Desarrollo y evaluación de sistemas microparticulares de liberación modificada de fármacos para el tratamiento de la artritis reumatoide vía intraarticular

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Iván Lamela Gómez 7HVLVGRFWRUDO 'HVDUUROOR\HYDOXDFLµQGH VLVWHPDVPLFURSDUWLFXODUHVGH OLEHUDFLµQPRGLೳFDGDGH I£UPDFRVSDUDHOWUDWDPLHQWRGH ODDUWULWLVUHXPDWRLGHY¯D LQWUDDUWLFXODU /XJR Programa de doctorado en Investigación y Desarrollo de Medicamentos TESIS DE DOCTORADO DESARROLLO Y EVALUACIÓN DE SISTEMAS MICROPARTICULARES DE LIBERACIÓN MODIFICADA DE FÁRMACOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA ARTRITIS REUMATOIDE VÍA INTRAARTICULAR Iván Lamela Gómez ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE MEDICAMENTOS LUGO AÑO 2022 DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS Diseño y evaluación de sistemas microparticulares de liberación modificada de fármacos para el tratamiento de la artritis reumatoide vía intraarticular D. Iván Lamela Gómez Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico. En Lugo, 12 de mayo de 2022 Fdo. Iván Lamela Gómez AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR/TUTOR DE LA TESIS Diseño y evaluación de sistemas microparticulares de liberación modificada de fármacos para el tratamiento de la artritis reumatoide vía intraarticular Dña. Asteria María Luzardo Álvarez En condición de: Directora y tutora INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D. Iván Lamela Gómez, bajo mi dirección/tutorización, y autorizo su presentación, considerando que reúne los requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación del doctorando fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Lugo, 12 de mayo de 2022 Fdo: Asteria María Luzardo Álvarez AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR/TUTOR DE LA TESIS Diseño y evaluación de sistemas microparticulares de liberación modificada de fármacos para el tratamiento de la artritis reumatoide vía intraarticular Dña. José Blanco Méndez En condición de: Director INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D. Iván Lamela Gómez, bajo mi dirección, y autorizo su presentación, considerando que reúne los requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación del doctorando fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Lugo, 12 de mayo de 2022 Fdo: José Blanco Méndez IVÁN LAMELA GÓMEZ XIV 5.3.14. Producción de interleucina 6 (Il-6) ............................................................... 147 5.4. Conclusiones ............................................................................................................ 149 5.5. Bibliografía ............................................................................................................... 152 6. Microcápsulas de PLGA/PEOT-PBT para la liberación intraarticular de indometacina 163 6.1. Introducción.............................................................................................................. 165 6.2. Materiales y Métodos ............................................................................................... 166 6.2.1. Preparación de las micropartículas .................................................................. 167 6.2.2. Diseño experimental ........................................................................................ 167 6.2.3. Rendimiento y eficacia de encapsulación ........................................................ 168 6.2.4. Análisis del tamaño de partícula ...................................................................... 169 6.2.5. Perfil de liberación in vitro .............................................................................. 169 6.2.6. Determinación del potencial ζ .......................................................................... 169 6.2.7. Difracción de rayos x ....................................................................................... 170 6.2.8. Calorimetría diferencial de barrido .................................................................. 170 6.2.9. Espectroscopía infrarroja ................................................................................. 170 6.2.10. Microscopía electrónica de barrido .............................................................. 171 6.2.11. Microscopía Raman confocal ....................................................................... 171 6.2.12. Evaluación del efecto de las formulaciones microparticulares en cultivos celulares in vitro ............................................................................................................. 171 6.2.12.1. Cultivo celular in vitro de monocitos THP-1 ............................................ 172 6.2.12.2. Diferenciación de monocitos THP-1 a macrófagos ................................... 172 6.2.12.3. Ensayo de proliferación celular XTT ........................................................ 172 6.2.12.4. Ensayo de fagocitosis ................................................................................ 172 6.2.13. Enzimainmunoensayos (ELISAs) ................................................................ 173 6.3. Resultados y discusión ............................................................................................. 174 6.3.1. Diseño experimental ........................................................................................ 174 6.3.2. Rendimiento y eficacia de encapsulación ........................................................ 175 6.3.3. Tamaño de partícula ......................................................................................... 175 6.3.4. Perfil de liberación in vitro de indometacina ................................................... 177 6.3.5. Potencial ζ ........................................................................................................ 178 6.3.6. Difracción de rayos X ...................................................................................... 178 6.3.7. Calorimetría diferencial de barrido .................................................................. 179 6.3.8. Espectroscopía infrarroja (FTIR) ..................................................................... 180 6.3.9. Morfología de las micropartículas ................................................................... 182 6.3.10. Microscopía Raman confocal ....................................................................... 185 6.3.11. Biocompatibilidad ........................................................................................ 187 Índice XV 6.3.12. Actividad fagocítica ...................................................................................... 188 6.3.13. Producción de mediadores proinflamatorios (TNF-α e Il-6) ........................ 190 6.4. Conclusiones ............................................................................................................ 193 6.5. Bibliografía. ............................................................................................................. 196 7. Microencapsulación de infliximab como estrategia innovadora para la administración intraarticular de DMARDs biológicos en el tratamiento de la artritis reumatoide ................. 203 7.1. Introducción ............................................................................................................. 205 7.2. Materiales y métodos ............................................................................................... 207 7.2.1. Preparación de las microcápsulas ..................................................................... 207 7.2.1.1. Atomización por ultrasonidos ................................................................... 207 7.2.1.2. Doble emulsión/ Evaporación del disolvente ............................................ 208 7.2.2. Eficacia de encapsulación ................................................................................. 208 7.2.3. Análisis del tamaño de partícula ....................................................................... 210 7.2.4. Microscopía electrónica de barrido .................................................................. 210 7.2.5. Determinación del potencial ζ .......................................................................... 211 7.2.6. Ensayo de adsorción de rosa de bengala .......................................................... 211 7.2.7. Calorimetría diferencial de barrido................................................................... 213 7.2.8. Espectroscopía de infrarrojo ............................................................................. 213 7.2.9. Liberación in vitro de infliximab ...................................................................... 213 7.2.10. Electroforesis SDS-PAGE ............................................................................ 214 7.2.11. Ensayo de bioactividad de TNF-α en la línea celular WEHI-13VAR .......... 216 7.2.11.1. Fundamento del ensayo de bioactividad de TNF-α .................................. 216 7.2.11.2. Mantenimiento de la línea WEHI-13VAR en cultivo in vitro. ................. 216 7.2.11.3. Ensayo de bioactividad en el sobrenadante de macrófagos THP-1 .......... 217 7.2.12. Evaluación en cultivos celulares in vitro de macrófagos humanos THP-1 .. 218 7.2.12.1. Mantenimiento y diferenciación de la línea celular THP-1 ...................... 218 7.2.12.2. Ensayo de proliferación celular WST-1 .................................................... 218 7.2.12.3. Ensayo de proliferación celular XTT ........................................................ 219 7.2.12.4. Ensayo de citotoxicidad basado en Resazurina ......................................... 220 7.2.12.5. Actividad fagocítica .................................................................................. 220 7.2.13. Enzimainmunoensayos ................................................................................. 221 7.3. Resultados y discusión ............................................................................................. 222 7.3.1. Microencapsulación de infliximab ................................................................... 222 7.3.2. Distribución de tamaño de partícula ................................................................. 224 7.3.3. Morfología de las micropartículas .................................................................... 226 7.3.4. Carga superficial ............................................................................................... 231 IVÁN LAMELA GÓMEZ XVI 7.3.5. Hidrofobicidad superficial ............................................................................... 233 7.3.6. Calorimetría diferencial de barrido .................................................................. 236 7.3.7. Caracterización FTIR ....................................................................................... 239 7.3.8. Perfil de liberación in vitro de infliximab ........................................................ 240 7.3.9. Estabilidad estructural de infliximab ............................................................... 242 7.3.10. Actividad biológica de INF microencapsulado ............................................ 244 7.3.11. Biocompatibilidad de las formulaciones ...................................................... 246 7.3.12. Actividad fagocítica ..................................................................................... 249 7.3.13. Respuesta celular de macrófagos THP-1 ...................................................... 253 7.4. Conclusiones ............................................................................................................ 256 7.5. Bibliografía ............................................................................................................... 259 8. Conclusiones ................................................................................................................... 271 8.1. Conclusiones ............................................................................................................ 273 8.2. Conclusions .............................................................................................................. 277 Anexo I: Lista de publicaciones .............................................................................................. 281 Anexo II. Declaraciones. ......................................................................................................... 283 Índice de figuras XVII ÍNDICE DE FIGURAS Figura 2-1. Sección sagital de una rodilla (lateral a la línea media de la rodilla). ................... 20 Figura 2-2. Microfotografías en las que se observan los macrófagos de la íntima sinovial mediante inmunohistoquímica. ................................................................................................. 22 Figura 2-3. Representación esquemática del mecanismo fisiopatológico de la artritis reumatoide. ............................................................................................................................... 25 Figura 2-4. Recomendaciones del American College of Rheumatology para el tratamiento de la artritis reumatoide. .................................................................................................................... 29 Figura 2-5. Estructura química y diagrama de obtención del polímero poli-ε-caprolactona a partir del monómero ε-caprolactona. ........................................................................................ 37 Figura 2-6. Estructura química del PLGA. ............................................................................... 38 Figura 2-7. Estructura química característica de los copolímeros bloque PEOT-PBT. ........... 39 Figura 4-1. Estructura de (a) trans-RSV (3,5,4'-trihidroxiestilbeno) y (b) cis-RSV. ............... 71 Figura 4-2. Microfotografías de microcápsulas cargadas con RSV obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido ........................................................................................... 81 Figura 4-3. Micrografías representativas (SEM) de secciones transversales de microcápsulas preparadas con diferentes concentraciones de PCL ................................................................. 82 Figura 4-4. Termogramas de trans-resveratrol puro, microcápsulas blancas y microcápsulas cargadas con resveratrol. .......................................................................................................... 83 Figura 4-5. Espectro UV-visible de disoluciones de RSV en (a) etanol y (b) PBS (50 mM; pH 7,4) durante su isomerización y degradación expuesto a radiación UV. .................................. 84 Figura 4-6. Porcentaje de RSV degradado tras la irradiación (254 nm) de las muestras de transRSV, libre y microencapsulado, durante 3,2 h. ........................................................................ 84 Figura 4-7. Degradación de trans-RSV, protegido de la luz, en disolución acuosa a (a) pH 7,4; (b) pH 6,4 y (c) pH 5,0. ............................................................................................................ 85 Figura 4-8. Perfil de liberación de RSV a pH 5, 37 ºC y en condiciones de oscuridad. .......... 88 Figura 4-9. Porcentaje de viabilidad de los macrófagos tras 24 h de incubación con varias concentraciones de RSV libre, microcápsulas blancas y microcápsulas cargadas con RSV. (a) Ensayo WST-1 y (b) Ensayo de captación de Rojo Neutro. .................................................... 89 Figura 4-10. Producción de NO en macrófagos RAW 264.7 preestimulados con LPS 0,5 mg/ml tras 24 horas de incubación con RSV libre y microencapsulado. El nivel de producción de NO se expresó en base a la concentración de nitritos (µM) en el sobrenadante del cultivo. .......... 90 Figura 4-11. Efecto del RSV libre y microencapsulado sobre la producción de ROS en macrófagos activados con zymosan A...................................................................................... 92 Figura 4-12. Microcápsulas blancas (a) y cargadas con RSV (b) fagocitadas por los macrófagos. .................................................................................................................................................. 93 Figura 4-13. Efecto del RSV libre y microencapsulado sobre el nivel de peroxidación lipídica (TBARS) inducida por H2O2 y t-BHT en macrófagos RAW 264.7 ......................................... 94 IVÁN LAMELA GÓMEZ XVIII Figura 5-1. Dipropionato de betametasona ............................................................................ 104 Figura 5-2. Cromatograma representativo de BDP (analito; tR = 9,580) y BV (patrón interno; tR =8,019 min). ........................................................................................................................... 107 Figura 5-3. Rendimiento del proceso y eficacia de encapsulación de las formulaciones de MCs preparadas mediante las dos técnicas: atomización por ultrasonidos y emulsión-evaporación. ................................................................................................................................................ 120 Figura 5-4. Microfotografías de microscopía óptica (200x) de suspensiones de MCs de BDP: F1 (a), F2 (b), F3 (c), F4 (d). Las flechas señalan los agregados de MCs. ............................ 122 Figura 5-5. Microfotografías representativas de las formulaciones de MCs cargadas con BDP. ................................................................................................................................................ 124 Figura 5-6. Microfotografías representativas de la morfología interna de las MCs cargadas con BDP preparadas mediante UA. .............................................................................................. 125 Figura 5-7. Termogramas de dipropionato de betametasona (a), Resomer® RG503 (b), MCs blancas F1 (c), MPs F1 (d), MPs blancas F3(e), MPs F3(f). ................................................. 126 Figura 5-8. Termogramas de dipropionato de betametasona (a), Polyactive® 1000PEOT70PBT30 (b), MCs blancas F2 (c), MPs F2 (d), MPs blancas F4 (e), MPs F4 (f). ................................................................................................................................................ 127 Figura 5-10. Espectros FTIR de Polyactive® 1000PEOT70PBT30 (a), Dipropionato de betametasona (b), MCs F2 blancas (c), MCs F2 con BDP (d), MCs F4 blancas (e) y MCs F4 con BDP (f). ........................................................................................................................... 129 Figura 5-11. Potencial ζ de las MCs blancas y cargadas con BDP, medido en KCl 1 mM. .. 131 Figura 5-12. Potencial ζ de las MCs en distintas condiciones de pH: Formulaciones compuestas por PLGA RG503 (a); Formulaciones compuestas por PEOT-PBT (b) ................................ 132 Figura 5-13. Perfil de liberación in vitro de BDP a pH 7,4 y 37ºC, en PBS 100 mM suplementado con un 0,5 % de SDS. ..................................................................................... 135 Figura 5-14. Ensayo con Yoduro de Propidio. Porcentaje de viabilidad de macrófagos THP-1 tras un periodo de 24 horas de incubación con BDP libre, BDP microencapsulada y MCs blancas. ................................................................................................................................... 136 Figura 5-15. Ensayo WST-1. Porcentaje de viabilidad de macrófagos THP-1 tras un periodo de 24 horas de incubación con BDP libre, BDP microencapsulada y MCs blancas. ................. 138 Figura 5-16. Microgramos de MCs fagocitadas por los macrófagos tras su incubación durante 2,5 horas con varias concentraciones de MCs fluorescentes. ................................................ 140 Figura 5-17. Microfotografías de microscopía UV mostrando las MPs fluorescentes fagocitadas por los macrófagos. ................................................................................................................ 139 Figura 5-18. Efecto del BDP libre y microencapsulado sobre la producción de ROS en macrófagos THP-1 activados con zymosan A. ...................................................................... 143 Figura 5-19. Producción de TNF-α por los macrófagos THP-1 estimulados con LPS (2 µg/ml) tras su exposición a BDP libre, BDP microencapsulada y MCs Blancas. ............................. 146 Figura 5-20. Producción de Il-6 por los macrófagos THP-1 estimulados con LPS (2 µg/ml) tras su exposición a BDP libre, BDP microencapsulada y MCs Blancas. .................................... 148 Índice de figuras XIX Figura 6-1. Estructura química de la IND. ............................................................................. 165 Figura 6-2. Diagramas de Pareto estandarizados y gráficas de superficie de respuesta para eficacia de encapsulación (2a y 2b), tamaño de partícula (2c y 2d) y liberación inicial de IND durante la primera hora (2e y 2f). ........................................................................................... 176 Figura 6-3. Perfil de liberación in vitro de indometacina a pH 7,4 y 37ºC. ........................... 177 Figura 6-4. Difractogramas de rayos X de indometacina pura (a), Polyactive® 1000PEOT70PBT30 (b), Resomer® RG502 (c), MPs blancas [F1 (d), F4 (e), F9 (f)] y MPs cargadas con IND [F1 (g), F4 (h) y F9 (i)]. ............................................................................ 179 Figura 6-5. Termogramas de γ indometacina (a), Resomer® RG 502 (b), Polyactive® 1000PEOT70PBT30 (c), MPs blancas F9 (d), MPs F9 (e), MPs blancas F4(f), MPs F4 (g), MPs blancas F1 (h) y MPs F1 (i). ................................................................................................... 180 Figura 6-6. Espectros FTIR de Resomer® RG502 (a), Polyactive® 1000PEOT70PBT30 (b), Indometacina (c), MPs blancas (d, f, h) y MPs cargadas con IND (e, g, i, j, k). .................... 181 Figura 6-7. Micrografías (SEM) características de las formulaciones de MPs cargadas con IND. ................................................................................................................................................ 183 Figura 6-8. Corte transversal de la matriz epoxi. ................................................................... 184 Figura 6-9. Imágenes (SEM) representativas de la sección transversal de las microcápsulas cargadas con IND. .................................................................................................................. 184 Figura 6-10. Imagen de microscopía óptica confocal de una MP de F1 (a1) e Imágenes de microscopía Raman confocal codificadas por colores de MPs blancas F1 (a2), F1 (b2-4), F4 (c), F5 (d), F7 (e) y F9 (f). ............................................................................................................ 186 Figura 6-11. Porcentaje de viabilidad de macrófagos THP-1 determinado mediante la prueba XTT tras la incubación de las células durante 24 h con IND libre, MPs blancas y MPs cargadas con IND. ................................................................................................................................. 187 Figura 6-12. Microgramos de MPs fagocitadas por los macrófagos THP-1 tras 1 o 2,5 horas de incubación (a). Micrografías de microscopía UV mostrando las MPs fluorescentes fagocitadas por los macrófagos.. ............................................................................................................... 189 Figura 6-13. Producción de TNF-α (A) e Il-6 (B) por los macrófagos THP-1 estimulados con LPS tras su exposición a IND libre, IND microencapsulada y MCs Blancas. ....................... 191 Figura 7-1. Estructura esquemática de infliximab. ................................................................. 205 Figura 7-2. Bloqueo de TNF-α soluble y de membrana por INF. .......................................... 206 Figura 7-3. Distribución de tamaño de las MCs preparadas por emulsión-evaporación antes (a) y después (b) del proceso de purificación. ............................................................................. 226 Figura 7-4. Morfología superficial de las MCs blancas (B) y cargadas (INF) preparadas por UA (F1, F2, F3). ............................................................................................................................ 228 Figura 7-5. Sección transversal de las MCs preparadas por UA: F1 (a), F2 (b), F3 (c). ........ 229 Figura 7-6.Caracterización morfológica de las formulaciones preparadas mediante emulsiónevaporación (F4, F5, F6). ....................................................................................................... 230 Figura 7-7. Potencial ζ de las MCs blancas y cargadas con INF, medido en: a) KCl 1 mM b) KCl (1mM); PBS (10 mM); pH = 7,4. ................................................................................... 233 IVÁN LAMELA GÓMEZ XX Figura 7-8. Isotermas de adsorción de RB a las MCs (F1, F2, F3). Se representan los resultados experimentales y las isotermas ajustadas a los modelos de Langmuir (a) y Freundlich (b). . 235 Figura 7-9. Termograma de INF en disolución acuosa (PBS 10 mM, pH 7,2) ..................... 236 Figura 7-10. Termogramas de Polyactive® 1000PEOT70PBT30 (a), Resomer® RG502 (b), Resomer® RG503 (c), Blanco F4 (d), F4 (e), Blanco F5 (f), F5 (g), Blanco F6 (h), F6 (i). .. 237 Figura 7-11. Termogramas de las formulaciones de MCs preparadas por UA: Blanco F1 (a), F1 (b), Blanco F2 (c), F2 (d), Blanco F3 (e), F3 (f). ................................................................... 238 Figura 7-12. Espectros FTIR de Infliximab puro (a), Polyactive® 1000PEOT70PBT30 (b), Resomer® RG502 (c), Resomer® RG503 (d), MCs blancas (e, g, i) y MCs cargadas con infliximab (f, h, j). .................................................................................................................. 240 Figura 7-13. Perfil de liberación in vitro de infliximab a partir de las MCs, a 37ºC en PBS (10 mM, pH 7,4). .......................................................................................................................... 241 Figura 7-14. Electroforesis SDS-PAGE de INF puro, INF atomizado e INF extraído de las microcápsulas en condiciones reductoras (A, B) y no reductoras (C, D). ............................. 243 Figura 7-15. Neutralización de la producción de TNF-α por los macrófagos THP-1 en respuesta al tratamiento con distintas concentraciones de INF en disolución. ...................................... 245 Figura 7-16. Porcentaje de mortalidad celular observado en la línea WEHI-13VAR en respuesta al tratamiento con diluciones seriadas del sobrenadante de los cultivos de macrófagos THP-1 en ausencia de tratamiento (control LPS) o tras el tratamiento con MCs blancas y cargadas con INF. ........................................................................................................................................ 246 Figura 7-17. Ensayo WST-1. Porcentaje de viabilidad de macrófagos THP-1 tras un periodo de 24 horas de incubación con las MCs. ..................................................................................... 247 Figura 7-18. Ensayo XTT. Porcentaje de viabilidad de macrófagos THP-1 tras un periodo de 24 horas de incubación con las MCs. ..................................................................................... 247 Figura 7-19. Ensayo de viabilidad basado en la metabolización de Resazurina. Porcentaje de viabilidad de macrófagos THP-1 tras un periodo de 24 horas de incubación con las MCs. .. 248 Figura 7-20. Microgramos de MCs fagocitadas por los macrófagos THP-1 tras la incubación durante 2,5 horas con varias concentraciones de MCs fluorescentes. ................................... 250 Figura 7-21. Microfotografías de microscopía UV mostrando las MCs fluorescentes preparadas mediante UA fagocitadas por los macrófagos THP-1 ........................................................... 251 Figura 7-22. Microfotografías de microscopía UV mostrando las MCs fluorescentes preparadas mediante emulsión-evaporación fagocitadas por los macrófagos THP-1. ............................. 252 Figura 7-23. Producción de TNF-a e Il-6 por los macrófagos THP-1 estimulados con LPS en respuesta al tratamiento con INF libre y microencapsulado. ................................................. 254 Índice de tablas XXI ÍNDICE DE TABLAS Tabla 4-1. Parámetros de preparación (El caudal de ambos canales fue de 3 ml/min), rendimiento del proceso (%) y eficacia de encapsulación (E.E.) para todas las formulaciones incluidas en el diseño experimental. ......................................................................................... 74 Tabla 5-1. Composición y técnica de preparación de las formulaciones de BDP. ................. 105 Tabla 5-2 Distribución de tamaño de partícula de las formulaciones de MCs cargadas con BDP. ................................................................................................................................................ 120 Tabla 5-3. Coeficientes de regresión lineal para la relación PQRB = a + k*m. La pendiente (k) es directamente proporcional a la hidrofobicidad de la superficie de las MCs. ..................... 133 Tabla 5-4. Concentración teórica de BDP que se alcanzaría en el cultivo tras la liberación completa del fármaco microencapsulado. .............................................................................. 145 Tabla 6-1. Parámetros de preparación para todas las formulaciones incluidas en el diseño experimental. .......................................................................................................................... 168 Tabla 6-2. Coeficientes de regresión del modelo cuadrático ajustado. .................................. 175 Tabla 6-3. Rendimiento del proceso, eficacia de encapsulación y potencial ζ de las formulaciones. ........................................................................................................................ 175 Tabla 6-4. Parámetros característicos de la distribución de tamaño de partícula ................... 177 Tabla 6-5. Concentración teórica de IND que se alcanzaría tras la liberación completa de la IND microencapsulada para las concentraciones de MPs ensayadas (200 y 50 µg MCs/ml). ....... 192 Tabla 7-1. Composición polimérica de las microcápsulas y técnica de microencapsulación. La contribución de cada polímero a la mezcla se expresa en porcentaje en peso. ...................... 207 Tabla 7-2. Eficacia de encapsulación y rendimiento del proceso de microencapsulación de infliximab. .............................................................................................................................. 223 Tabla 7-3. Parámetros característicos de distribución de tamaño de partícula de las formulaciones. ........................................................................................................................ 225 Tabla 7-4. Parámetros de las isotermas de adsorción de RB ajustadas a los modelos de Langmuir y Freundlich. ........................................................................................................................... 234 Tabla 7-5. Concentración teórica de INF que se alcanzaría tras la liberación completa del INF microencapsulado para las concentraciones de MCs ensayadas (200 y 50 µg MCs/ml) ....... 255 Lista de abreviaturas XXIII LISTA DE ABREVIATURAS ABTS Ácido 2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) ACN Acetonitrilo ACPA Anticuerpo antipéptidos citrulinados AINE Antiinflamatorio no esteroideo APS Persulfato amónico (Amonium Persulfate) AR Artritis reumatoide BDP Dipropionato de betametasona BSA Seroalbúmina bovina. BV Valerato de betametasona COX Ciclooxigenasa. DCF 2’,7’-diclorofluoresceína DCFH-DA 3’,6’-diacetato de 2’,7’-diclorofluoresceína DCM Cloruro de metileno (CH2Cl2) DMARD Fármaco modificador de la enfermedad (Disease-Modifying Antirheumatic Drugs) DMEM Medio Eagle (Modificación de Dulbecco); (Dulbecco’s Modified Eagle Medium). DMSO Dimetilsulfóxido. DSC Calorimetría diferencial de barrido (Differential Scanning Calorimetry) E.E. Eficacia de encapsulación ELISA Enzimainmunoensayo (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ELS Dispersión electroforética de luz (Electrophoretic Light Scattering) Em/Ev Doble emulsión-evaporación del disolvente FBS Suero fetal bovino (Foetal Bovine Serum) FTIR Espectroscopía en el infrarrojo de transformada de Fourier (Fourier Transformed Infrared Spectroscopy) HBSS Solución salina balanceada de Hank (Hank´s Balanced Salt Solution) HEPES (Ácido 4-(2-hidroxietil)-piperazin-1-iletanosulfónico) HLA Haplotipo de antígeno leucocitario humano HPLC Cromatografía líquida de alta presión (High Pressure Liquid Chromatography) Il-1 Interleucina 1 Il-6 Interleucina 6 IND Indometacina INF Infliximab iNO Óxido nítrico sintasa LOD Límite de detección LOQ Límite de cuantificación IVÁN LAMELA GÓMEZ 6 polímeros, la técnica de microencapsulación y los parámetros de formulación seleccionados, se pueden obtener micropartículas cargadas con diferentes fármacos y con diferentes propiedades. Además, se ha demostrado in vivo en un modelo animal de AR que las micropartículas de más de 10 µm consiguen una retención eficaz en la cavidad articular. Por tanto, la microencapsulación es una técnica idónea para la obtención de formulaciones con las propiedades adecuadas tanto para mejorar la eficacia de los fármacos habitualmente administrados por vía intraarticular (glucocorticoides), como para permitir la administración de otras moléculas con potencial en el tratamiento intraarticular de la AR, como los antioxidantes, los AINEs y, especialmente, los anticuerpos monoclonales terapéuticos anti-TNF-α. El objetivo principal de esta tesis doctoral fue el desarrollo y caracterización de sistemas microparticulares biodegradables con propiedades adecuadas para la liberación intraarticular de fármacos de distinta naturaleza, con potencial aplicación en el tratamiento local de la artritis reumatoide. El trabajo de investigación se dividió en cuatro partes principales, cada una de las cuales constituye un capítulo de la presente tesis doctoral, cuyo objetivo fue la microencapsulación de antioxidantes (resveratrol), glucocorticoides (dipropionato de betametasona), antiiflamatorios no esteroideos (indometacina) y DMARDs biológicos antiTNF-α (infliximab). El primer capítulo comprende la microencapsulación de trans-resveratrol en microcápsulas biodegradables de poli(-ε-caprolactona) mediante la técnica de atomización por ultrasonidos. Con el fin de evaluar la influencia de la concentración de polímero y la potencia suministrada a la boquilla sobre las propiedades finales de las microcápsulas, las formulaciones se prepararon de acuerdo con un diseño experimental central compuesto. Todas las formulaciones incluidas en el diseño se prepararon con éxito obteniendo un elevado rendimiento del proceso (80,2 – 92,1 %) y eficacia de encapsulación (39,7 – 96,0 %). La caracterización morfológica de las formulaciones reveló que todas las formulaciones están compuestas por partículas esféricas, de superficie lisa no porosa, que se caracterizaron por una distribución de tamaño polidispersa con un tamaño medio de 13,8 ± 0,3 µm para la formulación óptima. Además, se comprobó mediante SEM que las micropartículas obtenidas fueron de tipo microcápsulas. El análisis de las formulaciones mediante DSC sugirió que el resveratrol se encuentra disperso en la matriz polimérica en forma amorfa. El trans-resveratrol se caracteriza por su extrema fotosensibilidad, por lo que en una segunda etapa del trabajo se evaluó la fotoestabilidad de RSV libre y microencapsulado en estado sólido, confirmando que la microencapsulación confirió protección al RSV frente a la radiación UV. Además, se investigó la estabilidad de RSV en disolución acuosa y etanólica frente a radiación UV, así como su estabilidad en disolución acuosa en oscuridad y a distintos valores de pH. La degradación de trans-RSV en disolución y expuesto a luz UV fue más rápida en solución acuosa. Respecto a su degradación en oscuridad, los resultados obtenidos mostraron su degradación a valores de pH superiores a pH 5, lo que es especialmente relevante de cara a la realización de experimentos en condiciones fisiológicas. Por tanto, el perfil de liberación in vitro se obtuvo a pH 5, mostrando una liberación caracterizada por un elevado burst inicial seguido por una liberación sostenida de RSV. La capacidad antioxidante de RSV se investigó mediante el ensayo de ABTS, demostrando que el RSV preservó su capacidad antioxidante una vez microencapsulado y extraído de las MCs. 1. Resumen 7 En una última etapa, las formulaciones de RSV se evaluaron en cultivos celulares in vitro de macrófagos de ratón RAW 264.7. Las microcápsulas presentaron una elevada biocompatibilidad y fueron internalizadas extensivamente por los macrófagos, dando lugar a un porcentaje de fagocitosis significativamente mayor al observado para las formulaciones blancas. Además, se investigó el efecto del RSV libre y microencapsulado sobre la producción de ROS y NO por los macrófagos, lo que demostró que las microcápsulas de RSV preservaron la capacidad de RSV para reducir el estrés oxidativo, un factor patogénico en la AR. Por último, las microcápsulas de RSV presentaron una acción inhibidora de la peroxidación lipídica de la membrana plasmática de los macrófagos, siendo el efecto observado para las microcápsulas de RSV mayor que para el RSV libre. En resumen, el RSV se microencapsuló con éxito preservando su capacidad antioxidante y obteniendo microcápsulas biodegradables con propiedades adecuadas para su potencial administración intraarticular. Además, las formulaciones demostraron su capacidad para reducir el nivel de estrés oxidativo y proteger a las células frente a la peroxidación lipídica, lo que refuerza su potencial como tratamiento complementario de la AR por vía intraarticular. En el segundo capítulo se aborda la microencapsulación de dipropionato de betametasona utilizando tanto un copolímero bloque PEOT-PBT (Polyactive® 1000PEOT70PBT30) como PLGA (Resomer® RG503). Las formulaciones se prepararon mediante dos aproximaciones tecnológicas: un método de doble-emulsión/evaporación y atomización coaxial por ultrasonidos. Los copolímeros PEOT-PBT, de carácter anfifílico, han mostrado excelentes propiedades para la microencapsulación de moléculas hidrofílicas, pero no habían sido explorados en la microencapsulación de moléculas hidrofóbicas. Se desarrollaron con éxito cuatro formulaciones de microcápsulas con elevado rendimiento (72,7 – 88,7 %) y eficacia de encapsulación (48,3 – 84,5 %). La técnica de microencapsulación mostró una gran influencia sobre el tamaño de partícula y la eficacia de encapsulación, presentaron menor tamaño y mayor E.E. las MCs preparadas mediante emulsión-evaporación en comparación con las preparadas por UA. En una segunda etapa, las cuatro formulaciones obtenidas se caracterizaron exhaustivamente a nivel galénico. Todas las formulaciones se compusieron de micropartículas esféricas, no porosas, con carga superficial negativa. Además, se comprobó que las partículas preparadas por atomización presentaron una estructura de microcápsula mononucleada. El análisis calorimétrico revelo que el BDP se microencapsuló en forma amorfa, y que las propiedades de los polímeros no se modificaron durante el proceso de microencapsulación. La investigación de la hidrofobicidad superficial de las MCs mostró que las compuestas por PEOT-PBT presentaron una superficie más hidrofóbica que las compuestas por PLGA RG503, lo que pudo estar relacionado con una orientación de los segmentos PBT hacia la parte externa de las microcápsulas, puesto que el segmento mayoritario (PEOT) es de carácter hidrofílico. Los perfiles de liberación in vitro de BDP se investigaron en PBS suplementado con SDS (0,5%) a pH 7,4 y 37ºC, observándose una liberación sostenida de BDP durante más de 15 días para la formulación con menor velocidad de liberación. La velocidad de liberación dependió tanto de la técnica de microencapsulación como de la composición de polímero. En una tercera etapa, las formulaciones se evaluaron en cultivos in vitro de macrófagos humanos THP-1, demostrando su biocompatibilidad mediante dos métodos diferentes. La investigación de la actividad fagocítica demostró que todas las formulaciones fueron IVÁN LAMELA GÓMEZ 8 internalizadas extensivamente de forma dependiente de la dosis. Se investigo el efecto de BDP libre y microencapsulado sobre la producción in vitro de ROS por los macrófagos estimulados con zymosan A, demostrando la capacidad de las MCs de BDP para reducir el estrés oxidativo in vitro y de forma aguda. Por último, se investigó el efecto de las MCs de BDP sobre la producción de TNF-α e Il-6, dos de los principales mediadores inflamatorios en AR, por los macrófagos estimulados con LPS. Los resultados obtenidos confirmaron el efecto antiinflamatorio in vitro de las microcápsulas de BDP, las cuales provocaron un descenso estadísticamente significativo de ambas citoquinas. Las formulaciones microparticulares presentan características adecuadas para el tratamiento local de la AR. Estas formulaciones nos permitirían obtener una liberación sostenida de BDP y lograr una retención efectiva del fármaco en la articulación, mejorando potencialmente la eficacia terapéutica y perfil de seguridad de las suspensiones de BDP libre utilizadas habitualmente en la práctica clínica. Además, la reducción observada en la producción de ROS, TNF-α e Il-6 refuerza el potencial terapéutico de las formulaciones. En resumen, las formulaciones desarrolladas demostraron su efecto antiinflamatorio in vitro. Además, presentaron características adecuadas para logar una retención efectiva en la cavidad articular. Esto, en combinación con una liberación de BDP sostenida en el tiempo, presenta un potencial prometedor para su aplicación en el tratamiento local de la AR. El tercer capítulo se centra en el desarrollo de microesferas de indometacina utilizando mezclas de PEOT-PBT (Polyactive® 1000PEOT70PBT30) y PLGA (Resomer® RG502) en diferente proporción. La microencapsulación se llevó a cabo mediante atomización coaxial por ultrasonidos, fijando las ratios PEOT-PBT: PLGA y Caudal Exterior: Caudal Interior de acuerdo con un diseño experimental central compuesto. Las 9 formulaciones incluidas en el diseño se prepararon satisfactoriamente, y la influencia de los parámetros de formulación sobre la eficacia de encapsulación, tamaño de partícula y liberación inicial de IND se investigó mediante tecnología de superficie de respuesta. Todas las formulaciones presentaron un elevado rendimiento (78,2 -88,5 %) y eficacia de encapsulación (66,2 -81,3 %). En líneas generales, el tamaño de partícula se incrementó de forma proporcional al porcentaje de PEOT-PBT en la mezcla, obteniéndose un amplio rango de tamaño dependiendo de los parámetros de formulación (22,8 – 82,6 µm). La E.E y la cantidad de IND liberada en la primera hora mostraron a un excelente ajuste de los datos experimentales a un modelo polinómico cuadrático, observándose una relación compleja entre los resultados obtenidos y los parámetros de formulación. En una segunda etapa, las formulaciones se caracterizaron exhaustivamente. Todas las formulaciones presentaron carga superficial negativa, con independencia de la composición de polímero. El análisis calorimétrico y por difracción de rayos X mostró que la IND se encuentra dispersa en la matriz polimérica en forma amorfa, así como la naturaleza semicristalina de la matriz polimérica. Sin embargo, ambos componentes presentes en el blend presentan una baja miscibilidad. Se investigó la morfología interna y superficial de todas las formulaciones desarrolladas y, adicionalmente, la distribución espacial del fármaco y los polímeros en las MPs se estudió mediante microscopía Raman confocal. De forma resumida, todas las formulaciones presentaron forma esférica y superficie porosa, observándose una morfología inusual compuesta por una matriz polimérica de tipo espongiforme, con presencia de partículas de 1. Resumen 9 menor tamaño dentro de los poros. El grado de porosidad y su localización varió en función de los parámetros de formulación. El esqueleto poroso presentó un mayor contenido en PEOTPBT, mientras que las partículas de menor tamaño observadas en su interior estaban compuestas por PLGA. La IND se localizó preferentemente en las regiones ricas en PEOT-PBT o en la interfase entre ambos polímeros. La evaluación in vitro de las micropartículas de IND en cultivos de macrófagos THP-1 confirmó su biocompatibilidad. Además, todas las formulaciones fueron internalizadas por los macrófagos en elevada proporción, de forma dependiente del tamaño, el tiempo y la dosis. Para investigar su potencial en el tratamiento de la artritis reumatoide, se investigó el efecto de las formulaciones de IND sobre la producción de TNF-α e Il-6 por los macrófagos preestimulados con LPS. Los resultados obtenidos mostraron que las formulaciones tuvieron un gran efecto antiinflamatorio in vitro, dando lugar a una reducción de la concentración de TNF e IL-6 superior a la observada tras el tratamiento de las células con concentraciones comparables de IND libre. La técnica de atomización coaxial por ultrasonidos nos permitió preparar formulaciones con propiedades significativamente diferentes variando los parámetros de formulación. Todas las formulaciones obtenidas presentaron un tamaño adecuado para obtener una retención efectiva en la articulación inflamada. Esto, en combinación con el efecto supresor observado sobre TNFα e Il-6, indica el potencial terapéutico de las formulaciones desarrolladas para su aplicación a nivel intraarticular. En el cuarto capítulo, se desarrollaron formulaciones microparticulares conteniendo infliximab con potencial aplicación en el tratamiento intraarticular de la AR. Infliximab es un DMARD biológico anti-TNF-α que, estructuralmente, es un anticuerpo monoclonal IgG. Por tanto, resulta fundamental optimizar las condiciones del proceso de microencapsulación para preservar su estructura tridimensional y por tanto, su actividad biológica. En este capítulo se prepararon con éxito microcápsulas conteniendo infliximab utilizando para ello PEOT-PBT y sus mezclas con dos copolímeros de PLGA (Resomer® RG502 y Resomer® RG503). Además, se utilizaron dos técnicas de microencapsulación: Atomización coaxial por ultrasonidos y un método de emulsión-evaporación (w/o/w). En total se desarrollaron seis formulaciones microparticulares con un rendimiento elevado para ambas técnicas de microencapsulación (68,7 – 94,5 %). La eficacia de encapsulación obtenida para las formulaciones preparadas mediante atomización coaxial por ultrasonidos fue muy elevada (69,7 - 80,2 %). Sin embargo, el método de emulsión evaporación resultó en un bajo atrapamiento de INF (17,3 – 23,0 %). Todas las formulaciones presentaron un tamaño adecuado para la administración intraarticular, aunque este dependió tanto de la técnica de microencapsulación, como en menor medida, de la composición polimérica. Las MCs preparadas por emulsión-evaporación presentaron un diámetro medio menor que las preparadas por UA. Además, la incorporación de PLGA RG502 en la matriz polimérica resultó en una reducción significativa del tamaño de partícula. En una segunda etapa, las formulaciones se caracterizaron desde el punto de vista morfológico, fisicoquímico y en términos de perfil de liberación in vitro. Las MPs presentaron forma esférica, no porosa, observándose diferencias en función de la composición polimérica. Además, presentaron carga superficial negativa, siendo esta mayor para las formulaciones cargadas con IVÁN LAMELA GÓMEZ 10 el anticuerpo. La morfología interna fue de tipo microcápsulas para las formulaciones preparadas por UA. Se investigó la hidrofobicidad superficial de las formulaciones mediante un ensayo basado en la adsorción de rosa de bengala. Los resultados obtenidos mostraron que las MCs compuestas por PEOT-PBT presentaron una mayor hidrofobicidad superficial, mientras que las compuestas por los blends con PLGA RG502 y RG503. La caracterización mediante DSC y FTIR mostraron una mayor compatibilidad para el blend con PLGA RG503. El perfil de liberación in vitro de INF mostró una liberación prolongada durante, al menos, 20 días, siendo la liberación más rápida a partir de las formulaciones preparadas por emulsiónevaporación. Además, la incorporación de PLGA en la matriz polimérica incrementó el burst inicial y la velocidad de liberación en comparación con las MCs preparadas con PEOT-PBT. En una tercera etapa se investigó la estabilidad de infliximab. La estructura primaria de infliximab preservó su estabilidad una vez microencapsulado y liberado a partir de las MCs, según se demostró mediante electroforesis SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. Además, se investigó la capacidad del INF microencapsulado para neutralizar el TNF-α producido por los macrófagos estimulados con LPS, demostrando mediante el ensayo de bioactividad en la línea WEHI-13VAR que INF preservó su actividad biológica tras ser microencapsulado en las 6 formulaciones desarrolladas. Finalmente, las formulaciones de caracterizaron in vitro en cultivos de macrófagos THP-1. Todas las formulaciones demostraron ser biocompatibles y fagocitables por los macrófagos. Para profundizar en el efecto antiinflamatorio de las formulaciones, se investigó la producción de TNF-α e Il-6 por los macrófagos estimulados con LPS en presencia de INF libre y de concentraciones comparables de INF microencapsulado. El tratamiento con INF microencapsulado resultó en una reducción dosis dependiente de ambos mediadores proinflamatorios, siendo especialmente acusada para Il-6. Además, el efecto observado para INF microencapsulado fue significativamente mayor que el observado para INF libre a la misma concentración. Se desarrollaron con éxito seis formulaciones de INF con diferentes características, logrando preservar la integridad estructural y actividad biológica de INF tras el proceso de microencapsulación. Además, las formulaciones mostraron un efecto antiinflamatorio in vitro mayor al del fármaco libre. A modo de conclusión, podemos extraer que en la presente tesis se desarrollaron sistemas microparticulares de liberación modificada de fármacos preparados a base de polímeros biodegradables y empleando diferentes aproximaciones tecnológicas. Las formulaciones obtenidas lograron responder a los objetivos planteados, presentando características adecuadas para su potencial aplicación en el tratamiento intraarticular de la AR y otras patologías inflamatorias articulares. Además, se obtuvieron prometedores resultados in vitro, que en un futuro deben ser evaluados en un entorno in vivo y en tratamientos de larga duración. 1. Resumen 11 1.2. SUMMARY Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease characterized by chronic inflammation of the synovial membrane, which results in the formation of Pannus, an invasive and highly destructive tissue which produce a pleiotropic spectrum of cytokines and degradative enzymes that perpetuate synovitis. Finally, it leads to joint destruction, severely affecting the patient’s autonomy and quality of life in the advanced stages of the disease. In addition, with a prevalence ranging between 0.5 and 1 % in developed countries, RA has a high social impact and over health expenditure. Rheumatoid arthritis pathophysiology is extremely complex and involves pleiotropic mechanisms between multiple cell types and proinflammatory mediators. However, it is widely accepted that macrophages play a central role in the pathogenesis of RA as the main amplifiers of the inflammatory process that characterize the disease. Additionally, macrophages significantly contribute to the pathological process by producing high levels of ROS and NO in the inflamed joint, contributing to the increase in oxidative stress, which has been identified as a pathophysiological marker of RA. Their central role in the inflammatory reaction of RA has made macrophages an attractive target in the design of drug delivery systems for the treatment of RA. Due to its polyarticular and systemic nature, RA treatment usually includes the systemic administration of one or more traditional or biological disease-modifying antirheumatic drugs (DMARDs) intended to achieve its clinical remission, combined with anti-inflammatory drugs to control pain and inflammation, like NSAIDs and glucocorticoids. Additionally, intraarticular administration of glucocorticoids is often in the therapeutical management of early stages of RA before achieving clinical remission and in acute episodes of joint inflammation. Nonetheless, this local administration route is limited by several factors, including rapid drug clearance from the joint into the systemic torrent, leading to reduced efficacy and systemic adverse effects, and the maximum number of injections recommended to perform in the same joint in a short period. Local administration of drugs by intra-articular injection can be an optimal approach for treating inflammatory joint diseases due to the possibility of achieving a drug release directly at the site of inflammation, increasing its efficacy and reducing the complications associated with systemic treatment. A local therapeutical approach makes sense in those situations where localized and easily accessible joints are affected. So, in the context of rheumatoid arthritis, it presents a promising potential as a complementary treatment in the control of inflammation and large joints destruction, the management of acute exacerbations of the chronic process and the symptomatic control of arthralgia. Developing drug delivery systems with suitable properties to be retained in the articular cavity and achieve a sustained drug release profile seems to be an excellent approach to overcome the main limitations of intraarticular administration. Polymeric microparticles meet those requirements and, depending on the polymers, formulation technique, and formulation parameters selected, microparticles loaded with different drugs and with different properties can be manufactured. Furthermore, microparticles bigger than 10 µm have been demonstrated to achieve effective retention into the joint in vivo in an animal model of RA. So, drug-loaded microparticles can potentially improve the efficacy of drugs often administrated by intraarticular injection (glucocorticoids) and enable the administration of other molecules with IVÁN LAMELA GÓMEZ 12 potential in the local treatment of RA, such as antioxidants, NSAIDs and, especially, anti-TNFα therapeutical monoclonal antibodies. The main objective of this doctoral thesis was the development and characterization of biodegradable microparticles with suitable properties for the intra-articular release of different drugs, with potential application in the local treatment of rheumatoid arthritis. The research work comprised four differentiated parts, which correspond with the four chapters of this doctoral thesis. Their main objective was, respectively, the microencapsulation of antioxidants (resveratrol), glucocorticoids (betamethasone dipropionate), non-steroidal anti-inflammatory drugs (indomethacin) and anti-TNF-α biological DMARDs (infliximab). The first chapter focuses on the microencapsulation of trans-resveratrol in biodegradable microcapsules of poly(-ε-caprolactone) using ultrasonic atomization. The formulations were prepared according to a central composite experimental design to evaluate the influence of the PCL concentration and power supplied to the nozzle on the final properties of the microcapsules. All the formulations included in the design were successfully prepared with a high process yield (80.2 - 92.1%) and encapsulation efficiency (39.7 - 96.0%). The morphological characterization of the formulations revealed that all the formulations were composed of spherical particles with a smooth, non-porous surface, characterized by a polydisperse size distribution with a mean size of 13.8 ± 0.3 µm for the optimal formulation. In addition, SEM observation verified that the microparticles obtained showed a core-shell structure. Analysis of the formulations by DSC suggested that RSV is dispersed in the polymeric matrix in an amorphous form. Trans-resveratrol is characterized by its extreme photosensitivity, so the photostability of free and microencapsulated RSV in a solid state was evaluated, confirming that microencapsulation conferred protection to RSV against UV radiation. In addition, the stability of RSV in aqueous and ethanolic solutions against UV radiation was investigated, as well as its stability in aqueous solutions at different pH values and protected from light. The degradation of RSV in solution exposed to UV light was faster in aqueous solution. Regarding its degradation protected from light, results showed its degradation at pH values higher than pH 5, which is especially relevant when conducting experiments under physiological conditions. Therefore, the in vitro release profile of RSV was obtained at pH 5, showing a release characterized by a high initial burst followed by a sustained release of RSV. The antioxidant capacity of RSV was investigated using the ABTS assay, showing that RSV preserved its antioxidant capacity once microencapsulated and extracted from MCs. In a final step, RSV formulations were evaluated in vitro in cell cultures of RAW 264.7 mouse macrophages. The microcapsules showed high biocompatibility and were extensively internalized by macrophages, exhibiting a higher percentage of phagocytosis than the observed for empty MCs. Furthermore, the effect of free and microencapsulated RSV over ROS and NO production by macrophages was investigated, showing that RSV microcapsules preserved the ability of RSV to reduce oxidative stress, a pathogenic factor in RA. Finally, RSV microcapsules showed an inhibitory action on lipid peroxidation of the plasmatic membrane of macrophages and RSV microcapsules enhanced the observed effect in comparison to free RSV. 1. Resumen 13 In summary, RSV was successfully microencapsulated, preserving its antioxidant capacity, and obtaining biodegradable microcapsules with suitable properties for its potential intra-articular administration. In addition, the formulations demonstrated their ability to reduce oxidative stress in vitro and protect cells against lipid peroxidation, reinforcing their potential as a complementary intra-articular treatment for RA. The second chapter focuses on betamethasone dipropionate microencapsulation using a PEOT-PBT block copolymer (Polyactive® 1000PEOT70PBT30) and PLGA (Resomer® RG503). The formulations were prepared using two technological approaches: a doubleemulsion/evaporation method and coaxial ultrasonic atomization. Amphiphilic PEOT-PBT copolymers have shown excellent properties for the microencapsulation of hydrophilic molecules, but they have not been explored in the microencapsulation of hydrophobic drugs. Four microcapsule formulations with high process yield (72.7 – 88.7 %) and encapsulation efficiency (48.3 – 84.5 %) were successfully developed. The microencapsulation technique showed a significant influence over particle size and encapsulation efficiency, so MCs obtained by emulsion-evaporation showed smaller particle size and higher E.E. than those prepared by emulsion-evaporation compared to those prepared by UA. In a second stage, the four formulations obtained were exhaustively characterized in terms of morphology, physicochemical properties and drug delivery profile. All formulations showed spherical, non-porous microparticles with a negative surface charge. In addition, it was found that the particles prepared by UA presented a typical core-shell structure. Calorimetric analysis revealed that the BDP was microencapsulated in an amorphous form. Also, polymer properties were not modified during the microencapsulation process. Surface hydrophobicity of the MCs was investigated, showing that MCs composed of PEOT-PBT presented a more hydrophobic surface than those composed of PLGA RG503, which could be related to an orientation of the PBT segments towards the outside of the microcapsules since soft segment (70%; PEOT) is hydrophilic. The in vitro release profiles of BDP were investigated in PBS supplemented with SDS (0.5%) at pH 7.4 and 37°C, observing a sustained release of BDP for more than 15 days for the formulation with the slowest release rate. The release rate depended on both the microencapsulation technique and the polymer composition. Finally, microparticulate formulations were evaluated in vitro in cultures of human THP-1 macrophages, demonstrating their biocompatibility using two different approaches. Investigation of phagocytic activity showed that all formulations were extensively internalized in a dose-dependent manner. The effect of free and microencapsulated BDP on the in vitro production of ROS by macrophages stimulated with zymosan A was investigated, demonstrating the ability of BDP-loaded MCs to reduce oxidative stress in vitro. Finally, the effect of BDP-loaded MCs over TNF-α and Il-6 production by LPS-stimulated macrophages was investigated. The results confirmed the in vitro anti-inflammatory effect of BDP-loaded MCs, which caused a statistically significant decrease in both cytokines, two of the main inflammatory mediators in RA. In summary, developed formulations loaded with BDP demonstrated their anti-inflammatory effect in vitro. In addition, they presented suitable characteristics to achieve effective retention into the joint, which, combined with a sustained release of BDP, presents a promising potential for its application in the local treatment of RA. IVÁN LAMELA GÓMEZ 14 The third chapter focuses on the development of indomethacin microspheres using mixtures of PEOT-PBT (Polyactive® 1000PEOT70PBT30) and PLGA (Resomer® RG502) in different proportions. Microencapsulation was carried out by coaxial ultrasonic atomization, setting the PEOT-PBT: PLGA and outer flow: inner flow ratios according to a central composite experimental design. All 9 formulations included in the design were successfully prepared, and the influence of formulation parameters on encapsulation efficiency, particle size, and initial release of IND was investigated using response surface technology. All formulations showed a high process yield (78.2-88.5%) and encapsulation efficiency (66.2-81.3%). Experimental data of E.E and IND released in the first hour showed an excellent fit to a quadratic polynomial model, observing a complex relationship between the results obtained and the formulation parameters. All formulations prepared were broadly characterized. All formulations exhibited a slightly negative surface charge, regardless of the polymeric composition. Calorimetric and X-ray diffraction analysis showed that IND is dispersed in the polymeric matrix in an amorphous form, as well as the semi-crystalline nature of the polymeric matrix. However, both components present in the blend have low miscibility. The inner and surface morphology of all the developed formulations was investigated, and additionally, the spatial distribution of the drug and the polymers in the MPs was studied by confocal Raman microscopy. In short, all the formulations presented a spherical shape and a porous surface, observing an unusual morphology composed of a spongiform-type polymeric matrix, with the presence of smaller particles inside the pores. The degree of porosity and its location varied depending on the formulation parameters. The porous skeleton presented a higher PEOT-PBT content, while the smaller particles observed inside were composed of PLGA. The IND was preferentially located in the regions rich in PEOT-PBT or the interface between both polymers. The coaxial ultrasonic atomization technique allowed us to prepare formulations with significantly different properties by varying the formulation parameters. All the formulations presented an adequate size to obtain effective retention of the microparticles in the inflamed joint. The increasing residence time of INF in the articular space, combined with the suppressive effect observed on TNF-α and Il-6, indicates the therapeutic potential of the formulations developed for their intra-articular application. In the fourth chapter, infliximab-loaded microparticle formulations with potential application in the intra-articular treatment of RA were successfully developed. Infliximab is a biological anti-TNF-α monoclonal antibody. Therefore, it is essential to optimize the conditions of the microencapsulation process to preserve its three-dimensional structure and biological activity. Microcapsules containing infliximab were prepared using PEOT-PBT and its mixtures with two PLGA copolymers (Resomer® RG502 and Resomer® RG503). In addition, two microencapsulation techniques were used: coaxial ultrasonic atomization and an emulsionevaporation (w/o/w) method. A total of six microparticle formulations were developed with a high process yield for both microencapsulation techniques (68.7-94.5%). Formulations prepared by coaxial ultrasonic atomization led to high encapsulation efficiency (69.7-80.2%). However, the emulsionevaporation method resulted in a low entrapment of INF (17.3 – 23.0%). All the formulations presented an adequate size for intra-articular administration. Particle size distribution depended 1. Resumen 15 on the microencapsulation technique and, to a lesser extent, on the polymeric composition. The MCs prepared by emulsion-evaporation presented a smaller mean diameter than those prepared by UA. Furthermore, the incorporation of PLGA RG502 into the polymeric matrix significantly reduced particle size. In a second step, formulations were characterized in terms of morphology, physicochemical properties, and in vitro INF delivery. Microparticular formulation exhibited a negative surface charge, which is more significant for INF-loaded MCs. All microparticles exhibited spherical shape and non-porous surface, with differences depending on the polymeric composition. Internal morphology observation showed a core-shell structure for the particles prepared by UA. The relative surface hydrophobicity of the formulations was investigated by the bengal rose adsorption assay. Results showed that the MCs composed of PEOT-PBT presented a higher surface hydrophobicity than those made of the polymeric blends with PLGA RG502 and RG503. DSC and FTIR characterization showed greater miscibility for the blend with PLGA RG503. The in vitro release profile of INF showed prolonged release for at least 20 days, with the fastest release rate from formulations prepared by emulsion-evaporation. In addition, the incorporation of PLGA in the polymeric matrix increased the initial burst and the release rate compared to the MCs prepared with PEOT-PBT. In a third stage, the stability of infliximab was investigated. The primary structure of infliximab preserved its stability once microencapsulated and released from MCs, as demonstrated by SDS-PAGE electrophoresis under reducing and non-reducing conditions. In addition, the capacity of microencapsulated INF to neutralize TNF-α produced by LPS-stimulated macrophages was investigated, demonstrating that INF preserved its biological activity after being microencapsulated in the 6 formulations developed, accordingly to TNF-α bioactivity assay performed in the WEHI-13VAR line. Finally, the formulations were characterized in vitro in cultures of THP-1 macrophages. All formulations proved their biocompatibility and high phagocytosis percentage by macrophages. To further investigate the anti-inflammatory effect of the formulations, the production of TNFα and Il-6 by LPS-stimulated macrophages in the presence of free INF and comparable concentrations of microencapsulated INF was investigated. Treatment with microencapsulated INF resulted in a dose-dependent reduction of both pro-inflammatory mediators, especially pronounced for Il-6. Furthermore, the effect observed for microencapsulated INF was significantly more significant than that observed for free INF at the same concentration. Six infliximab-loaded microparticulate formulations with different characteristics were successfully developed while preserving the infliximab’s structural integrity and biological activity. In addition, the formulations showed an in vitro anti-inflammatory effect more remarkable than the free drug. In conclusion, in this doctoral thesis, different microparticulate drug delivery systems made of biodegradable polymers were developed using different technological approaches. The formulations obtained showed features according to the stated objectives, presenting suitable features for their potential application in the intra-articular treatment of RA and other inflammatory joint diseases. In addition, promising in vitro results were obtained, which in the future should be evaluated in an in vivo environment and in long-term treatments in an animal model of RA. IVÁN LAMELA GÓMEZ 22 hialurónico y lubricina, componentes fundamentales para la función lubricante del líquido sinovial, así como en la producción de componentes de la matriz extracelular. En la articulación inflamada, expresan gran cantidad de MMPs, prostaglandinas, citoquinas y otros mediadores inflamatorios, contribuyendo al proceso de destrucción articular [21,22,27-29]. La capa subíntima se localiza bajo la capa de revestimiento sinovial, y su estructura consiste en una matriz de tejido conjuntivo laxo de grosor variable, alcanzando los 5 mm en algunas regiones. Se compone de una matriz de tejido conjuntivo con presencia de vasos sanguíneos, vasos linfáticos y terminaciones nerviosas. En función de su estructura y composición se pueden diferenciar tres tipos de membrana sinovial: areolar, fibrosa y adiposa. La areolar es la más especializada, está presente en las articulaciones grandes y se caracteriza por una subíntima rica en tejido conjuntivo laxo y muy vascularizada. La íntima tiene una profundidad de 2-3 capas de sinoviocitos y presenta pliegues y vellosidades. La sinovial fibrosa presenta una escasa vascularización y una mayor proporción de tejido conjuntivo denso, con una capa discontinua de células de revestimiento. Por último, la sinovial adiposa está presente en el recubrimiento de las almohadillas grasas intraarticulares y es más frecuente en edades avanzadas, caracterizándose por una monocapa de sinoviocitos en la íntima, que descansa sobre el tejido adiposo [21-23,26,30]. Pese a que la función fisiológica de la membrana sinovial es proporcionar una adecuada lubricación articular y contribuir a la homeostasis y buen funcionamiento de la articulación, en los pacientes de AR su estructura y composición se modifica drásticamente hasta convertirse en la principal responsable de la destrucción articular propia de la patología [30]. 2.1.2. Fisiopatología de la artritis reumatoide 2.1.2.1. Etiología La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmune de etiología desconocida que se caracteriza por una inflamación crónica de la membrana sinovial y cursa principalmente con destrucción del tejido óseo y cartilaginoso a nivel articular y, en menor medida, con afectaciones extraarticulares. Su fisiopatología es altamente compleja, clasificándose en varios subtipos en función de la producción o no de dos marcadores de enfermedad: el factor reumatoide (RF) y los anticuerpos anti-péptidos citrulinados (ACPAs). Los ACPAs destacan Figura 2-2. Microfotografías en las que se observan los macrófagos de la íntima sinovial mediante inmunohistoquímica. Los macrófagos están marcados con CD45 (flecha en A) y CD68 (B), que identifican las células hematopoyéticas (CD45) y los macrófagos (CD68). Reproducido de Budd, R.C. et al. Chapter 2 - – Synovium, en Kelley and Firestein's Textbook of Rheumatology, 10th edition, pág. 22, 2017, con el permiso de Elsevier. 2. Introducción 23 por su alta especificidad para AR (≈ 96 %), en contraposición con la baja especificidad del RF (≈ 70 %), el cual puede asociarse a otras enfermedades autoinmunes o condiciones fisiopatológicas [31]. Ambos marcadores son autoanticuerpos que, pese a no relacionarse con un papel patogénico en la AR, presentan especial relevancia en la práctica clínica como indicadores de la actividad de la enfermedad y como herramienta diagnóstica, en combinación con otros marcadores inespecíficos entre los que destaca la proteína C reactiva (PCR) [31,32]. Estos autoanticuerpos (ACPAs y RF) están presentes en un 50 – 70 % de los pacientes en el momento del diagnóstico y se han asociado con un peor pronóstico de la enfermedad, cursando con una sintomatología más grave, un mayor grado de afectación articular e incluso, un incremento de la mortalidad [33]. Pese a que no se conoce con exactitud el origen del proceso autoinmune, existe consenso acerca de su carácter complejo y multifactorial, que implica tanto factores genéticos como ambientales. La interacción de dichos factores termina por desencadenar el proceso autoinmune responsable de la AR, el cual se inicia de manera insidiosa años antes de que aparezcan las primeras manifestaciones clínicas de la enfermedad [11,32-34]. La heredabilidad de la AR, la cual de define como el porcentaje de variación en la susceptibilidad a padecer AR que puede explicarse en base a factores genéticos, se ha estimado en un 66%, confirmando la existencia de un componente genético [35]. Sin embargo, la tasa de concordancia observada en gemelos homocigóticos cuando uno de ellos padece AR osciló entre el 12 y el 15 % [36], lo que puso de manifiesto la existencias de factores ambientales con un papel clave en el desarrollo de la enfermedad [11,32]. A pesar de que determinados alelos presentes en numerosos loci se han asociado a un mayor riesgo de padecer AR, el principal factor genético de susceptibilidad, representando en torno al 40% de la influencia genética, son determinados haplotipos del antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II, cuyas moléculas se expresan en la superficie de células dendríticas, macrófagos y linfocitos B, entre otras, tienen un papel esencial en la presentación de antígenos a los linfocitos T. Concretamente, un mayor riesgo de padecer AR y una mayor gravedad se han asociado con una secuencia de 5 aminoácidos (QKRAA, QRRAA o RRRAA) presente en una región de reconocimiento de antígenos codificada por algunos alelos del HLA-DRβ1, la cual se conoce como epítopo compartido o epítopo de susceptibilidad (SE) [11,32,37]. Se han relacionado varios factores ambientales y su interacción con factores genéticos con una mayor susceptibilidad de padecer AR. Entre los factores que cuentan con un mayor grado de evidencia destaca el tabaquismo [38-40], que interacciona sinérgicamente con factores genéticos e incrementa hasta en un 39,6 % el riesgo de padecer AR en los casos en que coexiste historial tabáquico con presencia de 2 alelos de SE [39]. La AR también ha sido relacionada con determinados agentes infecciosos como Escherichia coli, Proteus mirabillis, citomegalovirus o el virus de Epstein-Barr. Asimismo, Porphyromonas gingivalis, agente causal de la periodontitis, se ha relacionado con la AR puesto que la enfermedad presenta el doble de prevalencia en paciente de AR que en población general. Sin embargo, es importante resaltar que la existencia de relación causal entre dichos agentes infecciosos y la AR, así como los mecanismos subyacentes no han sido todavía esclarecidos por completo [33,34,41,42]. En los últimos años, ha suscitado interés el papel de la microbiota en la susceptibilidad y grado de progresión de la enfermedad. En esta línea, varios estudios in vivo en modelos animales de AR sugieren que la microbiota podría jugar un papel esencial en la fisiopatología de la enfermedad. Por otra parte, estudios preliminares en humanos mostraron tanto una mayor prevalencia de IVÁN LAMELA GÓMEZ 24 disbiosis, como diferencias en la población microbiológica en distintas regiones del tracto gastrointestinal, las cuales se ven alteradas en respuesta al tratamiento con DMARDs. Dichos hallazgos evidencian la necesidad de realizar estudios adicionales con el fin de dilucidar la influencia del microbioma en la AR [33,43,44]. Por último, el papel de la dieta y el riesgo de AR asociado a obesidad también ha sido objeto de estudio en los últimos años, perfilándose como un potencial factor de riesgo [45-47]. Cronológicamente, el proceso de desarrollo de la enfermedad, que abarca desde la exposición de los factores desencadenantes del proceso autoinmune hasta el momento en que la patología es diagnosticada, abarca distintas etapas. De acuerdo con la nomenclatura propuesta por la Liga Europea Contra las Enfermedades Reumáticas (EULAR), el desarrollo de la enfermedad puede dividirse en 3 de etapas preclínicas y 3 sintomáticas [48]. Las Fases A y B se corresponden, respectivamente, con la existencia de factores de predisposición genética y la posterior exposición del individuo susceptible a factores ambientales relacionados con la enfermedad. La Fase C, hace referencia al inicio insidioso del proceso autoinmune responsable de la AR, detectándose autoinmunidad sistémica en ausencia de sintomatología. Las Fases D-F son las fases sintomáticas de la enfermedad. Inicialmente (Fase D) aparece sintomatología inespecífica sin existencia de artritis, que posteriormente evoluciona hasta una fase de artritis indiferenciada (Fase E), en la cual se detecta artritis, pero no se puede establecer un diagnóstico de AR. Por último, la Fase F se determina como el momento en que se establece el diagnóstico de la artritis reumatoide [48,49]. 2.1.2.2. Sinovitis: formación del pannus y destrucción articular La AR es una enfermedad crónica autoinmune, de etiología desconocida, cuya fisiopatología es altamente compleja, involucrando componentes de la inmunidad innata (macrófagos, células dendríticas, mastocitos, etc.) e inmunidad adaptativa (Linfocitos T colaboradores Th1 y Th17, Linfocitos B, células plasmáticas, autoanticuerpos, etc.). La principal característica de la enfermedad es la inflamación de la membrana sinovial o sinovitis, la cual se manifiesta con hiperplasia de la membrana sinovial, angiogénesis e infiltración por células inmunocompetentes, dando lugar a una elevada producción de citoquinas, factores quimiotácticos y mediadores proinflamatorios que amplifican y perpetúan la sinovitis. Este proceso da lugar a la transformación de la sinovial inflamada en un tejido invasivo y altamente destructivo denominado “pannus”, responsable de la destrucción del hueso y cartílago de las articulaciones inflamadas [27,32,33,50-53]. Durante el proceso de hiperplasia sinovial en la AR se produce un incremento significativo del número total de sinoviocitos, que se acompaña de un desequilibrio en la proporción de sinoviocitos tipo A y B, incrementándose la proporción de los sinoviocitos derivados de macrófagos (tipo A). Pese a esto, está ampliamente aceptado que los macrófagos residentes a nivel de la íntima y subíntima articular se encuentran completamente diferenciados y carecen prácticamente de capacidad de proliferación, por lo que la acumulación de células en la articulación en AR proviene del reclutamiento de precursores de médula ósea en respuesta a la expresión de citoquinas y factores quimiotácticos durante el proceso inflamatorio. El proceso que va desde el inicio de una reacción autoinmune, en respuesta a la interrelación de un conjunto de estímulos ambientales y genéticos (sección 2.1.2.1), hasta el desarrollo de la reacción inflamatoria articular y el desarrollo clínico de la AR es extremadamente complejo. 2. Introducción 25 En la Figura 2-3 se representa de forma muy resumida el desarrollo del principal mecanismo fisiopatológico de la AR, el cual se describe en mayor detalle a continuación. De forma general, se acepta que el proceso inflamatorio local, que terminará por desencadenar la destrucción de la articulación, comienza con el reclutamiento y migración de monocitos y linfocitos T hacia la membrana sinovial y los tejidos circundantes en respuesta a un conjunto de estímulos desconocido relacionado con el proceso autoinmune. [32,54,55]. En este sentido, se han identificado en la sinovial linfocitos T colaboradores alterados, con signos de agotamiento, posiblemente secundarios a una estimulación crónica del receptor de linfocitos T como consecuencia de la alteración de su respuesta a estímulos [56]. Además, en la membrana sinovial de pacientes de AR se han observado folículos linfáticos similares a los presentes en los órganos linfoides, por lo que la sinovial inflamada podría ser capaz de estimular linfocitos T y B, actuando, en cierta medida como un órgano linfático secundario [57]. La reacción autoinmune local parece jugar un papel patogénico clave en el desarrollo de la reacción inflamatoria articular. Las evidencias existentes apuntan a la presencia de linfocitos T colaboradores autorreactivos en la articulación, los cuales dan lugar a la activación de macrófagos por contacto directo célula-célula y por liberación de mediadores proinflamatorios, desencadenando así el desarrollo y amplificación de una cascada inflamatoria que terminará constituyendo el principal factor patogénico de la enfermedad, al provocar el desarrollo de una sinovitis crónica, altamente destructiva [11,32-34,54,58]. El papel central que desempeñan los macrófagos activados en respuesta al proceso inmune patológico anteriormente descrito, hace que estos hayan sido considerados las principales células efectoras en el desarrollo de la sinovitis crónica en la AR [34,59,60]. Esta hipótesis ha sido demostrada por la drástica disminución en el grado de infiltración de macrófagos en la sinovial en respuesta al tratamiento con DMARDs biológicos, así como por la elevada eficacia terapéutica de estos fármacos dirigidos a bloquear los principales mediadores inflamatorios secretados por los macrófagos (TNF-α, Il-1, Il-6, etc.…)[61-65]. Estos mediadores actúan sobre un amplio abanico de tipos celulares en que se expresan sus receptores, entre las que destacan los propios monocitos/macrófagos, linfocitos T, linfocitos B, y en especial, los sinoviocitos similares a fibroblastos (tipo B)[27,34]. Como respuesta al estímulo inducido por los macrófagos, las células sinoviales tipo B se activan y expresan su propio espectro de Figura 2-3. Representación esquemática del mecanismo fisiopatológico de la artritis reumatoide. Adaptado de “Pat hogenesis of Rheumatoid Arthritis” con Biorender.com (2022). Obtenido de https://app.biorender.com/biorender - template s. IVÁN LAMELA GÓMEZ 26 mediadores, principalmente Il-6, prostanoides, metaloproteasas de matriz y otros mediadores como el ligando RANK, que resultan en un círculo autocrino/paracrino que perpetua la sinovitis, reclutando más células a la articulación inflamada y contribuyendo a la destrucción de la matriz extracelular. Las MMPs secretadas por los sinoviocitos (colagenasas, estromelinasas, gelatinasas) dan lugar a una degradación del cartílago articular, mientras que la activación de los osteoclastos en respuesta a RANKL y otros mediadores resulta en destrucción ósea. Todo ello redunda en la transformación de la membrana sinovial en un tejido altamente destructivo, compuesto principalmente por macrófagos, osteoclastos y sinoviocitos tipo B, conocido como “pannus”, y que presenta un comportamiento similar al de un tumor invasivo que progresa de forma descontrolada, causando la completa destrucción del cartílago articular y el hueso subyacente [27,34,51,66,67]. Es precisamente este papel central de los macrófagos en la amplificación de la inflamación lo que los ha situado como una diana atractiva de cara al diseño de sistemas de liberación de fármacos para el tratamiento de la artritis reumatoide [68,69], ya que estos además de liberar una gran cantidad de factores quimiotácticos y proinflamatorios, contribuyen de manera significativa al proceso patológico mediante la producción de óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno, dando lugar a un incremento del estrés oxidativo. Este ha sido identificado como un marcador fisiopatológico de la AR, estableciéndose una relación entre los niveles de estrés oxidativo y el daño tisular en la articulación artrítica [70-73]. Como se ha expuesto anteriormente, las citoquinas y mediadores proinflamatorios producidos principalmente por los macrófagos y sinoviocitos presentes en el pannus han demostrado tener un papel fundamental en la progresión de la AR, lo que ha quedado claramente evidenciado por la efectividad de los DMARDs biológicos destinados a bloquear la actividad de estas citoquinas y mediadores inflamatorios, entre los que destacan TNF-α, Il-1 e Il-6. El factor de necrosis tumoral (TNF-α) es una citoquina con efectos pleiotrópicos sobre múltiples tipos celulares que ha sido identificada como la principal citoquina proinflamatoria en la AR, encontrándose en elevada concentración sérica, así como en el líquido sinovial, en los pacientes de artritis reumatoide. Desde el punto de vista molecular, se expresa en la superficie celular como una proteína transmembrana que puede ser liberada en forma de TNF-α soluble tras la escisión proteolítica mediada por un enzima perteneciente a la familia de las metaloproteasas de matriz (MMPs), siendo la forma biológicamente activa un homotrímero. Su acción sobre las células diana da lugar a una explosión inflamatoria que incluye la liberación de citocinas, la expresión de moléculas de adhesión y la síntesis de enzimas degradativos, principalmente MMPs, que contribuyen de forma significativa a la destrucción del cartílago articular en la AR. La Il-1 es secretada en grandes cantidades por los fibroblastos y macrófagos sinoviales, estimulando la producción de Il-6, Il-8 y otros mediadores inflamatorios. Además, presenta un efecto sinérgico con el TNF-α en muchos aspectos a pesar de utilizar receptores y vías de señalización intracelular diferentes. Sin embargo, las terapias destinadas a bloquear esta vía de señalización han mostrado una menor eficacia que los anti-TNF-α, dando lugar a un modesto beneficio clínico. La interleucina-6 es otra de las citoquinas clave en la AR, encontrándose a concentraciones muy elevadas en el líquido sinovial. Además, es sorprendente la correlación existente entre la concentración sérica de Il-6 y los niveles séricos de reactantes de fase aguda, en especial, 2. Introducción 27 proteína C reactiva. Respecto a su origen, los macrófagos la expresan en gran cantidad, aunque en la sinovial inflamada los sinoviocitos tipo B son los principales productores de Il-6. Su destacado papel en los mecanismos fisiopatológicos de la AR queda demostrado por la similar respuesta clínica observada para los anticuerpos monoclonales anti-Il-6 (tocilizumab) en comparación con los inhibidores de TNF-α. Además, estos han resultado de especial utilidad en el tratamiento de pacientes refractarios a los anti-TNF-α, lo que no es fácilmente explicable ya que el TNF se encuentra en un nivel superior en la estructura jerárquica de la cascada inflamatoria y, además, el tratamiento con anti-TNF-α resulta en un descenso significativo de los niveles de Il-6 [11,67,74-76]. La causas y mecanismos implicados en la AR son extremadamente complejos y no han sido completamente dilucidados por el momento. Por tanto, resulta de especial interés tanto continuar profundizando en su conocimiento, de cara a la búsqueda de nuevos tratamientos, como trabajar activamente en el desarrollo de nuevas formas de dosificación y sistemas avanzados de liberación de fármacos que nos permitan tanto mejorar la eficacia del arsenal terapéutico actualmente disponible, como optimizar su perfil de seguridad. 2.1.3. Tratamiento de la artritis reumatoide El tratamiento farmacológico de la artritis reumatoide ha experimentado un salto cualitativo en las últimas tres décadas, cuya evolución ha estado marcada por varios hitos entre los que destaca la aparición de los fármacos biológicos anti-TNF-α tras la autorización de comercialización de infliximab (INF) por la FDA en 1998, lo que abrió la puerta a logar la remisión y estabilización de la enfermedad en un elevado número de pacientes refractarios a los tratamientos convencionales [11,77,78]. Sin embargo, pese al papel fundamental de los fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDs) de origen biológico, estos no son los únicos responsables de los progresos alcanzados. Buena parte de esta mejoría puede atribuirse al cambio en los criterios de tratamiento como consecuencia del mayor conocimiento de la etiología de la enfermedad, lo que llevó a establecer la necesidad de un tratamiento precoz de la AR para alcanzar un objetivo de baja actividad, así como a establecer como criterio universal la necesidad de que todo paciente de AR debe ser sometido a tratamiento al menos con un DMARD tradicional o biológico. Pese a los importantes progresos alcanzados, la AR reumatoide continúa siendo hoy en día una enfermedad crónica incurable, por lo que las estrategias terapéuticas utilizadas en clínica persiguen el objetivo de lograr una baja actividad de la enfermedad, ralentizado significativamente su progresión tanto en términos de destrucción articular como de las posibles manifestaciones extraarticulares de la enfermedad. Por tanto, en el escenario actual, se acepta que la mayoría de los pacientes con un diagnóstico reciente de AR lograrán una remisión de la enfermedad con el tratamiento adecuado, por lo que uno de los objetivos prioritarios es el desarrollo de nuevas estrategias y sistemas de administración de fármacos encaminados a incrementar la eficacia y reducir los efectos adversos tanto de los DMARDs, como de los restantes fármacos empleados en el control sintomático de la enfermedad, entre los que destacan los glucocorticoides y los AINEs [49,7986]. Los conocidos como fármacos modificadores de la enfermedad son aquellos que tienen la capacidad de disminuir o inducir la remisión de la enfermedad, con la consiguiente mejoría en la evolución de la destrucción articular desde el punto de vista de su evaluación radiográfica. Los DMARDs pueden dividirse en dos grandes grupos: DMARDs tradicionales y DMARDs biológicos. IVÁN LAMELA GÓMEZ 28 Entre los DMARDs tradicionales, el más utilizado es sin lugar a duda el metotrexato (MTX), junto con otros entre los que destaca la sulfasalazina, hidroxicloroquina, y los glucocorticoides [49,80]. Pese a que estos son los más utilizados, hoy en día el tratamiento de la AR comprende más de 4000 combinaciones posibles de fármacos modificadores de la enfermedad tradicionales, entre los que se incluyen, junto con las ya mencionados, la azatioprina, la minociclina, la ciclosporina, la penicilamina, el tofacinib y las sales de oro [79,87]. Pese a que las sales de oro fueron uno de los primeros tratamientos establecidos para el tratamiento de la AR hace más de un siglo, con una elevada eficacia terapéutica, su estrecha ventana terapéutica, junto con su perfil de efectos adversos y las dificultades asociadas a su administración han terminado por relegarlo a un papel secundario hasta el punto de no ser prácticamente utilizadas a día de hoy en el manejo terapéutico de la AR [88,89]. La inclusión de una familia tan amplia de fármacos como son los glucocorticoides dentro de los considerados como “DMARDs tradicionales” responde a que su uso combinado con MTX u otros fármacos modificadores de la enfermedad ha demostrado reducir de forma significativa el progreso radiográfico de la AR, en términos de destrucción articular, en comparación con la administración de MTX en monoterapia [90-93]. Estos hallazgos han motivado que, en los últimos años, la administración oral de corticoides a dosis bajas en combinación con DMARDs se haya establecido como parte del tratamiento inicial de la AR reduciendo la dosis de corticoide paulatinamente a medida que el DMARD, de acción más lenta, logra alcanzar los objetivos de control de la enfermedad [49,80,81,87,94,95]. Los DMARDs biológicos comprenden un grupo de macromoléculas destinadas principalmente a bloquear de forma específica algunas de las principales citoquinas implicadas en el proceso inflamatorio de la AR. Entre ellos destacan los anticuerpos monoclonales destinados a inhibir el TNF-α (infliximab, adalimumab y golimumab) [62,82,96], así como una proteína de fusión compuesta por un receptor dimérico y la región Fc de una inmunoglobulina que inhibe competitivamente la unión de TNF-α a su receptor (etanercept) [97] y un fragmento Fab pegilado que se une con alta afinidad a TNF-α (certolizumab) [98]. Además, el bloqueo de otros mediadores clave en la AR ha dado lugar a buenos resultados terapéuticos, destacando el antagonista del receptor de Il-1 (Anakinra) [99] y el anticuerpo monoclonal contra la Il-6 (tocilizumab) [100]. Por último, también se incluyen dentro de esta categoría anticuerpos destinados a inhibir tipos celulares implicados en el complejo proceso fisiopatológico de la AR, destacando rituximab (un anticuerpo monoclonal anti-CD20, que se expresa en los linfocitos B), y abatacept (una proteína de fusión que se une a CD80 y CD86, bloqueando la activación de linfocitos T) [101]. Respecto al uso de los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en el control de la sintomatología asociada a la AR, estos han estado presentes en el esquema terapéutico prácticamente desde el descubrimiento de la enfermedad [102,103]. Sin embargo, la mejor eficacia terapéutica de los DMARDs actuales, junto con el avance en el conocimiento de los efectos adversos de los AINEs a nivel digestivo, renal y, especialmente a nivel cardiovascular, nos han llevado al escenario actual, en el cual se intenta minimizar el uso de este tipo de fármacos. Estos efectos colaterales resultan especialmente preocupantes en los pacientes de AR, en los cuales la mayor tasa de mortalidad está relacionada con su mayor predisposición a padecer complicaciones cardiovasculares [79,103]. 2. Introducción 29 En todo caso, merece especial mención, que de acuerdo con los criterios de tratamiento actuales es esencial que en todo paciente de AR se establezca un tratamiento basado en uno o varios DMARDs, sintéticos o biológicos, con el fin de lograr un objetivo de remisión o baja actividad de la enfermedad, por lo que tanto el uso de AINEs en monoterapia, como la administración de glucocorticoides sin uso concomitante de otro DMARD esta, en líneas generales, desaconsejado y restringido a situaciones concretas. En la Figura 2-4 se presenta un esquema en el cual se resume la estrategia a seguir en el establecimiento del tratamiento modificador de la enfermedad en un escenario de enfermedad temprana (Figura 2-4 A) y en pacientes con AR establecida (Figura 2-4 B) [79]. Pese a que el tratamiento sistémico con fármacos modificadores de la enfermedad es esencial para lograr un control efectivo de la enfermedad, la vía intraarticular ha sido ampliamente utilizada en clínica en el tratamiento de recidivas, articulaciones activas en pacientes controlados y en formas de la enfermedad que cursan con una mayor afectación de articulaciones diferenciadas. El interés de esta vía de administración, y sus limitaciones, se aborda en mayor detalle en la sección 2.4. En la práctica clínica habitual, los corticoides en combinación con anestésicos locales son, prácticamente, los únicos fármacos administrados por Figura 2-4. Recomendaciones del American College of Rheumatology para el tratamiento de la artritis reumatoid e [1]. A. Enfermedad Temprana. B. Enfermedad establecida. FARME, fármaco antirreumático modificador de la enfermedad ; HCQ, hidroxicloroquina; LEF, leflunomida; MTX, metotrexato ; TNF, factor de necrosis tumoral. Reproducido de O'Dell, J.R, Capítulo 71 , en Kelley y Firestein. Tratado de reumatología, 10ª ed. , 2017 , pág.1195, con el permiso de Elsevier. [1] Singh, J.A et al. Arthritis Care & Research 2012, 64, 625-639. Contenido r eproducido con el permiso de Wiley and Sons como propietarios de los derechos de la publicación [1]. IVÁN LAMELA GÓMEZ 30 esta vía. Sin embargo, no podemos pasar por alto en interés que suscita la posible administración de DMARDs biológicos a nivel local, ya que su administración sistémica ha demostrado una elevada eficacia en la inducción y mantenimiento de la remisión clínica de la enfermedad, pero su elevado coste y efectos adversos siguen limitando su uso como fármacos de primera elección [104-107]. Sin embargo, los casos en que se ha explorado la administración intraarticular de este tipo de fármacos han demostrado que se trata de una práctica segura y bien tolerada, que resultó en una mejoría de la inflamación y la sintomatología articular, aunque está muy limitada por el rápido aclaramiento del fármaco en la articulación inflamada, imposibilitando su uso como terapia a medio y largo plazo [108-112]. En esta tesis doctoral se abordará el desarrollo de sistemas de liberación modificada de fármacos, basados en la microencapsulación de estos en polímeros biodegradables, destinados a obtener formulaciones de micropartículas con una potencial aplicación en la liberación intraarticular de DMARDs biológicos (infliximab), AINEs (indometacina), glucocorticoides (dipropionato de betametasona) y moléculas antioxidantes (trans-resveratrol). 2.2. MICROENCAPSULACIÓN 2.2.1. Doble emulsión-evaporación del disolvente La microencapsulación de fármacos y sustancias activas (fármacos, vacunas, ingredientes alimentarios, cosméticos, etc) presenta múltiples ventajas en cuanto a la preservación de la estabilidad química de la molécula y en caso de los principios activos, beneficios terapéuticos. No obstante, la preparación de grandes cantidades y que además cumplan con unos criterios de calidad exigibles para su autorización por las agencias reguladoras, de cara a su comercialización y uso en humanos, sigue siendo una limitación para la puesta en el mercado de este tipo de sistemas farmacéuticos. La mayor parte de los procedimientos de preparación de microesferas son modificaciones de las tres técnicas básicas de encapsulación: extracción del disolvente/evaporación, separación de fases o coacervación y secado por atomización (spray-drying). De entre ellos, y posiblemente debido a su relativa sencillez, uno de los métodos más comúnmente utilizados para la preparación de microesferas y microcápsulas es el proceso denominado como emulsiónextracción del disolvente/evaporación. Por esta razón, esta metodología ha sido una de las más empleadas por un mayor número de investigadores, cobrando una especial importancia el estudio de los parámetros de formulación y sus efectos sobre las características de la formulación en años pasados. Este método presenta como principales características que no requiere el uso de temperaturas elevadas o la incorporación de sustancias que induzcan la separación de fases, así como la obtención de partículas de tamaño controlado tanto a nivel micrométrico como nanométrico. Sin embargo, en comparación con otras técnicas de obtención de partículas, exige un mayor grado de optimización, tanto en la selección de los materiales como, sobre todo, de los parámetros o condiciones de encapsulación, para poder conseguir rendimientos elevados de encapsulación, bajos contenidos de disolvente residual y una distribución de tamaño monodispersa. Además, este método de encapsulación presenta ciertas ventajas, como la disponibilidad de materiales formadores de cubiertas entre los que destacan los polímeros tanto de origen natural como sintético, los tiempos relativamente cortos de preparación, sin que 2. Introducción 31 tengan lugar reacciones químicas y la posibilidad de obtener un tamaño controlado de partícula mediante la correcta optimización de los parámetros de formulación. Desde el punto de vista experimental, este método de preparación de micropartículas consiste básicamente en 4 pasos: 1. Disolución o dispersión del principio activo en un disolvente orgánico, que a su vez contiene una dispersión del material formador de la matriz; 2. Emulsificación de esta fase orgánica en una segunda fase continua (generalmente, de carácter acuoso e inmiscible con la primera). En esta etapa tiene lugar la formación de una emulsión con un tamaño de gota estable; 3. Extracción del disolvente orgánico desde la fase dispersa, a partir de la cual tiene lugar la evaporación del disolvente, lo que provoca la formación de microesferas sólidas a partir de las gotas formadas previamente, en la etapa anterior. El disolvente se evapora mediante presión reducida empleando un evaporador rotativo o, simplemente, dejando la formulación bajo agitación a temperatura ambiente (dependiendo del punto de ebullición del disolvente); 4. Aislamiento y secado de las microesferas. En este proceso, el principio activo puede ser incorporado, bien en la dispersión polimérica mediante disolución en un disolvente común a ambos, bien en forma de polvo pulverizado finamente dispersado en la fase orgánica o bien emulsificado en una disolución acuosa inmiscible con la dispersión del polímero en disolvente orgánico [113-116]. Para la completa disolución o dispersión de un fármaco en la dispersión polimérica se suelen emplear métodos como la disolución asistida por ultrasonidos [117-119], el uso de mezcladores estáticos [120], mediante mezcladores/homogeneizadores de alta velocidad [121,122] o bien, mediante microfluídica [117,123]. El procedimiento óptimo para la incorporación del principio activo de interés está condicionado por la hidrofilia o hidrofobia del principio activo a encapsular. Para la encapsulación de sustancias hidrofóbicas o muy poco solubles en agua, la formación de una emulsión de fase externa acuosa (o/w) es generalmente la alternativa empleada, dando lugar a buenos resultados según demuestran los numerosos ejemplos de principios activos hidrofóbicos encapsulados con éxito mediante este procedimiento [124-126]. Sin embargo, esta aproximación fracasa en el caso de principios activos de naturaleza hidrofílica. Esto es debido a que el fármaco difunde fácilmente a la fase continua durante la formación de las partículas o bien directamente, desde un inicio, el fármaco no se disuelve en la fase orgánica. Como alternativa para solventar esta limitación se desarrollaron métodos basados en la formación de una emulsión múltiple de fase externa acuosa (w/o/w; emulsión de una emulsión), destinada a limitar la difusión de los principios activos hidrofílicos a la fase externa durante la emulsificación y evaporación del solvente. Por sus obvias ventajas, esta estrategia se consolidó como alternativa de elección en el caso de principios activos hidrofílicos, como pueden ser los péptidos o proteínas. En este caso, la selección de los tensoactivos adecuados para la emulsificación es un factor crítico, ya que la estabilidad de estas emulsiones dobles, así como las propiedades de liberación de las micropartículas obtenidas dependerán fundamentalmente del tipo y de la concentración del estabilizante empleado para preparar el sistema [127]. Si bien una de las ventajas de estos sistemas es la posibilidad que ofrecen de encapsular, incluso de forma simultánea, fármacos de carácter hidrofílico e hidrofóbico [128], esta técnica de encapsulación también presenta algunas dificultades cuando se emplean fármacos hidrofílicos en cuanto a su formulación (es un proceso en dos pasos) y en cuanto a su estabilidad, debido a una cierta susceptibilidad de las formulaciones resultantes a la degradación tanto física como química. Así, se han desarrollado estrategias por distintos investigadores con la finalidad de aumentar la estabilidad de las emulsiones múltiples, entre otras, la selección del tensoactivo IVÁN LAMELA GÓMEZ 38 de la ratio láctico: glicólico del copolímero, que se diferencian en su grado de hidrofobicidad y cinética de degradación [195]. El principal mecanismo de degradación del PLGA implica la hidrólisis del enlace éster, dando lugar a los ácido láctico y glicólico, los cuales son fácilmente eliminados del organismo y carecen de toxicidad [196]. Esta liberación de ácidos libres durante el proceso de degradación da lugar a un descenso del pH tanto en el interior de las micropartículas como en su ambiente circundante, lo que en el caso de micropartículas destinadas a la liberación de proteínas bioactivas se ha identificado como una de las principales fuentes de estrés a las que se ven sometidas las macromoléculas en este tipo de sistemas de liberación, pudiendo llegar a comprometer su estabilidad conformacional y, por tanto, su actividad biológica [197-199]. Por tanto, resulta de interés la exploración de polímeros alternativos al ampliamente estudiado PLGA de cara a la microencapsulación fármacos de naturaleza proteica, y en especial de anticuerpos monoclonales terapéuticos. En este sentido, en el último capítulo de esta tesis doctoral (sección 7) se ha investigado el desarrollo de microcápsulas para la liberación sostenida de infliximab, un anticuerpo monoclonal anti-TNF-α, empleando un copolímero bloque PEOT-PBT y sus mezclas con dos variedades de PLGA con una ratio 50:50 de ácido láctico: glicólico y diferente peso molecular (Resomer® RG502 y RG503). Adicionalmente, en el segundo capítulo (sección 5) se evaluó comparativamente la microencapsulación de glucocorticoides (dipropionato de betametasona) en PLGA RG503 y en un copolímero bloque PEOT-PBT, mientras que en el tercer capítulo (sección 6) se desarrollaron microesferas de indometacina utilizando mezclas de PLGA RG502 y PEOT-PBT, investigando la influencia del porcentaje de PLGA en la mezcla sobre las propiedades de las micropartículas mediante un diseño experimental. 2.3.3. Copolímeros bloque PEOT-PBT Los copolímeros bloque compuestos por tereftalato de óxido de polietileno (PEOT) y tereftalato de polibutileno (PBT) son elastómeros termoplásticos que, pese a ser desarrollados inicialmente con otros fines, han demostrado tener propiedades físicas con un gran potencial para su aplicación biomédica [200,201]. Desde el punto de vista estructural, son copolímeros multibloque y, por tanto, se caracterizan por la existencia de una microseparación de fases entre los bloques del copolímero, dando lugar a la dispersión de uno de los bloques (fase dispersa) en una fase continua compuesta mayoritariamente por el otro bloque [202]. En el caso concreto de los copolímeros PEOT-PBT, cuya estructura se representó en la Figura 2-7, el bloque disperso se corresponde con un segmento cristalino compuesto por PBT, que confiere resistencia al polímero (segmento duro), mientras que la fase continua, de naturaleza amorfa, se compone mayoritariamente de PEOT y en baja proporción, por la fracción amorfa de PBT (segmento blando). Como consecuencia de la hidrofobicidad y carácter cristalino del segmento PBT, en combinación con la naturaleza hidrofílica del PEOT, los copolímeros PEOT-PBT son anfifílicos y presentan una estructura semicristalina, con una temperatura de transición vítrea inferior a la temperatura ambiente [202-207]. Estos copolímeros han demostrado ser biodegradables, biocompatibles y presentar una elevada capacidad de hidratación [200,204,208,209]. Adicionalmente, se ha demostrado in vitro que Figura 2-6. Estructura química del PLGA. 2. Introducción 39 presentan excelentes capacidades para la adhesión y crecimiento de diversos tipos celulares sobre su superficie, incluyendo condrocitos, queratinocitos y fibroblastos, entre otros. La evaluación de su biocompatibilidad se investigó en varios modelos animales in vivo mediante implantación subcutánea, sin que se observasen reacciones inflamatorias significativas ni reacciones de rechazo tras la implantación [200,208,210,211]. Estas excelentes propiedades motivaron el interés en este tipo de polímeros, siendo la ingeniería de tejidos y, en mayor medida, el desarrollo de implantes destinados a regeneración ósea uno de los campos en que han sido estudiados estos copolímeros obteniendo excelentes resultados [212-218]. Además, sus propiedades varían significativamente en función del peso molecular del segmento PEOT y de la proporción de cada uno de los bloques en la composición total del copolímero, lo que permite obtener una amplia variedad de polímeros que difieren en sus propiedades mecánicas, grado de hidrofobicidad y velocidad de degradación [208,209]. Estos copolímeros, en especial aquellos con una mayor ratio PEOT/PBT, han sido explorados de cara a su utilización en el desarrollo de sistemas microparticulares destinados a la liberación tanto de fármacos de origen proteico, como de fármaco hidrofílicos de bajo peso molecular, obteniendo resultados prometedores [219-227]. De cara a la microencapsulación y liberación sostenida de fármacos de naturaleza proteica, es de interés el uso de un polímero hidrofílico y con capacidad de hinchamiento, por lo que las variedades con un mayor porcentaje del segmento PEOT, y por tanto más hidrofílicas, resultaron ser más adecuadas de cara a esta aplicación [219,222]. En la presente tesis doctoral, el objetivo de uno sus capítulos es el desarrollo de una formulación compuestas por el copolímero bloque Polyactive® 1000PEOT70PBT30 destinada a la liberación sostenida del anticuerpo monoclonal infliximab. Por ello, a continuación, abordaremos brevemente las características de este tipo de polímeros de cara a liberación de proteínas de elevado peso molecular. Además, se investigará el comportamiento de este copolímero en la microencapsulación de moléculas hidrofóbicas de bajo peso molecular, así como su comportamiento en mezclas poliméricas con PLGA, las cuales no habían sido caracterizadas previamente. Bezemer et al. microencapsularon con éxito lisozima, mediante un método de emulsiónevaporación, utilizado distintos copolímeros PEOT-PBT. Para las partículas de Polyactive® 1000PEOT70PBT30 observaron un perfil de cesión de lisozima a velocidad constante, de orden cero, sin que se observase un efecto burst significativo. Además, se preservó la actividad biológica del enzima [222]. Sin embargo, el estudio de los mecanismos implicados en la liberación de las proteínas microencapsuladas demostró que el copolímero PEOT-PBT, una vez hidratado, se comporta como un hidrogel a través del cual difunden las proteínas microencapsuladas. Por tanto, no fue posible lograr la liberación de proteínas con un radio hidrodinámico mayor al tamaño de poro del hidrogel, lo que constataron al no lograr liberar Figura 2-7. Estructura química característica de los copolímeros bloque PEOT-PBT. IVÁN LAMELA GÓMEZ 40 seroalbúmina bovina (BSA) tras su microencapsulación en las mismas condiciones que lisozima [219,222]. Sin embargo, investigaciones posteriores demostraron la posibilidad de preparar micropartículas heterogéneas con una red interconectada de dominios acuosos dispersos en la matriz polimérica, a través de los cuales difunde la proteína encapsulada, permitiendo por tanto la liberación de proteínas de elevado peso molecular [220]. Para alcanzar este objetivo, emplearon una técnica de doble emulsión seguida de evaporación del disolvente (w/o/w) para la preparación de micropartículas conteniendo BSA. Durante el proceso de liberación observaron que el transporte de las macromoléculas (BSA) a través de la matriz y por tanto, la velocidad de liberación, pueden ser modulados en función de la fracción de agua respecto a la cantidad de polímero (w/p) durante la preparación de la emulsión primaria. De hecho, por debajo de un umbral crítico (w/p < 1 ml/g) no se observó liberación de BSA, mientras que para valores superiores a 1,5 ml/g se observó una liberación de BSA cuya velocidad se incrementó de forma proporcional a esta ratio w/p. Además, se observó que, por encima de ese umbral crítico, no todos los dominios acuosos se encontraban interconectados, lo que resultó en una liberación incompleta de la BSA, incrementándose el porcentaje total liberado a medida que se incrementó el ratio p/w, y por tanto, el grado de interconexión entre los dominios acuosos en que se alojó la proteína [220,223-225]. Más recientemente, Adamson et al. desarrollaron formulaciones de micropartículas compuestas por PEOT-PBT cargadas con un anticuerpo monoclonal dual anti-VEGF (109 KDa) preservando su actividad biológica y obteniendo un perfil de liberación sostenida en el tiempo [228]. Los mecanismos implicados en la degradación de los copolímeros PEOT-PBT se investigaron in vitro e in vivo. En términos generales, este tipo de polímeros presentan una velocidad de degradación lenta, cuya velocidad aumenta para las variantes más hidrofílicas. Desde el punto de vista químico, la hidrólisis del grupo éster y la oxidación de los grupos éter del segmento blando son las principales vías de degradación. Además, la degradación del segmento blando (PEOT) del copolímero tuvo lugar con mayor velocidad que la degradación del fragmento cristalino (PBT). Aunque es esperable que in vivo la degradación del polímero se vea acelerada por la presencia de numerosas células fagocíticas y otros factores, la degradación completa de las micropartículas de PEOT-PBT in vitro no se alcanzó tras 24 semanas de incubación en PBS a 37ºC y pH 7,4 [204,208,209]. 2.4. ADMINISTRACIÓN INTRAARTICULAR DE FÁRMACOS 2.4.1. Características de la cavidad articular para la administración de fármacos. El tratamiento de las lesiones articulares originadas como consecuencia de la inflamación crónica existente en enfermedades como la artritis reumatoide o la osteoartritis es extremadamente complejo. El abordaje inicial suele consistir en un tratamiento de tipo farmacológico, no quirúrgico, que aún sigue constituyendo un reto para los especialistas médicos por diversas razones entre las que destacan la dificultad de curación en estos tejidos, así como la necesidad de administrar dosis elevadas a nivel sistémico para alcanzar concentraciones terapéuticas a nivel articular, dando lugar a una exacerbación de los efectos secundarios inherentes a la terapia farmacológica. Esto es debido, en parte, tal y como se desprende de la introducción realizada en este trabajo, al limitado potencial de curación inherente a estas zonas del organismo. De forma general, la regeneración del cartílago está limitada debido a varios factores: su aislamiento de la circulación general y la escasez de vasos sanguíneos e inervación. A diferencia de la mayoría de los tejidos, no existen procesos de 2. Introducción 41 reparación inflamatorios y los condrocitos no son capaces de migrar desde un tejido sano hasta el lugar de la lesión [229-231]. Por otra parte, cabe señalar que en las enfermades crónicas que cursan tanto con afectación articular individual (entre las que se encuentran la osteoartritis y algunas variedades poco prevalentes de artritis reumatoide monoarticular [232-234]), como en las patologías inflamatorias poliarticulares, incluyendo a la artritis reumatoide, es necesario contemplar tratamientos a largo plazo. Por tanto, en aquellos casos con una afectación importante de articulaciones diferenciadas y fácilmente accesibles, un abordaje terapéutico local mediante inyección intraarticular se presenta como una alternativa idónea de cara a minimizar algunas de las complicaciones frecuentemente asociadas al tratamiento sistémico [111,235]. La AR se encuentra entre las patologías poliarticulares con potencial para beneficiarse de un tratamiento intraarticular local. En el curso clínico de la forma más prevalente de la enfermedad, es frecuente la aparición de afectación significativa de articulaciones grandes como rodilla, codo o cadera a medida que progresa la enfermedad, lo que se traduce en un rápido deterioro del grado de movilidad, independencia y calidad de vida del paciente [1,13,236,237]. Además, pese al carácter sistémico de la enfermedad, esta se asocia con afectaciones extraarticulares tan solo en un 40 - 50 % de los pacientes [1,238-241], lo que hace que aún más idónea la administración de fármacos a nivel local. Así mismo, este tratamiento localizado podría ser de interés en formas de AR con afectación inicial de articulaciones grandes, con evolución lenta, en las cuales resulta fundamental el control del proceso inflamatorio en las articulaciones afectadas [1]. Cabe señalar que mientras que en enfermedades con afectación monoarticular, o únicamente a nivel de un número limitado articulaciones, la vía intraarticular podría ser una alternativa óptima al tratamiento sistémico, mientras que en enfermedades poliarticulares sistémicas como la AR en sus variantes más prevalentes, la administración intraarticular local presenta gran potencial como tratamiento coadyuvante en el control del proceso inflamatorio y la destrucción de articulaciones mayores, el manejo de exacerbaciones agudas del proceso crónico y el control sintomático de la artralgia. Todo ello redunda en una menor exposición sistémica al tratamiento farmacológico y los consecuentes efectos deletéreos de este a largo plazo. Por lo tanto, para ciertas indicaciones clínicas, la liberación de fármacos directamente dentro del espacio articular supone aumentar su eficacia terapéutica con respecto a la administración sistémica. Así, y teniendo en consideración que el cartílago es un tejido avascular, un fármaco debe alcanzar en primer lugar el fluido sinovial y desde ahí, difundir a través de la matriz extracelular cartilaginosa. Esta matriz, a menos que se encuentre dañada, presenta una alta carga aniónica y es extremadamente impermeable a moléculas con tamaños superiores a aproximadamente 67 KDa (el peso molecular de la albúmina). Influyen, además, otros factores como su carga y la conformación que presente el fármaco [242]. La inyección intraarticular ha sido empleada como vía de administración de fármacos, principalmente corticoides y anestésicos locales, para el tratamiento del dolor articular en artritis desde la década de los cincuenta hasta la actualidad. En la práctica clínica habitual, su uso es frecuente y limitado en el tiempo, siendo ampliamente utilizados tanto durante el control inicial de la enfermedad como en el tratamiento de articulaciones con activas incluso tras alcanzar un control y estabilización de la progresión de la artritis reumatoide con el tratamiento de fondo establecido [49]. De forma general, en los pacientes que han sido tratados con inyecciones intraarticulares se observa una mejoría en la actividad de la enfermedad, un mejor control del dolor, mejores valores en la presión arterial y de forma general, una reducción de IVÁN LAMELA GÓMEZ 42 los efectos adversos (debilidad muscular, úlceras pépticas o valores de glucemia) con respecto a los pacientes que han sido tratados con corticoides por vía oral o bien por vía sistémica [243,244]. En los últimos años, además, se han explorado otras sustancias como alternativas al uso de anestésicos y corticoides como son el ácido hialurónico [245,246], plasma enriquecido en plaquetas [247,248], células madre mesenquimales [249], fracción vascular estromal [250] y de forma más reciente, terapia génica [251,252]. En el caso concreto de la administración intraarticular de los glucocorticoides, los fármacos más utilizados por esta vía en la práctica clínica habitual, la selección del fármaco a administrar se ha fundamentado en su tiempo de permanencia en la articulación, ya que tras su administración se produce un rápido aclaramiento articular y adsorción sistémica, con un tiempo de residencia en el espacio articular generalmente inferior a 12 horas [111,253-255]. Puesto que el tiempo de permanencia del fármaco a nivel articular está condicionado, entre otros factores, por su solubilidad en medio acuoso, generalmente se recurre a corticoides lipofílicos para su administración intraarticular, encontrándose entre los más utilizados el acetato de metilprednisolona, el acetato de betametasona, así como el acetónido y hexacetónido de triamcinolona. Así mismo, en los últimos años se ha popularizado el uso de formulaciones comerciales que combinan un derivado liposoluble con una sal hidrosoluble de betametasona, entre los que destacan la combinación acetato de betametasona/fosfato sódico de betametasona (Celestone-Cronodose®) y dipropionato de betametasona/fosfato sódico de betametasona (Diprospan®; no comercializado en España) [49,235,255,256]. En otras ocasiones, se ha empleado la combinación con un anestésico local como la lidocaína o la bupivacaina, ya que de por sí, tienen un cierto efecto antiinflamatorio de carácter transitorio [49,257,258]. En este tipo de tratamientos, la complicación de carácter agudo más seria que se puede dar es la infección intraarticular, si bien suele estar relacionada estrictamente con la incorrecta asepsia de la técnica y afecta, en mayor medida, a pacientes que han sido sometidos una artroplastia o lo van a ser recientemente tras la administración del corticoide [259-261]. En cuanto a las reacciones adversas más comunes, están las reacciones a nivel local, siempre de tipo leve, como por ejemplo la sinovitis a la que puede dar lugar en respuesta a los cristales inyectados de cierto tamaño [262]. Sin embargo, la complicación más preocupante, concretamente en el caso de los corticoides, es el daño articular, e incluso la destrucción de la articulación tras la administración de inyecciones repetitivas [255,256,263]. Teniendo en cuenta esta consideración, la indicación para este tipo de administraciones intraarticulares es la de separarlas al menos 3 meses (en la misma articulación) o de emplearlas por cortos periodos de tiempo. Pese a que no existe un consenso sobre este tema, la sociedad española de reumatología recomienda en su guía de práctica clínica no realizar en un corto periodo de tiempo más de 3-4 inyecciones en un misma articulación y separarlas al menos 3-4 semanas [49]. A pesar de la experiencia acumulada en las últimas décadas, y de la evidencia que existe sobre la relativa seguridad de las inyecciones intraarticulares, especialmente en lo referente a la aparición de efectos colaterales a nivel sistémico, no existe un consenso general sobre los potenciales beneficios de las inyecciones intraarticulares, concretamente, en el caso de los corticoides y, de hecho, no existe una recomendación ni a favor ni en contra sobre este tipo de tratamientos. Así, y gracias al avance de las nuevas técnicas de imagen, se aconseja vigilar estrechamente la aparición de los posibles efectos adversos a nivel de la articulación, como son la propia progresión de la artritis (con reducción del espacio articular), con destrucción acelerada de la articulación, pérdida de hueso e incluso, osteonecrosis. Por todo ello, unido a la 2. Introducción 43 amplia variabilidad en la respuesta individual a este tipo de tratamientos, la corta duración de efectos, la ausencia de datos clínicos sobre la potencia terapéutica y los potenciales efectos adversos, las inyecciones intraarticulares de corticoides se reservan para casos graves de pacientes con dolor refractario a otros tratamientos y donde no existe posibilidad de reemplazo de la articulación debido a la edad, presencia de otras patologías o ambos factores [264,265]. Para un fármaco con un mecanismo de acción directa, la administración local en la cavidad articular, especialmente en el caso de analgésicos y corticoides, presenta muchas ventajas sobre la administración sistémica. De forma resumida: un aumento de la biodisponibilidad, una reducción de los efectos adversos por la limitada exposición sistémica, y un menor coste sanitario. Se asume de forma general, que la limitada eficacia clínica de la administración intraarticular se debe además de los factores descritos anteriormente, a la rápida eliminación de los principios activos de la cavidad articular. Dicho de otra forma, el tiempo de permanencia de un fármaco dentro de la cavidad articular depende de la velocidad a la que es aclarado del fluido sinovial. Esta velocidad, a diferencia de lo que ocurre cuando el principio activo debe alcanzar el fluido sinovial desde el torrente circulatorio, no depende del tamaño del principio activo ya que en el caso de fármacos solubles de pequeño tamaño, estos son eliminados a través de la red capilar del tejido subsinovial, altamente vascularizada, mientras que los principios activos de mayor tamaño, como las proteínas, son aclaradas a través del sistema linfático [266]. Curiosamente, las macromoléculas una vez están en una cavidad articular inflamada (por ejemplo, en un paciente de artritis reumatoide) presentan un tiempo de residencia menor de lo que cabría esperar (como máximo, unas pocas horas), ya que a diferencia de lo que ocurre en la entrada del fármaco desde el torrente circulatorio (en el caso de una administración sistémica), su aclaramiento desde la cavidad articular tiene lugar a través del flujo linfático sinovial, y este es totalmente independiente del tamaño de la molécula [267]. Este drenaje linfático es muy eficiente en el caso de la eliminación de macromoléculas, mientras que el aclaramiento de moléculas de pequeño tamaño tiene lugar a través de los capilares sinoviales. En el caso de moléculas pequeñas de carácter soluble, el tiempo de permanencia en la cavidad articular es de entre 1-4 horas, lo constituye un verdadero reto a la hora de administrar fármacos en la cavidad articular, especialmente en el caso de patologías crónicas [268]. Este es el caso por ejemplo de los corticoides, moléculas característicamente de <700 KDa, hidrofóbicas, que presentan una vida media intraarticular que raramente excede las 12 h, incluso en el caso de que se empleen estrategias para aumentar el tiempo de retención, como es el uso de suspensiones a base de polisorbato, dextrano o polietilenglicol (PEG), o la utilización de sales que mantienen al fármaco en forma cristalina, retrasando así el aclaramiento de la cavidad articular [253,254]. En el caso del ácido hialurónico, considerado el principal agente lubricante de la articulación, también se emplean estrategias basadas en la obtención de derivados con la finalidad de aumentar su tamaño molecular. Esto ha conseguido preparaciones de hialurónico con vidas medias intraarticulares de más de dos días [269]. En cuanto a agentes biológicos, proteínas solubles como el infliximab, etanercept, adalimumab u otros agentes anti-TNF, presentan vidas medias intraarticulares de entre 2-4 h tras su administración. Si bien algunos estudios han demostrado a nivel experimental el potencial IVÁN LAMELA GÓMEZ 44 terapéutico de estos fármacos administrados por vía intraarticular, a diferencia de los fármacos y agentes mencionados anteriormente, la administración intraarticular de anti-TNFs no constituye una práctica clínica habitual [270-272]. Esto es debido principalmente a que la administración de estos fármacos por vía intraarticular se considera actualmente como una nueva indicación, por lo que aún no están establecidos ni la cantidad de fármaco, ni la dosis o frecuencia de administración que permitirían obtener una concentración terapéutica en la cavidad articular, variables críticas además, teniendo en cuenta el breve tiempo de residencia que se esperan puedan presentar tras su administración, junto con el coste de este tipo de fármacos. Todo ello hace que este tipo de formulaciones basadas en estos anticuerpos monoclonales se encuentren en este momento en una etapa preclínica de su desarrollo [108110,270-272]. 2.4.2. Sistemas para la liberación de fármacos a nivel intraarticular Como se ha comentado anteriormente, en el tratamiento de la artritis en cualquiera de sus variantes y niveles de gravedad, la baja eficacia terapéutica que se consigue por vía oral o por vía tópica ha incrementado enormemente el interés por el desarrollo de nuevas formas farmacéuticas que puedan ser administradas por vía intraarticular y al mismo tiempo, que sean capaces de liberar el fármaco en el sitio de acción, mitigando así al máximo los efectos adversos asociados a la ruta parenteral. Con estos nuevos sistemas desarrollados hasta el momento se persiguen de forma clara varios objetivos. Por una parte, se pretende alcanzar un tipo celular diana o bien un tejido diana sobre el que el fármaco pueda ejercer su acción de una forma directa. Por otra parte, se pretende lograr una acumulación del fármaco de interés en la cavidad articular en niveles terapéuticos. Como se ha comentado anteriormente, el objetivo último y final de esta liberación controlada y prolongada en la cavidad articular es la de reducir la frecuencia de dosificación, minimizar la fluctuación de los niveles plasmáticos del principio activo y en último término mejorar la aceptación del tratamiento por parte del paciente [273-275]. El interés por este tipo de sistemas de liberación queda plenamente justificado por el hecho de que la administración intraarticular de una simple disolución o dispersión del fármaco cuenta con numerosas desventajas que redunda en una baja eficacia terapéutica. En el caso de fármacos hidrofóbicos, una vez administrados en forma de suspensión acuosa, presentan una dispersión muy poco homogénea en el fluido sinovial. En el caso de fármacos hidrosolubles, estos se “fugan” rápidamente de la cavidad articular, dando lugar a un descenso de los niveles de fármaco en el lugar de acción, y la consecuente reducción en la eficacia, e incrementado su concentración sistémica, y por tanto, la probabilidad de aparición de efectos adversos. El tamaño molecular del fármaco, tal y como se ha descrito anteriormente, tampoco constituye una limitación para que sean aclarados a menor velocidad. En cualquiera de los dos casos, resulta evidente que el uso de un vehículo capaz de mantenerse retenido en la cavidad articular y, además, de liberar el fármaco de una forma controlada podría solventar estas limitaciones y, por tanto, mejorar la eficacia del fármaco encapsulado. De todo lo expuesto anteriormente se desprende que la naturaleza permeable de la pared sinovial de una cavidad articular inflamada es la principal responsable de la rápida eliminación tanto de moléculas de bajo peso molecular como de macromoléculas, pero también, de sistemas de tipo coloidal como las nanopartículas. Este hecho constituye la base de este trabajo, en el que planteamos el desarrollo de sistemas de tamaño micrométrico como estrategia para incrementar el tiempo de residencia de las micropartículas en una articulación inflamada y que 2. Introducción 45 así el fármaco pueda ser liberado de forma prolongada en el lugar de acción, lo que aumentaría su eficacia terapéutica. Así, se ha demostrado como partículas de más de 10 µm quedan retenidas en la cavidad articular independientemente de su estado inflamatorio. Por el contrario, el límite mínimo en el tamaño de partícula que se pierde con facilidad desde la cavidad articular está establecido en 300 nm. Por otra parte, tamaños de aproximadamente de 3 µm pueden quedar retenidas en una articulación sanas, pero son aclaradas en mayor medida como consecuencia del incremento en la permeabilidad vascular que está presente en una articulación inflamada [276]. Algunos de los sistemas destinados a administración intraarticular desarrollado hasta el momento están basados en polímeros sintéticos como el ya conocido PLGA. Este tipo de partículas biodegradables han demostrado ser sistemas de liberación prolongada de fármacos muy eficaces en otras aplicaciones. Así por ejemplo, en un estudio del 2013, la encapsulación del acetónido de triamcinolona proporcionó concentraciones terapéuticas durante 6 semanas tras la administración [277]. En otros estudios la incorporación del fármaco en microesferas, tanto de PLLA como de PLGA, han demostrado in vivo que es posible mantener concentraciones terapéuticas a nivel articular de hasta 2-3 meses mediante el uso de estrategias basadas en de la microencapsulación [278]. Estos autores también investigaron la influencia del tamaño de partícula sobre el tiempo de retención del sistema a nivel articular en un modelo de ratón in vivo, estableciendo un límite de 10 µm como tamaño crítico para lograr la retención de las partículas a nivel articular, mientras que las partículas de mayor tamaño ensayadas (25 µm) proporcionaron una liberación sostenida en el tiempo de al menos dos meses de duración frente a las más pequeñas de 2,5 µm, que liberaron rápidamente el principio activo debido al pequeño camino de difusión en las partículas y a un mayor proceso de erosión. De cara a su administración intraarticular local, también se ha investigado la encapsulación de otro tipo de fármacos, con diferentes mecanismos de acción como el paclitaxel o siRNA anti-TNFα, empleando PLGA como material formador de la cubierta [279,280]. Los primeros intentos en el desarrollo de sistemas con vistas a ser administrados por vía intraarticular se basaron en microesferas de albúmina cargada con el analgésico diclofenaco sódico. Estas partículas, estabilizadas con glutaraldehído y con un tamaño medio de unas 15 µm fueron administradas a un modelo in vivo de artritis inducida en conejos. Aunque los ensayos de liberación in vitro indicaron tiempos máximos de liberación de 7-8 días, la evaluación in vivo sobre la progresión de la artritis en conejo, arrojaron resultados prometedores a los 30 días post-administración [281]. Posteriormente, Puebla et al. [282] desarrollaron microesferas de indometacina empleando PLGA. Con la finalidad de controlar y extender la liberación en el tiempo, se exploró la posibilidad de incorporar un derivado de PEG. Las partículas obtenidas tras la optimización del proceso mediante un diseño experimental presentaron un tamaño aproximado de 50 µm y demostraron en ensayos in vitro tanto su citocompatibilidad como la posibilidad de prolongar la liberación de la indometacina gracias a la incorporación del derivado de PEG, el cual modificó el proceso de cristalización del fármaco y como consecuencia, su solubilidad y coeficiente de difusión [282]. Recientemente, en el año 2021, Liang et al. demostraron un aumento en la retención del furoato de mometasona en más de 35 días tras ser encapsulado en microesferas de PLGA [283]. También de manera reciente, Stefani et al. han desarrollado un hidrogel a base de agarosa en el que incorporaron microesferas de PLGA cargadas con dexametasona para su aplicación en casos de osteoartritis. Esta estrategia de combinar un vehículo en forma de hidrogel aumentó las propiedades de liberación sostenida durante 99 días [284]. Otros autores emplearon partículas a base de PLGA, quitosano IVÁN LAMELA GÓMEZ 46 y gelatina para encapsular un lisado de plaquetas que fue administrado en un modelo animal de rata [285]. La liberación sostenida a partir de estos sistemas incrementó la proliferación de los condrocitos y restableció el cartílago dañado con osteoartritis. Otras aproximaciones más recientes se han basado en el empleo de microesferas poliméricas preparadas a partir de un tipo de poliéster (PEA), donde se consiguió una liberación de acetónido de triamcinolona más prolongada comparativamente al PLGA. Además, en un modelo de artritis aguda desarrollada en ratas, se pudo comprobar como estas partículas, de un tamaño medio aproximado de 38 µm fueron capaces de mantener concentraciones terapéuticas de corticoide con un marcado efecto antiinflamatorio durante 60 días [286]. Actualmente, existen varias formulaciones basadas en microesferas que se encuentran disponibles a nivel comercial, y otras que se consideran como muy prometedoras para el tratamiento intraarticular de la artritis reumatoide y otras patologías articulares como la osteoartritis. Por ejemplo, una formulación de liberación sostenida de acetónido de triamcinolona se encuentra comercializada como Zilretta® en Estados Unidos [287,288], mientras que otras formulaciones microparticulares cargadas con fluvastatina, celecoxib y etoricoxib se encuentran ya en las últimas etapas de desarrollo preclínico y comenzarán pronto su evaluación en ensayos clínicos [289-291]. Pese a los avances realizados en los últimos años en el desarrollo de sistemas de liberación intraarticular de fármacos destinados a prolongar el tiempo de permanencia de estos en la cavidad articular, es necesario continuar trabajando en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas destinadas no solo a prolongar el tiempo de residencia de fármacos habitualmente utilizados en clínica, sino también a desarrollar formulaciones que nos permitan administrar por esta vía otros fármacos como los anticuerpos monoclonales anti-TNF-α u otros agentes biológicos. Estos fármacos modificadores de la enfermedad de origen biológico han demostrado presentar una elevada eficacia terapéutica en el control de progresión de la artritis reumatoide tras su administración sistémica, pero su elevado coste y perfil de efectos adversos ha limitado su uso como fármacos de primera línea en un número elevado de pacientes. 2. Introducción 47 2.5. BIBLIOGRAFÍA 1. Erickson, A.R.; Cannella, A.C.; Mikuls, T.R. 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INTRODUCCIÓN El trans-resveratrol (3,5,4’-trihidroxiestilbeno) es un fitoalexina presente en numerosas plantas vasculares como metabolito secundario (Figura 4-1). Presenta una estructura polifenólica, teniendo en común con otros polifenoles la presencia de uno o varios anillos benceno sustituidos como uno o más grupos hidroxilo, siendo especialmente relevante la presencia de sendos grupos hidroxilo en posición 3 y 5 de anillo A y el doble enlace con la función 4’-oxo en el anillo C, debido a que son estos grupos los responsables de su capacidad antioxidante. Se ha demostrado que el estrés oxidativo y, por tanto, el daño celular y tisular causado por los radicales libres, tiene un papel fundamental en numerosas patologías, entre otras la artritis reumatoide (AR), en la cual el estrés oxidativo se considera un marcador fisiopatológico de la enfermedad [1,2]. La capacidad antioxidante de resveratrol ha sido profundamente investigada y documentada. Estos estudios han identificado al RSV como molécula prometedora en la prevención del daño inducido por radicales libres, lo cual podría ser la causa de los efectos antiinflamatorios de RSV demostrados en estudios in vitro [3] e in vivo [4]. Sin embargo, el potencial terapéutico de RSV como antioxidante se ha visto limitado por su baja biodisponibilidad oral (prácticamente nula), su baja hidrosolubilidad (0,03 mg/ml) y corta vida media, así como su inestabilidad química y más concretamente por su extrema fotosensibilidad frente a radiación UV [5]. De hecho, el trans-RSV en disolución se isomeriza rápidamente a cis-RSV al ser expuesto a radiación UV con una longitud de onda de 254 o 366 nm, alcanzando un 91% de isomerización tras 4 horas [6,7]. Así mismo, el resveratrol es inestable en solución acuosa a pH alcalino y próximo a la neutralidad, incluso cuando se encuentra protegido de la luz, incrementándose exponencialmente su velocidad de degradación a valores de pH superiores a 6,8, siendo por tanto inestable a pH fisiológico [8]. Desde el punto de vista de una aplicación biomédica, una alternativa adecuada sería el diseño de una forma de dosificación sólida capaz de lograr un perfil de liberación sostenida de RSV y permanecer en contacto con el tejido inflamado de forma prolongada. Dada la rapidez con que tiene lugar la degradación del RSV, un incremento de la estabilidad de RSV hasta tiempos de varias horas nos permitiría mejorar la biodisponibilidad local del mismo y por tanto, permitiría que RSV ejerza su acción terapéutica [9]. Considerando la baja estabilidad y solubilidad del trans-RSV, su encapsulación en una cubierta biocompatible y biodegradable presenta las características adecuadas para obtener una liberación en el lugar de acción y maximizar su concentración en el foco de la inflamación. En este contexto, las micropartículas se postulan como una alternativa excelente para solventar las principales limitaciones que presenta el RSV de cara a su incorporación al tratamiento de la artritis reumatoide. Concretamente, la incorporación de RSV en micropartículas esféricas protegería al RSV frente a la degradación en presencia de luz UV o determinados valores de pH, nos permitiría una fácil administración local por vía intraarticular, así como incrementar su tiempo de permanencia en el espacio b a Figura 4-1. Estructura de (a) trans-RSV (3,5,4'-trihidroxiestilbeno) y (b) cis-RSV. IVÁN LAMELA GÓMEZ 72 articular, dando lugar a un incremento del intervalo posológico, maximizando su potencial terapéutico y mejorando la aceptación por parte del paciente. Los macrófagos han demostrado tener un papel central en la fisiopatología de la artritis reumatoide, siendo los principales amplificadores de la reacción inflamatoria. La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmune, de etiología desconocida, que se caracteriza por una inflamación crónica de la membrana sinovial, dando lugar a hinchazón, dolor articular y finalmente artritis incapacitante. La elevada infiltración y activación de los macrófagos en el tejido sinovial contribuye significativamente a la destrucción articular, promoviendo la degradación de cartílago y hueso mediante la secreción de un amplio espectro de citoquinas y factores proinflamatorios (factor de necrosis tumoral-α, interleucina-1, interleucina-6, interleucina-8, prostaglandina, etc.). Así mismo, la producción de especies reactivas de oxígeno por parte de los macrófagos infiltrados en la articulación inflamada contribuye a la destrucción de los tejidos circundantes [10]. El estrés oxidativo juega un papel fundamental en el desarrollo de la artritis, ya que las especies reactivas de oxígeno contribuyen a la destrucción del cartílago e inducen inflamación crónica. En este sentido, los radicales lipídicos generados como producto de la peroxidación lipídica actúan como moléculas de señalización intracelular, teniendo una función clave en los mecanismos fisiopatológicos involucrados en el proceso de destrucción articular [10-12]. Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto, la liberación dirigida de RSV a los macrófagos mediante su incorporación en microcápsulas fagocitables, en combinación con una administración local a nivel intraarticular, se presenta como una alternativa para mejorar la acción antioxidante y antiinflamatoria del RSV. El tratamiento actual de la AR consiste en una combinación de fármacos que difiere en función del estadio de enfermedad y está orientado, por un lado, al control sintomático y por otro a bloquear la reacción inflamatoria responsable de la progresión de la enfermedad. El esquema terapéutico suele incluir la combinación de fármacos modificadores de la enfermedad clásicos y/o biológicos con corticosteroides y antiinflamatorios no esteroideos. Sin embargo, pese a los avances alcanzados en las últimas décadas, no existe por el momento ningún tratamiento capaz de curar completamente la enfermedad. Existen diferentes técnicas de uso frecuente para la obtención de microcápsulas poliméricas utilizando para ello poliésteres como la poli-(ε-caprolactona) [13-15]. La atomización por ultrasonidos, sin embargo, es una alternativa novedosa con respecto a los métodos comunes de microencapsulación, que no ha sido tan ampliamente investigada y que se caracteriza por su simplicidad y versatilidad. Concretamente, los equipos de atomización coaxial por ultrasonidos han demostrado ser adecuados para la microencapsulación de fármacos en condiciones suaves, obteniendo microcápsulas esféricas con elevada eficacia de encapsulación y características idóneas para la liberación de fármacos, las cuales varían en función de la configuración del equipo y otras variables del proceso de preparación. Algunos de los parámetros experimentales que pueden ser modificados para modular las características de las microcápsulas, como su tamaño de partícula, son los flujos a través de ambos canales, la potencia suministrada por el generador de ultrasonidos o la concentración de polímero [16-23]. En esta técnica, la boquilla es alimentada a través de dos canales concéntricos que confluyen en la punta, donde tiene lugar la formación de microgotas por acción de la energía vibracional suministrada por el generador de ultrasonidos, proyectando un fino aerosol. Este es recogido en un baño en constante agitación, dando lugar a la solidificación de la cubierta polimérica en torno a un núcleo acuoso y la posterior evaporación del solvente orgánico. Entre las ventajas de la atomización por ultrasonidos frente a las técnicas convencionales destaca la posibilidad de producir en pocos 4.Microencapsulación de moléculas antioxidantes | Resveratrol 73 minutos y de forma continua, lo que facilita enormemente el escalado a un nivel de producción industrial, microcápsulas cuya estructura se caracteriza por una cubierta polimérica rodeando un núcleo acuoso. El principal objetivo de este trabajo es la preparación de microcápsulas de poli-ε-caprolactona conteniendo RSV y la evaluación del impacto del proceso de microencapsulación sobre la estabilidad y capacidad antioxidante de la molécula. Siguiendo un diseño experimental, las microcápsulas fueron preparadas mediante atomización por ultrasonidos y caracterizadas en términos de eficacia de encapsulación, tamaño de partícula, morfología, estabilidad de RSV, propiedades antioxidantes y perfil de liberación in vitro. Por último, se llevaron a cabo estudios in vitro en macrófagos murinos activados con el fin de evaluar la preservación de la actividad biológica del RSV como agente antiinflamatorio con potencial en el tratamiento de enfermedades reumáticas como la artritis reumatoide. 4.2. MATERIALES Y MÉTODOS Tanto la poli-ε-caprolactona (Pm = 14.000 g/mol), como el trans-resveratrol y el alcohol polivinílico (PVA) (Pm = 30.000-70.000 Da) fueron suministrados por Sigma-Aldrich Química (Madrid, España). El diclorometano y etanol fueron adquiridos a Fluka (Sigma-Aldrich Química). Los restantes reactivos empleados fueron de grado analítico. 4.2.1. Preparación de las microcápsulas Las microcápsulas fueron preparadas utilizando una boquilla coaxial de atomización por ultrasonidos conectada a una fuente de alimentación de frecuencia fija (60 kHz) y potencia variable (Sono-Tek Corp., Milton, NY, EE. UU.). En primer lugar, se preparó una solución acuosa de PVA al 3,5 % (p/p) que se hizo llegar a través de ambos canales de la boquilla a un caudal constante de 3 ml/min. Para ello, se utilizó una bomba peristáltica en el caso del canal exterior (Masterflex 77390-00, Masterflex SE, Gelsenkirchen, Alemania) y una bomba de jeringa programable para el canal interior (NE-1000; New Era Pump systems Inc., Farmingdale, NY, EE. UU.). Así, se obtuvo un aerosol fino y estable que fue recogido sobre una dispersión de PCL (Tabla 4-1) en cloruro de metileno conteniendo un 3,3 % (p/p) de RSV que se mantuvo en constante agitación hasta la completa evaporación del solvente. La formación de las microcápsulas tuvo lugar como consecuencia la precipitación gradual del polímero alrededor de las microgotas y la posterior evaporación del solvente orgánico mediante el uso de un evaporador rotativo. Por último, las microcápsulas ya solidificadas se aislaron por centrifugación a 6000 r.p.m. (EBA 21, Andreas Hettich GmbH & Co., Tuttlingen, Alemania), se lavaron por duplicado con agua destilada para eliminar el excedente de tensoactivo y finalmente se secaron en cámara de vacío durante 24 h. La preparación de las microcápsulas y la totalidad de los experimentos, excepto aquellos encaminados a evaluar la fotoestabilidad del RSV microencapsulado, se llevaron a cabo en oscuridad o bajo condiciones tenues de iluminación para prevenir la degradación de trans-RSV. 4.2.2. Diseño experimental Para evaluar el impacto de la concentración de polímero y la potencia suministrada a la boquilla en el tamaño de partícula, morfología, eficacia de encapsulación y perfil de liberación in vitro de RSV, ambos parámetros de formulación se establecieron de acuerdo con un diseño experimental rotacional compuesto (Tabla 4-1). Los valores para la concentración de PCL fueron establecidos entre 0,08 % y 2,91 %, mientras que el rango de potencia se fijó entre 3.58 IVÁN LAMELA GÓMEZ 74 y 6.41 W. El diseño experimental y el posterior tratamiento de datos fue realizado con el paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI, v. 16.1.15 (StatPoint Technologies, Inc., Warrenhouse, VA, EE. UU., 2010). La concentración de PVA (3,5 %) y el contenido de RSV respecto a la cantidad de polímero (3,3 %) se mantuvieron invariables para todas las formulaciones preparadas. Los parámetros de formulación para las 9 formulaciones incluidas en el diseño experimental se detallan en la Tabla 4-1. La cuantificación del efecto de las variables de estudio sobre las características de las microcápsulas se llevó a cabo mediante regresión múltiple y tecnología de superficie de respuesta. Tabla 4-1. Parámetros de preparación (El caudal de ambos canales fue de 3 ml/min), rendimiento del proceso (%) y eficacia de encapsulación (E.E.) para todas las formulaciones incluidas en el diseño experimental. Formulación [PCL] Potencia [PVA] Rendimiento del proceso Eficacia de encapsulación F1 0,08 % 5,00 W 3,50 % 85,83% 39,66% F2 0,50 % 4,00 W 3,50 % 85,45% 63,80% F3 0,50 % 6,00 W 3,50 % 80,43% 50,20% F4 1,50 % 3,58 W 3,50 % 85,30% 83,97% F5 1,50 % 5,00 W 3,50 % 92,07% 96,00% F5 1,50 % 5,00 W 3,50 % 92,07% 96,00% F5 1,50 % 5,00 W 3,50 % 92,07% 96,00% F5 1,50 % 5,00 W 3,50 % 92,07% 96,00% F5 1,50 % 5,00 W 3,50 % 92,07% 96,00% F6 1,50 % 6,41 W 3,50 % 80,22% 66,16% F7 2,50 % 4,00 W 3,50 % 86,12% 77,30% F8 2,50 % 6,00 W 3,50 % 89,88% 91,48% F9 2,91 % 5,00 W 3,50 % 91,88% 92,76% 4.2.3. Determinación de la cantidad de fármaco encapsulado Una muestra de 20 mg de microcápsulas secas se disolvió en 10 ml de cloruro de metileno y se mantuvo en agitación durante 1 hora con el fin de extraer la totalidad del RSV contenido en la misma. Posteriormente, las muestras fueron diluidas con etanol y filtradas para eliminar los restos del polímero. La concentración de RSV fue determinada tanto espectrofotométricamente, a la longitud de onda de absorción máxima del trans-RSV (307 nm), como fluorimétricamente (λex = 334 nm; λem = 379 nm). La eficacia de encapsulación (E.E.) se expresó como el porcentaje de RSV extraído de las microcápsulas respecto a la carga teórica de fármaco en las mismas. 4.2.4. Análisis del tamaño de partícula La distribución de tamaño de todas las formulaciones microparticulares incluidas en el diseño experimental se determinó por difracción de luz láser siguiendo el modelo de difracción de Fraunhofer (Mastersizer Micro; Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). Las formulaciones se analizaron tras completar el proceso de secado. Las medidas de tamaño se determinaron a partir de una suspensión homogénea de densidad óptica adecuada, la cual fue sometida a ultrasonidos durante 1 minuto antes de cada medida. Los resultados obtenidos se expresaron en forma de distribución volumétrica, la cual se caracteriza por los parámetros d(v, 0.1), d(v, 0.5) y d(v, 0.9) que representan respectivamente los percentiles 10, 50 y 90 de la distribución de tamaño. El valor de d(v, 0.5) fue seleccionado para expresar el diámetro medio 4.Microencapsulación de moléculas antioxidantes | Resveratrol 75 y el ancho de la distribución de tamaño fue estimado a través del parámetro span, que se calculó de acuerdo con la ecuación (4-1). 𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆= 𝑑𝑑(𝑣𝑣, 0.9)−𝑑𝑑(𝑣𝑣, 0.1) 𝑑𝑑(𝑣𝑣, 0.5) (4-1) 4.2.5. Microscopía electrónica de barrido La morfología de las microcápsulas se estudió mediante microscopía electrónica de barrido (SEM; Jeol JSM-6360LV, JEOL Ltd., Akishima, Japón). Para observar la morfología interna de las microcápsulas, una pequeña cantidad de muestra fue dispersada en 2-cianoacrilato de etilo para formar un pellet que una vez solidificado se seccionó transversalmente con una cuchilla metálica. Las muestras se montaron en soportes de aluminio recubiertos con cinta de carbono de doble cara y posteriormente fueron metalizadas con una aleación oro/paladio (SDC 005 Sputter Coater, BAL-TEC GmbH, Schalksmühle, Alemania). Por último, operando el microscopio a un voltaje de aceleración de 15 kV, se tomaron imágenes de las formulaciones a distintos aumentos. 4.2.6. Calorimetría diferencial de barrido Las propiedades térmicas de la formulación óptima de microcápsulas cargadas con RSV, microcápsulas blancas y RSV puro se estudiaron mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). Todos los termogramas fueron registrados por triplicado entre 25º C y 300º C, con una rampa de calentamiento de 10º C/min (DSC, Mettler-Toledo International, Columbus, OH, EE. UU). El equipo fue calibrado previamente utilizando indio como estándar. Los ensayos se realizaron en cápsulas de aluminio con tapa no hermética conteniendo entre 5 y 10 mg de microcápsulas secas. 4.2.7. Ensayo de fotodegradación Con el fin de evaluar la estabilidad del trans-RSV puro en presencia de radiación UV, así como la protección que le confiere su inclusión en las microcápsulas, las muestras fueron irradiadas en cubetas de cuarzo a una longitud de onda de 254 nm con una lámpara UV situada a 20 cm de distancia (Vilver Lourmat, VL-204G, Marne-la-Vallée, Francia). Para analizar la estabilidad de trans-RSV en forma pulverulenta, cantidades iguales de RSV puro y microencapsulado fueron irradiadas durante 3,2 h. A continuación, las muestras se diluyeron con etanol absoluto, se centrifugaron y se analizó la cantidad del trans-RSV en las mismas. La determinación analítica se llevó a cabo mediante espectrofotometría visible-UV (Evolution 60S, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU) a partir de una recta de calibrado en etanol en el rango 0,5 – 7 µg/ml (A307nm = 0,0024 + 0,1311·[RSV]; r2 =0,9999). La absortividad molar de trans-RSV disuelto en etanol absoluto fue de 29924 M−1·cm−1 (r2 = 0,9999). Complementariamente, se llevaron a cabo estudios de estabilidad de trans-RSV en disolución acuosa y en etanol absoluto. 4.2.8. Capacidad antioxidante La actividad antioxidante del RSV libre y microencapsulado se evaluó mediante un ensayo colorimétrico previamente descrito por Re et al. que se basa en la extinción del radical ABTS en presencia de antioxidantes, y su consecuente pérdida de color [24]. Para determinar la IVÁN LAMELA GÓMEZ 76 capacidad antioxidante del RSV, este se añadió a una disolución conteniendo el radical ABTS (ABTS●+) y tras 40 minutos se cuantificó espectrofotométricamente la cantidad remanente de ABTS●+ (λ = 730 nm). Puesto que la cantidad de ABTS●+ consumido es proporcional al porcentaje de disminución de la absorbancia de la solución, se obtuvieron las correspondientes rectas de calibración entre la concentración de antioxidante (RSV y Trolox) y el porcentaje de inhibición de la absorbancia a 730 nm. Para permitir una comparación estandarizada de los resultados obtenidos, la actividad antioxidante del RSV se expresó como Capacidad Antioxidante Equivalente de Trolox (TEAC), la cual puede definirse como los moles del estándar antioxidante Trolox (Ácido 3,4-dihidro-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-2H-1-benzopiran2-carboxílico) que producen el mismo porcentaje de extinción de ABTS●+ que 1 mol de RSV. Para generar el radical ABTS●+ se preparó una disolución acuosa 7 mM de ABTS (Ácido 2,2azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)) a la cual se añadió persulfato potásico 2,45 mM, dejando reaccionar la mezcla durante 16 horas en agitación constante y protegida de la luz. La disolución obtenida se diluyó con etanol absoluto hasta obtener una absorbancia de 0,80 ± 0,02. Para la realización del ensayo, 0,3 ml de muestra de Trolox, RSV libre y RSV microencapsulado se añadieron a 3,7 ml de ABTS●+, obteniendo entre un 20 y un 80% de reducción de la absorbancia (λ = 730 nm) con respecto al blanco una vez finalizada la reacción. El tiempo de incubación necesario para completar la reacción se fijó respectivamente en 2 y 40 minutos para Trolox y RSV. Todas las muestras se diluyeron con etanol absoluto. Para extraer el RSV microencapsulado, 15 mg de microcápsulas se suspendieron en 10 ml de etanol y se mantuvieron en agitación constante (750 r.p.m.) durante 1 hora. Las microcápsulas se aislaron por centrifugación a 6000 r.p.m. durante 5 minutos y a continuación, se realizó el ensayo ABST utilizando un rango de concentración de RSV comprendido entre 0,035 mM y 0,125 mM. Como control negativo se utilizaron microcápsulas blancas. 4.2.9. Liberación in vitro El perfil de liberación de trans-RSV a partir de las microcápsulas se obtuvo en diferentes condiciones de pH. Se pesaron 5 mg de microcápsulas y se suspendieron en 25 ml de solución tampón en viales de vidrio, incubándolos a 37º C y agitación suave durante 485 horas (Unimax 1010/Inkubator 1000; Heidolph Instruments, Schwabach, Alemania). Los ensayos de liberación se llevaron a cabo en tres condiciones de pH utilizando como medio de liberación tampón acetato 100 mM (pH 5) y tampón fosfato (PBS) 50 mM (pH 7,4 y pH 6,4). Los experimentos se realizaron por triplicado y en condiciones de oscuridad. En todo momento se mantuvieron condiciones sink. A intervalos prefijados de tiempo se tomaron muestras de 5 ml reponiendo el mismo volumen de medio de liberación. Como controles, se mantuvieron una solución patrón de trans-RSV (10 µg/ml) y una suspensión de micropartículas blancas en las mismas condiciones para evaluar en qué medida la degradación del polímero o del propio RSV podría interferir con la determinación analítica del RSV. Finalmente, las muestras se centrifugaron y la concentración de RSV fue cuantificada fluorimétricamente (λex = 334 nm; λem = 379 nm) de acuerdo con la siguiente recta de calibrado: (y = 0.0006 + 0,1353·[RSV], r2=0,9999). Complementariamente, se investigó la estabilidad del trans-RSV en los tres medios de liberación utilizados (pH 5, 6,4, y 7,4) y en condiciones de oscuridad. Para determinar la estabilidad del fármaco en disolución acuosa durante el ensayo de liberación, se registró el espectro UV de las disoluciones en el rango 200 – 400 nm a distintos tiempos. 4.Microencapsulación de moléculas antioxidantes | Resveratrol 77 4.2.10. Evaluación en cultivos celulares in vitro de macrófagos RAW 264.7 Para la realización de estos ensayos se adquirió la línea celular de macrófagos de ratón RAW 264.7 a ECACC (RAW 264.7; ECACC 91062702, Salisbury, Reino Unido). Los macrófagos se cultivaron en medio Eagle (modificación de Dulbecco; DMEM; Sigma Aldrich Química, Madrid, España) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de solución antibiótica compuesta por 10.000 unidades/ml de penicilina y 10.000 unidades/ml de estreptomicina (Chemicon international, Limburg, Alemania). Los cultivos se mantuvieron en un incubador a 37º C, un 5% de CO₂ y una humedad relativa del 95%. 4.2.10.1. Ensayos de citotoxicidad La biocompatibilidad de las microcápsulas se determinó mediante dos métodos comúnmente utilizados: el ensayo de proliferación celular basado en la metabolización de WST-1 y el ensayo de captación de rojo neutro. Para el ensayo WST-1, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos a una densidad de 15.000 células/pocillo, en DMEM suplementado con un 10% de FBS, y el cultivo se incubó durante la noche para facilitar la adherencia de los macrófagos. A continuación, las células fueron tratadas con 4 concentraciones de RSV (10, 30, 50 y 100 µM) y 2 concentraciones de microcápsulas blancas y conteniendo RSV (10 y 15 µg/pocillo). El ensayo se realizó por triplicado para cada tratamiento. Tras 24 horas de incubación, la proliferación celular se determinó usando el reactivo WST-1 (Roche Applied Bioscience, Madrid, España) siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. Para la realización del ensayo de captación de rojo neutro, los macrófagos se sembraron a una densidad de 10.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y el cultivo se incubó durante la noche previamente a la aplicación del tratamiento. Posteriormente a la incubación del cultivo con microcápsulas blancas, RSV libre y RSV microencapsulado durante 24 horas, la viabilidad celular fue determinada siguiendo una versión modificada del ensayo de captación de rojo neutro previamente descrito por Repetto et al. [25]. Para ello, se añadió al cultivo una disolución de rojo neutro 40 µg/ml en DMEM y este se incubó durante 2 horas para permitir la captación del colorante por parte de las células viables. Posteriormente, se retiró el medio con rojo neutro y tras una etapa de lavado con PBS, se añadió una solución de extracción compuesta por un 50% de etanol, un 49% de agua purificada y un 1% de ácido acético glaciar. La cantidad de rojo neutro extraída fue cuantificada espectrofotométricamente a 540 nm (Espectrofotómetro de placas Multiskan, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU), y el porcentaje de viabilidad celular fue calculado acorde a la recta de calibración incluida en cada experimento. 4.2.10.2. Producción de óxido nítrico Los niveles de óxido nítrico (NO) producidos por los macrófagos se determinaron de forma indirecta mediante la cuantificación de la cantidad de nitritos acumulados en el medio de cultivo. Tras la exposición de los cultivos a los tratamientos objeto de estudio, la cantidad de NO producida fue determinada mediante la reacción de Griess [26]. Para ello, se mezclaron volúmenes iguales de sobrenadante de cultivo celular y de reactivo de Griess (1% sulfanilamida, 0,1 % dihidrocloruro de N-(1-naftil)-etilendiamina, 2.5% H3PO4) y se dejaron reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia a 570 nm se midió en un lector de placas (Multiskan, Thermo Scientific) y la concentración de nitritos se determinó de acuerdo con una recta de calibrado de nitrito sódico. Una disolución stock de lipopolisacárido (LPS; 1 mg/ml) de E. coli serotipo 0111.B4 (Sigma Aldrich) en PBS (pH 7,4) fue preparada y conservada a -20 °C hasta su uso. Los macrófagos fueron incubados con LPS (0,5 µg/ml; IVÁN LAMELA GÓMEZ 78 control positivo), no tratados (control negativo) o preestimulados con LPS con anterioridad al tratamiento con RSV o micropartículas. Con el fin de evaluar el efecto del RSV sobre la producción de NO, se evaluaron varias concentraciones de RSV libre y microencapsulado (1, 10 y 50 µM). 4.2.10.3. Producción de especies reactivas de oxígeno La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) por los macrófagos RAW 264.7 se determinó mediante un ensayo fluorimétrico en microplacas basado en la oxidación del compuesto no fluorescente 3’,6’-diacetato de 2’,7’-diclorofluoresceína (DCFH-DA), que da lugar al compuesto altamente fluorescente 2’,7’- diclorofluoresceína. Para la realización del experimento, las células se cultivaron en medio sin rojo fenol, en placas negras de 96 pocillos con fondo plano, a una densidad de 25.000 células/pocillo y se incubaron durante la noche para permitir su adherencia. Posteriormente, las células fueron incubadas (5% CO₂, 37 °C) en presencia de una disolución de DCFH-DA 20 µM en PBS durante 45 minutos y posteriormente tratadas con RSV libre (1 – 30 µM), RSV microencapsulado (1 – 10 µM) y microcápsulas blancas (10 – 20 µg/pocillo). La producción de especies reactivas de oxígeno se calculó basándose en la acumulación de 2’, 7’-diclorofluoresceína, la cual se determinó en un fluorímetro de placas (Fluostar Optima, BMG Labtech, Ortenberg, Alemania) operado a una longitud de onda de excitación de 495 nm y una longitud de emisión de 529 nm. La producción de ROS tras la aplicación de los tratamientos investigados se expresó como el porcentaje de fluorescencia en relación con la señal obtenida para el control positivo de células estimuladas con Zymosan A (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich). Como control negativo se utilizaron células no tratadas. 4.2.10.4. Ensayo de fagocitosis La idoneidad de las microcápsulas para ser internalizadas por las células fagocíticas se evaluó en la línea de macrófagos murinos RAW 264.7. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos (5 x 105 células/pocillo) y fueron coincubadas con una suspensión 50 µg/ml de micropartículas (n = 6) en medio de cultivo con baja concentración de FBS. Tras 4 horas de incubación a 37º C en una atmósfera con un 5 % de CO₂ y un 95% de humedad relativa, se retiró el medio conteniendo las partículas no fagocitadas y los cultivos se fijaron con metanol y se tiñeron con Giemsa. Los cultivos teñidos se observaron al microscopio óptico y se tomaron 10 imágenes aleatorias de cada muestra a 200 y 400 aumentos utilizando una cámara CCD (DP71, Olympus Corp.). Los resultados se expresaron en términos de índice de fagocitosis, el cual se define como el porcentaje de células que han fagocitado al menos una micropartícula. Para el cálculo del índice de fagocitosis, fueron contadas 200 células de cada replicado. 4.2.10.5. Ensayo de peroxidación lipídica La capacidad antioxidante de las formulaciones de RSV en cultivo celular se evaluó mediante la determinación del nivel de sustancias reactivas al ácido barbitúrico (TBARS) siguiendo el método descrito por Vyncke [27]. Las células (2 x 106) se lavaron por duplicado con tampón de lisis (Tris-HCl, KCl; 150 mM) y posteriormente lisadas por tratamiento con ultrasonidos en un baño de hielo. Los lisados celulares se mezclaron con una disolución acuosa de ácido tricloroacético (TCA; 10%) y ácido tiobarbitúrico (0,6%) y la mezcla se mantuvo a 95º C durante 60 minutos. Tras centrifugar las muestras para eliminar los precipitados de proteína, el contenido en TBARS se determinó midiendo la absorbancia a 532 nm. Previamente se elaboró una recta de calibrado utilizando malonaldehido como estándar. Como control 4.Microencapsulación de moléculas antioxidantes | Resveratrol 79 positivo de estrés oxidativo, los macrófagos se incubaron en presencia de hidroperóxido de tertbutilo (tert-BHT) 100 µM y peróxido de hidrógeno 5 µM. La concentración de proteínas en los lisados celulares se determinó usando un ensayo BCA optimizado para microplacas. Para analizar el efecto del RSV libre y microencapsulado sobre la peroxidación lipídica, las células fueron pretratadas con inductores del estrés oxidativo (H2O2 e hidroperóxido de tertbutilo) y posteriormente, incubadas con los distintos tratamientos. La concentración de RSV empleada fue 10 µM tanto para el fármaco libre como microencapsulado. Los resultados se expresaron como concentración de malonaldehido por miligramo de proteína (nM/mg proteína). 4.2.11. Análisis estadístico Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados finales se expresaron como media aritmética ± desviación estándar de la media. El análisis de datos fue realizado con el paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI, v. 16.1.15 (StatPoint Technologies, Warrenton, EE. UU.). Las medias fueron comparadas mediante análisis de la varianza (ANOVA) de un factor, seguida de un análisis post-hoc mediante la prueba de Tukey-Kramer. El nivel de significación estadística fue fijado en un valor p≤0,05. 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.3.1. Diseño experimental Los rangos de trabajo para la preparación de las microcápsulas se fijaron, de acuerdo con el diseño experimental, en 3,58 – 6,41 Watios para la potencia (P) suministrada a la boquilla y en 0,08 – 2,91 % (p/p) para la concentración de polímero (%PCL). Todas las formulaciones incluidas en el diseño experimental fueron preparadas con éxito. Sin embargo, el empleo de valores de P o de concentraciones de polímero fuera de los límites en el diseño provocó, o bien la atomización incorrecta con goteo de la boquilla y/o el fracaso del proceso de microencapsulación, resultando en una precipitación completa de la PCL en el medio acuoso. La influencia de los parámetros experimentales (P y %PCL) sobre el diámetro medio de partícula (d(v, 0.5)) se avaluó mediante regresión lineal múltiple (Ecuación (4-2)) y tecnología de superficie de respuesta. En base a los resultados obtenidos, se seleccionó la formulación óptima en términos de tamaño de partícula. 𝐷𝐷𝐷𝐷á𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑚𝑚𝑚𝑚𝑑𝑑𝐷𝐷𝑚𝑚=−7,59378 + 2,64044 ∙𝑃𝑃+10,6761 ∙%𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 (4-2) De acuerdo con los resultados del análisis de la varianza (ANOVA) se puede inferir, con un nivel de confianza del 97 % (p = 0,0128), que existe una relación estadísticamente significativa entre los factores experimentales (P y %PCL) y el diámetro medio de las microcápsulas. Sin embargo, según el modelo de regresión ajustado, solo el 58% (r2 = 0,5817) de la variabilidad en el tamaño de partícula puede ser explicado por cambios en la concentración de polímero y la potencia suministrada a la boquilla. Como podemos observar en la ecuación del modelo, el tamaño del efecto de la concentración de PCL es significativamente mayor que el de la potencia suministrada para la generación del spray, siendo por tanto la concentración polimérica un factor determinante para el tamaño de partícula obtenido (Figura 4-2). En cuanto a la optimización de una formulación final, a la vista de los resultados previamente descritos y a los IVÁN LAMELA GÓMEZ 86 La isomerización y la degradación de la forma trans-RSV a cis-RSV en disoluciones de transRSV, tanto en etanol como en PBS y que fueron irradiadas con luz UV aparecen representadas en la Figura 4-5. Se pudo observar una absorbancia secundaria máxima para ambas formas isoméricas. De forma más concreta, en las disoluciones de etanol, el porcentaje de cada isómero descendió un 50% después de 4 h de exposición. Teniendo en consideración la estabilidad del RSV en disoluciones acuosas protegidas de la luz, se pudo comprobar como la degradación del trans-RSV se ve claramente afectada por el nivel de pH de la disolución (Figura 4-7). Como comparativa, los resultados indicaron que el trans-RSV sufrió una rápida isomerización en PBS (PH 7,4), muestras que fueron expuestas a la luz UV (Figura 4-5b), al contrario que las muestras de la misma concentración que si fueron protegidas de la luz (Figura 4-7). Además, la isomerización desde la forma -trans a la -cis siguió una cinética lineal de orden uno (y = −0,0856X + 1,013; r2 = 0,9975), tal y como se pudo comprobar a partir las concentraciones de RSV determinadas en función de los tiempos de exposición. Como se pudo observar, tras la irradiación con luz UV, apareció un producto de degradación a 260 nm (Figura 4-5a), lo que indicaría que tiene lugar un proceso de fotodescomposición de la molécula de RSV. La estabilidad del trans-RSV en disolución acuosa y en oscuridad se investigó en distintas condiciones de pH con el fin de profundizar en el estudio de la estabilidad de RSV en condiciones fisiológicas y en las condiciones en que se llevaron a cabo los ensayos de liberación in vitro. En consonancia con los resultados obtenidos por otros autores, se confirmó que el RSV puede mantenerse de manera estable a tiempos mucho más largos a pH más bajos (6,4 y 5) y en condiciones de oscuridad (Figura 4-7b y c). De hecho, la estabilidad de la molécula del RSV en disoluciones a pH 5 se mantuvo durante al menos 312h. Muchos de los resultados de nuestro trabajo son coincidentes con otro estudio publicado de manera paralela a este, donde se estudió de forma más profunda las cinéticas de degradación del RSV en disoluciones acuosas, en función de la temperatura y del nivel de pH [8]. En conclusión, y a la vista de los resultados obtenidos, podemos afirmar que la estabilidad física y estructural de las microcápsulas preparadas en este trabajo, no solo proporcionaron estabilidad química al RSV, sino que, además, permitieron preservar las propiedades biológicas del transRSV encapsulado. 4.3.7. Actividad antioxidante En este trabajo, se estudió la encapsulación de RSV en microcápsulas poliméricas como alternativa para proteger al fármaco frente a la degradación (estabilidad química) y, como consecuencia, preservar su actividad antioxidante. El ensayo ABTS se utilizó para determinar la capacidad de RSV para neutralizar el exceso de producción de especies reactivas de oxígeno, el cual se asocia con una exacerbación del proceso inflamatorio en algunas enfermedades inflamatorias como la AR. Para cuantificar la actividad antioxidante del RSV, en primer lugar se prepararon las correspondientes rectas de calibrado para establecer la relación lineal entre el porcentaje de reducción del radical catiónico ABTS●+ y la concentración de trolox (estándar antioxidante) y RSV (libre y microencapsulado). La relación existente entre la concentración de trans-RSV libre y el porcentaje de ABTS●+ reducido se estableció mediante regresión lineal en el rango 0,04 – 0.90 mM: y = 0,2321 + 4,778·[RSVlibre] (R2 = 0,9972). Para el cálculo de la actividad antioxidante equivalente de trolox (TEAC) se construyó una recta de calibrado entre la concentración de trolox (0,07 – 0,45 mM) y el porcentaje de ABST reducido, obteniéndose la 4.Microencapsulación de moléculas antioxidantes | Resveratrol 87 siguiente recta de calibrado: y = 0,0387 + 1,7741·[Trolox] (R2 = 0.9978). Para determinar la actividad antioxidante del RSV encapsulado, análogamente a lo anteriormente descrito, se construyó la correspondiente recta de calibrado utilizando el fármaco extraído de las microcápsulas en el intervalo lineal 0,035 – 0,125 mM (y = 0.,783 + 3,5426·[RSVencapsulado]; R2 = 0.9922). Los resultados de actividad antioxidante del RSV libre y microencapsulado se expresaron en TEAC con el fin de estandarizarlos y permitir su comparación. Para ello se construyeron dos curvas de respuesta relacionando las concentraciones (mM) de RSV (libre y microencapsulado) y trolox que producen un mismo porcentaje de reducción del catión ABTS, obteniendo en ambos casos una relación lineal descrita por las siguientes ecuaciones: [Trolox] = 0,109 + 2,5243·[RSVlibre] (R2=0,9971) y [Trolox] = 0,135 + 2,0694·[RSVencapsulado] (R2 = 0,9922). Esta relación lineal nos permitió calcular la capacidad antioxidante expresada en TEAC, siendo esta la concentración de trolox necesaria para producir el mismo porcentaje de reducción de ABTS●+ que 1 mM de RSV. Los resultados obtenidos confirmaron la ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre la actividad antioxidante del RSV libre y microencapsulado, siendo respectivamente, de 2,54 y 2,07 equivalentes de trolox o TEAC. La relación lineal establecida entre la concentración y la actividad antioxidante del RSV, en comparación con trolox, evidencia la buena linealidad del método. Pese a que no se encontraron diferencias significativas en la actividad antioxidante del RSV libre y microencapsulado, los valores de TEAC obtenidos indicaron que el RSV extraído de las microcápsulas retuvo un 82,14 % de su capacidad antioxidante, en comparación con el RSV libre. La diferencia observada podría deberse a diversos factores como una extracción incompleta del RSV a partir de las microcápsulas, o probablemente, a la degradación o isomerización de un pequeño porcentaje del fármaco durante el proceso de extracción. La potencial actividad antioxidante del cis-RSV y otros productos de degradación, en comparación a la capacidad antioxidante del trans-RSV no está todavía completamente esclarecida. Los resultados obtenidos nos permiten concluir que la microencapsulación preservó la actividad antioxidante del trans-RSV y además, demuestran el potencial terapéutico de las microcápsulas de PCL cargadas con RSV en el control del daño oxidativo producido por las ROS en las enfermedades inflamatorias articulares como la AR. 4.3.8. Perfil de liberación in vitro Los ensayos de liberación in vitro de RSV se realizaron a tres valores de pH (5; 6,4 y 7,4). Sin embargo, sólo se presentan los datos correspondientes al perfil de liberación a pH 5 debido a la inestabilidad de trans-RSV a pH 6,4 y 7,4, tal y como quedó demostrado a través de los resultados de los ensayos de estabilidad realizados en estas condiciones (Sección 4.3.6). De hecho, a pH 7,4 se observó una degradación constante del trans-RSV a medida que este fue liberado a partir de las microcápsulas. El perfil de liberación del RSV a pH 5 (Figura 4-8) se caracterizó por una liberación inicial del 55% de la carga de fármaco durante los primeros 90 minutos, seguida de una liberación controlada de RSV que se prolongó hasta que se detectaron los primeros signos de degradación una vez transcurridas 485 h desde el comienzo del ensayo. En ese momento, ya se había liberado más del 80 % del contenido total de RSV en las microcápsulas. A la vista de estos resultados podemos estimar que, durante los experimentos en cultivos celulares in vitro, aproximadamente un 68 % de la carga de RSV se liberó en las primeras 24 h. Sin embargo, debido al complejo comportamiento del RSV a pH fisiológico y en presencia de las proteínas séricas del medio de IVÁN LAMELA GÓMEZ 88 cultivo, resulta complicado determinar cuál sería la exposición real de los macrófagos al RSV durante los ensayos en cultivo celular. Por último, los datos experimentales obtenidos tras la liberación se ajustaron a los principales modelos cinéticos de liberación de fármacos con el fin de esclarecer los mecanismos implicados en la liberación de RSV a partir de las microcápsulas. El mejor ajuste se obtuvo para el modelo de Korsmeyer-Peppas (Q=k·tn), en el cual “Q” representa el porcentaje de fármaco liberado cada tiempo (t), “k” es una constante que depende de las características estructurales del sistema de liberación y “n” es un parámetro característico cuyo valor es indicativo del mecanismo de liberación predominante [34]. El análisis de la varianza (ANOVA) concluyó que el ajuste al modelo cinético de liberación fue estadísticamente significativo (p < 0,05), mostrando una buena bondad de ajuste a los datos experimentales (R2 =0,9992). El exponente “n” de la ecuación ajustada para el modelo cinético (Q = 0,52254·t0,09576) sugiere que el mecanismo predominante en la liberación del RSV es la difusión a través de la cubierta de las microcápsulas, la cual comienza en el momento en que la formulación entra en contacto con el medio de liberación. Una vez cesa la liberación inicial de las moléculas de RSV localizadas en capas más accesibles para el medio de liberación, se produce un descenso de la velocidad de liberación como consecuencia de la baja velocidad de degradación de la matriz polimérica [35,36]. 4.3.9. Biocompatibilidad Con el fin de evaluar el efecto del RSV, tanto libre como microencapsulado, y de las microcápsulas blancas sobre la proliferación celular de los macrófagos RAW 264.7, se realizó un ensayo basado en la metabolización de la sal de tetrazolio WST-1 por parte de las células viables. Los resultados demostraron que tras 24 horas de coincubación con microcápsulas blancas, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en términos de viabilidad celular con respecto a las células no tratadas, obteniendo porcentajes de viabilidad elevados (95 – 100 %) incluso con la máxima concentración investigada de partículas (Figura 4-9a). Sin embargo, cuando las células se coincubaron con RSV libre y microencapsulado, se observó una reducción dosis-dependiente de la viabilidad celular, sugiriendo que el RSV tiene un efecto antiproliferativo sobre los macrófagos de ratón cuando se utiliza a dosis altas, llegando a reducir Figura 4-8. Perfil de liberación de RSV a pH 5, 37 ºC y en condiciones de oscuridad. 050 100 150 200 250 300 350 400 0 20 40 60 80 Tiempo (horas) Tiempo (horas) 4.Microencapsulación de moléculas antioxidantes | Resveratrol 89 los niveles de viabilidad en un 45% en comparación con el control no tratado. Estos resultados coinciden con el efecto inhibitorio del RSV que ha sido descrito previamente por otros autores en varios tipos celulares [37-39]. No obstante, otros estudios realizados en líneas celulares de macrófagos y utilizando concentraciones de RSV en rangos similares (10, 50, 100 µM) no mostraron influencia del RSV sobre la viabilidad celular [40,41]. Para contrastar los resultados obtenidos y profundizar el impacto del RSV sobre la proliferación celular, se realizó un ensayo de viabilidad basado en la captación de neutral red, obteniendo resultados similares tras el tratamiento con trans-RSV (Figura 4-9b). Se observó un elevado porcentaje de viabilidad (próximo al 100 %) tras la coincubación de los macrófagos con microcápsulas conteniendo RSV, lo que confirmó que la mayoría de las células permanecían viables tras el tratamiento. A la hora de interpretar los distintos resultados presentes en la bibliografía, debemos tener en cuenta que en cada laboratorio se utilizaron ensayos de viabilidad diferentes, lo que podría justificar los resultados contradictorios han sido publicados en lo relativo a la toxicidad celular del RSV [42]. En resumen, teniendo en cuenta la cantidad de RSV presente en las microcápsulas (carga de fármaco = 32 mg/ml microcápsulas), podemos Ctrl + (células sin tto) Ctrl - (10% SDS) RSV (10 µM) RSV (30 µM) RSV (50 µM) RSV (100 µM) MCs blancas (100 µg/mL) MCs blancas (150 µg/mL) RSV_MCs (1,4 µM) RSV_MCs (13,9 µM) RSV_MCs (20,8 µM ) 0 20 40 60 80 100 120 Viabilidad celular (%) a Ctrl + (células sin tto.) Ctrl - (10% SDS) RSV (10 µM) RSV (50 µM) MCs Blancas (100 µg/mL) MCs Blancas (150 µg/mL) RSV_MCs (13,9 µM RSV) RSV_MCs (20,8 µM RSV) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Viabilidad celular (%) b Figura 4-9. Porcentaje de viabilidad de los macrófagos tras 24 h de incubación con varias concentraciones de RSV libre, mic rocápsulas blancas y microcápsulas cargadas con RSV. (a) Ensayo WST1 y (b) Ensayo de captación de Rojo Neutro . IVÁN LAMELA GÓMEZ 90 concluir que la microencapsulación confiere cierto grado de protección frente a la citotoxicidad del RSV. No obstante, es necesaria la realización de estudios adicionales, puesto que debe tenerse en consideración que el RSV, al igual que otros polifenoles, puede acomplejarse con algunas proteínas presentes en el medio de cultivo como la BSA. Por tanto, la concentración real de RSV en el medio de cultivo durante la realización de los experimentos no se pudo determinar con exactitud. 4.3.10. Producción de óxido nítrico El óxido nítrico (NO) es una de las principales moléculas considerada como marcador de estrés oxidativo, puesto que contribuye significativamente al desarrollo y mantenimiento de la inflamación [43]. El RSV es conocido por su actividad antiinflamatoria y, de hecho, se ha demostrado su participación en varias vías de señalización celular implicadas en los procesos inflamatorios, como la ruta de la óxido nítrico sintetasa [44,45]. Teniendo en cuenta estas evidencias, una estrategia con potencial para retardar la progresión de la inflamación crónica podría ser la reducción del número de macrófagos activados, con el fin de inhibir la cascada inflamatoria inducida por la producción de señalizadores celulares proinflamatorios (NO, citoquinas, prostaglandinas, etc…). La producción de NO se determinó tras incubar el cultivo durante 24h con RSV libre, RSV microencapsulado y microcápsulas blancas durante 24 horas. Los ensayos se llevaron a cabo tanto, en presencia como en ausencia de LPS (0,5 µg/ml). La producción de NO fue calculada en base a la determinación, mediante la reacción de Griess, de la concentración de nitritos en el sobrenadante del cultivo tras 24 h de incubación. El tratamiento con RSV (10 – 100 µM) y microcápsulas blancas, en ausencia de LPS, no dio lugar a diferencias estadísticamente significativas en la producción de nitritos con respecto a la producción basal de los macrófagos no tratados (resultados no presentados). Los experimentos descritos a continuación fueron realizados en macrófagos estimulados con LPS 0.5 µg/ml. Como control negativo se utilizó LNAME (1mM), el cual inhibe la óxido nítrico sintasa y consecuentemente, la producción de NO. Los resultados presentados en la Figura 4-10 evidencian una reducción significativa de la Ctrl + (LPS) Ctrl - (células sin tto) L-NAME RSV (1 µM) RSV (10 µM) RSV (50 µM) RSV_ MCs (1 µM RSV) RSV_ MCs (10 µM RSV) RSV_ MCs (50 µM RSV) 0 5 10 15 20 25 30 35 Producción de NO ( µM ) Figura 4-10. Producción de NO en macrófagos RAW 264.7 preestimulados con LPS 0,5 mg/ml tras 24 horas de incubación con RSV libre y microencapsulado. El nivel de producción de NO se expresó en base a la concentración de nitritos (µM) en e l sobrenadante del cultivo. 4.Microencapsulación de moléculas antioxidantes | Resveratrol 91 producción de NO tras el tratamiento con RSV libre. No obstante, debe tenerse en cuenta que parte de ese efecto dependiente de la dosis puede deberse a la posible toxicidad de RSV a concentraciones superiores a 50 µM, de conformidad con los resultados obtenidos en el ensayo de citotoxicidad celular WST-1 (Sección 4.3.9). Este efecto también se observó tras la incubación de los macrófagos con RSV microencapsulado, excepto cuando se utilizó la menor dosis objeto de investigación (1 µM). La incubación de los macrófagos en presencia de microcápsulas blancas no modificó la producción de NO, obteniéndose valores comparables a los del control positivo. Esto sugiere que la reducción en los niveles de nitrito se debió principalmente al efecto del RSV contenido en las microcápsulas, el cual podría ejercer su acción desde el medio extracelular, o bien a nivel intracelular, tras la fagocitosis de las partículas. Los resultados obtenidos están en consonancia con los publicados previamente por otros autores, los cuales confirmaron la reducción de la producción de NO tras el tratamiento con RSV [46-49] e incluso, la reducción de la expresión de óxido nítrico sintasa (iNOs) a nivel citosólico [41,46,50,51]. 4.3.11. Producción de especies reactivas de oxígeno Las especies reactivas de oxígeno (ROS), cuando se producen a niveles fisiológicos, tienen una función clave como moléculas de señalización implicadas en numerosas funciones celulares entre las que se incluyen la fagocitosis, la apoptosis, la proliferación celular, o los procesos de señalización redox. Sin embargo, cuando se produce una sobreproducción de ROS, y el consecuente aumento de su concentración a nivel intracelular, se da una situación que se conoce como estrés oxidativo y que se caracteriza por el daño celular que provocan las elevadas concentraciones de radicales libres, el cual puede desembocar en muerte celular. La producción de ROS en respuesta a estímulos como la fagocitosis, está relacionada con el daño tisular asociado a algunas enfermedades inflamatorias. Concretamente, está ampliamente aceptado que el estrés oxidativo es un factor fundamental en la patogénesis de enfermedades como la AR, las cuales se caracterizan por una inflamación crónica a nivel articular [2,52,53]. Con el fin de profundizar en la respuesta in vitro de los macrófagos a los tratamientos objeto de investigación, se determinó la producción de ROS tras la estimulación de las células con zymosan A (control positivo), RSV libre, microcápsulas conteniendo RSV y microcápsulas blancas. La generación de ROS se cuantificó utilizando un método fluorimétrico basado en la oxidación de DCFH-DA, dando lugar a la molécula altamente fluorescente DCF. Los resultados de producción de ROS se expresaron como porcentaje de fluorescencia con respecto a la señal de las células tratadas con zymosan A (control positivo). Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 4-11. La coincubación de los macrófagos con partículas blancas, RSV libre o RSV microencapsulado no provocó un incremento en la producción de ROS con respecto al nivel de producción basal observado para las células en ausencia de tratamiento (control negativo). Sin embargo, las células estimuladas con zymosan A produjeron niveles de ROS muy elevados, los cuales disminuyeron de forma dependiente de la dosis tras la exposición de las células al RSV libre. No obstante, debe tenerse en cuenta la posible citotoxicidad del máximo nivel de dosis incluido en los experimentos. Tras la coincubación de los macrófagos con microcápsulas blancas también se observó una reducción en los niveles de ROS, aunque esta fue más pronunciada tras la incubación con microcápsulas cargadas con RSV, observándose de nuevo un efecto dosisdependiente (Figura 4-11). Para facilitar la comparación del efecto producido por RSV libre y IVÁN LAMELA GÓMEZ 92 microencapsulado, en esta serie de experimentos se ensayaron las mismas cantidades de RSV para ambas muestras. Sin embargo, en las células tratadas con RSV libre se observó una mayor reducción de los niveles de ROS que en aquellas tratadas con la misma cantidad de RSV microencapsulado, lo que sugiere una menor biodisponibilidad del RSV incluido en las microcápsulas, posiblemente, como consecuencia de su liberación prolongada en el tiempo. Los resultados también mostraron entorno a un 25 % de reducción en la producción de ROS tras la exposición de las células a microcápsulas blancas. A pesar de que la causa de este efecto no ha podido ser dilucidada por el momento, podría deberse a la existencia de una interferencia analítica, puesto que las concentraciones de microcápsulas empleadas en los experimentos no eran citotóxicas. En resumen, en este trabajo los resultados demostraron una disminución en la producción de ROS tras la incubación de las células con microcápsulas conteniendo RSV, lo que confirmó que el RSV mantuvo su actividad como antioxidante e inhibidor de la producción de ROS una vez microencapsulado. Estos resultados vienen a confirmar la capacidad del RSV para reducir la concentración de ROS y los niveles de estrés oxidativo, en consonancia con los datos publicados previamente por otros autores [47,54]. 4.3.12. Fagocitosis Para investigar la actividad fagocítica de los macrófagos en presencia de microcápsulas blancas y cargadas con RSV se determinó el índice de fagocitosis (PI), es decir, el porcentaje de células que fagocitaron al menos una partícula. Los resultados demostraron la existencia de un efecto estadísticamente significativo del RSV sobre la actividad fagocítica, puesto que los macrófagos mostraron una actividad atenuada frente a las microcápsulas blancas (PI = 19,3 ± 3,5 %), en comparación con el elevado PI obtenido para las formulaciones cargadas con RSV (99,1 ± 2,4 %) (Figura 4-12). Es importante tener en cuenta que estos experimentos se realizaron en ausencia de estimulación con LPS, lo que podría justificar el bajo índice de fagocitosis observado para las microcápsulas blancas. Además, para esclarecer el mecanismo responsable del efecto del RSV sobre la capacidad fagocítica de los macrófagos, sería necesaria la Figura 4-11. Efecto del RSV libre y microencapsulado sobre la producción de ROS en macrófagos activados con zymosan A . Ctrl - (células sin tto.) Ctrl + (Zymosan A) RSV (1 µM) RSV (5 µM) RSV (10 µM) RSV (30 µM) MCs_Blancas (10 µg) MCs_Blancas (20 µg) MCs_RSV (1 µM RSV) MCs_RSV (10 µM RSV) 0 20 40 60 80 100 120 Porcentaje de ROS respecto al control + 4.Microencapsulación de moléculas antioxidantes | Resveratrol 93 realización de estudios adicionales. Una hipótesis que podría justificar este comportamiento sería que el RSV presenta cierta actividad como inmunomodulador, ejerciendo su acción en direcciones opuestas en función de la dosis, ya que es capaz de activar el sistema inmune a dosis bajas mientras que promueve su inhibición a dosis elevadas [55-57]. Otra hipótesis probable es que dependa del mecanismo de acción a través del cual el RSV ejerce su acción. De hecho, los ensayos de fagocitosis se realizaron con 4 h de incubación, mientras que, en los experimentos encaminados a determinar la producción de NO y ROS, los tratamientos se coincubaron durante 24 h con los macrófagos. Durante las 4 h de duración del ensayo de fagocitosis, podemos estimar que se liberó aproximadamente un 55 % del RSV contenido en las microcápsulas (en base a los resultados del ensayo de liberación; sección 4.3.8). Teniendo en cuenta esta estimación, es lógico especular que pudo tratarse de una dosis demasiado baja como para modificar la respuesta celular en un periodo de tiempo tan breve, pero suficiente para observar los primeros signos de activación celular en respuesta a la fagocitosis. 4.3.13. Peroxidación lipídica en cultivo celular Con el fin de determinar el impacto del RSV, incluido o no en las microcápsulas en la protección frente a la peroxidación lipídica de la membrana celular de los macrófagos RAW 264.7, se investigaron los niveles de peroxidación lipídica, en presencia o ausencia de tratamiento con RSV. Estos ensayos se llevaron a cabo mediante la exposición de las células a moléculas prooxidantes con actividad inductora de la peroxidación lipídica (tert-BHT y H2O2). El malonaldehido (MDA) es un aldehído que se genera como producto final de la peroxidación lipídica, motivo por el cual ha sido ampliamente utilizado como biomarcador de peroxidación lipídica mediante su detección a través de su reacción con el ácido tiobarbitúrico (TBA). En este estudio, la cantidad de MDA en las muestras de cultivo celular se determinó utilizando el ensayo de determinación de sustancias reactivas al ácido barbitúrico (TBARS). En un entorno in vivo, una producción excesiva de MDA puede dar lugar a su reacción con proteínas, RNA y DNA, generando aductos. Estas alteraciones inducidas por el MDA se han asociado con diferentes daños a nivel molecular [58], siendo además, altamente inmunogénicos [59]. En los experimentos realizados en este trabajo, las sustancias oxidantes utilizadas como control positivo atacaron los ácidos grasos poliinsaturados presentes en la membrana celular, inhibiendo su funcionalidad (peroxidación lipídica). En respuesta a altos niveles de peroxidación lipídica de la membrana celular, las células tratan de sobrevivir mediante la activación de diversos mecanismos de defensa celular, que incluyen desde un incremento en la producción de proteínas antioxidante hasta, en el caso de que el daño oxidativo supere la a b Figura 4-12. Microcápsulas blancas (a) y cargadas con RSV (b) fagocitadas por los macrófagos. IVÁN LAMELA GÓMEZ 94 capacidad de los mecanismos de reparación celular, la inducción de apoptosis. Adicionalmente, los niveles de peroxidación lipídica pueden ser utilizados como marcador de daño celular inducido por radicales libres en enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide [12]. En el ensayo de peroxidación lipídica realizado en macrófagos se observó un elevado contenido en TBARS en las células expuestas a H2O2 y t-BHT, el cual disminuyó significativamente tras la incubación con RSV 10 µM, sugiriendo una disminución de la peroxidación lipídica en respuesta al tratamiento con RSV (Figura 4-13). La incubación de las células con microcápsulas, cargadas con la misma cantidad de RSV utilizada en los experimentos realizados con RSV libre, también dio lugar a una disminución significativa de los niveles de TBARS, aunque los valores obtenidos fueron mayores que los detectados en presencia de RSV libre o trolox (una molécula con elevado poder antioxidante). El estrés oxidativo incontrolado a nivel celular provoca un daño directo sobre los lípidos. Por otra parte, los altos niveles de radicales libres o especies reactivas de oxígeno (ROS) son producidos por las mitocondrias, el retículo endoplasmático, la membrana plasmática o los peroxisomas como respuesta a la exposición a diferentes situaciones de estrés o a estímulos exógenos como infecciones, toxinas, principios activos o formulaciones farmacéuticas. En base a los resultados obtenidos, podemos concluir que el RSV, tanto libre como encapsulado, ejerce una acción inhibidora de la peroxidación lipídica en las condiciones experimentales utilizadas en los ensayos. Sin embargo, es importante destacar que los niveles de MDA se determinaron mediante el ensayo TBARS, el cual es muy sensible a las variaciones en las condiciones de reacción que pueden tener entre laboratorios. Por tanto, la comparación directa de los datos publicados por distintos investigadores es compleja. Aun así, los resultados obtenidos están en consonancia con los presentes en la bibliografía, puesto que el RSV ha demostrado inhibir la peroxidación lipídica tanto in vivo [60], lo que puede ser explicado por varios mecanismos, como en cultivos celulares in vitro [60,61]. H2O2 Ctrl - (células sin tto) H2O2 (5 mM) t-BHT (100 µM) RSV H2O2_RSV t-BHT_RSV H2O2_RSV_MCs BHT_RSV_MCs t-BHT_Trolox (10 µM) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 TBARS (nmol/mg proteina) Figura 4-13. Efecto del RSV libre y microencapsulado sobre el nivel de peroxidación lipídica (TBARS) inducida por H 2O2 y t-BHT en macrófagos RAW 264.7 4.Microencapsulación de moléculas antioxidantes | Resveratrol 95 4.4. CONCLUSIONES En el presente capítulo se prepararon de forma satisfactoria microcápsulas poliméricas de PCL conteniendo RSV mediante la técnica de atomización por ultrasonidos. Las formulaciones obtenidas presentaron una morfología y distribución de tamaño de partícula adecuadas para su administración local vía intraarticular, y se demostró que la microencapsulación preservó la estabilidad y las propiedades antioxidantes del RSV. Los ensayos in vitro realizados en cultivos celulares en macrófagos de ratón, activados con LPS, confirmaron la biocompatibilidad de las microcápsulas y demostraron su eficacia en el control de los principales signos de la inflamación y estrés oxidativo, uno de los principales factores en las patologías inflamatorias que cursan con inflamación y destrucción articular. A pesar de que se obtuvieron resultados prometedores que demuestran el potencial de las microcápsulas de RSV en el tratamiento de enfermedades inflamatorias en la cuales el estrés oxidativo juega en papel relevante, se haría necesaria la realización de futuros estudios encaminados a investigar la eficacia clínica de las formulaciones desarrolladas y especialmente, a estandarizar la dosis de RSV. Aunque la magnitud del efecto terapéutico del RSV pueda ser significativamente menor que la de otros fármacos utilizados habitualmente en el tratamiento de la AR y otras enfermedades reumáticas, los resultados obtenidos in vitro, en macrófagos, sugieren que las microcápsulas de RSV ejercen un efecto antiinflamatorio que por sí solas, o en combinación con la terapia farmacológica habitual, podrían reducir la inflamación y retardar la progresión de la destrucción articular. Asimismo, uno de los objetivos de este trabajo era obtener formulaciones capaces de mantener concentraciones terapéuticas del RSV durante un tiempo prolongado. Así, los resultados de este estudio han aportado información adicional sobre el desarrollo de microcápsulas destinadas a su administración local en la cavidad sinovial, a través de inyección intraarticular. Por último, y con vistas a una posible aplicación clínica, se hace necesaria la realización de estudios posteriores in vivo en un modelo animal de AR con el fin de investigar los posibles beneficios de una administración a nivel local, el consecuente aumento de la biodisponibilidad de la molécula antioxidante en los tejidos articulares inflamados y, por tanto, la reducción de la frecuencia de administración con la consiguiente mejora en la calidad de vida de estos pacientes. 5. Microencapsulación de glucocorticoides | Betametasona 103 5.1. INTRODUCCIÓN La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria crónica, de carácter sistémico, que cursa con inflamación e hiperplasia de la membrana sinovial de las articulaciones diartrodiales, la cual se convierte en un tejido altamente destructivo (pannus) que termina por causar la destrucción articular [1,2]. Su tratamiento habitualmente implica la administración sistémica de uno o varios fármacos modificadores de la enfermedad (DMARDs) destinados a frenar la progresión de la enfermedad, así como glucocorticoides y AINEs para reducir la inflamación y sintomatología de la enfermedad [3-5]. A pesar de que, hoy en día, en la mayor parte de los pacientes se logra alcanzar el objetivo de baja actividad de la enfermedad mediante una terapia con DMARDs, en la práctica clínica es frecuente tener que recurrir a la administración intraarticular de glucocorticoides para controlar la artralgia e inflamación articular en situaciones que dan lugar a una afectación de articulaciones localizadas y accesibles para ser infiltradas. Entre este amplio abanico de situaciones que requieren un tratamiento intraarticular local se incluyen, entre otras, la etapa inicial previa al control de la enfermedad, los brotes que cursan con una exacerbación del proceso inflamatorio en articulaciones concretas, el tratamiento de variantes de AR que cursan inicialmente con una afectación severa de articulaciones grandes (rodilla, codo, cadera), o el tratamiento de articulaciones que permanecen activas incluso tras el control sistémico de la enfermedad [4,6-9]. El abordaje de estas situaciones desde el punto de vista de un tratamiento local a nivel intraarticular presenta numerosas ventajas, entre las que destaca la posibilidad de obtener de forma inmediata concentraciones mayores de fármaco en el lugar de inflamación, dando lugar a un incremento de la eficacia terapéutica y una disminución de los efectos adversos sistémicos [10-12]. Sin embargo, la administración intraarticular de fármacos, y en especial de glucocorticoides, está limitada por su rápido aclaramiento del espacio articular. Este aclaramiento, que se ve favorecido por la mayor permeabilidad de la articulación inflamada, resulta en una absorción del fármaco hacia la circulación general, y por tanto en la posibilidad de efectos adversos a nivel sistémico, así como en la necesidad de realizar inyecciones frecuentes para lograr mantener niveles terapéuticos de fármaco a nivel articular de forma sostenida en el tiempo [13-17]. Esto impide el uso de la vía intraarticular a largo plazo, puesto que el número de infiltraciones que se pueden realizar en una misma articulación es limitado, aunque no existe un consenso acerca del intervalo mínimo entre dos administraciones [7,10]. De forma orientativa, la guía de práctica clínica de la sociedad española de reumatología no recomienda más de 3-4 infiltraciones en una misma articulación en un periodo corto de tiempo, con un intervalo mínimo de 3-4 semanas entre administraciones [4]. En el manejo clínico habitual de la AR, los glucocorticoides suelen ser los fármacos de elección para la infiltración articular por su elevada potencia antiinflamatoria y efecto inmunosupresor, que resulta en un alivio sintomático prácticamente inmediato. Para paliar en la medida de lo posible su bajo tiempo de residencia en la cavidad articular, se recurre a suspensiones de glucocorticoides con muy baja solubilidad en agua, que se conocen en la jerga clínica como formulaciones “Depot”, pese a que estas no constituyen un sistema de liberación modificada de fármacos, sino simplemente una suspensión acuosa de un fármaco prácticamente insoluble en agua. Así mismo, se utilizan frecuentemente formulaciones que combinan una baja concentración de un derivado hidrosoluble con una suspensión de un derivado insoluble de un mismo fármaco. Entre los corticoides más utilizados a nivel articular se encuentran el acetónido de triamcinolona (Triesence®, Trigon Depot®), hexacetónido de triamcinolona* (Bluxam®), el acetato de parametasona* (Cortidene Depot®), acetato de metilprednisolona* (Depo-Medrol®), IVÁN LAMELA GÓMEZ 104 así como las combinaciones de fosfato sódico de betametasona/acetato de betametasona (Celestone-Cronodose®) y fosfato sódico de betametasona/ dipropionato de betametasona (Diprospan®), de la cuales las señaladas con (*) no se encuentran actualmente comercializadas en España. Además, en el caso de articulaciones pequeñas, se recurre excepcionalmente a fármacos ligeramente más hidrosolubles como betametasona o metilprednisolona [4,11,18-21]. Las limitaciones existentes en la actualidad para poder realizar un tratamiento intraarticular de forma prolongada en el tiempo, así como la necesidad de mejorar la eficacia y reducir los efectos adversos sistémicos asociados a los corticoides ha estimulado el desarrollo de sistemas de liberación modificada de fármacos que permitan superar dichas limitaciones [10,17,22,23]. La microencapsulación se presenta como una alternativa excelente para dar respuesta a las limitaciones de la administración intraarticular de glucocorticoides, ya que nos permite obtener un perfil de liberación sostenida del fármaco y, además, se ha demostrado en modelos animales de AR in vivo que las micropartículas pueden ser retenidas en la articulación inflamada, existiendo una relación dependiente del tamaño, de modo tal que se logró una retención efectiva para las partículas mayores de 10 µm [24-26]. Además, la obtención de partículas esféricas de un rango de tamaño fagocitable, nos permitiría dirigir el fármaco a los macrófagos, los cuales han sido identificados como el principal tipo celular responsable de la amplificación de la cascada inflamatoria de la AR. Este tipo de sistemas nos permitiría obtener concentraciones terapéuticas de fármaco en la cavidad articular de forma prolongada en el tiempo, incrementando la eficacia terapéutica. Esto se traduce en la exposición del cartílago articular a una menor concentración de glucocorticoide, ya que este se libera de forma paulatina a partir de la formulación retenida a nivel articular, lo que evita la necesidad de administrar dosis elevadas de fármaco libre que alcanzan rápidamente la circulación sistémica. Cabe destacar que además de reducir los efectos colaterales a nivel sistémico, la liberación controlada a nivel articular podría minimizar los deletéreos efectos de la administración intraarticular de corticoides, la cual es responsable de que no exista una evidencia científica consolidada acerca de los beneficios de la inyección intraarticular de este tipo de fármacos pese a que su uso está establecido en la práctica clínica desde hace décadas [4,12,20,27-29]. En este sentido se han desarrollado diversos sistemas destinados a la liberación intraarticular de glucocorticoides, basados en distintas estrategias entre las que ha destacado la nanoy microencapsulación [30-36]. Algunas de estas formulaciones han demostrado resultados prometedores in vitro e in vivo. En este sentido, es reseñable que la FDA ha autorizado la comercialización de una formulación de liberación sostenida de acetónido de triamcinolona basada en micropartículas de PLGA (Zilretta®) [36,37]. El presente capítulo tiene como objetivo el desarrollo de microcápsulas poliméricas conteniendo dipropionato de betametasona (BDP), con características adecuadas para su potencial administración por vía intraarticular en el tratamiento de la AR y otras enfermedades articulares inflamatorias. El BDP (17,21-dipropionato de 9α-Fluoro-16β-methyl-11β,17α,21trihidroxi-1,4-pregnadieno-3,20-diona), cuya estructura química se presenta en la Figura 5-1, F HO O O H H O O O O Figura 5-1. Dipropionato de betametasona 5. Microencapsulación de glucocorticoides | Betametasona 105 es un glucocorticoide altamente hidrofóbico, prácticamente insoluble en agua [38], que se ha utilizado ampliamente en clínica en el tratamiento de la AR y destaca por su eleva potencia [21]. Para la preparación de las microcápsulas se utilizaron dos polímeros biodegradables: el ampliamente estudiado PLGA RG503 (Resomer® RG503) y un copolímero bloque PEOT-PBT (Polyactive® 1000PEOT70PBT30), el cual ha demostrado tener excelentes propiedades en la liberación de fármacos proteicos, pero cuyo comportamiento en la microencapsulación de moléculas hidrofóbicas de bajo peso molecular como BDP no había sido investigado anteriormente. Con el fin de investigar la influencia de la técnica de microencapsulación sobre las propiedades de las formulaciones, las micropartículas se prepararon con ambos polímeros empleando tanto un método de emulsión-evaporación, como la técnica de atomización coaxial por ultrasonidos. Todas las formulaciones obtenidas se caracterizaron exhaustivamente tanto a nivel galénico como en términos de respuesta celular en cultivos celulares in vitro de macrófagos humanos. 5.2. MATERIALES Y MÉTODOS 5.2.1. Microencapsulación de betametasona La microencapsulación de BDP se llevó a cabo mediante dos técnicas diferentes de preparación de microcápsulas. Las MCs se prepararon tanto utilizando atomización coaxial por ultrasonidos, una técnica que nos permite obtener microcápsulas en condiciones suaves, como mediante la técnica de doble-emulsión evaporación del disolvente, ampliamente explorada y caracterizada para la preparación de MCs poliméricas. Así mismo, las microcápsulas se han preparado, mediante ambas técnicas, utilizando dos polímeros biodegradables. En primer lugar, las MCs de BDP se prepararon utilizando Resomer® RG503, un copolímero de ácido lácticoco-glicólico (PLGA; 50:50) ampliamente caracterizado en la microencapsulación de otros corticosteroides [39-42]. Por otra parte, con el fin de explorar el comportamiento de los copolímeros bloque PEOT-PBT en la microencapsulación de fármacos hidrofóbicos, los cuales han demostrado previamente presentar características adecuadas para la microencapsulación de proteínas y fármacos hidrofílicos [43-48], la BDP se microencapsuló utilizando Polyactive® 1000PEOT70PBT30. Dada la marcada hidrofobicidad del principio activo (BDP), prácticamente insoluble en agua, este se incorporará en la fase orgánica durante la preparación de las MCs por ambos métodos. En la Tabla 5-1 se detallan la composición y técnica de microencapsulación para todas las formulaciones microparticulares de betametasona preparadas. Tabla 5-1. Composición y técnica de preparación de las formulaciones de BDP. PLGA RG503 PEOT-PBT Carga teórica de BDP Técnica F1 100 % 0 % 10 % Em/Ev F2 0% 100 % 10 % Em/Ev F3 100 % 0 % 10 % UA F4 0% 100 % 10 % UA 5.2.1.1. Doble emulsión-evaporación del disolvente La microencapsulación de BDP utilizando tanto PEOT-PBT como PLGA RG503, se llevó a cabo en condiciones idénticas, mediante el método de doble emulsión (w/o/w) seguida de evaporación del disolvente. La emulsión primaria, de fase externa oleosa (w/o), se preparó IVÁN LAMELA GÓMEZ 106 por emulsificación de 500 µl de una disolución de PVA al 5% (p/p) con 5 ml de una dispersión de polímero al 5% (p/p) en CH2Cl2 a 25000 r.p.m, durante 3 minutos, en un homogeneizador de alta velocidad (VWR VDI 12, VWR International, Radnor, PA, EE. UU.). A continuación, se preparó la emulsión múltiple (w/o/w) por reemulsificación de la emulsión primaria en una fase externa compuesta por 25 ml de PVA al 2,5 % (p/p), durante 10 minutos a 25.000 r.p.m. La emulsión obtenida se mantuvo durante 4 horas a temperatura ambiente, sometida a agitación magnética constante (450 r.p.m), con el fin de evaporar el disolvente, dando lugar a la solidificación de las microcápsulas por precipitación gradual del polímero formador de la cubierta. La betametasona, de carácter marcadamente hidrofóbico, se incorporó en la dispersión polimérica en una proporción del 10 % respecto a la cantidad de polímero. Una vez solidificadas, las microcápsulas se separaron de la fase externa de PVA mediante centrifugación a 6000 r.p.m (EBA 21, Andreas Hettich GmbH & Co., Tuttlingen, Alemania) y se resuspendieron en agua purificada. Por último, las microcápsulas se aislaron por filtración a presión utilizando una membrana de acetato de celulosa con un tamaño de poro de 0,8 µm, se lavaron por triplicado con agua purificada para eliminar los restos de tensoactivo (PVA) y se secaron en cámara de vacío durante 24 horas. 5.2.1.2. Atomización por ultrasonidos La preparación de MCs poliméricas conteniendo BDP también se llevó a cabo mediante la técnica de atomización por ultrasonidos (UA), utilizando idénticos parámetros de formulación para la obtención de las MCs compuestas tanto por PLGA RG503 como PEOTPBT. Para ello, una disolución de PVA al 2,5% (p/p) y una dispersión polimérica al 3% (p/p) en CH2Cl2 se bombearon, respectivamente, a través de los canales interior y exterior de una boquilla coaxial de atomización por ultrasonidos (Sono-Tek Corp., Milton, EE. UU.). El canal interior se alimentó a un caudal constante de 0,2 ml/min con una bomba de jeringa programable (NE-1000; New Era Pump Systems Inc, Farmingdale, EE. UU.), mientras que la solución polimérica se bombeó a través del canal exterior a un caudal de 1 ml/min utilizando una bomba de doble pistón y caudal variable (Merck-Hitachi L6000, Merck-Hitachi, Tokyo, Japón). La boquilla se conectó a un generador de ultrasonidos (Sono-Tek) de frecuencia fija (60 kHz) y potencial variable, operado a una potencia constante de 4 watios durante el proceso de atomización. El aerosol generado por la boquilla se recogió sobre una solución acuosa de PVA al 5% en agitación magnética constante y a continuación, se evaporó el disolvente a temperatura ambiente, bajo agitación magnética (450 r.p.m), durante 4 horas. Las MCs solidificadas se separaron de la fase externa de PVA por centrifugación a 6000 r.p.m, se resuspendió el sedimento en agua purificada y finalmente se aislaron por filtración con una membrana filtrante de tamaño de poro 0,8 µm. Las formulaciones se lavaron por triplicado con agua purificada y finalmente se secaron en una estufa de vacío, a temperatura ambiente, durante 24 horas. 5.2.2. Determinación analítica de dipropionato de betametasona Para la determinación analítica de la concentración de dipropionato de betametasona, tanto en las muestras obtenidas tras la extracción del fármaco de las MCs con el fin de determinar su eficacia de encapsulación, como en las muestras de liberación, se desarrolló un método analítico mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC). El análisis se llevó a cabo utilizando un cromatógrafo de líquidos Shimazdu Prominence Series (Shimadzu Corporation, Kioto, Japón) compuesto por una bomba de doble pistón (LC-20AT) acoplada a un desgasificador en línea (DGU-20A5), un compartimento termostatizador para la columna (CTO-20A), un detector ultravioleta-visible de longitud de onda variable (SPD-20A) y un inyector manual Rheodyne 5. Microencapsulación de glucocorticoides | Betametasona 107 7725i provisto de un loop de inyección de 20 µl y detector automático de inyección (Rheodyne LLC, Rohnert Park, CA, EE.UU.). La separación se llevó a cabo mediante cromatografía líquida de alta presión en fase reversa (RP-HPLC). Como fase estacionaria, de carácter apolar, se utilizó una columna cromatográfica Sunfire® C18 (5 µm, 100 Å, 4,6 mm x 150 mm) con una precolumna Sunfire® Vanguard® Cartridge C18 (5 µm, 100 Å, 3,9 mm x 5 mm), termostatizada a 35ºC. La fase móvil consistió en una mezcla compuesta por metanol (MetOH), tampón acetato sódico 20 mM (pH 3,8), acetonitrilo (ACN) y tetrahidrofurano (THF). La separación analítica se llevó a cabo en condiciones isocráticas con una mezcla MetOH: Tampón Acetato: ACN: THF (45:37:10:5) y un caudal constante de 1 ml/min. La ratio de disolventes en la fase móvil se expresó en porcentaje en peso, puesto que la fase móvil se preparó por pesada para obtener una mayor reproducibilidad. El volumen de inyección se estableció en 20 µl y la detección del analito se realizó a la longitud de onda de máxima absorción de BDP (λmáx. = 242 nm). Tanto la fase móvil como las muestras objeto de análisis se filtraron previamente a través de filtros de membrana de nylon con un tamaño de poro de 0,22 µm. Todos los disolventes empleados fueron de grado HPLC. El análisis de los cromatogramas obtenidos se realizó con el software LabSolutions® (LC Solutions v. 1.25, Shimadzu Corp., Kioto, Japón). La cuantificación del dipropionato de betametasona se llevó a cabo mediante el método del patrón interno. Como patrón interno se seleccionó el 17-valerato de betametasona (BV), puesto que reúne las características que debe presentar todo patrón interno: no está presente las muestras objeto de análisis; su estructura química es muy similar a la de BDP, difiriendo de esta solamente en la longitud de la cadena del radical en posición 17 y en la ausencia del radical propionato en posición 21; presenta un tiempo de retención próximo al de BDP, así como buena resolución respecto a los picos del analito y otros constituyentes de la muestra. Es estable en las condiciones de la fase móvil y matriz de las muestras. Para la adición del patrón interno, se preparó una disolución de BV en fase móvil de concentración 6 µg/ml y tanto los patrones de BDP como las muestras se diluyeron con esta en proporción 1:1, obtenido una concentración final de 3 µg/ml. Las muestras se diluyeron con fase móvil en proporción adecuada previamente a la adición del patrón interno. BDP (analito) F HO O O H H O O O O BV (Patrón interno) Figura 5-2. Cromatograma representativo de BDP (analito; t R = 9,580) y BV (patrón interno; t R =8,019 min). IVÁN LAMELA GÓMEZ 108 Se construyó una recta de calibración de BDP. Para ello se prepararon por triplicado patrones de BDP en fase móvil en un rango de concentración comprendido entre 0,0122 y 12,5000 µg/ml suplementados con 3 µg/ml de patrón interno (BV). Tras el análisis de los patrones, la relación entre la concentración de BDP y la ratio de las áreas de los picos correspondientes a BDP y BV (ABDP/ABV) se investigó mediante regresión lineal. En la Figura 5-2 se muestra un cromatograma representativo del análisis de un patrón de BDP. El tiempo de análisis necesario para la elución de todos los componentes presentes en la muestra fue de 10,5 minutos, obteniéndose un tiempo de retención (tR) de 9,72 ± 0,20 min para BDP y de 8,12 ± 0,16 min para el patrón interno (BV). El método analítico presentó una buena linealidad de acuerdo con el coeficiente de determinación obtenido tras el ajuste de los datos por regresión lineal (R2=0,99995; Adj-R2=0,99994). Los límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) del método, se calcularon de conformidad con los protocolos de validación descritos en la guía ICH Q2(R1) [49], estableciéndose el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) del método, respectivamente, en 43,53 y 131,91 ng/ml. La ecuación (5-1) describe la relación existente entre la concentración de BDP, expresada en µg/ml, y la ratio de áreas (ABDP/ABV). 𝑃𝑃𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵 =(0,01502 ± 0,00448)+(0,33957 ± 0,00094)∙ 𝐴𝐴 𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵𝐵 𝐴𝐴𝐵𝐵𝐵𝐵 ( 5-1) 5.2.3. Eficacia de encapsulación y rendimiento del proceso Para determinar la eficacia de encapsulación de la betametasona en las diferentes formulaciones microparticulares preparadas, se realizó una extracción completa del fármaco presente en las MCs. Para ello, se pesaron por triplicado muestras representativas de 20 mg de cada una de las formulaciones de MCs y se suspendieron en 500 µl de CH2Cl2. Las suspensiones se mantuvieron en agitación el tiempo necesario para disolver completamente la cubierta polimérica de las MCs, así como la BDP, en el cloruro de metileno. Una vez disueltas las MCs, se añadieron poco a poco 9,5 ml de metanol con el fin de precipitar gradualmente el polímero y, al mismo tiempo, extraer completamente el fármaco presente en las MCs. Una vez precipitado el polímero, las suspensiones resultantes se mantuvieron en agitación orbital durante 5 minutos y a continuación, el polímero precipitado se aisló mediante filtración a presión con un filtro de jeringa de nylon con un tamaño de poro de 0,45 µm. La solución metanólica resultante, conteniendo el BDP, se diluyó apropiadamente con fase móvil y la concentración de fármaco se determinó mediante RP-HPLC siguiendo el método descrito en la sección 5.2.2. Como control, se realizaron extracciones de partículas blancas y las soluciones metanólicas obtenidas se analizaron en las mismas condiciones. Todas las extracciones se realizaron por triplicado. La eficacia de encapsulación (E.E.) se calculó de acuerdo con la ecuación (5-2), y representa el porcentaje de fármaco atrapado en las microcápsulas respecto a la cantidad teórica de fármaco presente en las mismas. 𝐸𝐸.𝐸𝐸.(%)= 𝐵𝐵𝐷𝐷𝑃𝑃 𝑐𝑐𝑚𝑚𝑆𝑆𝑚𝑚𝑚𝑚𝑆𝑆𝐷𝐷𝑑𝑑𝑆𝑆 𝑚𝑚𝑆𝑆 20 𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑑𝑑𝑚𝑚 𝑀𝑀𝑃𝑃𝑀𝑀 𝑃𝑃𝑚𝑚𝑆𝑆𝑚𝑚𝑚𝑚𝑆𝑆𝐷𝐷𝑑𝑑𝑚𝑚 𝑚𝑚𝑚𝑚ó𝑚𝑚𝐷𝐷𝑐𝑐𝑚𝑚 𝑑𝑑𝑚𝑚 𝐵𝐵𝐷𝐷𝑃𝑃 𝑚𝑚𝑆𝑆 20 𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑀𝑀𝑃𝑃𝑀𝑀 × 100 (5-2) Se investigó el rendimiento del proceso (R.P) tras la microencapsulación de BDP utilizando ambos polímeros y técnicas de microencapsulación. Para ello se pesó la cantidad de MCs obtenidas una vez finalizado el proceso de secado y posteriormente se calculó el rendimiento del proceso según se indica en la ecuación (5-3). 5. Microencapsulación de glucocorticoides | Betametasona 109 𝑅𝑅.𝑃𝑃.(%)= 𝐺𝐺𝑚𝑚𝑆𝑆𝑚𝑚𝑚𝑚𝑀𝑀 𝑑𝑑𝑚𝑚 𝑀𝑀𝑃𝑃𝑀𝑀 𝑀𝑀𝑚𝑚𝑐𝑐𝑆𝑆𝑀𝑀 𝑚𝑚𝑜𝑜𝑚𝑚𝑚𝑚𝑆𝑆𝐷𝐷𝑑𝑑𝑚𝑚𝑀𝑀 𝐺𝐺𝑚𝑚𝑆𝑆𝑚𝑚𝑚𝑚𝑀𝑀 𝑑𝑑𝑚𝑚 𝑃𝑃𝑚𝑚𝑃𝑃í𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑀𝑀+𝐺𝐺𝑚𝑚𝑆𝑆𝑚𝑚𝑚𝑚𝑀𝑀 𝑑𝑑𝑚𝑚 𝐵𝐵𝐷𝐷𝑃𝑃 × 100 (5-3) 5.2.4. Determinación del tamaño de partícula La distribución de tamaño de partícula de las cuatro formulaciones seleccionadas como óptimas (F1 -F4) se determinó en un analizador de tamaño Mastersizer micro (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). Este equipo determina el tamaño medio de las micropartículas presentes en una suspensión mediante su análisis por difracción de luz laser, de acuerdo con el modelo de difracción de Fraunhofer. Para llevar a cabo el análisis, se prepararon por triplicado suspensiones de MCs en agua purificada con una densidad óptica adecuada y se sometieron a ultrasonidos durante 1 minuto, previamente a la realización del análisis, con el fin de disgregar posibles aglomerados de MCs y eliminar las burbujas de aire. Todas las formulaciones de analizaron por triplicado y los resultados se expresaron en forma distribución volumétrica, siendo los parámetros característicos de la misma d(v,0.1), d(v,0.5)) y d(v,0.9), que representan respectivamente el diámetro por debajo del cual se encuentran el 10, 50 y 90 % del volumen total de micropartículas. El parámetro d(v,0.5) se seleccionó para expresar el diámetro medio de las MCs de cada una de las formulaciones preparadas. También se calcularon los diámetros equivalentes de superficie (D[4,3]) y volumen (D[3,2]). El parámetro Span, característico del ancho de la distribución y, por tanto, de la polidispersión de las formulaciones, se calculó de acuerdo con la Ecuación (5-4). 𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆= 𝑑𝑑(𝑣𝑣, 0.9)−𝑑𝑑(𝑣𝑣, 0.1) 𝑑𝑑(𝑣𝑣, 0.5) (5-4) 5.2.5. Microscopía óptica La morfología de las microcápsulas secas, así como su grado de agregación se evaluó mediante microscopía óptica. Las suspensiones de MCs secas se prepararon en PBS 10 mM (pH 7,4) mediante agitación manual intensa y posterior dispersión en baño de ultrasonidos durante 30 segundos. A continuación, las suspensiones obtenidas se observaron en campo claro utilizando un microscopio Olympus IX71 y se tomaron de forma aleatoria fotografías representativas de todas las formulaciones analizada (Cámara DP71, Olympus Corp., Tokio, Japón). 5.2.6. Microscopía electrónica de barrido La morfología interna y superficial de las formulaciones microparticulares de BDP compuestas por Resomer® RG503 o Polyactive® 1000PEOT70PBT30 y obtenidas mediante emulsión-evaporación o atomización por ultrasonidos se investigó mediante microscopía electrónica de barrido. Para poder observar la estructura interna de las micropartículas, estas se incluyeron en una matriz de resina epoxi (5 Minute® Epoxy, Devcon®, Solon, OH, EE.UU.) y posteriormente se cortaron transversalmente con un bisturí, siguiendo una versión modificada del protocolo descrito por Kim et al. [50]. Las micropartículas se dispersaron en la resina (reactivo A) hasta formar una suspensión homogénea y a continuación, se mezclaron con una cantidad igual de catalizador (reactivo B) para iniciar la polimerización. Tras 1 horas, el pellet resultante se seccionó en láminas finas, dando lugar a láminas de resina epoxi conteniendo algunas micropartículas seccionadas. Para su observación, tanto las muestras de MCs secas IVÁN LAMELA GÓMEZ 110 como las láminas de resina se montaron en portaobjetos metálicos, cubiertos con cinta conductora de carbono provista de adhesivo de doble cara. Una vez montadas, las muestras se metalizaron con una aleación oro/paladio bajo atmósfera inerte de argón en un metalizador SDC 005 (BAL-TEC GmbH, Schalksmühle, Alemania) y se observaron utilizando un microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-6360LV (JEOL Ltd., Tokyo, Japón) operado a un voltaje de 15 kV. Finalmente se tomaron microfotografías de alta resolución representativas de la morfología de las formulaciones. 5.2.7. Calorimetría diferencial de barrido El comportamiento térmico de las microcápsulas, tanto blancas como cargadas con BDP, se investigó mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) utilizando un calorímetro Q1000 equipado con un módulo de refrigeración RSC90 (TA instruments, New Castle, DE, EE. UU.). Previamente a la realización de los análisis, la calibración del equipo se verificó utilizando indio como estándar. Se pesaron muestras representativas (≈ 5 mg) de PLGA RG503, Polyactive®, BDP y formulaciones de MCs, tanto blancas como cargadas con fármaco, en cápsulas de aluminio (Tzero pan, model 901683.901, TA instruments, New Castle, DE, EE. UU) no selladas herméticamente. Para el registro de los termogramas, las muestras se enfriaron inicialmente hasta -80º C (10ºC/min), se mantuvieron a -80 ºC durante 30 segundos y a continuación se calentaron hasta 250ºC con una rampa de 10ºC/min. Como referencia, se utilizó una cápsula de aluminio vacía. Los termogramas obtenidos se analizaron con el software TA Universal Analysis 2000 (TA instruments, New Castle, DE, EE. UU). 5.2.8. Espectroscopía en el infrarrojo (FTIR) Las interacciones físicoquímicas entre BDP y los polímeros empleados para la preparación de las microcápsulas (PLGA RG503 y PEOT-PBT), así como las posibles alteraciones en la estructura del polímero tras el proceso de microencapsulación, se investigaron mediante espectroscopía en el infrarrojo de transformada de Fourier (FTIR). Los espectros de transmisión de las muestras de polímeros puros (PLGA y PEOT-PBT), BDP y MCs blancas y cargadas, se registraron en la región del infrarrojo medio (400 – 4000 cm-1) en un espectrómetro Vertex 70v FT-MIR (Bruker Corporation, Billerica, MA, EE. UU.). La preparación de las muestras para su posterior análisis consistió en su inclusión en pastillas transparentes de bromuro de potasio. Para ello, las muestras secas se mezclaron con KBr en proporción adecuada (1:30 – 1:100), se pulverizaron con ayuda de un molino de bolas y finalmente se comprimieron, obteniendo las pastillas con la muestra embebida y características adecuadas para el registro del espectro infrarrojo de transmisión. 5.2.9. Determinación de potencial ζ La influencia de la composición polimérica, la técnica de microencapsulación y la incorporación de BDP sobre la carga superficial de las MCs se investigó a través de las variaciones en el potencial ζ de las microcápsulas. El potencial ζ de todas las formulaciones desarrolladas, tanto blancas como cargadas con BDP, se determinó a 25 ºC en una suspensión de MCs en KCl 1 mM. Adicionalmente, se investigó el efecto del pH del medio sobre la carga superficial de las formulaciones. Para ello, se determinó el potencial ζ de las MCs suspendidas en soluciones tampón compuestas por KCl (1mM) y PBS (10 mM) y ajustadas a distintos valores de pH (3; 6; 7,4; 8 y 11). La determinación del potencial ζ se llevó a cabo mediante dispersión electroforética de luz (ELS) en un medidor de potencial ζ (ZetaPlus, Brookhaven Instruments Corporation, New York, EE. UU.). Esta técnica nos permite estimar el valor del 5. Microencapsulación de glucocorticoides | Betametasona 111 potencial ζ a partir de la medida directa de la movilidad electroforética de las partículas en presencia de un campo eléctrico. Todas las muestras se ensayaron por triplicado, y cada determinación consistió en una batería de 10 medidas. 5.2.10. Determinación de la hidrofobicidad superficial La hidrofobicidad superficial de las MCs poliméricas utilizadas como sistemas de liberación de fármacos ha demostrado tener un papel relevante en el comportamiento de las formulaciones en un entorno biológico, en términos de respuesta celular en cultivos celulares in vitro. En este sentido, varios autores han descrito una relación directa entre la hidrofobicidad superficial de las partículas y su facilidad para ser internalizadas por las células fagocíticas [5154]. Con el fin de caracterizar la hidrofobicidad relativa de la superficie de las distintas formulaciones de MCs desarrolladas, así como estudiar como afectó la técnica de microencapsulación y la naturaleza de la composición polimérica a la hidrofobicidad de la superficie, esta se investigó utilizando un ensayo basado en la adsorción de Rosa de Bengala (RB). El método, ampliamente utilizado en la determinación de la hidrofobicidad superficial de nanoy micropartículas poliméricas, se basa en la relación existente entre la hidrofobicidad de la superficie de las partículas y la magnitud e intensidad de la adsorción superficial de RB (4,5,6,7-Tetracloro-2’,4’,5’,7’-tetraiodofluoresceina disódica), un derivado lipofílico de fluoresceína [51,55-58]. El ensayo se realizó siguiendo una versión modificada de los ensayo previamente descrito por otros autores [56,57,59] . Parla ello, distintas cantidades de MCs (2-0,25 mg) se incubaron con 1 ml de una disolución de RB (10 µg/ml) en PBS (100 mM, pH 7,4). El tiempo de incubación se fijó en 24 horas tras verificar en un ensayo piloto realizado previamente, que en ese momento se había alcanzado el equilibro del proceso de adsorción. Se seleccionó una concentración de 100 mM para la solución tampón con el fin de minimizar el efecto de la carga sobre el proceso de adsorción y, al mismo tiempo, favorecer las interacciones hidrofóbicas entre el RB y la superficie polimérica [56]. Durante el periodo de incubación, las suspensiones se mantuvieron en oscuridad y sometidas a agitación orbital constante para garantizar un contacto homogéneo de la superficie de las MCs con la disolución de RB. Se mantuvo en las mismas condiciones una disolución de RB en ausencia de MCs para cuantificar la cantidad de RB adsorbido a la superficie de los tubos, puesto que este presenta una gran afinidad por el propileno que compone los tubos y puntas de micropipeta [60]. Se ensayaron 6 replicados para cada muestra y control. Una vez finalizado el periodo de incubación, y alcanzado el equilibrio de adsorción, las suspensiones se centrifugaron a 23.900 RCF durante 15 minutos (EBA 21, Andreas Hettich GmbH & Co., Tuttlingen, Alemania) y la concentración de RB en el sobrenadante se determinó espectrofotométricamente a 549 nm (Evolution 60s, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU). La cuantificación de la concentración de RB en el equilibrio (Ceq) se realizó a su longitud de onda de absorción máxima (λmax = 549 nm) de acuerdo con una recta de calibrado de RB en PBS 100mM (pH 7,4) obtenida en el rango 0,094 – 6 µg/ml. (A549 nm = -0,005 + 0,1033[RB]; R2=0,9999). La cantidad de RB libre (RBL; µg) y adsorbido a la superficie de las MCs (RBA; µg) se calculó de acuerdo con la ecuación (5-5), en la cual, Ceq representa la concentración de RB en el equilibrio en las muestras de MCs (µg/ml), CeqB la concentración de RB en el equilibrio en los controles en ausencia de MCs (µg/ml) y V el volumen de la disolución de RB (1 ml). El coeficiente de reparto (PQRB) de RB entre la superficie de las microcápsulas y el medio de dispersión se calculó de acuerdo con la ecuación (5-6). IVÁN LAMELA GÓMEZ 118 1) Para inmovilizar el anticuerpo de captura en la superficie de las placas de 96 pocillos, estas (ab210903, placas alta afinidad Nunc™ MaxiSorp™) se incubaron con 50µl/pocillo de una disolución del anticuerpo de captura específico para cada analito (2 µg/ml) en un tampón compuesto por NaHCO3 (35 mM), Na2CO3 (15 mM) ajustado pH 9,6 (ab210899) durante 2 horas a temperatura ambiente, bajo agitación constante. 2) Las placas se lavaron por triplicado con 350 µl/pocillo de tampón de lavado (TL) para eliminar el anticuerpo de captura no adsorbido a la microplaca. El TL (ab206977) consistió en tampón fosfato salino (PBS) suplementado con un 0,05% de Tween® 20. 3) Para bloquear los sitios de adsorción de las placas no ocupados por el anticuerpo de captura y minimizar la adsorción inespecífica del analito, las placas se incubaron durante 12 a 4ºC con 300 µl/pocillo de un tampón de bloqueo (TB) compuesto por un 1% de albúmina bovina (BSA) y un 0,05 % de Tween® 20 en tampón fosfato salino (PBS; pH 7.4). 4) Tras la incubación, las placas se lavaron por triplicado con 350 µl/pocillo de TL. 5) Para la realización del ensayado, las placas se incubaron durante 2 horas con 50 µl/pocillo tanto de los patrones de concentración conocida de analito en TB, como de los sobrenadantes de cultivo celular objeto de análisis sin diluir, o diluidos apropiadamente en TB. La etapa de incubación se llevó a cabo a temperatura ambiente en constante agitación. 6) Una vez finalizada la etapa de incubación, y por tanto la unión específica entre el analito y el anticuerpo de captura, las placas se lavaron por triplicado con 350 µl/pocillo de TL para eliminar los restantes componentes de la muestra. 7) Para llevar a cabo la etapa de detección, las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, en agitación constante, con 50 µl/pocillo de una disolución del anticuerpo de detección específico para el analito (0,5 µg/ml) en TB. 8) Una vez finalizado el periodo de incubación, el anticuerpo de detección remanente se eliminó mediante un lavado por triplicado con 350 µl/pocillo de TL. 9) A continuación, las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y bajo agitación orbital constante. con una disolución 0,05 µg/ml de peroxidasa de rábano conjugada con estreptavidina (HRP-estreptavidina) para permitir su conjugación con el anticuerpo de detección biotinilado unido específicamente al analito. 10) Las placas se lavaron por triplicado con 350 µl/pocillo de TL para eliminar el enzima no conjugado. 11) Para llevar a cabo la determinación de la concentración de analito, se añadieron 100 µl/pocillo de una solución de TMB (3, 3’, 5, 5’-Tetrametilbenzidina; ab210902), sustrato del enzima HRP. Las placas se incubaron en oscuridad, a 25ºC y bajo agitación constante en un espectrofotómetro de placas provisto de incubador (Fluostar Optima, BMG Labtech, Ortenberg, Alemania). El desarrollo de la reacción se monitorizó espectrofotométricamente a una longitud de onda de 600 nm, a intervalos de 2 minutos, con el fin de optimizar el tiempo de incubación. 12) Una vez alcanzado el tiempo de incubación óptimo, se detuvo la reacción enzimática por adición de 100 µl/pocillo de una solución stop (ab210900; 4,9 % H3PO4), provocando un desplazamiento de la longitud de onda de máxima absorción del 5. Microencapsulación de glucocorticoides | Betametasona 119 cromógeno desde 600 a 450 nm. Tras añadir la solución stop, la placa se mantuvo en agitación durante un minuto, y a continuación se registró la absorbancia a 450 nm. Para la cuantificación, en cada placa se incorporó una curva de calibrado utilizando TNF-α e Il-6 recombinantes, suministrados como estándar junto con el par de anticuerpos. La recta se construyó entre 15,6 y 1000 pg/ml para TNF-α y MMP-9 y entre 3,9 y 250 pg/ml para Il-6. Los datos experimentales obtenidos para la curva de calibración se ajustaron al modelo matemático que proporcionó un mejor ajuste en cada caso, según se describe más adelante en la sección de resultados. Todas las muestras y patrones se ensayaron por duplicado. 5.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.3.1. Preparación de las microcápsulas El dipropionato de betametasona se microencapsuló con éxito utilizando ambas técnicas de microencapsulación, así como los dos polímeros biodegradables investigados, obteniendo un buen rendimiento del proceso y eficacias de encapsulación elevadas. Las cuatro formulaciones obtenidas tras la optimización de las condiciones de cada proceso de producción se caracterizaron por estar compuestas por microcápsulas esféricas y presentar, una vez secas, aspecto pulverulento. El rendimiento del proceso de microencapsulación fue elevado para todas las formulaciones preparadas (Figura 5-3), no existiendo diferencias estadísticamente significativas en el R.P. obtenido en función de la composición polimérica ni la técnica de microencapsulación empleada (p>0,05). Sin embargo, a pesar de que las diferencias no fueron estadísticamente significativas, la tendencia de los datos reflejó un mayor R.P. para las MCs compuestas por PEOT-PBT preparadas por ambas técnicas. El análisis de la varianza (ANOVA) confirmó que existieron diferencias significativas en la eficacia de encapsulación de BDP obtenida para las formulaciones preparadas (p<0,05). El análisis post hoc mediante la prueba de Tuckey evidenció que la técnica de microencapsulación tuvo una influencia significativa sobre las E.E. de BDP, mientras que no se encontraron diferencias significativas en la E.E. de las formulaciones preparadas mediante la misma técnica, pero con polímeros diferentes. Las MCs preparadas mediante la técnica de doble emulsión presentaron una eficacia de encapsulación significativamente mayor (80,82 – 84,54%) que la de las formulaciones preparadas por UA (48,34 - 56,95 %). Teniendo en cuenta la baja solubilidad del fármaco, sería esperable el atrapamiento de un porcentaje elevado de este en la matriz polimérica lipofílica, y una baja difusión a la fase acuosa. Sin embargo, a pesar de su baja solubilidad en agua, se han descrito previamente distintos fenómenos que pueden dificultar el atrapamiento de las moléculas con estructura esteroidea en la matriz polimérica mediante métodos que se basan en la formación de emulsiones de fase externa acuosa. Estos incluyen la cristalización del fármaco en la superficie de las micropartículas o la fase externa en presencia de PVA, o la formación de poros como consecuencia de una evaporación demasiado rápida del solvente [77]. Por otra parte, se ha descrito previamente que la E.E obtenida se puede ver modificada en función de la concentración de polímero y el tamaño de las micropartículas obtenidas [78,79]. En este sentido, Dawes et al. describió la existencia de una relación inversa entre el tamaño final de partícula y la E.E. obtenida tras la microencapsulación de dexametasona en PLGA siguiendo un método de emulsión-evaporación (o/w) [79], lo que se encuentra en consonancia con los resultados obtenidos por nosotros, ya que las formulaciones que presentan una menor E.E (Figura 5-3), presentan un tamaño medio significativamente superior al de F1 y F2 (Tabla 5-2). Respecto a la influencia de la concentración de polímero, es importante tener IVÁN LAMELA GÓMEZ 120 en cuenta que las formulaciones obtenidas mediante emulsión-evaporación (F1, F2) se prepararon utilizando una mayor concentración de polímero (4 %) en comparación con las preparadas por emulsión-evaporación (3%), lo que pudo contribuir a la menor E.E obtenida para estas formulaciones, puesto que se ha descrito una relación directa entre la concentración de la dispersión polimérica y la E.E. obtenida para la microencapsulación de prednisolona en PLGA [78], así como de otras moléculas hidrofílicas y lipofílicas de diversa naturaleza [80-82]. Este fenómeno se ha relacionado tanto con una posible precipitación más rápida del polímero en la interfaz polímero-agua a partir de dispersiones de mayor concentración, impidiendo la difusión del fármaco a la fase externa, como con la mayor viscosidad de las dispersiones más concentradas, lo que podría retardar la difusión del fármaco en las gotículas de la fase interna [80,81,83]. Dada la baja solubilidad del BDP en agua [38,61,84], en las formulaciones que presentan una menor E.E es probable que parte del fármaco precipitara en la fase externa durante el proceso de microencapsulación [78,85]. Sin embargo, durante el análisis de las formulaciones finales mediante SEM no se observó la presencia de cristales de BDP en la superficie de estas (sección 5.3.4), sugiriendo que el porcentaje de fármaco que pudo cristalizar una vez saturada la fase externa, fue eliminado completamente durante el exhaustivo proceso de lavado que se llevó a cabo durante el aislamiento de las formulaciones. 5.3.2. Distribución de tamaño de partícula La distribución de tamaño de partícula de las formulaciones obtenidas tras la optimización de los parámetros de formulación se determinó mediante difracción de luz láser. Todas las formulaciones presentaron una distribución de tamaño unimodal y polidispersa. A pesar de que se observaron diferencias notables en la distribución de tamaño de las cuatro formulaciones desarrolladas, todas las formulaciones presentaron una distribución de tamaño adecuada de cara a su posible administración mediante inyección intraarticular (Tabla 5-2). Tabla 5-2 Distribución de tamaño de partícula de las formulaciones de MCs cargadas con BDP. d(v,0.1) (µm) d(v,0.5) (µm) d(v,0.9) (µm) Span F1 0,80 ± 0,05 1,38 ± 0,05 2.32 ± 0,02 1,11 ± 0,09 F2 1,26 ± 0,05 2,09 ± 0,14 3.54 ± 0,43 1,09 ± 0,11 F3 3,97 ± 0,68 23,60 ± 0,53 54,91 ± 5,46 2,15 ± 0,21 F4 8,04 ± 0,11 46,65 ± 3,93 108,99 ± 25,49 2,30 ± 0,38 Figura 5-3. Rendimiento del proceso y eficacia de encapsulación de las formulaciones de MCs preparadas mediante las dos técnicas: atomización por ultrasonidos y emulsión-evaporación. Eficacia de encapsulación (%) Rendimiento del proceso (%) F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4 0 50 100 0 50 100 E .E R .P. 5. Microencapsulación de glucocorticoides | Betametasona 121 Se observó que tanto la técnica de microencapsulación como el polímero empleado tuvieron una influencia significativa sobre la distribución de tamaño obtenida, si bien el efecto del proceso de producción fue significativamente mayor. En este sentido, las MCs preparadas por emulsión-evaporación (F1 y F2) presentaron menor polidispersión y un diámetro medio notablemente inferior al de las obtenidas mediante atomización (F3 y F4), lo que puede atribuirse a la reducción de tamaño de glóbulo de las emulsiones primaria y secundaria como consecuencia del mayor trabajo suministrado durante los procesos de emulsificación a alta velocidad realizados en la técnica de doble-emulsión. Esto contrasta con las condiciones suaves que caracterizan al proceso de formación de las MCs mediante atomización por ultrasonidos, que resultó en una distribución de tamaño con un mayor tamaño medio y un mayor grado de polidispersión. Son estas condiciones suaves las que hacen a esta técnica idónea de cara a la microencapsulación de moléculas lábiles como biomoléculas de origen proteico o ácidos nucleicos, lo que abre la puerta a nuevas vías de investigación encaminadas a la coencapsulación de BDP y un fármaco hidrofílico, el cual podría incorporarse en la fase interna acuosa durante la producción de las MCs. En lo relativo a la influencia del polímero sobre la distribución de tamaño obtenida, se observó que las formulaciones compuestas por PLGA RG503 (F1 y F3) presentaron una menor polidispersión y tamaño medio, en comparación con las preparadas utilizando el copolímero PEOT-PBT con la misma técnica e idénticas condiciones (Tabla 5-2). Puesto que el único parámetro del proceso que difiere entre ambas formulaciones preparadas con la misma técnica es el polímero utilizado, el menor tamaño observado en las MCs de PLGA RG503 se atribuye a diferencias inherentes a la naturaleza de los polímeros investigados. Pese a que no se han podido dilucidar con exactitud los mecanismos implicados en el proceso, la gran diferencia de peso molecular existente entre el copolímero Polyactive® 1000PEOT70PBT30 (80.000 – 125.000 Da) [86,87] y Resomer® RG503 (24.000 – 38.000 Da) podría explicar en parte el mayor tamaño de partícula observado en las MCs compuestas por PEOT-PBT (F2: 2,09 µm; F4: 46,65 µm) en relación al tamaño obtenido con PLGA RG503 en las mismas condiciones (F1: 1,38 µm; F3: 26,60 µm). En este sentido, en la producción de nanoy micropartículas de PLGA es bien conocido el incremento del tamaño medio de partícula a media que se incrementa el peso molecular del polímero, posiblemente a consecuencia de la mayor viscosidad de las dispersiones de polímeros de elevado peso molecular, lo que dificulta la reducción del tamaño de glóbulo durante la preparación de las emulsiones en las mismas condiciones [88-90]. En la técnica de atomización por ultrasonidos no existe una posición consensuada acerca del efecto de la viscosidad sobre el tamaño de gotícula generado por la boquilla, puesto que este depende tanto de los parámetros de formulación como de las propiedades inherentes a cada dispersión polimérica. Mientras que algunos autores relacionaron una mayor viscosidad con un incremento del tiempo de permanencia de la dispersión en la superficie de la boquilla y una reducción del diámetro medio del aerosol generado [91], otros autores observaron que un incremento en la viscosidad de la dispersión atomizada dio lugar a incrementos en el tamaño de gotícula obtenido [92]. En nuestro caso, para los valores de caudal y potencia establecidos (sección 5.2.1.2), durante el proceso de optimización de las formulaciones se observó que un incremento en la concentración de polímero, y por tanto de la viscosidad de la dispersión, dio lugar a un incremento de la polidispersión y tamaño medio de las microcápsulas, hasta alcanza un valor de concentración crítica por encima del cual no fue posible general un aerosol en las condiciones fijadas, provocando el goteo y obturación de la boquilla. Dicho valor crítico se estableció, utilizando CH2Cl2 como disolvente, en una concentración del 3,5 % (p/p) para PEOT-PBT y del 5% (p/p) para PLGA RG503. Por otra parte, se observó que una disminución IVÁN LAMELA GÓMEZ 122 del caudal suministrado a la boquilla disminuyó dicho valor crítico. En base a las observaciones realizadas, una hipótesis factible para explicar dicho comportamiento podría ser la mayor evaporación del DCM, que presenta un bajo punto de ebullición, como consecuencia del mayor tiempo de contacto de la dispersión de polímero con la punta de la boquilla, que pudo alcanzar temperaturas entre 30 y 50ºC en base a las determinaciones realizadas con un termómetro de infrarrojos. Dicha evaporación del solvente, y el consiguiente incremento de la viscosidad de la dispersión podrían explicar el descenso de la concentración crítica por encima de la cual no se pudo generar el aerosol, aunque sería necesaria la realización de un ensayo exhaustivo sobre el tema para poder esclarecer las causas y mecanismos implicados en este fenómeno, lo que extralimita los objetivos planteados en esta tesis doctoral. 5.3.3. Caracterización en suspensión acuosa La observación de las suspensiones de MCs al microscopio óptico confirmó que las cuatro formulaciones desarrolladas están compuestas por partículas esféricas con un tamaño acorde al obtenido mediante el análisis por difracción de luz láser. Las suspensiones de MCs en PBS se prepararon a partir de las formulaciones secas por agitación manual y posterior disgregación en baño de ultrasonidos durante 30 segundos. Como puede observarse en la Figura 5-4, se evidenciaron diferencias relevantes en el grado de agregación de las formulaciones preparadas mediante atomización por ultrasonidos y las a b c d Figura 5-4. Microfotografías de microscopía óptica (200x) de suspensiones de MCs de BDP: F1 (a), F2 (b), F3 (c), F4 (d). Las flechas señalan los agregados de MCs. La escala representa 100 µm. 5. Microencapsulación de glucocorticoides | Betametasona 123 preparadas mediante emulsión-evaporación. Por una parte, las formulaciones preparadas por UA, con independencia de su composición de polímero, se dispersaron fácilmente en solución acuosa dando lugar a una suspensión de MCs individuales sin presencia de agregados, a excepción de un bajo porcentaje de partículas pequeñas dispuestas en torno a otras de mayor tamaño (Figura 5-4c, d). Por otra parte, las suspensiones de las formulaciones preparadas mediante la técnica de doble-emulsión presentaron agregados estables de MCs, siendo mayor el grado de agregación en las MCs compuestas por PEOT-PBT (Figura 5-4b) que en las compuestas por PLGA RG503 (Figura 5-4a). Así, mientras que las MCs de PLGA RG503 (F1) se encontraron mayoritariamente dispersas de forma individual en la suspensión y coexistiendo con algunos agregados de MCs, un elevado porcentaje de las MCs compuestas por PEOT-PBT (F2) se dispuso en pequeños agregados estables que coexistieron con partículas individuales y algunos agregados de mayor tamaño. Esto podría condicionar su perfil de liberación del fármaco al modificar de forma sustancial la superficie en contacto con el medio de liberación [79], así como su comportamiento en términos de respuesta celular en cultivos celulares in vitro, puesto que algunos procesos como la fagocitosis se encuentran en gran medida condicionados por el tamaño y forma de las micropartículas [93,94]. 5.3.4. Morfología interna y superficial La influencia del polímero formador de la cubierta y de la técnica de microencapsulación sobre la morfología interna y superficial de las micropartículas preparadas se investigó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Todas las formulaciones se caracterizaron por estar compuestas por microcápsulas esféricas con un tamaño que se correspondió con los resultados obtenidos mediante difracción de luz láser, según se muestra en la Figura 5-5. La formulación F1, preparada con PLGA RG503 mediante emulsión-evaporación, se compuso de partículas esféricas con superficie lisa, no porosa, que mostraron una disposición en forma de agregados (Figura 5-5a). A pesar de que la mayoría de las partículas no presentaron porosidad superficial, se observó la presencia de una muy baja proporción de MCs con un único poro de gran tamaño y algunas estructuras semiesféricas que parecen corresponderse con artefactos generados durante el proceso de microencapsulación (Figura 5-5a.1). Por otra parte, las MCs compuestas por PEOT-PBT y preparadas por emulsión evaporación (Figura 5-5b) se caracterizaron por su forma esférica y superficie ligeramente irregular, sin presencia de poros, así como su mayor grado de agregación en comparación con la formulación F1. El aspecto más compacto de los agregados podría explicar el mayor grado de agregación en suspensión acuosa observado mediante microscopía óptica. La morfología interna de las MCs preparadas mediante emulsión-evaporación no pudo ser observada al no lograr seccionar ninguna micropartícula como consecuencia de las limitaciones inherentes al método empleado para ello (sección 5.2.6.). Posiblemente como consecuencia de su pequeño tamaño y agregación en estado sólido, las MCs no pudieron ser inmovilizadas al no embeberse adecuadamente en la matriz de resina, siendo desplazadas por la cuchilla durante el corte, lo que impidió que estas fueran seccionadas transversalmente. Las formulaciones preparadas mediante UA se caracterizaron por estar compuestas de partículas esféricas y presentar un bajo grado de agregación, aunque se observaron diferencias en su distribución de tamaño y morfología dependiendo del polímero utilizado para su preparación. Las MCs compuestas por PLGA RG503 (Figura 5-5c) se caracterizaron por tener una superficie externa lisa con presencia de algunas depresiones puntiformes a nivel superficial, las cuales no alcanzaron el interior de las MCs de acuerdo con la observación de las MCs [Document text truncated for crawler view.]