Síntesis fotoquímica de clústeres de plata de baja atomicidad

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Nerea Borja González Programa de doctorado en Ciencia de Materiales TESIS DE DOCTORADO SÍNTESIS FOTOQUÍMICA DE CLÚSTERES DE PLATA DE BAJA ATOMICIDAD Nerea Borja González ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIA DE MATERIALES SANTIAGO DE COMPOSTELA 2022 D./Dña. Nerea Borja González Título de la tesis: Síntesis fotoquímica de clústeres de plata de baja atomicidad Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Santiago de Compostela, 06 de mayo de 2022. Firma electrónica D./Dña. José Rivas Rey En condición de: Tutor/a Título de la tesis: Síntesis fotoquímica de clústeres de plata de baja atomicidad INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D/Dña Nerea Borja González, bajo mi dirección/tutorización, y a utorizo su presentación, considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director/tutor de esta no incurre en las causas de abstención establecidas e n la Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 06 de mayo de 2022 Firma electrónica D./Dña. Manuel Arturo López Quintela y David Buceta Fernández En condición de: Director/a Título de la tesis: Síntesis fotoquímica de clústeres de plata de baja atomicidad INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D/Dña Nerea Borja González, bajo mi dirección/tutorización, y a utorizo su presentación, considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director/tutor de esta no incurre en las causas de abstención establecidas e n la Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 06 de mayo de 2022 Firma electrónica Nerea Borja González 4. ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN ATÓMICA CON PLASMA ACOPLADO INDUCTIVAMENTE ................................. 67 5. ESPECTROMETRÍA DE MASAS ...................................... 68 6. DISPERSIÓN DE LUZ DINÁMICA (DLS) ...................... 71 7. CROMATOGRAFÍA DE GASES ....................................... 73 CONCLUSIONES GENERALES ................................................... 77 MAIN CONCLUSIONS .................................................................. 81 REFERENCIAS .................................................................................. 85 DECLARACIONES DE USO DE IMÁGENES Y CONTENIDO PUBLICADO ............................................................................................. 95 17 ABREVIATURAS ADN Ácido Desoxirribonucleico AFM Microscopía de Fuerzas Atómicas AQCs Clústeres Cuánticos Atómicos BC Banda de Conducción B-S Brust-Schiffrin BV Banda de Valencia CTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio DFT Teoría del Funcional de la Densidad DLS Dispersión de luz dinámica DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo DTT Ditiotreitol Eg Energía del Band gap EF Energía del nivel de Fermi EDTA Ácido etilendiaminotretraacético ESI-TOF Ionización por Electrospray – Tiempo de Vuelo EXAFS Estructura fina de absorción de rayos X extendida HOMO Orbital Molecular Ocupado de más Alta Energía HS Hole Scavenger o Agente de Sacrificio ICP-MS Espectroscopía de Masas con Plasma de Acoplamiento Inductivo Nerea Borja González 18 ICP-OES Espectroscopía de Emisión Óptica con Plasma de Acoplamiento Inductivo ISE Electrodo Selectivo de Iones IPA Isopropanol LD Límite de detección LDA Aproximación Local de Densidad LSP Plasmón de Superficie Localizado LUMO Orbital Molecular Desocupado de más Baja Energía NGT Teoría de Nucleación y Crecimiento NPs Nanopartículas MeOH Metanol PMMA Polimetilmetacrilato ppb Partes por billón ppm Partes por millón QM/MM Mecánica Cuántica/Mecánica Molecular RT Temperatura Ambiente (Room Temperature, en inglés) rpm Revoluciones por minuto SF Síntesis Fotoquímica SPE Extracción en Fase Sólida SPR Resonancia Plasmónica Superficial TCD Detector de Conductividad Térmica TEA Trietilamina TNC Teoría de Nucleación y Crecimiento 19 UV Ultravioleta vis-UV Visible-Ultravioleta XANES Estructura Fina de Absorción Rayos X cerca del Borde XPS Espectroscopía Fotoelectrónica de Rayos X 21 RESUMEN La presente tesis doctoral está dirigida hacia la obtención de clústeres de Ag a gran escala en ausencia de surfactantes o grupos protectores. Para ello, se estudiará la optimización de una síntesis fotoquímica que nos permita obtener estas especies subnanométricas en concentraciones elevadas mediante un método fácilmente escalable a nivel industrial, lo que supone sin duda un gran desafío. Además, se realizará una amplia investigación acerca de los métodos de caracterización y purificación de estos materiales cuyas propiedades, estrictamente dependientes de su tamaño, representan una gran novedad en diversas aplicaciones como catálisis, fotocatálisis y biomedicina, entre otras. Nerea Borja González 22 ABSTRACT This PhD Thesis is focused on the scale-up synthesis of silver atomic quantum clusters without any surfactant. For that purpose, we will optimize a photochemical synthesis to obtain clusters in high concentrations by a scalable process. That supposes a really challenge in this research field. In addition, we will explore different characterization and purification methods of clusters, whose size-dependent properties have become very attractive in catalytic, photocatalytic, and biomedical applications. 23 OBJETIVOS El objetivo concreto de esta tesis es la síntesis de clústeres de 5 átomos de Ag puros, libres de surfactantes o agentes protectores y de manera escalada. De esta forma se tratará de solventar uno de los mayores problemas de las síntesis de clústeres en disolución, el escalado, ya que con los métodos actuales se producen cantidades del orden de µg/día. A parte de la reducida cantidad, las disoluciones obtenidas son muy diluidas (del orden de ppbs) y son necesarios procesos de concentración costosos y laboriosos, que hacen inviable su utilización más allá de la escala de laboratorio. Además, en los últimos años, se ha incrementado el interés por estas especies subnanométricas debido a su excelente actividad en reacciones de catálisis implicadas en la eliminación de gases de efecto invernadero, así como en el ámbito de la salud, donde demuestran poseer, entre otras, actividades antitumorales. Para lograr el objetivo, nos centraremos en cuatro objetivos principales: (1) Diseñar y optimizar la síntesis de clústeres de 5 átomos de Ag basada en un método fotoquímico, (2) estudiar diferentes métodos de purificación de los clústeres obtenidos en disolución (3) diseñar un método de caracterización de los clústeres obtenidos que permita además su cuantificación de forma sencilla y (4) evaluar la actividad catalítica de los clústeres obtenidos, estudiando asimismo la influencia de la purificación en dicha propiedad. Capítulo I. Introducción 25 CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN 1. EL ORIGEN DE LA NANO ESCALA Los materiales se pueden clasificar en función de su tamaño tal como se muestra en la Figura 1. Aquellos materiales cuyo tamaño es mayor de 100 micrómetros pueden observarse a simple vista. Cuando el tamaño varía entre 100 µm y 100 nm, se necesita la ayuda de un microscopio óptico, sin embargo, los materiales cuyo tamaño es menor de 100 nm precisan de un microscopio electrónico para ser observados. Los materiales a escala atómica, debido a su pequeño tamaño, sólo pueden observarse mediante el uso de longitudes de onda más energéticas, como los rayos X. Figura 1. Escala métrica desde los 10 m hasta 0.1 nm ejemplificada con materiales biológicos y químicos bien conocidos. Imagen creada con Biorender. Nerea Borja González 32 (kBT). Esta zona de energías prohibidas que aparece en los AQCs nos recuerda al band gap propio de semiconductores o, en el caso de los clústeres de menor tamaño, al HOMO-LUMO gap existente en los materiales moleculares (ver Figura 4)21–23. Figura 4. Diagrama de la estructura electrónica en función del tamaño de partícula. De izquierda a derecha: metal masivo, nanopartículas, clústeres grandes y clústeres pequeños. Imagen adaptada de la referencia 14 bajo licencia Copyright con el permisos de uso anexados en la presente tesis. En la Figura 4 se puede observar la clara dependencia de la banda de energías prohibidas con el tamaño del clúster. También resaltamos la idea de las diferencias que existen entre los clústeres grandes (aquellos que poseen un número de átomos aprox. entre 10-20 hasta ≈150) y los clústeres pequeños, denominados clústeres de baja atomicidad (con un número de átomos menor de ≈ 10-15), pues las propiedades de los primeros Capítulo I. Introducción 33 son más parecidas a las de las nanopartículas y tienen una menor estabilidad que ellas, mientras que los segundos, tienen una gran estabilidad, mayor incluso no sólo a la de las nanopartículas sino también a la del material masivo del que proceden, tal como demostraremos en la presente tesis doctoral. En todos ellos, clústeres grandes y pequeños, su banda de energías prohibidas (o su HOMO-LUMO gap) varía de forma inversamente proporcional a su tamaño. Por lo que acabamos de decir, los clústeres grandes (con un pequeño band gap) precisan de ligandos fuertes que los protejan y estabilicen, mientras que los clústeres pequeños (con un HOMO-LUMO gap muy grande) no precisan de ligandos estabilizadores, ya que no son susceptibles a fenómenos de agregación o sinterización debido a que poseen estructuras electrónicas y geométricas bien definidas.15 El modelo del Jellium24 (descrito más adelante en el apartado 2.1.) es capaz de predecir de forma aproximada muchas de las propiedades fisicoquímicas de los clústeres. Este modelo mecanocuántico permite obtener una solución analítica para el valor de las energías permitidas, y es capaz de predecir la aparición de la banda de energías prohibidas, propia de los clústeres, en función del tamaño del clúster. En la ecuación 1 se puede observar la relación -predicha por este modeloque hay entre la banda de energías prohibidas (Eg) y el tamaño del clúster (N) y que no contiene ningún parámetro ajustable, pues solamente depende de la energía del nivel de Fermi del metal correspondiente (EF). Nerea Borja González 34 𝐸𝑔=𝐸𝐹 𝑁1/3 (1) En la Figura 5 se puede ver la variación del band gap predicho por esta simple ecuación, en función del tamaño del clúster. A modo comparativo, se representa también la posición de los correspondientes band gaps de los semiconductores más típicos, pudiendo observarse que con tan solo dos metales (Ag y Cu), variando su tamaño, se puede cubrir todo el espectro de band gaps de los semiconductores tradicionales. Figura 5. Comparación de la energía de bandas prohibidas (band gap) de clústeres de Cu y Ag con algunos semiconductores clásicos. Imagen adaptada de referencia 16 con permiso del autor. Capítulo I. Introducción 35 Por este motivo, los clústeres de pequeño tamaño abren la ventana a la exploración de materiales totalmente nuevos, donde con tan solo modificar en una unidad el tamaño del clúster, se pueden modificar drásticamente sus propiedades. Gracias a estas nuevas propiedades podemos proponer una tabla periódica en 3D14 (Figura 6), donde se muestra como variarían la propiedades de los clústeres y nanopartículas respecto a las propiedades ya conocidas de los materiales masivos. Es de destacar que los clústeres se han convertido en una excelente alternativa para muchas aplicaciones, como por ejemplo la catálisis, no sólo por la versatilidad de su tamaño sino por su gran relación superficie-volumen21, donde todos o la mayoría de los átomos que los componen quedan expuestos a la superficie y, por lo tanto, pueden jugar un papel importante en catálisis heterogénea, que es un fenómeno exclusivamente superficial. Figura 6. Tabla periódica en tres dimensiones donde se representa la influencia del tamaño en las propiedades fisicoquímicas de los elementos. Imagen tomada y adaptada con permiso del autor14. Nerea Borja González 36 2.1. ESTRUCTURA ELECTRÓNICA DE LOS AQCS Aunque la estructura electrónica de los clústeres se puede calcular tanto mediante métodos cuánticos ab initio como por métodos teóricos aproximados, como la teoría del Funcional Densidad (DFT) -o aproximaciones más sencillas dentro de ella, como la de la densidad local (LDA)-*, en general los cálculos son complejos y solamente se utilizan para casos muy concretos. Es cierto que, en los últimos años, han aparecido herramientas de trabajo que simplifican enormemente los cálculos -como por ejemplo el “aprendizaje automático” o “machine learning (ML)”, que le permite al software -mediante procedimientos derivados de la inteligencia artificialaprender a través de la adaptación de los algoritmos utilizados a la entrada de nuevos datos. Pero, también en estos casos de ML, se precisa disponer de cálculos precisos mediante DFT o ab initio. En el caso que nos ocupa, se precisa disponer de cálculos teóricos precisos para clústeres de un metal con diversos números de átomos que, introducidos en el algoritmo de ML nos podrían dar de forma rápida las proyecciones para clústeres con números de átomos diferentes. Por este motivo, para explicar de una forma sencilla la estructura electrónica de los clústeres, se desarrolló el modelo del Jellium. Este modelo es un modelo mecanocuántico sencillo, que * La solución de la ecuación de Schrödinger obtenida mediante cálculos ab initio está basada en una función multielectrónica, mientras que la solución de la ecuación mediante la aproximación DFT está basada en el funcional (es decir, una función de una función) de la densidad electrónica, disminuyéndose así, en gran medida, la complejidad del cálculo. Capítulo I. Introducción 37 ofrece una solución analítica y que fue desarrollado en 1984 para clústeres de metales alcalinos (Na, Li, y K) en fase gas25. Más tarde se comprobó su consistencia para clústeres de Cu, Ag y varias aleaciones de estos metales26. El modelo del Jellium supone que el clúster es una esfera positivamente cargada rodeada de una nube electrónica donde tanto la esfera positiva -formada por el núcleo y los electrones del núcleocomo la nube electrónica - formada por los electrones de valenciaestán distribuidas uniformemente en el espacio. Los electrones de valencia se mueven en un potencial de campo medio que sustituye el potencial externo por un potencial atenuado que confina a los electrones en un volumen finito. En el modelo del Jellium se supone que el sistema posee una simetría esférica en tres dimensiones, cuyos pozos de potencial se puedan ajustar a un pozo de potencial armónico, intermedio o de pozo cuadrado27 (ver Figura 7). La forma de dicho pozo de potencial varía en función de la naturaleza del clúster. Mediante la solución analítica de este modelo se puede obtener un potencial efectivo total que permite la obtención de un sistema muy similar al utilizado en los átomos, con la consiguiente ocupación electrónica de niveles energéticos en una estructura de capas, siguiendo el principio de Aufbau (1S2 | 1P6 | 1D10 | 2S2 1F14 | 2P6 1G18 |…). 27 Esta solución es consistente con la estabilidad de los clústeres encontrados al analizar la vaporización de metales alcalinos y metales nobles en vacío mediante cromatografía de gases. En efecto, se observó la presencia de clústeres de determinados tamaños mucho más estables que el resto de los clústeres (números mágicos26,28). De acuerdo con el modelo del Jellium, Nerea Borja González 38 esto se debe a que la energía total del clúster en función del tamaño presenta ciertas discontinuidades, con la presencia de mínimos de energía que se corresponden con estructuras electrónicas de capas cerradas. Las estructuras de capas cerradas, que se pueden predecir a partir de los niveles de energía representados en la Figura 7, para elementos monovalentes son: 8, 18, 20, 34, 40, 58, 92, 138, ..., que se corresponden con los clústeres más estables y de mayor abundancia encontrados en los experimentos. Figura 7. (izda) Ocupación de los niveles energéticos para estructuras con geometría esférica 3D según la forma del pozo de potencial: armónico, intermedio y de pozo cuadrado. (dcha) Potencial efectivo de una esfera del Jellium de Na40 y ocupación electrónica de los niveles de energía. Imagen adaptada de referencia 16 bajo licencia Copyright con el permisos de uso anexados en la presente tesis. Capítulo I. Introducción 39 2.2. ESTRUCTURA GEOMÉTRICA DE LOS AQCS El modelo del Jellium y cálculos DFT nos permiten también predecir la estructura geométrica óptima de los materiales minimizando la energía electrónica respecto a la densidad electrónica. Las estructuras cristalinas serán tanto más estables cuanto menor sea su energía. Una de las primeras estructuras cristalinas calculada mediante cálculos DFT y técnicas experimentales fue la de [Au13(SR)18]-. Al igual que ocurre con la estructura electrónica de los clústeres sin ligandos protectores, también la estructura geométrica de los clústeres sin ligandos depende del tamaño y del tipo de metal. Se ha observado que, generalmente, la geometría más estable para clústeres en 2D es la triangularplana, mientras que para clústeres en 3D es la icosaédrica. Sin embargo, la estructura cristalina de los metales masivos y de las nanopartículas metálicas de metales como son el oro, la plata o el cobre, es un empaquetamiento cúbico centrado en las caras (FCC). Para clústeres pequeños, menores de 6 átomos, la geometría plana es la más estable (en el vacío). En el caso de los clústeres de Ag5, la diferencia de energías entre sus dos estructuras más estables, la trapezoidal plana y la bipirámide trigonal, varía entre 0.49 y 0.15 eV, siendo la primera la más estable. En la Figura 8 se pueden ver las estructuras más estables de los clústeres de Ag de 3 a 20 átomos en función de su tamaño.29,30 Nerea Borja González 40 Figura 8. Estructuras geométricas más estables de los clústeres cuánticos atómicos de plata de 3 a 20 átomos. Figura adaptada de la referencia 29 bajo licencia Copyright con el permisos de uso anexados en la presente tesis. 3. PROPIEDADES DE LOS AQCS 3.1. PROPIEDADES ÓPTICAS Como se ha mencionado, los clústeres -debido al confinamiento cuántico que sufren a causa de su pequeño tamañopresentan propiedades distintas de su análogo masivo o de las nanopartículas del mismo metal. Un ejemplo de esto son sus propiedades ópticas. Los metales masivos poseen su característico brillo metálico que se pierde a medida que el tamaño de partícula disminuye. Cuando llegamos a la región nanométrica (≈ 100 nm), se observa la aparición de colores intensos que varían en función del tamaño Capítulo I. Introducción 41 de las nanopartículas y del metal que las forma. El color que presentan las nanopartículas metálicas se debe a los plasmones superficiales localizados (LSP). Los plasmones superficiales localizados son un tipo de banda plasmónica superficial (SPR) que tiene lugar en la superficie de volúmenes pequeños, como es el caso de las nanopartículas metálicas. Cuando una nanopartícula es irradiada con una radiación cuya longitud de onda es similar al tamaño de la nanopartícula (por ejemplo, con luz visible incidiendo en una partícula de ≈100 nm), los electrones de la banda de conducción de la nanopartícula interaccionan con la onda electromagnética de la radiación incidente y esto provoca que los electrones de la nanopartícula oscilen y resuenen a longitudes de onda determinadas, dando lugar a una absorción de luz y la correspondiente aparición de los colores característicos en partículas de Cu, Ag y Au31 (en otros metales sucede lo mismo pero las longitudes de absorción están en el UV, por lo que no presentan color). Los electrones de los clústeres, debido a que su energía está cuantizada, se encuentran confinados en niveles de energía dentro de la banda de valencia y precisan de una energía mayor que la energía térmica para alcanzar la banda de conducción. Al no haber electrones en la banda de conducción (BC), el plasmón superficial típico de las nanopartículas metálicas desaparece en los clústeres. Tal como se muestra en la Figura 9, las propiedades ópticas de los clústeres varían en función de su tamaño. Tanto para clústeres grandes como para clústeres pequeños se observa la Nerea Borja González 48 su empleo en el aumento de la eficacia terapéutica de los antitumorales basados en el ADN. En efecto, como el tiempo de residencia de los clústeres en el interior de las hebras de ADN supera a los intercaladores utilizados actualmente en dos o tres órdenes de magnitud, aumentan muy notablemente la ventana de tiempo que tienen las sustancias anticancerígenas para introducirse en el ADN y, por ello, su eficiencia, de forma que se podría reducir la cantidad de agentes antitumorales empleados sin pérdida de eficiencia, pero con una disminución muy importante en sus efectos secundarios.36 Figura 12. Estructuras de mínima energía de complejos d(ATATATA-TAT)2/Ag3 y d(GCGCGCGCGC)2/Ag3 obtenidas mediante cálculos QM/MM, mostrando la intercalación del clúster de Ag3 entre los pares de bases 5º y 6º. Imagen adaptada de la referencia 36 bajo licencia Copyright con el permisos de uso anexados en la presente tesis. Por su parte, los clústeres de Ag5, son capaces de oxidar los tioles de proteínas con mayor intensidad en células tumorales. Capítulo I. Introducción 49 La oxidación de los azufres de cisteína y glutatión provoca la apoptosis celular de las células tumorales. Además, debido a su pequeño tamaño son capaces incluso de atravesar la barrera hematoencefálica, por lo que, podrían actuar contra tumores cerebrales. Esto convierte a los AQCs en excelentes candidatos como agentes antitumorales. Debemos resaltar que este hecho ha sido explorado también en la presente tesis doctoral, presentándose estudios de la aplicación de clústeres, obtenidos por un nuevo procedimiento fotoquímico, como agentes antitumorales41,42. Veremos cómo su actividad y eficacia varía en función de la pureza de las muestras, lo que constituye un aspecto de gran importancia al que no se le había dado anteriormente la atención que merece. 4. MÉTODOS DE SÍNTESIS DE AQCS La síntesis de clústeres se centra en desarrollar métodos que nos permitan obtener clústeres de determinado tamaño para su uso en una aplicación concreta. Es todo un reto obtener clústeres monodispersos cuyo tamaño difiera en un número pequeño de átomos. Tal como hemos visto, el tamaño, la forma y el origen del metal influyen en las características y propiedades de los AQCs. Es por este motivo que, el disponer de métodos de síntesis de clústeres monodispersos de forma sencilla y robusta es de suma importancia para los estudios posteriores de sus propiedades y aplicaciones. Los primeros clústeres sintetizados, como comentamos al describir el modelo esférico del Jellium, fueron los clústeres en fase gas. La síntesis consistía en calentar a vacío una lámina Nerea Borja González 50 metálica a elevadas temperaturas, de forma que se produjera la evaporación de los átomos metálicos. Los átomos metálicos evaporados tenían un número de átomos determinado (números mágicos) y fueron analizados por espectrometría de masas. El problema principal de este método es la baja concentración de clústeres obtenida, sin mencionar la complejidad de la síntesis. Por este motivo, se hizo necesario investigar otros tipos de síntesis más sencillas y eficientes, que permitieran además controlar de forma adecuada el tamaño de los clústeres. De forma general, las síntesis de clústeres metálicos, al igual que ocurre con la síntesis de nanopartículas, se pueden dividir en dos grandes grupos: síntesis bottom-up y síntesis top-down. Los nombres de estas síntesis se basan en el proceso de obtención: las síntesis bottom-up describen aquellos procesos que ocurren de “abajo” a “arriba”, es decir, partiendo de átomos (o iones) se obtengan clústeres; mientras que las síntesis top-down engloban aquellos procesos en los que, a partir de una micro o nanopartícula o incluso del metal masivo, “arriba”, se obtienen los clústeres, de tamaño mucho más pequeño “abajo”. En esta sección se expondrán de forma resumida algunos de estos métodos. 4.1. SÍNTESIS TOP-DOWN Este tipo síntesis, tal como hemos comentado, se basa en partir de una nanopartícula o del metal masivo para obtener clústeres. Uno de los métodos más utilizado para obtener clústeres en disolución es el etching, que describiremos a continuación. También existen métodos como la ablación láser que se utiliza generalmente para la obtención de clústeres Capítulo I. Introducción 51 bimetálicos43, que resultan muy interesantes por sus propiedades catalíticas. 4.1.1. ETCHING DE NANOPARTÍCULAS Esta síntesis es un método top-down que consiste en el etching o troceado de nanopartículas metálicas en presencia de ligandos que sean capaces de eliminar, gracias a su capacidad corrosiva, los átomos superficiales de las nanopartículas metálicas formando clústeres estables. La estabilidad de los clústeres vendrá determinada por la capacidad del ligando de proteger completamente los átomos superficiales de la nanopartícula. Este es el caso del clúster de oro protegido con glutatión-tiolato, Au25(SG)18.22 Una variación de este método es el etching de nanopartículas de Au protegidas con ácido mercaptosuccínico44. El etching, realizado con el ligando glutatión, forma clústeres de distinto tamaño en función del pH de la disolución. Cuando el pH es ácido, pH 3, el clúster formado posee 25 átomos de Au, mientras que si la reacción ocurre a pH neutro-alcalino (7-8) el clúster más estable es el de oro de 8 átomos. Este es un claro ejemplo de cómo modificando los parámetros de la síntesis se puede variar drásticamente las características del clúster obtenido. Aunque el mecanismo de etching no está muy claro, se han propuesto dos rutas sintéticas a través de las cuales podrían formarse los clústeres (ver Figura 13)44. La primera se basa en la eliminación de átomos de oro de la superficie de las nanopartículas por la acción del glutatión, formándose un complejo Au(I)-glutatión que, debido a las interacciones aurofílicas propias de complejos de oro, forme el clúster de oro. Nerea Borja González 52 La segunda ruta se basa en el etching de los átomos de la superficie por el glutatión, que irá reduciendo el tamaño de la nanopartícula hasta llegar al clúster de oro. Figura 13. Mecanismos propuestos para el etching de nanopartículas de Au protegidas con ácido mercaptosuccínico. Imagen adaptada de la referencia 44 bajo licencia Copyright con el permisos de uso anexados en la presente tesis. 4.2. SÍNTESIS BOTTOM-UP Las síntesis basadas en métodos bottom-up consisten en la formación de clústeres a partir de átomos o iones. Una de las síntesis más extendidas es la reducción química en presencia de un agente protector, de igual modo que ocurre en la síntesis de nanopartículas metálicas. A continuación, se expondrán algunos de los métodos más utilizados. Capítulo I. Introducción 53 4.2.1. EFECTO PLANTILLA El nombre, traducido del término inglés Template Synthesis, hace referencia al uso de scaffolds que sirvan como guía en el crecimiento del clúster evitando que al reducirse crezcan y se agreguen para reducir su energía superficial formando nanopartículas de gran tamaño45. Los scaffolds o plantillas utilizadas varían en función del tamaño de clúster que se quiera sintetizar y de las propiedades ópticas, catalíticas o magnéticas que se deseen, ya que el origen del scaffold y su interacción con el clúster van a determinar sus propiedades fisicoquímicas. Algunos de los scaffolds más utilizados son: ADN46,47, péptidos48, proteínas49,50, dendrímeros51 y polímeros52. 4.2.2. SÍNTESIS EN MICROEMULSIÓN Este método se basa en la formación de gotas de un tamaño nanométrico en un disolvente no miscible, generalmente, gotas de agua en aceite o viceversa. Las nanogotas se forman de manera espontánea y se estabilizan mediante surfactantes o copolímeros de bloque.14 El parámetro que determina el tamaño del clúster es el tamaño de la gota formada y éste depende estrechamente de la cantidad de sal metálica de partida17. En el marco de nuestro grupo de investigación se han sintetizado, mediante este método, clústeres de Ag53 y de Cu54 de baja atomicidad que presentan excelentes propiedades ópticas. Nerea Borja González 54 4.2.3. REDUCCIÓN QUÍMICA O BRUST-SCHIFFRIN Brust y Schiffrin describieron este procedimiento para la síntesis de nanopartículas de oro de pequeño tamaño (1-3 nm) protegidas con grupos tiolados 55,56. La reacción se puede llevar a cabo mediante dos variantes: síntesis en una fase o síntesis en dos fases. El método B-S en una fase consiste en la reducción de una sal de oro, el ácido tetracloroaurico, con borohidruro de sodio. La sal áurea y el p-mercaptofenol se disuelven en metanol y se añade ácido acético para evitar que se desprotone el mercaptofenol. Después se añade la solución acuosa de borohidruro sódico para la reducción del oro. Las nanopartículas obtenidas no son solubles en agua porque el ligando que protege a la nanopartícula es apolar, siendo el grupo fenólico el que se une a la superficie de la nanopartícula. El método en dos fases, reportado un año de antes y basado en la síntesis de oro coloidal de Faraday3, consiste en utilizar un sistema de dos fases, agua-tolueno para reducir el ácido tetracloroaurico en presencia de borohidruro sódico. De nuevo, el ligando que protege a la nanopartícula es un ligando tiolado. Para llevar a cabo la reacción se disuelve ácido tetracloroaurico en agua y se mezcla con una disolución de bromuro de tetraoctilamonio en tolueno, de forma que, el catalizador de transferencia de fase (bromuro de tetraoctilamonio) provoque que la sal de oro pase a la fase orgánica. Después se añade la solución acuosa de borohidruro sódico y se observa la formación de nanopartículas de oro tioladas de 1-3 nm. Capítulo I. Introducción 55 Este método es uno de los más utilizados en la síntesis de clústeres ya que permite un buen control del tamaño del clúster tan sólo optimizando variables de la síntesis tales como el pH, la relación metal-ligando, la estructura del ligando protector, el origen del reductor, etc. Es de destacar que, recientemente, se ha reportado una síntesis modificada del método B-S mediante la que se obtienen clústeres de Au de 18, 23, 25 y 31 átomos, cuyo tamaño varía al cambiar la cantidad de agente de transferencia de fase utilizado57. 4.2.4. SÍNTESIS ELECTROQUÍMICA Esta síntesis es una modificación del método electroquímico diseñado por Reetz y Helbig para la síntesis de nanopartículas metálicas58. El método original consiste en la disolución oxidativa de un ánodo metálico, seguida de la migración de los cationes metálicos al cátodo donde se produce la reducción. Una vez formados los átomos metálicos, estos crecen siguiendo la teoría clásica de nucleación y crecimiento hasta formar nanopartículas que se estabilizan gracias al bromuro de tetraoctilamonio, que provoca su precipitación en el medio de reacción59. En el grupo de investigación en el que se enmarca la presente tesis doctoral, el Dr. José M. Blanco Trillo y la Dra. Shahana Huseyinova, optimizaron el método electroquímico para la obtención de clústeres de Ag60 y de Cu61 de baja atomicidad, respectivamente. El método se basa, tal como podemos ver en la Figura 14, en la oxidación de un ánodo metálico y la consiguiente migración de iones al cátodo donde se reducen y se agregan dando lugar a la formación de clústeres. La síntesis tiene lugar Nerea Borja González 56 bajo una atmósfera y temperatura controladas. En el caso de la plata, tanto el ánodo como el cátodo son de ese mismo metal, pero en el caso del Cu, el ánodo es de cobre y el cátodo de platino. Los parámetros implicados en la velocidad de oxidación del metal y de reducción de los iones metálicos son los factores esenciales que determinan el tamaño final de los clústeres formados. Figura 14. Esquema de la síntesis electroquímica de AQCs. A diferencia del método de Reetz y Helbig, los clústeres sintetizados en los procedimientos descritos no poseen surfactantes, es decir, carecen de sustancias protectoras, por lo Capítulo I. Introducción 57 que el control de tamaño se basa en un estricto control cinético mediante el que se pueden llegar a obtener clústeres de pequeño tamaño con gran monodispersidad. 4.2.5. FOTOREDUCCIÓN DE SALES Otro de los métodos utilizados para la síntesis de nanopartículas metálicas que se ha aplicado a la obtención de clústeres metálicos es la reducción de una sal metálica con luz UV en presencia de un surfactante. Este método es la base de la presente tesis doctoral. Dickson y colaboradores fueron los primeros en sintetizar clústeres de Ag con unas excelentes propiedades lumínicas al irradiar una película de óxido de plata. Después se sintetizaron también por un procedimiento parecido clústeres de plata embebidos en microgeles62. Este método de síntesis también se ha utilizado para obtener clústeres de otros metales, como, por ejemplo, platino63,64. La diferencia principal entre el método de fotoreducción utilizado para la obtención de clústeres y el presentado en esta tesis doctoral es la presencia o ausencia de surfactantes. Todos los métodos vistos hasta ahora -excepto los mencionados métodos electroquímicos de nuestro grupo de investigaciónse basan en la síntesis de clústeres en presencia de surfactantes o agentes protectores, ya que el control de tamaño es termodinámico y este control es más sencillo que el control cinético. Sin embargo, para muchas de las aplicaciones (por ejemplo, las mencionadas en la sección 3 de este capítulo) se precisa el uso de clústeres sin ligandos protectores que inhiben, Nerea Borja González 64 Figura 16. Esquema del electrodo sólido combinado del electrodo PerfectIon de Mettler Toledo. Por este motivo, en la presente tesis las muestras se midieron siempre en matrices acuosas (o con un porcentaje acuoso mayoritario) y los calibrados se realizaron en la misma matriz que la de las muestras a medir. De esta forma garantiza la robustez y exactitud de la medida del sensor electroquímico. Todas las medidas de la concentración de iones de plata se realizaron por calibración directa del electrodo mediante un ajuste por mínimos cuadrados de los puntos obtenidos. Los patrones y muestras se midieron en una celda de vidrio termostatizada a 25°C con un baño termostático Julabo. Los electrodos utilizados fueron el HI4115 de Hanna Instruments y el electrodo perfectION de Ag+/S-2 de Mettler Toledo, con sus Capítulo II. Técnicas de Caracterización 65 correspondientes electrolitos y soluciones estabilizadoras de la fuerza iónica proporcionados por las casas comerciales de los electrodos. Todas las medidas se realizaron con un pH-metro CRISON GLP 22+. 3. ESPECTROSCOPÍA DE MASAS CON PLASMA ACOPLADO INDUCITVAMENTE Esta técnica analítica (ICP-MS) es una técnica destructiva que sirve para analizar de manera cuantitativa o semicuantitativa los componentes de una muestra. Mediante esta técnica se pueden detectar la mayoría de los elementos de la tabla periódica a excepción de unos pocos, como C, N, H, O, F, gases nobles, tierras raras y aquellos elementos que no posean isótopos naturales. La muestra se introduce en disolución en el ICP-MS y pasa a través de un nebulizador. Las gotas de aerosol generadas en el nebulizador se ionizan en el plasma y se dirigen al espectrómetro de masas. La mayoría de los ICP-MS poseen un espectrómetro de masas con cuadrupolo. El cuadrupolo es el encargado de filtrar las masas que llegan al analizador de forma que solo llegarán aquellos iones cargados que posean una relación masa/carga determinada. Por ejemplo, en el caso de la plata, el cuadrupolo filtraría los iones masa/carga de 107/1 y 108/1 que se corresponden con los dos isótopos de la plata. Los iones salen del espectrómetro de masas y llegan a un tubo fotomultiplicador convirtiéndose en pulso eléctrico medible. El software del equipo compara los pulsos medidos de los patrones de calibración y de las muestras para determinar la concentración del elemento. Nerea Borja González 66 Figura 17. Tabla periódica de los elementos con sus isótopos y abundancias que pueden ser determinados (en color) y los que no (en blanco) mediante ICP-MS. Las muestras de plata obtenidas en este trabajo se caracterizaron con un espectrómetro de masas con acoplamiento de plasma inducido NexION 2000. Todas las muestras se midieron con un calibrado multipatrón en ácido nítrico al 2% en el intervalo de 1 a 60 ppb. El alcohol isopropílico, así como otros disolventes orgánicos, interfieren en la medida del ICP-MS ya que apagan el plasma, por lo que es preciso realizar una dilución de las muestras a analizar de, al menos, tres órdenes de magnitud, para minimizar las interferencias de la matriz de la muestra con el plasma. Capítulo II. Técnicas de Caracterización 67 4. ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN ATÓMICA CON PLASMA ACOPLADO INDUCTIVAMENTE Esta técnica analítica (ICP-OES) es una de las más utilizadas para determinar trazas y ultratrazas de elementos en una gran variedad de matrices, previa digestión de las muestras. Al igual que en el ICP-MS, se pueden determinar la mayoría de los elementos de la tabla periódica. El funcionamiento del ICP-OES y el ICP-MS es similar, lo que cambia es la forma de detectar los iones. En el ICP-OES la muestra líquida se introduce en el equipo, se nebuliza y se dirige al plasma donde se atomiza. Hasta este punto el funcionamiento es análogo al del ICP-MS. La diferencia es que los electrones de las moléculas ionizadas han pasado del estado fundamental al excitado. La permanencia de los electrones en un estado excitado no es un proceso favorable por lo que se produce rápidamente la vuelta del electrón a su estado fundamental. Al regresar, se emite una radiación con una longitud de onda determinada que es característica de cada elemento de la tabla periódica y, es precisamente esta radiación la que se mide en el ICP-OES. Una ventaja del uso de un ICP-OES respecto a un ICP-MS es la detección simultánea de los elementos. En algunos casos como, por ejemplo, el O2 molecular y el azufre, hay una interferencia de masa y esto provoca errores en la medida. Por este motivo, para medir ciertos elementos es más adecuado utilizar un ICP-OES. Las muestras de plata obtenidas en la presente tesis se midieron en colaboración con el grupo de investigación GETEE de la Universidad de Santiago de Compostela, mediante un Nerea Borja González 68 equipo ICP-OES Optima 3300 DV, provisto de un automuestreador AS91 de Perkin-Elmer. 5. ESPECTROMETRÍA DE MASAS La espectrometría de masas es una técnica analítica destructiva que nos permite obtener información acerca de la estructura química de las moléculas presentes en una muestra. El objetivo de esta técnica es ionizar los componentes químicos de una muestra, generando moléculas cargadas (o clústeres cargados en nuestro caso) o fragmentos de ésta, dando lugar a un espectro de masas donde se muestren las relaciones masa-carga de los componentes analizados y, de esa forma, se puede llegar a elucidar la estructura molecular de los componentes de la muestra. Existen distintos métodos de ionización que se pueden dividir en métodos de ionización fuerte o suave. La ionización suave es aquella que no provoca la fragmentación de las moléculas o la provoca parcialmente, lo que resulta muy interesante para la determinación de biomoléculas de elevada masa molecular o para moléculas pequeñas o clústeres68, donde la ruptura de la molécula en secciones de menor tamaño no nos interesa, ya que su identificación sería mucho más compleja. Algunos de los métodos de ionización suave más utilizados para la determinación de clústeres son: Capítulo II. Técnicas de Caracterización 69 ▪ FAB (Bombardeo atómico rápido) La muestra se bombardea con un haz de átomos de Xe o Ar acelerados hasta alcanzar energías del orden de kilovoltios (kV). La muestra se mezcla con una matriz, generalmente un ácido orgánico, para favorecer su enfriamiento y evitar la ionización directa y la consecuente fragmentación de la muestra. ▪ SIMS (Espectrometría de masas de iones secundarios) Este método de ionización es igual al de bombardeo atómico con la diferencia de que la muestra se bombardea con un haz de iones de Cesio. ▪ MALDI (Absorción/Desorción láser asistida por matriz) La muestra se introduce una matriz y se ioniza la muestra con un láser de luz pulsada a vacío. La matriz absorbe la radiación láser y le transfiere un protón a la muestra. Generalmente este tipo de ionización genera iones con una sola carga. Esta técnica es una variación de la desorción láser, donde la muestra se ioniza en ausencia de la matriz. ▪ ESI69 (Ionización por electrospray) Esta ionización ocurre a presión atmosférica. La muestra se introduce, en disolución acuosa junto con un disolvente volátil, mediante una jeringa de acero inoxidable en un Nerea Borja González 70 capilar cargado a un elevado potencial eléctrico. Los iones se repelen en el interior del capilar debido a la ley de Coulomb y se origina un spray formado por pequeñas gotas cargadas que se evaporan rápidamente. Los iones pueden estar protonados de forma múltiple formando diferentes especies para una misma molécula. Las técnicas de ionización más utilizadas para determinar la estructura molecular de los clústeres son ESI y MALDI. Ambas se suelen acoplar con el analizador de tiempo de vuelo (Time of flight, TOF), que es el más utilizado para la determinación de clústeres de metales nobles. Además, para la caracterización de los clústeres se utilizan tanto la ionización en modo negativo como en modo positivo.70,71 El analizador de tiempo de vuelo consiste en un campo eléctrico que aumenta la energía cinética de los iones y los dirige hacia el tubo de vuelo. Los iones que posean la misma carga serán separados por su tamaño, ya que los más ligeros volarán más que los más pesados. De esta forma, los iones llegan al detector en función de su relación masa/carga, que es proporcional al tiempo de vuelo. La resolución de los picos de masas será mejor cuanto mayor sea la longitud del tubo de vuelo y cuanto menor sea la dispersión de energías de los iones generados en la fuente de ionización. En la presente tesis se analizaron las muestras de clústeres mediante un espectrómetro de masas ESI-TOF de la casa comercial Waters, modelo Acquity QDa. Las muestras se introducen en ocasiones mediante inyección directa, sin diluir, y Capítulo II. Técnicas de Caracterización 71 en otras ocasiones se diluye en una mezcla de metanol y ácido fórmico. Las muestras se miden mediante ionización por electrospray en modo negativo. Este método de medida fue optimizado por el Dr. Darío de la Iglesia a lo largo de su tesis doctoral72. 6. DISPERSIÓN DE LUZ DINÁMICA (DLS) La dispersión de luz dinámica es una técnica no destructiva que se utiliza para medir la distribución de tamaños de partículas micro y nanométricas (10 µm hasta >≈ 1 nm) en disolución. La técnica se basa en medir el movimiento Browniano o aleatorio de las partículas en disolución. Las partículas sólidas colisionan constantemente con las moléculas de disolvente que las rodean induciendo un movimiento aleatorio de las partículas en las diferentes direcciones del espacio73. Las partículas de menor tamaño se mueven más rápidamente que las de mayor tamaño. Esto se debe a que la energía transferida a la partícula, por las colisiones con el disolvente, afecta en mayor medida a una partícula de menor tamaño. De esta forma, se puede relacionar el coeficiente de difusión con el diámetro hidrodinámico de la partícula a través de la ecuación StokesEinstein: 𝐷 = 𝑘𝐵𝑇 6𝜋𝜂𝑅𝐻 (4) donde D es el coeficiente de difusión, 𝑘𝐵 es la constante de Boltzmann, T la temperatura, 𝜂 la viscosidad de la muestra y 𝑅𝐻 el radio hidrodinámico de la partícula74. Nerea Borja González 72 Tal como se ve en la ecuación anterior, el coeficiente de difusión es inversamente proporcional al tamaño hidrodinámico de la partícula, es decir, las partículas de menor tamaño se moverán más rápido. Además, el coeficiente de difusión es directamente proporcional a la temperatura, por lo que las medidas se realizan a temperatura constante. La luz láser atraviesa la muestra, interacciona con las partículas suspendidas en disolución y dispersa la luz en distintas direcciones. El equipo recoge la cantidad de luz dispersada a un determinado ángulo y en un intervalo de tiempo determinado, relacionándose esta cantidad con el coeficiente de difusión. Las partículas de menor tamaño, que se mueven más rápido, dispersarán mayor cantidad de luz que aquellas que posean un tamaño mayor. Esta técnica se utiliza generalmente para medir la distribución de tamaños y el índice de polidispersidad de una muestra de nanopartículas dispersada en un disolvente. En la distribución de tamaños podremos observar si en la muestra se encuentran una o varias poblaciones de nanopartículas de diferentes tamaños. El índice de polidispersidad es una variable adimensional que varía de 0 a 1, siendo 0 el valor para una muestra totalmente monodispersa y 1 para el de una de muy alta polidispersidad. Las medidas realizadas en la presente tesis, para conocer la distribución de tamaños de las nanopartículas presentes en las muestras, se llevaron a cabo en un DLS Malvern Z-sizer, a una Capítulo II. Técnicas de Caracterización 73 temperatura de 25°C, en cubetas de PMMA (polimetilmetacrilato). 7. CROMATOGRAFÍA DE GASES La cromatografía de gases es una técnica analítica utilizada para analizar y cuantificar los componentes volátiles de una muestra. También se puede utilizar para analizar y cuantificar los componentes en fase gas. En el cromatógrafo de gases hay dos maneras de inyectar la muestra, la primera, es inyectar una porción de muestra con analitos volátiles y calentarla hasta vaporizarla, mientras que en el segundo se inyectan directamente los analitos en fase gas. Este segundo procedimiento es el que se ha utilizado para las medidas cromatográficas realizadas en esta tesis. De forma más concreta, la cromatografía de gases se ha utilizado para determinar la cantidad de hidrógeno fotogenerado en la catálisis de reducción del agua por los AQCs. La reacción se llevaba a cabo en una cubeta cerrada de cuarzo de 3,5 mL, dejándose 0,5 mL de espacio de cabeza, es decir, del espacio de la cubeta que queda por encima de la disolución. El gas del espacio de cabeza, que contiene los gases a analizar, se introduce directamente en el cromatógrafo de gases para su estudio. El espectro mostrará los tiempos de retención correspondientes a los gases que se pueden determinar75 y, analizando el área del pico, podremos conocer la cantidad del gas a analizar presente en nuestra muestra. El cromatógrafo usado, Clarus 580 de Perkin Elmer, posee un detector de conductividad térmica (TCD) que es el más Main conclusions 81 MAIN CONCLUSIONS Due to the results shown in this thesis we can conclude that small clusters are highly stable in solution and that the synthesis of AQCs, the purification methods, and the catalytical and biomedical applications are strongly influenced by the catalytic properties of AQCs and the interaction of AQCs with ions in solution. The main conclusions of this thesis are summarized as follow: 1. We have developed a Ag5-AQCs synthesis method that produces 0.1 g/L of AQCs. This concentration is five orders of magnitude higher than that obtained by electrochemical synthesis (≈1 µg/L). 2. It has been possible to characterize the AQCs obtained by high resolution mass spectrometry. 3. It was observed that the Ag5 clusters synthesized by the photochemical method did not exhibit the catalytic properties attributed to clusters of 5 atoms, due to the interference of silver ions, in the case of applications in photocatalysis and heterogeneous catalysis and due to the IPA, Ag+ and nitrates in the case of biomedical applications. 4. The influence of sodium silicate on the Ag5-Ag+ interaction was observed. Sodium silicate is a chaotropic agent that removes Ag+ ions from the coordination sphere of the cluster, improving purification yields. Nerea Borja González 82 5. It was possible to purify Ag5 clusters in the presence of 0.2 mM sodium silicate with a cation exchange resin (Dowex) and determine the presence of Ag5 by biological activity in tumor cells even the losses in the purification step were of 94-97 % of synthesized clusters. 6. Samples were found to completely inhibit cell growth of tumor cells when they have been sonicated after the concentration process. This means that AQCs form agglomerates during the concentration step. For this reason, the samples become inactive, and they must be sonicated to recover their activity. 7. For first time it was possible to lyophilize samples of Ag5 clusters without losing clusters in the process due to the presence of sodium silicate in solution. 8. In addition, the IPA and HNO3 were completely removed by the lyophilization process, allowing the synthesized samples to be redispersed in an aqueous solution. 9. Ag5 clusters were purified for the first time in the presence of 0.2 mM sodium silicate in aqueous solution (1 mM HNO3) with a loss yield of 60%. The samples were purified by SPE Silica cartridges pretreated with 2 mM NaOH. 10. The biological activity of these samples was determined by biological assays with tumor cells in the presence of DTT and It was demonstrated that the presence of Ag5 because of this clusters oxidize the glutathione and cysteine groups of tumor cells causing their apoptosis and DTT can reverse this effect. 11. It was shown that in the presence of 92.5 and 185 mM EDTA Ag5 clusters catalyze the reduction of Ag ions to Main conclusions 83 metal NPs. This reaction does not take place without AQCs. 12. A method based in the catalysis of metallic NPs in the presence of sodium citrate and tannic acid was developed for the characterization of catalytic clusters in lyophilized samples. 13. We can use this method to characterize catalytic clusters in less than 10 min with a detection limit of ≈25 mM of Ag5-AQCs (45 µg/L of Ag5-AQCs). In summary, in this thesis it has been possible to synthesize, purify, characterize, and determine the catalytic activity of Ag5 clusters. These clusters have novel properties that a huge field of possibilities in some applications as catalysis or biomedicine and for this reason they will continue to be the focus of our scientific research. Referencias 85 REFERENCIAS 1. Freestone, I., Meeks, N., Sax, M. & Higgitt, C. The Lycurgus Cup - A Roman nanotechnology. Gold Bull. 40, 270–277 (2008). 2. Barber, D. J. & Freestone, I. C. An Investigation of the Origin of the Colour of the Lycurgus Cup By Analytical Transmission Electron Microscopy. Archaeometry 32, 33–45 (1990). 3. Faraday, M. On the Relations of Gold and other Metals to Light. Philos. Trans. R. Soc. London Ser. I 356–360 (1857). 4. Einstein, A. On the movement of small particles suspended in stationary liquids required by molecularkinetic theory of heat. Ann. Phys. 17, 549–560 (1905). 5. Feynman, R. There’s plenty of room at the bottom. Eng. Sci. 23, 22–36 (1960). 6. Taniguchi, N. 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