Descripción de nuevos taxones bacterianos asociados a almeja cultivada. Caracterización de la especie Vibrio toranzoniae sp. nov.

TESIS DOCTORAL MODALIDAD DE COMPENDIO DE ARTÍCULOS DESCRIPCIÓN DE NUEVOS TAXONES BACTERIANOS ASOCIADOS A ALMEJA CULTIVADA. CARACTERIZACIÓN DE LA ESPECIE Vibrio toranzoniae SP. NOV. DESCRIPTION OF NEW BACTERIAL TAXA ASSOCIATED TO REARED CLAMS. CHARACTERIZATION OF Vibrio toranzoniae SP. NOV. Memoria que presenta Aide Lasa González para optar al Grado de Doctor en Biología (Mención Internacional). Aide Lasa González Programa de Doctorado en Avances en Biología Microbiana y Parasitaria DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. CIBUS-FACULTAD DE BIOLOGÍA Santiago de Compostela, 2017. Jesús López Romalde, Catedrático del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela Informa: que la presente Tesis Doctoral titulada: “Descripción de nuevos taxones bacterianos asociados a almeja cultivada. Caracterización de la especie Vibrio toranzoniae sp. nov.”, que presenta Aide Lasa González para optar al grado de Doctor en Biología, ha sido realizada en el Departamento de Microbiología y Parasitología bajo mi dirección, y considerando que se haya concluída, autorizo su presentación para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente En Santiago de Compostela, a 23 de Febrero de 2017 Prof. Dr. Jesús L. Romalde Este trabajo se desarrolló en el marco de dos proyectos de investigación, AGL2010-18438 y AGL2013-42628-R subvencionados por los Ministerios de Ciencia e Innovación y Economía y Competitividad dentro de los Subprogramas de proyectos de investigación fundamental no orientada y retos de la sociedad, respectivamente. Durante el desarrollo del mismo, he disfrutado de una beca FPI del Ministerio de Ciencia e Innovación. AGRADECIMIENTOS Se hace difícil escribir este apartado, quizás el más complicado de la tesis. Es mucha la gente a la que agradecer su apoyo durante estos años. De una u otra manera, todos habéis contribuido a que esto cogiera forma poco a poco y a que yo creciera en el mundo de la investigación. Esto es solo un pequeño homenaje a vosotros, los que me habéis acompañado en este viaje. Con todo mi cariño. Debo empezar por mi director, el Dr. Jesús L. Romalde. Gracias por haberme dado la oportunidad de entrar a formar parte de este maravilloso grupo e iniciar mi andadura en la investigación… Aún recuerdo aquel día que Alba y yo entramos en el despacho de Jesús para informarnos sobre los T.A.D. Cuando salimos del despacho cada uno tenía asignado su cometido, una moneda al aire había decidido por nosotros y a mí me tocó inmiscuirme en la bacteriología. Así es como he llegado hasta aquí, lo demás es historia. Estos años he aprendido mucho de ti, desde los entresijos de la taxonomía a algo tan sencillo y difícil a la vez como es escribir un artículo o la propia Tesis. Por contar conmigo para nuevos proyectos y por tu confianza ante nuevas responsabilidades. No debo olvidar tu eterna paciencia. Y también por los momentos de diversión, que no han sido pocos. Un placer poder trabajar contigo, siempre he presumido de director ante mis amigos. Al Dr. Barja, por contagiar su infinita curiosidad y por la ingente cantidad de conocimientos y datos de otras tantas disciplinas. Creo que nunca dejaré de aprender cosas nuevas de ti. Porque este laboratorio no sería lo mismo sin las “Juanadas”, ante todo reciclar. A la Dra. Toranzo, por haberme enseñado tanto estos años. El homenaje va implícito en el título de la Tesis. También por sacarme de dudas y algún que otro problemilla sin importancia con el decreto que regula el doctorado. A la Dra. Magariños, que aunque no hayamos compartido laboratorio siempre he podido aprender contigo. Por tu apoyo y por tantas charlas en las horas del café. A la Dra. Balboa. Sabela, iSabella para los amigos. No figuras en esta Tesis como codirectora (no haré mas comentarios al respecto) ni tutora pero tu aportación ha sido fundamental, sobretodo en estos últimos meses. Me has enseñado mucho desde que entré por la puerta del laboratorio, demasiadas para enumerarlas. A nivel personal poco que decir, sabes que aunque me meta contigo cada día (la tensión de la Tesis ya sabes) te aprecio mucho. Y mucho nos hemos reído juntos. Reconocimiento merecido para mis compañeros de laboratorio, que tantas horas han compartido conmigo. Trabajar con ellos ha sido lo más fácil en estos años (a pesar del desorden de algunos), con un ambiente que muchos envidian. Es otra de las cosas de las cuales presumo con mis amigos. Esta tesis también es de ellos. Gracias por todo vuestro apoyo, por las horas de conversaciones (sin sentido a veces), por las cañas que hemos disfrutado después de largos días, por las tonterías y juegos con hielo seco. De todos he ido aprendiendo a lo largo de estos años. Millones de gracias le debo a Ana, sin ella probablemente seguiría dando vueltas sobre mi mismo como cuando empecé. Me enseñaste a trabajar en un laboratorio, buscar secuencias, cepas y miles de cosas mas. Mucha paciencia tuviste conmigo. A Javi le debo su compañía en un laboratorio dominado por mujeres. Por sus pilas de cajas de puntas para rellenar los viernes…. Por compartir horas de trabajo pero también de diversión. A Alba, porque empezó conmigo esta andadura y por ser una de las mejores personas que jamás he conocido y una gran amiga. Siempre te he admirado y me siento orgulloso de ti. A Noemí, por contagiar su alegría desde su laboratorio y compartir el estrés de estar acabando una Tesis conmigo. A Diego, por tus “papelitos”, tus agobios repentinos y por muchas risas que nos hemos echado desde que entraste. A Miguel, porque siempre es un placer poder hablar contigo de deporte y en concreto de ciclismo, que sabes que me apasiona. A Quique, porque aunque llegaste hace poco encontré un buen amigo en ti. Muchas batallas tenemos tu y yo. A Imen, porque hablar contigo significa reírme a carcajadas y tu autenticidad. A Berta, por ser una maravillosa persona y una trabajadora ejemplar. A Celsa y su eterna amabilidad. A Sol por aceptarme en su laboratorio y ayudarme con horas de ácidos grasos. A todos los que habéis pasado por el laboratorio, Ale, Carmen, David, Asmine, Nuria… To people in Charlotte, for made my stage in America really comfortable. To Dr. Oliver for give the chance to work at his lab. To Mez, Brtiney and Tiffany for your help at the lab and the fun we had in our free time. A mis amigos de la carrera/Santiago, con los que he pasado los mejores años de mi vida. Aún tenemos mucho que disfutar y celebrar juntos. Sois geniales. A Brais y Olalla, por apoyarme estos últimos meses complicados y geniales a la vez. Me habeis dado mucho. A Lore (herriko-chica) por abrirme los ojos y apoyarme, y también por los buenos momentos que hemos pasado en los últimos tiempos. A mis amigos desde que era pequeño, que vieron como me escapaba a Santiago para empezar una nueva etapa de mi vida. También a Susi, por acompañarme tanto tiempo en este viaje y por aguantarme tanto. Mención especial merecen mi familia. A mis padres por su entrega y confianza en mi. A mi madre por inculcarme esa calma y paciencia, y por enseñarme a no darme por vencido nunca. Por enseñarme que el esfuerzo siempre tiene su recompensa. Y por su inagotable comprensión. Nire aitari, hainbeste ezagutza partekatzen nirekin eta erakutsi beharra espiritu kritikoa mantentzea. Joan-erako, hau zuretzat da. Por abrir el camino y mostrármelo. Estoy seguro de que encontrarás lo que buscas y te mereces. A toda mi familia. ¡Mirad en lo que habeis conseguido convertirme! ! Int J Syst Evol Microbiol. doi: 10.1099/ijsem.0.001705. Índice de impacto: 2,439; Q3 en Microbiology. CAPITULOS EN LIBROS. Romalde JL, Diéguez AL, Doce A, Lasa A, Balboa S, López C, BeazHidalgo R. 2012. Advances in the Knowledge of the microbiota associated with clams from natural beds, p 166 - 190. En F. da Costa (Ed.) Clam Fisheries and Aquaculture.. Nova Science Publishers, Inc. ISBN 978-1-62257-518-3. Balboa S, Lasa A, Gerpe D, Diéguez AL, Romalde JL. 2016. Microbiota associated to clams and oysters: a key factor for culture success, p 39 – 66. En JL Romalde (Ed.) Oysters and clams: cultivation, habitat threats and ecological impact. Nova Science Publishers, Inc. ISBN 978-163485-074-2. ! RESUMEN ! RESUMEN: El estudio de la microbiota asociada a diferentes especies de almeja cultivada es importante, por la capacidad que tienen de concentrar microorganismos, siendo útil para el éxito de los cultivos, pero también para la detección de posibles patógenos de especies con interés acuícola, y la identificación y descripción de nuevas especies bacterianas. Los estudios que analizan las comunidades microbianas en almejas todavía son escasos. Uno de los trabajos mas extensos fue el realizado por nuestro grupo de investigación en el que se detectó un gran número de aislados con metabolismo fermentativo y oxidativo de los cuales un importante número no fue identificado. Sobre esta base y a lo largo de este trabajo se han identificado cinco nuevos taxones bacterianos. Dos de ellos miembros del género Vibrio, una especie del género Lacinutrix y dos pertenecientes al género Marinomonas. Además, se analizaron los genomas de tres posibles nuevas especies del género Psychrobacter con interés potencial en biorremediación. En esta Memoria también se incluye la primera identificación de Vibrio toranzoniae, descrita en este trabajo, asociada a mortalidades de peces y se demuestra el potencial patógeno de los aislados de V. toranzoniae procedentes de Chile mientras que las cepas aisladas de almeja no presentaron actividad patógena frente a peces. El análisis genómico comparativo realizado entre la cepa tipo de la especie y un representante de los aislados chilenos mostró las diferencias en los factores de virulencia que permiten explicar este comportamiento. El estudio de los mecanismos de persistencia en el ambiente de esta especie en condiciones adversas demostró que estas cepas siguen ! estrategias diferentes. Mientras la cepa tipo sobrevive durante estas condiciones entrando en el estado viable no cultivable, la cepa representativa chilena es capaz de tolerar estas limitaciones y mantener intacta la capacidad para crecer en los medios de cultivo. PALABRAS CLAVE: Microbiota asociada a almeja, nuevos taxones bacterianos, Vibrio toranzoniae, virulencia, mecanismos de persistencia. ! RESUMO: O estudo da microbiota asociada a diferentes especies de ameixa cultivada é importante, pola capacidade de acumular microorganismos, sendo útil para o éxito dos cultivos, pero tamén para a detección de posibles patóxenos de especies con interese acuícola, e a identificación e descrición de novas especies bacterianas. Os estudos que analizan as comunidades microbianas en ameixas aínda son escasos. Un dos traballos mais extensos foi o realizado polo noso grupo de investigación no que se detectou un gran número de illados con metabolismo fermentativo e oxidativo dos cales un importante número non foi identificado. Sobre esta base e ao longo deste traballo identificáronse cinco novos taxones bacterianos. Dous deles membros do xénero Vibrio, unha especie do xénero Lacinutrix e dous pertencentes ao xénero Marinomonas. Ademais, analizáronse os xenomas de tres posibles novas especies do xénero Psychrobacter con potencial interese en biorremediación. Nesta Memoria tamén se inclúe a primeira identificación de Vibrio toranzoniae, descrita neste traballo, asociada a mortalidades de peces e demóstrase o potencial patóxeno dos illados de V. toranzoniae procedentes de Chile mentres que as cepas illadas de ameixa non presentaron actividade patóxena frente a peces. A análise xenómica comparativa realizada entre a cepa tipo da especie e un representante dos illados chilenos mostrou as diferenzas nos factores de virulencia que permiten explicar este comportamento. O estudo dos mecanismos de persistencia no ambiente desta especie en condicións adversas demostrou que estas cepas seguen ! estratexias diferentes. Mentres a cepa tipo sobrevive durante estas condicións entrando no estado viable non cultivable, a cepa representativa chilena é capaz de soportar estas limitacións e manter intacta a capacidade para crecer nos medios de cultivo. PALABRAS CHAVE: Microbiota asociada a ameixa, novos taxones bacterianos, Vibrio toranzoniae, virulencia, mecanismos de persistencia. ! SUMMARY: The study of the microbiota associated to different species of reared clam is important, because of their ability to concentrate microorganisms, and can be useful for the success of the cultures, but also for the detection of potential pathogens of aquaculture species, and the identification and description of new bacterial species. Studies analyzing microbial communities in clams are still scarce. One of the most extensive studies carried out by our research group detected a large number of isolates with fermentative and oxidative metabolism of which an important number was not identified. On this basis and throughout this work five new bacterial taxa have been identified. Two of them are members of the genus Vibrio, one species of the genus Lacinutrix and two belonging to the genus Marinomonas. In addition, we analysed the genomes of three possible new species of the genus Psychrobacter with potential interest in bioremediation. In the present study, we also included the first identification of Vibrio toranzoniae, described in this work, associated with fish mortalities and also we demonstrated the pathogenic potential of V. toranzoniae isolates from Chile while the strains isolated from clams did not show pathogenic activity against fishes. The comparative genomic analysis carried out between the type strain of the species and a representative of the Chilean isolates showed the differences in the virulence factors that give us clues to understand this behaviour. The study of the persistence mechanisms in the environment of this species under harsh conditions showed that these strains follow different strategies. While the type strain survives during these ! conditions entering the viable but non-culturable state, the Chilean representative strain is able to bear these limitations and maintain intact the ability to grow in the culture media. KEYWORDS: Associated microbiota to clams, new bacterial taxa, Vibrio toranzoniae, virulence, persistence mechanisms. ! ÍNDICE I. RESUMEN ................................................................................................. 1 II. SUMMARY .............................................................................................. 9 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................. 19 1.1. MICROBIOTA GENERAL ASOCIADA A ALMEJA CULTIVADA ................................................................................. 19 1.1.1. Género Vibrio ......................................................................... 23 1.1.1.1. Características generales ............................................... 23 1.1.1.2. Taxonomía y filogenia .................................................. 26 1.1.1.3. Ecología del género Vibrio ........................................... 30 1.1.2. Bacterias con metabolismo oxidativo ..................................... 33 1.1.2.1. Género Lacinutrix ......................................................... 34 1.1.2.2. Género Marinomonas ................................................... 35 1.1.2.3. Género Psychrobacter .................................................. 36 1.2. PATÓGENOS DEL GÉNERO VIBRIO PARA ESPECIES CON INTERÉS ACUÍCOLA ........................................................ 37 1.2.1. Vibrio anguillarum ................................................................. 39 1.2.2. Vibrio vulnificus ...................................................................... 42 1.2.3. Vibrio splendidus .................................................................... 45 1.2.4. Vibrio aestuarianus ................................................................ 46 1.2.5. Vibrio tapetis .......................................................................... 47 1.2.6. Vibrio harveyi ......................................................................... 49 1.3. MECANISMOS DE ADAPTACIÓN Y PERSISTENCIA EN EL MEDIOAMBIENTE ................................................................ 50 ! ! 1 RESUMEN La microbiota asociada a moluscos bivalvos se ha diferenciado, generalmente, en microbiota “residente” que es aquella que es estable en el hospedador y no sufre la influencia del ambiente, y la microbiota “en transición”, que varía en función de las condiciones ambientales. El estudio de la microbiota asociada a diferentes especies de almeja cultivada es importante para determinar el estado sanitario de las poblaciones siendo útil, por tanto, para el éxito de los cultivos. Sin embargo, los estudios que analizan las comunidades microbianas en almejas todavía son escasos. En general, los estudios que existen hasta el momento se centran en la búsqueda de grupos bacterianos concretos y de bacterias con potencial patogénico para moluscos. Uno de los trabajos más extensos fue el realizado por nuestro grupo de investigación en el que se detectó y, posteriormente, se estudió un gran número de aislados (1400) con metabolismo fermentativo y oxidativo, obtenidos de dos especies de almeja y en muestreos realizados a lo largo de dos años. Del total de cepas estudiadas un importante número no llegó a ser identificado. Entre las bacterias fermentativas que pudieron ser identificadas a nivel de especie se observó una predominancia de V. splendidus y otras especies del clado, pero también en menor proporción de V. alginolyticus, V. diazotrophicus o V. aestuarianus. En cuanto a los aislados con metabolismo aeróbico, la identificación en base a la secuencia del gen ARNr 16S mostró que los géneros más abundantes eran Pseudoalteromonas y Shewanella. En menor proporción también se encontraron otros como Tenacibaculum, Psychrobacter, Alteromonas, Polaribacter, Luteimonas, Marinomonas o Lacinutrix. En este estudio ! ! 2 también se analizó el potencial patógeno o probiótico de diferentes representantes de los grupos bacterianos encontrados. Sobre esta base y a lo largo de este Memoria nos propusimos los objetivos de describir nuevos taxones bacterianos a partir de la caracterización de aislados con metabolismo fermentativo (ocho aislados) y oxidativo (once aislados). El estudio se llevó a cabo empleando una aproximación polifásica mediante la caracterización fenotípica, quimiotaxonómica y análisis del gen ARNr 16S y otros genes esenciales de los diferentes aislados. Esto ha permitido describir cinco nuevas especies bacterianas, además de tres posibles nuevas especies. Por un lado, el análisis polifásico de cuatro cepas con metabolismo fermentativo permitió asignar estos aislados al género Vibrio. El análisis de la secuencia del gen ARNr 16S y el análisis multilócico en base a la secuencia de cinco genes esenciales (atpA, recA, pyrH, rpoA y rpoD) junto con los experimentos de hibridación ADN-ADN confirmaron que estas cepas representaban una nueva especie, para la cual se propuso el nombre de Vibrio toranzoniae sp. nov. Por otro lado y empleando la misma aproximación, otro grupo de cuatro cepas se identificaron como miembros de este mismo género, situándose en una posición intermedia entre los clados Splendidus y Anguillarum y filogenéticamente próxima a la especie V. tapetis. Los resultados de la hibridación ADN-ADN permitieron confirmar estos resultados, dando lugar a la descripción de Vibrio cortegadensis sp. nov., y que representa una especie “huérfana” (orphan species). En esta Memoria también se incluye el análisis de diferentes aislados con metabolismo aerobio. Entre estos se analizó un grupo de cinco bacterias inmóviles y que forman colonias pigmentadas de color ! ! 3 amarillo. El análisis de la secuencia del gen ARNr 16S permitió identificarlas como miembros del género Lacinutrix, con una similitud del 97% con la especie Lacinutrix mariniflava. La caracterización fenotípica y los resultados de los ensayos de hibridación ADN-ADN confirmaron que estos aislados constituían una nueva especie dentro del género, para la cual se propuso el nombre de Lacinutrix venerupis sp. nov. Otro grupo de cepas estudiados dentro del marco de esta Memoria incluía tres aislados de bacterias móviles no pigmentadas. El análisis del gen ARNr 16S permitió identificar a los aislados como miembros del género Marinomonas, próximos a la especie M. aquimarina. Sin embargo, el análisis filogenético de la secuencias mostraron que los tres aislados formaban dos grupos diferentes y distantes respecto de esta especie. Las hibridaciones ADN-ADN in vitro rindieron valores inferiores al límite recomendado para la delimitación de nuevas especies con respecto a la especie de referencia y también entre los dos grupos de aislados. Estos resultados se confirmaron con los valores obtenidos in silico (ANIm, ANIb, OrthoANI y eDDH). Así, se describieron dos nuevas especies dentro del género, Marinomonas gallaica sp. nov. y Marinomonas atlantica sp. nov. También, se analizaron los genomas de tres cepas con metabolismo aerobio. En base a la secuencia del gen ARNr 16S los aislados pudieron ser identificados como miembros del género Psychrobacter. La similitud en este gen respecto de las especies más próximas y también entre estos tres aislados es inferior al límite establecido para la descripción de nuevas especies y por lo tanto, representarían tres nuevos taxones del género Psychrobacter. En el análisis de los genomas se detectó la presencia una serie de características interesantes, como son genes relacionados con la ! ! 4 resistencia a metales pesados y a antibióticos, o la presencia de genes de virulencia como un sideróforo tipo vibrioferrina y otro de tipo aerobactina. Otra característica importante encontrada es la presencia de un gen codificante para una reductasa de mercurio, implicada en la detoxificación del mismo, y un grupo de genes de resistencia a mercurio. En este trabajo también se incluye la primera identificación de Vibrio toranzoniae como potencial patógeno de especies con interés acuícola. Así, se aislaron tres cepas bacterianas a partir de congrio rojo (Genypterus chilensis) cultivado en Chile, que presentaban lesiones externas y en las branquias. El análisis filogenético en base a la secuencia del gen 16S ARNr junto con las secuencias de cuatro genes esenciales (atpA, pyrH, rpoA y rpoD) mostró que estos aislados agrupaban con la especie V. toranzoniae. Los valores obtenidos en las hibridaciones ADN-ADN confirmaron estos resultados. Además, los resultados obtenidos en los ensayos de infectividad confirmaron el potencial patógeno de los aislados chilenos, mientras que los aislados de almeja no produjeron mortalidades. El hecho de que los aislados chilenos sean capaces de establecer una infección en los peces y las cepas aisladas de almeja no, hizo pensar que existen mecanismos y factores de virulencia subyacentes que expliquen este comportamiento diferencial. Para comprobar esta hipótesis se secuenciaron los genomas de la cepa tipo de la especie y un cepa representativa de los aislados chilenos y se sometieron a un análisis comparativo. La secuenciación del genoma bacteriano de la cepa tipo de la especie V. toranzoniae mostró la presencia de grupos genes importantes para la persistencia de esta bacteria en el ambiente, así como algunos genes relacionados con mecanismos de virulencia. ! ! 5 La comparación de los genomas mostró una elevada homología a lo largo de todo el genoma. Sin embargo, la presencia de pequeñas regiones con una homología inferior al 70% indican zonas con presencia de grupos de genes de interés para el análisis comparativo. Estas regiones incluyeron, entre otros, islas genómicas y de patogenicidad como resultado probablemente de fenómenos de transferencia horizontal. La búsqueda de estas islas genómicas dio como resultado la identificación de importantes factores de virulencia, y es aquí donde encontramos las principales diferencias como son la síntesis de capsula, los sistemas de adquisición de hierro o proteínas con actividad citotóxica. Entre los sistemas implicados en la síntesis de capsula encontramos que la cepa tipo carece del gen wzy que codifica para una proteína implicada en la elongación de los polisacáridos de la cápsula y de otra necesaria en la ruta de síntesis de ramnosa que está asociada a polisacáridos de la cápsula que si está presente en la cepa R17. De esta forma, la cepa chilena R17 (productora de cápsula), a diferencia de la cepa tipo, sería capaz de resistir dentro del organismo y extender la infección. Estas observaciones coinciden con la morfología de las colonias cuando crecen en medio sólido. Donde encontramos las diferencias mas importantes es en los mecanismos de captación de hierro. Resulta interesante observar que la cepa R17 posee un sistema para incorporar y asimilar hierro (kit de ensamblaje de sideróforos) que está ausente completamente en la cepa CECT 7225T. Además, en el genoma de ambas cepas encontramos el grupo de genes para la producción de un sideróforo tipo aerobactina. Los genes responsables de sintetizar el sistema de transporte y las proteínas receptoras están presentes en ambas cepas, pero los genes que ! ! 6 codifican el sideróforo sólo se encuentran en la cepa R17. Si bien es cierto que ambas cepas estudiadas poseen otros sistemas de adquisición de hierro, estos sideróforos tipo aerobactina están ampliamente descritos como sistemas fundamental en el desarrollo del proceso infeccioso y en la colonización de órganos internos en otras especies bacterianas. Otro aspecto importante a la hora de determinar la virulencia bacteriana viene dada por la capacidad de producir daño celular mediante la producción de proteínas con actividad citotóxica. La actividad citotóxica que pueden desarrollar la cepa tipo y la cepa chilena se debe en parte a la actividad hemolítica ya que, en este caso, ambas cepas poseen genes codificantes para este tipo de proteínas. Otro tipo de actividad citotóxica que son capaces de desarrollar estas cepas sería la derivada de la producción de la toxina RTX. A pesar de que observamos que el gen codificante para la toxina está presente en ambas cepas, la longitud del gen en la cepa CECT 7225T es relativamente más pequeño que el homólogo en la cepa R17, lo que podría provocar que la proteína codificada perdiera la función en la cepa tipo. Las observaciones realizadas al comparar los genomas de estas cepas abren nuevos frentes en el estudio en la patogenicidad de los diferentes aislados de V. toranzoniae. Es necesario diseñar y realizar diferentes experimentos para tratar de entender el papel que juegan los diferentes factores de virulencia encontrados. También es necesario estudiar la ruta de infección que sigue este patógeno en los peces, desde la colonización del hospedador a la proliferación y expansión del patógeno por los órganos internos. Por su parte, los ensayos de supervivencia realizados en este trabajo ponen de manifiesto las diferencias en la respuesta frente a ! ! 7 condiciones estresantes de las cepas CECT 7225T y R17. Después de 49 días en un ambiente bajo en nutrientes y a baja temperatura y salinidad, la cepa tipo entró en el estado VNC mientras la cepa R17 mantuvo la intacta su cultivabilidad, aunque mostrando una reducción en el número de células cultivables. Además, cepa CECT 7225T fue capaz de recuperar la cultivabilidad (“resucitar”) después de restablecer las condiciones óptimas para el crecimiento. Los resultados obtenidos indican que la cepa R17 podría necesitar un período mas largo para alcanzar el estado VNC o su incapacidad para entrar en dicho estado. Como resultado del análisis de expresión de los genes en ambas cepas durante el período de incubación bajo condiciones de estrés, y en estado VNC y durante la resucitación en el caso de la cepa CECT 7225T, observamos comportamientos similares excepto en el caso del gen envZ. La sobreexpresión de este gen, que codifica para una proteína osmorreguladora, en la cepa tipo parece clave en la respuesta del mismo ante las condiciones estresantes a las que está sometido. De este punto de vista, este gen parece tener una función relevante en la adaptación de la bacteria al ambiente. En este mismo sentido, en la cepa chilena R17 se observa un descenso en la expresión que es similar a otros vibrios y que podría estar relacionado con la incapacidad para entrar en el estado VNC. El cambio en la forma celular de ambas cepas, pasando de una forma bacilar a cocoide, está en concordancia con los resultados en la expresión del gen mreB. Este cambio en la morfología se ha descrito como un indicativo de la entrada de las bacterias en el estado VNC. Sin embargo los resultados que obtuvimos, y de acuerdo con otros trabajos parecen indicar que se trata de una adaptación general de la bacteria al estrés y no una respuesta específica de las células en estado VNC. Por ! ! 8 su parte, la expresión del gen ftsZ también descendió en ambas cepas durante todo el experimento, de forma similar a lo encontrado en otros vibrios. En estas condiciones las bacterias no tienen los recursos necesarios para su división, por lo que pueden prescindir de la maquinaria necesaria para este proceso celular. Es interesante estudiar los mecanismos que promueven la supervivencia de las cepas de V. toranzoniae en el ambiente, ya que se trata de una especie con potencial patógeno. Las observaciones obtenidas en los ensayos preliminares de unión a quitina y formación de biofilm de los dos aislados de V. toranzoniae muestran una capacidad similar para ambas de persistencia en el ambiente. Las diferencias observadas en cuanto al potencial patogénico y a los mecanismos de supervivencia en el ambiente entre cepas de V. toranzoniae hacen de esta especie un buen modelo para el estudio de estas características en el futuro. ! ! 9 SUMMARY The microbiota associated with bivalve molluscs has generally been differentiated into "resident" microbiota, which is stable in the host and is not influenced by the environment, and "in transition" microbiota, which varies according to the environmental conditions. The study of the microbiota associated to different species of reared clam is important to determine the health status of the populations and, therefore, useful for the success of the cultures. However, studies analysing microbial communities in clams are still scarce. In general, the studies published focus so far on the search for specific bacterial groups with pathogenic potential for molluscs. One of the most extensive studies was carried out by our research group in which a large number of isolates (1400) with fermentative and oxidative metabolisms were obtained, isolated from two species of clam during a two-year sampling program. Of the total number of strains studied, a significant number could not be identified. Among the fermentative bacteria that could be identified at the species level, they observed a predominance of V. splendidus and other species of the clade, but also in a lower proportion V. alginolyticus, V. diazotrophicus or V. aestuarianus. The identification of isolates with aerobic metabolism based on the sequence of the 16S rRNA gene showed that the most abundant genera were Pseudoalteromonas and Shewanella. To a lesser extent, they also found others such as Tenacibaculum, Psychrobacter, Alteromonas, Polaribacter, Luteimonas, Marinomonas or Lacinutrix. In this study they also analysed the pathogenic or probiotic potential of different representatives of the bacterial groups. ! ! 10 Based on this study and throughout this work we propose the objectives of describing new bacterial taxa by the characterising isolates with fermentative (eight isolates) and oxidative (eleven isolates) metabolism. The study was carried out using a polyphasic approach including the phenotypic characterization, chemotaxonomic and analysis of the 16S rRNA gene and other housekeeping genes of the different isolates. This allowed the description of five new bacterial species, in addition to three possible new species. The polyphasic analysis of four strains with fermentative metabolism allowed the assignation of these isolates to the genus Vibrio. Thus, based on the sequence of the 16S rRNA gene, the multilocus sequence analysis based on five housekeeping genes (atpA, recA, pyrH, rpoA and rpoD) and DNA-DNA hybridization experiments these strains were identified as a new species, for which the name Vibrio toranzoniae sp. nov. was proposed. On the other hand and using the same approach, another group of four strains were identified as members of this genus being allocated in an intermediate position between the Splendidus and Anguillarum clades and phylogenetically close related to V. tapetis. The results of the DNA-DNA hybridization confirmed these results, allowing the description of Vibrio cortegadensis sp. nov., representing an "orphan species". The results presented here also included the analysis of different isolates with oxidative metabolism. A group of five non-motile bacteria forming yellow pigmented colonies were analysed. Analysis of the 16S rRNA gene sequence allowed the identification of this strains as members of the genus Lacinutrix, with a similarity of 97% with the species Lacinutrix mariniflava. The phenotypic characterization and results of the DNA-DNA hybridization assays confirmed that these ! 1. INTRODUCCIÓN ! ! ! Introducción 19 1.1. Microbiota general asociada a almeja cultivada. El estudio de la microbiota asociada a diferentes especies de almeja cultivada es importante desde el punto de vista sanitario para determinar el estado general de las poblaciones, así como para conocer las causas biológicas de brotes recurrentes que afectan a estos organismos. Sin embargo, los estudios que analizan la composición, diversidad y distribución de bacterias asociadas a estos moluscos son escasos. En general, estos estudios, existentes desde los años 60, coinciden en que hay un predominio de bacterias Gram negativas sobre Gram positivas, siendo uno de los grupos mayoritarios el género Vibrio (Beenson y Johnson, 1967; Colwell y Liston, 1960; Kueh y Chan, 1985; Prieur y col., 1990; Pujalte y col., 1999). En este sentido, gran parte de los estudios se han centrado en el estudio de bacterias con potencial patogénico para moluscos y concretamente para almejas. Es por esto que el género Vibrio es uno de los taxones más estudiados, ya que es uno de los principales géneros bacterianos que afectan a cultivos de moluscos bivalvos. Dentro de este género se encuentra la especie V. tapetis causante de la enfermedad del anillo marrón (BRD, Brown Ring Disease) en almejas (Borrego y col., 1996), única enfermedad con etiología bacteriana conocida hasta el momento que afecta a almejas adultas. Por otro lado, también se han descrito especies bacterianas marinas con efectos beneficiosos (por ejemplo, con actividad inhibitoria frente a patógenos de larvas) asociadas a la microbiota presente en plantas de cultivo de diferentes moluscos (Prado y col., 2009). ! ! Introducción 20 La microbiota presente en organismos marinos se ha diferenciado en microbiota “residente” y microbiota “en transición”. El primer tipo de microbiota es aquella que es estable en el hospedador y que no sufre la influencia del ambiente, mientras que la microbiota “en transición” varía en función de las condiciones ambientales. Sin embargo, Jorquera y col. (2001) propusieron que la microbiota “en transición” sería la única presente en moluscos bivalvos. A estas poblaciones bacterianas se les han asignado un gran número de funciones, desde alimento, fuente de vitaminas y factores de crecimiento, así como un papel importante como mecanismo para evitar la colonización por parte de patógenos (McHenery y Birkbeck, 1985; Prieur y col., 1990; Seguineau y col., 1996). Debido al mecanismo de filtración por el cual se alimentan las almejas, éstas acumulan una gran cantidad de bacterias que forman parte de las poblaciones microbianas naturales del medio acuático. Las especies identificadas como parte de la microbiota pertenecen a diferentes géneros como Vibrio, Pseudomonas, Acinetobacter, Photobacterium, Moraxella, Aeromonas, Micrococcus y Bacillus (Murchelano y Brown, 1970; Kueh y Chan, 1985; Prieur y col., 1990). Como se ha mencionado anteriormente, no existen suficientes estudios intensivos sobre la microbiota asociada a diferentes especies de almejas cultivadas. Uno de los escasos estudios existentes hasta la fecha, realizado por nuestro grupo de investigación, analizó las poblaciones bacterianas asociadas a diferentes especies de almejas cultivadas en Galicia (Ruditapes decussatus y R. philippinarum), con el objetivo de conocer la diversidad de especies presentes, las posibles diferencias en función del hospedador y/o localizaciones geográficas y la distribución ! ! Introducción 21 estacional en los diferentes órganos (Romalde y col., 2013). Los resultados obtenidos mostraron que la densidad bacteriana sufría un incremento estacional durante los meses con temperaturas más altas, coincidiendo con otros estudios previos en el delta del Ebro y en el Mar Mediterráneo (Ortigosa y col., 1989; Montilla y col., 1994; Arias y col., 1999). A nivel de órganos (hepatopáncreas, manto, gónada y branquia), la composición poblacional fue similar y dependiente de la temperatura, aunque en las gónadas se encontró mayor presencia de bacterias totales y vibrios en algunas de las localizaciones. La composición bacteriana fue similar asimismo entre las diferentes localizaciones geográficas, resultados que corroboraban los encontrados por Arias y col. (1999). Estos autores observaron una mayor incidencia de ciertas especies en los meses de verano mientras que otras eran dominantes a lo largo del año en bivalvos del mar Mediterráneo. Sin embargo no pudieron relacionar la diversidad bacteriana con una localización geográfica determinada. De todos los aislados que se obtuvieron durante los años que duró el estudio, algo más de 1400 en total, aproximadamente el 60% se identificaron como vibrios mientras que el resto de aislados se correspondieron con bacterias con metabolismo aeróbico. La identificación en base a perfiles fenotípicos a nivel de especie de los aislados del género Vibrio mostró una gran presencia de V. splendidus y otras especies del clado, y también en menor proporción de V. alginoltycus, V. diazotrophicus o V. aestuarianus. De nuevo, estos resultados coincidieron con otros estudios previos (Ortigosa y col., 1989; Montilla y col., 1994; Pujalte y col., 1999; Castro y col., 2002). Diferentes representantes de los grupos fenotípicos se analizaron mediante AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) y se ! ! Introducción 22 observó que solo una parte de los aislados se pudieron identificar a nivel de especie (V. cyclitrophicus, V. splendidus, V. alginolyticus, V. diabolicus, etc.), siendo el más variable el grupo Splendidus (BeazHidalgo y col., 2008). En cuanto a los aislados con metabolismo aeróbico, que constituían en torno a un 35% de la microbiota asociada, se identificaron mediante el análisis del gen ARNr 16S. Los géneros más abundantes eran Pseudoalteromonas y Shewanella (52,8 y 16% respectivamente). Otros géneros presentes en el estudio fueron Tenacibaculum, Psychrobacter, Alteromonas, Polaribacter, Luteimonas, Marinomonas o Lacinutrix. En general, las diferentes técnicas empleadas mostraron que gran parte de los aislados no se podían asignar a las especies descritas en el momento del estudio, y que un número importante de estos podrían suponer nuevos taxones. También en este estudio se estudió la patogenicidad y los efectos inhibitorios frente a patógenos de peces y moluscos de diferentes representantes de los grupos bacterianos encontrados. Lo que se observó es que tan solo una de las nuevas posibles especies del género Vibrio (V. celticus) presentaba potencial patógenico, y también algunas posibles nuevas especies de las bacterias oxidativas, pertenecientes a los géneros Pseudoalteromonas, Alteromonas y Tenacibaculum. Los aislados que se ensayaron frente a patógenos y mostraron efectos inhibitorios pertenecieron a los géneros Pseudoalteromonas, Tenacibaculum, Shewanella, Psychrobacter, Aquimarina o Lacinutrix, entre otros (BeazHidalgo y col., 2008). Es importante tener en cuenta que todos los estudios existentes hasta el momento se realizaron en base a técnicas clásicas dependientes ! ! Introducción 23 de cultivo, las cuales llevan implícita una infraestimación de la diversidad bacteriana presente en las muestras debido a los problemas de cultivabilidad que presentan un gran número de bacterias. La irrupción de nuevas técnicas de secuenciación masiva ha abierto un abanico de posibilidades a la hora de estudiar la microbiota presente en una muestra. Hasta el momento, el trabajo más completo empleando las plataformas de secuenciación masiva en moluscos es el realizado por Trabal y col. (2014) en tres especies diferentes de ostra (Crassostrea corteziensis, C. gigas y C. sikamea). En total identificaron 243 géneros bacterianos, mostrando una gran diversidad que no se había detectado previamente en moluscos. La aplicación de estas técnicas en almejas cultivadas permitirá una caracterización más precisa de la microbiota asociada y también desentrañar el papel que juegan las bacterias presentes. 1.1.1. Género Vibrio 1.1.1.1. Características generales La primera descripción de una especie del género Vibrio la realizó Pacini en 1854 cuando descubrió el agente causal del cólera. Posteriormente fue Robert Koch quién identificó y describió con mayor detalle Vibrio cholerae (1883,1884). Desde ese momento, el número de especies pertenecientes al género se ha incrementado considerablemente y actualmente existen más de 125 especies descritas. De acuerdo con el Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology (2011) los vibrios pertenecen a la clase Gammaproteobacteria, Gram negativas por lo tanto, y se caracterizan por ser bacterias móviles, con ! ! Introducción 24 forma bacilar, con un tamaño entre 0,5-0,8 µm de diámetro y 1,4-2,6 µm de longitud (Farmer 3rd y col., 2005), mesofílicos y quimioorganotrofos, metabolismo anaerobio facultativo y suelen crecer en TCBS (Tiosulfato– citrato–bilis–sacarosa). La temperatura óptima de crecimiento se encuentra en el rango de 20-30 ºC, aunque algunas especies pueden crecer entre 4-40 ºC. Los vibrios son bacterias halófilas, por lo tanto precisan de Na+ para su crecimiento, con concentraciones óptimas de 1 a 3 % de NaCl generalmente. Este género es muy abundante en ambientes acuáticos, como estuarios, zonas costeras y sedimentos. Su presencia en plantas acuáticas es común (Barbieri y col., 1999; Heidelberg y col., 2002; Ortigosa y col., 1989). También se encuentran asociados a organismos marinos eucariotas, como son los cnidarios (Hoffman y col., 2012), corales (Rosenberg y col., 2002), moluscos (Sawabe y col., 2003; Romalde y col., 2013), crustáceos (Gomez-Gil y col., 1998), zooplancton (Heidelberg y col., 2002) y peces (Grisez y col., 1997; Huys y col., 2001). A nivel genómico todas las especies del género poseen dos cromosomas. Esta observación se realizó por primera vez en V. cholerae por parte de Truckis y col. (1998). El cromosoma 1 es más grande con un tamaño relativamente constante de 3 millones de pares de bases, que codifican para 2700 proteínas aproximadamente. En este cromosoma se encuentran la mayor parte de los genes esenciales para la vida y reproducción bacteriana, por ejemplo proteínas ribosomales, flagelo o replicación del ADN (Grimes y col. 2009). En cambio, el cromosoma 2 es de menor tamaño y variable, con una longitud aproximada de un millón de pares de bases que contienen en torno a 100 secuencias codificantes, que participan en procesos metabólicos y actividades ! ! Introducción 25 enzimáticas asociadas a la membrana. Este cromosoma aloja también otros genes accesorios implicados en patogenicidad, resistencia antimicrobiana y supervivencia (Makino y col., 2003; Lukjancenko y Ussery, 2014). Heidelberg y col. (2000) propusieron que el origen de este segundo cromosoma era un megaplásmido adquirido por un vibrio ancestral que posteriormente incorporó algunos genes esenciales favoreciendo su retención genética. Los genomas de las especies del género Vibrio presentan numerosas islas genómicas, pudiendo contener funciones que permiten la adaptación a ambientes específicos y, posiblemente, pueden representar eventos de especiación (Vesth y col., 2010). Desde su descubrimiento, este género ha sido un foco de atención importante ya que entre las bacterias que lo componen hay especies patógenas humanas como el propio V. cholerae, y otros patógenos como V. parahaemolyticus o V. vulnificus, pero también patógenos de organismos marinos como V. anguillarum, V. ordalii, V. harveyi o V. splendidus. Además, existen evidencias de que los vibrios participan en gran medida en los ciclos de nutrientes en ambientes acuáticos, incorporando materia orgánica disuelta en el medio (Sherr y col., 2000 y 2002), por su capacidad de producir ácidos grasos poliinsaturados y liberarlos al medio (Cotrell y col., 2003), degradar quitina (Cotrell y col., 2000), e incluso algunas especies son capaces de degradar hidrocarburos aromáticos policíclicos (Hedlund y col., 2001). ! ! Introducción 26 1.1.1.2. Taxonomía y Filogenia La familia Vibrionaceae pertenece a la clase Gammaproteobacteria y está compuesta por los géneros Aliivibrio, Catenococcus, Echinimonas, Enterovibrio, Grimontia, Photobacterium, Salinivibrio y Vibrio. De estos, el género Vibrio es el más abundante de la familia con más de 125 especies descritas y reconocidas (http://www.bacterio.net), que se encuentran agrupadas en 22 clados (Sawabe y col., 2013) (Figura 1). Figura 1. Representación de la red de descomposición filogenética de la familia Vibrionaceae en diferentes clados bacterianos en base a 8 genes esenciales (ftsZ, gapA, gyrB, mreB, pyrH, recA y topA) propuesto por Sawabe y col. 2013. ! ! Introducción 33 En este sentido, el cambio climático está recibiendo una atención creciente por el impacto que tiene sobre la vida animal marina y comunidades de plantas pero el conocimiento sobre la influencia que ejerce sobre la distribución de los procariotas es muy reducida todavía. Estudios recientes sobre la incidencia de enfermedades causadas por especies del género Vibrio han mostrado la aparición por primera vez de infecciones en países del Norte de Europa asociados a baños en aguas costeras (Semenza, 2012; Frank y col., 2006). Más recientemente, el estudio realizado por Vezzulli y col. (2016) mostró el incremento en la abundancia de vibrios a lo largo de 54 años probablemente promovido por el aumento en la SST en las costas del Atlántico Norte. 1.1.2. Bacterias con metabolismo oxidativo Los estudios de microbiota cultivable asociada a diferentes organismos marinos han empleado generalmente técnicas clásicas de caracterización fenotípica para el análisis e identificación de las bacterias que lo componen. Sin embargo, la identificación a nivel de especie de las bacterias con metabolismo aeróbico resulta complicada debido a la falta de claves de identificación apropiadas en la literatura. Esto puede estar directamente relacionado con la gran diversidad que muestran estas bacterias, incluso dentro de una misma especie o género. Además, a esto hay que sumar la baja reactividad que muestran algunas bacterias aeróbicas frente a las pruebas fenotípicas que se emplean, tanto las clásicas en tubo y placa como los sistemas miniaturizados (API y BIOLOG), dando lugar a resultados erróneos. ! ! Introducción 34 Es por esto que para realizar una correcta identificación de este grupo de bacterias el estudio taxonómico se enfoca desde punto de vista molecular, empleando la secuencia del gen ARNr 16S. A diferencia de lo que ocurre en otros grupos bacterianos, como es el caso del género Vibrio, el análisis de este gen generalmente es suficiente para una identificación precisa. 1.1.2.1. Género Lacinutrix El género Lacinutrix es un género relativamente reciente que fue propuesto por primera vez por Bowman y Nichols en el año 2005 para acomodar una bacteria aislada del copépodo Paralabidocera antarctica. Este género se encuentra dentro de la familia Flavobacteriaceae, cuyas características principales es que son bacterias Gram negativas, heterotróficas, de metabolismo aerobio y pigmentadas mostrando un color amarillo. Actualmente el género está formado por siete especies, a falta de ser validadas otros dos nuevos taxones. La mayor parte de estas bacterias fueron aisladas de ambientes marinos polares, desde un alga roja en el Antártico (Nedashkovskaya y col., 2008) a muestras de sedimentos en el Ártico y Antártico (Srinivas y col., 2013; Lee y col., 2014). Las otras especies del género se aislaron de algas marrones (Huang y col., 2016) y de algas rojas (Park y col., 2015) en el Mar de China Oriental y el Mar del Sur (Corea del Sur) respectivamente. Más recientemente, se ha descrito una especie de este género asilada de alga verde en el Mar de Japón (Nedashkovskaya y col., 2016). Este género, como otros muchos del cluster CytophagaFlavobacteria-Bacteroides (CFB), está involucrado en diferentes ciclos ! ! Introducción 35 biogeoquímicos mediante la incorporación y posterior degradación de la DOM. Este grupo no sólo juega un papel importante en estos ciclos por su abundancia en los medios acuáticos, si no también por su especialización en la degradación de biopolímeros como celulosa y quitina (Kirchman y col., 2001) y su participación en la desnitrificación de las aguas oceánicas contribuyendo en el balance general del nitrógeno (Lee y col., 2016). 1.1.2.2. Género Marinomonas El género Marinomonas (familia Oceanospirillaceae) fue propuesto por Van Landschoot y De Ley en 1983 para acomodar dos especies “atípicas” del género Alteromonas, Alteromonas communis y Alteromonas vaga. Estos autores propusieron que estas dos especies se encontraban alejadas del resto de especies del género en base a experimentos de hibridación ARNr-ADN y además observaron diferencias a nivel fenotípico, como la capacidad de degradar compuestos aromáticos o la presencia de un flagelo polar en cada extremo de la célula. Desde ese momento el número de especies del género se ha incrementado notablemente hasta alcanzar las 24 especies descritas y validadas actualmente. Las bacterias de este grupo taxonómico se caracterizan por ser aerobios estrictos, quimiorganotrofos, móviles y porque la mayoría requieren sal para su crecimiento. Un gran número de las especies descritas se han aislado de agua y sedimentos marinos, aunque también se han recuperado de corales (Chimetto y col., 2011; Kumari y col., 2014), de praderas marinas de Posidonica oceanica ! ! Introducción 36 (Espinosa y col., 2010; Lucas-Elío y col., 2011) y de la microbiota endofítica de la planta Spartina maritima (Lucena y col., 2016). Algunas bacterias del género Marinomonas han demostrado ser de interés industrial por su capacidad para producir diferentes compuestos activos superficiales (SACs, surface-active compounds) (Dang y col., 2015), o la capacidad de producir arilsulfatasas alcalinas que hidrolizan enlaces éster sulfato (Wang y col., 2015). También se ha encontrado un miembro de este género capaz de inhibir la formación de la biopelícula de V. cholerae (Rajalaxmi y col., 2016). 1.1.2.3. Género Psychrobacter El género Psychrobacter forma parte de la familia Moraxellaceae (Gammaproteobacteria). Este género fue propuesto por Juni y Heym (1986) con la descripción de la especie Psychrobacter inmobilis. Las características generales de las especies que forman este género es que son bacterias Gram negativas, con metabolismo aeróbico, psicrotolerantes, inmóviles y con morfología cocobacilar. Las bacterias de este género se han detectado en una amplia gama de muestras diferentes, desde peces, aves de corral o productos cárnicos hasta muestras de origen humano. Aunque este género tiene una distribución global, es más frecuente encontrar estas especies en ambientes fríos o polares a elevadas densidades poblacionales que en regiones templadas (Rodrigues y col., 2009). Actualmente, el género está formado por 38 especies descritas y validadas. De estas, 18 han sido aisladas de ambientes que se encuentran a bajas temperaturas, incluyendo sedimentos y lodo procedentes de un glaciar Antártico (Bozal y col. ! ! Introducción 37 2003), suelos Antárticos (Bowman y col., 1996), hielo marino (Romanenko y col., 2004), suelos alpinos (Srinivas y col., 2011), permafrost Siberiano (Bakermans y col., 2006), agua de mar Ártica (Zeng y col., 2015) y de un glaciar Ártico (Zeng y col., 2016). En algunos casos, en este género el análisis del gen ARNr 16S presenta algunas limitaciones a la hora de realizar la filogenia del género ya que hay especies que comparten una similitud entre el 99-100% en la secuencia. Este es el caso de las especies P. luti y P. okhotskensis, P. aquaticus y P. vallis, P. faecalis y P. pulmonis, P. marincola y P. submarinus, y no es posible por tanto diferenciarlas. Por ello, Bakermans y col. (2006) propusieron el gen que codifica la subunidad B de la girasa (gyrB) como mejor marcador molecular para establecer las relaciones filogenéticas del género. 1.2. Patógenos del género Vibrio en especies con interés acuícola. La acuicultura es la cría de organismos acuáticos incluyendo peces, moluscos, crustáceos y plantas acuáticas y supone un sector industrial emergente que requiere de una investigación constante. La producción mundial en el año 2014 fue aproximadamente de 73,7 millones de toneladas, representando un total del 44% respecto de las capturas extensivas para el consumo humano (FAO, 2016). En muchos casos, la aparición y desarrollo de una infección en peces o moluscos bivalvos es el resultado de la interacción entre hospedador, ambiente y patógeno, pudiendo ser este un oportunista más que un patógeno primario (Romero y col., 2014). Por lo tanto, el estudio de las principales enfermedades que afectan a las diferentes especies ! ! Introducción 38 acuícolas de interés requiere de una aproximación multidisciplinar entre estos tres aspectos. Los principales agentes infecciosos que se describen en los sistemas de cultivo también están presentes en las poblaciones salvajes de los mismos. Sin embargo, éstos rara vez ocasionan mortalidades en los ambientes naturales debido a la falta de las condiciones de estrés que suponen las instalaciones de cultivo para los organismos marinos. La vibriosis es la forma genérica para denominar las enfermedades causadas por las diferentes especies del género Vibrio en animales acuáticos ya sean peces, moluscos bivalvos o crustáceos. Diferentes especies del género Vibrio son conocidos patógenos bacterianos para especies marinas cultivadas. Por ejemplo, V. anguillarum, V. vulnificus, V. splendidus o V. aestuarianus son algunos de los principales patógenos de diferentes especies de peces como salmones, anguilas, rodaballo, lubina o bacalao entre otros (Austin y Austin, 2007), mientras que V. harveyi es el principal patógeno de las especies de langostino Penaeus vannamei y Peaneus monodon (LavillaPitogo y col., 1998; Austin y col., 2003). Por otro lado, Vibrio tapetis es el agente causal de la única enfermedad (BRD) que afecta a almejas adultas (Ruditapes phillipinarum) (Borrego y col., 1996; Paillard, 2004). Recientemente, se han identificado dos nuevas especie, V. bivalvicida y V. europaeus (Dubert y col., 2016 a,b), esta última después de la reclasificación de la subespecie V. tubiashii subsp. europaeus, como patógenos de larvas de diferentes moluscos bivalvos. Estos se unen a las especies patógenas para larvas conocidas anteriormente: V. tubiashii, V. alginolyticus, V. splendidus, V. pectenicida, V. coralliilyticus, V. aestuarianus subsp. aestuarianus, V. harveyi y V. neptunius (Tubiash y ! ! Introducción 39 col., 1965; Jeffries, 1982; Lambert y col., 1998; Lodeiros y col., 1987; Saínz y col., 1998; Takahashi y col., 2000; Luna–González y col., 2002; Gómez–Leon y col., 2005; Prado y col., 2005; Torkildsen y col., 2005; Sandlund y col., 2006; Elston y col., 2008; Gómez–Leon y col., 2008; Saulnier y col., 2010; Kesarcodi–Watson y col., 2012; Genard y col., 2013; Travers y col., 2014; Richards y col., 2015; Rojas y col., 2015). En este apartado se tratarán los principales patógenos causantes de vibriosis en peces, atendiendo a las características de la enfermedad que provocan y los factores de virulencia que poseen. 1.2.1. Vibrio anguillarum Vibrio anguillarum es el agente de la clásica vibriosis, causando una septicemia hemorrágica que afecta a diferentes peces tanto de aguas frías como calientes que incluyen el salmón Atlático y Pacifíco (Oncorhynchus spp. y Salmo salar), trucha arcoíris (O. mykiss), rodaballo (Scophtalmus maximus), lubina (Dicentrarchus labrax), dorada (Sparus aurata) o anguila Japonesa y Europea (Anguilla japónica y Anguilla anguilla) (Toranzo y col., 2005). También afecta a bivalvos moluscos y crustáceos (Aguirre-Guzman y col., 2004; Paillard y col., 2004). Como se ha mencionado anteriormente, V. anguillarum causa una vibriosis clásica, que en base a los signos clínicos también se denominó furunculosis de agua salada (Rucker, 1963) o enfermedad ulcerosa (Bagge y Bagge, 1956). Los signos externos típicos incluyen la pérdida de peso, letargia, puntos rojos en la parte ventral y lateral, así como zonas hinchadas y lesiones cutáneas oscuras que pueden ulcerarse ! ! Introducción 40 y sangrar (Figura 2). También los ojos resultan infectados apareciendo opacidad en un principio y derivando posteriormente en ulceración y exoftalmia. El patógeno se encuentra en altas concentraciones en la sangre y en los tejidos hematopoyéticos. Internamente se pueden observar los órganos distendidos y llenos de un líquido claro y viscoso (Actis y col., 1999;Toranzo y col., 2005; Austin y Austin, 2007). La ruta de infección que sigue este patógeno sigue siendo un punto de discusión importante en la literatura. Tanto la infección a través de la piel como a través de la ingesta del patógeno en agua contaminada o comida parecen las vías de entrada principales en el pez (Grisez y col., 1996; Svendsen y Bogwald, 1997; O´Toole y col., 2004; Weber y col., 2010). En la mayoría de los casos la infección ocurre por la penetración a través de la piel del pez. La renovación constante que sufre la mucosa superficial previene la adhesión de la bacteria a las células epiteliales, sin Figura 2. Hemorragias en cabeza, aletas y zona ventral de un ejemplar de lubina causadas por V. anguillarum. ! ! Introducción 41 embargo lesiones o una capa mucosa dañada son las vías típicas de entrada de V. anguillarum (Svendsen y Bogwald, 1997; Spanggaard y col., 2000; O´Toole y col., 2004; Croxatto y col., 2007; Weber y col., 2010). En caso de ingestión oral de la bacteria y entrada en el tracto gastrointestinal, V. anguillarum es capaz de sobrevivir en el ambiente ácido del estómago (Larsen, 1984) y una vez que alcanza el intestino comienza la adhesión, colonización y proliferación (Olsson y col., 1998, O´Toole y col., 1999, 2004). Desde aquí puede llegar al torrente sanguíneo e infectar otros órganos como el hígado, riñón o páncreas (Grisez y col., 1996). En cuanto al mecanismo de patogenicidad, se han identificado algunos factores de virulencia y genes relacionados con la movilidad y quimiotaxis, sistemas de adquisición de hierro, lipopolisacáridos (LPSs) y productos extracelulares con actividad proteolítica o hemolítica. La movilidad y quimiotaxis son factores de virulencia importantes en los procesos infecciosos de diversos patógenos, y también en el caso de V. anguillarum. O´Toole y col. (1996) mostraron que una mutación en el gen cheR, que codifica para una metil transferasa citoplasmática esencial en la respuesta a señales quimiotácticas, resultaba en un descenso de la virulencia en trucha arcoíris. Sin embargo, esto no ocurría cuando el pez era infectado por vía intraperitoneal. El flagelo también juega un papel importante en el proceso infeccioso, y se ha demostrado que cuando se alteran la flagelina A (FlaA), y las subunidades flaD y flaE, la virulencia se reduce (Milton y col., 1996). La adhesión es otro paso importante en la colonización del hospedador y posterior infección. Este proceso está facilitado por las adhesinas, proteínas de la membrana externa, LPS y polisacáridos ! ! Introducción 42 extracelulares (Pizarro-Cerda y Cossart, 2006). Después de la adhesión, V. anguillarum necesita penetrar el epitelio para poder causar una infección sistémica. Para ello necesita degradar la mucosa, donde está involucrada una metaloproteasa extracelular EmpA con actividad mucinasa (Norqvist y col., 1990). V. anguillarum también posee varias hemolisinas extracelulares contribuyendo a una septicemia hemorrágica (Rodkhum y col., 2005), pero además Li y col. (2008) identificaron el operón de la toxina RTX (Repeat in toxins) que también contribuye a la actividad hemolítica. Otro mecanismo empleado por V. anguillarum, y también por otros patógenos de peces, es la adquisición de hierro del hospedador mediante la producción de sideróforos (Lemos y col., 2010). Los distintos serotipos de V. anguillarum son capaces de sintetizar diferentes sideróforos, por ejemplo la mayoría de cepas del serotipo 1 producen el sideróforo anguibactina (codificado en un plásmido) mientras que las cepas del serotipo 2 que expresan un sideróforo que se encuentra codificado en el cromosoma bacteriano, la vanchrobactina (Actis y col., 1986; Stork y col., 2002; Conchas y col., 1991; Soengas y col., 2006). 1.2.2. Vibrio vulnificus Vibrio vulnificus se encuentra en zonas templadas y ecosistemas acuáticos tropicales, aunque su presencia se ha ampliado a los países Nórdicos debido al calentamiento global. Es un conocido patógeno humano oportunista y que causa diferentes enfermedades en función de la vía de entrada en el cuerpo humano (Böer y col., 2013). Pero esta bacteria también está implicada en la vibriosis de “agua caliente” en ! ! Introducción 49 Entre los mecanismos de patogenicidad estudiados en V. tapetis, el primer estudio realizado se centró en la importancia del gen djlA (Lakhal y col., 2008). Los mutantes de V. tapetis carentes de este gen no fueron capaces de producir la enfermedad en inoculaciones experimentales.!Además, en estudios in vitro, se ha observado que las cepas carentes de este gen no inducen el redondeamiento de hemocitos ni inhiben sus propiedades de adhesión, efectos citotóxicos característicos de la infección por V. tapetis. El estudio del secretoma de V. tapetis (Madec y col., 2014) permitió la identificación de nuevos factores de virulencia que podrían estar implicados en el proceso infeccioso de este patógeno. Entre las proteínas identificadas se encuentraron una lipasa de la misma familia que la fosfolipasa Pla1 que secreta Aeromonas hydrophila y que es un conocido factor de virulencia en esta especie. Además, identificaron una proteína del tipo RTX y que contribuye en la virulencia de otras especies del género Vibrio (Ziolo y col., 2014). Recientemente se ha aislado V. tapetis por primera vez de lesiones en lenguados (Solea solea) capturados y posteriormente mantenidos en cautividad (Declercq y col., 2015). Estos peces presentaban decoloraciones blanquecinas en la piel que evolucionaban en lesiones vesiculares con un punto central blanco y bordes rojos. 1.2.6. Vibrio harveyi Esta especie del género Vibrio causa la vibriosis que se conoce como luminiscente, por su capacidad para producir bioluminiscencia. V. harveyi se ha asociado con mortalidades de larvas de langostino ! ! Introducción 50 cultivado, salmón atlántico, rodaballo, caballito de mar o corales (Austin y col., 2006). A pesar de que esta especie provoca grandes pérdidas en la producción acuícola, aun no se conocen bien los mecanismos de patogenicidad. Se considera que el desarrollo del proceso infeccioso conlleva la formación de una biopelícula asociado con una movilidad tipo “swimming” y la producción de diversos productos extracelulares como hemolisinas, proteasas, lipasas y quitinasas (Austin and Zhang, 2006; Ruwandeepika y col., 2012; Yang y Defoirdt, 2014). Un factor importante en el control del mecanismo de virulencia de esta especie es el gen luxR, regulador principal de los mecanismos de control mediante Quorum Sensing (QS), que regula la expresión de diferentes factores de virulencia in vivo e in vitro (Defoirdt y col., 2008; Mok y col., 2003). De esta forma, en V. harveyi la producción de sideróforos, los componentes del sistema de secreción tipo III o diferentes toxinas extracelulares están controladas mediante QS (Henke and Bassler, 2004; Manefield y col., 2000; Lilley and Bassler, 2000). 1.3. Mecanismos de adaptación y persistencia en el medioambiente. La supervivencia bacteriana depende en gran medida de la capacidad de los microorganismos para adaptarse a las condiciones ambientales cambiantes. Los miembros del género Vibrio son capaces de proliferar en ambientes de alta densidad celular, como las biopelículas, pero también pueden persistir como células de vida libre. Por lo tanto, el ciclo de vida de los vibrios es complejo y tiene períodos donde no hay crecimiento poblacional seguido de intervalos de crecimiento con ! ! Introducción 51 tiempos largos de generación, en función de las condiciones del entorno. En este apartado se tratarán los diferentes mecanismos adaptativos que poseen los vibrios, al igual que bacterias de otros géneros, para su supervivencia. Entre estos mecanismos se encuentra el estado viable no cultivable (VNC), que se tratará con mayor profundidad su regulación e importancia en bacterias patógenas, la formación de biopelículas o la adherencia a superficies y que ya se comentaron brevemente en apartados anteriores. 1.3.1. Estado Viable No Cultivable La primera vez que se describió el fenómeno conocido como VNC fue en 1982 para identificar el estado de células de Escherichia coli y V. cholerae que habían sufrido un cambio de forma y que no podían ser recuperadas, aunque seguían siendo viables (Xu y col., 1982). Este supuso el primer paso para separar los conceptos de cultivabilidad y viabilidad celular, ya que generalmente la viabilidad se evalúa a través de la cultivabilidad. Actualmente, se conocen un gran número de bacterias, tanto patógenas como no patógenas, que entran en este estado latente (Pinto y col., 2013). Como consecuencia el interés en este estado celular se ha incrementado notablemente por la implicación que pueden tener estas bacterias no cultivables en medicina, biorremediación, como indicadores ambientales. De acuerdo con lo que se conoce actualmente acerca del estado VNC, las células cuando están expuestas a condiciones ambientales adversas entran en un estado de supervivencia en el cual no son capaces de formar colonias en los medios de cultivo de uso rutinario, donde en ! ! Introducción 52 condiciones normales crecerían y desarrollarían colonias (Figura 4). Éstas son células que mantienen intacta su estructura pero que sufren importantes cambios morfológicos (Takeda, 2011) y en la composición de la pared celular (Signoretto y col., 2002). Además son capaces de mantener la respiración celular (Oliver y col., 1995), la transcripción génica (Lleó y col., 2000) y la síntesis proteica (Rahman y col., 1994). Por lo tanto, las células en el estado VNC muestran niveles de actividad metabólica muy baja, pero que pueden ser medidas. El estado VNC se ha descrito en un total de 68 especies bacterianas diferentes (Pinto y col., 2013), filogenéticamente distribuidas en Gammaproteobacteria (40 especies), Betaproteobacteria (4 especies), Alfaproteobacteria (5 especies), Epsilonproteobacteria (5 especies), Bacteroidetes (1 especie), Actinobacteria (3 especies) y Firmicutes (9 especies). Además de la amplia diversidad de especies en las que se ha descrito este estado, también se observa una amplia distribución ambiental. Así, desde la primera descripción por parte de Xu y col. (1982) en agua marina y salobre, otros autores detectaron células VNC en agua de mar (Maalej y col., 2004; Pommepuy y col., 1996), agua de grifo (Pawlowski y col., 2011), sedimentos del fondo marino (Magariños y col., 1994) o suelos (Ben Abdallah y col., 2008; Ressbrodt y col., 2000). Incluso se ha descrito en alimentos como agua embotellada (Defives y col., 1999; Liu y col., 2008), vino (Millet y Lonvaud-Funel, 2000), cerveza (Suzuki y col., 2006), zumo de uvas (Nicolo y col., 2011) o lechuga (Dinu y Bach, 2011). ! ! Introducción 53 Las células entran en el estado VNC en respuesta a diferentes tipos de estrés natural, como son la privación de nutrientes, incubación a una temperatura fuera del rango de crecimiento óptimo (Asakura y col., Figura 4. La formación de células en estado VNC se da ante condiciones estresantes en un cultivo bacteriano en crecimiento. Durante este proceso, las células se vuelven indetectables en los medios de cultivo (línea azul) aunque una proporción del cultivo inicial se mantienen viables (curva roja). Cuando las condiciones estresantes desaparecen la población se vuelve cultivable nuevamente después de un período de resucitación (línea verde). Si esta población de células resucitada tiene nutrientes darán lugar a una población similar a la inicial (línea negra). ! ! Introducción 54 2007; Day y Oliver, 2004; Fera y col., 2008; Pinto y col., 2011), concentración salina elevada (Besnard y col., 2000, 2002; Pinto y col., 2011), concentración de oxígeno (Bovill y Mackey, 1997; Pinto y col., 2011), exposición a luz blanca (Oliver, 2000), desecación (Dinu y Bach, 2011; Dreux y col., 2007) o exposición a metales pesados (Aurass y col., 2011; del Campo y col., 2009). Es bien conocido que el peróxido de hidrógeno (H2O2) juega un papel importante en la inducción del estado VNC en diferentes bacterias, incluyendo E. coli o V. parahaemolyticus (Mizunoe y col., 1999, Lin y col., 2015). Kong y col. (2004) crearon un mutante en el gen oxyR (sensor de peróxido de hidrógeno), que regula el gen de la catalasa (katG), en V. vulnificus de forma que este no podía degradar H2O2. Lo que observaron es que este mutante no era capaz de crecer en los medios de cultivo a temperatura ambiente, sugiriendo que el H2O2, bien porque lo produzca la propia bacteria al crecer en el medio de cultivo o porque esté presente en el medio, está involucrado en la cultivabilidad de células VNC. También comprobaron que bajas temperaturas previenen la actividad de esta catalasa así como su síntesis de novo. En principio las células VNC se forman como respuesta de la población bacteriana a condiciones ambientales estresantes, sin embargo se ha demostrado la existencia de estas células en cultivos en crecimiento indicando que la célula podría entrar en estado VNC de manera estocástica. Un estudio reciente mostró que un cultivo de E. coli en fase logarítmica contenía un gran número de células en este estado (Orman y Brynildsen, 2013). Este hecho se contrapone al punto de vista clásico según el cual el estado VNC es inducido por las condiciones estresantes, y apoya la idea de que éste esté presente incluso en ! ! Introducción 55 condiciones de crecimiento óptimas y suponga un “seguro de vida” para las poblaciones bacterianas anticipando condiciones desfavorables. Desde un punto de vista biológico, el estado VNC sólo puede tener significado en términos de supervivencia si las células son capaces de aumentar su actividad metabólica y recuperar la cultivabilidad. Este fenómeno se conoce como “resucitación”, y se da cuando las condiciones de crecimiento vuelven a ser favorables para la bacteria, revirtiendo el estado VNC (Figura 5). El descenso de la temperatura es uno de los factores más comunes en la inducción de este estado en vibrios y otros géneros, y se ha observado en diferentes estudios que la inversión de este factor estresante es suficiente para permitir la resucitación desde dicho estado (Gupte y col., 2003; Wong y col., 2004). A pesar de que la resucitación ocurre cuando las condiciones óptimas para la bacteria se recuperan, Epstein (2009) propuso la hipótesis de exploración microbiana (microbial scout hypothesis), según la cual una pequeña porción de la población en el estado VNC resucitan de forma aleatoria independientemente de las señales ambientales. Si las condiciones siguen siendo desfavorables, este grupo de bacterias “exploradoras” acabará muriendo. Pero si las condiciones han mejorado o vuelven a ser totalmente favorables, este grupo emitirá una serie de señales al resto de la población indicando que las condiciones son permisivas para el crecimiento. Siguiendo esta misma idea, el estudio realizado por Buerguer y col. (2012) aportó evidencias de este proceso, mostrando como diversos microorganismos, que incluyen especies ambientales y también E. coli y Mycobacterium smegmatis, resucitaban de forma estocástica e independientemente de las condiciones ambientales, incluso en incubaciones de larga duración (de meses a ! ! Introducción 56 años). Estos resultados indican que la salida aleatoria de una fase de no crecimiento puede ser un elemento clave de la estrategia general de supervivencia bacteriana, y la variedad de organismos que muestran este hecho pondría de relieve que se trata de un fenómeno general. Este proceso estocástico, además, aporta una posible explicación a la aparición de infecciones aparentemente aleatorias. Siguiendo en esta misma línea, un aspecto importante y de gran interés en el caso de bacterias patógenas, es que las células en el estado VNC pueden resistir mejor otros factores estresantes, como un tratamiento prolongado con antibióticos (Maisonnneuve y Gerdes, 2014). La capacidad de resucitar e iniciar una infección por parte de bacterias en estado VNC ha llevado a diferentes grupos de investigación a estudiar la expresión de diferentes genes relacionados con virulencia y toxicidad. En el patógeno A. hydrophila se determinó que en el estado VNC perdía la habilidad de lisar eritrocitos humanos, pero después de la resucitación recuperaba la virulencia (Maalej y col., 2004). En el año 2005, Vora y col. comprobaron que cepas de Vibrio spp. patógenas para humanos expresaban genes de toxicidad (ctxAB, rtxA, hlyA, tdh, y vvhA) y virulencia (tcpA y TTSS) mientras se encontraba en estado VNC. Coutard y col. (2007) estudiaron la transcripción de diferentes genes de virulencia en la resucitación de V. parahaemolyticus y encontraron que no había expresión de los genes tdh2 (hemolisina termoestable), escU, spa24, vopP (proteínas de la membrana interna y efectores del sistema enterotoxigénico). ! ! Introducción 57 Figura 5. Esquema representativo de los modelos de resucitación propuestos. En una población compuesta por células en estado en VNC (círculos azules) en un momento dado una célula se vuelve cultivable (círculos blancos) dando lugar a una célula “exploradora": (A) Si las condiciones ambientales no son favorables todavía esta célula “exploradora” muere. (B) Por el contrario, si las condiciones ambientales son favorables para el crecimiento esta célula “exploradora" comienza a dividirse y producir y secretar moléculas señalizadoras (fondo negro) que serán captadas por las demás células de la población provocando la resucitación de las mismas. (C) Un modelo alternativo independiente de la existencia de células “exploradoras" propone que cuando las células en estado VNC se exponen a un estímulo (presencia de aminoácidos, nutrientes, etc.) da lugar directamente a la resucitación. Adaptado de Pinto y col. (2013). ! ! Introducción 58 En otro patógeno entérico humano, E. coli, las enterotoxinas termolábil y termoestable no se expresaban después de un periodo de incubación prolongado en agua de mar (Lothigius y col., 2010). En conjunto, estos estudios muestran que los genes relacionados con virulencia y toxicidad están infraexpresados mientras las células se encuentran en el estado VNC. Por lo tanto, las especies patógenas parecen ser no virulentas mientras se encuentran en este estado pero si resucitan, pueden recuperar la virulencia. 1.3.2. Regulación del estado VNC Como ya se ha dicho, el estado VNC aparece como una respuesta de la célula bacteriana ante factores ambientales estresantes o de forma aleatoria en cultivos en fase exponencial como un “seguro de vida”, sin embargo todavía se desconoce el mecanismo molecular subyacente en la inducción de este estado. Probablemente, y debido a que hay diversos factores inductores de este estado en diferentes especies, exista más de un mecanismo responsable. Un posible mecanismo implicado en el proceso son los denominados sistemas tipo II toxina-antitoxina (TA systems) (Figura 6), que están compuestos por una toxina que inhibe el crecimiento celular y una antitoxina que regula la actividad de la toxina (Gerdes y Maisonneuve, 2012). Entre estos, se encuentran las familias relBE, vapBC, hipBA y mazEF. En la familia hipBA, HipA actúa como inhibidor del crecimiento celular reprimiendo la transcripción e HipB interactúa con HipA inhibiendolo. En un estudio cuantitativo realizado por Rotem y col. ! ! Introducción 65 prometen abaratar todavía más los precios de la secuenciación pero también acabar con el concepto de borrador de un genoma bacteriano (Land y col., 2015). Paralelo al desarrollo de las nuevas tecnologías de secuenciación, y como consecuencia del incremento y complejidad de los datos generados, se han ido desarrollando nuevas herramientas bioinformáticas que permiten analizar, comparar, intrepretar y visualizar la enorme cantidad de datos derivadas de la secuenciación de genomas, metagenomas, transcriptomas, etc. 1.4.1. Nuevas herramientas filogenéticas derivadas de las NGS Una de las especialidades de la microbiología que se ha beneficiado de la aparición de las NGS es la de la Taxonomía, Sistemática y Filogenia. Antes de la incorporación de la secuenciación de genomas completos, la descripción de nuevas especies se realizaba desde una aproximación polifásica y empleando la hibridación ADNADN in vitro como la técnica para la delimitación de nuevos taxones. Sin embargo, tras la introducción de las NGS y la disponibilidad de miles de genomas en las bases de datos públicas, la técnica clásica de hibridación ADN-ADN ha sido sustituida por la comparación in silico de los genomas. Los diferentes métodos empleados para analizar la similitud a nivel genómico tienen diferentes valores para delimitar especies nuevas y es por eso que se ha intentado correlacionar estos valores con los índices obtenidos en la hibridación clásica (Tabla 1). El primer método ! ! Introducción 66 descrito para la comparación de identidad de genomas completos fue el valor Promedio de Identidad Nucleotídica (ANI). Konstantinidis y Tiedje (2005), mostraron que el valor de ANI de genes compartidos entre dos genomas es una buena medida de la distancia evolutiva y que se correlaciona bien con los valores de DDH. Posteriormente Goris y col. (2007) mejoraron este método simulando artificialmente el paso de fragmentación del genoma que se da en los experimentos de DDH. A su vez, el valor ANI puede ser calculado empleando dos algoritmos diferentes. Por un lado, el empleado por Goris y col. (2007) (ANIb) se calcula como la identidad de todos los emparejamientos de BLASTN (Alstchul y col., 1990) entre dos genomas donde solo se consideran los emparejamientos con al menos una identidad en la secuencia del fragmento del 30%. El otro método empleado fue introducido por Richter y Rosselló-Mora (2009) (ANIm) usando el software MUMmer (Kurtz y col., 2004) para agilizar el cálculo sin perder precisión. El límite propuesto para este método, independientemente del algoritmo empleado para el cálculo, está Tabla 1. Herramientas bioinformáticas para la comparación de identidad entre genomas empleadas en taxonomía. ! ! Introducción 67 definido en un rango del 95-96 %. El cálculo mediante ANIb y ANIm da como resultado dos valores para cada comparación. Recientemente, Lee y col. (2015) propusieron un nuevo algoritmo (OrthoANI) basado en el cálculo de ANI para resolver el problema que existe en los resultados de los valores recíprocos. De la misma forma que ocurre en los métodos de DDH basados en ADN marcado, la medida de los valores ANI con los algoritmos originales (ANIb y ANIm) no es simétrico. A diferencia de los métodos de cálculo de valores ANI originales, los obtenidos mediante el algoritmo OrthoANI si son idénticos, obteniendo un único valor. Así, el software fragmenta el genoma y sólo tiene en cuenta los pares de fragmentos ortólogos para el cálculo. Otro método empleado es el índice GBDP (Genome BLAST distance Phylogeny) (Henz y col., 2005). En este el genoma no es fragmentado si no que se alinean las secuencias de ambos genomas empleando BLAST (Alstchul y col., 1990) o BLAST+ (Camacho y col., 2009) para obtener un conjunto de HSPs (High Scoring Segment Pairs), que son los que se usan para el cálculo de la distancia. Meier-Kolthoff y col. (2013) mejoraron el algoritmo con modelos estadísticos con estimación de intervalos de confianza. Este método es el empleado por el GGDC (Genome-to-Genome Distance Calculator) y conserva el valor delimitado para la hibridación clásica (70%), lo que hace la interpretación de los resultados más sencilla. 1.4.2. Análisis de genomas bacterianos completos La anotación y análisis de los genomas bacterianos que están depositados en el GenBank (2671) permite establecer que el contenido ! ! Introducción 68 en secuencias codificantes de proteínas se corresponde con un 88%. Sin embargo Land y col. (2014) afirman que este porcentaje se encuentra en un rango del 40 al 97%. El genoma típico bacteriano está formado por 5 millones de pares de bases que codifican para 5000 proteínas aproximadamente. El genoma más grande conocido actualmente es el de la especie Sorangium cellulosum con más de 14 millones de pares de bases y 11599 genes (Hans y col., 2013), mientras que el genoma más pequeño es el de la bacteria Candidatus Nasuia deltoceohalinicola con una longitud de 112091 pares de bases y únicamente 137 proteínas codificadas (Bennet y Moran, 2013). A medida que el número de genomas aumenta, adquiere gran importancia la calidad y riqueza de los metadatos asociados a estos genomas. En muchos casos, los genomas pertenecen a muestras que no han sido caracterizadas fenotípica y fisiológicamente. Es por esto, que Kottmann y col. (2008) desarrollaron unos estándares mínimos que deben ser incluidos con la secuencia. 1.4.2.1. Contenido genómico y diversidad genética La diversidad genética entre genomas dentro de una misma especie parece ser mayor de lo esperado. Dentro de una misma especie las diferentes cepas que lo componen pueden ser ligeramente diferentes en términos de su contenido génico, como puede ser el caso de los 2000 genomas de la especie E. coli (Land y col., 2015). Muchos genomas contienen un gran número de redundancias, debido a duplicaciones génicas, pero también pesudogenes que han perdido cualquier tipo de función. ! ! Introducción 69 En todos los genomas bacterianos hay al menos una copia de los genes ARNr 23S, 16S y 5s, que están organizados en un operón con la estructura conservada del gen ARNr 23S, seguido de uno o más ARNt y después los genes ARNr 16S y ARNr 5S. El número de copias de este operón varía de 1 a 15 (Land y col., 2014). El número de ARNt puede variar en desde unas pocas copias (20 copias serían las mínimas para cubrir todos los aminoácidos) hasta 284, aunque la media está en torno a las 55 (Land y col., 2014). Un elemento importante presente en los genomas bacterianos son las islas genómicas (GEIs, Genomic Islands). Estas islas están formadas por varios genes accesorios que han sido adquiridos por transferencia horizontal. La adquisición de estas islas genómicas contribuye a la adaptación y diversificación de los microorganismos, por lo que tiene un impacto importante sobre la plasticidad y evolución del genoma, pero también en la diseminación de resistencias a antibióticos y genes de virulencia (Juhas y col., 2008). Sin embargo, las islas no están limitadas a la transferencia de funciones patógenas, si no que también incluyen la adquisición de características simbióticas (Sullivan y col., 2002), contribuyen al metabolismo de azucares y compuestos aromáticos (Gaillard y col., 2006) o a la síntesis de sideróforos (Larbig y col., 2002b). Otro elemento del genoma bacteriano son las repeticiones espaciadas denominadas CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) (Mojica y col., 2000). Además, estas repeticiones están asociadas a una familia de proteínas CRISPR-Cas (CRISPR-associated proteins) encargadas de la organización de estas repeticiones (Makarova y col., 2011 a, b). El sistema CRISPR-Cas se ha ! ! Introducción 70 definido como un mecanismo de defensa general, que permite esquivar el ataque de virus (Hovarth y Barrangou, 2010) pero también juegan un papel importante en la evasión del sistema inmune del hospedador (Louwen y col., 2014). 1.4.2.2. Aplicaciones de la información obtenida de la secuenciación de genomas completos Entre la información que podemos obtener rápidamente con la secuenciación del genoma bacteriano está el conjunto de reacciones y rutas metabólicas. De esta forma se pueden detectar funciones específicas en el metabolismo bacteriano de cada especie (Francke y col., 2005). La reconstrucción del metabolismo de una especie específica para establecer la relación entre genotipo y fenotipo se aplica en los modelos conocidos como GEM (Genomic-scale Metabolic Model) (Thiele y Palsson, 2010). El uso de estos modelos escalables han permitido realizar diferentes estudios en evolución microbiana, ingeniería metabólica o aplicaciones biomédicas (Bordbar y col., 2014; Monk y Palsson, 2014). La reconstrucción de los GEM es un proceso complejo y necesita de abundantes secuencias diferentes de genomas bacterianos para hacerlo ágil. Por eso aparecieron diferentes bases de datos, siendo la primera de ellas MetaCyc en 1999 y que en la actualidad cuenta con más de 2000 rutas metabólicas y más de 11000 reacciones (Caspi y col., 2014). Esta base de datos metabólica junto con BioCyc aportaron la información necesaria para la creación de software para el análisis de otros organismos. Otro tipo de herramientas para la generación y análisis de los GEM se han desarrollado en base a entornos ! ! Introducción 71 Web llamado Model SEED (Henry y col., 2010). La reconstrucción del proceso del sistema SEED se basa en la anotación generada por el servicio de RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology) (Aziz y col., 2008). Además en la actualidad, la secuenciación completa de los genomas puede jugar un papel muy importante en la identificación y respuesta efectiva frente a brotes infecciosos (Sánchez-Busó y col., 2016). El método más sencillo para realizar análisis epidemiológicos sería un sistema basado en un entorno Web que permitiera realizar el ensamblado, tipado, MLST, búsqueda de genes de resistencia y/o de virulencia y la búsqueda de SNPs (Single Nucleotide Polimorphism) (Sánchez-Busó y col., 2015). ! ! 2. OBJETIVOS ! ! ! 81 3.1.1. Vibrio toranzoniae sp. nov., a new member of the Splendidus clade in the genus Vibrio. Lasa A, Diéguez AL, Romalde JL. Syst Appl Microbiol. 36(2):96-100, 2013. Índice de impacto: 3,310; Q1 en Biotechnology and applied microbiology. Cuatro aislados marinos anaerobios facultativos móviles (Vb 10.8T [CECT 7225T, CAIM 1869T], CMJ 9.4 [CECT 8091, CAIM 1870], CMJ 9.11 y Cmf 13.9), obtenidos a partir de almejas cultivadas (Venerupis philippinarum y Venerupis decussata) en Galicia (noroeste de España). Estos aislados se estudiaron siguiendo un enfoque polifásico, que incluyó un análisis filogenético basado en las secuencias del gen ARNr 16S y cinco genes esenciales atpA, recA, pyrH, rpoA y rpoD. Este análisis apoyó su inclusión en el clado Splendidus dentro del género Vibrio, formando un grupo bien definido y separado de las otras especies del clado. Las hibridaciones ADN-ADN llevadas a cabo contra las cepas tipo de las especies que mostraron una similitud superior al 98,5% en la secuencia del gen ARNr 16S rindieron valores inferiores al 60%. Estos aislados pueden diferenciarse de las especies más próximas en base a varias características fenotípicas y quimiotaxonómicas. Los resultados obtenidos demostraron que las cepas constituyen una nueva especie del género para el cual se propone el nombre de Vibrio toranzoniae sp. nov., con Vb 10.8T (= CECT 7225T CAIM 1869T) como la cepa de tipo. ! http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0723202012001580 ! ! ! 83 3.1.2. Vibrio cortegadensis sp. nov., isolated from clams.! Lasa A, Diéguez AL, Romalde JL. Antonie Van Leeuwenhoek. 105(2):335-41, 2014. Índice de impacto: 1,806; Q3 en Microbiology. Un grupo de cuatro cepas aisladas de almejas (Venerupis decussata y Venerupis philippinarum) en Galicia (noroeste de España) se sometieron a un análisis polifásico, basado en la caracterización fenotípica, el análisis de los perfiles de ácidos grasos, la secuenciación del gen ARNr 16S y cinco genes esenciales (atpA, pyrH, recA, rpoA y rpoD), así como hibridación ADN-ADN (DDH). El análisis de las características fenotípicas y los perfiles quimiotaxonómicos, así como los resultados del estudio filogenético, indicó claramente que estas cepas pertenecen al género Vibrio, situándose en una posición intermedia entre el clado Splendidus y Anguillarum. Las especies más próximas en base a la secuencia del gen ARNr 16S son Vibrio tapetis (98,8%), Vibrio pomeroyi (98,0%) y Vibrio crassostreae (97,9%). Los resultados de los experimentos de hibridación ADN-ADN confirmaron que estos aislados constituyen una nueva especie. Se propone el nombre Vibrio cortegadensis sp. nov. con C 16.17T (= CECT 7227T = LMG 27474T) como la cepa de tipo. ! ! http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10482-013-0078-z ! ! 3.2. DESCRIPCIÓN DE NUEVOS TAXONES DE LOS GÉNEROS LACINUTRIX Y MARINOMONAS. ANÁLISIS GENÓMICO DE AISLADOS DE TRES POSIBLES NUEVAS ESPECIES DEL GÉNERO PSYCHROBACTER. ! ! 3.2.1. Description of Lacinutrix venerupis sp. nov.: A novel bacterium associated with reared clams. Lasa A, Diéguez AL, Romalde JL. Syst Appl Microbiol. 38(2):115-9, 2015. Índice de impacto: 3,691; Q1 en Biotechnology and applied microbiology. Un grupo de cinco cepas Gram-negativas aisladas de almejas (Venerupis decussata y Venerupis philippinarum) en Galicia (NO España) se analizaron desde un enfoque polifásico. Las bacterias eran bacilos inmóviles, estrictamente aerobias que forman colonias pigmentadas de color amarillo. En base al análisis del gen ARNr 16S, los aislados de almeja se identificaron como miembros del género Lacinutrix, dentro de la familia Flavobacteriaceae, mostrando una mayor similitud en la secuencia del gen con Lacinutrix mariniflava (97,0%) y Lacinutrix algicola (96,9%). El contenido G + C del ADN de la cepa tipo designada Cmf 20.8T fue de 34,1%, que se encuentra dentro del rango del género (29,0-37,0%). Los ácidos grasos principales de la cepa tipo Cmf 20.8T fueron iso-C15:0 3-OH, iso-C15:1 G, iso-C15:0 e iso-C17:0 3-OH. Los valores de reasociación de las cadenas de ADN-ADN de la cepa Cmf 20.8T con L. mariniflava AKS292T fue de 51% y de un 56% con L. algicola AKS293T. Las características fenotípicas de los aislados permitió diferenciarlos de las otras especies del género. Los resultados obtenidos indican que las cepas representan una nueva especie del género Lacinutrix, para la cual se propone el nombre Lacinutrix venerupis sp. nov., designando el aislado Cmf 20.8T (= CECT 8573T = DSM 28755T) como la cepa tipo. ! ! ! http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0723202014001544 ! ! ! 3.2.2. Marinomonas gallaica sp. nov. and Marinomonas atlantica sp. nov., isolated from reared clams (Ruditapes decussatus).! Lasa A, Pichon P, Diéguez AL, Romalde JL. Int J Syst Evol Microbiol. 66(8):3183-8, 2016. Índice de impacto (2015): 2,439; Q3 en Microbiology. Tres cepas bacterianas Gram-negativas (Cmf 17.2T, Rd 20.33 y Cmf 18.22T) aisladas de almejas cultivadas en Galicia se sometieron a un estudio taxonómico, basado en una caracterización genética y fenotípica. El análisis del gen ARNr 16S permitió identificar los aislados como miembros del género Marinomonas, compartiendo una mayor semejanza con Marinomonas aquimarina CECT 5080T (97,8% -98,5% similitud obtenida en la secuencia del gen ARNr 16S). El análisis filogenético de la secuencias de este gen mostraron que los tres aislados formaban dos grupos diferentes y distantes respecto de la especie mas próxima, M. aquimarina. Para confirmar la posición taxonómica de las cepas se realizaron las hibridaciones ADN-ADN obteniendo resultados inferiores al límite recomendado para la delimitación de nuevas especies, concretamente 44,5% (Cmf 17.2T con M. aquimarina CECT 5080T) y 55% (Cmf 18.22T con M. aquimarina CECT 5080T). Además, el promedio de identidad nucleotídica (ANIb, ANIm y OrthoANI) y la estimación de los valores de reasociación de ADN-ADN in silico entre las cepas Cmf 17.2T, Cmf 18.22T y M. aquimarina CECT 5080T estaban en todos los casos por debajo del umbral propuesto para la descripción de nuevas especies. El contenido G + C estimado del ADN genómico fue de 45,3% (Cmf 17,2 T) y de 44,6% (Cmf 18,22T). Los ácidos grasos principales de las cepas resultaron ser “Summed Feature” 3 (C16: 1 ω7c/C16: 1 ω6c), “Summed Feature” 8 (C18: 1 ω7c/C18: 1 ω6c), C16:0, C12:0 ! ! ! y C10:0 3-OH. Los resultados obtenidos en la caracterización de los aislados de almeja indican que éstos representan dos nuevas especies del género Marinomonas, para las que se proponen los nombres de Marinomonas gallaica sp. nov. (cepa tipo Cmf 17.2T = CECT 9049T = LMG 29243T) y Marinomonas atlantica sp. nov. (cepa tipo Cmf 18.22T = CECT 9050T = LMG 29244T). ! ! http://ijs.microbiologyresearch.org/content/journal/ijsem/10.1099/ijs em.0.001170#tab2 ! ! ! 97 3.3.2. Draft Genome Sequence of Vibrio toranzoniae Strain CECT 7225T.! Lasa A, Gibas CJ, Romalde JL. Genome Announc. 31;4(2): e00212-16, 2016. Open Access Journal: American Society for Microbiology. Vibrio toranzoniae (CECT 7225T) se aisló de las almejas fina en Galicia (Noroeste de España). Además, esta especie ha sido identificada recientemente como un potencial patógeno del congrio rojo en Chile. El borrador del obtenido genoma tiene 4,5 Mbp, un contenido de G + C de 43.9%, y mas de 3.800 genes codificantes de proteínas. ! http://genomea.asm.org/content/4/2/e00212-16.full ! ! ! 99 3.3.3. Comparative genomic analysis of Vibrio toranzoniae strains reveals clues on its pathogenicity for fish.! Lasa A, Gibas CJ, Romalde JL. Front Microbiol. 8:86. DOI:10.3389/fmicb.2017.00086, 2017. Índice de impacto: 4,165; Q1 en Microbiology. Vibrio toranzoniae es una bacteria Gram-negativa del clado Splendidus dentro del género Vibrio. Vibrio toranzoniae fue aislado por primera vez de almejas sanas en Galicia (España), pero recientemente también se identificó asociado a brotes de enfermedad de congrio rojo en Chile. Los ensayos experimentales demostraron que los aislados chilenos fueron capaces de producir mortalidad de peces, pero no las cepas aisladas de almejas. El objetivo del presente estudio fue determinar las diferencias a nivel genómico entre dos cepas representativas R17, aisladas de congrio rojo en Chile, y la cepa tipo de la especie (CECT 7225T). La comparación basada en el genoma completo mostró alta homología entre ambas cepas, pero se observaron diferencias en ciertos grupos de genes que incluyen algunos factores de virulencia. Entre ellos, encontramos que los sistemas de adquisición de hierro y los genes de síntesis de la cápsula fueron las principales características diferenciales entre ambos genomas que podrían explicar las diferencias en la patogenicidad de las cepas. Además, los genomas estudiados presentaron islas genómicas y toxinas, y la cepa R17 presentó secuencias CRISPR que están ausentes en la cepa tipo. En conjunto, este análisis proporcionó información importante sobre los factores de virulencia de V. toranzoniae que conducirán a una mejor comprensión del proceso patógeno. ! ! ! 100 http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2017.00086/full ! ! ! ! ! 3.4. MECANISMOS ADAPTATIVOS DE V. TORANZONIAE EN CONDICIONES AMBIENTALES ADVERSAS: EL ESTADO VIABLE NO CULTIVABLE ! ! ! 103 3.4.1. Different survival strategies of environmental and pathogenic strains of Vibrio toranzoniae. Aide Lasa, Sabela Balboa, Mezrop Ayrapetyan, Britney Phippen, James D. Oliver, Jesús L. Romalde. FEMS Microbiol Ecol. Manuscrito en preparación. Índice de impacto: 3,53 ; Q2 en Microbiology Las bacterias del género Vibrio poseen diferentes mecanismos adaptativos como respuesta a condiciones desfavorables permitiéndoles sobrevivir en el ambiente. El estado viable no cultivable (VNC) es una estrategia de supervivencia singular que adoptan un gran número de bacterias en respuesta a condiciones ambientales adversas, de la cual resucitan cuando se recuperan las condiciones favorables. Además, la adherencia a superficies es una parte fundamental en el estilo de vida acuático de muchos vibrios, y que constituyen el primer paso para la colonización de sustratos y formación de biopelículas. Vibrio toranzoniae se aisló originalmente de almejas y posteriormente se asoció con mortalidades de congrio rojo en Chile. Este estudio analiza la habilidad de dos cepas de V. toranzoniae (CECT 7225T y R17), para entrar en el estado VNC. La cepa tipo CECT 7225T en el estado VNC después de 49 dias de incubación a 4ºC y resucitó cuando se incubó a 24±1 ºC. Por otro lado, la cepa R17 mantuvo la cultivabilidad después de este período de incubación. Además de este comportamiento, ambas cepas cambiaron la morfología de sus células de forma bacilar a cocoide durante el experimento. El análisis de la expresión de los genes mreB, esencial para mantener la morfología bacilar, y ftsZ, responsable de la ! ! ! 104 formación del divisoma, mostró un descenso en su transcripción, mientras que se observó una sobreexpresión del gen envZ, un osmosensor, en la cepa CECT 7225T. ! ! ! ! Resultados ! ! ! 105 Different survival strategies of environmental and pathogenic 1! strains of Vibrio toranzoniae. 2! 3! Aide Lasaa, Sabela Balboaa, Mezrop Ayrapetyanb, Britney Phippenb, 4! James D. Oliverb, Jesús L. Romaldea*. 5! 6! aDepartamento de Microbiología y Parasitología. CIBUS–Facultad de 7! Biología. Universidade de Santiago de Compostela. Santiago de 8! Compostela, 15782. Spain. 9! bDepartment of Biological Sciences, University of North Carolina at 10! Charlotte, Charlotte, North Carolina, USA. 11! 12! 13! 14! Running title: VBNC in Vibrio toranzoniae 15! 16! 17! 18! Manuscript in preparation 19! 20! 21! 22! *Corresponding author: 23! Tel: (+34) 881816908 24! Fax: (+34) 881816966 25! E–mail: [email protected] 26! 27! ! ! ! ! Resultados ! ! ! 106 ABSTRACT 28! 29! Vibrios have several adaptive mechanisms in response to harsh 30! conditions allowing their persistence in the environment. The viable but 31! nonculturable (VBNC) state is a unique survival strategy, adopted by 32! many bacteria in response to adverse environmental conditions, 33! resuscitating when favourable conditions are recovered. In addition, 34! attachment to surfaces is an integral part of the aquatic lifestyle of many 35! vibrios, constituting the first step for substrate colonization and biofilm 36! formation. Vibrio toranzoniae was originally isolated from clams and 37! later was associated with mortalities of red conger eels in Chile. The 38! present study examined the ability of two V. toranzoniae strains (CECT 39! 7225T and R17), to enter into the VBNC state. Strain CECT 7225T 40! entered the VBNC state after 49 days of incubation at 4ºC and 41! resuscitated when incubated at 24±1 ºC. On the other hand, R17 42! maintained culturability even after long incubation at 4oC. Besides these 43! different behaviours, both strains changed their morphology during the 44! experimental period from rod to coccoid shape. Analysis of gene 45! expression showed a down-regulation of genes mreB, essential for rod 46! morphology, and ftsZ, responsible of the divisome formation, for both 47! strains, while an up-regulation of envZ gene, an osmosensor, was 48! observed in the CECT 7225T strain. 49! 50! 51! Keywords: V. toranzoniae, VBNC, environmental persistence, gene 52! expression. 53! 54! ! ! ! ! Resultados ! ! ! 113 nm, 0.15 to 0.25). Cells were subsequently washed twice to remove 217! nutrients, resuspended with 15 ‰ ASW at a 1:100 (vol/vol) ratio, and 218! stored at 4ºC. Microcosms were quantified daily, as described above, 219! until strains were no longer culturable on MA (<10 CFU/ml detectable). 220! The experiments were performed in triplicate for each strain. The Live 221! and Dead BacLightTM detection kit was employed according to 222! manufacturers (Invitrogen, USA) with observation under an 223! epifluorescent microscope, to confirm the cells were in the VBNC state. 224! To resuscitate VBNC cells, 1 ml of VBNC cultures was transferred from 225! 4ºC to room temperature (24±1 ºC) for 24 h and plated on MA media to 226! assess the resuscitation. 227! Data were statistically analysed using unpaired Student’s t test, or 228! one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Tukey’s post hoc 229! test for multiple comparisons. Statistical significance was determined 230! using an alpha level of 0.05. Error bars in all figures represent standard 231! deviations (SD). All data were analyzed using GraphPad Prism (version 232! 7.0; GraphPad Software Inc.). 233! 234! Quantitative PCR assessment of gene expression 235! Total RNA was extracted from the microcosms using a NucleoSpin 236! RNA kit (Macherey-Nagel, Germany) according to the manufacturer´s 237! instructions. For the extraction, 1 ml of control cells, cells in VBNC state 238! and resuscitated cells were transferred to centrifuge tubes for the 239! extraction. The RNA was eluted in RNase-free water and stored at -80 240! ºC until use. RNA quantity was measured using the QUBIT 3 241! Fluorometer (Invitrogen, USA). 242! ! ! ! ! Resultados ! ! ! 114 Primers employed for RT-qPCR were those designed by Rao et al. 243! (2014) (Table 1). Primer pairs efficiency was initially analysed by 244! utilizing endpoint PCR for the genes of interest in each strain. RT-qPCR 245! was performed using three biological and three technical replicates. 246! cDNA was synthesized using RevertAid Reverse Transcriptase (Thermo 247! Fisher Scientific, USA) following the manufacturer’s conditions. 248! Briefly, 20 µl of reaction was prepared containing 10 µM of the 249! appropriate reverse primer, 1 mM dNTP mix and 10 ng of total RNA. 250! Reverse transcription was performed in a BioRad T100 Thermal (USA) 251! cycler with conditions varying depending on the gene. Thus, RNA for 252! 16S rRNA, envZ and ftsZ, genes was reverse transcribed at 45ºC for 253! 45min, while for mreB the temperature used was 52ºC. For the 254! quantitative PCR, 2.5 µl of cDNA was added to 25 µl of reaction 255! mixture (Maxima SYBR Green qPCR Master Mix, Thermo Scientific, 256! USA) containing 12.5 µl of 2x Master Mix 10 µM of each primer and 1 257! mM of dNTP mix. The cycling conditions employed included: initial 258! denaturation step at 95ºC for 10 min, followed by 40 cycles consisting in 259! a denaturation step at 95ºC for 15 sec, primer annealing at 48ºC for 30 s, 260! followed by a final extension at 72ºC for 30s. The relative expression 261! ratios were calculated using REST-MCS v2 software 262! (http://www.gnequantification.de/rest-mcs.html). 263! 264! RESULTS AND DISCUSSION 265! Entering into the VBNC state 266! The VBNC induction experiment showed different behaviours of the 267! two tested strains. The type strain CECT 7225T maintained its 268! culturability over a period of 49 days. After this time the ability to grow 269! ! ! ! ! Resultados ! ! ! 115 in solid media (i.e. MA) was lost, thus likely entering the VBNC state 270! (Figure 1). On the other hand, R17 strain did not lose the culturability 271! after a period of 60 days, although the number of surviving cells 272! recovered on MA plates dropped from 2 x 105 to 5 x 102 CFU/ml (Figure 273! 1). To validate whether the cells were still viable we stained the cultures 274! with Live and Dead BacLightTM kit. Initial cell cultures growing in 275! exponential phase showed motile bacilli for both strains with intact 276! membranes. Both isolates, regardless of their capability of reaching 277! VBNC state, showed coccoid cells that lost motility after 72h of 278! incubation. Retention of membrane integrity of the final cultures was 279! confirmed, indicating cell viability, and only a small amount of dead 280! cells were detected. This result may indicate that R17 strain requires a 281! longer incubation period to fully enter the VBNC state. Meanwhile, cells 282! showed the morphological features of VBNC cells and maintained 283! membrane integrity. VBNC cultures of CECT 7225T strain were held at 284! 24±1 ºC during 24 h to assess cell viability resulting in their 285! resuscitation. As a result, 4 x 102 cfu/ml were obtained after resuscitation 286! of the VBNC cells, although not reaching the initial cell number. 287! It is well known that seawater temperature and salinity play an 288! important role in affecting the persistence of vibrios in the aquatic 289! environment. To assess entrance into the VBNC state of the V. 290! toranzoniae strains, experiments were conducted at low temperature and 291! salinity, as well as with nutrient deprivation, since the optimal growth 292! temperature of both strains cultured under laboratory conditions is 24±1 293! ºC and 3% as optimal salinity. In this sense, CECT 7225T may be 294! adapted to survive when the environmental conditions are adverse, and 295! to resuscitate to the original state when the stress is removed. The 296! ! ! ! ! Resultados ! ! ! 116 resuscitation occurred after 24h incubation at optimal growth 297! temperature. Similar time and conditions were described for V. vulnificus 298! (Rao et al., 2014), while others such as V. cholerae needed 72h to 299! recover their culturability (Mishra et al. 2012). 300! The different behaviour observed in response to the stress conditions 301! tested could be related to strain origin. Strain CECT 7225T is a 302! molluscan-associated bacterium isolated during the transition through a 303! filter-feeding organism and thus more exposed to the environmental 304! conditions. Conversely, R17 strain is a bacterium highly adapted to live 305! in tight contact with the host, which may protect it from potential 306! environmental stresses and promoting the development of other adaptive 307! mechanisms. 308! Interestingly, one of the differences between the two isolates is the 309! ability to produce capsule. Our comparative genome analysis showed 310! that R17 posses the entire machinery necessary for its synthesis and 311! transport while CECT 7225T lacks these genes (Lasa et al. 2017). 312! Curiously, strain R17 maintained the ability to produce capsule during 313! the whole experiment, forming opaque colonies when grown on solid 314! media. The role of the capsule in relation to the environmental 315! persistence is still unknown and further studies are required to determine 316! if this feature can act as an osmoprotector. 317! It has been described that the ability to enter into the VBNC state is 318! strain dependent rather than a species attribute (Rao et al. 2014). 319! Casabianca et al. (2015) found that two different strains of A. 320! hydrophila, one virulent and one non-virulent with different origins, 321! displayed different behaviours after exposure to nutrient stress 322! conditions. Our findings support such statement. 323! ! ! ! ! Resultados ! ! ! 117 324! Gene expression during environmental stress 325! The effect of osmolarity, among other stressors such as starvation or 326! pH changes, is key to the maintenance of membrane integrity. In that 327! sense, the role of the osmosensor EnvZ is essential. The expression of 328! envZ gene was significantly up-regulated in V. toranzoniae CECT 7225T 329! while in VBNC state, in comparison with the original culture (Fig 2A). 330! In contrast, V. toranzoniae strain R17 showed a 5-fold down-regulation 331! of envZ when incubated in 15‰ ASW (Fig. 2B). In the present study, 332! VBNC induction represents the combined action of three abiotic factors, 333! including starvation, temperature and osmotic stress. Therefore, the 334! overexpression of an osmoregulator seems necessary for the bacterium 335! to be able to adapt to a new osmotic environment. However, it is worth 336! pointing out that in V. vulnificus, envZ gene appeared also to be down-337! regulated in VBNC cells (Rao et al. 2014). On the other hand, Darcan et 338! al. (2008) found in E. coli that an envZ mutant remained culturable for 339! longer periods than the wildtype strain, although the mutant ultimately 340! disappeared from the media, in part due to its inability to adapt to 341! changes in the environment. 342! The expression the protein mreB, dropped two fold when the type 343! strain CECT 7225T cells entered the VBNC state (Fig. 2A). This result is 344! consistent with the coccoid form displayed by V. toranzoniae under the 345! employed stress conditions. V. vulnificus YJ016 and V. harveyi DY1 346! suffered a considerable reduction in the expression of this protein (6-fold 347! approximately) when in starvation conditions (Rao et al. 2014; Sun et al. 348! 2016), while in V. harveyi ATCC 14126T it was undetectable by 349! proteomic studies (Parada et al. 2016). Although the transcription levels 350! ! ! ! ! Resultados ! ! ! 118 of mreB rose after the resuscitation process in CECT 7225T strain, it 351! never reached the levels seen in actively growing cells, being two fold 352! less than the initial culture. A similar trend was found for V. vulnificus 353! (Rao et al. 2014; Sun et al., 2016), which showed even lower mreB 354! expression values (almost 8 fold) than V. toranzoniae. It has been 355! proposed that in Vibrio spp., the acquisition of the coccoid form is 356! indicative of entrance into the VBNC state (Chiu et al. 2008) However, 357! our results showed that strain R17, although did not reach the VBNC 358! state, also exhibited rounded morphology, and the reduction of the mreB 359! gene expression after 50 days was even more dramatic than in strain 360! CECT 7225T, reaching almost 8-fold less with respect to the exponential 361! culture (Fig. 2B). Therefore, although preliminary, our results of gene 362! expression are more in agreement with the fact that the loss of the 363! bacillary shape is a response to environmental pressures rather than a 364! specific-VBNC response, as observed by other authors (Parada et al., 365! 2016; Kaberdin et al. 2015). 366! The expression of ftsZ gene was rather low during the entire 367! experiment, even during the resuscitation phase (Fig. 2). In other vibrios, 368! the expression of ftsZ gene during the starvation or VBNC states is also 369! relatively low (Rao et al. 2014), although higher than in V. toranzoniae. 370! It is noteworthy that in our case, resuscitation was achieved by a 371! temperature change in an oligotrophic media, and not in the optimal 372! medium for the bacteria to initiate the division. 373! 374! Adhesion to surfaces and biofilm formation 375! Several studies have shown that attachment to surfaces, biotic or 376! abiotic, is an important part of the aquatic lifestyle of many vibrios 377! ! ! ! ! Resultados ! ! ! 119 (Vezzulli et al. 2010). The mechanisms promoting the survival of V. 378! toranzoniae isolates are an issue of interest because of their potential 379! pathogenicity. Adhesion assays showed similar efficiency for both 380! isolates, after normalizing the cell counts to the initial culture (Figure 381! 3A). Interestingly, we observed that the percentage of cells attached to 382! the chitin particles, 4% of the initial cell culture, represented low values 383! when compared to other Vibrio species like V. vulnificus (Williams et al. 384! 2014) or V. cholerae (Vezzulli et al. 2015). 385! Adhesion of bacterial cells to solid substrates can lead to the 386! formation of biofilm, which constitutes a successful survival mechanism 387! in some Vibrio species, as V. cholerae, increasing the ability of the 388! bacteria to survive under diverse environmental conditions (Matz et al. 389! 2005). We investigated biofilm formation of V. toranzoniae strains on 390! borosilicate surfaces. The results showed similar capabilities to form 391! biofilm, although CECT 7225T seemed to be able to attach and form 392! biofilm with higher efficiency (Figure 3B). 393! 394! In this study, we analysed two different strains with different origins: 395! one isolated from clams (CECT 7225T) and another isolated from 396! external and gill lesions of diseased fish (R17). As noted above, the 397! difference between the two strains is significant, not only because of 398! their host and geographic origin but also because one of the strains, R17, 399! displays pathogenic potential. In a deeper study recently carried out in 400! our group (Lasa et al. 2017), we found important genomic differences 401! between these strains that can explain such differences. Namely, R17 402! strain posses a set of iron acquisition systems and capsule production 403! genes, which are absent in the type strain. The current study highlights a 404! ! ! ! ! Resultados ! ! ! 120 new difference between the two isolates, the fact that both strains display 405! a different rate to enter the VBNC state. This observation does not 406! necessarily mean that R17 strain is unable to enter the VBNC state in a 407! longer period of incubation or even under other stressing factors. The 408! physiological mechanisms promoting environmental survival of V. 409! toranzoniae constitute an issue of interest because it may be crucial for 410! understanding the occurrence and survival of this species. The fact of 411! forming biofilm at similar levels, despite of the presence or absence of 412! capsule, and their ability to attach to organic compounds with the same 413! efficacy are important features in the bacterial ecophisyology, especially 414! related to the living style as a free-living or planktonic bacteria. In 415! addition, the VBNC state is believed to be associated with seasonal 416! fluctuations in the environment, with culturability decreasing during 417! winter months, when some cells enter the VBNC state, and increasing 418! during warmer months, when these cells begin to resuscitate (Oliver et 419! al. 1995). 420! In summary, results presented here reflect diverse survival strategies 421! displayed by two strains of the same species with different lifestyles. V. 422! toranzoniae type strain CECT 7225T, obtained from healthy clams, could 423! be considered as an environmental strain isolated during its transit 424! through a filter-feeding mollusc. Adapted as a free living bacterium, it is 425! able to enter the VBNC state in response to adverse environmental 426! conditions, and to resuscitate when favourable conditions are recovered. 427! On the other hand, strain R17, associated to diseased fish, could be 428! considered as a host-adapted bacterium, using the water environment for 429! short transfers between hosts. Therefore, the rapid infection of new hosts 430! ! ! ! ! Resultados ! ! ! 121 may hamper the entrance into VBNC state,of this strain. Further studies 431! to confirm such hypothesis are currently in progress. 432! 433! ACKNOWLEDGEMENTS 434! This research was supported in part by grant AGL2013-42628-R from 435! Ministerio de Economia y Competitividad. 436! 437! 438! Conflict of interest. None declared. 439! 440! ! ! ! ! Resultados ! ! ! 122 REFERENCES 441! 442! Arias CR, Macián MC, Aznar R, Garay E et al. 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