Diseño de un método basado en la técnica molecular LAMP para la detección de Klebsiella pneumoniae

FACULTADE DE CIENCIAS GRAO EN BIOQUÍMICA D.ª Icía Bermúdez Fornos Diseño de un método basado en la técnica molecular LAMP para la detección de Klebsiella pneumoniae. Traballo Fin de Grao Xuño 2024 1 Resumen Diseño de un método basado en la técnica molecular LAMP para la detección de Klebsiella pneumoniae. Klebsiella pneumoniae es una bacteria gram negativa incluida dentro del grupo ESKAPE y uno de los principales patógenos oportunistas causante de infecciones nosocomiales. La propagación de cepas que combinan hipervirulencia con multirresistencia a fármacos, hace necesario el desarrollo de métodos rápidos para la detección de este patógeno. Por ello, el objetivo de este trabajo fue el de desarrollar un método basado en la técnica molecular LAMP para la detección rápida de este patógeno en tres matrices biológicas: sangre, orina y leche. Para ello, se probaron y compararon cuatro métodos simples de extracción de ADN diferentes. Se optimizó el ensayo con chelex como método seleccionado para la extracción de ADN, y tras un enriquecimiento de las muestras de 6 horas, se obtuvo un límite de detección del 95% (LOD95) cercano a 2 UFC/mL para leche y orina, y a 5 UFC/mL para sangre. Finalmente, este método fue aplicable a LAMP colorimétrico con SYBR Green I como método de detección, obteniéndose un LOD95 cercano a 1 UFC/mL en sangre y orina, y a 3 UFC/mL en leche. Esto permitió llevar a cabo los ensayos LAMP en menos de una jornada laboral y con un equipamiento tan sencillo como un termobloque, lo que hace apta a la técnica para ser aplicada en puntos de interés. Palabras clave: LAMP, Klebsiella pneumoniae, detección rápida de patógenos, ESKAPE, extracción ADN, chelex, sangre, orina, leche. 2 Resumo Deseño dun método baseado na técnica molecular LAMP para a detección de Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae é unha bacteria gram negativa incluída dentro do grupo ESKAPE e un dos principais patóxenos oportunistas causante de infeccións nosocomiais. A propagación de cepas que combinan hipervirulencia con multirrestencia a fármacos, fai necesario o desenvolvemento de métodos rápidos para a detección deste patóxeno. Por iso, o obxectivo deste traballo foi o de desenvolver un método baseado na técnica molecular LAMP para a detección rápida deste patóxeno en tres matrices biolóxicas: sangue, ouriños e leite. Para iso, probáronse e comparáronse catro métodos simples de extracción de ADN diferentes. Optimizouse o ensaio con chelex como método seleccionado para a extracción de ADN, e tras un enriquecemento das mostras de 6 horas, obtívose un límite de detección do 95% (LOD95) próximo a 2 UFC/mL para leite e ouriños, e a 5 UFC/mL para sangue. Finalmente, este método foi aplicable a LAMP colorimétrico con SYBR Green I como método de detección, obténdose un LOD95 próximo a 1 UFC/mL en sangue e ouriños, e a 3 UFC/mL en leite. Isto permitiu levar a cabo os ensaios LAMP en menos dunha xornada laboral e cun equipamento tan sinxelo como un termobloque, o que fai apta á técnica para ser aplicada en puntos de interese. Palabras chave: LAMP, Klebsiella pneumoniae, detección rápida de patóxenos, ESKAPE, extracción ADN , chelex, sangue, ouriños, leite. 3 Summary Design of a method based on the LAMP molecular technique for the detection of Klebsiella pneumoniae. Klebsiella pneumoniae is a gram-negative bacterium that is included in the ESKAPE group and one of the main opportunistic pathogens causing nosocomial diseases. The spread of strains that combine hypervirulence with multidrug resistance, makes it necessary to develop rapid methods for the detection of this pathogen. Thus, the aim of this study was to develop a method based in the molecular technique LAMP for the rapid detection of this pathogen in three biological matrices: blood, urine and milk. To this end, four different simple methods for DNA extraction were tested and compared. The assay was optimised with chelex as the selected method for DNA extraction, and after a 6 hours enrichment of the samples, a limit of detection of 95% (LOD95) close to 2 CFU/mL was obtained for milk and urine, and close to 5 CFU/mL for blood. Finally, this method was applicable to colorimetric LAMP with SYBR Green I as the detection method, achieving a LOD95 close to 1 CFU/mL in blood and urine, and 3 CFU/mL in milk. This allowed the LAMP assays to be carried out in less than a working day and with equipment as simple as a thermal block, making the technique suitable for point-of-care applications. Keywords: LAMP, Klebsiella pneumoniae, rapid pathogen detection, ESKAPE, DNA extraction, chelex, blood, urine, milk. 4 Índice 1. Introducción ........................................................................................................... 6 1.1. Clasificación y características generales de Klebsiella pneumoniae ............... 6 1.2. Factores de virulencia ...................................................................................... 8 1.3. Resistencia a antibióticos ................................................................................. 9 1.4. Técnicas moleculares para la detección de patógenos ................................. 10 2. Objetivos .............................................................................................................. 16 3. Materiales y métodos .......................................................................................... 17 3.1. Cepas bacterianas y medio de cultivo ........................................................... 17 3.2. Extracción de ADN ......................................................................................... 17 3.2.1. Lisis térmica directa ............................................................................................ 18 3.2.2. Chelex ................................................................................................................. 18 3.2.3. Lisis térmica con purificación por beads magnéticas. ......................................... 19 3.2.4. Lisis térmica con purificación por Glass milk ...................................................... 20 3.3. Ensayos LAMP ............................................................................................... 21 3.3.1. Diseño de los cebadores ..................................................................................... 21 3.3.2. Enriquecimiento de las muestras ........................................................................ 22 3.3.3. Ensayos LAMP a tiempo a real (qLAMP) ............................................................ 22 3.3.4. Determinación del rango dinámico ...................................................................... 22 3.3.5. Determinación del límite de detección (LOD) y otras medidas analíticas ........... 23 3.3.6. Ensayos LAMP colorimétricos ............................................................................ 23 4. Resultados ........................................................................................................... 25 4.1. Comparación de los protocolos de extracción de ADN .................................. 25 4.2. Límite de detección ........................................................................................ 32 5. Discusión ............................................................................................................. 38 6. Conclusión ........................................................................................................... 44 7. Bibliografía ........................................................................................................... 45 5 Abreviaturas ADNe: ADN extracellular B3: Backward outer primer BHI: Brain Heart Infusion BIP: Backward inner primer BLEE: Betalactamasas de espectro extendido CECT: Colección Española de Cultivos Tipo cKP: Klebsiella pneumoniae clásica cLAMP: LAMP colorimétrico con SYBR Green I EMA: Monoazida de etidio F3: Forward outer primer FIP: Forward inner primer hvKP: Klebsiella pneumoniae hipervirulenta KpI: Klebsiella pneumoniae KpII: Klebsiella quasipneumoniae KpIII: Klebsiella variicola LAMP: Amplificación isotérmica mediada por bucle LB: Backward loop primer LF: Forward loop primer LOD: Límite de detección NA: Nutrient Agar PCR: Reacción en cadena de la polimerasa PMA: Monoazida de propidio POD: Probabilidad de detección qLAMP: LAMP a tiempo real qPCR: PCR cuantitativa SHV-1: Penicilinasa cromosómica TSB: Soja triptona WHO: World Health Organization 6 1. Introducción 1.1. Clasificación y características generales de Klebsiella pneumoniae La era de los antibióticos comenzó en 1928 con la llegada de la penicilina, lo que constituyó un detonante para el desarrollo de la medicina moderna. Sin embargo, el abusivo uso de antibióticos, la automedicación y la exposición a infecciones en hospitales, han tenido como resultado la aparición de bacterias con multirresistencia a fármacos (Mulani et al., 2019). En 2008, Rice agrupó bajo el término ESKAPE a aquellas bacterias patógenas que evadían la acción de los antibióticos y que además eran paradigmas en cuanto a patogénesis, transmisión y resistencia. Dentro de este grupo incluyó a los siguientes organismos: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp. (Rice, 2008). Estos patógenos son altamente virulentos, responsables de la mayoría de las infecciones nosocomiales y capaces de evadir la acción biocida de los agentes antimicrobianos (Navidinia, 2016; Rice, 2008). K. pneumoniae es una bacteria Gram negativa encapsulada, carente de motilidad y comúnmente está presente en el ambiente, incluyendo el suelo, la superficie del agua y dispositivos médicos (Paczosa & Mecsas, 2016). Esta especie bacteriana presenta un genoma 5.7 Mb (GCF_000240185.1) con entre 5000 y 6000 genes, de los cuales, la mayoría constituyen el genoma accesorio conformado por diversos genes localizados en plásmidos y cromosomas, que genera diferencias entre cepas (Holt et al., 2015; Martin & Bachman, 2018). Esto da lugar a que unas cepas sean oportunistas, otras presenten un fenotipo de hipervirulencia y otras de multirresistencia a fármacos. La mayoría del genoma está conformado por genes accesorios como los relacionados con la fijación de N2, factores de virulencia, y enzimas de resistencia a antibióticos (Martin & Bachman, 2018). Inicialmente, se consideraba a K. pneumoniae como una especie conformada por tres filogrupos diferentes, KpI, KpII y KpIII (Davis & Price, 2016). Sin embargo, se observó que el genoma accesorio separa cada uno de estos tres filogrupos en tres especies diferentes: K. pneumoniae (KpI), K. quasipneumoniae (KpII) y K. variicola (KpIII) (Davis & Price, 2016; Holt et al., 2015; Martin & Bachman, 2018). Además del genoma accesorio, presenta un genoma núcleo que se corresponde con un conjunto de genes que se encuentran conservados en las tres especies (KpI, KpII y KpIII), en más del 95 % de los genomas de las mismas (Holt et al., 2015). 7 En personas sanas, K. pneumoniae coloniza superficies mucosas como pueden ser la orofaringe, la nasofaringe y el tracto gastrointestinal (Paczosa & Mecsas, 2016; Piperaki et al., 2017). Sin embargo, K. pneumoniae es un patógeno oportunista, por lo que puede colonizar otros tejidos y causar infecciones del tracto urinario, neumonía o bacteriemias (Stojowska-swędrzyńska et al., 2022; Paczosa & Mecsas, 2016). En 1986, se observó que K. pneumoniae podía provocar también infecciones graves, o incluso la muerte, en individuos sanos además de en inmunocomprometidos (Chen et al., 2023). Se vio también como ciertas cepas bacterianas de dicha especie tenían la capacidad de invadir otros tejidos, experimentando una propagación metastásica desde los lugares que colonizaban de forma natural. Consecuentemente, daban lugar a múltiples infecciones severas, como abscesos piogénicos, endoftalmitis o meningitis (Chen et al., 2023; Martin & Bachman, 2018; Paczosa & Mecsas, 2016). De este modo, aquellas cepas responsables de provocar infecciones en personas inmunocompetentes fueron consideradas hipervirulentas con relación a las cepas clásicas (Chen et al., 2023; Paczosa & Mecsas, 2016). En la actualidad, se considera que la especie K. pneumoniae está constituida por dos principales patotipos: K. pneumoniae clásica (cKP) y K. pneumoniae hipervirulenta (hvKP) (Chen et al., 2023). Las cepas de cKP son de manera natural resistentes a la ampicilina, carbenicilina, y ticarcilina debido a la producción de penicilinasa cromosómica (SHV-1) (Piperaki et al., 2017; Stojowska‐swędrzyńska et al., 2022). No obstante, están adquiriendo cada vez más multirresistencia a fármacos debido a la presencia de determinantes de resistencia en cromosomas o elementos móviles (plásmidos y transposones) (Marr & Russo, 2019). Las infecciones provocadas por este patotipo se caracterizan clínicamente por ser nosocomiales y por producirse mayoritariamente en pacientes de avanzada edad o inmunodeprimidos. Adicionalmente, son monomicrobianas y no suelen invadir otros tejidos (Chen et al., 2023). Por otro lado, el patotipo hvKP está caracterizado por su habilidad para provocar infecciones que son adquiridas en la comunidad y que pueden poner en peligro la vida de pacientes sanos además de la de aquellos inmunodeprimidos. A diferencia de las cepas del patotipo anterior, estas sí que tienen capacidad para invadir otros tejidos y provocar infecciones polimicrobianas (Chen et al., 2023; Marr & Russo, 2019). Este patotipo difiere genéticamente del cKP debido a la adquisición de un clúster de factores de virulencia codificados en plásmidos y otros elementos genéticos móviles del 8 cromosoma (Marr & Russo, 2019). En el estudio realizado por Kang et al. (Kang et al., 2006) donde se comparaban las infecciones provocadas por K. pneumoniae nosocomiales en relación con las adquiridas en la comunidad; se demostró que las primeras, de manera general, son significativamente más resistentes a agentes antimicrobianos que en el caso de las segundas. 1.2. Factores de virulencia Un factor de virulencia de gran relevancia en las infecciones nosocomiales provocadas por K. pneumoniae es la formación de biofilms. Estos protegen al patógeno de la respuesta inmune del hospedador, de los antibióticos y potencian su supervivencia en tejidos epiteliales y superficies de dispositivos médicos (Ashwath et al., 2022). El biofilm se genera por un proceso de polimerización en el que los microorganismos se adhieren a superficies inertes o vivas por medio de una matriz exopolimérica que producen ellos mismos y que puede estar compuesta entre otros componentes por polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y ADN extracelular (ADNe) (Ashwath et al., 2022; Bertoglio et al., 2018). Por otro lado, en las cepas del patotipo hvKP, los factores de virulencia más comunes serían (1) Sistemas de sideróforos para la captación de hierro, (2) Producción aumentada de la cápsula, (3) Producción de la toxina colibactina y (4) Hipermucoviscosidad (Chen et al., 2023). Los seres humanos almacenan hierro unido a diversas proteínas, lo que limita la disponibilidad de hierro libre para las bacterias patógenas; para quienes representa un nutriente esencial para su crecimiento, replicación y metabolismo (Page, 2019). A bajas concentraciones de dicho metal, se promueve la síntesis de los sideróforos para la obtención de hierro, lo que potenciaría la letalidad del patógeno (Chen et al., 2023). Por otra parte, la sobreexpresión de la cápsula está estrechamente relacionada con la virulencia (Dorman et al., 2018). Lee et al. (I. R. Lee et al., 2017) comprobaron en su estudio que las cepas de K. pneumoniae que presentaban hipermucoviscosidad mostraban mayor tolerancia inmunitaria a las trampas extracelulares de neutrófilos. Adicionalmente, la hipermucoviscosidad se emplea para diferenciar cepas del patotipo hvKP del resto de cepas. Finalmente, la producción de colibactina es también un factor de virulencia, pues esta toxina ejerce un efecto genotóxico al unirse al ADN y romper la doble cadena de dicho ácido nucleico de la célula hospedadora (Lam et al., 2018). 15 específica (Notomi et al., 2000). Adicionalmente, esta metodología cuenta con una elevada especificidad por la secuencia diana atribuible a la gran cantidad de cebadores empleados que reconocen entre 6-8 regiones separadas (Moon et al., 2022; Notomi et al., 2000; Soroka et al., 2021). Finalmente, cabe destacar que la ADN polimerasa empleada en LAMP tiene actividad retrotranscriptasa por lo que se podrían amplificar secuencias de ARN con elevada eficiencia (Notomi et al., 2000). Otro punto destacable de esta técnica es que LAMP es menos sensible que la PCR a los inhibidores de muestras mínimamente procesadas o sin procesar como la sangre, el esputo o la orina, haciéndolo adecuado para su uso en el diagnóstico pointof-care (Notomi et al., 2000). Aun así, hay ciertas matrices complejas, como algunos alimentos, que pueden llegar a inhibir la detección de los patógenos. Un ejemplo sería el quitosano presente en el cangrejo y el langostino que provoca la agregación de las moléculas molde de ADN cargadas negativamente. Otro ejemplo serían los polisacáridos presentes en el arroz que también se ha visto que son capaces de inhibir la actividad de la ADN polimerasa (Moon et al., 2022). La técnica LAMP reduce considerablemente el tiempo de análisis, lo que ha captado la atención de los laboratorios de diagnóstico. La aplicabilidad de esta técnica en el diagnóstico de enfermedades contagiosas tanto en humanos como en animales domésticos continúa expandiéndose (Soroka et al., 2021). Esta tecnología es empleada no solo en la detección de numerosas enfermedades de origen vírico, bacteriano o parasitario, sino también en inspección para la seguridad alimentaria y cosmética (Q. Zhang et al., 2023). 16 2. Objetivos El objetivo principal de este estudio es el desarrollo y optimización de un método basado en la técnica molecular isotérmica LAMP para la detección de Klebsiella pneumoniae en sangre, orina y leche. Para ello se establecieron los siguientes subobjetivos: a) Evaluar cuatro métodos simples de extracción de ADN (lisis térmica directa, lisis térmica con beads magnéticas, lisis térmica con glass milk y chelex), en las tres matrices incluidas en el estudio. b) Optimizar el flujo de trabajo con el método de extracción seleccionado para conseguir una detección rápida de K. pneumoniae reduciendo el tiempo del ensayo a una jornada laboral (8h). c) Determinar el límite de detección (LOD) del método en cada una de las matrices. 17 3. Materiales y métodos 3.1. Cepas bacterianas y medio de cultivo Como microorganismo de referencia se empleó la cepa WDCM 00192 de la especie K. pneumoniae, adquirida de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Esta bacteria fue seleccionada para llevar a cabo la optimización y evaluación del método. Se reconstituyeron las células bacterianas liofilizadas de la cepa de referencia en medio líquido Brain Heart Infusion (BHI; Merck KGaA Darmstadt, Alemania) y se incubaron a 37 °C durante la noche. Posteriormente, se pasaron a placas con medio de cultivo Nutrient Agar (NA, Nutrient Broth VWR chemicals, EC y Agar-agar polvo, VWR chemicals, España) para las que se emplearon 3,75 g de agar-agar por cada 250 mL de medio. Tras incubar las placas a 37 °C durante 24 horas, se tomaron colonias bacterianas de las mismas para la preparación del Estándar de turbidez de McFarland. Para ello se empleó el fotómetro (Photometer DEN-600, Grant-bio) donde una absorbancia de 0,2 equivaldría aproximadamente a 108 UFC/mL. A partir de esta solución obtenida, se realizaron diluciones seriadas 1:100 y se sembraron en placas con medio de cultivo NA, que tras ser incubadas a 37 °C durante 24 horas, sirvieron para realizar un recuento de las colonias, y por lo tanto, para conocer la concentración bacteriana inicial de la solución. Esta fue empleada para inocular las diferentes matrices, sangre, orina y leche, utilizadas en los diversos ensayos llevados a cabo. 3.2. Extracción de ADN El ADN fue extraído siguiendo los diferentes protocolos que se detallan a continuación; con el objetivo de seleccionar aquel que sea más adecuado para la detección del microorganismo de referencia seleccionado. Para todos los métodos se realizó una centrifugación inicial de 16000×g durante 2 minutos (Centrifuge 5415D, Eppendorf) con el posterior descarte del sobrenadante. Adicionalmente, en el caso de la extracción de ADN con sangre como matriz, fue necesario incubar 900 µL de la misma en 100 µL de una solución de lisis constituida por NH4Cl al 0,8 % (Merck, KGaA Darmstadt, Alemania) durante 10 minutos antes de la centrifugación inicial. Tras dicha centrifugación, se realizó un lavado del pellet con 1 mL 18 de PBS con pH 7,4 (Invitrogen, Thermofisher Scientific) con su respectiva centrifugación y descarte del sobrenadante. Al realizar la extracción de los ácidos nucleicos en leche, tras la primera centrifugación se generó una capa de grasa, que se eliminó con una espátula. Posteriormente se realizó un lavado del pellet con 1 mL de PBS y a continuación se sometió a una segunda centrifugación. Para cultivos frescos puros u orina no fueron necesarios pasos extra de incubación con solución de lisis o de lavado con PBS. En cuanto a la preservación del ADN purificado obtenido, se almacenó refrigerado (4 °C) para su aplicación a corto plazo, o congelado (-20 °C) a largo plazo. 3.2.1. Lisis térmica directa Se siguió el protocolo de Ribeiro-Costa et al. (Costa-Ribeiro et al., 2024) para la extracción del ADN (Figura 3). Así, tras la centrifugación inicial, el pellet se resuspendió en 100 µL de agua libre de nucleasas y posteriormente se calentó a 99 °C durante 5 minutos a 1400 rpm en un termobloque. Posteriormente se centrifugó a 16000×g durante 2 minutos y se preservó el sobrenadante 3.2.2. Chelex El pellet se resuspendió directamente en 100 µL de Chelex® al 6 % (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) y se incubó durante 15 minutos a 56 °C y 1400 rpm e inmediatamente después, se calentó a 99 °C durante 8 minutos y 1400 rpm. Ambos pasos fueron ejecutados en un termobloque para microtubos de 1,5 mL (Thermomixer comfort, Eppendorf AG, Hamburg, Germany). Para finalizar, se centrifugó a 16000×g y se preservó el sobrenadante, donde se encontraba el material genético ya purificado, teniendo cuidado de no arrastrar resina (Figura 4). Figura 3. Resumen gráfico del protocolo para la extracción de ADN por lisis térmica directa. Creado con www.biorender.com 19 3.2.3. Lisis térmica con purificación por beads magnéticas. Este protocolo está basado en el descrito por Costa-Ribeiro et al. (Costa-Ribeiro et al., 2024) con leves modificaciones (Figura 5). El pellet se resuspendió en 100 µL de agua libre de nucleasas y se calentó a 99·°C por 5 minutos a 1400 rpm en un termobloque. A continuación, se centrifugó a 16000 ×#g, se descartó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 100 µL de beads magnéticas Mag-Bind® (Omega Bio-tek, Inc. Georgia, USA). Esta mezcla se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de balanceo (SBS). Posteriormente, empleando un concentrador de beads magnéticas (Dynal® MPC, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), se concentraron las beads de la solución durante 2 minutos, y con cuidado se eliminó el sobrenadante. Se realizaron dos lavados del pellet con etanol al 70 %, y finalmente, tras secarlo al aire, se añadieron 100 µL de agua libre de nucleasas que funcionó como eluyente. Finalmente se separaron las beads magnéticas, y se preservó el sobrenadante, pues este contenía el ADN purificado. Figura 4. Resumen gráfico del protocolo para la extracción de ADN con Chelex®. Creado con www.biorender.com 20 3.2.4. Lisis térmica con purificación por Glass milk En este caso, para llevar a cabo la purificación del ADN, se siguió el protocolo de Page et al. (R. Page et al., 2022a, 2022b) pero realizando algunas modificaciones (Figura 6). Primeramente, se resuspendió el pellet en 100 µL de agua libre de nucleasas junto con 100 µL de una solución de SDS al 4 %. Tras esto, se incubó en un termobloque a 99 °C y 1400 rpm durante 5 minutos. A continuación, teniendo en cuenta que la lisis ya había tenido lugar, se añadieron 400 µL de isopropanol puro, 200 µL de una disolución de NaCl 1.25 M y 10 µL de glass milk. Posteriormente, se incubó 5 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó en una minicentrífuga (Thermo Scientific, mySPIN6) 15 segundos; preservando el pellet. Se realizaron dos lavados del pellet con etanol al 70·%, con su respectiva centrifugación en la minicentrífuga y el descarte del sobrenadante. Tras esto, se volvieron a introducir en la mini centrífuga durante 30 segundos para poder eliminar con una micropipeta el exceso de etanol que hubiera podido quedar tras los lavados, y se calentó en un termobloque durante 5 minutos a 65 °C con la tapa de los microtubos abierta. Finalmente, el pellet se resuspendió en 100 µL de agua libre de nucleasas, se centrifugó durante 15 segundos en la mini centrífuga, y se preservó el sobrenadante. Figura 5. Resumen gráfico del protocolo para la extracción de ADN con partículas magnéticas. Creado con www.biorender.com 21 3.3. Ensayos LAMP 3.3.1. Diseño de los cebadores Para realizar el ensayo LAMP se diseñaron cebadores utilizando como herramienta Primer Explorer V5 (https://primerexplorer.jp/e/). Para ello se seleccionó la secuencia del gen que codifica para la hemolisina en la especie bacteriana K. pneumoniae con número de acceso NC_016845.1 en NCBI. Los cebadores diseñados se muestran en la Tabla 1. Tabla 1: Cebadores diseñados para los ensayos LAMP Nombre del cebador Secuencia (5’ à 3’) Concentración STOCK (µM) F3 TGG AAG CTG GAG CCC G 4 B3 GTG TGG ACC GAA GAA CTG C 4 FIP* GAC GAA CTT CCT GCT CGG TGT T - ACA GCG TGG GTT TTC CCG 16 BIP* GGC CAA CAA GAA GTA CAA CCG C - GTC AAC CCA ACG ATC CTG G 16 LF TTG AGA AAG GTG TGG CAG ATG C 8 LB TAC CCG CTC AAT CCC GG 8 * El “-” en FIP y BIP representa el linker conformado por TTTT. Figura 6. Resumen gráfico del protocolo para la extracción de ADN por ‘Glass Milk’. Creado con www.biorender.com 22 3.3.2. Enriquecimiento de las muestras Para mejorar la detección de K. pneumoniae en las diferentes matrices inoculadas, antes de realizar la purificación del ADN se realizó un enriquecimiento incubando 1 mL de las mismas, con 9 mL de Soja Triptona (TSB, PanReac Applichem, Castellar del Vallès, Barcelona, España) durante 6 horas en una estufa a 37 °C. Posteriormente, se procedió a la purificación del ADN y a la realización de los ensayos LAMP. 3.3.3. Ensayos LAMP a tiempo a real (qLAMP) Las reacciones LAMP que se llevaron a cabo en los diferentes ensayos, se realizaron bajo las siguientes condiciones: un volumen final de reacción de 20 µL, de los cuales 12 µL se corresponden con la Master Mix isotérmica ISO-004 (OptiGene Ltd., Horsham, UK) que contiene la ADN polimerasa GspSSD2.0, 4.7 µL de agua libre de nucleasas, 0.3 µL de ROX (colorante de referencia), 2 µL de la muestra (ADN purificado) y 1 µL de la mezcla de cebadores de un stock 20X, obteniendo así, las siguientes concentraciones finales de los mismos en la mezcla de reacción: FIP/BIP 800 nM, LB/LF 400 nM y F3/B3 200 nM. Las reacciones se llevaron a cabo a 65 °C por 30 minutos, durante los que se realizaron un total de 60 ciclos de 30 segundos, tras cada uno de los cuales, se midió la fluorescencia. Esto se llevó a cabo en el equipo QuantStudio™ 12K Flex System y se analizó con QuantStudio™ 12K Flex Software v1.2.2. (Applied Biosystems™, Foster city, CA, USA). Tras la amplificación, se realizó un análisis de las curvas de fusión, donde las muestras fueron sometidas a 95 °C durante 15 segundos, a 80 °C durante 20 segundos y finalmente se fue aumentando la temperatura 0.05 °C/s hasta alcanzar los 95 °C, midiendo la fluorescencia tras cada incremento. Un único pico de fusión entorno a los 90 °C indicaría que el ensayo es positivo para la secuencia buscada. 3.3.4. Determinación del rango dinámico Para poder determinar el rango dinámico, fue necesario obtener el ADN empleando los diferentes métodos de extracción explicados, de cultivos frescos de la cepa de referencia de la especie K. pneumoniae empleada. Posteriormente, con el ADN extraído, se realizaron 6 diluciones seriadas 1/10 en agua libre de nucleasas, y se analizó siguiendo como estrategia de detección LAMP a tiempo real. 23 3.3.5. Determinación del límite de detección (LOD) y otras medidas analíticas Se llevó a cabo por medio del método establecido por Wilrich & Wilrich (Wilrich & Wilrich, 2009). El LOD determina la concentración en UFC/g o UFC/mL con la que una muestra contaminada da positivo con una probabilidad determinada (por ejemplo, del 50 o 95 %). Para poder calcular el LOD y otras medidas analíticas como la sensibilidad, el valor negativo predictivo y la tasa de falsos negativos, se inocularon diferentes muestras de cada matriz de estudio, orina, leche y sangre, con concentraciones decrecientes de la cepa de referencia. Se enriquecieron las muestras como se especifica en Materiales y Métodos 1.3.2. y se incubaron durante 6 horas a 37 °C. Posteriormente se analizó por tres metodologías diferentes: LAMP colorimétrico (cLAMP), qLAMP y siembra en placa con medio de cultivo MacConkey Agar (VWR International bvba, Leuven, Bélgica) con incubación durante 24 horas a 37 °C. 3.3.6. Ensayos LAMP colorimétricos Se llevaron a cabo en microtubos de 1,5 mL con el mismo volumen de reacción que se ha mencionado en Materiales y Métodos 2.3.3. Para llevar a cabo el ensayo se tomó un fragmento de Parafilm® y se tapó la parte superior del microtubo, dejando un pequeño hueco sin cubrir. Posteriormente, se depositó 1 µL de una dilución 1:10 de SYBR Green·I que se encontraba en un stock de 10000X (Invitrogen™, ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA), en el Parafilm® y se cerró cuidadosamente, procurando que la gota quedara en el centro de la tapa del microtubo. Una vez preparados los microtubos, se sometió la mezcla de reacción a un calentamiento durante 30 minutos a 65 °C en un termobloque (Thermomixer comfort, Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania). Una vez transcurrido el tiempo, se introdujeron los microtubos en una minicentrífuga (Thermo Scientific, mySPIN6) para que la gota de SYBR Green I cayera en la mezcla de reacción. Así, se unió a los amplicones y a simple vista, pudimos diferenciar aquellas mezclas de reacción en las que había habido una amplificación y que, por tanto, eran positivas, de aquellas en las que esta no había sucedido. De este modo, las muestras positivas en K. pneumoniae se tornaron a un color verdoso, mientras que las negativas permanecieron de un color anaranjado. Además, el SYBR Green I unido a los amplicones, tiene la capacidad de emitir fluorescencia, por lo que, sometiéndolo a luz 24 UV se pudieron diferenciar las muestras positivas (emiten fluorescencia) de las negativas. La Figura 7 resume gráficamente el flujo de trabajo seguido que ha sido explicado a lo largo de esta sección. De este modo aparecen reflejados los diferentes pasos que han tenido lugar desde que se ha tomado la muestra, pasando por la purificación del material genético, el empleo de qLAMP, cLAMP y siembra en MacConkey Agar como métodos alternativos de detección y finalmente la visualización de los resultados. Figura 7. Representación gráfica del flujo de trabajo desde la toma de la muestra, pasando por la purificación del ADN y las tres estrategias de detección comparadas en el estudio junto con la visualización de los resultados para cada una de ellas. Creada con www.biorender.com 31 como chelex no solo es el método con el rango dinámico más amplio, sino que además la asociación lineal del mismo es mayor que la del resto de protocolos de extracción. En cuanto a la calidad del ADN obtenido tras la extracción del material genético en orina, se puede observar en la Tabla 7, como la purificación del material genético por los protocolos de lisis térmica directa o chelex, da lugar a un ratio de absorbancias 260/280 más cercano al intervalo de referencia (1,7-2,0) que el resto de los métodos de extracción. Por otra parte, los ratios de absorbancia 260/230 obtenidos se encuentran por debajo del valor de referencia, indicando la presencia de contaminantes en el extracto. Paralelamente, con relación a la concentración de ADN presente en los purificados obtenidos por cada uno de los métodos de extracción, se puede comprobar como aquellas muestras que habían sido tratadas con lisis térmica directa o chelex tienen mayor cantidad del ácido nucleico que el resto. Es mencionable que los valores elevados de concentración de ADN obtenidos tras las mediciones con el Nanodrop, son debidos a una sobreestimación derivada de los niveles de contaminación de la muestra, que interfirieron en la cuantificación del material genético. 56789 0 10 20 30 40 LOG UFC/mL Cq Matriz 3: Orina Glass milk Beads magnéticas Chelex Lisis térmica directa Y = -4.533*X + 55.93 R2= 0.7028 Glass milk Y = -2.603*X + 39.51 R2= 0.7221 Beads magnéticas Chelex Lisis térmica directa Y = -2.276*X + 32.23 R2= 0.984 Y = -2.882*X + 39.18 R2= 0.9636 Figura 10. En la gráfica se muestra el número de ciclos que tarda el equipo en detectar la presencia de K. pneumoniae frente al logaritmo de la concentración inicial de dicha bacteria en orina por cuatro métodos de purificación de ADN diferentes; Glass milk, beads magnéticas, chelex y lisis térmica directa. También aparecen descritas las ecuaciones de la recta para cada método de extracción junto con su respectivo valor de R2. 32 Tabla 7: Datos de calidad y concentración del ADN extraído en orina Muestra Concentración bacteriana* A 260/280 A 260/230 Concentración ADN† LT 2,9·108 1,6 0,4 516,6 LT 2,9·107 1,6 0,2 664,1 LT 2,9·106 1,6 0,2 817,8 LT 2,9·105 1,6 0,2 1368,1 Che 2,9·108 1,6 0,5 563,1 Che 2,9·107 1,6 0,5 585,5 Che 2,9·106 1,6 0,2 784,4 Che 2,9·105 1,6 0,2 770,0 GM 2,9·108 1,5 0,7 15,1 GM 2,9·107 1,5 0,6 20,7 GM 2,9·106 1,6 0,5 10,5 GM 2,9·105 1,5 0,4 14,3 BM 2,9·108 1,5 0,4 7,6 BM 2,9·107 1,6 0,2 4,6 BM 2,9·106 0,6 0,0 0,2 BM 2,9·105 2,6 0,1 0,5 LT: Lisis térmica directa; Che: Chelex; BM: Beads magnéticas; GM: Glass milk. *UFC/mL. †ng/ µL Al comparar las temperaturas de melting para cada una de las matrices con chelex, se observaron diferencias mínimas siendo de 89,4± 0,1°C para sangre, de 89,7±0,2 °C para leche y de 89,9 ±0,1 °C para orina. Adicionalmente, al comparar las temperaturas de melting de cada uno de los métodos de extracción, se observaron diferencias más notables que en el caso anterior, siendo de 88,6 ±2,6 °C para lisis térmica, de 88,5 ±2,3 °C para glass milk, de 89,6 ±0,2 °C para chelex y de 89,2 ±1,6 °C para las beads magnéticas. Tras recopilar y comparar todos los resultados obtenidos, se comprueba como el método chelex es la mejor opción en las tres matrices para la purificación y posterior detección del ADN. 4.2. Límite de detección Para poder calcular el LOD del ensayo para cada una de las matrices, se prepararon diferentes muestras que fueron inoculadas con diferentes concentraciones conocidas de K. pneumoniae. Inicialmente, se realizaron ensayos sin el enriquecimiento de las muestras, dando lugar a límites de detección demasiado altos. Finalmente, tras la inoculación de las muestras, estas se enriquecieron con TSB, y gracias a este paso previo a la extracción del ADN con chelex, se consiguió reducir el límite de detección del ensayo. Estas muestras se sometieron a tres métodos de detección diferentes: 1) 33 qLAMP, 2) cLAMP , 3) Siembra en MacConkey Agar. Se obtuvieron los resultados que se muestran en la Tabla 8. Tabla 8: Recopilación de los resultados obtenidos en los diferentes métodos de detección empleados para cada muestra inoculada en cada una de las matrices de estudio. UFC/mL inoculados Inoculaciones en sangre Inoculaciones en leche Inoculaciones en orina qLAMP cLAMP MacConkey Agar qLAMP cLAMP MacConkey Agar qLAMP cLAMP MacConkey Agar 50 45 40 35 30 25 20 15 15 12 10 10 9 8 7 5 5 2 2 1 0 + + - - + + + + + + + - + + - - + - + - - + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - - + + + - + + + - + + + + + + + - - + + - - + + + + + + + + + + + - + - + + + + - - - + + + - + + + + + + + - + - + + + + - + - + + + + + + + + - - + - + - - + - - - - - + + + + + + + + + + + + + + - - + - + - - + + + + + + + + + + + + + + + - + - + - - + + + + + + + + + + + + - + - - + + - + - Con los resultados obtenidos tras someter a las muestras inoculadas con K. pneumoniae a qLAMP para cada una de las matrices, se procedió al cálculo del LOD50 y LOD95 siguiendo el modelo matemático de Wilrich & Wilrich (Wilrich & Wilrich, 2009). Los límites de detección obtenidos para cada matriz junto con el intervalo de confianza se muestran en la Tabla·9. Tabla 9: Recopilación de los límites de detección y límites de confianza del método qLAMP optimizado para tres matrices: sangre, leche y orina. Matriz LOD50 %= 50 % LOD en UFC/mL LOD95 %= 95 % LOD en UFC/mL Límite de detección Límite inferior confianza Límite superior confianza Límite de detección Límite inferior confianza Límite superior confianza Sangre 1,09 0,56 2,16 4,73 2,39 9,33 Leche 0,41 0,19 0,84 1,75 0,84 3,65 Orina 0,36 0,17 0,76 1,55 0,74 3,28 LOD50: Límite de detección del 50%, LOD95: Límite de detección del 95% 34 De este modo, el menor, y por lo tanto el mejor límite de detección, se consigue en las muestras inoculadas de orina, seguido por aquellas que tienen leche como matriz y finalmente en sangre. Sin embargo, los límites de detección para las tres matrices son relativamente bajos y por lo tanto buenos valores. Al comparar las funciones POD (Probabilidad de detección) en la Figura 11; se comprueba como las funciones representadas para la leche y la orina, se acercan bastante a la función POD ideal, mientras que la función de la sangre se aleja más. También se calcularon los LOD50 y LOD95 del cLAMP para cada una de las matrices. Los límites de detección obtenidos para cada matriz junto con el intervalo de confianza se muestran en la Tabla·10. Figura 11. Representación gráfica de los datos para la determinación de LOD95 en las tres matrices para LAMP a tiempo real. Se muestran 6 curvas diferentes; POD1 que se corresponde con sangre, POD 2 con leche y POD 3 con orina. POD ideal se corresponde con la curva que presentaría un método de detección ideal, POD ideal L y POD ideal U se corresponden con el límite inferior y superior de confianza ideales respectivamente. 35 En el caso del cLAMP, los mejores límites de detección se obtienen para las muestras de sangre inoculadas, siendo las de leche las que peor límite tienen. Adicionalmente, al observar la Figura 12, se comprueba como las funciones de sangre y orina se acercan más al POD ideal en relación con la leche. Tabla 10: Recopilación de los límites de detección y límites de confianza del método cLAMP optimizado para tres matrices: sangre, leche y orina. Matriz LOD50 %= 50 % LOD en UFC/mL LOD95 %= 95 % LOD en UFC/mL Límite de detección Límite inferior confianza Límite superior confianza Límite de detección Límite inferior confianza Límite superior confianza Sangre 0,19 0,08 0,44 0,86 0,35 2,09 Leche 0,63 0,32 1,27 2,74 1,37 5,47 Orina 0,26 0,11 0,58 1,11 0,49 2,49 LOD50: Límite de detección del 50%, LOD95: Límite de detección del 95% Figura 12. Representación gráfica de los datos para la determinación de LOD95 en las tres matrices para cLAMP. Se muestran 6 curvas diferentes; POD1 que se corresponde con sangre, POD 2 con leche y POD 3 con orina. POD ideal se corresponde con la curva que presentaría un método de detección ideal, POD ideal L y POD ideal U se corresponden con el límite inferior y superior de confianza ideales respectivamente. 36 Al comparar los datos que aparecen recopilados en la Tabla 9 y Tabla 10, se pueden observar diferencias entre las dos estrategias de detección empleadas, pues al detectar colorimétricamente los productos de LAMP empleando SYBR Green I, se obtienen unos límites de detección peores para las muestras de leche y mejores para las de sangre y orina, en relación con los obtenidos por qLAMP. La sensibilidad con la que se detecta K. pneumoniae varía no solo entre las diferentes matrices de partida, sino también entre los propios protocolos de detección estudiados. De este modo, se puede observar en la Tabla 11 como la detección por cLAMP presenta una mejor sensibilidad en sangre que en orina o leche, mientras que en el caso de qLAMP la peor sensibilidad se da para esa misma matriz. En leche y orina se detecta K. pneumoniae con una sensibilidad similar independientemente de la estrategia de detección empleada. Adicionalmente, es mencionable la menor tasa de falsos negativos que presenta cLAMP para sangre y orina en relación con qLAMP, mientras que dicha tasa es igual para ambas estrategias en muestras de leche. En la Figura 13 se ilustran los resultados visualizados por cada uno de los tres métodos de detección empleados en este estudio, para un mismo nivel de inoculación (50 UFC) en cada una de las tres matrices utilizadas. En los tres métodos de detección se necesitaron 6 horas de incubación de las muestras. Para la obtención de resultados tras siembra en MacConkey agar, ilustrado en 13-A, 13-B y 13-C, se necesitaron además, 24 horas de incubación de las placas sembradas; de modo que tuvieron que pasar 30 horas hasta poder determinar si una muestra era positiva o negativa en K. Tabla 11: Otras métricas de los ensayos LAMP Métrica Fórmula Resultados qLAMP* Resultados cLAMP† Leche Sangre Orina Leche Sangre Orina Sensibilidad 𝑇𝑃 𝑇𝑃 +𝐹𝑁 0,80 0,65 0,80 0,80 0,90 0,85 Valor negativo predictivo 𝑇𝑁 𝑇𝑁 +𝐹𝑁 0,20 0,14 0,20 0,20 0,33 0,25 Tasa de falsos negativos 𝐹𝑁 𝐹𝑁 +𝑇𝑃 0,20 0,35 0,20 0,20 0,16 0,15 TP: True positive, FN: False negative, TN: True negative. *Para las tres matrices, n=21 siendo n el número de muestras inoculadas e los cuales en leche TN=1, TP=16, FN=4, en sangre TN=1, TP=13, FN=7 y en orina TN=1, TP=16, FN=4 † Para las tres matrices n=21 siendo n el número de muestras inoculadas, de los cuales en leche TN=1, TP=16, FN=4, en sangre TN=1, TP=18, FN=2 y en orina TN=1, TP=17, FN=3 37 pneumoniae. Paralelamente, en las Figura 13-E y 13-F se muestra la visualización de las mismas muestras pero por cLAMP y qLAMP respectivamente. Para ambos métodos de detección se invirtieron menos de 30 minutos en la extracción del ADN por chelex, y otros 30 minutos de amplificación, que junto con la incubación previa de las muestras, suman un total de 7 horas. De este modo se comprueba, como qLAMP y cLAMP proporcionan resultados en un tiempo menor que la siembra placa, y además cLAMP lo hace con un equipamiento sencillo. Figura 13. A, B y C colonias de K. pneumoniae en MacConkey Agar, de muestras de sangre, leche y orina inoculadas con 50 UFC de la bacteria. D diferencias de coloración entre una muestra positiva para K. pneumoniae y una negativa, empleando cLAMP como método de detección. E y F muestran el resultado de las mismas muestras sembradas en placa para cLAMP y qLAMP, respectivamente. 38 5. Discusión El objetivo de este estudio fue de desarrollar un método de detección rápida de K. pneumoniae, uno de los patógenos causantes de un mayor número de muertes debido a su resistencia a los antimicrobianos. Para ello, se empleó la técnica molecular LAMP, evaluándose su rendimiento para cuatro métodos de extracción de ADN diferentes y se optimizó para tres matrices: sangre, orina y leche Se emplearon dos estrategias diferentes para la detección de dicha especie bacteriana: 1) qLAMP con monitorización de fluorescencia y 2) cLAMP. Al comparar los cuatro métodos de extracción de ADN se observó que, para las tres matrices, el mejor protocolo era el que empleada chelex, pues no solo presentó la mayor asociación lineal, sino que además dio lugar a valores de Cq más bajos, lo que indica una mayor concentración de ADN a igualdad de pureza, al conseguirse detectar la presencia de K. pneumoniae en menos tiempo. Por otra parte, tanto en leche como en sangre a pesar de que la calidad del ADN extraído no fue óptima para este protocolo, se obtuvo el rango dinámico más amplio, probablemente por la ya mencionada resistencia del LAMP a los inhibidores típicos. Adicionalmente, la linealidad de los resultados obtenidos no se vio influenciada por la baja calidad del material genético. En el caso de la orina, las beads magnéticas y el chelex tienen el mismo rango dinámico, sin embargo, la extracción de ADN con las primeras tiene un coste más elevado (Tabla 12), además de una eficiencia menor y una peor asociación lineal. Tabla 12: Comparación de costes de los cuatro protocolos de extracción Protocolo de extracción de ADN Cantidad Precio Nº muestras Precio/muestra Beads magnéticas 5 mL 125 € 50 2,50 € Chelex 100 g 375 € 16666 0,02 € Sílica* 500 g 132,20 € 71428 <0,01€ Lisis térmica directa+ - - - 0 € *El glass milk empleado para el protocolo de extracción es una suspensión de sílica. + La lisis térmica directa no precisa de reactivos específicos. Si se comparan los costes para cada uno de los métodos, se comprueba como hay una gran diferencia entre los mismos, siendo las beads magnéticas las más caras. Por lo tanto, aunque para todas las matrices la calidad del ADN extraído se acerca a los 39 valores de los ratios de absorbancia establecidos, su rango dinámico es más estrecho en relación con el método seleccionado. En el hipotético caso de que se quisiera aumentar el rango dinámico para dicho protocolo, sería necesario aumentar la cantidad de beads empleadas, pues uno de los motivos por los que se detectan menos órdenes de magnitud, podría ser la saturación de las beads magnéticas. Es decir, que a pesar de que puedan quedar moléculas de ADN por purificar, finalmente son descartadas ante la ausencia de beads magnéticas libres a las que se puedan unir. No obstante, un aumento de la cantidad adicionada de beads en el protocolo de extracción, derivaría en un aumento del precio/muestra. A pesar de que empleando el equipo Nanodrop™ Lite Plus Spectrophotometer (Thermo Scientific™) se consiguió cuantificar el ADN de doble cadena presente en cada una de las muestras, al tratar de hacerlo empleando el Invitrogen™ Qubit™ 4 Fluorometer no fue posible debido a que la señal de fluorescencia se encontraba por debajo del rango detectable. La sobreestimación de la cantidad de ADNbc por parte del Nanodrop con relación a lo obtenido por el Qubit, se debe probablemente a que el equipo mide la absorbancia a 260 nm, longitud de onda a la cual, no solo absorbe el ADNbc, sino también el ADNmc y el ARN. Paralelamente, las mediciones del Qubit se obtienen empleando fluorescencia y son específicas para el ADNbc (Bruijns et al., 2022). Es por ello por lo que se recomienda combinar un método espectrofotométrico como el Nanodrop con uno fluorimétrico como el Qubit, para obtener y contrastar datos de pureza y cuantificación del ADNbc (Bruijns et al., 2022; Simbolo et al., 2013). Para determinar la pureza del ADN, se optó por la obtención de los ratios de absorbancias: 260/280 y 260/230 empleando el Nanodrop. Una vez obtenidos los ratios, estos otorgan información sobre los contaminantes presentes en las muestras. De este modo, para el ratio 260/280 nm se recomiendan valores entre 1,7-2,0; siendo el valor 1,8 el óptimo de calidad del ADN. Un valor por debajo de 1,7 indicaría contaminación por compuestos fenólicos o proteínas. Por otra parte, para el ratio 260/230 nm, valores por encima de 1,5 indican una buena calidad del material genético extraído (Bruijns et al., 2022). Como se mencionó en el apartado de resultados, los ratios de pureza obtenidos se encuentran en todos los casos por debajo de lo deseado, lo que puede ser debido a contaminantes remanentes tras la purificación pertenecientes a la matriz de partida. Además, en el caso del chelex, cabe la posibilidad de que, tras la extracción del ADN, hayan podido quedar restos de la resina que interfieran en la pureza del mismo. 40 Existen ciertos componentes en las matrices que a elevadas concentraciones podrían llegar a inhibir la reacción de LAMP. Nwe et al. (Nwe et al., 2024) estudiaron el efecto inhibitorio de la urea sobre las reacciones de LAMP, y comprobaron que este metabolito debía estar en concentraciones de alrededor de 1200 mM para llegar a inhibir la reacción. Realmente, esta concentración es superior a la que se esperaría encontrar en muestras reales de orina y además, es mucho más elevada de la que se observó que inhibía las PCR (~50 mM) (Khan et al., 1991). Por otro lado, se vio que la hematina que se encuentra en la sangre a concentraciones superiores de 25 µM podía provocar una reducción en la intensidad de fluorescencia en qLAMP al actuar como quencher (Nwe et al., 2024). Otro inhibidor que puede afectar al rendimiento de la reacción, es el Ca2+ que no solo está presente en la leche, sino que también se encuentra en fluidos biológicos como la sangre (Vavrusova & Skibsted, 2014) y la orina (Foley et al., 2010). Este catión, al ser divalente, compite con el cloruro de magnesio por unirse a la ADN polimerasa y además podría estabilizar estructuras secundarias y terciarias del ADN. Se genera un aumento de la temperatura de melting así como de los Cq, dependiente de la concentración de CaCl2 (Nwe et al., 2024). Todos los componentes potencialmente inhibitorios mencionados, se encuentran en las matrices que fueron objeto de estudio; por lo que una purificación del ADN tras la que permanezcan ciertos contaminantes, podría haber afectado al rendimiento del ensayo. Adicionalmente la diferencia en cuanto a rango dinámico, linealidad y límite de detección entre los métodos de extracción, puede venir dada también por la capacidad de los mismos para separar estos contaminantes presentes en las matrices, del material genético de interés. Para conseguir un límite de detección, y en consecuencia, una sensibilidad adecuada, se realizó un pre-enriquecimiento de K. pneumoniae en las tres matrices previo a la purificación del ADN. La incubación de las muestras de sangre con TSB ya había mostrado en otros estudios no solo mejorar la sensibilidad del método de detección (Andini et al., 2018) sino también hacerla más eficiente, al conseguirse la detección del patógeno en menos ciclos en PCR (Jordan & Durso, 2000) y en qPCR (Andini et al., 2018). El límite de detección del 95 % obtenido en LAMP en orina por Jevtuševskaja et al. (Jevtuševskaja et al., 2016) para Chlamydia trachomatis fue de 70 copias por cada reacción de LAMP, lo que aproximadamente equivaldría a 5,8·104 UFC/mL, asumiendo que una UFC se corresponde con una bacteria. En ese trabajo no se realizó un 47 Jordan, J. A., & Durso, M. B. (2000). Comparison of 16S rRNA gene PCR and BACTEC 9240 for detection of neonatal bacteremia. Journal of Clinical Microbiology, 38(7), p. 2574–2578. https://doi.org/10.1128/JCM.38.7.25742578.2000 Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., & Suzutani, T. (2007). Tolerance of loopmediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 70(3), p. 499– 501. https://doi.org/10.1016/j.jbbm.2006.08.008 Kang, C. I., Kim, S. H., Bang, J. W., Kim, H. Bin, Kim, N. J., Kim, E. C., Oh, M. D., & Choe, K. W. (2006). 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