Regulación de la expresión y función del receptor GPR55 en la homeostasis energética y metabólica

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA Tesis Doctoral Adenis Ibett Díaz Arteaga Octubre 2012 Prof. Dr. Carlos Diéguez González, Catedrático del Departamento de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela Dr. Rubén Nogueiras Pozo, Investigador del Programa Ramón y Cajal de la Universidad de Santiago de Compostela Certifican que: La presente Tesis Doctoral titulada “Regulación de la expresión y función del receptor GPR55 en la homeostasis energética y metabólica”, fue realizada por Adenis Ibett Díaz Arteaga, bajo su dirección en los Laboratorios del Departamento de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela, estimando que se encuentra concluida y en condiciones de ser presentada para optar al grado de Doctor. Y para que así conste, firmamos la presente autorización en Santiago de Compostela 2012. Fdo.: Prof. Dr. Carlos Diéguez González Fdo.: Dr. Rubén Nogueiras Pozo Fdo.: Adenis Ibett Díaz Arteaga DEPARTAMENTO DE FISIOLOXIA ÍNDICE 5 INDICE INTRODUCCIÓN ..................................................................................... 19 1. HOMEOSTASIS ENERGETICA Y OBESIDAD ....................................................................... 19 1.1. Homeostasis energética ............................................................................................. 19 1.2. Obesidad .................................................................................................................... 21 2. REGULACIÓN DE LA INGESTA ......................................................................................... 22 2.1. Señales periféricas..................................................................................................... 23 2.1.1. Hormonas del tejido adiposo .......................................................................... 23 Leptina .......................................................................................................... 23 Adiponectina ................................................................................................ 24 Resistina (RSTN) ............................................................................................ 25 Interlukinas (IL-6 e IL-1) ................................................................................ 26 Factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) ........................................................ 27 2.1.2. Señales del tracto gastrointestinal que regulan la ingesta ............................... 27 Ghrelin .......................................................................................................... 27 Colecistoquinina (CCK) ................................................................................. 28 GLP-1 (Glucagón-like-peptide) ..................................................................... 30 Péptido YY (PYY) ........................................................................................... 30 2.1.3. Hormonas pancreáticas ..................................................................................... 32 Insulina ......................................................................................................... 32 Polipétido pancrético (PP) ............................................................................ 32 2.2. Señales del Sistema Nervioso Central ....................................................................... 33 2.2.1. Núcleos hipotalámicos y señales de adiposidad ............................................ 34 Núcleo arcuato ............................................................................................. 34 Núcleo ventromedial .................................................................................... 35 Hipotálamo lateral ........................................................................................ 36 Núcleo paraventricular ................................................................................. 37 Núcleo dorsomedial ..................................................................................... 37 2.2.2. Señales de recompensa .................................................................................. 38 3. SISTEMA ENDOCANNABINOIDE ..................................................................................... 39 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 6 3.1. Uso terapéutico del cannabis .................................................................................... 39 3.2. Orígenes del Sistema Endocannabionide .................................................................. 39 3.3 Localización y características farmacológicas de los EC ........................................... 42 3.4. Biosíntesis y metabolismo de los EC ........................................................................ 42 3.5. Ligandos y Receptores .............................................................................................. 43 3.5.1. Receptor Cannabinoide CB1 ........................................................................... 44 3.5.2 Receptor Cannabinoide CB2 .......................................................................... 47 3.6. Agonistas ................................................................................................................... 48 3.7. Antagonistas ............................................................................................................. 49 3.8. SEC: adipogénesis y lipogénesis ................................................................................ 52 3.9. SEC: Obesidad, hiperglicemia y diabetes en animales y humanos .......................... 52 3.9.1. Modelos animales ........................................................................................... 53 3.9.2. Estudios en humanos ...................................................................................... 56 4. RECEPTOR HUÉRFANO GPR55 (Receptor acoplado a proteínas G-55) .......................... 58 4.1. Localización de GPR55 .............................................................................................. 60 4.2. Farmacología de GPR55 ........................................................................................... 61 4.3. Funciones de GPR55 .................................................................................................. 63 OBJETIVOS ............................................................................................ 67 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................. 67 OBJETIVOS ESPECIFICOS ...................................................................................................... 67 MATERIAL Y METODOS ......................................................................... 69 1. Animales de Experimentación ........................................................................................ 69 1.1. MODELOS ANIMALES ............................................................................................... 69 1.1.1. Rata Sprague-Dawley ...................................................................................... 69 1.1.2. Ratas Lewis enanas (dwarf) ............................................................................ 70 1.1.3. Ratón knock-out de Leptina ob/ob ................................................................. 70 1.1.4. Ratón knockout para GPR55 ........................................................................... 70 2. TECNICAS EXPERIMENTALES ........................................................................................ 71 2.1. Administración de la anestesia ................................................................................. 71 2.2. Implantación cánula i.c.v. para tratamiento agudo .................................................. 72 ÍNDICE 7 2.3. Colocación de bombas osmóticas para tratamiento crónico ................................... 72 3. MODELOS EXPERIMENTALES .......................................................................................... 73 3.1. Modelos experimentales in vivo ............................................................................... 73 3.1.1. Desarrollo Postnatal y Dimorfismo sexual ..................................................... 73 3.1.2. Efecto hormonas gonadales ........................................................................... 73 3.1.3. Ayuno ............................................................................................................. 73 3.1.4. Ayuno y tratamiento con Leptina .................................................................. 74 3.1.5. Gestación ....................................................................................................... 74 3.1.6. Restricción alimenticia crónica ...................................................................... 74 3.1.7. Dieta alta/baja en grasas ............................................................................... 75 3.1.8. Efecto de las hormonas Tiroideas ................................................................... 76 3.1.9. Adrenalectomía .............................................................................................. 76 4. TRATAMIENTOS FARMACOLOGICOS ............................................................................. 77 4.1. Tratamientos con O-1602 ........................................................................................ 77 4.1.1. Efectos metabólicos del tratamiento agudo con O-1602 .............................. 77 4.1.2. Efectos metabólicos del tratamiento subcrónico con O-1602 ...................... 77 4.1.3. Efectos metabólicos del tratamiento intraperitoneal agudo con O-1602 en ratones deficientes del gen GPR55 ................................................................. 78 4.2. Tratamientos con LPI ................................................................................................. 79 4.2.1. Estudio periférico en ratones knockout de GPR55 ........................................ 79 4.2.2. Efectos metabólicos del tratamiento agudo con LPI ..................................... 79 4.2.3. Efectos in vitro de la administración de O-1602 y LPI en una línea celular de roedores .......................................................................................................... 80 4.2.3.1. Efecto de O-1602 en la diferenciación adipocitaria de células 3T3-L1 ................................................................................................... 80 4.2.3.2. Efecto de O-1602 en la movilización intracelular de calcio ([Ca2+]i) en adipocitos 3T3-L1 ................................................................ 81 4.2.3.3. Efecto de LPI en la diferenciación adipocitaria de células 3T3L1 .......................................................................................................... 82 5. REGULACION DE CB1 Y GPR55 EN GRASA BLANCA E HIGADO EN HUMANOS ............... 82 Pacientes y métodos .................................................................................... 82 Recolección de tejidos .................................................................................. 83 5.1. Ensayos en sangre .................................................................................................... 84 5.2. Análisis de LPI ........................................................................................................... 85 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 8 5.3. Experimentos ex-vivo usando explantes de tejido adiposo subcutáneo y visceral .. 87 5.4. Efecto de LPI sobre los niveles intracelulares de calcio ([Ca2+]i) en cultivos de adipocitos diferenciados ........................................................................................... 88 5.5. Extracción de ARN y PCR a tiempo real .................................................................... 89 6. TECNICAS EXPERIMENTALES .......................................................................................... 91 6.1. Extracción de ARN total ........................................................................................... 91 Aislamiento del ARN ..................................................................................... 92 Precipitación del ARN ................................................................................... 92 Lavado del ARN ............................................................................................. 92 6.1.1. Cuantificación del ARN ................................................................................... 93 6.1.2. Retrotranscripción (RT) .................................................................................. 93 6.1.3. PCR a tiempo real ........................................................................................... 94 6.1.4. Condiciones para la PCR en Tiempo Real con Sondas de Hidrólisis ............... 95 6.1.5. Diseño de primers ........................................................................................... 95 6.2. Western Blot (WB) .................................................................................................. 100 6.2.1. Extracción de proteínas totales: ................................................................... 100 6.2.2. Electroforesis y Transferencia: ...................................................................... 101 6.2.3. Inmunodetección .......................................................................................... 103 7. ANALISIS ESTADISTICO Y REPRESENTACIONES GRAFICAS ............................................ 105 RESULTADOS ....................................................................................... 107 I. REGULACION DE CB1 Y GPR55 EN GRASA BLANCA ...................................................... 107 1. Efecto del ayuno sobre la expresión de CB1 y GPR55 en WAT .................................... 107 2. Efecto del estado nutricional sobre la expresión de CB1 y GPR55 en WAT: ayuno, administración de leptina, restricción alimenticia y dieta. .......................................... 108 3. Efecto de la gestación sobre la expresión de CB1 y GPR55 en WAT ............................ 112 4. Efecto del desarrollo postnatal sobre la expresión de CB1 y GPR55 en WAT ................ 112 5. Efecto de alteraciones en función hipofisaria sobre la expresión de CB1 y GPR55 en WAT: adrenalectomías, hormonas tiroideas y hormona del crecimiento ............. 114 6. Efecto de las gonadectomías sobre la expresión de CB1 y GPR55 en WAT ................. 116 ÍNDICE 9 II. REGULACION DE CB1 Y GPR55 EN HIGADO ................................................................. 118 1. Efecto del estado nutricional sobre la expresión de CB1 y GPR55 en hígado: ayuno y administración de leptina .......................................................................................... 118 2. Efecto de la restricción alimenticia sobre la expresión de CB1 y GPR55 en hígado .... 119 3. Efecto de la dieta sobre la expresión de CB1 y GPR55 en hígado ................................ 119 4. Efecto del desarrollo postnatal sobre la expresión de CB1 y GPR55 en hígado .......... 120 5. Efecto de alteraciones en la función hipofisaria sobre la expresión de ARNm de CB1 y GPR55 en hígado ................................................................................................ 122 III. EFECTOS METABOLICOS DE LA ADMINISTRACION DE LIGANDOS DEL RECEPTOR GPR55: O-1602 vs LPI .............................................................................................................. 123 1. Efectos de la administración aguda de O-1602 ............................................................ 123 1.1. Administración aguda i.c.v., dosis y tiempo respuesta ........................................... 123 1.2. Administración aguda i.p. dosis y tiempo respuesta .............................................. 123 1.3. Efectos de la administración aguda central del O-1602 sobre neuropéptidos hipotalámicos .......................................................................................................... 124 1.4. Administración aguda i.p. de O-1602 sobre la ingesta en ratones deficientes de GPR55 ...................................................................................................................... 126 2. Efectos de la administración crónica de O-1602 .......................................................... 127 2.1. Administración i.c.v crónica (7 días) de O-1602: Efectos sobre la ingesta, la composición corporal y el tejido adiposo blanco. ................................................... 127 2.2. Administración i.p crónica (7 días) de O-1602: Efectos sobre la ingesta, la composición corporal, parámetros metabólicos y el tejido adiposo blanco. ......... 129 3. Efectos de O-1602 sobre adipocitos in vitro ................................................................ 134 IV. EFECTOS METABÓLICOS DE LA ADMINISTRACIÓN DE LPI ........................................... 136 1. Efectos de la administración aguda de LPI .................................................................. 136 1.1. Administración central i.c.v de LPI ......................................................................... 136 1.2. Administración i.p. aguda de LPI ............................................................................ 137 2. Administración i.p. crónica (7 días) de LPI. Efectos sobre la ingesta, la composición corporal y el tejido adiposo blanco .............................................................................. 137 3. Efectos de LPI sobre células 3T3-L1 in vitro ................................................................. 138 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 16 PKA Proteína kinasa A POMC Nroopiomelanocortina PP Nolipéptido pancréatico PPAR-γ Peroxisoma proliferador-activado por receptor-γ PVH Núcleo paraventricular PYY Péptido YY r.c.f. Relative centrifugal force rCB1 Receptor endocanabinoide tipo 1 rCB2 Receptor endocanabinoide tipo 2 RhoA Ros homolog genefamily member A RIO Ensayo clínico Rimonabant en obesidad RQ Cociente respiratorio RSTN Resistina SCD-1 Stearoyl-Coenzyme A desaturase 1 SD Estándar diet – dieta estándar SEC Sistema endocannabinoide SHAM Grupo control que no es sometido a una adrenalectomía SNC Sistema Nervioso Central SR141716A Antagonista específico de CB2 SREBP1 Factor de transcripción lipogénico TGs Triglicéridos THC Δ9Tetrahidrocannabinol TNFα Factor de necrosis tumoral alfa TRAAK Potassium channel subfamily K member 4 (KCNK4) TREK-1 Potassium channel subfamily K member 2 (KCNK2) ABREVIATURAS 17 TRH Hormona liberadora de tirotropina TRPV1 Receptor vanilloide tipo 1 TSH Hormona estimulante de la glándula tiroides VMH Núcleo ventromedial VTA Area tegmental ventral WAT Tejido Adiposo Blanco WATg Tejido Adiposo Blanco gonadal WB Western Blot INTRODUCCIÓN 19 INTRODUCCIÓN 1. HOMEOSTASIS ENERGETICA Y OBESIDAD 1.1. Homeostasis energética La capacidad de ajustar los alimentos ingeridos en respuesta a las cambiantes necesidades de energía, es esencial para la supervivencia. Los avances recientes han proporcionado una visión de los mecanismos, moleculares, celulares y comportamentales vinculados a los cambios de almacenamiento de grasa en el cuerpo y a su adaptación al comportamiento alimenticio. La importancia fisiológica de este sistema de control homeostático radica en que la obesidad puede ser el resultado de una disfunción severa en cualquiera de estos mecanismos (Morton et al., 2006) Parece fácil elegir qué alimentos son más apetitosos y cuáles no, pero la manera cómo el sistema nervioso central procesa esta información es compleja, dado que además del sustrato genético, señales cognitivas, visuales y olfativas también están implicadas. (Morton et al., 2006). Figura 1. Modelo para la regulación de retroalimentación negativa de la ingesta de alimentos en respuesta a cambios en el contenido de grasa corporal (Morton et al., 2006). REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 20 Los cambios en la energía requerida son otro factor que influye en el consumo de alimentos. Este proceso conocido con el nombre de homeóstasis energética tiene la finalidad de regular la ingesta en un tiempo determinado para controlar el combustible corporal almacenado en forma de grasa (Morton et al., 2006). A través de la corriente sanguínea y de señales neuronales aferentes, la información del estado nutricional y de la reserva de energía se comunica al cerebro y ésta es integrada con las señales cognitivas, visuales, olfativas y de gusto, las cuales suceden de manera inconsciente antes de que se lleve a cabo el acto de comer (Morton et al., 2006). Por tanto, en la regulación del peso corporal parecen importantes dos acciones, por un lado, la motivación para elegir el alimento y por otra parte la percepción de saciedad. Adicionalmente, la transformación de alguna de las moléculas involucradas en este proceso, podría causar obesidad tanto en modelos animales como humanos (Morton et al., 2006). Se ha dado un rápido progreso hacia la comprensión de los procesos cerebrales y a su relación con las propiedades psicológicas y sensoriales de los alimentos, y cómo las señales de saciedad regulan el apetito durante y después de comer (Rolls E.T., 2006). Si bien existen mecanismos cerebrales que controlan el apetito, un gran número de factores sensoriales y medioambientales contribuyen a sobre estimular el sistema sensorial, dando lugar a importantes señales de recompensa que pueden ser fácilmente controladas por las señales de saciedad (Rolls E.T., 2006). Se están llevando a cabo avances científicos en neurociencia y psicología para identificar y comprender algunos de los muchos factores que regulan la ingesta de alimentos, el gasto de energía y la obesidad. Es crucial desarrollar esta comprensión, ya que este conocimiento supondrá un gran potencial en la prevención y tratamiento de la obesidad. Por esta razón, es necesario conocer cómo interactúan los diferentes factores y cómo los seres humanos pueden ser ayudados a controlar su peso corporal utilizando INTRODUCCIÓN 21 las combinaciones más eficaces, así como quizás, tener en cuenta otros factores aún desconocidos (Rolls E.T., 2006). 1.2. Obesidad La obesidad, por definición, resulta de un almacenamiento de calorías que excede los requerimientos de energía del organismo. Aunque factores medioambientales y de estilo de vida contribuyen a la patogénesis de la obesidad, existe una importante adaptación homeostática en el proceso de pérdida de peso inducida por restricción calórica voluntaria, tanto en individuos delgados como en obesos (Morton et al., 2006). Por tanto, ciertos mecanismos biológicos, parecen proteger a individuos con peso corporal normal, frente un aumento (inducido por sobre alimentación) o pérdida de peso (Morton et al., 2006). En consecuencia, la interacción entre factores genéticos, factores medioambientales que promueven la obesidad y el sistema de control homeostático, contribuyen al desarrollo de diferentes tipos de obesidad, y por ende, a aumentar la pandemia global de obesidad (Morton et al., 2006). En este sentido, la obesidad se ha convertido en la enfermedad del siglo XXI y está afectando a más de un billón de personas en todo el mundo. En un futuro se duplicará o se triplicará el número de personas con sobrepeso (Malecka-Tendera E & Mazur A., 2006). Desafortunadamente, el crecimiento de este problema está afectando a niños y datos de la International Obesity Task Force, indican que 22 millones de niños menores de 5 años son obesos o tienen sobrepeso (Malecka-Tendera E, Mazur A., 2006). El sobrepeso y la obesidad infantil están asociados con varias consecuencias adversas y además conllevan un mayor riesgo de padecer obesidad en la edad adulta y en consecuencia, la obesidad en adultos aumenta la morbilidad (Malecka-Tendera E, Mazur A., 2006). REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 22 Desde 2008, aproximadamente 1.500 millones de individuos en todo el mundo se consideran ahora preobesos, incluidos 500 millones que se consideran obesos (Finucane MM. et al., 2011). Investigaciones llevadas a cabo por el Grupo de Colaboración Repercusión Global de los Factores de Riesgos Metabólicos de las Enfermedades Crónicas, dirigido por Majid Ezzati (Imperial College London, UK), informan que el IMC normalizado para la edad se incrementó en casi 0,4 kg/m2 por decenio en los hombres y en 0,5 kg/m2 en las mujeres (Danaei G. et al., 2011). Anand & Yusuf señalan que es decisivo comprender las modificaciones en la obesidad y en factores de riesgo cardiovascular como la presión arterial y el colesterol total, de esta manera podrían aclararse conceptos útiles que podrían ayudar a mitigar los efectos adversos de la epidemia de obesidad. Estos autores consideran que la forma más eficaz de reducir la morbilidad global de las enfermedades cardiovasculares sigue siendo el control de los factores de riesgo al nivel de la población (Anand & Yusuf, 2011). 2. REGULACIÓN DE LA INGESTA Figura 2. Control del sistema nervioso central y periférico en el balance de la homeóstasis energética (Woods SC. et al., 2008) INTRODUCCIÓN 23 2.1. Señales periféricas 2.1.1. Hormonas del tejido adiposo Durante un tiempo, el tejido adiposo fue considerado un reservorio, donde se acumulaba la energía en forma de grasa. Sin embargo, con el descubrimiento de la leptina en 1994 (Zhang et al., 1994), se estableció con certeza que el tejido adiposo era un órgano endocrino caracterizado por sintetizar y secretar muchos péptidos denominados adipoquinas que pueden actuar a nivel local (autocrina/paracrina) o sistémico (endocrina), así como expresar numerosos receptores que le permiten recibir señales procedentes de otros órganos entre ellos el sistema nervioso central (SNC). La capacidad de recibir información desde distintos órganos y poder responder a ella mediante la liberación de adipoquinas, hace que el tejido adiposo además de ser uno de los mayores tejidos del cuerpo, se considere un elemento clave en funciones biológicas tan importantes como la regulación del metabolismo y del balance energético (Welsch, 2009) y de funciones neuroendocrinas e inmunológicas (Kershaw EE & Flier JS, 2004). Adicionalmente, el tejido adiposo está constituido principalmente por células adiposas o adipocitos que además de almacenar los lípidos, también pueden sinterizarlos a partir de los hidratos de carbono. Existen dos tipos fundamentales de adipocitos que van a dar origen a dos clases de tejido adiposo; el tejido adiposo pardo (BAT) y el tejido adiposo blanco (WAT). Entre las hormonas secretadas por el WAT se encuentran: Leptina Entre las hormonas adipocitarias, la que más ha cambiado el concepto del WAT como un tejido inerte es la leptina (López M. et al., 2007; Zhang et al., 1994). La leptina se expresa principalmente en adipocitos (Zhang et al., 1994) y a niveles REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 24 inferiores en el tracto gastrointestinal (Bado et al., 1998) y la placenta (Señarís et al., 1997; Masuzaki et al., 1997) entre otros tejidos. Los niveles circulantes de leptina están estrechamente correlacionados con la masa de tejido adiposo (Maffei et al., 1995; López M. et al., 2007) y la restricción alimenticia reduce los niveles circulantes de leptina (Frederich et al.1995; Maffei et al. 1995), la cual puede ser revertida mediante realimentación. La administración central y periférica de leptina reduce la hiperfagia (Ahima et al., 1996; López M. et al., 2007), inducida por el ayuno y la administración periférica crónica reduce la ingesta dando como resultado una disminución de la masa grasa y del peso corporal (Halaas et al., 1995; López M. et al., 2007). La carencia absoluta de leptina en los ratones ob/ob, trae grandes consecuencias sobre la homeostasis del peso corporal, causando hiperfagia y obesidad, así como también desregulación neuroendocrina e inmune, la cual es revertida por la administración de leptina (Campfield et al., 1995; Halaas et al., 1995; Pelleymounter et al., 1995; López M. et al., 2007). Al igual que en roedores, en humanos la deficiencia de leptina causa obesidad mórbida e hipogonadismo, lo cual puede ser mejorado con leptina recombinante (Farooqi & O´Rahilly, 1999). Adiponectina Es una proteína de 244 aminoácidos secretada por el tejido adiposo principalmente y en menor medida por otros tejidos entre los que se encuentran la placenta y los cardiomiocitos (Hu et al., 1996; Berg et al., 2002; Tsao et al., 2002; López M. et al., 2007). Es importante en la homeostasis energética (López M. et al., 2007), ya que los niveles plasmáticos de adiponectina guardan una correlación inversa con la adiposidad en varias especies, incluidos los humanos (Hu et al., 1996; Arita et al., 1999; Hotta et al., 2001; López M. et al., 2007). La adiponectina se une y activa dos receptores de membrana, adipoR1 y adipoR2 (Yamauchi et al. 2003; López M. et al., 2007). AdipoR1 se expresa altamente en el músculo esquelético; tiene gran afinidad por el dominio globular de la INTRODUCCIÓN 25 adiponectina y baja afinidad por el ligando de duración completa. AdipoR2 es altamente expresado en hígado y se une preferencialmente a la longitud total del ligando. Se han detectado receptores para adiponectina en diversos órganos entre ellos, el hipotálamo (Qi et al. 2004) y la placenta (Caminos et al. 2005), tracto gastrointestinal y tejido adiposo (Gonzalez et al. 2010). En roedores, los niveles de adiponectina se incrementan después de la restricción de alimentos y con la administración periférica de esta hormona se observa una atenuación en la ganancia del peso corporal debida a un incremento en el consumo de O2, sin afectar la ingesta (Berg et al., 2001; Fruebis et al., 2001; Yamauchi et al., 2003). Este efecto sobre el gasto energético parece estar mediado por el sistema de melanocortinas en el hipotálamo, sin afectar a otros neuropéptidos regulados por la leptina (Qi et al., 2004; López M. et al., 2007). Los niveles circulantes de adiponectina se correlacionan negativamente con la resistencia a la insulina (Hotta et al., 2001) y el tratamiento con adiponectina puede reducir la ganancia de peso corporal, incrementar la sensibilidad a la insulina y disminuir los niveles lipídicos en roedores (Berg et al., 2001; Yamauchi et al., 2001; Qi et al., 2004; Winzell et al., 2004). De acuerdo con estas evidencias, los ratones carentes de adiponectina desarrollan una importante resistencia a la insulina inducida por dieta (Liu et al., 2007) Resistina (RSTN) Esta hormona es producida por el tejido adiposo y en roedores parece estar involucrada en la modulación de la sensibilidad a la insulina y en la diferenciación de adipocitos (Steppan et al. 2001a, b; Vidal-Puig & O’Rahilly, 2001; Steppan & Lazar, 2002). Adicionalmente al tejido adiposo, la RSTN también se expresa en estómago, intestino, glándula adrenal, testículo y músculo esquelético (Nogueiras et al. 2003a, b, 2004a). La restricción de alimentos produce una disminución en los niveles de expresión de mRNA de RSTN solamente en tejido adiposo (Nogueiras et al. 2003a, b). Los niveles circulantes de RSTN se incrementan con la obesidad tanto en roedores REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 32 2.1.3. Hormonas pancreáticas Insulina La insulina es también una señal de adiposidad. Las concentraciones de insulina plasmáticas pueden modificar tanto los depósitos de grasa corporal total, como su distribución, siendo el tejido visceral el que mayor relevancia tiene en este sentido. La secreción de insulina se incrementa rápidamente en el páncreas después de comer, ejerciendo un efecto anoréxico a través del SNC (Schwartz et al. 1992a, 2000; López et al., 2007). La insulina atraviesa la barrera hematoencefálica entrando así en el SNC y fue la primera hormona propuesta como factor circulante implicado en la regulación del peso corporal a través de distintos neuropéptidos del cerebro (Baskin et al., 1999). La administración central de insulina reducen la ingesta y el peso corporal en roedores y primates y la administración de un antagonista para el receptor de insulina induce hiperfagia y aumento de masa grasa (Woods et al., 1979; López et al., 2007); en este mismo sentido, la supresión de la expresión del receptor de insulina en el SNC, produce obesidad, hiperinsulinemia y dislipidemia en ratones (Bruning et al. 2000). Los receptores de insulina están muy extendidos en el cerebro, especialmente en los núcleos hipotalámicos implicados en la ingesta de alimentos; tales como el ARC, el núcleo dorsomedial (DMH) y el núcleo paraventricular (PVH) (Corp et al. 1986; Marks et al., 1990). Las acciones de la insulina en el hipotálamo están mediadas por NPY y por el sistema melanocortinas (Hagan MM. et al., 1999). Polipétido pancrético (PP) El PP pertenece a la familia de péptidos, tales como PYY y NPY (Conlon, 2002). El PP se produce mayoritariamente en células de los islotes de Langerhans, el páncreas exocrino y el área distal del tracto gastrointestinal (Small & Bloom, 2004; Stanley et al., 2005). INTRODUCCIÓN 33 Las concentraciones de PP en plasma se incrementan proporcionalmente a la energía consumida (Small & Bloom, 2004; Stanley et al., 2005), lo cual parece ser inversamente proporcional a la adiposidad, por ello se ha encontrado que los niveles de PP son mayores en sujetos anoréxicos y se reducen en sujetos obesos (Lassmann et al., 1980; Fujimoto et al., 1997). La administración periférica de PP reduce la ingesta y el peso corporal en roedores obesos (Malaisse-Lagae et al. 1977). Su efecto anoréxico está mediado por el receptor Y5 y sus acciones se ejercen vía tallo cerebral (área postrema), regulación de los neuropéptidos hipotalámicos (NPY y OX) y la modulación de la expresión de ghrelin (Asakawa et al. 2003). De manera contraria a los efectos periféricos, la administración central de PP incrementa la ingesta (Clark et al., 1984); por tanto, los receptores que median su acción y los mecanismos involucrados no están claros. 2.2. Señales del Sistema Nervioso Central El SNC es de suma importancia dentro de la regulación de la ingesta, ya que la información procedente de la periferia, es recibida, analizada y procesada en el cerebro (Gao & Horvath, 2008). Otras investigaciones corroboraron esta idea y demostraron que, mediante experimentos de lesiones en diferentes zonas del SNC, el hipotálamo desempeñaba una función fundamental en la regulación de la ingesta. En estos estudios se observó que la destrucción de diferentes núcleos hipotalámicos como el hipotálamo ventromedial (VMH) , el DMH y el PVH, llevaba asociada la aparición de hiperfagia y obesidad, o en zonas como el hipotálamo lateral (LHA), en donde se pudo observar la aparición de hipofagia tras su lesión (Anand & Brobeck, 1951). Los experimentos de estimulación eléctrica han confirmado los datos obtenidos de lesiones cerebrales; sugiriendo la existencia de dos centros reguladores de la ingesta: un centro de hambre ubicado en el LHA, y un centro de saciedad situado en el VMH (Khisi & Elmquist., 2005). REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 34 Además del hipotálamo también existen otras zonas del SNC implicada en la regulación de la homeostasis energética. Por ejemplo, en el tronco cerebral, el núcleo del tracto solitario (NTS) y el área premotora (AP) integran la información sensorial y hormonal procedente del tracto gastrointestinal y del hígado (vía nervio vago y aferencias del ganglio cervical superior), así como la información sobre el sabor, procedente de la cavidad bucal (vía nervios craneales), el olor y la apariencia (Schwartz et al., 2000). 2.2.1. Núcleos hipotalámicos y señales de adiposidad Núcleo arcuato Dentro de los núcleos hipotalámicos más importantes, el ARC, tiene un papel crucial en la regulación de la ingesta debido a su posición en hipotálamo, en donde la barrera hematoencefálica está modificada lo que permite el paso de factores y proteínas circulantes (Broadwell & Brightman, 1976). En este núcleo se identifican dos grupos de neuronas que están próximos y se interconectan para recibir señales del estado nutricional, NPY/AgRP y POMC/CART. Estas neuronas secretan neuropéptidos orexigénicos y anorexigénicos respectivamente y constituyen el primer orden de neuronas implicadas en la regulación de la ingesta (Cone et al., 2001). Estas poblaciones neuronales reciben y regulan las acciones de gran cantidad de hormonas provenientes de la periferia. NPY y AgRP son inhibidos por la leptina, la insulina y el PPY3-36, y por otra parte son estimulados por ghrelin. En consecuencia la pérdida de peso es activada gracias a la combinación de este proceso de inhibición y estimulación (Morton et al., 2006). La POMC, es un polipéptido precursor del cual se derivan melanocortinas tales como la α-MSH. En los axones terminales, la α-MSH se une y activa a las neuronas de los receptores de melanocortinas, disminuyendo así la ingesta y favoreciendo la pérdida de peso. Las neuronas de POMC son estimuladas por la leptina e inhibidas por INTRODUCCIÓN 35 ghrelin. En respuesta a la pérdida de peso, la activación de NPY/AgRP está acoplada a la inhibición de POMC, una combinación que favorece la recuperación de la pérdida de peso y refleja la integración de diversos procesos humorales y neuronales (Morton et al., 2006). La ausencia de leptina en modelos animales obesos (Lepob/Lepob), reduce la expresión de POMC en el ARC, mientras que se incrementan los niveles de NPY y AgRP (Morton et al., 2006). Similarmente, la ausencia de la α-MSH en ratones knockout de POMC causa hiperfagia y obesidad. El bloqueo de la señalización neuronal de melanocortinas reduce la respuesta a la administración central de leptina (Morton et al., 2006). Las neuronas del ARC están reguladas además de por las señales humorales, por sinapsis excitatorias e inhibitorias, y el balance de este proceso está afectado por el estado nutricional. Específicamente, el ayuno disminuye la excitación mientras se intensifican los contactos sinápticos inhibitorios en las neuronas de POMC, lo contrario se aplica para NPY/AgRP (Morton et al., 2006). Núcleo ventromedial El VMH ha sido denominado “centro de saciedad” al comprobarse que lesiones bilaterales causaban hiperfagia y obesidad. Al igual que con el ARC, se ha demostrado que el VMH del hipotálamo es esencial para la regulación de la ingesta y del balance energético (Morton et al., 2006). El VMH puede aumentar directamente la actividad de las neuronas POMC mediante microcircuitos, estimulando su actividad excepto en estado de ayuno en el que disminuye. Además de proyectar al ARC, también lo hace hacia otros núcleos hipotalámicos y al tronco cerebral (Irani et al., 2008). La administración de NPY en el VMH aumenta la ingesta, mientras que el ayuno está asociado con unos niveles elevados de NPY en esta región. Por otro lado la respuesta electrofisiológica de las neuronas en el VMH a α-MSH está disminuida en animales en ayuno y/o tratados con AgRP (Irani et al., 2008). REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 36 Este núcleo ha adquirido gran importancia recientemente al haberse demostrado que el efecto orexigénico está mediado por la activación de AMPK y metabolismo lipídico (López M. et al., 2008). Además se ha visto que los efectos de otras señales como hormonas tiroideas (Varela L. et al., 2012) y la nicotina (Martínez de Morentin PB. et al., 2012) se ejercen a este nivel regulando el gasto energético. A este respecto, se ha visto que estados de hipotiroidismo, el cual se caracteriza por un mayor gasto energético y una marcada hiperfagia y las alteraciones en la termogénesis relacionada con este estado, están asociados con la desregulación del eje hipotalámico AMPK y el metabolismo de los ácidos grasos (Varela L. et al., 2012). Por otra parte, se ha encontrado que la pérdida de peso inducida por la nicotina está asociada con la inactivación de AMPK en el hipotálamo. De manera contraria, la abstinencia de la nicotina o la activación genética de AMPK en el VMH del hipotálamo revierte el balance energético negativo inducido por la nicotina (Martínez de Morentin PB. et al., 2012). Hipotálamo lateral El LHA, forma parte del segundo orden de integración de señales implicadas en la regulación energética, especialmente del ARC. En él se sintetizan dos tipos de péptidos orexigénicos: hipocretinas (orexinas) y hormona concentradora de melanina (MCH). Estas neuronas están inervadas por axones de neuronas POMC y NPY, sugiriendo que su función en la estimulación de la ingesta, podría estar mediada por el sistema de melanocortinas del ARC (Gao & Horvath, 2008). Es considerado el “centro del hambre”, ya que animales con lesiones provocadas en esta área desarrollaron un fenotipo hipofágico y delgado. Las neuronas del LHA se caracterizan por emitir proyecciones a un amplio número de zonas del SNC (córtex, tálamo o sistema límbico) participando en numerosas funciones tales como aprendizaje, memoria, emoción, y respuestas INTRODUCCIÓN 37 motoras en función del estado energético ya que están reguladas por numerosas hormonas, entre ellas, ghrelin y leptina (Peyron et al., 1998; Broberger et al., 1998). El LHA puede ser también un lugar de acción para el sistema endocanabinoide (SEC) ya que las neuronas orexigénicas de esta zona (orexina y MCH) expresan el receptor endocanabinoide CB1 (rCB1) (Bellocchio et al., 2008). Núcleo paraventricular El PVN está situado en la parte anterior del hipotálamo, próximo a la parte superior del tercer ventrículo (3V) y se ha descrito que su destrucción implica la aparición de hiperfagia. Al igual que el VMH, es un núcleo que integra señales (tales como NPY, AgRP o POMC) procedentes del ARC y de otras regiones del SNC. Además es un núcleo muy sensible a la administración de péptidos implicados en la ingesta, como CCK, NPY, ghrelin o leptina (Neary et al., 2004). Su principal característica es que es el núcleo productor de hormona liberadora de corticotropina (CRH) y de hormona liberadora de tirotropina (TRH), ambos factores anorexigénicos (Fekete & Lechan, 2007). Núcleo dorsomedial El DMH está implicado en la regulación de una variedad de mecanismos reguladores que incluyen la modulación de la secreción de glucocorticoides, temperatura corporal, sueño y ritmos circadianos de la actividad locomotora (Gooley et al., 2006; Chou et al., 2003). Este núcleo recibe proyecciones de las neuronas del ARC y de otras zonas cerebrales implicadas en la regulación de la ingesta. Se ha visto que lesiones provocadas en este núcleo inducen hiperfagia, aunque los animales mantienen la misma composición corporal (Bellinger & Bernardis, 2002). REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 38 2.2.2. Señales de recompensa El concepto de que la percepción de recompensa está sujeta a la regulación homeostática, proviene de la evidencia de que la deprivación de alimentos aumenta de manera intensa el valor de la recompensa. El ayuno incrementa el valor del refuerzo estimulando el “centro de placer” en el cerebro y con la menor disponibilidad de alimentos parece ejercerse una estimulación global sobre la percepción de recompensa (Morton et al., 2006). Un mecanismo para explicar este efecto, supone que la leptina y la insulina inhiben los circuitos de recompensa en el cerebro y que al reducirse los niveles circulantes de estas hormonas, la restricción de energía incrementa la sensibilidad de los circuitos de recompensa. De acuerdo con esta hipótesis, la administración central de insulina o de leptina disminuye la preferencia por la sacarosa (medida de alimentorecompensa) y el ayuno incrementa las propiedades de recompensa de la estimulación eléctrica del centro de placer (sistema límbico cerebral), el cual está ubicado en el núcleo accumbes del hipotálamo (Morton et al., 2006; Kelley et al., 2005). De acuerdo con esta hipótesis, la insulina o la leptina administradas a nivel central disminuyen tanto la preferencia por la sacarosa y el efecto de ayuno para aumentar las propiedades de recompensa de la estimulación eléctrica del centro de del placer. A nivel celular, existe una mayor expresión en la recaptación de los transportadores de dopamina en las neuronas del área tegmental ventral (VTA), lo cual reduce los niveles sinápticos de dopamina en el núcleo arcuato (NAc) y esto, puede contribuir al efecto inhibidor de las hormonas de adiposidad relacionadas con los mecanismos de recompensa (Morton et al., 2006). Estas observaciones sugieren que al disminuir las señales de adiposidad, la restricción de energía aumenta las respuestas dirigidas a la búsqueda de estímulos de recompensa como un mecanismo de adaptación; es el caso de animales amenazados por falta de calorías, motivados a buscar y obtener alimentos más apetitosos (Morton et al., 2006). INTRODUCCIÓN 39 3. SISTEMA ENDOCANNABINOIDE 3.1. Uso terapéutico del cannabis El cannabis fue usado con fines medicinales en China 4.000 años a.C. Desde allí, la planta se extendió por India y el Sudeste Asiático, llegando a la civilización grecorromana. En la India, en el siglo XV a.C., se usaba el cáñamo por su efecto estimulante sobre el apetito (Grinspoon y Bakalar, 1993). Durante la Edad Media, los árabes (Al-Badri, 1251 d.C.) recomendaron el uso médico del cannabis por esa propiedad. En 1842, el empleo del cannabis como remedio medicinal fue introducido en Gran Bretaña con el regreso de un cirujano irlandés que había estado en la India, O´Shaughnessy. Este médico hizo popular la utilización de la denominada tintura de cannabis para distintos estados patológicos, describiendo su efecto sobre el apetito (Ramos & Fernández, 2000). En una publicación en la revista Lancet en 1889, Birch refirió el empleo del cannabis para la dependencia de opiáceos, observando dicho incremento sobre el apetito. En 1942, la revista JAMA en una editorial, reconoce el uso del cannabis como un potencial terapéutico para la pérdida de apetito. De forma interesante, los consumidores de cannabis describían un incremento pertinaz del apetito, incluso estando saciados previamente y con frecuencia se hacía referencia a una mayor apetencia por los dulces (Hollister, 2001). 3.2. Orígenes del Sistema Endocannabionide El SEC fue identificado a principios de 1990 durante investigaciones del mecanismo de acción del mayor compuesto psicotrópico derivado del cannabis, Δ9tetrahydrocannabinol (THC) (Di Marzo, 2008; Mechoulam, 1999; Pertwee, 2005). La clonación de los receptores cannabionoides condujo a la identificación de moléculas endógenas capaces de unirse y activarse a sus propios receptores, tomando REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 40 de allí el nombre de “endocannabinoides” (EC), pues pese a ser diferentes del THC, son capaces de reconocer sus sitios de unión específicos (Di Marzo, 2008). El interés del tema ha resurgido a raíz de la descripción del SEC y la síntesis de agonistas y antagonistas de éste, produciéndose una gran proliferación de trabajos en experimentación animal que va constatando la relevancia del SEC en la regulación del apetito. Adicionalmente a su implicación con la obesidad, el SEC está involucrado en la patofisiología de la osteoporosis, la adicción a la nicotina y la adicción a las drogas (Rodriguez de Fonseca F. et al., 2005) en enfermedades mentales, dolor inflamatorio y neuropático, enfermedades neurológicas como la esclerosis múltiple (Rodriguez de Fonseca F. et al., 2005), desorden cardiovascular, enfermedades del hígado, entre otros (Di Marzo, 2006; Fowler et al., 2005; Ross, 2009). Los principales cannabinoides son Δ9 –tetrahidrocannabinol (Δ9-THC o THC), Δ8 - tetrahidrocannabinol (Δ8– THC), cannabidiol (CBD) y cannabinol (CBN) (Turner et al., 1980). El Δ9-THC es el cannabinoide con mayor potencia psicoactiva. Presenta propiedades hidrofóbicas por lo que es muy soluble en lípidos. Esto hace que su distribución en el organismo y su eliminación presenten diferencias con lo descrito para otras drogas de abuso. Dada la elevada liposolubilidad tanto del Δ9-THC como de otros cannabinoides naturales, durante mucho tiempo se pensó que estos compuestos ejercían sus efectos mediante interacciones inespecíficas con lípidos de membrana. Sin embargo, estudios detallados de relación estructura-actividad sugirieron mecanismos mediados por el receptor como los responsables de los efectos ejercidos por los cannabinoides. En un inicio se clonaron dos receptores para cannabinoides: el receptor CB1 (Matsuda et al., 1990), densamente expresado en el sistema nervioso central, y el receptor CB2 (Munro et al., 1993), localizado fundamentalmente a nivel del sistema inmune. La identificación, caracterización farmacológica y localización de receptores específicos de membrana que mediaban los efectos centrales y periféricos de los INTRODUCCIÓN 41 cannabinoides llevó a los investigadores a emprender la búsqueda de ligandos endógenos que activaran estos receptores. De esta manera, a partir de un extracto lipídico obtenido de cerebro de cerdo se aisló la anandamida (AEA) (Devane et al., 1992), el primer EC conocido que resultó ser una amida de un ácido graso poliinsaturado, concretamente del ácido araquidónico. Posteriormente, a partir de intestino de perro y cerebro de rata se aisló otro ligando endógeno, el 2-araquidonil glicerol (Mechoulam et al., 1995). Todas estas observaciones han proporcionado una clara evidencia acerca de la existencia de un sistema cannabinoide endógeno. Además de los receptores CB1 y CB2, acoplados a proteínas G (GPCRs) y caracterizados por la presencia de siete dominios transmembrana; se reconoce también el receptor vanilloide tipo 1 (TRPV1), canal iónico (Brown, 2007). CB1 y CB2 son también receptores de lípidos y reconocen análogos de la aciletanolamida, tipificada por la anandamida (araquidonoiletanolamida, AEA), y 2arachidonoilglicerol (2-AG). TRPV1 es activado por varios lípidos incluyendo aciletanolamidas tales como AEA (Brown, 2007). Figura 3. Principales receptores y vías de señalización del sistema endocannabinoide. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 48 Todos los tipos celulares mencionados intervienen en los procesos inflamatorios, por lo que se considera que los rCB2 pueden desempeñar importantes funciones en esos fenómenos. Su presencia en esas células podría explicar buena parte de los efectos moduladores que ejercen los cannabinoides naturales y sintéticos sobre la respuesta inmune (Kaminski, 1998). 3.6. Agonistas Los agonistas cannabinoides producen incremento del apetito y del peso corporal en experimentación animal. Por lo cual, una serie de investigaciones se han centrado en el estudio del papel del SEC en la regulación del apetito, el peso y el balance energético en animales. Se han usado modelos de animales deprivados de alimentos desde 1 hora hasta 24 horas, posteriormente pre-saciados antes de la administración de la sustancia experimental o no pre-saciados (modelo de animales hiperfágicos en este último caso), y podían estar deprivados de agua o no simultáneamente. Otros autores han empleado modelos de animales con libre acceso a comida, con dietas ricas en hidratos de carbono, ricas en grasas o dietas estándar. Por otro lado, son interesantes los datos aportados por los modelos animales de obesidad, ya sean inducidos por dieta (DIO) o manipulados genéticamente (modelos de ratones ob/ob o db/db, ya sean con déficit del gen de la leptina o déficit del receptor de ésta, respectivamente, modelo de ratas obesas Zucker, etc). Por último, son muy útiles los modelos de animales knockout para el rCB1. Los experimentos más recientes confirman el efecto orexígeno de los agonistas incluso en animales saciados y dicho efecto está mediado por los rCB1. Los agonistas cannabinoides más usados son el Δ9-THC y un agonista endógeno como la AEA que aumentan la ingesta en distintos procedimientos experimentales (Berry & Mechoulam 2002). Otros agonistas como el 2-AG producen un efecto similar (Kirkham et al., 2002). Así mismo, se ha descrito que el Δ8-THC, con menos efectos INTRODUCCIÓN 49 psicoactivos que el Δ9-THC, podría tener un efecto orexigénico más potente (Avraham et al., 2004). El efecto orexigénico se observa con la administración de agonistas en centros cerebrales relacionados con la regulación de la ingesta, como el VMH (Jamshidi & Taylor, 2001); NAc (Kirkham et al. 2002) o en el cuarto ventrículo por la proximidad del núcleo parabraquial (Miller, Murray, Freeman y Edwards, 2004). 3.7. Antagonistas El desarrollo de antagonistas específicos para los receptores cannabinoides ha sido también de vital importancia para la investigación en este campo. Compuestos que bloquean al rCB1 han generado un gran interés como supresores del apetito. Figura 5. Efectos metabólicos del bloqueo del receptor cannabinoide CB1. Dentro de este grupo de compuestos destacan el SR141716A (Rimonabant) (Rinaldi-Carmona et al., 1994), compuesto que exhibe una marcada selectividad por los rCB1 frente a los rCB2, y frente a otros tipos de receptores para neurotransmisores, es capaz de prevenir y/o revertir las acciones de los agonistas cannabinoides que actúan a REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 50 través del rCB1 tanto in vitro, como in vivo (Pertwee, 1997); y por otra parte se halla el SR144528 (Rinaldi-Carmona et al., 1998), antagonista específico de rCB2. A partir de la estructura del SR141716A se han desarrollado moléculas como el AM-251 y el AM-281, que también antagonizan de forma selectiva efectos cannabimiméticos derivados de la activación de rCB1. El SR141716A (N-(Piperidin-1-yl)-5-(4-chlorophenyl)-1-(2,4-dichlorophenyl)-4methyl-1H-Pyrazole-3-Carboxamide) mostró tener eficiencia anorexigénica en un buen número de estudios a corto plazo (agudos) en ratas, ratones y monos (Hildebrant et al., 2003). Estos estudios investigaron la actividad anorexigénica a corto plazo después de una sola dosis del compuesto. Estudios realizados en ratas y ratones han demostrado que la eficacia a largo plazo del SR141716A es transitoriamente anorexigénica pero con el tiempo se produce una reducción sostenida del peso corporal en comparación con el grupo control que es independiente de la ingesta (Hildebrant et al., 2003). Se ha encontrado que la administración de Rimonabant a dosis de 1-10 mg/kg en experimentos durante 14 a 35 días, disminuye la ingesta en animales con acceso ilimitado a la comida (Colombo et al., 1998; Simiand et al., 1998) y en animales deprivados de alimentos (Gómez et al., 2002). La pérdida de peso oscila alrededor del 20% del peso basal (Pagotto y Pasquali, 2006). En humanos, la administración del fármaco (Rimonabant) se ha asociado con la reducción de peso (aunque se observó una recuperación del peso después de la interrupción del tratamiento), el aumento en el colesterol HDL, una disminución de las concentraciones de triglicéridos, reducción de los niveles de glucosa e insulina en plasma, disminución de los niveles de leptina en plasma y aumento de los niveles de adiponectina plasmáticos (Bermudez-Silva FJ et al., 2010). Adicionalmente al Rimonabant, otros antagonistas/agonistas inversos del rCB1, como el taranabant (M (CP-945598, SLV-319) están en fase de estudio (Bermudez-Silva FJ et al., 2010). Sin embargo, el mecanismo por el cual el SR141716A reduce la ingesta no es suficientemente conocido y es posible que la reducción de peso pueda ser INTRODUCCIÓN 51 consecuencia de acciones provocadas por diferentes mecanismos homeostáticos y hedónicos (Hodge et al., 2008). Algunos autores han puesto de manifiesto que el SR141716A revierte los efectos de la AEA con menos potencia que los de otros agonistas cannabinoides en determinados sistemas in vitro, y también se ha sugerido que este antagonista cannabinoide no es capaz de bloquear algunos efectos farmacológicos de la AEA en ensayos in vivo, a concentraciones que revierten totalmente las acciones de otros agonistas (Smart et al., 2000). En los sistemas in vivo, esta discrepancia se ha atribuido a la capacidad de la AEA para activar receptores vanilloides, además de receptores cannabinoides (Di Marzo et al., 1998) Por otra parte, los resultados obtenidos en estudios de modelos animales con obesidad inducida por dieta, donde se han bloqueado a nivel periférico los rCB1, utilizando el LH-21 como antagonista neutral de la acción periférica de estos receptores, el cual tiene poca penetración en el cerebro, han mostrado ser un tratamiento seguro y eficaz contra la obesidad, aparentemente carece de los efectos adversos secundarios a nivel psiquiátrico producidos por los antagonistas de acción central de los rCB1 (Alonso M. et al., 2012). REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 52 3.8. SEC: adipogénesis y lipogénesis Figura 6. Rol del sistema endocannabinoide en la regulación de la adipogénesis y la lipogénesis (Di Marzo, 2008). Existe evidencia de que el SEC juega un papel importante en la adipogénesis. Los niveles de CB1 se incrementan durante la diferenciación de pre-adipocitos de células 3T3-F442A, en ratones (Bensaid et al., 2003; Pagano et al., 2007). La estimulación de CB1 en pre-adipocitos 3T3F442A de ratones y adipocitos humanos se acompaña de un incremento en la expresión de los niveles de mRNA de PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ) y por un incremento en el tamaño de los adipocitos y un mayor contenido de triacilglicerol (Matias et al., 2006). El bloqueo del rCB1 inhibe la proliferación de adipocitos 3T3-F442A (Gary-Bobo et al., 2006). 3.9. SEC: Obesidad, hiperglicemia y diabetes en animales y humanos Además de otras implicaciones del SEC en procesos fisiológicos y terapéuticos, éste participa también en el control del metabolismo de lípidos y la glucosa (Di marzo, 2008). INTRODUCCIÓN 53 Cuando existe un desequilibrio en el consumo de energía, el SEC también sufre alteraciones en algunos órganos que participan en la homeóstasis energética, en particular, en el tejido adiposo intra-abdominal. Esta desregulación podría contribuir a una acumulación excesiva de grasa visceral y a una reducción en la liberación de adiponectina en este tejido, trayendo consigo, la aparición de varios factores de riesgo cardiometabólico asociados con la obesidad y la diabetes tipo 2 (DT2) (Di marzo, 2008). Este fenómeno podría ser la base de los mecanismos de acción de los agonistas y antagonistas inversos de CB1 desarrollados recientemente por varias empresas farmacéuticas como coadyuvantes a la modificación en el estilo de vida para la reducción de peso, el control glucémico y la dislipidemia, presentes en personas obesas y en pacientes con DT2. Sin embargo, aunque su eficacia clínica ha sido demostrada en humanos, el hecho de que produjese algunos efectos secundarios indeseables hizo que se retirara del mercado el Rimonabant y que otros en diferentes estadios de estudios en fase clínica se haya detenido su desarrollo. 3.9.1. Modelos animales En ratones obesos con un mal funcionamiento en el sistema de señalización de leptina, se observa permanentemente una elevación de los niveles de EC en tejido y mayores niveles de expresión de leptina en el hipotálamo, donde la leptina disminuye la biosíntesis de EC (Di Marzo et al., 2001). En los órganos periféricos, se ha confirmado que la insulina disminuye los niveles de EC o contribuye a la degradación de EC en animales delgados, como se observa en células de insulinoma de ratas, en adipocitos 3T3-L1 de ratón y en células de grasa subcutánea de humanos; por otra parte, la resistencia a la insulina puede dar origen a un aumento en los niveles de EC (Matias et al., 2006). El incremento en los niveles de 2AG y/o AEA precede al desarrollo de la obesidad, acompañada de hiperglicemia en el hígado (Osei-Hyiama et al., 2005), páncreas (Di Marzo et al., 2008), tejido adiposo marrón, músculo sóleo y corazón de ratones alimentados con HFD (Matias et al., 2008). REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 54 En el páncreas de ratones jóvenes de 3 a 8 semanas de edad alimentados con HFD, se observa un incremento en los niveles tanto de AEA como de 2AG, acompañado por la presencia de enzimas biosintéticas en células alfa y beta y la disminución de FAAH (Fatty acid amide hydrolase) en células alfa (Di Marzo et al., 2008). La disminución en los niveles de FAAH y el aumento en los niveles de CB1, se acompañó también de un incremento en los niveles de EC a nivel hepático en ratones alimentados durante 3 semanas con una dieta distinta a las dietas altas en grasa (Oshei-Hyiama et al., 2005). Ratones alimentados con HFD muestran una redistribución de los EC en varios depósitos grasos: disminución en los niveles de grasa subcutánea, sin cambios en la grasa mesentérica y un incremento en la grasa epididimal (Di Marzo et al., 2008; D`Eon et al., 2008). Por otra parte, experimentos in vivo realizados en ratas, han sugerido el rol del SEC en el control de la glicemia. La administración intraperitoneal aguda de agonistas de CB1 retrasa la salida de glucosa en plasma después de su administración oral. Los agonistas de CB2, por su parte, ejercen el efecto contrario (Bermúdez et al., 2007). Existe evidencia de que la administración del antagonista de CB1, AVE1625 causa glicogenolisis en hígado y un incremento inmediato en el consumo de energía, lo cual ha sido atribuido no solo a un incremento en la oxidación de grasa, sino también a un aumento transitorio en la oxidación de glucosa (Herling et al., 2007). Por otra parte, la disminución en la utilización de glucosa podría ser una ventaja para que los EC medien la captación de glucosa en los adipocitos para la biosíntesis de nuevo triacilglicerol. Estos efectos de los EC, podrían deberse a la reducción de la liberación de insulina en las células beta o a la inhibición de la sensibilidad a la insulina a nivel de tejidos no adiposos que utilizan glucosa, o a ambos (Di Marzo, 2008). Adicionalmente, el rol de los EC en el metabolismo de la glucosa hepática no es muy conocido, quizá debido a que la cantidad del receptor CB1 en hígado es baja INTRODUCCIÓN 55 (aunque en ratones con obesidad inducida por dieta puede observarse una mayor regulación de la producción de CB1 en hígado) (Di Marzo, 2008). Se ha encontrado que ratones expuestos a HFD desarrollan obesidad y esteatosis y son resistentes a la insulina y a la leptina así como cambios en los lípidos plasmáticos similares a los asociados con el síndrome metabólico (Poirier et al., 2005). Osei-Hyiaman et al., (Osei-Hyiaman et al., 2008) encontraron que la activación de los rCB1 en ratones wild type estimula la lipogénesis de novo en el hígado a través de la inducción del factor de transcripción lipogénico SREBP1c y su enzima diana acetilCoA carboxilasa-1 (ACC1) y el ácido graso sintasa (FAS) (OseiHyiaman et al., 2005). El grupo de Kunos G. (2008), probó la función de los rCB1 a nivel hepático, a través de la generación de un modelo de ratón con la supresión selectiva de CB1 en el hígado y compararon los efectos metabólicos de la HFD, así como también los efectos del tratamiento con el agonista y el antagonista de cannabinoides HU-210 y Rimonabant respectivamente, y se compararon con los ratones wild type y con ratones knockout para el rCB1 (OseiHyiaman et al., 2008). La resistencia de los ratones deficientes del rCB1 a la obesidad y a la esteatosis inducida por dieta a pesar de una ingesta calórica similar, indicó un aumento del gasto energético y la oxidación de la grasa (OseiHyiaman et al., 2008). En consecuencia, estos estudios indicaron que los EC actúan en los rCB1 hepáticos mediando la esteatosis inducida por la dieta a través del incremento de la lipogénesis de novo y la inhibición de la oxidación de ácidos grasos en el hígado (OseiHyiaman et al., 2008). En este mismo sentido, se ha demostrado que el tratamiento crónico con un antagonista del rCB1 reduce de manera importante la esteatosis en ratas genéticamente obesas (Gary-Bobo et al., 2007). A nivel de salud pública, la importancia de la esteatosis hepática mediada por los rCB1 ha sido ilustrada por hallazgos epidemiológicos donde el uso diario de la REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 56 marihuana, predispone a la esteatosis hepática en pacientes con hepatitis C (Hezode, C. et al., 2008). Adicionalmente, el alto consumo de marihuana también se ha relacionando con el aumento a nivel plasmático de la apolipoproteína C-III (Jayanthi, S., et al., 2008), un componente plasmático derivado del hígado, el cual se correlaciona con la dislipidemia y el riesgo cardiovascular en el síndrome metabólico (Ooi, E. et al., 2008). Estos hallazgos respaldan el potencial terapéutico del bloqueo del rCB1 en el tratamiento del hígado graso de diversas etiologías, las cuales son factores predisponentes tanto en la DT2 como en la cirrosis hepática (OseiHyiaman et al., 2008). 3.9.2. Estudios en humanos La primera evidencia del aumento de EC en humanos proviene de estudios en mujeres con sobrepeso/obesidad que tienen un importante desorden en la alimentación (Monteleone et al., 2005) y en mujeres postemopáusicas obesas (Engeli et al., 2005), en quienes se encuentran elevados los niveles de AEA en sangre o AEA y 2-AG respectivamente. Sin embargo, en un estudio posterior el incremento de los niveles de 2-AG en personas con sobrepeso/obesidad, solo fue observado en el tejido adiposo visceral, pero no en el tejido subcutáneo (Matias et al., 2006). La sobre expresión del sistema EC en los depósitos de grasa visceral y subcutánea se confirmó con estudios que mostraron una correlación positiva entre los niveles plasmáticos de 2-AG, no de AEA, y la cantidad de grasa intra-abdominal (medida a través de tomografía computarizada) (Blüher et al., 2006; Côte et al., 2007). En pacientes con DT2, no obesos (IMC ~30), controlada parcialmente la hiperglicemia, los niveles de AEA y 2-AG se encuentran elevados en comparación con los controles no diabéticos (Matias et al., 2006). INTRODUCCIÓN 57 La desregulación del sistema EC y los niveles de CB1 pueden afectar todas aquellas acciones biológicas que son ejercidas por el SEC en varios órganos. En el tejido adiposo, el desequilibrio de los EC en los depósitos grasos visceral y subcutáneo podría determinar una acumulación excesiva de grasa (Di Marzo et al., 2008). Teniendo en cuenta el rol desempeñado por la grasa intra-abdominal en la resistencia a la insulina y a la inflamación aterogénica, esto podría contribuir al desarrollo de la DT2 y la ateroesclerosis. La relación causa-efecto entre la sobre activación del SEC (particularmente en grasa intra-abdominal) y los factores de riesgo cardiometabólicos en humanos, se ha encontrado en la correlación entre los niveles plasmáticos de 2-AG y el incremento de triacilglicerol, de glucosa en ayunas y la disminución del la sensibilidad a la insulina y el HDL-colesterol en pacientes obesos (Blüer et al., 2006, Côte et al., 2007). Adicionalmente, entre los años 2001 y 2004 se llevó a cabo un ensayo clínico aleatorio en humanos donde participaron centros de Europa y Estados Unidos, denominado RIO-Europa (Rimonabant In Obesity) con el fin de evaluar la eficacia y seguridad del Rimonabant en la reducción del peso corporal y en la mejora de los factores de riesgo cardiovascular en pacientes con sobrepeso u obesidad (Van Gaal et al., 2005). En un estudio de 1507 pacientes con un IMC de 30 kg/m2 o más y sujetos con masa corporal superior a 27 kg/m2 con dislipidemia tratada o sin tratar, con hipertensión o las dos, fueron randomizados para recibir tratamiento doble ciego con placebo, 5 mg de Rimonabant, o 20 mg de Rimonabant una vez al día, además de una dieta hipocalórica (600 kcal /de déficit al día). El criterio de valoración de la eficiencia del uso del Rimonabant, fue el cambio de peso originado desde el inicio hasta después de un año de tratamiento (Van Gaal et al., 2005). Este estudio demostró que el tratamiento durante un año con Rimonabant llevaba a una pérdida de peso clínicamente significativa y sostenida, una reducción de REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 64 El GPR55 se expresa en ciertos lechos vasculares y se ha encontrado que estimular este receptor con un potente análogo del cannabidiol anormal, O-1602 disminuye espontáneamente la presión arterial en ratas hipertensas (Járai et al., 1999; Baker et al., 2006). Estudios adicionales acerca de la farmacología de GPR55 han usado células HEK293 transfectadas con GPR55 encontrando una amplia distribución (Sawzdargo et al., 1999; Ryberg et al., 2007), sin embargo, la función fisiológica de GPR55 in vivo aún es ampliamente desconocida. Adicionalmente, LPI está involucrado en numerosas acciones fisiológicas, incluyendo la reproducción, angiogénesis, apoptosis e inflamación, entre otros, procesos que están muy relacionados con la biología del tejido adiposo (Choi et al., 2008). Estudios recientes han indicado que el GPR55 juega un papel importante en el dolor inflamatorio (Staton et al., 2008), en la regulación de la fisiología ósea normalizando el número de osteoclastos y sus funciones, así como el recambio óseo in vivo (Whyte et al., 2009). Adicionalmente, se ha implicado al sistema LPI/GPR55 en cáncer. Existe evidencia que el sistema LPI/GPR55 desempeñan un rol importante en la proliferación y migración de células cancerosas (Ross, 2011). Se ha encontrado que el GPR55 se expresa en tumores de humanos y su expresión se correlaciona con la agresividad del tumor. En general la supervivencia del paciente es menor en los pacientes cuyos glioblastomas expresan mayores niveles de GPR55 (Ross, 2011). Adicionalmente, investigaciones en ratones deficientes para GPR55, han probado la hipótesis de que el GPR55 es el receptor cannabinoide vasodilatador en ratón. Sin embargo, la observación de que la presión arterial basal y el ritmo cardiaco no fueron diferentes entre los ratones knockout de GPR55 y sus controles wild type, sugiere que el GPR55 no está involucrado en la regulación de la presión arterial en condiciones fisiológicas normales (Johns DG. et al., 2007). INTRODUCCIÓN 65 No obstante, esto no excluye necesariamente el papel de GPR55 en la mediación de los efectos de la presión arterial causados por los cannabinoides atípicos administrados exógenamente. Al respecto, estudios previos han encontrado efectos hipotensores de GPR55 al ser inyectado en animales anestesiados, incluyendo el perro (Adams et al., 1977) y el ratón (Jarai et al., 1999; Offertaler et al., 2003). Así mismo, McHugh D. et al., (2008), demostraron que el O-1602 inhibe la migración de los neutrófilos humanos y en este sentido, la acumulación o el aumento de la actividad de los neutrófilos son características de la inflamación del colon (Kozol RA., 1992; Lampinen M. et al., 2005; Schicho R. et al., 2011). Adicionalmente, en ratones knockout para GPR55, se encontró que el tratamiento con DSS (dextran sodium sulfate polymers) solo inducía una colitis leve respecto al grupo control wild type (Schicho R. et al., 2011). En este sentido, se ha demostrado que el O-1602 ofrece una protección significativa contra la colitis experimental murina y sus efectos protectores involucran la inhibición del reclutamiento de neutrófilos independiente del receptor GPR55, lo que indica que estos efectos son mediados a través de otro receptor. En resumen, acciones como la vasodilatación (Johns DG. et al., 2007) y la colitis (Schicho R. et al., 2010) están mediadas de manera independiente de GPR55. OBJETIVOS 67 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Investigar las acciones de los ligandos putativos O-1602 y LPI del receptor GPR55 sobre la regulación de la ingesta y el control metabólico. OBJETIVOS ESPECIFICOS 1. Determinar la regulación de los niveles de expresión del ARNm del receptor cannabinoide CB1 y del GPR55 en el tejido adiposo blanco e hígado en roedores en diferentes estadios fisiológicos relacionados con alteraciones en la homeostasis energética. 2. Investigar los efectos metabólicos de la administración de O-1602 y LPI sobre la ingesta y la adiposidad en ratas. 3. Determinar in vitro los efectos del tratamiento con O-1602 y LPI en células 3T3-L1. 4. Investigar la expresión de CB1, CB2 y GPR55 en el tejido adiposo blanco e hígado de pacientes obesos y diabéticos y sus correlaciones con otros parámetros metabólicos 5. Determinar in vitro los efectos del tratamiento con LPI en explantes y adipocitos aislados de pacientes obesos. MATERIAL Y MÉTODOS 69 MATERIAL Y METODOS 1. Animales de Experimentación Todos los protocolos de manipulación animal han sido revisados y aprobados de acuerdo con las normas institucionales y en estricto cumplimiento de las Normas de la Comunidad Europea 86/609/EEC que regula el cuidado de animales y la experimentación animal. Los animales permanecen en el animalario durante 5 ó 6 días antes de ser usados para los experimentos, con el fin de que se adapten a las condiciones controladas de iluminación (12 horas luz/oscuridad), temperatura (22ºC) y humedad constante. Los animales son alimentados con pienso comercial y tienen libre acceso a agua y comida (excepto en los experimentos indicados). En cada experimento se usaron de 8 a 10 animales por grupo. 1.1. MODELOS ANIMALES 1.1.1. Rata Sprague-Dawley En los experimentos realizados con ratas macho (Rattus norvergicus), se usaron animales de la cepa Sprague-Dawley procedentes del Animalario Central de la Universidad de Santiago de Compostela. En los casos donde se han usado otros modelos animales, se especifica en cada experimento. CEPA MASA (gramos) EDAD Sprague-Dawley 250-300 g 10 a 12 semanas REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 70 1.1.2. Ratas Lewis enanas (dwarf) Las ratas Lewis enanas (dwarf) (HsdOla: Dwarf-dw-4) (Harlam Ibérica) carecen de GH como consecuencia de una mutación en el gen de la GH (Charlton et al., 1988; Carmignac & Robinson, 1990). Como controles de este experimento se utilizaron ratas Lewis de tipo salvaje (LEW/SsNHsd) (Harlam Ibérica). Después de una semana en el animalario para su adaptación se sacrifican y se extrae hígado y tejido adiposo blanco gonadal (WAT) para el análisis a través de RTPCR a tiempo real de la expresión de CB1 y GPR55. CEPA MASA (gramos) EDAD Lewis 250-300 g 10 a 12 semanas Dwarf 150-175 g 10 a 12 semanas 1.1.3. Ratón knock-out de Leptina ob/ob Los ratones (Mus musculus) son procedentes de la compañía Charles River. Llegan al animalario con 6 semanas de edad y se estabulan durante una semana para su adaptación. 1.1.4. Ratón knockout para GPR55 Los ratones (Mus musculus) deficientes para el gen GPR55 y su correspondiente control wild type fueron enviados por la Profesora Ruth Ross (Universidad de Aberdeen, UK). CEPA MASA (gramos) EDAD C57BL6/J 25-30 g 6 Semanas MATERIAL Y MÉTODOS 71 Los ratones llegaron al laboratorio con una edad de 6 a 8 semanas y se estabularon durante una semana para su adaptación antes de realizar los experimentos. 2. TECNICAS EXPERIMENTALES 2.1. Administración de la anestesia Para llevar a cabo los procedimientos quirúrgicos, los animales fueron anestesiados previamente, aplicando una inyección intraperitoneal. En el caso de las ratas, se utiliza una dosis de ketamina/xylazina en proporciones determinadas 200µl/100 gramos de peso corporal, considerándose ésta una dosis adecuada para conseguir una anestesia de grado II-III durante períodos de una o dos horas. SOLUCION ANESTÉSICA:  KETAMINA: 42.5% Ketolar, Parke-Davis, Morris Plañís N.J., (USA). 50 mg/ml.  XILAZINA: 20% Rompun, Bayer Lewerkusen, Alemania. 2 mg/ml.  SOLUCION SALINA FISIOLOGICA: 37.5%. En el caso de los ratones se usa Avertina (Ref. T4.840-2, 25gramos) (Sigma Aldrich) (2,2,2-Tribromoethanol, 97%), este producto viene liofilizado y se disuelven los 25 gramos en 15.5 ml de alcohol isoamílico (C5H12O) (MERCK) consiguiendo un stock inicial concentrado al 50X, se almacena a -20ºC. Cuando va a usarse, se descongela en un baño calentando a 37ºC y se preparan alícuotas de 20 ml diluyendo la Avertina concentrada al 50X en una cantidad de salino determinada para obtener una solución final concentrada al 1X. Para anestesiar a los ratones se usa esta solución en una proporción de 150µl/10 gr (15µl/gr). REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 72 2.2. Implantación cánula i.c.v. para tratamiento agudo Este procedimiento debe llevarse a cabo aproximadamente unos cuatro días antes del experimento. El objetivo de la implantación de estas cánulas es acceder al ventrículo lateral. Se utilizan cánulas de polietileno (PE-20, Clay-Adams, BectonDickinson, New Jersey, USA) de calibre fino (1.09 mm de de diámetro externo y 0.38 mm de diámetro interno). En uno de los extremos de la cánula se pone un tope y se corta en bisel a unos 3/4 mm de distancia, siendo esta parte la que se introduce en el cerebro y que permite el acceso al ventrículo lateral. El extremo opuesto de la cánula se sella hasta el día del experimento. La cánula se implanta a las ratas estereotáxicamente usando las siguientes coordenadas: 1.3 mm posterior al bregma, 1.9 mm lateral a la sutura sagital media y a una profundidad de 3.5 mm (Nogueiras et al., 2004) y se sella con un pegamento comercial (Loctite Super Glue-3) asegurándose que quede perfectamente fijada. 2.3. Colocación de bombas osmóticas para tratamiento crónico Para la realización de un tratamiento crónico (7 días) a nivel central se usan bombas osmóticas (modelo 2001; Alza Corp., Palo Alto, CA) conectadas mediante un tubo xilastic a la cánula i.c.v. Estas bombas, que tienen un volumen de expulsión constante de 1 µl/hora, se rellenan con el compuesto estudiar o su vehículo hasta un volumen total de 233 µl y se ponen sobre salino en un baño a 37oC durante, al menos, 4 horas previas a la operación para asegurar que ya están liberando el tratamiento cuando se colocan sobre el animal. Para colocar la bomba, se procede primero a implantar la cánula i.c.v. tal y como se ha descrito previamente. Luego se inserta la bomba en la parte retrocervical del animal, creando un bolsillo subcutáneo y conectándola mediante xilastic, dilatándola con Xileno para que quede perfectamente pegado a la cánula i.c.v. Posteriormente se sella la zona craneal con pegamento comercial (Loctite Super Glue-3), la incisión es cerrada con suturas. MATERIAL Y MÉTODOS 73 3. MODELOS EXPERIMENTALES 3.1. Modelos experimentales in vivo 3.1.1. Desarrollo Postnatal y Dimorfismo sexual Se utilizaron ratas macho y hembra de la raza Sprague-Dawley de distintas edades: 25, 45, 60 y 90 días postnatales. Tras mantenerlas estabuladas una semana se procedió a sacrificarlas el día que alcanzaron dicha edad (Gonzalez et al., 2008). De los tejidos extraídos se usó el WATg para el correspondiente análisis de la expresión de CB1 y GPR55. 3.1.2. Efecto hormonas gonadales Se extrajeron las gónadas a ratas macho y hembra de 21 días (prepúberes) y se usó un grupo control (Sham) simulando la cirugía. Tras 15 días de estabulación se sacrificaron contando 45 días de edad (postpuberal) (Gonzalez et al., 2008). De la misma forma que en el modelo descrito anteriormente, de los tejidos extraídos se usó el WATg para el correspondiente análisis de la expresión de CB1 y GPR55. 3.1.3. Ayuno Para este ensayo se utilizaron ratas macho adultas, las cuales se mantuvieron en el animalario durante una semana para su adaptación a las condiciones estándar. Después de este período, las ratas fueron divididas aleatoriamente en cuatro grupos: Control: alimentadas ad libitum Deprivación alimenticia a 24 horas Deprivación alimenticia a 48 horas Ayuno a 48 horas con realimentación ad libitum durante otras 48 horas REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 80 dosis de LPI fue de 500 µl. A continuación se procede a inyectar a cada rata en el área peritoneal. Una vez se ha terminado de pinchar a cada rata, se monitoriza la ingesta a 1, 2, 4, 6, y 24 horas. Al término de las 24 horas, las ratas vuelven a ser pesadas individualmente. Estudio del efecto a nivel central en ratas Peso de los animales: 250 - 300 gramos n: 40 ratas Grupos: Vehículo 0.02 µg 0.1 µg 0.5 µg Se sigue el mismo procedimiento descrito anteriormente en la administración central de O-1602. 4.2.3. Efectos in vitro de la administración de O-1602 y LPI en una línea celular de roedores 4.2.3.1. Efecto de O-1602 en la diferenciación adipocitaria de células 3T3-L1 El procedimiento de diferenciación de adipocitos se llevó a cabo en presencia o ausencia de O-1602 (10 μM) durante 10 días. Durante este período, el tratamiento fue renovado cada 2 días. Al cabo de 10 días, las células fueron fijadas en paraformaldehído 4% por un período de 15 minutos. A continuación se lavan exhaustivamente en isopropanol 60% y se incubaron en la solución Oil Red O (Sigma) durante 30 minutos. Después se lavó el exceso de MATERIAL Y MÉTODOS 81 colorante con H2O2 y las placas se observaron al microscopio y se tomaron fotos de campos al azar usando un objetivo de 10X. Posteriormente, la solución Oil Red O se eluyó incubando las células con isopropanol 100% durante 10 minutos y se determinó la densidad óptica a 500 nm para estimar la incorporación de colorante. 4.2.3.2. Efecto de O-1602 en la movilización intracelular de calcio ([Ca2+]i) en adipocitos 3T3-L1 Las células 3T3-L1 se diferenciaron a adipocitos como se describió previamente. Las células 3T3-L1 se cultivaron sobre cubreobjetos de 25 mm recubiertos con poli-Llisina (0.1 mg/ml) en DMEM complementado con FBS 10%, glutamina 4mM y solución de antibiótico-antimicótico al 1%. Al 100% de confluencia (día 0), las células se incubaron en DMEM que contenía FBS 10%, isobutilmetilxantina (IBMX) 0.5 mM, dexametasona 0.25 μM e insulina 10 μg/ml durante 72 horas (día 3). Posteriormente, el medio de cultivo fue reemplazado por DMEM con FBS 10% e insulina 10 μg/ml por un período adicional de 72 horas (día 6) y luego fue cambiado por DMEM sin insulina hasta completar los días 10-12, cuando las células fueron procesadas para las mediciones de [Ca2+] i. A las células 3T3-L1 diferenciadas se les adicionó Fura-2AM 2.5 μM (Molecular Probes, Eugene, OR) y Pluronic F127 0.02% (Molecular Probes, Eugene, OR) en medio libre de rojo fenol que contenía NaHCO3 20 mM (pH 7.4) durante 30 min a 37₀C. Los cubreobjetos con las células fueron lavados con DMEM libre de rojo fenol y montados en soportes Sykes–Moore y colocados en un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE2000-E (fluorescence microscope) (Tokio, Japón) a temperatura controlada y observados con aceite de inmersión PLAN-FLUOR con el objetivo 40X. Las células fueron secuencialmente iluminadas desde arriba a 340y 380-nm por 100 ms cada 5 segundos durante 8 – 10 minutos. La adquisición de las imágenes se controló utilizando el programa Metafluor PC (Universal Imaging Corp., West Chester, PA) y la emisión de fluorescencia se capturó a 505/510 nm antes (línea basal) y después de adicionar O-1602 (100 μM) utilizando una cámara digital CCD en frio (ORCA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 82 II BT; Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japón) en el modo 1 bit. Los cambios en [Ca2+] i se interpretaron como la relación de las ondas de excitación (F340/F380). 4.2.3.3. Efecto de LPI en la diferenciación adipocitaria de células 3T3-L1 Para valorar los efectos de LPI sobre adipocitos in vitro, se llevó a cabo el mismo procedimiento descrito previamente en el análisis de los efectos de O-1602. De esta manera, adipocitos de células 3T3-L1 fueron cargados con una sonda sensible al calcio, Fura-2; y después de la manipulación farmacológica con LPI a 1 y 10 µM durante 10 días, se monitorizó la movilización de calcio intracelular. 5. REGULACION DE CB1 Y GPR55 EN GRASA BLANCA E HIGADO EN HUMANOS Pacientes y métodos Cohorte 1: Participaron voluntariamente 95 individuos Caucasianos entre personas sanas y pacientes atendidos en el Departamento de Endocrinología y Cirugía de la Clínica Universitaria de Navarra. Los pacientes fueron sometidos a una evaluación clínica que incluyó historia clínica, examen físico, análisis de composición corporal y valoración de co-morbilidad. La obesidad se clasificó de acuerdo con el IMC (Indice de Masa Corporal) (>30 kg/m2). La grasa corporal fue estimada mediante pletismografía por desplazamiento de aire (Bod-Pod®, Life Measurements, Concord, CA) (Ginde et al., 2005). Los pacientes obesos fueron subclasificados de acuerdo a los umbrales de diagnóstico de diabetes establecidos: - Normoglicemia (NGT): Concentración de glucosa plasmática en ayunas (FPG) entre < 100 mg/dL y PG < 140 mg/dL, 2 horas después del test oral de tolerancia a la glucosa (OGTT). MATERIAL Y MÉTODOS 83 - Intolerancia a la glucosa (tolerancia alterada) (IGT): Concentración de glucosa plasmática en ayunas entre 100-125 mg/dL o PG entre 140-199 mg/dL 2 horas después del test oral de tolerancia a la glucosa (OGTT). Concentración de glucosa plasmática en ayunas (FPG) > 126 mg/dL o PG ≥ 200 mg/dL 2 horas después del OGTT. - Sujetos con diabetes Tipo 2: Sujetos con Diabetes tipo 2 que no fueron tratados con terapia de insulina o medicamentos que pudiesen influir en los niveles de insulina endógena. Recolección de tejidos Las muestras de tejido adiposo visceral (68 muestras) y subcutáneo (59 muestras) fueron recogidas de pacientes que se someten a una Funduplicatura de Nissen (Voluntarios delgados, que han sido operados de hernia de hiato) o sujetos obesos con cirugía de bypass gástrico (Roux-en-Y gastric bypass), como tratamiento de la obesidad mórbida. Las muestras de tejido extraído, fueron congeladas y almacenadas inmediatamente a -80₀C. El estudio fue aprobado, respetando la perspectiva ética y científica, por el Comité ético del hospital responsable de la investigación y con el consentimiento informado de los participantes. Cohorte 2: Las muestras de tejido adiposo visceral de 64 sujetos (35 con tolerancia normal a la glucosa, 17 con intolerancia a la glucosa en ayunas y 12 con diabetes tipo 2), fueron obtenidas del Servicio de Endocrinología del Hospital Universitario Dr. Josep Trueta (Girona, España). El IMC estuvo entre 20 y 68 kg/m2. Las muestras de tejido adiposo se obtuvieron de depósitos viscerales durante procedimientos quirúrgicos electivos (colecistectomía, cirugía de hernia abdominal y cirugía de bypass gástrico). REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 84 Todos los sujetos fueron de origen Caucasiano y dieron su consentimiento por escrito después de explicarles el objetivo del estudio. Se excluyeron expresamente enfermedades renales y hepáticas mediante análisis bioquímicos. El estudio fue aprobado, desde una perspectiva ética y científica, por el Comité Ético del Hospital Universitario Dr. Josep Trueta (Girona, España). Las muestras de tejido adiposo fueron lavadas, cortadas y congeladas inmediatamente en nitrógeno líquido antes de almacenarlas a -80₀C. Para realizar el aislamiento de adipocitos, los tejidos no congelados fueron lavados de tres a cuatro veces con tampón fosfato salino (PBS) y suspendida en igual volumen de PBS suplementado estreptomicinapenicilina al 1% y colagenasa tipo I al 0.1% precalentado a 37₀C. Los tejidos fueron puestos en un baño a 37₀C en agitación continua durante 60 minutos y centrifugados durante 5 minutos entre 300 y 500g a temperatura ambiente. A continuación se recogió el sobrenadante que contiene los adipocitos maduros. El pellet fue identificado como células de la fracción del estroma vascular. 5.1. Ensayos en sangre Cada individuo de la cohorte 1, permaneció en ayunas la noche anterior a la toma de la muestra. Todas las muestras se dejaron reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de centrifugarlas a 1300g durante 10 minutos. Las muestras de plasma fueron luego alicuoteadas en eppendorf (Sigma-Aldrich) y congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80 °C. La glucosa fue analizada a partir de reacciones enzimáticas en un analizador automático de espectrofotometría (Hitachi Modular P800, Roche, Basel, Suiza). La insulina fue medida por medio de un ensayo de quimiluminescencia de enzima amplificada (IMMULITE®, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA). El colesterol total, los niveles de lipoproteína de densidad alta (HDL-colesterol) y la lipoproteína de densidad baja (LDL-colesterol) fueron calculados como se describió MATERIAL Y MÉTODOS 85 previamente. (Catalán et al., 2007). Las concentraciones de CRP (High sensitivity Creactive protein - CRP) fueron determinadas como se describió previamente.(GómezAmbrosi et al., 2006; Gómez-Ambrosi et al., 2007). La leptina fue medida por el método RIA de doble anticuerpo (Linco Research, Inc., St. Charles, MO). Los coeficientes de variación intra e inter-ensayo fueron 5.0 y 4.5 %, respectivamente. 5.2. Análisis de LPI Las muestras de plasma para la medición de LPI fueron obtenidas a partir de 78 individuos de la cohorte 1. Estos permanecieron en ayunas la noche anterior a la toma de la muestra (Tabla 3). El LPI total fue calculado por combinación de 16:0, 18:0 y 20:4. El LPI estándar; LPI 16:0, LPI 18:0, LPI 20:4 y LPA 17:0 se adquirieron en Avanti Polar lipids, INC®. Las muestras de plasma (30µl) por triplicado fueron disueltas con metanol (70µl) conteniendo un patrón interno (LPA 17:0) a una concentración de 100 ng/mL. Las muestras se vortearon fuertemente y se centrifugaron a 10.000x g durante 10 minutos a 4₀C. El sobrenadante fue recogido y almacenado a -80 °C para su posterior análisis por cromatografía líquida - espectrofotometría de masas (LC ó HPLC-MS). La separación de fosfolípidos por cromatografía de líquido fue llevada a cabo mediante el sistema de Agilent 1100 HPLC (Agilent Technologies, Wokingham, UK) usando una columna de Phenomenex Jupiter 150 mm x 2 mm C18. El gradiente utilizado para separar los fosfolípidos consistió en una fase móvil donde la solución A fue Acetato de Amonio (1 µM) y la solución B,l metanol/acetonitrilo 9:1 (v/v). El gradiente comenzó con un 70% de B y se aumentó linealmente al 100% de B durante 10 min antes de completar el 100% durante 8 min. El caudal es de 300 µl/min, con un volumen de inyección de 5 µl. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 86 El LC eluyente fue dirigido sin separarlo hacia un espectrómetro de masas cuadrupolar - Q-trampa 4000 triple (Applied Biosystems, Warrington, UK) equipado con un turbo Ion Spray™ (TIS). Para el análisis de fosfolípidos, el espectrómetro de masas se utilizó en modo de iones negativos con la siguiente configuración de la fuente: voltaje ión spray 4500 V, temperatura de la fuente 400 °C, gases 1 & 2 a 25 V y 40 V respectivamente y la Cortina de gas de 10 V. Los fosfolípidos fueron cuantificados usando un monitor de múltiples reacciones por comparación a las muestras estándar. El ion de las transiciones para cada una de las muestras se determinó con base a su ion molecular y a un gran fragmento de ion (el cual correspondía a la pérdida de cabeza de grupo); (16:0, 18:0 y 20:4; Q1 = 571.4, 599.4 y 619.4 respectivamente y Q2 = 241.2 para todos). LPA (17:0; Q1 437.20; Q2 153.10). Las curvas de calibración se prepararon para cada muestra, utilizando una serie de estándares que van de 2 ng/µl a 10 pg/µl y los límites de detección estuvieron dentro de este rango. MATERIAL Y MÉTODOS 87 Tabla 3. Características antropométricas y analíticas de los sujetos de la cohorte 1 usadas para la determinación de los niveles circulantes de LPI. BMI, índice de masa corporal; CRP, proteína C reactiva -. Datos medidos por SEM. Las diferencias entre grupos fueron analizadas mediante ANOVA seguido del test post hoc de Tukey. *P<0.05 y **P<0.01 vs delgados. †P<0.05 y ††P<0.01 vs obesos NG. P<0.01 vs obesos IGT. 5.3. Experimentos ex-vivo usando explantes de tejido adiposo subcutáneo y visceral En los experimentos ex vivo se usaron muestras de tejido adiposo subcutáneo y visceral. Las muestras de los dos tipos de tejido fueron transportadas inmediatamente al laboratorio (5-10 minutos) y su manipulación fue llevada a cabo bajo estrictas condiciones de asepsia. Los tejidos fueron cortados con ayuda de tijeras en pequeñas piezas (5-10mg), e incubados en buffer de albumina plus (3 ml/g de tejido) entre 5 - 30 min aproximadamente. Después de la incubación, los explantes de tejido se centrifugaron durante 30s a 400g. Los 100 mg de tejido mezclado fueron colocados en 1 ml M199 (Gibco, Invitrogen) conteniendo suero bovino fetal al 10% (Hyclone, Thermo Delgados Obesos NGT Obesos IGT Obesos DMT2 P N (hombres/mujeres) 5 (2/3) 29 (11/18) 24 (12/12) 20 (8/12) Edad (años) 38 4 36 2 42 2 45 2†† 0.053 BMI (kg/m2) 21.3 1.1 43.1 1.2** 45.5 1.1** 48.9 2.3** <0.001 Grasa Corporal (%) 26.5 2.8 48.7 1.6** 53.3 1.0** 52.6 1.3** <0.001 Glucosa en ayuno(mg/dL) 86.8 3.5 89.0 1.9 104.7 2.2 151.3 15.8**,††, <0.001 Insulina en ayuno ( U/mL) 8.2 1.7 17.0 1.6 18.5 2.3 21.1 2.9 0.070 Trigliceridos (mg/dL) 68 11 101 9 140 25 204 53 0.069 Colesterol (mg/dL) 192 10 181 8 209 9 204 8 0.081 LDL (mg/dL) 118 10 119 6 131 8 130 8 0.562 Colesterol -HDL (mg/dL) 58 2 41 2* 50 2† 43 2* <0.01 Leptina (ng/mL) 7.8 1.5 51.0 5.8* 58.9 6.5** 68.3 9.6** <0.01 CRP (mg/L) 1.8 0.3 6.8 1.4 13.1 2.4* 9.3 1.9 0.016 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 88 Fisher Scientific Inc.), penicilina 100 unit/ml (Gibco, Invitrogen), estreptomicina 100 µg/ml (Gibco, Invitrogen) e incubados durante 48h en suspensión bajo condiciones de asepsia (Moreno-Navarrete et al., 2011). Se compararon los grupos de control tratado (M199) y LPI (1 y 10 µM). Las dosis fueron seleccionadas con base a referencias previas (Bondarenko et al., 2010; Kapur et al., 2009). Después de 48 h, todas las muestras fueron congeladas inmediatamente en nitrógeno líquido antes de ser almacenadas a -80⁰C. El experimento fue llevado a cabo en cinco réplicas de cada muestra de tejido adiposo y tratamiento. Para evaluar la integridad celular, la actividad de la deshidrogenasa láctica (lactate deshidrogenasa, LDH) de las células dañadas fue analizada mediante el kit de detección de citotoxicidad (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para todos los tratamientos. La expresión de los genes FASN, ACC1, ADIPOQ, PPARG, LEP and GPR55 fue analizada usando TaqMan®, técnica utilizada para la cuantificación de la expresión génica relativa, como se describe posteriormente. 5.4. Efecto de LPI sobre los niveles intracelulares de calcio ([Ca2+]i) en cultivos de adipocitos diferenciados Las fracciones del estroma vascular de células de humanos fueron aisladas a partir de tejido adiposo visceral y subcutáneo de sujetos obesos sometidos a cirugía abdominal (baypass gastrointestinal) como se describió previamente (Rodriguez et al., 2009). Las fracciones del estroma vascular fueron cortadas en 25-mm aproximadamente y puestos sobre los cubreobjetos (30.000 células/cubreobjeto) para el posterior sembrado de adipocitos en DMEM/F-12 [1:1] (Invitrogen, Paisley, UK), 16 µM biotin, 18 µM pantotenato, 100 µM ascorbato y antibiótico-antimicótico complementado con NCS (newborn calf serum) al 10% a 37⁰C en atmósfera húmeda al 95%, CO2 al 5% en aire. Después de cuatro días, las células cultivadas fueron inducidas para diferenciarlas con un medio de diferenciación estándar de adipocitos que contiene NCS 3%, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) 0.5 mM, dexametasona 0.1 µM, MATERIAL Y MÉTODOS 89 BRL49653 1 µM e insulina a 10 µg/ml. Después del tercer día del período de inducción, las células fueron cultivadas en un medio de diferenciación IBMX and BRL49653. Los cultivos fueron repuestos cada dos días. Al día 9, los cultivos de adipocitos diferenciados fueron procesados para realizar las medidas de [Ca2+]i. Posteriormente, las células fueron grabadas con Fura-2AM (Molecular Probes, Eugene, OR) 2.5 μM y Pluronic F127 0.02% (Molecular Probes, Eugene, OR) y DMEM libre de rojo fenol que contiene NaHCO3 (pH 7.4) 20 mM durante 30 minutos a 37 ⁰C. Para remover el tinte extracelular, las células fueron lavadas tres veces con DMEM libre de rojo fenol. A continuación los cubreobjetos con las células tintadas fueron montados en soportes Sykes-Moore y colocados a una temperatura controlada en un microscopio Nikon Eclipse TE2000-E (Tokio, Japón). Las células fueron secuencialmente iluminadas desde arriba a 340-y 380-nm durante 100ms cada 5 segundos durante 8-10 minutos. La adquisición de la imagen fue controlada usando el programa Metafluor PC (Universal Imaging Corp., West Chester, PA) y la emisión de fluorescencia fue capturada a 505/510 nm antes y después de la adición de LPI a 5μM usando una cámara digital (ORCA II BT; Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japón) corriendo en el modo 1 bite. La respuesta de diferenciación de adipocitos primarios para LPI fue determinada después del establecimiento de una imagen estable. Los cambios en [Ca2+]i fueron grabados como un radio de la correspondiente excitación (F340/F380). Salvo indicación contraria, todos los reactivos adicionales se adquirieron en Sigma-Aldrich. 5.5. Extracción de ARN y PCR a tiempo real El procedimiento seguido para la extracción de ARN de tejido adiposo e hígado de roedores y tejido adiposo de humanos, y el análisis de las muestras por PCR a tiempo real se describe posteriormente. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 96 Tabla 5. Secuencias de las sondas usadas para PCR a tiempo real en rata ARNm Nº Gen Bank Cebador Secuencia 18S V01270.1 Sentido Antisentido Sonda 5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’ 5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’ FAM-5’-GACGGCAAGTCTGGTGCCAGCA3’-TAMRA ACCα NM_022193 Sentido Antisentido Sonda 5’-TGGGCGGGATGGTCTCTTT-3’ 5’-AGTCGCAGAAGCAGCCCATT-3’ FAM-5’- ACCTTTGAAGATTTCGTCAGGATCTTT GATGA-3’-TAMRA ADIPONECTINA NM_144744.3 Applied biosystems Rn00595250 m1 Adrβ1 NM_012701.1 Sentido Antisentido Sonda 5’-CCCCAAGTGCTGCGATTTC-3’ 5’AGGTACACGAAGGCCATGATG-3’ FAM-5’- TCGTCCGTCGTCTCCTTCTACGTGC-3’- TAMRA Adrβ2 NM_012492.2 Sentido Antisentido Sonda 5’-GTGGATCGCTATGTTGCTATCACA-3’ 5’CACTCGGGCCTTATTCTTGGT-3’ FAM-5’- CGCCCTTCAAGTACCAGAGCCTGCT-3’- TAMRA Adrβ3 NM_013108.1 Sentido Antisentido Sonda 5’-CACCGCTCAACAGGTTTGATG-3’ 5’CCCAGAAGTCCTGCAAAAACG-3’ FAM-5’-ACGTGAAGGGCCGTGAAGATCCA GC-3’-TAMRA AgRP NM_033650.1 Sentido Antisentido Sonda 5’-GCACAAGTGGCCAGGAACTC-3’ 5’CAGGACACAGCTCAGCAACATT-3’ FAM-5’- CAAGGATCAACAAGCAAAGGCCATGC-3’- TAMRA ATGL NM_001108509.2 Sentido Antisentido Sonda 5’-CCGCTGGAGAGTGCAGTGT-3’ 5’CACCGGATATCTTCAGGGACAT-3’ FAM-5’-CACCATCCGCTTGTTGGAGTGGC- MATERIAL Y MÉTODOS 97 3’-TAMRA CART NM_017110.1 Sentido Antisentido Sonda 5’-GGACATCTACTCTGCCGTGGAT-3’ 5’GCGCTTCAATCTGCAACACA-3’ FAM-5’- TCCCATGAGAAGGAGCTGCCAAGGC-3’- TAMRA CPT-1M NM_013200.1 Applied biosystems Rn00566242_m1 FAS NM_017332 Sentido Antisentido Sonda 5’-GACATTTCATCAGGCCACC-3’ 5’-CCTCTAGCAGCCGCACCTC-3’ FAM-5’-CTGCCCAGGACAGGAACCG-3’- TAMRA GLUT1 NM_138827.1 Sentido Antisentido Sonda 5’-GCATCGTCGTTGGGATCCT-3’ 5’CAAGTCTGCATTGCCCATGA-3’ FAM-5’- TTGCCCAGGTGTTCGGCTTAGACTCC-3’- TAMRA GLUT4 NM_012751.1 Sentido Antisentido Sonda 5’-CATTCTCGGACGGTTCCTCAT-3’ 5’GCGATTTCTCCCACATACATAGG-3’ FAM-5’- CGCCTACTCAGGGCTAACATCAGG GTT G3’-TAMRA HSL NM_012859.1 Sentido Antisentido Sonda 5’-CCAAGTGTGTGAGCGCCTATT-3’ 5’TCACGCCCAATGCCTTCT-3’ FAM-5’- AGGGACAGAGACGGAGGACCATTT TGACTC-3’-TAMRA IL6 NM_012589.1 Sentido Antisentido Sonda 5’-TGCCCTTCAGGAACAGCTATG-3’ 5’TGTCAACAACATCAGTCCCAAGAA-3’ FAM-5’- CTCCGCAAGAGACTTCCAGCCAGTTG-3’- TAMRA LPL NM_012598.2 Sentido Antisentido 5’-CTGAAAGTGAGAACATTCCCTTCA-3’ 5’CCGTGTAAATCAAGAAGGAGTAGGTT-3’ REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 98 Sonda FAM-5’-CCTGCCGGAGGTCGCCACAAATA3’-TAMRA MCP1 NM_031530.1 Sentido Antisentido Sonda 5’-GGCCTGTTGTTCACAGTTGCT-3’ 5’GCATTAACTGCATCTGGCTGAGA-3’ FAM-5’-CTGTAGCATCCACGTGC-3’- TAMRA NPY NM_012614.1 Sentido Antisentido Sonda 5’-CACAGAAAATGCCCCCAGAA-3’ 5’TCAGGAGAGCAAGTTTCATTT CC-3’ FAM-5’-AAGGCTTGAAGACCCTTCCATGTG GTG-3’-TAMRA POMC NM_139326.2 Sentido Antisentido Sonda 5’-CGTCCTCAGAGAGCTGCCTTT-3’ 5’TGTAGCAGAATCTCGGCATCTTC-3’ FAM-5’-CGCGACAGAGCCTCAGCCACC-3’- TAMRA PPARγ NM_013124.3 Sentido Antisentido Sonda 5’-CCTGTTGACCCAGAGCATGGT-3’ 5’TGGGCCAGAATGGCATCT C-3’ FAM-5’- CTGATGCACTGCCTATGAGCACTTCA CA3’-TAMRA SCD-1 NM_139192.2 Sentido Antisentido Sonda 5’-TGCCAGAGGGAATAGGGAAA-3’ 5’-CTCTCCCATCCTTACTTACAAACCA-3’ FAM-5’- TCACCTTGAGAGAAGAATTAGCACGC ACGG-3’-TAMRA TNFα NM_012675.3 Sentido Antisentido Sonda 5’-CTAACTCCCAGAAAAGCAAGCAA-3’ 5’CCTCGGGCCAGTGTATGAGA-3’ FAM-5’-CAGCCAGGCAGGTTCCGTCC-3’- TAMRA MATERIAL Y MÉTODOS 99 Tabla 6. Secuencias de las sondas usadas para PCR a tiempo real en ratón ARNm Nº Gen Bank Cebador Secuencia ACCα NM_022193 Sentido Antisentido Sonda 5’-TGGGCGGGATGGTCTCTTT-3’ 5’-AGTCGCAGAAGCAGCCCATT-3’ FAM-5’-ACCTTTGAAGATTTCGTCAGGATCTTTG ATGA-3’-TAMRA CPT-1L NM_031559 Sentido Antisentido Sonda 5’-ATGACGGCTATGGTGTCTCC-3’ 5’-TCATGGCTTGTCTCAAGTGC-3’ FAM-5’-TGAGACAGACTCAGACCGCT-3’-TAM CPT-1M NM_013200.1 Applied biosystems Rn00682395_mg1 18S M11188 Sentido Antisentido Sonda 5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’ 5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’ FAM-5’-GACGGCAAGTCTGGTGCCAGCA-3’-TAMRA INSIG2 NM_178082 Sentido Antisentido Sonda 5’-CGTGCTGCGGTACAGCC-3’ 5’-GGCTCTCCTAGATGCCTGTCA-3’ 5’-CAGCTGTGATTGGACTATTGTACCCCTGCA-3’ PPARγ NM_0011273 30.1 Sentido Antisentido Sonda 5`-CCTGTTGACCCAGAGCATGGT-3` 5`-TGGGCCAGAATGGCATCTC-3` FAM-5`-CTGATGCACTGCCTATGAGCACTTC ACA-3`- TAM CEBP NM_007678.3 Sentido Antisentido Sonda 5`-CGCAAGAGCCGAGATAAAGC-3` 5`-CGGTCATTGTCACTGGTCAACT-3` FAM-5`-CAACGTGGAGACGCAACAGAAGGTGC-3`- TAM CEBPβ NM_009883.3 Sentido Antisentido Sonda 5`-CAGAGTAGCCCCTTGTCTTTTGG-3` 5`-GGATTGCAGGTCAGACACAGAA-3` FAM-5`-TGAGGATAGCCAGGTCAAAGCCCA-3`-TAM PPAR NM_013196.1 Sentido Antisentido Sonda 5`-TGGAGTCCACGCATGTGAAG-3` 5`-CGCCAGCTTTAGCCGAATAG-3` FAM-5`-CTGCAAGGGCTTCTTTCGGCGA-3`-TAM EPGC1 NM_013196.1 Sentido Antisentido Sonda 5`-CGATCACCATATTCCAGGTCAAG-3` 5`-CGATGTGTGCGGTGTCTGTAGT-3` FAM-5`-AGGTCCCCAGGCAGTAGATCCTCTTCAAGA- REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 100 3`-TAM SREBP1 NM_011480.3 Sentido Antisentido Sonda 5`-GCGGCTGTTGTCTACCATAAGC-3` 5`-TGTTGCCATGGAGATAGCATCTC-3` FAM-5`-ACCAGCTGCATGCCATGGGCAAGTA-3`- TAM PEPCK NM_011044.2 Sentido Antisentido Sonda 5`-CCACAGCTGCTGCAGAACAC-3` 5`-GAAGGGTCGCATGGCAAA-3` FAM-5`-AGGGCAAGATCATCATGCACGACCC-3`- TAM G6Pase NM_008061.3 Sentido Antisentido Sonda 5`-CCAGGTCGTGGCTGGAGTCT-3` 5`-TGTAGATGCCCCGGATGTG-3` 5`-CAGGCATTGCTGTGGCTGAAACTTTCAG-3`-TAM NFKβ NM_009045.4 Sentido Antisentido Sonda 5`-GCCGTGGAGTACGACAACATCT-3` 5`-GTGTAGTCCCATCATAGGTGGTACTGT-3` FAM-5`-CTGCTTCTGGAGGGTGATGCCCAC-3`-TAM LPL NM_008509.2 Sentido Antisentido Sonda 5`-GGGAAATGATGTGGCCAGATT-3` 5`-CCCTAAGAGGTGGACGTTGTCT-3` FAM-5`-ACTGGATGGAGGAGGAGTTTAACTACC CCC-3`-TAM 6.2. Western Blot (WB) El análisis mediante WB de las distintas proteínas implicadas en el metabolismo de lípidos se realiza con base en protocolos estandarizados por nuestro grupo de investigación. 6.2.1. Extracción de proteínas totales: Se realiza todo el proceso en hielo para evitar que las proteínas se degraden. - Las muestras de tejido se homogenizan mecánicamente hasta que estén completamente disgregadas. MATERIAL Y MÉTODOS 101 - Se añade tampón de lisis en proporción al tejido (1:5 peso:volumen).  Tampón de lisis (500ml): 3.0285 ml TRIS-HCL pH=7.5, 5 ml TritonX100 v/v, 0.185 ml EDTA 0.19 ml Ortovanadato sódico, 1.0495 ml Fluoruro Sódico, 1.115 ml Pirofosfato Sódico, y 42.75 Sacarosa. Esta solución se conserva a 4 º y en el momento de su uso se le añaden los inhibidores de proteasas (RocheDiagnostics): 1 pastilla de cóctel de inhibidores / 5 ml de tampón de lisis. Después de añadir los inhibidores de proteasas se añade βmercaptoetanol. Así, en cada ml de Tampón de lisis: 900 µl Tampón de lisis, 100 µl inhibidores y 10 µl β-mercaptoetanol. - Se centrifuga a 13500 rpm a 4 ºC durante 30 minutos. En el sobrenadante se determina la concentración de proteína (método colorimétrico de Bradford) mediante el reactivo Bio-Rad Protein Assay Kit, (Bio-Rad Laboratorios, Inc., Richmond, CA). - Después se guarda la muestra a -80ºC, hasta que se vaya a usar. - En el momento en que se utilicen las muestras se añade el tampón de carga y tampón de lisis y se calientan a 95 ºC durante 10 minutos. 6.2.2. Electroforesis y Transferencia:  La separación por peso de las proteínas se realiza por electroforesis en geles SDS-PAGE, compuesto por dos fases: fase superior o stacking (permite homogenizar la entrada de las proteínas en el gel separador), y la fase inferior o separadora (permite la separación de las proteínas exclusivamente en función del tamaño). El porcentaje de acrilamida de esta última fase varía en función del tamaño de las proteínas a estudiar. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 102  Gel 6 % : 7 ml H2Od, 13.5 ml Tampón A (90.1 g Tris-HCl, 2 g SDS, 1 l H2Od: pH=8.8), 5.4 ml Acrilamida,75 µ lTEMED y 150µl APS.  Gel 8 % : 5.2 ml H2Od 13.5 ml TampónA, 7.2 ml Acrilamida, 75 µl TEMED y 150 µlAPS. La cantidad total de proteína cargada: 40 µg de hipotálamo, 20 µg de hígado o 15 µg en el caso del tejido adiposo. Para determinar el peso de las proteínas y confirmar la transferencia de las muestras se utiliza un marcador comercial (Precision plus proteinEstándar, Bio-Rad). Para cargar el gel, la proteína se lleva a un volumen de 16 µl con tampón de lisis y se le añade tampón de carga 5X (el tampón de carga debe quedar en la muestra a 1X).  Tampón de carga 5X (25 ml): 12.5 ml glicerol, 1.25 ml βmercaptoetanol, 2.5 g SDS, 0.125 ml azul de bromofenol y 6.25 ml Tris-HCl pH6.8.  La electroforesis se realiza durante 60-75 minutos bajo las siguientes condiciones: Voltaje constante 130 V y Amperaje 180 mA.  Tampón de electroforesis 5X (1l): 72 g Glicina, 15 g Tris base y 5S DS. Para pasar a 1X: 100 ml de tampón de electroforesis 5X en un volumen final de 500ml.  La transferencia (Transferencia Semiseca) se realiza sobre membrana de PVDF (Millipore), que debe ser activada previamente (5 minutos en Etanol, 2 minutos en H2Od y 2 minutos en Tampón de Transferencia).  Tampón de Transferencia 25X (500 ml): 72.5 g Tris base, 36.5 g Glicina y 4.5 g de SDS. Para pasar a 1X: 40 ml del tampón de MATERIAL Y MÉTODOS 103 transferencia 25X, 200 ml de Metanol en un volumen final de 1 L de H2Od. Duración transferencia: 90minutos a 25 V y 180 mA.  Finalizada la transferencia se bloquea la membrana con exceso de proteína (BSA3%) durante 60 minutos de agitación a temperatura ambiente. 6.2.3. Inmunodetección  Se lava la membrana con solución de lavado TBS-TWEEN 0.1 % (24.2 g Tris Base, 80 g NaCl y 1 ml Tween20© en un volumen final de 1 L, a un pH=7.6) durante unos 30minutos.  Se incuba con el anticuerpo primario toda la noche a 4 oC ó 2 horas a temperatura ambiente en solución de bloqueo (TBS-TWEEN 0.1 % + 3 % BSA) en agitación.  Se realizan tres lavados de 10 minutos cada uno con la solución de lavado.  Se incuba 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo se cundario en solución de bloqueo.  Se realizan tres lavados de 10 minutos cada uno con la solución de lavado.  Se incuba la membrana durante 1-2 minutos con el sustrato y potenciador de quimioluminiscencia a volúmenes iguales (1 ml de cada uno), en oscuridad y sin agitación.  Para detectar la proteína se usa anticuerpo secundario conjugado con HRP y quimioluminiscencia.  Sustrato de Quimioluminiscencia: Pierce®ECLWb substrate (Thermoscientific). REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 104 Cuando el anticuerpo secundario se incuba con el sustrato y el potenciador se emite una reacción luminosa que permite la visualización, mediante autorradiografía, de la interacción de los anticuerpos con la proteína de la muestra.  Se coloca la membrana en un casete de autorradiografía con películas fotográficas (Amersham, Hi.perfilm Mrpn6k) y se revelan las películas a distintos tiempos en función de la señal obtenida. Tabla 7. Relación de anticuerpos primarios y secundarios usados y sus correspondientes diluciones Anticuerpo Primario DILUCION Casa Comercial Anticuerpo Secundario DILUCION Casa Comercial Β-Actina 1:500 Sigma Aldrich anti-mouse 1:5000 Dakocytomation GPR55 mouse 1:500 Abcam Anti-mouse 1:5000 Dakocytomation GPR55 humanos 1:500 Abcam anti-rabbit 1:5000 Dakocytomation  Para rehibridar la membrana con otros anticuerpos es necesario incubarla en solución de “stripping” durante 30 minutos a 50 ₀C. Así se consigue despegar el anticuerpo de la membrana.  Solución de “stripping”: 6.25 ml Tris-HCl pH 6.8, 20 ml SDS, 710 µl β-mercaptoetanol. Completar con H2Od hasta un volumen final de 100 ml. A continuación se lava con solución de lavado (3 lavados de 5 minutos) y se procede a bloquear de nuevo la membrana. Para conservar la membrana para futuros experimentos se lava en PBS, se seca al aire sobre un papel de filtro y se guarda. MATERIAL Y MÉTODOS 105 7. ANALISIS ESTADISTICO Y REPRESENTACIONES GRAFICAS Los datos obtenidos de la experimentación animal, se expresaron como MEDIA±SEM y fueron representados en relación a las unidades de expresión del grupo tratado respecto al control (porcentaje). Los valores de probabilidad (P) de que la hipótesis nula sea correcta fueron representados por un asterisco en la gráfica de acuerdo al código siguiente.*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Los datos de ingesta y peso se analizan mediante el test no paramétrico MannWhitney, tomando como grado de significación p<0.05. Las representaciones gráficas fueron realizadas con el programa Excel (Office de Microsoft) y el análisis estadístico fue realizado con el programa GraphPad Instat 3.05 (GraphPad software). En el caso del análisis estadístico de los datos obtenidos de muestras de humanos, se usó el programa estadístico SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, IL). A menos que se indique lo contrario, la descripción de los resultados de las variables continuas se expresó como media y desviación típica de las variables Gaussianas. Las variables que no cumplían una distribución normal fueron transformadas logarítmicamente en posteriores análisis. La relación entre variables se analizó mediante correlación simple (test de Pearson) y análisis de regresión múltiple. La ANOVA fue utilizada para comparar NGT, IGT y pacientes con diabetes tipo 2 seguido por un test pair-wise a posteriori. Para las mediciones del [Ca2+]i se usó la prueba t. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 112 3. Efecto de la gestación sobre la expresión de CB1 y GPR55 en WAT Dado que la gestación es un modelo fisiológico caracterizado por aumento en la ingesta, en la cantidad de grasa y la hiperleptinemia (Garcia MD., et al 2000), estudiamos la expresión de los dos receptores en ratas gestantes. Nuestros resultados mostraron que tanto los niveles de CB1 (Figura 11A) y GPR55 (Figura 11B) en WATg disminuyen significativamente (P<0,01) durante la gestación, alcanzando los niveles más bajos durante el último período de gestación, a los 19 y 21 días. A B Figura 11. Efecto del estado gestacional sobre la expresión de ARNm de CB1 y GPR55 en WAT de ratas medidos por RT-PCR en tiempo real. A. Niveles de expresión de CB1 durante la gestación. B. Expresión génica de GPR55 durante la gestación. Los valores fueron normalizados por los niveles de 18S, como control interno, y los resultados se expresan en unidades arbitrarias. Los valores representan la media, obtenida a partir de 8 animales por grupo, ± sem. * P<0.05, ** P<0,01. 4. Efecto del desarrollo postnatal sobre la expresión de CB1 y GPR55 en WAT Una de las principales características fisiológicas de la leptina es que sus niveles circulantes se incrementan durante el desarrollo posnatal junto con la ganancia en masa del tejido adiposo. Además, existe una importante influencia del género sobre los niveles de leptina, observándose diferencias entre hembras y machos independientemente de adiposidad (Pinilla L., et al 1999). Por lo tanto, hemos evaluado los niveles de expresión génica en WATg de CB1 y GPR55 durante las 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 ** ** ** ** ** CB1 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) GPR55 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) No preñadas Preñadas RESULTADOS 113 distintas etapas del desarrollo tanto en machos (Figura 12A y 12B) como en hembras (Figura 12C y 12D). Con respecto a los machos se encontró que los niveles de ambos receptores están aumentados en fases adultas. Durante el desarrollo postnatal en ratas macho, encontramos un incremento muy significativo (P<0,001) en los niveles de expresión de ambos receptores en fases adultas, 60 y 90 días (Figura 12A y 12B). En el caso de las hembras, el mayor incremento se observa a los 60 días (Figura 12C y 12D). MACHOS A B HEMBRAS C D Figura 12. Efecto del desarrollo postnatal de ratas macho sobre la expresión de CB1 y GPR55 en WAT. A. Niveles de expresión de ARNm de CB1 a lo largo del desarrollo postnatal en ratas macho. B. Expresión de ARNm de GPR55 a lo largo del desarrollo postnatal en ratas macho. C. Niveles de expresión génica de CB1 a lo largo del desarrollo postnatal en ratas hembra. D. Niveles de expresión de ARNm de GPR55 a lo largo del desarrollo postnatal en ratas hembras. Los valores representan la media, obtenida a partir de 8 animales por grupo, ± sem. * P<0.05, ** P<0,01. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 25 45 60 90 días 25 45 60 90 días 0 50 100 150 200 250 300 350 * *** *** ** *** *** CB1mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) GPR55 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) 25 45 60 90 días 0 100 200 300 400 500 600 700 800 0 100 200 300 400 500 600 25 45 60 90 días ** *** ** ** *** ** CB1 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) GPR55 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 114 5. Efecto de alteraciones en función hipofisaria sobre la expresión de CB1 y GPR55 en WAT: adrenalectomías, hormonas tiroideas y hormona del crecimiento La glándula pituitaria segrega varias hormonas que cumplen un rol importante en la regulación del balance energético. Por lo tanto, hemos evaluado el efecto específico de alteraciones funcionales relacionadas con varias hormonas hipofisarias, y los consiguientes cambios en los ejes por ellas regulados, en la expresión de CB1 y GPR55.  Hormona estimulante de la glándula tiroides (Tirotropina-TSH).  Hormona folículo estimulante (FSH) y hormona luteinizante (LH); involucradas en la síntesis de las hormonas gonadales.  Hormona del crecimiento (GH); además de su papel en el crecimiento lineal, desempeña un papel importante en la homeostasis metabólica.  Hormona adrenocorticotrópica (ACTH); actúa sobre de la corteza suprarrenal, estimulándola para producir glucocorticoides, mineralocorticoides y esteroides gonadales. En primer lugar analizamos el rol de las glándulas adrenales. La eliminación de los glucocorticoides por adrenalectomía (ADX) reduce la ingesta y el peso corporal en roedores y previene la ganancia de peso en muchos modelos dietéticos y genéticos de obesidad (Andrews RC. & Walker BR., 1999). Para determinar si la expresión de CB1 y GPR55 se regula por glucocorticoides endógenos, las ratas fueron sometidas a una ADX. Encontramos que la expresión tanto de CB1 (Figura 13A) como de GPR55 (Figura 13B), no fue modificada después de la ADX, esto nos indica que los glucocorticoides no son importantes mediadores de estos dos receptores. En segundo lugar, cambios en la función hipofisaria producidos por las hormonas tiroideas tienen efectos importantes sobre la regulación del crecimiento, el desarrollo y el metabolismo y al ser potentes moduladores de la termogénesis adaptativa, pueden contribuir al desarrollo de la obesidad (Krotkiewski M., 2002). RESULTADOS 115 Así, en el caso de los estados hipertiroideos existe una ingesta aumentada y un gasto energético mayor (Krotkiewski M., 2002). En nuestros resultados se observa una disminución en la expresión de los niveles de ARNm del rCB1 en estados hipertiroideos, sin cambios en el grupo hipotiroidismo (Figura 13C). Aunque hubo una disminución en los niveles de expresión de ARNm de GPR55 (Figura 13D) en el grupo hipertiroideos ésta no fue significativa. Finalmente, la GH está implicada en diversos procesos metabólicos que afectan la composición corporal, influenciando el metabolismo de lípidos y de la glucosa (Rizza RA., et al 1982; Casanueva & Diéguez, 1998). Las ratas deficientes de GH (Dwarf) no mostraron diferencias en la expresión tanto de CB1 (Figura 13E) como de GPR55 (Figura 13F) al compararlas con las ratas control acordes a la edad, lo que sugiere que la falta de GH no es relevante en la expresión de estos dos receptores. A B C 0 0,5 1 1,5 2 2,5 SHAM ADX CB1 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 SHAM ADX GPR55 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 0,5 1 1,5 ** CB1 mRNA/18S mRNA (Unidades arbitrarias) GPR55 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 116 E F Figura 13. Efecto de los factores pituitarios sobre la expresión de CB1 y GPR55 en WAT. A y B. Análisis de la expresión génica de CB1 y GPR55 tras una adrenalectomía. C. Niveles de expresión de ARNm de CB1 en estados de hipotiroidismo (P<0,05). D. Niveles de expresión de GPR55 en wat de ratas hipertiroideas e hipotiroideas. E y F. Niveles de expresión de CB1 y GPR55 en ratas enanas o dwarf (deficientes de GH) respecto a sus controles (Lewis). Los valores representan la media, obtenida a partir de 8 animales por grupo, ± sem. * P<0.05, ** P<0,01. 6. Efecto de las gonadectomías sobre la expresión de CB1 y GPR55 en WAT Para caracterizar el efecto de las hormonas gonadales sobre la expresión de CB1 y GPR55, se midió la expresión del mensajero de estos dos genes en machos orquidectomizados y sus controles y en hembras ovariectomizadas y en sus controles, después de 2 semanas de la cirugía. Observamos una disminución muy marcada tanto en los niveles de expresión de CB1 como de GPR55 en machos orquidectomizados (Figura 14A y 14B). En las hembras, encontramos una disminución significativa en la expresión del receptor CB1 (Figura 14C) en las ratas ovariectomizadas. Por el contrario, la expresión de GPR55 (Figura 14D) en ratas ovariectomizadas aumenta levemente con respecto a sus controles sin llegar a ser significativo. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 mRNA CB1/mRNA 18S (unidades arbitrarias) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 mRNA GPR55/ mRNA 18S (unidades arbitrarias) RESULTADOS 117 MACHOS A B HEMBRAS C D Figura 14. Análisis del efecto de las gonadectomías (GDX) sobre los niveles de expresión de ARNm de CB1 y GPR55 en WAT. A y B. Niveles de expresión de CB1 y GPR55 en ratas macho orquidectomizados. C. Niveles bajos en la expresión de CB1 en ratas hembra ovariectomizadas (P<0,01). D. Expresión del mensajero para GRP55 en ratas hembra ovariectomizadas. Los valores representan la media, obtenida a partir de 8 animales por grupo, ± sem. **P<0,01. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 ** CB1mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 ** GPR55mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 ** 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 CB1 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) GPR55mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 118 II. REGULACION DE CB1 Y GPR55 EN HIGADO 1. Efecto del estado nutricional sobre la expresión de CB1 y GPR55 en hígado: ayuno y administración de leptina En muestras de hígado de ratas, encontramos una disminución significativa en los niveles de expresión de mRNA de CB1 y GPR55 que además es dependiente de la administración de leptina; adicionalmente tanto en estados de ayuno, como en episodios de restricción alimenticia, se observa incremento en la expresión de los dos genes (Figura 15). A B Figura 15. Expresión de ARNm de CB1 y GPR55 en hígado: ayuno y administración de leptina en hígado. A y B. Niveles de ARNm de CB1 y GPR55 dependiente de la administración de leptina e incremento de la expresión de los genes en estados de ayuno. Los valores representan la media, obtenida a partir de 8 animales por grupo, ± sem. *P<0,05, **P<0,01. 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 ** *** ** * * CB1 mRNA /18S mRNA (unidades arbitrarias) GPR55 mRNA /18S mRNA (unidades arbitrarias) RESULTADOS 119 2. Efecto de la restricción alimenticia sobre la expresión de CB1 y GPR55 en hígado Animales con restricción calórica crónica (se les alimenta con el 30% de lo que comen las ad libitum) a distintos tiempos, mostraron un incremento significativo en los niveles de expresión de ARNm tanto de CB1 (8 y 12 días) como de GPR55 (12 y 21 días) (Figura 16). A B Figura 16. Expresión del ARNm de CB1 y GPR55 en hígado ratas macho sometidas a restricción alimenticia. A. Niveles de expresión de ARNm de CB1 a los 12 días de restricción alimenticia. B. Expresión de ARNm de GPR55 con incremento significativo a los 12 y 21 días de restricción alimenticia. Los valores representan la media, obtenida a partir de 8 animales por grupo, ± sem. *P<0,05, **P<0,01. 3. Efecto de la dieta sobre la expresión de CB1 y GPR55 en hígado De manera contraria a lo observado en WAT, cuando los animales fueron sometidos a dos tipos de dieta (baja y alta en grasas), no encontramos cambios significativos en los niveles de expresión de CB1 y GPR55 en muestras de hígado de ratas alimentadas con dieta alta en grasa (Figura 17). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 C 8 12 21 días Ad libitum Restricción alimenticia * 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 C 8 12 21 días * ** CB1 mRNA /18S mRNA (unidades arbitrarias) GPR55 mRNA /18S mRNA (unidades arbitrarias) REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 120 A B Figura 17. Expresión de ARNm de CB1 y GPR55 en hígado de ratas macho, alimentadas con dieta baja y alta en grasa. A y B. Niveles de expresión de los mensajeros en animales alimentados con dos tipos de dieta; HF (Dieta alta en grasas o High Fat Diet) y LF (Dieta baja en grasas o Low Fat Diet). Los valores representan la media, obtenida a partir de 8 animales por grupo. 4. Efecto del desarrollo postnatal sobre la expresión de CB1 y GPR55 en hígado Aunque se observa un aumento en los niveles de ARNm de CB1 a los 60 y 90 días de desarrollo postnatal de machos, este incremento no llegó a ser significativo, con respecto a la expresión de GPR55, encontramos un aumento de los niveles de expresión a los 45 días, aumento que se revierte a los 60 y 90 días (Figura 18). Al igual que ocurre con el WAT donde se observan diferencias en la expresión de los dos genes dependiendo del género, en las muestras de hígado también se encontraron diferencias entre machos y hembras. En las hembras se da un aumento secuencial en los niveles del ARNm tanto de CB1 como de GPR55 y se da un incremento significativo a los 90 días (Figura 18C y 18D). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 LF HF 0 0,5 1 1,5 2 2,5 LF HF CB1 mRNA /18S mRNA (unidades arbitrarias) GPR55 mRNA /18S mRNA (unidades arbitrarias) RESULTADOS 121 MACHOS A B HEMBRAS C D Figura 18. Análisis de los niveles de ARNm de CB1 y GPR55 en hígado de machos y hembras de 24, 45, 60 y 90 días. A y B. Niveles de CB1 y GRP55 de ratas macho durante el desarrollo postnatal. C y D. Niveles del mensajero a los 90 días de desarrollo postnatal en ratas hembra. Los datos fueron normalizados por los niveles de 18S, como control interno y los resultados se expresan en unidades arbitrarias. Los valores representan la media, obtenida a partir de 8 animales por grupo. **P<0,01, *P<0,05. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 25 45 60 90 días CB1 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 25 45 60 90 días GPR55 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) 0 1 2 3 4 5 6 7 25 45 60 90 días 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 25 45 60 90 días ** * CB1 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) GPR55 mRNA /18S mRNA (Unidades arbitrarias) REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 128 Sin embargo, sí observamos un incremento en la cantidad de masa grasa (figura 24C), sin encontrar cambios en la masa no grasa (figura 24D). El hecho de observar cambios en la masa grasa, nos condujo a medir varias enzimas clave involucradas en el metabolismo de lípidos, transportadores de glucosa y adipoquinas implicadas en acciones inflamatorias. Encontramos que el tratamiento con O-1602 disminuye de forma específica los niveles de ARNm de la hormona sensible de lipasa (HSL) y los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT4 al ser comparados con las ratas control (vehículo) (Figura 24E). A B 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Ingesta Acumulada (g) V 0.04 0.4 (µg/h) 0 10 20 30 40 50 60 70 Ganancia de peso corporal (g) V 0.04 0.4 (µg/h) CD Cambios en la masa grasa (g) 0 1 2 3 4 5 6 7 8* V 0.04 0.4 (µg/h) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Cambios en la masa no grasa (g) V 0.04 0.4 (µg/h) RESULTADOS 129 Figura 24. Efectos de la administración i.c.v del O-1602. A. Efectos sobre la ingesta, de la administración i.cv de O-1602 a dosis de 0.04 y 0.4 µg/h/rata, durante 7 días. B. Efectos sobre el peso corporal de la administración i.cv de O-1602 a dosis de 0.04 y 0.4 µg/h/rata, durante 7 días. C. Efectos sobre la masa grasa de la administración i.cv de O-1602 a dosis de 0.04 y 0.4 µg/h/rata, durante 7 días. D. Efectos sobre la masa magra de la administración i.cv de O-1602 a dosis de 0.04 y 0.4 µg/h/rata, durante 7 días. E. Efectos de la administración i.cv de O-1602 (0.4 µg/h/rata), durante 7 días sobre la expresión de ARNm en tejido adiposo blanco gonadal de acetyl coenzima-A carboxylasa-α, fatty acid synthasa, SCD-1, LPL, CPT-1, hormona sensible de lipasa, adipose tryglyceride lipase, receptores adrenérgicos β1, Adr-β2, Adr-β3, peroxisoma proliferador-activado por receptor-γ, GLUT1, GLUT4, adiponectina, MCP1, factor de necrosis tumoralα, e interluquina-6. Los valores han sido normalizados con 18S, el cual es usado como gen control (housekeeping). Los valores representan la media obtenida a partir de 6 - 8 animales por grupo. *P<0,05 comparados con el grupo control. 2.2. Administración i.p crónica (7 días) de O-1602: Efectos sobre la ingesta, la composición corporal, parámetros metabólicos y el tejido adiposo blanco. El objetivo de este experimento fue evaluar si la administración i.p. continua de O-1602 podría inducir alteraciones en la ingesta de alimentos o en el peso corporal en ratas. Evehículo O-1602 0.4 µg/h FAS ACCα CPT1 SCD1 LPL 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 TNFα PPARγ IL6 * GLUT1 GLUT4 * ADIPONECTINA MCP1 Expresión de mRNA en WAT (unidades arbitrarias) β1-AR β2-AR β3-AR HSL * ATGL REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 130 Para ello, el O-1602 fue inyectado periféricamente a dosis de 0,1, 0,5 y 1 mg/kg cada día durante 1 semana. Encontramos que después de este período, el O-1602 no modificó ni la ingesta (figura 25A) ni el peso corporal (figura 25B). Sin embargo, si hubo un incremento en la masa grasa después del tratamiento con el O-1602 a dosis de 0.1mg/kg (figura 25C), sin cambios en la masa no grasa (figura 25D). Debido al aumento encontrado en la masa grasa, después de 1 semana de tratamiento se pesaron los depósitos de grasa retroperitoneal y visceral (figura 25E), encontrando un ligero pero no significativo aumento de peso en las ratas tratadas con el O-1602. Adicionalmente, medimos la expresión génica en WATg de varias enzimas clave involucradas en el metabolismo de lípidos, así como también, transportadores de glucosa y adipoquinas implicadas en acciones inflamatorias. Observamos que el tratamiento periférico con el O-1602 disminuye específicamente los niveles de la lipasa ATGL (adipose triglyceride lipase) e incrementa los niveles de interluquina-6 (IL-6) y el factor de necrosis tumoral (TNF)-α, al compararlas con las ratas control tratadas con vehículo (figura 25F). Por otra parte, usando calorimetría indirecta, no encontramos ninguna alteración en el gasto de energía total (figura 25G), ni en la actividad locomotora espontánea (figura25 H). Sin embargo, es interesante señalar que la administración periférica crónica del O-1602 dio lugar a un incremento del RQ (Cociente respiratorio) durante la fase nocturna (figura 25J), lo que sugiere una disminución en el porcentaje de grasa utilizada como sustrato energético. RESULTADOS 131 Peso corporal ganado (g) 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 V 0.1 0.5 1 (mg/kg) Ingesta acumulada (g) A 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 V 0.1 0.5 1 (mg/kg) B V 0.1 0.5 1 (mg/kg) Cambios en masa grasa (g) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 * C Cambios en masa no grasa (g) 0 5 10 15 20 25 30 V 0.1 0.5 1 (mg/kg) D E Peso de los depósitos de grasa (g) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 vehículo O-1602 0.1 mg/kg REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 132 FAS ACCα CPT1 SCD1 LPL vehículo O-1602 0.1 mg/kg PPARγ GLUT1 GLUT4 MCP1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 ADIPONECTINA Expresión de mRNA en WAT (unidades arbitrarias) F ATGL HSL β1-AR β2-AR β3-AR * TNFα 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 IL6 * 0 2 4 6 8 10 Expresión de mRNA en WAT (unidades arbitrarias) Expresión de mRNA en WAT (unidades arbitrarias) RESULTADOS 133 Figura 25: Efectos de la administración intraperitoneal crónica de O-1602 durante 7 días. A: Efectos sobre la ingesta acumulada de la administración i.p. crónica de O-1602 (0,1, 0,5 y 1 mg/kg). B: Resultados sobre el peso corporal de la administración i.p. crónica de O-1602 (0,1, 0,5 y 1 mg/kg). C: Cambios en la masa grasa producidos por la administración i.p. crónica de O-1602 (0,1, 0,5 y 1 mg/kg). D: Cambios en la masa no grasa producidos por la administración i.p. crónica de O-1602 (0,1, 0,5 y 1 mg/kg). E: Diferencias en depósitos grasos derivados de la administración i.p. crónica de O-1602 (0,1 mg/kg). F: Efectos de la administración i.p. crónica de O-1602 (0,1 mg/kg).sobre los niveles de expresión de ARNm de ACCα (acetyl coenzima-A carboxylasa-α), FAS (fatty acid synthasa), SCD-1, LPL, CPT-1, HSL (hormone sensitive lipase), ATGL (adipose tryglyceride lipase), Adrenérgico β1, Adr-β2, Adr-β3, PPARγ (peroxisoma proliferador-activated receptor-γ), GLUT1, GLUT4, adiponectina, MCP1, TNFα (tumour necrosis factor-α), e IL-6 (interlukin-6). Los valores han sido normalizados con 18S, el cual es usado como gen control (housekeeping). G: Efectos de la administración i.p. crónica de O-1602 durante 7 días (0,1 mg/Kg/día) sobre el consumo de energía. H: Efectos de la administración i.p. crónica de O-1602 (0,1 mg/Kg/día) sobre distintos parámetros metabólicos; actividad locomotora espontánea. I: Cociente respiratorio durante la fase diurna. J: Cociente respiratorio durante la fase nocturna. Los valores representan la media obtenida a partir de 6 - 8 animales por grupo. *P<0,05 comparados con el grupo control. G H 0 100 200 300 400 500 600 700 800 0 10000 20000 30000 40000 50000 Energía consumida (kcal/kg/72h) Actividad locomotora Total (rotura del rayo infrarrojo/48h) 0,72 0,73 0,74 0,75 0,76 0,77 0,78 0,76 0,77 0,78 0,79 0,8 0,81 0,82 * IJ RQ (vCO2/vO2 (fase diurna) RQ (vCO2/vO2 fase nocturna) REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 134 3. Efectos de O-1602 sobre adipocitos in vitro Después de demostrar que la administración crónica del O-1602 favorece el incremento de tejido adiposo in vivo, quisimos evaluar sus efectos directos sobre adipocitos. En primer lugar, analizamos si el O-1602 (10 y 100 µM) es capaz de movilizar calcio intracelular en adipocitos diferenciados de células 3T3L1, en la medida en que los niveles intracelulares de calcio se han asociado con lipogénesis en estas células (Gericke et al., 2009). Para este fin, los adipocitos fueron cargados con una sonda sensible al calcio, Fura-2, y después de la manipulación farmacológica con O-1602 se monitorizó el calcio intracelular. Encontramos que el O-1602 no movilizó (Ca2+)i a la dosis menor estudiada (10 µM) (figura 26A), pero provocó un importante y continuo aumento en el (Ca2+)i a 100 µM, (figura 26B). n = 34 células sensibles de tres experimentos independientes. Este ascenso en el (Ca2+)i podría estar relacionado con un aumento de actividad lipogénica (Gericke et al., 2009). Por consiguiente, para comprender este fenómeno, analizamos el efecto del tratamiento con O-1602 durante 10 días en cultivos de células 3T3-L1 durante la diferenciación en adipocitos. Como se muestra en las imágenes de la figura 26C, este tratamiento indujo un incremento en la acumulación de lípidos en comparación con las células no tratadas. La cuantificación de la incorporación del aceite rojo por fluorimetría, confirma esta observación, las células tratadas con O-1602exhibieron 2,8 veces más contenido de tinte que las células no tratadas (figura 26D). Por otra parte, hemos medido la expresión génica de tres marcadores de diferenciación adipocitaria como PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor), CEBP-α y CEBP-β (enhancer-binding protein alpha & beta). Encontramos que los niveles de expresión de ARNm de CEBP-α se incrementaron en las células tratadas con O-1602 (figura 26E), mientras que CEBP-β (figura 26F) y PPAR-γ (figura 26G) se mantuvieron sin cambios al compararlas con sus controles. RESULTADOS 135 Figura 26. Efectos de O-1602 sobre la movilización de (Ca2+)i en adipocitos diferenciados en células 3T3-L1. A y B. Lapso de tiempo de grabación de (Ca2+)i en adipocitos de células 3T3-L1, en ausencia y presencia de O-1602 a 10 μM (Fig. A) y 100 μM (Fig. B). Los datos se presentan como el índice promedio de la emisión de fluorescencia a 340 y 380 nm ± el error estándar de un promedio de 34 adipocitos de tres experimentos independientes. C. Representación de las imágenes fotografiadas de los adipocitos diferenciados en células 3T3-L1 durante 10 días en ausencia (panel izquierdo) y presencia de O-1602 a 10 μM (panel derecho), las imágenes son teñidas con aceite rojo (Oil Red O). Barra de escala, 100 μM. D. Cuantificación fluorimétrica de la tinción en aceite rojo de la diferenciación de adipocitos en células 3T3-L1 al cumplirse el día 10 de tratamiento en ausencia o presencia de O-1602 (10 μM). E, F y G. Expresión de ARNm de CEBP-α, CEBP-β y PPAR-γ en adipocitos diferenciados de células 3T3-L1 durante 10 días, en ausencia y presencia de 10 μM de O-1602. Los valores se representan como el promedio ± del error estándar de los tres experimentos independientes. ∗P < 0,05. B 100 µM O-1602 A 10 µM O-1602 C Control 10 M O-1602 D ** Tinción con aceite rojo (OD a 500 nm) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 C O-1602 Expresión de ARNm de PPARγ (unidades arbitrarias) G E F Expresión de ARNm de CEBPα (unidades arbitrarias) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 C O-1602 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Expresión de ARNm de CEBPβ (unidades arbitrarias) C O-1602 * REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 136 IV. EFECTOS METABÓLICOS DE LA ADMINISTRACIÓN DE LPI 1. Efectos de la administración aguda de LPI 1.1. Administración central i.c.v de LPI Al igual que con O-1602, las ratas fueron tratadas con LPI a dosis de 0.02, 0.1 y 0.5 µg/rata (figura 27) y se administró de manera aguda a nivel central i.c.v. Encontramos que la administración de LPI no alteró el comportamiento alimenticio (figura 27). Figura 27. Efecto de la administración central aguda i.c.v de LPI sobre la ingesta acumulada. Ingesta en ratas tratadas con LPI (0.2, 0.1, 0.5 µg). Los valores representan la media obtenida a partir de 6 - 8 animales por grupo. Vehículo LPI 0.02 µg LPI 0.1 µg LPI 0.5 µg 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1h 2h 4h 6h 24h Ingesta acumulada (g) 11 13 15 17 19 21 23 25 RESULTADOS 137 1.2. Administración i.p. aguda de LPI Al administrar LPI periféricamente encontramos que la dosis más baja utilizada 2 µg/kg (Figura 28) estimula la ingesta, aunque no de manera significativa; mientras que cuando las ratas son tratadas con dosis más elevadas de LPI i.p. (20 y 200 µg/kg); no se observa ningún cambio sobre la ingesta. Figura 28. Efecto de la administración periférica aguda de LPI sobre la ingesta acumulada. Los valores representan la media obtenida a partir de 6 - 8 animales por grupo. 2. Administración i.p. crónica (7 días) de LPI. Efectos sobre la ingesta, la composición corporal y el tejido adiposo blanco De la misma forma como analizamos los cambios producidos por la administración i.p. crónica de O-1602 sobre la ingesta y el peso corporal, quisimos evaluar los efectos del otro ligando de GPR55, LPI, usando las mismas dosis (0.1, 0.5 and 1 mg/kg). El LPI se administró a las ratas intraperitonealmente cada día durante 1 semana. Al finalizar 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Ingesta acumulada (g) 0 5 10 15 20 25 30 1h 2h 4h 6h 24h Vehículo LPI 2 µg/kg LPI 20 µg/kg LPI 200 µg/kg REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 144 F Expresión relativa de GPR55 en tejido adiposo visceral NG IG DT2 0 * 0,5 1 1,5 2 2,5 n=35 n=17 n=12 Expresión relativa de CB1en tejido adiposo subcutáneo E 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2# * ** n=5 n=20 n=17 n=17 N NG IG DT2 Niveles relativos de proteína de GPR55 en tejido adiposo G Delgados Obesos GPR55 β-actina Delgados Obesos 0 50 100 150 200 250 300 350 400 ## n=5 n=7 Niveles relativos de proteína de GPR55 en tejido adiposo visceral GPR55 β-actina NG IG DT2 H 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 NG IG DT2 * n=4 n=4 n=4 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Visc Subc Expresión relativa de GPR55 * I n=8 n=8 0 20 40 60 80 100 120 Visc Subc ** Niveles relativos de proteína de GPR55 J GPR55 β-actina Visc Subc n=8n=8 RESULTADOS 145 Figura 32. Regulación de GPR55, CB1 y CB2 en tejido adiposo blanco de humanos. A. Niveles de expresión de ARNm de GPR55, B. CB1 y C. CB2 en tejido adiposo visceral obtenido de sujetos delgados y obesos en la cohorte 1. D. Niveles de expresión de ARNm de GPR55 y E. CB1 en tejido adiposo subcutáneo obtenido de sujetos delgados y obesos en la cohorte 1. F. Niveles de expresión de ARNm de GPR55 en tejido adiposo visceral obtenido de sujetos delgados y obesos en la cohorte 2. G. Niveles de proteína de GPR55 en tejido adiposo visceral de sujetos delgados y obesos en la cohorte 2. H. Niveles de proteína de GPR55 en tejido adiposo visceral de pacientes obesos NG, IG y con diabetes tipo 2 en la cohorte 1. I. Niveles de expresión de ARNm de GPR55 en grasa visceral y subcutánea obtenido de sujetos obesos. J. Niveles de proteína de GPR55 en grasa visceral y subcutánea obtenido de sujetos obesos. K. Niveles de expresión de ARNm de CB1 en grasa visceral y subcutánea obtenido de sujetos obesos. Los sujetos obesos fueron subclasificados en normoglicémicos (NG), intolerantes a la glucosa (IG) y diabéticos tipo 2 (DT2). Los valores de ARNm relativo fueron normalizados con los valores de los grupos (normoglicémicos NG), DT2; Visc, visceral; Subc, subcutáneo. #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs. Sujetos delgados; *P < 0.05, **P < 0.01 vs. NG. 2. Correlaciones para GPR55 y CB1 en tejido adiposo blanco con diferentes factores metabólicos En un análisis de regresión lineal multivariante, el IMC surgió como un predictor significativo de la expresión de GPR55, excepto en hombres de la cohorte 2 (Tabla 9). La expresión de GPR55 en el tejido adiposo visceral de los sujetos de la cohorte 1, guarda una correlación positiva con el peso corporal (figura 33A), el índice de masa 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Expresión relativa de CB1 Visc Subc ** K n=8 n=8 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 146 corporal (figura 33B), los niveles circulantes de LPI (figura 33C) y el porcentaje de grasa (tabla 10). Adicionalmente, teniendo en cuenta la variabilidad de género en los grupos, se realizó un análisis para verificar si las diferencias observadas se explican con esta variable. La correlación fue hecha considerando solo hombres o mujeres. Los resultados mostraron una correlación positiva entre la expresión de GPR55 en el tejido adiposo visceral y el IMC en ambos sexos (tabla 10). Por otra parte, no encontramos correlación entre los niveles de ARNm de GPR55 en tejido adiposo subcutáneo y las variables estudiadas (tabla 10). De manera contraria a GPR55, la expresión de CB1 en tejido adiposo visceral no se correlaciona con el IMC (tabla 11), aunque en tejido adiposo subcutáneo, la expresión de CB1 sí se correlaciona con este parámetro pero solamente en mujeres (tabla 11). Paralelamente a la cohorte 1, los niveles de ARNm de GPR55 en tejido adiposo visceral están asociados positivamente con el peso corporal (figura 33D), el IMC (figura 33E), y el porcentaje de grasa (Tabla 12) en los sujetos de la cohorte 2. La correlación de la expresión de GPR55 con el peso corporal, el índice de masa corporal y el porcentaje de grasa fue especialmente significativa en las mujeres de ambas cohortes (Tablas 10 y 12). RESULTADOS 147 Tabla 9. Análisis de regresión lineal multivariante para la expresión de GPR55 en tejido adiposo visceral como variable dependiente Beta es el coeficiente de regresión estándar. r2 representa el ajuste de R cuadrada. Diabetes tipo 2 es una variable (diabetes = 0 vs no diabetes = 1) y se la diagnosticó a partir de la medición de glicemia en ayunas. Cohorte 1 Niveles de mRNA de GPR55en hombres Tejido adiposo Visceral r2=0.358; P=0.043 Tejido adiposo Subcutáneo r2=-0.049; P=0.549 β P β P Edad -0.07 0.778 0.37 0.70 IMC 0.50 0.020 0.35 0.42 Trigliceridos 1.07 0.025 1.02 0.37 Colesterol - Total -0.34 0.188 -0.12 0.89 HOMA -0.71 0.114 -0.98 0.26 Niveles de mRNA de GPR55en mujeres Tejido adiposo Visceral r2=0.207; P=0.026 Tejido adiposo Subcutáneo r2=-0.098; P=0.771 β P β P Edad 0.03 0.856 0.19 0.459 IMC 0.42 0.018 0.10 0.698 HOMA 2.58 0.134 0.20 0.411 Cohorte 2 Niveles de mRNA de GPR55en hombres Tejido adiposo Visceral r2=-0.018; P=0.46 Tejido adiposo Subcutáneo r2=0.084; P=0.28 β P β P Edad 0.12 0.653 0.18 0.566 IMC 0.32 0.277 0.63 0.077 Diabetes Tipo 2 0.19 0.445 -0.28 0.325 Niveles de mRNA de GPR55en mujeres Tejido adiposo Visceral r2=0.054; P=0.16 Tejido adiposo Subcutáneo r2=0.066 P=0.089 β P β P Edad 0.009 0.951 -0.078 0.563 IMC 0.331 0.032 0.292 0.036 Diabetes Tipo 2 0.080 0.599 -0.183 0.184 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 148 Tabla 10. Correlaciones entre la expresión de GPR55 en tejido visceral y subcutáneo y parámetros metabólicos seleccionados, para los sujetos de la cohorte 1 GPR55 en tejido adiposo visceral Hombres (n=25) Mujeres (n=30) Pearson p Pearson p Peso 0.33 0.052 0.49 0.0024** Indice de Masa Corporal 0.34 0.046* 0.42 0.0095** Porcentaje de grasa 0.15 0.242 0.33 0.035* Glucosa 0.25 0.158 0.10 0.297 Insulina 0.42 0.045* 0.27 0.095 TGs 0.60 0.004** -0.02 0.539 Col. Total -0.29 0.870 -0.10 0.694 Col. LDL. -0.55 0.987 -0.08 0.671 Col. HDL. -0.35 0.912 -0.04 0.588 Leptins 0.34 0.107 0.32 0.100 LPI 0.39 0.028* 0.20 0.130 HOMA-IR 0.28 0.11 0.35 0.02* GPR55 en tejido adiposo subcutáneo Hombres (n=25) Mujeres (n=30) Pearson p Pearson p Peso 0.27 0.118 -0.09 0.684 Indice de Masa Corporal -0.06 0.61 -0.05 0.600 Porcentaje de grasa Fat % 0.35 0.062 -0.20 0.846 Glucosa 0.17 0.257 0.31 0.080 Insulina -0.34 0.869 0.04 0.419 TGs 0.003 0.496 -0.07 0.622 Col. Total 0.31 0.147 -0.14 0.728 Col. LDL. 0.36 0.128 -0.07 0.622 Col. HDL. -0.07 0.595 -0.31 0.906 Leptina -0.13 0.68 -0.10 0.661 LPI -0.21 0.792 -0.21 0.846 HOMA-IR -0.19 0.73 0.08 0.35 RESULTADOS 149 Tabla 11. Correlaciones entre la expresión de CB1 en tejido visceral y subcutáneo y parámetros metabólicos seleccionados, para los sujetos de la cohorte 1 Tabla 12. Correlaciones entre la expresión de GPR55 en tejido visceral y parámetros metabólicos seleccionados, para los sujetos de la cohorte 2. CB1 en tejido adiposo visceral Hombres (n=25) Mujeres (n=30) Pearson p Pearson p Weight 0.13 0.269 0.22 0.112 BMI 0.24 0.116 0.17 0.179 Fat % 0.18 0.200 0.36 0.022* Glucose 0.51 0.014* 0.06 0.372 Insulin 0.21 0.215 -0.13 0.743 TGs 0.29 0.128 0.02 0.448 Total Chol. -0.37 0.931 0.07 0.361 LDL Chol. -0.27 0.849 0.03 0.432 HDL Chol. -0.17 0.740 0.18 0.173 Leptin 0.55 0.014* 0.13 0.309 CB1 en tejido adiposo subcutáneo Hombres (n=25) Mujeres (n=30) Pearson p Pearson p Weight -0.13 0.723 0.40 0.017* BMI -0.23 0.852 0.46 0.007** Fat % -0.05 0.587 0.06 0.381 Glucose 0.05 0.420 0.31 0.083 Insulin 0.42 0.067 -0.14 0.725 TGs -0.02 0.530 0.34 0.066 Total Chol. 0.27 0.190 -0.10 0.666 LDL Chol. 0.34 0.141 -0.03 0.562 HDL Chol. -0.09 0.619 -0.62 0.998 Leptin -0.17 0.725 0.48 0.017* Hombres (n=20) Mujeres (n=44) Pearson p Pearson p Peso 0,26 0.27 0.39 0.01* IMC 0.29 0.21 0.31 0.03* % Grasa 0.3 0.19 0.32 0.03* Glucosa 0.32 0.17 0.07 0.64 Insulina 0.46 0.3 -0.03 0.9 TGs 0.15 0.5 -0.03 0.86 Col. Total -0.06 0.82 -0.07 0.64 Col. LDL -0.09 0.75 -0.27 0.057 HOMA-IR 0.43 0.33 -0.03 0.85 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 150 Cohorte 1 hombres mujeres Expresión relativa de GPR55 en tejido adiposo visceral Peso corporal (kg) p<0.001, r = 0.41, n = 55 A 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 50 75 100 125 150 175 200 Indicede masa corporal (kg/m2) p<0.01, r = 0.35, n = 55 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 20 40 60 80 B Expresión relativa de GPR55 en tejido adiposo visceral hombres mujeres 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 0500 1000 1500 hombres mujeres Expresión relativa de GPR55 en tejido adiposo visceral Niveles de LPI (nmol/L) p<0.05, r = 0.24, n = 55 C RESULTADOS 151 Figura 33. Correlación de GPR55 en tejido adiposo visceral con diferentes factores metabólicos en los sujetos de la cohorte 1. A. Correlación de la expresión de ARNm de GPR55 en tejido adiposo visceral con el peso corporal. B. Correlación del índice de masa corporal con la expresión de ARNm de GPR55. C. Correlación de la expresión de ARNm de GPR55 con los niveles circulantes de LPI. Las correlaciones usadas en la cohorte 1 se realizaron teniendo en cuenta solo los individuos obesos y el valor usado como parámetro para el diagnóstico de la obesidad fue un índice de masa corporal (IMC) > 30 Kg/m2. D. Correlación entre GPR55 en tejido adiposo visceral y peso corporal. E. Correlación entre el índice de masa corporal y la expresión de GPR55. 3. Expresión relativa de ARNm de GPR55 en adipocitos versus fracción vascular estromal Quisimos estudiar adicionalmente donde se expresaba el GPR55. Para este fin, hemos utilizado grasa visceral de humanos y hemos separado la fracción vascular estromal de los adipocitos. Para corroborar la eficiencia de esta separación, comprobamos que los niveles de expresión de los genes adipogénicos (FASN, ACC y SREBP) son más elevados en los adipocitos que en la FEV (Fig. 34A, 34B y 34C Cohorte 2 E p=0.02, r = 0.29, n = 64 Expesión relativa de GPR55 en tejido adiposo visceral Indicede masa corporal (kg/m2) hombres mujeres D p=0.01, r = 0.33, n = 64 Peso corporal (kg) Expesión relativa de GPR55 en tejido adiposo visceral hombres mujeres 50 75 100 125 150 175 200 20 40 60 70 30 50 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL RECEPTOR GPR55 EN LA HOMEOSTASIS ENERGÉTICA Y METABÓLICA 152 respectivamente). Por el contrario, la expresión del gen CD14 (Monocyte differentiation antigen) fue significativamente mayor en la fracción vascular estromal (Fig. 34D). El GPR55 se localiza de forma similar tanto en adipocitos como en la FEV (Fig. 34E). 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 FEV Adipocitos Expresión génica de FASN A *** 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0.05 FEV Adipocitos Expresión génica de ACC B *** 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 FEV Adipocitos Expresión génica de SREBP 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 FEV Adipocitos Expresión génica de CD14 CD *** ** RESULTADOS 153 Figura 34. Expresión relativa de ARNm en adipocitos versus fracción vascular estromal de humanos. A. Niveles de expresión de ARNm de FASN en adipocitos humanos. B. Niveles de ARNm de ACC en la fracción vascular estromal y adipocitos de humanos. C. Incremento significativo de la expresión génica de SREBP en adipocitos de humanos con respecto a la fracción vascular estromal. D. Niveles de expresión de ARNm de CD14 en fracción del estroma vascular y adipocitos. E. Expresión de GPR55 en fracción del estroma vascular y adipocitos. ** P<0.01, *** P<0.001. 4. Niveles circulantes de LPI total 4.1. Niveles circulantes de LPI en sujetos delgados y obesos Al evaluar los niveles circulantes en plasma de LPI, el único ligando endógeno conocido de GPR55, en sujetos delgados y obesos de la cohorte 1; encontramos que los niveles de LPI total fueron significativamente mayores en los pacientes obesos en comparación con los sujetos delgados (Figura 35A). Del mismo modo, que los niveles plasmáticos de LPI total, se observa que en las tres formas circulantes de LPI medidas – LPI 16.0 (Figura 35B), LPI 18.0 (Figura 35C) y LPI 20.4 (Figura 35D), también se incrementaron en los tres grupos de pacientes obesos cuando son comparados con los sujetos delgados. FEV Adipocitos 0 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 0.0006 0.0007 0.0008 0.0009 Expresión génica de GPR55 E