Estructuras supramoleculares generadas por derivados de ácidos biliares y ciclodextrinas

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA-FÍSICA ESTRUCTURAS SUPRAMOLECULARES GENERADAS POR DERIVADOS DE ÁCIDOS BILIARES Y CICLODEXTRINAS TESIS DOCTORAL Mª de las Mercedes Álvarez Alcalde Lugo, Abril de 2007 Facultade de Ciencias Departamento de Química-Física Facultade de Ciencias Departamento de Química-Física ESTRUCTURAS SUPRAMOLECULARES GENERADAS POR DERIVADOS DE ÁCIDOS BILIARES Y CICLODEXTRINAS TESIS DOCTORAL Mª de las Mercedes Álvarez Alcalde Lugo, Abril de 2007 A mis padres Mercedes y Demetrio A mi hermano Juan José A Álvaro Llegado el momento final de la redacción de mi tesis doctoral me gustaría señalar que es el fruto del sacrificio y del compromiso no sólo mío sino de todas las personas que han contribuido a su realización. Por ello, mi más sincero agradecimiento hacia los directores de esta tesis doctoral: D. José Vázquez Tato y Dña. Aida Jover Ramos, quienes me han dirigido gentilmente durante estos años de investigación. Una mención especial a Luciano Galantini y Nicolae V. Pavel por su agradable acogida en las estancias realizadas en su laboratorio en Roma, y a los demás profesores del departamento de Química Física de Lugo, Francisco Meijide, Jorge Carrazana, Wajih Al-Soufi y Mercedes Novo, así como a Julio Seijas y Pilar Vázquez por su buena disposición para trabajar conmigo. Mi más sincero agradecimiento al personal de los servicios RIAIDT de Lugo y Santiago por realizar su trabajo en el menor tiempo posible en análisis de urgencia y a todos los compañeros que han pasado por el laboratorio y a los que todavía se encuentran trabajando en él. Ya por último un agradecimiento muy especial a mis padres y a mi hermano por su cariño siempre incondicional, y a Álvaro por su apoyo y ayuda constante día a día. También agradezco al Ministerio de Ciencia y Tecnología por los proyectos MAT2001-2911 y MAT2004-04606 y a la Xunta de Galicia por los proyectos PGIDIT02PXIC26202PN y PGIDIT05PXIC26201PN, en cuyo marco se ha desarrollado la presente investigación. Y gracias al MEC por la beca FPI concedida durante esta etapa así como las ayudas para la realización de estancias en el extranjero. … y gracias a Dios por permitir que siga este camino. Facultade de Ciencias Departamento de Química-Física Facultade de Ciencias Departamento de Química-Física D. José Vázquez Tato, Catedrático del Departamento de Química Física y Dña. Aida Jover Ramos, Contratada Doctor del Departamento de Química Física de la Universidad de Santiago de Compostela CERTIFICAN Que el trabajo descrito en la presente memoria “Estructuras supramoleculares generadas por derivados de ácidos biliares y ciclodextrinas”, que para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Santiago de Compostela, presenta la Licenciada en Química por la Universidad de Santiago de Compostela, Dña. Mª de las Mercedes Álvarez Alcalde, ha sido realizado bajo su dirección en el Departamento de Química Física de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, expiden el presente certificado en Lugo, a 30 de abril de 2007. Fdo.: José Vázquez Tato Aida Jover Ramos Índices III.7.- Determinación de la cmc 85 III.8.- Caracterización en disolución de los agregados mediante Light Scattering 87 BIBLIOGRAFÍA 90 IV.- SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE NUEVAS SONDAS FLUORESCENTES DE ÁCIDOS BILIARES 93 BIBLIOGRAFÍA 125 V.- NUEVOS SURFACTANTES GEMINI DE SALES BILIARES 127 V.1.- Introducción 129 V.2.- Gemini g-2DC24-AEDT 141 V.3.- Gemini g-2C24-AEDT 174 V.4.- Breve introducción a los cristales líquidos 186 V.5.- Gemini g-2DC24-PIR 197 V.6.- Gemini g-2C24-PIR 225 BIBLIOGRAFÍA 234 VI.- NUEVOS SURFACTANTES DIMÉRICOS DE SALES BILIARES 241 VI.1Breve revisión bibliográfica 243 VI.2.- Nuevos surfactantes diméricos: d-2C3-AEDT y d-2DC3-AEDT 258 BIBLIOGRAFÍA 272 Índices VII.- ESTUDIO DEL ISOMERISMO “IN-OUT” DE UN DERIVADO DE β-CICLODEXTRINA 277 BIBLIOGRAFÍA 305 COCLUSIONES 311 APÉNDICE A.- SÍNTESIS, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DERIVADOS DE SALES BILIARES 321 A.1.- Síntesis y caracterización del puente de unión derivado del ácido etilendiaminotetraacético (AEDT) 323 A.2.- Síntesis del puente de unión derivado del ácido piromielítico (PMA) 324 A.3.- Síntesis y caracterización de los 24-aminoderivados del ácido cólico, desoxicólico, quenodesoxicólico y ursodesoxicólico 327 A.4.- Síntesis y caracterización de los 3-aminoderivados del ácido cólico, desoxicólico y litocólico 333 A.5.- Síntesis, purificación y caracterización de compuestos R-BS 337 A.5.a.- Síntesis del derivado aromático, colato-3-amino-benzoato de sodio 338 A.5.b.- Síntesis del derivado alifático, colato-3-amino-succinato de sodio 339 A.5.c.- Síntesis del derivado ácido 3-pirenocólico 340 A.5.d.- Síntesis del derivado ácido 3-pirenolitocólico 341 A.5.e.- Caracterización espectral. Espectros 1H y 13C resueltos 341 A.6.- Síntesis, purificación y caracterización de dímeros de ácidos biliares unidos mediante un puente de AEDT 346 Índices A.6.a.- Síntesis y purificación del d-2C3-AEDT 346 A.6.b.- Síntesis y purificación del d-2DC3-AEDT 346 A.6.c.- Caracterización espectral. Espectros 1H y 13C resueltos 347 A.7.- Síntesis, purificación y caracterización de gemini derivados de ácidos biliares 349 A.7.a.- Síntesis y purificación del g-2C24-AEDT 349 A.7.b.- Síntesis y purificación del g-2DC24-AEDT 350 A.7.c.- Síntesis y purificación del g-2DC24-PIR 351 A.7.d.- Síntesis y purificación del g-2C24-PIR 354 A.7.e.- Caracterización espectral. Espectros 1H y 13C resueltos 356 A.7.f.- Caracterización por Espectroscopia de Masas 359 A.8.- Síntesis de los epímeros del ácido quenodesoxicólico y ursodesoxicólico 360 BIBLIOGRAFÍA 360 APÉNDICE B.- TÉCNICAS EXPERIMENTALES 363 B.1.- Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) 365 B.1.a.- Fundamentos físicos 365 B.1.b.- Acoplamiento espín-espín; Acoplamiento directo o bipolar; Acoplamiento indirecto o Espín-Espín y Acoplamiento múltiple 377 B.1.c.- Tipos de intercambio según los tiempos de los experimentos de RMN 385 B.2.- Balanza de tensión superficial 388 Índices B.2.a.- Fundamentos físicos 388 B.2.b.- Medida de la tensión superficial 395 B.3.- Espectroscopia de Fluorescencia 397 B.3.a.- Rendimiento cuántico de fluorescencia 398 B.3.b.- Tiempo de vida de fluorescencia 399 B.3.c.- Espectroscopia de Fluorescencia en estado estacionario y con resolución temporal 400 B.3.d.- Análisis de datos 402 B.4.- Dispersión de luz 403 B.4.a.- Difusión Estática de la luz (Static Light Scattering, SLS) 404 B.4.b.- Difusión Dinámica de luz (Dynamic Light Scattering, DLS) 409 B.4.c.- Equipos utilizados 413 B.5.- Otras técnicas utilizadas 414 BIBLIOGRAFÍA 415 CAPÍTULO I.- INTRODUCCIÓN Capítulo I A B CD 1 2 12 3 4 24 5 67 8 9 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 A B CD 1 2 12 3 4 24 5 67 8 9 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Toda tesis doctoral se desarrolla en un contexto que viene limitado por sus objetivos, que comúnmente son parte de un proyecto de investigación más ambicioso o amplio, el cual, a su vez, se enmarca en una disciplina científica cuyas fronteras están generalmente definidas de un modo difuso. La disponibilidad de técnicas instrumentales, en caso de que sean necesarias, o la capacidad económica del grupo de investigación en el que se realiza, son también variables que la encorsetan. Asimismo, la ejecución de la tesis doctoral está limitada en el tiempo por los plazos de ejecución definidos por las ayudas económicas al doctorando (usualmente en forma de beca de investigación) y al grupo de investigación en el que aquel se encuadra. Difícilmente, los límites definidos por estas variables externas pueden ser sobrepasados. Por otra parte, existen otras variables asociadas al propio proceso investigador y que son, si cabe, tan importantes como las definidas en el párrafo anterior. Entre ellas podemos mencionar el avance de la propia investigación, determinado por los logros parciales de la misma, la aparición de novedades científicas relevantes alcanzadas por otros autores y que directamente inciden en el estudio ya iniciado, la adquisición o disponibilidad de nuevas técnicas instrumentales o, incluso, la aparición de una idea más prometedora que la que se encuentra en vías de evolución. Todas estas variables van introduciendo variaciones en la orientación inicial de la tesis doctoral, obligando a redefinir, al menos en parte, los objetivos iniciales de la misma. Comentemos algunas de las variables mencionadas en los párrafos anteriores para el caso concreto de la presente tesis doctoral. En primer lugar, esta tesis doctoral se ubica en el ámbito de la Química Supramolecular a la que Jean Marie Lehn1 le otorgó buena parte de su significado actual hace una treintena de años. Desde el descubrimiento de los éteres corona de Pedersen2 en 1967, esta disciplina ha experimentado una evolución conceptual vertiginosa, marcándose, paralelamente, objetivos inimaginables en sus comienzos. Ambos aspectos, conceptual y finalidad, están resumidos en las preguntas definidas por el propio Lehn3 que recopilamos en el cuadro I.1. Las tres preguntas anteriores encierran una palabra clave y que, explícitamente, aparece en la segunda de ellas, esto es, evolución. Quizá desconozcamos cómo ha ido evolucionando la naturaleza hacia su momento actual, pero si que estamos francamente familiarizados con el desarrollo de toda índole alcanzado por la humanidad. Este no puede entenderse sin el proceso evolutivo de una idea, modelo, teoría o dispositivo iniciales que fue transformándose sucesivamente hasta su diseño actual, implicando, algunas veces, saltos 3 A B CD 1 2 12 3 4 24 567 8 9 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 A B CD 1 2 12 3 4 24 567 8 9 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Capítulo I vertiginosos y, en otras ocasiones, pasos menores. En este proceso, han estado (y están) involucradas, mentes privilegiadas y otras, que sin serlo tanto, son igualmente imprescindibles. Todo ello es cierto aún cuando muchos hallazgos fuesen alcanzados de un modo serendípico, aspecto al que no es ajeno el descubrimiento de los éteres corona por Pedersen. - ¿Cómo se vuelve compleja la materia? - ¿Cómo ha sido la evolución hacia sistemas más complejos (incluyendo los organismos inteligentes)? - ¿Qué otras formas de materia compleja pueden ser desarrolladas y creadas? Cuadro I.1.- Preguntas formuladas por Jean -Marie Lehn3 y que definen el presente status de la Química Supramolecular. Así pues, podemos concluir que a la hora de desarrollar una idea o un proceso, partimos, casi inevitablemente, de un estadío anterior de desarrollo. Por lo tanto, parece lógico que si vamos a trabajar con productos de origen natural conozcamos su papel en la propia naturaleza y las razones por las que funcionan tal y como lo hacen. Tal comprensión encierra que, en nuestro estudio, obviamos, por desconocimiento, cualquier desarrollo intermedio que la naturaleza en su evolución haya descartado. Menger4 lo ha interpretado de otra manera: “al imitar a la naturaleza, incluso para mejorar los resultados de la evolución natural, uno puede diseñar en el papel un dispositivo con funcionalidades orientadas óptimamente, dedicar tiempo, recursos y gente en obtenerlo, mientras nos preguntamos si, al final, será un fracaso”. Esta frase resume el riesgo de diseñar, por ejemplo, una estructura supramolecular para una determinada finalidad y comprobar, cuando ya se han aplicado todos los esfuerzos necesarios, que el dispositivo no alcanza el objetivo para el que había sido diseñado. En esta memoria presentamos la síntesis y caracterización fisicoquímica de nuevos derivados de ácidos biliares. En el contexto esbozado en los párrafos anteriores, la cuestión es entonces ¿por qué el grupo de investigación en el cual se ha desarrollado la presente tesis, ha elegido los ácidos biliares como materiales de partida? Tenemos una primera respuesta en el catálogo de grupos de investigación 4 Capítulo I A B CD 1 2 12 3 4 24 5 67 8 9 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 A B CD 1 2 12 3 4 24 5 67 8 9 10 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 de la Universidad de Santiago, el cual reconoce al grupo GI-1589 con la denominación “Fisicoquímica de Coloides y Química Supramolecular”, y en el hecho de que los ácidos biliares naturales son tensioactivos5 bien caracterizados y que originan diversos tipos de estructuras supramoleculares, incluyendo complejos de inclusión en estado sólido,6 estado en el que los ácidos biliares siguen ciertas pautas de auto-reconocimiento a través de los grupos hidroxilo y el grupo ácido carboxílico de la cadena lateral.7 Obviamente, los ácidos biliares están implicados en múltiples procesos biológicos que requieren reconocimiento molecular, como, por ejemplo, por parte de las proteínas transportadoras específicas localizadas en las membranas apical y basal de los ileocitos y basolateral y canalicular de los hepatocitos. Los ácidos biliares aparecen ampliamente distribuidos en el mundo animal (mamíferos, peces...) y se ha postulado que su estructura química ha de estar correlacionada con la evolución de los vertebrados,8 aunque la etiología de la evolución molecular de los ácidos biliares todavía esté pobremente entendida.9 Existen evidencias de la evolución de los ácidos biliares desde sulfatos C27 a ácidos C24.8 Así, podemos afirmar que los ácidos biliares parecen ser la solución óptima que la naturaleza ha conseguido para multitud de procesos biológicos y probablemente están asociados a una etapa crucial de la evolución biológica. Los comentarios anteriores no deben inducir al error de que los esteroles pertenecen exclusivamente al reino animal. Antes bien, el núcleo esteroide tiene un cierto carácter universal. Por ejemplo, los brassinosteroides comprenden una clase de derivados de esteroles de aparición prácticamente ubicua en el mundo vegetal. Entre las hormonas del reino animal, los brassinosteroides son los compuestos que estructuralmente más se asemejan a las hormonas esteroides de los animales. Igual que aquéllas, regulan la expresión de numerosos genes, contribuyen a la división y diferenciación celular, están implicadas en procesos que regulan el crecimiento de las plantas, son esenciales para la diferenciación vascular, la fertilidad femenina, la senescencia, el desarrollo de las hojas, la respuesta a la luz, etc.10 Sería pretencioso dar una respuesta global a la pregunta ¿cuáles son las características del núcleo esteroide que lo hacen tan universal? y, por ello, reduciremos nuestra respuesta al ámbito de los ácidos biliares, aunque algunos comentarios son posiblemente extrapolables a la familia de compuestos esteroles. Nos referiremos al ácido desoxicólico de la figura I.1 como referencia. En primer lugar, todos los ácidos biliares presentan el núcleo esteroide compuesto de tres anillos de seis átomos de carbono (A, B y C) y un anillo D de cinco átomos de carbono. Una primera diferencia entre los diversos ácidos biliares radica en la 5 CAPÍTULO II.- SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE DERIVADOS EPÍMEROS DE ÁCIDOS BILIARES 3, 7 DIHIDROXÍLICOS Capítulo II II.1.- PERSPECTIVAS HISTÓRICAS A pesar de que la investigación sobre los ácidos biliares tiene una historia de más de 100 años, en la actualidad no ha perdido vigencia alguna dada la importancia biológica y médica de los mismos. En estos últimos años, se ha logrado identificar la mayoría de los ácidos biliares naturales, tarea que comenzó en los inicios del siglo XIX con las primeras investigaciones sobre la naturaleza de los componentes de la bilis. Gemelin, Thenard y Berzelius enfocaron su trabajo hacia los ácidos presentes en la bilis a mediados del siglo XIX. En 1848 Strecker logró aislar el ácido taurocólico y el glicocólico de la vesícula biliar del buey. Demarcay fue el primero en reconocer la uniformidad de la materia sólida en la bilis y caracterizar la taurina en 1838. Platner fue el primero en preparar una muestra cristalina de un ácido biliar mediante la adición de éter a una disolución seca de ácido biliar. En 1886 Mylius descubrió el ácido desoxicólico, y también otorgó una gran importancia biológica al ácido cólico al encontrarse presente en la bilis de un gran número de animales vertebrados. El ácido litocólico no se conoció hasta 1911 cuando Fischer consiguió aislarlo de piedras generadas en la vesícula biliar de buey.1 En 1912, Heinrich Otto Wieland1 comienza su investigación sobre los ácidos biliares producidos por el hígado, y encontró que los tres ácidos que él había aislado tenían una estructura similar a la del colesterol. Al mismo tiempo, Windaus logró con éxito la transformación del colesterol en ácido colánico, uno de los ácidos biliares aislados ya por Wieland. Bernal en 1932 resolvió la estructura del ciclopentano-perhidrofenantreno del colesterol mediante Espectroscopia de Rayos X y Rosenheim y King determinaron correctamente la estructura de los ácidos biliares en 1934. Gracias a estos trabajos, algunos de estos autores fueron merecedores del Premio Nobel. La tabla II.1 recoge los galardonados con tal premio cuyas investigaciones han estado relacionadas con el colesterol o los ácidos biliares. Los trabajos citados sentaron una base científica sólida para el estudio de los ácidos biliares y compuestos relacionados. Así, en la década de los cuarenta el ácido cólico, que ya se aislaba fácilmente de la bilis de buey, se convirtió en un producto de interés comercial al descubrirse los efectos anti-inflamatorios de la cortisona (figura II.1), por lo que los esfuerzos sintéticos en estos años se centraron en la ruta de conversión del ácido desoxicólico en esteroides con propiedades anti-inflamatorias. A partir de la década de los cincuenta se desarrollaron multitud de estudios sobre ácidos biliares, entre los que cabe citar el aislamiento y caracterización de numerosos ácidos biliares presentes en diferentes especies 15 Capítulo II animales, exhaustivos estudios metabólicos y estudios detallados de las propiedades fisicoquímicas de los mismos. Tabla II.1.- Premios Nobel otorgados a investigadores cuyo trabajo estuvo relacionado con el colesterol o con sales biliares. Año Investigador/es Premio Nobel 1927 Wieland, H. O. Química 1928 Windaus, O. R. Química 1939 Ruzicka, L. Química 1947 Robinson, R. Química 1950 Diles, O. P. Química 1964 Bloch, K. E. y Lynen, F. Fisiología y Medicina 1965 Woodward, R. B., Hassel, O. y Barton, D. H. Química 1975 Conforth, J. W. Química 1985 Goldstein, J. L. y Brown, M. S. Fisiología y Medicina Figura II.1.- Fórmula química de la cortisona. O O CH 3 CH 3 C OH O H 2 COH En los años 60-80 se observó un gran auge en el número de publicaciones y patentes que versan sobre sales biliares (figura II.2), lo que se atribuye al descubrimiento de nuevas aplicaciones en campos muy variados. Así, por ejemplo, los ácidos biliares y sus derivados han sido utilizados como receptores supramoleculares de varios tipos de huéspedes e iones. Debido a su esqueleto químico, los ácidos biliares constituyen un pilar importante en el estudio del reconocimiento molecular, de la química huésped-anfitrión y de la química 16 Capítulo II biomimética. También se han utilizado los ácidos biliares como quelatantes y agentes de contraste en Resonancia Magnética de Imagen. Han sido preparados diversos derivados como agentes antibacterianos, antifúngicos o precursores de fármacos. Ciertos ácidos biliares y sus análogos actúan como agentes gelificantes potentes en medio acuoso u orgánico. En consecuencia, el número de patentes ha aumentado considerablemente. Buscando el término “bile acid” nos aparecen 16655 referencias bibliográficas que lo incluyan y 50615 su concepto.# La búsqueda de patentes arroja 1013 referencias. En 1984, A. Hofmann se aventuró a decir que si los 25 años precedentes habían sido fructíferos en el campo de las sales biliares, los próximos 25 años, en los que nos encontramos, serían todavía más satisfactorios ya que a los estudios fisicoquímicos y fisiológicos sobre ácidos biliares se les uniría la química orgánica y la biología celular. Efectivamente, esta unión se tradujo en un clarísimo aumento en el número de publicaciones tal y como se refleja en la figura II.2. En la tabla II.2 se puede observar el número de publicaciones referidas a cada ácido biliar por separado. El ácido cólico y desoxicólico presentan un nivel de publicaciones bastante superior a los ácidos quenodesoxicólico, ursodesoxicólico, y litocólico. 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 0 200 400 600 nº publicaciones de ácidos biliares año 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 nº patentes de ácidos biliares año (a) (b) Figura II.2.- Número de (a) publicaciones y (b) patentes que contienen el término “bile acid” localizados mediante SCIFINDER. #La búsqueda fue realizada hasta el 14-07-2006, mediante SCIFINDER. GOOGLE ACADÉMICO arroja 1360 referencias a lo largo de 2006. 17 Capítulo II Tabla II.2.- Número de publicaciones referidas a los distintos ácidos biliares presentes en el organismo humano. Búsqueda realizada desde el año 1920 hasta la actualidad. Término de búsqueda Nombre en castellano Nº de publicaciones Cholic acid Ácido cólico 8459 Deoxycholic acid Ácido desoxicólico 7543 Chenodeoxycholic acid Ácido quenodesoxicólico 5128 Ursodeoxycholic acid Ácido ursodesoxicólico 4540 Lithocholic acid Ácido litocólico 4012 No es de esperar el descubrimiento de muchos ácidos biliares naturales nuevos. Se podría predecir que no son muchos los nuevos ácidos C24 (figura I.1) que se van a encontrar, ya que la mayoría de las especies de vertebrados presentan ácidos biliares comunes. Sin embargo sí que se espera encontrar nuevas moléculas de ácidos C27.2 II.2.- ÁCIDOS BILIARES NATURALES. ASPECTOS IMPORTANTES. CONSIDERACIONES ESTRUCTURALES Se considera ácido biliar o sal biliar a cualquiera de los ácidos resultantes de la bioconversión o modificación química del colesterol (figura II.3). En los vertebrados superiores, los ácidos biliares más importantes presentan una estructura que deriva del ácido colánico (figura II.4): un grupo esteroide de 24 átomos de carbono con un núcleo compuesto por cuatro anillos saturados y una cadena lateral alifática corta. Figura II.3.- Estructura del colesterol, molécula casi completamente saturada. El único doble enlace, entre los átomos de carbono 5 y 6, le otorga cierta planaridad. Posee un núcleo esteroide 3β-hidroxilado con 19 átomos de carbono y una cadena lateral compuesta de 8 átomos de carbono. HO 18 Capítulo II Figura II.4.- Estructura del ácido colánico o (R)-4-((8R,9S,10S,13R,14S,17R)- hexadecahidro-10,13-dimetil-1Hciclopenta[a]fenantren-17-il)pentanoico. OH O Como se puede observar en la figura II.5, el núcleo esteroide de los ácidos biliares consiste en una estructura hidrocarbonada saturada, denominada ciclopentano-perhidrofenantreno.3 Otros aspectos ya han sido comentados en la introducción de esta tesis doctoral. La figura II.6 recoge la funcionalidad de los ácidos biliares más comunes. dO1a-COOH~14,6ÅdO1a-COOH~14,6Å (a) (b) dH19-O1α~5,9Å dH1a-H6a~4,9Å dH19-O1α~5,9Å dH1a-H6a~4,9Å (c) (d) Figura II.5.- Estructura del ácido cólico tridimensional. Vistas lateral (a) y frontal desde la cadena lateral (b) o desde el anillo A (c). (d) Croquis representativo. Las medidas son aproximadas y han sido obtenidas a partir de los modelos básicos que presenta el programa de diseño molecular CHEM3D. 19 Capítulo II R1 R2 R3 R4 Ácido colánico H H H OH Ácido cólico OH OH OH OH Ácido quenodesoxicólico OH(α) OH(α) H OH Ácido desoxicólico OH H OH OH Ácido ursodesoxicólico OH(α) OH(β)H OH Ácido litocólico OH H H OH Glicocolato OH OH OH NHCH2COOTaurocolato OH OH OH NHCH2CH2SO3Figura II.6.- Estructura bi y tridimensional y numeración de un ácido biliar C24. Se indica la estructura de los ácidos biliares más importantes y de sus derivados con glicina y taurina (presentes en el cuerpo humano). Los ácidos biliares más comunes presentan como base la estructura del ácido colánico con las posiciones 3 y 7 hidroxiladas por lo general, con orientación α, siendo el ácido ursodesoxicólico la gran excepción. Los ácidos biliares C24 suelen presentar con más o menos frecuencia un grupo hidroxilo adicional, ya sea en el núcleo o en la cadena lateral. La hidroxilación en la cadena lateral se realiza en la posición C23, generando los ácidos α-hidroxi biliares, o en la C22, constituyendo los ácidos β-hidroxi biliares. Esta hidroxilación en el núcleo puede tener lugar en varios lugares: 1α, 1β, 2β, 4β, 5β, 6α, 6β, 12α, 12β, 15α, 16α y 19β. Basados en los análisis de Hagey, esta tercera hidroxilación parece tener preferencia por las posiciones C12 y C16. Debido al largo número de especies OH O R 1 R 2 R 3 AB CD 1 2 34567 8 9 10 11 12 13 14 1516 17 18 19 20 21 22 23 24 O R 4 R 2 R 3 R 1 1 24 12 7 19 3 18 10 21 20 17 cara β cara α 20 Capítulo II avícolas que poseen el ácido 3α,7α,16α-trihidroxi-5β-colánico (ácido avicólico, véase la figura II.7), posiblemente sea el de mayor distribución entre las especies dentro de las sales biliares trihidroxiladas.2 En resumen, los ácidos biliares de las distintas especies difieren químicamente en tres aspectos: (i) estereoquímica de los anillos A/B, (ii) estructura de la cadena lateral y (iii) distribución del número, posición y estereoquímica de los grupos hidroxilos en el núcleo esteroide.4 5 La mayoría de los ácidos biliares se encuentran en la naturaleza en forma de sus sales sódicas aunque en algunos casos pueden aparecer conjugados con determinados aminoácidos como la glicina (un 75% de los ácidos biliares conjugados) y con la taurina (un 25%), dando lugar a la formación de las correspondientes amidas. II.3.- BIOSÍNTESIS DE LOS ÁCIDOS BILIARES La síntesis del colesterol a partir del acetil-coenzima A, a través de la ruta del ácido mevalónico, y su posterior degradación metabólica a ácidos biliares, representan las dos rutas biosintéticas fundamentales en la regulación de la homeostasis del colesterol. Por ello las sales biliares naturales proceden en su mayoría de esta modificación enzimática del colesterol (figura II.8), siendo por lo tanto estas sales biliares los derivados polares del colesterol.4,6 Como ya hemos visto, la molécula de colesterol tiene 27 átomos de carbono y sólo una posición hidroxilada, por lo que es necesario realizar modificaciones estructurales en esta molécula para obtener las sales biliares. En esta ruta metabólica se encuentran unas 15 reacciones enzimáticas y requiere, al menos, de unos cinco pasos tanto en el cuerpo cíclico como en la cadena lateral. Además, los pasos biosintéticos podrían ocurrir en cualquier orden, no siendo sencilla la elucidación del mecanismo.7 Según esta ruta biosintética, los ácidos biliares se pueden dividir en dos grandes grupos: ácidos biliares primarios que se obtienen directamente de la conversión del colesterol, como son el ácido cólico y el quenodesoxicólico, y los ácidos biliares secundarios como el desoxicólico y el litocólico que se obtienen de la conversión de los ácidos primarios. 21 Capítulo II 2-10 12-120 Nº de agregación Micelas primarias Micelas secundarias 2-10 12-120 Nº de agregación Micelas primarias Micelas secundarias Figura II.13.- Estructura de los agregados de sales biliares propuesta por Small.19 Esta interacción entre las caras β, también denominada espalda-contraespalda, ha sido apoyada por medidas de ESR utilizando sondas que portan el grupo radical nitrosilo.20 Estos autores indican que las micelas tendrían una forma de disco con la cara hidrófoba de las sales biliares orientada hacia el interior de la micela y la cara hidrófila (α) dirigida hacia el disolvente (figura II.14). Tal modelo estaría de acuerdo con los estudios de fluorescencia de sondas solubilizadas en el interior de los agregados. Una discusión más detallada puede ser consultada en la revisión debida a Jover et al.12 El anterior modelo sería posteriomente completado por Coello et al.16 Si los componentes de los agregados se orientan alternativamente hacia arriba y hacia abajo, para un número de agregación igual a 3, dos grupos carboxílicos deben estar orientados en la misma dirección (figura II.15). La ubicación de un contraion (normalmente Na+) entre ambos grupos carboxilato permitiría apantallar las repulsiones electrostáticas desfavorables. Ello implica que la fracción de contraiones de los agregados debería ser 1/3 lo que fue corroborado experimentalmente por los citados autores. En la figura II.15 puede verse la disposición de los contraiones para un trímero (número de agregación determinado para sales trihidroxílicas) y un hexámero (número de agregación determinado para 28 Capítulo II sales dihidroxílicas). Dado el bajo número de agregación, la disposición de los iones agregados, difícilmente recuerda las micelas clásicas originadas por tensioactivos alquílicos de cadena larga. Figura II.14.- Estructura en forma de disco propuesta por Kawamura et al20 para los agregados de sales biliares. ++ ++ ++ Figura II.15.- Ubicación de los contraiones en los trímeros (izquierda) y hexámeros (derecha) de sales biliares según Coello et al.16 A pesar del bajo número de agregación, las medidas de fluorescencia parecen sugerir que el agregado protege ampliamente a la sonda fluorófora de su entorno. Así, Vethamuthu et al21 han estimado que la fracción de pireno en contacto con el agua es tan sólo de un 4% cuando está solubilizado en colato sódico, porcentaje que se reduce al 0% en las micelas de desoxicolato. En las 29 Capítulo II micelas clásicas es más fácil que entre en contacto con el agua, al ubicarse hacia el exterior de las mismas,22 donde residen entre 5 y 10 moléculas de agua por monómero agregado.23 El segundo de los modelos, claramente contrapuesto a los anteriores, es debido a Giglio et al.24 Este modelo acepta que la estructura de los agregados es helicoidal estando los contraiones de la micela en el interior de la hélice, donde también se ubican las moléculas de agua. La molécula sería neutra por cuanto las cargas positivas de los contraiones neutralizarían exactamente las negativas de los monómeros de sal biliar. Los grupos polares se ubicarían en la cara lateral de la hélice, recordando la estructura de una micela inversa (figura II.16). El modelo fue inferido por Giglio et al a partir de la resolución de las estructuras cristalinas de las sales biliares objeto de estudio. Ello constituye razón suficiente para justificar el esfuerzo dedicado durante la ejecución de la presente tesis doctoral a los cristales de los epímeros del ácido quenodesoxicólico y ursodesoxicólico así como de los nuevos derivados de ácidos biliares sintetizados y que se exponen en el capítulo III. Pero antes conviene que realicemos una presentación de los cristales resueltos por otros autores. Por la extensión de la revisión le dedicaremos un apartado específico a la misma. Figura II.16.- Estructura propuesta por Giglio et al25 para los agregados de desoxicolato sódico. Vistas a lo largo del eje de la hélice (izquierda) y transversal (perpendicular) al mismo. 30 Capítulo II Por otra parte, el conocimiento de la estructura cristalina de estos derivados puede ser también útil a la hora de proponer estructuras para los agregados que originan en disolución acuosa, una estrategia que ha sido seguida durante años por el Profesor Giglio et al.24 II.5.- ANÁLISIS DE LOS CRISTALES DE LOS EPÍMEROS DEL ÁCIDO DESOXICÓLICO Jover et al26 pudo predecir con éxito la estructura de los enlaces de hidrógeno del ácido 3-cetodesoxicólico en estado cristalino a partir del estudio de la red de enlaces de hidrógeno en los cristales de los diferentes epímeros del ácido desoxicólico (3α,12α) y los otros tres epímeros, además del análisis en referencias bibliográficas donde se muestra que el desoxicólico forma complejos de inclusión con una gran variedad de huéspedes,27-33 incluyendo el p-xileno,34-39 mientras que el epímero 3β,12α no los forma (al menos con el citado disolvente).40 Además, las redes de enlaces de hidrógeno que establecen son también muy diferentes. Todos los epímeros del ácido desoxicólico fueron recristalizados en p-xileno, disolvente que no forma enlaces de hidrógeno con el ácido biliar. Los sistemas de empaquetamiento resultaron diferentes en los cuatro epímeros del ácido desoxicólico, y sólo el cristal del ácido desoxicólico 3α,12α, incluye al disolvente p-xileno con una estequiometría 2:1. También genera inclusión de disolvente el ácido 3-oxo,12α-hidroxi-5β-colán-24-oico con una estequiometría 1:1/2. Todos estos parámetros se pueden observar en la tabla II.3 donde se aparecen las características de los cristales. Los datos del cristal del ácido desoxicólico en p-xileno se deben a Gallese et al,38 mientras que el resto de los epímeros se resolvieron dentro de nuestro grupo de investigación en diferentes publicaciones, el 3β,12α40 y los restantes.41 La figura II.17 ilustra con detalle los enlaces de hidrógeno que se forman entre los grupos hidroxilo y carboxílico de los cuatro compuestos. Se demuestra en este trabajo que los tres grupos funcionales de los cuatro epímeros actúan simultáneamente como donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno, y el resultado de todo ello es que cada uno de los cuatro epímeros participa en la formación de seis enlaces de hidrógeno intermoleculares con seis moléculas diferentes. El estudio de estos enlaces permite concluir que cualquier cambio de la configuración de un grupo hidroxilo del núcleo esteroide afecta a la red de enlaces de hidrógeno del cristal. Los grupos implicados en la formación de 31 Capítulo II tales enlaces también dependen de la configuración. Estos patrones quedan resumidos en el esquema de la figura II.17. En la figura II.18 la flecha indica qué oxígeno es el donante y cuál es el aceptor del enlace de hidrógeno. Asimismo, el recuadro indica qué átomos pertenecen a la misma función orgánica. Tabla II.3. Datos de los cristales de tres epímeros derivados del ácido desoxicólico: 3α,12α;38 3β,12α;40 3α,12β; 3β,12β y el ácido 3-oxo,12α-hidroxi-5βcolán-24-oico.41 Fórmula empírica C48H80O8·C8H10 C24H40O4C24H40O4C24H40O4C24H38O4·½C8H10 Epímero 3α,12α 3α,12β 3β,12β 3β,12α 3ceto,12α Sistema cristalino, grupo espacial Monoclínico P21 Ortorrómbico P212121 Hexagonal P65 Ortorrómbico P212121 Monoclínico P21 a/Å 7,196 (13) 9,0670 (12) 18,2134 (14) 7,3232 (6) 6,904 (2) b/Å 26,205 (5) 10,030 (3) 18,2134 (14) 10,5938 (16) 13,286 (4) c/Å 13,313 (2) 24,086 (5) 12,5060 (19) 28,2957 (18) 26,669 (7) α (º) 90 90 90 90 90 β (º) 90,007 (4) 90 90 90 92,51 (2) γ (º) 90 90 120 90 90 Volumen/Å3 2510,7 (8) 2190,5 (8) 3592,8 (7) 2195,2 (4) 2443,9 (12) Las secuencias aquí establecidas nos informan de que cada receptor de un enlace de hidrógeno actúa de un modo específico, es decir, interactúa con un donante exclusivo. Ello es equivalente a afirmar que no existen ramificaciones en las secuencias formadas. 32 Capítulo II ab c ab c Enlaces de hidrógeno donante/aceptor O3-H ... O24b O12-H ... O3 O24a-H ... O12 O3 O3 O3 O12 O12 O12 O24a O24a O24b O24b Enlaces de hidrógeno donante/aceptor O3-H ... O24b O12-H ... O3 O24a-H ... O12 O3 O3 O3 O12 O12 O12 O24a O24a O24b O24b (a) c b a c b a O24b O3 O12 O24a Enlace de hidrógeno donante/aceptor O3-H ... O12 O12-H ... O24b O24a-H ... O3 O3 O12 O24a O3 O24b O24a O24b O3 O12 O24a Enlace de hidrógeno donante/aceptor O3-H ... O12 O12-H ... O24b O24a-H ... O3 O3 O12 O24a O3 O24b O24a (b) a b c a b c O3 O12 O24a O24b Enlace de hidrógeno donante/aceptor O3-H ... O24b O12-H ... O3 O24a-H ... O12 O3 O12 O24a O24b Enlace de hidrógeno donante/aceptor O3-H ... O24b O12-H ... O3 O24a-H ... O12 (c) (d) Figura II.17.- (a) Empaquetamiento del cristal (monoclínico P21) del ácido desoxicólico (epímero 3α,12α) con el que forma un complejo de inclusión de estequiometría 2:1. (b) Empaquetamiento del cristal (hexagonal P65) del epímero 3β,12β del ácido desoxicólico. (c) Empaquetamiento del cristal (ortorrómbico P212121) del epímero 3α,12β del ácido desoxicólico. (d) Empaquetamiento del cristal (ortorrómbico P212121) del epímero 3β,12α del ácido desoxicólico. Todos los cristales fueron obtenidos en p-xileno. 33 Capítulo II O3 O24b O24a O12 O3 O12 O24a O24b 3α,12βO3 O12 O24a O24b 3β,12αEstructura cíclica Enlace de hidrógeno : abcabc... y acbacb... abc O12 O24a O24b O3 O3 3α,12αO3 O3O12 O24a O24b 3β,12βO3 O24b O24a O12 O3 O12 O24a O24b 3α,12βO3 O12 O24a O24b 3β,12αEstructura cíclica Enlace de hidrógeno : abcabc... y acbacb... abc O12 O24a O24b O3 O3 3α,12αO3 O3O12 O24a O24b 3β,12βFigura II.18.- Esquema de los enlaces de hidrógeno observados en los cristales de los cuatro epímeros (3α,12α; 3α,12β; 3β,12α y 3β,12β) del ácido desoxicólico.41 A partir de este esquema se logró predecir con éxito la red de enlaces de hidrógeno de la molécula del ácido 3-oxo,12α-hidroxi-5β-colán-24-oico (3-cetodesoxicólico). En la figura II.19.a mostramos la deducción de la red de enlaces de hidrógeno a la que obedece y en la figura II.19.b los enlaces de hidrógeno que se obtuvieron al resolver el cristal en p-xileno encontrándose una completa coincidencia entre lo predicho y lo observado. O3 O12 O24a O24b 3α,12βO3 O12 O24a O24b 3β,12αabc O12 O24a O24b O3 O3 3α,12αO3 O3O12 O24a O24b 3β,12βO3 O12 O24a O24b 3α,12βO3 O12 O24a O24b 3β,12αabc O12 O24a O24b O3 O3 3α,12αO3 O3O12 O24a O24b 3β,12βO3 O12 O24a O24b 3α,12βO3 O12 O24a O24b 3β,12αabc O12 O24a O24b O3 O3 3α,12αO3 O3O12 O24a O24b 3β,12βO3 O12 O24a O24b 3α,12βO3 O12 O24a O24b 3β,12αabc O12 O24a O24b O3 O3 3α,12αO3 O3O12 O24a O24b 3β,12βO12 O3 O24a O24b O3 O12 O24a O12 Enlace de hidrógeno donante/aceptor O12-H ... O3 O24a-H ... O12 O12 O3 O24a O24b O3 O12 O24a O12 Enlace de hidrógeno donante/aceptor O12-H ... O3 O24a-H ... O12 (a) (b) Figura II.19.- (a) Esquema de los enlaces de hidrógeno observados en los cristales de los cuatro epímeros (3α,12α; 3α,12β; 3β,12α y 3β,12β) del ácido desoxicólico aplicado al 3-cetodesoxicolato. (b) Enlaces de hidrógeno del cristal del 3-oxo,12α derivado del ácido desoxicólico. 34 Capítulo II II.6.- RESOLUCIÓN DE LOS CRISTALES DE LOS EPÍMEROS DEL ÁCIDO QUENODESOXICÓLICO Y URSODESOXICÓLICO El éxito del análisis anterior hizo que se plantease un estudio análogo para la serie de epímeros de los ácidos quenodesoxicólico y ursodesoxicólico con grupos hidroxilo en las posiciones 3 y 7 (figura II.20) con el fin de conseguir una base completa de referencia para la predicción de las propiedades de nuevos cristales. Aunque algunas estructuras cristalinas de estos derivados han sido ya publicadas, en este trabajo se hace uso de la sistemática de la recristalización de todos ellos en el mismo disolvente. Y así, del mismo modo que en la serie del ácido desoxicólico, los cristales fueron obtenidos de p-xileno a excepción del correspondiente al ácido quenodesoxicólico que se obtuvo de una mezcla p-xileno con cantidades mínimas de n-pentanol, lo que no afectó al cristal obtenido. epímero 3α,7αCDCA 3β,7αi-CDCA 3α,7βUDCA 3β,7βi-UDCA epímero 3α,7αCDCA 3β,7αi-CDCA 3α,7βUDCA 3β,7βi-UDCA epímero 3α,7αCDCA 3β,7αi-CDCA 3α,7βUDCA 3β,7βi-UDCA O OH 3 7 12 18 19 17 20 21 22 23 24 24a 24b 13 14 15 16 HO OH Figura II.20.- Estructura de los epímeros estudiados y nomenclatura utilizada en el desarrollo del capítulo. A diferencia del ácido desoxicólico del que existe mucho material bibliográfico sobre los cristales que forma, del ursodesoxicólico y quenodesoxicólico apenas existen referencias. Sí ha sido posible obtener información sobre un cristal de ácido ursodesoxicólico sin huéspedes,42 (no así para el ácido desoxicólico) difiriendo su empaquetamiento molecular del de los cristales con huéspedes incluidos. Con fenantreno cristaliza en el sistema ortorrómbico P212121 y la estequiometría es 1:1.43 La red de enlaces de hidrógeno origina un canal a lo largo de b (figura II.21), donde se aloja el fenantreno. La estructura de los canales es diferente a la del ácido cólico y desoxicólico. 35 Capítulo II Anteriormente, se había comprobado44 que este ácido biliar incluye a los huéspedes fenantreno y antrona cuando los complejos se preparan usando la técnica de co-grinding por medio de un molino vibracional, aunque no lo hace cuando se utiliza el método convencional de coprecipitación. Esto muestra una mayor selectividad del ácido ursodesoxicólico hacia los huéspedes en comparación con el ácido desoxicólico. Figura II.21.- Estructura del cristal del ácido ursodesoxicólico con fenantreno.43 En 1978 se informó del fenómeno de polimorfismo presentado por el ácido quenodesoxicólico, habiéndose establecido, mediante análisis térmico diferencial, tres formas cristalinas y una amorfa.45 Dos años más tarde, Lindley et al46 publicaron la estructura del cristal (monoclínico P21) de la forma polimórfica de mayor punto de fusión (438-439K), obtenido a partir de su cristalización en acetonitrilo (no incluyendo huéspedes). En la celda aparecen dos tipos de moléculas de ácido que se diferencian ligeramente en la conformación del anillo D. Debemos destacar que las dos moléculas se comportan anómalamente porque, aún presentando una orientación inadecuada del grupo carboxilo, en comparación con otros cristales de ácidos biliares, éste está implicado en la formación de enlaces de hidrógeno, los cuales se establecen entre moléculas de cada uno de los dos tipos entre sí y también de forma cruzada. Así, entre las moléculas de tipo I se establece el enlace bifurcado O3...O24b y O3...O24a, y entre las de tipo II se establece un enlace sencillo O3...O24b que genera una hélice cabeza-cola paralela a b, dejando 36 Capítulo II las moléculas de tipo I y II prácticamente perpendiculares entre sí. Ambos tipos de moléculas se unen de la siguiente forma: en las proximidades del O7 de I quedan dos moléculas de tipo II. Una le ofrece su cabeza y la otra su cola, formándose así el enlace de hidrógeno bifurcado O7...O3 y O7...O24a, enlaces que aparecen invertidos en la parte opuesta de la hélice. Asimismo, aparece el enlace de hidrógeno O24a...O7 entre una molécula I y una molécula II de la hélice. La estructura del cristal se visualiza en la figura II.22. Figura II.22.- Vista estereoscópica de la estructura del cristal polimórfico del ácido quenodesoxicólico (438-439K).46 Chikada et al47 llevaron a cabo un estudio de intercalación (intercambio de huéspedes) y polimerización en canales del ácido quenodesoxicólico. En primer lugar, obtuvieron cristales a partir del gel que se forma por disolución del ácido biliar en acetato de n-octilo, y luego procedieron al intercambio de huéspedes disolviendo los cristales en el líquido correspondiente. El cristal con acetato de n-octilo posee una estequiometría 1:1 y es hexagonal P65, presentando una estructura con columnas helicoidales, isomorfa con la de los cristales con acetato de etilo48 o cloroformo.49 Los monómeros empleados para el intercambio fueron vinilos y dienos, aunque sólo aportan datos cristalográficos para el cristal con estireno (también hexagonal P65 y estequiometría 1:1). Estos autores también indican que la polimerización (llevada a cabo por irradiación γ con una fuente de 60Co) tiene lugar en los canales cristalinos y separan los polímeros en una gran cantidad de metanol. 37 Capítulo II Plano v Plano h Plano v Plano h Figura II.25.- Planos utilizados para referenciar la posición del grupo carboxílico del ácido quenodesoxicólico. Arriba: plano horizontal, h, definido por 15 átomos de carbono C1/C6-C17/C20. Debajo: plano vertical, v, definido por los dos grupos metilo C18 y C19 y los átomos de carbono a los que se enlazan, C10 y C13. Los dos planos son casi perpendiculares entre sí, el valor del ángulo promedio para los cuatro ácidos biliares estudiados aquí es 88,4±0,6º (valor máximo 89,3º para el ácido ursodesoxicólico (verde); valor mínimo 87,9º para el isómero 3β,7α). Las distancias del átomo de carbono carboxílico C24 a los dos planos se representan en la figura II.26. Para una mejor comprensión de la magnitud de las desviaciones de los planos, debemos recordar que la longitud de la cadena alquílica desde C17 hasta C24 tiene un valor medio de 6,08±0,02 Å. Por tanto podemos concluir que las cuatro sales biliares evidencian pequeñas desviaciones con respecto al plano vertical, correspondiendo el valor máximo al isómero 3β,7β (=-0,466 Å), mientras que se observa un intervalo más amplio (=3,3 Å) para las coordenadas verticales (distancias al plano horizontal). Solamente el ácido quenodesoxicólico da lugar a desviaciones hacia la parte hidrófoba de la molécula (β), facilitando así la formación de dos enlaces de hidrógeno, O24b←O7 y O24a→O3, con otras dos moléculas localizadas encima del grupo carboxílico (figura II.27). 44 Capítulo II -1,0 1,0 2,0 3,0 -3,0 -2,0 -1,0 1,0 2,0 3,0 3β,12β 3α,12β 3oxo,12α 3α,12α3α,7β (azul) 3α,7β (verde) 3α,7α 3β,7β 3β,7αh/Å v/Å -1,0 1,0 2,0 3,0 -3,0 -2,0 -1,0 1,0 2,0 3,0 3β,12β 3α,12β 3oxo,12α 3α,12α3α,7β (azul) 3α,7β (verde) 3α,7α 3β,7β 3β,7αh/Å v/Å Figura II.26.- Coordenadas de los átomos carboxílicos C24 respecto a los dos planos definidos en la figura II.25 para varios ácidos biliares. O24a O24b O7 O3 O24a O24b O7 O3 Figura II.27.- Orientación hacia arriba del grupo carboxilato del ácido quenodesoxicólico que facilita la formación de los enlaces de hidrógeno O24b←O7 y O24a→O3 con otras dos moléculas. La red de enlaces de hidrógeno observada en los cristales del ácido quenodesoxicólico (3α,7α) es bastante compleja. Cada posición capaz de formar un enlace de hidrógeno puede participar, a su vez, en la formación de dos enlaces de 45 Capítulo II hidrógeno con otras dos moléculas y, consecuentemente, cada molécula de ácido quenodesoxicólico se interconecta con seis moléculas, pero solamente existen tres enlaces de hidrógeno diferentes (O7→O24b, O24a→O3 y O3→O7; figura II.28). Estos enlaces de hidrógeno son los mismos que los observados para las formas polimórficas de bajo punto de fusión que incluyen acetato de etilo48 o cloroformo.49 O3 O7 O24a O24b O7 2.858 2.653 O24b 2.858 O3 2.789 O7 2.789 O24a 2.653 O3 O3 O7 O24a O24b O7 2.858 2.653 O24b 2.858 O3 2.789 O7 2.789 O24a 2.653 O3 Figura II.28.- Distancias en Å de los enlaces de hidrógeno observados en el cristal del ácido quenodesoxicólico en p-xileno. Siguiendo la interconexión de los enlaces de hidrógeno nos encontramos con la existencia de dos ciclos diferentes requiriendo ambos cuatro moléculas de quenodesoxicólico. El primer ciclo sigue la secuencia *O24b-O24a→O3→O7O3→O7* y el segundo obedece al esquema *O7-O3→O24a-O7→O24bO24a→O3-O24b*. Aquí los átomos de oxígeno que pertenecen a la misma molécula aparecen subrayados y el asterisco significa que ambos átomos están unidos mediante un enlace de hidrógeno cerrando el polígono. En el primer ciclo hay dos enlaces de hidrógeno O3→O7, sin embargo, este enlace de hidrógeno no existe en el segundo ciclo. Estos ciclos son muy diferentes a los observados para los isómeros 3α,12β y 3β,12α del ácido desoxicólico.41 La red de enlaces de hidrógeno de estos dos isómeros engloba tres moléculas que forman un triángulo en el cual cada vértice es donante de enlace de hidrógeno hacia el segundo vértice y aceptor de enlace de hidrógeno del tercer vértice. Para el isómero 3α,12β del ácido desoxicólico41 la longitud total de los tres enlaces de hidrógeno es 8,234 Å, y para el 3β,12α40 es 46 Capítulo II 8,405 Å. Es decir, los triángulos de los derivados 3α,12β y 3β,12α tienen los lados formados exclusivamente por enlaces de hidrógeno mientras que los dos polígonos del ácido quenodesoxicólico están formados por moléculas enlazadas por enlaces de hidrógeno. Las longitudes totales de los polígonos son 16,130 Å (solamente 11,089 Å corresponden a enlaces de hidrógeno) y 38,837 Å (11,022 Å corresponden a enlaces de hidrógeno). Para los otros tres isómeros se evidencian situaciones similares ya que en todos los casos cada átomo susceptible de enlace de hidrógeno participa en la formación de dos enlaces de hidrógeno con otras dos moléculas. Para el i-quenodesoxicólico (3β,7α) los enlaces de hidrógeno observados son O3→O24b, O24a→O7 y O7→O3. Ahora se requieren sólo tres moléculas de ácido biliar para cerrar el ciclo *O7-O24a→O7-O24b←O3←O7* (figura II.29). Dos de las moléculas se encuentran en disposición casi opuesta una con respecto a la otra, permitiendo una doble interacción casi directa del grupo carboxílico/grupo hidroxilo O7H. Sin embargo, en una de las terminaciones, el grupo hidroxilo O3H de una tercera molécula se localiza entre los grupos anteriores formando dos enlaces de hidrógeno, O7→O3 y O3→O24b. Sus planos esteroides horizontales forman un ángulo de 48,6º, es decir, sus lados hidrófobos están rotados un ángulo de 131,4º. El isómero 3β,7β sigue el mismo esquema de enlaces de hidrógeno que el isómero 3β,7α, pero ahora los dos núcleos esteroide de las dos moléculas opuestas están casi perpendiculares entre sí con un valor de 79,6º entre ellas (sus superficies hidrófobas están rotadas un ángulo de 100,4º). Tal diferencia entre los dos valores de los ángulos de los isómeros se puede comprender en función de la diferente orientación del grupo hidroxilo O7H que para formar el enlace de hidrógeno O24a→O7 necesita un giro de las moléculas. Sin embargo, se debe resaltar que el epímero 3β,7β forma complejos de inclusión con el disolvente, estando localizado el huésped fuera del ciclo de enlaces de hidrógeno mencionado (véase la figura II.30). La orientación de las moléculas de ácido biliar hacia el huésped facilita las interacciones hidrófobas anfitrión-huésped. La cavidad hidrófoba del anfitrión está formada por: (i) el grupo C19 de una primera molécula, (ii) los átomos de hidrógeno de la posición C1 y C2 del anillo A, y C11 y C12 del anillo C de una segunda molécula; y (iii) los átomos de hidrógeno en C17 y C16 del anillo D y el grupo metilo C21, y el primer grupo metileno C22 de la cadena lateral de una tercera molécula (figura II.31). Esta estructura es muy similar a la encontrada por Miyake et al58 para los cristales de inclusión del isómero 3β,7β con la 2-acetonaftona y por Fukami et al43 para los cristales del ácido 47 Capítulo II ursodesoxicólico/fenantreno. Esta estructura fue bautizada58 como de tipo “cierre de gallinero”. Los canales donde se acomoda la molécula de huésped tienen una sección transversal aproximadamente rectangular de unas dimensiones aproximadas de 7×16 Å2. Las moléculas huésped se acomodan paralelas a los canales con una distancia entre sí de 2,97 Å y las de esteroide con una distancia de 4,4 Å. 2.706 Å 2.793 Å 2.655 Å 10.770 Å 9.087 Å O24a O24b O3 O7 2.706 Å 2.793 Å 2.655 Å 10.770 Å 9.087 Å O24a O24b O3 O7 Figura II.29.- Red de enlaces de hidrógeno que engloba tres moléculas de ácido biliar de 3β,7α-i-quenodesoxicólico. Distancias en Å. La red de enlace de hidrógeno en los cristales del ácido ursodesoxicólico (derivado 3α,7β) es compleja debido a que existen interacciones entre moléculas de tipo I, entre moléculas de tipo II, y entre moléculas de tipo I y II como ya observaron Lindley y Carey.67 Teniendo en cuenta que nuestros datos concuerdan con sus resultados no comentaremos con más profundidad este tema para esta molécula. La figura II.32 resume los resultados obtenidos. Solamente resaltaremos que estas dos moléculas están directamente enlazadas por dos enlaces de hidrógeno, implicando los átomos de oxígeno O7 y los grupos carboxílicos de ambas moléculas, lo cual requiere que los planos de los núcleos esteroide formen un ángulo de 54,7º (figura II.33). Éste es el único ácido biliar que exhibe este tipo de interacción de enlace de hidrógeno. 48 Capítulo II 2.624 Å O24a O24b O3 O7 10.131 Å O7 2.631 Å 2.686 Å 9.338 Å 2.624 Å O24a O24b O3 O7 10.131 Å O7 2.631 Å 2.686 Å 9.338 Å Figura II.30.- Distancias de los ciclos de enlace de hidrógeno del ácido i-ursodesoxicólico (epímero 3β,7β). C19 C1 C2 C16 C11 C12 C17 C21 C22 C19 C1 C2 C16 C11 C12 C17 C21 C22 Figura II.31.- Interacciones hidrófobas anfitrión-huésped del ácido i-ursodesoxicólico (epímero 3β,7β). 49 Capítulo II azul verde O3 O24a O24b O3 O7, azul O24b, azul 2.842 2.949 O7, verde O24a, verde 2.698 2.729 O7 O7 O3, azul O3, verde 2.949 2.803 2.729 O3, azul O24b O3, verde O24a 2.842 2.803 2.698 azul verde O3 O24a O24b O3 O7, azul O24b, azul 2.842 2.949 O7, verde O24a, verde 2.698 2.729 O7 O7 O3, azul O3, verde 2.949 2.803 2.7292.729 O3, azul O24b O3, verde O24a 2.842 2.803 2.698 Figura II.32.- Red de enlaces de hidrógeno formada por las dos moléculas de la unidad asimétrica de la celda del cristal del ácido ursodesoxicólico. Distancias en Å. 54.7454.74 Figura II.33.- Ángulo formado por los dos planos esteroide de las dos moléculas de la unidad asimétrica del cristal del ácido ursodesoxicólico. 50 Capítulo II La tabla II.6 resume los parámetros geométricos de los enlaces de hidrógeno de los cuatro epímeros. Tabla II.6. Enlaces de hidrógeno, longitudes y ángulos para los cuatro isómeros. Epímero CDCA i-CDCA D-H...A d (D...A)/Å <DHA (o) D-H...A d (D...A)/Å <DHA (o) O(24a)-H...O(3) O(3)-H...O(7) O(7)-H...O(24b) 2,652 (14) 2,789 (11) 2,857 (13) 169 (15) 162 (4) 119 (6) O(24a)-H...O(7) O(7)-H...O(3) O(3)-H...O(24b) 2,654 2,705 2,793 UDCA i-UDCA D-H...A d (D...A)/Å <DHA (o) D-H...A d (D...A)/Å <DHA (o) O(24a)-HI...O(24b)II O(3)I O(7)II O(7)II O(24a)II O(7)I O(3)II O(7)I O(24b)I O(7)...HI ... ... O(3)...HII ... ... O(7)...HII ... ... O(3)...HI ... ... O(24a)-HI...O(24b)II O(3)I O(7)II O(7)II O(24a)II O(7)I O(3)II O(7)I O(24b)I O(7)...HI ... ... ... ... O(3)...HII ... ... ... ... O(7)...HII ... ... ... ... O(3)...HI ... ... ... ... 2,803 2,949 2,803 2,729 2,698 2,803 2,729 2,949 2,842 O(24a)-H...O(7) O(7)-H...O(3) O(3)-H...O(24b) 2,621 (3) 2,632 (3) 2,682 (3) 171 (5) 161 (5) 167 (5) Cuando se comparan los resultados para los cuatro isómeros aquí estudiados con la familia del ácido desoxicólico se pueden obtener varias conclusiones: (i) Cada uno de los cuatro isómeros del ácido desoxicólico muestra su propio patrón de enlaces de hidrógeno y diferente de los otros tres derivados. Sin embargo en el presente caso, los dos isómeros que tienen una orientación β para el grupo hidroxilo O3H, muestran patrones de enlace de hidrógeno idénticos, *O7-O24a→O7-O24b←O3←O7* como ya se mencionó anteriormente. (ii) Teniendo en cuenta que el O24a es siempre donante y el O24b es siempre aceptor, las secuencias de enlace de hidrógeno se pueden comprender en función de la interacción entre los dos grupos hidroxilo. El conjunto de orientaciones del ácido desoxicólico (α o β) del grupo hidroxilo en la posición C3, O3H, determina la 51 Capítulo II secuencia aceptor-donante, puesto que es O12→O3 cuando O3H es α, pero es O3→O12 cuando O3H es β. La comparación para los cuatro isómeros dihidroxilados 3,7 es compleja debido a la existencia de dos moléculas en la unidad asimétrica del cristal del ácido ursodesoxicólico que obliga a que el mismo sitio de enlace de hidrógeno (por ejemplo O3) sea donante hacia diferentes aceptores (O7 o O24b) (figura II.32). Para los restantes ácidos biliares la “regla del ácido desoxicólico”41 es obedecida ya que la secuencia es O7→O3 cuando O3H es β y O3→O7 cuando es α. (iii) Para los derivados del ácido desoxicólico, cuando los dos grupos hidroxilo tienen orientaciones opuestas (es decir, 3α,12β y 3β,12α) las redes de enlace de hidrógeno engloban tres moléculas que conforman un triángulo de enlaces de hidrógeno en el cual cada vértice es donante de enlace de hidrógeno hacia un segundo vértice y aceptor de enlace de hidrógeno desde el tercer vértice.40 Este patrón no ha sido observado para ningún isómero de la familia estudiada, por ello la comparación se complica nuevamente por el caso excepcional del ácido ursodesoxicólico. (iv) Se han introducido dos planos h y v, para visualizar la orientación de la cadena alquílica con respecto al núcleo esteroide. Para la familia del ácido quenodesoxicólico las distancias del grupo carboxílico al plano vertical (figura II.26) son cortas (el valor máximo corresponde al isómero 3β,12β). Además, sólo el ácido quenodesoxicólico muestra una desviación positiva hacia la parte hidrófoba de la molécula (cara β). Sin embargo, los isómeros del ácido desoxicólico muestran desviaciones considerablemente mayores (figura II.26). Los cristales de los isómeros del ácido desoxicólico se utilizaron para predecir la estructura del cristal del derivado 3-oxo-desoxicólico. De acuerdo con esta predicción, este compuesto debería cristalizar como el ácido desoxicólico, como así lo hace. Es notable que los dos compuestos tienen casi las mismas coordenadas en el sistema de referencia de los dos planos. BIBLIOGRAFÍA 1. Wieland, H. Angew. Chem. 1929, 42, 421-4. 2. Roda, A.; Roda, E.; Hofmann, A. F. Ed. Acidi Biliari 2000 Aggiornamento Per Il Futuro 1999. 3. Nair, P. P.; Kritchevsky, D. The Bile Acids. Chemistry, Physiology, and Metabolism. Volume I: Chemistry.; Plenum Press: New York, 1971. 4. Mukhopadhyay, S.; Maitra, U. Curr. Sci. 2004, 87, 1666-83. 52 Capítulo II 5. Haslewood, G. A. D. J. Lipid Res. 1967, 8, 535-50. 6. Hofmann, A. F.; Mysels, K. J. Colloids Surfaces 1988, 30, 145-73. 7. Zarras, P.; Vogl, O. 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Si se cambia de orientación un sustituyente hidroxilo desde una configuración alfa a una beta, la cmc aumenta. Si se tiene en cuenta la cadena lateral en la posición 17, se observan dos efectos, siendo uno de ellos el aumento de la cmc al acortarse la cadena lateral que concuerda con lo observado para detergentes con cadenas apolares largas. Otro efecto es que la amidación con glicina o con taurina tiene poca importancia sobre la cmc, ya que el aumento de un metileno o dos (según sea conjugado) se ve compensado por el incremento de polaridad que introduce el enlace amida. De aquí se deduce que el efecto de la conjugación con glicina o taurina introduce un cambio más importante en el valor de pKa que en la cmc.3 Tabla III.1.- Propiedades fisicoquímicas de algunas sales biliares. aReferida a las formas protonadas; ba 25ºC; cdatos tomados a 75ºC; dvalores tomados de la figura II.11; e[Na]=150mM.4 cmc/mM Nombre común Posiciones hidroxiladas Solubilidada en aguab/mM AguabNaClbNº de agregación en agua Litocolato sódico 3α 0,00005 0,9c0,5c Quenodesoxicolato sódico 3α,7α 0,027 9 4 Ursodesoxicolato sódico 3α,7β 0,0009 19 7 Desoxicolato sódico 3α,12α 0,028 10 3 2-170d Colato sódico 3α,7α,12α 0,273 13 11 2-20d Ursocolato sódico 3α,7β,12α 1,67 60 39 Glicocolato 3α,7α,12α 12 10 9,6e Taurocolato 3α,7α,12α 10 6 4-10d Existe una gran controversia en los valores de cmc, número de agregación o tamaño de los agregados a los que dan lugar las diferentes sales biliares (vide supra). En algunos casos estas diferencias se corresponden a la presencia de impurezas y en otros al uso de técnicas no comparables.5 Se han usado muchas técnicas para tratar de elucidar cuál es el método correcto pero el problema puede radicar en aplicar un único modelo de agregación para todas las sales biliares. Capítulo III 61 Tampoco está muy claro si los agregados primarios son monodispersos o si aumenta el número de agregación con la concentración de sal biliar. En la actualidad ya se acepta la formación de esa primera etapa y se la suele denominar etapa de premicelización.6-9 Temperatura micelar crítica de sales biliares En la figura III.1 se puede ver un diagrama de fases de un tensioactivo típico. A baja temperatura, los detergentes se encuentran en una fase cristalina altamente insoluble en equilibrio con pequeñas cantidades de monómero disuelto. Si se aumenta la temperatura, la fase cristalina se va disolviendo hasta alcanzar un valor en el que el monómero no se encuentre en forma libre sino agregado formando micelas. Se alcanza entonces lo que se conoce como cmc y la temperatura donde se ha alcanzado la cmc se denomina cmt (temperatura micelar crítica). Existe una temperatura conocida como punto de Kraft en el que coexisten las tres fases en equilibrio: estado cristalino, monómero libre y micelas. Ésta es la temperatura mínima por debajo de la cual no tiene lugar la micelización sea cual sea la cantidad de surfactante, y por encima de la misma el exceso de surfactante que se añada dará lugar a la formación de más micelas, o incluso a cambios de fase pudiendo llegar a la formación de geles. El valor de la cmt depende de la fuerza iónica del medio ya que ésta influye en la solubilidad del monómero y, por lo tanto, en su valor de cmc y en la estabilidad de la estructura cristalina. El valor de la cmt ha sido medido para varios ácidos biliares naturales, obteniéndose como norma que un aumento en el número de grupos hidroxilo produce una disminución en la cmt.10 El colanoato sódico tiene una cmt aproximada de 90ºC, mientras que la mayoría de las sales monohidroxílicas presentan valores en torno a 40-80ºC. Por ejemplo, el litocolato sódico, considerado en su momento insoluble, tiene una cmt de 65ºC por encima de la cual su solubilidad aumenta debido a la formación de micelas.11,12 El resto de sales naturales tanto dicomo trihidroxiladas tienen una temperatura de micelización crítica por debajo de los 0ºC. Este hecho tiene poca relevancia en los animales homeotérmicos ya que presentan valores de temperatura en torno a los 36-38ºC, pero en peces u otros animales que viven en las latitudes árticas, este valor de cmt por debajo de la temperatura de congelación del agua tiene gran importancia. Capítulo III 62 cmc FASE MICELAR FASE LÍQUIDO-CRISTALINA cmt transición de temperatura FASE CRISTALINA (suspensión en agua) pto de Kraft 300 200 100 010075 50 25 micelas cilíndricas agua fase cilíndrica micelas esféricas fase lamelar Temperatura / ºC Concentración de tensioactivo (% en peso) cmc FASE MICELAR FASE LÍQUIDO-CRISTALINA cmt transición de temperatura FASE CRISTALINA (suspensión en agua) pto de Kraft 300 200 100 010075 50 25 micelas cilíndricas agua fase cilíndrica micelas esféricas fase lamelar Temperatura / ºC Concentración de tensioactivo (% en peso) Figura III.1.- Diagrama de fases de un sistema agua-tensioactivo. La cmt se muestra como una línea en la que la fase cristalina se convierte en una fase micelar en un intervalo estrecho de temperaturas. La línea desde el origen que denota un aumento en la solubilidad con la temperatura muestra un cambio brusco en el punto de Kraft cuando la concentración alcanza la cmc del sistema. pH micelar crítico de sales biliares El cmpH es un intervalo de pH estrecho por debajo del cual el detergente está en una forma cristalina de baja solubilidad y por encima del cual se disuelve para formar una disolución micelar. La solubilidad de los ácidos biliares protonados en general se incrementa con el número de grupos hidroxilo que posee la molécula, es decir, se incrementa en proporción inversa al tamaño del área hidrofóbica de la molécula (normalmente la cara β). Como cualquier molécula aniónica cuya forma protonada tiene baja solubilidad, el logaritmo de la solubilidad aumenta al aumentar el pH, por ello cuando la concentración de especies ionizadas alcanza la cmc, las micelas que se forman solubilizan las especies protonadas. Estas especies suelen tener un pKa comprendido entre 6-7 cuando están solubilizadas dentro de la micela. Si se adicionan iones OH-, las especies protonadas solubilizadas dentro de las micelas se transforman en aniones, incrementando con Capítulo III 63 ello el número de micelas con un mínimo cambio en el pH del medio. Cuanto más insoluble es la forma protonada para una cmc dada, mayor es el cmpH. A modo de ejemplo, el valor de cmpH del quenodesoxicolato sódico está en torno a un pH 6-7, para el desoxicolato sódico sobre un pH 7-8, y para el ursodesoxicolato sódico próximo a 8. Si una disolución de estas sales biliares se prepara con una concentración y pH similar a la que hay en el intestino delgado, es decir 10 mM y pH 6,3, los ácidos biliares estarán protonados y precipitarán de la disolución. El pKa de todos los ácidos biliares no conjugados es, aproximadamente, 5, ya que la cadena lateral de las sales biliares es análoga a un ácido pentanoico y el núcleo sustituyente no tiene influencia en la ionización. La amidación con glicina reduce el pKa aproximadamente hasta un valor de 3,9, y con taurina a menos de la unidad. Por consiguiente, el valor de cmpH de los conjugados con glicina del quenodesoxicolato y del desoxicolato sódico debería ser aproximadamente sobre 1,1 unidades de pH inferior a la del derivado no conjugado, esto es, sobre 5,6 y 5,9, respectivamente. Para las sales trihidroxiladas, el cmpH es inferior, en torno a 6. Por tanto, la amidación con glicina o taurina proporciona sales solubles a pH inferiores a las sales sin conjugar (pH=5,5-7).13 III.2.- FUNCIONES FISIOLÓGICAS Solubilización y transporte de lípidos polares en micelas mixtas La bilis es un fluido complejo generado por la secreción hepática (hepatocitos) y modificado (secreción, absorción) por la vía biliar (colangiocitos) en su tráfico desde el hepatocito hacia la vesícula biliar y el intestino. Sus principales solutos son las sales biliares (68%), lecitina (22%), colesterol libre (4%), proteínas (4,5%) y bilirrubina (0,3%). El colesterol es una molécula prácticamente insoluble en agua, y por ello la presencia de sales biliares y lecitina en la bilis es fundamental para mantener en disolución al colesterol biliar. En condiciones fisiológicas se logra formando asociaciones moleculares donde se unen estos tres lípidos en relaciones de concentración definidas (relaciones molares) que le dan estabilidad en una disolución acuosa. Estas asociaciones moleculares se denominan micelas mixtas (sales biliares, lecitina, colesterol) y vesículas o liposomas (lecitina y colesterol).14,15 Véase la figura III.2. La capacidad de las sales biliares de solubilizar lípidos mediante la formación de micelas mixtas con el colesterol y monoglicéridos es una de las propiedades fisicoquímicas y biológicas más importantes de los ácidos biliares y Capítulo III 64 sus funciones fisiológicas se ven mejoradas en casi todos sus aspectos. También son responsables de la solubilización y absorción de vitaminas, como por ejemplo la vitamina E. Las vesículas unilamelares formadas por el colesterol y la lecitina son metaestables y se considera que el fluido biliar es más estable desde un punto de vista termodinámico cuando el colesterol presente es solubilizado en micelas mixtas. Las sales biliares y los fosfolípidos, por sus propiedades anfipáticas, orientan sus regiones polares hacia la fase acuosa manteniendo sus regiones apolares alejadas del agua y crean un centro micelar hidrófobo donde se disuelve el colesterol. El tamaño de las micelas mixtas es mayor que el de las micelas de sales naturales puras. Es este aumento en el área superficial de la grasa lo que hace que sea posible su digestión por las lipasas, que de otra manera no podrían acceder al interior de los agregados lipídicos. 0 50 100 0 50 100 050100 B C DA Colesterol Lecitina Sales Biliares 1 fase micelas 2 fases cristalina micelas 3 fases vesiculas cristalina micelas 2 fases vesiculas micelas 0 50 100 0 50 100 050100 B C DA Colesterol Lecitina Sales Biliares 1 fase micelas 2 fases cristalina micelas 3 fases vesiculas cristalina micelas 2 fases vesiculas micelas Figura III.2.- Triángulo de fases en porcentaje molar de los constituyentes de la bilis. (A) Zona de dos fases: vesículas y micelas mixtas. (B) Zona de tres fases: vesículas, micelas mixtas y colesterol cristalino. (C) Zona de dos fases: colesterol cristalino y micelas mixtas. (D) Zona de única presencia de micelas mixtas.16 La solubilidad del colesterol en agua (aproximadamente 1 nM) puede verse incrementada en más de un millón de veces en presencia de micelas de sales Capítulo III 65 biliares, y son las dihidroxisales las que poseen una mayor capacidad de solubilización frente a las trihidroxisales.17,18 Activación de enzimas En el intestino se encuentra una enzima pancreática del tipo lipasa (BAL) que depende de la presencia de las sales biliares para realizar su función, la lipólisis o digestión de los triglicéridos.19 La activación de esta enzima sólo tiene lugar en presencia de sales biliares trihidroxiladas, en este caso en la presencia del 7αOH. Esto indica también la gran especificidad de la interacción.20 Ha sido resuelta la estructura cristalina de este tipo de lipasa en ausencia y en presencia de sales biliares, en concreto del taurocolato sódico. En ausencia de sal biliar el cristal muestra un “loop” con conformación dinámica entre abierto y cerrado, mientras que la presencia de la sal biliar estabiliza su conformación abierta que es necesaria para su unión al sustrato.21 Homeostasis del colesterol La principal vía de eliminación del colesterol en los humanos es la conversión diaria de 500 mg del mismo en ácidos biliares. Probablemente, esta ruta de eliminación sea igual de importante en todos los animales. Durante la circulación enterohepática las sales biliares realizan un viaje cíclico desde el hígado (donde son sintetizados por las células hepáticas) hasta el tracto gastrointestinal. Durante esta circulación sólo un 5% de las sales biliares se pierde en el intestino. Si en algún momento, el nivel de las sales biliares presentes aumenta (por ejemplo, por la ingesta de comida) se produce una supresión de la síntesis de las sales biliares y esto afecta a la ruta de eliminación del colesterol.22,23 Recientemente se ha descubierto que los ácidos biliares pueden actuar como hormonas, y por tanto enlazar receptores nucleares y consecuentemente modular la expresión de proteínas que repercuten en la homeostasis del colesterol.12 III.3.- ÁCIDOS BILIARES MODIFICADOS. NUEVOS DERIVADOS La primera modificación de la estructura de los ácidos biliares para mejorar sus funciones fue llevada a cabo por la naturaleza mediante su complejación con glicina y taurina. Esta conjugación aumenta la solubilidad en disolución acuosa de las sales biliares bajo condiciones fisiológicas, lo que produce varios efectos: evita la precipitación bajo las condiciones ácidas que se dan en las proximidades del Capítulo III 66 duodeno y a altas concentraciones del catión calcio en la vesícula biliar, además permite que los ácidos biliares puedan estar en concentraciones bastante elevadas en el tracto intestinal sin atravesar las membranas celulares. Una segunda modificación que se produce en el organismo es la 7α-deshidroxilación para obtener el desoxicólico y el litocólico, ácidos biliares secundarios, que tienen mejor capacidad de formación de micelas mixtas en presencia de lípidos y colesterol. Otras reacciones de los ácidos biliares que tienen lugar en el organismo son la hidroxilación en 3β (en lugar de la posición 3α) que da lugar a colestasis; la hidroxilación en C25 (en el lugar de C27) provoca una interrupción en la inhibición por retroalimentación del colesterol, lo que aumenta la biosíntesis del colesterol y con ello la acumulación de más alcoholes. Antes del auge en la modificación de las sales biliares, que tiene lugar a principios de los noventa, ya estaba ampliamente implantado el uso de ácidos biliares naturales en el tratamiento de enfermedades intestinales. A modo de ejemplo, el ácido ursodesoxicólico (ácido 3α,7β-dihidroxi-5β-colánico) inició su andadura como agente clínico a principios de los ochenta, aunque en 1961 ya se conocía su eficacia en el tratamiento de la hepatitis crónica y, desde 1975, su eficacia en la disolución de las piedras biliares.24-26 El ácido ursodesoxicólico sustituyó al ácido quenodesoxicólico en la disolución de cálculos de colesterol a pesar de su menor eficacia en la disolución de colesterol.27 La razón radica en que no es citotóxico ya que tiene menor tendencia a solubilizar membranas. De este modo, se consiguieron evitar los efectos secundarios del ácido quenodesoxicólico: aumento de las transaminasas y fiebre alta. El ácido ursodesoxicólico tiene como límites de aplicación farmacéutica su bajo grado de absorción por el organismo (un 50% de la dosis suministrada) y su metabolismo intestinal que da lugar a la 7-deshidroxilación, de todas formas es el único ácido biliar ampliamente usado en clínica en la actualidad.16 En los últimos años, las peculiaridades estructurales y fisicoquímicas de los ácidos biliares han favorecido el resurgimiento de otras aplicaciones además de las ya mencionadas, como son: nuevas aplicaciones farmacéuticas, la química supramolecular, la química combinatoria, la química de geles… III.4.- NUEVAS APLICACIONES EN LA INVESTIGACIÓN FARMACÉUTICA En la bibliografía aparecen descritas un gran número de aplicaciones farmacológicas de los ácidos biliares y sus derivados modificados como puede ser Capítulo III 67 su uso en el tratamiento de la deficiencia de ácidos biliares, en enfermedades hepáticas y la disolución de cálculos biliares de colesterol. En las últimas décadas se le ha dado una gran importancia a la síntesis y el estudio de sales biliares de carácter catiónico. En muchos de estos estudios, una diamina se une al grupo carboxílico del ácido biliar mediante un enlace amida, mientras el grupo amino remanente forma una sal de amonio cuaternaria28 (figura III.3). El estudio de las propiedades fisicoquímicas en disolución acuosa muestra que el cambio del grupo carboxílico en la posición 24 no compromete la capacidad de formación de micelas, siendo la única diferencia que, en este caso, pasan a ser catiónicas a pH fisiológico.29 Estos derivados aminados y/o las amidas presentan una elevada actividad antibacteriana in vitro a dosis relativamente bajas (~10 µg/mL) que, en general, son menores que las de compuestos convencionales de función similar.30 Un apartado interesante desde el punto de vista farmacéutico es la obtención de un fármaco de actividad selectiva que se suele conseguir confiriendo a la molécula una característica que le permita un transporte efectivo al órgano diana (figura III.4). Para obtener fármacos dotados con selectividad hepática se usan nanocápsulas o liposomas, pero ha surgido una vía alternativa mediante ácidos biliares oportunamente modificados que actuarán de transportadores a través de la vía hepática-gastrointestinal. OH X O OH R OH X O R1 HO OH X R 1 HO X: -H, -OH R: -NH2 R1: -NH 2 -CH 2 N(CH 3 ) 2 N NCH 3 H N (a) (b) (c) Figura III.3.- Estructuras de (a) ácido 3-β-aminocólico y 3-β-aminodesoxicólico; (b) 24-colanamidas; (c) colan-24-amina y desoxicolan-24-amina. Capítulo III 68 HO OH OH O OH HO OH OH O OH Figura III.4.- Posiciones susceptibles de conjugación con un fármaco. A continuación se muestran ejemplos de conjugación de ácidos biliares con diferentes indicaciones médicas. Con la conjugación se consigue activar la acción de un fármaco inactivo a nivel hepático e intestinal. En la figura III.5 se muestra el clorambucil, un agente químico con capacidad citostática usado en el tratamiento de varios tipos de cáncer (leucemia linfoblástica crónica y linfoma de Hodgkin). Los metabolitos del clorambucil son eliminados básicamente por vía renal. Para favorecer su eliminación por vía hepática se ha diseñado su conjugado con ácido cólico manteniendo intacto el grupo carboxílico para su posterior conjugación con glicina y taurina. Este conjugado se absorbe a nivel intestinal y es transportado al hígado donde realiza su acción al permanecer inalterada su capacidad de alquilar las proteínas en los hepatocitos. Así se consigue un fármaco de acción selectiva a nivel hepático.31 O HO Cl Cl OOH OH O OH O HN Cl Cl (a) (b) Figura III.5.- (a) Estructura del clorambucil; (b) clorambucil-ácido cólico. Ambos compuestos tienen potencial en la quimioterapia contra el carcinoma hepatocelular. Capítulo III 69 Los oxaprolilpéptidos (figura III.6) son inhibidores eficaces de la prolil-4-hidrolasa, enzima clave en la biosíntesis de colágeno. Dotar a este fármaco de selectividad a nivel hepático ofrece la posibilidad de que sea utilizado como fármaco contra la fibrosis hepática. Este fármaco tiene demostrada una mayor absorción en el íleon que su fármaco no conjugado por vía parental. Además su enlace peptídico protege al compuesto conjugado del catabolismo de la propia enzima a desactivar.16 OOH OH O OH N H O ON HN O HN O 2 N N ONO H N O OOH OH O OH N H O ON HN O HN O 2 N N ONO H N O Figura III.6.- Conjugado de oxaprolilpéptido-ácido cólico, se ha resaltado el fármaco de partida. La conjugación del fullereno-C60 con el ácido ursodesoxicólico ofrece la posibilidad de estudiar este derivado en patologías gastrointestinales (datos sin publicar). Este conjugado puede resaltar las características fisicoquímicas comunes a las dos moléculas que lo componen, como son la actividad membranotrópica y la posibilidad de actuar como transportador. Este derivado de ácido biliar puede ejercer el papel de agente bloqueante del transporte específico para ácidos biliares debido a la presencia de un grupo estéricamente enorme16 tal y como puede verse en la figura III.7. Otros ejemplos de pro-fármacos son los mostrados en las figuras III.8.b, III.9 y III.10. La primera de ellas muestra el conjugado de un inhibidor de la reductasa 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (enzima reguladora de la biosíntesis del colesterol), cuya eficacia como fármaco es tres órdenes de magnitud menor que el fármaco original.32 En las siguientes, se combinan en la misma molécula las propiedades peculiares de las moléculas iniciales y se unen en una única molécula actividad y selectividad.6,33,34 Capítulo III 76 Los empaquetamientos cristalinos de ambos derivados se muestran en las figuras III.14 y III.15. a c b Figura III.14.- Empaquetamiento cristalino del monómero colato-3-amino succínico, vista a lo largo de los ejes a, b y c. La tabla III.3 muestra los valores de los ángulos de torsión más relevantes y la conformación de la cadena lateral para ambos derivados. Los ángulos de torsión vienen condicionados por las interacciones que existen entre las moléculas en el cristal. Por ello los valores que alcanzan se ven condicionados, entre otros factores, por la red de enlaces de hidrógeno. La conformación del anillo D se analiza siguiendo el criterio de Altona et al41 por medio de los llamados ángulos de torsión máximo posible (φm) y ángulo de fase (∆). Los valores obtenidos de φm y de ∆ para los monómeros estudiados son indicativos de una conformación intermedia entre media-silla y β-sobre, la misma que en los cristales de ácido cólico con los Capítulo III 77 huéspedes metanol, etanol y 1-propanol de estequiometrías 1:1,42 y de otros cristales de sales biliares.43,44 Por otra parte, los valores de los ángulos de torsión alrededor de los enlaces C20-C22 y C22-C23 indican que la cadena lateral en el monómero colato-3-amino succínico se encuentra en una conformación estirada, que supone una distancia d(C3-C24) de 1,301 nm. En el colato-3-amino bencílico dicha distancia es 1,212 nm. Este menor valor es debido a que el ángulo de torsión φ3 proporciona una conformación gauche en torno al enlace C22-C23. ab c Figura III.15.- Empaquetamiento cristalino del monómero colato-3-amino bencílico, vista a lo largo de los ejes a, b y c. Como ya hemos visto, la orientación de la cadena alquílica lateral en la posición 17 del esteroide respecto al núcleo esteroide puede evaluarse midiendo la distancia del grupo carboxílico, concretamente desde el átomo de carbono C24, al Capítulo III 78 plano horizontal y vertical definidos ambos en el capítulo II y que aparecen representados en las figuras III.16 y III.17. Por otra parte, en dichas figuras también se ilustran los valores de los ángulos que forman entre sí los dos planos en cada una de las moléculas. El valor del ángulo para el monómero colato-3-amino succínico es 88,40º, y para el monómero colato-3-amino bencílico es de 88,21º, por lo que son prácticamente perpendiculares entre sí. Tabla III.3.- Ángulos de torsión de la cadena lateral y el anillo D para los dos monómeros. †φ0=φm·cos(∆/2); ††tg (∆/2) = [(φ2+φ4)-(φ1+φ3)]/3,0777·φ0. colato-3-amino succínico colato-3-amino bencílico ángulos de torsión (º) Ψ1≡C13-C17-C20-C22=170,53 Ψ1≡C13-C17-C20-C22=-179,23 Ψ2≡C17-C20-C22-C23=-171,06 Ψ2≡C17-C20-C22-C23=-165,14 Ψ3≡C20-C22-C23-C24=166,07 Ψ3≡C20-C22-C23-C24=66,31 Ψ4≡C22-C23-C24-O24a=142,78 Ψ4≡C22-C23-C24-O24a=-117,12 conformación de la cadena lateral tttt ttgt ángulos de torsión (º) φ0≡C17-C13-C14-C15=46,13º φ0≡C17-C13-C14-C15=45,07º φ1≡C16-C17-C13-C14=-41,76º φ1≡C16-C17-C13-C14=-37,68º φ2≡C15-C16-C17-C13=-2,78º φ2≡C15-C16-C17-C13=17,23º φ3≡C14-C15-C16-C17=5,35º φ3≡C14-C15-C16-C17=10,38º φ4≡C13-C14-C15-C16=-32,25 φ4≡C13-C14-C15-C16=-34,26º φm† (ángulo máximo de torsión) 46,13º 45,19º ∆†† (fase del ángulo de pseudorotación) 1,11º 8,47º En el cristal del colato-3-amino succínico, la distancia del C24 al plano horizontal es de 0,414 Å, y la distancia al plano vertical de -0,315 Å. Por otro lado, Capítulo III 79 la distancia del C28 a dichos planos es de 1,250 Å y 1,042 Å, respectivamente. Cabe resaltar la coincidencia del plano en el que se encuentra el grupo amida (CONH) con el plano vertical. Lo mismo sucede con el grupo hidroxilo de la posición 3 del ácido cólico no modificado.45 En el cristal del colato-3-amino bencílico, la distancia del C24 al plano horizontal es de 1,779 Å, y la distancia al plano vertical es de -0,436 Å. Además, la distancia del C30 al plano horizontal y vertical es de 1,842 Å y de 0,638 Å, respectivamente. Por otra parte, el ángulo del anillo bencénico con el plano horizontal es de 29,24º mientras que con el plano vertical es de 63,05º, por lo que el anillo bencénico no se dispone ni paralela ni perpendicularmente a ninguno de los planos ya definidos. Plano hPlano h (a) Plano vPlano v (b) 88,40º v h (c) Figura III.16.- Análisis de la geometría de la molécula colato-3-amino succínico respecto a los planos (a) horizontal, h (definido por 14 átomos de carbono C1/C6C17/C20) y (b) vertical, v (definido por los dos grupos metilo C19 y C18 y los átomos C10 y C13). (c) Ángulo entre ambos planos. En el caso del ácido cólico cristalizado de una mezcla etanol y agua,46 la distancia del C24 al plano vertical es de 0,245 Å y al plano horizontal de 0,856 Å. En la figura III.18 se representan las coordenadas del ácido cólico y de los dos Capítulo III 80 monómeros derivados del colato. Se puede apreciar un claro cambio de la posición del ácido carboxílico desde el ácido cólico a sus mono-derivados y también respecto a los epímeros del ácido quenodesoxicólico (capítulo II). v Plano h (a) (b) 88,21º h Plano v (c) Figura III.17.- Análisis de la geometría de la molécula colato-3-amino bencílico respecto a los planos (a) horizontal, h (definido por 14 átomos de carbono C1/C6C17/C20) y (b) vertical, v (definido por los dos grupos metilo C19 y C18 y los átomos C10 y C13). (c) Ángulo entre ambos planos. Figura III.18.- Representación esquemática de la posición del grupo carboxílico de la cadena lateral de los colato-derivados y del ácido cólico en función de su distancia a los planos. -1,5 -0,75 0 0,75 1,5 2,25 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 v h colato-3-amino succínico colato-3-amino bencílico Ácido cólico -1,5 -0,75 0 0,75 1,5 2,25 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 v h colato-3-amino succínico colato-3-amino bencílico Ácido cólico Capítulo III 81 Una de las características más importantes en la química supramolecular es el reconocimiento molecular, mediante el cual las moléculas se asocian selectivamente dando lugar a estructuras perfectamente definidas. El reconocimiento molecular se basa en las fuerzas intermoleculares compuestas mayoritariamente por interacciones no covalentes, de las que destaca el enlace de hidrógeno. El enlace de hidrógeno ocurre en una amplia diversidad de bio-moléculas, en las que juega un papel importante en la regulación de estructuras supramoleculares y empaquetamiento molecular necesario para realizar sus funciones biológicas. Por ello, se ha realizado un estudio de los enlaces de hidrógeno presentes en ambos cristales. Sus características principales se recogen en la tabla III.4. Estos resultados indican que los grupos funcionales en las posiciones 7, 12, 24 del esteroide en los dos monómeros actúan simultáneamente como donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno. El grupo carboxilo de la amida lo hace lógicamente como aceptor y el grupo carboxílico terminal lo hace como donante y aceptor. El átomo de nitrógeno de la amida no participa en la red de enlaces de hidrógeno en ninguno de los monómeros, así como los carbonilos terminales del sustituyente 28b y 30b. Tabla III.4.- Enlaces de hidrógeno, ángulos y longitudes en los dos monómeros. colato-3-amino succínico colato-3-amino bencílico D-H…A d(D…A)/Å <DHA (º) D-H…A d(D…A)/Å <DHA (º) O(agua)-HA…O12i O(agua)-HB…O7ii O(12) H O(7) H O25 O(12) H O(7) H O25 i O(24a)-H…O(agua)iii O(28a)-H…O(24b)iv 2,721 2,710 2,798 2,891 2,616 2,703 71,99 32,14 153,68 161,88 179,04 163,96 O(24a)-H…O(7)v O(metanol)-H…O(24b)vi O(12)-H…O(metanol)vii O(metanol)-H…O(12)viii O(7)-H…O(25)ix O(30)-H…O(metanol)x 2,631 2,743 2,718 2,689 2,673 2,551 166,62 173,20 165,91 162,26 176,26 171,36 Transformaciones de simetría utilizadas para generar átomos equivalentes para el monómero colato3-amino succínico y el monómero colato-3-amino bencílico: ix+1/2,+y-1/2,-z+1; iix,y,z; iiix+1/2,+y+1/2,-z+1; ivx-1/2,+y+1/2,+z-1; vx-1,+y,+z; vix+1/2,-y+1/2,-z+1; viix,+y+1,+z; viiix,+y-1,+z; ix-x+1,+y-1/2,-z+1/2; x-x+1/2+1,-y+1,+z-1/2. La estructura del cristal del derivado alifático presenta una estructura base de bicapas con las caras α de las moléculas de esteroide enfrentadas y estabilizadas por enlaces de hidrógeno. En la parte hidrófila se genera una red cíclica en la que participan (i) los dos grupos hidroxilo de las posiciones 7 y 12, (ii) el carboxilo de la amida (posición 25), (iii) el grupo carboxílico de la cadena de succinilo (posición Capítulo III 82 28) y (iv) el ácido carboxílico de la cadena lateral (posición 24) de tres moléculas de esteroide diferentes dispuestas de forma antiparalela, sin huecos entre las partes lipófilas. El disolvente (agua) se incluye de manera desordenada en la parte hidrófila entre las cadenas laterales (figura III.19). El átomo de oxígeno de la amida de una molécula actúa como aceptor de los grupos hidroxilo 7 y 12 de otra, la cual se dispone de forma antiparalela. Este esquema se repite por toda la estructura del cristal a lo largo del plano ac (figura III.14.b). O28a O(agua) O24b O28a O7 O(agua) O28a O24a O25 O12 O7 O28a O(agua) O24a 2,703 2,616 2,891 2,798 Figura III.19.- Red de enlaces de hidrógeno que engloba dos moléculas de colato-3-amino succínico (distancias en Å). En definitiva, el grupo carboxílico de la posición 24 del esteroide y el de la posición 25 participan en un ciclo de enlaces de hidrógeno a través de una molécula de agua que implica a tres núcleos esteroide tal y como se esquematiza en la figura III.20. Para el cristal del derivado aromático, la red de enlaces de hidrógeno tiene una estructura en zig-zag. Existe entonces un proceso de autorreconocimiento que conduce al autoensamblaje en bicapas. Las moléculas contiguas no se disponen de forma que se favorezcan interacciones π-π entre los grupos aromáticos (figura III.21). Capítulo III 83 O 28a H O 25 HH O 12 O 7 H O HH O 7 n O 24a O 24b O 28a H O 25 HH O 12 O 7 H O HH O 7 n O 24a O 24b O 24a O 24b Figura III.20.- Esquema de los enlaces de hidrógeno observados en el cristal del monómero colato3-amino succínico. Cada color representa una molécula que forma parte de la estructura del cristal. O7 Ometanol Ometanol O7 Ometanol Ometanol O25 O30a O25 O7 O12 O24a O24b O24b O12 2,551 2,673 2,631 2,743 2,718 2,689 2,631 O7 Ometanol Ometanol O7 Ometanol Ometanol O25 O30a O25 O7 O12 O24a O24b O7 Ometanol Ometanol O7 Ometanol Ometanol O25 O30a O25 O7 O12 O24a O24b O24b O12 2,551 2,673 2,631 2,743 2,718 2,689 2,631 Figura III.21.- Red de enlaces de hidrógeno que engloba tres moléculas de colato-3-amino bencílico (distancias en Å). Dentro de la estructura cristalina de este derivado podemos observar una disposición en capas en zig-zag. En cada capa la cara hidrófoba del derivado biliar aparece enfrentada al grupo aromático de otra molécula, mientras que la cara α se encuentra enfrentada al grupo polar de la cadena lateral en la posición 17 del esteroide. En esta disposición se establece una red de enlaces de hidrógeno que Capítulo III 84 engloba: (i) los dos grupos hidroxilo de las posiciones 7 y 12; (ii) el grupo carboxílico de la cadena lateral (el O24a como dador y el O24b como aceptor); (iii) el grupo carboxílico del anillo aromático (posición 30) y el (iv) el carboxilo de la amida (posición 25). De modo que, el átomo O7 es aceptor desde un O24a y dador hacia un O25. Si bien por medio del enlace de hidrógeno O24a−H···O7 se pasa a una conformación idéntica (es decir, los esteroides que actúan en este enlace de hidrógeno se disponen paralelamente), no obstante, con el enlace de hidrógeno O7−H···O25 se pasa a una conformación invertida y de sentido inverso de las unidades esteroide, lo que se denomina como disposición antiparalela. Por otro lado, a través de los grupos carboxílicos terminales O30 y O24b que participan en la formación de enlaces de hidrógeno a través de moléculas de metanol, se pasa a una disposición contigua en zig-zag. Finalmente, si la unión se realiza mediante O12−metanol−O24b el ángulo que forman los planos de los anillos aromáticos es de 85,97º. Si la unión se realiza mediante O30-metanol-O12 el ángulo es inferior y vale 83,28º. La figura III.22 muestra el esquema de los enlaces de hidrógeno observados en la estructura del cristal del derivado aromático. O 1CH3OH O12 H O 2CH3OH O24b H H O30 H O24a O7HHO25 disposición antiparalela disposición paralela 83,28º 85,97º O 1CH3OH O12 H O 2CH3OH O24b H H O30 H O24a O7HHO25 disposición antiparalela disposición paralela O 1CH3OH O12 H O 2CH3OH O24b H H O30 H O24a O7HHO25 disposición antiparalela disposición paralela 83,28º 85,97º (a) ab c d d c ab c d d c (b) Figura III.22.- (a) Esquema de los enlaces de hidrógeno observados en el cristal del monómero colato-3-amino bencílico. (b) Croquis de la disposición de las moléculas de colato-3-amino bencílico en el cristal. El ángulo que forma la unidad a con la unidad b es igual al que forman la unidad c con la d y vale 35,64º. El ángulo entre la a y la c vale 85,97º y el que forma la unidad a con la d (o la b con la c) vale 83,28º. Capítulo III 85 III.7.- DETERMINACIÓN DE LA cmc Al observar su estructura molecular, es de esperar que el valor de la cmc de estos nuevos derivados fuera aproximadamente similar a los de la sal biliar de partida, como finalmente demostraron los diferentes ensayos realizados. En este caso, para la medida de la cmc, se ha recurrido a medidas de fluorescencia (método invasivo) y osmometría de punto de congelación (método no invasivo) para la determinación de la cmc de ambos monómeros. Es bien conocido que la relación de las intensidades de las bandas de vibración 1 y 3 del pireno, I1/I3 (a 371 y 381 nm respectivamente siendo la λex=336 nm), solubilizado en una disolución micelar es un reflejo claro de la polaridad del micro-entorno que rodea al pireno. Por ejemplo, I1/I3 toma un valor de 0,54 para el ciclohexano y de 1,70 para el agua. Para el desoxicolato sódico y colato sódico, se han publicado valores de I1/I3 iguales a 0,6847 y 0,79,48 respectivamente. El obtenido para el derivado colato-3-amino succinato de sodio es 1,08 (figura III.23). Esta diferencia en los valores podría ser debida a que el nuevo sustituyente succinilo en la posición 3 de la sal biliar origina una modificación en la estructura interna hidrófoba de los agregados que engloban el pireno. El aumento del valor de la relación I1/I3 con respecto al valor del colato indica una ligera disminución del carácter hidrófobo del núcleo interno del agregado dando a entender una estructura más abierta del mismo o un menor número de agregación. Es importante hacer notar que la curva experimental I1/I3 vs LnC es una curva sigmoidal. El valor de cmc obtenido a partir del punto de inflexión del ajuste de la curva I1/I3 vs LnC para el monómero colato-3-amino succinato de sodio es de 69,90 mM, valor cinco veces superior al encontrado en la bibliografía47 para el colato sódico (13,5 mM) utilizando la misma técnica experimental. Este comportamiento está en concordancia con la disminución del carácter hidrófobo del interior del agregado. En la figura III.24 se puede ver una representación de ∆Tk-1 frente a la concentración en mol·Kg-1 para el derivado aromático del colato (colato-3-amino benzoato de sodio). El valor de cmc viene dado por un cambio en la pendiente de los puntos experimentales. El punto de corte de las dos rectas extrapoladas a partir de los datos experimentales, en este caso, tiene un valor de 11,30 mM comparable al valor de 19,7 mM obtenido para el colato sódico con medidas en disolución acuosa llevadas a cabo con la misma técnica experimental.49 Capítulo III 92 H; Boger G; Urmann M; Hoffmann A J. Med. Chem. 1994, 37, 3240-6. 35. Kramer, W.; Wess, G.; Bewersdorf, U.; Corsiero, D.; Girbig, F.; Weyland, C.; Stengelin, S.; Enhsen, A.; Bock, K.; Kleine, H.; Le Dreau, M.-A.; Schafer, H.- L. Eur. J. Biochem. 1997, 249, 456-64. 36. Campanelli, A. R.; Candeloro de Sanctis, S.; Chiessi, E.; D'Alagni, M.; Scaramuzza, L. J. Phys. Chem. 1989, 93, 1536. 37. Spek, A. L. A Program for Data Reduction of CAD4 Data. 1997, University of Utrech. 38. SADABS Area-Detector Absorption Correction. Siemens Industrial Automation, Inc.: Madison, WI. 1996. 39. Altomare A.; Burla M.C.; Camalli M.; Cascarano G.L.; Giacovazzo C.; Guagliardi A.; Moliterni A.G.G.; Polidori G.; Spagna R. J. Appl. Cryst. 1999, 32, 115-9. 40. Sheldrick, G. M. SHELXL97. Programs for Crystal Structure Analysis (Release 97-2) 1997, University of Göttingen, Germany. 41. Altona, C.; Geise, H. J.; Romers, C. Tetrahedron 1968, 24, 13-32. 42. Johnson, P. L.; Schaefer, J. P. Acta Crystal. 1972, 28, 3083-8. 43. Jones, E. L.; Nassimbeni, L. R. Acta Crystal. 1990, B46, 399-405. 44. Jover, A.; Meijide, F.; Soto, V. H.; Vázquez Tato, J.; Rodríguez Núñez, E.; Ton-Nu, H.-T.; Hofmann, A. F. Steroids 2004, 69, 379. 45. Volkov, A.; Zhu, H.; Liu, S.; White, M. A.; Coppens, P. Acta Crystal. 1998, C54, i, IUC9800026. 46. Volkov, A.; Zhu, H.; Liu, S.; White, M. A.; Coppens, P. Acta Crystal. 1998, C54, i, IUC9800026. 47. Gouin, S.; Zhu, X. X. Langmuir 1998, 14, 4025-9. 48. Jover, A.; Meijide, F.; Rodríguez Núñez, E.; Vázquez Tato, J.; Mosquera, M.; Rodríguez Prieto, F. Langmuir 1996, 12, 1789-93. 49. Coello, A.; Meijide, F.; Rodríguez Núñez, E.; Vázquez Tato, J. J. Phys. Chem. 1993, 97, 10186-91. 50. Corti, M.; Degiorgio, V. J. Phys. Chem. 1981, 85, 711-7. CAPÍTULO IV.- SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE NUEVAS SONDAS FLUORESCENTES DERIVADAS DE ÁCIDOS BILIARES Capítulo IV 95 La fluorescencia es una técnica ampliamente utilizada en análisis bioquímicos y clínicos debido a que muchas sustancias de interés bioquímico pueden analizarse directamente sin necesidad de someter a la muestra a tediosos procedimientos de aislamiento. De hecho, esta técnica se ha utilizado en análisis cualitativo y cuantitativo de enzimas y coenzimas, esteroides, vitaminas (ácido ascórbico, nicotinamida, piridoxal, riboflavina, tiamina, vitaminas A y B12…). Entre los medicamentos se encuentran tranquilizantes tales como reserpina; alucinógenos, como LSD; antibióticos, como penicilinas; barbitúricos; analgésicos; sedantes; relajantes musculares, etc. Asimismo, una de las aplicaciones más importantes es su utilización en análisis de edulcorantes, agentes contaminantes del aire y agua, pesticidas y sus residuos, productos vegetales, como clorofila, flavocinidas y alcaloides del centeno. Existen indicadores de fluorescencia que son usados en análisis de la misma manera que se utilizan los indicadores coloreados para encontrar el punto final de una valoración. En este caso la propiedad observada es la variación de la intensidad de fluorescencia como consecuencia del cambio que se produce en el medio. Entre las aplicaciones a sistemas biológicos, cabe citar la utilización de estas técnicas en el estudio de la unión de sustancias (por ejemplo, medicamentos) a macromoléculas (proteínas, enzimas, etc.), y la determinación de lugares activos, así como en enzimología, inmunología, alteraciones de membranas, etc.1 Las sondas fluorescentes son una importante herramienta en el estudio de diversos aspectos relacionados con la estructura y dinámica de micelas. En la figura IV.1 se pueden ver diferentes estructuras moleculares de sondas fluorescentes típicas, como la Dansilamida, el Rojo Nilo, el Colorante de Reichardt y el pireno.2 Este último y sus derivados son probablemente las sondas fluorescentes usadas con mayor frecuencia,3 incluyendo las sales biliares entre los sistemas en los que han sido utilizados.4,5 El espectro electrónico del pireno ha sido ampliamente estudiado y sus propiedades fotofísicas lo convierten en una herramienta útil como sonda fluorescente (véanse la tabla IV.1 y la figura IV.2). Entre ellas, cabe destacar un alto rendimiento cuántico de fluorescencia (φ1=0,6) y un estado S1 con un tiempo de vida relativamente largo (τ=450ns en ciclohexano desoxigenado), características fácilmente determinables mediante simples técnicas de fluorescencia. Además, las intensidades relativas de las bandas de la estructura vibracional del espectro de fluorescencia del pireno, bandas de Ham, son sensibles a la polaridad del medio en Capítulo IV 96 el que se encuentra.# Esta polaridad transforma al pireno en un compuesto espectroscópicamente diferente. Los derivados del pireno también son ampliamente utilizados en la investigación de agregados multimoleculares, como micelas o membranas, en el estudio de las posiciones activas de enzimas…6 S NH 2 OO N N ON O N O (a) (b) (c) (d) S NH 2 OO N N ON O N O (a) (b) (c) (d) Figura IV.1.- Estructuras moleculares de sondas fluorescentes típicas: (a) Dansilamida; (b) Rojo Nilo; (c) Colorante de Reichardt; (d) Pireno. Las membranas biológicas sufren transformaciones de fase como un requerimiento de sus funciones fisiológicas. Se han aplicado diversas técnicas con objeto de estudiar estas transiciones de fase que incluyen: Rayos-X, Microscopía Electrónica, Análisis Térmico, Sondas moleculares de Spin y Sondas fluorescentes. Siendo estas últimas un campo prometedor para la detección de estos cambios #Los espectros UV-Visible e IR cercano de algunos compuestos están influenciados por el medio que los rodea. Éste provoca un cambio en la intensidad y la posición de las bandas, efecto solvatocrómico, que en el caso de la espectroscopia de fluorescencia se llama solvatofluorocrómico o fluorosolvatocrómico.21 Capítulo IV 97 teniendo en cuenta lo bien establecido que se encuentra el cambio energético de las sondas en función del medio que las rodea. Tabla IV.1.- Relación de intensidad de las bandas de vibración 1 y 3 para el pireno (I1/I3).2 Valores del índice de polaridad de Snyder según el tipo de disolvente. aDatos bibliográficos. Todas las disoluciones tienen una concentración de pireno aproximadamente 10 µM, excepto la disolución en agua, que es 0,1 µM. Cada muestra fue excitada a 337 nm con una anchura de rejilla de excitación y emisión de 2 y 1 nm respectivamente. bDatos experimentales. Todas las disoluciones tienen una concentración de pireno aproximadamente 6 µM, excepto la disolución en agua, que es 0,1 µM. Cada muestra fue excitada a 336 nm con una anchura de rejilla de excitación y emisión de 5 y 1,5 nm, respectivamente. disolvente ε Índice de polaridad7I1/I3aI1/I3b ciclohexano 2,0 0,0 0,64±0,01 0,62±0,02 diclorometano 1,45±0,01 etanol 5,2 1,37±0,01 1,27±0,02 metanol 32,6 6,6 1,50±0,01 1,43±0,02 acetonitrilo 6,2 1,88±0,01 dimetilsulfóxido 1,90±0,01 etilenglicol 1,55±0,02 agua 80,2 9,0 1,96±0,05 1,88±0,02 90% de glicerol en agua 1,66±0,02 bmimPF6e 1,84±0,02 cloroformo 4,8 3,4 1,38±0,02 acetato de etilo 4,3 1,50±0,02 Capítulo IV 98 360 370 380 390 400 410 420 0 10 20 30 40 50 60 70 80 I 1 /I 3 λ / nm acetato de etilo cloroformo ciclohexano etanol metanol agua I1 I2 I3I4 I5 360 370 380 390 400 410 420 0 10 20 30 40 50 60 70 80 I 1 /I 3 λ / nm acetato de etilo cloroformo ciclohexano etanol metanol agua I1 I2 I3I4 I5 Figura IV.2.- Espectro de emisión fluorescente del pireno en disolventes de diferente polaridad: acetato de etilo, cloroformo, ciclohexano, etanol, metanol y agua a pH básico en condiciones ambiente. Sólo la disolución acuosa fue preparada 0,1 µM, el resto fueron preparadas a mayor concentración, 6 µM. Los derivados fluorescentes lipídicos disfrutan de un amplio uso en el estudio de la bioquímica de membranas que atañe a la bioquímica de lípidos. Sus aplicaciones se han ajustado a dos clases principales:8 • Como sonda para obtener información del sistema en general, como por ejemplo, la fluidez de la membrana. En este caso se denominan “sondas de sistema”. • Obtención de información de una única molécula lipídica en lo que se refiere a su conformación a su movimiento transmembrana. Se suelen elegir estos derivados lipídicos ya que con frecuencia presentan una orientación y profundidad dentro de la membrana mucho mejor definida que si se tratara del fluorórofo libre. Además es posible la presencia de fluoróforos en lugares, como proteínas transportadoras de lípidos, a los cuales las sondas originales no tendrían fácil acceso. Pero las ventajas de estos derivados no se quedan aquí, ya que presentan una configuración estructural estéricamente más compatible cuando la sonda forma parte íntegra de la molécula lipídica, siempre asumiendo que una perturbación de este tipo es siempre inevitable, Capítulo IV 99 independientemente de la estructura del fluoróforo. Además de esta perturbación estérica, un fluoróforo polar puede producir un cambio en la conformación de los lípidos vecinos. Si sumamos las propiedades mencionadas de los derivados lipídicos a las del pireno, tenemos como resultado los derivados lipídicos del pireno que son importantes en el estudio de la biología celular, debido fundamentalmente a su facilidad para dar lugar a excímeros dependiendo de su concentración local. En la figura IV.3 se representan fluoróforos que derivan de la fosfatidilcolina. O O H C H 2 C O O CH 2 O P O O O NH H H H H 3 C H 2 C H 3 C OO H C H 2 C OO CH 2 O P O O O NH H H H H 3 C H 2 C H 3 C (a) (b) Figura IV.3.- Estructuras típicas de mono (a) y dipireno-fosfolípidos (b). Una característica especial de la estructura de la derecha es la habilidad que presentan estos compuestos para dar lugar a excímeros. Los excímeros son una herramienta importante en el estudio de diversos fenómenos como es la difusión lateral, la fluidez de membranas, transiciones de fase, traslocación de lípidos así como del metabolismo lipídico y el transporte en las células vivas. Otra ventaja importante de estos derivados lipídicos del pireno es que la característica hidrófoba del grupo aromático no modifica el alto carácter hidrofóbico de las cadenas alquílicas. Capítulo IV 100 Derivados fluorescentes de sales biliares Las sales biliares también permiten este tipo de sustitución. Se han desarrollado diversos tipos de sales biliares acopladas a diferentes grupos fluoróforos. Estos ácidos biliares “etiquetados” han mostrado ser una herramienta útil en la caracterización del transporte hepático.9 El transporte de las sales biliares requiere de un estudio muy laborioso debido a la propia complejidad morfológica del hígado, así como de la bioquímica del transporte transcelular y la fisicoquímica intrínseca de las sales biliares. La unión de un agente fluoróforo a las sales biliares permite a los investigadores la posibilidad de vencer alguna de estas dificultades al mismo tiempo que ofrece nuevas posibilidades para el estudio del transporte de las sales biliares con la ayuda de la Microscopía de Fluorescencia. Estos derivados fluorescentes suelen ser usados como sustitutos de los ácidos biliares naturales u otros aniones orgánicos hepatofílicos, lo que permite la caracterización hepática. Es útil conocer si estas moléculas se transportan activa o pasivamente por el intestino delgado, y por lo tanto pueden ser absorbidos y entrar en el ciclo enterohepático. Los grupos fluoróforos se pueden conjugar con el ácido biliar a través de su cadena lateral o bien, a través de los grupos hidroxilos del cuerpo esteroide. En la figura IV.4 se muestran derivados fluorescentes con el grupo fluoróforo colgado de la cadena lateral. Estos ácidos biliares fluorescentes se han sometido a ensayos de transporte hepático en ratas, presentando una capacidad de transporte de 1/6 del reportado para el taurocólico. Los mejores resultados se han encontrado para los derivados del glicocolato, además estos derivados sufren una escasa biotransformación (<5%) durante el transporte hepático (ver tabla IV.2). Kurz et al10 han sintetizado diversos derivados de sales biliares fluorescentes por sustitución de uno de los grupos hidroxilo de la posición 3, 7 y 12 por 4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD), un fluoróforo destacado y de amplio uso. El uso del grupo amino-NBD unido al esqueleto esteroide ofrece dos ventajas: a) Se mantiene el carácter monoaniónico de la sal biliar. b) Hay una alta accesibilidad dirigida a la obtención sintética de diferentes estereoisómeros; Ácido 3α-NBD-amino-7α,12α-dihidroxi-5β-colanoico; Ácido 3β-NBD-amino-7α,12α-dihidroxi-5β-colanoico; Ácido 7α-NBD-amino3α,12α-dihidroxi-5β-colanoico; Ácido 7β-NBD-amino-3α,12α-dihidroxi-5βcolanoico; Ácido 12α-NBD-amino-3α,7α-dihidroxi-5β-colanoico; Ácido 12βNBD-amino-3α,7α-dihidroxi-5β-colanoico, así como los derivados análogos conjugados de la taurina. Capítulo IV 101 Sin embargo, nos encontramos con el problema de que incluso la conjugación de este fluoróforo pequeño provoca una expansión del sistema electrónico de la sal biliar, lo que puede provocar alteraciones en su actuación a nivel fisiológico. Un hecho a tener en cuenta para que el estudio del transporte de la sal biliar pueda ser seguido por Microscopía de Fluorescencia es que el derivado debe ser lo más análogo posible a la molécula fisiológica y, además, debe comportarse como tal a nivel del metabolismo, transporte y toxicidad. Por lo tanto, estos derivados fluorescentes deben ser cualitativamente metabolizados y transportados por los mismos mecanismos por los que se rigen las sales biliares fisiológicas y la tolerancia debe ser similar. N O N NO 2 R 1 R 2 R 3 O NCOOH NH (a) R 1 R 2 R 3 O N H OH O OH O OH (b) OH O OH O OH (c) OH O OH O OH H N N HO R 1 R 2 R 3 O (d) Figura IV.4.- Ejemplos de sondas fluorescentes derivadas de ácidos biliares. (a) C-L-NBD ó UDC-L-NBD; (b) CamF ó UDCamF; (c) Fluoresceína; (d) CGamF. Abreviaturas: NBD, nitrobenzoxadiazolil; amF, aminofluoresceína; C, ácido cólico; UDC, ursodesoxicólico; CG, glicocólico. Capítulo IV 108 definidas ya que la tercera banda suele manifestarse como un hombro. Tales espectros de emisión son similares al espectro del ácido 1-pirenocarboxílico del que derivan tal y como puede deducirse a partir de la comparación de los mismos con los datos recogidos en la tabla IV.4. Tabla IV.3.- Parámetros de absorción UV-Visible del pireno y otros derivados en diclorometano. *Error en la longitud de onda: ±0,5nm; §desde el ajuste de la curva. λmáx / nm* Compuesto S1-S0§S2-S0S3-S0 Py 372,5 337,0 274,5 Py-COOH 386,0 355,0 283,0 Py-CO-NH-C3H7377,0 344,0 278,0 Py-CO-NH-Leu-OMe 378,0 344,0 277,5 360 380 400 420 440 460 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Intensidad de fluorescencia λ / nm ciclohexano cloroformo acetato de etilo etanol metanol agua pHbásico (a) 360 380 400 420 440 460 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Intensidad de fluorescencia λ / nm ciclohexano acetona cloroformo agua pHbásico acetato de etilo acetonitrilo etanol dimetilformamida metanol (b) Figura IV.10.- Espectros de emisión fluorescente en disolventes de diferente polaridad de los ácidos (a) 3-pirenocólico y (b) 3-pirenolitocólico en disolventes de diferente polaridad (concentración de la sonda 6 µM). λexc=342 nm. Capítulo IV 109 Tabla IV.4.- Banda vibracional máxima y desplazamientos Stokes en los espectros de emisión del pireno y de algunos derivados en diclorometano. aLongitudes de onda en nm [números de onda] de la banda vibracional máxima (hombros) grabada en el espectro de emisión de fluorescencia. bLongitudes de onda en nm [números de onda] de las bandas originarias de las transiciones S1-S0 en los espectros de excitación. cDesplazamientos Stokes, se calculan a partir de la diferencia en cm-1 de las bandas originarias S1-S0 en los espectros de emisión y excitación. La incertidumbre es ca.±50cm-1. λ / nm Compuesto S1→S0aS1↔S0bDesplazamiento Stokes, ∆ν/cm-1c Py 371,5; 377,5; 382,5; (413,0) [26918, 26490, 26414, 25478] 371,5 [26918] 0 Py-COOH 392,0; 413,0; (431,0) [25510, 24213] 385,5 [25940] 430 Py-CO-NH-C3H7381,0; 400,0; (419,0) [26247, 25000] 376,0 [26596] 350 Py-CO-NH-Leu-OMe 383,0; 402,5; (420,5) [26110, 24845] 377,0 [26525] 420 Una primera inspección de los espectros de emisión de ambas sondas permite deducir que no se observan cambios apreciables en las longitudes de emisión. Esto era de esperar ya que el esqueleto de unión al pirenocarboxílico es común a las dos y no se añade ningún elemento resonante que influya significativamente en el espectro. Dado que en la estructura de estas sondas se encuentra el grupo cromóforo pirenilo, se comprobó si la relación de intensidades de sus bandas presentaba algún cambio en función de la polaridad del microentorno circundante. Las bandas a estudiar son las de la transición vibrónica 0,0 (I1) y la 0,1 (I2) ya que la tercera banda aparece como hombro en la mayoría de los disolventes lo que hace difícil su selección (tabla IV.5). En las tablas IV.6 y IV.7 se pueden ver los valores para la relación de las intensidades de las bandas de vibración 1 y 2, es decir, I1/I2, los tiempos de vida medio, τ, y el porcentaje de cada uno, así como la relación chi2 que juzga la bondad del ajuste para cada una de las experiencias realizadas. Hay que resaltar que en los Capítulo IV 110 disolventes, ciclohexano y agua a pH básico, es donde menos se disuelven las nuevas sondas, lo que teniendo en cuenta su polaridad, era de esperar. Tabla IV.5.- Parámetros de emisión de fluorescencia del ácido 3-pirenocólico y del ácido 3-pirenolitocólico en diferentes disolventes. En verde se indica que la transición vibrónica aparece como un hombro en el espectro de emisión. En gris, bandas no obtenidas experimentalmente. †Medidas experimentales. λmáx / nm† λmáx / nm† Disolvente Transición vibrónica 0,0 Transición vibrónica 0,1 Transición vibrónica 0,2 Transición vibrónica 0,0 Transición vibrónica 0,1 Transición vibrónica 0,2 ciclohexano 379,8 398,0 - 380,4 400,2 422,0 cloroformo 382,2 401,6 - 383,0 402,2 - acetato de etilo 378,4 397,8 420,4 379,6 399,0 421,2 acetonitrilo 379,4 398,8 - acetona 380,0 398,8 420,8 dimetilformamida 380,2 398,8 - metanol 378,8 397,8 - 380,0 398,8 - etanol 379,0 398,4 - 380,4 399,6 - Ácido 3-pirenocólico NaOH, 1mM 379,0 397,2 - Ácido 3-pirenolitocólico 386,2 398,2 - Se puede observar que hay un cambio claro en los valores de la relación I1/I2 con el disolvente para ambas sondas. Este es un resultado interesante ya que en principio le puede otorgar aplicaciones similares a las del pireno. En la figura IV.11 se representa la relación del ácido 3-pirenolitocólico vs la relación I1/I2 del ácido 3-pirenocólico. La no influencia del residuo biliar sobre el espectro de fluorescencia del residuo pirenilo, debiera manifestarse en una dependencia lineal entre ambas variables con una pendiente igual a la unidad. La mencionada figura muestra esta relación, siendo la pendiente calculada igual a 0,96±0,05, es decir, muy próxima a lo esperado. De los nueve disolventes estudiados, sólamente el ciclohexano muestra una desviación apreciable respecto a la linealidad de los demás disolventes. Capítulo IV 111 Tabla IV.6.- Relación de intensidades de las bandas de vibración 1 y 2 del espectro del ácido 3-pirenocólico, así como los tiempos de vida medidos en cada uno de los disolventes que se han utilizado para su caracterización. T=25,0±0,5ºC. disolvente I1/I2τ1/ns τ2/ns Rel.% Rel.% χ2 ciclohexano 1,8227 47,79±0,55 9,36±0,18 55,35 39,87 1,269 cloroformo 1,6208 25,18±0,08 8,77±0,76 96,17 3,83 1,004 acetato de etilo 1,5659 62,68±0,13 15,95±1,35 96,08 3,92 1,016 acetonitrilo 1,5372 64,13±0,41 20,02±3,78 98,33 1,67 1,061 acetona 1,5508 61,29±0,17 8,86±0,85 98,73 1,27 1,049 dimetilformamida 1,5085 48,63±0,12 8,88±0,99 98,64 1,36 1,008 metanol 1,4015 54,94±0,15 53,55±0,42 9,96±2,09 18,13±3,46 99,24 98,01 0,76 1,99 1,072 1,029 etanol 1,4492 48,76±0,25 16,50±2,76 97,95 2,05 0,934 agua pHbásico 1,0784 35,10±0,07 8,29±1,09 98,42 1,58 1,083 Tabla IV.7.- Ídem tabla IV.6 para el ácido 3-pirenolitocólico. disolvente I1/I2τ1/ns τ2/ns Rel.% Rel.% χ2 ciclohexano 1,6561 45,43±0,28 14,02±0,76 92,07 7,93 1,166 cloroformo 1,5446 26,63±0,10 26,46±0,09 10,59±0,40 10,08±0,37 88,64 89,30 11,36 10,70 1,114 1,037 acetato de etilo 1,5350 64,24±0,34 64,19±0,51 14,76±0,43 19,50±0,73 92,66 90,70 7,34 9,30 1,092 1,042 acetonitrilo 1,4695 67,57±0,48 61,94±0,50 18,43±0,67 19,84±0,84 92,15 91,22 7,85 8,78 1,044 0,995 acetona 1,5361 59,27±0,43 59,60±0,33 18,44±0,76 15,71±0,51 91,61 92,04 8,39 7,96 1,110 1,096 dimetilformamida 1,4925 56,50±0,27 55,30±0,26 14,43±0,39 13,92±0,40 90,91 91,45 9,09 8,55 1,158 1,157 metanol 1,3673 53,61±0,37 54,95±0,38 18,05±0,56 17,98±0,53 87,83 87,43 12,17 12,57 0,985 1,038 etanol 1,4074 50,67±0,37 51,50±0,35 18,42±0,65 17,92±0,62 87,90 88,51 12,10 11,49 0,984 1,022 agua pHbásico 1,0480 34,30±0,53 34,74±0,53 13,33±0,18 13,30±0,15 33,53 29,74 62,68 65,96 0,958 1,194 Capítulo IV 112 La caracterización de una nueva sonda fluorescente implica también la determinación del tiempo de vida media. A modo de ejemplo, en la figura IV.12 se representa un decaimiento de la sonda fluorescente ácido 3-pirenolitocólico solubilizada en etanol. A partir del análisis de la curva de decaimiento se obtiene el tiempo (o tiempos, si hay más de uno) de vida media. El decaimiento de fluorescencia fue medido excitando a una longitud de onda de 342 nm y se empleó una técnica por mínimos cuadrados no lineal para extraer los tiempos de vida media de las especies fluorescentes. Los resultados se resumen en las tablas IV.6 y IV.7. Figura IV.11.- Representación de la relación I1/I2 del ácido 3-pirenolitocólico vs la relación I1/I2 del ácido 3-pirenocólico en los nueve disolventes estudiados. 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 ciclohexano cloroformo acetato de etilo acetona DMF acetonitrilo etanol metanol I1/I2 (ácido 3-pirenolitocólico) I1/I2 (ácido 3-pirenocólico) agua 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 ciclohexano cloroformo acetato de etilo acetona DMF acetonitrilo etanol metanol I1/I2 (ácido 3-pirenolitocólico) I1/I2 (ácido 3-pirenocólico) agua , , , tiempo / ns Residuales Cuentas , , , , , , , , , tiempo / ns Residuales Cuentas Figura IV.12.- Decaimiento de fluorescencia de la sonda ácido 3-pirenolitocólico solubilizada en etanol. λexc.=342 nm. T=25,0±0,5ºC. Capítulo IV 113 De un modo análogo al de la figura IV.11, en la figura IV.13 se representa τ1 del ácido 3-pirenolitocólico (datos de la tabla IV.7) vs τ1 del ácido 3-pirenocólico (datos de la tabla IV.6). En este caso, el valor de la pendiente es 0,98±0,08, concordante con lo esperado. Las gráficas de las figuras IV.11 y IV.13, junto con la cercanía del valor experimental de la pendiente a la unidad, constituyen un muy poderoso aval sobre la autoconsistencia de los datos obtenidos para ambas sondas. Asimismo, vienen a representar que en posteriores estudios de aplicación de las sondas, los datos a obtener por cualquiera de ellas, deben ser prácticamente idénticos. Por ello, la elección entre una u otra debe estar basada en aspectos ajenos a su papel de fluoróforo, y atender a otras razones como, por ejemplo, su mayor o menor solubilidad. Figura IV.13.- Representación de τ1 del ácido 3-pirenolitocólico vs τ1 del 3-pirenocólico obtenidos en los disolventes indicados. 20 30 40 50 60 70 30 40 50 60 70 τ(ácido 3-pirenolitocólico) 1/ ns τ1 (ácido 3-pirenocólico)/ ns ciclohexano cloroformo acetato de etilo acetonitrilo acetona DMF etanol metanol agua En la figura IV.14 se representa gráficamente la relación de las intensidades I1/I2 para ambas sondas fluorescentes y la relación de las señales I1/I3 del pireno frente a los índices de polaridad (según Snyder) y las constantes dieléctricas de los disolventes en los que se han caracterizado. La figura evidencia una relación invertida para estas sondas en relación con la tendencia observada para el pireno. Efectivamente, la relación I1/I3 para el pireno es máxima para el agua y mínima para el ciclohexano, mientras que la relación I1/I2 de estas sondas es máxima para el ciclohexano y mínima para el agua. También debemos hacer notar que el intervalo |∆I1/I3| es mayor que el |∆I1/I2|. En cualquier caso, al tener en cuenta cómo se ve afectada la relación I1/I2 de las nuevas sondas por la polaridad del disolvente, se puede concluir que las mismas pueden ser utilizadas para obtener una idea acerca de la polaridad del microambiente en donde se aloje la sonda y Capítulo IV 114 también para otras aplicaciones similares a las del pireno como, por ejemplo, determinación de la cmc de un agregado micelar. 0246810 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 metanol cloroformo agua ciclohexano agua metanol dimetilformamida acetonitrilo Relación de intensidad Índice polaridad ácido 3-pirenocólico ácido 3-pirenolitocólico pireno ciclohexano acetato de etilo etanol acetona 0246810 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 metano ciclohexano agua metanol l cloroformo agua dimetilformamida acetonitrilo Relación de intensidad Índice polaridad ácido 3-pirenocólico ácido 3-pirenolitocólico pireno ciclohexano acetato de etilo etanol acetona (a) 0 20406080 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 agua metanol acetona cloroformo ciclohexano agua metanol ciclohexano Relación de intensidad ε ácido 3-pirenocólico ácido 3-pirenolitocólico pireno 0 20406080 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 agua l acetona cloroformo ciclohexano Relación de intensidad ε metano agua metanol ciclohexano ácido 3-pirenocólico ácido 3-pirenolitocólico pireno (b) Figura IV.14.- Relación de las intensidades de las bandas de vibración de las sondas: ácido 3-pirenocólico; ácido 3-pirenolitocólico y pireno vs (a) los índices de polaridad (b) o las constantes dieléctricas.7 Por otra parte, dado que la relación I1/I3 del pireno ha sido propuesta como una escala de polaridad de los disolventes,18 en la figura IV.15 se representa la relación I1/I2 de las sondas sintetizadas frente a la relación I1/I3 del pireno. Sin embargo, una vez comentadas las gráficas anteriores, esta nueva gráfica no aporta conclusiones adicionales. Análogamente a la figura IV.14, en la figura IV.16 se representan los tiempos de vida de la sonda ácido 3-pirenocólico frente a los índices de polaridad.7 Las tablas IV.6 y IV.7 evidencian que estos derivados exhiben un decaimiento bien representado por una doble exponencial. En estas tablas se recoge también el peso relativo de ambos componentes. En estos casos, el porcentaje mayor, que corresponde al mayor tiempo de vida (proceso más lento) podría ser atribuido a la fluorescencia del confórmero del fluóroforo en mayor proporción, mientras que el tiempo de vida más rápido sería atribuido al confórmero en menor población fraccional.6 Esto mismo sucede para derivados del 1-pirenocarboxílico con enlace amida con la misma direccionalidad (tabla IV.8), siendo el ángulo formado entre el enlace amida y el pireno el responsable de los diferentes tiempos de vida. Cabe recordar que en el caso del pireno, los valores de los tiempos de vida Capítulo IV 115 medio son mayores en los disolventes apolares (450 ns en ciclohexano, 200 ns en DMSO), mientras que en estas sondas no se observa una tendencia en la misma dirección, ya que en el agua, por ejemplo, exhibe un tiempo de vida menor que en los disolventes considerados de menor polaridad, tales como, acetona, acetonitrilo, metanol o etanol (figura IV.16). 0,60,81,01,21,41,61,82,0 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 agua metanol etanol acetato de etilo cloroformo I1/Isonda 2 I1/Ipireno 3 ácido 3-pirenocólico ácido 3-pirenolitocólico ciclohexano Figura IV.15.- Representación de la relación I1/I2 para las nuevas sondas vs la relación I1/I3 del pireno para diversos disolventes. 3456789 10 20 30 40 50 60 70 DMF agua τ / ns índice polaridadSnyder τ1 τ2 cloroformo acetato de etilo etanol acetona acetonitrilo metanol DMF cloroformo acetato de etilo etanol acetona acetonitrilo metanol agua Figura IV.16.- Representación de los dos tiempos de vida del ácido 3-pirenocólico vs los índices de polaridad.7 Capítulo IV 116 Tabla IV.8.- Rendimiento cuántico y tiempos de vida del componente fluorescente mayoritario del pireno y de algunos derivados en diclorometano desoxigenado a temperatura ambiente.6 ‡Los errores máximos estimados en los rendimientos cuánticos son ±10% del valor citado. ††Excitado a 361nm y observado a 400 nm. Los errores son ±1 ns para los tiempos de vida mayores que 100 ns, y ±0,2 ns para los tiempos de vida menores que 100 ns. Compuesto Φf‡τ/ ns†† Py 0,41 167 Py-COOH 0,75 5,3 Py-CO-NH-C3H70,64 32,4 Py-CO-NH-Leu-OMe 0,70 20,3 A partir de la relación de energía de la minimización de las estructuras de los dos confórmeros del ácido 3-pirenocólico se realizó un cálculo aproximado del porcentaje de ambos a partir de la ecuación de distribución de Boltzmann (ecuación IV.1). Para ello se empleó el programa Gaussian 03ℵ utilizando como base de cálculo el modelo PM3 (Parametric Method 3) semi-empírico. −− =(E E ) kT ij ij Ne N [IV.1] La figura IV.17 muestra las estructuras minimizadas de los confórmeros del ácido 3-pirenocólico. Los cálculos condujeron a un mayor porcentaje (=88%) ℵGaussian 03, Revision A.1, M. J. Frisch, G. W. Trucks, H. B. Schlegel, G. E. Scuseria, M. A. Robb, J. R. Cheeseman, J. A. Montgomery, Jr., T. Vreven, K. N. Kudin, J. C. Burant, J. M. Millam, S. S. Iyengar, J. Tomasi, V. Barone, B. Mennucci, M. Cossi, G. Scalmani, N. Rega, G. A. Petersson, H. Nakatsuji, M. Hada, M. Ehara, K. Toyota, R. Fukuda, J. Hasegawa, M. Ishida, T. Nakajima, Y. Honda, O. Kitao, H. Nakai, M. Klene, X. Li, J. E. Knox, H. P. Hratchian, J. B. Cross, C. Adamo, J. Jaramillo, R. Gomperts, R. E. Stratmann, O. Yazyev, A. J. Austin, R. Cammi, C. Pomelli, J. W. Ochterski, P. Y. Ayala, K. Morokuma, G. A. Voth, P. Salvador, J. J. Dannenberg, V. G. Zakrzewski, S. Dapprich, A. D. Daniels, M. C. Strain, O. Farkas, D. K. Malick, A. D. Rabuck, K. Raghavachari, J. B. Foresman, J. V. Ortiz, Q. Cui, A. G. Baboul, S. Clifford, J. Cioslowski, B. B. Stefanov, G. Liu, A. Liashenko, P. Piskorz, I. Komaromi, R. L. Martin, D. J. Fox, T. Keith, M. A. AlLaham, C. Y. Peng, A. Nanayakkara, M. Challacombe, P. M. W. Gill, B. Johnson, W. Chen, M. W. Wong, C. Gonzalez, and J. A. Pople, Gaussian, Inc., Pittsburgh PA, 2003. Capítulo IV 117 del confórmero “i”, mientras que el confórmero “j” se encuentra en un 12%. Aunque este cálculo representa un dato simbólico, esta relación presenta bastante concordancia con el porcentaje de los tiempos de vida de cada uno de ellos. Confórmero i Confórmero j Figura IV.17.- Estructuras minimizadas de los confórmeros de la estructura ácido 3-pirenocólico. Caracterización de la sonda fluorescente ácido 3-pirenolitocólico en algunos sistemas micelares convencionales También se ha investigado el comportamiento de las nuevas sondas fluorescentes en tensioactivos convencionales como el dodecilsulfato sódico (SDS) y el bromuro de cetilpiridinio (CTAB), así como en ácidos biliares de características bien conocidas como el colato sódico (NaC) y el desoxicolato sódico (NaDC). Nos hemos centrado en el ácido 3-pirenolitocólico debido a que no existe ningún grupo hidroxilo en la unidad esteroide, por lo que debe ser una sonda más hidrófoba que la del ácido 3-pirenocólico, y por lo tanto tendrá mayor tendencia a incorporarse en la región más hidrófoba de las micelas, esto es, en su corazón. La figura IV.18 muestra los espectros de emisión fluorescente del ácido 3-pirenolitocólico solubilizado en estos sistemas. La solubilización de la sonda en la disolución micelar fue llevada a cabo como sigue: en primer lugar, se prepara una disolución patrón de la sonda en etanol (disolvente con bajo punto de ebullición y en el que es muy soluble); a continuación, se añade un volumen exactamente conocido de la disolución patrón en el vial en el que se va a preparar la suspensión micelar previa evaporación del disolvente, de modo que la concentración final de la sonda sea aproximadamente 8 µM. Capítulo IV 124 anomalía parece indicar que las sondas se ubican en entornos diferentes debido a la naturaleza del residuo biliar. De un modo cualitativo se observó que la solubilidad del ácido 3-pirenocólico en agua es mayor que la del ácido 3-pirenolitocólico, lo que repercutiría en una mayor afinidad del primero hacia el medio acuoso, y la del segundo hacia disolventes menos polares. Por lo tanto, es posible que, comparativamente, la sonda ácido 3-pirenocólico tenga menos tendencia a incluirse en el seno de los agregados que el ácido 3-pirenolitocólico. Además, como veremos en el capítulo siguiente, la naturaleza de los agregados formados por los distintos gemini es también diferente. Por este motivo, sería prematuro proponer conclusiones definitivas a la luz de la disparidad de los valores de los tiempos de vida. En definitiva, consideraremos que las nuevas sondas sintetizadas pueden ser utilizadas para la determinación correcta de la polaridad microambiental donde se encuentran ubicadas pero su utilización en sistemas más complejos requiere de investigaciones en un mayor número de sistemas de referencia básicos. as dos sondas fluorescentes a bajas concentraciones en diferentes sistemas surfactantes obtenidos a partir del análisis multiexponencial de los decaimientos experimentales. T=25,0±0,5ºC. λexc. Tabla IV.12.- Tiempos de vida, τ, y relación I1/I2 para l =342 nm. relación sonda /gemini 1:5000. I † 1/I2τ1/ns τ2/ns τ3/ns Rel.% Rel.% Rel.% χ2 Ácido 3-pirenocólico †g-2C24-AEDT 45,05 13,55 3,56 40,00 34,69 24,29 1,009 †g-2DC24-AEDT 1,2062 80,63 24,13 6,41 39,68 45,53 14,78 1,074 g-2DC †24-PIR 1,2352 80,99 24,84 7,09 55,42 39,49 5,09 1,038 Ácido 3-pirenolitocólico †g-2C24-AEDT 1,3983 44,15 16,14 2,06 48,76 43,95 7,29 1,328 †g-2DC24-AEDT 1,4629 56,31 18,29 1,81 70,22 27,57 2,21 1,058 g-2DC †24-PIR 1,3882 66,81 20,72 2,09 59,81 37,36 2,83 1,289 g-2C †24-PIR 1,2323 52,97 16,55 2,08 48,10 44,21 7,68 1,268 Capítulo IV 125 1. Sanz Pedrero, P. Fisicoquímica Para Farmacia y Biología 1992, Ed. 2. F en 3. Lianos, P.; Viriot, M. L.; Zana, R. J. Phys. Chem. 1984, 88, 1098-101. 4. Jover, A.; Meijide, F.; Rodríguez Núñez, E.; Vázquez Tato, J.; Mosquera, M. 3, 161-164. 5. Jover, A.; ez, E.; Vázquez Tato, J.; Mosquera, M.; rLangmuir 12 96. Yao, C.; Kraatz, H.-B.; Steer, R. P. Photochemical & Photobiological Sci. 2005, 7. t s 1Verlag Chemie, . 8. , P. P pi 2, 57 9. Holzinger, F. ; Schteingart, C. 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La primera síntesis de tensioactivos gemelos convencionales fue anunciada en 1971 por Bunton et al1 quienes los bautizaron como detergentes dicatiónicos y los utilizaron como catalizadores de ciertas reacciones de sustitución nucleófila. Estas sustancias fueron renombradas sucesivamente como tensioactivos bis-amonio cuaternarios,2 tensioactivos diméricos,3 tensioactivos gemini1 y tensioactivos siameses.4 (a) PuentePuente (b) CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 N CH 3 H 2 CH 2 CH 2 CH 2 C N CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 H 3 C (c) Puente GRUPOS POLARES CADENAS LIPOFÍLICAS Puente GRUPOS POLARES CADENAS LIPOFÍLICAS PuentePuente (d) Figura V.1.- (a) Estructura básica de un surfactante típico. (b) Estructura de un surfactante dimérico no gemini. (c) Fórmula del catión de amonio cuaternario de uno de los primeros tensioactivos gemini sintetizados. (d) Dos esquemas de la estructura de un surfactante gemini. Más concretamente, la definición de un gemini abarca: a) Todos los gemini poseen al menos dos cadenas hidrófobas y dos grupos iónicos o polares (véase la figura V.1). Capítulo V b) El puente∗ puede ser corto (dos grupos metileno) o largo (12 grupos metileno); rígido (benceno) o flexible (cadena de metilenos); polar (poliéter) o no polar (alifático, aromático) y une las cabezas polares o átomos de carbono de la cadena hidrocarbonada próximos a ellas (véase la figura V.1.d). El puente puede estar situado al mismo nivel de los grupos polares o muy próximo a ellos. c) El grupo polar puede ser positivo (amonio), negativo (fosfato, sulfato, carboxilato), no iónico (poliéter, azúcar) o zwitteriónico.5 La mayor parte de los tensioactivos gemelos poseen moléculas simétricas, es decir, con los grupos polares iguales y los mismos grupos no polares. Sin embargo, también se han sintetizado tensioactivos gemelos con distintos grupos polares6 y con cadenas hidrocarbonadas diferentes.7 A los tensioactivos gemini que poseen moléculas simétricas se los suele simbolizar como m-s-m, donde m es el número de átomos de carbono de cada cadena hidrocarbonada (grupo no polar) y s es el número de átomos de carbono del grupo puente; mientras que a los asimétricos se los representa como m-s-n. También se clasifican como gemini, los surfactantes trímeros, que poseen tres cadenas lipófilas y tres grupos polares8 (se representan como m-n-m-n-m), y los tetrámeros (m-n-m-n-m-n-m), con cuatro grupos de cada tipo.9 ∗En el trabajo pionero de Bunton et al1, a la cadena hidrocarbonada corta que actúa como puente se la nombra, en inglés, como bridging group, ya que une a las dos partes del tensioactivo, cada una de las cuales está constituida por un grupo polar, en este caso un catión, y una cadena lipofílica. Sin embargo, en publicaciones posteriores y hasta la actualidad, al grupo que actúa como puente se le llama spacer, que en inglés significa separador o espaciador. La traducción como separador no parece la más adecuada debido a que esta cadena une, y no separa, dos partes de una misma molécula. En cuanto a la otra acepción, espaciador, en nuestro idioma está confinada a la tecla de las máquinas de escribir y de los ordenadores y se utiliza para los espacios en blanco. Por esta razón, sería más adecuado denominarlo como “puente” o “grupo puente”. 130 Capítulo V 131 CH CH 2 OCH 2 CH 2 O 2 CH 2 CO OC 10 H 21 CH OCH 2 CO 2 CH 2 OC 10 H 21 Na Na (a) O P O O O N (b)5 C N CH 2 COO - H CN CH 2 COO - H O O H O O (c) O O O O O O O O N N N N C 12 H 25 C 12 H 25 C 12 H 25 C 12 H 25 (d) O O O O O HO HO OH OH OOH OH OH HO 3 (e) CH O(CH 2 ) 2 O(CH 2 ) 2 OCH (CH 2 OCH 3 ) 16 CH 2 OCH 3 O 3 S(H 2 C) 3 OH 2 C C 10 H 21 C 10 H 21 Na (f) Figura V.2.- Algunos ejemplos de surfactantes gemini sintetizados hasta la actualidad: (a) gemini aniónico;10 (b) gemini Zwitterionico; (c) “Pseudo-gemini” obtenido en disolución utilizando puentes de hidrógeno entre dos grupos hidroxilo;11 (d) gemini catiónico tetramérico12; (e) gemini no iónico13; y (f) gemini asimétrico.14 En definitiva pueden ser tan complejos como un investigador sea capaz de diseñar o su ambición (y los medios) se lo permitan. Capítulo V La síntesis de estos nuevos surfactantes se basa, a grandes rasgos, en acoplamientos teóricamente sencillos mediante enlaces amina, amida, éster, éter, fosfato… entre los grupos funcionales del puente y los surfactantes convencionales tal y como se muestra en el esquema de la figura V.3. En algunos casos, la parte polar del surfactante (cabeza) debe ser modificada para poder ser acoplado a un determinado puente. En el proceso de síntesis del nuevo compuesto, debe prestarse especial atención a la purificación del mismo, siendo éste un paso crítico ya que la presencia de impurezas puede cambiar la actividad superficial del nuevo surfactante. RN(CH 3 ) 2 Br(CH 2 ) n Br RN(CH 3 ) 2 (CH 2 ) n (CH 3 ) 2 N R Br Br 2 R = cadena alifática Figura V.3.- Esquema de síntesis de un gemini catiónico simple.10 La cmc de los tensioactivos gemini es menor que la de los tensioactivos ordinarios en uno o dos órdenes de magnitud.15 Así, por ejemplo, mientras que la cmc del bromuro de dodeciltrimetilamonio a temperatura ambiente es igual a 16 mM, la del gemini constituido por dos unidades de bromuro de dodecildimetilamonio unidas por un puente formado por 16 grupos metileno es de sólo 0,12 mM, es decir, 130 veces menor. Una de las posibles razones de esta disminución en el valor de la cmc es que se ha encontrado que hay un mayor empaquetamiento de los grupos hidrófobos de los gemini en la interfase aire-agua con respecto a los surfactantes convencionales. La elevada actividad superficial que presentan estos tensioactivos se traduce en que se necesita menos cantidad de los mismos para mejorar las funciones del original. Debido a su baja cmc, los gemini producen menos irritación en la piel, ya que esta característica depende de la concentración del tensioactivo no asociado en micelas.9 En general, también podemos decir que los surfactantes aniónicos suelen presentar valores de cmc algo inferiores a sus homólogos catiónicos.15 El valor de la cmc decrece a medida que se incrementa la longitud de la cadena no polar debido a que en ese sentido se ve incrementado lo que se conoce como efecto hidrófobo.16,17 Además, los valores de cmc no son sensibles a la 132 Capítulo V 133 polaridad de los puentes cortos, entre 2 y 8 átomos, pero si se ven afectados por un puente largo de, por ejemplo, 16 grupos metileno. Un puente largo contribuye a la hidrofobia del gemini, reduciendo la solubilidad del monómero y mejorando su tendencia a autoensamblarse. Debido al alto coste que representa su síntesis, para muchas aplicaciones, los surfactantes gemini se usan en sistemas mixtos con surfactantes convencionales. Los surfactantes gemini interaccionan preferentemente con surfactantes neutros o de carga opuesta. La posible existencia de efectos sinérgicos entre el surfactante convencional y el gemini pueden hacer incluso más atractivo su uso. Hay estudios que se centran en la búsqueda de esos efectos sinérgicos respecto a la micelización,18 la formación de la monocapa en la interfase aire-agua,19 o bien en su forma de agregación. Así, por ejemplo, el 12-2-12 2Brda lugar a micelas alargadas mientras que con la adición de una fracción molar de 0,3 de CTAB estas micelas se transforman en esféricas.20 La tensión superficial del agua (72 mN/m) se ve reducida a 30-40 mN/m cuando la concentración de surfactante alcanza su valor de cmc. Los tensioactivos gemini poseen una capacidad para disminuir la tensión superficial del agua que es hasta tres órdenes de magnitud superior a la de los tensioactivos ordinarios. Una forma de cuantificar esta característica consiste en determinar la concentración del tensioactivo que produce una disminución de la tensión superficial del agua igual a 20 mN/m, C20. A 25ºC, este valor representa un descenso del 28%. Para el dodecilsulfato de sodio, esta concentración es igual a 4,4 mM, mientras que para ciertos tensioactivos gemini aniónicos, que poseen dos grupos sulfato está comprendida entre 0,0065 y 0,01 mM. En los tensioactivos gemini, cuando el grupo que actúa como puente es pequeño o hidrófilo, el acomodamiento de los grupos lipófilos en la interfase aire-agua es más compacto que en los tensioactivos convencionales y, por lo tanto, la concentración del tensioactivo en esa interfase es mayor, lo que causa una mayor disminución de la tensión superficial. El acomodamiento más compacto de las moléculas o iones de los tensioactivos gemini reduce películas interfaciales más estables, lo que se traduce en una mayor estabilidad de emulsiones21 y de espumas. Por esta razón, para obtener emulsiones estables, se utilizan en concentraciones muy bajas, del orden del 0,1%. Otra consecuencia del mejor acomodamiento molecular o iónico en la interfase es la mayor estabilidad de las vesículas preparadas con tensioactivos gemini.9 El área superficial, a, ocupada por un surfactante en la interfase aire-agua es una característica muy importante en la química de tensioactivos. Para surfactantes convencionales este valor disminuye con la longitud de la cadena hidrocarbonada, manteniendo su cabeza polar inmersa en el agua y su cola Capítulo V 35. Kirby, A. J.; Camilleri, P.; Engberts, J. B. F. N.; Feiters, M. C.; Nolte, R. J. M.; Soderman, O.; Bergsma, M.; Bell, P. C.; Fielden, M. L.; Garcia Rodriguez, C. L.; Guedat, P.; Kremer, A.; McGregor, C.; Perrin, C.; Ronsin, G.; van Eijk, M. C. P. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 1448-57. 36. McKenna, J.; McKenna, J. M.; Thornthwaite, D. W. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1977, 809-11. 37. Li, Y.; Dias, J. R. Chem. 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El ácido cólico posee cuatro grupos funcionales que no son equivalentes entre sí, ubicados a lo largo de la molécula, lo que permite obtener un gran control en su modificación química. Por ello, se pueden sintetizar moléculas con diferentes capacidades para generar estructuras supramoleculares en función de los sustituyentes que se coloquen en cada uno de los grupos funcionales que posee. Desde el punto de vista económico, este ácido es casi tan favorable como el colesterol. Oligómeros acíclicos de ácidos biliares. Estructuras lineales La idea de fusionar dos o más unidades de sal biliar mediante una molécula puente para formar oligómeros acíclicos surgió hace tres décadas a través de McKenna et al.1 que fueron los primeros en sintetizar un derivado de este tipo. El ensamblaje de los fragmentos esteroides a través de un puente se puede realizar por la unión al puente del grupo carboxílico en posición 24, de los grupos hidroxilo en posiciones 3, 7 o 12 o a partir de un derivado en estas mismas posiciones como puede ser un derivado amínico como se muestra en la figura VI.1. La molécula de la figura VI.I.a presenta una estructura de gemini de sal biliar que resulta de la unión al puente a través de enlaces amina. La proximidad de las unidades esteroide permite mejorar la capacidad solubilizadora a concentraciones bajas respecto a la cmc del monoesteroide de partida.2 Este enlace amina permite la formación de sales de amonio cuaternario y convertirse en un gemini catiónico, biológicamente importante a la hora de interactuar con la doble hélice de ADN.3,4 Los dímeros que se pueden observar en la figura VI.1.c añadidos a disoluciones de sales biliares favorecen la micelización al disminuir su cmc.5 Por ello, han sido propuestos para prevenir la reabsorción de los ácidos biliares en el tracto intestinal y así bajar el nivel de colesterol en el torrente sanguíneo.6 Se han 243 Capítulo VI sintetizado también dímeros similares de ácido cólico y desoxicólico con propiedades antimicrobianas.7 En este caso, los dímeros se unen a través de un enlace amida. N OH OH OH N HO HO HO O RN HO HO HO O RN HO HO HO R:H,CH3 (a) (b) O OH R OH O HO R OH OO O O n O OH R OH O HO R OH OO O O n R: H, OH n: 6,8 (c) Figura VI.1.- Diferentes ejemplos de dímeros acíclicos unidos mediante enlace (a) amina, (b) amida y (c) éster. Otra clase importante de estos compuestos lo forman derivados análogos a los de la figura VI.1.b, denominados compuestos tipo pinza. Estos compuestos se pueden agrupar en torno a una determinada molécula de una forma similar a los procesos biológicos enzima-sustrato. La situación espacial de estos grupos así como sus propiedades químicas dan lugar a una estructura tipo sandwich en cuyo interior se localiza un determinado huésped. En este tipo de compuestos es más deseable la presencia de un grupo rígido que uno flexible, ya que en el primero se 244 Capítulo VI ve restringida la movilidad de los grupos esteroide. Un análisis conformacional, mediante 1H-RMN, de la molécula a diferentes temperaturas nos muestra dos tipos de comportamiento diferente: • En ausencia de una molécula huésped la pinza presenta dos tipos de conformación estables. • En presencia de la molécula que se asocia presenta una única conformación. Un ejemplo de este tipo de conformación se puede ver en la figura VI.2, aunque la molécula no tiene porque presentar una unión imida.8 N N O O O O OOCH 3 OH OH O H 3 CO HO HO N N O O O O OOCH3 OH OH O H3CO HO HO N N O O O O OOCH 3 OH OH O H 3 CO HO HO HO OH N N O O O O OOCH 3 OH OH O H 3 CO HO HO HO OH (a) (b) (c) Figura VI.2.- Conformaciones más estables de una molécula tipo pinza en ausencia de huésped (a y b); y conformación más estable inducida por la presencia de 2,6-bis(hidroximetil)naftaleno (c). La conformación (a) se denomina “sin” y la (b) “anti”. Otras moléculas de características similares, pero en este caso el grupo huésped va ligado a la molécula anfitrión, se denominan paraguas.9 Este tipo de 245 Capítulo VI síntesis, al igual que para los colafanos, empieza con la preparación de los oligómeros monoméricos o diméricos lineales de ácidos biliares. Si la unión se realiza mediante enlaces amida, los compuestos se suelen denominar ciclocolanamidas. O HN O HN HN NH O OCH 2 Ph PhH 2 C H H OH OH HO HO OO OO OO OO N H N H OO O HO O OH O OH OH O O HO HO O O O O O O O (a) (b) (c) Figura VI.7.- Ejemplos de colafanos. (a) Cavidad totalmente apolar compuesta de unidades de litocólico. (b) Cavidad más polar debido a los grupos hidróxilo del ácido cólico, con dos tipos de enlace al puente: amida y éster. (c) Colafano trimérico dicíclico. En estas moléculas, algunos oxígenos esteroides se pueden utilizar para construir macrolactonas, como la 3,24-lactona, 7,24-lactona o 12,24-lactona en función de los OH implicados. Estas lactosas ofrecen la posibilidad de poder realizar diferentes funciones. Por ejemplo, el trímero de la figura VI.8.a da lugar a una cavidad que puede hospedar iones metálicos, y si la cavidad es mayor, puede acomodar incluso un anillo porfirínico en su interior como muestra la figura VI.8.b. La ciclación no tiene por qué ser necesariamente a partir del anillo A, como se muestra en la figura VI.9, donde se ha usado el ácido quenodesoxicólico como elemento de partida y la ciclación se realiza a partir del grupo hidroxilo en posición 7. 252 Capítulo VI O O O O O O O O O O OO O OO O O O O O O O O M O O O O O O O O O O OO O OO O O O O O O O O M O O OH O O O OH O O O O OH OO HO O N NN N Zn R R R R O O O O O O OO (a) (b) Figura VI.8.- (a) Ciclocolato trimérico que actúa de anfitrión de iones metálicos. (b) Ciclocolato tetramérico con un anillo porfirínico en su interior, lo que permite procesos de transferencia electrónica. HO OH O OH PhSO 2 Cl Piridina PhSO 3 O O O 3 SPh O O Figura VI.9.- Síntesis de un ciclocolato de cavidad reducida y con unión al anillo B. 253 Capítulo VI Otro grupo de derivados son aquellos en los que los esteroides se encuentran unidos a un macrociclo, bien sea un calixareno u otro tipo de macrociclos.24 Los esteroides les confieren un carácter anfifilo que les permite agregarse en medio acuoso. La concentración de agregación crítica (cac) presenta unos valores de 6-35 µM para los compuestos de la figura VI.10. Aunque el tipo de agregado al que dan lugar éstos no ha sido todavía esclarecido, se sabe por medio de técnicas de Light Scattering que los agregados presentan un diámetro hidrodinámico entre los 160 nm y 650 nm. A pesar de la complejidad de su agregación en agua estos ciclofanos esteroides presentan un comportamiento de complejación huésped-anfitrión 1:1 en un intervalo de concentraciones tanto mayores como menores a su cac. Esto indica que la hidrofobia de su cavidad tridimensional no esteroide es muy superior al espacio intermolecular hidrófobo que generan las moléculas de esteroides.25 N N(CH 2 ) 4 (CH 2 ) 4 N N R R R R N N(CH 2 ) 4 (CH 2 ) 4 N N R R R R O NH Y Z X H 3 NCl O=R O NH Y Z XHOOC O =R X, Y, Z: H, OH + + + ++ + + + Señal externa Enzima Señal + + + ++ + + ++ + + ++ + + + Señal externa Enzima Señal Figura VI.10.- Ejemplo de la estructura típica de los ciclofanos de esteroides, representación esquemática del ciclofano embebido en la membrana celular y su posible colaboración con una enzima en función de una señal externa como, por ejemplo, un sacárido como la pentosa. Teniendo en cuenta también que muchos procesos metabólicos que tienen lugar en las células se producen a través de procesos de activación mediante señales que reciben receptores específicos, nos encontramos con un grupo de 254 Capítulo VI compuestos con una gran capacidad para ser usados como receptores superficiales de membrana o como canales de iones,26 ya que cumplen los siguientes requisitos: 1. El receptor es capaz de reconocer una señal del medio. 2. El receptor es capaz de modificar su afinidad a un determinado compuesto en función de la señal anterior. Este tipo de moléculas pueden actuar como canales catiónicos para Na+ o K+, bien en forma de molécula paraguas tetrao di-funcionalizadas.27,28 Una nueva aplicación de los derivados esteroides es su uso como sensores cuantitativos de cationes en disolución. Estas moléculas combinan un grupo fluoróforo (pireno) y un grupo receptor de cationes como un éter corona (figura VI.11).29 El par de electrones no enlazante del nitrógeno de la sonda catiónica actúa de desactivador del grupo fluoróforo. Pero en presencia de iones potasio, ese par de electrones se ve comprometido con el catión con lo que la fluorescencia se ve aumentada, mediante un mecanismo de transferencia electrónica fotoinducida. Estos sensores de iones potasio tienen un buen rendimiento en disolventes orgánicos, mientras que para mejorar sus características de sensor en medio acuoso necesitan ser fijados a una resina.30 O R O O O O O O N O O O R O O O O O O N O O K + h ν K + O R O O O O O O N O O O R O O O O O O N O O K + h ν K + Figura VI.11.- Mecanismo de transferencia electrónica fotoinducida (PET) mediante ión potasio de un derivado del ácido quenodesoxicólico. Por dendrímero se entiende una estructura molecular monodispersa de tipo globular y altamente ramificadas. Hay ejemplos de moléculas generadas a partir de sales biliares tipo oligómeros, trímeros y tetrámeros cuya estructura recuerda a un núcleo dendrítico, pero no son dendrímeros reales debido a su bajo nivel de 255 Capítulo VI ramificación (figura VI.12). Para poder considerar una molécula como dendrímero debe poseer tres regiones diferenciadas: un núcleo, las ramificaciones y los grupos finales. Existen dos tipos de rutas sintéticas que se usan para la generación de dendrímeros; una ruta divergente, en la que los monómeros se van añadiendo sucesivamente en diferentes capas o generaciones y, una ruta convergente donde las ramificaciones, llamadas dendrones, se crean de manera aislada y después se ensamblan al núcleo central obteniendo un dendrón con las generaciones deseadas. O O HN O HN OHN HO OH O HO HO HO O HO OH OH OOH HO OH O OH NH Figura VI.12.- Enhsen et al31. sintetizaron tetrámeros basados en el ácido cólico. Estos compuestos fueron diseñados como agentes p ara disminuir la concentración de colesterol en sangre. Debido a su biocompatibilidad estas bases dendríticas formadas por derivados de ácidos biliares tienen potenciales aplicaciones como transportadores de medicamentos. Maitra et al32 publicaron la síntesis de una base dendrítica usando las sales biliares en el año 1999. Se trata de un dendrón de segunda generación en la que el núcleo está formado por ácido desoxicólico y las ramificaciones son de ácido cólico (véase la figura VI.13). Con un dendrímero de estas características se obtienen estructuras micelares en todo el intervalo de concentraciones, en realidad, generan lo que se denomina micelas unimoleculares. Los dendrímeros podrán adoptar una conformación u otra dependiendo de la polaridad del medio33 como sucede con las moléculas paraguas. Otra clase de dendrones son los sintetizados por el grupo de investigación de Ropponen et al,34 quienes han sintetizado dendrones de primera y segunda generación (figura VI.14), con una estructura muy semejante a la que presentan dendrímeros convencionales.35 Victor H. Soto36 ha sintetizado dendrímeros similares utilizando puentes amida para acoplar las distintas unidades. Todos estos 256 Capítulo VI esteroides diméricos y oligoméricos están creando un campo emergente y prometedor en el campo de la arquitectura e ingeniería molecular. O OO O O OAc OAc OAc O OAc OAc OAc O AcO AcO AcO O O O O O OAc OAc OAc OOAc OAc OAc O OAc OAc OAc O O O O Molécula apolar Molécula apolar Medio polar Molécula polar Molécula polar Medio apolar Figura VI.13.- Base dendrítica sintetizada por Maitra et al.32 Representación del modelo de inclusión de diferentes compuestos en función del medio. (a) OH O O OH O O O OR (b) OH OO OH O OOH O O OH O O O OO O O O R R: H, Tolueno Figura VI.14.- (a) Dendrón de primera generación. (b) Dendrón de segunda generación, sintetizados por Ropponen et al.35 257 Capítulo VI VI.2.- NUEVOS SURFACTANTES DIMÉRICOS: d-2C3-AEDT y d-2DC3AEDT En este apartado describimos la síntesis de un nuevo tipo de dímero de sal biliar (figura VI.15). Se trata de una molécula híbrida entre un surfactante gemini (los monómeros se unen mediante un puente a través de las posiciones polares de los mismos) y un surfactante dimérico tipo “bolaform” (dímero constituido por la unión de los monómeros mediante un puente ligado a las posiciones apolares de la molécula). Puente Puente AEDT GÉMINI GÉMINI DÍMERO DÍMERO + + Nueva clase Nueva clase de de surfactante surfactante PuentePuente PuentePuente AEDTAEDT GÉMINI GÉMINI DÍMERO DÍMERO + + Nueva clase Nueva clase de de surfactante surfactante Figura VI.15.- Esquema de la nueva clase de dímeros de sales biliares. La síntesis de estos nuevos derivados se ha realizado mediante la activación de los ácidos carboxílicos del puente, en este caso el AEDT, mediante el agente DEPC. Este reactivo produce un anhídrido mixto de fósforo y carbono con el ácido carboxílico que es capaz de reaccionar de forma regioselectiva con aminas para la generación de enlaces amida. El procedimiento experimental puede verse en el apéndice A, y el esquema de reacción aparece en la figura VI.16. La estructura de estos dímeros recuerda a la del tetrámero presentado en la figura VI.12. La arquitectura de estas moléculas es muy novedosa ya que presentan cuatro cabezas polares: dos grupos iónicos que forman parte del puente y otros dos 258 Capítulo VI grupos polares de la sal biliar (cadena lateral en posición 17) que le debería conferir una mayor solubilidad en agua. Además, se conserva la peculiar estructura tridimensional de los grupos esteroides con lo que podría actuar como agente reductor de colesterol en sangre. N N O O OO O O O OOH NH O OOH N H Na Na Na Na O O OH N O O N O OHO O OH O 1) DEPC / NEt3 / DMF 2) NaOH/agua y acetona Y=-OH--------- 3β -aminocolato de metilo Y=-H----------- 3-β-aminodesoxicolato de metilo Y Y Y H2N AEDTAEDTAEDTAEDTAEDTAEDTAEDT N N O O OO O O O OOH NH O OOH N H Na Na Na Na O O OH N O O N O OHO O OH O 1) DEPC / NEt3 / DMF 2) NaOH/agua y acetona Y=-OH--------- 3β -aminocolato de metilo Y=-H----------- 3-β-aminodesoxicolato de metilo Y Y Y H2N AEDTAEDTAEDTAEDTAEDTAEDTAEDT Figura VI.16.- Ruta sintética de los dímeros d-2C3-AEDT y d-2DC3-AEDT. Determinación de la cmc de los dímeros d-2DC3-AEDT y d-2C3-AEDT por tensión superficial y fluorescencia La determinación de la cmc para estos dos surfactantes se ha realizado mediante medidas de tensión superficial, γ (mN m-1), y a través de medidas de fluorescencia utilizando como sonda fluorescente el pireno. Al diluir una disolución de tensioactivo, la tensión superficial aumenta hasta alcanzar el valor de la tensión superficial del disolvente. Este incremento no se produce de forma lineal, sino que puede sufrir ciertos cambios que dependen de las etapas de agregación que se producen dentro de la disolución al variar la concentración de surfactante (ver apéndice B). El valor de la tensión superficial nos da idea del estado en el que se encuentran las moléculas de tensioactivo, en forma de monómero, o formando diferentes tipos de agregados. En la figura VI.17 se pueden ver las gráficas γ-LnC para los dos dímeros estudiados en este capítulo. La ausencia de mínimos en estas curvas evidencia la ausencia de impurezas superficialmente activas en las disoluciones utilizadas, hecho previsible debido al elaborado procedimiento de síntesis y purificación realizado hasta la obtención del producto final tal y como se indica en las técnicas de síntesis y caracterización que se muestran en el apéndice A. Es interesante hacer notar que la curva γ-LnC para el d-2C3-AEDT muestra una zona que se podría llamar de preagregación. Los valores obtenidos para la cmc de ambos dímeros son muy similares a los de la sal biliar de partida, siendo para el desoxicolato sódico 10 mM37 y 6,74 259 Capítulo VI mM para el dímero d-2DC3-AEDT. Igualmente para el colato sódico38 la cmc alcanza valores en torno a 15-20 mM mientras que para el dímero d-2C3-AEDT el valor es 19,62 mM (tabla VI.2). Sin embargo, si se compara la cmc del monómero colato-3-amino succinato de sodio (ver capítulo III), que posee la misma relación carga:núcleo esteroide que los dos dímeros aquí sintetizados, tiene lugar una reducción considerable en el valor de la cmc del dímero. La molécula de colato-3amino succinato de sodio tiene dos cargas negativas en los dos extremos flexibles de la molécula, además de la cara α hidrofílica del núcleo esteroide. Por lo tanto, comparativamente, la molécula presenta una superficie hidrófila mayor que el área hidrófoba que el ácido biliar de partida, lo que conduce a una mayor solubilidad en disolución acuosa y a una menor tendencia a la agregación. -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 45 50 55 60 65 70 cmc=6,74mM γ / mN·m-1 LnC / M d-2DC3-AEDT en agua -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 cmc=19,62mM γ / mN·m-1 LnC / M d-2C3-AEDT en agua cmcp=3,36mM (a) (b) Figura VI.17.- Gráficas γ-LnC para el d-2DC3-AEDT (a) y el d-2C3-AEDT (b) en agua (T=25,0±0,5ºC). Tabla VI.2.- Datos experimentales obtenidos desde la curva γ-LnC. Experiencias realizadas a T=25,0±0,5ºC. aNúmero de puntos experimentales; bmol·m-2; cÅ2·molécula-1; dmM, emN·m-1. Tensión superficial en la cmc. dímero Na107·Г1ba1ccmcp dГ2ba2ccmcdγcmce d-2DC3-AEDT 22 5,63 295 6,74 47,3 d-2C3-AEDT 23 5,53 300 3,36 2,68 620 19,62 51,5 260 Capítulo VI Las curvas de tensión superficial fueron realizadas en disolución acuosa sin ningún tipo de electrolito añadido y al pH natural de la disolución, en torno a 9,5. En la tabla VI.2 aparecen los resultados de exceso superficial (Г), área superficial por molécula (a) y el valor de concentración micelar crítica (cmc). Para el cálculo, se ha tenido en cuenta el valor del número de especies posibles en la interfase de n=5 para el que se han realizado las siguientes aproximaciones: (i) no formación de pares iónicos y, (ii) los nitrógenos centrales del puente AEDT no se encuentran protonados al pH de la disolución (pKa1=3,6-4,2 y pKa2=7,1-8,1).39 Previamente, se realizó una estimación del área de las moléculas utilizando modelos moleculares de los dímeros en diferentes posiciones en la interfase aireagua (figura VI.18). Así, para una disposición apical se obtuvo un área estimada por molécula aproximada de 32 Å2, para una disposición en V, un valor de 95 Å2 y por último, para una posición totalmente estirada resultó de 337 Å2 (figura VI.18). Teniendo en cuenta los resultados de la tabla VI.2, se podría predecir que las moléculas de los nuevos derivados estarían muy cerca de una disposición completamente estirada en la interfase aire-agua. Estos valores concuerdan con los de las sales biliares convencionales recogidos en la bibliografía (vide supra).40,41 En el trabajo de Carnero-Ruíz et al42 los valores reales de la cmc de un surfactante a partir del análisis Boltzmann de las curvas que representan la intensidad de las bandas de vibración 1 y 3 del pireno (I1/I3) frente al LnC son: si |x0/ ∆ X|<10, se debería considerar como cmcreal el valor de cmc2 (ver figura V.10 del capítulo V) mientras que si |x0/ ∆ X|>10 se tomaría como correcto el valor de x0 o punto de inflexión de la curva. Si se tiene en cuenta este supuesto, para ambos dímeros se tendría que considerar el valor cmc2 (véase la tabla VI.3), valores comprendidos en todas las experiencias realizadas en el intervalo 21-44 mM para el dímero del desoxicolato y entre 48-53 mM para el dímero del colato. En este caso, esta hipótesis no parece la más adecuada para los dos dímeros, ya que al comparar los datos de cmc obtenidos mediante fluorescencia con los resultados experimentales de las medidas de tensión superficial, son los valores de cmc obtenidos a partir del punto de inflexión de la curva de fluorescencia los que muestran unos valores casi idénticos. Si tomamos como valor de cmc real el que se calcula a partir del punto de corte de las dos rectas a mayor concentración, el resultado que proporcionan las dos técnicas es muy dispar, siendo un orden mayor el valor obtenido por fluorescencia. 261 Capítulo VI d-2DC3-AEDT y d-2C3-AEDT, respectivamente. Mientras el primero está dentro del intervalo de temperaturas experimental observado, el segundo no, y además los valores son considerablemente mayores que los obtenidos para las sales biliares clásicas. Los valores entálpicos son de ∆H∗m=-9,42 kJ·mol-1 para el d-2DC3-AEDT y de ∆H∗m=-8,07 kJ·mol-1 para el d-2C3-AEDT, inferiores a los de las sales biliares de partida (véase la figura V.55 del capítulo V). Caracterización estructural de los agregados en disolución de los dímeros d-2DC3-AEDT y d-2C3-AEDT por medidas de Light Scattering Para estos dos nuevos dímeros, se han realizado medidas de Light Scattering en modo estático (SLS) y dinámico (DLS) con el fin de analizar el tamaño de los agregados a que dan lugar en disolución acuosa. Del mismo modo que para las sales biliares naturales, se asume que la disolución es isótropa y que las dimensiones de los agregados hacen que el factor de luz dispersada sea S(q)=1. El método de preparación de cada muestra ha sido el seguido en el capítulo III. Se prepararon varias muestras de diferente concentración de los dos dímeros a fuerza iónica constante, y variando la fuerza iónica con cloruro sódico. Posteriormente cada una de las muestras fue filtrada y medida en el menor tiempo posible desde su preparación. Cada una de las muestras fue filtrada con filtros de Øporo=100 nm para evitar la presencia de partículas no deseadas, como por ejemplo polvo, que conducirían a un resultado erróneo. Las muestras se siguieron con el tiempo, obteniéndose resultados idénticos. En las tablas VI.5 y VI.6 se resumen los resultados experimentales obtenidos a partir de las medidas de Light Scattering en modo dinámico y estático para los nuevos dímeros. Para el dímero del desoxicolato, d-2DC3-AEDT, a fuerza iónica constante, la relación I90 disminuye proporcionalmente a medida que las muestras se diluyen mientras que el tamaño hidrodinámico del agregado en disolución no varía sustancialmente (véase la tabla VI.5). A partir del valor de cmc del d-2DC3-AEDT, 6,74 mM, se puede calcular la concentración de monómeros en disolución que nos permitirá a su vez determinar la masa molecular aparente, así como el número de agregación. A medida que la concentración de tensioactivo disminuye, la masa aparente y el número de agregación aumentan a las fuerzas iónicas de trabajo, aumento que en este caso no afecta al tamaño. Se asume que la cmc no cambia de manera significativa con la fuerza iónica. Tal y como se indica en la tabla VI.5, el Dh90 sufre un ligero 268 Capítulo VI aumento con la fuerza iónica y apenas varía con la concentración del surfactante. Este aumento que se observa en la tabla podría ser ficticio y deberse a las interacciones intermicelares, como ya se explicó en el capítulo III. El diámetro hidrodinámico se encuentra en un intervalo comprendido entre 2,7-3,7 nm que nos indica la formación de agregados micelares típicos de sales biliares con un número de agregación que oscila entre 3 y 7 unidades de dímero. Tabla VI.5.- Resultados experimentales de las medidas QELS y SLS realizadas para el d-2DC3-AEDT a 25ºC y diferente fuerza iónica. aNaCl; bDh90=diámetro hidrodinámico medido a θ=90º; cσ=polidispersidad; dI90=I*Sen(θ=90º)muestra/I*Sen(θ=90º)decalina; eMap=∆R/KCMA (∆R=[(I90, muestra-I90, tampónb/c)/I90, tolueno]*Rtolueno, K=[(4π2n02)/(NAλ4)]*(dn/dc)2, CMA=CT-cmc), fn=Map/PM (n=número de agregación). C/ mM aF.I./ mM bDh90/ nm cσ dI90 eMap/ g·mol-1 fn 28,4 200 2,7 0,33 5,51 3582 3,2 30,6 600 3,2 0,30 8,36 6684 5,9 30,8 1000 3,5 0,19 10,89 8770 7,8 106,1 1000 3,7 0,16 22,29 4450 4,0 78,32 1000 3,6 0,19 19,78 5464 4,8 55,77 1000 3,5 0,17 17,92 7206 6,4 40,48 1000 3,5 0,15 13,60 7889 7,0 29,72 1000 3,5 0,18 10,92 9202 8,2 105,0 600 3,0 0,14 13,80 2747 2,4 65,3 600 3,1 0,20 11,70 3885 3,4 47,7 600 3,0 0,22 9,50 4464 4,0 31,0 600 3,0 0,22 6,84 5303 4,7 En la tabla VI.6 se pueden observar los datos obtenidos para el caso del dímero del colato, d-2C3-AEDT. El comportamiento es similar al del derivado del 269 Capítulo VI desoxicolato, tanto si se varía la fuerza iónica como la concentración. El tamaño de los agregados de ambos dímeros es prácticamente igual. Tabla VI.6.- Resultados experimentales de las medidas QELS y SLS realizadas para el d-2C3-AEDT a 25ºC y diferente fuerza iónica. (a-b-c-d-e-f)Véanse notas en la tabla VI.5. C/ mM aF.I./ mM bDh90/ nm cσ dI90 eMap/ g·mol-1 fn 52,9 300 3,2 0,29 5,02 2679 2,3 52,5 1000 3,5 0,18 7,11 3969 3,4 52,4 2000 3,9 0,16 12,31 7110 6,1 99,2 600 3,0 0,31 7,83 1817 1,6 63,0 600 3,0 0,22 6,51 2736 2,4 45,8 600 3,0 0,26 5,05 3426 3,0 29,3 600 3,1 0,25 3,81 6732 5,8 100,5 1000 9,57 2213 1,9 63,3 1000 7,40 3116 2,7 46,1 1000 6,06 4136 3,6 34,8 1000 5,04 5883 5,1 27,0 1000 3,84 8983 7,8 Este tipo de comportamiento es el típico para las micelas de sales biliares clásicas,51 como en el caso del desoxicolato sódico que, por encima de un valor comprendido entre 24 y 48 mM, donde las micelas adquieren un mayor tamaño, el segundo y órdenes mayores del coeficiente del virial empiezan a ser notables. Asumiendo la formación de micelas como un modelo paso a paso en el que el número de agregación crece en función de la concentración, este aumento puede ser debido a dos efectos: las interacciones intermicelares y, un cambio en el tamaño micelar real. A la vista de los resultados obtenidos, el segundo efecto no tiene lugar en nuestro caso, siendo las interacciones intermicelares las que contribuyen al 270 Capítulo VI “falso” aumento en el número de agregación. En la figura VI.22 se representan los gráficos 1/Map vs CT de tensioactivo a diferentes fuerzas iónicas. El cálculo del diámetro hidrodinámico se hace a través del coeficiente de difusión asumiendo el modelo de movimiento browniano. Aquí entran en juego el propio tamaño micelar y las interacciones entre partículas. En las disoluciones micelares, la polidispersidad puede complicar el análisis de estos coeficientes de difusión y, además, existen dos tipos de interacciones entre las partículas sometidas a movimiento browniano: interacciones hidrodinámicas transmitidas a través del disolvente, que dependen de la fricción de la disolución, y las interacciones directas de Debye-Hückel de largo alcance y al potencial de van der Waals. Para valores bajos de fuerza iónica el término que prevalece es el término repulsivo de Debye-Hückel ya que al aumentar la concentración de electrolito se apantalla cada vez más.52 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,00008 0,00012 0,00016 0,00020 0,00024 0,00028 0,00032 0,00036 0,00040 1/Map / g·mol-1 CT/g·mL-1 F.I. = 600mM F.I. = 1000mM 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,0001 0,0002 0,0003 0,0004 0,0005 0,0006 1/Map CT/g·mL-1 F.I. = 600 mM F.I. = 1000 mM (a) (b) Figura VI.22.- Dependencia del inverso del peso molecular aparente (determinado por difusión de luz estática) con la concentración de (a) d-2DC3-AEDT y (b) d-2C3-AEDT a diferentes concentraciones de NaCl y a 25,0±0,2ºC. En ambos casos la presencia de una mayor concentración de electrolito provoca un cambio en la pendiente. Esto no excluye la posibilidad de un crecimiento micelar con la concentración, sino sólo una disminución del mismo. 271 Capítulo VI Esto es lo mismo que se obtiene para las sales biliares naturales, véase la figura VI.23. 1/M ap *10 4 (mol/g) 1 2 3 4 5 0 51015 253020 C-CMC (g/L) [NaCl]=0,03M [NaCl]=0,05M [NaCl]=0,075M [NaCl]=0,1M [NaCl]=0,2M [NaCl]=0,5M 0 1/M ap *10 4 (mol/g) 1 2 3 4 5 0 51015 2530020 C-CMC (g/L) [NaCl]=0,03M [NaCl]=0,05M [NaCl]=0,075M [NaCl]=0,1M [NaCl]=0,2M [NaCl]=0,5M Figura VI.23.- Inversa de la masa molecular aparente de las micelas de NaGDC en disolución acuosa a diferentes fuerzas iónicas a 25ºC. Las líneas sólidas representan un ajuste simple de segundo orden. La línea de puntos es una simple conexión de guía visual.52 BIBLIOGRAFÍA 1. McKenna, J.; McKenna, J. M.; Thornthwaite, D. W. J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1977, 809-11. 2. Li, Y.; Dias, J. R. Chem. Rev. 1997, 97, 283-304. 3. Hsieh, H.-P.; Muller, J. G.; Burrows, C. J. J. Am.Chem. 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La sección aromática del huésped, a su vez, se introduce en la cavidad de la α-CD permitiendo que el polímero se caracterice por la alternancia de la α-CD y la β-CD (figura VII.8).40 Recientemente, se han publicado una serie de polímeros lineales del tipo (ii). En primer lugar, debemos citar el trabajo pionero en el que se aportaron Capítulo VII 285 evidencias inequívocas de la formación de un polímero lineal entre el desoxicolato sódico (huésped ditópico) y un dímero de ciclodextrina (figura VII.9).2 Este ha sido ampliado a diversos dímeros de ciclodextrina, habiendo analizado la influencia de factores estéricos y electrostáticos sobre la formación de este tipo de polímeros.10 En estos ejemplos, la molécula huésped utilizada no muestra una ditopicidad asimétrica muy acusada, por lo que es de esperar que la utilización de moléculas huésped ditópicas más adecuadas, permita la obtención de polímeros supramoleculares más rígidos, estables, etc.23 H NN H O O NH NH H N H NN H O O H NN H O O H NN H O O NH NH H N NH NH H N H N O H N O O H NO O H N O H N O H N O O H N O H N O O H N O H N O O H NO O H N O H NO O H N O Figura VII.8.- Polímero supramolecular generado con derivados de α y β-CD.40 HO O O NH HN CO 2HO HO O O NH HN CO 2HO O O NH HN HO O O NH HN CO 2HO HO O O NH HN CO 2HO O O NH HN Figura VII.9.- Primer polímero supramolecular lineal publicado por Parrilla et al.2 Capítulo VII 286 Liu et al17 han preparado un polímero supramolecular que puede ser considerado del mismo género que el anterior. En este caso el huésped ditópico es un fullereno (figura VII.10). La estructura es de interés en aplicaciones biológicas y químicas pues posee una moderada solubilidad en agua y un efecto de ruptura del ADN bajo la irradiación de luz. El complejo fue generado en una mezcla de tolueno/DMF v/v = 4:6 con un rendimiento del 4% y caracterizado por RMN, TEM, y STM. Figura VII.10.- Polímero supramolecular formado por un dímero de ciclodextrina con un centro metálico y un fullereno.17 Otro de los derivados obtenidos por Liu et al11 se ilustra en la figura VII.11. En este trabajo, son de destacar las imágenes SEM que rubricaron los datos obtenidos con otras técnicas. Efectivamente, se observa que la morfología de las superficies obtenidas para el dímero de ciclodextrina y el huésped es irregular, mientras que el polímero muestra una superficie regular consistente en macropilares cuadrados. Las medidas de TEM sirvieron para determinar la forma lineal y el tamaño del polímero que se estimó entre 400 y 900 nm. Figura VII.11.- Polímero supramolecular obtenido a partir de un dímero de ciclodextrina con un centro de selenio y un dímero huésped basado en un calixareno.11 Capítulo VII 287 Muy recientemente, Harada et al41 han preparado dos polímeros de carácter lineal con dímeros de ciclodextrina y dímeros de adamantano flexibles y rígidos. En la figura VII.12 se pueden ver los dos primeros ejemplos, en los que se emplea inicialmente un dímero de ciclodextrina rígido y dos sondas, una flexible con la que se produce una estructura supramolecular cíclica, y otra rígida, que produce una especie lineal similar a las de Liu et al. Tanto las estructuras de los compuestos como las de los polímeros fueron caracterizadas por RMN. Las masas de los polímeros se obtuvieron por osmometría de presión de vapor. N HN H OO N O N[CH 2 ] n O Br Br N HN H OO N HN H OO N O N[CH 2 ] n O Br Br Figura VII.12.- Polímero supramolecular obtenido muy recientemente por Harada et al41 a partir de un dímero de ciclodextrina con puente rígido y dos dímeros de adamantano. Estos mismos autores,24 al utilizar polietilenglicol como puente en los huéspedes ditópicos (de adamantano) y dímeros de ciclodextrina observaron una estructura supramolecular menos soluble en agua que los casos anteriores. El ensamblaje fue caracterizado mediante osmometría de presión de vapor y especialmente por RMN, técnica por la cual obtuvieron la constante cinética del proceso de complejación y los coeficientes de difusión de las especies. En contraste con las descripciones anteriores referidas a polímeros supramoleculares lineales, no hemos encontrado más que dos publicaciones, nacidas en nuestro grupo de investigación,30,42 que hagan referencia a la formación de estructuras ramificadas del tipo Árbol de Cayley. Como ya hemos mencionado, la estructura dendrímera se produjo al complejar desoxicolato sódico30 o un dímero de adamantano42 con un trímero derivado de β-CD (figura VII.13). Las imágenes SEM muestran una morfología acorde con la disposición dendrítica de la superestructura. Capítulo VII 288 O OH HO OH O O OH HO OH O O OH OH N H O O OH OH HO O O OH OH HO O OOH OH HO O O OH HO HO O O OH HO OH O O OH HO OH O O OH OH OH O O OH OH OH O O OH OH HO O O OH OH HN O OOH HO HO O O OH HO NH O O OH HO OH O O OH HO OH O O OH OH OH O O OH OH HO O O OH OH HO O OOH HO HO O O O O O O HO OH Na Figura VII.13.- Polímero supramolecular de tipo Árbol de Cayley.30 La mayoría de complejos de ciclodextrina obedecen a condiciones de intercambio rápido dentro de la escala de tiempos de RMN. Bajo estas circunstancias, las señales químicas que se observan son un promedio de las señales químicas en ambos estados, libre y complejado, permitiendo la determinación de las constantes de equilibrio en la formación del complejo si se varía la relación de concentración anfitrión/huésped.43,44 Sin embargo, cuando el fenómeno de la complejación tiene una velocidad de intercambio lenta comparada con la escala de tiempos RMN, las señales del anfitrión y del huésped libres y en el complejo aparecen a diferentes desplazamientos químicos. Hasta el momento se conocen muy pocos complejos intermoleculares de ciclodextrina que obedecen a una situación de intercambio lento.45,46 Para estudiar este fenómeno, se modificó la β-CD insertándole una cadena flexible de 6 carbonos y un grupo amina en el extremo en la posición 6.47 La colocación de esta cadena puede conducir a dos procesos de inclusión diferentes: a) si las interacciones intermoleculares son las dominantes, la ciclodextrina modificada puede formar entidades supramoleculares dirigiendo a la formación de un polímero supramolecular;19,22-27,30-39,48,49b) mientras que si las interacciones intramoleculares son las que predominan, la autoinclusión de la cadena hidrófoba hacia el interior de la cavidad de la ciclodextrina origina un complejo de inclusión intramolecular. Este fenómeno se conoce como isomerismo “in-out”.50 Este tipo de complejos tienen importantes aplicaciones ya que si el grupo en el extremo de la cadena es un fluoróforo, podrían usarse como sensores químicos.51,52 Ambos Capítulo VII 289 fenómenos, inter/intra, compiten entre sí, y uno de ellos prácticamente no tendrá lugar si el otro se ve favorecido. El intercambio lento es ideal para la determinación del equilibrio intramolecular entre los dos confórmeros puesto que las señales químicas (y otros parámetros RMN) de los núcleos en ambos estados, libre y complejado, se determinan individualmente en el mismo espectro RMN.53,54 En disolución acuosa, el equilibrio entre los dos confórmeros es un compromiso entre las interacciones del grupo unido a la cadena lateral con el ambiente hidrófobo que existe en el interior de la cavidad de la ciclodextrina y el ambiente hidrófilo que existe fuera. En consecuencia, una modificación fuerte de la polaridad del grupo de esta cadena tendría un elevado efecto en el isomerismo “inout”, incluso pudiendo eliminarlo. Para estudiar esta hipótesis, se sintetizó y purificó el 6-(6-aminohexanamido)-6-desoxi)-β-CD (de aquí en adelante lo nombraremos como P5). Se ha elegido este derivado debido a que su naturaleza hidrofóba/hidrófila se puede modificar fácilmente mediante cambios en el pH de la disolución. De modo que, las especies de amina no protonadas, menos hidrófilas, podrían residir en el interior de la cavidad de la ciclodextrina, mientras que si se encuentran protonadas tenderán hacia su exterior por encontrarse en un medio más polar. Esto es, un simple sistema dentro-fuera en el que su posición depende del pH y puede ser muy útil para la comprensión y diseño de otros complejos moleculares. El P5 fue sintetizado siguiendo la ruta sintética que se muestra en la figura VII.14 y fue puesta a punto por Carrazana y Gancedo47 en el grupo de investigación donde se desarrolló el presente trabajo. Los procedimientos pueden verse en la memoria del proyecto “Fin de Carrera de Gancedo”. En el estudio de asociación intramolecular del P5 por RMN, es importante tener en cuenta que el grupo amino de la β-CD sustituida en posición 6 estará cargado positivamente a pH ácido y en forma neutra a pH básico. Por ello se estudiaron los espectros de RMN de esta especie a una concentración de 10 mM y a dos valores de pH: 5,93 y 11,10. Las disoluciones fueron preparadas en tampón deuterado de fosfato y de carbonato a una fuerza iónica 0,2 M y se resolvieron los espectros monodimensionales, 1H, 13C, y bidimensionales, 1H-1H COSY y correlación heteronuclear 1H-13C. Capítulo VII 290 HO NH2 O HO NH O F FF O ONH O F FF O N O O F O FF A NOH O O B Pr1 Pr2 Pr3 ß-CD OS O ONH2 ß-CDTos ß-CDNH2+ N H H N O O F FF N H NH2 OP5 P4 Desprotección del grupo amino Figura VII.14.- Etapas de la ruta sintética del P5. Espectro mono y bidimensional de 1H a pH 5,93 La asignación se hizo a partir del experimento 1H-1H COSY a pH 5,93 (figuras VII.15 y VII.16), en el que se parte de la señal H-a, que aparece claramente separada de las demás señales a un desplazamiento similar al teórico, 2,09 ppm. La única interacción que muestra es una señal cruzada a un desplazamiento de 1,41 ppm con los protones H-b. La existencia de una señal cruzada única indica que tanto los dos protones situados en el carbono C-a como los del carbono C-b son equivalentes y aparecen al mismo desplazamiento químico. Si esto no fuera así, tendríamos que observar como mínimo tres señales (interacciones a1-a2, a1-b1 y a1-b2), que en este caso no existen. Del mismo modo, los protones H-b interaccionan con una única señal a δ1,20 ppm correspondiendo a los dos protones equivalentes H-c, y éstos muestran otra señal única a un δ1,49 ppm (protones equivalentes H-d), que correlacionan con los protones H-e a δ2,78 ppm también Capítulo VII 291 equivalentes entre sí. Cada una de estas señales integra por 2 confirmando la equivalencia de los protones situados en el mismo carbono. Se realizó la asignación del fragmento de las glucosas correspondientes a la β-CD siguiendo un procedimiento semejante. En este caso el punto de partida son los protones H-1 y H-1´ que aparecen a campos más bajos que el resto (la prima indica la unidad de glucosa sustituida). Como resultado de la resolución de los dos espectros de 1H mono y bidimensionales que se muestran en las figuras VII.15 y VII.16 se obtiene que: • Los seis H-1 y el H-1´ aparecen como un doblete a δ4,89 ppm que integra por siete. • Los seis H-2 y el H-2´ aparecen como un doblete de dobletes a δ3,45 ppm. • Los seis H-3 aparecen a δ3,77 y el H-3´a 3,75 ppm como un doblete de dobletes. • La señal correspondiente a los seis protones H-4 aparece como un triplete a 3,39 ppm y la señal del H-4´ aparece a campo más alto a 3,25 ppm. • Los seis protones H-5 aparecen a dos desplazamientos diferentes, 3,62 y 3,67 ppm, mientras que el H-5´ aparece a 3,70 ppm. • Y por último, los doce protones H-6 aparecen como una señal ancha a 3,69 ppm, mientras que los dos H-6´ aparecen a dos desplazamientos diferentes, 3,16 y 3,62 ppm. Capítulo VII 292 7.0033 27.003 13.005 2.0614 2.0375 2.0000 4.2324 2.0276 (ppm) 1.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.8 1 3 3´ 5´ 6 5 6´ 2´ 2 4 6´ 4´ e adb c 5 O NH HO OH O 7 O H2N a b c d e 6´ 4´ 3´ 2´ 1´ 5´ 7.0033 27.003 13.005 2.0614 2.0375 2.0000 4.2324 2.0276 (ppm) 1.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.8 1 3 3´ 5´ 6 5 6´ 2´ 2 4 6´ 4´ e adb c 5 O NH HO OH O 7 O H2N a b c d e 6´ 4´ 3´ 2´ 1´ 5´ O NH HO OH O 7 O H2N a b c d e 6´ 4´ 3´ 2´ 1´ 5´ (ppm) 3.323.363.403.443.483.523.563.603.643.683.723.763.803.84 33´ 5´ 5, 6´ 2 2´ 4 4 6 5 (ppm) 3.323.363.403.443.483.523.563.603.643.683.723.763.803.84 33´ 5´ 5, 6´ 2 2´ 4 4 6 5 33´ 5´ 5, 6´ 2 2´ 4 4 6 5 Figura VII.15.- Asignación detallada del espectro 1H-RMN para el P5 10 mM en D2O a pH 5,93, 750 MHz. (La prima indica los hidrógenos de la unidad de glucosa sustituida). Capítulo VII 293 (a) (b) Figura VII.16.- (a) Espectro Cosy 1H-1H para el P5 10 mM en D2O a pH 5,93 de la unidad β-CD, 750 MHz; (b) espectro Cosy 1H-1H para el P5 10 mM en D2O a pH 5,93 de la parte de la cadena lateral en la posición seis de la β-CD, 750 MHz. Espectro mono y bidimensional de 1H a pH 11,10 El espectro monodimensional de 1H a pH 11,10 (figura VII.17) se resuelve siguiendo el mismo patrón que a pH ácido. El punto de partida para las señales de la cadena lateral (figura VII.17.b) es de nuevo la señal de los protones H-a, que aparecen a un desplazamiento similar al teórico de 2,06-2,08 ppm. Esta señal se encuentra menos definida en el 1H-1H COSY que a pH 5,93, y si se observa detalladamente, se puede distinguir que realmente es el cómputo de dos señales ligeramente separadas en lugar de una única señal. Una explicación podría ser que la cadena adopta a este valor de pH una determinada conformación espacial en la que los dos protones H-a dejan de ser equivalentes. Si éste fuera el caso, se debería observar una señal cruzada entre las señales de los dos H-a ya que éstos son protones geminales, y esta señal no existe. Sin embargo, cada una de las dos interacciones exclusivas de cada H-a (δ2,06 y δ2,08 ppm) tiene una única interacción con un H-b (δ1,38 y δ1,39 ppm, respectivamente) (figura VII.17), no existiendo interacción entre estos dos H-b. A partir de cada H-b se llega a un H-c (δ1,12 y δ 1,14 ppm), y de cada H-c se llega a un H-d (δ1,28 y δ1,40 ppm), y (ppm ) 2. 4 2. 0 1. 6 1. 2 2. 8 2. 4 2. 0 1. 6 1. 2 ( ppm a-b e-d b-cd-c e-c eadbc (ppm ) 2. 4 2. 0 1. 6 1. 2 2. 8 2. 4 2. 0 1. 6 1. 2 ( ppm a-b e-d b-cd-c e-c eadbc (ppm ) 2. 4 2. 0 1. 6 1. 2 2. 8 2. 4 2. 0 1. 6 1. 2 ( ppm a-b e-d b-cd-c e-c eadbc (ppm ) 2. 4 2. 0 1. 6 1. 2 2. 8 2. 4 2. 0 1. 6 1. 2 ( ppm a-b e-d b-cd-c e-c eadbc Capítulo VII 300 Tabla VII.2.- Composición en porcentaje calculada de las diferentes especies del P5 en disolución en el intervalo de pH 5,93-11,10 (pKa1=-155-57 y pKa2=10,53 obtenido experimentalmente). Composición de P5 en disolución/ % pH P5 P5H+ P5H22+ 5,93 3,3·10-3 100,0 1,2·10-5 7,83 0,3 99,7 1,5·10-7 9,29 7,1 92,9 4,8·10-9 9,74 17,6 82,4 1,5·10-9 9,98 27,1 72,9 7,6·10-10 10,08 31,9 68,1 5,7·10-10 10,13 34,4 65,6 4,9·10-10 11,10 83,0 17,0 1,3·10-11 Teniendo en cuenta la distribución de especies que se muestra en la tabla VII.2 se puede decir que, a pH ácido las moléculas de P5 en disolución están en un 100% en forma monoprotonada, con la cadena lateral libre y con libertad de movimiento y por tanto debería existir únicamente una especie en disolución. La existencia de dos glucosas con entornos diferentes se puede explicar ya que la cadena estaría moviéndose con libertad hacia el disolvente, afectando únicamente al entorno de las glucosas más próximas a la glucosa sustituida y diferenciándolas de las más alejadas, que tendrán un entorno casi idéntico al de una β-CD sin sustituir. Sin embargo, a pH básico la cadena se encuentra en un 83% en forma neutra e incluida en la cavidad, aunque existe un 17% de la especie en forma monoprotonada. Es decir, la cadena tiende a incluirse en el interior de la cavidad. Es ahora, cuando se encuentra en un ambiente más apolar y uniforme, de manera que todas las unidades de glucosa se ven afectadas prácticamente por igual por la cadena, de ahí que una de las interacciones H4-H5 disminuya en favor del aumento de la otra. Como ya se ha apuntado anteriormente existen dos posibilidades de inclusión de la cadena en el interior de la cavidad de la ciclodextrina. Una de ellas sería un proceso intramolecular que denominaremos autoasociación,42,62 y la otra posibilidad se daría entre distintas moléculas de manera que la cadena de una ciclodextrina se incluiría en otra molécula de ciclodextrina adyacente, formando un polímero supramolecular. El mejor modo de distinguir qué situación se da es obtener el peso molecular y el radio hidrodinámico del complejo a partir de medidas experimentales de luz dispersada (SLS y DLS). Los ensayos realizados de SLS generaron un peso molecular de 1,1×103 g·mol-1, muy cercano al valor del Capítulo VII 301 peso molecular del monómero. Análogamente, el radio hidrodinámico se determinó a partir de experimentos DLS, se obtuvo un valor de 1,05 nm y polidispersidad 0,29. Este valor es semejante al tamaño de una molécula de P5 (la altura de un cono de ciclodextrina es aproximadamente de 8 Å).63 Se demuestra así una asociación de tipo intramolecular o autoasociación. 4-5 4-5 4-5 4-5 4-5 4-5 4-5 4-5 pH ácido pH básico Figura VII.21.- Visión tridimensional de las dos interacciones H4-H5 que existen a pH 5,93 y 11,1. Cálculo de la constante del equilibrio La autoasociación de la cadena lateral, en este caso, es un proceso de intercambio lento y por ello a partir del análisis de las áreas de las señales de 1H se puede obtener la constante de inclusión. El cálculo se puede realizar porque las áreas de las señales de 1H son directamente proporcionales a la concentración de las especies en disolución, ya sea especie libre o autoasociada. El primer paso consistió en realizar una selección de las señales de los protones más apropiados para este análisis. Es necesario que las señales correspondientes a un mismo protón (asociado y libre) aparezcan suficientemente separadas en el espectro y, además, no deberían estar solapadas con otras señales. Las señales que cumplen estas características son las de los protones 6´, e y c. Cada una de ellas se desdobla en dos nuevas señales, 6´C, 6´L, eC, eL, cC, y cL, al aumentar el pH. Todas ellas se podrían utilizar para el cálculo de la constante de inclusión, aunque en algunas se produce una cierta superposición de otras señales que dificulta la integración normal brindada por los diferentes programas de análisis de Capítulo VII 302 espectros de RMN disponibles comercialmente. Para obtener valores fiables de áreas, se utilizó un programa realizado en “Mathcad Profesional 2001”, que ajusta la intensidad (IRMN)-ppm a una función compuesta por Lorentzianas que simula la zona del espectro que nos interesa mediante el método de Levenberg-Marquardt. Una vez se han obtenido los parámetros optimizables del ajuste de la función global, ésta se puede separar en funciones que describen cada una de las señales individuales, y que se integran por separado. Finalmente, para calcular la constante de asociación es necesario buscar una relación entre el área y la concentración del complejo (como referencia interna se toma un protón que da una señal aislada e inalterable durante todo el experimento). Se sabe que el área está directamente relacionada con la concentración inicial de nuestra ciclodextrina, y en nuestro caso, como protón de referencia se ha tomado la señal que en la figura VII.19 se designa como a (engloba aC y aL). La figura VII.22 recoge los equilibrios que pueden aparecer en la disolución. Este sistema de ecuaciones se puede simplificar al no existir evidencias de la especie P5CH+ (en la figura VII.19 no existen desplazamientos de las señales del P5 asociado) y se puede afirmar que el valor de pKa calculado mediante desplazamientos de RMN representa únicamente el equilibrio ácido-base del P5 libre. Se puede llegar fácilmente a las ecuaciones que relacionan la concentración con las áreas de las señales de P5 complejado y libre partiendo de las ecuaciones de la constante de acidez, balance de materia y de la constante de autoasociación: 5 5 L L PH aPH K ⎡ ⎤ ⎡⎤ ⎢ ⎥ ⎣⎦ ⎣ ⎦ ⎡⎤ ⎢⎥ ⎣⎦ + + = 5 5 C L P CP K ⎡ ⎤ ⎣ ⎦ ⎡ ⎤ ⎣ ⎦ = [VII.2] [ ] [ ] [ ] 0 55 55 L LC PPHPP + =++⎡⎤ ⎣⎦ [VII.3] Combinando las ecuaciones anteriores, y despejando la concentración de P5C en función de la concentración inicial de P5, de la concentración de protones y de las constantes, se obtiene: 0 5 1 5C H C Ka kP CK P⎡⎤ ⎢⎥ ⎣⎦ ⎡⎤ ⎢⎥ ⎣⎦ + ++ ⎡⎤ ⎣⎦ = [VII.4] La concentración de las diferentes especies se calcula usando el área de la señal de referencia (áreaa) que se define como: Capítulo VII 303 P5 L H + P5 C H + P5 L + P5 C + K a K C + H + K a´ + H + K C´ XX P5 L H + P5 C H + P5 L + P5 C + K a K C + H + K a´ + H + K C´ P5 L H + P5 C H + P5 L + P5 C + K a K C + H + K a´ + H + K C´ XX Figura VII.22.- Equilibrios del P5 en disolución. [P5LH+]=concentración de P5 libre protonado en su grupo amino terminal; [P5L]=concentración de P5 libre; [P5CH+]=concentración de P5 complejado protonado en su grupo amino terminal; [P5C]=concentración de P5 complejado; [P5]0=concentración de P5 total. [] [] 0 5 25 P ctecte P área aa a a== [VII.5] y sabiendo que la ecuación que define el área relativa de las señales de P5 autoasociado es función del área de la señal de referencia a, [ ] [] 0 5 5 P P cte área área relativaárea C global a C C== [VII.6] se obtiene la ecuación del área relativa de cada una de las señales del P5 complejado como una función de la concentración de protones y de Ka, pudiendo obtener así la constante de autoasociación, KC. [] 1++ =+ C a C globalC K K H K cterelativaárea [VII.7] Capítulo VII 304 [] ⎥ ⎥ ⎥ ⎥ ⎦ ⎤ ⎢ ⎢ ⎢ ⎢ ⎣ ⎡ ++ −= + 1 1 C a C globalL K K H K cterelativaárea [VII.8] La figura VII.23 muestra los valores de las áreas de las distintas señales en función del pH y los resultados del ajuste obteniéndose un valor para la KC que oscila entre 3,3±0,3 y 23,2±2,8 si se analiza el área de la molécula libre o autoasociada respectivamente. En estos ajustes se ha fijado el valor del parámetro Ka al valor determinado experimentalmente. El valor obtenido es similar a los valores obtenidos en disolución acuosa por Ikeda et al64 y Matsumura et al65 para derivados dansilo de la β-CD, a partir de medidas de fluorescencia. El tautomerismo dentro-fuera implica el movimiento de la cadena lateral hacia el interior de la ciclodextrina cuando el grupo amino terminal está en forma neutra. Este mecanismo es diferente de aquéllos que implican el giro (en un determinado ángulo) de la glucosa a la que está unido el grupo que actúa de huésped.53,66 El ejemplo más claro es el mecanismo citado por Yamada et al53,66 que obliga a la unidad de glucosa a realizar un giro de 360º. Este giro debería justificar la alta energía libre de activación (=81 kJ·mol-1) observada por Ellwoood et al,66 que provoca la velocidad de intercambio lento en la escala de tiempos de RMN. Los valores para las dos constantes cinéticas, k1 y k-1, fueron determinados por experimentos EXSY. Los valores obtenidos fueron 0,174 y 0,161 s-1, respectivamente (Kintra=k1/k-1=1,1) y por tanto corroboran el valor de la constante de asociación obtenida desde el análisis de las áreas de las señales de RMN. La alta barrera energética que origina unos valores bajos de las constantes cinéticas, puede deberse a la pérdida necesaria de moléculas de agua de hidratación del grupo amino antes de entrar en la cavidad. Este fenómeno de deshidratación podría explicar procesos similares de intercambio lento para otros sistemas que engloben ciclodextrinas.67 Capítulo VII 305 1E-12 1E-11 1E-10 1E-9 1E-8 1E-7 1E-6 1E-5 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 [H+] / M áreas libres eL cL 6'L Parámetro Valor Error ------------------------------------------------ K a 2,95·10 -11 0 K C 3,3 0,3 ------------------------------------------------ Chi 2 R 2 0,02017 0,94145 1E-12 1E-11 1E-10 1E-9 1E-8 1E-7 1E-6 1E-5 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 [H+] / M áreas complejadas eC cC 6'C Parámetro Valor Error ------------------------------------------------ K a 2,95·10 -11 0 K C 23,2 2,8 ------------------------------------------------ Chi 2 R 2 0,00202 0,9896 Figura VII.23.- Representación de los valores de las áreas de las señales e, c y 6´ del P5 libre y complejado en función de la concentración de protones en el medio. BIBLIOGRAFÍA 1. Szejtli, J. 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Resumamos otras conclusiones para cada gemini por separado: 8 g-2DC24-AEDT Este es el primer derivado de sal biliar del que se tiene constancia que da lugar a una transición vesícula-micela al aumentar la concentración. Se concluye que ello es debido a que en el intervalo de concentraciones previo a la cmc tiene lugar la incorporación de parte de la multicapa, generada en la interfase, al interior de la disolución, plegándose y dando lugar a vesículas espontáneas. Por medidas de dispersión de la luz dinámica se determinó el radio hidrodinámico de tales vesículas y mediante la dispersión de luz estática el radio de giro y la masa molecular. De esta última se deduce un número de agregación del orden de 6×104. El valor obtenido para el parámetro ρ = Rg/Rh es congruente con la formación de vesículas. A concentraciones elevadas tiene lugar la formación de micelas y, adicionalmente, se produce la disolución de las vesículas. El número de agregación de estas micelas es de 12 y su radio hidrodinámico Rh=2,5 nm. 8 g-2C24-AEDT El cambio de ácido biliar en la estructura del gemini produce un cambio drástico en el comportamiento de agregación. La característica de este gemini en disolución es la cinética de crecimiento de los agregados iniciales hasta la precipitación de los mismos, fenómeno debido a un proceso de coalescencia donde las fuerzas atractivas superan la elasticidad de la vesícula. El hecho de que el aislamiento de las micelas, de características similares a las del g-2DC24-AEDT, no implique un posterior crecimiento de las mismas, permite concluir que el crecimiento de los agregados está catalizado por las vesículas presentes en la disolución. 8 g-2DC24-PIR La introducción de un puente rígido piromielítico entre los dos residuos biliares da lugar a un comportamiento totalmente diferente a los anteriores. El gemini derivado del ácido desoxicólico da lugar a estructuras vesiculares con un tamaño en torno a los 100 nm a bajas concentraciones. El proceso es fundamentalmente entálpico. Los agregados iniciales se transforman en estructuras tipo “gusano” o cilíndricas que provocan un cambio en las propiedades reológicas Conclusiones 317 0,1mM 2mM 100 200mM de la disolución, aumentando la viscosidad de la misma, originando finalmente una mesofase nemática. Aunque algunas sales biliares forman cristales líquidos liotrópicos, la peculiaridad de este gemini está en que esta fase se obtiene a concentraciones muy inferiores y de un modo casi instantáneo. Por simplicidad de explicación, el esquema 1 recoge las distintas regiones del diagrama de fases. Los estudios de Rayos X a bajo ángulo (SAXS) indican un orden bajo en la mesofase, recogiendo el esquema 2 los datos derivados de tal estudio. Vesículas Agregados cilíndricos Agregados cilíndricos Disolución isotrópica Disolución Isotrópica GEL Mesofase nemática Obtención de fibras 25 25ºC ºC Vesículas 40 40ºC ºC 5-10mM - Obtención de fibras 25 25ºC ºC 40 40ºC ºC Vesículas Agregados cilíndricos Agregados cilíndricos 0,1mM 2mM 100 200mM Disolución isotrópica Disolución Isotrópica GEL Mesofase nemática Obtención de fibras 25 25ºC ºC Vesículas 40 40ºC ºC 5-10mM - Obtención de fibras 25 25ºC ºC 40 40ºC ºC Esquema 1.- Diagrama de fases básico para el g-2DC24-PIR. d d cc cc =108 =108- -113 113 Ǻ ǺR R g g =14 =14- -17,5 17,5 Ǻ Ǻ d d cc cc =108 =108- -113 113 Ǻ ǺR R g g =14 =14- -17,5 17,5 Ǻ Ǻ Esquema 2.- Resultados SAXS obtenidos para la disolución anisotrópica. Se ha observado la formación de esferulitas por parte de la di-imida del desoxicólico (que en reacciones sucesivas deriva en el gemini g-2DC24-PIR) en una mezcla MeOH/CHCl3. Conclusiones 318 8 g-2C24-PIR El cambio del residuo biliar, en relación al g-2DC24-PIR, conduce a un proceso de agregación diferente. En disoluciones de concentración por encima de la cmc, se observan agregados cilíndricos y no se detecta un cambio visual en el comportamiento reológico ni un cambio anisotrópico. La técnica de Microscopía Electrónica de Transmisión nos ha proporcionado imágenes donde se observaron agregados cilíndricos con un diámetro de 20-30 nm y una longitud de 180-240 nm. Por medidas de Light Scattering se determinó el número de agregación de ~3000 unidades de gemini. La agregación en disolución está controlada principalmente por el factor entálpico. Nuevos dímeros derivados del ácido cólico y desoxicólico Se sintetizaron dos nuevos dímeros cola-cola derivados del ácido 3β-cólico y 3β-desoxicólico. Estas moléculas se caracterizan por poseer doble carga respecto al número de unidades esteroide, localizadas en los extremos de cada sal biliar. Esta estructura viene siendo como un dímero del colato-3-amino succinato de sodio, puesto que también en su estructura existe una carga doble. La determinación de la cmc a distintas temperaturas ha permitido concluir que este tipo de dímeros presenta un modelo de agregación micelar en el que domina el efecto entálpico frente al entrópico, dominante en el proceso de agregación de las sales biliares naturales. El diámetro hidrodinámico de los agregados en disolución de los dos dímeros es similar al de las sales biliares de partida, ~3,2 nm. El dímero del desoxicólico presenta un número de agregación ligeramente superior al del derivado del cólico. Teniendo en cuenta la escala de polaridad del pireno, las nuevas micelas presentan un ambiente de polaridad semejante a las del colato y del desoxicolato, respectivamente. Si comparamos el d-2C3-AEDT con el colato-3-amino succinato de sodio, se observa un descenso considerable en el valor de cmc, no debiendo resultar extraño este fenómeno ya que el mismo ha sido observado en la dimerización de surfactantes convencionales. Otra peculiaridad de estos nuevos dímeros viene impuesta por el puente y los valores de pKa del mismo, dos unidades inferiores a los valores para ácidos carboxílicos como por ejemplo el ácido acético, esto nos lleva a pensar que puedan Conclusiones 319 presentar valores de cmpH bajos, favoreciendo su solubilidad a pH entre 5,5-7, valor de pH en el intestino delgado, lo que les otorga ciertas perspectivas biológicas. Isomerismo in-out Se ha sintetizado un nuevo derivado aminado de la β-ciclodextrina, 6-(6-aminohexanamido)-6-desoxi-β-ciclodextrina, que da lugar a un proceso de inclusión intramolecular, que ha sido estudiado mediante técnicas de RMN. El proceso de desprotonación/protonación del grupo amino terminal estimula el movimiento “in-out” de la cadena lateral hacia o desde la cavidad de la ciclodextrina. Cuando el grupo amino terminal está protonado, la cadena lateral tiende hacia fuera de la cavidad hidrófoba de la ciclodextrina. Por otro lado, a valores altos del pH, donde el grupo amino está desprotonado, la cadena reside interna y externamente de la cavidad. En la escala de tiempos de RMN, la protonación del grupo amino es rápida y el movimiento de la cadena lateral es lento. Se determinaron las constantes de equilibrio para ambos procesos y las constantes cinéticas para el proceso de inclusión. APÉNDICE A.- SÍNTESIS, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DERIVADOS DE SALES BILIARES Apéndice A A.1.- SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DEL PUENTE DE UNIÓN DERIVADO DEL ÁCIDO ETILENDIAMINOTETRAACÉTICO (AEDT) La ruta sintética1,2 se divide en las dos etapas que se representan en la figura A.1: Etapa 1) Síntesis del anhídrido de AEDT. Para ello se pesan 3,64 gramos de AEDT (12,45 milimoles) y 6,12 mL de piridina (75,85 milimoles) disueltos en 4,78 mL de anhídrido acético (50,84 milimoles). La reacción se pone a reflujo a 65ºC durante 24 horas. En la parte superior del refrigerante se coloca una trampa de CaCl2 para garantizar una atmósfera de reacción completamente seca. Transcurridas las 24 horas, se filtra el producto obtenido y se lava el residuo con 25 mL de anhídrido acético y con 50 mL de éter etílico respectivamente. Finalmente se deja en estufa a vacío durante 12 horas a 60ºC. Etapa 2) Doble reacción de esterificación. Para ello se parte inicialmente de 4,68 gramos del anhídrido de AEDT sintetizado en la etapa 1 (18,27 milimoles) a los que se añaden 45 mL de metanol de calidad para HPLC y se calienta a reflujo constante a 80-90ºC durante dos horas. Después de aproximadamente 90 minutos de iniciado el reflujo, el anhídrido de AEDT se disuelve por completo, indicio claro de que la reacción de esterificación de los grupos ácidos ya ha tenido lugar. Sin embargo, se deja que la reacción transcurra durante otros 30 minutos más. El punto final de la reacción se determina mediante cromatografía en capa fina. Las placas se desarrollan en una mezcla metanol: acetato de etilo 1:1 y se revelan con yodo. Una vez terminada la reacción, se lleva a temperatura ambiente y se concentra hasta la aparición de un característico aceite amarillento. A continuación se añaden 200 mL de metanol y se reduce su volumen hasta que aparece una leve turbidez. Se precipita a baja temperatura (después de tres horas aproximadamente ya se observa la formación de una buena cantidad de precipitado), se filtra y se lava con metanol (calidad para HPLC). Finalmente se seca en estufa a vacío durante 12 horas y se pesa. El rendimiento de la reacción fue del 50%. En la figura A.2 se pueden ver los espectros 13C del AEDT y del derivado diéster. Recientemente se ha encontrado en la bibliografía un método de purificación que resulta en un mayor rendimiento (del 98%) con sólo una purificación en acetato de etilo.3 323 Apéndice A N O O N O O HO OH OH HO NO O O NO O O N O O N O O HO O OH O 2) MeOH / 2h reflujo 1) Ácido acético anh. piridina 24 h a reflujo AEDT AN AN2Me Figura A.1.- Ruta sintética del puente bidentado derivado del ácido etilendiaminotetraacético. p pm (f1) 5 0 10 0 15 0 171,836 54,588 51,022 DMSO -N-CH 2 -CH 2 -N -N-CH 2 COOH COOH p pm (f1) 5 0 10 0 15 0 171,836 54,588 51,022 DMSO -N-CH 2 -CH 2 -N -N-CH 2 COOH COOH 172,375 171,378 54,481 54,244 51,306 51,068 p pm (f1) 0 5 0 10 0 15 0 20 0 COOH COOCH 3 -N-CH 2 COOH -N-CH 2 COOCH 3 CH 3 -N-CH 2 -CH 2 -N DMSO p pm (f1) 0 5 0 10 0 15 0 20 0 172,375 171,378 54,481 54,244 51,306 51,068 COOH COOCH 3 -N-CH 2 COOH -N-CH 2 COOCH 3 CH 3 -N-CH 2 -CH 2 -N DMSO (a) (b) Figura A.2.- Espectros del 13C del AEDT (a), y del diéster del AEDT (b). DMSO deuterado, 300MHz. A.2.- SÍNTESIS DEL PUENTE DE UNIÓN DERIVADO DEL ÁCIDO PIROMIELÍTICO (PMA) Esta ruta consta de tres etapas tal y como se representa en la figura A.3: 324 Apéndice A Etapa 1) Cristalización del anhídrido piromielítico comercial. Se llevan a ebullición aproximadamente 50 mL de anhídrido acético a los que se añaden, a medida que se va disolviendo, pequeñas cantidades del anhídrido piromielítico comercial. Cuando la disolución está saturada, se tapa el recipiente y se observa como el anhídrido piromielítico va cristalizando al alcanzar la temperatura ambiente. Finalmente se filtra y se seca en estufa a vacío. Etapa 2) Apertura de los dos grupos anhídrido. Se pesan 4,39 gramos del anhídrido piromielítico cristalizado en la etapa anterior (20,10 milimoles) y se añaden 40 mL de metanol (calidad para HPLC). La reacción tiene lugar a reflujo durante dos horas bajo atmósfera de argón siguiéndose mediante cromatografía en capa fina (eluyente: metanol:acetato de etilo 1:1 y revelado en yodo). Finalizada la reacción, se enfría a temperatura ambiente y se añaden 100-150 mL de agua destilada, se concentra hasta que se observa la aparición de una leve turbidez y se pone la mezcla de reacción a baja temperatura durante 24-48 horas. En primer lugar precipita el p-diésterpiromielítico: transcurridas 48 horas en la nevera se filtra (reservando la disolución filtrada) y se lava con agua el precipitado obtenido que se seca a vacío a 60-70 ºC durante 24 horas. El rendimiento de la reacción fue del 35%. La disolución guardada (meta-diésterpiromielítico) se concentra en rotavapor hasta formación de un sólido blanquecino. Se añade metanol (calidad para HPLC) y se disuelve. Se concentra nuevamente hasta la obtención de una especie de aceite. Se añade de nuevo un poco de agua y se guarda a temperatura baja. Transcurridas 24 horas se forma un nuevo precipitado que es en su mayoría el ácido metapiromielítico, mientras que en disolución queda una mezcla al 50% de ambos, p, mpiromielítico. Se consigue separar así satisfactoriamente ambos isómeros, meta y para.4 Etapa 3) Obtención del dicloruro p-diésterpiromielítico. Se ponen a reflujo 0,18 gramos de para-diésterpiromielítico (0,627 milimoles) en 25 mL de SOCl2 durante aproximadamente una hora. Transcurrido este tiempo, se evapora completamente el disolvente en un rotavapor y se pone a vacío en un baño de silicona a 50ºC durante dos horas para eliminar completamente cualquier resto de SOCl2. El rendimiento de esta reacción es prácticamente el 100%. En la figura A.4 pueden verse los espectros 13C de los dos isómeros. 325 Apéndice A p p m 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0 3,48 2,66 2,06 0,97 0,72 3.00 1.00 4.13 27.56 1.76 2.00 H18 H3β H7αH24 H12β H1α H4α H15β H16α H alifático MeOH-d4 p p m 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0 3,48 2,66 2,06 0,97 0,72 3.00 1.00 4.13 27.56 1.76 2.00 H18 H3β H7αH24 H12β H1α H4α H15β H16α H alifático MeOH-d4 p p m 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 72,20 72,06 57,64 56,78 44,85 44,66 44,15 42,73 41,70 40,84 38,69 38,14 36,98 36,20 35,26 34,34 31,14 29,77 29,22 27,99 23,98 22,47 19,40 12,71 Figura A.11.- Espectros del 1H y 13C del 24-aminoursodesoxicolato. Metanol deuterado, 300MHz Tabla A.1.- Desplazamientos químicos de los 24-amido y 24-aminoderivados. Disolvente: metanol deuterado. En rojo se resaltan señales que pueden estar intercambiadas. 24amidocolato 24aminocolato 24amidodesoxicolato 24aminodesoxicolato 24aminoquenodesoxicolato 24aminoursodesoxicolato tipo 13C tipo 13C tipo 13C tipo 13C tipo 13C tipo 13C 1 CH236,53 CH240,47 CH236,53 CH236,54 CH236,61 CH236,20 2 CH231,22 CH231,19 CH231,18 CH231,18 CH231,41 CH231,14 3 CH 72,92 CH 72,88 CH 72,63 CH 72,62 CH 72,88 CH 72,06 4 CH240,50 CH240,47 CH237,33 CH237,33 CH240,52 CH238,69 5 CH 43,23 CH 43,19 CH 43,75 CH 43,75 CH 43,22 CH 42,73 6 CH235,92 CH235,91 CH228,47 CH228,48 CH235,98 CH238,14 7 CH 69,09 CH 69,09 CH227,52 CH227,53 CH 69,08 CH 72,20 8 CH 41,05 CH 41,00 CH 37,56 CH 37,56 CH 40,80 CH 44,15 9 CH 27,92 CH 27,9 CH 34,95 CH 34,94 CH 34,12 CH 40,84 10 C 35,94 C 35,93 C 35,38 C 35,38 C 36,27 C 35,26 11 CH229,63 CH229,63 CH229,99 CH230,00 CH221,84 CH222,47 12 CH 74,08 CH 74,10 CH 74,12 CH 74,14 CH2 (Hβ) 41,14 CH2 (Hα) 41,70 332 Apéndice A 24amidocolato 24aminocolato 24amidodesoxicolato 24aminodesoxicolato 24aminoquenodesoxicolato 24aminoursodesoxicolato 13 C 47,53 C 47,45 C 47,67 C 47,63 C 43,70 C 44,85 14 CH 43,04 CH 43,04 CH 49,37 CH 49,36 CH 51,06 CH 56,78 15 CH224,27 CH224,28 CH224,91 CH224,93 CH224,68 CH227,99 16 CH228,71 CH228,70 CH228,67 CH228,49 CH229,40 CH229,77 17 CH 48,05 CH 48,13 CH 48,24 CH 48,43 CH 57,43 CH 57,64 18 CH313,03 CH313,00 CH313,25 CH313,26 CH312,21 CH312,71 19 CH323,21 CH323,21 CH323,74 CH323,75 CH323,45 CH323,98 20 CH 36,98 CH 37,09 CH 36,53 CH 36,54 CH 37,07 CH 36,98 21 CH317,73 CH317,98 CH317,74 CH318,07 CH319,21 CH319,40 22 CH233,41 CH234,13 CH233,62 CH234,39 CH234,19 CH234,34 23 CH233,26 CH227,83 CH233,24 CH230,25 CH228,08 CH229,22 24 C 180,32 CH242,21 C 178,66 CH243,09 CH242,30 CH244,65 A.4.- SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE LOS 3-AMINODERIVADOS DEL ÁCIDO CÓLICO, DESOXICÓLICO Y LITOCÓLICO  [(3β, 5β, 7α, 12α)-3-amino-7,12-dihidroxicolan-24-oico ácido metil éster)] (3-β-aminocolato de metilo)  [(3β, 5β, 12α)-3-amino-12-hidroxicolan-24-oico ácido metil éster)] (3-β-aminodesoxicolato de metilo)  [(3β, 5β)-3-amino-colan-24-oico ácido metil éster)] (3-β-aminolitocolato de metilo) La incorporación del grupo amino se realizó en dos procesos "one pot", es decir, se ejecutan en el mismo balón de reacción sin aislar ningún intermedio (véase la figura A.12). El primero de ellos se conoce como reacción de Mitsunobu7,8 y su mecanismo consta de las siguientes etapas: 1) activación de la trifenilfosfina mediante la formación de un aducto de tipo zwitterion; 2) activación del alcohol, vía un dialquiloxifosforano, ya que no hay un ácido en el medio lo que favorecería la ruta 2; 3) desplazamiento de tipo SN2 que genera el producto final de reacción, la azida. La azida obtenida se reduce por la adición posterior de una mayor cantidad de trifenilfosfina y agua (reacción de Staudinger).9 La adición de trifenilfosfina promueve la formación de un intermedio de tipo iminofosforano que 333 Apéndice A se hidroliza en presencia de ácidos, o bien con un exceso de agua, generando el óxido de trifenilfosfina y la amina de interés. Etpa 1) Protección del grupo ácido terminal por formación de un grupo éster. En un balón de 250 mL se agregan 67 milimoles (27,4 gramos) de ácido cólico, 125 mL de metanol de calidad para HPLC y 1 mL de ácido clorhídrico concentrado. La mezcla se pone a reflujo durante una hora y se enfría a temperatura ambiente. Después se deja en el congelador durante doce horas aproximadamente. Transcurrido este tiempo se filtran los cristales del producto y se secan durante 30 minutos al aire. Finalmente se dejan en estufa a vacío a una temperatura de 60ºC. El producto se utiliza sin purificaciones adicionales para el resto de la secuencia. Etapa 2) Preparación de los 3-aminoderivados. En un balón de tres bocas de volumen adecuado con agitación, embudo de adición de presión compensada y entrada de argón, se prepara una disolución de 21 g del éster obtenido en la primera etapa en 500 mL de THF seco. Se agregan 13 gramos de trifenilfosfina, PPh3, y 10 mL de di-isopropilazodicarboxilato. Posteriormente se prepara en el embudo una disolución de azida difenilfosfina (11 mL) en 50 mL de THF. Esta disolución se debe añadir en 30 minutos. A continuación la mezcla se agita durante 24 horas. Se añaden ahora 13 g de PPh3 y otros 10 mL de diisopropilazodicarboxilato, se agita durante 4 horas y finalmente se añaden otros 13 gramos de PPh3 y 30 mL de agua, para reducir el grupo amino. Se agita durante 4 días. Transcurrido este tiempo se adsorbe la mezcla de reacción en una cantidad suficiente de gel de sílice y se elimina el THF en el rotavapor. Para un secado completo se incorpora a la bomba de vacío hasta que la cabeza de columna se observe totalmente suelta. Finalmente, se distribuye la cabeza en dos columnas cromatográficas que se empaquetan con una mezcla 1:1 acetato de etilo: metanol. Se eluye alrededor de un 1L de esta mezcla para eliminar los productos secundarios que se han formado durante la reacción, y posteriormente el producto puro se arrastra con una mezcla 95:5 metanol: trietilamina. Se realizan placas de capa fina en la misma mezcla de disolventes y como revelador se emplea el ácido fosfomolíbdico. En las figuras A.13, A.14 y A.15 pueden verse los espectros 1H y 13C de los 3-aminoderivadas. Y en la tabla A.2 pueden consultarse los desplazamientos químicos de las señales 13C en ppm de estos derivados en dimetilsulfóxido. 334 Apéndice A O OH Y Z X O O Y Z X X, Y, Z=α-OH---------------- ácido cólico X, Z=α-OH; Y=-H--- ------- ácido desoxicólico X=α-OH; Y, Z=-H----------- ácido litocólico zona α zona β O O Y Z 1) HCl (c) / MeOH reflujo 1h 1) DIAD/DPPA / PPh 3 THF 2) PPh 3 / H 2 O 4días H 2 N Figura A.12.- Ruta sintética de los 3-aminoderivados. p pm 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 3,78 3,63 3,58 2,66 0,88 0,59 0.90 1.07 4.76 1.47 3.00 21.91 7.01 OH H12 H7 OCH 3 H3 H alifaticos H21 H7 H19, H1β 3,78 3,63 3,58 2,66 0,88 0,59 p pm 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 0.90 1.07 4.76 1.47 3.00 21.91 7.01 OH H12 H7 OCH 3 H3 H alifaticos H21 H7 H19, H1β p p m 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 71,66 66,83 51,80 47,61 46,78 46,52 42,04 40,00 35,74 35,65 35,36 34,53 32,13 31,43 31,22 29,57 29,22 27,86 26,38 23,67 23,41 22,85 17,64 12,99 p p m 16 0 17 0 18 0 190 174,53 Figura A.13.- Espectros del 1H y 13C del 3-β-aminocolato de metilo. DMSO, 300MHz. 335 Apéndice A p p m 0.5 0 1.0 0 1.5 0 2.0 0 2.5 0 3.0 0 3.5 0 4.0 0 4,06 3,78 3,57 3,12 0,88 0,60 3.00 0.90 0.70 1.92 27.73 2.57 OH H12 OCH 3 H3 DMSO H23 H alifaticos H18 H21 p p m 0.5 0 1.0 0 1.5 0 2.0 0 2.5 0 3.0 0 3.5 0 4.0 0 4,06 3,78 3,57 3,12 0,88 0,60 3.00 0.90 0.70 1.92 27.73 2.57 OH H12 OCH 3 H3 DMSO H23 H alifaticos H18 H21 pp m 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 71,83 51,80 48,22 46,86 46,77 46,28 36,31 36,19 35,58 35,18 34,11 32,86 31,41 31,20 30,09 29,44 28,21 27,79 27,32 26,61 24,21 24,14 17,61 13,12 p p m 16017 0 18019 0 174,41 Figura A.14.- Espectros del 1H y 13C del 3-β-aminodesoxicolato de metilo. DMSO, 300MHz. H18 Halifático H23 DMS O H2O H3, OCH3 ppm (t1) 0.501.001.502.002.503.0 0 3.50 3,56 0,88 0,61 3.00 1.98 31.48 3.50 H18 Halifático H23 DMS O H2O H3, OCH3 H18 Halifático H23 DMS O H2O H3, OCH3 ppm (t1) 0.501.001.502.002.503.0 0 3.50 3,56 0,88 0,61 3.00 1.98 31.48 3.50 p p m 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 56,80 56,30 51,76 46,34 43,05 42,83 40,45 40,07 36,30 36,02 35,57 35,42 33,92 31,45 30,16 28,15 27,21 26,61 24,29 21,30 18,74 12,52 p pm 174.0174.50 174,29 Figura A.15.- Espectros del 1H y 13C del 3-β-aminolitocolato de metilo. DMSO, 300MHz. 336 Apéndice A Tabla A.2.- Desplazamientos químicos de los 3-aminoderivados. Desplazamientos en dimetilsulfóxido deuterado. En rojo se resaltan señales que pueden estar intercambiadas. 3-β-aminocolato de metilo 3-β-aminodesoxicolato de metilo 3-β-aminolitocolato de metilo tipo 13C tipo 13C tipo 13C 1 CH232,13 CH232,86 CH235,42 2 CH223,66 CH226,61 CH230,15 3 CH 47,61 CH 46,77 CH 46,34 4 CH229,58 CH230,09 CH236,30 5 CH CH 34,11 CH 42,83 6 CH234,53 CH228,21 CH227,19 7 CH 66,82 CH227,32 CH226,70 8 CH 40,00 CH 36,31 CH 36,02 9 CH 26,38 CH 35,19 CH 40,07 10 C 35,36 C 35,58 C 33,92 11 CH229,22 CH229,44 CH221,27 12 CH 71,66 CH 71,83 CH240,45 13 C 46,52 C 46,28 C 43,05 14 CH 42,04 CH 48,22 CH 56,80 15 CH223,41 CH224,14 CH224,46 16 CH227,86 CH227,79 CH228,21 17 CH 46,78 CH 46,86 CH 56,30 18 CH312,99 CH313,12 CH312,55 19 CH322,85 CH324,21 CH324,46 20 CH 35,74 CH 36,19 CH 35,57 21 CH317,63 CH317,61 CH318,77 22 CH231,43 CH231,20 CH231,34 23 CH232,13 CH231,41 CH231,17 24 C C 174,51 C 174,29 A.5.- SÍNTESIS, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE COMPUESTOS R-BS  colato-3-amino-benzoato de sodio  colato-3-amino-succinato de sodio  ácido 3-pirenocólico  ácido 3-pirenolitocólico 337 Apéndice A A.5.a.- Síntesis del derivado aromático, colato-3-amino-benzoato de sodio La ruta sintética del monómero colato-3-amino-benzoato de sodio se divide en dos etapas: la síntesis del monómero derivado en forma ácida y la obtención en forma de sal disódica. Etapa 1) Obtención del monómero en forma ácida. En un balón de 100 mL se dispersan 0,9 gramos (5 milimoles) de ácido 4-metoxicarboxilbenzoico en 15 mL de DMF seca mediante agitación y bajo atmósfera de argón. Posteriormente se adicionan 0,7 mL (5,95 milimoles) de DEPC. Una vez disuelto el sólido en suspensión se añaden en porciones de 2,3 gramos (5,5 milimoles) de 3β-aminocolato de metilo (preparado como se describe en el apartado A.4) y se agita durante 10 minutos. Se enfría a continuación a 0ºC y se añaden 8 mL (5,25 milimoles) de trietilamina gota a gota. El baño se mantiene durante 30 minutos y se retira para dejar agitando la reacción a temperatura ambiente durante 6 horas. Transcurrido este tiempo, se evapora la DMF a presión reducida y el crudo de reacción se disuelve en 200 mL de acetato de etilo y se lava con 3 porciones de 50 mL de agua. La fase orgánica se seca con sulfato de sodio anhidro. La purificación del producto se realiza mediante cromatografía de columna en gel de sílice con una mezcla de disolventes 9:1 acetato de etilo: metanol. Purificado ya el producto, se hidrolizan los grupos éster como sigue: 1 gramo del producto protegido con el grupo éster se añade en 50 mL de una disolución de KOH 1 M en metanol y se pone a reflujo durante 1 hora. Se evapora el disolvente y el concentrado que se obtiene se añade a 150 mL de agua, y se neutraliza con HCl concentrado hasta su completa precipitación. El producto se filtra y se lava 5×20 mL de agua, se seca y se recristaliza en metanol (ver figura A.16). El rendimiento de esta reacción fue del 75%. 1) DEPC / NEt 3 / DMF 2) KOH / MeOH 3) H + O O OH OH O O OH O O OH OH OH O OH O H 2 NH N Figura A.16.- Ruta sintética del derivado aromático del colato. 338 Apéndice A Etapa 2) Obtención de la sal disódica. 1 gramo (18 milimoles) del diácido se disuelve con un equivalente de hidróxido sódico (0,07 gramos) en la mínima cantidad de agua (aproximadamente 5 mL). El ácido se añade lentamente sobre aproximadamente 200 mL de acetona sobre la que precipita, se espera a que se evapore cierta cantidad de acetona para conseguir un mejor precipitado y una mayor cantidad del mismo. Finalmente se filtra y se seca en estufa a vacío a 80ºC durante el tiempo necesario para garantizar la ausencia de disolvente orgánico ocluido en el sólido (ver figura A.17). O O OH OH H N O O O 1) NaOH / H 2 O 2) Acetona Na Na O OH OH OH O OH OH N Figura A.17.- Ruta sintética del colato-3-amino-benzoato de sodio. A.5.b.- Síntesis del derivado alifático, colato-3-amino-succinato de sodio La ruta sintética del monómero colato-3-amino-succinato de sodio se puede dividir también en dos etapas: la síntesis del monómero derivado en forma ácida y la obtención de la sal disódica. Etapa 1) Obtención del monómero en forma ácida. Una disolución de 6,15 gramos (15 milimoles) del 3-β-aminocolato de metilo (preparado tal y como se describe en el apartado A.4) en 85 mL de THF y 17mL de trietilamina se añade con 1,5 gramos de anhídrido succínico (15 milimoles). Después de 4 horas a temperatura ambiente la mezcla de reacción se vierte en 200mL de HCl 1M y se extrae con acetato de etilo. La fase orgánica se lava con agua, se seca y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía en columna con una mezcla de elución 6:4 acetato de etilo: MeOH (ver figura A.18). El rendimiento final es del 82%. 339 Apéndice A O O O 1) THF / NEt 3 2) HCl 1M O O OH OH O OH OH OH H N HO O O H 2 N Figura A.18.- Ruta sintética del derivado alifático del colato. Etapa 2) Obtención de la sal disódica. Se obtiene del mismo modo que el derivado aromático (ver figura A.19). Na Na 1) NaOH / H 2 O 2) Acetona O O OH OH H N O O O O OH OH OH H N HO O O Figura A.19.- Ruta sintética del colato-3-amino-succinato de sodio. A.5.c.- Síntesis del derivado ácido 3-pirenocólico El esquema de síntesis puede verse en la figura A.20. La reacción tiene lugar bajo atmósfera de argón. Se pesan 3 gramos de 3-β-aminocolato de metilo que se disuelven en 25 mL de cloroformo y 5 mL de trietilamina; se agita hasta su completa disolución y posteriormente se enfría en un baño agua-hielo-sal a -10ºC. A continuación se añade gota a gota sobre una disolución previamente preparada en otro balón de 1,70 gramos del cloruro de 1-carboxipirenoilo disuelto en 5 mL de cloroformo. Se retira el baño de hielo y se deja que tenga lugar la reacción durante las horas siguientes. El producto final se purifica en cromatografía en columna (Rf=0,62 en una mezcla 10:1 acetato de etilo: metanol). El rendimiento de la reacción es del 65%. 340 Apéndice A Y, Z=-OH--------- 3-β-aminocolato de metilo Y, Z=-H----------- 3-β-aminolitocolato de metilo O O H 2 NY Z N H O Y Z OH O O Cl 1) CHCl 3 / NEt 3 / -10ºC 2) 6h a T amb. 3) KOH/MeOH Figura A.20.- Ruta sintética del ácido 3-pirenocólico y del ácido 3-pirenolitocólico. A.5.d.- Síntesis del derivado ácido 3-pirenolitocólico El esquema de síntesis puede verse en la figura A.20; el procedimiento es el mismo que el que se describe en el apartado anterior. El producto final se purifica en cromatografía en columna, teniendo este derivado un Rf de 0,58 en una mezcla 6:4 hexano: acetato de etilo. El rendimiento de la reacción fue del 60%. A.5.e.- Caracterización espectral. Espectros 1H y 13C resueltos Los cuatro derivados R-BS han sido caracterizados por espectroscopia de resonancia magnética nuclear. A continuación aparecen representados los espectros monodimensionales 1H y 13C de los cuatro monómeros; así como, en la tabla A.3 pueden verse los desplazamientos de las señales de 13C correspondientes al grupo esteroide y a la cadena alifática o aromática respectivamente según el caso, y en la tabla A.4 los desplazamientos correspondientes al grupo esteroide y al grupo pireno. 341 Apéndice A Tabla A.4.- Desplazamientos químicos de los dímeros d-2C3-AEDT y d-2DC3AEDT (diéster). Desplazamientos en dimetilsulfóxido deuterado. En rojo se resaltan señales que pueden estar intercambiadas. d-2C3-AEDT (DMSO) d-2DC3-AEDTdiéster (DMSO) tipo 13C tipo 13C 1 CH231,30 CH231,26 2 CH225,23 CH225,20 3 CH 45,05 CH 44,81 4 CH235,09 CH231,40 5 CH 37,48 CH 32,92 6 CH234,12 CH227,77 7 CH 67,00 CH226,44 8 CH 40,14 CH 37,65 9 CH 26,32 CH 35,56 10 C 35,44 C 34,86 11 CH229,41 CH229,44 12 CH 71,79 CH 71,82 13 C 46,53 C 46,77 14 CH 42,07 CH 46,87 15 CH223,47 CH224,12 16 CH227,90 CH227,13 17 CH 46,85 CH 48,14 18 CH313,01 CH313,11 19 CH323,60 CH324,07 20 CH 35,68 CH 36,15 21 CH317,67 CH317,61 22 CH231,52 CH231,05 23 CH231,57 CH231,19 24 C 175,54 C 174,41 -N-CH2-CH2-N53,74 -CH2COOH 56,95 -CH2CONH59,27 -COOH 170,01 -CONH 173,35 -N-CH2-CH2-N53,61 -CH2COOCH3 56,50 -CH2CONH58,99 -COOCH3 169,71 -CONH 172,37 PUENTE AEDT PUENTE AEDT 348 Apéndice A A.7.- SÍNTESIS, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE GEMINI DERIVADOS DE ÁCIDOS BILIARES  N,N’-1,2-etanodiilbis[N-(2-((3α, 5β, 7α, 12α)-3,7,12-trihidroxicolan-24il)amino]-2-oxoetilglicina] (g-2C24-AEDT)  N,N’-1,2-etanodiilbis[N-(2-((3α, 5β, 12α)-3,12-dihidroxicolan-24-il)amino]-2oxoetilglicina] (g-2DC24-AEDT)  Ácido 2,5-bis[(((3α, 5β, 12α)-3,12-dihidroxicolan-24-il)amino)carbonil]-1,3bencenodicarboxílico (g-2DC24-PIR)  Ácido 2,5-bis[(((3α, 5β, 7α, 12α)-3,7,12-trihidroxicolan-24-il)amino)carbonil]- 1,3-bencenodicarboxílico (g-2C24-PIR) A.7.a.- Síntesis y purificación del g-2C24-AEDT En un balón de fondo redondo provisto de barra agitadora se pesan 0,60 gramos del puente bidentado derivado del ácido etilendiaminotetraacético (1,87 milimoles) y se disuelven en 6 mL de DMF seca y 10 mL de THF seco. Una vez disuelto el sólido en suspensión se adicionan 0,65 mL de DEPC (4,28 milimoles). Mientras, en otro balón se pesan 1,55 gramos de 24-aminocolato (3,94 milimoles), y se disuelven en 8 mL de DMF seca y 7 mL de THF seco (pues la amina del colato no es muy soluble en THF). Una vez disuelta la amina se añaden 0,6 mL de trietilamina (4,30 milimoles). Transcurridos aproximadamente 30 minutos desde la adición del DEPC sobre el diéster del anhídrido se enfría en un baño de agua-hielo a 0ºC y se añade la disolución de la amina lentamente con una jeringa de vidrio. El baño de agua-hielo se retira a los 90 minutos y se deja que la reacción transcurra a temperatura ambiente durante 6 horas. Finalizada la reacción, se evapora la DMF lo máximo posible y sobre el crudo de reacción se realiza un proceso de extracción. Se añaden 200 mL de cloroformo, y se realizan dos extracciones con 50 mL de agua. Se seca la fase orgánica con sulfato sódico anhidro y se concentra finalmente hasta sequedad. El objetivo de los procesos de extracción es la eliminación total de la DMF. Finalmente, el producto de reacción se disuelve en la mínima cantidad de cloroformo y se purifica en una columna cromatográfica, acetato de etilo: metanol 7:3. El gemini sintetizado tiene un Rf de 0,41, mientras que el de la amina de partida es de 0,06 en esta mezcla de disolventes, por ello es muy conveniente para su purificación en columna. El rendimiento de la reacción fue del 40%. El paso siguiente es la reacción de desesterificación en una disolución de potasa 1 M en metanol a reflujo durante una hora a 80ºC. Una vez finalizada la 349 Apéndice A reacción, se concentra a sequedad y se disuelve en 200-300 mL de agua. Se añade ácido clorhídrico concentrado hasta pH próximo a uno. Se deja en refrigerante tres horas hasta que se forma una buena cantidad de precipitado, se filtra, se lava hasta pH 6-7 y finalmente se seca en estufa a vacío. Este compuesto es más interesante en forma de sal disódica; para ello, debemos disolver el compuesto en una cantidad de NaOH equivalente y disuelta en la menor cantidad de agua posible para conseguir un buen rendimiento. Posteriormente se filtra si fuera necesario, y se precipita en acetona (véase la figura A.28). NH 2 OH OH N O O N O O HO O OH O H N OH OH O N N O O O O N H OOH OH 1) DEPC / NEt 3 / DMF / Ar / 6h 2) Hidrólisis con KOH/MeOH 3) NaOH/acetona Na Na OH OH OH Figura A.28.- Ruta sintética del g-2C24-AEDT. A.7.b.- Síntesis y purificación del g-2DC24-AEDT En un balón de fondo redondo se pesan 0,61 gramos del puente bidentado derivado del ácido etilendiaminotetraacético en forma diéster (1,90 milimoles) y se disuelven en 5 mL de DMF seca y 15 mL de THF seco. Una vez disuelto el sólido en suspensión se añaden 0,65 mL de DEPC (4,28 milimoles); mientras, en otro balón se pesan 1,51 gramos del 24-aminodesoxicolato (4,00 milimoles) que se disuelven en 20 mL de THF seco. Una vez disuelta la amina se añaden 0,6 mL de trietilamina (4,30 milimoles). Transcurridos aproximadamente 30 minutos desde la adición del DEPC sobre el diéster del anhídrido, se enfría el balón de reacción en un baño de agua-hielo a 0ºC y se añade la disolución de la amina lentamente con una jeringa de vidrio. El baño de agua-hielo se retira a los 90 minutos y se espera a que la reacción transcurra a temperatura ambiente durante 6 horas (se sigue por cromatografía en capa fina). Finalizada la reacción, se evapora la DMF lo máximo posible y sobre el crudo de reacción se realiza un proceso de extracción: se añaden aproximadamente 200 mL de cloroformo, y se realizan dos extracciones con 50 mL de agua. Se seca la fase orgánica con Na2SO4 anhidro y se concentra finalmente en rotavapor hasta sequedad. El objetivo de los procesos de extracción es la 350 Apéndice A eliminación total de la DMF. Finalmente, el producto de reacción se disuelve en la mínima cantidad de cloroformo y se purifica en una columna cromatográfica con acetato de etilo: metanol 7:3. El dímero sintetizado tiene un Rf de 0,51, mientras que la amina de partida sale con un Rf de 0,08 en esta mezcla de disolventes, por ello es muy conveniente para su purificación en columna. El rendimiento de la reacción es del 45%. El paso siguiente es la hidrólisis de los dos grupos ésteres del gemini en una disolución de KOH 1 M en metanol a reflujo durante una hora a 80ºC. Una vez terminada la reacción de desesterificación de los dos grupos ésteres se concentra a sequedad y se disuelve en aproximadamente 200-300 mL de agua y se añade HCl concentrado hasta pH próximo a uno. Se pone a baja temperatura tres horas hasta que se forma una buena cantidad de precipitado, se filtra y se lava hasta conseguir un pH~6. Finalmente se seca en una estufa a vacío toda la noche. Para trabajar con este compuesto conviene pasarlo a su forma de sal disódica; para ello, debemos disolver el compuesto en la cantidad de NaOH correspondiente disuelta en la mínima cantidad de agua para conseguir un buen rendimiento. Posteriormente se filtra si fuera necesario, y se precipita en acetona, ver figura A.29. NH 2 OH OH N O O N O O HO O OH O H N OH OH O N N O O O O N H OOH OH 1) DEPC / NEt 3 / DMF / Ar / 6h 2) Hidrólisis con KOH/MeOH 3) NaOH/acetona Na Na Figura A.29.- Ruta sintética del g-2DC24-AEDT. A.7.c.- Síntesis y purificación del g-2DC24-PIR El mecanismo de reacción de síntesis de este derivado de ácido biliar se puede entender en tres etapas: Etapa 1) Formación de una di-imida cíclica.10-12 Una disolución del 24-aminodesoxicolato (0,58 gramos; 1,53 milimoles) y trietilamina (3 mL; 40,80 milimoles) en 15 mL de cloroformo comercial se agita vigorosamente y se le agrega gota a gota y en baño agua-hielo a 5ºC una disolución del compuesto que forma el puente p-diésterpiromielítico en forma de dicloruro (0,20 g; 0,627 351 Apéndice A milimoles) disuelto en 5 mL de cloroformo. Transcurrida la reacción (12 horas, seguimiento de la reacción por cromatografía en capa fina, acetato de etilo: metanol 9:1, revelado con ácido fosfomolíbdico), el cloroformo se evapora y el precipitado se purifica en columna cromatográfica de silicagel utilizando la misma mezcla de disolventes. Dicha mezcla es conveniente para su purificación ya que el producto de reacción y la amina de partida presentan valores de Rf muy diferentes en la misma, 0,05 y 0,42 respectivamente. El rendimiento de esta reacción fue del 35%. A pesar de separar el p-diésterpiromielítico del m-diésterpiromielítico tal y como se describe en el apartado A.2 de este mismo apéndice, una caracterización completa del producto final de esta reacción nos indica que no ha sido posible la obtención del dímero de esteroide para y meta por separado. Se obtuvo una mezcla racémica de aproximadamente ambos gemini al 50% no siendo posible su separación mediante comatografía de columna. Al analizar los espectros de IR, masas y RMN se puede observar que cuando tiene lugar la reacción entre el puente piromielítico y la amina se forma una di-imida cíclica en lugar del diéster esperado tal y como puede verse en el mecanismo propuesto en la figura A.30. El espectro del IR muestra la presencia de una señal muy pronunciada a 1712 cm-1 y otra menos intensa a 1770 cm-1, bandas características de las imidas (figura A.31), en el espectro 1H-RMN de la figura A.32 no aparece la señal correspondiente a la amida, en el caso de que se obtuviera el diéster y no la di-imida y en el espectro 13C-RMN tampoco se encuentran las señales correspondientes a los dos grupos -OCH3, ver figura A.32. NH 2 OH OH O Cl Cl O O O O O 1) CHCl 3 / NEt 3 / Ar / 24 h a T amb. OH OH N N O O O OOH OH Figura A.30.- Ruta sintética de obtención de la 24-di-imida del desoxicolato. Etapa 2) Apertura de la di-imida cíclica en medio básico. En un balón de fondo redondo de 50 mL se pesan 0,80 gramos de la 24-di-imida del desoxicolato (0,80 milimoles) y se añaden 25 mL de una disolución de potasa 1M en metanol. Se calienta a reflujo a 80ºC durante aproximadamente una hora (ver figura A.33). Cuando la reacción ha finalizado, se concentra a sequedad y se disuelve en 200-300 mL de agua y se añade ácido clorhídrico concentrado hasta pH~1. Se deja en 352 Apéndice A refrigerante durante tres horas hasta la formación de un precipitado. Se filtra y se lava con abundante cantidad de agua hasta que el pH sea aproximadamente 5. Finalmente se seca en estufa a vacío. El rendimiento de la reacción es del 84% y como ya se ha dicho anteriormente se obtiene una mezcla de los dos isómeros. 1000200030004000 Wavenumbers 80 100 120 1770 1712 1772, 1712 N O O CH 3 Figura A.31.- Espectro IR de la 24-di-imida del desoxicolato en cm-1. p p m 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0 6. 0 7. 0 8. 0 p pm 0 5 0 10 0 15 0 166,89 137,64 117,78 71,84 70,72 48,16 47,00 46,75 42,44 39,25 37,10 36,44 35,91 35,47 34,55 33,75 33,35 31,00 29,34 27,80 27,73 26,77 25,08 24,13 17,90 13,09 8,15 4,35 4,06 3,76 3,56 0,89 0,82 0,57 1.79 6.00 73.33 1.96 2.00 1.99 3.61 H ar OH H12 H3 H24 H19 H21 H18 H alifáticos Figura A.32.- Espectros 1H y 13C-RMN de la 24-di-imida del desoxicolato en DMSO. 353 Apéndice A OH HO N H H NO O O OOH OH HO OH 24-aminodesoxicolato 24 aminodesoxicolato HO O OO O OH 1) KOH/ MeOH a reflujo 1h 2) HCl OH OH N N O O O OOH OH Figura A.33.- Ruta sintética del g-2DC24-PIR como mezcla en para y meta. Etapa 3) Formación de la sal disódica. En la última etapa obtenemos el compuesto en forma de sal disódica, figura A.34. Para hidrolizar dos grupos ácidos se añade el doble de moles de NaOH que de compuesto en la mínima cantidad de agua (cuanto menor será la cantidad de agua añadida mejor será el rendimiento de la reacción). Una vez hidrolizados se añade acetona sobre la disolución para que precipite la sal. Se deja evaporarla acetona lentamente y se va añadiendo acetona nueva. El sólido formado se filtra y se pasa a un recipiente de vidrio cerrado. El rendimiento de este último proceso fue muy elevado, del 91%. Gracias a la evaporación lenta del disolvente se obtuvo una mayor cantidad y mejor calidad del precipitado. Na Na Na Na OH OH N H H NO O O OOH OH HO OH 24-aminodesoxicolato 24 aminodesoxicolato HO O OO O OH 1) NaOH 2) Acetona OH OH N H H NO O O OOH OH O O 24-aminodesoxicolato 24 aminodesoxicolato O O OO O O Figura A.34.- Ruta sintética de la sal disódica del g-2DC24-PIR como mezcla en para y meta. A.7.d.- Síntesis y purificación del g-2C24-PIR Del mismo modo que para el g-2DC24-PIR, la reacción tiene lugar a través de una di-imida cíclica, y por ello en la última etapa de reacción se obtienen los dos 354 Apéndice A isómeros a pesar de partir del puente p-diésterpiromielítico (véase la figura A.35). 1,44 milimoles (0,46 gramos) de puente piromielítico en posición para se disuelven en 12 mL de cloroformo seco y se añaden gota a gota y lentamente sobre otro balón donde hemos pesado la cantidad necesaria del 24-aminocolato, 3,60 milimoles (1,42 gramos, un exceso de 2,5 veces) en 30 mL de cloroformo seco y 10 mL de DMF (no es muy soluble en cloroformo). La mezcla de reacción se mantiene a 0ºC hasta la completa disolución de todos los componentes y se añaden 7,5 mL de trietilamina. Se observa que la reacción está teniendo lugar por el desprendimiento de cloruro de ácido, intenso en los primeros minutos de reacción. Se deja transcurrir la reacción durante 6 horas, se concentra a sequedad y se seca en una estufa a vacío. Se purifica mediante cromatografía en columna con una mezcla 9:1 acetato de etilo:metanol (Rf de 0,23). El último paso es la obtención del dímero en forma de sal disódica que se explica en la etapa 3 del apartado anterior. El rendimiento de esta reacción fue bastante bajo, aproximadamente un 20%, y teniendo en cuenta que la formación de la imida es inevitable siendo también imposible la separación de los dos isómeros para y meta, se decidió sintetizar este nuevo gemini directamente a partir del anhídrido piromielítico cristalizado. Para ello se disolvieron 0,25 gramos (1,1 milimoles) en 10 mL de DMF. A continuación se añadió en frío una disolución de 1 gramo del 24-aminocolato (2,4 milimoles) en 5 mL de DMF y 1,5 mL de trietilamina. La reacción se dejó transcurrir durante 24 horas. De esta forma se obtuvo igualmente una mezcla de los dos isómeros pero con un mayor rendimiento, 65%, ver figura A.36. NH 2 OH OH OH OH N H H N O O O OOH OH O O O Cl Cl O O O O O Na 1) CHCl 3 / NEt 3 / Ar / 24 h a RT 2) Hidrólisis con KOH/MeOH 3) NaOH/acetona 24-aminocolato 24 aminocolato O O OO O ONa Na Na OH HO N N O O O OOH OH OH OH OH OH OH Figura A.35.- Ruta sintética de la sal disódica del g-2C24-PIR como mezcla racémica a partir del p-diésterpiromielítico. 355 Apéndice A NH 2 OH OH OH OH OH OH OH OH OH O H N NH O O OO O Na Na 1) CHCl 3 / NEt 3 / Ar / 24 h a T amb. 2) Hidrólisis con KOH / MeOH 3) NaOH/acetona 24-aminocolato 24 aminocolato O O OO O ONa Na O O O O O O OH HO N N O O O OOH OH OH OH Figura A.36.- Ruta sintética de la sal disódica del g-2C24-PIR como mezcla racémica. La reacción tiene lugar a partir del anhídrido piromielítico. A.7.e.- Caracterización espectral. Espectros 1H y 13C resueltos A continuación se pueden ver los espectros monodimensionales 1H y 13C en DMSO para los cuatro gemini sintetizados. En la tabla A.5 aparecen los desplazamientos de las señales 13C. p p m 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0 6. 0 7. 0 8. 0 7,85 3,79 3,62 3,35 3,19 3,04 2,70 0,85 0,59 6.00 3.78 4.01 3.96 2.03 2.02 63.05 4.24 6.13 OH H12 H7 H24 H19 H21 H18 H alifáticos DMSO H amida CH 2 CONH CH 2 COOH + H3 H4α+H8α N-CH 2 -CH 2 -N p p m 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0 6. 0 7. 0 8. 0 7,85 3,79 3,62 3,35 3,19 3,04 2,70 0,85 0,59 6.00 3.78 4.01 3.96 2.03 2.02 63.05 4.24 6.13 OH H12 H7 H24 H19 H21 H18 H alifáticos DMSO H amida CH 2 CONH CH 2 COOH + H3 H4α+H8α N-CH 2 -CH 2 -N p p m 0 5 0 10 0 15 0 173,20 170,80 71,79 71,16 67,01 58,40 56,23 53,14 47,00 46,46 42,26 42,03 39,58 36,03 35,79 35,59 35,10 33,57 31,12 29,27 28,02 26,94 26,63 23,50 23,29 18,05 13,04 Figura A.37Espectros 1H y 13C-RMN del g-2C24-AEDT en DMSO. 300 MHz. 356 Apéndice A p p m 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0 6. 0 7. 0 8. 0 7,74 4,35 4,08 3,78 3,60 3,44 3,14 3,02 2,67 0,83 0,58 4.11 3.76 7.43 2.24 2.39 4.13 76.84 6.00 2.05 OH H12 H3 H24 H19 H21 H18 H alifáticos DMSOH amida H 2 O OCH 3 CH 2 CONH CH 2 COCH 3 p p m 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0 6. 0 7. 0 8. 0 7,74 4,35 4,08 3,78 3,60 3,44 3,14 3,02 2,67 0,83 0,58 4.11 3.76 7.43 2.24 2.39 4.13 76.84 6.00 2.05 OH H12 H3 H24 H19 H21 H18 H alifáticos DMSOH amida H 2 O OCH 3 CH 2 CONH CH 2 COCH 3 71,71 70,67 58,23 55,68 53,01 51,85 48,13 47,07 46,68 42,36 37,03 36,40 35,87 35,73 34,53 33,68 33,52 30,95 29,34 27,94 27,71 26,80 26,64 24,19 23,76 18,00 13,13 p p m 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 pp m 170.00170.50171.00171.50172.00 172,20 170,56 Figura A.38.- Espectros 1H y 13C-RMN del g-2DC24-AEDT (diéster) en DMSO. 300MHz. p pm (t1) 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 p pm (t1) 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0 6. 0 7. 0 8. 0 8,055 7,676 7,321 4,440 4,162 3,783 3,127 0,828 0,592 2.03 0.38 0.95 0.43 1.57 2.19 6.00 75.49 H ar OH H12 H3 H24 H19 H21 H18 H alifáticos DMSO H amida H 2 O H7 p pm (t1) 1. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 0 6. 0 7. 0 8. 0 8,055 7,676 7,321 4,440 4,162 3,783 3,127 0,828 0,592 2.03 0.38 0.95 0.43 1.57 2.19 6.00 75.49 H ar OH H12 H3 H24 H19 H21 H18 H alifáticos DMSO H amida H 2 O H7 H ar OH H12 H3 H24 H19 H21 H18 H alifáticos DMSO H amida H 2 O H7 71,894 71,282 67,113 47,075 46,582 42,404 42,156 40,362 36,157 35,967 35,698 35,222 33,809 31,248 29,391 28,150 27,050 26,425 23,621 23,430 18,209 13,171 Figura A.39.- Espectros 1H y 13C-RMN del g-2C24-PIR en DMSO. 300MHz. 357 Apéndice B B.1.- ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) La espectroscopia RMN1 se ha convertido en el método más importante de elucidación estructural de componentes orgánicos, particularmente en disolución. B.1.a.- Fundamentos físicos2-4 Uno de los postulados fundamentales de la mecánica cuántica establece que, para una partícula aislada, el momento angular de la misma sólo puede tomar determinados valores discretos. Así, el momento angular total de una partícula P está cuantizado: () [] 2 1 1RRP += h [B.1] donde el número cuántico de momento angular R toma valores positivos enteros o semienteros y ћ es la constante reducida de Planck (h/2π). Puesto que el momento angular de una partícula está cuantizado, la energía del sistema también lo está. De esta forma, cada estado energético de una partícula puede especificarse mediante los números cuánticos apropiados, teniendo además asociada una función de onda de estado estacionario (también llamada eigenfunción). Aquellos estados que poseen diferente eigenfunción pero poseen la misma energía, se dice que son estados degenerados. Como veremos más adelante, este es el caso de los niveles de energía nuclear en ausencia de un campo magnético externo. Para describir el momento angular de una partícula debemos especificar no sólo su magnitud (ecuación B.1) sino también su dirección, pues se trata de un parámetro vectorial. La dirección del vector momento angular también está cuantizada, caracterizándose por medio de un número cuántico de dirección de momento angular mR, definido de tal forma que la proyección del momento angular sobre una dirección arbitraria z (componente Pz) viene dada por la ecuación: Rz mP h= [B.2] donde mR toma valores desde –R hasta + R con ∆mR = ±1. Existen pues, 2R+1 valores posibles para el número cuántico mR (R, R-1, R-2,...-R) que caracterizan a las 2R+1 proyecciones del vector P sobre la dirección z (figura B.1). De las diferentes contribuciones individuales al momento angular total de un núcleo atómico, la teoría de la RMN se centra en la debida al espín nuclear. Los componentes del núcleo atómico (protón y neutrón) poseen un número cuántico de 365 Apéndice B espín cuyo valor es I=1/2. Para átomos diferentes al de hidrógeno (1H) los momentos angulares de los nucleones se acoplan entre sí, dando lugar a un número cuántico de espín nuclear I, que toma valores enteros o semienteros. z θ Rz m P h= z mR = +1 mR = -1 mR = 0 ( a ) ( b ) ( ) [ ] 2/1 1RRP += h () [] 2/1 R 1RR m Cos + =θ Figura B.1.- (a) Momento angular y su proyección en función de los números cuánticos R y mR. (b) Posibles orientaciones del momento angular para R = 1. En general, se pueden plantear los siguientes hechos relacionados con el espín nuclear: • Los núcleos de masa impar tienen espín semientero; por ejemplo 1H, 13C y 19F. • Los núcleos de masa par y carga par tienen espín cero; por ejemplo 12C, 16O y 32S. • Los núcleos de masa par y carga impar tienen espín entero; por ejemplo 14N y 2H. En la tabla B.1 se muestran los valores del espín nuclear de algunos núcleos utilizados en RMN, junto con otras propiedades magnéticas de los mismos. En espectroscopia de RMN sólo pueden ser utilizados núcleos que poseen un valor de espín nuclear no nulo, por lo que el uso de isótopos como 12C o 16O está descartado. Por otro lado, aquellos núcleos que posean espín superior a 1/2 (14N o 2H, por ejemplo) poseen un momento eléctrico cuadrupolar, lo que conlleva que la vida media de estos núcleos en estado excitado es muy corta, y como consecuencia del principio de incertidumbre, las líneas de absorción son generalmente muy débiles y difusas, por lo que dichos núcleos no suelen ser utilizados en RMN. De esta forma, la espectroscopia de RMN se restringe al uso de núcleos que poseen 366 Apéndice B espín 1/2, siendo el protón 1H y el isótopo de carbono 13C los utilizados habitualmente. La magnitud del vector momento angular de espín nuclear P viene dada por una expresión idéntica a la ecuación B.1: () [] 2 1 1IIP += h [B.3] Tabla B.1.- Propiedades magnéticas de los núcleos más estudiados en RMN. Núcleo Espín Abundancia natural % Momento magnético µ·µN-1 Razón giromagnética γ / 107 rad T-1 s-1 Frecuencia Ξ∗ Electrón 1 / 2 - -3 , 18392 103-1 , 76084 1046 , 582 104 Neutrón 1 / 2 - -3,31362 -18,325 68,50 1H 1 / 2 99,985 4,83724 26,7520 100,000 2H 1 0,015 1,2126 4,1066 15,351 3H 1 / 2 Radioactivo 5,1596 28,535 106,664 7Li 3 / 2 92,58 4,20394 10,3975 38,866 11B 3 / 2 80,42 3,4708 8,5843 32,089 13C 1 / 2 1,108 1,2166 6,7283 25,145 14N 1 99,63 0,57099 1,9338 7,228 15N 1 / 2 0,37 -0,4903 -2.712 10,137 17O 5 / 2 0,037 -2,2407 -3.6279 13,561 19F 1 / 2 100 4,5532 25.181 94,094 23Na 3 / 2 100 2,86265 7.08013 26,466 27Al 5 / 2 100 4,3084 6,9760 26,077 29Si 1 / 2 4,70 -0,96174 -5.3188 19,867 31P 1 / 2 100 1,9602 10,841 40,481 59Co 7 / 2 100 5,234 6,317 23,610 113Cd 1 / 2 12,26 -1,0768 -5,9550 22,193 119Sn 1 / 2 8,58 -1,8119 -10,021 37,291 *Ξ es una frecuencia calculada tomando como base 100MHz para la resonancia del protón. 367 Apéndice B estando definida la dirección de dicho vector por la proyección sobre un eje arbitrario z. Dicha proyección está cuantizada por el número cuántico mI, denominado número cuántico magnético: Iz mP h= [B.4] Según las leyes de Maxwell, toda partícula cargada en movimiento lleva asociado un campo magnético. Este fenómeno también está presente a nivel atómico, de tal manera que un núcleo y los electrones que lo rodean, llevan asociados su correspondiente momento magnético. Puesto que el momento angular de dichas partículas está cuantizado, el momento magnético también lo estará. Considerando un electrón moviéndose a una velocidad angular ω, el momento angular orbital P vendrá definido como: ω= 2 ermP [B.5] donde me es la masa del electrón y r es la distancia del mismo al núcleo. De esta forma, la corriente eléctrica generada por dicho electrón será: 2 er m 2 P e 2 e iπ = π ω = [B.6] Según la teoría electromagnética, el momento magnético asociado µ será: i A−=µ [B.7] donde A es el área que delimita el orbital del electrón. Si por simplicidad se considera que el electrón describe una órbita circular, A toma el valor πr2, de tal forma que combinando las ecuaciones B.6 y B.7 se obtiene una expresión para el momento magnético asociado a P: P m2 e e⎟ ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎜ ⎝ ⎛ −=µ [B.8] (nótese que para el electrón, µ y P son vectores antiparalelos.) La simplificación de una órbita circular no es aceptable cuando se considera el espín del electrón, y por ello se introduce un factor de corrección denominado factor de Landé o factor g, transformándose la ecuación B.8 en: P g P m2 e g B eh µ −= ⎟ ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎜ ⎝ ⎛ −=µ [B.9] 368 Apéndice B en la que µB es el magnetón de Böhr. Es importante mencionar que los valores obtenidos experimentalmente para el factor g pueden ser explicados completamente mediante un tratamiento cuántico exhaustivo de la teoría de RMN. Si en lugar de un electrón se considera un núcleo atómico, se puede realizar un tratamiento análogo, obteniéndose ecuaciones muy similares en las que se deben considerar la carga (Z·e) y masa (n·mp) del núcleo en lugar de las del electrón. De esta forma se obtiene un momento magnético nuclear que cumple la condición: P g NN h µ =µ [B.10] donde µN es el magnetón nuclear y gN es el factor g nuclear, que incluye los valores de Z y n. En este caso, la ecuación B.10 no incluye de forma explícita un signo negativo (como ocurría en la ecuación B.8). Esto implica que el momento angular nuclear P y el momento magnético nuclear µ pueden ser paralelos o antiparalelos, en función del signo de gN. Por comodidad, los momentos magnéticos nucleares se suelen expresar en función de una magnitud denominada razón giromagnética (γ): P γ=µ [B.11] obteniéndose una expresión para γ por combinación de las ecuaciones B.10 y B.11: h NN g µ =γ [B.12] Algunos valores de γ se encuentran en la tabla B.1. La expresión del momento magnético nuclear se obtiene por combinación de las ecuaciones B.3, B.10 y B.11: () [] () [] 2 1 2 1 NN 1II 1II g +γ=+µ=µ h [B.13] En ausencia de campos magnéticos externos, la energía de una partícula que posee un momento magnético µ es independiente de la orientación de la misma. Si esa partícula es sometida a la acción de un campo magnético externo B0, aplicado a lo largo de una dirección arbitraria z, entonces la energía de la misma depende de la orientación relativa de dicha partícula respecto a la dirección del campo externo aplicado. De acuerdo con las leyes del electromagnetismo, la energía del sistema vendrá dada por la expresión: 369 Apéndice B 0z BE µ−= [B.14] en donde µz es la componente de µ en la dirección de aplicación de B0 (dirección z). Como ya se ha mencionado en el caso del espín nuclear, esta componente viene definida por el número cuántico magnético mI, que toma valores desde –I hasta +I con ∆I = ±1. IINNz m mg hγ= µ =µ [B.15] Por lo tanto, la ecuación B.14 puede expresarse como: 0I B m E hγ−= [B.16] Es decir, la energía de la partícula bajo la acción de un campo magnético B0 está cuantizada, existiendo 2I+1 niveles de energía diferentes separados entre sí por: 0 B E hγ=∆ [B.17] Estos niveles de energía se denominan niveles energéticos de Zeeman y, en ausencia de campos magnéticos externos (B0=0), son estados degenerados. En presencia de un campo magnético externo estático (B0) se rompe esta degeneración de estados energéticos, siendo entonces posible inducir transiciones entre los mismos. Esta es una de las diferencias fundamentales que existen entre la espectroscopia de RMN y otras espectroscopias como la Visible-UV o la IR, ya que en la primera se precisa de la existencia de un campo externo que rompa la degeneración inicial de los niveles energéticos. Las transiciones entre los distintos niveles de energía ocurrirán cuando la energía de la radiación que las provoca, de frecuencia ν, corresponda exactamente a la diferencia de energía de los niveles entre los que se produce la transición, esto es: I0 m B h ∆γ=ν h [B.18] Esta ecuación expresa la denominada condición de resonancia de un núcleo en un campo magnético. El valor de la frecuencia a la que se produce la resonancia de un átomo se obtiene despejando de la ecuación B.18 y considerando que ∆mI= ±1: 370 Apéndice B 0 B 2⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ π γ =ν [B.19] Considerando que los campos magnéticos externos que se suelen utilizar en RMN son generalmente del orden de 2 a 20 Teslas (20 a 200 kilogauss), los valores de las frecuencias de resonancia de los núcleos atómicos se encuentran localizadas en la banda de los MHz del espectro electromagnético. Otra de las diferencias fundamentales entre la espectroscopia de RMN y otras espectroscopias como Visible-UV o IR radica en que para la RMN la condición de resonancia expresada mediante la ecuación B.18, se puede alcanzar de dos formas diferentes, pudiendo ser inducido un tránsito entre dos niveles de energía concretos variando la frecuencia de la radiación que provoca dicho tránsito (ν) o variando la intensidad del campo magnético externo aplicado (B0). Esto es consecuencia del hecho de que la diferencia de energía entre los diferentes niveles energéticos nucleares depende de un parámetro experimental como es la intensidad del campo magnético estático aplicado (figura B.2). ∆E ∆E1 ∆ E2 ∆ E3 ∆E4 (Β0)1 (Β0)2 (Β0)3 (Β0)4 Estado β E stado α Figura B.2.- Variación de la distancia entre los niveles de Zeeman (para un núcleo con I= ½) en función del campo magnético estático aplicado. Si la frecuencia de resonancia de un determinado núcleo atómico correspondiera exactamente a la expresada en la ecuación B.19, la técnica de RMN tendría poca aplicabilidad práctica ya que en dicha ecuación sólo aparecen reflejados dos parámetros experimentales: el campo magnético externo aplicado B0 (que es igual para todos los núcleos de una muestra) y la razón giromagnética γ (que es igual para un determinado tipo de núcleos, véase tabla B.1). De esta forma sólo podríamos detectar qué tipos de núcleos están presentes en la muestra (1H, 13C, 371 Apéndice B etc.). Afortunadamente, existe un factor denominado apantallamiento electrónico, que introduce elementos diferenciadores entre los núcleos de la misma especie presentes en una molécula y que nos va a permitir distinguir unos de otros. Hasta ahora se han considerado los efectos que causa sobre una molécula el hecho de someterla a la acción de un campo magnético estático B0 (la molécula se magnetiza, se desdoblan sus niveles de energía nuclear, etc.), pero no hemos considerado que la muestra, en cierta manera, también produce una perturbación del campo magnético aplicado B0. El momento angular de un núcleo atómico (y el de los electrones que le rodean), posee un movimiento de precesión alrededor de la dirección del eje de aplicación del campo externo (dirección z). Este movimiento se conoce con el nombre de precesión de Larmor. Debido a dicho movimiento de precesión, en cada núcleo atómico se genera un campo magnético secundario que actúa en su conjunto a favor o en contra del campo aplicado. Para un núcleo atómico, este campo es normalmente muy pequeño. Pero en el caso de los electrones que rodean a esos núcleos, los efectos que causan sobre el campo magnético efectivo que actúa sobre el núcleo son importantes. Por ello, se debe considerar la magnetización de un núcleo desde dos puntos de vista diferentes. Por un lado, existe un efecto global macroscópico que se debe a que toda la muestra en su conjunto es magnetizada al ser introducida en un campo magnético. Esta magnetización es proporcional a la intensidad del campo aplicado (B0), afectando a todos los núcleos por igual. De esta forma la muestra genera un campo magnético inducido que actúa reforzando o debilitando el campo externo aplicado. La constante que caracteriza esta magnetización global de la muestra se conoce como susceptibilidad magnética (χ). Se denominan sustancias diamagnéticas a aquellas que poseen una susceptibilidad magnética negativa (χ<0). Así, la magnetización inducida en la muestra se opone al campo aplicado externamente, haciendo que el campo magnético efectivo que actúa sobre los núcleos sea inferior al aplicado. En general, este efecto es muy pequeño. Son sustancias paramagnéticas aquellas que poseen una susceptibilidad magnética positiva (χ>0), y son especies que poseen átomos con electrones desapareados. Su efecto, que es mucho más notable que el producido por las sustancias diamagnéticas, es el de reforzar el campo aplicado exteriormente. Hay que indicar que el uso de sustancias paramagnéticas en RMN está altamente desaconsejado (sólo en determinadas ocasiones se realiza de forma explícita), ya que dichas sustancias interaccionan de forma muy intensa con los diferentes núcleos de la muestra por la acción de los electrones desapareados, provocando una relajación muy efectiva de dichos núcleos y una disminución de la intensidad de las señales de RMN. 372 Apéndice B Por otro lado, existe un efecto local microscópico que actúa sobre cada núcleo de forma individual y que es producido por los electrones que rodean a dicho núcleo. El movimiento de precesión de un núcleo atómico implica el consiguiente movimiento de los electrones que le rodean figura B.3, lo que genera una corriente eléctrica (i) que lleva asociada su correspondiente campo magnético (Bi). La velocidad angular de dicha corriente es: 0 e iB m2 e⎟ ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎜ ⎝ ⎛ =ω [B.20] El signo en la ecuación B.20 implica que la corriente inducida sigue el sentido de las agujas del reloj respecto al vector B0, al revés que la rotación del momento magnético del núcleo µ. El momento magnético inducido µi para un solo electrón a una distancia r del núcleo viene dado por la ecuación: θ ⎟ ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎜ ⎝ ⎛ −=µ 2 0 2 e 2 isenBr m4 e [B.21] donde θ es el ángulo entre los vectores r y B0. B0 Bi µ i i (a) (b) Figura B.3.- (a) Circulación de la nube de carga electrónica bajo la influencia de un campo magnético. (b) Campo magnético secundario inducido por la precesión. El campo magnético total que actúa sobre el núcleo es el resultante del campo magnético aplicado B0 y del campo magnético inducido Bi que, como se puede observar en la figura B.3, son opuestos. Así el campo efectivo es menor que 373 Apéndice B Los acoplamientos indirectos ocurren por más de un mecanismo, pero se puede visualizar fácilmente el proceso desde un punto de vista clásico a través del llamado modelo vectorial de Dirac. Para un determinado núcleo, la conformación más estable es aquella en la que el espín nuclear y el espín electrónico son antiparalelos. (b) H (a) H C D D Figura B.7.- Modelo vectorial de Dirac para acoplamientos (H,H) en (a) un sistema HD y (b) un sistema HCD. Las flechas gruesas representan a los espines nucleares y la finas a los electrónicos. Si se considera un sistema formado por dos núcleos H-D enlazados entre sí (figura B.7.a), la situación de mayor estabilidad para el átomo H corresponde a aquella en la que el espín nuclear y el espín electrónico son antiparalelos. Si ahora se considera el enlace químico formado por ambos núcleos, en virtud del principio de exclusión de Pauli, en el orbital enlazante los espines de electrones de los átomos H y D deben ser antiparalelos. Para el núcleo D la situación de mayor estabilidad corresponde también a aquella en que el espín del electrón y el espín del núcleo D están situados de forma antiparalela. Así, indirectamente, la posición del espín nuclear H condiciona la posición del espín nuclear D, siendo ambos paralelos en la situación de máxima estabilidad. Este acoplamiento viene caracterizado por una constante de acoplamiento que se define como J>0. Para un sistema formado por tres núcleos enlazados entre sí H-C-D, el modelo de Dirac es igual de sencillo, siempre que los electrones enlazantes estén todos localizados. Como se puede observar en la figura B.7.b, los núcleos H y D tienen ahora sus espines en posición paralela, dando lugar a una constante de acoplamiento que se define como J<0. 380 Apéndice B Siguiendo una secuencia lógica, los núcleos separados por un número impar de enlaces presentarían constantes de acoplamiento positivas, y los núcleos separados por un número par de enlaces presentarían constantes de acoplamiento negativas. Esta regla no suele cumplirse habitualmente ya que el modelo de Dirac es un modelo muy simple, y falla en muchas ocasiones. Puesto que existe una interacción entre cada átomo que interviene en el acoplamiento, el modelo de Dirac prevé que la magnitud de la constante J se vaya atenuando paulatinamente al ir aumentando el número de núcleos implicados. Para sistemas saturados, se considera que el acoplamiento deja de ser efectivo cuando están implicados más de cuatro enlaces. Los acoplamientos indirectos son los responsables del desdoblamiento de las señales observadas en un espectro de RMN. A continuación se analizan los motivos por los que se producen dichos desdoblamientos. Considérese un sistema sencillo formado por dos núcleos con espín diferente de cero, I1 e I2. Experimentalmente, se observa que la señal producida por el núcleo I1 se desdobla en 2I2+1 señales de la misma intensidad. Igualmente, la señal producida por el núcleo 2 se desdobla en 2I1+1 señales de la misma intensidad. La separación entre las líneas de I1 es la misma que la separación entre las líneas de I2. Este fenómeno sugiere una relación entre el número de desdoblamientos de la señal de un determinado núcleo y el número cuántico magnético de espín (mI) del núcleo que interacciona con él. Así, si se considera la propiedad de espín como un movimiento de rotación del núcleo sobre su propio eje (visión clásica de la propiedad de espín), la rotación de una partícula cargada (a una velocidad angular determinada y con un sentido de giro concreto) se verá afectada por la presencia en sus cercanías de otra partícula rotatoria cargada. Esta interacción dependerá del sentido de giro de la segunda partícula (figura B.8). mI(A)= -1/2 mI(X)= +1/2 mI(A)= -1/2 mI(X)= -1/2 E1 E2 Figura B.8.- Para un sistema con I = 1/2 (mI =+1/2, mI =-1/2) existen dos situaciones energéticas diferentes por lo que se producen dos señales en el espectro de RMN. 381 Apéndice B Al existir dos situaciones energéticas diferentes (figura B.8) se producirán dos señales diferentes. Como se puede observar, para un sistema de dos espines no acoplados (figura B.9 izquierda), la transición α−β de uno de ellos es independiente del estado del otro, apareciendo en este caso una única señal en el espectro. Pero si los dos núcleos están acoplados (figura B.9 derecha), se produce un desdoblamiento de los niveles de energía debido a las dos situaciones representadas en la figura B.8. Ahora la energía del tránsito α−β de un núcleo depende del espín del núcleo vecino. Al existir dos transiciones de energía diferente (E1 y E2) aparecen dos señales en el espectro. α β β y β α α β β β E E1E2 α Figura B.9.- Origen del desdoblamiento de las señales de RMN. No es frecuente observar el acoplamiento entre espines para sistemas de espín I>½ ya que poseen una velocidad de relajación muy rápida y apenas permanecen en estado excitado. Las constantes de acoplamiento, al igual que la frecuencia de resonancia de los núcleos, dependen del entorno químico de los núcleos y por ello resultan de utilidad en la determinación estructural de las moléculas. Es muy importante tener presente que la frecuencia del campo magnético aplicado no afecta a la magnitud de las constantes de acoplamiento (mientras que sí afectaba a las frecuencias de resonancia). Este hecho se debe a la naturaleza de dichos desdoblamientos, cuyo origen está en la creación de diferencias de energía en los niveles de Zeeman y aunque el valor absoluto de la energía de dichos niveles dependa del campo aplicado, el valor relativo de las variaciones sufridas por los acoplamientos entre espines es el mismo. Puesto que los desplazamientos químicos (en valor relativo, no en valor absoluto referenciado al TMS) se ven afectados por el campo aplicado, y las 382 Apéndice B constantes de acoplamiento no, la apariencia de un espectro de RMN cambia en función del equipo con el que ha sido determinado (figura B.10). Si el campo no es lo suficientemente intenso, podría no llegar a apreciarse el desdoblamiento de las señales. El acoplamiento espín-espín se transmite a través de los electrones enlazantes de las moléculas. Por ello, sólo existe acoplamiento indirecto intramolecular. Acoplamiento múltiple.- Cuando el núcleo considerado se encuentra acoplado con más de un núcleo vecino, el número, posición e intensidad relativa de los desdoblamientos de las señales va a depender de las constantes de acoplamiento entre los diferentes núcleos. X A TMS δ 7 4 0 X A TMS δ 7 4 0 a) b) 10 Hz 10 Hz 10 Hz 10 Hz Figura B.10.- Espectro de RMN de un sistema de dos núcleos acoplados (A y X) en un equipo de RMN con campo magnético intenso (a) y pequeño (b). Suponiendo que un núcleo A está acoplado con un único núcleo X, con una constante JAX característica de este acoplamiento, la señal del espectro se desdobla en dos señales (para núcleos con espín ½) de la misma intensidad (figura B.11). A este tipo de señal se le denomina doblete. Si el núcleo A está acoplado con dos núcleos diferentes X y M, existirá una constante característica para cada acoplamiento (JAX y JAM). En primer lugar la señal A sufre un desdoblamiento debido a su acoplamiento con el núcleo X. A continuación pueden presentarse tres situaciones 383 Apéndice B diferentes, en función de la relación de las constantes de acoplamiento (JAX > JAM, JAX = JAM y JAX < JAM). Todas ellas se pueden observar en la figura B.12. En el primer y en el último caso se observarían cuatro señales para el núcleo A. Este tipo de señal se denomina doble doblete y todas las señales tendrían igual intensidad. En el segundo caso sólo se observarían tres señales, teniendo la del medio el doble de intensidad que las otras dos. A este tipo de señal se le denomina triplete y es típica de sistemas en los que X=M (núcleos magnéticamente equivalentes). JAX Figura B.11.- Acoplamiento de un núcleo A con un núcleo X. JA X J A XJ A X J A MJ A M JAM JAM J A MJ A M (a) (b) (c) Figura B.12.- Acoplamiento de un núcleo A con dos núcleos diferentes X y M bajo tres suposiciones distintas: (a) JAX < JAM, (b) JAX = JAM, (c) JAX > JAM. Por último, si se considera que un núcleo A está acoplado con más de tres núcleos diferentes X, M, R, ..., se deberá plantear la existencia de una constante Jik característica de cada acoplamiento (esto es JAX, JAM, JAR, ...). La situación que así se obtiene es tremendamente compleja ya que, por ejemplo para un sistema de 4 espines acoplados, las combinaciones que pueden ocurrir son múltiples en función de los valores relativos de las constantes Jik. De esta forma se suelen obtener 384 Apéndice B grupos de señales múltiples. Para el núcleo A, obtendríamos 2n-1 líneas (siendo n el número total de átomos acoplados entre sí). Este tipo de señales se denomina genéricamente como multiplete y no se suelen analizar debido a su complejidad. Un caso particular sencillo, es aquel en que todos los núcleos acoplados con el núcleo observado (A) son magnéticamente idénticos. Tal y como se observa en la figura B.13, para un núcleo acoplado con n núcleos magnéticamente equivalentes aparecen n+1 señales cuya relación de intensidades viene dada por el triángulo de Pascal. Estas reglas sólo son aplicables cuando tratamos con núcleos de la misma especie acoplados entre sí, y cuando la separación de las señales espectrales es grande en relación con las constantes de acoplamiento (espectros de primer orden), no siendo válidos en los denominados espectros de segundo orden, en los que la separación entre las señales de los distintos núcleos es comparable a las constantes de acoplamiento, produciéndose entonces un solapamiento de las señales que complican la interpretación de los espectros de RMN. Núcleo A Nº de núcleos Intensidad acoplados de las señales 1 2 3 4 5 1 : 1 1 : 2 : 1 1 : 3 : 3 : 1 1 : 4 : 6 : 4 : 1 1 : 5 : 5 : 10 : 10 : 5 : 5 : 1 Figura B.13.- Método de los desdoblamientos sucesivos e intensidad relativa de los mismos para un núcleo acoplado con n núcleos equivalentes. B.1.c.- Tipos de intercambio según los tiempos de los experimentos de RMN Como se ha descrito con anterioridad, el desplazamiento químico observado para un determinado núcleo depende del entorno químico de éste, ya que el apantallamiento electrónico al que está sometido depende en gran medida del ambiente que le rodea. Así, si un núcleo sufre un proceso de cualquier tipo en el 385 Apéndice B que su entorno electrónico se vea afectado, se podrá observar experimentalmente una variación en la frecuencia de resonancia de dicho núcleo. Es evidente que durante un proceso, por ejemplo de asociación, los núcleos atómicos de las dos moléculas que interaccionan situados en las proximidades del lugar de asociación van a sufrir un cambio importante en su entorno, causado básicamente porque, antes de la interacción estaban rodeadas de disolvente, y después éste se sustituye por partes de la otra molécula. De esta forma cambia la polaridad del entorno de ambas moléculas. Esta situación es detectable experimentalmente observándose un resultado diferente en función de la velocidad con la que ocurre un proceso de asociación (por ejemplo, una complejación) comparado con la escala de tiempos de RMN (figura B.14). Se dice que el sistema está bajo un régimen de intercambio lento si el proceso de entrada y salida de la molécula huésped es muy lento en comparación con la escala de tiempos de la RMN, esto es, si la detección de la señal (que se corresponde con el proceso de relajación de los núcleos desde estados excitados al estado fundamental y que en RMN va desde 10-6 a 1 segundo) es más rápida que la entrada y salida del huésped del interior de la ciclodextrina. En este caso se podrán detectar los dos estados de la ciclodextrina por separado (no complejada y complejada), y en el espectro de RMN se observan dos señales bien diferenciadas. La intensidad relativa de ambas señales será proporcional a la fracción de cada una de las dos especies presentes en equilibrio (figuras B.14 y B.15). Por otro lado, se dice que el sistema está bajo un régimen de intercambio rápido si el proceso de entrada y salida de la molécula huésped es muy rápido en comparación con la escala de tiempos de la RMN. En este caso sólo se va a detectar una única señal, cuya posición será un promedio ponderado de la correspondiente a cada una de las dos especies por separado (figuras B.14 y B.16). Así, para un proceso de complejación, la posición de la señal observada experimentalmente (δobs) vendrá dada por la ecuación: CCCDCDobs f nf δ+δ=δ [B.32] en la que fCD y fC representan las fracciones de ciclodextrina sin complejar y complejada. Evidentemente, ambos términos satisfacen la condición: fCD + n fC =1 [B.33] 386 Apéndice B Figura B.14.- Posibles situaciones observadas en RMN para el proceso de complejación de una ciclodextrina: (a) Señal característica de un determinado núcleo de la ciclodextrina (δCD). (b) Señal característica de ese mismo núcleo en el complejo (δC). (c) Espectro observado bajo un régimen de intercambio lento. δCD δC δobs 1 δobs 2 δCD δC δobs 1 δobs 2 (d) Espectro observado bajo un régimen de intercambio rápido (δobs). CD + H ⇄ C Figura B.15.- Señal observada en RMN par a n proceso de complejación bajo intercambio ento. u l [ ] I1 [] 1 2 ICD = I C I2 4 3,5 3 ppm 387 Apéndice B F u r igura B.16.- Señal observada en RMN para n proceso de complejación bajo intercambio ápido. B.2.- BALANZA DE TENSIÓN SUPERFICIAL B.2.a.- Fundamentos físicos5 Comportamiento de adsorción de equilibrio. La tensión superficial, propiedad termodinámica de los sistemas de más de un componente fluido separados por una interfase, se define como el trabajo que debe realizar el sistema líquido-líquido o líquido-gas para aumentar el área de separación de ambos fluidos. La adsorción de una sustancia en una interfase líquido-líquido o líquidogas, es un fenómeno dinámico, y por ello se consideran dos tipos de estudios de la tensión superficial. En este apartado nos referiremos esencialmente al segundo de ellos. • Estudio dinámico de la tensión superficial (DST). • Estudio de la tensión superficial de equilibrio (EST). En la bibliografía se pueden encontrar diferentes métodos para la determinación de la tensión superficial de equilibrio de un sistema.5 Ésta, se obtiene básicamente por medio del control del comportamiento de la tensión dinámica de una disolución, esperando a que se alcance un valor constante. La curva típica correspondiente a la variación de la tensión superficial con el tiempo (figura B.17) puede dividirse en cuatro etapas, de acuerdo con el criterio de Rosen:6 región de inducción; región de caída rápida; región de meso-equilibrio y región de equilibrio. 3,5 3 ppm CD + H ⇄ C δobs 4 388 Apéndice B Figura B.17.- Variación con el tiempo de la tensión superficial de una disolución 3,84 µM de Triton X-100 a 25ºC. γe corresponde a la tensión superficial de equilibrio.5 γ e 75 70 65 60 55 t (s) γ (mN/m) 10-1 100 101 102 103 104 No es fácil relacionar cada una de estas etapas con modelos concretos de transferencia de masa entre la interfase y el seno de la disolución. Por ello, sólo interesa recordar que existe un cierto intervalo de tiempo necesario para alcanzar un estado de equilibrio, que depende de las características del sistema objeto de estudio. La tensión superficial correspondiente γe, reflejo de las interacciones a nivel interfacial, se verá afectada por la presencia en disolución de otros compuestos. Si estas impurezas son muy activas superficialmente, pueden afectar al estudio realizado aunque estén presentes en cantidades mínimas. Este aspecto debe considerarse con cuidado ya que puede conducir a errores, atribuyendo el valor de γe de la impureza a la sustancia tensioactiva que se está analizando (figura B.18). Figura B.18.- Tensión superficial de un surfactante contaminado por una impureza superficialmente activa.5 10-7 10-5 10-3 10-1 100 80 60 40 20 0 t (h) Impureza Surfactante γ (mN/m) γe γe 389