Charles River Laboratories (Barcelona). 1.3.- Bioética Todos los experimentos fueron llevados a cabo siguiendo las directrices del Real Decreto 53/2013 del 1 de febrero, por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos y la guía de cuidado y uso de animales de laboratorio adoptado por el instituto nacional de salud (NIH). Todos los protocolos experimentales han sido aprobados por el Comité Institucional de cuidado y uso animal de la Universidad de Santiago de Compostela. MaterialyMétodos 70  2.- Reactivos químicos Los reactivos químicos empleados para la realización de este trabajo fueron de grado analítico y se adquirieron a Sigma-Aldrich excepto el PG (Fluka) y el bisfosfonato AMDP (Chemlin; Nanjing Chemlin Chemical industry Co, Ltd, China). Todas las disoluciones acuosas se prepararon con agua ultrapura, y las soluciones stock de los compuestos que se emplearon como tratamiento en los ciliados; AMA, SHAM, PG, RESV, CQ, ART y los bisfosfonatos, se disolvieron en DMSO y fueron almacenadas a -20ºC hasta su uso. 3.- Técnicas parasitológicas 3.1.-Parásitos 3.1.1.- Ciliados: Philasterides dicentrarchi. Cultivo e infecciones experimentales Los ciliados utilizados se obtuvieron en condiciones asépticas a partir líquido ascítico de la cavidad peritoneal de rodaballos con signos de escuticociliatosis en varias piscifactorías de Galicia (España) y el Algarve (Portugal) (cepa I1, Iglesias y col., 2001; cepas B1, C1, D2, D3, P1 y S1, Budiño y col., 2011) con fines comparativos. Los ciliados se obtuvieron en condiciones asépticas tal y como ha sido descrito previamente por Iglesias y col., 2001. Una vez aislados, los ciliados fueron cultivados a 21 ºC en medio L-15 completo estéril (Leibovitz, PAA Laboratories GmbH, 10 % salinidad, pH 7.2) suplementado con 90 mg/L de adenosina, citidina y uridina, 150 mg/L de guanosina, 5 g/L de glucosa, 400 mg/L de L-α-fosfatidilcolina, 200 mg/L de Tween 80, 10 % de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS) y 10 mL/L de una solución de antibióticos y antimicóticos (procedentes de una solución stock 100X y conteniendo una concentración final en el medio de MaterialyMétodos 71  100 unidades/mL de penicilina G, 0,1 mg/mL de sulfato de estreptomicina y 0,25 mg/mL de anfotericina B; Sigma-Aldrich), como ha sido descrito previamente por Iglesias y col., 2003a. En los experimentos llevados a cabo en normoxia, los ciliados fueron cultivados en frascos de cultivos con tapas que permitan la ventilación. Para los experimentos en hipoxia, se burbujeó argón durante al menos 10 min sobre el medio L-15 completo y a continuación se cerraron herméticamente los frascos que contenían los cultivos. En los experimentos realizados para investigar el efecto de la salinidad, los ciliados fueron cultivados en soluciones salinas, a varias concentraciones, suplementadas con un 10% de FBS. Con el propósito de mantener la virulencia de los ciliados, se realizaron infecciones experimentales cada 6 meses mediante inyección intraperitoneal de 200 μL de solución salina fisiológica (SSF; NaCl 0,15 M) estéril, conteniendo 5 x 105 ciliados. Los ciliados se recuperaron del fluido ascítico como ha sido descrito previamente (Paramá y col., 2003; Leiro y col., 2008). 3.1.2.- Apicomplejos:Plasmodium berghei. Infecciones experimentales yobtención del parásito. La cepa de Plasmodium berghei, (Vincke y Lips, 1978; ATCC® 50175™) se descongeló siguiendo las instrucciones de uso recomendadas por la ATCC, transfiriéndola a un baño a 35 ºC, y se centrifugó a 300 x g durante 5 min, sustituyendo el sobrenadante (correspondiente al medio de congelación) por solución SSF. Para su propagación, se inyectaron los parásitos contenidos en la ampolla suministrada por la casa comercial en ratones ICR (Swiss) CD-1 de 8-10 semanas de edad (adquiridos en Charles River Laboratories, Barcelona) por vía intraperitoneal. Semanalmente, se extrajo sangre del seno venoso periorbital y se realizó la comprobación del MaterialyMétodos 72  nivel de parasitemia tras la tinción de frotis de glóbulos rojos con una tinción hematológica (ver a continuación). 3.1.2.1. - Tinción de glóbulos rojos Para la tinción de los frotis sanguíneos se empleó el colorante comercial Diff-Quick (IHCWorld) (Woodstock, EE.UU), una modificación de la tinción de Giemsa, siguiendo las instrucciones del fabricante. El frotis sanguíneo se dejó secar al aire y una vez fijado con metanol durante 30 segundos, se añadió el colorante durante otros 30 segundos. Se lavó con agua para eliminar el exceso de colorante y se deshidrató en etanol absoluto seguido del montaje y observación al microscopio óptico. Cuando la intensidad de infección era elevada (porcentaje de glóbulos rojos infectados (> 80 %) se procedió al sangrado completo de los ratones a través del plexo venoso retroorbital. 3.2.- Microscopía electrónica de transmisión (TEM) Los ciliados (5 x 106 células) se recogieron por centrifugación a 1000 x g durante 5 min. Después de la fijación durante 12 h en glutaraldehido al in 2,5 % (v/v) tamponado en cacodilato sódico a 0,1 M, pH 7,2 a 4 ºC, los ciliados se lavaron dos veces con tampón cacodilato 0,1 M, cada uno de ellos de 4 min de duración. A continuación se post-fijaron con OsO4 al 1 % (p/v), en tampón cacodilato al 0,1 M durante 1 h a 4 ºC y seguidamente se realizaron 3 lavados de 15 min con tampón maleato-NaOH 0,05 M a pH 5,2. Posteriormente las muestras se tiñeron con una solución de acetato de uranilo al 2 % en tampón maleato, pH 4,2, durante 2 horas a 4 ºC. Tras una batería de deshidratación con acetona (5 min en cada uno de los siguientes: 25 %, 75 %, 95 %, y tres cambios en acetona al 100 %), las muestras fueron embebidas en una mezcla a partes iguales de acetona pura y resina Spurr y se dejaron en esa solución durante 12 h a 4 ºC. La resina Spurr fue preparada conteniendo 10 g MaterialyMétodos 79  (DTT) y 1 mM de fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) e incubado a 100 ºC durante 5 minutos. Para la caracterización de las proteínas nativas, se emplearon muestras preparadas en tampón no reductor, que posee la misma composición que el tampón reductor excepto que carece de DTT y las muestras no se sometieron al tratamiento con calor. 5.1.2.-Extracción de proteínas de membrana de P. dicentrarchi Las proteínas del ciliado asociadas a membrana (MAP) fueron extraídas por separación de fases en una solución de Triton X-114 (Bordier, 1981), mediante el método previamente descrito por Iglesias y col., 2003b, con pequeñas modificaciones. Las células (107) fueron resuspendidas en 1 mL de tampón Tris (tris(hidroximetil)aminometano)– HCl 10 mM frío, a pH 7,5, al que se le añadió 1 mL del tampón de extracción también frío, conteniendo NaCl 300 mM, Tris–HCl 20 mM, pH 7,5 y Triton X-114 al 2 %. Se eliminaron los elementos pertenecientes al citoesqueleto que quedaron en el pellet mediante centrifugación a 16000 x g durante 10 min a 4ºC. El sobrenadante se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 mL y se calentó a 37 ºC durante 5 min. Al final del proceso, la solución presentó un aspecto de nube debido a la condensación del detergente. La muestra se dividió en tubos Eppendorf de 0,5 mL (200 μl/tubo) conteniendo cada uno de ellos 300 μl de una solución de sacarosa (sacarosa 6%, NaCl 150 mM, Tris–HCl 10 mM, pH 7,5 y Triton X-114 al 0,06%). Seguidamente, el detergente y las fases acuosas fueron separados por centrifugación a 300 x g, durante 5 min a temperatura ambiente. Los sobrenadantes resultantes de cada tubo fueron extraídos cuidadosamente y mezclados en tubos Eppendorf de 1,5 mL. El proceso de extracción fue repetido una vez más añadiendo a la mezcla acuosa la cantidad suficiente de Triton X-114 para obtener una concentración final de 0,5 % de este. La mezcla se calentó a 37 ºC, 5 minutos, y después de la condensación micelar, se distribuyó en tubos Eppendorf conteniendo una solución de MaterialyMétodos 80  sacarosa 0,2 M en PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) y la fase de detergente separada en la primera extracción. Los tubos se centrifugaron a 300 x g durante 4 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, el sobrenadante se descartó y las proteínas contenidas en la fase del detergente se precipitaron por la adición de 9 volúmenes de acetona fría, seguidamente se resuspendieron por vórtex y se incubaron durante 30 min en hielo. Las proteínas de membrana precipitadas, se recogieron por centrifugación a 16000 x g durante 15 min a 4ºC y el pellet se secó en un concentrador por vacío (MiVac, GeneVac, UK). Finalmente, los extractos obtenidos fueron resuspendidos en 10 mM Tris–HCl, pH 7,5, y guardados a -80 ºC hasta su empleo posterior. 5.1.3.- Construcciones plasmídicas para producción de vacunas de ADN. El ADN de P. dicentrarchi fue obtenido como se ha descrito con anterioridad. Una secuencia parcial del gen de la H+-PPasa se amplificó por PCR usando la pareja de cebadores diseñados y optimizados con el programa Primer 3 Plus (directo/reverso; (FPiph/RPiph) 5’- CGGGACCAGAGGTATCTTTTA-3’ / 5’-ATTGATGTCAACGCCCCC-3’). La PCR inicialmente se desarrolló tal y como se ha descrito previamente y los productos de PCR se purificaron empleando un gel de agarosa al 1% en tampón de electroforesis TAE modificado (40 mM Tris–acetato, pH 8, 0,1 mM EDTA-Na2) conteniendo EtBr (0,5 mg/ml). La banda de ADN se recortó del gel con la ayuda de un transiluminador, y se purificó con el empleo de un filtro de purificación de ADN a partir de geles de agarosa (MicroconPCR, Millipore, EE.UU). Una vez purificado el producto de PCR, se clonó en el vector pTargeTTM-Mammalian Expression Vector System (Promega, EE.UU) (fig. 16) usando las instrucciones del kit suministradas por el fabricante. Se transformaron células de Escherichia coli (cepa JM109) y seleccionaron en base a su sensibilidad a ampicilina (Amp) y su color, y el ADN plasmídico MaterialyMétodos 81  fue purificado empleando el sistema Endo Free Plasmid Maxi Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones de uso del kit. El ADN plasmídico purificado fue clonado y testado por secuenciación e inyectado en ratones como se describe posteriormente. Figura 16: Mapa esquemático del vector pTarget. Promega 5.1.4.- Producción proteínas recombinantes en vector pET21d. El ARNm de P. dicentrarchi fue extraído a partir de 5x10 6 ciliados siguiendo el mismo método que se ha descrito con anterioridad. Una secuencia parcial del gen de la H + -PPasa fue amplificado por RT-PCR empleando los cebadores (con sitio de corte) directo: 5’- CCCGAATTCCGGGACCAGAGGTATCTTTTA-3’ (EcoRI) y reverso: 5′- AAGGGGGCGTTGACATCAATGCGGCCGCAAA-3′ (Not I) siguiendo el método descrito anteriormente. El producto de PCR purificado fue clonado en el vector de expresión pET-21d (Promega, EE.UU.) (fig. 17) y transformado en las células de E. coli BL21 (DE3) siguiendo los protocolos estándares. Los clones positivos fueron confirmados por secuenciación nucleotídica. La expresión en los cultivos en fase logarítmica fue inducida con diferentes concentraciones de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (0,5, 1,0, 1,5, y 2,0 mM) en medio Luria Bertani (LB; conteniendo triptona 10 g/L, extracto MaterialyMétodos 82  de levadura 5 g/L, NaCl 5 g/L, pH 7) y revisado cada hora en un intervalo de 5 horas. Para identificar la localización de la proteína recombinante, la suspensión celular fue sometida a sonicación y el lisado celular resultante fue centrifugado a 11000 x g durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante clarificado y el pellet obtenido fueron recogidos por separado y analizados por electroforesis SDS-PAGE del mismo modo que se describirá con posterioridad. Los clones recombinantes de las células BL21 (DE3) vieron inducida su expresión a través del empleo de una solución de isopropil-β-D-1tiogalactopiranósido, (IPTG) 1 mM a 37 ºC durante 7 h en medio LB conteniendo 50 μg/mL de Amp. Figura 17: Esquema del vector pET-21d (Promega). MaterialyMétodos 83  Cuando la OD600 del cultivo alcanzó un valor aproximado de 0,6, el pellet celular fue resuspendido en 5 mL de tampón de lisis celular MCAC-0 (20 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,5 M NaCl, 10 % v/v glicerol y 1 mM PMSF) y se le añadieron 50 µL de un cóctel inhibidor de proteasas 100x (Promega). Inicialmente, la muestra fue disgregada por ultrasonidos durante 3 ciclos de 5 pulsos de 1 min a 60 W en un equipo W-250 Sonifier (Branson Ultrasonic Corporation) y después sometida a 3 ciclos de refrigeración a -70 ºC y descongelación en hielo añadiendo 0,05 mL de 1 M Mg Cl2 y 0,05 mL de una solución de DNasa I. Tras incubar 10 min a temperatura ambiente, se centrifugó a 11000 x g durante 30 min a 4 ºC y el sobrenadante obtenido fue analizado por SDS PAGE. La proteína recombinante fue purificada por cromatografía de afinidad usando una columna precargada de níquel, Ni Sepharose Histrap Column (GE Healthcare Life Sciences) en un sistema de cromatografía líquida ÄKTAprime Plus (GE Healthcare Life Sciences). Inicialmente, la columna fue equilibrada con 5 mL de tampón de unión (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazol, pH 7,4) y posteriormente, la unión de la proteína a la columna fue eliminada haciendo pasar 15 mL del tampón de elución (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, 250 mM imidazol, pH 7,4). Cada fracción eluida fue recogida en alícuotas de 1 mL con un colector de fracciones, y analizada por electroforesis SDS-PAGE al 12,5 %. Las fracciones de proteína purificada fueron dializadas toda la noche frente a agua destilada y luego concentradas empleando un sistema de concentración por centrifugación Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (Millipore, EE.UU) con un poro de membrana de 10 kDa. La concentración final de la proteína se estimó por el método de Bradford empleando un reactivo Bio-Rad Protein Assay (Bradford, 1976). MaterialyMétodos 84  5.1.5.- Producción de proteínas recombinantes en levadura El ADNc de P. dicentrarchi fue obtenido tal y como se ha descrito previamente y la PCR se realizó con los cebadores específicos diseñados para una secuencia parcial de la pirofosfatasa translocadora de electrones de P. dicentrarchi (pareja de cebadores directo/reverso 5’- AAAGAAGAAGGGGTACCTTTGGATAAAAGAattgatgtcaacgccccctt3’/5’- TGGGACGCTCGACGGATCAGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTG GTGgggaccagaggtatctttta-3’). Estos cebadores fueron diseñados y optimizados empleando la base de datos del genoma de Saccharomyces, disponible en (http://www.yeastgenome.org/), incluyendo la región de hibridación con el plásmido de levaduras YEpFLAG-1 (Eastman Kodak Company) y la cola de histidinas, región poly-His (las letras en minúscula se corresponden con la zona de anillamiento del gen). La reacción de PCR se desarrolló inicialmente a 95 ºC durante 5 min, y después de 30 ciclos de 94 ºC, 1 min, 55 ºC, 1.5 min y 72 ºC, 2 min, una fase de extensión a 72 ºC, 7 min. Los productos de PCR fueron purificados usando el kit de purificación Gene Jet PCR Purification Kit (Fermentas, Life Sciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR purificados, fueron clonados en el vector de expresión de levaduras YEpFLAG-1 (Eastman Kodak Company) (fig. 18). Este vector contiene un plásmido que contiene un gen (TRP1) que completa la auxotrofía por el triptófano de la célula hospedadora (López-López y col., 2010). El plásmido YEpFLAG-1 una vez linearizado por digestión con el enzima EcoRI y SalI (Takara) fue empleado para transformar células de Saccharomyces cerevisiae (cepa BJ 3505) por el procedimiento del acetato de litio (Ito y col., 1983). Las colonias positivas fueron seleccionadas usando medio completo sin triptófano (CM-Trp) conteniendo glucosa (20 g/L), medio MaterialyMétodos 85  Yeast Nitrogen Base (YNB) sin aminoácidos (Sigma-Aldrich), adenina (40 mg/L) y los aminoácidos (histidina, leucina, tirosina, 40 mg/L de cada uno; arginina, metionina, treonina 10 mg/L de cada uno; isoleucina y fenilalanina 60 mg/L y 40 mg/L, respectivamente). Figura 18: Mapa del vector de expresión en levaduras YEpFLAG-1. Sigma-Aldrich El ADN plasmídico fue entonces extraído empleando Easy Yeast Plasmid Isolation Kit (Clonetech) siguiendo las instrucciones de uso del fabricante y el fragmento de ADN purificado fue analizado por secuenciación (Sistemas Genómicos, España). La proteína recombinante de P. dicentrarchi fue purificada desde los cultivos celulares de Saccharomyces cerevisiae después de 72 horas de crecimiento en medio modificado de expresión de alta estabilidad plasmídica (Yeast Peptone High Stability Expression Medium (YPHSM)) conteniendo 1 MaterialyMétodos 86  % de glucosa, 3 % de glicerol, 1 % de extracto de levadura, y un 8 % de peptona, a 30ºC en matraces Erlenmeyer rellenados aproximadamente con un 20 % de su volumen con medio de cultivo y en agitación a 250 rpm (LópezLópez, y col., 2010). Como inóculo se empleó un volumen adecuado de un pre-cultivo para obtener una OD600 inicial de 0,1. La suspensión celular fue centrifugada a 7500 x g durante 15 minutos y el sobrenadante clarificado fue purificado por una cromatografía de afinidad en una columna precargada de níquel-sefarosa, Ni-Sepharose Histrap column (ÄKTAprime plus, GE Healthcare Life Sciences). Inicialmente, la columna se equilibró con 25 mL de tampón de unión (20 mM fosfato sódico, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazol, pH 7,4). Después del equilibrado de la columna, se cargaron 100 mL de medio de cultivo, a un flujo de 0,5 mL/min y finalmente, la proteína retenida en la columna se eluyó con tampón de elución (20 mM fosfato sódico, 0,5 M NaCl, 250 mM imidazol, pH 7,4). Se recogieron fracciones del eluido y se analizaron en un gel de acrilamida-bisacrilamida (SDS-PAGE) al 12,5 % y paralelamente se dializaron durante toda al anoche en agua bidestilada. La muestra dializada se concentró con un filtro Amicon ultra (Millipore, EE.UU) con un tamaño de poro de 10 kDa. La concentración proteica final se calculó a través del ensayo de Bradford (Bradford, 1976) empleando un reactivo comercial (Bio-Rad Protein Assay). 5.1.6.- Síntesis péptidíca Se encargó la síntesis química de un péptido con 17 aminoácidos, correspondiente con el dominio (PABHK, HKAAVIGDTIGDPLKDT) de la H+-PPasa de P. dicentrarchi y se conjugó con keyhole-limpet hemocyanin (KLH), una proteína carrier, con la finalidad de asegurar el máximo nivel de inmunogenicidad (ProteoGenix, Francia). El aminoácido cisteína fue añadido a la secuencia para permitir su conjugación con el KLH. El péptido fue sintetizado y conjugado con el KLH por acoplamiento sulfo-SMCC a un MaterialyMétodos 87  rendimiento de 10-20 mg teniendo una pureza mayor del 85 %; posteriormente fue liofilizado y almacenado a -20 ºC hasta su uso. 5.1.7.- Determinación de la concentración proteica La concentración de proteínas en las muestras fue determinada mediante el método de Bradford (1976), utilizando el reactivo comercial BioRad Protein Assay (BioRad Laboratories, Alemania). Para la cuantificación, se construyó una recta de calibrado con diferentes concentraciones de seroalbúmina bovina (BSA; Sigma-Aldrich). 5.2.- Inmunizaciones y obtención de los sueros policlonales 5.2.1.- Inmunización genética Inicialmente un grupo de 5 ratones BALB/c fueron anestesiados previamente por inyección intraperitoneal (i.p.) con 30 μL de una mezcla de 0,4 mL de 100 mg/mL de ketamina y 0,1 mL de 20 mg/ml de xilacina. La inmunización genética se realizó inyectando en el cuádriceps de ratón a 0,5 cm sobre la rodilla, 0,2 cm de profundidad y una ángulo de 30º, con la ayuda de una jeringuilla de tuberculina provista de una aguja de 28G (Becton Dickinson, EE.UU) un volumen de 50 μL de solución salina (0,9 % NaCl, estéril) conteniendo 50 μg del plásmido puro obtenido empleando el Qiagen Plasmid Maxi kit (Qiagen) y 50 μL de solución salina conteniendo 0,4 % azul de tripano. Transcurridos 30 días, los ratones fueron reinmunizados con la misma dosis de plásmido y por la misma vía. 5.2.2.- Inmunización con proteínas/péptidos Los ratones se inmunizaron intraperitonealmente, con 200 µL de una dilución 1:1 (v/v) de la mezcla con adyuvante completo de Freund (ACF; Sigma–Aldrich) y 500 µg de la proteína recombinante de levaduras purificada o con 400 µg del péptido (PABHK). Los ratones empleados en este caso fueron MaterialyMétodos 88  de la cepa ICR (Swiss) CD-1, dos grupos de 5 ratones para cada preparación antigénica. Estas mismas dosis en adyuvante incompleto de Freund se volvieron a inyectar a los 15 y 30 días tras la primera inmunización. 5.2.3.- Obtención del suero Para la obtención del suero inmune, los ratones inmunizados se sangraron vía plexo venoso retrobulbar 7 días después de la segunda reinmunización (Piazzón y col., 2011). La sangre obtenida se dejó coagular durante 2 h a temperatura ambiente y durante toda la noche a 4 ºC. Tras la coagulación, el suero se extrajo mediante centrifugación a 2500 x g durante 5 min a 4 ºC y se almacenó a -20 ºC diluido 1:1 en glicerol hasta su uso. 5.3.- Inmunoensayos 5.3.1.- Determinación de los niveles de anticuerpos en el suero 5.3.1.1.- ELISA Para la titulación inicial de los sueros de los ratones inmunizados con antígenos de membrana (MAP) o totales de P. dicentrarchi obtenidos como se ha descrito con anterioridad, se empleó un ensayo ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) indirecto, como se ha descrito previamente (Sanmartín y col., 2008). El antígeno se resuspendió en tampón de acoplamiento (carbonato-bicarbonato, pH 9.6), a una concentración de 20 µg/mL. A continuación, se añadió a una microplaca de ELISA de 96 pocillos (Iwaki, Japón), 100 μL de la muestra por pocillo y la placa se incubó durante toda la noche a 4 ºC. Las placas se lavaron posteriormente 3 veces con TBS (50 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4) y se bloquearon durante 1 hora con TBS conteniendo 0,2 % Tween 20 (TBS-T) y 5 % de leche descremada en polvo. Seguidamente, se incubaron con 100 μL de diferentes diluciones del suero a estudio en TBS-T conteniendo 1 % de leche en polvo descremada durante 30 min en agitación a 750 rpm a temperatura ambiente y se lavaron durante 5 MaterialyMétodos 95  Tras la inmunofluorescencia, algunos ciliados se tiñeron doblemente para visualizar los núcleos. Para ello, los ciliados se incubaron con una solución 0,8 mg/ml de 40, 6-diamidine-20-fenilindol (DAPI; Sigma-Aldrich) en DPBS durante 15 min a temperatura ambiente. Después de varios lavados con DPBS, se montaron en DPBS/glicerol 1:1 se visualizaron al microscopio de fluorescencia (Zeiss Axioplan, Alemania) y/o al microscopio confocal (Leica TCS-SP2, LEICA Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Alemania). 6.- Técnicas Fisiológicas y Bioquímicas 6.1.- Técnicas para el estudio de la función mitocondrial 6.1.1.- Determinación del consumo de oxígeno mitocondrial Para estudiar el funcionamiento de la cadena respiratoria mitocondrial, se realizó un ensayo polarográfico mediante la medición del consumo de O2 con un electrodo de Clark. Para ello, los ciliados fueron permeabilizados con digitonina (DIG) (Sigma –Aldrich) (Cuperus y col., 2010). La suspensión de ciliados (3 x 106 ciliados /ml) se lavó dos veces con medio L-15 incompleto, (medio L-15 sin nucleósidos, glucosa, lípidos ni FBS) por centrifugación a 700 x g, 5 min. A continuación, se añadió el inhibidor de proteasas fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF; Sigma-Aldrich) a una concentración final 1 mM y DIG a una concentración final de 6,6 μM. Los tubos se agitaron cuidadosamente durante un minuto para evitar romper los ciliados, y se volvieron a centrifugar a 700 x g 5 min a 4 ºC y se resuspendieron finalmente en medio L-15 incompleto a una concentración de 5 x 106 ciliados/mL. Antes de la realización del ensayo, se procedió al calibrado del oxímetro (Hansatech Instruments, UK) y posteriormente se rellenó la cámara de incubación, con 500 μL de medio L-15 incompleto. Tras un breve periodo de estabilización del equipo se añadieron, con el empleo de una jeringuilla Hamilton, para MaterialyMétodos 96  evitar la formación de burbujas e introducción de aire en la cámara, 50 μL de las siguientes soluciones stock preparadas en tampón fosfato salino (PBS): ADP 50 mM, glutamato 1 M (G), succinato 1 M (S) junto con 0,1 mL de células permeabilizadas atemperadas a 25 ºC (Morais y col., 2009). Todos los ensayos fueron realizados por triplicado, y el consumo de oxígeno fue analizado con el programa informático Oxygraph Plus (Hansatech, UK). Se estudió el funcionamiento de la cadena respiratoria mediante el consumo de oxígeno con diferentes inhibidores: el cianuro (KCN), un inhibidor de la vía clásica, y el ácido salicilhidroxámico (SHAM), un inhibidor de la vía alternativa de la respiración. Las concentraciones finales de los inhibidores empleadas fueron 100 μM KCN y 1 mM SHAM (SigmaAldrich). La diferencia en el ratio de consumo de O2, antes y después de la adición del compuesto, fue determinada como porcentaje de inhibición. Para analizar el consumo total de O2 por los ciliados se ha empleado el mismo método descrito aquí, pero sin tratar los ciliados previamente con DIG y sin adicionarles sustratos metabólicos. Para el estudio del consumo de oxígeno con el empleo de diferentes inhibidores, las concentraciones finales de los inhibidores antimicina A (AMA), trans-resveratrol (RESV) y propilgalato (PG) fueron de 100 μM. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado, y el consumo de oxígeno fue analizado con el software Oxygraph Plus (Hansatech UK). 6.1.2.- Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) El ΔΨm de P. dicentrarchi se determinó empleando el kit JC-1 (Invitrogen, EE.UU), con la sonda catiónica fluorescente ioduro de 5,5′, 6,6′- tetracloro-1,1′, 3,3′ tetraetilbenzimidazol-carbocianina (JC-1). La sonda JC-1 es un colorante catiónico que se acumula en las mitocondrias en función del potencial de membrana, pasando de fluorescencia verde a roja y dando lugar a la formación de agregados rojos al incrementarse MaterialyMétodos 97  el potencial. La despolarización de la membrana implica, por lo tanto, una disminución de la relación de la intensidad de fluorescencia roja/verde (Roy y col., 2008). Para este ensayo, 5 x 105 trofozoítos de P. dicentrarchi/mL se resuspendieron en medio L-15 conteniendo PG a unas concentraciones finales de 0, 6,25, 12,5 y 25 μM, RESV a unas concentraciones finales de 25, 50 y 100 μM y se incubaron en una placa multipocillos de 96 pocillos durante 2 horas a 25 ºC (Morais y col., 2009). Transcurrido este periodo, se añadió en cada pocillo 10 μL de la sonda diluida a 1:10 en medio L-15 se incubó en oscuridad durante 30 min a 25 ºC. Seguidamente el PG y el RESV se eliminaron por centrifugación de las placas a 200 x g durante 5 min y los trofozoitos se lavaron dos veces con 200 μL de medio L-15 y se resuspendieron en 100 μL de L-15. Finalmente, la fluorescencia emitida se midió en un fluorímetro de microplacas (FLx800, Biotek, EE.UU), con unos filtros de excitación/emisión de 485/535 nm. En todos los experimentos, la fluorescencia producida por la oxidación espontánea de la sonda fue sustraída de los valores de fluorescencia obtenida de las muestras experimentales. 6.2.- Actividad translocadora de H+ dependiente de pirofosfato El ensayo se llevó a cabo por fluorimetría usando naranja de acridina como indicador de la diferencia de pH transmembrana en medio de ensayo enriquecido en vacuolas del ciliado. El naranja de acridina es un colorante catiónico fluorescente que se acumula en los compartimientos ácidos, ya que su forma no ionizada prevalece en punto muerto para ambientes alcalinos, emitiendo fluorescencia verde, en este estado difunde fácilmente a través de las membranas; sin embargo, su forma ionizada, que prevalece en ambientes ácidos y emite fluorescencia naranja, no atraviesa la membrana. Consecuentemente, la acumulación de naranja de acridina en compartimentos MaterialyMétodos 98  ácidos, puede ser visualizada como un naranja brillante observando al microscopio de epifluorescencia. La pérdida de la compartimentalización de la fluorescencia naranja o el incremento de la fluorescencia verde en el citosol, es un signo de alcalinización (Rohloff y Docampo., 2006). Los ciliados (2,5 x 105 células) fueron lavados con PBS por centrifugación. Se resuspendieron en el tampón de ensayo conteniendo 100 mM KCl, 0,4M glicerol, 1mM Tris-EGTA, and 5 mM Tris-HCL, 1 mM PMSF y 1 μg/ml leupeptina, pH 8. El pellet de células fue homogeneizado en un Homogeneizador PotterS (Braum Biotech, EE.UU) hasta que la lisis fue mayor del 90 % (generalmente 30 segundos). La mezcla fue resuspendida en 5 mL de tampón de ensayo, centrifugado a 750 x g durante 5 min (para eliminar las células que no estén rotas). El sobrenadante obtenido fue centrifugado a 15000 x g durante 10 min, y el pellet fue resuspendido en 1 mL de tampón de ensayo conteniendo una concentración de naranja de acridina de 2.5 µM. La reacción fue iniciada por la adición de Tris-PPi (1 mM) al medio, en el que ya hay una concentración de MgSO4 de 1,3 mM. La cinética del decrecimiento de la fluorescencia fue medida a 485/530 excitación/emisión en un fluorímetro (Fluox800, BioTek, EE.UU.) (Zhen y col., 1997, Hill y col., 2000; Marchesini y col., 2000; Rodrigues y col., 2000). En todas las ocasiones se estableció un control negativo del ensayo sin adición de pirofosfato. El primer ensayo de translocación se llevó a cabo de este modo, empleando una fracción de los ciliados, enriquecida en vesículas, para comprobar que efectivamente, los resultados obtenidos eran correspondientes a esos orgánulos, pero para el resto de ensayos de translocación, se emplearon ciliados permeabilizados con DIG a una concentración final de 6,6 μM, en lugar de la fracción enriquecida en vacuolas. Previamente al ensayo de translocación, se llevó a cabo un ensayo de inmunofluorescencia con el anticuerpo anti-H+-PPasa vacuolar del ciliado para verificar que la fracción que se va a emplear en el ensayo como muestra MaterialyMétodos 99  efectivamente está enriquecida en vacuolas del ciliado. La fracción obtenida se incubó durante 30 min en tampón de bloqueo conteniendo un 1 % de BSA en PBS a temperatura ambiente. El anticuerpo anti-H+-PPasa a una dilución 1:100 y conteniendo un 1 % de BSA y 0,05 % de Triton X100 en PBS y después se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de 3 lavados con PBS. Finalmente, se añadió el anticuerpo secundario anti-Ig de ratón acoplado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma-Aldrich) a una dilución 1:80 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de realizar 3 lavados con PBS, las muestras se montaron en una solución de PBS/glicerol 1:1 y se visualizaron en un microscopio de fluorescencia (Zeiss Axioplan, Alemania). En el caso de P.berghei, la muestra se preparó centrifugando la sangre obtenida conteniendo 0,1 mg/mL de heparina, a 2500 x g durante 5 minutos y sobre el pellet se añadió agua y PMSF. Posteriormente, se añadió el volumen necesario de DPBS (10X) para que quedase a una concentración final de 1X, se centrifugó a 3000 x g y se retiró el sobrenadante. El pellet se resuspendió en tampón de ensayo con naranja de acridina y se realizó el ensayo, en este caso a 37 ºC. Los compuestos empleados para ver las variaciones en la actividad se añadieron desde soluciones stock en tampón de reacción (Moreno y col., 2011) y fueron adquiridos a través de Sigma-Aldrich. El NH4Cl se añadió como control final del ensayo, ya que actúa como alcalinizador, y por lo tanto se confirma que el decrecimiento en la fluorescencia con el naranja de acridina está atribuido a su acumulación en un compartimento acídico (Rodrigues y col., 1999 a y b; Lemercier y col., 2002). MaterialyMétodos 100  6.3.- Técnicas de análisis del pH intracelular: tinciones fluorescentes con colorantes sensibles al pH. Los ciliados (5 x 105 células) se centrifugaron a 700 x g durante 5 min y se lavaron 2 veces con PBS seguido de una tinción durante 10 min con una solución de naranja de acridina 3 μM (Sigma-Aldrich) y/o con una solución Lysotracker Red DND-99 (Life Technologies) a una concentración de 75 nM. Después de la tinción, los ciliados fueron observados en un microscopio de fluorescencia con un filtro de excitación BP 546 nm, de espejo dicroico y un filtro de emisión FT 580 nm, LP 590 nm (para el naranja de acridina), y un filtro BP 450-490 nm, FT 510 nm y LP 520 (para el caso del Lysotracker Red DND-99). 6.4.- Determinación del calcio intracelular Los ciliados se lavaron 2 veces por centrifugación y se resuspendieron en medio de ensayo (1X HBSS, 20 mM HEPES) a una concentración de 1,25 x 106 ciliados/mL. Posteriormente, se incubaron con los diferentes tratamientos durante 1 hora en una microplaca de 96 pocillos a 21 ºC. Después de la incubación, se añadió la sonda marcadora de calcio, Fluo-4 AM (Life Technologies), siguiendo las instrucciones de uso del fabricante y se midió la fluorescencia (Ex: 494 nm, Em: 516 nm) en un fluorímetro (Flx800, BioTek, EE.UU). Se emplearon controles negativos con ciliados sin sonda de calcio Fluo-4 AM (Takahasi y col., 1999; Paredes y col., 2008). Para el ensayo de localización de calcio, los ciliados se incubaron simplemente con la sonda y se visualizaron posteriormente con el microscopio de fluorescencia. MaterialyMétodos 101  6.5.- Determinación de los niveles de PPi El ensayo para la determinación de PPi fue llevado a cabo en lisados de ciliados cultivados durante 3 días con diferentes tratamientos. Se centrifugaron 2 x 106 ciliados/mL a 700 x g durante 5 min, y el pellet se lavó un par de veces con PBS por centrifugación a 4ºC. Posteriormente, el pellet fue resuspendido en 1 mL de agua destilada fría conteniendo PMSF a una concentración de 1 mM y se incubó en hielo durante 15 min. Tras la incubación, se rompieron las células por sonicación (10 ciclos de 5 pulsos en un W-250 sonicador (Branson Ultrasonic Corporation), y seguidamente, se centrifugaron a 10000 x g durante 10 min a 4 ºC para eliminar los restos celulares. La concentración proteica de los lisados fue determinada por el método de Bradford empleando una concentración conocida de BSA, como estándar. A esta solución proteica se le añadieron 10 µl de tampón de muestra concentrado 10X (MgCl2 30 mM, EDTA 2 mM, BSA 2 %) y se filtró a través de un filtro de 10 kDa de tamaño de poro, Amicon Ultra-0,5 mL (MerckMillipore, USA) para eliminar el PPi endógeno. La determinación de PPi se realizó espectrofotométricamente a través del empleo del reactivo comercial, “PPi reagent” (P7275, Sigma-Aldrich), siguiendo las instrucciones del fabricante mediante la medición del descenso de la absorbancia a 340 nm, durante 10 min. Esta técnica se basa en la oxidación de dos moles de NADH a NAD, por mol de PPi consumido, por la actividad de la fructosa 6-fosfato quinasa dependiente de PPi (PFK-PPi). Se empleó una concentración de 22 mg por muestra y el volumen final de reacción empleado fue de 100 µL. Se empleó como estándar PPi a una concentración de 1 mM (O'Brien, 1976). MaterialyMétodos 102  7.- Análisis filogenéticos, bioinformáticos y estadísticos 7.1.- Análisis filogenéticos Para estudiar la variación del gen de la H+-PPasa en diferentes cepas del ciliado P. dicentrarchi (B1, C1, D2, D3, I1, P1 y S1), una vez extraídas las muestras de ADN de la forma descrita con anterioridad, se realizó la PCR con los cebadores de una secuencia parcial de la H+-PPasa de P.dicentrarchi del mismo modo explicado previamente. (F/R PiPh (directo/reverso: 5’- ATTGATGTCAACGCCCCCTT-3’/5’-CGGGACCAGAGGTATCTTTTA3’). Una vez realizada la PCR con una enzima de alta fidelidad (NZYProof DNA polymerase NZYTech), los productos de PCR se purificaron con GeneJet PCR Purification Kit (Life-Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se clonaron en el vector pJET1.2/blunt, con el kit comercial (CloneJET PCR Cloning Kit, LifeTechonologies) y se enviaron al servicio de secuenciación (Sistemas Genómicos, España) (fig. 19). Las secuencias de aminoácidos, fueron obtenidas de la secuencia nucleotídica del gen de la H+-PPasa mediante la herramienta de traducción del portal de recursos bioinformáticos Expasy empleando el código genético de ciliados, y estas fueron alineadas con los programas de alineamiento múltiple Clustal W2 y Clustal Omega (Sievers y col., 2011) y editadas con Jalview Multiple Alignment Editor V1.8. Los sitios conteniendo huecos (gaps) fueron excluidos. Las distancias genéticas fueron calculadas para cuantificar la divergencia de secuencia entre los aislados empleando el modelo de dos parámetros de Kimura (1980), tal y como está implementado en la versión 6.0 del programa MEGA (Tamura y col., 2013). Los árboles filogenéticos fueron construidos con el programa MEGA mediante la aplicación del método de neighbour-joining (NJ), aplicando el modelo corrector de 2 parámetros de Kimura (Kimura, 1980) mediante la MaterialyMétodos 103  realización de 1000 réplicas de bootstrap (Saitou y col., 1987), como se ha descrito anteriormente. Figura 19: Mapa del vector de expresión pJET 1.2/blunt 7.2.- Análisis Bioinformático La identificación de dominios proteicos y el análisis funcional de las proteínas, fueron realizados utilizando la herramienta InterProScan (versión 4.8) del Instituto Europeo de Bioinformática (EMBL-EBI), disponible en la siguiente página web: http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/ (Zdobnov y Apweiler, 2001; Quevillon y col., 2005). El modelado de la H + -PPasa de P. dicentrarchi ha sido realizado empleando servidor Swiss-model accesible a través de la página del ExPASy o en el Deep View (Swiss PDB-Viewer) en http://swissmodel.expasy.org/ (Kiefer y col., 2009). Para determinar las propiedades fisicoquímicas de las H + -PPasas desde la secuencia de aminoácidos, se empleó la herramienta bioinformática ProtParam del servido ExPASy disponible en la siguiente dirección: http://web.expasy.org/tools/protparam/. Con la intención de predecir las MaterialyMétodos 104  señales de exportación nuclear ricas en leucina (NES) en la secuencia de la proteína se empleó el servidor NetNES 1.1 disponible en http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNES/. La predicción de los sitios de fosforilación de la proteína fue realizada usando el servidor NetPhos Server 2.0 disponible en la siguiente dirección: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/. Para predecir la presencia y localización de los sitios de marcaje del péptido señal en la secuencia de aminoácidos, se empleó el servidor Signal-3L, disponible en: http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Signal-3L/ (Shen y Chou, 2007). El servidor NetNglyc se utilizó para pronosticar los sitios de N-glicosilación (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/). El pronóstico del lugar en donde la secuencia de aminoácidos de la PPasa contendría dominios de péptido de marcaje mitocondrial, (mTP) se empleó la herramienta bioinformática iPSORT disponible en la siguiente dirección: http://ipsort.hgc.jp/. Finalmente, la predicción de los dominios de hélice transmembrana en la proteína, se empleó el servidor THHMM v 2.0 disponible en la página web http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/. 7.3.- Análisis estadístico Los resultados mostrados en las figuras están expresados como medias ± error estándar. Las diferencias significativas (p = 0,05) fueron determinadas por análisis de la varianza de una vía (ANOVA) seguido del test de comparaciones múltiples Tukey-Kramer. Resultados  112  Figura 23: Análisis mediante Western blot, utilizando un anticuerpo policlonal anti-AOX, de extractos totales y membranales (MAP) de P. dicentrarchi, obtenidos a partir de cultivos en normoxia (tiras 1 y 3), cultivos en hipoxia (tira 2), de ciliados obtenidos de infecciones experimentales (tira 4), y de proteínas de membrana de ciliados crecidos en hipoxia y bajo condiciones reductoras (con DTT, tira 5) y no reductoras (sin DTT, tira 6). De cada uno de los extractos se emplearon 30 µg proteína/tira. Las tiras 7 y 8 muestran la señal obtenida usando un suero policlonal normal de conejo frente a un extracto proteico total y uno de proteínas asociadas a membrana, respectivamente. PM: marcador de peso molecular de proteínas, mostrando los valores en kDa. La flecha y el recuadro indican la banda que posee una expresión variable entre los diferentes tratamientos. 1.5.- Efecto de los inhibidores de cadena de respiración mitocondrial en la expresión de la AOX en P. dicentrarchi Para analizar la regulación de la expresión de la oxidasa alternativa en P. dicentrarchi se han realizado diferentes tratamientos con los inhibidores estándar de los componentes de la cadena respiratoria. Los inhibidores de la vía clásica que se testaron fueron el KCN y la antimicina A (AMA) ambos a una concentración de 100 μM, y como inhibidor de la ruta alternativa se empleó el SHAM a una concentración de 1mM. Estos inhibidores se utilizaron en ciliados procedentes de cultivos normóxicos y en la fase logarítmica de crecimiento y se dejaron actuar durante un periodo de 4 horas. Posteriormente, se realizó un Western blot con un extracto de las proteínas totales del ciliado (fig. 24). En todos los casos, la incubación de los ciliados con los inhibidores se tradujo en un incremento de la expresión de la AOX, en comparación con el cultivo control sin inhibidores.   Resultados  113   Figura 24: Análisis mediante Western blot con un anticuerpo policlonal anti-AOX de un extracto proteico total de P. dicentrarchi bajo condiciones reductoras (con DTT), obtenido a partir de cultivos crecidos en condiciones de normoxia (tira 1) e incubados en presencia de KCN (tira 2), AMA (tira 3) y SHAM (tira 4). De cada uno de los extractos se emplearon 30 µg/carril. PM: Marcador de peso molecular de proteínas en kDa. La flecha y el recuadro indican la banda correspondiente a la expresión de la AOX. 1.6.- Consumo de O 2 y expresión de la AOX en ciliados procedentes de una infección experimental en rodaballo Para estudiar las variaciones entre ciliados mantenidos durante varios años en cultivo in vitro en laboratorio y ciliados recién extraídos de líquido ascítico de rodaballo, y comprobar el consumo de O 2 de un modo más parecido a lo que se produciría durante la fase parásita, se realizó una infección experimental y se utilizó esta muestra para medir el consumo de O 2 a través del empleo de un ensayo polarográfico con electrodo de Clark, así como la variación en la expresión del gen de la AOX mediante Western blot, empleando proteínas de membrana del ciliado y un anticuerpo policlonal antiAOX. Como puede observarse en la figura 25, los ciliados recién salidos del pez, en el que se encontrarán en condiciones de anoxia, muestran una mayor expresión de la proteína. El consumo de oxígeno obtenido fue menor (pendiente de -1,84/min) en los ciliados extraídos del pez con respecto a los de cultivo en laboratorio (-4,99/min). PM Resultados  114  Figura 25: Western blot con una fracción de proteínas membranales (MAP) del ciliado en condiciones reductoras. 1: muestra de ciliados de cultivo in vitro. 2: muestra de ciliados recién extraídos del pez. PM: Marcador de peso molecular de proteínas en kDa. 1.7.- Consumo de oxígeno y niveles de AOX durante el cultivo in vitro de P. dicentrarchi Se analizaron simultáneamente el consumo de oxígeno y la presencia de la enzima en ciliados durante las diferentes fases de crecimiento (exponencial y estacionaria) bajo condiciones de normoxia. Las mediciones de consumo de oxígeno se realizaron con un ensayo polarográfico y las variaciones en los niveles de la enzima mediante el empleo de Western blot con extractos proteicos totales frente a un anticuerpo policlonal anti-AOX. Simultáneamente, se evaluó el consumo de O 2 en ciliados, en las fases exponencial y estacionaria de crecimiento, permeabilizados con digitonina e incubados con inhibidores de la vía clásica (AMA) y alternativa (SHAM) (fig. 26). Durante la fase exponencial de crecimiento, aparece un fuerte incremento en el consumo de oxígeno, con un pico en el día 3 de cultivo, que decrece bruscamente cuando el ciliado entra en la fase estacionaria de crecimiento (a partir del día 4), fase a partir de la cual, los niveles de consumo de oxígeno se mantendrán relativamente bajos. Además, el decrecimiento en el consumo de O 2 por los ciliados parece ser independiente de la concentración de O 2 presente en el medio de cultivo, ya que éste no sufre apenas variaciones en todo el periodo de duración del ensayo (entre 210 y 290 nmol/mL) (fig. 26 A). Analizando los niveles de AOX en cultivo, se muestra que éstos son muy PM 70— 50— 40— 35— 25— 10— 12  Resultados  115   bajos o casi inexistentes durante la fase exponencial de crecimiento (fig. 26 B, días 2 y 3). Esta fase coincide con la de incremento de consumo de O 2 por el ciliado (fig. 26 A). En contraste, los niveles de AOX se incrementan notablemente durante la fase estacionaria de crecimiento, que coincide con una caída en el consumo de O 2 por los ciliados (fig. 26 B, días 4-7). Estos resultados indican que el ciliado estaría usando la vía clásica durante la fase exponencial y la alternativa solamente en la fase estacionaria, concordando con los resultados de expresión de la proteína observados en el Western blot (fig. 26 B). El tipo de ruta metabólica que emplean los ciliados según su fase de cultivo puede observarse en la figura 6 C. El consumo de O 2 en ciliados a día 2 de cultivo se realiza principalmente a través de la ruta clásica de la respiración mitocondrial, ya que la incubación con AMA inhibe totalmente la respiración (fig. 26 C, día 2); sin embargo, la AMA solo afecta parcialmente a la inhibición en el consumo de O 2 en el día 7 de cultivo (un 59%), en el que los ciliados ya se encuentran en fase estacionaria, indicando que el parásito emplea la ruta alternativa durante esta fase (fig. 26 C, día 7). A) 0246810 0 1x10 5 2x10 5 3x10 5 4x10 5 5x10 5 Crecimiento Consumo de O 2 Tiempo (Días) Crecimiento (Ciliados/mL) 0 -10 -20 -30 -40 -50 [O 2 ] nmol/mL Resultados  116  C) Figure 26: Efecto de la cinética de crecimiento en el consumo total de O2 por trofozoitos de P. dicentrarchi en condiciones de normoxia (A) y en ciliados permeabilizados con DIG obtenidos de cultivos en los días 2 y 7 de crecimiento, en los cuales la respiración fue inducida por la adición de succinato (S), glutamato (G) y ADP y después de la inhibición con AMA y SHAM (C), determinado mediante ensayo polarográfico con electrodo de Clark. Los niveles de AOX se determinaron por Western blot en condiciones reductoras en extractos proteicos totales obtenidos de ciliados cultivados del día 1 al 7. (B). PM: Marcador de peso molecular de proteínas en kDa. En la figura A), la curva superior muestra los cambios en la concentración de O2 (en nmol/mL) en el medio de cultivo durante la duración del experimento. B)  Días Día 2 Día 7 Tiempo(min) Tiempo(min) [ O 2 ] nmol / mL [ O 2 ] nmol / mL (100) (100) (59)  PM Resultados  117  2.- Inhibidores de la oxidasa alternativa como agentes antiparasitarios frente a la escuticociliatosis 2.1.- Efecto de los antioxidantes propilgalato y resveratrol en la respiración del ciliado Para estudiar el efecto del propilgalato (PG) y el resveratrol (RESV) sobre la ruta clásica y alternativa, se han realizado ensayos polarográficos de consumo de O2 con electrodo de Clark en ciliados creciendo en fase exponencial (día 2) en diferentes condiciones fisiológicas: normoxia e hipoxia y permeabilizados con DIG. Ambos se emplearon a una concentración de 100 µM. En normoxia, la AMA, también empleada a 100 µM, bloquea totalmente la respiración en ciliados a los que se le había inducido la respiración con succinato (S), glutamato (G) y ADP, lo que es indicativo de que, en esas condiciones, el ciliado está respirando solamente a través de la vía clásica, al tratarse la AMA de un inhibidor del complejo 3 de esta vía (fig. 27 a). Sin embargo, en hipoxia, la antimicina no inhibe completamente la respiración, pero se inhibe completamente con la adición posterior de PG, indicando que en P. dicentrarchi también actúa como un inhibidor de la AOX (fig. 27 c). El propilgalato sólo inhibe la respiración parcialmente en normoxia (fig. 27 e), pero casi la inhibe en su totalidad en condiciones de hipoxia (fig. 27 f). El resveratrol, como se había visto en un estudio previo, inhibe el 100% de la respiración en normoxia (fig. 27 b), indicando que este antioxidante bloquea la vía clásica, pero además en este ensayo podemos observar que también ocurre lo mismo en hipoxia (fig. 27 d), lo que demuestra que está actuando también sobre la vía alternativa. Resultados  118  Resultados  119   Figura 27: Análisis polarográficos del consumo de oxígeno por ciliados (c) de Philasterides dicentrarchi cultivados durante 2 días, en fase de crecimiento exponencial, bajo condiciones de normoxia (a, b y e) e hipoxia (c, d y f). Los ensayos fueron realizados sobre ciliados permeabilizados con DIG a los que se le estimuló la respiración mediante la adición de los inductores S, G y ADP y posteriormente se le adicionaron los inhibidores AMA, RESV y PG a una concentración de 100 μM. Los valores indicados sobre las gráficas indican el consumo medio de O2 (nmol/mL) obtenido a partir de 3 ensayos individuales. Entre paréntesis se muestran los porcentajes de inhibición en cada tramo. 2.2.- Efecto del PG sobre la expresión de la AOX Se analizó el efecto del PG, un inhibidor de la AOX alternativa, sobre los niveles de la AOX en P. dicentrarchi. Las concentraciones empleadas fueron de 6,25, 12,5 y 25 μM y se dejaron actuar sobre los cultivos durante 2 horas bajo condiciones de normoxia. El ensayo se realizó con extractos de proteínas totales del ciliado en condiciones reductoras, frente a un anticuerpo policlonal anti-AOX. Se observó un incremento dosis dependiente en los niveles de AOX (fig. 28). Figura28: Western blot mostrando los niveles de AOX en extractos totales de P. dicentrarchi utilizando condiciones reductoras. 1: control sin PG; 2: ciliados con PG 6,25μM; 3: ciliados con PG 12,5 μM; 4: ciliados con PG 25 μM. PM: Marcador de peso molecular en kDa. El recuadro indica la banda que se regula con la expresión de la AOX. 2.3.- Efecto de PG y AMA sobre el crecimiento in vitro de P. dicentrarchi Se estudió el efecto del PG sobre ciliados crecidos en medio L-15 suplementado con un 10% de FBS, durante 3 días, en condiciones de PM 135— 100— 70— 50— 40— 35— 25—   1234 Resultados  120  normoxia (a) e hipoxia (b). Como puede observarse en la figura 29, el PG inhibe el crecimiento a partir del segundo día de cultivo, observándose una mayor inhibición en los cultivos en normoxia. Para el caso de la AMA, el crecimiento se ve inhibido también en ambas condiciones de cultivo (fig. 30), al igual que sucede con el PG y RESV, mostrando una efectividad similar en ambas condiciones de cultivo. Las concentraciones empleadas en la comparación de efecto inhibitorio de crecimiento fueron: 50 μM RESV, 50 μM AMA. 0123 0 50000 100000 150000 200000 250000 * * * Control PG 25M PG 12.5M PG 6.25M Ciliados/mL Tiempo (días) (a) (b) 0123 0 50000 100000 150000 200000 250000 * * Control PG 25M PG 12.5M PG 6.25M Ciliados/mL Tiempo (días) Resultados  121   Figura 29: Efecto dosis-dependiente del propilgalato sobre el crecimiento in vitro de trofozoítos de Philasterides dicentrarchi durante la fase exponencial en cultivos en normoxia (IC50: 9,7μM, a día 3) (a) e hipoxia (IC50: 9,7μM, a día 3) (b). *Significativamente diferentes del control (P<0,01), (n= 5). Figura 30: Efecto del PG, la AMA y el RESV sobre el crecimiento in vitro de trofozoítos de Philasterides dicentrarchi durante 4 días en cultivos en normoxia (a) e hipoxia (b). Las concentraciones empleadas fueron de 50 μM RESV, 50 μM AMA *Significativamente diferentes del control (P<0,01), (n= 5). (b) (a) ** Resultados  128  NetPhos 2.0 indican que la proteína tiene 19 sitios de fosforilación en S, 5 sitios en T y 10 sitios en Y. Se predijeron también 2 sitios potenciales para Nglicosilación (372 y 403). De acuerdo con el programa Signal-3L, la proteína contiene un péptido señal en las posiciones 1-15 y un péptido de diana mitocondrial en la posición 1-30 (iPSORT prediction, fig. 36A). La secuencia proteica contiene un loop con un residuo de 57 aminoácidos con tres motivos característicos de la H+- PPasa subrayados en la siguiente secuencia en posición 86-143: VGGGIFTKAADVGADLVGKVEEGMDEDSPSNPATIADNVGDN VGDIAGMGSDLFGSF (fig. 36A). En la posición 260-265 e localiza el motivo [T (ácido) YYT (neutro)], que contiene aminoácidos, neutro, serina (S) y ácido, ácido glutámico (E), típicos de V-H+-PPasas dependientes de K+. La presencia de una alanina (A) en la posición 375, que determina la dependencia de K+, confirma que se trata de un enzima de este tipo (fig. 36A). Para detectar miembros de unión a membrana de la familia de bombas de protones, H+-PPasas, se realizó una búsqueda empleando la información obtenida del programa InterPro Scan del EMBL,-EBI, una herramienta bioinformática diseñada para el análisis funcional de proteínas. Este método reveló que esta secuencia de proteína comparte un alto grado de similitud de secuencia con la familia de proteínas pirofosfatasas, bombas de protones energéticas, entre los nucleótidos 1 y 583 (de acuerdo con el método de búsqueda PFAM del instituto Sanger) con un valor (match) de 6.9E-223. Cuando se llevó a cabo la búsqueda en la base de datos Comprehensive Microbial Resurce (CMR), se obtuvo la predicción de una secuencia de 1-583 aminoácidos para nuestra secuencia con proteínas pertenecientes a la familia V-PPasa con un match de 3.5E-227 (fig. 36B). Todos los motivos de la secuencia son residuos conocidos por ser característicos de las V-PPasas de tipo I están conservados en la H+-PPasa. Resultados  129   La secuencia proteica tiene 4 motivos característicos de la pirofosfatasa vacuolar de tipo I de Arabidopsis (AVP-1): el motivo EYYTS localizado entre los sitios 206-265, el motivo DG(A)YGPISDNAGGIAEMA localizado entre los sitios 338-354 que presenta una sustitución simple del aminoácido glicina (G) por el aminoácido alanina (A) en posición 2; el motivo GGAWDNAKKYIE localizado entre los sitios 532-543 y el motivo HKAAVIGDTIGDPLKDT localizado entre los sitios 562-578 (fig. 36A). El modelo topológico de la H + -PPasa predicho por el programa de predicción de hélices transmembrana en proteínas, THHMM, indica que la proteína tiene 11 regiones de hélices transmembrana localizadas entres los sitios 35-57, 70-92, 165-187, 206-225, 240-262, 286-308, 313-335, 380-402, 417-439, 484-506, 510-532 (fig. 36C). A B) Diana peptídica Péptido señal mitocondrial Resultados  130  C) Figure 36: A) Secuencia aminoacídica de la pirofosfatasa obtenida el código genético de ciliados. Según las predicciones de Signal-3L y iPSORT, los 15 aminoácidos iniciales funcionan como un péptido señal y los 30 aminoácidos iniciales se corresponden con una diana peptídica mitocondrial, respectivamente. En la segunda y tercera fila, el residuo de los 57 aminoácidos indicado en negrita contiene tres motivos (subrayados) típicos de H+-PPasas. La presencia del motivo T[neutro]YYT[ácido] en el quinto renglón, que contiene el aminoácido ácido E y el neutro S, indica que esta secuencia pertenece a una H+-PPasa K+-dependiente de tipo I. En el séptimo renglón de la secuencia, indicado en negrita y subrayado, existe un dominio altamente conservado, GNTAAA, que contiene la forma A relacionada con la dependencia al K+. En las líneas 5, 7 y 9 están indicadas en negrita y subrayadas las secuencias conservadas predichas para el arquetipo pirofosfatasa vacuolar (V-PPasa) de tipo 1 de Arabidopsis (AVP-1). Los epitopos conservados para el anticuerpo policlonal PABHK están incluidos en el recuadro. B) Predicción funcional de la familia de proteínas a la cual pertenece la secuencia usando la herramienta bioinformática InterPro Scan. C) Predicciones topológicas de D) Pesomolecular:61665.9;pI:5.00 Probabilidad Transmembrana‐‐ Interior‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Exterior‐‐‐ Dominio de unión a p irofosfato Resultados  131  las hélices transmembrana y localización de los dominios de unión al PPi. D) Modelado y predicción del peso molecular y del punto isoeléctrico, empleando el servidor Swiss-Model y la herramienta ProtParam.Los lugares de fosforilación en la secuencia se representan en azul (serina), verde (treonina) y rojo (tirosina). 3.3.- Análisis filogenético de la H+-PPasa de P. dicentrarchi Para la comparación de las H+-PPasas de los ciliados Tetrahymena thermophila, Paramecium tetraurelia, Icththyophthirius multifiliis y P. dicentrarchi se ha realizado un alineamiento múltiple de secuencias analizando 5 segmentos conservados (SC) característicos de V-PPasas de Arabidopsis (AVP1 y AVP2), de Rhodospirillum rubrum (RVP) y de Pyrobaculum aerophilum (PVP) (fig. 37A). La secuencia aminoacídica de la H+-PPasa presenta residuos idénticos a la AVP1 en el SC2 (motivo EYYTS), en el SC4 (motivo GGAWDNAKKYIE) y en el motivo SC5 (HKAAVIGDTIGDPLKDT); sin embargo, posee muchos cambios con respecto al patrón de AVP1 en los residuos correspondientes a SC1 y solo un cambio (A/G) en el SC3 (fig. 37A). Las secuencias aminoacídicas de otras especies de ciliados analizadas también exhiben esencialmente el mismo tipo de patrón de secuencia AVP1 en varios SC, excepto en el caso del SC3 y SC5 teniendo un patrón de secuencia tipo PVP/PVP y RVP, respectivamente (fig. 37A). Cuando comparamos la secuencia de la H+-PPasa con las secuencias de H+-PPasa de especies de ciliados en la base de datos, se consigue la identidad más alta con la H+-PPasa de T. thermophila (73%), seguida por la H+-PPasa de I. multifiliis (71%) y la de la H+-PPasa de P. tetraurelia (69%) (fig. 37B). Se ha construido el árbol filogenético de la familia de las H+-PPasas usando el método de Neighbor Joining (NJ) y la confianza del orden de ramificación fue verificada realizando 1000 réplicas bootstrap con el programa MEGA 5 (fig. 37). Los árboles de NJ revelan que las H+-PPasas del ciliado representan un grupo relacionado pero separado de las PPasas de Resultados  132  plantas. Dentro del subgrupo de los ciliados, las H + -PPasas de T. thermophila y I. multifiliis están más relacionadas, mientras que las H + -PPasas de P. dicentrarchi y P. tetraurelia están filogenéticamente más distantes (fig. 37C). A)  Origendela PPasa  Nºacceso Max score Total score Query cover E value  Ident. Tetrahymena thermophila  XP_001020551.1  878  878  99%  0.0  73% Icthyophthyrius multifiliis  XP_004030525.1  834  834  99%  0.0  71% Paramecium tetraurelia  XP_001428883.1  820  820  99%  0.0  69%  B) Resultados  133  C) Figura 37: A) Alineamiento múltiple de secuencias aminoacídicas de las H+-PPasas de los ciliados Philasterides dicentrarchi, Ichthyophthirius multifiliis, Tetrahymena thermophila y Paramecium tetraurelia. Los residuos idénticos entre secuencias están marcados con asteriscos. Los guiones indican los huecos insertados para optimizar los alineamientos. Se han marcado 5 secuencias conservadas entre la pirofosfatasa de Philasterides y la pirofosfatasa vacuolar de tipo I de Arabidopsis (AVP I) (Los residuos idénticos se muestran en letras blancas con fondo negro). B) Especies de ciliados incluidas en el análisis filogenético, mostrando los números de acceso al GenBank para sus secuencias de aminoácidos y el porcentaje de identidad con la secuencia de aminoácidos de P. dicentrarchi. C) Árbol filogenético de las secuencias de aminoácidos alineadas de la H+-PPasa de P. dicentrarchi y otras especies de ciliados y plantas. La filogenia presentada está basada en alineamientos de secuencias de proteína usando el programa de alineamiento múltiple Clustal W2. El árbol filogenético basado en el método de Neighbor Joining (NJ), fue construido empleando el programa MEGA 5. Los números en los nodos representan los valores de bootstrap de 1000 valores en el análisis NJ con la corrección de 2 parámetros de Kimura. La escala indica la distancia de 0,05. 3.4.- Caracterización bioquímica de la H+-PPasa en P. dicentrarchi. Para la caracterización bioquímica de la H+-PPasa se procedió a generar anticuerpos de ratón obtenidos a partir de la inmunización genética con un fragmento de ADN, y de la inmunización con el fragmento de la proteína recombinante de la H+-PPasa. La construcción plasmídica empleada para la inmunización genética fue un fragmento de ADN de 531 pb clonado en el vector de expresión de eucariotas pTargeT, mientras que para producir la   Ciliados Plantas Resultados  134  proteína recombinante se empleó una construcción plasmídica clonando un fragmento de ADN de 507 pb en el vector pET-21d, codificando una proteína de 169 aminoácidos localizada entre los sitios 413 y 582 de la secuencia de la H + -PPasa (fig. 38). Los anticuerpos producidos después de la inmunización genética reconoció una única banda de un tamaño de aproximadamente 60 kDa en Western blot realizado con un extracto total de proteínas de P. dicentrarchi (fig. 38A). En el caso de la proteína recombinante, inicialmente se testó que las células trasformadas expresaran la proteína. Para ello se realizó un ensayo de Western blot sobre extractos totales de las bacterias usando el anticuerpo monoclonal anti-T7-Tag, que reconoció una única banda de unos 20 kDa correspondiente con el tamaño estimado para la proteína recombinante diseñada, incluyendo el péptido del vector de 14 aminoácidos conteniendo una secuencia His-tag (fig. 38B, a). Cuando se empleó el suero de ratones inmunizados con la proteína recombinante en Western blot sobre un extracto total de proteínas de P. dicentrarchi, también se observó una única banda de aproximadamente 60 kDa (fig. 38B, b). A) PM PM Resultados  135   B) Figura 38: Producción de anticuerpos anti H+-PPasa (H+-PPasa) en P. dicentrarchi. A) Representación esquemática de los pasos de la preparación de la construcción plasmídica en el vector pTargeT , conteniendo un fragmento de 531 pb localizado entre las posiciones 1233 y 1764 de la secuencia nucleotídica de la H+-PPasa. Una vez preparados los anticuerpos, fueron testados en Western blot sobre extractos de proteína totales de P. dicentrarchi. 1: patrón de reconocimiento obtenido por el suero de la inmunización con el vector pTargeT frente al extracto total de proteínas de P. dicentrarchi; 2: patrón de reconocimiento obtenido por los anticuerpos anti-pTargeT conteniendo el fragmento de la H+-PPasa, frente a las proteínas totales del ciliado. B) Representación esquemática de los pasos de preparación de la proteína recombinante producida a partir de una secuencia nucleotídica parcial de la H+-PPasa en el vector pET-21d. El inserto posee una secuencia de aminoácidos de la H+-PPasa clonada presentando una cola de 6 histidinas y el tamaño estimado es de 19 kDa. a) Patrón de inmunoreconocimiento por Western-blot utilizando el anticuerpo anti-T7-Tag b) patrón de inmunoreconocimiento por Western blot empleando el anticuerpo policlonal anti-H+-PPasa recombinante. 1: proteína de fusión β-galactosidasa T7-Tag; 2: Extracto total de E. coli expresando la proteína de fusión T7-tag; 3: extractos totales de E. coli expresando la proteína de fusión T7-tag frente a un suero normal de ratón; 4: proteínas totales de P. dicentrarchi. PM: marcador de peso molecular en kDa. 3.5.- Localización subcelular de la H + -PPasa en P. dicentrarchi. Para estudiar la localización de la H + -PPasa en el ciliado, se realizó un análisis inmunohistoquímico con el anticuerpo anti-H + -PPasa recombinante, empleándolo a una dilución 1:50. Éste produjo una tinción intensa tanto en las membranas de las vacuolas (fig. 39A) como en las membranas de los sacos alveolares (fig. 39B). Como puede observarse, la localización subcelular coincide con la predicción bioinformática de localización para esta proteína. PM PM IDVNAPLIFSGLLVGAMLPYAFS ALTMKSVGKAAYEMVEEVRRQL RSDPNIKLGRSRPDYERCINIATK SSLSEMFLPATIVLGTPFVAGCF FGPTCVAGVLPGILISGVSMAIS SANSGGAWDNAKKYIESGQYTD ASGMVKKKGSNEHKAAVIGDTI GDPLKDTSGPEAAALEHHHHHH Resultados  136  Figura 39: Inmunolocalización de la H+-PPasa de P. dicentrarchi (H+-PPasa). El estudio de la localización celular de la H+-PPasa fue llevado a cabo mediante inmunohistoquímica usando un anticuerpo policlonal anti-H+-PPasa recombinante. La tinción del anticuerpo anti-H+-PPasa se localiza en la membrana de algunas vacuolas. (A) y en la membrana de los sacos alveolares (B). Predicción de la localización según la secuencia de la H+-PPasa en la membrana vacuolar empleando la herramienta bioinformática LocTree2 (C). Las flechas indican el marcaje en las vacuolas (A) y en la membrana de los sacos alveolares. 3.6.- Efecto del NaF y los análogos del pirofosfato en la translocación de H + dependiente de PPi y en la expresión génica. Para comprobar la actividad de la H + -PPasa de P. dicentrarchi, se realizó un ensayo de translocación de H + , dependiente de PPi, para lo cual se empleó una fracción de trofozoitos de P. dicentrarchi enriquecida en vacuolas, las cuales resultaron marcadas con los anticuerpos anti-PPasa, como se demostró por inmunofluorescencia (fig. 40 A) y Western blot (fig. 40 B) empleando el anticuerpo de la H + -PPasa recombinante. La acidificación vacuolar inducida por PPi en las fracciones enriquecidas en vesículas de P. dicentrarchi se monitorizó empleando el colorante naranja de acridina en un medio conteniendo NaF 1mM, un inhibidor clásico de las H + -PPasas y PAM 0.1mM, un análogo del PPi (fig. 40 C), que además resultó inhibir el crecimiento del ciliado in vitro (fig. 40 E). La adición de PPi produjo un decrecimiento significativo en la fluorescencia, indicando un incremento en la acidificación de las vacuolas (fig. 40 C). La adición de NaF y PAM a l medio de reacción al que previamente se le había añadido PPi produjo una inhibición significativa en la acidificación de las vacuolas con respecto al control sin inhibidores (fig. 40 C), pero no afectó a los niveles de fluorescencia en los A) B) C) Resultados  137   ensayos en los cuales el PPi no había sido añadido previamente. También se empleó el método de RT-qPCR para analizar el efecto de los bisfosfonatos sobre la expresión génica de la H + -PPasa y se observó que el PAM inhibió significativamente la expresión del gen con respecto a los controles (fig. 40 D) A) B) C) D) E) 0 5 10 15 20 25 9000 9500 10000 10500 11000 11500 12000 12500 13000 13500 14000 14500 15000 Inhibidores PPi Fluorescencia 485/530 t (min) Control NaF PAM Control - PPi Bibliografía 244  Murphy AD, Doeller J, Hearn B, Lang-Unnasch N. (1997). Plasmodium falciparum: cyanide resistant oxygen consumption. Experimental Parasitology, 87: 112120. Murphy AD, Lang-Unnasch N. (1999). Alternative oxidase inhibitors potentiate the activity of atovaquone against Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 43:651–654. Murphy MP. (2009). How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal, 417(1):1–13. Muth R, Manber U. (1996). 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