Nuevas estrategias en oncología de precisión: estudio del proceso de anidamiento de células tumorales circulantes y desarrollo de la tecnología ExoGAG para el aislamiento de vesículas extracelulares

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Carolina Herrero Filgueira Tesis doctoral Nuevas estrategias en oncología de precisión: estudio del proceso de anidamiento de células tumorales circulantes y desarrollo de la tecnología ExoGAG para el aislamiento de vesículas extracelulares Santiago de Compostela, 2022 Programa de doctorado en Medicina Molecular 1 TESIS DE DOCTORADO NUEVAS ESTRATEGIAS EN ONCOLOGÍA DE PRECISIÓN: ESTUDIO DEL PROCESO DE ANIDAMIENTO DE CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES Y DESARROLLO DE LA TECNOLOGÍA EXOGAG PARA EL AISLAMIENTO DE VESÍCULAS EXTRACELULARES Carolina Herrero Filgueira ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN MEDICINA MOLECULAR SANTIAGO DE COMPOSTELA 2022 2 3 DECLARACIÓN DEL AUTOR/A DE LA TESIS D./Dña. Carolina Herrero Filgueira Título de la tesis: Nuevas estrategias en oncología de precisión: estudio del proceso de anidamiento de células tumorales circulantes y desarrollo de la tecnología ExoGAG para el aislamiento de vesículas extracelulares Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Santiago de Compostela, 18 de Febrero de 2022 Firma electrónica 4 5 AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR/ TUTOR DE LA TESIS Nuevas estrategias en oncología de precisión: estudio del proceso de anidamiento de células tumorales circulantes y desarrollo de la tecnología ExoGAG para el aislamiento de vesículas extracelulares D./Dna. Miguel Abal Posada D./Dna. Lorena Alonso Alconada D./Dna. Rafael López López INFORMAN: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D/Dª. Carolina Herrero Filgueira, bajo mi dirección/tutorización, y a utorizo su presentación, considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación del doctorando/a fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Santiago de Compostela, 18 de Febrero de 2022 Fdo.Miguel Abal Posada Fdo. Lorena Alonso Alconada Fdo. Rafael López López 6 7 Carolina Herrero Filgueira, autora de la presente tesis, declaro que no existe ningún conflicto de interés. Carolina Herrero Filgueira, autora de la presente tesis, declaro que todas las figuras presentes en este documento son originales y han sido realizadas por mí. CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 14 AGRADECIMIENTOS 15 AGRADECIMIENTOS Hoy se termina una gran etapa en la cual he crecido no solo a nivel profesional sino también a nivel personal y no podría haber llegado hasta aquí sin la ayuda de muchas personas, a las cuales estoy enormemente agradecida. En primer lugar, quisiera dar las gracias a mi tutor de tesis, el Dr. Rafael López López, por apoyar y creer en la investigación y permitirme formar parte de ONCOMET. También quisiera dar las gracias a mis directores de tesis, el Dr. Miguel Abal Posada y la Dra. Lorena Alonso Alconada. A Miguel, gracias por haber confiado en mi desde el primer momento, por tu positividad infinita sin la cual no habría podido llegar hasta aquí. Muchas gracias por todo tu apoyo y por todo lo que me has enseñado en todos estos años. A Lore, mi hermana mayor en el laboratorio, no se que haría sin ti. Gracias por haberme formado como investigadora, por tu gran dedicación, por tu compresión, por enseñarme que “lo primero, es lo primero” y darme tanta calma en mis momentos de ansiedad (que no han sido pocos). Muchas gracias por las risas, las confidencias y por todos los chocolates compartidos. Sin duda trabajar contigo ha hecho todo más fácil y siempre ocuparás un lugar muy importante en mi vida. Quisiera hacer mención especial también a Alex. Gracias por tu optimismo, el cual me ha ayudado a seguir adelante. Gracias por todas tus ideas, por creer en mi, y estar dispuesto en todo momento a ayudarme. Este trabajo también es tuyo. Gracias a los pacientes y sus familiares por confiar en nuestro trabajo. A Alba, gracias por tu ayuda incondicional, por relativizar siempre todo y buscar el lado positivo. Gracias por endulzarme con brownie y por CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 16 todos los cafés y charlas compartidas. Gracias por hacer más llevadera la tesis. A Lau, gracias por estar siempre ahí dispuesta a ayudarme sea la hora que sea. Gracias por tu cariño y por tu apoyo. A Jorge, gracias por animarme siempre y ayudarme a ver el mundo cientifíco más allá del laboratorio, por interesarte por todos los predocs y por traer ideas frescas y nuevas al labo. A Cloti, gracias porque a pesar de no vernos tanto como al principio, siempre has estado ahí apoyándome. A mi “club de Wendoline”, que ha hecho sin duda que esta etapa sea memorable. A Nuria, por tantos momentos compartidos, por nuestras cenas de picoteo, por los vermús en el Abastos 2.0 y los vinos en la Artesana, por ayudarme tantas veces con temas informáticos y por animarme en cada momento de dificultad. Sin duda ha sigo genial compartir piso contigo estos últimos años, ya te echo de menos. A Inés, por comprender tan bien mi ansiedad, por estar siempre ahí sobre todo esta última etapa. Gracias por cada vino y vermú (o menta poleo) compartidos, por sacarme siempre una sonrisa. Nos quedan muchas cosas por vivir las tres juntas. A Óscar, gracias por entenderme tan bien y ayudarme en todo siempre, has sido una de las personas más importantes para mi en toda esta etapa. A Carlos, mi dramas favorito, gracias por descubrirme el mundo “Paco y Lola”, por las cenitas en el piso, por los paseos en barco y los cotilleos, gracias por estar siempre dispuesto a echarme una mano, por ser siempre tan generoso. A Pachu, mi chica de la sonrisa infinita, gracias por tu alegría constante, por transmitir tanta paz y por ayudarme siempre que grito “help”, gracias por estar siempre dispuesta a tomarte una caña. A Pablo, gracias por ser la persona más calmada del mundo y transmitirlo, por ayudarme siempre. A las nuevas incorporaciones Raquel y Ana, gracias por transmitir tan buen rollo siempre. A mis epigenéticos Aida, Aitor (y Manu), gracias por vuestras historias surrealistas que han hecho más llevadera esta etapa, por estar siempre dispuestos a escuchar y ayudar, gracias por tantas risas y buenos momentos compartidos. A las chicas nano, en especial a Sandra D., Sandra A. (y Luís), Sai, Marce y María, gracias por vuestra ayuda y por cada caña. A Ali por ayudarme siempre con las muestras y a Ramón por todos los buenos momentos compartidos y por ayudarme siempre con la ddPCR. AGRADECIMIENTOS 17 A mis amigas María, Zara y Bele gracias por vuestros ánimos constantes, por vuestra amistad. A mi Rebe, por los audios infinitos que tanta calma me transmiten, por estar ahí siempre. A Maribel, por avisarme que la tesis no sería fácil pero que sin duda merecería la pena. Gracias por regalarme tantos momentos de desconexión, por todos los dulces compartidos. A Berta, gracias por darme tantas herramientas para aprender a llevar cada momento de esta etapa. A mi familia, sin la cual no podría haber recorrido todo este camino. A mis padres, Richard y Esther, por darme alas y apoyarme siempre, por vuestro esfuerzo, gracias por todos los valores que me habéis enseñado, por tanta paciencia que habéis tenido. A mi hermano Adrián, la alegría de la casa, gracias por sacarme siempre una sonrisa, porque siempre te siento cerca a pesar de estar lejos y siempre estás dispuesto a ayudarme. A mis abuelos, Carlos y Fini, por vuestro apoyo incondicional, por quererme tanto, por vuestro sacrificio siempre, por regalarme tantos momentos felices. A mis tíos, Cacu y Ester, Santi y Eli, por creer en mi y estar siempre a mi lado. A Borja, gracias por ser el mejor compañero de vida que podría tener, por entenderme tan bien, por cuidarme tanto, por tu paciencia infinita, por no dejarme caer nunca. Gracias por compartir conmigo los días buenos y abrazarme fuerte en los días malos. No podría haber llegado hasta aquí sin ti. A Dios, por darme la fortaleza necesaria para afrontar toda esta etapa. CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 18 ÍNDICE 19 ÍNDICE CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 20 ÍNDICE 21 ÍNDICE ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS .............................................. 27 RESUMEN ........................................................................................ 39 INTRODUCCIÓN ............................................................................ 47 1. Oncología de precisión ................................................................. 49 2. Biopsia líquida ............................................................................... 50 2.1. Ácidos nucleicos libres circulantes .......................................... 50 2.2. Células Tumorales Circulantes (CTC) .................................... 52 2.3. Vesículas extracelulares .......................................................... 56 2.3.1. Biogenésis y secreción ...................................................... 58 2.3.2. Composición ..................................................................... 61 2.3.3. Métodos de aislamiento .................................................... 64 2.3.4. Caracterización ................................................................. 75 2.3.5. Vesículas extracelulares en cáncer ................................... 77 2.3.5.1. Vesículas extracelulares en tumores ginecológicos ... 82 3. Desarrollo comercial del producto: desde la investigación básica a la práctica clínica ........................................................................... 86 OBJETIVOS ..................................................................................... 91 CAPÍTULO 1 - MODELIZACIÓN DEL PROCESO DE ANIDAMIENTO DE LAS CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES QUE SOBREEXPRESAN ANXA2 Y CRIBADO DE COMPUESTOS QUE ALTERAN EL PROCESO DE METÁSTASIS EN CÁNCER DE ENDOMETRIO ...................... 95 CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 22 1.1. Introducción .............................................................................. 97 1.2. Resumen gráfico ...................................................................... 101 1.3. Materiales y métodos .............................................................. 102 1.3.1. Pacientes ............................................................................. 102 1.3.2. Expresión de ANXA2 en las CTC de pacientes con cáncer de endometrio con alto riesgo de recurrencia ................................... 103 1.3.3. Análisis de datos ................................................................ 103 1.3.4. Líneas celulares .................................................................. 104 1.3.4.1. Líneas celulares de cáncer de endometrio ................... 104 1.3.4.2. Línea celular endotelial ............................................... 105 1.3.5. Aislamiento de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real (RTqPCR) ........................................................................................... 106 1.3.6. Western Blot ...................................................................... 106 1.3.7. Ensayo de migración en transwell ..................................... 107 1.3.8. Adhesión de las células tumorales al endotelio ................. 108 1.3.9. Modelización del anidamiento de las CTC ........................ 108 1.3.10. Cribado de alto rendimiento (HTS) ................................. 109 1.3.11. Ensayo de migración transendotelial en 3D ..................... 111 1.3.12. Modelo in vivo de cáncer de endometrio recurrente ........ 112 1.4. Resultados ................................................................................ 113 1.4.1. Validación de la expresión de ANXA2 en CTC de pacientes con cáncer de endometrio con alto riesgo de recurrencia ............ 113 1.4.2. La sobreexpresión de ANXA2 en líneas celulares de cáncer de endometrio promueve un fenotipo mesenquimal ......................... 114 ÍNDICE 23 1.4.2.1 La sobreexpresión de ANXA2 en las CTC promueve el proceso de metástasis ................................................................ 115 1.4.3. Cribado de alto rendimiento (HTS) de compuestos dirigidos específicamente a ANXA2 ........................................................... 120 1.4.4. Validación de la daunorrubicina en un sistema de migración transendotelial 3D y en un modelo in vivo de cáncer de endometrio recurrente ...................................................................................... 123 CAPÍTULO 2 - DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE UNA NUEVA TECNOLOGÍA DE AISLAMIENTO DE VESÍCULAS EXTRACELULARES TRASLADABLE A LA PRÁCTICA CLÍNICA: EXOGAG ..................................................................... 129 2.1. Introducción ............................................................................. 131 2.2. Resumen gráfico ...................................................................... 135 2.3. Materiales y métodos ............................................................... 136 2.3.1. Resumen del proceso de optimización de la tecnología ExoGAG ....................................................................................... 136 2.3.2. Aislamiento de VEs de medio de cultivo condicionado mediante ultracentrifugación ........................................................ 137 2.3.3. Optimización del protocolo de aislamiento de VEs con la tecnología ExoGAG ..................................................................... 138 2.3.3.1. NTA Nanosight NS300 ............................................... 141 2.3.3.2. Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAGs) ......... 141 2.3.3.3. Extracción de ARN de las VEs (ARN-VEs) de plasma y orina y PCR cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR). ................ 142 2.3.4. Aislamiento de VEs a partir de medio de cultivo condicionado y muestras de plasma, suero y orina control utilizando la tecnología ExoGAG ....................................................................................... 143 CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 30 ARNr: ARN ribosómico ARNt: ARN de transferencia ARN-VEs: ARN de las VEs AR-V7: androgen receptor splice variant 7 ATR: ataxia telangiectasia and Rad3 related AuNPs: nanopartículas de oro AUROC: area under receiver operating characteristic curve BBS: borate buffered saline BCA: bicinchoninic assay BCL2L1: BCL2 like 1 BCL-6: B-cell lymphoma 6 BDNF: brain-derived neurotrophic factor BMP2: bone morphogenetic protein 2 BMP6: bone morphogenetic protein 6 BRAF: v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B Ca: calcio CA 19-9: carbohydrate antigen 19-9 CA-125: carbohydrate antigen 125 CAV-1: caveolin-1 CBL: Cbl (Casitas B-lineage Lymphoma) proto-oncogene, E3 ubiquitin protein ligase CCL28/VIC: chemokine C-C motif ligand 28 CCND1: cyclin D1 CCNE1: cyclin E1 CCR: cáncer colorrectal CCRm: cáncer colorrectal metastásico CDKN2A: cyclin dependent kinase inhibitor 2A CE: cáncer de endometrio/carcinoma endometrial CEA: carcinoembryonic antigen CEE: carcinoma endometrial endometrioide CHUK: conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase CLIC4: chloride intracellular channel 4 ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS 31 C-MYC : cellular myelocytomatosis CNA: QIAamp Circulating Nucleic Acid kit CO: cáncer de ovario CP: cáncer de próstata CPm: cáncer de próstata metastásico Cq: quantification cycle CREBBP: CREB (cyclic adenosine monophosphate response element binding protein) binding protein Cryo-ME: criomicroscopía electrónica CSPG4: chondroitin sulfate proteoglycan 4 CTC: células tumorales circulantes Cu: cobre d: día (s) DBT: DNeasy Blood & Tissue ddPCR: droplet digital PCR DLS: dynamic light scattering DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO: dimethylsulfoxide DPBS: dulbecco′s phosphate buffered saline DTT: ditiotreitol EDC: clorhidrato de N-(3-Dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid EEE: Espacio Económico Europeo EGFR: epidermal growth factor receptor ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay EMAPII: aminoacyl tRNA synthetase complex-interacting multifunctional protein EMEA: European Medicines Evaluation Agency EMMPRIN: extracellular matrix metalloproteinase inducer ENITEC: European Network for Individualized Treatment in Endometrial Cancer EP300: E1A binding protein p300 CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 32 EpCAM: epithelial cell adhesion molecule ER: estrogen receptor ERBB2: erythroblastic oncogene B2 ERG: erythroblast transformation-specific related gene ESCRT: endosomal sorting complex required for transport FAM: frecuencia de alelos mutados FAM49B: family with sequence similarity 49, member B FBS: fetal bovine serum FDA: Food and Drug Administration FERMT3: fermitin family homolog 3 FFF: field flow fractionation FGA: fibrinogen alpha chain FGF11: fibroblast growth factor 11 FGF21: fibroblast growth factor 21 FGFR1: fibroblast growth factor receptor 1 FGFR3: fibroblast growth factor receptor 3 FGFR4: fibroblast growth factor receptor 4 FGG: fibrinogen gamma chain FIGO: Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia FOS: FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog FRt: fragmentos derivados del ARNt f/s: fotones/segundo FZD3: frizzled family receptor 3 FZD8: frizzled family receptor 8 GAGs: glicosaminoglicanos GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GDF3: growth differentiation factor 3 GDF5: growth differentiation factor 5 GDF8: growth differentiation factor 8 GDF9: growth differentiation factor 9 GDF11; growth differentiation factor 11 GFP: green fluorescent protein ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS 33 GGT1: gamma-glutamyltransferase 1 GNA11: guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha 11 (Gq class) GPI: glycosylphosphatidylinositol GRB2: growth factor receptor bound protein 2 GRO: growth-regulated protein GSK3β: glycogen synthase kinase 3 beta GSN: gelsolin h: hora (s) H-ANXA2: Hec1A annexin A2 HCl: hydrochloride H-Ctrl: Hec1A control HDAC11: histone deacetylase 11 HDL: high-density lipoprotein HER2: human epidermal growth factor receptor 2 HMGA2: high mobility group AT-hook 2 HPB: hiperplasia prostática benigna HSC70: heat shock cognate HSP70: heat shock protein 70 HSP90: heat shock protein 90 HSP90AB1: heat shock protein 90 alpha family class B member 1 HTS: high-throughput screening IC50 : half-maximal inhibitory concentration I+D: investigación y desarrollo IFN-gamma: interferon gamma IgG: inmunoglobulina G IK: Ishikawa IK-ANXA2: Ishikawa annexin A2 IK-Ctrl: Ishikawa control IL-7: interleukin 7 ILVs: intraluminal vesicles IP: intraperitoneal CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 34 IPA: Ingenuity Pathway Analysis IRS1: insulin receptor substrate 1 ISEV: International Society for Extracellular Vesicles ITGA: integrin subunit alpha ITGA8: integrin subunit alpha 8 ITGB: integrin subunit beta ITGB6: integrin subunit beta 6 kDa: kiloDaltons kg: kilogramo KOL: Key Opinion Leaders KRAS: kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog kV: kilovoltios l: litro L1CAM: L1 cell adhesion molecule LBP: lipopolysaccharide binding protein LDL: low-density lipoprotein LEF1: lymphoid enhancer-binding factor 1) LRG1: human leucine rich alpha-2-glycoprotein 1 M: molar MAGE3/6: melanoma-associated antigen 3/6 MAP2K2: mitogen-activated protein kinase kinase 2 MAPK1: mitogen-activated protein kinase 1 Marcado CE: marcado de Conformidad Europea MDA: MDA-MB-231 MDM2: mouse double minute 2 oncogene MET: microscopía electrónica de transmisión Met: met proto-oncogene mg: miligramo (s) MHC: major histocompatibility complex miARN: micro ARN min: minuto (s) ml: mililitro (s) ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS 35 mM: milimolar mm: milímetro (s) MMP1: matrix metalloproteinase-1 MSCs: mesenchymal stromal cells MUC1: mucin 1 MVs: microvesículas MVBs: multivesicular bodies NaCl: sodium chloride Na3VO4: sodium orthovanadate NaF: sodium fluoride NHS: N-hidroxisuccinimida nM: nanomolar nm: nanometro (s) NODAL: nodal growth differentiation factor NSCLC: non-small-cell lung cancer nSMase: putative neutral sphingomyelinase nt: nucleótidos NTA: nanoparticle tracking analysis NTRK2: neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2 pb: pares de bases PBS: phosphate buffered saline PCA3: prostate cancer antigen 3 PCL: prestwick chemical library PCR: polymerase chain reaction PD-1: programmed cell death protein 1 PDGFB: platelet-derived growth factor beta polypeptide PDGFC: platelet derived growth factor C PD-L1: programmed death-ligand 1 PEG: polyethylene glycol P-gp: p-glycoprotein piARN: ARN asociado a PIWI PIC: protease inhibitor cocktail CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 36 PIK3CA: phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha PIK3CG: phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma PIK3R5: phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 5 PIWI: P-element Induced WImpy testis PLD: pegylated liposomal doxorubicin PMEL17: premelanosome protein 17 PMSF: phenylmethylsulfonyl fluoride PR: progesterone receptor PRKAR1B: protein kinase, cAMP-dependent, regulatory, type I, beta PRKCA: protein kinase, cAMP-dependent, catalytic, alpha PSA: prostate specific antigen PTEN: phosphatase and tensin homolog p/v: peso/volumen PVDF: polyvinylidene fluoride qPCR: quantitative polymerase chain reaction Rab: ras-associated binding RB1: retinoblastoma 1 RHOA: ras homolog family member A ROC: receiver operating characteristic curve ROS: reactive oxygen species rpm: revolutions per minute RPS: resistive pulse sensing RT-qPCR: reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction RUO: Research Use Only SD: standard deviation SDS: sodium dodecyl sulfate SEA: single extracelular vesicles analysis SEC: size-exclusion chromatography seg: segundo (s) ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS 37 SEM: standard error of the mean SERS: surface-enhanced Raman spectroscopy SG: supervivencia global shARN: short hairpin ARN SH-PEG-COOH: O-(3-Carboxipropil)-O’-(2-(3mercaptopropionilamino)etil)-polietilenglicol SIN3A: SIN3 transcription regulator family member A) SLE: supervivencia libre de enfermedad SLP: supervivencia libre de progresión SMAD9: SMAD family member 9 SNARE: soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion attachment protein receptor SNX3: sorting nexin-3 SPDEF: SAM pointed domain containing ETS transcription factor SPR: surface plasmon resonance t: tiempo TA: temperature ambiente TBS‐T: tris buffered saline with tween TCF7L1: transcription factor 7-like 1 (T-cell specific, HMG-box) TEM: transición epitelio-mesénquima TFF: tangential flow filtration TGFβ1: transforming growth factor β1 TKI: tirosin kinasa inhibitors TME: transición mesénquima-epitelio Top1: topoisomerase 1 TP53: tumor protein P53 TSG101: tumor susceptibility gene 101 protein TUBB3: tubulin beta 3 U.A.: unidades arbitrarias UC: ultracentrifugación UE: Unión Europea UF: ultrafiltración CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 38 uf: unidades de fluorescencia μg: microgramo (s) μl: microlitro (s) μM: micromolar µm: micrómetro (s) VEs: vesículas extracelulares VIM: vimentina VLDL: very-low-density lipoprotein Vps4: vacuolar protein sorting-associated protein 4 WB: Western Blot WNT3: wingless-type MMTV integration site family, member 3 WNT5A: wingless-type MMTV integration site family, member 5A WNT5B: wingless-type MMTV integration site family, member 5B WNT6: wingless-type MMTV integration site family, member 6 WNT10A: wingless-type MMTV integration site family, member 10A WNT10B: wingless-type MMTV integration site family, member 10B RESUMEN 39 RESUMEN CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 46 Por ello, se están llevando a cabo diferentes ensayos de seguridad, estabilidad, sensibilidad y reproducibilidad y un estudio del marco regulatorio para poder alcanzar el marcado CE y trasladar la tecnología ExoGAG a la práctica clínica. INTRODUCCIÓN 47 INTRODUCCIÓN CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 48 INTRODUCCIÓN 49 INTRODUCCIÓN Algunas partes del apartado 2.3.5 y el subapartado 2.3.5.1 han sido extraídas/adaptadas de un trabajo previamente publicado [1] 1. Oncología de precisión El cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte en todos los países del mundo. Las estimaciones a nivel mundial indican que la incidencia aumentará a 28,4 millones de casos nuevos en 2040 [2]. Esto pone de manifiesto la necesidad de desarrollar estrategias de prevención, diagnóstico temprano y terapias eficientes para mejorar los ratios de supervivencia y la calidad de vida de los pacientes. En este sentido, en las últimas décadas, la medicina oncológica ha evolucionado desde un enfoque tradicional hasta la era de la medicina de precisión, donde se utiliza la información molecular para dirigir las terapias a las alteraciones específica que impulsan el desarrollo tumoral. Las nuevas tecnologías de alto rendimiento, como la secuenciación de nueva generación y las herramientas bioinformáticas, han permitido estudiar la complejidad genética del tumor, identificando nuevos biomarcadores genéticos y favoreciendo el desarrollo de terapias dirigidas. Así, la oncología de precisión basada en las pruebas moleculares permite clasificar y diagnosticar los tumores con mayor precisión y mejorar el pronóstico de los pacientes oncológicos [3]. Actualmente, el estudio de los perfiles moleculares de los tumores sólidos suele depender de procedimientos invasivos, como las biopsias de tejido, que proporcionan una escasa información de la heterogeneidad tumoral y no pueden obtenerse repetidamente [4]. En los últimos años, la oncología médica de precisión puede llevarse a CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 50 cabo gracias al estudio de la denominada biopsia líquida, una nueva herramienta no invasiva que utiliza la detección de biomarcadores presentes en diferentes fluidos biológicos, con fines diagnóstico y pronóstico, lo cual representa un cambio en el paradigma de la biología molecular del cáncer [5]. 2. Biopsia líquida El término biopsia líquida fue adoptado por primera vez en 2010 [6] y hace referencia al análisis del material tumoral aislado de diferentes fluidos biológicos como pueden ser suero, plasma, orina, saliva o líquido cefalorraquídeo, entre otros [7]. La medicina de precisión basada en la biopsia líquida supone una herramienta mínimamente invasiva, en comparación con la biopsia de tejido, proporcionando una solución al problema de la heterogeneidad intratumoral y permitiendo el seguimiento en tiempo real de la evolución del tumor. Esta estrategia incluye el estudio de los llamados ácidos nucleicos libres circulantes (ANlc), las células tumorales circulantes (CTC) , las vesículas extracelulares (VEs), las plaquetas tumorales, las proteínas y los metabolitos presentes en diferentes biofluidos [8], proporcionando una herramienta clínica para el diagnóstico, la selección de terapias moleculares específicas y el seguimiento de la enfermedad. 2.1. Ácidos nucleicos libres circulantes Los ácidos nucleicos libres circulantes (ANlc) incluyen el ADN genómico (ADNg), el ADN tumoral circulante (ADNtc), el ADN mitocondrial (ADNmt), el ARN mensajero (ARNm) y el microARN (miARN), entre otros [9]. Los cambios en los niveles de estos ácidos nucleicos liberados en la sangre de los pacientes con cáncer se han asociado con la carga tumoral y la progresión. En general, aunque la mayor parte del ADNlc (ADN extracelular de doble cadena y ADN INTRODUCCIÓN 51 mitocondrial) no suele ser de origen tumoral, sus niveles suelen ser elevados en la sangre de los pacientes con cáncer y su cinética puede ser útil para ayudar en el diagnóstico del cáncer, la respuesta al tratamiento o en el pronóstico [10–13]. El ADNtc tiene el potencial de ser utilizado en la detección temprana del cáncer, y sus niveles también pueden tener un valor pronóstico incluso después de la cirugía, detectando la enfermedad mínima residual [14,15]. Uno de sus mayores potenciales es la detección de mutaciones específicas que proporcionan información sobre la selección de terapias, para monitorizar la respuesta y la resistencia al tratamiento. Por ejemplo, la mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC, non-smallcell lung cancer) acaban adquiriendo resistencia debido, en parte, a la aparición de la mutación EGFR T790M (epidermal growth factor receptor), la cual es detectable en el ADNtc [16]. Otro ejemplo de la utilidad clínica del ADNtc, se encuentra en el cáncer colorrectal metastásico (CCRm), donde el análisis de las alteraciones moleculares en EGFR, KRAS (kirsten rat sarcoma virus), HER2 (human epidermal growth factor receptor 2), BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B) y PIK3CA (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3kinase catalytic subunit alpha) detectadas a nivel del ADNtc permitiría estudiar los mecanismos de resistencia a las terapias dirigidas ofreciendo una guía para mejorar el tratamiento de los pacientes con este tipo de tumores [17–19]. No obstante, las concentraciones de ADNtc detectadas suelen ser relativamente bajas, por lo que se requiere un enfoque muy sensible y específico lo cual es un gran reto en el desarrollo de aplicaciones de biopsia líquida. Otras moléculas biológicas con gran potencial en el descubrimiento de nuevos biomarcadores son los ARN libres circulantes (ARNlc). Se pueden distinguir diferentes tipos según su longitud y función: microARN (miARNs), ARNs asociados a PIWI (piARNs), fragmentos derivados del ARNt (FRt), ARN circular (ARNcirc), ARN no codificante de cadena larga (ARNncl) y ARN CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 52 mensajero (ARNm). Además, los ARNlc se pueden encontrar libres o asociados a VEs, a varias proteínas o complejos lipídicos permitiéndoles mayor estabilidad [20]. Estos ácidos nucleicos juegan un papel importante como reguladores de procesos relacionados con respuesta inmune, apoptosis o la transición epitelio-mesénquima (TEM), considerándose además potenciales biomarcadores de diagnóstico y pronóstico en diferentes tipos de cáncer [21]. Otros dos pilares importantes de la biopsia líquida son el estudio de las CTC y de las VEs que se detallarán en los siguientes apartados. 2.2. Células Tumorales Circulantes (CTC) El desarrollo del cáncer se considera un proceso de varios eventos que implica la acumulación de numerosas mutaciones, conocidas como mutaciones driver, que contribuyen al crecimiento y la progresión tumoral [22]. Este tipo de mutaciones pueden producirse en protoncogenes o genes supresores de tumores dando lugar a la proliferación descontrolada de una población de células en un determinado tejido u órgano, originándose así lo que se conoce como tumor primario o carcinoma in situ [23]. En una fase temprana, una subpoblación de células epiteliales localizadas en ese tumor primario, pueden sufrir una transición epitelio-mesénquima (TEM), adquiriendo un fenotipo mesenquimal, agresivo, con propiedades invasivas y gran capacidad migratoria. Esto les permite adquirir la capacidad de diseminar desde el tumor primario e intravasar al sistema vascular, donde se les conoce como células tumorales circulantes (CTC) (Figura 1). La TEM asociada a la progresión metastásica contribuye a la generación de fenotipos híbridos con gran plasticidad. Está descrito que las células tumorales que expresan una mezcla de fenotipos epiteliales y mesenquimales tienen mayor capacidad de colonización y desarrollo de metástasis [24]. Esta plasticidad celular proporcionaría a las CTC un mayor potencial de adaptación a los diferentes microambientes que se INTRODUCCIÓN 53 encuentran durante su diseminación [25]. No obstante, este hecho limita el uso de las CTC en biopsia líquida ya que la mayoría de los métodos para la detección de estas células se basan en marcadores epiteliales, en particular la molécula de adhesión celular epitelial EpCAM (epithelial cell adhesion molecule). Esta proteína se expresa en la superficie de las células epiteliales y es utilizada como marcador de superficie de enriquecimiento por el sistema CellSearch®, el único método autorizado por la FDA (Food and Drug Administration) de Estados Unidos para la enumeración de CTC [26]. Una vez en circulación, las CTC tienen que ser capaces de sobrevivir evitando el fenómeno de anoikis así como el daño causado por las fuerzas hemodinámicas y por las células del sistema inmune [27]. Una de las formas de sobrevivir en circulación es mediante la generación de clusters. De hecho, está descrito que estas agrupaciones de CTC muestran un mayor potencial metastásico en comparación con las células individuales, porque aumentan la supervivencia celular y reducen la apoptosis [28]. Además la interacción de las plaquetas con las CTC también hace que las células del sistema inmune no puedan reconocer a estas células tumorales y como resultado la tasa de supervivencia de las CTC aumenta [29]. En la última etapa de la cascada metastásica, las CTC que sobreviven al microambiente sanguíneo, acabarán sufriendo un proceso de arresto en un lugar a distancia y entrarán en contacto con las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos de esas zonas. Tras su llegada al endotelio, las CTC aumentan la permeabilidad de la barrera endotelial, lo que permite su extravasación en un tejido u órgano, donde proliferarán y darán lugar a la formación de metástasis [30] (Figura 1). CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 54 Las CTC que diseminan desde el tumor primario al torrente sanguíneo, contienen información por tanto sobre el inicio, la progresión y la generación de metástasis, por lo que su enumeración y caracterización puede ser una herramienta prometedora para diseñar nuevas estrategias terapéuticas para tratar la enfermedad metastásica. Figura 1. Proceso de anidamiento de las Células Tumorales Circulantes (CTC) y generación de metástasis. Tras sufrir una transición epitelio-mesénquima (TEM) y adquirir un fenotipo invasivo, las células tumorales pueden intravasar en la circulación y viajar a través del torrente sanguíneo hasta órganos distantes. Una vez allí, las CTC tienen el potencial de extravasar y adaptarse en un órgano secundario, proliferando y dando lugar a la formación de metástasis. Esta figura se realizó utilizando Servier Medical Art (https: //smart.ser-343 vier.com) bajo la licencia Creative Common Attribution 3.0 Generic License. INTRODUCCIÓN 55 La enumeración de CTC ha demostrado ser una potencial herramienta de pronóstico en muchos tipos de cáncer. Así, el número de CTC se ha correlacionado con una reducción de la supervivencia libre de enfermedad (SLE) y la supervivencia global (SG) en pacientes con cáncer de mama en estadios tempranos que recibieron terapia neoadyuvante [31,32]. Otros estudios han demostrado que el recuento de CTC es un biomarcador fiable para determinar la respuesta al tratamiento y el pronóstico en pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración que reciben quimioterapia o terapias dirigidas a receptores de andrógenos (AR, androgen receptor) [33,34]. En el NSCLC se ha descrito que los pacientes con un número ≥2 CTC en sangre periférica, tienen mayor riesgo de recurrencia de la enfermedad y peor pronóstico [35]. En el CCRm varios estudios demostraron una correlación significativa entre un número ≥3 CTC por 7,5ml de sangre y la reducción de la supervivencia [36,37]. También se ha demostrado en este tipo tumoral que la detección de CTC es más frecuente en pacientes con enfermedad metastásica en comparación con la enfermedad no metastásica. Además, los pacientes con enfermedad no metastásica en los cuales se detectan CTC tienen una peor SG en comparación con los pacientes con CTC negativas [38]. Más allá del valor pronóstico de su enumeración, la caracterización molecular de las CTC se ha utilizado para evaluar la resistencia a regímenes de tratamiento específicos y ha proporcionado información relevante para las diferentes opciones terapéuticas. Por ejemplo, el seguimiento de la expresión de la topoisomerasa 1 (Top1) en las CTC tras el tratamiento con etirinotecán pegol, permite identificar a las pacientes con cáncer de mama metastásico con beneficios en la SG [39]. Los pacientes con cáncer de próstata metastásico (CPm) que presentan CTC positivas a la variante 7 del receptor de andrógenos (AR-V7, androgen receptor splice variant 7) se benefician del tratamiento con taxanos más que de la inhibición de la señalización del AR. Además, se encontró un aumento de CTC CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 62 - Proteínas Las VEs están enriquecidas en proteínas del citoesqueleto, citosólicas, proteínas de choque térmico y de la membrana plasmática, así como en proteínas implicadas en el tráfico de vesículas y glicoproteínas. Se ha demostrado que los perfiles proteómicos obtenidos dependen en gran medida de cómo se hayan aislado las VEs, ya que los diferentes métodos de aislamientos recogen subpoblaciones de VEs de homogeneidad variable [73]. No obstante, aunque los perfiles proteicos pueden ser característicos de los distintos subgrupos de VEs, no existe un marcador único que pueda identificar de forma exclusiva las VEs. Entre las proteínas enriquecidas en las VEs, y que suelen utilizarse como marcadores de identificación, se encuentran las tetraspaninas (CD9, CD63, CD81 y CD82), las proteínas 14-3-3, las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, major histocompatibility complex), proteínas de choque térmico como HSP70 (heat shock protein 70) o HSP90 (heat shock protein 90), TSG101 y la proteína de unión al complejo de clasificación endosómica requerido para el transporte (ESCRT-3) Alix [74]. Las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81 se consideraron en un primer momento marcadores específicos de los exosomas. Sin embargo, hay que tener precaución, ya que estas proteínas también se expresan abundantemente en la superficie celular y, por tanto, están presentes en otros tipos de VEs que se generan por gemación directa de la membrana plasmática y no tienen un origen endocítico [75]. También se ha propuesto una categorización sistemática de las VEs basada en la utilización del perfil de tetraspaninas como criterio de distinción de subpoblaciones individuales de VEs [76]. Por otra parte, está ampliamente descrito que las VEs están fuertemente glicosiladas, enriquecidas en glicoconjugados específicos [77–79]. Varios estudios han destacado la importancia de los patrones de glicosilación de las VEs en su captación e interacción con las células INTRODUCCIÓN 63 receptoras [80–82]. Además, cabe destacar que, en procesos patológicos como el cáncer, se producen alteraciones de estos patrones de glicosilación en las VEs tumorales, convirtiendo a estas nanoestructuras en potenciales biomarcadores en el ámbito clínico. Así, la N-glicosilación en el PSA (prostate specific antigen) asociado a VEs de la orina se asoció con un potencial diagnóstico en cáncer de próstata [83]. En las pacientes con cáncer de ovario, se han identificado exosomas derivados de la ascitis que contienen CD24 Ny Oglicosilado y la molécula EpCAM N-glicosilada, los cuales son importantes para el diagnóstico de este tipo de carcinoma [84]. Además la presencia del proteoglicano glipican-1 en exosomas presentes en el suero de pacientes con cáncer de páncreas ha demostrado una gran especificidad y sensibilidad para distinguir a los controles sanos y a los pacientes con una enfermedad pancreática benigna, de los pacientes con cáncer de páncreas en fase temprana y tardía, convirtiéndose en una potencial herramienta de diagnóstico en este tipo tumoral [85]. Un estudio más reciente, identificó la glicoproteína CD133 altamente glicosilada en exosomas de ascitis de pacientes con cáncer de páncreas, lo cual se asoció con la supervivencia de los pacientes. Aunque se necesitan más estudios, estos resultados muestran el potencial pronóstico de la glicosilación específica de CD133 en el cáncer de páncreas [86]. -Ácidos nucleicos Las VEs pueden contener ARN mensajero (ARNm), ARN no codificante de cadena larga (ARNncl), microARN (miARN), ARN ribosómico (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt) que pueden transferir a las células receptoras [87,88]. Varios estudios han demostrado que los miARNs juegan un importante papel en cáncer y su encapsulación en VEs les confiere gran estabilidad, convirtiéndose en potenciales biomarcadores pronósticos y diagnósticos [89,90]. CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 64 Las VEs no sólo contienen ARN, sino también se ha detectado en ellas la presencia de ADN mitocondrial (ADNmt), ADN monocatenario, ADN bicatenario y elementos retrotansposones [91]. Kawamura y colaboradores también han demostrado que las VEs obtenidas de células tumorales y tratadas con DNasa siguen conteniendo el oncogén KRAS mutado, lo que sugiere una transferencia horizontal de material genético mediada por las VEs [91]. - Lípidos Los estudios sobre el contenido lipídico de las VEs son todavía mucho más escasos que los relativos a las proteínas y los ácidos nucleicos. No obstante, se ha descrito un enriquecimiento en glicoesfingolípidos, esfingomielina, colesterol y fosfatidilserina que desempeñan funciones importantes en la formación de las VEs [92]. 2.3.3. Métodos de aislamiento Para facilitar el estudio y la aplicación clínica de las VEs es crucial emplear técnicas de aislamiento eficientes y rápidas, capaces de aislar VEs a partir de diferentes tipos de muestras. Existen una amplia variedad de técnicas de aislamiento que se basan en la densidad, tamaño, carga y proteínas de superficie de las VEs para facilitar su purificación. - Ultracentrifugación La ultracentrifugación (UC) es la técnica más utilizada para el aislamiento de VEs y está basada en la sedimentación de solutos a una fuerza de centrifugación elevada [93]. Existen varios protocolos que utilizan diferentes tipos de rotor, pasos de lavado, fuerzas centrífugas y tiempos que deben adaptarse al volumen y la viscosidad de la muestra [94] y, por tanto, pueden influir en el rendimiento y la pureza de las vesículas aisladas [95]. Un consenso aproximado que se establece es realizar una centrifugación de 400-2.000×g para eliminar las células y INTRODUCCIÓN 65 los residuos celulares de la muestra y posteriormente una centrifugación opcional a 10.000-12.000×g para obtener vesículas más grandes, y luego una UC a 100.000×g durante un rango entre 70-90 minutos para obtener un pellet de VEs que puede resuspenderse y lavarse (opcional) en una UC final de 100.000×g durante 1-2 h [96,97] (Figura 3A). Sin embargo, se ha demostrado que si se añaden rondas de UC se recuperan cantidades adicionales de VEs, lo que indica el bajo rendimiento de esta tecnología [98]. Además, la centrifugación a velocidades tan elevadas podría provocar la agregación y coprecipitación de proteínas solubles presentes en la muestra, lo cual disminuiría la pureza de las VEs obtenidas. Por otra parte, este método de aislamiento es relativamente lento y requiere un equipamiento específico lo cual limita también el proceso de obtención de las VEs y su posterior aplicación en el ámbito clínico. Existe una variación de este método de aislamiento que sería la UC en gradiente de densidad que se utiliza para aumentar la eficacia de la separación de las partículas en función de su densidad de flotación. Este sistema utiliza dos métodos para la formación del gradiente, un gradiente de densidad continuo (formado durante la centrifugación) como el iodixanol, o un gradiente escalonado como puede ser un gradiente de sacarosa [99] (Figura 3B). En esta técnica de aislamiento se coloca la muestra en la parte superior del medio de gradiente de densidad y se somete a una ronda prolongada de UC. Al aplicar una fuerza centrífuga los solutos, incluidas las VEs de la muestra, se mueven como zonas individuales a través del medio de gradiente de densidad hacia el fondo, cada uno a su velocidad de sedimentación específica[100]. Esta técnica permitiría la separación de las VEs de las proteínas contaminantes, basándose en su diferente flotabilidad. De este modo, se eliminaría el material no vesicular que se copurificaría en el pellet de la UC clásica. No obstante, este método sigue siendo difícil de trasladar a la práctica clínica debido al tiempo requerido para el CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 66 aislamiento de las VEs y la necesidad de equipamientos específicos, como la ultracentrífuga. - Ultrafiltración Otra de las técnicas más populares de aislamiento de VEs basada en el tamaño de partículas es la ultrafiltración (UF) (Figura 3C). Los fundamentos de la ultrafiltración no difieren de la filtración por membrana convencional, en la que la separación de las partículas depende principalmente de su tamaño o peso molecular [101]. La UF utiliza membranas con un peso molecular definido que van de 10 a 100 kDa (kiloDaltons). Esta técnica se utiliza sobre todo para aislar VEs de muestras relativamente diluidas, como puede ser la orina y los cultivos celulares [102,103]. El rango de partículas que atraviesan un tamaño de poro determinado no permite el fraccionamiento de los diferentes tipos de VEs o asegurar la separación de proteínas contaminantes, pudiéndose incluso llegar a obturarse los poros de la membrana. No obstante, es un método rápido y fácil para aislar las VEs en comparación con la UC [103]. Alternativamente a la UF, existen otros métodos de aislamiento de VEs basados en filtración como la filtración de flujo tangencial (TFF, tangential flow filtration), en donde la muestra que contiene las VEs fluye tangencialmente moviéndose a lo largo de la membrana, pero no directamente a través de la misma. Las moléculas más pequeñas se descartarían, mientras que las moléculas más grandes que el nivel de corte, como las VEs, permanecerían en la membrana y se recircularían y concentrarían [104]. La TFF es más beneficiosa en comparación con los filtros convencionales en los que el fluido fluye directamente a través membrana, lo que a menudo da lugar a la obstrucción de los poros. - Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, size-exclusion chromatography) es una técnica que se utiliza para la separación de INTRODUCCIÓN 67 partículas en función de su tamaño molecular o volúmenes hidrodinámicos (Figura 3D). La SEC se ha utilizado para el aislamiento de VEs a partir de una gran variedad de muestras como puede ser plasma y suero [105,106], orina [107,108], leche [109], saliva [110], fluído sinovial [111], fluído cerebroespinal [112] y ascitis [113], entre otros. El aislamiento de VEs utilizando esta técnica se basa en los perfiles de elución diferencial de partículas de diferentes tamaños que atraviesan un polímero poroso, que constituye la fase estacionaria (también conocida como matriz de filtración en gel o resina), y que atraviesa la fase móvil de la columna SEC. Las partículas pequeñas se ven frenadas al entrar en los poros del polímero, por lo que eluyen más tarde que las partículas más grandes. Así, las VEs de mayor tamaño viajan más rápido a lo largo de la columna por lo que eluyen primero. Metodológicamente, hay tres fases estacionarias que suelen utilizarse: Sepharosa® CL2B y CL4B y Sephacryl® S-400. La utilización de la Sepharosa CL4B y Sephacryl® S-400 permite un aislamiento más puro al reducir la coelución de contaminantes comunes como la albumina o lipoproteínas que pueden estar presentes sobre todo en suero y plasma [98]. Varios estudios han demostrado la ventaja que tiene esta tecnología frente a técnicas convencionales como la UC. Dado que las lipoproteínas de alta densidad (HDL, high-density lipoprotein) y las VEs comparten un rango de densidad similar, las VEs aisladas por UC podrían coprecipitar HDL [114], mientras que con la SEC este problema se solventaría debido a que este tipo de lipoproteínas son más pequeñas que las VEs. Otros estudios han revelado que la SEC permite obtener VEs de mayor calidad derivadas de cultivos celulares, con menos contaminación proteica y menos alteración composicional y estructural en comparación con el aislamiento utilizando agentes precipitantes, como el polietilenglicol [115]. No obstante, aunque la SEC ha sido eficaz en la eliminación de la mayoría de las HDL y proteínas relativamente pequeñas del plasma, su mayor inconveniente es el coaislamiento de otras lipoproteínas, incluyendo VLDL (very-low- CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 68 density lipoprotein) y LDL (low-density lipoprotein), que comparten el mismo rango de tamaño que las VEs [105]. Además, se observó que la SEC aislaba VEs relativamente más pequeñas que las obtenidas por UC, dando lugar a proteomas diferentes. Para solventar algunas limitaciones de la SEC y mejorar la pureza de las VEs aisladas, algunos estudios han combinado el uso de esta metodología con otras técnicas como la UC y UF [116,117], lo cual ralentizaría el proceso de aislamiento. - Sistemas basados en agentes de precipitación La mayoría de estos sistemas se basan en la utilización de polímeros de exclusión como el PEG (polyethylene glycol) para precipitar las VEs (Figura 3E). La recuperación de VEs con estos métodos puede ser alta, pero sin mucha pureza, ya que precipitan todas las partículas solubles presentes en la muestra de partida. Existen varios kits comerciales basados en agentes de precipitación: ExoQuick (System Biosciences), Total Exosome Isolation Reagent (Invitrogen), ExoPrep (HansaBioMed), y miRCURY Exosome Isolation Kit (Exiqon), entre otros. El procedimiento de aislamiento de VEs con estas tecnologías es sencillo, rápido y escalable y no requiere equipo adicional para el aislamiento, lo que hace que este método sea muy atractivo para la investigación clínica. Sin embargo su principal desventaja es la contaminación variable de la muestra con complejos proteicos y lipoproteínas, así como con partículas virales y de otro tipo [118], lo que hace que las VEs aisladas no sean puras. - Fraccionamiento de campo de flujo (FFF) El fraccionamiento de flujo de campo (FFF, field flow fractionation) es una técnica emergente basada en el tamaño para la separación de VEs. El AF4 (asymmetrical flow field-flow fractionation) es la técnica derivada de FFF más utilizada en donde la separación de macromoléculas se basa en sus coeficientes de difusión (Figura 3F). INTRODUCCIÓN 69 Este sistema contiene dos placas separadas por un espaciador con una membrana permeable en el fondo (pared de acumulación). El perfil de flujo laminar transporta las VEs desde el canal hasta los detectores. El fraccionamiento basado en el tamaño se consigue mediante un flujo cruzado transversal a un perfil de flujo laminar que separa las VEs en función de su tamaño en la pared de acumulación [119]. El flujo cruzado puede modificarse y optimizarse incluso entre las carreras para mejorar la eficiencia de la separación, lo que hace que este sistema sea más flexible en comparación con la SEC. Una de las ventajas del AF4 para la separación de las VEs es el fraccionamiento suave, de forma que las partículas no se deterioran. No obstante, las VEs obtenidas por AF4 están diluidas y pueden requerir un paso extra de preconcentración antes de realizar estudios posteriores. - Sistemas basados en inmunoafinidad Los métodos de aislamiento basados en la afinidad utilizan interacciones selectivas y específicas entre las proteínas o los receptores de la membrana de la VEs y sus correspondientes ligandos, como pueden ser los anticuerpos. Para desarrollar una técnica de aislamiento basada en la afinidad, los ligandos se inmovilizan o se conjugan en una variedad de medios sólidos, como perlas magnéticas (Figura 3G) o materiales poliméricos (perlas de agarosa). Los anticuerpos más utilizados se dirigen a las proteínas tetraspaninas comúnmente enriquecidas en las superficies de las VEs, como CD9, CD63 y CD81. Una de las principales ventajas de la inmunoafinidad, además del aislamiento selectivo de VEs en general, es la posibilidad de aislar VEs procedentes de diferentes tipos celulares. Así por ejemplo, en un estudio llevado a cabo por Sharma et al., utilizaron un anticuerpo monoclonal con especificidad hacia un péptido de las células de melanoma, pero no de células sanas, para capturar los exosomas derivados de las células del melanoma del plasma humano [120]. Otros anticuerpos se han utilizado para aislar poblaciones CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 70 específicas de VEs, como anti-CD105 o anti-CD34 [121] o anti-CD171 [122]. En general, las VEs unidas se eluyen de las perlas magnéticas utilizando reactivos adecuados, o bien, los complejos perlas-VEs pueden utilizarse directamente para un análisis posterior, por ejemplo, un inmunoensayo. Así, se ha desarrollado un dispositivo de microfluídica (ExoSearch chip) para el aislamiento y la detección de VEs a partir de plasma humano utilizando perlas magnéticas conjugadas con tres anticuerpos contra los marcadores de VEs (CD9, CD81 y CD63) para la inmunocaptura y anticuerpos fluorescentes frente a los marcadores tumorales (CA-125 (carbohydrate antigen 125), EpCAM y CD24) para la detección específica de VEs tumorales [123]. Otro sistema de microfluídica, el OncoBean chip, descrito previamente como un dispositivo para el aislamiento de CTC, se modificó con anticuerpos que reconocen los marcadores comunes de las VEs para lograr un aislamiento de alto rendimiento de estas nanoestructuras [124]. Además de las tecnologías basadas en la inmunoafinidad, los aptámeros se han utilizado para capturar VEs con gran afinidad y especificidad. Los aptámeros son oligonucleótidos de ADN o ARN monocatenarios con estructura tridimensional que reconocen una gran variedad de moléculas. En un estudio reciente, se emplearon aptámeros de ADN específicos para CD63 y el biomarcado tumoral MUC1 (mucin 1) marcados con biotina, para el aislamiento de VEs de plasma. Una vez unidas las VEs a los aptámeros, se introdujeron perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina, para capturar las VEs marcadas. Posteriormente se introdujo un oligonucleótido de secuencia complementaria para hibridar con los aptámeros y permitir la liberación de las VEs de las perlas magnéticas sin alterar su estructura. Esto hizo que el aislamiento basado en aptámeros fuera más ventajoso en comparación con la utilización de perlas magnéticas acopladas a anticuerpos [125]. En general las ventajas de las tecnologías basadas en la afinidad para el aislamiento de VEs incluyen un proceso rápido, una INTRODUCCIÓN 71 instrumentación simple y una alta selectividad para las VEs de interés, lo que las hace muy atractivas y adecuadas para aplicaciones clínicas y fines de diagnóstico. No obstante, se trata de tecnologías costosas y son necesarios varios parámetros de optimización para un aislamiento eficiente, como el proceso de elución capaz de mantener la integridad de la VEs, el número de perlas magnéticas requeridas y la especificidad de los anticuerpos hacia las VEs. Además, la inmunocaptura aísla eficazmente las VEs de los cultivos celulares pero el proceso se dificulta cuando se utilizan muestras más complejas como el plasma, lo que da lugar a un bajo rendimiento. CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 78 supervivencia y el crecimiento de las células tumorales diseminadas [151]. Cabe destacar que la hipoxia y la acidez del microambiente son factores clave que influyen en el destino de las células dentro del microambiente tumoral, así como en la secreción de VEs [152–154], independientemente de la histología del tumor [155]. Estos datos refuerzan el valor de los niveles de VEs como un biomarcador común en el cáncer [156]. Así, por ejemplo, está descrito que en el plasma de los pacientes con glioblastoma los niveles de VEs cambian a lo largo de la enfermedad [157]. Entre los mecanismos relacionados con el cáncer mediados por las VEs, la angiogénesis parece ser importante para mantener el crecimiento y la diseminación del tumor. De hecho, se ha demostrado que las VEs secretadas por diferentes células tumorales son mediadores relevantes de la angiogénesis [158]. Por otra parte, varios estudios han demostrado que las VEs modulan la resistencia a los fármacos a través de diferentes mecanismos. Por ejemplo, las VEs HER2-positivas secretadas por células de cáncer de mama se unen al fármaco trastuzumab y bloquean su actividad antiproliferativa en las células tumorales [159]. Además, la liberación de la glicoproteína P (P-gp, pglycoprotein) a través de las VEs se ha descrito como otro mecanismo de resistencia a los fármacos en pacientes con cáncer de mama [160] y de próstata [161]. También se ha descrito que mecanismos alternativos mediados por las VEs son responsables de la resistencia a la temozolamida en glioblastoma [162], al gefitinib en el carcinoma de células escamosas de esófago [163] o al tamoxifeno en el cáncer de mama [164]. Además de las funciones importantes que desempeñan las VEs en la promoción de los tumores y su interés como dianas terapéuticas, las VEs han surgido como prometedores biomarcadores del cáncer debido a su incremento en los diferentes fluidos biológicos como consecuencia de la enfermedad [150] y a su gran estabilidad en la circulación, protegiendo su carga molecular (proteínas, ARNm, ARN INTRODUCCIÓN 79 no codificante y ADN monocatenario o bicatenario, entre otros) del ambiente extracelular gracias a la bicapa lipídica. En este sentido, el análisis de las VEs es una herramienta prometedora para mejorar el manejo clínico de los pacientes con cáncer. Así, el aumento de los niveles del PSA exosomal ha demostrado ser un valioso biomarcador para el cribado del cáncer de próstata [165]. En otro estudio piloto se ha demostrado que los exosomas caveolina 1 (CAV-1, caveolin-1) positivos aumentan después de la cirugía, mientras que los bajos niveles perioperatorios de exosomas plasmáticos se correlacionan con una mejor supervivencia en pacientes con carcinoma oral de células escamosas [166]. Un estudio llevado a cabo por Melo et al. ha identificado las VEs asociadas a glipican-1 como una potencial herramienta de diagnóstico no invasiva para detectar estadios tempranos de cáncer de páncreas [85]. Así mismo, otro grupo ha descrito bajos niveles de miR-let7a y altos niveles de miR-10b, miR21, miR-30c y miR-181a exosomales para diferenciar pacientes con cáncer de próstata de controles sanos y de enfermos crónicos, en comparación con los niveles de CA 19-9 (carbohydrate antigen 19-9) en plasma o con el glipican-1 exosomal [167]. Está descrito, además, que las VEs pueden incorporar las alteraciones genómicas que se observan habitualmente en los procesos oncogénicos, por lo que estas nanoestructuras constituyen un material potencialmente valioso para el descubrimiento de biomarcadores basados en el ADN circulante. En el cáncer de próstata, el ADN asociado a VEs aisladas de orina ha demostrado ser un potencial biomarcador en la monitorización de la progresión [168]. En un estudio reciente llevado a cabo por Foroni et al. se han identificado amplificaciones del gen del receptor de andrógenos en el ADN de las VEs aisladas de plasma de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración [169]. Yang et al. destacaron el valor diagnóstico de la detección de KRASG12D y TP53R273H (tumor protein P53) en las VEs, lo que permitió diferenciar controles sanos de pacientes con cáncer de CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 80 páncreas [170]. Además, otros estudios han demostrado que la detección de la mutación KRAS en el ADN de las VEs de pacientes con cáncer de páncreas era superior a su detección en el ADNtc [171,172]. García-Romero et al. también destacaron una posible ventaja del ADN derivado de VEs sobre el ADNlc como biomarcador en gliomas. En este estudio demostraron que el ADN derivado del tumor sólo podía cruzar la barrera hematoencefálica cuando se asociaba con VEs y podía detectarse en sangre periférica, indicando su potencial como biomarcador mínimamente invasivo en comparación con las biopsias líquidas obtenidas del líquido cefalorraquídeo [173]. Además, recientemente se ha descrito una mayor sensibilidad en la detección de mutaciones en EGFR en el ADN de exosomas en comparación con el ADNlc en pacientes con NSCLC [174]. En relación a los ARNs contenidos en VEs, varios trabajos han demostrado que los miARNs asociados a VEs pueden ser útiles también como biomarcadores de diagnóstico en diferentes tipos de tumores. Ogata-Kawata et al. identificaron en suero mayores niveles de los miARNs exosomales let-7a, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 y miR-23a en pacientes con CCR que en personas sanas [175]. En la misma línea, un estudio reciente ha descrito que los miR-92 y miR-21 exosómicos son factores de diagnóstico independientes con mayor sensibilidad y especificidad que el biomarcador clínico CEA (carcinoembryonic antigen) utilizado habitualmente [176]. Liu et al. demostraron que los niveles elevados de miR-23b-3p, miR-10b-5p y miR-21-5p exosómicos se asociaban de forma independiente con una peor supervivencia global en pacientes con NSCLC [177]. Otro estudió reveló que la regulación a la baja del miARN exosómico let-7a-5p conducía a una expresión elevada del gen diana BCL2L1 (BCL2 like 1) y a una peor supervivencia en pacientes con adenocarcinoma de pulmón [178]. Más recientemente, se postuló que una combinación de miR-375, miR-655-3p, miR-548b-5p y miR-24-2-5p sería una buena herramienta de diagnóstico para detectar el cáncer de mama en fase inicial [179]. INTRODUCCIÓN 81 Además de su potencial diagnóstico, algunos estudios han explorado el uso de las VEs como vectores para la administración de fármacos antitumorales. Así, un estudio reveló que las VEs derivadas de células estromales mesenquimales (MSCs, mesenchymal stromal cells) que contenían paclitaxel mostraban una acción antiproliferativa sobre la línea celular de cáncer de páncreas CFPAC-1 [180]. Además, el tratamiento combinado de adenovirus oncolíticos y paclitaxel encapsulado en VEs mejoró sus efectos anticancerígenos in vitro e in vivo en modelos de cáncer de pulmón [181]. En otro estudio, en un modelo xenograft murino de cancer de pulmón, la administración oral de paclitaxel encapsulado en exosomas derivados de la leche, ejerció una supresión tumoral mayor en comparación con el uso de paclitaxel libre administrado por vía intraperitoneal [182]. También se ha visto que la administración de fármacos mediante las VEs puede reducir la toxicidad sistémica. Así, Toffoli et al, demostraron in vitro e in vivo que la administración de doxorrubicina a través de exosomas derivados de las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231 y CCR HCT116, reducía la cardiotoxicidad ofreciendo así la posibilidad de aumentar la eficacia de la doxorrubicina [183]. Dada la gran cantidad de estudios preclínicos que exploran la eficacia de las VEs como potencial herramienta diagnóstica y terapéutica, se han desarrollado varios ensayos clínicos [184]. Así por ejemplo, un estudio clínico en fase 2 completado por el Centro Médico de la Universidad de Konkuk evaluó la eficacia antitumoral de Olmutinib (Olita®) administrado a pacientes con NSCLC que presentan la mutacion EGFR T790M, confirmada mediante el ADN extraído de las VEs del líquido de lavado broncoalveolar [185]. Otro ensayo de fase I llevado a cabo por el M.D. Anderson Cancer Center está reclutando pacientes para estudiar la mejor dosis y los efectos secundarios de los exosomas derivados de células estromales mesenquimales con ARN pequeño de interferencia contra KRASG12D CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 82 (iExosomes) en el tratamiento de pacientes con cáncer de páncreas que presentan esa mutación [186]. En general, todos estos datos evidencian el importante papel de las VEs en cáncer como indicador de la complejidad del tumor y como prometedora herramienta diagnóstica y terapéutica. Sin embargo, el campo de las VEs está lejos de la aplicabilidad clínica en todos los tipos de tumores, en particular en los tumores ginecológicos. 2.3.5.1. Vesículas extracelulares en tumores ginecológicos Algunas partes de este subapartado han sido extraídas/adaptadas de un trabajo previamente publicado [1] Las neoplasias ginecológicas son una de las principales causas de muerte por cáncer en las mujeres [187]. Entre los tumores ginecológicos más frecuentes se encuentra el cáncer cervical, el cáncer de endometrio, el cáncer de ovario, el cáncer vaginal y el cáncer vulvar [188]. El tratamiento de este tipo de neoplasias sigue siendo un reto, ya que en la mayoría de los casos la enfermedad se diagnostica en estadios avanzados, por lo que se necesita la identificación de biomarcadores que puedan predecir y diagnosticar de forma temprana la enfermedad. El cáncer de endometrio (CE) constituye el cáncer ginecológico más prevalente en los países desarrollados. Aunque muchos de los casos son diagnosticados en estadios tempranos, entre el 2-15% de los casos desarrollan enfermedad recurrente, y esta proporción puede incrementarse hasta el 50% en mujeres con estadios avanzados de CE [189]. En este sentido, se han estudiado varios biomarcadores con valor pronóstico y predictivo en muestras de tejido de CE, como la proteína L1CAM (L1 cell adhesion molecule), cuyos niveles son un factor pronóstico para los tumores en estadio I, y la proteína ANXA2 (annexin A2), identificada como predictor de enfermedad recurrente en CE [190,191]. Sin embargo, ninguno de estos biomarcadores se ha implementado en la práctica clínica, debido a su INTRODUCCIÓN 83 escasa sensibilidad y/o especificidad. Por otra parte, aunque el potencial de la biopsia líquida en el CE apenas se ha explorado, algunos estudios han demostrado la viabilidad de detectar tanto CTC como ADNtc en muestras de sangre de pacientes con diferentes estadios de la enfermedad, principalmente en casos de alto riesgo o metastásicos [192–194]. Estos prometedores resultados preclínicos apoyan la necesidad de explorar el beneficio clínico de los biomarcadores circulantes para estratificar a las pacientes con CE e identificar terapias alternativas. Para ello, las VEs presentes en sangre, orina o aspirados uterinos constituyen una valiosa alternativa para mejorar la sensibilidad analítica de los biomarcadores proteicos y genéticos [193]. Es importante destacar que, en este sentido, los eventuales efectos de las VEs en el microambiente uterino han sido explorados en el contexto de la implantación embrionaria, con la transferencia del contenido de miARN de los exosomas y microvesículas entre las células epiteliales endometriales y las células trofoectodérmicas del blastocisto [195] y en la endometriosis [196], pero no en el contexto del carcinoma endometrial [197], donde se desconoce su papel. En los últimos años ha aumentado el estudio de los miARNs como potenciales biomarcadores. Cabe destacar que varios estudios han identificado miARNs en VEs de diferentes fluidos corporales en pacientes con CE. Srivastava et al. evaluaron el potencial de los miARNs de los exosomas como biomarcador diagnóstico de CE, mostrando un enriquecimiento del miR-200c-3p en los exosomas de la orina de estas pacientes [198]. Roman-Canal et al. encontraron un grupo de miARNs significativamente alterados en VEs del lavado peritoneal de pacientes con CE que mostraron valor pronóstico[199]. Otro estudio realizado por Li et al. sugirió que las VEs enriquecidas en miR-302a derivadas de células madre mesenquimales del cordón umbilical humano podían ser una estrategia terapéutica potencial en las pacientes con CE [200]. Además, se descubrió que los miR-93 y miR205 exosomales aumentan en el suero de las pacientes con CE, y los CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 84 niveles elevados de miR-205 se podrían asociar con una peor evolución del tumor [201]. A pesar de todos estos datos, la aplicación de VEs en pacientes con CE está aún poco desarrollada, siendo necesarios más estudios para explorar todo su potencial. Por otra parte, el cáncer de ovario (CO) es el segundo tumor más frecuente en los países occidentales. La mayoría son tumores de alto grado que afectan a uno o a ambos ovarios, y tienen una gran capacidad de diseminación [202]. En este tipo de tumor se suelen emplear los niveles de CA-125 como biomarcador circulante para el manejo de la enfermedad [203]. No obstante, en el CO, al igual que en el CE, se necesitan biomarcadores precisos no invasivos con valor clínico para mejorar el diagnóstico y predecir la evolución de las pacientes después de la cirugía, para facilitar un seguimiento más preciso y la selección de la terapia más adecuada. En este sentido, el estudio de las VEs en CO como herramienta de biopsia líquida no invasiva, arroja luz sobre el descubrimiento de nuevos biomarcadores de diagnóstico, pronóstico y selección de dianas terapéuticas. Las VEs optimizan el microambiente para la colonización en el CO, promoviendo la angiogénesis, la remodelación del estroma y la inmunosupresión en el nicho premetastásico [204]. Los exosomas liberados en el líquido ascítico podrían dar lugar a cambios biofísicos y funcionales en los fibroblastos que promueven el desarrollo de un microambiente tumoral maligno en el CO [205]. Además, nuestro grupo encontró que los exosomas obtenidos de ascitis de pacientes con CO promueven la adhesión de la línea celular humana de CO SKOV3. Este hallazgo se aprovechó para desarrollar un novedoso sistema de captura de células tumorales (M-Trap), compuesto por exosomas con capacidad adhesiva para capturar células tumorales y prevenir la diseminación peritoneal generalizada, que es tan común en el CO. En un modelo murino de diseminación tumoral del CO generado por inyección intraperitoneal de células SKOV3, se observó como, tras el implante del dispositivo M-Trap en el peritoneo, el patrón de INTRODUCCIÓN 85 diseminación de las células SKOV3 se modificó notablemente, de manera que la metástasis se localizó en el sistema M-Trap. Así, la tecnología M-Trap fue capaz de remodelar los patrones metastásicos, transformando una enfermedad sistémica en una enfermedad focal y ofreciendo un nuevo enfoque terapéutico [206]. Por otro lado, se describieron diferentes cargas proteicas derivadas de las VEs como potenciales biomarcadores clínicos en el CO. Peng et al. identificaron ocho proteínas (CLIC4 (chloride intracellular channel 4), AKT1(serine/threonine-protein kinase 1), EMAPII (aminoacyl tRNA synthetase complex-interacting multifunctional protein), SNX3 (sorting nexin-3), FAM49B (family with sequence similarity 49, member B), FERMT3 (fermitin family homolog 3), TUBB3 (tubulin beta 3) y lactotransferrina) en los exosomas circulantes de las pacientes con CO y han sugerido su utilidad en el diagnóstico temprano [207]. También se describió la presencia de las proteínas GSN (gelsolin), FGG (fibrinogen gamma chain), FGA (fibrinogen alpha chain) y LBP (lipopolysaccharide binding protein) en los exosomas derivados del CO y se ha asociado con la disfunción de la coagulación que se produce con frecuencia en pacientes con este tipo de carcinoma [208]. Además, las proteínas de las VEs también tienen un papel importante en la estadificación del tumor y como biomarcadores de la respuesta al tratamiento en pacientes con CO. En este sentido, Szajnik et al. informaron que el plasma de pacientes con CO se caracteriza por tener niveles más altos de proteínas exosomales que los del plasma de los controles (enfermedad benigna y donantes sanos), y estos niveles están correlacionados con el estadio del tumor [209]. Además de las proteínas asociadas a las VEs, los ARNm o los miARNs también se han relacionado con la carcinogénesis y la agresividad del CO. Yokoi et al. descubrieron que las VEs de ascitis de pacientes con CO que contienen ARNm de la metaloproteinasa 1 (MMP1, matrix metalloproteinase-1) inducían la apoptosis en las CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 86 células mesoteliales, promoviendo así la diseminación peritoneal [210]. Xu et al. indicaron que una disminución del miR-101 en los exosomas del suero podía servir como potencial biomarcador de diagnóstico en el CO [211]. En un análisis de VEs plasmáticas en CO y controles sanos, Zhang et al. encontraron que la expresión de los miR-106a-5p, hsa-let7d-5p, y miR-93-5p era significativamente mayor en pacientes con CO, mientras que la de los miR-185-5p, miR-122-5p, y miR-99b-5p disminuía, sugiriendo que estos miARNs podrían ser potenciales objetivos de diagnóstico y pronóstico para el tratamiento del CO [212]. Pan et al. encontraron que los niveles de miR-200b exosomal se correlaciona con el marcador tumoral CA-125 y la SG de las pacientes con CO [213]. Por otra parte, los miARNs asociados a las VEs desempeñan un papel en la respuesta terapéutica del CO. Así, un trabajo llevado a cabo por Kuhlmann et al. analizó un conjunto de miARNs asociados a VEs de plasma diferencialmente expresados en pacientes resistentes y sensibles a platino, sugiriendo así su potencial como biomarcadores predictores de la resistencia a este fármaco [214]. También se exploraron otros fluidos biológicos tales como líquido peritoneal y pleural u orina, donde los miARNs asociados a VEs demostraron su papel como potenciales biomarcadores pronósticos y diagnósticos del CO [215,216]. Todos estos estudios demuestran que las VEs son una fuente potencial de biomarcadores diagnóstico y pronóstico en el CE y el CO. Sin embargo, hay que afrontar muchos retos antes de que sea posible la utilización clínica de las VEs en la detección y el tratamiento de estos tumores ginecológicos. 3. Desarrollo comercial del producto: desde la investigación básica a la práctica clínica El término "investigación médica traslacional" hace referencia a los descubrimientos generados en los laboratorios de investigación y su INTRODUCCIÓN 87 aplicación en la práctica clínica de forma que beneficie al paciente. Así, el objetivo de la investigación traslacional es poder combinar disciplinas, recursos, conocimientos y tecnologías para promover mejoras en la prevención, el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes [217]. El campo de la investigación traslacional incluye varias etapas (Figura 4). En primer lugar, la investigación básica, basada en la exploración científica, el conocimiento de las bases biológicas de la enfermedad y las necesidades que hay en el ámbito donde queremos aplicar la investigación desarrollada. En segundo lugar, la investigación preclínica, que conecta el conocimiento científico con su aplicación en modelos celulares o animales o incluso simulaciones asistidas por ordenador de interacciones de fármacos y dispositivos para comprender mejor la base de la enfermedad. En tercer lugar, estaría la investigación clínica, que incluye los ensayos clínicos en seres humanos para probar la seguridad y eficacia de los modelos desarrollados en la etapa preclínica. El objetivo principal de esta etapa es obtener datos que respalden la aprobación regulatoria para poder implementar la tecnología o compuesto desarrollado en la práctica clínica. Por último, estaría la fase de implementación ya en la práctica clínica que implica la utilización de las tecnologías o modelos que han demostrado ser útiles y eficaces en un entorno de investigación, en la rutina clínica. Figura 4. Representación esquemática de las diferentes estapas de la investigación médica traslacional. Esta figura se realizó utilizando Adobe Stock bajo la licencia estándar de graphic monster: stock.adobe.com. CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 94 CAPÍTULO 3Aplicaciones de la tecnología ExoGAG: búsqueda de biomarcadores proteicos y genéticos en oncología y traslación a la práctica clínica. 3.1. Aplicar la tecnología ExoGAG a la búsqueda y validación de biomarcadores proteicos. 3.1.1. Validar los biomarcadores proteicos, L1CAM y ANXA2, asociados a VEs aisladas utilizando la tecnología ExoGAG en muestras de plasma de pacientes con CE. 3.1.2. Realizar una búsqueda de biomarcadores en CCR mediante el uso de arrays de glicoproteínas a partir de VEs aisladas utilizando la tecnología ExoGAG. 3.2. Aplicar la tecnología ExoGAG en la búsqueda de biomarcadores genéticos. 3.2.1. Detectar mutaciones puntuales en el ADN de las VEs aisladas mediante ExoGAG. 3.2.2. Optimizar el sistema de extracción de ARN de las VEs aisladas mediante ExoGAG y realizar un análisis de expresión génica a nivel del ARNm de las VEs. 3.2.3. Analizar la expresión de miARNs en las VEs aisladas con la tecnología ExoGAG. 3.3. Trasladar la tecnología ExoGAG a la práctica clínica. CAPÍTULO 1 95 CAPÍTULO 1 Modelización del proceso de anidamiento de las células tumorales circulantes que sobreexpresan ANXA2 y cribado de compuestos que alteran el proceso de metástasis en cáncer de endometrio CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 96 CAPÍTULO 1 97 CAPÍTULO 1 Modelización del proceso de anidamiento de las células tumorales circulantes que sobreexpresan ANXA2 y cribado de compuestos que alteran el proceso de metástasis en cáncer de endometrio Los resultados de este capítulo han sido extraídos/adaptados de un trabajo previamente publicado [221] 1.1. Introducción El cáncer de endometrio (CE) es el cáncer ginecológico más frecuente en los países desarrollados. La mayoría de los casos se diagnostican en una fase temprana de la enfermedad, principalmente debido a una hemorragia uterina anormal sintomática, con una tasa de supervivencia a cinco años de más del 95%, pero esta tasa disminuye drásticamente cuando existe una diseminación regional (69%) o una enfermedad a distancia (16%) [222]. Aproximadamente entre el 2% y el 15% de las mujeres diagnosticadas con CE en fase inicial presentarán enfermedad recurrente, pero esta tasa de recurrencia aumenta hasta el 50% en estadios avanzados y condiciones histológicas agresivas [189]. La cirugía representa el tratamiento primario, que incluye la extirpación del útero, las trompas de Falopio y ovarios, y la estadificación quirúrgica con linfadenectomía basada en el estadio, la invasión del miometrio y el grado histológico. Además, las pacientes con alto riesgo de recurrencia reciben radioterapia adyuvante. La quimioterapia, incluyendo compuestos de platino y taxanos, se limita a la enfermedad metastásica/recurrente y los estadios avanzados o los tipos histológicos de alto riesgo, como el seroso [223]. Sin embargo, los regímenes de CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 98 quimioterapia tradicionales son menos eficaces en comparación con los cánceres de otros órganos debido a la resistencia a la quimioterapia adquirida por las células cancerosas, la no selectividad de los tratamientos actuales y la heterogeneidad biológica del CE [224–226]. Se han estudiado varios marcadores inmunohistoquímicos para la predicción de recurrencias, como la expresión reducida del receptor de estrógeno (ER, estrogen receptor) o del receptor de progesterona (PR, progesterone receptor), o la expresión aumentada de la molécula L1CAM, descrita como predictor de recurrencia y de supervivencia global en el CE [227,228], pero ninguno de ellos se ha llevado a la práctica clínica debido a su limitada sensibilidad y/o especificidad. Todo esto enfatiza la importancia de mejorar el tratamiento de la enfermedad avanzada en el CE mediante la identificación de nuevas dianas moleculares y biomarcadores asociados al riesgo de recurrencia y/o a la respuesta al tratamiento. En este aspecto, previamente se ha identificado y validado la sobreexpresión de la proteína ANXA2 en un estudio retrospectivo que incluía a 93 pacientes en el que ANXA2 predecía eficazmente los carcinomas endometriales endometrioides (CEE) que finalmente sufrían recidiva [229]. Es importante destacar que ANXA2 demostró un valor predictivo también entre los CEE de bajo riesgo en estadio I, destacando la utilidad clínica del biomarcador ANXA2 como predictor de enfermedad recurrente en CE. ANXA2 puede aparecer como un monómero libre en el citoplasma, en asociación con membranas intracelulares o expuesta en la cara externa de la membrana plasmática [230], formando un complejo heterotetramérico con la proteína S100A10. A nivel intracelular, ANXA2 juega un papel importante en la exocitosis, endocitosis y tráfico de membrana y es esencial para la formación de los raft lipídicos. A nivel extracelular, ANXA2 interviene en la fagocitosis, coagulación y angiogénesis y se ha descrito su papel en procesos de invasión y metástasis en diferentes tipos de cáncer [231,232]. CAPÍTULO 1 99 Paralelamente, la enumeración y la caracterización molecular de las CTC representan una herramienta clínica prometedora para el seguimiento en tiempo real de los pacientes en tratamiento, convirtiéndose en una de las soluciones de biopsia líquida que permite la medicina personalizada [233]. La cuantificación de CTC ha demostrado ser un factor pronóstico independiente en cáncer de mama avanzado [32,234], próstata [235] y CCR [236]. Destacar también que la evolución de la enumeración de las CTC durante el tratamiento se correlaciona con la respuesta a la terapia y la supervivencia [237]. En el CE, los hallazgos apuntan sistemáticamente a un pequeño porcentaje de pacientes con CE de alto riesgo que presentan CTC positivas para la molécula EpCAM en el momento del diagnóstico, aunque se han realizado estudios de cohorte limitados [238]. El consorcio ENITEC (European Network for Individualized Treatment in Endometrial Cancer) describió un 22% (n=32) de pacientes de alto riesgo con CTC positivas, y caracterizaron estas CTC con un fenotipo de plasticidad asociado a alto riesgo de recurrencia [192]. Además del valor clínico de las CTC como biomarcador de diagnóstico y pronóstico en enfermedad avanzada, desde una perspectiva biológica las CTC se consideran responsables de la generación de nuevas metástasis tumorales y una atractiva diana farmacológica para la alteración del proceso de diseminación y colonización. La caracterización molecular de las CTC también permite comprender mejor la biología de la metástasis y resistencia a las terapias establecidas [239]. Los recientes descubrimientos interpretan las CTC como entidades de gran plasticidad que deben adherirse eficientemente a los sitios que colonizarán y darán lugar a micrometástasis [240–242]. La transición epitelio-mesénquima (TEM), que da lugar a la desregulación de los marcadores epiteliales y a la adquisición de propiedades mesenquimales, aumenta la capacidad de las células tumorales para migrar e invadir el entorno y favorecer su intravasación al torrente sanguíneo, y el proceso inverso, la transición CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 100 mesénquima-epitelio (TME), permite que las CTC se adhieran a los tejidos generando micrometástasis [243,244]. Estudios anteriores han descrito una asociación entre las CTC y ANXA2 en cáncer de mama temprano, relacionada con la TEM [245]. Basándonos en estas premisas, en este capítulo se ha desarrollado una nueva estrategia terapéutica en CE para impedir la adhesión de las CTC a los nichos premetastásicos. CAPÍTULO 1 101 1.2. Resumen gráfico CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 102 1.3. Materiales y métodos 1.3.1. Pacientes Un total de 57 pacientes con CE con alto riesgo de recurrencia fueron reclutadas en tres hospitales de España (Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela, Hospital Universitario Vall d'Hebron y MD Anderson Cancer Center Madrid). Todas las pacientes firmaron el consentimiento informado aprobado por el comité ético. Los criterios de inclusión para participar en el estudio fueron: pacientes con alto riesgo de recurrencia; carcinomas endometriales FIGO (Federación internacional de ginecología y obstetricia) en estadio III o IV; carcinomas de grado 3; invasión miometrial >50%, carcinomas de células claras o serosas (Tabla 2) Tabla 2. Características clínicas de la cohorte de pacientes con CE. CAPÍTULO 1 103 1.3.2. Expresión de ANXA2 en las CTC de pacientes con cáncer de endometrio con alto riesgo de recurrencia Las CTC se aislaron en función de la expresión de EpCAM, utilizando el kit CELLectionTM Epithelial Enrich (Invi-trogen, Dynal, Oslo, Noruega), como se describe en Alonso-Alconada et al. [192]. La expresión de ANXA2 en las CTC se determinó mediante RT-qPCR (reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction) tras la extracción del ARN total con el kit QIAmp viral RNA mini kit (Qiagen, Valencia, CA). El ADN complementario (ADNc) se sintetizó utilizando SuperScriptIII (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los genes ANXA2 y CD45 se preamplificaron utilizando el kit TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) con 14 ciclos de reacción. La qPCR (quantitative polymerase chain reaction) se llevó a cabo utilizando el kit TaqMan Gene Expression MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando la plataforma 7500 Real‐Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU). Los datos se analizaron con el software StepOne v.2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU) y se normalizaron con respecto al receptor de la proteína tirosina fosfatasa tipo C (PTPRC, CD45), como marcador previamente validado de aislamiento no específico [246]. Los datos se representaron como el valor Cq (quantification cycle) de ANXA2 normalizado a 40 (número máximo de ciclos) (40 - CqANXA2), y este valor se normalizó al 40-CqCD45 ((40 - CqANXA2) - (40-CqCD45)). 1.3.3. Análisis de datos El valor de la mediana de la expresión de ANXA2 en la población de CTC de pacientes con CE se definió como el punto de corte para clasificar a las pacientes con niveles bajos o altos de ANXA2 en CTC. Se utilizó el test de Kaplan-Meier con log-rank para determinar las CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 110 cultivo) utilizando una micropipeta multicanal. Tras 5 días de incubación del sistema a 37ºC con 5% de CO2, las colonias se tiñeron con azul Alamar (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU), siguiendo las instrucciones del fabricante, y la fluorescencia se midió a una longitud de onda de excitación de 531 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. Los controles negativos (células sin tratamiento) y positivos (células tratadas con Docetaxel 1.2 μM) se incluyeron en todas las placas, así como puntos con el compuesto de referencia a una concentración equivalente a su IC50 (17 nM (nanomolar)). La medida de IC50 (half-maximal inhibitory concentration) hace referencia a la concentración a la que un fármaco es capaz de inhibir un proceso biológico concreto en un 50%. Tras este primer cribado, se seleccionaron 34 compuestos capaces de inhibir la proliferación de las células IK-PLKO en al menos un 60%, los cuales se volvieron a testar en tres experimentos diferentes y finalmente 27 compuestos se consideraron los compuestos confirmados. Posteriormente, estos 27 compuestos se testaron en un segundo cribado en las líneas celulares IK-pLKO e IK-shANXA2 y se seleccionaron aquellos compuestos que inhibían la proliferación de las células IK-pLKO con una IC50 al menos diez veces inferior a la de las células IK-shANXA2. Los compuestos seleccionados se testaron finalmente en las líneas celulares IK-Ctrl e IK-ANXA2, seleccionándose daunorrubicina como compuesto que mostraba una IC50 diez veces más baja en la línea que sobreexpresaba ANXA2. La daunorrubicina se seleccionó para ser testada en posteriores análisis in vitro e in vivo. Las curvas de dosis-respuesta se calcularon utilizando el software GraphPad Prism 4.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU) para determinar los valores de IC50 para cada línea celular. Los valores se expresaron como Media±SEM de al menos tres experimentos independientes. CAPÍTULO 1 111 1.3.11. Ensayo de migración transendotelial en 3D Para estudiar el proceso de migración transendotelial, se cubrió una placa de 96 pocillos de fondo transparente (Perkin Elmer, MA, EE.UU) con la matriz extracelular de colágeno 3D Culture Matrix™ Rat Collagen I (Cultrex, Abingdon, Reino Unido), utilizando 7.5% (p/v (peso/volumen)) de bicarbonato de sodio para la neutralización y medio de cultivo, hasta una concentración final de 1.6 mg/ml (miligramo/mililitro). La placa se centrifugó durante 10 min a 300×g y 4ºC. Tras 45 min de polimerización a 37ºC en 5% CO2, se colocó una placa absorbente RAFT (TAP Biosystems, Wilmington, EE.UU) encima de la matriz de colágeno para absorber el medio durante 15 min. La capa de colágeno se trató entonces con laminina al 2% (laminina de sarcoma murino Engelbreth-HolmSwarm, Sigma, MO, EE.UU) durante 30 min para favorecer la adhesión celular y se sembraron 6×104 células EAhy926-GFP sobre la matriz de colágeno. Al día siguiente, una vez formada la monocapa de células endoteliales, se sembraron 12×103 células IK-ANXA2, previamente teñidas con DiD (Vybrant™ DiD CellLabeling Solution, Thermofisher, MA, EE.UU), siguiendo las instrucciones del fabricante, en presencia o no de daunorrubicina (compuesto seleccionado en el HTS) a 10-7 M, 3x10-7 M y 10-6 M. Se seleccionaron cuatro campos en cada pocillo individual a tiempo inicial y siete días después de la incubación a 37ºC en 5% CO2, usando el sistema de imágenes de alto contenido Operetta® (PerkinElmer, MA, EE.UU), tomando planos cada 5 µm. Se seleccionó una excitación a 460-490 nm y una emisión a 500-550 nm para medir GFP y una excitación a 620-640 nm y emisión a 660-760 nm para medir DiD. Las imágenes se analizaron con el programa ImageJ. Los valores se expresaron como Media±SEM de al menos tres experimentos independientes. Para determinar la actividad citotóxica de la daunorrubicina en las células endoteliales EAhy926-GFP se llevó a cabo un ensayo de viabilidad celular basado en el reactivo azul Alamar, el cual se añadió CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 112 a las células en un volumen correspondiente al 10% del medio y se incubó durante tres horas. El ensayo se reveló mediante el uso de un lector de placas basado en la fluorescencia. 1.3.12. Modelo in vivo de cáncer de endometrio recurrente Para el ensayo experimental in vivo, se utilizaron 20 ratones hembras CB17-SCID CD-17/lcr/Prkdc scid/Rj de 28 semanas de edad (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Francia) que se dividieron en cuatro grupos de 5 ratones cada uno y se inocularon con 2×106 células H-Ctrl o H-ANXA2, por vía intraperitoneal (IP). En el momento de la inyección, el grupo control recibió placebo (solución salina con DMSO (dimethylsulfoxide)) por inyección IP y el grupo tratado recibió daunorrubicina IP (1 mg/kg en solución salina). El clorhidrato de daunorrubicina se adquirió en Sigma (ref. 30450) y se disolvió en DMSO. El tratamiento se repitió al quinto día. Las metástasis tumorales se detectaron el sexto día mediante imágenes bioluminiscentes utilizando el equipo Xenogen IVIS (Xenogen, Caliper LifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU) acoplado al software Living Imaging 4.2 (Xenogen Corporation). La luciferina (150 mg/kg (miligramo/kilogramo); Firefly Luciferin, Caliper Lifescience Corp, Hopkinton, MA, EE.UU) en PBS se inyectó intraperitonealmente como sustrato para la luciferasa. Los ratones se alojaron y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE para la experimentación con animales y fueron aprobados por el Comité de Uso de Cuidados de Animales de la Universidad de Santiago de Compostela (USC). CAPÍTULO 1 113 1.4. Resultados Los resultados de este capítulo han sido extraídos/adaptados de un trabajo previamente publicado [221] 1.4.1. Validación de la expresión de ANXA2 en CTC de pacientes con cáncer de endometrio con alto riesgo de recurrencia Las CTC de sangre periférica de pacientes con CE con alto riesgo de recurrencia se purificaron por inmunoaislamiento basado en EpCAM (n=57; véase la Tabla 2 para las variables clínicas de la cohorte incluida en este estudio). Los niveles de expresión de ANXA2 en las CTC se analizaron por qPCR y los valores de la mediana se emplearon para evaluar la SLP y la SG. Así, los resultados mostraron que las pacientes con altos niveles de expresión de ANXA2 en CTC se asociaron con un tiempo más corto hasta la progresión, con una media de 34.85 meses, mientras que en aquellas pacientes con niveles bajos de ANXA2, los tiempos de SLP aumentaron hasta 45.52 meses (Figura 6A; p=0.108). La SG también se redujo en pacientes con altos niveles de expresión de ANXA2 en CTC (Figura 6B; p=0.208). Estos resultados indican la posible utilidad clínica de la monitorización de CTC en CE avanzado [192] y el posible valor de ANXA2 para la estratificación de los pacientes [229]. CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 114 1.4.2. La sobreexpresión de ANXA2 en líneas celulares de cáncer de endometrio promueve un fenotipo mesenquimal Una vez analizada la relación entre la expresión de ANXA2 en las CTC y el riesgo de recurrencia, se exploró el impacto de la expresión de ANXA2 en las CTC durante su circulación en la sangre y en los lugares de futura metástasis. Para ello en primer lugar se recrearon CTC endometriales aumentando la expresión de ANXA2 en las líneas celulares de CE Ishikawa (IK-ANXA2) y Hec1A (H-ANXA2) (Figura 7A). Cabe destacar que el aumento de la expresión de ANXA2 dio lugar a una transición de un fenotipo epitelial a un fenotipo mesenquimal, caracterizado por una mayor expresión de Vimentina (Figura 7A; IK **p=0.002, H *p=0.029 y Figura 7B) y un aumento de la migración celular analizado mediante un ensayo de migración en transwell tras 48 h de incubación en comparación con las células IK-Ctrl (Figura 7C; p=0.062). Estas evidencias están de acuerdo con los resultados Figura 6. Curvas de supervivencia de KaplanMeier de 57 pacientes con CE con alto riesgo de recurrencia estratificadas por los niveles de expresión de ANXA2 en CTC. (A) Curva de supervivencia libre de progresión (test long-rank; p=0.108) y (B) curva de supervivencia global (test long-rank, p=0.208). CAPÍTULO 1 115 anteriores, que proponen una asociación de las CTC de CE con un fenotipo de plasticidad asociado a la metástasis [192]. 1.4.2.1 La sobreexpresión de ANXA2 en las CTC promueve el proceso de metástasis Una vez confirmada la sobreexpresión de ANXA2 en las líneas celulares de CE Ishikawa y Hec1A, se modelizó in vitro e in vivo el proceso de adhesión y anidamiento de las células tumorales. Figura 7. Caracterización de las líneas celulares de CE, Ishikawa y Hec1A. (A) Niveles de expresión de ANXA2 y Vimentina en las líneas celulares IK-Ctrl e IKANXA2 (panel izquierdo) y H-Ctrl y H-ANXA2 (panel derecho) analizados por qPCR (Mean±SEM; test Mann-Whitney; IK**p=0.002 y H *p=0.029). (B) Niveles de proteína ANXA2 y Vimentina en las líneas celulares IK-Ctrl, IK-ANXA2, HCtrl y H-ANXA2 analizadas por Western Blot; vimentina (VIM) (57 KDa); ANXA2 (38 KDa) y Cherry-ANXA2 (67K Da). (C) Efecto de la sobreexpresión de ANXA2 en la línea celular Ishikawa en un ensayo de migración en transwell. CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 116 Para modelar in vitro el proceso escalonado que deben cumplir las CTC una vez incorporadas a la circulación, incluyendo la fijación eficiente al endotelio y el anidamiento para la generación de micrometástasis, se diseñaron sistemas de microfluídica para perfundir las células tumorales de CE dentro de vasos endoteliales simulados. En primer lugar, se analizó el impacto de la expresión de ANXA2 en las CTC de CE que eventualmente contactan con un endotelio para generar una interacción célula-célula, lo cual podría dar lugar al anidamiento de las células tumorales. Para ello, se utilizaron una serie de canales en paralelo en los cuales se sembró una monocapa de células endoteliales humanas que expresaban la proteína verde fluorescente (EAhy926GFP). Una vez formada la monocapa de células endoteliales, se perfundieron en los canales las células tumorales de CE IK-Ctrl, H-Ctrl e IK-ANXA2 y H-ANXA2 en una atmósfera humidificada a 37ºC y 5% CO2 durante 2 h (Figura 8A, panel superior). Tras la perfusión, las células tumorales adheridas se observaron en el microscopio de fluorescencia, se tomaron imágenes de campos representativos y se cuantificó la fluorescencia (Figura 8A, panel intermedio), observándose una eficiencia de adhesión endotelial similar entre las células IK-Ctrl e IK-ANXA2 (Figura 8A, histograma; p=0.222). Resultados similares, sin diferencias significativas, se encontraron al comparar las células control y las que sobreexpresan ANXA2 en la línea célular Hec1A (Fig. 8A, histograma, p=0.474). Estos resultados concuerdan con el fenotipo mesenquimal que caracteriza a las CTC endometriales lo cual resulta en una eficiencia limitada para establecer contactos focales con células endoteliales [247]. Posteriormente, se aumentó la complejidad del modelo integrando una matriz de agarosa polimerizada como base para la localización de las CTC en el sistema microfluídico (Figura 8B, panel superior), y se realizó un ensayo de adhesión competitiva de células tumorales con la línea Hec1A, la cual había mostrado en el ensayo anterior un rendimiento de fijación celular más competente en CAPÍTULO 1 117 comparación con las células Ishikawa. Así, una vez formado el canal de agarosa, este se trató con laminina para favorecer la adhesión celular y se perfundieron las líneas celulares de CE H-Ctrl teñida con DiD (rojo) y H-ANXA2 teñida con DiO (verde) durante 1 h. El sistema se incubó hasta cuatro días para estudiar no solo el proceso de adhesión sino también el anidamiento de las células tumorales. Como ya se describió anteriormente, las células Hec1A que sobreexpresaban ANXA2 demostraron una menor eficacia en la adhesión inicial, lo que se tradujo en un menor porcentaje de estas células tumorales a las 24 h de la perfusión, tras la cuantificación de la fluorescencia (Figura 8B; histograma; t=24 h). No obstante, tras cuatro días de incubación, las células Hec1A que sobreexpresaban ANXA2 mostraron una mayor formación de micrometástasis en comparación con las células Hec1ACtrl, (Figura 8B; histograma; t=4 d). Estos resultados sugieren que la expresión de ANXA2 en las CTC de CE promueve la transición a un fenotipo mesenquimal asociado a una mayor capacidad de invasión y proliferación, pero con propiedades de adhesión limitadas, dando lugar a un proceso más eficiente de diseminación y localización en lugares distantes para la generación de micrometástasis en los órganos diana. Finalmente, se analizó el impacto de la sobreexpresión de ANXA2 en un modelo preclínico in vivo de diseminación de CE, en particular un modelo de anidamiento en el que se analiza el impacto de ANXA2 en las células tumorales, recapitulando los eventos ya descritos previamente en los modelos in vitro. El carcinoma endometrial presenta una diseminación tanto hematógena como peritoneal, dando lugar a recurrencias loco-regionales y a distancia. Así, se modeló la adhesión de CTC a un mesotelio, inyectando células Hec1A, que expresaban luciferasa con o sin sobreexpresión de ANXA2, en la cavidad peritoneal de ratones inmunodeficientes (Figura 8C, panel superior). Tras la inyección, se midió la señal de bioluminiscencia de las células Hec1A a tiempo inicial, sin encontrar diferencias significativas entre los grupos a los que se les inyectó la línea control (H-Ctrl) y la línea CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 118 que sobrexpresaba ANXA2 (H-ANXA2) (Figura 8C, t=0h; histograma superior; n=5; p=0.413). No obstante, a los seis días de la inyección de las células tumorales, la señal de bioluminiscencia fue significativamente mayor en aquellos ratones inyectados con la línea H-ANXA2 (Figura 8C, t=6 d; histograma inferior; n=5; **p=0.008). Estos resultados indicaron que la línea Hec1A que sobreexpresaba ANXA2 presentaba una mayor capacidad para generar micrometástasis peritoneales, lo cual fue consistente con las propiedades invasivas que favorecen el anidamiento en las condiciones dinámicas mostradas previamente in vitro. Así, además de validar el potencial metastásico de las células tumorales de CE con expresión aumentada de ANXA2, estos resultados apoyaron el potencial de ANXA2 como una diana atractiva para la alteración del proceso de metástasis. CAPÍTULO 1 119 Figura 8. Efecto de la sobreexpresión de ANXA2 en la adhesión de células tumorales de CE y la formación de micrometástasis. (A) Imagen esquemática del ensayo de adhesión (panel superior). Imágenes representativas de células tumorales IK y Hec1A teñidas con DiD (rojo) adheridas a una monocapa de células endoteliales EAhy926-GFP (verde) en un sistema comercial de canales paralelos (panel central). Ampliación 10x. Cuantificación del área total de células adheridas fluorescentes (Histograma; Media±SEM; test Mann-Whitney; IK p=0.222 y Hec1A p=0.474); U.A (unidades arbitrarias). (B) Imagen esquemática del ensayo de formación de micrometástasis en matriz de agarosa (panel superior). Imágenes representativas de las células H-Ctrl (DiD rojo) y H-ANXA2 (DiO verde) 24h (panel superior central) y 4 días (panel inferior central) después de la perfusión. Datos cuantitativos del área total de fluorescencia de las células H-Ctrl y H-ANXA2 24h y 4 días después de la perfusión (Histograma; Media ± SEM; test Kruskal-Wallis; p=ns). (C) Imagen esquemática de la inyección intraperitoneal en ratones (panel superior). Imágenes de bioluminiscencia IVIS de un ensayo de metástasis peritoneal in vivo tras la inyección (t=0h; panel central) y 6 días después de la inyección intraperitoneal de células H-Ctrl y H-ANXA2 (t=6 d; panel inferior). Cuantificación de las imágenes de bioluminiscencia (histograma; media ± SEM; test Mann-Whitney; p=0.413 y **p=0.008, respectivamente); f/s (fotones/segundo) CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 126 Por último, se evaluó en un modelo in vivo la capacidad de la daunorrubicina para impedir la adhesión de las células tumorales al mesotelio peritoneal y evitar la metástasis loco-regional utilizando el modelo preclínico de inyección intraperitoneal de células tumorales Hec1A. La daunorrubicina se administró por vía intraperitoneal (1 mg/kg) en el día 0 y en el día 5 tras la inyección de las células tumorales. La eficiencia del tratamiento con daunorrubicina sobre las células Hec1A con niveles basales de ANXA2 (H-Ctrl) comparada con la de las células Hec1A que sobreexpresaban ANXA2 (H-ANXA2), se analizó mediante la cuantificación de la bioluminiscencia total a los seis 6 días de la inyección intraperitoneal de las células tumorales utilizando el sistema Xenogen IVIS (Figura 12A). La daunorrubicina demostró una mayor capacidad para inhibir la proliferación de las células tumorales en función de la expresión de ANXA2, en este modelo preclínico de diseminación peritoneal de CE avanzado. Como se muestra en la Figura 12A, el patrón de metástasis peritoneal se redujo drásticamente en aquellos ratones inyectados con las células H-ANXA2 tras el tratamiento con daunorrubicina, confirmado además por la cuantificación de la señal de bioluminiscencia de los implantes metastásicos peritoneales (Figura 12B). (D) Validación de la daunorrubicina en las células endoteliales EAhy926-GFP. Cuantificación del área total de las células endoteliales EAhy926-GFP fluorescentes tratadas o no con daunorubicina (1x10-6M) durante 7 días en un cultivo de migración transendotelial en 3D utilizando el sistema de imágenes de alto contenido Operetta® (panel izquierdo; Media±SEM; test Mann-Whitney; p=ns). Ensayo de viabilidad celular basado en el azul Alamar que muestra la curva dosis-respuesta que compara la actividad citotóxica de la daunorrubicina en las células endoteliales EAhy926-GFP (IC50=1,69x10-6M). CAPÍTULO 1 127 Todos estos resultados refuerzan la validez de una estrategia terapéutica dirigida específicamente a la población de células tumorales diseminadas responsables de la metástasis. También confirman el potencial de la daunorrubicina para la inhibición de la adhesión de las células tumorales asociadas al fenotipo mesenquimal resultante de la expresión aumentada de ANXA2, para la prevención de la enfermedad recurrente en CE. Figura 12. Validación de la daunorrubicina en las células Hec1A que sobreexpresan ANXA2 en un modelo de ratón con inyección intraperitoneal. (A) Imágenes de bioluminiscencia IVIS de un ensayo de metástasis peritoneal in vivo en el momento inicial (t=0h; panel izquierdo) y 6 días después de la inyección intraperitoneal de las líneas celulares H-Ctrl y H-ANXA2 tratadas con daunorrubicina (1mg/kg) (t=6d; panel derecho). (B) Cuantificación de las imágenes de bioluminiscencia (Media±SEM; test Mann-Whitney ; H-Ctrl p=ns; HANXA2 **p=0.008) CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 128 Los resultados de este capítulo han sido extraídos/adaptados de un trabajo previamente publicado [221] “Modeling ANXA2-overexpressing circulating tumor cells homing and high throughput screening for metastasis impairment in endometrial carcinomas” Carolina Herrero1a, Jose Brea2a, Amparo Pérez-Díaz2, Emiliano Cuadrado2, Noelia Ferreño1, Cristian Pablo Moiola3, Eva Colás3,4, Antonio GilMoreno3,4, Rafael LópezLópez1,4, María Isabel Loza2, Miguel Abal1,4*, Lorena Alonso-Alconada1 ** 1 Oncología Médica Traslacional (Oncomet), Instituto de Investigación Sanitaria de Santiago de Compostela (IDIS), Hospital Universitario de Santiago de Compostela (SERGAS), Santiago de Compostela, España. 2 Plataforma de Screening de fármacos/ Grupo de investigación Biofarma. Centro Singular de Investigación en Medicina Molecular y Enfermedades Crónicas (CIMUS), Universidad de Santiago de Compostela (USC). Santiago de Compostela, España. 3 Grupo de investigación biomédica en ginecología. Instituto de Investigación Vall d'Hebron (VHIR), Universidad Autónoma de Barcelona. Barcelona, España 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC). Madrid, España. a Coautores con la misma contribución Biomedicine & Pharmacotherapy. Volumen:140; páginas:111744;2021 DOI: https://doi.org/10.1016/j.biopha.2021.111744 ISSN: 0753-3322 Índice de impacto: 6.529 Cuartil 1 (Q1) en medicina (miscellaneous) Este es un artículo open access distribuído bajo términos de licencia Creative Commons CC-BY-NC-ND 4.0, que permite copiar y distribuír el material en cualquier medio, para fines no comerciales, siempre que se acrediten los autores originales y la fuente. No se permite un uso comercial de la obra original ni la generación de obras derivadas. Contribución en este artículo: Yo, Carolina Herrero Filgueira, he contribuído en el desarrollo experimental, concretamente en la caracterización de las líneas celulares mediante las técnicas de Western Blot y RT-qPCR, la realización de los ensayos de adhesión y anidamiento in vitro utilizando sistemas 3D y la realización de ensayos in vivo con modelos murinos. Además, he llevado a cabo el análisis de datos y la preparación del manuscrito. CAPÍTULO 2 129 CAPÍTULO 2 Desarrollo y optimización de una nueva tecnología de aislamiento de vesículas extracelulares trasladable a la práctica clínica: ExoGAG CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 130 CAPÍTULO 2 131 CAPÍTULO 2 Desarrollo y optimización de una nueva tecnología de aislamiento de vesículas extracelulares trasladable a la práctica clínica: ExoGAG Parte de los resultados de los apartados 2.4.2 y 2.4.3 han sido extraídos/ adaptados de un trabajo previamente publicado [248] 2.1. Introducción El diagnóstico precoz del cáncer es esencial para mejorar la supervivencia de los pacientes. La mayoría de los diagnósticos de tumores sólidos se basan en pruebas de imagen con una sensibilidad y especificidad limitadas para identificar posibles casos, que luego se confirman de forma invasiva mediante la biopsia de tejido. En los últimos años las investigaciones se han centrado en el desarrollo de enfoques menos invasivos para mejorar el diagnóstico de los diferentes tipos de cáncer. Así, ha surgido el concepto de biopsia líquida como método no invasivo para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de los pacientes mediante la detección y el análisis de biomarcadores tumorales liberados en la circulación, tales como los ácidos nucleicos libres circulantes (ADNlc), las CTC, y las VEs [249].Varios estudios han analizado el potencial de cada uno de estos analitos como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico [250–252]. Sin embargo, tanto las CTC como el ADNtc se enfrentan a muchos retos como biomarcadores de enfermedad tumoral. Así, las CTC en circulación suelen ser extremadamente escasas y presentan una gran heterogeneidad, lo cual dificulta su aislamiento y análisis [253]. Por otra parte, el ADNtc suele encontrarse muy fragmentado y no es estable CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 132 en sangre ni en otros fluidos biológicos, lo que dificulta en la mayoría de casos su detección [254]. En comparación con estos biomarcadores circulantes, las VEs presentan propiedades que les confieren una ventaja superior debido a su relativa abundancia y a su estabilidad, protegiendo el material que contienen de las enzimas presentes en el plasma y otros fluidos biológicos. Para facilitar la estandarización de la investigación sobre estas nanoestructuras se ha creado la base de datos EV-TRACK (http://evtrack.org) que registra los parámetros experimentales de estudios relacionados con la VEs, con el fin de mejorar la interpretación y la reproducibilidad de los experimentos realizados con VEs [255]. No obstante, uno de los retos de la traslación de las VEs como biomarcadores tumorales a la práctica clínica es el desarrollo de tecnologías de aislamiento y enriquecimiento eficientes y robustas. La ultracentrifugación es la técnica estándar para aislamiento de VEs, pero tiene el gran inconveniente de necesitar grandes cantidades de muestra, equipamientos específicos y mucho tiempo para obtener las VEs, de forma que es muy difícil su implementación en la rutina clínica [256]. Otras tecnologías basadas en agentes de precipitación, consiguen obtener VEs de forma rápida pero coprecipitando grandes cantidades de proteína contaminante por lo que las muestras obtenidas no son puras, dificultando así la búsqueda de biomarcadores [257]. Técnicas como la cromatografía de exclusion (SEC) pueden también coaislar proteínas de tamaño similar a las VEs. Está descrito que la SEC combinada con otros métodos como la ultracentrifugación o la ultrafiltración mejora la pureza en comparación con cualquiera de los métodos por separado [258,259], pero el proceso de aislamiento sería más complicado lo que dificultaría su traslación a la clínica. Los sistemas de microfluídica y de aislamiento basados en el uso de anticuerpos permitirían obtener vesículas más puras pero se trataría de métodos muy costosos lo que impide su uso generalizado en la clínica [260]. Por todo ello, uno de los principales retos en el campo de las VEs CAPÍTULO 2 133 es el desarrollo de una tecnología de aislamiento sencilla, eficiente y robusta que pueda ser fácilmente trasladable a la práctica clínica. Paralelamente la mayoría de los estudios de diagnóstico y pronóstico basados en el uso de VEs se han centrado en las proteínas y ácidos nucleicos, pero los biomarcadores basados en los glicanos podrían ser especialmente prometedores, ya que se ha descrito que estos carbohidratos son capaces de modular varios procesos durante la progresión tumoral [261–263]. Además, se han encontrado patrones específicos de glicanos enriquecidos en las VEs en diferentes tipos de cáncer [264–266]. Por otra parte, durante el desarrollo tumoral se produce una alteración en los patrones de glicosilación que se puede ver reflejado a nivel de las VEs, lo cual puede constituir un marcador importante para la detección y aislamiento de estas nanoestructuras y para la distinción de las VEs tumorales de las no tumorales. Así, la presencia del proteoglicano glipican-1, en cáncer de páncreas, y el proteoglicano condroitin sulfato asociado a melanoma (CSPG4, chondroitin sulfate proteoglycan 4), han permitido diferenciar las VEs tumorales de las no tumorales [120,267]. Además, en los exosomas de ascitis de pacientes con cáncer de páncreas se encontró un incremento de la glicosilación de la proteína CD133, lo cual se asoció con la supervivencia, revelando su potencial papel pronóstico en este tipo de tumores [86]. Por otra parte, se ha identificado un aumento significativo de las VEs O-glicosiladas en pacientes con cáncer de páncreas en estadios iniciales que eran negativas para el marcador CA 19-9 [268]. Otro estudió reveló, la presencia de variantes altamente glicosiladas del inductor de la metaloproteinasa de la matriz extracelular (EMMPRIN, extracellular matrix metalloproteinase inducer) en las microvesículas derivadas de pacientes en varios tipos de cáncer, lo cual se correlacionó con una peor supervivencia [269]. Teniendo en cuenta el potencial uso de los glicanos presentes en la membrana de las VEs unido a la necesidad de un método de aislamiento y enriquecimiento de estas nanoestructuras sencillo y CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 134 eficiente, que pueda trasladarse fácilmente a la práctica clínica, en este capítulo se ha desarrollado y optimizado la tecnología ExoGAG. Esta herramienta se trata de una nueva técnica eficiente de aislamiento de exosomas y otras VEs, basada en la unión de un agente de precipitación catiónico (ExoGAG) a la carga negativa derivada de la presencia de glicosaminoglicanos (GAGs) en la superficie de las VEs, agregándose en forma de complejos que luego pueden ser purificados por centrifugación. Así, tras un período de incubación y centrifugación de la muestra con el reactivo ExoGAG, las VEs serían purificadas en formato pellet. CAPÍTULO 2 135 2.2. Resumen gráfico CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 142 2.3.3.3. Extracción de ARN de las VEs (ARN-VEs) de plasma y orina y PCR cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR) La velocidad de centrifugación más adecuada para el aislamiento de VEs de muestras de plasma se testó también mediante la cuantificación de la expresión de GAPDH por RT-qPCR en las VEs aisladas por la tecnología ExoGAG. Para ello, 500 µl y 3 ml de plasma de un donante sano (control) fueron procesados con el doble de volumen de ExoGAG (Tabla 4; velocidad de centrifugación). Los pellets obtenidos tras el aislamiento se resuspendieron en 500 µl y 3 ml de DPBS, respectivamente. El ARN-VEs fue extraído utilizando el kit QIAamp Circulating Nucleic Acid kit (CNA) (Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó también un tratamiento con DNasa I (79254, Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la purificación del ARN, el ADNc se sintetizó utilizando la enzima reversotranscriptasa MulV (Applied Biosystems, Foster City, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. La RT-qPCR se llevó a cabo utilizando la sonda Taqman GAPDH (#Hs99999905_m1; Applied Biosystem, Foster City, CA) empleando el termociclador QuantSudioTM 3 (Thermofisher Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU) con las condiciones: 50oC 2 min, 95oC 10 min; 40 ciclos (95oC 15 segundos (seg) y 60oC 1 min). Los resultados de la expresión del gen GAPDH se representaron como 40-Media Cq. Los datos se analizaron con el software QuantstudioTM Design & Analysis version 2.5.1 (Thermofisher Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU). Con el fin de determinar cuál era el ratio adecuado muestrareactivo para el aislamiento de VEs a partir de muestras de orina con la tecnología ExoGAG, se analizó la expresión del gen GAPDH por RTqPCR en las VEs aisladas. Para ello, se incubaron 3 ml de orina de un donante sano (control) con 3 ml, 6 ml y 1.5 ml de ExoGAG durante 5 min a 4oC y posteriormente se centrifugaron a 3000xg 15 min 4oC CAPÍTULO 2 143 (Tabla 4; ratio muestra-ExoGAG). Los pellets de VEs se resupendieron en 4.5 ml de TRIzol (TRIzol™ Reagent, 15596018, Thermofisher Scientific, Van Allen Way, CA, EE.UU) y se incubaron a TA durante 5 min. Luego, se añadieron 1.2 ml de cloroformo (J.T Baker, Gliwice, Polonia) a cada muestra, se mezclaron vigorosamente y se incubaron 5 min a TA. La fase acuosa, que contiene el ARN, se recogió después de una centrifugación a 12000xg 15 min a 4oC y se procedió a la extracción del ARN utilizando el kit miRNeasy microkit (Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó también un tratamiento con DNasa I (79254, Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La síntesis del ADNc y la qPCR para testar la expresión de GAPDH se llevó a cabo tal y como se describió anteriormente. Los resultados de la expresión del gen GAPDH se representaron como 40-Media Cq mostrando la media de la expresión de GAPDH de dos ensayos independientes. Los datos se analizaron con el software QuantstudioTM Design & Analysis version 2.5.1 (Thermofisher Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU). 2.3.4. Aislamiento de VEs a partir de medio de cultivo condicionado y muestras de plasma, suero y orina control utilizando la tecnología ExoGAG Una vez definido el mejor protocolo de aislamiento de VEs con el reactivo ExoGAG, se recogieron 40 ml de medio de cultivo condicionado de las líneas celulares MDA-MB-231, IK, SKOV3 y Hec1A, tras 48 h de cultivo en las condiciones descritas anteriormente, y se incubaron con 20 ml de ExoGAG durante 5 min a 4oC. Las VEs se aislaron mediante centrifugación a 3000xg 30 min 4oC (centrífuga Sorvall ST 8R, Thermo Scientific, Osterode am Harz, Alemania) y se resuspendieron en DPBS para su posterior caracterización. Para el aislamiento de plasma, la sangre periférica se recogió en tubos EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) (BD Vacutainer, CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 144 367525, 532 Plymouth, Reino Unido) y se centrifugó durante 10 min a 1600xg. El sobrenadante se recogió y se centrifugó de nuevo durante 10 min a 5500xg para eliminar las células restantes y el plasma se almacenó a -80°C hasta su uso. Para el aislamiento de suero, la sangre periférica se recogió en tubos SST™ II advance (BD Vacutainer, 367958, Reino Unido) y se centrifugó durante 10 min a 1800xrpm (revolutions per minute). El suero se recogió y se almacenó a -80°C hasta su uso. Las muestras de orina se recogieron en tubos de C&S Boric Acid Sodium Bo-535 rate/Formate (BD Vacutainer, 364955, Eysins, Suiza) y se centrifugaron durante 10 min a 3000xg para eliminar cualquier resto celular y se almacenaron a -80°C hasta su uso. Las VEs se aislaron a partir de muestras de plasma, suero y orina de donantes sanos (controles) utilizando la tecnología ExoGAG. Las muestras de plasma y suero se incubaron con el doble de volumen de ExoGAG (1:2; muestra-ExoGAG), mientras que las muestras de orina se procesaron con la mitad de volumen de reactivo (1:0.5; orinaExoGAG) durante 5 min a 4oC. A continuación, las muestras se centrifugaron a 3000xg durante 15 min a 4oC y los pellets resultantes se resuspendieron en DPBS para la caracterización de las VEs. Cabe destacar que, tras el aislamiento, las VEs de las muestras de orina se depleccionaron de uromodulina, una glicoproteína presente en abundancia en la orina la cual coprecipita como contaminante y es necesaria su deplección para facilitar la caracterización de las VEs por NTA Nanosight NS300 y citometría de flujo. Para ello, el pellet de VEs se incubó con ditiotreitol (DTT, concentración final de 200 mg/ml), durante 10 min a 37ºC y 1000xrpm. Luego se realizó una centrifugación a 3000xg, durante 15 min a 4ºC. El sobrenadante se descartó y el pellet se volvió a suspender en DPBS para su caracterización. CAPÍTULO 2 145 2.3.5. Caracterización de las VEs aisladas de medio de cultivo condicionado, plasma, suero y orina utilizando la tecnología ExoGAG La caracterización de las VEs aisladas por ExoGAG a partir de muestras sencillas, como medio de cultivo condicionado, o muestras más complejas como plasma, suero y orina se realizó mediante la cuantificación y determinación del tamaño de las VEs por la tecnología NTA Nanosight NS300 y la presencia de marcadores asociados a VEs analizados por citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión (MET). 2.3.5.1. NTA Nanosight NS300 Se utilizaron 40 ml de medio de cultivo condicionado de las líneas celulares MDA-MB-231, IK y SKOV3, 50 μl de plasma y suero y 3 ml de orina de donantes sanos (controles), para aislar las VEs con la tecnología ExoGAG, como se describió anteriormente. Los pellets de VEs resultantes se resuspendieron en 1 ml de DPBS para su caracterización por NTA Nanosight NS300 tal y como se describió anteriormente (apartado 2.3.3.1). 2.3.5.2. Citometría de flujo Para realizar el análisis de citometría de flujo, 40 ml de medio de cultivo condicionado de las líneas celulares MDA-MB-231, IK y SKOV3, 100 μl de plasma y suero y 3 ml de orina de donantes sanos (controles) se utilizaron para aislar las VEs con la tecnología ExoGAG, como se describió anteriormente. Los pellets de VEs resultantes se resuspendieron en 200 μl de DPBS y se incubaron 1 h a 4oC con anticuerpos dirigidos a marcadores asociados a VEs [130]: CD9 (1:50, sc13118, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU), CD81 (1:50, sc7637, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU), CD63 (1:50, sc5275, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU), HSP70 (1:50, sc66048, Santa Cruz Biotechnology, Santa CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 146 Cruz, CA, EE.UU), o flotillin-1 (1:50, sc74566, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU). Se utilizó un anticuerpo de isotipo IgG (inmunoglobulina G) (1:50, 400120, BioLegend) como control negativo. Posteriormente, se añadió un anticuerpo secundario anti-ratón Alexa 488 (1:1000, ab150113, Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante 1 h a 4oC en oscuridad. A continuación, las VEs se lavaron una vez con DPBS mediante centrifugación a 3000xg durante 15 min a 4oC y se analizaron mediante citometría de flujo (BD FACSAriaTM IIu, BD biosciences, San José, CA, EE.UU). 2.3.5.3. Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) Se realizó una prueba de concepto de inmunogold y visualización por MET para verificar la compatibilidad de ExoGAG con otras técnicas de caracterización de VEs. Para ello, se recogieron 40 ml de medio de cultivo condicionado de la línea celular de cáncer de endometrio Hec1A y las VEs se aislaron mediante ultracentrifugación y ExoGAG, tal y como se describió anteriormente. El anticuerpo CD9 anti-ratón (sc13118, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU) se funcionalizó con nanopartículas de oro. Cloruro de oro (III) hidratado (50% base Au), citrato de sodio tribásico dihidratado (99%), O-(3-Carboxipropil)-O’-(2-(3-mercaptopropionilamino)etil)- polietilenglicol (Mw. 5000 Da) (SH-PEG-COOH), clorhidrato de N-(3Dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida (98%) (EDC), Nhidroxisuccinimida (97%) (NHS) e hidrato de ácido fosfotúngstico se adquirieron en Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). Las nanopartículas de oro recubiertas de citrato (AuNPs) se sintetizaron siguiendo una versión ligeramente modificada del método de Turkevich-Frens [271], tal y como describe Lafuente et al. [272]. Posteriormente, las AuNPs fueron funcionalizadas con el anticuerpo anti-CD9 mediante carbodiimida/hidroxisuccinimida [273], utilizando un enlazador heterobifuncional. En detalle, 1 ml de solución acuosa de O-(3-Carboxipropil)-O’-(2-(3-mercaptopropionilamino) etil) CAPÍTULO 2 147 polietilenglicol (2 mg/ml) se añadió gota a gota en un vial que contenía 1 ml de la dispersión acuosa ya preparada de AuNP (2 mg/ml) y se dejó reaccionar durante 12 h en agitación. A continuación, las AuNP funcionalizadas con SH-PEG-COOH se lavaron tres veces en agua Milli-Q y tres veces en solución salina con borato (pH 9) (BBS, borate buffered saline). A continuación, se mezclaron 250 μl de AuNPs-PEGCOOH en BBS (0.2 mg/ml) con 25 μl de una solución de anticuerpo anti-CD9 en BBS (0.2 mg/ml) durante 1 h en agitación. Luego, se añadieron 96 μg de EDC y 115 μg de NHS a la mezcla y se dejaron reaccionar durante 24 h. Las AuNPs-PEG-CD9 obtenidas se lavaron tres veces en una solución de tris-borato-EDTA que reaccionó durante 12 h para bloquear los grupos que no habían reaccionado. Por último, las nanopartículas resultantes se lavaron tres veces en DPBS y se almacenaron a 4oC hasta su uso posterior. Las AuNPs-PEG-CD9 se incubaron con las VEs en DPBS durante 24 h a 37oC. A continuación, las muestras se separaron por centrifugación a 3000xrpm durante 5 min para eliminar agregados que podían interferir con la visualización por MET. Luego se realizó una segunda centrifugación a 13000xrpm para separar las AuNP-PEG-CD9 libres de las VEs acopladas a estas nanopartículas marcadas con anti-CD9. Todas las muestras se contrastaron con una solución acuosa de ácido fosfotúngstico (3 % en peso) y se analizaron mediante imágenes utilizando un MET operado a 200 kV (kilovoltios) (FEI TECNAI T20, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU). 2.3.6. Aislamiento de VEs a partir de muestras de plasma utilizando las tecnologías ExoQuick y ExoSpin Para comparar la tecnología ExoGAG con otras técnicas de aislamiento también basadas en agentes de precipitación, se utilizaron dos tecnologías: ExoQuick y ExoSpin. Para el aislamiento de VEs utilizando el sistema ExoQuick, se incubaron 50 μl de plasma de un CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 148 donantes sano (control) con 13.4 μl de reactivo ExoQuick (System Biosciences, CA, EE.UU) durante 30 min y posteriormente se centrifugaron a 3000xg 10 min 4oC (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Para el aislamiento de las VEs utilizando la tecnología ExoSpin, se incubaron 50 μl de plasma de un donantes sano (control) durante 5 min con 25 μl de reactivo ExoSpin (Cell Guidance Systems, EE.UU) y posteriormente las muestras se centrifugaron a 16000xg, 30 min a 4oC (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Los pellets de VEs resultantes en ambos casos se resuspendieron en DPBS para su posterior análisis. 2.3.7. Determinación de la eficiencia de aislamiento de VEs y análisis de coprecipitación proteica La eficiencia en el aislamiento de VEs se determinó mediante la cuantificación de partículas por campo analizado mediante el sistema NTA Nanosight NS300 cuyo funcionamiento ya se describió previamente (apartado 2.3.3.1). Para el análisis de la coprecipitación proteica la proteína total de las VEs se extrajo utilizando tampón de lisis (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 5 mM de EDTA, 10% de Tritón 100X, 2 mM de Na3OV4, 4 mM de NaF, 1X PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), 1X PIC). Los extractos de proteínas se cuantificaron mediante la técnica de ácido bicinconínico (BCA, bicinchoninic assay), un ensayo colorimétrico basado en el cobre (Cu) para la cuantificación de proteínas totales. El BCA se basa en la formación de un complejo Cu2+-proteína en un entorno básico, seguido de la reducción del Cu2+ a Cu+. La cantidad de Cu2+ que se reduce es proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra [274]. CAPÍTULO 2 149 2.4. Resultados 2.4.1. Optimización de la tecnología ExoGAG para el aislamiento de VEs Para conseguir el mejor rendimiento de la tecnología ExoGAG se optimizó el protocolo de aislamiento de VEs. Así, en primer lugar, se purificaron VEs de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 mediante ultracentrifugación para generar un stock de VEs con el cual poder testar la tecnología ExoGAG. Brevemente, 40 ml de medio de cultivo de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 se recogieron y se procesaron mediante ultracentrifugación como se describió en Materiales y Métodos. El pellet resultante se resupendió en 100 µl de DPBS. Con el fin de establecer un protocolo de aislamiento de VEs eficiente se buscó el ratio muestra-reactivo ExoGAG, el tiempo de incubación y el tiempo y velocidad de centrifugación óptimos para la purificación de VEs. Para establecer el mejor ratio muestra-ExoGAG, se seleccionaron 2 alícuotas del stock de VEs de la línea celular MDA-MB-231 (100 µl/alícuota) que se incubaron 5 min a 4oC con la mitad y el doble de volumen del reactivo ExoGAG, 50 µl y 200 µl, respectivamente. Posteriormente las muestras se centrifugaron a 16000xg 15 min a 4oC (Tabla 3; ratios muestra-ExoGAG). Los pellets de VEs resultantes se resuspendieron en 1 ml de DPBS y se cuantificaron mediante el sistema NTA Nanosight NS300. Los resultados mostraron una concentración de 7.5x108 partículas/ml cuando se incubó la muestra con la mitad de reactivo ExoGAG, mientras que el número de partículas se redujo a 2.6x108 partículas/ml cuando se empleó el doble de reactivo (Figura 14A). Estos resultados indicaron que el ratio óptimo muestra-ExoGAG para purificar VEs de muestras procedentes de la línea celular MDAMB-231 utilizando la tecnología ExoGAG era de 1:0.5, reflejando esta condición un perfil más homogéneo de partículas entorno a 200 nm de tamaño medio. CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 150 Para determinar el tiempo de incubación de la muestra con el reactivo ExoGAG se emplearon 3 alícuotas del stock de VEs de la línea celular MDA-MB-231 (100 µl/alícuota) que se incubaron con 50 µl de ExoGAG a 4oC durante 1, 5 y 15 min, respectivamente. Las muestras se centrifugaron 16000xg 15 min a 4oC (Tabla 3; tiempo de incubación). Los pellets resultantes se resuspendieron en 1 ml de DPBS y se realizó la cuantificación de VEs utilizando la tecnología NTA Nanosight NS300. Las muestras incubadas con ExoGAG durante 1 y 15 min mostraron una concentración de 6.68x108 y 6.84x108 partículas/ml y un tamaño medio de partículas de 235 nm y 251 nm, respectivamente, mientras que con una incubación de 5 min se consiguió una concentración de 8.03x108 partículas/ml y un tamaño medio de partículas de 231 nm (Figura 14B), demostrando ser esta la condición de incubación más eficiente para aislar las VEs de la línea celular MDA-MB-231 utilizando la tecnología ExoGAG. Con el fin de establecer el tiempo y velocidad de centrifugación óptimos para el aislamiento de VEs, se testaron tres condiciones: una centrifugación a 16000xg durante 15 min a 4oC, una centrifugación a 16000xg durante 5 min 4oC y una centrifugación a 3000xg durante 30 min 4oC (Tabla 3; tiempo y velocidad de centrifugación). Los pellets resultantes se resuspendieron en 1 ml de DPBS y se cuantificó el número de partículas de las tres condiciones por el sistema NTA Nanosight NS300. Los resultados mostraron una concentración de 9.46x108, 7.55x108 y 7.59x108 partículas/ml y un tamaño medio de partículas de 225 nm, 211nm y 208 nm, respectivamente (Figura 14C). A pesar de que el número de partículas fue mayor en el caso de la primera condición, se encontró que el pellet se resuspendía con mayor facilidad en el caso de realizar una centrifugación a 3000xg, por lo que se seleccionó esta velocidad, como la óptima para el protocolo de aislamiento de VEs obtenidas de la línea celular MDA-MB-231. CAPÍTULO 2 151 Para confirmar los resultados obtenidos al variar las velocidades y los tiempos de centrifugación, se realizó un ensayo de absorbancia a 525 nm para cuantificar los GAGs presentes en las VEs purificadas con la tecnología ExoGAG. Para ello, se utilizó 1 ml medio de cultivo Figura 14. Perfiles representativos de la concentración (partículas/ml) y tamaño de partículas (nm) obtenidos mediante el sistema NTA Nanosight NS300 tras precipitar las VEs de la línea celular MDA-MB-231 con ExoGAG. (A) Ratio muestra-ExoGAG de 1:0.5 y 1:2. (B) Incubación de la muestra-ExoGAG durante 1 min, 5 min y 15 min. (C) Condiciones de centrifugación de 16000xg 15 min, 16000xg 5 min y 3000xg 30 min. CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 254 Tabla S3: Transcriptos identificados por encima del background en el ARNm-VEs de la muestra de plasma del donante sano (control). TABLAS SUPLEMENTARIAS 255 CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 256 Tabla S4: Transcriptos identificados por encima del background en el ARNm-VEs de la muestra de plasma del paciente con HPB TABLAS SUPLEMENTARIAS 257 CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 258 Tabla S5: Transcriptos identificados por encima del background en el ARNm-VEs de la muestra de orina del paciente con CPm TABLAS SUPLEMENTARIAS 259 CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 260 TABLAS SUPLEMENTARIAS 261 CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 262 BIBLIOGRAFÍA 263 BIBLIOGRAFÍA CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 270 J.; et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J. Extracell. Vesicles 2015, 4, 27066. 44. Costa-Silva, B.; Aiello, N.M.; Ocean, A.J.; Singh, S.; Zhang, H.; Thakur, B.K.; Becker, A.; Hoshino, A.; Mark, M.T.; Molina, H.; et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat. Cell Biol. 2015, 17, 816–826. 45. 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Contribución en este artículo: Yo, Carolina Herrero Filgueira, he contribuído en la revisión bibliográfica y la preparación del manuscrito. • Herrero, C.a; Brea, J.a; Pérez-Díaz, A.; Cuadrado, E.; Ferreño, N.; Moiola, C.P.; Colás, E.; Gil-Moreno, A.; López-López, R.; Loza, M.I.; et al. Modeling ANXA2-overexpressing circulating tumor cells homing and high throughput screening for metastasis impairment in endometrial carcinomas. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2021, 140, 111744. a Coautores con la misma contribución DOI: https://doi.org/10.1016/j.biopha.2021.111744 ISSN: 0753-3322 Índice de impacto: 6.529 Cuartil 1 (Q1) en medicina (miscellaneous) Este es un artículo open access distribuído bajo términos de licencia CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 310 Creative Commons CC-BY-NC-ND 4.0, que permite copiar y distribuír el material en cualquier medio, para fines no comerciales, siempre que se acrediten los autores originales y la fuente. No se permite por tanto un uso comercial de la obra original ni la generación de obras derivadas. Contribución en este artículo: Yo, Carolina Herrero Filgueira, he contribuído en el desarrollo experimental, concretamente en la caracterización de las líneas celulares mediante las técnicas de Western Blot y RT-qPCR, la realización de los ensayos de adhesión y anidamiento in vitro utilizando sistemas 3D y la realización de ensayos in vivo con modelos murinos. Además, he llevado a cabo el análisis de datos y la preparación del manuscrito. • Herrero, C.; de la Fuente, A.; Casas-Arozamena, C.; Sebastian, V.; Prieto, M.; Arruebo, M.; Abalo, A.; Colás, E.; Moreno-Bueno, G.; Gil-Moreno, A.; et al. Extracellular Vesicles-Based Biomarkers Represent a Promising Liquid Biopsy in Endometrial Cancer. Cancers (Basel). 2019, 11, 2000. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers11122000 ISSN: 2072-6694 Índice de impacto: 6,126 Cuartil 1 (Q1) en oncología Este es un artículo open access distribuído bajo términos de licencia Creative Commons CC-BY-licence que permite el uso, la distribución y la reproducción del material de los artículos publicados en cualquier medio, siempre que se acrediten los autores originales y la fuente. Contribución en este artículo: Yo, Carolina Herrero Filgueira, he contribuído en el desarrollo experimental concretamente he llevado a cabo los ensayos de comparación de la tecnología ExoGAG con otras tecnologías mediante la determinación de la eficiencia de aislamiento de vesículas extracelulares, medida por el sistema NTA Nanosight NS300, y la cuantificación de la coprecipitación proteica por el sistema BCA. He llevado a cabo el procesamiento de las muestras de plasma y el aislamiento de las vesículas extracelulares mediante la tecnología ExoGAG. Además, he realizado los ensayos de determinación mediante ELISA de los niveles de L1CAM y ANXA2 tanto a nivel de plasma total como a nivel de las vesículas extracelulares aisladas por ExoGAG a partir de muestras de plasma. He realizado también el estudio de correlación ANEXO 311 de los niveles de ANXA2 con características clínicas de la cohorte de pacientes objeto de estudio. Además, he llevado a cabo el análisis de datos y la preparación del manuscrito. CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 318 CERTIFICADO DE CAPACITACIÓN PARA EL TRABAJO CON ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN: FUNCIÓN C ANEXO 319 CAROLINA HERRERO FILGUEIRA 320 LICENCIA DE USO DE LA PATENTE “MÉTODO PARA LA SEPARACIÓN DE LA FRACCIÓN UNIDA A GLICOSAMINOGLICANOS Y SUS APLICACIONES” WO2017/042416 (A1) ANEXO 321 de su uso a la práctica clínica. comercialización y se analizaron las estrategias para el traslado se establecieron los mecanismos que permitieron su búsqueda de biomarcadores proteicos y genéticos. Finalmente, estudiaron diferentes aplicaciones de esta tecnología para la ExoGAG, una nueva herramienta de aislamiento de VEs y se metástasis. Además, se desarrolló y optimizó la tecnología in vivo y se buscaron estrategias para bloquear el proceso de contexto del carcinoma endometrial en modelos in vitro e estudió el proceso de adhesión y anidamiento de las CTC en el (CTC) y las vesículas extracelulares (VEs). En esta tesis, se nucleicos libres circulantes, las células tumorales circulantes la evolución del tumor mediante el análisis de los ácidos La biopsia líquida permite la monitorización en tiempo real de