Identificación de nuevos biomarcadores y dianas farmacológicas anti-plaquetarias en infarto agudo de miocardio

Paula Vélez Viéitez Santiago de Compostela, 2016 Universidade de Santiago de Compostela Departamento de Farmacoloxía UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN MEDICINA MOLECULAR E ENFERMIDADES CRÓNICAS (CiMUS), DEPARTAMENTO DE FARMACOLOXÍA E INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN SANITARIA DE SANTIAGO DE COMPOSTELA (IDIS) Tesis doctoral Identificación de nuevos biomarcadores y dianas farmacológicas anti-plaquetarias en infarto agudo de miocardio Paula Vélez Viéitez Santiago de Compostela, 2016 Imagen de portada reproducida con licencia de SciencePhotoLibrary. © 2013 Science Photo Library Ltd. 327-329 Harrow Road, London, UK, W9 3RB (http://www.sciencephoto.com) La doctoranda ha sido receptora de una beca predoctoral de la Fundación Ramón Domínguez para la Investigación, el Desarrollo y la Innovación biosanitaria. Esta tesis ha sido realizada gracias a la financiación del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), con cofinanciación del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), ref. SAF2013-45014-R. Dr. Ángel García Alonso Profesor Contratado Doctor Departamento de Farmacología Líder del Grupo “Proteómica de Plaquetas” IDIS-CIMUS Universidade de Santiago de Compostela Centro de Investigación en Medicina Molecular y Enfermedades Crónicas (CIMUS) Avda Barcelona s/n 15782 Santiago de Compostela Tel. 881815429 e-mail: [email protected] Don Ángel García Alonso, Profesor Contratado Doctor del Departamento de Farmacología de la Universidade de Santiago de Compostela (USC), y Don José María García Acuña, Profesor Asociado del Departamento de Medicina de la USC INFORMAN Que Dña. Paula Vélez Viéitez, licenciada en Ciencias Biológicas por la Universidade de Santiago de Compostela, ha realizado bajo su dirección el trabajo titulado: “IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS BIOMARCADORES Y DIANAS FARMACOLÓGICAS ANTI-PLAQUETARIAS EN INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO”, que presenta como Tesis Doctoral para obtener el grado de Doctora por la Universidade de Santiago de Compostela. Revisado el presente trabajo, estiman que se corresponde fielmente a los resultados obtenidos, además de haberse evaluado por otros expertos, lo que dio lugar a su publicación en reconocidas revistas internacionales. Por ello, dan su conformidad a su presentación para ser juzgada por el tribunal correspondiente. Y para que así conste a los efectos oportunos, en cumplimiento con las disposiciones vigentes, firman el presente en Santiago de Compostela, a 7 de junio de 2016. Directores: Dr. Ángel García Alonso Dr. José María García Acuña Agradecimientos Resultaría complejo nombrar a todas las personas que de un modo u otro han contribuido a la realización de esta tesis. No ha sido un camino fácil, pero con la ayuda y apoyo de todas ellas este largo proceso ha ido tomando forma hasta convertirse en lo que hoy aquí presento. Un agradecimiento especial debo al Prof. Ángel García Alonso y al Dr. José María García Acuña, mis directores de tesis, quienes han apoyado y dirigido mi labor científica de manera incansable e intachable. Gracias a ellos he aprendido que el esfuerzo, el compromiso, la dedicación y como no, la perseverancia, son pilares básicos en una carrera investigadora. No puedo olvidar a todos los colaboradores del Servicio de Cardiología del CHUS, enfermeras y doctores, por el empeño en la toma de muestras esenciales para esta tesis, pero sobre todo por comprender y demostrar que su implicación es esencial para el desarrollo de cualquier investigación en el campo de la biomedicina. Por lo anteriormente dicho, un agradecimiento especial al Dr. González-Juanatey. Agradecer también a la Prof. Mabel Loza y al grupo de investigación BioFarma por su implicación en lo relacionado con la búsqueda de fármacos. A mis ya más que compañeros de laboratorio (Isaac, Irene y María) por la generosidad que han mostrado en innumerables ocasiones, pero sobre todo por demostrarme una vez más que el trabajo en equipo siempre origina los mejores resultados. En especial a Isaac por su paciencia, por no haber dudado en compartir todo su conocimiento y experiencia conmigo, y por demostrar ser mucho más que un compañero. A mi familia por el interés con el que cada día se preocuparon por mis avances y por la paciencia que han demostrado en más de una ocasión. De manera especial a mi madre por haberme proporcionado las mejores lecciones de vida y, en definitiva, por ser la promotora de mis sueños. A mi abuela, por ser mi gran inspiración para esforzarme y superarme cada día, aun cuando ya no la tengo cerca. A Alex por haber sabido compartir mi pasión y comprender mis frustraciones, por estar siempre ahí. A todos aquellos amigos que han logrado levantarme el ánimo en momentos de flaqueza. Índices vii vii Índices Índice general Página Abreviaturas xv 1 Introducción 1 1.1 Plaquetas 3 1.1.1 Definición y biogénesis 4 1.1.2 Subpoblaciones de plaquetas 4 1.1.3 Estructura de las plaquetas 5 1.1.4 Receptores plaquetarios 6 1.1.5 Principales vías de secreción plaquetaria 7 1.1.5.1 Vía clásica de secreción de proteínas 7 1.1.5.2 Vías alternativas de secreción de proteínas. Microvesículas e importancia de su estudio 8 1.1.6 Función plaquetaria 9 1.1.6.1 Funciones fisiológicas de las plaquetas 9 1.1.6.2 Funciones patológicas de las plaquetas 11 1.2 El receptor de colágeno GPVI: función y relevancia como diana farmacológica 19 1.2.1 Estructura del complejo GPVI/ FcRγ 19 1.2.2 Agonistas de GPVI: endógenos y exógenos 20 1.2.3 Vía de señalización de GPVI 22 1.2.4 Papel de GPVI en trombosis y hemostasia 23 1.2.5 Inhibición de la activación de GPVI 24 1.3 Proteómica 29 1.3.1 Introducción a la proteómica 29 1.3.2 Diseño experimental en estudios cardiovasculares de proteómica de plaquetas 31 1.3.3 Técnicas de separación de proteínas 34 1.3.3.1 La electroforesis bidimensional diferencial en gel, 2D-DIGE 34 1.3.4 Técnicas analíticas en proteómica: la espectrometría de masas 38 1.4 Importancia de los estudios de proteómica de plaquetas 42 1.4.1 Análisis del proteoma total 44 1.4.2 Análisis de las modificaciones postraduccionales 44 1.4.3 Análisis de los subproteomas 46 1.4.4 Proteómica de plaquetas en enfermedades cardiovasculares 49 viii Índices 2. Objetivos 53 3. Material y Métodos 59 3.1 Material 61 3.2 Métodos 62 3.2.1 Selección de muestras 62 3.2.1.1 Características de los pacientes y recogida de muestras 62 3.2.1.2 Características de los donantes sanos y recogida de muestras 63 3.2.2 Aislamiento de plaquetas 64 3.2.3 Activación e inhibición de plaquetas 66 3.2.3.1 Activación para estudios de agregación 66 3.2.3.2 Activación para estudios bioquímicos 66 3.2.3.3 Inhibición de GPVI 67 3.2.4 Precipitación de proteína a partir de lisados de plaquetas para estudios proteómicos por 2D-DIGE 68 3.2.5 Inmunoprecipitación de proteína para estudios proteómicos 68 3.2.6 Preparación de plasmas y aislamiento de microvesículas 69 3.2.7 Cuantificación de proteína 70 3.2.8 Estudios de proteómica 71 3.2.8.1 Electroforesis monodimensional (1D-SDS-PAGE) 71 3.2.8.2 Electroforesis bidimensional 2D-DIGE 71 3.2.8.3 Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas 77 3.2.9 Estudios de validación 80 3.2.9.1 Inmunoprecipitaciones 80 3.2.9.2 Inmunodetecciones 80 3.2.10 Análisis estadísticos 83 3.2.11 Análisis de biología de sistemas 84 3.2.12 Estudios para caracterización de MVs 85 3.2.13 Búsqueda de pequeños inhibidores de GPVI 86 4. Resultados 89 4.1 Estudio de las microvesículas del plasma de pacientes con IAMCEST 91 4.1.1 Características de pacientes y controles 91 4.1.2 Caracterización de las microvesículas del plasma 91 4.1.3 Análisis proteómico 2D-DIGE 92 4.1.4 Identificación de proteínas 96 4.1.5 Validación de los resultados 100 4.1.6 Análisis de biología de sistemas 103 ix Índices 4.2 Estudio de las plaquetas de pacientes con IAMCEST obtenidas de sangre arterial en contacto con el trombo 105 4.2.1 Características de los pacientes 105 4.2.2 Análisis proteómico 2D-DIGE 105 4.2.3 Identificación de proteínas 108 4.2.4 Validación de los resultados 109 4.3 Estudios de la vía de señalización de GPVI en pacientes con IAMCEST 114 4.3.1 Estudio de la vía de señalización de GPVI en sangre venosa de pacientes con IAMCEST 114 4.3.1.1 Características de pacientes y controles 114 4.3.1.2 Análisis proteómico 114 4.3.1.3 Identificación de proteínas 117 4.3.1.4 Validación de los resultados. Las formas pTyr de PLCγ2, SLP76, DOK2 y G6F están aumentadas en plaquetas de sangre venosa de pacientes con IAMCEST activadas con CRP 118 4.3.1.5 Estudio piloto de agregación 120 4.3.2 Estudio de la vía de señalización de GPVI en sangre arterial de pacientes con IAMCEST 122 4.3.2.1 Características de pacientes 122 4.3.2.2 Inmunodetecciones. Las formas pTyr de PLCγ2, SLP76, DOK2 y G6F están aumentadas en plaquetas de sangre arterial de pacientes con IAMCEST activadas con CRP 123 4.4 Estudios de inhibición de la vía de señalización de GPVI 125 4.4.1 Inhibición de la vía de señalización de GPVI mediante el fragmento Fab del anticuerpo OM2 125 4.4.1.1 Estudios de agregación en donantes sanos 126 4.4.1.2 Estudios bioquímicos en donantes sanos 127 4.4.2 Estudio de la agregación plaquetaria inducida por colágeno y CRP e inhibición de la misma con inhibidores específicos de los principales receptores de colágeno 128 4.4.3 Búsqueda de pequeños inhibidores de GPVI 129 5. Discusión 133 5.1 Estudio de las microvesículas del plasma de pacientes con IAMCEST 135 5.2 Estudio de las plaquetas de pacientes con IAMCEST obtenidas de sangre arterial en contacto con el trombo 140 x Índices 5.3 Estudios de la vía de señalización de GPVI en pacientes con IAMCEST 145 5.4 Estudios de inhibición de la vía de señalización de GPVI 149 6. Conclusiones 153 6.1 Estudio de las microvesículas del plasma de pacientes con IAMCEST 155 6.2 Estudio de las plaquetas de pacientes con IAMCEST obtenidas de sangre arterial en contacto con el trombo 156 6.3 Estudios de la vía de señalización de GPVI en pacientes con IAMCEST 157 6.4 Estudios de inhibición de la vía de señalización de GPVI 158 7. Bibliografía 159 8. Anexos 195 Anexo I. Composición de tampones y soluciones empleadas. 197 Anexo II. Versiones extendidas de las tablas de características clínicas de los pacientes. Tablas suplementarias 199 Anexo III. Lista de publicaciones realizadas durante el desarrollo de la presente tesis doctoral. Tablas suplementarias 207 Anexo IV. Versiones extendidas de las tablas de proteómica CD Anexo V. Imágenes de alta resolución, geles 2D-DIGE CD xi Índices Índice de figuras Página Figura 1 - Diagrama de la estructura básica de las plaquetas. 6 Figura 2 - Fases de activación plaquetaria: adhesión, activación y agregación. 11 Figura 3 - Clasificación de las cardiopatías isquémicas. 16 Figura 4 - Principales fármacos antiplaquetarios y sus dianas. 18 Figura 5 - El receptor de colágeno GPVI. 20 Figura 6 - Vía de señalización de la glicoproteína VI (GPVI). 22 Figura 7 - Disciplinas científicas que convergen para la formación de la biología de sistemas. 30 Figura 8 - Flujo de trabajo esquemático para estudios de proteómica de plaquetas en enfermedades cardiovasculares. 33 Figura 9 - Representación esquemática de la técnica 2D-DIGE. 37 Figura 10 - Elementos que conforman un espectrómetro de masas. 39 Figura 11 - Tipos de espectrómetros de masas comúnmente utilizados en proteómica. 40 Figura 12 - Aplicaciones actuales y futuras de la proteómica de plaquetas. 43 Figura 13 - Diagrama representativo del método de aislamiento de plaquetas. 65 Figura 14 - Proceso de análisis de imagen con SameSpots v4.5. 75 Figura 15 - Caracterización de las MVs del plasma. 91 Figura 16 - Estimación del porcentaje, en volumen, de cada subpoblación de MVs por dispersión dinámica de luz. 92 Figura 17 - Análisis proteómico de alta resolución 2D-DIGE. Comparativa de MVs plasmáticas de pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST. Imagen representativa de un análisis 2D-DIGE donde se superpone la emisión de los fluoróforos Cy3 y Cy5. 94 Figura 18 - Análisis de imagen diferencial. Comparativa de MVs plasmáticas de pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST. Imagen representativa del análisis en escala de grises. 95 Figura 19 - Validaciones por inmunodetección de α2-macroglobulina, fibrinógeno y viperina. 102 Figura 20 - Estudio de MVs plasmáticas de pacientes con IAMCEST: análisis de redes de las proteínas reguladas diferencialmente mediante el software Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity systems). 103 xii Índices Figura 21 - Las proteínas reguladas diferencialmente están directamente relacionadas con infarto y con aterosclerosis. 104 Figura 22 - Análisis de imagen diferencial 2D-DIGE. Comparativa entre el proteoma de plaquetas procedentes de la arteria coronaria obstruida y el proteoma de plaquetas procedentes de la arteria radial. Imagen representativa del análisis en escala de grises. 107 Figura 23 - ITA2B y SKAP2 están sobreexpresadas en las plaquetas intracoronarias de pacientes con IAMCEST. 112 Figura 24 - Figure 24. Validaciones por inmunodetección de TSP-1 y talina-1. TSP-1 y talina-1 están reguladas diferencialmente en las plaquetas intracoronarias. 113 Figura 25 - Análisis de la vía de señalización de GPVI en plaquetas de pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST: proteínas fosforiladas en residuos tirosina. 116 Figura 26 - La activación de la vía de señalización de GPVI esta aumentada en plaquetas de pacientes con IAMCEST. 119 Figura 27 - La agregación plaquetaria inducida por la activación de GPVI es mayor en pacientes con IAMCEST. 121 Figura 28 - La activación de la vía de señalización de GPVI está aumentada en plaquetas en contacto directo con el trombo. 124 Figura 29 - Porcentaje de agregación inducida por diferentes agonistas. 126 Figura 30 - Porcentaje de agregación tras la inhibición con Fab-OM2. 127 Figura 31 - Análisis bioquímico de la vía de señalización de GPVI: inhibición con diferentes dosis de Fab-OM2 tras la activación plaquetaria con CRP 5µg/mL. 128 Figura 32 - Efecto de los inhibidores de GPVI y α2β1 en la agregación inducida por colágeno y CRP. 129 Figura 33 - Efecto del inhibidor Fab-OM2 en los niveles de calcio intracelular tras la activación plaquetaria con CRP. 130 xiii Índices Índice de tablas Página Tabla 1 - Principales receptores plaquetarios: agonistas y características. 7 Tabla 2 - Tipos de marcaje para 2D-DIGE: marcaje mínimo y marcaje de saturación. 36 Tabla 3 - Lista de materiales utilizados y casas comerciales. 61 Tabla 4 - Lista de anticuerpos primarios y secundarios utilizados para las inmunoprecipitaciones e inmunodetecciones. 83 Tabla 5 - Características clínicas de los pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST incluidos en el estudio proteómico de MVs. Versión reducida. 93 Tabla 6 - Lista de manchas proteicas identificadas en el estudio de MVs acompañadas de sus identificaciones. Version reducida. 96 Tabla 7 - Características clínicas de los pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST incluidos en el las validaciones del estudio de MVs. Versión reducida. 100 Tabla 8 - Características clínicas de los pacientes con IAMCEST incluidos en el estudio proteómico intracoronario. Versión reducida. 106 Tabla 9 - Lista de manchas proteicas identificadas en el estudio de intracoronaria acompañadas de sus identificaciones. Versión reducida. 108 Tabla 10 - Características clínicas de los pacientes con IAMCEST incluídos en las validaciones del estudio intracoronario. Versión reducida. 109 Tabla 11 - Características clínicas de los pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST incluidos en el estudio proteómico de la vía de señalización de GPVI. Versión reducida. 115 Tabla 12 - Lista de proteínas identificadas en el estudio proteómico de la vía de señalización de GPVI. Versión reducida. 117 Tabla 13 - Características clínicas de los pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST incluidos en el estudio de validación de la vía de señalización de GPVI realizado en plaquetas de sangre venosa. Versión reducida. 118 Tabla 14 - Características clínicas de los pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST incluidos en el estudio piloto de agregación tras la 120 xx Abreviaturas SCASEST Síndrome coronario agudo sin elevación del segmento ST SELLEX Enriquecimiento exponencial en presencia de ligando (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) SDS Dodecil sulfato sódico (Sodium dodecyl sulphate) SH2 Dominio de homología 2 con Src (Src homology 2) SKAP2 Fosfoproteína asociada a la quinasa Src (Src kinase-associated phosphoprotein 2) (sinónimo: SKAP-HOM) SLP-76 Proteína de leucocitos de 76 kDa que contiene un dominio SH2 (SH2 domain-containing leukocyte protein of 76 kDa) Src Tirosina quinasa Src SSC Parámetro de dispersión que determina la complejidad de las partículas en un citómetro de flujo (Side scatter) Syk Tirosina quinasa del bazo (Spleen tyrosine kinase) TLN-1 Talina-1 TBS-T Tampón Tris salino con Tween 20 (Tris-buffered saline with Tween 20) TCA Ácido tricloroacético (Trichloroacetic acid) TEM Microscipía electrónica de transmisión (Transmission electron microscopy) TEMED N,N,N’,N’-tetrametil-etilendiamina (Tetramethylethylenediamine) TFN-α Factor de necrosis tumoral alfa (Tumor necrosis factor alpha) TiO2 Dióxido de titanio (Titanium dioxide) TOF Tiempo de vuelo (Time of flight) TSP-1 Trombospondin-1 TXA2 Tromboxano A2 v/v Relación volumen/volumen vWF Factor de von Willebrand (von Willebrand factor) 1. Introducción 3 Introducción 1.1 Plaquetas La primera aproximación al estudio de las plaquetas data de 1865, cuando Max Schultze detectó en la sangre unas pequeñas esferas incoloras que a menudo tendían a formar grupos entre sí.1 Fue sin embargo Giulio Bizzozero quien en 1882 publicó un extensísimo trabajo sobre plaquetas, apuntando características tan fundamentales como su falta de núcleo, y demostrando que tenían un papel importante en trombosis.2 Desde su descubrimiento, las plaquetas han sido consideradas incapaces de llevar a cabo los procesos de expresión génica regulada y síntesis proteica por su ausencia de núcleo. Sin embargo, en la década de los 60s diversos estudios han demostrado la existencia de un potencial sintético limitado a partir de ARN mensajeros (ARNm) procedentes de los megacariocitos precursores,3-6 y en los siguientes años se demostró la existencia de ribosomas en las plaquetas y otros componentes necesarios para la síntesis de proteínas.7,8 Varios estudios han demostrado síntesis proteica de novo en plaquetas7,9,10 y, aunque el nivel de traducción es bajo en las plaquetas en reposo, la activación plaquetaria aumenta la síntesis proteica.11 En la actualidad se acepta que las plaquetas no sólo tienen el potencial para sintetizar proteínas, sino que esta capacidad parece ser necesaria para cumplir con sus funciones ya que son capaces de expresar productos génicos biológicamente relevantes de forma oportuna y dependiente de señales.12 Este proceso de traducción utiliza un transcriptoma constitutivo y vías especializadas para alterar el fenotipo de las plaquetas y sus funciones, lo que puede tener gran relevancia clínica. A pesar de lo dicho, se reconoce que la función plaquetaria depende fundamentalmente de las modificaciones postraduccionales (post-translational modifications, PTMs) que sufren las proteínas. Así, cuando las plaquetas se activan se ponen en marcha vías de señalización mediadas por PTMs, fundamentalmente fosforilaciones.13,14 La regulación mediada por PTMs tiene la ventaja de permitir a las plaquetas reaccionar rápidamente ante estímulos externos, lo que es beneficioso en caso de lesión mecánica para evitar la pérdida excesiva de sangre. Sin embargo la naturaleza hipersensible de las plaquetas las hace responder a otros estímulos durante la preparación de muestras, por lo que es fundamental tomar las máximas precauciones durante su manipulación. 4 Introducción 1.1.1 Definición y biogénesis Las plaquetas son células sanguíneas que se caracterizan por su reducido tamaño (2-3 µm de diámetro, ~0,5 µm de espesor y 6-10 fL de volumen) y ausencia de núcleo. En condiciones fisiológicas tienen forma discoidal y circulan por el torrente sanguíneo durante aproximadamente diez días hasta que son destruidas y sustituidas por otras nuevas.15 Su concentración en sangre oscila entre los 150 y 350x106/mL. El origen principal de las plaquetas son los megacariocitos de la médula ósea, células hematopoyéticas poliploides exclusivas de mamíferos que se especializan en su producción y liberación al torrente sanguíneo en un proceso denominado trombopoyesis. Aunque el principal lugar en el que sucede la trombopoyesis es la médula ósea, un número limitado de megacariocitos ha migrado desde su localización inicial, colonizando lugares lejanos en los que se han observado diferentes etapas del desarrollo plaquetario. Estos lugares alternativos en los que tiene lugar la diferenciación plaquetaria a partir de sus progenitores son los pulmones y la sangre. La formación de plaquetas está regulada por la trombopoyetina (hormona sintetizada en hígado y riñones) y su destrucción se realiza por las células de Kupffer en el hígado y por fagocitosis en el bazo.16 1.1.2 Subpoblaciones de plaquetas Entre sus funciones básicas, que son la adhesión a una lesión vascular y la promoción de la generación de trombina, se ha venido asumiendo que todas las plaquetas son igualmente capaces de cumplir la primera. Sin embargo, en la última década varios estudios sugieren una mayor capacidad para promover la generación de trombina por parte de algunas de ellas. Así, dentro de un trombo se distinguen claramente plaquetas con diferentes propiedades de superficie, lo que abre el camino para el estudio de las diferentes subpoblaciones de plaquetas y sus funciones. Recientemente Heemskerk y colaboradores han publicado una revisión interesante en la que describen las diferentes subpoblaciones plaquetarias y sus funciones.17 En un trombo, cerca de las fibras de colágeno, existe una población de plaquetas altamente activadas dispuestas a modo de parches. Son conocidas como plaquetas procoagulantes, tienen una estructura redondeada, exponen fosfatidilserina (PS) en su superficie, tienen una morfología inducida por la liberación de calcio sostenida, capacidad de unirse a factores de coagulación y capacidad de generar microvesículas procoagulantes. Las plaquetas recubiertas (coated-platelets) son una subpoblación formada tras la estimulación con colágeno y trombina al mismo tiempo. Aunque esto es cierto, hay estudios 5 Introducción que demuestran la existencia de plaquetas indistinguibles a esta subpoblación, formadas tras la estimulación con otros agonistas o pares de agonistas.18-21 Este tipo de plaquetas se caracterizan por mostrar en su superficie elevados niveles de proteínas procoagulantes derivadas de gránulos-α (FV, fibrinógeno, trombospondina, vWF), por exponer altos niveles de PS en su superficie, por su capacidad para unirse al FXa y generar un complejo de protrombinasa activo, por unirse a proteínas conjugadas a serotonina, y también por liberar microvesículas. Su importancia fisiológica es aún desconocida, aunque se especula que podrían ser importantes contribuyentes en el proceso trombótico. Desde un punto de vista clínico, se cree que son de gran relevancia para la hemostasia y trombosis, ya que un bajo nivel de plaquetas recubiertas se correlaciona con la aparición de hemorragias cerebrales espontáneas22 y predisposición al sangrado,23 mientras que un elevado número parece correlacionarse con ataque isquémico transitorio, infarto cerebral isquémico,24,25 y con pacientes con una historia de trombosis arterial o venosa.26 Además, estas plaquetas parecen tener un impacto en el fenotipo de hemorragia en hemofilia,27 entre otras enfermedades. En un trombo también se observan plaquetas agregantes que se caracterizan por la presencia de αIIbβ3 (GPIIb/IIIa) activo en su superficie unido a fi brinógeno. Son las responsables de la consolidación y retracción del coágulo. Una última categoría son las plaquetas apoptóticas y necróticas, caracterizadas por una exposición apoptótica de PS, que parece basarse en la activación de caspasas. Aunque varios estudios in vitro han revelado que estas plaquetas tienen un potencial coagulante, su papel en condiciones fisiológicas es cuestionable, ya que son eliminadas rápidamente por las células de barrido presentes en la circulación. Se ha sugerido incluso que estas plaquetas se activan por una vía necrótica de muerte celular.28 1.1.3 Estructura de las plaquetas A pesar de su aparente simplicidad por su reducido tamaño y ausencia de núcleo, las plaquetas son morfológica y bioquímicamente complejas. En cuanto a su estructura, las plaquetas se componen de cuatro zonas bien diferenciadas: la zona periférica, la zona estructural, la zona de organelas y la zona de membranas (Figura 1).  La zona periférica está formada por el glicocálix y la membrana plasmática, que son el primer contacto con el exterior. El glicocálix funciona a modo de intermediario entre la plaqueta y el entorno, detectando los cambios en la vasculatura. La membrana posee 6 Introducción innumerables receptores proteicos que interaccionan con agonistas externos desencadenando las diversas reacciones plaquetarias.  La zona estructural se compone por el sistema de microtúbulos que soportan el citoesqueleto, y por el sistema de microfilamentos de actina y miosina que lo forman, confiriendo a las plaquetas la capacidad de cambiar de forma cuando se activan.  La zona de organelas incluye depósitos de glucógeno, lisosomas cargados de enzimas hidrolíticos, gránulos densos que contienen pequeñas moléculas involucradas en los procesos de señalización (ADP, ATP, 5-HT y Ca2+) y gránulos alfa que contienen proteínas esenciales para llevar a cabo las funciones plaquetarias.  Los sistemas de membrana incluyen el sistema canalicular abierto, aberturas o conductos membranosos que se prolongan desde la membrana plasmática hacia el interior de la célula, y el sistema tubular denso derivado del retículo endoplasmático rugoso de los megacariocitos. Este último sistema es un depósito importante de iones de calcio libres, esenciales para la regulación de la activación y metabolismo de las plaquetas. Figura 1. Diagrama de la estructura básica de las plaquetas. 1.1.4 Receptores plaquetarios En la membrana de las plaquetas se localizan receptores de muy diversos tipos que establecen interacciones entre plaquetas adyacentes y con el medio externo, determinando su reactividad con un amplio rango de agonistas y proteínas adhesivas. Entre los principales tipos de receptores plaquetarios encontramos los receptores de la familia de las integrinas, los receptores ricos en leucina (leucine-rich repeat receptors, LRR), los receptores transmembrana ligados a proteína G, las proteínas de la superfamilia de las inmunoglobulinas, los receptores de tipo tirosina quinasa y las lectinas. Los principales 7 Introducción receptores plaquetarios y sus agonistas se muestran en la Tabla 1. Más adelante nos centraremos en el receptor de colágeno GPVI, objeto especial de estudio de esta tesis doctoral. Tabla 1. Principales receptores plaquetarios: agonistas y características. Ig: inmunoglobulina, CRP: péptido relacionado con colágeno (collagen-related peptide); GPCR: receptor acoplado a proteína G (G-protein coupled receptor); vWF: factor de von Willebrand (von Willebrand factor). 1.1.5 Principales vías de secreción plaquetaria La secreción plaquetaria, el secretoma, es el conjunto de proteínas y otras biomoléculas liberadas por las plaquetas activadas. Las proteínas constituyentes de este producto liberado se asocian con inflamación, coagulación, angiogénesis, crecimiento celular y adhesión celular.29-33 Se sabe que la secreción de plaquetas es heterogénea y dependiente de agonista,34,35 lo que resulta relevante en diferentes contextos patológicos. Un ejemplo de su relevancia patológica es la presencia de proteínas plaquetarias en la placa aterosclerótica humana, lo que indica que el secretoma podría estar contribuyendo a la patogénesis de la aterosclerosis.36,37 Como se explica a continuación, la liberación de proteínas por parte de una célula puede suceder por vía clásica o por vías alternativas. 1.1.5.1 Vía clásica de secreción de proteínas En la vía clásica de secreción las proteínas destinadas al exterior celular son dirigidas por una secuencia o péptido señal. Estas proteínas viajan incluidas en vesículas desde el retículo endoplásmico hasta el Golgi para fusionarse finalmente con la membrana celular y liberar Receptor plaquetario Agonista Tipo de receptor Vía de señalización GPVI Colágeno, CRP Ig Tirosina quinasa α2β1 Colágeno integrina Tirosina quinasa GPIb-V-IX vWF, trombina Rico en leucina Tirosina quinasa αIIbβ3 Fibrinógeno, vWF Integrina Tirosina quinasa P2Y1 ADP GPCR Gαq P2Y12 ADP GPCR Gαi PAR-1 Trombina GPCR Gαq, Gα12/13 PAR-4 Trombina GPCR Gαq, Gα12/13 TP Tromboxano A2 GPCR Gαq, Gα12/13 8 Introducción su contenido. Este es el mecanismo de liberación del contenido de los gránulos plaquetarios a consecuencia del aumento de Ca2+ citosólico que se produce cuando las plaquetas son estimuladas con agonistas fuertes. Los gránulos alfa contienen proteínas esenciales para llevar a cabo las funciones plaquetarias, mientras que los gránulos densos contienen pequeñas moléculas involucradas en los procesos de señalización. Ambos tipos de gránulos derivan de los cuerpos multivesiculares de los megacariocitos.38 Se ha demostrado la existencia de distintos subtipos de gránulos α con distinto contenido proteico que son liberados de forma diferencial en función del estímulo.39 En cuanto a su función, los gránulos de plaquetas contribuyen a la propagación de la activación plaquetaria, y por otra parte, a procesos tales como coagulación, defensa del huésped, angiogénesis, cicatrización de heridas e inflamación.40 1.1.5.2 Vías alternativas de secreción de proteínas. Microvesículas e importancia de su estudio Alternativamente la secreción puede tener lugar por rutas no clásicas en la que las proteínas no utilizan el camino clásico de secreción ya que carecen de una secuencia señal que las dirija. Un tipo importante de secreción no clásica es la liberación de vesículas extracelulares que incluyen las microvesículas (MVs), los exosomas y los cuerpos apoptóticos. Las microvesículas del plasma son fragmentos citoplasmáticos de menos de una micra rodeadas de membrana celular, que se originan fundamentalmente a partir de células sanguíneas, endoteliales, tumorales y esqueléticas. Son liberadas por gemación de la membrana plasmática, e inducidas por apoptosis o activación de las plaquetas. Su contenido y función es específico, y depende directamente de la célula parental que las liberó y del mecanismo que desencadenó su liberación. Representan un importante modo de comunicación intercelular al servir como vehículos para la transferencia de proteínas a través de las membranas,41 pero además están involucradas en muchas otras funciones tales como coagulación, inflamación, trombosis, comunicación intercelular y progresión tumoral. Se sabe que las plaquetas activadas generan microvesículas42,43 que liberan al plasma contribuyendo al aumento de las microvesículas plasmáticas. Aproximadamente el 90% de las microvesículas del plasma proceden de plaquetas44 y son liberadas a la circulación junto con vesículas más pequeñas, los exosomas. Las microvesículas tienen papeles importantes en la patogénesis de diversas enfermedades inflamatorias tales como la aterosclerosis45 y su número está aumentado en la sangre de pacientes con síndromes coronarios agudos,46-48 diabetes49 y sepsis,50 entre otras enfermedades. 9 Introducción 1.1.6 Función plaquetaria El papel principal de las plaquetas en el mantenimiento de la hemostasia corporal fue descubierto hace ya más de un siglo.2 Sin embargo, hoy en día se sabe que están implicadas en muchas otras funciones biológicas cruciales al margen de la hemostasia, algunas beneficiosas como el mantenimiento de la integridad vascular, y otras patológicas como inflamación, inmunidad, cáncer, trombosis o enfermedades cardiovasculares.51 1.1.6.1 Funciones fisiológicas de las plaquetas  Papel de las plaquetas en hemostasia La hemostasia, definida como mecanismo de defensa del organismo que se activa para evitar la pérdida de sangre en el sistema circulatorio, es la función más relevante de las plaquetas. En condiciones fisiológicas, cuando el endotelio de algún vaso sanguíneo sufre una lesión (por traumatismo, intervención quirúrgica o enfermedad), se exponen a la luz del mismo los componentes de la matriz subendotelial desencadenando la activación plaquetaria para iniciar la formación de un tapón hemostático. El proceso de activación plaquetaria consta de tres fases (adhesión, activación y agregación) e implica numerosos receptores (Figura 2).  Adhesión. En ausencia de daño la superficie interna de los vasos sanguíneos está revestida por una capa delgada de células endoteliales que actúan inhibiendo la activación de las plaquetas mediante la producción de óxido nítrico (NO) y prostaglandina I2 (PGI2) que actúan de modo sinérgico.52-54 Estas células también presentan actividad ecto-ADPasa (CD39) que se encarga de metabolizar el ADP (activador plaquetario) en adenosina (inhibidor plaquetario).55,56 La actuación coordinada de estos tres mecanismos inhibe la activación y el cambio de forma de las plaquetas. Cuando se produce una lesión vascular estos mecanismos inhibitorios se ven alterados y los componentes de la matriz subendotelial se exponen a la luz del vaso sanguíneo desencadenando la activación plaquetaria que conduce a la formación de un tapón hemostático para evitar la pérdida excesiva de sangre. La activación se inicia con la liberación de la proteína multimérica factor de von Willebrand (von Willebrand factor, vWF) por parte de las células endoteliales, y su unión al colágeno expuesto formando una interacción transitoria e inestable con el complejo receptor GPIb-V-IX. Esta interacción ralentiza la velocidad de las plaquetas, facilitando la formación de una 16 Introducción observar un electrocardiograma y por el aumento de marcadores de necrosis miocárdica. Por último, la AI se caracteriza por la aparición de un trombo no oclusivo112 y la ausencia de liberación detectable de las enzimas y biomarcadores de necrosis miocárdica. En la Figura 3 se muestra un diagrama clasificatorio de los tipos de cardiopatía isquémica. Figura 3. Clasificación de las cardiopatías isquémicas. Un buen diagnóstico y estratificación de los pacientes es crucial para el manejo de pacientes con SCA. El objetivo fundamental en el manejo de los pacientes que presentan dolor torácico es clasificarlos de forma eficiente, rápida y precisa. Es el médico quien tiene el reto de identificar cual es el tratamiento más adecuado en cada caso. Es bien sabido que las plaquetas desempeñan un papel fundamental en los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a muchas enfermedades cardiovasculares, especialmente en los SCA, ya que están implicadas en la formación del trombo tras la ruptura de la placa de ateroma.113 Esta es la razón por la cual las moléculas implicadas en la activación y agregación plaquetaria son los objetivos principales para el tratamiento de los SCA.114 Se han destinado innumerables esfuerzos a la búsqueda de fármacos que inhiban la activación de las plaquetas. Sin embargo, muy a menudo es difícil separar los beneficios terapéuticos de los efectos nocivos de los fármacos, ya que tanto la acción fisiológica de las plaquetas como la patológica se deben a los mismos mecanismos, y es aquí donde radica la importancia de avanzar en la búsqueda de fármacos antiplaquetarios efectivos para el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares.115 17 Introducción Principales dianas y fármacos antiplaquetarios utilizados en el tratamiento de SCAs Existen algunos agentes antiplaquetarios utilizados rutinariamente en el tratamiento de los SCA. Los inhibidores de la ciclooxigenasa-1 (como la aspirina) actúan reduciendo drásticamente la mortalidad por infarto de miocardio, el riesgo de recurrencia de eventos cardiovasculares posteriores y las complicaciones isquémicas debido a las intervenciones coronarias percutáneas.116,117 Otros medicamentos incluyen tienopiridinas (como clopidogrel o ticagrelor) que son antagonistas del receptor de ADP, P2Y12, y los inhibidores de la glicoproteína IIb/IIIa (tales como abciximab o epifibatide). La combinación de inhibidores de la ciclooxigenasa-1 y tienopiridinas se utiliza rutinariamente en la prevención y el tratamiento de los SCAs.118 Las directrices actuales sobre la intervención coronaria percutánea recomiendan la administración de dos antiagregantes plaquetarios,119 pero surgen dudas a la hora de establecer un tiempo óptimo de administración del tratamiento tras el infarto. Un tratamiento prolongado con dos o tres antiagregantes puede desarrollar dos respuestas: por un lado podría conducir a una respuesta hipo-reactiva de las plaquetas, que finalizaría con la aparición de una resistencia a dichos fármacos,120,121 y por otro lado a una respuesta hiper-reactiva de las plaquetas que desencadenaría un aumento del riesgo de sangrado.122 Por el contrario, un tratamiento excesivamente corto podría provocar eventos recurrentes en el paciente. Por razones evidentes el estudio y desarrollo de nuevos agentes antiplaquetarios como inhibidores más potentes de los receptores P2Y12 y GPIIb/IIIa, así como de nuevos fármacos contra receptores todavía no inhibidos como GPVI, se encuentra en auge. El fin último de estos estudios es encontrar el modo de disminuir los eventos aterotrombóticos recurrentes sin aumentar el riesgo de hemorragia. Los principales fármacos antiplaquetarios y sus dianas celulares se muestran en la Figura 4. 18 Introducción Figura 4. Principales fármacos antiplaquetarios y sus dianas. Ilustración adaptada de Francesco Franchi y Dominick J. Angiolillo.123 19 Introducción 1.2 El receptor de colágeno GPVI: función y relevancia como diana farmacológica La glicoproteína VI (GPVI) es una de las inmunoglobulinas más importantes en plaquetas y, junto con α2β1, es uno de los principales receptores de colágeno. Su expresión se restringe únicamente a plaquetas y megacariocitos, y se ha estimado que existen entre 4000 y 6000 copias de GPVI en la superficie de las plaquetas.124-127 Su activación desencadena una vía de señalización que funciona a través de fosforilaciones en los residuos tirosina de las proteínas que conforman dicha vía. Este receptor se identificó inicialmente como una glicoproteína de membrana plaquetaria de unos 60-65 kDa y función desconocida.128 El primer indicio de su papel como receptor de colágeno en plaquetas provino del estudio de un paciente con trombocitopenia autoinmune causada por los autoanticuerpos de una proteína de 65 kDa que estaba presente en individuos sanos, pero ausente en este paciente.129 Las plaquetas de este paciente eran insensibles al colágeno mientras que la activación por otros estímulos era normal. Se han descrito a posteriori casos de pacientes con bajos niveles de GPVI que presentaban un fenotipo de sangrado leve y cuyas plaquetas eran defectuosas en la agregación por colágeno.130-132 Por otro lado, la depleción de GPVI utilizando un anticuerpo monoclonal selectivo anti GPVI conduce a una deficiencia transitoria sin afectar a otros receptores, inhibiendo la agregación inducida por colágeno y por agonistas específicos de GPVI en plaquetas normales de ratón.133 El conjunto de estos estudios pone de manifiesto la importancia de GPVI como receptor de colágeno. 1.2.1 Estructura del complejo GPVI/ FcRγ La glicoproteína VI humana está formada por 339 aminoácidos que se distribuyen formando dos dominios Ig extracelulares, un único domino transmembrana y una cola citoplasmática corta.134 La estructura cristalina del receptor humano GPVI (PDB ID.2GI7) fue publicada por Horii K y colaboradores en el año 2006 y se muestra en la Figura 5A.135 El dominio extracelular está formado por dos bucles C2 responsables de la interacción con el colágeno, uno de los cuales presenta un lugar único de N-glicosilación. Además presenta un cuello mucilaginoso fuertemente O-glicosilado rico en residuos serina y treonina, que eleva los dominios C2 y los aleja de la membrana para hacerlos accesibles al colágeno. El dominio transmembrana tiene como tercer residuo una arginina que forma un puente salino con un ácido aspártico del dominio transmembrana de la cadena γ del receptor Fc (FcRγ), 20 Introducción estabilizando el complejo GPVI/FcRγ, lo que res ulta crítico para el proceso de señalización.136 El dominio citoplasmático contiene un lugar de unión a calmodulina y una región rica en prolina que se une selectivamente a miembros de la familia Src (Lyn y Fyn) fundamentales para la activación de la vía. La cola citosólica de FcRγ contiene una copia del motivo atípico de activación del inmunoreceptor basado en tirosina (immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM) que es fosforilado durante el proceso de activación. La estructura del complejo GPVI/FcRγ se muestra en la Figura 5B. Figura 5. El receptor de colágeno GPVI. A) estructura cristalina del receptor GPVI. Imagen de Horii K y colaboradores.135 B) Representación de la estructura del complejo GPVI/FcRγ. Ilustración adaptada de Sebastian Dütting et al.137 1.2.2 Agonistas de GPVI  Agonistas endógenos De las más de 20 formas de colágeno existentes, los tipos fibrilares I y III son los principales componentes de la matriz extracelular de los vasos sanguíneos. El colágeno es uns superhélice dextrógira formada por la asociación de tres cadenas peptídicas ricas en glicina (G), prolina (P) e hidroxiprolina (O), entre otros aminoácidos. El motivo de repetición GPO (glicina-prolina-hidroxiplolina) es la secuencia específica que activa GPVI,138 mientras que el motivo GER (glicina-ácido glutámico-arginina) es específico para la activación de α2β1.139 En la década de los 90, el grupo de Morton y el de Santoro propusieron independientemente que la activación de las plaquetas por colágeno sucedía por la combinación de dos receptores, lo que se conoce como el modelo de activación plaquetaria en dos fases: una primera fase de adhesión mediada por α2β1 y una segunda fase de activación mediada por un receptor desconocido, que resultó ser finalmente GPVI.140-141 21 Introducción También se sabe que la laminina de la membrana basal es uno de los primeros ligandos que entran en contacto con las plaquetas cuando se produce una lesión y que actúa activando GPVI; sin embargo, su baja afinidad por el receptor hace pensar que su función es la de sellar pequeñas heridas en los vasos sanguíneos en las que no se requiere la formación de un trombo oclusivo.142 Por último, también se ha demostrado que la adiponectina globular juega un papel en la activación de GPVI, pero su relevancia fisiológica no está del todo clara ya que los niveles circulantes de esta hormona son insuficientes para desencadenar la activación plaquetaria.143  Agonistas exógenos Existen varias moléculas que actúan a modo de agonistas exógenos de GPVI, como es el caso de los CRPs (collagen-related piptides), péptidos sintéticos que imitan la estructura de triple hélice de colágeno y que están constituidos por un motivo de repetición GPO. Estos péptidos mimetizan la activación plaquetaria inducida por colágeno, e inducen la agregación de manera independiente de α2β1.144,145 Existe además un gran número de lectinas tipo C (venenos de serpiente) capaces de activar GPVI. La primera descubierta y de uso más extendido es la convulxina, que se extrae del veneno de la serpiente de cascabel Crotalus Durissus terrificus, y activa selectivamente a este receptor.146,147 La convulxina es una toxina multimérica con gran capacidad de clusterizar el receptor e inducir así la activación plaquetaria.148,149 Cabe destacar que, a diferencia del colágeno que activa otros receptores presentes en las plaquetas, el CRP y la convulxina son activadores específicos de GPVI, por lo que tienen gran interés para el estudio específico de la vía de señalización de este receptor. Por último, existen anticuerpos monoclonales como JAQ1 que pueden inducir la activación específica de GPVI.133 Los eventos de fosforilación originados por CRP, convulxina, y anticuerpos anti GPVI son cualitativamente similares a las inducidas por colágeno, aunque la intensidad de la respuesta es considerablemente mayor en los primeros. Los estímulos específicos de GPVI tienen la capacidad de inducir la formación de grupos de GPVI en la superficie de las plaquetas, generando así una señal intracelular de gran alcance, mientras que los motivos GPO del colágeno no presentan la espaciación adecuada para inducir un grado equivalente de agrupación. 22 Introducción 1.2.3 Vía de señalización de GPVI El receptor GPVI se encuentra constitutivamente asociado con FcRγ formando el complejo GPVI/FcRγ en la m embrana de las plaquetas. La fosforilación en tirosina (pTyr) del dominio ITAM de la cadena FcRγ resulta esencial para la activación de GPVI136,150 y es llevada a cabo por proteínas de la familia de las Src quinasas como Fyn y Lyn. Esta fosforilación tiene lugar en las balsas lipídicas de las membranas a las que se trasloca GPVI durante su activación.151,152 La fosforilación del motivo ITAM desencadena una cascada de señalización que se inicia con la fosforilación de la tirosina quinasa Syk, quien a su vez fosforila varios residuos tirosina de la proteína adaptadora LAT. La activación de LAT conduce al reclutamiento de proteínas adaptadoras que contienen el dominio SH2 (Grb2 y Gads) y también de PLCγ2 hacia las balsas lipídicas. Gads, por su parte, se asocia constitutivamente con SLP-76 y ambas proteínas son reclutadas por la fosforilación de LAT. La activación de PLCγ2 desencadena un aumento de los niveles de Ca2+ citoplasmático y la consiguiente liberación del contenido de los gránulos plaquetarios al plasma, los cuales actúan como factores de refuerzo positivo. En la Figura 6 se muestra un esquema de la vía de señalización desencadenada tras la activación de GPVI. Figura 6. Vía de señalización de la glicoproteína VI (GPVI). Ilustración adaptada de Sebastian Dütting et al.137 La activación mediada por GPVI permite una firme adhesión de las plaquetas al endotelio y promueve la secreción de sustancias procoagulantes y proinflamatorias que hacen que el trombo crezca y se consolide. Tras la activación, la expresión de fosfatidilserina (PS) proporciona actividad protrombinasa aumentando la formación de trombina. Las plaquetas adheridas permanecerán vivas durante horas o días en el lugar de la lesión vascular, y liberarán microvesículas con actividad proinflamatoria y protrombótica. Muchas otras 23 Introducción proteínas efectoras forman parte de esta vía, la cual comparte muchas similitudes con otros receptores, como el receptor de células T. Se ha demostrado que algunas de las proteínas de esta vía son esenciales, como es el caso de FcRγ y Syk, ya que las plaquetas de ratones knockout para estas proteínas no son reactivas frente a CRP y colágeno.153 La expresión de GPVI en la superficie plaquetaria es estrictamente dependiente de su asociación con FcRγ. Estudios de asociación virtual,154 así como de cristalografía135,155 han demostrado que el GPVI/FcRγ en estado monomérico no tiene afinidad por el colágeno, mientras que la forma dimérica presenta elevada afinidad. Se sabe que existe una subpoblación de GPVI que forma dímeros de manera constitutiva en la superficie de las plaquetas, lo que facilita una rápida clusterización del receptor tras su activación.156 Por otro lado, hay evidencias claras de que la mayoría de las moléculas de GPVI existen en forma monomérica en las plaquetas inactivas, y que la activación plaquetaria con agonistas solubles induce la dimerización del receptor promoviendo de este modo su activación por colágeno.157,158 Resulta interesante destacar que las propias plaquetas cuentan con mecanismos inhibitorios de la señalización de GPVI. Por un lado, la señalización basal de GPVI está bloqueada por su proximidad a receptores como PECAM-1, CECAM1 y G6b, que contienen motivos de inhibición del inmunoreceptor basado en tirosina (immunoreceptor tyrosinebased inhibition motif, ITIM). Estos receptores actúan como reguladores negativos de la señalización plaquetaria mediada por GPVI.142 Por otro lado, el receptor GPVI presenta un lugar de corte reconocido por metaloproteasas que sirve para regular a la baja la reactividad de las plaquetas. Este lugar de corte se localiza en el dominio extracelular muy cerca de la membrana, y su escisión da lugar a un fragmento de GPVI soluble (GPVIs) de 55 kDa y un fragmento transmembrana de 10 kDa.159 1.2.4 Papel de GPVI en trombosis y hemostasia Varios estudios destacan el papel crucial que desempeña GPVI en la trombosis arterial in vivo,160-162 y han demostrado que GPVI se une a las estructuras de colágeno presentes en la región central de la placa ateromatosa humana.163 La inhibición de este receptor da lugar a protección contra la aterosclerosis en conejos y ratones164 y también contra la formación de trombos arteriales.165-167 De este modo, se sabe que a pesar de su papel esencial en el proceso de trombosis arterial, GPVI parece ser de menor importancia para la hemostasia normal, ya que su deficiencia no se asocia con mayor riesgo de hemorragia en humanos ni 24 Introducción en ratones.165 Todo ello, junto con el hecho de que GPVI se expresa solamente en las plaquetas y megacariocitos, ha hecho de este receptor una diana farmacológica antitrombótica prometedora para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, proporcionando una buena relación riesgo/beneficio.168 El grupo de Boris Bigalke ha sido pionero en el estudio de GPVI en pacientes con SCAs y han hecho numerosos e importantes avances en este campo. Inicialmente han demostrado en varios estudios y utilizando un elevadísimo número de pacientes, que la expresión de GPVI está aumentada en la superficie de las plaquetas de pacientes con SCA,169-172 lo que asociado al bajo recuento de plaquetas en estos pacientes refleja una mayor activación y reclutamiento de plaquetas al lugar de la lesión.171 Más en concreto, han demostrado que el aumento de GPVI en la superficie de plaquetas de pacientes con IAM se correlaciona con una disminución de GPVI soluble, y afirman que estas medidas tienen una mejor asociación con el desarrollo de la enfermedad en etapas iniciales del proceso que la propia troponina I utilizada como marcador de daño miocárdico.173 Por otro lado, el aumento de GPVI en superficie se asocia con una mayor agregación residual, aun a pesar de los tratamientos antiplaquetarios.170 Además proponen a GPVI soluble como una molécula interesante para estudios de imagen molecular que podría identificar placas vulnerables a la ruptura174 y destacan su gran valor predictivo y pronóstico para la estratificación de los pacientes con SCAs. En resumen, Bigalke y colaboradores proponen firmemente al receptor GPVI como un biomarcador útil para detección temprana de isquemia miocárdica, que contribuye además a la estratificación de pacientes de riesgo y predice su evolución clínica. En relación a lo dicho, nuestro grupo ha estudiado recientemente el proteoma de plaquetas de pacientes con IAMCEST y los resultados sugieren una participación directa de la vía de GPVI en el evento agudo.175 Este resultado, junto con los estudios de Bigalke, ha dirigido nuestros esfuerzos al estudio en profundidad de este receptor y de su vía de activación, siendo uno de los temas principales de esta tesis doctoral. 1.2.5 Inhibición de la activación de GPVI Como ya se ha comentado, el desarrollo de fármacos contra la activación de GPVI tiene un gran interés antitrombótico y antiinflamatorio. Han sido muchos los esfuerzos focalizados en el desarrollo de diferentes estrategias para inhibir la activación plaquetaria desencadenada por GPVI, pero por el momento no existe ningún fármaco disponible en la clínica. Entre estas estrategias se encuentra el uso de compuestos que se unen a GPVI (anticuerpos, aptámeros y pequeñas moléculas), la inhibición competitiva por colágeno 25 Introducción (imitadores de GPVI), la depleción de GPVI, la inhibición de mediadores de la vía de GPVI y la inhibición de la dimerización/oligomerización del receptor.  Bloqueo del receptor GPVI El bloqueo directo del lugar de unión a colágeno del receptor GPVI, podría ser una estrategia prometedora para prevenir la formación de trombos oclusivos en vasos enfermos, con poco o ningún aumento en el riesgo de sangrado. En este contexto se han desarrollado anticuerpos monoclonales contra GPVI mediante inmunización de ratones knockout para GPVI, utilizando células CHO que expresan cantidades altas de GPVI humano.176 Estos anticuerpos reciben el nombre de OM2 y OM4, y sus fragmentos Fab han resultado ser eficaces en la inhibición de la trombosis sin alterar la expresión del receptor ex vivo en ratas y monos cynomolgus, sin causar un aumento significativo del riesgo de sangrado.177-179 Se ha demostrado también que estos fragmentos inhiben la formación de trombos oclusivos in vivo en arterias lesionadas de ratas y ratones.161,178 El fragmento Fab de OM2 se ha utilizado en esta tesis doctoral. Los aptámeros, también denominados anticuerpos químicos, son ácidos nucleicos de cadena sencilla (ARNss) y ARNs aislados de genotecas de oligonucleótidos por selección in vitro mediante enriquecimiento exponencial en presencia del ligando (systematic evolution of ligands by experimental enrichment, SELEX). El descubrimiento de aptámeros útiles para la inhibición de GPVI fue llevado a cabo por el grupo de Christopher Rusconi en el año 2010. Lo más interesante es que esta inhibición puede ser revertida a demanda, ya que los aptámeros presentan un lugar de unión para un agente control que lo inactiva, volviendo la función del receptor a la normalidad. De este modo, Rusconi propone un antagonista de GPVI activamente controlable con interés farmacológico.180  Inhibición competitiva por colágeno Otra estrategia para inhibir la activación de GPVI se basa en la inhibición competitiva por el colágeno utilizando compuestos que presentan una mayor afinidad por él que el propio GPVI. Con este fin, se ha sintetizado una proteína formada por la forma soluble y dimérica de GPVI fusionada con el fragmento Fc de la IgG humana (GPVI-Fc). Esta inmunoadhesina soluble denominada Revacept, inhibe la adhesión plaquetaria estable y la agregación en vasos lesionados de ratones, disminuyendo la trombosis arterial,181 preserva la función miocárdica tras una isquemia transitoria,182 y mejora la disfunción vascular en la aterosclerosis sin ningún impacto sobre los tiempos de sangrado.183 Un estudio clínico en 32 Introducción de sangre destinada a estudios plaquetarios, aconsejando extraer la sangre de la vena cubital, desechar los primeros 2 mL de sangre, utilizar una aguja de 21g y un torniquete, y recoger las muestras en tubos con anticoagulantes que preserven la activación plaquetaria.206 Los tubos seleccionados para la extracción de muestras pueden influir en las funciones plaquetarias y en los estudios proteómicos posteriores, por lo que se recomienda que sean de plástico y contengan como anticoagulante un 3,8% de citrato sódico. El procesamiento de la muestra debe hacerse tan pronto como sea posible, y siempre antes de que transcurran 2 h tras la extracción de la sangre. Las condiciones ambientales también deben ser adecuadas dado que las plaquetas son extremadamente sensibles a los cambios de temperatura y pH por lo que debemos tenerlos en cuenta durante el transporte y manipulación de las muestras. La temperatura debe estar entre 20-25oC y el pH debe ser controlado en torno a 6,6 con ácido-citrato-dextrosa (ACD) con el fin de evitar la agregación. Durante el aislamiento de las plaquetas es crucial evitar la contaminación con otras células o proteínas plasmáticas para un análisis exitoso del proteoma. En cuanto a la separación de las plaquetas de otros tipos celulares no existe un método estandarizado. Algunos estudios utilizan centrifugación cuidadosa de la sangre para obtener el plasma rico en plaquetas (platelet-rich plasma, PRP), mientras que otros utilizan filtros para eliminación de leucocitos.207-209 Recientemente se ha desarrollado una estrategia alternativa basada citometría de flujo utilizando bolas magnéticas contra la subunidad β3 de la integrina.210 La separación de plaquetas y plasma, se puede realizar por filtración en gel o por centrifugaciones sucesivas realizadas en presencia de inhibidores que eviten la activación de las plaquetas. Esta última alternativa es la utilizada con éxito por nuestro grupo211 y será explicada en profundidad en la sección de material y métodos. Por último, es aconsejable volver a suspender las plaquetas en un tampón fisiológico adecuado, como puede ser el tampón de Tyrode modificado (modified Tyrode´s buffer, MTB). Se recomienda realizar una etapa de centrifugación final para reducir las proteínas plasmáticas al mínimo y obtener plaquetas lavadas. Todos los pasos de centrifugación deben ser realizados a temperatura ambiente ya que la refrigeración puede activar las plaquetas.212 El recuento de las plaquetas puede hacerse idealmente utilizando un analizador electrónico de partículas, por ejemplo un contador de partículas Coulter, para finalmente resuspenderlas a la concentración deseada con un tampón adecuado, que de nuevo puede ser tampón de Tyrode modificado. Es importante tener en cuenta que la concentración de las plaquetas tras su aislamiento nunca debe exceder las 109 plaquetas/mL para evitar su activación espontánea. 33 Introducción Figura 8. Flujo de trabajo esquemático para estudios de proteómica de plaquetas en enfermedades cardiovasculares. Ilustración adaptada de Vélez et al.51 Las técnicas más utilizadas en proteómica se basan en la electroforesis, como método preparativo, y en la espectrometría de masas, como método analítico. Sin embargo la proteómica de nueva generación denominada proteómica de perdigones (o shotgun proteomics) utiliza técnicas proteómicas no basadas en gel que están tomando el relevo por su gran sensibilidad y sus numerosas aplicaciones. 34 Introducción 1.3.3 Técnicas de separación de proteínas Debido a la enorme complejidad que supone el estudio de un proteoma se hace indispensable una separación bioquímica de la muestra. Con este fin se utilizan diversas técnicas entre las que destacan la electroforesis monodimensional (one-dimensional electrophoresis, 1-DE), la electroforesis bidimensional (two-dimensional electrophoresis, 2DE) y la cromatografía líquida (liquid chromatography, LC). La técnica electroforética más empleada es la 1-DE en geles de poliacrilamida (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) y se basa en la separación de las proteínas en función de su masa molecular relativa (Mr). Esta técnica requiere de la adición del detergente dodecilsulfato sódico (sodium dodecyl sulfate, SDS) con el fin de desnaturalizar las proteínas y asegurar que todas ellas se encuentren cargadas. En la electroforesis 2-DE, el fraccionamiento por Mr es precedido por una separación basada en el punto isoeléctrico (pI) de las proteínas, lo que aumenta mucho la resolución del análisis. Esta técnica presenta algunos inconvenientes como son la baja representación de proteínas muy hidrofóbicas, de proteínas extremadamente acidas o básicas, y de proteínas de muy alto peso molecular. Una vez realizado el fraccionamiento, la tinción de los geles permite visualizar las proteínas separadas. Una variante de la 2-DE convencional es la electroforesis bidimensional diferencial en gel (two-dimensional differential gel electrophoresis, 2D-DIGE) que disminuye la variabilidad técnica y mejora la reproducibilidad. Otra ventaja importante del 2D-DIGE es la considerable reducción en la cantidad de muestra requerida para el análisis. Esta técnica será explicada en profundidad a continuación ya que es la base de algunos de los estudios que componen esta tesis. 1.3.3.1 La electroforesis bidimensional diferencial en gel, 2D-DIGE La electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE) es una variación de la electroforesis bidimensional clásica diseñada para mejorar algunas de sus limitaciones más importantes. Esta técnica permite la cuantificación precisa de cambios en el proteoma, incluyendo isoformas y modificaciones postraduccionales.213 En los estudios 2D-DIGE, las proteínas de hasta tres muestras distintas son marcadas con fluoróforos espectralmente distinguibles, mezcladas y separadas en un único gel. Generalmente, una de las tres muestras en un estándar interno, es decir una mezcla a partes iguales de las otras dos muestras a comparar.214 El estándar interno ayuda a normalizar las posibles diferencias técnicas producidas por la manipulación de las muestras215 de modo que se reduce la 35 Introducción variabilidad entre geles y se mejora la reproducibilidad y la capacidad de extraer información cuantitativa de los análisis. Todas las manchas proteicas pueden ser medidas en base a la relación que presenten respecto a su mancha correspondiente presente en el estándar interno.214 Este sistema permite separar y comparar la expresión de proteínas de varias muestras para detectar variaciones en el nivel de expresión de cada una de ellas en las diferentes condiciones, y permite además separar la variabilidad técnica de la variación biológica inherente a las propias muestras.216 El esquema simplificado del funcionamiento de esta técnica se puede consultar en la Figura 9.  Preparación de la muestra para estudios 2D-DIGE La preparación de la muestra es uno de los pasos más importantes en proteómica ya que de ello depende la calidad, la relevancia y la fiabilidad de los datos obtenidos.217 De este modo resulta fundamental que el procesado no altere de modo alguno la muestra. Así, para realizar un análisis por electroforesis bidimensional 2D-DIGE es necesario que las proteínas se encuentren desnaturalizadas, disgregadas, reducidas y solubilizadas. Para ello existen numerosos protocolos dependiendo del tipo de muestra, y del grupo de proteínas que se va a estudiar, aunque estos protocolos deben ser revisados, ajustados y optimizados en función de las características de cada estudio.218  Fundamento y desarrollo de la técnica 2D-DIGE Para que varias muestras puedan ser resueltas en un mismo gel, se recurre su marcaje con diferentes fluoróforos denominados CyDyes (Cy2, Cy3 y Cy5) antes de realizar la electroforesis. Estos fluoróforos son cianinas que se excitan y emiten a longitudes de onda diferentes y conocidas, lo que permite su detección de manera independiente utilizando diferentes filtros y láseres en un escáner. Su unión a las proteínas es lineal y tienen una masa molecular similar entre sí. Existen dos versiones diferentes de fluoróforos: los utilizados para el marcaje mínimo (minimal dyes) que se unen a residuos lisina de las proteínas y los utilizados en el marcaje de saturación (saturation dyes) que se unen a residuos cisteína. El marcaje mínimo es el más utilizado cuando se dispone de la cantidad de muestra necesaria ya que funciona uniéndose a residuos más accesibles y frecuentes en las proteínas, además de presentar la gran ventaja de ser mucho más económico. Las diferencias entre ambos marcajes se muestran en la Tabla 2. En esta tesis se han empleado los fluoróforos de marcaje mínimo. 36 Introducción Tabla 2. Tipos de marcaje para 2D-DIGE: marcaje mínimo y marcaje de saturación. Del mismo modo que en una 2-DE convencional, el principio funcional del 2D-DIGE es la separación de las proteínas de una muestra mediante electroforesis en dos dimensiones: una primera dimensión en función de su carga eléctrica mediante isoelectroenfoque (isoelectrofocusing, IEF), y una segunda dimensión en función de su tamaño mediente SDSPAGE. La adición de un paso extra entre ambas electroforesis resulta fundamental para preparar la muestra para la segunda dimensión. Este paso se conoce como equilibrado y se realiza incubando la muestra con tampones que contienen SDS, entre otros componentes. La incubación con SDS, confiere carga negativa a las proteínas asegurando que los péptidos tengan igual movilidad cuando se someten a un campo eléctrico y se separen únicamente por su tamaño. El equilibrado consta de dos fases: reducción y alquilación. La reducción es comúnmente realizada con de ditiotreitol (dithiothreitol, DTT) y sirve para mejorar la solubilidad de las proteínas al romper los puentes disulfuro que forman agregados, mientras que la alquilación suele realizarse con iodoacetamida (iodoacetamide, IAA) para proteger a los grupos sulfidrilo libres frente a la oxidación, evitando que se formen nuevos enlaces disulfuro.  Visualización y análisis de los mapas proteicos 2D-DIGE El siguiente paso es la digitalización de los geles. Para ello se utilizan escáneres potentes basados en láseres que permiten la exportación de imágenes a formatos informáticos adecuados para su posterior análisis con programas externos.219,220 En el caso del 2D-DIGE, es necesaria la utilización de tres láseres y tres filtros diferentes para obtener cada una de las imágenes correspondientes a los diferentes Dyes, obteniendo así tres imágenes por cada gel. Existen diferentes tipos de programas diseñados de forma específica para el análisis diferencial de las imágenes (Samespots, PDQuest, etc.). Estos programas utilizan algoritmos matemáticos complejos para poder detectar de manera fiel las manchas proteicas y normalizar las posibles diferencias de carga. Su misión es alinear los mapas de proteínas Marcaje mínimo Marcaje de saturación Residuos de unión 1-2% de las lisinas 100% de las cisteínas Sensibilidad Alta (~1-2 ng) Muy alta (~0,1 ng) Proteína necesaria por muestra ~75 µg ~5 µg 37 Introducción obtenidos y emparejar las manchas entre geles para realizar un análisis estadístico apropiado que permita detectar diferencias significativas entre los grupos de imágenes a comparar. SameSpots es uno de los programas más utilizados hoy en día para el análisis de imagen ya que es capaz de sobreponerse a los problemas más comunes del análisis de geles 2D, tales como la falta de reproducibilidad en los resultados, el prolongado tiempo de edición y la confianza en la significación estadística de la medición de los cambios de expresión de proteínas. Además es fácil de utilizar y contiene muchos procesos automatizados, proporcionando resultados rápidos, objetivos y reproducibles sobre la expresión diferencial de proteínas en geles bidimensionales. Su flujo de trabajo comienza con la creación de una imagen de fusión representativa de todos los geles incluidos en el análisis, para luego realizar el paso de detección de manchas proteicas. Los parámetros estadísticos son seleccionados por el usuario, quien puede determinar a qué nivel considera que la diferencia de expresión de una mancha determinada es real y con qué nivel de significación (p valor) la considera como tal. Este software de análisis de imagen ha sido el empleado en la presente tesis doctoral. Figura 9. Representación esquemática de la técnica 2D-DIGE. Aunque las técnicas más utilizadas en proteómica se basan en la electroforesis como método preparativo, han comenzado a desarrollarse técnicas y métodos alternativos para el estudio de proteínas a gran escala debido a los problemas tecnológicos de la electroforesis en gel, como la falta de resolución para el estudio de proteomas complejos. La cromatografía líquida es una de estas técnicas, y permite separar proteomas complejos en función de su hidrofobicidad (cromatografía de fase reversa), carga eléctrica (cromatografía de 38 Introducción intercambio catiónico/aniónico) o tamaño (cromatografía de exclusión molecular). Esta técnica en combinación con la espectrometría de masas en tándem y los algoritmos de búsqueda en base de datos de los que se hablará más adelante, son la base de la proteómica de nueva generación.221 1.3.4 Técnicas analíticas en proteómica: la espectrometría de masas La espectrometría de masas (mass spectrometry, MS) es una poderosa técnica analítica fundamental en proteómica que permite obtener información de la masa molecular del compuesto analizado así como información estructural del mismo, o simplemente detectar su presencia y/o cuantificar su concentración. Esta técnica permite estudiar compuestos de naturaleza diversa (orgánica, inorgánica o biológica) o analitos, y lo hace en función de su relación masa/carga (m/z). La gran revolución supuesta por la aparición de las técnicas de ionización suave en la década de los 80s, permitió la aplicación de la espectrometría de masas al estudio de proteínas de elevado peso molecular y al análisis de mezclas complejas, ya que los componentes de una mezcla se ionizan sin sufrir apenas fragmentaciones.222 En las últimas décadas la combinación de los métodos de fragmentación suave y los analizadores de masas basados en tiempo de vuelo, han supuesto un enorme avance en el campo de la proteómica. La espectrometría de masas se ha convertido actualmente en una herramienta indispensable en cuanto a estudios proteómicos se refiere, y en el campo concreto de las plaquetas ha generado innumerables avances en el conocimiento de los mecanismos bioquímicos que subyacen a su comportamiento. En la actualidad, esta técnica continúa teniendo los mismos fundamentos que en su origen. Los elementos principales que forman un espectrómetro de masas incluyen una fuente de ionización, un analizador de masas y un detector que se mantienen en una cámara de vacío. Es necesario acoplar a estos elementos un procesador de datos para manejar toda la información obtenida. En la Figura 10 se esquematizan los componentes de un espectrómetro de masas. 39 Introducción Figura 10. Elementos que conforman un espectrómetro de masas. Fuente de ionización. Es la encargada de ionizar las moléculas, utilizando si fuera preciso una separación cromatográfica previa, para los iones en fase gaseosa. Los iones generados serán transportados por los campos magnéticos o eléctricos al analizador. Las técnicas para la ionización determinan qué tipos de muestras se pueden analizar por espectrometría de masas. Las fuentes más comúnmente utilizadas en proteómica son la ionización por electrospray (electrospray ionization, ESI)223,224 y la ionización/desorción inducida por láser asistida por matriz (matrix-assisted lased desorption ionization, MALDI).225 Ambos tipos de fuentes se caracterizan por no producir una fragmentación excesiva de la muestra y se conocen como métodos de ionización suave. Analizador de masas. Los iones generados en la fase anterior son acelerados hacia un analizador y separados en función de su relación m/z. Esta relación puede ser determinada mediante la aplicación de campos eléctricos o magnéticos, o en función del tiempo que tardan en llegar los iones al detector. Los analizadores afectan a la trayectoria o la velocidad de las partículas cargadas utilizando un campo eléctrico o magnético que provoca un cambio en la dirección de los iones que están volando a través del analizador. Los parámetros clave que caracterizan a un analizador son sensibilidad, resolución y precisión de masa. Existen cuatro tipos de analizadores utilizados comúnmente en proteómica: 1) los analizadores de tiempo de vuelo (time of flight, TOF) que miden el tiempo que los iones tardan en llegar al detector; 2) los cuadrupolos (quadrupole, Q) basados en campos magnéticos; 3) los analizadores de trampa iónica (ion trap, IT) basados en la separación por eyección selectiva de iones por radiofrecuencia y campos eléctricos oscilantes y 4) los analizadores de transformada de Fourier (Fourier transform ion cyclotron resonance, FT-ICR) que se basan en la aplicación de un campo magnético muy intenso sobre la trayectoria de iones. En la Figura 11 se muestran los principales espectrómetros de masas utilizados en proteómica. 40 Introducción Las combinaciones más comunes de fuentes de ionización y analizadores utilizados en proteómica son MALDI-TOF, MALDI-TOF/TOF y ESI-Q-TOF. Figura 11. Tipos de espectrómetros de masas comúnmente utilizados en proteómica. Ilustración adaptada de Aebersold et al.226 Detector. Es el elemento del espectrómetro encargado de registrar la carga inducida o la corriente producida cuando un ion pasa cerca o golpea una superficie. La señal producida en el detector durante la trayectoria del ion, en función de su relación m/z, genera un espectro de masa. Así, la magnitud de la corriente producida en el detector en función del tiempo se utiliza para determinar la abundancia y el valor derivado de la relación m/z del ion. Hoy en día se utilizan principalmente los multiplicadores de electrones o placas de microcanales. Procesadores de datos. Los iones que llegan al detector producen una señal eléctrica que es procesada, ampliada y enviada a un ordenador. Este ordenador se encarga de procesar los datos utilizando programas informáticos especializados227 basados en algoritmos que correlacionan los datos obtenidos en el análisis de espectrometría de masas con las bases de datos disponibles, con el fin último de identificar la proteína.228 El registro obtenido se denomina espectro de masas y representa las abundancias iónicas obtenidas en función de la relación m/z de los iones detectados. Las técnicas de identificación mediante espectrometría de masas son la identificación por huella peptídica (peptide mass fingerprinting, PMF) y la espectrometría de masas en tándem o MS/MS. 41 Introducción La PMF es el conjunto de fragmentos peptídicos que se obtienen tras tratar una proteína concreta con una proteasa determinada (generalmente tripsina), y este conjunto de péptidos es característico de cada proteína. Las masas absolutas de estos fragmentos pueden determinarse mediante la ionización MALDI o ESI acopladas a un analizador TOF. Las masas obtenidas son comparadas con una base de datos de proteínas cuya secuencia se conoce, o bien con una base de datos de información genómica mediante un enfoque in sílico, empleando softwares capaces de traducir las secuencias nucleotídicas a secuencias de aminoácidos.229-233 La estrategia de PMF suele utilizarse para muestras poco complejas como las provenientes de manchas proteicas de geles 2D.234 La puntuación de la proteína identificada se asigna mediante algoritmos que tienen en cuenta varios parámetros. Uno de los algoritmos más utilizados es MOWSE (molecular weight search)230 que está incorporado en motores de búsqueda como el Mascot.235 La espectrometría de masas en tándem se utiliza para el análisis de proteínas complejas o conjuntos de proteínas, y se basa en el acoplamiento de una fragmentación adicional a una MS convencional (normalmente MALDI-TOF/TOF o nanoLC-ESI-MS/MS). En este proceso se acoplan dos analizadores de masas consecutivos que permiten seleccionar un péptido concreto de la muestra a estudiar y su fragmentación inducida por la colisión de los iones con un gas inerte. El segundo analizador del espectrofotómetro es quien se encarga de separar los fragmentos generados y crea un espectro de fragmentación MS/MS característico del péptido analizado que aporta además información sobre su secuencia de aminoácidos.234 El espectro de masas obtenido se compara con la información almacenada en bases de datos de secuencias conocidas, como UniProt o GenBank, utilizando motores de búsqueda como Mascot (www.matrixscience.com) que ordenan las proteínas identificadas y llevan finalmente a la identificación de la proteína en cuestión. 48 Introducción mientras que en los estudios de microvesículas de plaquetas éstas son aisladas tras la activación de las plaquetas purificadas. En cualquier caso la eliminación de células residuales es fundamental, y en última instancia se realiza el aislamiento de las microvesículas por el método seleccionado. El aislamiento de microvesículas suele realizarse mediante ultracentrifugaciones o utilizando kits de extracción comerciales. Una revisión reciente de Smalley y colaboradores provee información detallada en cuanto al aislamiento de microvesículas de plaquetas, su proteoma y la contribución de éstas a las enfermedades humanas.284  Proteoma de gránulos plaquetarios Cuando las plaquetas son estimuladas con agonistas fuertes liberan el contenido de sus gránulos como consecuencia del aumento de Ca2+ citosólico. Del mismo modo que las MVs, estos gránulos forman parte del secretoma pero pueden ser aislados y estudiados de forma independiente. La liberación de los gránulos contribuye al aumento de la superficie de la membrana de las plaquetas debido a la fusión de sus membranas, y la liberación de su contenido a la sangre tiene grandes consecuencias tanto a nivel fisiológico (hemostasia) como patológico (trombosis, aterosclerosis y otros procesos patológicos). Como ya se ha mencionado, los gránulos de plaquetas contribuyen a la propagación de la activación plaquetaria y, por otra parte, a procesos tales como la coagulación, la defensa del huésped, la angiogénesis, la cicatrización de heridas y la inflamación.40 Las enfermedades de almacenamiento de plaquetas (o storage pool diseases) son trastornos genéticos raros que afectan predominantemente a los gránulos plaquetarios cuyos síntomas ilustran perfectamente la importancia de la secreción plaquetaria en la hemostasia. Existen distintos subtipos de gránulos α con distinto contenido proteico39 que son liberados de forma diferencial en función del estímulo. A pesar de la enorme importancia de los gránulos α, sólo un grupo ha estudiado su proteoma en detalle.285,286 Los gránulos densos contienen predominantemente moléculas pequeñas, y el estudio específico de su contenido ha sido únicamente abordado por el grupo de Hernández-Ruiz.37 Los resultados de este estudio revelaron un bajo número de proteínas, lo que es consistente con la gran proporción de pequeñas moléculas que albergan. El aislamiento de los gránulos plaquetarios se suele llevar a cabo tras la estimulación plaquetaria que provoca su liberación, y a continuación se eliminan los restos celulares por centrifugación. Entre las técnicas para el enriquecimiento de los gránulos destaca la centrifugación utilizando gradientes de sacarosa y la eliminación por centrifugación de los restos celulares y por ultracentrifugación de las microvesículas. 49 Introducción El análisis de subproteomas, así como los estudios de las vías de señalización, han proporcionado información suficiente como para que podamos afirmar que hoy en día un porcentaje importante del proteoma plaquetario ha sido descubierto. 1.4.4 Proteómica de plaquetas en enfermedades cardiovasculares Durante la última década el potencial de la proteómica para el estudio de enfermedades complejas ha aumentado exponencialmente. Las nuevas tecnologías altamente sensibles y la evolución de las estrategias de análisis (avances en el estudio de subproteomas,287,288 mejora en la visualización de proteínas poco abundantes…289,290) han permitido acceder a proteínas de baja abundancia aumentando el éxito en la detección de nuevos biomarcadores.239 De este modo, la proteómica se ha convertido en una herramienta indispensable para el descubrimiento de muchos receptores plaquetarios y proteínas de señalización, enriqueciendo la comprensión de la función biológica de estas células y potenciando la búsqueda de nuevos biomarcadores y antiagregantes plaquetarios.239 Los métodos de preparación y manipulación de muestras para los estudios de proteómica de plaquetas en enfermedades cardiovasculares han sido recientemente revisados por nuestro grupo51 y se han descrito brevemente en la sección 1.3.2 de esta introducción. El esquema general de un estudio proteómico de plaquetas en enfermedades cardiovasculares puede ser consultado en la Figura 8. En los últimos años los estudios del proteoma plaquetario se han ido focalizando en enfermedades con implicaciones plaquetarias y en la identificación de los cambios funcionales que surgen en diferentes patologías.291 Así se ha comenzado a investigar por proteómica el papel que desempeñan las plaquetas en diferentes patologías como la uremia,292,293 la fibrosis quística,294 enfermedades degenerativas como Alzheimer o Parkinson,295 defectos de función plaquetaria como el síndrome de plaquetas grises (gray platelet síndrome),285,286 el trastorno plaquetario de Quebec (Quebec platelet disorder)296 o el síndrome de depósito de gránulos delta (δ-storage pool disease).297 Además, la proteómica de plaquetas también ha contribuido en gran medida al campo de la transfusión sanguínea mediante el estudio de los cambios que se producen durante el almacenamiento de las plaquetas,208,209,254,255,298,299 pero sin duda alguna, el estudio de las enfermedades cardiovasculares y otras condiciones relacionadas con las mismas son las áreas clínicas en las que la proteómica de plaquetas ha tenido una mayor actividad.51 Los estudios de proteómica de plaquetas en el contexto de las enfermedades cardiovasculares han servido para arrojar luz sobre los mecanismos moleculares que 50 Introducción regulan la actividad plaquetaria en diferentes contextos patológicos. Hasta el momento se han publicado varios estudios relacionados con síndromes coronarios agudos,175,300-302 enfermedades coronarias estables,175,300-303 trombosis arterial,304 hipertensión202,305 y diabetes.306 Como en todo estudio clínico, el fin último es identificar posibles biomarcadores y dianas farmacológicas cuyo descubrimiento nos acerque hacia la aplicación de la proteómica para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades cardiovasculares, así como su tratamiento médico,307 pero además, los estudios proteómicos pueden abordar cuestiones de gran relevancia clínica como las diferencias en la respuesta a los tratamientos antiplaquetarios o el potencial patológico de plaquetas en la génesis de enfermedades cardiovasculares.308 Algunos de estos estudios en los que nuestro grupo ha sido pionero se han centrado en la búsqueda de biomarcadores y dianas farmacológicas de plaquetas en pacientes con enfermedad coronaria estable y síndromes coronarios agudos.175,300-302,309 En el caso de los SCAs, los estudios realizados reflejan en líneas generales una sobrerregulación de proteínas de señalización y de proteínas de citoesqueleto, además de una disminución de proteínas antioxidantes.175,300-302 Estos datos están en línea con el aumento de los niveles de activación plaquetaria detectados en pacientes con síndromes coronarios agudos, que podrían ser responsables de los eventos aterotrombóticos relacionados con el evento. Por otro lado, los estudios de pacientes con enfermedad coronaria estable también reflejan un estado hiperreactivo de las plaquetas.302,309 También se han realizado estudios de proteómica de plaquetas en otras patologías relacionadas con las enfermedades cardiovasculares, como la hipertensión202,305 o la diabetes,306 y los resultados también están en consonancia con el estado hiperreactivo de las plaquetas en esas patologías. En el caso de la diabetes, los resultados parecen indicar que la disfunción plaquetaria está mediada por la calpaína, por lo que se propone la inhibición de la activación de la calpaína como una manera para frenar el desarrollo de aterotrombosis y preservar la función plaquetaria.306 Otra línea de estudio interesante es la evaluación del efecto que tienen ciertos fármacos en el proteoma plaquetario.202,303,310,311 Los estudios realizados hasta el momento muestran que el tratamiento con terapia doble antiagregante parece disminuir la reactividad de las plaquetas, como era de esperar.311 Otro dato interesante proviene de estudios que indican que las plaquetas de pacientes resistentes a la aspirina pueden presentar un mayor estado de apoptosis que los pacientes sensibles a la aspirina.310 51 Introducción El diagnóstico precoz y el hallazgo de dianas terapéuticas mejoran los tratamientos y la supervivencia de los pacientes. Cuando un paciente se presenta con problemas cardiovasculares en el servicio de urgencias de un hospital, resulta trascendental un correcto y rápido diagnóstico. Aquí es donde reside la importancia de encontrar parámetros bioquímicos que funcionen como biomarcadores de la enfermedad y ayuden al clínico a diferenciar rápidamente el problema que aqueja al paciente. Los marcadores actuales como la troponina, la creatina quinasa total (CK) o la creatina quinasa MB (CK-MB), funcionan adecuadamente para detectar la necrosis miocárdica. Sin embargo la identificación de un biomarcador que permitiese la detección temprana de la isquemia, antes de llegar a producirse necrosis miocárdica, seria de suma importancia y podría llegar incluso a cambiar la medicina moderna en este campo.312 Por otro lado, la identificación de dianas moleculares potencialmente atacables para modificar el comportamiento de las plaquetas es un asunto que desborda interés. Numerosos estudios han demostrado el efecto beneficioso de la combinación de inhibidores de la COX e inhibidores del receptor de ADP, P2Y12, en diferentes situaciones clínicas agudas, como es el caso de los síndromes coronarios agudos. Sin embrago, la utilización de estas dianas presenta la desventaja de que en muchas ocasiones los pacientes continúan sufriendo complicaciones aterotrombóticas.313-316 En este punto radica la importancia de profundizar en el conocimiento de los mecanismos involucrados en el proceso de activación plaquetaria, ya que un mayor conocimiento permitirá el desarrollo de fármacos dirigidos a dianas terapéuticas nuevas todavía no completamente delimitadas. Todavía nos encontramos en las primeras etapas de la aplicación de la proteómica de plaquetas a la clínica, ya que sólo en los últimos 7 años se ha aplicado a estudios clínicos, y más en concreto a la investigación cardiovascular. Aunque es un trabajo complejo, la aplicación de una metodología adecuada, protocolos estandarizados y técnicas de fraccionamiento subcelular, junto con los avances recientes en la proteómica cuantitativa, permitirán la obtención de resultados prometedores para el descubrimiento de nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas. Los recientes avances en este campo nos permiten ser moderadamente optimistas. 2. Objetivos 55 Objetivos Los objetivos generales planteados en la presente tesis doctoral son: I. Identificar, mediante proteómica, nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas antiplaquetarias relevantes en infarto agudo de miocardio. II. Analizar en profundidad el nivel de activación de la vía de señalización del receptor de colágeno glicoproteína VI (GPVI) en plaquetas de pacientes con infarto agudo de miocardio con vistas a postular este receptor como diana terapéutica relevante en dicha patología. III. Caracterizar el potencial del fragmento Fab del anticuerpo monoclonal OM2 en la inhibición de GPVI y establecer las bases para la identificación de pequeñas moléculas inhibidoras de GPVI. De los objetivos generales se derivan los siguientes objetivos específicos: 1. Proporcionar información novedosa sobre proteínas de las microvesículas derivadas del plasma que pudieran estar jugando un papel relevante en los eventos fisiopatológicos que subyacen a un IAMCEST y que pudieran servir como biomarcadores o dianas terapéuticas para la enfermedad. 2. Analizar el proteoma de las plaquetas procedentes de sangre arterial del lugar de la oclusión, en comparación con sangre arterial periférica, en pacientes con IAMCEST, con el fin de ampliar el conocimiento sobre la fisiopatología del infarto, e identificar proteínas alteradas que pudieran servir como biomarcadores o dianas terapéuticas. El estudio de las plaquetas en contacto con el trombo podría reflejar fielmente lo que sucede durante el infarto. 3. Analizar el estado de activación de la vía de señalización de GPVI en plaquetas obtenidas a partir de sangre periférica venosa de pacientes con IAMCEST para confirmar su estado de activación. 4. Analizar los niveles de activación de la vía de señalización de GPVI en plaquetas procedentes de sangre arterial intracoronaria en contacto directo con el trombo (lugar 56 Objetivos de la oclusión), con el fin de determinar si presentan mayores niveles de activación de la vía que aquellas alejadas del lugar de la oclusión. 5. Testar el efecto inhibitorio que tiene el fragmento Fab del anticuerpo monoclonal OM2 sobre el receptor plaquetario GPVI, tanto a nivel de agregación como a nivel bioquímico. 6. Determinar cuál de los receptores de colágeno presentes en las plaquetas es el principal responsable de la agregación/activación inducida por colágeno. 7. Buscar pequeños inhibidores del receptor de colágeno GPVI para su uso como potenciales agentes antitrombóticos mediante técnicas de cribado de alto rendimiento (high-throughput screening, HTS) en combinación con estudios de simulación computacional. 57 Objetivos Para alcanzar los objetivos anteriores se han planteado los siguientes estudios: 1. Estudio de las microvesículas del plasma de pacientes con IAMCEST. 2. Estudio de las plaquetas de pacientes con IAMCEST obtenidas de sangre arterial en contacto con el trombo. 3. Estudios de la vía de señalización de GPVI en pacientes con IAMCEST: 3.1 Estudio de la vía de señalización de GPVI en sangre venosa de pacientes con IAMCEST. 3.2 Estudio de la vía de señalización de GPVI en sangre arterial de pacientes con IAMCEST. 4. Estudios de inhibición de la vía de señalización de GPVI: 4.1 Inhibición de la vía de señalización de GPVI mediante el fragmento Fab del anticuerpo OM2. 4.2 Estudio de la agregación plaquetaria inducida por colágeno y CRP e inhibición de la misma con inhibidores específicos de los principales receptores de colágeno. 4.3 Búsqueda de pequeños inhibidores de GPVI. 64 Material y métodos 3.2.2 Aislamiento de plaquetas Todas las muestras de sangre fueron procesadas con un margen riguroso de dos horas desde el momento de la extracción para evitar activaciones espontáneas que pudiesen alterar el proteoma. Las plaquetas se aislaron mediante un procedimiento estandarizado con el fin de limitar la contaminación con otras células sanguíneas y proteínas del plasma, minimizando además la posibilidad de una activación plaquetaria indeseada debida a la manipulación de las muestras.211 Este procedimiento se esquematiza en la Figura 13 y se explica a continuación: - Se calienta en un baño térmico a 30oC ácido-citrato-dextrosa (ACD) y tampón de Tyrode modificado (MTB) que se suplementa con 5 mM de glucosa justo antes de empezar el experimento. - Se añade a cada tubo de sangre un 10% (v/v) de ACD para mantener el pH del medio controlado (aproximadamente 6,6) y evitar la agregación plaquetaria. Se mezcla invirtiendo suavemente los tubos tres veces. - La sangre se pasa a tubos de polipropileno adaptados para una centrífuga hematológica y se centrifuga durante 20 min a 200 g. Esta centrifugación separa la sangre en una fase inferior roja compuesta de eritrocitos y una parte superior amarillenta donde se encuentra el plasma rico en plaquetas (platelet-rich plasma, PRP), ambas separadas por una interfase con forma de disco blanquecino compuesta de leucocitos. - Se recogen únicamente las 3/4 partes superiores de la fracción de PRP para asegurarse de evitar la contaminación con leucocitos, y se pasa a un tubo de polipropileno de 50 mL. - Se añade prostaglandina I2 (PGI2) (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, EEUU) 1 µM para evitar que se activen las plaquetas por las fuerzas de centrifugación. Se mezcla lentamente por inversión y se centrifuga 10 min a 1000 g. En esta fase se consigue separar las plaquetas por deposición en el fondo del tubo. El sobrenadante es el plasma pobre en plaquetas (platelet-poor plasma, PPP) que se utilizará en el caso de los estudios de microvesículas. - El sedimento de plaquetas se resuspende en 150 µL de ACD y 1 mL de MTB, se mezcla y se incrementa el volumen con MTB hasta 25 mL y se añaden 3 mL de ACD. - Para realizar el contaje de las plaquetas lo primero es preparar el contador de plaquetas (Z1 Coulter Particle Counter, Beckman Coulter) haciendo dos medidas del blanco (10 mL de Isoton II) que den por debajo de 1x106 partículas. A continuación se diluyen 5 µL de suspensión de plaquetas en 10 mL de tampón de contaje Isoton II (Beckman Coulter, Brea, CA, EEUU) y se mide por duplicado controlando que el número de partículas/células que pudieran estar contaminando la muestra sea menor a 1x106. El 65 Material y métodos contador se calibra de modo que sólo cuente como plaquetas aquellas células de un tamaño comprendido entre 1,785 y 3,855 µm. - Se vuelve a añadir PGI2 1µM a la suspensión de plaquetas y se centrifuga 10 min a 1000g para eliminar contaminaciones plasmáticas. - El sedimento de plaquetas se resuspende de nuevo en la cantidad necesaria de MTB para dejar las plaquetas a la concentración deseada en función del estudio (entre 4 y 8x108 plaquetas por mL), y siempre por debajo de 1x109 plaquetas por mL para evitar agregación espontánea. - Se deja reposar la muestra a temperatura ambiente durante 30 min para que la PGI2 deje de funcionar. - En los estudios que no implican activaciones las plaquetas se dejan a una concentración de 8x108, se dividen en alícuotas de 500 µL y se lisan con otros 500 µL de tampón de lisis 2X suplementado con inhibidores de proteasas y fosfatasas. Tras dejar reposar en hielo durante 15 min, se centrifugan las alícuotas a 10000 g durante 5 min. Se pasa el sobrenadante a un nuevo tubo y se realizan lisados totales de la siguiente manera: 32 µL de muestra + 8 µL de tampón Laemmli 5X. Se hierven los lisados 5 min a 100oC. También se separan alícuotas para cuantificar y se guardan junto con las muestras y los lisados a -80oC hasta el momento de su utilización. En el caso de los estudios en los que se llevan a cabo activaciones se procedió como se explica en la siguiente sección. Figura 13 - Diagrama representativo del método de aislamiento de plaquetas. 66 Material y métodos 3.2.3 Activación e inhibición de plaquetas 3.2.3.1 Activación para estudios de agregación Para aquellos estudios en los que se pretende estudiar la respuesta de agregación tras la estimulación plaquetaria el protocolo utilizado fue el siguiente: - Se dejan las plaquetas a una concentración de 3 ó 4x108 por mL en función del estudio y no se añaden inhibidores de la agregación ni de los mediadores secundarios. - En un agregómetro Chrono-log se calientan a 37 oC alícuotas de 500 µL de plaquetas (1,5 o 2x108 plaquetas) durante 4 min sin agitación y durante 1 min con agitación constante (1200 rpm). - A continuación se estimulan las plaquetas durante 5 min con agitación constante (1200 rpm) utilizando el agonista que corresponda o su diluyente como control de la agregación basal, y se registran las curvas de agregación en un ordenador acoplado al agregómetro. Las plaquetas se desechan tras su activación. 3.2.3.2 Activación para estudios bioquímicos En el caso de los estudios destinados al análisis bioquímico tras la activación plaquetaria se procedió de la siguiente manera: - Se dejan las plaquetas a una concentración de 6x108 plaquetas por mL (estudios de inmunoprecipitación) o de 4x108 plaquetas por mL (estudios de inmunodetección) y se añade sobre el volumen total de las plaquetas 1 mM de EGTA o 900 µM de integrilina 5 min antes de la activación plaquetaria para inhibir la agregación. Además se añaden inhibidores de los mediadores secundarios (2 U/mL apirasa y 10 mM indometacina) para evitar la amplificación de la activación plaquetaria inducida por el ADP y los tromboxanos liberados por las propias plaquetas activadas. - Se dividen las plaquetas en alícuotas de 500 µL (2 ó 3x108 plaquetas) y se calientan a 37oC durante 2 min sin agitación y durante 30 segundos con agitación constante a 1200 rpm en un agregómetro Chrono-log. - Se estimulan las plaquetas durante 90 segundos en el caso de CRP, colágeno y trombina, o durante 4 min en el caso de rhodocytin. Las estimulaciones se realizan en agitación constante (1200 rpm) con el agonista adecuado o el diluyente del agonista como control. - Se para la reacción de activación lisando las plaquetas con 500 µL de tampón de lisis 2X suplementado con inhibidores y se dejan reposar en hielo durante 15 min. 67 Material y métodos - Se separa una alícuota para cuantificación y se congelan las muestras a -80oC, o se procede directamente con el siguiente paso (inmunoprecipitación o precipitación de proteína). 3.2.3.3 Inhibición de GPVI Para el estudio de la inhibición de GPVI se utilizó el fragmento Fab del anticuerpo monoclonal OM2 (Fab-OM2) cedido por Otsuka Maryland Medicinal Laboratories, Rockville, Japón. El estudio de la inhibición de dicho receptor por parte de Fab-OM2 se realizó tanto a nivel de agregación como bioquímico, como se explica a continuación. Estudio de inhibición de la agregación tras la estimulación de GPVI: - Se añade la cantidad deseada del inhibidor Fab-OM2 sobre 500 µL de plaquetas (1,5x108 plaquetas) justo antes de su activación en el agregómetro. - Se calientan las alícuotas a 37oC durante 10 min sin agitación para dejar actuar el inhibidor, y durante 1 min con agitación constante (1200 rpm) en un agregómetro Chrono-log. - Finalmente se realizan estimulaciones durante 5 min y se registra la agregación. Estudio de inhibición de la activación de GPVI: - En estos estudios se añade un inhibidor de la agregación (900 µM de integrilina) e inhibidores de los mediadores secundarios (2 U/mL apirasa y 10 mM indometacina) para evitar la amplificación de la activación plaquetaria inducida por el ADP y los tromboxanos liberados por las propias plaquetas activadas. - Se añade la cantidad deseada del inhibidor Fab-OM2 sobre 500 µL de plaquetas (4x108 plaquetas) justo antes de su activación en el agregómetro. - Se calientan las alícuotas a 37oC durante 10 min sin agitación para dejar actuar el inhibidor, y durante 30 segundos con agitación constante (1200 rpm) en un agregómetro Chrono-log. - Finalmente se realizan estimulaciones durante 90 segundos con los agonistas deseados, salvo en el caso de la rhodocytin en donde las plaquetas son estimuladas durante 4 min. 68 Material y métodos 3.2.4 Precipitación de proteína a partir de lisados de plaquetas para estudios proteómicos por 2D-DIGE Las proteínas se extrajeron a partir de las suspensiones de plaquetas congeladas y lisadas, utilizando precipitación con 20% de ácido tricloroacético (trichloroacetic acid, TCA) en acetona según el siguiente protocolo: - Sobre las muestras todavía congeladas se añade TCA/Acetona 60% (m/v) en una proporción 1:2 (v/v) y se dejan reposar en hielo durante 45 min. La concentración final de TCA es del 20%. - A continuación se centrifugan las muestras durante 2 min a 10000 g y se descarta el sobrenadante. - Se lavan las muestras con 500 µL de acetona fría para eliminar los posibles lípidos residuales y se aplica sonicación ligera a pulsos de 1 segundo para disgregar el sedimento formado. Se centrifuga durante 2 min a 10000 g y se descarta el sobrenadante. Este paso se realiza por duplicado. - Finalmente se resuspenden las muestras en el tampón de muestra 2D-DIGE (50 µL en el caso de estudios plaquetarios y 40 µL en el caso del estudio de MVs) y se congelan o se procede directamente con el siguiente paso. 3.2.5 Inmunoprecipitación de proteína para estudios proteómicos En los estudios proteómicos y bioquímicos de la vía de GPVI se realizó inmunoprecipitación de las proteínas fosforiladas en tirosina a partir de muestras congeladas y lisadas. El protocolo utilizado fue el siguiente: - El primer paso es el preaclarado de la muestra para eliminar posibles interacciones inespecíficas entre proteínas y bolitas de sefarosa recubiertas de proteína A (protein A sepharose, PAS) o con el anticuerpo de la inmunoprecipitación. Este preaclarado se realiza con bolitas de PAS previamente hidratadas con TBS-T en una relación 1:1 (v/v). Se añaden 25 µL de PAS hidratado a cada muestra y se incuban durante 1 h a 4oC en rotación. - Una vez preaclaradas, se centrifugan las muestras a 10000 g y a 4oC durante 10 min, y se recoge el sobrenadante. En este punto se preparan los lisados totales (32 µL de muestra y 8 µL de tampón de Laemmli 5X), se hierven durante 5 min y se guardan a -80oC hasta su uso. 69 Material y métodos - Tras dejar reposar los lisados preaclarados en hielo durante 20 min, se añaden 10 µg del anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina 4G10 conjugado a agarosa (Millipore) a cada alícuota y se dejan en rotación a 4oC toda la noche para que la proteína interaccione con el anticuerpo. - A la mañana siguiente se centrifugan las muestras durante 1 min a 10000 g y a 4oC. Se retira el sobrenadante y se lava el sedimento de bolitas una vez con 1 mL de tampón de lisis 1X y dos veces más con 1 mL de TBS-T, intercalando centrifugaciones de 1 min a 10000 g y a 4oC y descartando el sobrenadante. - Finalmente se añaden 10 µL de tampón de Laemmli 2X sobre las bolitas para liberar la muestra unida al anticuerpo, se mezcla en el agitador de vórtice y se hierve durante 5 min. Se centrifuga de nuevo 1 min a 10000 g y se pasa la muestra a un nuevo microtubo para eliminar las bolitas. 3.2.6 Preparación de plasmas y aislamiento de microvesículas Como se ha explicado con anterioridad, durante el proceso de aislamiento de plaquetas se obtiene una fracción de plasma pobre en plaquetas (PPP). A partir de ahí se continuó de la siguiente manera para obtener el plasma libre de plaquetas (platelet free plasma o PFP): - Se centrifuga el PPP durante 10 min a 1500 g para eliminar plaquetas. - Se recoge el sobrenadante y se vuelve a centrifugar 2 min a 15000 g para eliminar completamente cualquier resto de plaquetas. De esta forma se obtiene el PFP. - Se divide el PFP en alícuotas y se congela a -80°C hasta su procesamiento. Se realizaron pruebas para la extracción de microvesículas (MVs) basadas en diferentes protocolos publicados. Los mejores resultados se obtuvieron con el protocolo de Ramacciotti y colaboradores317 con la adición de un lavado final en PBS. La extracción de microvesículas plasmáticas se realizó como sigue: - El volumen de PFP utilizado para la extracción de MVs son 7,2 mL por paciente, y se utilizan 6 tubos de ultracentrífuga. En cada tubo se diluyen 1,2 mL de PFP en 3 mL de tampón HEPES y se ultracentrifuga durante 90 min a 200000 g y 4°C. - Tras retirar el sobrenadante se resuspende el sedimento de MVs en 4 mL de KBr 0,25 M para solubilizar proteínas plasmáticas y se incuba en hielo durante 20 min. Se ultracentrifuga de nuevo en las mismas condiciones. 70 Material y métodos - Se retira el sobrenadante, se lava el sedimento con 4 mL de PBS 1X y se realiza una última ultracentrifugación en las mismas condiciones. - Tras eliminar el sobrenadante se deja secar el sedimento de MVs al aire y finalmente se disuelve en 40 µL de tampón 2D-DIGE que se van trasladando de tubo en tubo hasta disolver por completo todas las MVs. Finalmente se aparta una alícuota para cuantificación y se guardan las muestras a -80°C. 3.2.7 Cuantificación de proteína Para cuantificar proteína se utilizó el método Bradford318 y se optó por utilizar el reactivo Coomassie Plus (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EEUU) por su compatibilidad con el tampón de muestra 2D-DIGE. El protocolo de cuantificación se realizó como sigue: - Se atemperan 50 mL de Coomassie Plus al mismo tiempo que se van descongelando las muestras en hielo. - Se realiza por duplicado una curva patrón que consiste en seis diluciones consecutivas 1:2 de la BSA concentrada (2 µg/µL) utilizando como diluyente el tampón 2D-DIGE en que se encuentra disuelta la muestra. Para ello se dispensan 20 µL de diluyente a cada tubo de la recta y se añaden 20 µL del BSA concentrada en el primer tubo que se van trasladando en serie al resto de los tubos. De esta manera se obtiene una curva patrón con seis puntos con las siguientes concentraciones de BSA: 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25 µg/mL. - Se añaden 600 µL de Coomassie Plus a cada tubo, se mezclan en el agitador de vórtice y se dejan reposar durante 5 min. - Para la lectura de absorbancia en el espectrofotómetro se selecciona la longitud de onda de 595 nm y se hace un blanco con tampón de 2D-DIGE (20 µL) y Coomassie (600 µL). Se traspasa el contenido de cada tubo a cubetas de espectrofotómetro y se leen las absorbancias. La variación entre los duplicados no puede ser mayor de un 10%. - Las muestras se preparan también por duplicado añadiendo normalmente 2 µL (según su concentración) sobre 600 µL de Coomassie y se mezclan en el agitador de vórtice. El blanco de las muestras se realiza añadiendo el mismo volumen que de las muestras (normalmente 2 µL) sobre 600 µL de Coomassie. - Tras dejar reposar 5 min se mide la absorbancia a la misma longitud de onda que la utilizada para la recta. En este caso la variación entre los duplicados tampoco puede ser mayor de un 10%. - Finalmente se calculan los datos de la concentración de las muestras utilizando la curva patrón. 71 Material y métodos 3.2.8 Estudios de proteómica 3.2.8.1 Electroforesis monodimensional (1D-SDS-PAGE) El estudio proteómico de la vía de señalización del receptor GPVI se basó en 1D-SDS-PAGE. Partiendo de las muestras inmunoprecipitadas y lisadas en tampón de Laemmli se realizaron pools de inmunoprecipitaciones y se corrieron en un gel de poliacrilamida en gradiente del 4-12% NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA, EEUU) de 8x8 cm. Tras la electroforesis se fijó el gel en una solución de 10% metanol y 7% ácido acético durante 1 hora, se tiñó toda la noche con el colorante fluorescente Sypro Ruby (Lonza Group, Basilea, Suiza) y se lavó finalmente con la solución de 10% metanol y 7% ácido acético durante 30 min. El escaneado del gel se realizó con el Gel Doc XR de Bio-Rad. Las bandas de interés fueron recortadas del gel con ayuda de un transiluminador de luz azul DR-45M (Clare, Chemical Research, Dolores, CO, EEUU) y digeridas con tripsina como se explicará más adelante. 3.2.8.2 Electroforesis bidimensional 2D-DIGE Esta tesis incluye dos estudios proteómicos basados en 2D-DIGE: i) Estudio de las microvesículas del plasma de pacientes con IAMCEST. ii) Estudio de las plaquetas de pacientes con IAMCEST obtenidas de sangre arterial en contacto con el trombo. Como los fluoróforos son fotosensibles, todos los pasos que conforman un ensayo 2D-DIGE deben ser realizados en oscuridad.  Marcaje fluorescente El análisis 2D-DIGE se inició con el marcaje de las muestras utilizando fluoróforos de marcaje mínimo que se unen a los residuos lisina de las proteínas. Independientemente del estudio, en cada uno de los geles se cargó un total de 150 µg de proteína, de los que 50 µg procedían de cada una de las condiciones a comparar y los otros 50 µg correspondían al estándar interno compuesto por una mezcla a partes iguales de todas las muestras incluidas en el análisis. El protocolo de marcaje se describe a continuación: 72 Material y métodos - Utilizando tiras indicadoras de pH se comprueba que el pH de las muestras se encuentre en torno a 8-8,5. - Se reconstituyen los tres fluoróforos en dimetilformamida anhidra (DMF) a una concentración de 1000 pmol/µL. Esta solución es estable durante tres meses a -20oC. - Los fluoróforos son nuevamente diluidos hasta una concentración de trabajo de 400 pmol/µL. Esta solución es estable 2 semanas a -20oC. - Se marcan 50 µg de cada muestra con 400 pmol de los fluoróforos Cy3 y Cy5, y 50 µg del estándar interno con el tercer fluoróforo, el Cy2. Se dejan reaccionar los marcadores y la muestra durante 30 min en hielo. - La reacción se para añadiendo 1 µL de lisina 10 mM a cada muestra y se deja reposar en hielo durante 10 min. - A continuación se juntan las tres muestras marcadas en un mismo tubo y se añade el mismo volumen de tampón de muestra 2X. Se mezcla en el agitador de vórtice y se deja reposar de nuevo durante 15 min en hielo. - Se añaden anfolitos a una concentración final 1,6% (v/v) (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania) y tampón de muestra 2-DE hasta un volumen final de 500 µL. - Finalmente se homogeneiza la muestra en un agitador de vórtice durante 2 min y se centrifuga durante 5 min a 10000 g para eliminar los posibles contaminantes.  Rehidratación Las tiras IPG se rehidrataron pasivamente durante 14-16 h con las muestras ya marcadas, utilizando tiras de gradiente de pH 4-7 de 24 cm (GE Healthcare). El proceso de rehidratación se explica a continuación: - Se pipetea cada muestra en un carril de la bandeja de rehidratación (Immobiline DryStrip Reswelling Tray, GE Healthcare) y se coloca encima la tira con el gel en contacto con la muestra. - Finalmente se cubre todo con aceite mineral DryStrip Cover Fluid (GE Healthcare) para evitar evaporaciones. 73 Material y métodos  Primera dimensión o isoelectroenfoque El siguiente paso, el isoelectroenfoque (isoelectric focusing, IEF), se realizó en el Multiphor II (GE Healthcare) a 17oC como se explica a continuación: - Tras rehidratar las tiras IPG se elimina el exceso de aceite dejándolo escurrir sobre un papel de filtro y a continuación se colocan en el Multiphor II con el gel hacia arriba. - Se colocan pequeñas tiras de papel de electrodo humedecidas con agua milliQ en los dos extremos de cada tira IPG con el fin de absorber posibles sales presentes en la muestra y se cubren las tiras con aceite mineral. - Se colocan los electrodos en la posición adecuada y se procede con el isoelectroenfoque. Programa para la primera dimensión de 2D-DIGE (64,4kVhT):  Fase 1: 150 V en gradiente, 3 mA, 5 W, 2 h  Fase 2: 300 V en gradiente, 10 mA, 5 W, 2 h  Fase 3: 1000 V en gradiente, 10 mA, 5 W, 1 h  Fase 4: 3500 V en gradiente, 10 mA, 5 W, 18 h  Equilibrado Antes de realizar la segunda dimensión se trataron las muestras con tampón de equilibrado 2D-DIGE. En este paso el SDS confiere a las proteínas una distribución de cargas negativa acorde con su tamaño, lo que permitió su separación por peso molecular en la segunda dimensión. El protocolo de equilibrado utilizado fue el siguiente: - Se colocan las tiras de nuevo en la bandeja de rehidratación y se incuban durante 15 min en agitación con el tampón de equilibrado 2D-DIGE suplementado con DTT 2% (p/v) que sirve para mantener a las proteínas en estado desnaturalizado. - Se pasan las tiras a un nuevo carril de la bandeja de rehidratación y se incuban durante otros 15 min en agitación con el tampón de equilibrado 2D-DIGE suplementado con iodoacetamida 2,5% (p/v). Este compuesto protege a los grupos sulfhidrilo de reoxidaciones para su mejor identificación por espectrometría de masas. - Para finalizar se lavan las tiras IPG con abundante agua destilada. 80 Material y métodos 3.2.9 Estudios de validación Para realizar las validaciones de las proteínas de interés se realizaron inmunodetecciones o inmunoprecipitaciones seguidas de inmunodetecciones, en función del estudio. 3.2.9.1 Inmunoprecipitaciones Para las validaciones del estudio de la vía de señalización de GPVI se realizaron inmunoprecipitaciones de las proteínas fosforiladas en tirosina, seguidas por inmunodetecciones de las proteínas de interés. Las inmunoprecipitaciones se realizaron como se describe en el apartado 3.2.5 de esta sección, con la diferencia de que en este caso se añadieron 5 µg del anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina 4G10 conjugado a agarosa (Millipore) a cada inmunoprecipitación. Las proteínas inmunoprecipitadas se eluyeron en 30 µL de tampón Laemmli 2X y se procedió con las inmunodetecciones. 3.2.9.2 Inmunodetecciones Las validaciones por inmunodetección se realizaron en geles de 8x8 cm. Los geles empleados fueron de poliacrilamida al 10% o geles comerciales en gradiente 4-12% NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). En función del estudio se realizaron geles mono o bidimensionales y se utilizaron marcadores de peso molecular Precision Plus Protein Standard (Bio-Rad). i) Inmunodetección en geles monodimensionales Para las inmunodetecciones por 1D se suplementó el volumen necesario de muestra (según el experimento) con el mismo volumen de tampón Laemmli 2X y se completó con tampón Laemmli 1X hasta 40 µL. Los geles se corrieron en el sistema XCell SureLock (Invitrogen) utilizando tampón de electroforesis en el caso de los geles hechos a mano, y tampón de electroforesis comercial MOPS (Invitrogen) para los geles comerciales. La electroforesis se realizó a 80 V durante 10 min para que las proteínas penetrasen lentamente en el gel, y a continuación a 120 V hasta que el frente llegase al final del gel. ii) Inmunodetección en geles bidimensionales En los estudios de MVs e intracoronaria algunas de las validaciones se realizaron mediante inmunodetección tras una electroforesis bidimensional. El protocolo utilizado fue el mismo que se explicó en el apartado del 2D-DIGE (3.2.8.2), con algunas excepciones: se utilizan tiras de 7 cm y pH 4-7 para el IEF, y el volumen necesario (según el experimento) de la 81 Material y métodos muestra disuelta en tampón de 2D-DIGE se suplementa con el mismo volumen de tampón de muestra 2X, anfolitos (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania) a una concentración final de 1,6% (v/v) y tampón de muestra 2-DE hasta un volumen final de 125 µL. Programa utilizado para la primera dimensión en geles pequeños:  Fase 1: 200 V, 3 mA, 5 W, 1 min  Fase 2: 3500 V, 10 mA, 5 W, 1 h 30 min  Fase 3: 3500 V, 10 mA, 5 W, 1 h 40 min La segunda dimensión se realizó en geles de poliacrilamida al 10% de 8x8 cm, y se corrió en el sistema XCell SureLock (Invitrogen) utilizando tampón de electroforesis. La electroforesis se realizó a 80 V durante 10 min y posteriormente a 120 V hasta que el frente llegase al final del gel. Una vez resueltas las proteínas en geles mono o bidimensionales se procedió a su transferencia a membranas de polifluoruro de vinilideno (PVDF) utilizando un sistema húmedo y siguiendo el protocolo que se describe a continuación: - Tras extraer cuidadosamente los geles de sus carcasas se depositan en una cubeta con tampón de transferencia durante 5 min para eliminar los restos del tampón de electroforesis. - Se monta el sándwich de transferencia utilizando esponjas para engrosar el sistema de transferencia y papeles de filtro para separar los geles y las membranas de las esponjas. Sobre cada gel se deposita una membrana de PVDF de su mismo tamaño, previamente hidratada. - Se realiza la transferencia en el sistema XCell SureLock (Invitrogen) a 200 mA constantes durante 2 h. Finalizada la transferencia se procedió con las incubaciones y lavados como se detalla a continuación: - Tras lavar las membranas en TBS-T durante 5 min, se bloquean en solución de bloqueo toda la noche a 4oC. - Al día siguiente se incuban las membranas con los anticuerpos de interés a una concentración y durante un tiempo óptimos, determinados experimentalmente. La 82 Material y métodos incubación y todos los pasos siguientes se realizan a temperatura ambiente y en agitación constante. - Se realizan tres lavados de 10 min con TBS-T. Se añade el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con la enzima peroxidasa de rábano y se incuba durante 1 h. - Se realizan nuevamente tres lavados de 10 min en TBS-T para eliminar todo el anticuerpo secundario que no esté unido al primario. Finalmente se procedió con el revelado utilizando Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific), Hypercassete (GE Healthcare), placas radiográficas Amersham Hyperfilm ECL (GE Healthcare) y líquidos de revelado de Ilford (Harman technology LTD, Alemania). Ocasionalmente se realizaron estripados de las membranas para poder incubarlas de nuevo con otro anticuerpo. Para ello se sumergieron las membranas en solución de retirada de anticuerpos durante 30 min a 50oC (en baño térmico), se realizaron tres lavados de 10 min con TBS-T y se volvieron a bloquear en solución de bloqueo toda la noche a 4oC. En la Tabla 4 se presenta una relación de todos los anticuerpos empleados durante la realización de la presente tesis doctoral. 83 Material y métodos Tabla 4. Lista de anticuerpos primarios y secundarios utilizados para las inmunoprecipitaciones e inmunodetecciones. Anticuerpos Primarios Casa Comercial Referencia Modo de empleo* Clase 4G10 (pTyr) Millipore 05-321 ID: 1:1000 / 90 min IgG2bk Ratón Mc 4G10 - Conjugado a agarosa Millipore 16-101 IP: 10 µg/IP (Proteómica) 5 µg/IP (ID) IgG Ratón Mc Actina Millipore MAB1501 ID: 1:1000 / 60 min IgG1κ Ratón Mc A2MG Santa Cruz sc-69750 ID: 1:1000 / 90 min IgG1 Ratón Mc Dok-2 Santa Cruz sc-13952 ID: 1:500 / 90 min IgG Conejo Pc Fibrinógeno Santa Cruz sc-69775 ID: 1:1000 / 90 min IgG1 Ratón Mc G6f CovalAb UK [14] ID: 1:1000 / 90 min IgG Conejo Pc GAPDH Ambion AM4300 ID: 1:200 / 60 min IgG1 Ratón Mc ITA2B Santa Cruz sc-15328 ID: 1:500 / 90 min IgG Conejo Pc MMRN1 Santa Cruz sc-104426 ID:1:500 / 90min IgG Cabra Pc PLCγ2 Santa Cruz sc-5283 ID: 1:500 / 90min IgG1 Ratón Mc RSAD2/Viperin Santa Cruz sc-102099 ID: 1:500 / 90 min IgG Conejo Pc SKAP2 Abcam ab96274 ID: 1:500 / 120 min IgG Conejo Pc SLP76 Santa Cruz sc-9062 ID: 1:500 / 90 min IgG Conejo Pc TLN1 Santa Cruz sc-15336 ID: 1:1000 / 60 min IgG Conejo Pc TSP1 Santa Cruz sc-73158 ID: 1:200 / 90 min IgG1 Ratón Mc Anticuerpos Secundarios IgG anti-cabra Santa Cruz sc-2020 ID: 1:5000 / 60 min IgG Burro Pc IgG anti-conejo Thermo Scientific 31460 ID: 1:5000 / 60 min IgG Cabra Pc IgG anti-ratón Thermo Scientific 31430 ID: 1:5000 / 60 min IgG Cabra Pc *IP: inmunoprecipitación; ID: inmunodetección; Mc: monoclonal; Pc: policlonal. 3.2.10 Análisis estadísticos Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico IBM SPSS Statistics 20 para Windows (IBM, NY, EEUU) y las gráficas con el GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc. San Diego California, EEUU). Los datos clínicos de los pacientes se expresan en porcentajes cuando se trata de variables categóricas y se compararon utilizando el test exacto de Fisher. En el caso de las variables continuas se utilizó el test exacto U de Mann-Withnney, y se expresan como la media seguida de la desviación estándar. En los estudios proteómicos se utilizó el estadístico ANOVA para calcular el valor p en cada una de las manchas proteicas utilizando los 84 Material y métodos volúmenes cuantificados y normalizados de cada una de las imágenes del análisis. Los valores de probabilidad empleados fueron en todos los casos de dos colas, considerando estadísticamente significativos aquellos con un p<0,05. Para los estudios de validación se realizaron densitometrías de las manchas proteicas o de las bandas utilizando el software ImageMeter versión1.1 (Flashcript). La comparación estadística de los grupos incluidos en cada estudio se realizó empleando el test exacto U de Mann-Whithnney o el test de Wilcoxon matched-pairs signed rank test, según correspondiese. 3.2.11 Análisis de biología de sistemas Con el fin de explorar las relaciones existentes entre las proteínas diferencialmente expresadas se utilizó Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity Systems, Redwood Cyty, CA, EEUU). Se empleó el módulo de exploración de redes que genera información de las diferentes redes de interacción en las que están implicadas las proteínas, así como las principales funciones en las que éstas están involucradas. De este modo se introdujo en cada estudio la lista de proteínas diferenciales encontradas y se analizaron utilizando los siguientes parámetros: - Ingenuity Knowledge Base (Genes Only) como base de datos de referencia. - Relaciones directas e indirectas entre las proteínas. - 25 redes por análisis. - 140 moléculas por red. - Todas las fuentes de datos disponibles. - Todos los tejidos y líneas celulares. - Solo los datos validados experimentalmente son de confianza. - Datos restringidos a la especie humana. Este programa generó información sobre las principales rutas canónicas en las que tienen protagonismo las proteínas detectadas como diferenciales, así como de aquellas patologías en las que están involucradas. 85 Material y métodos 3.2.12 Estudios para caracterización de MVs i) Caracterización de las MVs mediante citometría de flujo Uno de los métodos empleados para la caracterización de las MVs tras su aislamiento fue la citometría de flujo (fluorescence activated cell sorting, FACS). Tras la segunda ultracentrifugación realizada durante el proceso de extracción de MVs (ver sección 3.2.6) se separó una alícuota de MVs disueltas en KBr 0,25 M y se procedió como se indica a continuación: - Se incuba la alícuota de MVs con anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD41 conjugado con FITC (DakoCytomation F7088) durante 30 min a 4oC y en oscuridad. - Se utiliza un isotipo control (BD Biosciences) con el fin de descartar la posible unión inespecífica del anticuerpo. - Se añaden 3 gotas / mL de bolitas de entre 1 y 1,4 µm (Spherotech Inc., Lake Forest, IL, EEUU) para estimar el tamaño de las MVs. Para el análisis FACS, el umbral del parámetro que determina el tamaño de las partículas (Forward Scatter, FSC) fue eliminado y el umbral del parámetro que determina la complejidad de las mismas (Side Scatter, SSC) se colocó en 300. La adquisición de los parámetros FSC y SSC se realizó en escala logarítmica, debido al reducido tamaño de las MVs. Para cada muestra se realizaron 30000 eventos de adquisición dentro de la región CD41+. El análisis se realizó en un citómetro de flujo BD FACS CANTO II, utilizando el software FACS Diva Version 6.1.2. ii) Caracterización de las MVs mediante microscopía electrónica de transmisión Del mismo modo, se realizó un análisis de microscopía electrónica de transmisión (transmission electron microscopy, TEM) para caracterizar las MVs plasmáticas aisladas. Se utilizaron muestras frescas de MVs obtenidas tras la segunda ultracentrifugación del proceso de extracción de (ver sección 3.2.6). Se recogió el sedimento de MVs diluído en 100 µL de PBS estéril y se colocaron 10 µL en una rejilla de cobre cubierta con una membrana Formvar. La muestra se tiñó con ácido fosfotúngstico con el fin de aumentar el contraste y una vez seca se introdujo en el microscopio electrónico de transmisión PHILIPS CM-12 (FEI Company, Eindhoven, Países Bajos) donde se analizó a 100 kV. 86 Material y métodos iii) Estimación de la distribución de las subpoblaciones de MVs mediante dispersión dinámica de luz Con el fin de estimar la distribución de los tamaños de partículas en suspensión presentes en la muestra se recurrió a la técnica de dispersión dinámica de luz (dynamic light scatterin, DLS) utilizando un Nanosizer ZS (Malvern). Este dispositivo tiene en cuenta la variación en la intensidad de dispersión de luz que producen las partículas en el tiempo. En este caso se realizó el procedimeinto completo de aislamiento de MVs y se resuspendieron finalmente en PBS 1X. Para este análisis se utilizó una dilución 1:10 de la concentración original de MVs. El área bajo cada pico se integró para producir una estimación del porcentaje de volumen de cada población de vesículas. 3.2.13 Búsqueda de pequeños inhibidores de GPVI Estudios basados en técnicas de cribado de alto rendimeinto Para la búsqueda de pequeños inhibidores del receptor de colágeno GPVI se realizó un estudio piloto basado en técnicas de cribado de alto rendimiento (o high-thoughput screening, HTS). Como medida indirecta del nivel de activación plaquetaria se evaluaron los niveles de Ca2+ intracelular utilizando el kit comercial Calcium 4 (Molecular Devices). Antes de comenzar con el ensayo de HTS se prepararon las diluciones intermedias de plaquetas, inhibidores y agonistas plaquetarios de la siguiente manera: - Tras extraer las plaquetas de la sangre como se explica en el apartado 3.2.2 se prepara una dilución intermedia resuspendiéndolas en una mezcla 1:1 de los buffers MTB y HBSS suplementado. La dilución intermedia se calcula teniendo en cuenta que en 25 µL debe haber 107 plaquetas. - Se prepara la dilución intermedia de inhibidores (integrilina, apirasa e indometacina) en una mezcla 1:1 de los buffers MTB y HBSS suplementado. Esta dilución debe ser cinco veces más concentrada de lo deseado ya que durante el ensayo se añadirán 12,5 µL a un volumen total de 62,5 µL. Las concentraciones finales deseadas son apirasa 2 U/mL, indometacina 10 µM e integrilina 9 µM. - Se preparan la dilución intermedia de inhibidores + Fab-OM2 en una mezcla 1:1 de los buffers MTB y HBSS suplementado. Esta dilución debe ser cinco veces más concentrada de lo deseado ya que durante el ensayo se añadirán 12,5 µL a un volumen total de 62,5 87 Material y métodos µL. Las concentraciones finales deseadas de inhibidores son las mismas que en el punto anterior, y la de Fab-OM es de 1 µg/mL. - Se preparan las diluciones intermedias de los agonistas plaquetarios (CRP, colágeno, trombina y rhodocytin) en una mezcla 1:1 de los buffers MTB y HBSS suplementado. Esta dilución debe ser seis veces más concentrada de lo deseado ya que durante el ensayo se añadirán 12,5 µL a un volumen total de 75 µL. Las concentraciones finales deseadas son CRP 5 µg/mL, CRP 3 µg/mL, CRP 1 µg/mL, CRP 0,5 µg/mL, CRP 0,25 µg/mL, colágeno 30 µg/mL, trombina 0,75 U/mL y rhodocytin 100 nM. Para realizar los ensayos de HTS se utilizaron placas negras de 384 pocillos de fondo transparente (Greiner Bio-One, Alemania) y se probaron fármacos de la quimioteca de Prestwick. El procedimiento utilizado fue el siguiente: - Se dispensan en los pocillos de las placas de ensayo 25 µL de la dilución intermedia de plaquetas, se añaden 25 µL del kit comercial Calcium 4 y se incuban las plaquetas durante 1 h a 37oC. Esta placa de ensayo será la placa de trabajo. - Al mismo tiempo que incuban las plaquetas se preparan dos placas de ensayo, una placa con inhibidores y con los fármacos que se van a probar o DMSO en el caso de los controles (placa de diluciones 1), y otra placa con los agonistas a diferentes concentraciones (placa de diluciones 2). - Pasado el tiempo de incubación se añaden con el Hamamatsu (Hamamatsu Photonics) 12,5 µL de la placa de diluciones 1 sobre cada pocillo de la placa de trabajo y se registra el efecto de los compuestos junto con los inhibidores. - Se añaden con el Hamamatsu 12,5 µL de la placa de diluciones 2 a cada pocillo y se registra el efecto de los agonistas durante 15 minutos. Estudios de simulación computacional Como enfoque adicional para la búsqueda de pequeños inhibidores del GPVI se está llevando a cabo un análisis de acoplamiento in silico utilizando la estructura cristalina conocida de GPVI (PDB 2gi7 ID)135 y un elevado número de compuestos procedentes de tres quimiotecas diferentes disponibles en el grupo. 4. Resultados 96 Resultados 4.1.4 Identificación de proteínas No todas las diferencias detectadas pudieron ser escindidas de los geles 2D-DIGE ni de los geles semipreparativos. De las 117 diferencias encontradas inicialmente, 102 fueron identificadas satisfactoriamente por espectrometría de masas, 61 de las cuales estaban aumentadas en pacientes con IAMCEST y 41 disminuidas. La mayor parte de las manchas fueron identificadas mediante LC-MS/MS, y un pequeño número mediante MALDITOF/TOF o MALDI-MS/MS. La identificación indicó que esas 102 manchas proteicas se correspondían con 25 proteínas únicas (oppen reading frames, ORFs) (Tabla 6). Tabla 6. Lista de manchas proteicas identificadas en el estudio de MVs acompañadas de sus identificaciones. Version reducida. Mancha Identificación UniProt Código UniProt Variación 206 von Willebrand factor VWF_HUMAN -2,1 Fibronectin FINC_HUMAN Complement C4-A CO4A_HUMAN 209 von Willebrand factor VWF_HUMAN -2 391 Complement C1r subcomponent C1R_HUMAN 2.1 408 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 2,5 409 No identificada -- 2,1 410 Complement C1s subcomponent C1S_HUMAN -2,1 416 No identificada -- 2,3 418 Alpha 2 macroglobulinaa A2MG_HUMAN 2,1 423 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 2,3 448 Ig mu chain c region IGHM_HUMAN -3,4 507 Complement C4-A CO4A_HUMAN -2,8 517 Serum albumin ALBU_HUMAN -3,2 518 Serum albumin ALBU_HUMAN -2,2 520 No identificada -- -2,6 522 Serum albumina ALBU_HUMAN -2,6 525 Serum albumina ALBU_HUMAN -2,3 527 Serum albumina ALBU_HUMAN -2,2 528 Serum albumin ALBU_HUMAN -2,2 531 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 3,8 535 Serum albumina ALBU_HUMAN -2,1 546 No identificada -- -2,7 576 Complement C1s subcomponent C1S_HUMAN -7,7 726 Ig mu chain C region IGHM_HUMAN 2,3 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 729 Ig mu chain C region IGHM_HUMAN 2,2 97 Resultados 824 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 2,2 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 829 Fibrinogen beta chain FIBB_HUMAN -2,5 830 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 2,6 837 Fibrinogen beta chain FIBB_HUMAN -4 840 Fibrinogen beta chain FIBB_HUMAN 2,2 842 Fibrinogen beta chain FIBB_HUMAN 2,2 845 Fibrinogen beta chain FIBB_HUMAN -7,7 847 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 3,1 848 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 3 alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 850 Fibronectin FINC_HUMAN 2,1 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 890 Haptoglobin HPT_HUMAN 2,2 907 Clusterin CLUS_HUMAN 5,6 Complement C1r subcomponent C1R_HUMAN 912 Complement C3 CO3_HUMAN 2,5 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 949 Clusterin CLUS_HUMAN 2,4 953 Apolipoprotein E APOE_HUMAN 2,3 963 Clusterin CLUS_HUMAN 2,7 965 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 2,4 967 No identificada -- 3,1 969 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 2,8 973 Clusterin CLUS_HUMAN 2,4 976 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 2,1 983 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN -2,1 994 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 3,3 996 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 3,5 999 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 2,3 Ig lambda-2 chain C regions LAC2_HUMAN Ig lambda chain V-IV region Hil LV403_HUMAN 1002 Fibrinogen gamma chainaa FIBG_HUMAN 3,4 1004 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 2,2 1005 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN -2,1 Ig lambda-2 chain C region LAC2_HUMAN 1007 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 2,4 1020 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN -2 Fibrinogen beta chain FIBG_HUMAN 1043 Ig kappa chain C region IGKC_HUMAN -6,9 1045 No identificada -- -2,8 1048 Ig kappa chain C region IGKC_HUMAN -3,1 1050 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN -2 1063 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 3,3 1065 No identificada -- 4,6 98 Resultados 1067 Fibrinogen alpha chain FIBA_HUMAN 3,7 1072 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 3,3 1076 Apolipoprotein A-1 APOA1_HUMAN -8,8 1080 Fibrinogen beta chain FIBA_HUMAN -2,4 1084 Apolipoprotein A-1 APOA1_HUMAN 5,7 1093 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 4,3 1096 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 3,7 1097 No identified -- 2,2 1102 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 3,7 1105 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 4,3 1108 No identificada -- 3,1 1114 Serum albumin ALBU_HUMAN 2,9 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN Mannan-binding lectin serine protease 2 MASP2_HUMAN Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN Ig alpha-1 chain C region IGHA1_HUMAN Apolipoprotein A-1 APOA1_HUMAN Haptoglobin HPT_HUMAN 1121 Haptoglobin HPT_HUMAN 3,2 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 1122 Fibrinogen alpha chain FIBA_HUMAN -2,2 1125 Haptoglobin HPT_HUMAN -4,6 1128 No identificada -- 2,7 1131 No identificada -- 2,3 1133 Fibrinogen alpha chain FIBA_HUMAN -3,2 1135 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 4,7 1141 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 4,8 1150 Fibrinogen alpha chain FIBA_HUMAN 2,7 1152 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 3,2 1154 Complement C3 CO3_HUMAN 2,5 Ig alpha-1 chain C region IGHA1_HUMAN 1155 No identificada -- 2,7 1157 Ig mu chain region IGHM_HUMAN 2,4 1159 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 3,6 1162 Ig kappa chain C region IGKC_HUMAN 2,8 1163 No identificada -- 2,8 1165 Fibrinogen alpha chain FIBA_HUMAN -3,8 1177 Haptoglobin HPT_HUMAN -2,7 1204 Prothrombin THRB_HUMAN -2,8 Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 ITIH4_HUMAN 1206 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 4,1 1207 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 3,5 1208 Fibronectin FINC_HUMAN -2,1 Complement C1s subcomponent C1S_HUMAN 99 Resultados 1209 Complement C1s subcomponent C1S_HUMAN -2,1 1210 Ig mu chain region IGHM_HUMAN -3,3 1211 Ig mu chain region IGHM_HUMAN -6,7 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 1212 No identificada -- 3,1 1215 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 4,9 1220 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 2,2 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 1221 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 2,8 1223 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 4,8 Radical S-adenosil methionine domain-containing protein2 (Viperin) (*) RSAD2_HUMAN (*) 1224 Complement C1s subcomponent C1S_HUMAN -8,6 1225 Complement C1s subcomponent C1S_HUMAN -9,1 1226 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 4,9 1239 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 4 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 1241 Alpha 2 macroglobulina A2MG_HUMAN -2,2 1244 Alpha 2 macroglobulinaa A2MG_HUMAN -2,2 1247 Alpha 2 macroglobulina A2MG_HUMAN -2,3 1249 Alpha 2 macroglobulina A2MG_HUMAN -2,2 1252 Alpha 2 macroglobulina A2MG_HUMAN -2,1 1254 CD5 antigen-like CD5L_HUMAN 2,3 1256 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 3,8 Fibrinogen gamma chain FIBG_HUMAN 1259 Alpha 2 macroglobulin A2MG_HUMAN 4,8 1263 Fibrinogen alpha chain FIBA_HUMAN 3,2 1265 Alpha 2 macroglobulinaa A2MG_HUMAN 2,6 1268 No identificada -- 3,9 Una variación positiva indica que la mancha está aumentada en MVs de pacientes con IAMCEST, mientras que una variación negativa indica que la mancha está disminuida en dichos pacientes, con respecto a controles CROIAMCEST. Las identificaciones se realizaron mediante LC-MS/MS, a menos que se indique lo contrario: proteínas identificadas por MALDI-TOF/TOFa o MALDI-MS/MSaa. La versión extendida de esta tabla se puede consultar en el CD adjunto (Anexo IV, Tabla suplementaria 9). En líneas generales, la mayor parte de las proteínas identificadas estaban involucradas en respuesta inflamatoria y enfermedad cardiovascular. 100 Resultados 4.1.5 Validación de los resultados Para las validaciones se seleccionó un grupo independiente de pacientes (15 IAMCEST y 13 CROIAMCEST) cuyas características clínicas básicas se muestran en la Tabla 7. Se incluyó además un grupo de 10 donantes sanos macheados por sexo. Las proteínas seleccionadas fueron validadas por inmunodetección 1D y 2D. Las inmunodetecciones por 1D se realizaron en geles de poliacrilamida al 10%, cargando 8 µg de proteína por carril. Las inmunodetecciones por 2D se realizaron para poder visualizar cambios en isoformas debidos a modificaciones postraduccionales y se emplearon tiras de IPG de 7 cm y rango de pH 4-7 (GE Healthcare) para la primera dimensión, y geles en gradiente (4-12%) NuPAGE (Invitrogen) Bis-Tris para la segunda. En este caso se cargaron 40 µg de proteína por gel. Tabla 7. Características clínicas de los pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST incluidos en el las validaciones del estudio de MVs. Versión reducida. Las variables categóricas de los pacientes se expresan en porcentajes y fueron comparadas utilizando el test exacto de Fisher. Las variables continuas se expresan como la media seguida de la desviación estándar y fueron comparadas utilizando el test exacto de Mann-Whitney. Hx, Historia de; *, p<0,05. Una versión extendida de las características clínicas de estos pacientes se puede consultar en el Anexo II, Tabla suplementaria 2. Del conjunto total de proteínas diferencialmente reguladas se seleccionaron tres para su validación mediante experimentos de inmunodetección mono o bidimensional. Dos de ellas estaban involucradas en trombogénesis (α2-macroglobulina y fibrinógeno-γ) y otra en procesos ateroscleróticos (viperina). Se seleccionaron estas proteínas porque podrían ser buenos marcadores de MVs en IAMCEST. Variable IAMCEST (N=15) CROIAMCEST (N=13) Edad (años) 65 ± 16 63 ± 14 Mujeres (%) 30 20 Hx hipertensión arterial (%) * 46,7 92,3 Hx diabetes mellitus (%) 40 20 Hx dislipidemia (%) 55,3 53,8 Hx enfermedad coronaria (%)* 0 100 Plaquetas/ µL 219357 ± 57911,9 225385 ± 51160,8 Tratamientos Aspirina (%) 100 100 Clopidogrel (%) 100 100 Otros antiplaquetarios (%) 0 0 Anticoagulantes (%) 0 0 101 Resultados a) Isoformas de α2-macroglobulina están aumentadas en las MVs del plasma de pacientes con IAMCEST Alfa-2-macroglobulina (A2MG) es una glicoproteína inhibidora de proteinasas presentes en el plasma humano. El análisis proteómico 2D-DIGE reveló la presencia de A2MG en 31 manchas con expresión diferencial, 23 de las cuales se encontraban aumentadas en las MVs del plasma de pacientes con IAMCEST (ver Tabla 6). Más en detalle, la mayoría de las manchas sobrerreguladas en IAMCEST se correspondían con fragmentos proteolíticos de entre 70 y 110 kDa. Las inmunodetecciones bidimensionales mostraron que esta proteína presenta manchas en la región de 70 a 110 kDa sobreexpresadas en MVs del plasma de pacientes con IAMCEST (Figura 19A), respecto a los controles crónicos y donantes sanos. b) Fibrinógeno y viperina están aumentadas en las MVs del plasma de pacientes con IAMCEST El fibrinógeno es una proteína clave para la agregación plaquetaria y la formación de trombos. El análisis proteómico detectó 41 manchas correspondientes a fibrinógeno, siete de las cuales se corresponden con la cadena α, cinco con la cadena β y 29 con la cadena γ (ver Tabla 6). De las 41 manchas correspondientes a fibrinógeno, 31 estaban aumentadas en MVs plasmáticas de pacientes con IAMCEST. Este resultado fue confirmado por inmunodetección monodimensional de la proteína (Figura 19B). La viperina, también conocida como Radical S-adenosil methionine domain-containing protein 2 (RSAD2), es una proteína antiviral inducible por virus, capaz de inhibir un amplio rango de virus de ADN y ARN. El análisis proteómico 2D-DIGE detectó la sobrerregulación de una mancha que contiene viperina en las MVs plasmáticas de pacientes con IAMCEST (Tabla 6). El análisis por inmunodetección monodimensional reveló una banda de unos 40 kDa aumentada en los pacientes con IAMCEST respecto de los controles crónicos y los donantes sanos (Figura 19B). 102 Resultados Figura 19. Validaciones por inmunodetección de α2-macroglobulina, fibrinógeno y viperina. Las tres proteínas se encuentran aumentadas en las MVs plasmáticas de pacientes con IAMCEST. (A) Imágenes de inmunodetecciones 2D de A2MG. Las manchas sobreexpresadas en IAMCEST están rodeadas. (B) (i) Imagen representativa de inmunodetecciónes 1D de FIB y RSAD2. (ii) Gráficos densitométricos que representan los valores medios y el error estándar de las intensidades de las bandas obtenidas por inmunodetección para todos los pacientes incluidos en el estudio de validación. Las diferencias estadísticamente significativas están destacadas **p<0,01; *p<0,05. ID: Inmunodetección. 103 Resultados 4.1.6 Análisis de biología de sistemas Se realizó un análisis de biología de sistemas para investigar las posibles interacciones directas e indirectas existentes entre las proteínas identificadas. Para ello se utilizó el programa Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity Systems). El análisis identificó que 20 de las 25 proteínas reguladas diferencialmente, estaban interconectadas en una red relacionada con respuesta inmune humoral, respuesta inflamatoria y enfermedad cardiovascular (Figura 20). Figura 20. Estudio de MVs plasmáticas de pacientes con IAMCEST: análisis de redes de las proteínas reguladas diferencialmente mediante el software Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity systems). La red de interacción representada está relacionada con la respuesta inmune humoral, respuesta inflamatoria y enfermedad cardiovascular, incluyendo 20 de las 25 proteínas identificadas en el análisis proteómico. Las proteínas identificadas en el estudio proteómico diferencial están marcadas como nodos sombreados con el nombre de su gen. Las líneas sólidas representan interacciones directas y las punteadas indirectas. Las flechas de un nodo hacia otro indican que este nodo actúa sobre el segundo. Las líneas sin flecha representan enlaces. Las formas de los nodos significan: doble circulo=complejo o grupo; triangulo=quinasa; forma curvilínea=enzima; circulo=otra. 104 Resultados La ruta canónica más importante relacionada con las proteínas identificadas es la respuesta de señalización en fase aguda. Curiosamente, 11 de las proteínas están implicadas en infarto (Figura 21A) y 10 están implicadas en aterosclerosis (Figura 21B). Figura 21. Las proteínas reguladas diferencialmente están directamente relacionadas con infarto (A) y con aterosclerosis (B). Las proteínas identificadas en el estudio proteómico diferencial están marcadas como nodos sombreados con el nombre de su gen. Los nodos sombreados en gris representan las proteínas con expresión diferencial detectadas en el análisis proteómico. Los nodos no sombreados son las restantes proteínas de cada red. 105 Resultados 4.2 Estudio de plaquetas de pacientes con IAMCEST obtenidas de sangre arterial en contacto con el trombo Con el objetivo de completar el estudio proteómico realizado por nuestro grupo en plaquetas procedentes de sangre venosa,175 surgió la idea de analizar el proteoma de plaquetas en contacto directo con el trombo coronario causante del infarto. 4.2.1 Características de los pacientes Para el estudio de plaquetas procedentes de sangre arterial de pacientes con síndrome coronario agudo con elevación del segmento ST (IAMCEST) se recogieron muestras de pacientes en el momento de su ingreso hospitalario. Se extrajeron 50 mL de sangre arterial por paciente (25 mL de sangre intracoronaria en contacto con el trombo y 25 mL de sangre periférica) a través de un catéter Pronto V3 (Vascular Solutions) que obstruye el flujo aterógrado permitiendo la recolección de la sangre bloqueada en las proximidades del trombo coronario causante del infarto. Las características clínicas básicas de los pacientes incluidos en este estudio se pueden consultar en las Tablas 8 y 10. 4.2.2 Análisis proteómico 2D-DIGE Para comparar los proteomas de las plaquetas procedentes de sangre de la arteria coronaria y sangre de la arteria radial de pacientes IAMCEST, se realizó un análisis proteómico 2DDIGE. Se emplearon un total de cinco geles 2D (réplicas técnicas) de bisacrilamida al 11% y tiras IPG de 24 cm con un rango de pH de 4 a 7. El análisis se realizó utilizando pools de muestras de sangre intracoronaria y pools de muestras de sangre periférica de 10 pacientes, cuyas características clínicas básicas se resumen en la Tabla 8. El análisis de imagen detectó una media de 1300 manchas proteicas por gel. Los criterios de selección de las diferencias significativas fueron las variaciones de intensidad de las manchas entre grupos ≥1,2 y valor p<0,05. Aplicando estos criterios, se detectaron un total de 16 diferencias significativas entre grupos (Figura 22), 11 de las cuales estaban sobreexpresadas en las muestras de intracoronaria y las 5 restantes disminuidas. 112 Resultados Figura 23. Validaciones por inmunodetección de ITA2B y SKAP2. Ambas proteínas están sobreexpresadas en las plaquetas intracoronarias de pacientes con IAMCEST. (A) Imágenes representativas de validaciones individuales por inmunodetección 2D de ITA2B y gráfico densitométrico representando la intensidad media de las manchas y la desviación estándar. Análisis estadístico. (B) Imágenes representativas de validaciones individuales por inmunodetección 2D de SKAP2 y gráfico densitométrico representando la intensidad media de las manchas y la desviación estándar. Análisis estadístico. (C) Controles de carga de las muestras de los paneles A y B. ID, inmunodetección; **p<0,01; Intra, intracoronaria; Peri, periférica. 113 Resultados Figura 24. Validaciones por inmunodetección de TSP-1 y talina-1. TSP-1 y talina-1 están reguladas diferencialmente en las plaquetas intracoronarias. (A) Validación de TSP1: imágenes representativas de validaciones individuales por inmunodetección 2D (B) Validación de talina-1: imágenes individuales representativas de validaciones individuales por inmunodetección 1D, control de carga y gráficos densitométricos representando la intensidad media de las bandas y error estándar. ID, inmunodetección; Intra, intracoronaria; Peri, periférica; Mr, masa molecular relativa. 114 Resultados 4.3 Estudios de la vía de señalización de GPVI en pacientes con IAMCEST 4.3.1 Estudio de la vía de señalización de GPVI en sangre venosa de pacientes con IAMCEST Con el fin de profundizar en el conocimiento de la implicación fisiopatológica que tiene la vía de señalización de GPVI en el infarto agudo de miocardio, surgió la idea de analizar estado de activación de la vía utilizando el proteoma de plaquetas obtenidas a partir de sangre venosa de pacientes con IAMCEST. 4.3.1.1 Características de pacientes y controles El estudio de la vía de señalización de GPVI en pacientes con IAMCEST incluyó muestras de sangre venosa de 19 pacientes con IAMCEST (grupo de muestras llamado IAMCEST) y 16 controles CROIAMCEST (grupo de muestras llamado CROIAMCEST). Las muestras de los controles fueron seleccionadas de modo que no hubiese diferencias significativas con el grupo de pacientes agudos en las siguientes variables: edad, sexo, tratamiento antiplaquetario y diabetes mellitus. Además de la esperada diferencia en tener una historia previa de enfermedad coronaria, el análisis estadístico no reveló la existencia de otras diferencias significativas entre ambos grupos. Las características clínicas básicas de los pacientes y controles del estudio se muestran en las Tablas 11 y 13. 4.3.1.2 Análisis proteómico El estudio proteómico consistió en la activación de plaquetas aisladas de sangre venosa de 5 pacientes con IAMCEST y de 5 controles CROIAMCEST, utilizando un agonista especifico del receptor GPVI, el collagen-related peptide o CRP, para seguir los niveles de activación de la vía. Como la vía de GPVI funciona a través de fosforilaciones en tirosina (pTyr) de las proteínas que la conforman, el análisis proteómico se basó en inmunoprecipitaciones utilizando el anticuerpo anti-pTyr 4G10 conjugado a agarosa. Las inmunoprecipitaciones de plaquetas basales y activadas con CRP (3x108 plaquetas) se realizaron utilizando 10 µg del anticuerpo anti-pTyr 4G10 conjugado a agarosa. Se realizaron pools juntando 5 inmunoprecipitaciones (una por paciente) de cada condición y se resolvieron por 1D-PAGE en un gel comercial del 4-12% NuPAGE (Invitrogen), que finalmente si tiñó con Sypro Ruby. Las características clínicas básicas del subgrupo de pacientes utilizados para el estudio proteómico se muestran en la Tabla 11. 115 Resultados Tabla 11. Características clínicas de los pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST incluidos en el estudio proteómico de la vía de señalización de GPVI. Versión reducida. Variable IAMCEST (N=5) CROIAMCEST (N=5) Edad (años) 64 ± 12 61 ± 16 Mujeres (%) 0 0 Hx hipertensión arterial (%) 40 40 Hx diabetes mellitus (%) 20 0 Hx dislipidemia (%) 60 60 Hx enfermedad arterial coronaria (%)* 20 100 Plaquetas/µL 269400 ± 114137,2 292200 ± 50642,9 Tratamientos Aspirina (%) 100 100 Clopidogrel (%) 100 100 Otros antiplaquetarios (%) 0 0 Anticoagulantes (%) 0 0 Las variables categóricas de los pacientes se expresan en porcentajes y fueron comparadas utilizando el test exacto de Fisher. Las variables continuas se expresan como la media seguida de la desviación estándar y fueron comparadas utilizando el test exacto de Mann-Whitney. Hx, Historia de; *, p<0,05. Una versión extendida de las características clínicas de estos pacientes se puede consultar en el Anexo II, Tabla suplementaria 5. El estudio proteómico reveló una mayor activación de la vía de GPVI en las plaquetas de los pacientes con IAMCEST, comparado con los controles, cuando se activan con el agonista CRP (Figura 25A). En concreto se detectaron 7 bandas aumentadas en plaquetas de pacientes con IAMCEST activadas con CRP, frente a plaquetas de controles CROIAMCEST activadas con el mismo agonista. Las 7 bandas fueron cortadas y analizadas por espectrometría de masas para la identificación de sus proteínas. Sin embargo, es importante destacar que el gel del análisis proteómico muestra proteína total, por lo que puede haber proteínas reclutadas de forma inespecífica al complejo de señalización durante el proceso de inmunoprecipitación que no presenten un mayor nivel de pTyr que los controles. Por esta razón se corrieron pools de los lisados totales de las plaquetas de los mismos pacientes, recogidos justo antes de realizar las inmunoprecipitaciones. Para ello se utilizó de nuevo un gel 4-12% NuPAGE Bis-Tris y, tras la electroforesis, se realizó inmunodetección de proteínas fosforiladas en tirosina con el anticuerpo anti-pTyr 4G10. En este caso el resultado muestra de forma fiel un aumento considerable de la fosforilación/activación de la vía de GPVI en pacientes con IAMCEST (Figura 25B). 116 Resultados Figura 25. Análisis de la vía de señalización de GPVI en plaquetas de pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST: proteínas fosforiladas en residuos tirosina. (A) Tinción de proteína total en un gel en gradiente (4-12%) NuPAGE (Invitrogen) en el que se cargaron pools de proteínas fosforiladas en tirosina de plaquetas basales y estimuladas con CRP, obtenidas tras inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-pTyr 4G10 conjugado a agarosa. (B) Inmunodetección de proteínas fosforiladas en tirosina (anticuerpo monoclonal 4G10) y control de carga (GAPDH) utilizando pools de los lisados totales de plaquetas obtenidos antes de realizar las inmunoprecipitaciones. Basal, plaquetas basales; CRP, plaquetas estimuladas con CRP (10 µg/mL, 90 seg); IP, inmunoprecipitación; ID, inmunodetección; Mr, masa molecular relativa. 117 Resultados 4.3.1.3 Identificación de proteínas Las bandas cortadas fueron analizadas por LC-MS/MS llevando a la identificación de 24 proteínas únicas. Sin embargo, en la mayoría de las bandas se identificó más de una proteína por lo que era indispensable validar los resultados con el fin de determinar si las proteínas de la vía de señalización de GPVI eran las responsables del aumento de intensidad de la banda. Entre las identificaciones se encontraron algunas proteínas de señalización pertenecientes a la vía de GPVI, incluyendo la tirosina quinasa Syk, los adaptadores SLAP130 y GADS, la enzima PLCγ2, la proteína transmembrana G6f, y los adaptadores SLP-76 y Dok-2. Las proteínas identificadas se muestran en la Tabla 12. Tabla 12. Lista de proteínas identificadas en el estudio proteómico de la vía de señalización de GPVI. Versión reducida. Banda Código UniProt Nombre 1 PLCG2_HUMAN Phospholipase C-gamma-2 ZO2_HUMAN Tight junction protein MMRN1_HUMAN Multimerin-1 2 FYB_HUMAN FYN-binding protein (SLAP130) PK3CB_HUMAN Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit beta isoform ITA2B_HUMAN Integrin alpha-IIb ARHGB_HUMAN Rho guanine nucleotide exchange factor 11 3 ACTN1_HUMAN Alpha-actinin-1 FYB_HUMAN FYN-binding protein (SLAP130) ACTN4_HUMAN Alpha-actinin-4 4 SRC8_HUMAN Src substrate cortactin LCP2_HUMAN Lymphocyte cytosolic protein 2 (SLP76) KSYK_HUMAN Tyrosine-protein kinase SYK HSP7C_HUMAN Heat shock cognate 71 kDa protein 5 SKAP2_HUMAN Src kinase-associated phosphoprotein 2 DOK2_HUMAN Docking protein 2 TBA4A_HUMAN Tubulin alpha-4A chain TBB1_HUMAN Tubulin beta-1 chain 6 MK14_HUMAN Mitogen-activated protein kinase 14 GRAP2_HUMAN GRB2-related adapter protein 2 (GADS) PPIP2_HUMAN Proline-serine-threonine phosphatase-interacting protein 2 ACTB_HUMAN Actin, cytoplasmic 1 PDLI1_HUMAN PDZ and LIM domain protein 1 7 CAPZB_HUMAN F-actin-capping protein subunit beta LY66F_HUMAN G6f Proteínas identificadas por LC-MS/MS en las 7 bandas que presentaban mayor intensidad en plaquetas de pacientes con IAMCEST activadas con CRP que en plaquetas de controles activadas con el mismo agonista. La versión extendida de esta tabla su puede consultar en el CD adjunto (Anexo IV, Tabla suplementaria 11). 118 Resultados 4.3.1.4 Validación de los resultados. Las formas pTyr de PLCγ2, SLP76, DOK2 y G6F están aumentadas en plaquetas de sangre venosa de pacientes con IAMCEST activadas con CRP Los estudios de validación se realizaron en un grupo independiente de 14 pacientes y 11 controles, cuyas características clínicas básicas se resumen en la Tabla 13. Para las validaciones se inmunoprecipitaron plaquetas basales y activadas con CRP (2x108 plaquetas) utilizando 5 µg del anticuerpo anti-pTyr 4G10 conjugado con agarosa. Tras la inmunoprecipitación, las proteínas se separaron en geles de bisacrilamida al 10% o geles en gradiente (4-12%) NuPAGE (Invitrogen), se transfirieron a membranas de PVDF y se realizaron inmunodetecciones con los anticuerpos de interés. Tabla 13. Características clínicas de los pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST incluidos en el estudio de validación de la vía de señalización de GPVI realizado en plaquetas de sangre venosa. Versión reducida. Las variables categóricas de los pacientes se expresan en porcentajes y fueron comparadas utilizando el test exacto de Fisher. Las variables continuas se expresan como la media seguida de la desviación estándar y fueron comparadas utilizando el test exacto de Mann-Whitney. Hx: Historia de; *: p<0,05. Una versión extendida de las características clínicas de estos pacientes se puede consultar en el Anexo II, Tabla suplementaria 6. De entre todas las proteínas identificadas se eligieron cuatro pertenecientes a la vía de señalización de GPVI para su validación, cuyos pesos moleculares fuesen bastante diferentes con el fin de analizarlas fácilmente por inmunodetección tras la inmunoprecipitación de proteínas pTyr. Las cuatro proteínas seleccionadas fueron (de mayor a menor peso molecular): la enzima PLCγ2, los adaptadores SLP-76 y Dok-2, y la proteína transmembrana G6f. Los resultados de las inmunodetecciones revelaron un aumento significativo de los niveles de pTyr para las cuatro proteínas estudiadas cuando Variable IAMCEST (N=14) CROIAMCEST (N=11) Edad (años) 69 ± 14 64 ± 17 Mujeres (%) 21,4 9,1 Hx hipertensión arterial (%) 50 63,6 Hx diabetes mellitus (%) 35,7 18,2 Hx dislipidemia (%) 64,3 54,6 Hx enfermedad arterial coronaria (%)* 7,1 100 Plaquetas/ µL 246538,5 ± 90981,6 244727,3 ± 57775,6 Tratamientos Aspirina (%) 100 100 Clopidogrel (%) 100 100 Otros antiplaquetarios (%) 0 0 Anticoagulantes (%) 0 0 119 Resultados comparamos plaquetas basales y plaquetas estimuladas (Figura 26). Cuando comparamos plaquetas activadas con CRP entre grupos (IAMCEST vs CROIAMCEST), los resultados mostraron un aumento de los niveles de pTyr en los pacientes IAMCEST para las cuatro proteínas, con diferencias estadísticamente significativas en el caso de PLCγ2, Dok-2 y G6f (Figura 26). El aumento observado en los niveles de pTyr se traduce en un aumento en la activación de la vía de señalización de GPVI. Figura 26. La activación de la vía de señalización de GPVI esta aumentada en plaquetas de pacientes con IAMCEST. Inmunodetección de PLCγ2 (A), SLP76 (B), Dok-2 (C) y G6f (D) tras la inmunoprecipitación de proteínas pTyr. i) Imágenes representativas de pacientes y controles individuales. ii) Gráficos densitométricos representando la intensidad media de las bandas, el error estándar y el análisis estadístico. Las diferencias significativas se representan como: *p<0,05; **p<0,01. Basal, plaquetas basales; CRP, plaquetas estimuladas con CRP (10 µg/mL, 90 seg). IP, inmunoprecipitación; ID, inmunodetección. 120 Resultados Los lisados totales también fueron separados por electroforesis 1D para realizar controles de carga con el fin de demostrar que no había diferencias de carga en los lisados utilizados para las inmunoprecipitaciones. 4.3.1.5 Estudio piloto de agregación Partiendo de la hipótesis de la existencia de un mayor número de receptores GPVI en la superficie de las plaquetas de pacientes con IAMCEST, se realizó un estudio piloto de agregación tras la estimulación plaquetaria con CRP o colágeno. Este estudio incluyó un nuevo grupo formado por 5 pacientes con IAMCEST y 5 controles CROIAMCEST cuyas características clínicas se muestran en la Tabla 14. Tabla 14. Características clínicas de los pacientes con IAMCEST y controles CROIAMCEST incluidos en el estudio piloto de agregación tras la estimulación de GPVI realizado en plaquetas de sangre venosa. Versión reducida. Variable IAMCEST (N=5) CROIAMCEST (N=5) Edad (años) 73 ± 13 64 ± 15 Mujeres (%) 20 20 Hx hipertensión arterial (%) 20 20 Hx diabetes mellitus (%) 20 40 Hx dislipidemia (%) 20 60 Hx enfermedad arterial coronaria (%)* 0 100 Plaquetas/µL 239000 ± 41364,2 187000 ± 61110,6 Tratamientos Aspirina (%) 80 100 Clopidogrel (%) 60 60 Otros antiplaquetarios (%) 40 40 Anticoagulantes (%) 0 0 Las variables categóricas de los pacientes se expresan en porcentajes y fueron comparadas utilizando el test exacto de Fisher. Las variables continuas se expresan como la media seguida de la desviación estándar y fueron comparadas utilizando el test exacto de Mann-Whitney. Hx, Historia de; *, p<0,05. Una versión extendida de las características clínicas de estos pacientes se puede consultar en el Anexo II, Tabla suplementaria 7. En este caso las plaquetas (0,9x108) fueron activadas con distintas dosis de CRP (10, 5 y 3 µg/mL) y colágeno (10 y 5 µg/mL). Se utilizaron activaciones con trombina (0,75 U/mL) a modo de control. Los resultados muestran un aumento de los niveles de agregación en pacientes con IAMCEST frente a controles CROIAMCEST cuando se activan sus plaquetas con CRP y colágeno. La diferencia en agregación es muy acusada a dosis bajas e intermedias de los agonistas de GPVI (CRP y colágeno), mientras que a dosis máximas la tendencia, 121 Resultados aunque clara, no llega a ser significativa. No hay diferencia en la respuesta a la agregación inducida por trombina. Los resultados se muestran en la Figura 27. g/mL)  IAMCEST (CRP 10 g/mL)  CROIAMCEST (CRP 10 g/mL)  IAMCEST (CRP 5 g/mL)  CROIAMCEST (CRP 5 g/mL)  IAMCEST (CRP 3 g/mL)  CROIAMCEST (CRP 3 g/mL)  IAMCEST (Col 10 g/mL)  CROIAMCEST (Col 10 g/mL)  IAMCEST (Col 5 g/mL)  CROIAMCEST (Col 5 IAMCEST (Trom 0.75 U/mL) CROIAMCEST (Trom 0.75 U/mL) 0 20 40 60 80 100 *** % Agregación Figura 27. La agregación plaquetaria inducida por la activación de GPVI es mayor en pacientes con IAMCEST. Se induce agregación plaquetaria con CRP y colágeno en plaquetas de pacientes con IAMCEST y CROIAMCEST. La agregación inducida por trombina se utiliza como control. Gráfico densitométrico representando la media de la agregación y el error estándar de 5 pacientes y 5 controles. Análisis estadístico. *p<0,05.