Influencia de la adenosina y de los receptores de adenosina en la diferenciación de subpoblaciones de monocitos

INFLUENCIA DE LA ADENOSINA Y DE LOS RECEPTORES DE ADENOSINA EN LA DIFERENCIACIÓN DE SUBPOBLACIONES DE MONOCITOS ADRIANA SAS BARBEITO 2016-2017 Trabajo fin de Grado FACULTAD DE BIOLOGÍA GRADO EN BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR I ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1 2. OBJETIVOS................................................................................................................... 4 3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................ 4 3.1. Muestras biológicas .......................................................................................................... 4 3.2. Material y reactivos .......................................................................................................... 4 3.3. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica: gradiente de Ficoll® .... 5 3.4. Purificación de monocitos por doble gradiente ............................................................. 6 3.5. Purificación de monocitos por adherencia ..................................................................... 7 3.6 Cultivo de los monocitos in vitro ...................................................................................... 7 3.7 Marcaje directo por inmunofluorescencia y análisis por citometría de flujo ............. 8 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 9 5. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 16 II ABREVIATURAS: A Ados Axencia de doazón de órganos e sangue Agencia de donación de órganos y sangre APC Antigen Presenting Cells Células presentadoras de antígenos B BC Buffy Coat Concentrado leucocitario BSA Bovine Serum Albumin Albúmina de suero bovino C CD14 Cluster of Differentiation 14 Cúmulo de diferenciación 14 CD86 Cluster of Differentiation 86 Cúmulo de diferenciación 86 D DCs Dendritic Cells Células dendríticas DMSO Dimethyl Sulfoxide Dimetilsulfóxido F FBS Fetal Bovine Serum Suero bovino fetal FITC Fluorescein Isothiocynate Isotiocinato de fluoresceína FSC Forward Scatter Dispersión frontal G Gm Geometric mean Media geométrica GM-CSF Granulocyte Macrophague ColonyStimulating Factor Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos I iDC’s Immature Dendritic Cells Células dendríticas inmaduras IL-4 Interleukin-4 Interleucina-4 L LPS Lipopolysaccharide Lipopolisacáridos M MFI Mean Fluorescence Intensity Intensidad media de fluorescencia MHC Major Histocompatibility Complex Complejo mayor de histocompatibilidad moDCs Monocyte-derived Dendritic cells Células dendríticas derivadas de monocitos N NECA 5’-(Nethylcarboxiamido)adenosine 5’- (NEtilcarboxiamido)adenosina P PAMP Pathogen Associated Molecular Pattern Patrones moleculares asociados con patógenos. PBMCs Peripheral Blood Mononuclear Cells Células mononucleares de sangre periférica PE Phycoerythrin Ficoeritrina PRR Pattern Recognition Receptors Receptores de reconocimiento de patrones R RBCs Red Blood Cells Células rojas de la sangre RT Room Temperature Temperatura ambiente S SSC Side Scatter Dispersión lateral T TB Trypan Blue Azul de Tripán TCR T Cell Receptor Receptor de célula T 1 RESUMEN La adenosina (Ado) es una molécula endógena moduladora de la respuesta inflamatoria. Este nucleósido se encuentra a bajas concentraciones en condiciones normales, pero condiciones como la hipoxia, necrosis, estrés metabólico y daño tisular (ej., cáncer u otras enfermedades) incrementan su síntesis y liberación. Ado interfiere en la activación de los macrófagos y en la diferenciación de monocitos a través de cuatro receptores asociados a proteínas G: A1, A2A, A2B y A3. El objetivo de este trabajo fue comprobar la acción que ejerce la adenosina sobre la diferenciación de monocitos a células dendríticas (DCs, Dendritic Cells) así como describir la acción de sus receptores A2A y A2B en dicho proceso. Para lograrlo, se cultivaron poblaciones de monocitos obtenidos a partir de concentrados leucocitarios (BC, Buffy Coats) de donantes sanos en presencia de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, Granulocyte Macrophague Colony-Stimulating Factor) e interleucina-4 (IL-4, Interleukin-4), un análogo no selectivo y más potente de adenosina, la 5’-(N-Etilcarboxiamido)adenosina (NECA, 5’-(Nethylcarboxiamido) adenosine) y dos antagonistas de sus receptores: CV69 (A2AR antagonista) y SYAF030 (A2BR antagonista). Los resultados obtenidos indican que la adenosina interfiere en la diferenciación de los monocitos hacia DCs inflamatorias dando lugar a una población de células con características intermedias entre ambos tipos celulares. Sin embargo, no se ha logrado discernir el receptor de adenosina involucrado entre los dos candidatos más probables: A2AR y A2BR. 1. INTRODUCCIÓN La respuesta inmunitaria constituye el conjunto de acciones que desempeña el sistema inmunitario frente a una infección, mediante mecanismos innatos o adaptativos. La inmunidad adaptativa se caracteriza por su especificidad y está mediada por los linfocitos B (respuesta humoral) y T (respuesta celular). Existen dos tipos de linfocitos T atendiendo a su receptor de antígenos (TCR), linfocitos Tαβ y Tγ; dentro de los primeros podemos distinguir entre linfocitos T citolíticos o CD8+ y linfocitos T colaboradores, helper o CD4+ (Regueiro et al., 2010). Estos últimos, se dividen en linfocitos T efectores (Th1, Th2, Th17, etc.) y linfocitos T reguladores (Treg). En cambio, la inmunidad innata se caracteriza por su rapidez e inespecificidad y en ella confluyen un amplio conjunto de tipos celulares con una herramienta común que les permite reconocer a los microorganismos: los receptores de reconocimiento de patrones (PRR, Pattern 2 Recognition Receptors). Estos receptores reconocen patrones moleculares asociados con patógenos (PAMP, Pathogen Associated Molecular Pattern) como los lipopolisacáridos (LPS, Lipopolysaccharide) de la superficie de ciertas bacterias (Fainboim & Geffner, 2011). Este tipo de inmunidad está mediada por el complemento, los interferones, los linfocitos NK y los fagocitos; estos últimos son los agentes celulares innatos del sistema inmunitario y los principales son granulocitos, neutrófilos, macrófagos y las DCs (Regueiro et al., 2010). Las DCs son un conjunto de células que actúan como vínculo entre la inmunidad innata y adaptativa gracias a la presencia de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, Major Histocompatibility Complex) de clase II en su superficie, que las convierten en células presentadoras de antígenos (APC, Antigen Presenting Cells) profesionales (Male et al.,2013). Existen dos poblaciones de DCs, las migratorias y las residentes (Segura et al., 2012). Algunas DCs proceden de precursores como los monocitos, que se encuentran en circulación y se dirigen hacia los tejidos donde residen como células dendríticas inmaduras (iDCs, immature Dendritic Cells) dedicadas a la captura y procesamiento de antígenos (Ag) gracias a su capacidad endocítica y fagocítica (Wilkin et al., 2001). Bajo la influencia de una variedad de señales de peligro, las DCs entran en un proceso de diferenciación (maduración) y migran hacia los órganos linfoides secundarios (La Sala et al., 2001), donde se convierten en APC profesionales adquiriendo la capacidad de activar a las células T vírgenes, desencadenando así la respuesta inmunitaria adaptativa y orientando su curso gracias a la liberación de diferentes familias de citocinas que inducen la diferenciación de los linfocitos T CD4+ en diferentes perfiles. Son células que se caracterizan por expresar elevados niveles de moléculas de MHC y moléculas coestimuladoras CD80 y CD86, pero son deficientes en moléculas propias de otros linajes como CD14, un marcador de monocitos y macrófagos (Fainboim & Geffner, 2011). La sangre periférica humana tiene un pequeño número de DCs, pero los monocitos circulantes pueden ser una importante fuente de precursores (Giordano et al., 2003) ya que en un contexto inflamatorio, se diferencian a poblaciones discretas de DCs. Esta vía de desarrollo puede ser reproducida in vitro mediante el uso de GM-CSF e IL-4, dando lugar a la expresión de marcadores característicos de DCs y eliminando aquellos de monocitos y macrófagos (Challier et al., 2012). 3 Pese a que las reacciones inflamatorias e inmunológicas protegen de las invasiones de microorganismos, también pueden desencadenar daño tisular; es por ello que el organismo genera distintos mecanismos con el fin de limitar este daño. La adenosina, un nucleósido de purina, es una molécula endógena que posee un papel central en la regulación de la respuesta inmune y en la limitación de la destrucción tisular. Aunque está constitutivamente presente en el espacio extracelular en bajas concentraciones, el estrés metabólico incrementa notablemente sus niveles (Haskó & Cronstein, 2004). Este incremento extracelular de Ado puede tener lugar mediante dos mecanismos no excluyentes: la generación intracelular y la generación extracelular. En el primer caso, cuando se alcanzan elevadas concentraciones de adenosina en la célula, esta se libera a espacio extracelular a través de transportadores especializados. En el segundo, se liberan precursores de nucleótidos de adenina como el ATP que son catalizados gracias a ectonucleotidasas (Haskó et al., 2009). Ado es reconocida por cuatro tipos de receptores (ARs), pertenecientes a la familia de receptores acoplados a proteínas G: A1, A2A, A2B y A3. A través de ellos, se encarga de potenciar la respuesta inflamatoria cuando se encuentra a bajas concentraciones, mientras que actúa con funciones antiinflamatorias en aquellos tejidos o células dañadas donde se ha incrementado su síntesis y las concentraciones son elevadas. Estos efectos antagónicos de Ado se explican, entre diversas causas, por la expresión diferencial de ARs en los tejidos, las diferentes afinidades de los mismos por Ado y las diferentes rutas de trasducción de señales. Así por ejemplo, A1R y A2AR son ARs de alta afinidad, mientras que A2BR y A3R lo son de baja. Igualmente, algunos ARs como A1 o A3 son capaces de reducir los niveles de cAMP, mientras que otros como A2A o A2B elevan su concentración intracelular (Haskó & Cronstein., 2004). Así en relación a la activación de macrófagos, Ado regula negativamente vía A2A (mayoritariamente) la activación de la vía clásica/proinflamatoria activada por PAMPs, lo que lleva a un descenso de la producción de TNFα y otras citocinas; al mismo tiempo favorece una activación alternativa, desencadenada por IL-4, en la que participa mayormente el receptor A2B (Haskó & Pacher, 2012). En este trabajo, se van a comprobar los efectos de la adenosina, mediante el uso de un agonista inespecífico de sus receptores, la NECA, así como comprobar si los receptores A2A y/o A2B están implicados en dichos efectos. 4 2. OBJETIVOS El objetivo de este trabajo es determinar si existe un efecto antiinflamatorio o proinflamatorio de Ado sobre el proceso de diferenciación de monocitos de sangre periférica humana en DCs y si dichos efectos están mediados por sus dos principales ARs: A2AR y A2BR. 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Muestras biológicas Las muestras biológicas a partir de las cuales se realizó la obtención de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs, Peripheral Blood Mononuclear Cells) y posterior purificación de monocitos, consistieron en concentrados leucocitarios de donantes sanos, facilitados por la Axencia de doazón de órganos e sangue (Ados, Agencia de donación de órganos y sangre). Las extracciones de sangre de las que procedieron los BCs fueron tomadas 1-2 días antes de la realización de cada experimento y dichos concentrados fueron conservados a temperatura ambiente (RT, Room Temperature) hasta el día de su uso. 3.2. Material y reactivos Como material de plástico se emplearon tubos de centrífuga de 15 mL (Labcon Superclear® centrifugue tubes, Labcon, California, USA) y tubos cónicos de polipropileno de 50 mL (Corning, Falcon®, Nueva York, USA), placas de cultivo de 24 pocillos de fondo plano de poliestireno (BD Falcon® MultiwellTM 24 well, BD, España) y tubos de citometría de poliestireno de 5 mL con fondo redondo (Corning, Falcon®, Nueva York, USA). El contaje celular se realizó en cámara de Neubauer (Blau Brand, Alemania), con ayuda de un microscopio invertido (Wilovert®) y de un contador celular (Milky Way® Counter, Taiwan). De la casa comercial Sigma-Aldrich®, España se han obtenido los siguientes reactivos: RPMI-1640, NECA, Histopaque®-1077, Percoll®, antibiótico (Penicilina + Estreptomicina) y albúmina de suero bovino (BSA, Bovine Serum Albumin). Este último, junto con Azida sódica (E. Merck) fueron empleados para la elaboración del tampón PBS-BSA 0.05% (p/v) Azida sódica. Los compuestos Cloruro sódico (NaCl), Cloruro potásico (KCl), Fosfato disódico dodecahidratado (Na2HPO4 x 12 H2O), Fosfato monopotásico 5 (KH2PO4) y Bicarbonato sódico (empleado para suplementar el RPMI-1640) fueron suministrados por la casa comercial Panreac Química S.A., España. Para la diferenciación de monocitos a células dendríticas se emplearon las citocinas GM-CSF e IL4 (PreproTech, Londres, Reino Unido) y para el marcaje se emplearon los anticuerpos Fitc Mouse AntiHuman CD86 y Fitc Mouse Anti-Human CD14; así como el isotipo Fitc Mouse IgG1k Isotype Control (PharmigenTM, BD Biosciences, España). Para la realización de los experimentos se emplearon los siguientes aparatos: Citómetro de Flujo (BD FACSortTM, BD, España), centrífuga con rotor basculante GH-3.8 (Beckman GS-6R Centrifuge, Marshall Scientific, USA), campana de flujo laminar (Telstar BioSTARPlus, Telstar, España) y una estufa de CO2 con atmósfera húmeda (Heraeus, Alemania). Todo el material no estéril como recipientes de vidrio o puntas de micropipetas, fue esterilizado en autoclave (Autoester-G). Como método de esterilización del RPMI-1640 se empleó una unidad de filtrado (Millipore® StericupTM filter units, 0.22 µm). 3.3. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica: gradiente de Ficoll® La purificación de las PBMCs se realizó a partir de un BC, mediante el uso de gradientes de densidad de Ficoll®. Este procedimiento se llevó a cabo en una cámara de flujo laminar para mantener la esterilidad. Así mismo, el material de plástico, los reactivos y las diferentes soluciones empleadas fueron también estériles. Se realizó una dilución 1:4 del BC en medio RPMI-1640. Sobre 10 mL de Ficoll® (añadidos previamente a dos tubos de 15 mL) fueron depositados cuidadosamente 20 mL de la dilución anterior, evitando la mezcla entre ambos líquidos. Se centrifugó a 400 xg, 20 min, sin freno (RT). Tras la centrifugación se obtuvieron cuatro regiones: la región superior formada por el plasma y las plaquetas, la banda constituida por las PBMCs, el Ficoll® y el pellet o precipitado, constituido por las células rojas de la sangre (RBCs, Red Blood Cells). Se extrajo la banda formada por las PBMCs con ayuda de una pipeta pasteur estéril y se resuspendió en 15 mL de RPMI-1640. A continuación, se centrifugó a 350 xg, 7 min, con freno (RT). Las PBMCs fueron lavadas en un volumen de 10 mL de RPMI-1640, repitiendo las condiciones de centrifugación del paso anterior. Posteriormente, se tomaron 10 µL de células y se mezclaron 6 con 10 µL de Azul de Tripán (TB, Trypan Blue) (colorante azoico que nos permitirá diferenciar las células vivas de las muestras basándose en la selectividad de la membrana a este tipo de compuestos) y 180 µL de medio RPMI-1640 (dilución 1:20) para el estudio de la viabilidad y la cuantificación celular. 10 µL de esta mezcla fueron cargados en la Cámara de Neubauer, realizando el contaje celular con ayuda de un microscopio óptico invertido y de un contador celular. Finalmente el cálculo del número de células se obtuvo empleando la siguiente expresión matemática: Nº absoluto de células= nº de células en un cuadrante (16 cuadrículas) x factor de dilución (20) x volumen de células (10 mL) x factor de conversión (10 000). 3.4. Purificación de monocitos por doble gradiente (Protocolo adaptado de Repnik, Knzevic, & Jeras, 2003) Tras el contaje celular, las PBMCs fueron ajustadas a una densidad celular de 50·106 células/ mL, para ello fue normalmente necesario centrifugar a 230 xg, 7 min, con freno (RT), se eliminó el sobrenadante y se añadió el volumen de RPMI-1640 necesario en función del número de PBMCs. Para realizar el gradiente hiperosmótico se depositaron (tubo de 15 mL) cuidadosamente 3 mL (150·106 células) de PBMCs sobre una solución constituida por 4.85 mL de Percoll®, 4.15 mL de agua destilada estéril y 1 mL de 1.6 M NaCl estéril, centrifugando posteriormente a 630 xg, 15 min, sin freno (RT). La finalidad de este primer gradiente fue separar monocitos (banda superior) de linfocitos (pellet celular). Tras la centrifugación, con la ayuda de una pasteur estéril se recogió la banda de monocitos y se resuspendió en 10 mL de medio RPMI-1640. Las células fueron posteriormente centrifugadas a 350 xg, 7 min, con freno (RT), se retiró el sobrenadante con una pasteur estéril y nuevamente se resuspendieron en un volumen de 3 mL de medio RPMI-1640. Esta suspensión celular fue depositada cuidadosamente (tubo de 15 mL) sobre una solución isoosmótica constituida por 4.15 mL de Percoll®, 4.85 mL de agua destilada autoclavada y 1 mL de 1.5 M NaCl estéril; tras lo cual se centrifugó a 350 xg, 15 min, sin freno (RT). La finalidad de este segundo gradiente fue la separación de monocitos de plaquetas y células muertas. Tras la centrifugación se retiró el sobrenadante con ayuda de una pasteur estéril y se resuspendió el precipitado con 5 mL de medio RPMI-1640. Tras un nuevo proceso de centrifugación a 350 xg, 7 min, con freno (RT), el sobrenadante fue retirado (pasteur estéril) y las células resuspendidas en 5 mL de medio completo: RPMI-1640, 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS, Fetal Bovine Serum) inactivado (56 ºC, 30 min), 100 IU/ mL penicilina y 100 µg/ mL estreptomicina. 13 2012). Actualmente no disponemos de una hipótesis que explique la diferencia entre nuestros resultados y los de otros investigadores en relación al efecto de NECA sobre CD86 en moDCs. 4.3 El efecto de los inhibidores SYAF030 y CV69 sobre los receptores de adenosina no produce cambios significativos en los niveles de expresión de CD14 y CD86 La adenosina juega un papel clave como mediador anti-inflamatorio e inmunosupresivo actuando mayoritariamente a través de los receptores A2A (Schiedel et al., 2013), debido a la mayor afinidad de los mismos por la Ado, ya que los receptores A2B necesitan una concentración mayor para activarse (Haskó et Figura 4. Expresión de CD14 y CD86 en ausencia y presencia de NECA. Los monocitos, procedentes de 5 donantes sanos y diferenciados a moDCs en presencia de GM-CSF e IL-4 fueron cultivadas en ausencia (-) y en presencia (+) de NECA (10 µM). Esta molécula induce el aumento de células CD14+ y reduce el de CD86+; el nº medio de moléculas de cada marcador expresado por célula positiva varía en el mismo sentido en el caso de CD86 y no muestra cambios significativos en el caso de CD14. El estadístico empleado fue paired t-test (el valor p mostrado se corresponde con el Twotailed P-value) 14 al., 2009). Para comprobar cuál de los ARs estaba implicado en el proceso de generación de la población celular con características intermedias entre monocitos e iDCs y moDCs, se llevó a cabo la incubación de los mismos en presencia de GM-CSF, IL-4, NECA y alternativamente dos antagonistas de dichos receptores: CV69 (A2AR) y SYAF030 (A2BR). Estos antagonistas fueron titulados previamente (0.01, 0.1, 1, 10 y 100 µM) y los resultados obtenidos no mostraron un efecto dosis-respuesta claro, pero si un efecto citotóxico a concentraciones >1 µM, por lo que para estos ensayos se decidió emplear una concentración reducida de 0.1 µM en ambos casos. Aunque el número de ensayos es muy reducido (n= 4), se puede apreciar que la presencia de los antagonistas CV69 y SYAF030 no elimina de forma significativa el efecto de NECA (5µM) sobre la expresión de CD14 o CD86 (% y MFI) (Fig. 5). No obstante los efectos de estos antagonistas parecen ser dependientes de la expresión inicial de dichos marcadores en las moDCs, aunque el tamaño muestral no Figura 5. Expresión de CD14 y CD86 en moDCs generadas en presencia de GM-CSF, IL-4 y NECA bajo la influencia de antagonistas de A2AR (CV69) o A2BR (SYAF030). Los datos obtenidos no muestran diferencias significativas en la expresión de CD14 y CD86 en ausencia y presencia de antagonistas. El número de ensayos realizados fue de 4, con moDCs procedentes de diferentes donantes y la concentración de NECA empleada fue de 5 µM. El estadístico empleado fue paired t-test (el valor p mostrado es el Two-tailed Pvalue). 15 permite extraer más conclusiones. Hace falta un mayor número de ensayos tanto con antagonistas como agonistas específicos de los diferentes ARs para discernir cuál o cuáles son responsables de los efectos de NECA (y por lo tanto Ado) sobre la diferenciación de monocitos en DCs. 4.4 El incremento de expresión de CD14 causado por NECA en moDCs está correlacionado positivamente con el número de células. En paralelo a los ensayos de inmunofluorescencia y citometría de flujo, las células tras ser cultivadas in vitro fueron resuspendidas siguiendo los mismos procedimientos (independientemente del tratamiento al que fueran sometidas) y cuantificadas con la ayuda del microscopio invertido, un contador celular y una cámara de Neubauer. Los datos obtenidos nos permitieron relacionar la expresión de CD14 y CD86 con el número absoluto de células y determinar que existe una correlación directa entre la proliferación celular y la expresión de CD14 (Fig. 6A), mientras que la relación no fue significativa en el caso de CD86 (Fig. 6B). Estos resultados podrían asociarse con la mayor capacidad proliferativa de las células en un estado de indiferenciación, como es el caso de monocitos CD14+, frente a células diferenciadas como las moDCs CD14low. La adenosina puede tener un efecto proliferativo o anti-proliferativo, estimulando el crecimiento celular o la apoptosis (Schiedel et al, 2013.) En este caso NECA estaría favoreciendo la proliferación celular o la supervivencia, incrementando el número absoluto final de moDCs. A B Figura 6. Correlación entre la expresión de CD14 y CD86 y la proliferación celular. En las gráficas se representa la correlación entre la expresión de ambos marcadores y el nº de células obtenidas. En la figura A se muestra la correlación del número absoluto de moDCs con la expresión de CD14, mientras que en la figura B se muestra la correlación con la expresión de CD86. Los resultados de correlación fueron obtenidos empleando un test de Spearman. 16 5. CONCLUSIONES 1. NECA interfiere con la diferenciación de monocitos humanos en noDCs, aumentando la expresión de CD14, reduciendo la de CD86 y generando una población de APCs menos eficiente y con características híbridas entre monocitos y moDCs. 2. Los resultados experimentales disponibles por nuestro grupo no permiten valorar, en estos momentos, si los antagonistas selectivos de los receptores A2A y A2B son capaces de revertir el efecto de la NECA sobre la diferenciación de moDCs. 3. El efecto de NECA sobre la diferenciación de moDCs genera un aumento bien de la proliferación celular o de la supervivencia. 6. BIBLIOGRAFÍA  Challier, J., Bruniquel, D., Sewell, A. K. et al. 2012, “Adenosine and cAMP signalling skew human dendritic cell differentiation towards a tolerogenic phenotype with defective CD8+ T-cell priming capacity”, Immunology, vol. 138, no. 4, pp. 402-410.  Giordano, D., Magaletti, D. M., Clark, E. A. et al. 2003, “Cyclic nucleotides promote monocyte differentiation toward a DC-SIGN+ (CD209) intermediate cell and impair differentiation into dendritic cells”, The Journal of Immunology, vol. 171, no. 12, pp. 6421-6430.  Fainboim, L. & Geffner, J. 2011, Introducción a la Inmunología Humana, 6ª Ed., Editorial Médica panamericana, Buenos Aires. ISBN: 9789500602709.  Haskó, G. & Cronstein, B. N. 2004, “Adenosine: an endogenous regulator of innate immunity”, Trends in immunology, vol. 25, no. 1, pp. 33-39.  Haskó, G., Csóka, B., Németh, Z. H. et al. 2009, “A(2B) adenosine receptors in immunity and inflamation”, Trends in Immunology, vol. 30, no. 6, pp. 263-270.  Haskó, G. & Pacher, P. 2012, “Regulation of macrophage function by adenosine”, Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology, vol. 32, no. 4, pp. 865-869.  La Sala, A., Ferrari, D., Corinti, S. et al. 2001, “Extracellular ATP induces a distorted maturation of Dendritic Cells and inhibits their capacity to initiate Th1 responses”, The Journal of Immunology, vol. 166, no. 3, pp. 1611-1617. 17  Male, D., Brostoff, J., Roth, D. B. et al. 2013, Inmunología, 8ª Ed., Editorial Elsevier, Barcelona. ISBN: 9780702045486.  Novitskiy, S. V., Ryzhov, S., Zaynagetdinov. R. et al. 2008, “Adenosine receptors in regulation of dendritic cell differentiation and function”, Blood Journal, vol. 112, no. 5, pp. 1822-1831.  Regueiro González, J. R., López Larrea, C., Rodríguez González, S. et al. 2010, Inmunología: Biología y patología del sistema inmunitario, 4ª Ed., Editorial Médica panamericana, Madrid. ISBN: 9788498350036.  Repnik, U., Knezevic, M. & Jeras, M. 2003, “Simple and cost-effective isolation of monocytes from buffy coats”, Journal of immunological methods, vol. 278, no. 1-2, pp. 283-292.  Schiedel, A. C., Lacher, S. K., Linnemann, C. et al. 2013, “Antiproliferative effects of selective adenosine receptor agonist and antagonist on human lymphocytes: evidence for receptorindependent mechanism”, Purinergic Signalling, vol. 9, no. 3, pp. 351-365.  Sciaraffia, E., Riccomi, A., Lindstedt, R. et al. 2014, “Human monocytes respond to extracelular cAMP through A2A and A2B adenosine receptors”, Journal of Leukocyte Biology, vol. 96, no. 1, pp. 113-122.  Segura, E., Valladeau-Guilemond, J., Donnadieu, M-H. et al. 2012, “Characterization of resident and migratory dendritic cells in human lymph nodes”, The Journal of Experimental Medicine, vol. 209, no. 4, pp. 653.  Volpini, R., Costanzi, S., Lambertucci, C. et al. 2004, “Adenosine receptor agonist: synthesis and binding affinity of 2-(aryl)alkythioadenosine derivatives”, ARKIVOC, vol. 5, pp. 301-311.  Wilkin, F., Duhant, X., Bruyns, C. et al. 2001, “The P2Y11 receptor mediates the ATP-induced maturation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells”, The Journal of Immunology, vol 166, no. 12, pp. 7172-7177.  Zarif, J. C., Hernandez, J. R., Verdone, J. E. et al. 2016, “A phased strategy to differentiate human CD14+ monocyte into clasically and alternatively activated macrophages and dendritic cells”, BioTechniques, vol. 61, no. 1, pp. 33-41. 18